Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN105388302A - 一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法 - Google Patents

一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105388302A
CN105388302A CN201510971526.9A CN201510971526A CN105388302A CN 105388302 A CN105388302 A CN 105388302A CN 201510971526 A CN201510971526 A CN 201510971526A CN 105388302 A CN105388302 A CN 105388302A
Authority
CN
China
Prior art keywords
elisa plate
antibody
detection method
immunoglobulin
tau protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510971526.9A
Other languages
English (en)
Inventor
叶生亮
曹海军
李长清
马莉
杜晞
王宗奎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Original Assignee
Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC filed Critical Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority to CN201510971526.9A priority Critical patent/CN105388302A/zh
Publication of CN105388302A publication Critical patent/CN105388302A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法，属于生物医药检测技术领域，其包括以下步骤：A.抗原包被；B.封闭；C.一抗孵育；D.二抗孵育；E.酶标三抗孵育；F.吸光度检测及含量计算步骤。该检测方法通过步骤B中选用的无蛋白封闭液而避免了常规封闭液中的蛋白质与待测样品中的多元抗体发生非特异性结合而影响检测结果；通过步骤C、D中使用去除了免疫球蛋白的牛血清白蛋白配制样品稀释液，避免了牛血清白蛋白中残留的IgG分子与检测体系发生交叉反应的影响；通过步骤C、步骤D和步骤E的生物素放大系统对待测样品中的Tau蛋白抗体的检测信号进行了放大，因此，本检测方法能够更准确测定人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量。

Description

一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医药检测技术领域，具体而言，涉及一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法。
背景技术
Tau蛋白是与阿尔兹海默症相关的一种重要蛋白。人静脉注射免疫球蛋白(intravenousimmunoglobulin，IVIG)是临床用于一种治疗免疫缺陷的药物，含多种抗体。同时，有研究者发现静脉注射人免疫球蛋白制品能够治疗阿尔兹海默症，其作用机理可能与免疫球蛋白中含有的Tau蛋白抗体有关。
IVIG若用于阿尔兹海默症的治疗，其中的Tau蛋白抗体含量的多少将是与其治疗阿尔兹海默症效果相关的重要指标，因此，有必要对IVIG中Tau蛋白抗体含量进行检测。
由于IVIG是以数千人份混合血浆为原料制备的血浆蛋白制品，因此其具有非常丰富的抗体多样性，包含成千上万种蛋白、多肽、核酸甚至小分子物质的IgG抗体，能够与多种成分发生抗原抗体反应，而单一一种抗体的含量也较少。常规的酶联免疫吸附实验中用到的封闭液、稀释液中，常含有各种复杂成分，会与待测样品发生交叉反应而影响检测方法的准确性；同时，因免疫球蛋白中的Tau蛋白抗体含量较低而不易检测，也会对检测方法的准确性产生影响。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法，以提高检测方法的准确性。
本发明所采用的技术方案为:
一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法，包括以下步骤:
A.抗原包被：在酶标板的每孔中加入Tau蛋白溶液，经孵育操作后用洗涤液洗涤；
B.封闭：在所述酶标板的每孔中加入无蛋白封闭液，经孵育操作后用洗涤液洗涤；
C.一抗孵育：在所述酶标板的每孔中加入待测样品，经孵育操作后用洗涤液洗涤；所述待测样品为用稀释液稀释的人免疫球蛋白制品，所述稀释液为采用去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白和磷酸钠-吐温缓冲液配制的混合液，所述稀释液中的去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白的质量含量为0.5％-1.5％；
D.二抗孵育：在所述酶标板的每孔中加入生物素偶联的抗一抗的抗体，经孵育操作后用洗涤液洗涤；
E.酶标三抗孵育：在所述酶标板的每孔中加入标记酶偶联的链抗生物素蛋白，经孵育操作后用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl缓冲液洗涤；
F.吸光度检测及含量计算：在所述酶标板的每孔中加入显色底物进行显色反应，经孵育操作后再加入终止液终止反应，然后将所述酶标板放入检测装置中进行吸光度检测，得待测样品的吸光度值OD待测样品，并采用标准曲线法计算出待测样品中的Tau蛋白抗体的含量。
