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CN104111331A - 应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片和试剂盒及其方法 - Google Patents

应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片和试剂盒及其方法 Download PDF

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CN104111331A CN201410382666.8A CN201410382666A CN104111331A CN 104111331 A CN104111331 A CN 104111331A CN 201410382666 A CN201410382666 A CN 201410382666A CN 104111331 A CN104111331 A CN 104111331A
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Abstract

本发明涉及一种应用于菊科植物病毒病的筛查和诊断的抗体芯片、试剂盒及其方法。一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片，其主要特点在于，包括有基膜和在基膜上分别点制的危害菊科植物的7种病毒的特异性捕获抗体(一抗)，所述的7种病毒的捕获抗体(一抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；在基膜上还封装有3个阳性质控点P，点制为碱性磷酸酶标记的IgG和封装有3个阴性质控点N，点制为pH 9.2-9.8的碳酸盐缓冲液。本发明的优点是成功构建了检测菊科植物多种病毒的抗体芯片，可以高通量地对多个病原进行综合性检测。

Description

应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片和试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及一种应用于植物病毒病的筛查和诊断的抗体芯片和试剂盒及其方法，主要针对菊科植物的菜豆黄花叶病毒、南芥菜花叶病毒、菜豆萎蔫病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脆裂病毒、烟草环斑病毒和番茄斑萎病毒7种病毒，属于生物技术领域。
背景技术
菊科植物中有大量药用、观赏和经济植物，病毒病是菊科植物生产的主要限制因素之一，菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus，BYMV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaicvirus，ArMV)、菜豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus，BBWV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)、烟草环斑病毒(Tobaccoringspot virus，TRSV)和番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)均可侵染菊科植物。BYMV侵染菊科、藜科、苋科、番杏科等多种植物；该病毒传播媒介主要是蚜虫，以非持久性方式传播，也可机械接种传播。ArMV是我国进境植物的检疫性有害生物，可危害约174属200多种植物，包括菊科蔬菜、花卉等，引起花叶、黄化褪绿、矮化、皱缩、坏死等症状；该病毒通过线虫和种子等途径传播。BBWV寄主范围广，可侵染44个科186个属中的328种植物，包括多种菊科植物；引起花叶、矮化、萎蔫和植株枯死等症状；自然界中由多种蚜虫以非持久性方式传播，易经机械接种传播。CMV为世界性分布病毒，能侵染1000多种单子叶和双子叶植物，是寄主植物最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒；CMV主要依赖多种蚜虫为传毒媒介，以非持久性方式传播，易通过机械接种传播，菟丝子也可传毒。TRV寄主范围广，可侵染50科400种双子叶和单子叶植物，自然条件下能侵染向日葵、莴苣等蔬菜和花卉；自然界中主要通过拟毛刺线虫和毛刺线虫传播，植物汁液、种子或菟丝子也能传毒。TRSV是可随植物种子、苗木传播的检疫性有害生物，可为害54科300多种植物，自然侵染寄主包括多种菊科蔬菜、花卉等；受TRSV侵染的植株症状因寄主而异，通常叶片出现环状或线状纹、褪绿斑、坏死斑等；该病毒通过线虫、机械接种和种子等途径传播，种传寄主多，种子传播是TRSV远距离传播的主要途径。TSWV为我国进境植物检疫性有害生物，寄主范围广泛，至少侵染900种植物，其中多种菊科植物易感染TSWV；该病毒主要靠汁液传毒，种子可传毒，易通过蓟马以持久性方式传播，嫁接也可传毒。
