CN105324492A

CN105324492A - 用于dna和rna检测的双探针：反探针组合物

Info

Publication number: CN105324492A
Application number: CN201480030108.3A
Authority: CN
Inventors: 戴维·A·谢弗; 詹姆斯·L·默里; 胡培栩
Original assignee: Genetag Technology Inc
Current assignee: Genetag Technology Inc
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2014-03-26
Publication date: 2016-02-10
Also published as: CA2907866A1; WO2014160797A1; EP2978862A1; EP2978862A4; US20160010152A1

Abstract

提供放大和/或检测样本中多个靶基因的多探针系统和方法。多探针系统包括两个或多个探针，这些探针标记有相同和/或不同的标记物，同时用于检测属，种或基因的两个或多个相关标签序列。探针系统包括一个或多个探针，他们选自于iDDS探针，iDDS-2Q探针，MacMan探针，Flip探针，通用探针，半通用探针，ZIPR探针，及G-Force探针。探针侧翼通常有一对引物，一个引物，一个引物探针或者两个引物。在实时PCR中使用多探针系统有利于通过确认靶标检测和提供更强的信号强度来分析或/和诊断核酸序列。

Description

用于DNA和RNA检测的双探针：反探针组合物

相关技术的描述

通常运用杂交的方法，将标记的DNA探针与感兴趣的靶基因结合来检测目的基因的核酸序列。为了获得好的检测结果，在杂交后必须对杂交产物进行清洗以去除未结合及非特异性结合的探针。然而，在实时定量PCR的过程中(美国专利4965188；美国专利5210015；美国专利5487972；美国专利5538848)，无法进行洗涤。因此，必须设计出新的探针，这种探针与目的基因结合的时候，能选择性的发出信号。而当他们未结合或者游离在溶液中时，信号减弱或者淬灭。曾经使用过一种探针来达到这一目的。该探针能够在供体分子和受体分子之间，诸如两个荧光之间或荧光剂和淬灭剂之间，激发并转移荧光能量。(DidenkoV，2001，Biotechniques31：1106-1116，1118，1120-1121；Chenetal.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA30：94：10756-10762)。供体的荧光发射谱与受体的吸收或激发谱重叠，当受体和供体距离比较近时(10-100angstroms)，供体的激发态能量就转到受体分子上，这时，如果受体分子为荧光剂，就能激发长波长的信号。但如果受体分子为淬灭剂，荧光信号会显著减少甚至消失。

TAQMAN.RTM和分子信标探针常用于实时定量PCR检测。这两种探针都能作为内部探针，与一对引物结合，而这对引物又分别与目的基因序列侧翼结合。引物扩增靶基因片段，而探针选择性结合到一个标识序列之间，从而导致荧光信号增加。尽管这些探针的作用相似，但它们的检测机制不同。

TAQMAN.RTM探针由短的寡核苷酸构成，该寡核苷酸与靶序列互补。探针尾部标记荧光供体和受体(美国专利5538848)。通常荧光团例如荧光素与更长波长的荧光团(例如TAMRA的。R商标)或非荧光淬灭剂，如BLACKHOLEQUENCHER.RTM，配对。虽然TAQMAN：RTM专利已经过期，但仍然为实时PCR探针的主要技术。

分子信标探针也是利用荧光相互作用来检测PCR产物(美国专利5925517；Tyagietal.，1996，Nat.Biotechnology14：303-308)，但是，该探针的末端包含短互补序列，这些序列相互结合形成颈环结构。在此猝灭剂和荧光标记的末端距离很近，从而抑制荧光的产生。

SCORPION.RTM探针的检测机制也是发夹机制，不同的是该探针还具有spacer？并连接一段引物(Whitcombeetal，1999年，Nat.Biotechnol.17：804-807；美国专利6,326,145)。在未杂交时该探针保持荧光淬灭的发夹结构，但发生变性，退火，并与模板结合后，发夹结构打开，荧光信号得以释放。

类似于SCORPION.RTM，SUNRISE.RTM探针包含一段引物，该引物连接于发夹探针上，该探针扩增时延伸。这样就将淬灭剂同5’端的荧光剂分开(Nazarenkoetal.，1997，Nucl.AcidsRes.25：2516-2521)。

其它实时PCR探针包括：(a)双杂交探针(Wittweretal.，1997，BioTechniques22：130-138)。该探针涉及两个和模板互补且相连的荧光探针。其原理是两个相邻标记物之间荧光能量的转移；以及(b)LUX引物探针(Kusser，2006，MethodsMol.Biol.335：115-133)。该引物对中的一个引物3′端用荧光团标记。该引物自身折叠并与引物5’端的短序列互补，使荧光淬灭。的引物自猝灭通过折叠和结合到短互补序列已被附加到5′引物序列ùENCE的末端。

传统的双标探针在设计上要有选择性，并且价格昂贵，合成起来非常困难。合成后需要手工加入至少一种标记物并要求高压液相色谱纯化。TAQMAN.RTM和分子信标探针需要两个结合在探针两端的反向引物。为了在退火阶段有效发挥功能，TAQMAN.RTM和分子信标探针必须更长，Tm(熔融温度)比引物的Tm高5至10度，因为在延伸之前探针必须牢固结合在靶基因上。这些就导致难以设计和开发检测SNP(单核苷酸多态性)或单碱基突变的双荧光探针。因此，假阳性是一个共同的问题困难。

FISH(荧光原位杂交)的探针技术需要：1)标记的DNA探针，2)探针杂交到已固定的变性靶标上，3)严格洗涤未结合的探针，和4)荧光的激发和检测(BarchM.J，editor.TheACTCytogeneticsLaboratoryManual2^nded.NewYork：RavenPress；1991)。

基因芯片检测类似FISH检测。通常将寡核苷酸cDNA探针排列在载体基质上。将靶基因DNA或RNA用荧光标记后与探针杂交；经严格洗涤后进行检测，通常由激光扫描仪来检测(Schenaetal.，(1995)Science270：467-470；Helleretal.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.94：2150-2155)。与FISH技术相同，洗步骤复杂且耗时。更重要的是，准备和标记目的基因的价格昂贵，因为每个样本都是是独一无二的，因此，基于微阵列的检测技术在临床诊断上价值有限。

因此需要更有效和更可靠的探针来检测核酸。由于qPCR法容易出现假阳性和阴性，因此当这种技术应用于临床分子诊断时，可能导致对病人制定有害的治疗方案。尤其是当前的技术在多探针系统中还存在缺陷。多探针系统通过在一个分析系统中同时检测2个或者更多个诊断靶序列来弥补假阴性和假阳性的缺陷。本项发明能够满足这些长远的需求。

摘要

本发明提供的探针系统适合于实时和终点检测DNA或RNA序列，包括区分单个碱基变异，如SNP和点突变的探针。本公开中主要包括有效用于实时定量PCR(qPCR的)的探针系统。实时定量PCR就是将小片段基因以指数扩增，在扩增期间其频度由荧光信号来检测。本公开也提供多探针方法。在一个分析中联合使用2个或多个探针，靶向一个物种或基因中的两个或更多个标识序列，以改善检测的确定性和/或信号容量。当检测一个扩增子中两个或更多序列时，该技术就更有使用价值了。此外，本发明提供多探针系统的诊断成分。由于多探针系统在一个分析中检测多个相关目的序列中的优势，而在诊断特定疾病和癌症方面有更高的敏感性和可信赖性。这些探针系统可应用于研究，生物药学及生命科学中各种不同的方面。

尤为特别的是，目前的发明直指多探针系统，以改善实时定量PCR及其他扩增方法中检测一个属种，一个基因或者其他相关核酸靶序列时的荧光信号或者检测的可靠性。该探针系统包括：(1)两个或者多个与样本中2个或多个相关的标识序列互补的探针。探针与信号放大器有相同的标记物，或者不同的标记物以明确检测，或者同时有相同和不同的标记物。探针包含一个或多个探针：反探针系统，其从含有iDDS探针，iDDS-2Q探针，MacMan探针，Flip探针，通用探针(Universalprobes)，半通用探针(Half-Universalprobes)，ZIPR探针，和G-Force探针中选取。多探针系统也包括(2)两侧引物成分，包括2个引物，一个引物或一个引物探针，或者两个引物探针。