上述检测方法中，通过采用无蛋白封闭液而避免了因封闭液中的蛋白质与待测样品中的多元抗体发生非特异性结合而影响检测结果；同时，采用去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白和磷酸钠-吐温缓冲液配制的混合液作为稀释液，避免了因稀释液中的牛血清白蛋白中残留的IgG分子与检测体系发生交叉反应而影响检测结果，因此，提高了检测方法的准确度。
同时，为了避免因待测样品中Tau蛋白抗体的含量较少而不易测量的问题，上述检测方法中，通过步骤C、步骤D和步骤E，使得吸附于酶标板上的Tau蛋白首先与步骤C中作为一抗的待测样品中的Tau蛋白抗体发生特异性结合形成一抗复合物，即抗原抗体复合物。然后该一抗复合物又与步骤D中作为二抗的生物素偶联的抗体特异性结合形成二抗复合物；最后该二抗复合与步骤E中作为三抗的标记酶偶联的链抗生物素蛋白特异性结合形成标记酶偶联的三抗复合物，通过步骤D和步骤E的生物素放大系统对待测样品中的Tau蛋白抗体的检测信号进行了放大而使其与显示底物反应后易于被检测，提高了该检测方法的准确性。
再者，上述步骤A、B、C、D和E均具有洗涤操作，这样可以及时洗去各步骤中酶标板上的游离成分和其他杂质蛋白，以免其影响检测结果的准确性。
因此，该检测方法能够更准确地测定人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量。
其中，优选地，所述稀释液中的去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白的质量含量为1％
进一步，所述生物素偶联的抗一抗的抗体为生物素偶联的免疫球蛋白G的Fc片段的抗体，所述生物素偶联的免疫球蛋白G的Fc片段的抗体为来源于其他物种的针对于人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体与生物素偶联后形成的抗体。
上述生物素偶联的人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体专门针对于人免疫球蛋白G中的Fc片段而发生特异性反应，使其更加专一地与结合了Tau蛋白抗体的人免疫球蛋白G结合，从而可以有效地避免其与测定体系中其它杂蛋白发生反应而影响检测的准确性，更好地提高了该检测方法的准确性。
进一步，所述生物素偶联的免疫球蛋白G的Fc片段的抗体为生物素偶联的羊抗人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体、生物素偶联的兔抗人免疫球蛋白G的Fc片段抗体或者生物素偶联的鼠抗人免疫球蛋白G的Fc片段抗体。
进一步，所述Tau蛋白溶液的浓度为5-20μg/ml；所述洗涤液为磷酸盐缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01-0.02mol/L，其含有的NaCl的浓度为0.1-0.2mol/L，Tween-20的质量百分含量为0.05％-0.2％。
优选地，所述Tau蛋白溶液的浓度为15μg/ml；所述所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.015mol/L，其含有的NaCl的浓度为0.15mol/L，Tween-20的质量百分含量为0.1％。
进一步，所述标记酶为碱性磷酸酶，所述显色底物为对硝基苯磷酸二钠，所述终止液为强碱溶液，所述吸光度检测是检测酶标板在波长405nm的吸光度值；或者所述标记酶为辣根过氧化物酶，所述显色底物为双氧水与四甲基联苯胺或者双氧水与邻笨二胺，所述终止液为强酸溶液，所述吸光度检测是检测酶标板在波长450nm或492nm的吸光度值。
显色底物为双氧水与四甲基联苯胺时，吸光度检测的波长为450nm；显色底物为双氧水与邻笨二胺时，吸光度检测的波长为492nm。
进一步，所述洗涤液和所述Tris-HCl缓冲液的洗涤次数均分别为3-5次。
上述洗涤次数分别为3-5次，以充分洗去各步骤中的游离成分以及其他残留的杂质蛋白。
进一步，所述孵育操作的孵育温度为4-37℃，孵育时间为5min-16h。
上述检测方法中，各步骤的孵育操作的温度可以为4-37℃，根据孵育温度，其孵育时间可以在5min-16h内进行适当调整。温度高时，孵育时间短些；而温度低时，孵育时间长些。
进一步，所述孵育操作的孵育温度为25℃，孵育时间为8min-4h。
温度较高时，应缩短孵育时间，以免因孵育时间填充而发生非特异性结合或酶促反应过度而影响检测结果。
进一步，步骤F中的所述标准曲线法包括以下步骤：
溶液配制：将标准品用稀释液进行梯度稀释，得到不同浓度的标准品溶液；
标准曲线绘制：根据所述检测方法分别测定所述不同浓度的标准品溶液经检测反应后的吸光度值OD标准品，再以OD标准品的值对标准品中Tau蛋白浓度值绘制标准曲线并获得曲线方程；
结果计算：将测得的所述待测样品的吸光度值OD待测样品代入曲线方程计算待测样品中Tau蛋白抗体含量。
其中优选地，标准品溶液的浓度为1.95ng/ml-500ng/ml之间。
进一步，所述标准品为鼠抗人Tau蛋白单克隆抗体，且所述标准曲线绘制中，所用的生物素偶联的抗一抗的抗体为生物素偶联的羊抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗体或者生物素偶联的兔抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗体。
容易理解的，根据所选用的作为标准品的Tau蛋白单克隆抗体而选择相应的生物素偶联的抗体，以便于其能够与Tau蛋白单克隆抗体结合，以便于标准曲线的绘制。
上述检测方法中，空白对照组的设立方法与现有的检测方法相同，其为本领域技术人员所公知的而不做详细说明。
本发明的有益效果：
本发明说提供的一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法，通过选用无蛋白封闭液而避免了封闭液中的蛋白质与待测样品中的多元抗体发生非特异性结合而影响检测结果；通过使用去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白和磷酸钠-吐温缓冲液配制的混合液作为稀释液，避免了稀释液中的牛血清白蛋白中残留的IgG分子与检测体系发生交叉反应而产生的不良影响；同时，通过步骤C、步骤D和步骤E的生物素放大系统对待测样品中的Tau蛋白抗体的检测信号进行了放大，因此，使得该检测方法能够更准确地测定人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量。