菊科植物受病毒病侵染后表现多种症状，如花叶、畸形、黄化、矮缩、坏死等，病株发育不良，导致产量和品质大大降低。在田间，菊科植物感染病毒病后，其症状受品种、植株生育阶段、环境条件和病毒株系影响很大，故很难从症状表现上判断病毒病究竟是由哪一种或哪几种病毒造成的，因此高通量、高灵敏度的多种菊科植物病毒的同步检测方法，对于及时查明病原、消灭初侵染源、防止病毒病的传播蔓延至关重要。目前应用较广泛的植物病毒检测方法有酶联免疫吸附测定实验(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)及反转录聚合酶链式扩增(Reverse Transcription-PCR，RT-PCR)，但采用常规方法检测样品中的多个病原，过程漫长，需要花费大量人力、物力和财力。
抗体芯片是利用抗原与抗体分子间可特异性结合的原理，将捕获抗体以阵列模式点样排布，与被分析样品反应后，获取杂交信号，最终确定样品中目标分子的分布及含量信息。抗体芯片具有可进行高通量平行分析、节省试剂与材料、样品处理过程简单的特点，已经应用于蛋白质功能研究、医疗诊断等多个生命科学领域。采用抗体芯片技术检测菊科植物病毒病，一次实验可同时检测多种病毒，能够提高检测效率，缩短检测周期，降低检测成本。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片，所述的这种用于联合诊断7种菊科植物病毒的抗体芯片具有简便、快速、灵敏、特异性好、通量化的特点。
本发明的还一目的在于提供一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片试剂盒。
本发明的又一目的在于一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片，其特征在于，包括有基膜和在基膜上分别点制的危害菊科植物的7种病毒的特异性捕获抗体(一抗)，所述的7种病毒的捕获抗体(一抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；在基膜上还封装有3个阳性质控点P，点制为碱性磷酸酶标记的IgG和封装有3个阴性质控点N，点制为pH9.2-9.8的碳酸盐缓冲液。所述的应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片的制备方法，其步骤为：
(1)抗体稀释：以捕获抗体(一抗)稀释缓冲液稀释7种多克隆捕获抗体(一抗)，稀释后的捕获抗体(一抗)浓度为抗体原液的1/18-1/3倍，即BYMV、ArMV、BBWV、CMV、TRV、TRSV和TSWV用于点样的抗体浓度依次为抗体原液的1:17、1:14、1:17、1:14、1:15、1:3和1:15倍，同时芯片上加1:10稀释的碱性磷酸酶标记驴抗山羊IgG原液作为芯片的阳性质控点，芯片点样液作为阴性质控点；点样缓冲液为：碳酸钠Na2CO31.59g，碳酸氢钠NaHCO32.93g，叠氮化钠NaN30.2g，双蒸水ddH2O 1000mL，pH 9.6；
(2)点样：将硝酸纤维素膜片印迹后，去离子水浸泡20min，37℃恒温箱中干燥20min。按芯片点阵，每种多克隆捕获抗体(一抗)重复点制2个点；分别针对7种病毒的捕获抗体(一抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒依次点在编号1-7的位置；在P和N的位置分别点阳性质控、阴性质控；
(3)将上述试剂按阵列排布点样于基膜表面，每点0.3uL，点间距0.2cm。点样完毕后，将抗体芯片置于湿盒中，湿度为45％，37℃固定30min；
(4)封闭：将固定好的抗体芯片用1％无蛋白封闭液37℃于湿盒中封闭1h，除去封闭液后，2-8℃保存，即为抗体芯片成品。
一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片试剂盒，其主要特点在于，包括有抗体芯片；7种病毒相对应的碱性磷酸酶标记的检测抗体(二抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；菊科植物病毒的阳性对照物，包括有菜豆黄花叶病毒的阳性对照物、南芥菜花叶病毒的阳性对照物、菜豆萎蔫病毒的阳性对照物、黄瓜花叶病毒的阳性对照物、烟草脆裂病毒的阳性对照物、烟草环斑病毒的阳性对照物、番茄斑萎病毒的阳性对照物；碱性磷酸酶；检测抗体(二抗)稀释缓冲液；洗涤缓冲液PBST；碱性磷酸酶显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/四唑硝基蓝。