本发明也指向一个相关的多探针系统，包含一个或多个可替换的探针，这些探针来自TaqMan探针，分子信标探针(MolecularBeaconprobes)，Scorpion探针，LUX探针，Sunrise探针和双杂交探针(DualHybridizationprobes)。多探针系统中的探针可以被可替换探针所替代。

本发明也明确改善检测信号和/或检测可靠性的方法。这个方法包括获得人体，动物或者生物标本，用标记的探针接触生物标本，两侧引物的成分，当生物样本与标记探针结合时，检测标记物释放的信号。如果标记的探针包含相同的标记物时，信号被放大，改善了检测信号的强度。如果探针标记物不同，那么能对检测结果进行验证，因此改善了检测的可靠性，同样，如果同时标记相同或不同标记物时，能同时增加检测信号的强度和检测可靠性。

简要描述

图1.系统解释例1中的多探针系统，包括2个iDDS-2Q探针：同时应用反探针系统来靶向检测粪肠球菌中的vanA基因。一个探针(P1-2Q)靶向反义序列，另一个探针(P2-2Q)靶向正义序列。黑色圆形代表吸收荧光的淬灭剂。灰白色圆形代表不同颜色的荧光发射分子。在这一组合中，与双探针结合的2个模板序列位于模板两端引物标记的序列之内。在传统的杂交条件下，在qPCR的退火阶段，双淬灭剂标记的探针(iDDS-2Q)首先与完全匹配的模板结合，从而释放荧光信号。淬灭剂标记的反探针(AP1和AP2)的作用是阻止探针与错误匹配的模板结合。为达到这一目的，这种反探针将关闭那些没有正确结合到靶基因上的探针。另外，探针3’端上的第二淬灭剂也能消除所有未结合到靶基因上的探针的信号，从而进一步减少背景信号。因此，这些探针提供高敏感性荧光信号，并通过同时平行检测2个相关的靶标序列而不断验证检测的准确性。

图2.显示的是利用特异性iDDS-2Q探针对耐万古霉素的粪肠球菌vanA基因进行qPCR扩增所产生的荧光信号曲线图(参见图1中的方案1)。该曲线图来自于两个管子中样本的扩增。每管都有两个vanA探针。第一管是vanA阳性模板，曲线1和曲线2显示第一管样本的扩增和阳性信号图。第二管是vanB对照模板，两条扁平曲线表明检测不到vanB的扩增。需要注意vanA探针1标记由橘色荧光(CalFluorOrange560)，vanA探针2标记为红色荧光(CalFluorRed610)，探针1发出的信号高于探针2发出的信号。然而，2个阳性信号通常在qPCR循环中相同的时间点开始升高，因此他们的CT值相同。大部分qPCR仪器，通过调整其获得设置来平衡不同荧光发出的信号水平。在这种获得性调整的基础上进行大规模的验证性研究。即采用vanA双探针对182例院内标本进行检测以筛查vanA感染情况。结果是：采用双iDDS-2Q探针准确检测出24例阳性标本，用CT值检测的iDDS-2Q双探针的阳性信号是相同的。仪器检测的CT值相当接近(均差～0.32CT，大多数变种～0.6CT的差异)，又验证了这一结论。

图3示出在一个管内加入双iDDS-2Q探针通过qPCR生成的荧光曲线的另一个示例(类似于图1的方案)；在这种情况下，由一对引物扩增这两个探针位点。同样，两个探针标有不同的颜色的荧光，并且靶向阴道毛滴虫(T.vag.)重复性DNA序列中相邻的标识序列。阴道毛滴虫的检测是该类感染性疾病的诊断基础。曲线1和2表示含有T.vag阳性标本的2个阳性探针信号，而两个平曲线来自于含有人类基因组DNA的第二管对照样品。同vanA的测定相同，阳性曲线的高度不同，但CT值基本相同。在另一个大规模病例(n＝186)的验证研究中，27例样本中发现T.vag，且CT值仅差0.3CT(最大差异0.6)。双iDDS-2Q法的检测敏感性是标准显微镜下“液体涂片”的3倍，传统方法仅测出9例阳性标本。

图4A显示使用双iDDS-2Q探针的qPCR荧光曲线。该双探针特异性针对(a)EGFR21外显子L858R突变位点，或者(b)野生EGFRL858位点序列。每个探针标记不同荧光。曲线1显示用突变特异性探针检测含有100％L858突变样本的检测情况。尽管2中探针使用相同的引物对，但野生型探针(曲线2)并没有给出假阳性信号。因此，这种双探针法可明确分辨单碱基的差异。

图4B示qPCR荧光图谱。所用探针与图4A相同，但所用仪器不同。在这种情况下，在一个管子内将野生型EGFR和L858R突变型EGFR模板按50/50混合后，加入双探针上机运行检测。阳性曲线1和2在角度及高度上非常相似，而2个平坦曲线为完全相同的2个探针在以水为对照管的第二管中的检测情况。

图5A显示使用特异于野生型人类EGFR的双iDDS-2Q探针通过qPCR产生荧光曲线。探针1检测与肺癌相关的19号外显子的突变情况，探针2检测EGFR19号外显子缺失位点上游的参考序列的。每个探针标记不同的荧光，并且，他们在一个侧引物对标记的序列内。这是一个反向检测突变频率的方法，因为普通的探针不能检测靶基因上多个不同的缺失。探针1只检测野生型19号外显子，不能检测19号外显子缺失突变。已知与癌症相关的19号外显子通常表现为15号碱基的缺失，但9-24号碱基都有可能缺失。探针2，参考探针，检测EGFR所有扩增子，不管有无19号缺失。因此，探针1与探针2之间的信号比例就反映了样本中有19号外显子缺失的相对量。在图示样本中，双探针检测的是一个100％野生型EGFR样本，因此两条曲线是并行的。

图5B显示使用与图5A相同的探针通过qPCR产生两条荧光曲线。在这种情况下，反应体系中包含以50/50混合的野生型EGFR和19号缺失的EGFR模板。因此野生型样本的曲线较参考曲线低50％。此法能容易的检测含20-50％EGFR突变细胞的病人样本。

图5C.显示使用与图5A相同的探针通过qPCR产生两条荧光曲线。在这种情况下，反应体系中含有100％的EGFR缺失突变的模板。参考探针，探针1只正向检测EGFR缺失突变体模板，尽管突变体序列存在。与此相反，探针2显示了一个平坦的曲线，表示所有的扩增子都有突变，在诊断性突变位点上没有发现野生型序列。

图.6所示的使用两个探针对肠道病毒有诊断意义的5′非编码区(UTR)的iDDS-2Q探针，通过qPCR产生两种荧光曲线。将探针末端连接一对引物，这两对引物在靶序列上部分重叠，分别检测正义链和反义链。阳性曲线1和2反映的是用双探针对一个管中EV阳性样本的检测结果。两条平坦曲线反映的是用两个EV探针对另一个管中人类基因组DNA对照样品的检测情况。

图.7所示的使用特异于副肠孤病毒(parechovirus)的有诊断意义的5′非编码区(PV)的两个2iDDS-2Q探针，通过qPCR产生两种荧光曲线。曲线1，2反映用两个探针检测一个管中PV阳性样品的信号。两平坦曲线反映的是用两个PV探针在另一个管中检测人类基因组DNA对照样品的检测情况。

本公开中涉及的方法和系统的一些示例将在下面详细描述。通过检测本公开中描述的内容，图谱，实例及声明，本领域技术人员可对本发明的其他特征，目的，和优点了如指掌。它意在将所有其他系统，方法，特征和优点被包括在本说明书内，包括在本公开的范围内，并且由所附的权利声明来保护。