附图说明
图1为实施例1中所述的Tau蛋白抗体含量检测标准曲线。
具体实施方式
实施例1
稀释液的配制：分别量取去免疫球蛋白的牛血清白蛋白和磷酸钠-吐温缓冲液，混合后配制成稀释液。稀释液中的去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白的质量含量为0.5％。
待测样品的制备：将选自四个不同厂家的人免疫球蛋白(IVIG)制品分别用稀释液稀释，得到待测样品，并相应地编号为A、B、C、D。
测定待测样品的吸光度值
将浓度为5μg/ml的Tau蛋白溶液加入到酶标板的每孔中，然后于4℃的条件下孵育10-16h，待Tau蛋白充分地吸附在酶标板上后用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，除去酶标板上的游离成分。
经洗涤后，在酶标板的每孔中再加入无蛋白封闭液进行封闭，并于4℃的条件下孵育10-16h后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第二次洗涤，洗涤次数为3次。经封闭步骤可以避免酶标板在吸附Tau蛋白后还存在没有被占据的空隙，从而可以排斥其后的操作中的干扰物质的再吸附。
经第二次洗涤后，向封闭后的酶标板的相应的检测样品孔中分别加入编号为A、B、C、D的待测样品，向封闭后的酶标板的相应的检测空白孔中加入稀释液作为空白对照组1，于4℃条件孵育10-16h，使吸附于酶标板上的Tau蛋白可以与待测样品中的Tau蛋白抗体充分反应而形成一抗复合物，然后再用磷酸盐缓冲盐对酶标板进行第三次洗涤，其洗涤次数为3次，从而去除游离成分。
酶标板经第三次洗涤后，在每孔中加入生物素偶联的羊抗人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体，然后在4℃的条件下孵育10-16h，使一抗复合物与生物素偶联的羊抗人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体结合形成生物素偶联的二抗复合物，然后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第四次洗涤，洗涤次数3次。
经第四次洗涤后再在酶标板的每孔中加入碱性磷酸酶偶联的链抗生物素蛋白，并于4℃孵育10-16h，使碱性磷酸酶偶联的链抗生物素蛋白作用于二抗复合物的生物素而反应，得到碱性磷酸酶偶联的三抗复合物，再用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl缓冲液对酶标板进行第五次洗涤，洗涤次数3次。Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01mol/L，其中NaCl的浓度为0.15mol/L，Tween-20的质量百分含量为0.05％。
在第五次洗涤后，在酶标板的每孔中加入对硝基苯磷酸二钠后于4℃孵育10-16h，使三抗复合物的碱性磷酸酶对硝基苯磷酸二钠作用而显色，待充分显色后加入氢氧化钠溶液以终止反应，然后将酶标板放入酶标仪中，于405nm测定待测样品吸光度值OD待测样品和空白对照组1的吸光度值OD对照组1，并计算OD待测样品与OD对照组1的差值。
标准曲线的绘制
标准品溶液的配制：将标准品鼠抗人Tau蛋白单克隆抗体用稀释液进行梯度稀释，得到不同浓度的标准品溶液，其浓度分别为1.95ng/ml、7.8ng/ml、31.25ng/ml、62.5ng/ml、125ng/ml、250ng/ml和500ng/ml。
标准曲线的绘制包括以下步骤：
将浓度为5μg/ml的Tau蛋白溶液加入到酶标板的每孔中，然后于4℃的条件下孵育10-16h，待Tau蛋白充分地吸附在酶标板上后用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，除去酶标板上的游离成分。
经洗涤后，在酶标板的每孔中再加入无蛋白封闭液进行封闭，并于4℃的条件下孵育10-16h后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第二次洗涤，洗涤次数为3次。
经第二次洗涤后，向封闭后的酶标板的检测标准品孔中分别加入各浓度梯度的标准品溶液，向封闭后的酶标板的相应的检测空白孔中加入稀释液作为空白对照组2；于4℃条件孵育10-16h，使吸附于酶标板上的Tau蛋白可以与标准品溶液中的Tau蛋白抗体充分反应而形成一抗复合物，然后再用磷酸盐缓冲盐对酶标板进行第三次洗涤，其洗涤次数为3次，从而去除游离成分。
酶标板经第三次洗涤后，在每孔中加入生物素偶联的羊抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗体，然后在4℃的条件下孵育10-16h，使一抗复合物与生物素偶联的羊抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗体结合形成生物素偶联的二抗复合物，然后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第四次洗涤，洗涤次数3次。
经第四次洗涤后再在酶标板的每孔中加入碱性磷酸酶偶联的链抗生物素蛋白，并于4℃孵育10-16h，使碱性磷酸酶偶联的链抗生物素蛋白与二抗复合物的生物素结合，得到碱性磷酸酶偶联的三抗复合物，再用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl缓冲液对酶标板进行第五次洗涤，洗涤次数3次。Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01mol/L，其中NaCl的浓度为0.1mol/L，Tween-20的质量百分含量为0.05％。