一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片试剂盒的检测方法，其主要特点在于步骤为：
(1)将检测样品与抗体芯片4℃隔夜孵育；所述的抗体芯片为包括有基膜和在基膜上分别点制的危害菊科植物的7种病毒的特异性捕获抗体(一抗)，所述的7种病毒的捕获抗体(一抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；在基膜上还封装有3个阳性质控点P，点制为碱性磷酸酶标记的IgG和封装有3个阴性质控点，点制为pH＝9.2-9.8的碳酸盐缓冲液；
(2)洗涤后再加入相应的植物病毒检测抗体(二抗)杂交孵育，继续反应4h；
(3)洗涤后加入显色工作液显色；
所述的菊科植物病毒捕获抗体(一抗)分别为菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaicvirus，BYMV、南芥菜花叶病毒Arabis mosaic virus，ArMV、菜豆萎蔫病毒Broad bean wiltvirus，BBWV、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus，CMV、烟草脆裂病毒Tobacco rattlevirus，TRV、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus，TRSV和番茄斑萎病毒Tomato spottedwilt virus，TSWV捕获抗体(一抗)中的至少一种；
以IgG作为质控对照。
本发明的原理是：选取分别针对这7种病原的特异性捕获抗体(一抗)，以阵列模式固定在硝酸纤维素基膜上，利用捕获抗体(一抗)特异性结合样品中病原，再与碱性磷酸酶标记的检测抗体(二抗)反应，进而在阵列表面特异性形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”的双抗体夹心结构，随后利用碱性磷酸酶对应的特定显色底物显示杂交信号，建立一种可以一次同时检测7种病毒的高效、灵敏、简便的菊科植物病毒检测方法。
本发明购置相应检测病毒的阳性对照物及多克隆捕获抗体(一抗)，在7个相同的基膜上加入混合阳性对照物，以及混合检测抗体(二抗)，未见明显的非特异性交叉反应，确立了双抗体夹心法对每一种病毒的检测范围、最低检测限、精密度，成功构建了可用于样品筛查的多重抗体芯片检测系统。以种子和植物叶片提取液测试阵列对实际样品的检测能力，结果显示其阳性检出率优于或与ELISA相当，显示出良好的实用前景。
本发明的有益效果：本发明成功构建了检测菊科植物多种病毒的抗体芯片，可以高通量地对多个病原进行综合性检测，可用于菊科植物病毒病的检测监测，也可用于菊科植物抗病毒育种的研究，具有重要的研究意义及社会意义。相对现行的菊科植物病毒检测方法，本发明的抗体芯片和方法所具有的优势在于：(1)设备简易，操作便利，成本低；(2)能同时实现对多个待检样本的检测，可在一次实验中同时检测多至7种植物病毒，提高病毒病的诊断效率，节约人力、物力和财力；(3)检测样品处理简单，样品粗提液即可满足检测要求，检测过程不需要特殊仪器和熟练技能，适用于田间和现场检测；(4)具有与ELISA等方法同等的灵敏度、特异性，推广前景广阔。
附图说明
图1为实施例1抗体芯片的点阵结构示意图。
图中：N表示阴性质控；P表示阳性质控。
图2为实施例2抗体芯片特异性验证实验的检测结果显示图像。
图中：1：BYMV；2：ArMV；3：BBWV；4：CMV；5：TRV；6：TRSV；7：TSWV；8：水。
图3为实施例4抗体芯片同时检测7种病毒的验证结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：见图1，一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片，其特征在于，包括有基膜和在基膜上分别点制的危害菊科植物的7种病毒的特异性捕获抗体(一抗)，所述的7种病毒的捕获抗体(一抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；在基膜上还封装有3个阳性质控点P，点制为碱性磷酸酶标记的IgG和封装有3个阴性质控点N，点制为pH 9.2-9.8的碳酸盐缓冲液。
实施例2：所述的应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片的制备方法，其步骤为：
(1)抗体稀释：以捕获抗体(一抗)稀释缓冲液稀释7种多克隆捕获抗体(一抗)，稀释后的捕获抗体(一抗)浓度为抗体原液的1/18-1/3倍，即BYMV、ArMV、BBWV、CMV、TRV、TRSV和TSWV用于点样的抗体浓度依次为抗体原液的1:17、1:14、1:17、1:14、1:15、1:3和1:15倍，同时芯片上加1:10稀释的碱性磷酸酶标记驴抗山羊IgG原液作为芯片的阳性质控点，芯片点样液作为阴性质控点；点样缓冲液为：碳酸钠Na2CO31.59g，碳酸氢钠NaHCO32.93g，叠氮化钠NaN30.2g，双蒸水ddH2O 1000mL，pH 9.6；