公开的详细描述

在参考文献中包含了本描述中引用的所有文献，专利及专利使用。但是应当理解的是，本公开并不限于所描述的特定实例，也不局限于所描述的方法和使用的材料，并且，由于该公开的使用范围仅受权利声明的限制而导致内容和方法有所不同。这里描述的每一个实例都其独特特征，这些特征可能与其他实例的特征不同或者相联系，但并不违背该公开的精神和范围。所有引用的方法可按照引用事件的顺序实施，或者以任何逻辑上可行的顺序实施。除非另有定义，否则这里所用的所有术语与分子生物学领域中普通技术人员所理解的含义相同。这也是可以理解的是，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不旨在进行限制，因为本公开的范围将由所附的权利要求来限定。

下列缩写：iDDS，内部的DNA检测开关；qPCR，定量PCR(实时PCR)；LNA，锁核酸；BNA，桥连核酸；Tm，解链温度；SNP，单核苷酸多态性；CT，循环阈值。

术语“一”，与术语“包括”在要求和/或说明书中一起使用时，可以指“一”，但也可指“一个或多个”，“至少一个”，以及“一个或一个以上的”。本发明的一些实例可以包括或基本上包括一个或多个元件，组件，方法步骤，和/或本发明的方法。可以预期的是任何方法，化合物，组合物，系统，或本文描述的设备可相对于任何其他方法，化合物，组合物，系统，或在本文描述的设备中实现。

术语“或”，在声明中是指“和/或”，除非明确“or”仅指替代或替代品与原品是相互排斥的。公开支持“or”仅指替代品，以及使用“和/或”。

术语″大约”一词是指一个数量值，无论是否明确指出，其包括整数，分数和百分数。术语“约”通常是指一个数值范围，例如，所引用的数值的+/-5-10％，即在本领域的普通技术人员将认为等同于所引用的数值，例如，具有相同的功能或结果。在一些情况下，术语“约”可包括四舍五入为最接近的数字.

术语“DNA扩增”和“扩增”是指任何通过酶扩增增加一个特定的DNA序列拷贝的方法。通常使用的方法是如美国专利号4,683,195和4,683,202中描述的聚合酶链反应(PCR)。

这里使用的“聚合酶链反应”和“PCR”是指在聚合酶的催化下以热循环的方式进行DNA扩增反应。DNA扩增反应需要核酸，与模板互补的寡核苷酸引物，热稳定性DNA聚酶，脱氧核糖核苷酸。

术语“qPCR”是指在PCR扩增过程中运用引物和标记的探针同时检测每个步骤产生的目的DNA分子数量的一种实时聚合酶链反应。

本文所用的术语“引物”指与被扩增或复制的DNA或RNA模板互补的寡核苷酸。引物与模板序列杂交或退火，并通过聚合酶来启动复制/扩增过程。

本文所用的术语“探针”是指长度可变的寡核苷酸。通过与靶基因杂交来检测相同，相似或互补的核酸序列。寡核苷酸探针通常被标记上可检测的物质如放射性，荧光或化学发光化合物。

本文所用的术语“荧光团”是指可以通过其发光特性而被检测到的任何报告基团。

本文所用的术语“淬灭剂”是指一种分子，它能够干扰或吸收由附近荧光团发射的荧光。

术语“互补”是指两个序列段之间有足够数量的匹配碱基存在，以便它们可以特异性结合或杂交。

术语“变性”是指通过热或变性剂处理，使双链DNA分离成为互补DNA单链。

本文所用的术语“杂交”是指两个核酸链通过氢键结合形成稳定的反向平行的双链体的过程。杂交链被称为“双链”。

术语“杂交亲和力”是指两个核酸片段间的化学亲和程度，取决于匹配的碱基对之间的结合，而杂交亲和力根据双链体的长度和序列的不同而有所变化。

本文所用的术语“错配碱基”是指在一个双链中，其中一个或多个反向核苷酸碱基与互补链不匹配。不匹配可能由于添加，缺失，或取代天然或非天然碱基，或间隔。

本文所用的术语“靶”和“靶核苷酸序列“是指期望检测的多核苷酸序列。

本文所用的术语“标签序列”是指一段靶核苷酸序列，该序列用以识别感兴趣的一个基因，物种，或有机体。

本文所用的术语“探针：反探针”指的是一对寡核苷酸序列，他们具有接近或者完全相同数量的碱基和具有基本互补的寡核苷酸序列。当缺失第三个可以杂交到探针或反探针的核苷酸序列时，所述寡核苷酸可以形成双链体。

本文所用的术语“系统”是指至少两种寡核苷酸的组合，他们选择性与靶核苷酸序列杂交，产生可检测的信号。该系统还包括引物，这些引物用与以聚合酶扩增靶核苷酸序列。

一般来说，所述多探针系统通常包括两个标记的寡核苷酸，一个探针和一个反探针，这些分子能够一起发挥作用。在最普通的组合中，探针序列与目标序列互补，反探针与探针序列互补，除了在非末端位置包括至少一个错配碱基的探针。反探针为探针的提供错误检查机制。大多数实施例中，探针通常用荧光发射剂标记，反探针通常用荧光调制剂标记，如猝灭剂，当然这种标记可以颠倒，其它物质如第二荧光团也可以作为荧光调制剂。在这样的实施方案中，当探针和反探针结合在一起时，标记物相互作用导致信号减弱，但是当探针与互补靶标结合时，荧光团信号增强。这个系统用于定量PCR的最常见的配置是iDDS探针，其中所述靶特异性探针是标记有荧光团的，反探针由淬灭剂标记，探针与侧引物对之间的序列靶序列结合。该探针的3′末端被封闭以阻止其延长。引物扩增靶片段，探针检测产生的扩增子，但对特定的靶序列具有高度特异性。在一个主要变型，iDDS-2Q探针中，荧光团标记的探针同时也标记有淬灭剂，以进一步减少背景信号。

这些iDDS探针系统可分辨仅相差一个碱基的两个靶序列。相应地，探针和反探针序列在溶液中有三个不同的杂交亲和水平：(i)是在探针和检测目标之间的第一高亲和力，(ii)探针和高探针之间的第二亲和水平。由错配置于反探针的位置和类型决定的。(iii)探针和错误靶基因间的第三亲和水平。这个错误的靶基至少含有一种碱基的错误。预期杂交亲和力水平是由计算预期双链体的Tm与ΔG来评估。

另一个探针：反探针系统是一个ZIPR探针。在ZIPR探针中，探针的3′末端未被阻塞并且它作为一个引物-探针，取代扩增反应中的一个引物。当引物-探针结合到扩增子，阻止反探针结合并激发荧光信号。然而，另一个探针：反探针系统是一个Flip探针。在一个Flip探针系统内，反探针与一个引物连接，这种变化产生线性而非S型实时PCR扩增曲线。另一个探针：反探针的系统，称为MacMan探针，探针的5′端用荧光团标记并在3′末端包括一个与靶序列不互补的尾序列，用淬灭剂标记的反探针与探针的尾序列互补。另一个探针：反探针系统，称为Universal探针，探针和反探针是通用的，并且包含与靶序列不互补的序列。靶模板首先在连接引物的作用下延伸，连接引物的序列与通用探针的3′末端匹配。探针则作为通用引物探针，可以放大和标记由连接引物产生的扩增子。与之相关的一个称为HalfUniversal探针系统中，探针5′端标记通用的荧光团，3′引物端与靶标互补。淬灭剂标记的反探针与探针5′的通用序列互补。另一个探针：反探针系统，称之为G-Force的探针，一个寡核苷酸序列按顺序包括：5′端荧光标记富含C段；一个垫片，能够吸收荧光的富含G的片段，该片段作为反探针；和3’引物片段。当浮动时，富含C-和G-片段折叠并结合在一起，减弱荧光信号。然而，当探针作为引物时，其被整合到扩增子内，从而使富含C和富含G的片段解离，而释放荧光信号。