在第五次洗涤后，在酶标板的每孔中加入对硝基苯磷酸二钠后于4℃孵育10-16h，使三抗复合物的碱性磷酸酶对硝基苯磷酸二钠作用而显色，待充分显色后加入氢氧化钠溶液以终止反应，然后将酶标板放入酶标仪中，于405nm测定各浓度标准品溶液的吸光度值OD标准品和空白对照组2的吸光度值OD对照组2；然后以各标准品溶液的浓度为横坐标，以其对应浓度的OD标准品与OD对照组2的差值为纵坐标，绘制Tau蛋白抗体含量检测标准曲线并获得曲线方程，如图1所示。
含量计算：将实施例1中测定的OD待测样品与OD对照组1的差代入曲线方程中，计算结果，再乘以其稀释倍数，从而得出待测样品中的Tau蛋白抗体的含量。
重复以上方法，对编号为A、B、C、D的待测样品均分别进行3次重复试验，检测结果求均值。Tau蛋白抗体含量的检测结果如下表1所示：
表1：实施例1中四种IVIG样品中Tau蛋白抗体含量测定结果
根据实际操作需要，本实施例中使用洗涤液和Tris-HCl缓冲液对酶标板进行洗涤时，其洗涤次数可以分别适当调整，例如洗涤次数为1次、2次或者多次，优选为3-5次，这样既保证酶标板得到充分洗涤，又避免浪费。
实施例2
稀释液的配制：分别量取去免疫球蛋白的牛血清白蛋白和磷酸钠-吐温缓冲液，混合后配制成稀释液。稀释液中的去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白的质量含量为1.0％。
待测样品的制备：将选自四个不同厂家的人免疫球蛋白(IVIG)制品分别用稀释液稀释，得到待测样品，并相应地编号为A、B、C、D。
测定待测样品的吸光度值
将浓度为15μg/ml的Tau蛋白溶液加入到酶标板的每孔中，然后于37℃的条件下孵育5min-2h，待Tau蛋白充分地吸附在酶标板上后用磷酸盐缓冲溶液洗涤4次，除去酶标板上的游离成分。
经洗涤后，在酶标板的每孔中再加入无蛋白封闭液进行封闭，并于37℃的条件下孵育5min-2h后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第二次洗涤，洗涤次数为4次。
经第二次洗涤后，向封闭后的酶标板的相应的检测样品孔中分别加入编号为A、B、C、D的待测样品，向封闭后的酶标板的相应的检测空白孔中加入稀释液作为空白对照组1；于37℃条件孵育5min-2h，使吸附于酶标板上的Tau蛋白可以与待测样品中的Tau蛋白抗体充分反应而形成一抗复合物，然后再用磷酸盐缓冲盐对酶标板进行第三次洗涤，其洗涤次数为4次，从而去除游离成分。
酶标板经第三次洗涤后，在每孔中加入生物素偶联的鼠抗人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体，然后在37℃的条件下孵育5min-2h，使一抗复合物与生物素偶联的鼠抗人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体结合形成生物素偶联的二抗复合物，然后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第四次洗涤，洗涤次数4次。
经第四次洗涤后再在酶标板的每孔中加入碱性磷酸酶偶联的链抗生物素蛋白，并于37℃孵育5min-2h，使碱性磷酸酶偶联的链抗生物素蛋白结合于二抗复合物的生物素，得到碱性磷酸酶偶联的三抗复合物，再用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl缓冲液对酶标板进行第五次洗涤，洗涤次数4次。Tris-HCl缓冲液的浓度为0.015mol/L，其中NaCl的浓度为0.15mol/L，Tween-20的质量百分含量为0.1％。
在第五次洗涤后，在酶标板的每孔中加入对硝基苯磷酸二钠后于37℃的条件孵育5min-1h，使三抗复合物的碱性磷酸酶对硝基苯磷酸二钠作用而显色，待充分显色后加入氢氧化钠溶液以终止反应，然后将酶标板放入酶标仪中，于405nm测定待测样品的吸光度值OD待测样品和空白对照组1的吸光度值OD对照组1，并计算OD待测样品与OD对照组 1的差值。
标准曲线的绘制
标准品溶液的配制：将标准品鼠抗人Tau蛋白单克隆抗体用稀释液进行梯度稀释，得到不同浓度的标准品溶液，其浓度分别为1.95ng/ml、7.8ng/ml、31.25ng/ml、62.5ng/ml和125ng/ml。
标准曲线的绘制包括以下步骤：
将浓度为15μg/ml的Tau蛋白溶液加入到酶标板的每孔中，然后于37℃的条件下孵育5min-2h，待Tau蛋白充分地吸附在酶标板上后用磷酸盐缓冲溶液洗涤4次，除去酶标板上的游离成分。
经洗涤后，在酶标板的每孔中再加入无蛋白封闭液进行封闭，并于37℃的条件下孵育5min-2h后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第二次洗涤，洗涤次数为4次。
经第二次洗涤后，向封闭后的酶标板的检测标准品孔中分别加入各浓度梯度的标准品溶液，向封闭后的酶标板的相应的检测空白孔中加入稀释液作为空白对照组2；于37℃条件孵育5min-2h，使吸附于酶标板上的Tau蛋白可以与标准品溶液中的Tau蛋白抗体充分反应而形成一抗复合物。然后再用磷酸盐缓冲盐对酶标板进行第三次洗涤，其洗涤次数为4次，从而去除游离成分。
酶标板经第三次洗涤后，在每孔中加入生物素偶联的羊抗鼠免疫球蛋白GFc片段的抗体，然后在37℃的条件下孵育5min-2h，使一抗复合物与生物素偶联的抗体结合形成生物素偶联的二抗复合物，，然后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第四次洗涤，洗涤次数4次。
经第四次洗涤后再在酶标板的每孔中加入碱性磷酸酶偶联的链抗生物素蛋白，并于37℃孵育5min-2h，使碱性磷酸酶偶联的链抗生物素蛋白与二抗复合物的生物素结合，得到碱性磷酸酶偶联的三抗复合物，再用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl缓冲液对酶标板进行第五次洗涤，洗涤次数4次。Tris-HCl缓冲液的浓度为0.015mol/L，其中NaCl的浓度为0.15mol/L，Tween-20的质量百分含量为0.1％。