(2)点样：将硝酸纤维素膜片印迹后，去离子水浸泡20min，37℃恒温箱中干燥20min。按芯片点阵，每种多克隆捕获抗体(一抗)重复点制2个点；分别针对7种病毒的捕获抗体(一抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒依次点在编号1-7的位置；在P和N的位置分别点阳性质控、阴性质控；
(3)将上述试剂按阵列排布点样于基膜表面，每点0.3uL，点间距0.2cm。点样完毕后，将抗体芯片置于湿盒中，湿度为45％，37℃固定30min；
(4)封闭：将固定好的抗体芯片用1％无蛋白封闭液37℃于湿盒中封闭1h，除去封闭液，2-8℃保存，即为抗体芯片成品。
实施例3：一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片试剂盒，其主要特点在于，包括有抗体芯片；7种病毒相对应的碱性磷酸酶标记的检测抗体(二抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；菊科植物病毒的阳性对照物，包括有菜豆黄花叶病毒的阳性对照物、南芥菜花叶病毒的阳性对照物、菜豆萎蔫病毒的阳性对照物、黄瓜花叶病毒的阳性对照物、烟草脆裂病毒的阳性对照物、烟草环斑病毒的阳性对照物、番茄斑萎病毒的阳性对照物；碱性磷酸酶；检测抗体(二抗)稀释缓冲液；洗涤缓冲液PBST；碱性磷酸酶显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/四唑硝基蓝。
实施例4：一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片试剂盒的检测方法，其主要特点在于步骤为：
(1)将检测样品与抗体芯片4℃隔夜孵育；所述的抗体芯片为包括有基膜和在基膜上分别点制的7种危害菊科植物的病毒的特异性捕获抗体(一抗)，所述的7种病毒的捕获抗体(一抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；在基膜上还封装有3个阳性质控点P，点制为碱性磷酸酶标记的IgG和封装有3个阴性质控点，点制为pH9.2-9.8的碳酸盐缓冲液；
(2)洗涤后再加入相应的植物病毒检测抗体(二抗)杂交孵育，继续反应4h；
(3)洗涤后加入显色工作液显色：
所述的菊科植物病毒捕获抗体(一抗)分别为菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaicvirus，BYMV、南芥菜花叶病毒Arabis mosaic virus，ArMV、菜豆萎蔫病毒Broad bean wiltvirus，BBWV、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus，CMV、烟草脆裂病毒Tobacco rattlevirus，TRV、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus，TRSV和番茄斑萎病毒Tomato spottedwilt virus，TSWV捕获抗体(一抗)中的至少一种；
以IgG作为质控对照。
实验例1：见图1，一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片，包括有基膜和在基膜上分别点制的危害菊科植物的7种病毒的特异性捕获抗体(一抗)，所述的7种病毒的捕获抗体(一抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；在基膜上还封装有3个阳性质控点P，点制为碱性磷酸酶标记的IgG和封装有3个阴性质控点，点制为pH 9.2-9.8的碳酸盐缓冲液。。
抗体芯片的制备：
(1)所用试剂
配制捕获抗体(一抗)稀释缓冲液(pH9.6)：碳酸钠Na2CO31.59g，碳酸氢钠NaHCO32.93g，叠氮化钠NaN30.2g，双蒸水ddH2O1000mL，作为芯片点样液；
硝酸纤维素膜：0.22μm(货号：66485，美国PALL公司)。
(2)制备抗体芯片
抗体稀释：以捕获抗体(一抗)稀释缓冲液稀释7种多克隆捕获抗体(一抗)，BYMV、ArMV、BBWV、CMV、TRV、TRSV和TSWV用于点样的抗体浓度依次为抗体原液的1:17、1:14、1:17、1:14、1:15、1:3和1:15倍，同时芯片上加1:10稀释的碱性磷酸酶标记驴抗山羊IgG原液作为芯片的阳性质控点，芯片点样液作为阴性质控点；