长度，序列和错配成分的位置被设计和构造成：(1)探针与待测目标杂交亲和性要高于探针与反探针的亲和力，如Tm高4度或更高，ΔG高2个或更多千卡/摩尔(2)探针与反探针的亲和性比探针与错误靶标的亲和力高(Tm高4度或更高，ΔG高2个或更多千卡/摩尔)。然而，当探针/待测靶标双链体和探针/不正确的靶双链之间固有的热力学差异是有限的时候，所述探针也可以受内在的错配而修饰，优先放置于离预期变异的单个碱基大约两个碱基的位置。由于探针不匹配与序列不匹配比较相近(SNP或感兴趣的单碱基突变体)，该探针的修饰能减少探针和不正确的靶标之间的杂交亲和力，由于这些不同的热力学设计，探针：反探针系统可以区别单碱基变异体，能够在各种杂交条件及解链温度中识别这种不同，尤其适用于实时PCR。

本公开的组合物和探针系统提供敏感而又特异的DNA或RNA靶序列的检测方法，特别是用于评估实时PCR(qPCR)扩增检测的PCR产物。本公开的初级实施案例包括qPCR的多探针系统，或其他扩增方法，以改善检测属，种，基因或其它相关核酸靶时的信号和或可靠性。在初级系统中包括两个或更多同时工作的探针，这些探针和检测样本中两个或多个相关的标签序列互补；所述系统包括两个侧翼引物组件，包括两种引物和两个引物-探针，两个引物中一个是引物，一个是引物-探针。与这个系统中，多个探针可以包含相同的标记；其中信号可以被放大并避免假阴性。

或者，所述多个探针包括不同的标记；其中能确认检测到相关目标并避免假阴性。随着这个初级多探针系统的应用，用于一个或多个探针的探针技术选自以下组别，包括：iDDS探针，iDDS-2Q探针，MacMan探针，翻转探测器，通用探针，半通用探针，ZIPR探针和G-Force的探针。先前公开的所有这些探针系统都由使用者公开过，包括美国专利No.8,076,067题为探针：反探针组合物和检测DNA或RNA的方法；美国出版社No.20120058474，名为探针：反探针组合物和检测DNA或RNA的方法；欧洲专利申请No.07836913.9和国际App.No.PCT/US2007018167题为探针：反探针组合物和检测DNA或RNA的方法；临时申请US系列61号/534925题为探针：反探针组成的高特异性的DNA或RNA检测；国际App.No.PCT/US2012/55077题为探针；反探针的组合物高特异性DNA或RNA的检测，和非临时申请US系列第14号/216413题为探针：反探针的组合物高特异性DNA或RNA的检测，并且通过引用并入本文。

本发明的实施例描述了基于iDDS探针，ZIPR探针和半通用探针的qPCR多探针系统。简言之，iDDS探针：反探针系统通常包括荧光团标记与预定目标互补的探针，和淬灭剂标记的反探针，反探针与探针互补，但不与在非末端位置有错配碱基的探针互补。该探针的3′末端被阻断，以防止延伸，并且反探针既提供信号功能，高特异性及错误检查机制。一对侧翼引物用于扩增含有靶向特异性的探针序列。在PCR反应的退火步骤，探针将优先结合一个正确的目标，发出荧光，或者结合于反探针，而使荧光熄灭。在这两种情况下，该系统避免了结合和检测一个密切相关的但不正确的序列的目标。一个iDDS-2Q探针是变体iDDS探针，其中所述探针还标记有淬灭剂。这种变化降低背景，提高了信号。

ZIPR探针和半通用探针也基于探针：反探针结构，但它们只适合于检测诸如实时PCR的扩增。ZIPR探针结构类似于iDDS探针和反探针，不同的是探针的3′末端没有被阻塞而作为一个引物。当ZIPR探针整合到扩增子，释放荧光信号。半通用探针是引物-探针，它们基于通用探针的原理，包括一个通用探针，反探针和一个连接引物。这个引物通过通用序列来延伸扩增子，而这个通用序列又能与通用探针结合。半通用探针与通用探针是相似的，因为它采用了一个通用的序列能同时与标记的探针和反探针结合。然而，探针的3′末端由靶特异性引物的序列来延伸。再次引物-探针掺入扩增子并释放荧光信号。半通用探针较ZIPR探针具有经济优势，因为它们使用一个通用的反探针。

在本发明的一个实施例中，一种多探针系统，在实时PCR或其它扩增方法中改进检测一个属，种，基因或其它相关靶核酸的信号和/或可靠性，该系统包括：(i)两个或更多个探针与样品中两个或多个相关的特征序列互补，所述探针具有相同标记以放大信号或具有不同的标记以或同时具有相同和不同的标记；在此该探针包括一个或多个探针：反探针系统，其选自的系统包括：iDDS探针，iDDS-2Q探针，MacMan探针，Flip探针，通用探针，半通用探针，ZIPR探针，和G-Force探针；和(ii)两侧翼的引物组份含有两种引物，一种引物或一种引物-探针，或两个引物-探针。

在本实施例中，该系统还包括一个或者更多的替换探针，其中包括TaqMan探针，分子信标探针，Scorpion探针，LUX探针，Sunrise探针和双杂交探针；或者，其中一种探针，包括该系统被备用探针所取代。尽管这些探针系统常规使用并可被多种组合应用，即在一个试管中进行两个单独的试验，但还没有使用两个或更多的探针，在单个扩增子中检测的两个或更多相关靶向序列。

在本实施例中的探针或反探针还可包括一种或多种合成核苷酸。例如，该合成核苷酸是LNA或BNA核苷酸。此外，一个或多个探针可以被配置为在目标检测中依次或分开使用。

在本实施例的多探针系统是适合于实时PCR或其它扩增方法，在检测一个属，种，基因或其它相关靶核酸时，改善信号和或可靠性。检测到的相关的靶序列可以是在相同的靶扩增子的相同链或相反链，在不同的扩增子，或在靶基因或物种的不同的片段。更好的信号越强越有价值。该技术的主要价值在于它能够分别检测两个或更多的密切相关的并且确认靶基因或种类存在的“标签”序列。这种能力对临床诊断非常重要，因为临床诊断中假阳性和假阴性的测试是常见的，他们需要昂贵的随访来明确诊断的准确性。多目标检测可以克服一种现象，即所关注目标在低频率和弱阳性信号的情况下被解释为假阳性。此外，多目标检测也可以克服假阴性，因为如果基因或物种存在，错过所有靶序列是不可能的。至少生成两个信号在临床诊断上特别有价值，相比于重新测试或者做出错误的治疗产生的高成本来讲，使用两个探针所增加的成本是微不足道的。

因此，在另一个本发明的实施案例中，提供了一种用于改进检测一个属，种，基因或其它相关靶核酸的信号和/或可靠性的方法，所述方法包括：从人类，动物或生物获得生物样品的步骤；将生物样品同标记的探针的和侧翼引物组件包含本文所描述的多探针系统混合；检测标记的探针和生物样品中的靶标结合时发出的信号；如果所有探针都标记相同的标记物，信号被放大，从而提高了检测靶标的荧光信号；如果探针由不同的标记物标记，可确认检测结果，从而提高检测靶标的可靠性；或它们组合检测。在本实施例中，探针依次或分开检测多个靶序列。

在这些实施方案中，采用多探针系统检测所选基因或物种的两个或多个相关的标签序列，包括：耐万古霉素肠球菌(VRE)的vanA基因，VRE的VanB基因，阴道毛滴虫的重复序列(GenBank：L23861.1)，EGFR858突变位点中，EGFR外显子19缺失位点，肠道病毒或副肠孤病毒或其组合的5’UTR区，人乳头瘤病毒16(HPV-16)的L1基因，人乳头瘤病毒18(HPV-18)的L1基因，流感A的HA基因或者B型流感的NS1基因或其组合，人T细胞受体切除环(TREC)的DNA，HIV-1的Gag和Pol基因，以及人类的异柠檬酸脱氢酶基因IDH1和IDH2外显子4的突变位点。