在第五次洗涤后，在酶标板的每孔中加入对硝基苯磷酸二钠后于37℃的条件孵育5min-1h，使三抗复合物的碱性磷酸酶对硝基苯磷酸二钠作用而显色，待充分显色后加入氢氧化钠溶液以终止反应，然后将酶标板放入酶标仪中，于405nm测定各浓度标准品溶液的吸光度值OD标准品和空白对照组2的吸光度值OD对照组2；然后以各标准品溶液的浓度为横坐标，以其对应浓度的OD标准品与OD对照组2的差值为纵坐标，绘制Tau蛋白抗体含量检测标准曲线并获得曲线方程。
含量计算：将实施例2中测定的OD待测样品与OD对照组1的差代入曲线方程中，计算结果，再乘以其稀释倍数，从而得出待测样品中的Tau蛋白抗体的含量。
重复以上方法，对编号为A、B、C、D的待测样品均分别进行3次重复试验，检测结果求均值。Tau蛋白抗体含量的检测结果如下表2所示：
表2：实施例2中四种IVIG样品中Tau蛋白抗体含量测定结果
实施例3
稀释液的配制：分别量取去免疫球蛋白的牛血清白蛋白和磷酸钠-吐温缓冲液，混合后配制成稀释液。稀释液中的去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白的质量含量为1.5％。
待测样品的制备：将选自三个不同厂家的人免疫球蛋白(IVIG)制品分别用稀释液稀释，得到待测样品，并相应地编号为A、B、C。
测定待测样品的吸光度值
将浓度为20μg/ml的Tau蛋白溶液加入到酶标板的每孔中，然后于25℃的条件下孵育1-4h，待Tau蛋白充分地吸附在酶标板上后用磷酸盐缓冲溶液洗涤5次，除去酶标板上的游离成分。
经洗涤后，在酶标板的每孔中再加入无蛋白封闭液进行封闭，并于25℃的条件下孵育1-4h后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第二次洗涤，洗涤次数为5次。
经第二次洗涤后，向封闭后的酶标板的相应的检测样品孔中分别加入编号为A、B、C的待测样品，向封闭后的酶标板的相应的检测空白孔中加入稀释液作为空白对照组1；于25℃条件孵育1-4h，使吸附于酶标板上的Tau蛋白可以与待测样品中的Tau蛋白抗体充分反应而形成一抗复合物。然后再用磷酸盐缓冲盐对酶标板进行第三次洗涤，其洗涤次数为5次，从而去除游离成分。
酶标板经第三次洗涤后，在每孔中加入生物素偶联的兔抗人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体，然后在25℃的条件下孵育1-4h，使一抗复合物与生物素偶联的兔抗人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体结合形成生物素偶联的二抗复合物，然后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第四次洗涤，洗涤次数5次。
经第四次洗涤后再在酶标板的每孔中加入辣根过氧化物酶偶联的链抗生物素蛋白，并于25℃孵育1-4h，使辣根过氧化物酶偶联的链抗生物素蛋白结合于二抗复合物的生物素，得到辣根过氧化物酶偶联的三抗复合物，再用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl缓冲液对酶标板进行第五次洗涤，洗涤次数5次。Tris-HCl缓冲液的浓度为0.02mol/L，其中NaCl的浓度为0.2mol/L，Tween-20的质量百分含量为0.2％。
在第五次洗涤后，在酶标板的每孔中加入底物四甲基联苯胺和双氧水后于25℃的条件孵育8min-1h，使三抗复合物的辣根过氧化物酶作用于双氧水，进而作用于四甲基联苯胺而显色，待充分显色后加入硫酸溶液以终止反应，于450nm测定待测样品的吸光度值OD待 测样品和空白对照组1的吸光度值OD对照组1，并计算OD待测样品与OD对照组1的差值。
标准曲线的绘制
稀释液的配制：分别量取去免疫球蛋白的牛血清白蛋白和磷酸钠-吐温缓冲液，混合后配制成去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白的质量含量为1.5％的稀释液。
标准品溶液的配制：将标准品鼠抗人Tau蛋白单克隆抗体用稀释液进行梯度稀释，得到不同浓度的标准品溶液，其浓度分别为1.95ng/ml、7.8ng/ml、31.25ng/ml、125ng/ml和500ng/ml。
标准曲线的绘制包括以下步骤：
将浓度为20μg/ml的Tau蛋白溶液加入到酶标板的每孔中，然后于25℃的条件下孵育1-4h，待Tau蛋白充分地吸附在酶标板上后用磷酸盐缓冲溶液洗涤5次，除去酶标板上的游离成分。
经洗涤后，在酶标板的每孔中再加入无蛋白封闭液进行封闭，并于25℃的条件下孵育1-4h后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第二次洗涤，洗涤次数为5次。
经第二次洗涤后，向封闭后的酶标板的检测标准品孔中分别加入各浓度梯度的标准品溶液，向封闭后的酶标板的相应的检测空白孔中加入稀释液作为空白对照组2；于25℃条件孵育1-4h，使吸附于酶标板上的Tau蛋白可以与标准品溶液中的Tau蛋白抗体充分反应而形成一抗复合物。然后再用磷酸盐缓冲盐对酶标板进行第三次洗涤，其洗涤次数为5次，从而去除游离成分。
酶标板经第三次洗涤后，在每孔中加入生物素偶联的兔抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗体，然后在25℃的条件下孵育1-4h，使一抗复合物与生物素偶联的兔抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗体结合形成生物素偶联的二抗复合物，然后用磷酸盐缓冲液对酶标板进行第四次洗涤，洗涤次数5次。
经第四次洗涤后再在酶标板的每孔中加入辣根过氧化物酶偶联的链抗生物素蛋白，并于25℃孵育1-4h，使辣根过氧化物酶偶联的链抗生物素蛋白与二抗复合物的生物素结合，得到辣根过氧化物酶偶联的三抗复合物并吸附于酶标板上，再用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl缓冲液对酶标板进行第五次洗涤，洗涤次数5次。Tris-HCl缓冲液的浓度为0.02mol/L，其中NaCl的浓度为0.2mol/L，Tween-20的质量百分含量为0.2％。