点样：将0.22μm硝酸纤维素膜片印迹后，去离子水浸泡20min，37℃恒温箱中干燥20min。按芯片点阵结构示意图，见图1，每种多克隆捕获抗体(一抗)重复点制2个点；分别将针对7种病毒的捕获抗体(一抗)：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒依次点在编号1-7的位置；在P和N的位置分别点阳性质控、阴性质控；
将上述试剂按阵列排布点样于基膜表面，每点0.3uL，点间距0.2cm。点样完毕后，将抗体芯片置于湿盒中(湿度为45％)37℃固定30min。
封闭：将固定好的抗体芯片用1％无蛋白封闭液37℃于湿盒中封闭1h，除去封闭液后，2-8℃保存，即为抗体芯片成品。
实验例2：一种应用于检测菊科植物病毒病的试剂盒，包含抗体芯片，所述的抗体芯片的检测对象包括BYMV、ArMV、BBWV、CMV、TRV、TRSV和TSWV；菊科植物病毒BYMV、ArMV、BBWV、CMV、TRV、TRSV和TSWV的阳性对照物；以及菊科植物病毒BYMV、ArMV、BBWV、CMV、TRV、TRSV和TSWV的碱性磷酸酶标记的检测抗体(二抗)。
主要组成如下：
(1)实验例1所制备的抗体芯片10张；
(2)七种病毒阳性对照物，特异性结合植物病毒的碱性磷酸酶标记的检测抗体(二抗)原液和显色底物：实验例1所述的7种病毒相应的检测抗体(二抗)原液各1管；检测抗体(二抗)的标记酶为碱性磷酸酶；
(3)检测抗体(二抗)稀释缓冲液：pH＝7.2-7.5，吐温-20质量含量为0.05％、BSA质量含量为0.2％的磷酸盐缓冲液，1瓶；
(4)洗涤缓冲液PBST(氯化钠NaCl 8.0g，磷酸氢二钠Na2HPO41.15g，磷酸二氢钾KH2PO40.2g，氯化钾KCl 0.2g，Tween-200.5mL，蒸馏水1000mL，pH＝7.4)，1瓶；
(5)显色底物：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/四唑硝基蓝(BCIP/NBT)和1×碱性磷酸酶显色缓冲液，1套。
实验例3抗体芯片检测目标病毒的特异性验证
将7种病毒的阳性对照物，分别用样品提取缓冲液[聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MW24000～40000)20.0g，Na2SO31.3g，NaN30.2g，卵清蛋白2.0g，Tween-2020.0mL，PBST1000mL，pH＝7.4]稀释，配制抗体芯片的测试样品液，用于抗体芯片检测；
1)样品杂交：将配好的测试样品，分别与制备好的抗体芯片于4℃下隔夜孵育；
2)洗涤：用洗涤缓冲液PBST洗膜，共4次，在水平摇床上以90r/min各洗涤1min；
3)检测抗体(二抗)孵育：以pH＝7.2-7.5，吐温-20质量含量为0.05％、BSA质量含量为0.2％的磷酸盐缓冲液稀释检测抗体(二抗)原液至1:600倍，配制同时含7种病毒特异性检测抗体(二抗)的混合液，加于芯片表面，在水平摇床上以30r/min继续振荡反应2-4h；
4)洗涤同2)；
5)显色：按BCIP:NBT:AP＝1:1:20的比例配制显色工作液，加于芯片表面，室温下反应20-30min；将显色完成后的膜片用水冲洗3-5次，使其变成紫黑色可目视检测的样点，然后于37℃干燥30min，待膜干燥后，用平板扫描仪获得检测图像，再将膜片用封口膜密封保存。
检测上述7种病毒的结果见图2。1-7分别为单独检测BYMV、ArMV、BBWV、CMV、TRV、TRSV和TSWV的阳性结果。结果显示，抗体芯片具有良好的特异性。
实验例4七种病毒抗体芯片检测方法建立
取7种病毒的阳性对照物，以样品提取缓冲液[聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MW 24000～40000)20.0g，Na2SO31.3g，NaN30.2g，卵清蛋白2.0g，Tween-2020.0mL，PBST 1000mL，pH＝7.4]稀释，随机混合模拟同时感染多种病毒的植物样品液。以ELISA法对各模拟感染的植物样品进行上述7种病毒的检测，同时以抗体芯片检测：
1)样品杂交：将配好的测试样品，分别与制备好的抗体芯片于4℃下隔夜孵育；
2)洗涤：用洗涤缓冲液PBST洗膜，共4次，在水平摇床上以90r/min各洗涤1min；
3)检测抗体(二抗)孵育：用pH＝7.2-7.5，吐温-20质量含量为0.05％、BSA质量含量为0.2％的磷酸盐缓冲液稀释检测抗体(二抗)原液至1:600倍，配制同时含7种病毒特异性检测抗体(二抗)的混合液，加于芯片表面，在水平摇床上以30r/min继续振荡反应2-4h；
4)洗涤同2)；
5)显色：按BCIP:NBT:AP＝1:1:20的比例配制显色工作液，加于芯片表面，室温下反应20-30min；将显色完成后的膜片用水冲洗3-5次，使其变成紫黑色的可目视检测的样点，然后于37℃干燥30min，待膜干燥后，用平板扫描仪获得检测图像，再将膜片用封口膜密封保存。