在这些实施案例的一个方面，相关的标签序列是vanA基因核酸序列，GenBank登录号No.M97297.1，探针系统包括一对侧翼引物，该引物特异性结合于vanA的编码区(CDS)，该区域大约从核苷酸7316至7381，及从7438到7488。或探针系统包含有两个iDDS探针：反探针，这些探针特异靶向vanACDS区，该区域大约从核苷酸7368至7413，及7407至7451；或探针系统由侧翼引物及探针：反探针系统。因此，该系统将扩增和检测耐万古霉素肠球菌vanA基因的两个不同的靶位点。

在这个方面，选择用于扩增和/或检测vanA基因的核酸序列(GenBank登录No.M97297.1)的引物和探针可以包括：正向引物GATATTCAAAGCTCAGCAATTTGT(SEQIDNO：5)，反向引物，TAGCTGCCACCGGCCTA(SEQIDNO：6)，第一iDDS探针，CTCCCGCCTTTTGGGTTATTAA(SEQIDNO：1)，第一iDDS反探针，TTAATAACCCAAATGGCGGGAG(SEQIDNO：2)，第二iDDS探针，CGCAACGATGTATGTCAACGA(SEQIDNO：3)和第二iDDS反探针，TCGTTGACATACCTCGTTGCG(SEQIDNO：4)；其中所述探针标记有荧光团或同时标记荧光团和淬灭剂，反探针标记有淬灭剂。

在另一个方面，相关的标签序列是vanB基因核酸序列，其GenBank登录号No.CP003351.1，该系统包括一对侧翼的引物，特异靶向vanB编码区序列(CDS)，该区域大约从核苷酸2839810至2840049，及2839810至2840049，或包括两个iDDS探针：反探针系统。该探针特异靶向到vanBCDS区，该区域大约从核苷酸2839878至2839958，及从2839936至2839995；或包括一对侧翼引物和两个iDDS探针：反探针组成。因此，该系统将扩增和检测抗万古霉素肠球菌的vanB基因的两个不同的靶位点。

在本公开的该方面，用于扩增和/或检测的vanB基因的核酸序列(GenBank登录No.CP0033551.1)引物和探针包括：正向引物，CAAATCACTGGCCTACATTCTTAC(SEQIDNO：11)，反向引物，CAGCGTTAAGTTCTTCCGTACC(SEQIDNO：12)，第一iDDS探针，ATCGCCGTTCCCGAATTTC(SEQIDNO.7)，第一iDDS反探针，GAAATTCGGGAACGGCCAT(SEQIDNO：8)，第二iDDS探针，CGCCTCCGGCTTGTCAC(SEQIDNO：9)，和第二iDDS反探针，GTGACAAGCCGGTGGCG(SEQINNO：10)；其中，所述探针标记有荧光团或同时标记有荧光团和淬灭剂，和反探针标记有淬灭剂。

在本公开的又一个方面，相关的标签序列是阴道毛滴虫(T.vag.)重复核酸，GenBank登录号No.L23861.1，该系统包括一对特异靶向T.vag的序列的侧翼引物，该区域大约从核苷酸580至639，及从678至737；或含两种特异靶向T.vag序列的iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸623至659，从645至686；或包括一对侧翼引物和两个iDDS探针：反探针。因此，该系统将放大和检测滴虫的重复核酸序列两种不同的靶位点。

在本公开的该方面，用于扩增和/或检测的T.vag.重复核酸序列(GenBank登录号L23861.1)的引物和探针可以包括：正向引物，AATTTCCGTTTAATTTCATGGTC(SEQIDNO：17)，反向引物，TTYGTGTCTCGTGCCATAGTC(SEQIDNO：18)，第一iDDS探针，TCCTCGGAGTCTTTGAATCGG(SEQIDNO：13)，第一iDDS反探针，CCGATTCATAGACTCCGAGG(SEQIDNO：14)，第二iDDS探针，ACCAAGAATGGTGTAACTCGACCT(SEQIDNO：15)，和第二iDDS反探针，AGGTAGAGTTACACCATTCTTGGT(SEQIDNO：16)；其中，所述探针标记有荧光团或同时标记荧光团和淬灭剂，反探针标记有淬灭剂。

在又一个方面，相关的标签序列是野生型(WT)的EGFR核酸序列或/和L858R突变的EGFR核酸序列，GenBank登录号No.NW-004078029.1。该系统包括一对特异性识别EGFRDNA序列的侧翼引物，该区域大约从核苷酸55207745至约55207805，从55207824至约55207884；或包含两个特异性识别野生型或突变的EGFR序列的iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸55207792至约55207832；或包括一对侧翼引物和两个iDDS探针：反探针。因此，该系统将扩增和检测野生型EGFR和L858REGFR突变体。

在这个方面，选择用于扩增和/或检测人类野生型(WT)和/或L858R突变的EGFR核酸序列(GenBank登录No.NM-005228.3)的引物和探针包括：正向引物，GAAAACACCGCACGATGTC(序列IDNO：23)，反向引物，CTGCATGGTATTCTTTCTCTTCC(SEQIDNO：24)，WTiDDS探针，AGCAGTTTGGGCAGCCCAA(SEQIDNO：19)，一个WTiDDS反探针，TTGGGCTGGCCTAACTGCT(SEQIDNO：20)，一种突变iDDS探针，AGCAGTTTGGGCCGCCC(SEQIDNO：21)，并和一种突变iDDS反探针GGGCGGGCCAAACGGCT(SEQIDNO：22)；其中，所述探针标记有荧光团的或同时标记荧光团和淬灭剂，反探针标记有淬灭剂。所述iDDS探针可选择性的含有一个或多个合成的碱基以增强结合力，如LNAs或BNAs。

在又一个方面，相关的标签序列是人类EGFR基因组19号外显子缺失的突变体序列和相邻的参考序列(GenBank登录号NW-004078029.1)。所述系统包括一对能特异性识别EGFR序列的侧翼引物，该区域大约从核苷酸55242321至55242414和55242489-55242537；或包括两个特异性识别野生型EGFR或缺失突变体靶序列的iDDS探针：反探针，该区域大约从核苷酸55242412至55242444，从55242458至55242489。因此，该系统将扩增并检测参考序列和EGFR缺失突变体。

在这个方面，选择用于扩增和/或检测人类WTEGFR和/或EGFR缺失突变体的序列(GenBank登录No.NW-004078029.1)的引物和探针包括：正向引物，GGTAACATCCACCCAGATCA(SEQIDNO：29)，反向引物，CATCGAGGATTTCCTTGTTG(SEQIDNO：30)，第一iDDS探针，CTCTGGATCCCAGAAGGTGAGA(SEQIDNO：25)，第一iDDS反探针，TCTCTCCTTCTGGGATCCAGAG(SEQIDNO：26)，第二iDDS探针，CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC(序列IDNO：27)，和第二iDDS反探针，GATGTTGCCTCTCTTAATTCCTTG(SEQIDNO：28)；其中，所述探针标记有荧光团或同时标记有荧光团和淬灭剂，反探针标记有淬灭剂。

在又一个方面，相关的标签序列是肠道病毒(EV)(GenBank登录No.HQ728259.1)或副肠孤病毒(PV)(GenBank登录No.EF051629.2)的5’-UTR区。所述系统包括一对特异靶向EVDNA的侧翼引物，靶向区域的核苷酸从约446至约487和从约583至约642，和一对特异靶向PVDNA的侧翼引物，该特异靶向区域从约核苷酸420至约461和从约核苷酸641至约680。或两个iDDS探针：反探针系统，该探针特异于EV序列，该区域的EV序列从约核苷酸527至约603，或两个iDDS探针：反探针系统，该探针特异于PV序列，该区域大约从核苷酸530至590和从556至约616或其组合。因此，该系统扩增并检测EV和PV5′UTRs两个不同的靶标位点。