在第五次洗涤后，在酶标板的每孔中加入底物四甲基联苯胺和双氧水后于于25℃孵育8min-1h，使三抗复合物的辣根过氧化物酶作用于和双氧水，进而作用于四甲基联苯胺而显色，待充分显色后加入硫酸溶液以终止反应，于450nm测定各浓度标准品溶液的吸光度值OD标准品和空白对照组2的吸光度值OD对照组2；然后以各标准品溶液的浓度为横坐标，以其对应浓度的OD标准品与OD对照组2的差值为纵坐标，绘制Tau蛋白抗体含量检测标准曲线并获得曲线方程。
含量计算：将实施例3中测定的OD待测样品与OD对照组1的差代入曲线方程中，计算结果，再乘以其稀释倍数，从而得出待测样品中的Tau蛋白抗体的含量。
重复以上方法，对编号为A、B、C、D的待测样品均分别进行3次重复试验，检测结果求均值。Tau蛋白抗体含量的检测结果如下表3所示：
表3：实施例3中三种IVIG样品中Tau蛋白抗体含量测定结果
本实施例中的底物还可以选用双氧水与邻笨二胺用于显色，吸光度检测的波长则相应地选用492nm。
容易理解地，实施例中的标准品还可以选用其他的标准品，例如兔抗人Tau蛋白单克隆抗体或者羊抗人Tau蛋白单克隆抗体，同时，标准曲线的绘制步骤中的生物素偶联的抗一抗的抗体也应选择相应的，以便于其能够与形成的一抗复合物发生特异性结合。
最终检测吸光度值的波长选择以该底物显色后最大吸收波长为准。
优选地，上述各实施例中，标准曲线绘制的各步骤的孵育时间与测定待测样品的吸光度值的各步骤中的孵育时间相同，这样，可以避免因孵育温度不同而引起的实验误差。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
A.抗原包被：在酶标板的每孔中加入Tau蛋白溶液，经孵育操作后用洗涤液洗涤；
B.封闭：在所述酶标板的每孔中加入无蛋白封闭液，经孵育操作后用洗涤液洗涤；
C.一抗孵育：在所述酶标板的每孔中加入待测样品，经孵育操作后用洗涤液洗涤；所述待测样品为用稀释液稀释的人免疫球蛋白制品，所述稀释液为采用去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白和磷酸钠-吐温缓冲液配制的混合液，所述稀释液中的去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白的质量含量为0.5％-1.5％；
D.二抗孵育：在所述酶标板的每孔中加入生物素偶联的抗一抗的抗体，经孵育操作后用洗涤液洗涤；
E.酶标三抗孵育：在所述酶标板的每孔中加入标记酶偶联的链抗生物素蛋白，经孵育操作后用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl缓冲液洗涤；
F.吸光度检测及含量计算：在所述酶标板的每孔中加入显色底物进行显色反应，经孵育操作后再加入终止液终止反应，然后将所述酶标板放入检测装置中进行吸光度检测，得待测样品的吸光度值OD待测样品，并采用标准曲线法计算出待测样品中的Tau蛋白抗体的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述生物素偶联的抗一抗的抗体为生物素偶联的免疫球蛋白G的Fc片段的抗体，所述生物素偶联的免疫球蛋白G的Fc片段的抗体为来源于其他物种的针对于人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体与生物素偶联后形成的抗体。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述生物素偶联的免疫球蛋白G的Fc片段的抗体为生物素偶联的羊抗人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体、生物素偶联的兔抗人免疫球蛋白G的Fc片段抗体或者生物素偶联的鼠抗人免疫球蛋白G的Fc片段抗体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述Tau蛋白溶液的浓度为5-20μg/ml；所述洗涤液为磷酸盐缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01-0.02mol/L，其含有的NaCl的浓度为0.1-0.2mol/L，Tween-20的质量百分含量为0.05％-0.2％。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述标记酶为碱性磷酸酶，所述显色底物为对硝基苯磷酸二钠，所述终止液为强碱溶液，所述吸光度检测是检测酶标板在波长405nm的吸光度值；或者所述标记酶为辣根过氧化物酶，所述显色底物为双氧水与四甲基联苯胺或者双氧水与邻笨二胺，所述终止液为强酸溶液，所述吸光度检测是检测酶标板在波长450nm或492nm的吸光度值。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述洗涤液和所述Tris-HCl缓冲液的洗涤次数均分别为3-5次。
7.根据权利1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述孵育操作的孵育温度为4-37℃，孵育时间为5min-16h。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述孵育操作的孵育温度为25℃，孵育时间为8min-4h。
9.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤F中的所述标准曲线法包括以下步骤：
溶液配制：将标准品用稀释液进行梯度稀释，得到不同浓度的标准品溶液；
标准曲线绘制：根据所述检测方法分别测定所述不同浓度的标准品溶液经检测反应后的吸光度值OD标准品，再以OD标准品的值对标准品中Tau蛋白浓度值绘制标准曲线并获得曲线方程；
结果计算：将测得的所述待测样品的吸光度值OD待测样品代入曲线方程计算待测样品中Tau蛋白抗体含量。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述标准品为鼠抗人Tau蛋白单克隆抗体，且所述标准曲线绘制中，所用的生物素偶联的抗一抗的抗体为生物素偶联的羊抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗体或者生物素偶联的兔抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗体。