检测结果见图3，为抗体芯片法同时检测7种病毒，说明本发明的抗体芯片具有同时检测上述7种病毒的能力。以抗体芯片对20份模拟感染的样品累计共筛选出41项感染，与ELISA法的检测结果基本一致。
实验例5利用上述抗体芯片检测种子样品
收集50份菊科植物种子样品，种子中所携带的病毒已经经过血清学及RT-PCR方法确认。采用ELISA方法对这50份样品分别进行7种病毒的检测，同时应用抗体芯片对这些样品进行检测，检测步骤同实施例3。检测结果显示，抗体芯片法特异性较强，与ELISA方法的检测结果一致，其不仅具有单病毒检测能力，而且还具有一次实验同时检测多种病毒的能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片，其特征在于，包括有基膜和在基膜上分别点制的危害菊科植物的7种病毒的特异性捕获抗体，所述的7种病毒的捕获抗体：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；在基膜上还封装有3个阳性质控点P，点制为碱性磷酸酶标记的IgG和封装有3个阴性质控点N，点制为pH9.2-9.8的碳酸盐缓冲液。
2.如权利要求1所述的应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片的制备方法，其特征在于步骤为：
(1)抗体稀释：以捕获抗体稀释缓冲液稀释7种多克隆捕获抗体，稀释后的捕获抗体浓度为抗体原液的1/18-1/3倍，即BYMV、ArMV、BBWV、CMV、TRV、TRSV和TSWV用于点样的抗体浓度依次为抗体原液的1:17、1:14、1:17、1:14、1:15、1:3和1:15倍，同时芯片上加1:10稀释的碱性磷酸酶标记驴抗山羊IgG原液作为芯片的阳性质控点，芯片点样液作为阴性质控点；点样缓冲液为：碳酸钠Na2CO31.59g，碳酸氢钠NaHCO32.93g，叠氮化钠NaN30.2g，双蒸水ddH2O 1000mL，pH 9.6；
(2)点样：将硝酸纤维素膜片印迹后，去离子水浸泡20min，37℃恒温箱中干燥20min。按芯片点阵，每种多克隆捕获抗体重复点制2个点；分别针对7种病毒的捕获抗体：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒依次点在编号1-7的位置；在P和N的位置分别点阳性质控、阴性质控；
(3)将上述试剂按阵列排布点样于基膜表面，每点0.3uL，点间距0.2cm。点样完毕后，将抗体芯片置于湿盒中，湿度为45％，37℃固定30min；
(4)封闭：将固定好的抗体芯片用1％无蛋白封闭液37℃于湿盒中封闭1h，除去封闭液后，2-8℃保存，即为抗体芯片成品。
3.一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片试剂盒，其特征在于，包括有抗体芯片；7种病毒相对应的碱性磷酸酶标记的检测抗体：抗-菜豆黄花叶病毒、抗-南芥菜花叶病毒、抗-菜豆萎蔫病毒、抗-黄瓜花叶病毒、抗-烟草脆裂病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-番茄斑萎病毒；菊科植物病毒的阳性对照物，包括有菜豆黄花叶病毒的阳性对照物、南芥菜花叶病毒的阳性对照物、菜豆萎蔫病毒的阳性对照物、黄瓜花叶病毒的阳性对照物、烟草脆裂病毒的阳性对照物、烟草环斑病毒的阳性对照物、番茄斑萎病毒的阳性对照物；碱性磷酸酶；检测抗体稀释缓冲液；洗涤缓冲液PBST；碱性磷酸酶显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/四唑硝基蓝。
4.一种应用于检测菊科植物病毒病的抗体芯片试剂盒的检测方法，其特征在于步骤为：
(1)将检测样品与抗体芯片4℃隔夜孵育；所述的抗体芯片为权利要求1；
(2)洗涤后再加入相应的植物病毒检测抗体杂交孵育，继续反应4h；
(3)洗涤后加入显色工作液显色；
所述的菊科植物病毒捕获抗体分别为菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus，BYMV、南芥菜花叶病毒Arabis mosaic virus，ArMV、菜豆萎蔫病毒Broad bean wilt virus，BBWV、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus，CMV、烟草脆裂病毒Tobacco rattle virus，TRV、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus，TRSV和番茄斑萎病毒Tomato spotted wiltvirus，TSWV捕获抗体中的至少一种；
以IgG作为质控对照。
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