在这个方面，用于扩增和/或检测EV或PV核酸序列的5′UTR(GenBank登录号分别为Nos.HQ728259.1和EF051629.2，)的引物和探针包括：一个正向EV引物，CCCCTGAATGCGGMTAAT(SEQIDNO：35)，反向EV引物，RATTGTCACCATAAGCAGCCA(SEQIDNO：36)，第一EViDDS探针，CGGAACCGACTACTTTGGGTG(SEQIDNO：31)，第一EViDDS反探针，CACCCAATGTAGTCGGTTCCG(SEQIDNO：32)，第二EViDDS探针，AAACACGGACACCCAAAGTAGTCG(SEQIDNO：33)，和第二EViDDS反探针，CGACTACTTTGGTTGTCCGTGTTT(SEQIDNO：34)，PV正向引物，GGCCAAAAGCCAAGGTTTA(SEQIDNO：41)，PV反向引物，TTGGCCCACTAGACGTTTTT(SEQIDNO：42)，一个第一PViDDS探针，CACTATGGATCTGATCTGGGGC(SEQIDNO：37)，一个第一PViDDS反探针，GCCCCAGATCAGATCCTTAGTG(SEQIDNO：38)，一个第二PViDDS探针，CGGGTACCTTCTGGGCATC(SEQIDNO：39)，和一个第二PViDDS反探针，GATGCCCTGAAGGTACCCG(SEQIDNO：40)；其中，所述探针由荧光团标记或同时标记有由荧光团和淬灭剂，反探针标记有淬灭剂。

在又一个方面，相关的标签序列是人乳头瘤病毒16(HPV16)L1基因核酸序列(GenBank登录No.EU430688.1)，包括一对特异于的L1CDS侧翼引物，该核苷酸区域大约从938至1020，从1077至1155；或包括两个特异于L1CDS的iDDS探针：反探针系统，该核苷酸区域大约从1020至1050，从1032至1063或其它们的组合。因此该系统扩增和检测的HPV-16L1基因两个不同的靶位点.

在这个方面，选择用于扩增和/或检测的HPV16L1基因的核酸序列(GenBank登录No.EU430688.1)的引物和探针包括：一个正向引物，GGTTACCTCTGATGCCCAAATA(SEQIDNO：47)，一个反向引物，TTTCTGAAGTAGATATGGCAGCAC(SEQIDNO：48)，第一iDDS探针，CGAGCACACGGGCCACAAT(SEQIDNO：43)，第一iDDS反探针，ATTGTGGTCCTGTGCTCG(SEQIDNO：44)，第二iDDS探针，GGTTACCCCAACAAATGCCA(SEQIDNO：45)，和第二iDDS反探针，TGGCTTTTGTTGGGGTAACC(SEQIDNO：46)；其中，在所述探针标记有荧光团或同时标记有荧光团和淬灭剂，反探针标记有淬灭剂。

在又一个方面，相关的标签序列是人乳头瘤病毒18(HPV18)L1基因核酸序列(GenBank登录No.EU834744.1)，包括一对特异于HPV18CDS的侧翼引物，该区域大约从核苷酸1032到1103，从1196至1287，或两个特异于HPV18的CDSiDDS探针：反探针系统，该核苷酸区域大约从1098至1160，从1125至1185或他们两者的组合。因此，该系统扩增和检测的HPV-18L1基因两个不同的靶位点。

在这个方面，选择用于扩增和/或检测的HPV18L1基因的核酸序列(GenBank登录号EU834744.1)的引物和探针包括：一个正向引物，TGTTACCTCTGACTCCCAGTTG(SEQIDNO：53)，反向引物，TTGCCCAGGTACAGGAGACT(SEQIDNO：54)，第一iDDS探针，GGTTACATAAGGCACAGGGTCATAAC(SEQIDNO：49)，第一iDDS反探针，GTTATGACCCTGTCCCTTATGTAACC(SEQIDNO：50)，第二iDDS探针，TTGATTATGCCAGCAAACACCA(SEQIDNO：51)，以及第二iDDS反探针，TGGAGTTTGCTGGCATAATCAA(SEQIDNO：52)；其中，所述探针被荧光团标记或同时标记有荧光团和淬灭剂，反探针标记有淬灭剂。

在又一个方面，相关的标签序列是A型或B型流感核酸序列，所述系统包括四组侧翼引物和相关iDDS探针：反探针，包括(i)第一组，一对特异于H1N1季节性流感A血凝素(HA)(GenBank登录No.CY069381.1)CDS的侧翼引物，在该区域大约从核苷酸25至95，从225至295；和一个特异于HACDS的iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸185到245；(ii)第二组，一对特异于2009年甲型H1N1大流行流感A(GenBank登录No.FJ969540.1)的HACDS的侧翼引物，在该区域大约从核苷酸878至938，从971至1061，和一个特异于HACDS的iDDS探针：反探针系统，该区域的大约从核苷酸920至980；(iii)第三组，特异于H3N2流感A(GenBank登录No.CY120904)的HACDS的一对侧翼引物，该区域的大约从核苷酸285至345，从370至约430，和一个特异于HACDS的iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸329至389；和(iv)第四组，特异于B型流感(GenBank登记No.JQ034241.1)的NS1CDS的一对侧翼引物，该区域核苷酸从大约770至830，从约892至约952，和一个特异于HACDS的iDDS探针：反探针系统，该区域的核苷酸从约831至约891。因此，这个系统将扩增和检测H3N2的HA基因、季节性和2009年大流行H1N1流感毒A株和流感病毒B的NS1基因上的不同位点。

在这个方面，选择用于扩增和/或检测流感A或B的核酸序列的引物和探针包括：第一组正向引物，GCTACCATGCTAACAACTCGC(SEQIDNO：57)，第一组的反向引物，TCGCATTCTGGGTTTCC(SEQIDNO：58)，第一组iDDS探针，TTGGGTAACTGCAGCGTTGC(SEQIDNO：55)，第一组iDDS反探针，GCAACGCAGCAGTTACCCAA(SEQIDNO：56)，第二组的正向引物，ATAAACACCAGCCTCCCATT(SEQIDNO：61)，第二组的反向引物，GTGGCCAGTCTCAATTTTGT(SEQIDNO：62)，第二组iDDS探针，TCCGATCACAATTGGAAAATGTC(SEQIDNO：59)，第二组iDDS反探针，GACTTTTTCCAATTGTGATCGGA(SEQIDNO：60)，第三组正向引物，CCTTTTTGTTGAACGAAGCA(SEQIDNO：65)，第三组的反向引物，TCATTGTTAAACTCCAGTGTGC(SEQIDNO：66)，第三组iDDS探针，TATGATGTGCCGGATTATGCCT(SEQIDNO：63)，第三组iDDS反探针，AGGCATAATCCGGCTCATCATA(SEQIDNO：64)，第四组的正向引物，GTCAAGAGCACCGATTATCAC(SEQIDNO：69)，第四组的反向引物，CAACCATGTCAGCTATTATGGAG(SEQIDNO：70)，第四组iDDS探针，CCGTGACCAGTCTAATTGTCTCC(SEQIDNO：：67)，和第四组iDDS反探针，GGAGACATTTAGACTGGTCACGG(SEQIDNO：68)；其中，所述探针被荧光团标记或同时标记荧光团和淬灭剂，反探针标记有淬灭剂。

在又一个方面，相关的标签序列是来源于人14号染色体的T细胞受体切除环(TREC)(GenBank登录No.NW-004078079.1)，所述系统包括一对特异于TREC序列的侧翼引物，该区域大约从核苷酸3941495至3941555，从3853115至3853175，或两个特异于TREC序列的iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸3941545至3941580，从3853091至3853120，或其他结合。该系统将因此扩增和检测TRECDNA两种不同的靶位点。