CN201510971526.9A 2015-12-22 2015-12-22 一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法 Pending CN105388302A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510971526.9A CN105388302A (zh) 2015-12-22 2015-12-22 一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510971526.9A CN105388302A (zh) 2015-12-22 2015-12-22 一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105388302A true CN105388302A (zh) 2016-03-09

Family

ID=55420812

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510971526.9A Pending CN105388302A (zh) 2015-12-22 2015-12-22 一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105388302A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108956573A (zh) * 2018-08-02 2018-12-07 重庆医科大学附属儿童医院 一种检测xiap蛋白的试剂盒及其应用
CN109580955A (zh) * 2018-11-21 2019-04-05 北京利德曼生化股份有限公司 用于检测Tau蛋白(TAU)的磁微粒分离化学发光免疫测定法
CN113063949A (zh) * 2021-03-23 2021-07-02 中国医学科学院输血研究所 一种血浆中特异性IgM抗体的定量测定方法
CN113075398A (zh) * 2021-03-23 2021-07-06 中国医学科学院输血研究所 一种血浆中特异性IgG抗体的定量测定方法
CN113960318A (zh) * 2021-09-28 2022-01-21 苏州赛分科技股份有限公司 一种基于酶联免疫的重组蛋白a测定方法及试剂盒

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1582394A (zh) * 2001-09-06 2005-02-16 基因描绘系统有限公司 分子的快速灵敏检测
CN101760557A (zh) * 2010-03-04 2010-06-30 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种辅助诊断肝细胞癌的试剂盒
CN102008719A (zh) * 2010-12-02 2011-04-13 上海微球生物科技有限公司 克服b细胞免疫耐受的免疫微球及其应用
CN103033625A (zh) * 2012-12-19 2013-04-10 中国科学院生物物理研究所 一种人膀胱癌细胞化学发光检测试剂盒及其制备方法
CN103339146A (zh) * 2010-10-11 2013-10-02 比奥根艾迪克国际神经科学公司 人抗tau抗体
CN103616507A (zh) * 2013-12-11 2014-03-05 山东博科生物产业有限公司 无蛋白包被板封闭液
CN104111331A (zh) * 2014-08-06 2014-10-22 甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片和试剂盒及其方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1582394A (zh) * 2001-09-06 2005-02-16 基因描绘系统有限公司 分子的快速灵敏检测
CN101760557A (zh) * 2010-03-04 2010-06-30 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种辅助诊断肝细胞癌的试剂盒
CN103339146A (zh) * 2010-10-11 2013-10-02 比奥根艾迪克国际神经科学公司 人抗tau抗体
CN102008719A (zh) * 2010-12-02 2011-04-13 上海微球生物科技有限公司 克服b细胞免疫耐受的免疫微球及其应用
CN103033625A (zh) * 2012-12-19 2013-04-10 中国科学院生物物理研究所 一种人膀胱癌细胞化学发光检测试剂盒及其制备方法
CN103616507A (zh) * 2013-12-11 2014-03-05 山东博科生物产业有限公司 无蛋白包被板封闭液
CN104111331A (zh) * 2014-08-06 2014-10-22 甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片和试剂盒及其方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENG LIU ET.AL.: "Site-directed alanine mutagenesis of Phe33, Arg35, and Arg42-Ser43-Lys44 in the human gonadotropin alpha-subunit.", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL》 *
LYNNAE M. SMITH等: "Intravenous immunoglobulin products contain specific antibodies to recombinant human tau protein.", 《INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY》 *
LYNNAE M. SMITH等: "Specific binding of intravenous immunoglobulin products to tau peptide fragments.", 《INERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY》 *
唐秋艳 等人主编: "《免疫诊断试剂实用技术》", 31 August 2009 *
李艳平 等: "ZZ亲和肽在大肠杆菌中的表达及IgG抗体亲和活性测定", 《中国免疫学杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108956573A (zh) * 2018-08-02 2018-12-07 重庆医科大学附属儿童医院 一种检测xiap蛋白的试剂盒及其应用
CN109580955A (zh) * 2018-11-21 2019-04-05 北京利德曼生化股份有限公司 用于检测Tau蛋白(TAU)的磁微粒分离化学发光免疫测定法
CN113063949A (zh) * 2021-03-23 2021-07-02 中国医学科学院输血研究所 一种血浆中特异性IgM抗体的定量测定方法
CN113075398A (zh) * 2021-03-23 2021-07-06 中国医学科学院输血研究所 一种血浆中特异性IgG抗体的定量测定方法
CN113960318A (zh) * 2021-09-28 2022-01-21 苏州赛分科技股份有限公司 一种基于酶联免疫的重组蛋白a测定方法及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10830771B2 (en) PIVKA-II assay method and method for manufacturing reagent or kit for PIVKA-II immunoassay
CN105388302A (zh) 一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法
CN102159591A (zh) 单克隆抗体和使用所述单克隆抗体的免疫测定法
JP5860394B2 (ja) 新規モノクローナル抗体ならびにｄダイマーの免疫学的測定法
CN101561433B (zh) 一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒
CN109239367A (zh) 测定小分子化合物的方法及试剂盒
CN111999506B (zh) 一种d-二聚体检测试剂盒及其制备方法
US11175292B2 (en) Anti-human hemoglobin monoclonal antibody or antibody kit, insoluble carrier particle to which anti-human hemoglobin monoclonal antibody is immobilized, and measurement reagent and measurement method using same
CN106501511A (zh) 一种重组Neu蛋白检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法及其试剂盒
US20220120737A1 (en) Method for detecting sars-cov-2-specific serum human immunoglobulins
CN105911293A (zh) 一种测定免疫球蛋白a的试剂盒及其制备方法
CN117092344B (zh) 一种检测金黄色葡萄球菌蛋白a的试剂盒及其应用
CN110221058A (zh) 一种小鼠tdar实验定量分析检测试剂盒及检测方法
US9541550B2 (en) Method for immunologically measuring soluble LR11
CN106405098A (zh) 抗β2糖蛋白I抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN111443202B (zh) 一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用
Thorpe et al. A competitive enzyme-linked immunoassay using erythrocytes fixed to microtitre plates for anti-D quantitation in immunoglobulin products
CA1208548A (en) Method for the determination of antigens
CN101275947A (zh) 磺胺甲噁唑单克隆抗体试剂盒及检测方法
CN101101295A (zh) 酶联免疫体外诊断试剂中酶结合物溶液的制备
CN117169518B (zh) T淋巴细胞制剂中的cd3抗体残留物的检测方法和试剂盒
Thorpe et al. Competitive enzyme‐linked immunoassay of monoclonal immunoglobulin G anti‐D preparations
CN106872692B (zh) 汞离子食品污染中直接竞争酶联免疫检测试剂盒及其应用
CN104360057B (zh) 一种检测抗cd52抗体的elisa反应体系与方法
CN106841626B (zh) 一种环境污染中铜离子直接竞争酶联免疫检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160309