在这个方面，用于扩增和/或检测从人14号染色体DNA的切除衍生的T细胞受体切除环(TREC)核酸序列(GenBank登录No.NW-004078079.1)的引物和探针包括：一个正向引物，TTCAACCATGCTGACACCTC(SEQIDNO：75)，反向引物，CAGCTGCAGGGTTTAGGC(SEQIDNO：76)，第一iDDS探针，TTGTAAAGGTGCCCACTCCTGT(SEQIDNO：71)，第一iDDS反探针，ACAGGAGTGGGCTCCTTTACAA(SEQIDNO：72)，第二iDDS探针，TGCAGGTGCCTATGCATCAC(SEQIDNO：73)，和第二iDDS反探针，GTGATGCTTAGGCACCTGCA(SEQIDNO：74)；其中，所述探针标记有荧光团或同时标记有荧光团和淬灭剂，反探针标有淬灭剂。

在又一个方面，相关的标签序列是人类免疫缺陷病毒(HIV)的Gag的核酸序列(GenBank登录No.JX244938.1)和人免疫缺陷病毒(HIV)聚合酶的核酸序列(GenBank登记No.KC462191.1)，所述系统包括特异于GagCDS的侧翼引物，该区域大约从核苷酸790至850，特异于GagCDS第一半通用探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸729至789，一个特异于PolCDS的侧翼引物，该区域大约从核苷酸1423至约1483，以及特异于PolCDS的第二半通用探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸1305至1365或其组合。因此，该系统扩增和检测HIV的Gag和Pol基因的靶位点。

在这个方面，选择用于扩增和/或检测人免疫缺陷病毒(艾滋病毒)的Gag和Pol基因核酸序列(GenBank登录号分别为Nos.JX244938.1和KC462191.1)的引物和探针包括：一个Gag引物，ATGCTGACAGGGCTATACATTCTT(SEQIDNO：79)，一个Pol引物，AGGGGTCGTTGCCAAAGAGTGAT(SEQIDNO：81)，一个的Gag半通用探针，CTACGTAGACTAGACGTTCACCTATCCCAGTGGGAGAGAT(SEQIDNO：77)，一个Pol半通用探针，CTACGTAGACTAGACGTTCCAGAGCAGACCAGAGCCA(SEQIDNO：80)，和一个半通用反探针，GAACGTCTAGTCTACGTAG(SEQIDNO：78)；其中，所述探针被荧光团标记或同时标记有荧光团和淬灭剂，反探针标记有淬灭剂。

在又一个方面，相关的特征序列是在人IDH1点突变(GenBank登录No.NT-005403.17)或IDH2基因(GenBank登录No.NC-000015.9)，所述系统包括特异于IDH1DNA的一对侧翼引物，该区域大约从核苷酸59322435至59322519，从59322545至59322614，特异于IDH2DNA的一对侧翼引物，该区域大约从核苷酸90631711至90631770，从90631981至90632040，或特异于IDH1突变的两个iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸59322510至59322550，或在IDH2序列，大约从核苷酸90631818至约核苷酸90631857或它们的组合。

在这个方面，用于扩增和/或检测IDH1或IDH2基因(GenBank登录号分别Nos.NT-005403.17和NC-000015.9)两个点突变的引物和探针包括：IDH1正向引物，GGCTTGTGAGTGGATGGGTA(SEQIDNO：86)，反向IDH1引物，AAAACATGCAAAATCACATTAT(SEQIDNO：87)，第一突变IDH1iDDS探针，CATAGGTCATGATGCTTATGGGGA(SEQIDNO：82)，第一突变IDH1iDDS反探针，TCCGCATAAGCATGATGACCTATG(SEQIDNO：：83)，第二突变IDH1iDDS探针，CCATAAGCATGACAAGCTATGATG(SEQIDNO：84)，第二突变IDH1iDDS反探针，CATCATAGGTTGTCTTGCTTATGG(SEQIDNO：85)，一个正向IDH2引物，CACTATTATCTCTGTCCTCA(SEQIDNO：92)，一个反向IDH2引物，AGACAAGAGGATGGCTA(SEQIDNO：93)，第一突变IDH2iDDS探针，CCATTGGCAAGGACGCCC(SEQIDNO：88)，第一突变IDH2iDDS反探针，GGGCGTGCTTGCCTATGG(SEQIDNO：89)，第二突变IDH2iDDS探针，CCATTGGCATGGACGCCC(SEQIDNO：90)，和第二突变IDH2iDDS反探针，GGGCGTGCATGCCTATGG(SEQIDNO：91)；其中，所述探针被荧光团标记或同时标记荧光团和淬灭剂，反探针标有淬灭剂。第1突变IDH1探针选择性加有一个或多个增强结合的核苷酸，例如LNA以及BNAS。

在又一个方面中，至少一个相关的标签序列选自下列一组基因或物种，包括(1)KRAS外显子2，密码子12或密码子13或同时含有两个突变位点(GenBank登录号No.NM-004985)(2)BRAF基因密码子600的突变位点(GenBank登录号No.NM-004333.4)(3)铜绿假单胞菌algD基因(GenBank登录号No.CP000438)(4)洋葱伯克霍尔德氏菌复合recA基因(GenBank登录号No.NC-018513.1)(5)嗜麦芽糖寡养单胞菌23S基因(GenBank登录号No.NC-015947)(6)无色物种OXA-114样基因(GenBank登录号No.EU188842.1)(7)金黄色葡萄球菌的femA基因(GenBank登录号No.CP003194)(8)金黄色葡萄球菌mecA基因(GenBank登录号AB033763.2)，(9)鸟分枝杆菌复合的基因间的间隔区基因(GenBank登录号No.L07855.2)或龟分枝杆菌(GenBank登录编号.DQ866771.1)或两者，和(10)脓肿分枝杆菌(MCAG)间隔区的基因(GenBank登录号：HG313848.1)。

在这个方面，相关的标签序列是人KRAS基因的参考序列和人KRAS基因外显子2，密码子12或13的突变相邻序列，所述系统包括：特异于KRAS基因序列的侧翼引物，该区域大约从核苷酸144到204，ZIPR参考探针特异于野生型KRAS序列，该区域核苷酸从231至291，和特异于假定密码子12或13突变体序列的WTiDDS探针，该区域大约从核苷酸205至230。因此，此系统利用参考ZIPR探针扩增和检测扩增子，并用WTiDDS探针评估突变区域的单碱基突变的相对频率。

此外，在这个方面，选择用于扩增和/或检测一个参考序列和人KRAS基因的外显子2密码子12或13(GenBank登录No.NM-004985)相邻区域突变体的引物和探针，包括：正向引物，CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAA(SEQIDNO：92)，一个iDDS探针，CCTACGCCACCAGCTC(SEQIDNO：93)，一个iDDS反探针，GAGGTGGTGGCGTAGG(SEQIDNO：94)，一个ZIPR探针，TGGATCATATTCGTCCACAAAA(SEQIDNO：95)，和一个ZIPR反探针，TTTTGAGGACGAATATGATCCA(SEQIDNO：96)；其中所述iDDS探针用荧光团或同时标记有用光团和淬灭剂，iDDS反探针标记有淬灭剂，ZIPR探针标记有荧光团，ZIPR反探针标记有淬灭剂。所述iDDS探针选择性加有一个或多个有增强结合作用的合成核苷酸，例如LNA以及BNAS。

在又一个方面，相关的标签序列是人BRAF基因的密码子600的突变位点或者BRAF基因的WT参照序列或两者都有，所述系统包括一对特异于BRAF序列的侧翼引物，该区域大约从核苷酸1785至1844，从1876至1935，V600E突变的iDDS探针和WTiDDS探针在该区域的大约从核苷酸1845至1875。因此，该系统使用WTiDDS探针检测所有扩增子，用V600E突变的iDDS探针和评估突变的相对频率。

在这个方面，选择用于扩增和/或检测的WT序列和人BRAF基因密码子600相邻突变区域(GenBank登录号No.NM-004985)的引物和探针包括：引物，TGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTG(SEQIDNO：97)和CCACAAAATGGATCCAGACA(SEQIDNO：98)，突变iDDS探针，AGCTACTGAGAAATCTCGATGG(SEQIDNO：99)，突变iDDS反探针，CCATCGAGATTTCTGTGTAGCT(SEQIDNO：100)中，WTiDDS探针，CAACTCATCACGGAGCTCATG(SEQIDNO：：101)，和WTiDDS反探针，CATGAGCTGCGTGATGTGTTG(SEQIDNO：102)；其中，所述探针被荧光团标记或同时标记有荧光团和猝灭剂，反探针标记有淬灭剂。所述iDDS探针任选有一种或多种合成的核苷酸与增强的结合，如LNAs或BNAS。iDDS探针选择性的加有一个或多个有增强结合作用的核苷酸，例如LNA以及BNAS。

在又一个方面，相关的标签标记序列是与囊性纤维化相关的至少一种细菌物种，所述系统包括八个集合侧翼引物或相关iDDS探针：反探针系统或两者都有，其包含(i)第一组的一对特异于铜绿假单胞菌ALGD基因的侧翼引物(GenBank登录号No.CP000438.1)，该区域大约从核苷酸1595235至1595294，从1595355至1595414或特异于铜绿假单胞菌ALGD基因的iDDS探针：抗系统，该区域大约从核苷酸1595295至1595354或它们的组合；(ii)第二组的一对特异于洋葱伯克霍尔德氏菌复合recA基因(GenBank登录号No.NC-018513)的侧翼引物，大约从核苷酸869329至869388，从869460至869519或的特异于洋葱伯克霍尔德氏菌复合物recA基因的iDDS探针：抗系统，该区域大约从核苷酸869389至869448或它们的组合；(iii)第三组的一对特异于嗜麦芽糖寡养单胞菌23S基因(GenBank登录号No.NC-015947)的侧翼引物，该区域大约从核苷酸368121至368180，从368216至368275，或特异于嗜麦芽糖寡养单胞菌23S基因的iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸368179至368215，或它们的组合；(iv)第四组的一对特异于无色杆菌属物种OXA-114样基因(GenBank登录号No.EU188842.1)的侧翼引物，大约从核苷酸230至289，从350至409，或特异于无色杆菌属物种OXA-114样基因的iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸290至349或它们的组合；(v)第五组的一对特异于金黄色葡萄球菌的femA基因(GenBank登录号No.CP003194.1)的侧翼引物。该区域大约从核苷酸1410168至1410227，从1410228至1410347，或特异于金黄色葡萄球菌的femA基因的iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸1410228至1410287或它们的组合；(vi)第六组的一对特异于金黄色葡萄球菌的femA基因(GenBank登录号No.AB033763.2)的侧翼引物，该区域核苷酸约从31680至31739，从31800至31859，或特异于金黄色葡萄球菌的femA基因的iDDS探针：反探针系统，大约从核苷酸31740至约31799或其组合；(vii)第七组的一对特定鸟分枝杆菌复合的基因间的间隔区基因(GenBank登录号No.L07855.2)的侧翼引物，该区域大约从核苷酸15至74，从135至194，或一个特异于鸟分枝杆菌复合的基因间的间隔区基因的iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸75至134或其组合；及(viii)第八组的一对通用侧翼引物，该引物特异于两个分枝杆菌间隔区基因(GenBank登录号No.DQ866771.1)，该区域大约从核苷酸1461至1520，从1571至1630，该引物也特异于脓肿分枝杆菌基因间的间隔区基因(GenBank登录号No.HG313848.1)，该区域大约从核苷酸26至85以及从146至205，或一个特异于龟分枝杆菌基因间的间隔区基因的iDDS探针：反探针系统，该区域大约从核苷酸1521至1570，或特异于脓肿分枝杆菌基因间的间隔区基因的iDDS探针：抗系统，该区域大约从核苷酸86至145或其组合。因此，该系统将检测一个或多个通常与囊性纤维化相关的细菌。

在本公开的另一个方面，选择用于扩增和/或检测通常与囊性纤维化相关的至少一个细菌种类的引物和探针包括：第一组正向引物，CGGGGCTCGTAGTAACG(SEQIDNO：103)，第一组的反向引物，CGACATAGCCCAAACCAAA(SEQIDNO：104)，第一组iDDS探针，TGAATGCGATGCGAATCAGC(SEQIDNO：105)，第一组iDDS反探针，GCTGATTCGCTTCGCATTCA(SEQIDNO：106)，第二组的正向引物，GGCTCGATCAAGAAGAACGA(SEQIDNO：107)，第二组的反向引物，GACGATCTTCGCCTGCAC(SEQIDNO：108)，第二组iDDS探针，CGTTCCGCGAAGCGATCT(SEQIDNO：109)，第二组iDDS反探针，AGATTGCTTCGCGGAACG(SEQIDNO：110)，第三组的正向引物，CAGAGYGTTTTCCTAGAACCA(SEQIDNO：111)，第三组的反向引物，GTATCCTGCAGTGAATACATAGCTG(SEQIDNO：112)，第三组iDDS探针，ACCAGGTTCGCTTCCAGCA(SEQIDNO：113)，第三组iDDS反探针，TGCTGGTAGCGAACCTGGT(SEQIDNO：114)，第四组的正向引物，GAGCCGGTCTGGAACTACC(SEQIDNO：115)，第四组的反向引物，TGGTGTAGCGCTGGAAGC(SEQIDNO：116)，第四组iDDS探针，CGCTGGATCAAGTATTCGGTGG(SEQIDNO：117)，第四组iDDS反探针，CCTCCGAATACTTGATCCAGCG(SEQIDNO：118)，第五组的正向引物，ACAGATAGCATGCCATACAGTCA(SEQIDNO：119)，第五组的反向引物，GCAGAAGTAAGCAAGCTGCAA(序列号：120)，第五组iDDS探针，CACGCAAACTGTTGGCCACT(SEQIDNO：121)，第五组iDDS反探针，AGTGGCTAACAGTTTGCGTG(SEQIDNO：122)，第六组的正向引物，CTACGGTAACATTGATCGCAAC(SEQIDNO：123)，第六组的反向引物，TTTCAATATGTATGCTTTGGTCTTTC(SEQIDNO：124)，第六组iDDS探针，TGCATCCTGGAATAATGACGC(SEQIDNO：125)，第六组iDDS反探针，GCGTCCTTATTCCAGGAATGCA(SEQIDNO：126)，第七组的正向引物，GGAGCACCACGAAAAGCA(SEQIDNO：127)，第七组的反向引物，ATGGAGGGACTCCACACG(SEQIDNO：128)，第七组iDDS探针，CAACAGCAAATGATTGCCAGAC(SEQIDNO：129)，第七组iDDS反探针，GTCTGGAAATCATTTGCTGTTG(SEQIDNO：130)，第八组的正向引物，CTTTCTAAGGAGCACCATTTCC(SEQIDNO：131)，第八组的反向引物，YATCCACGGGGTGGACAG(SEQIDNO：132)，第八组龟分枝杆菌iDDS探针，TCTGTAGTGGTTACTCGCTTGGTG(SEQIDNO：：133)，第八组龟分枝杆菌iDDS反探针，CTTCAAGCGAGTAACCACTACAGA(SEQIDNO：134)，第八组脓肿分枝杆菌iDDS探针，GAATGAACTAGGGAACATAAAGTAGGCA(SEQIDNO：135)，和第八组脓肿分枝杆菌iDDS反探针，TGCCTACTTTTAGTTCCCTAGTTCATTC(SEQIDNO：136)；其中，所述探针标记有荧光团和任选的淬灭剂，反探针标记有淬灭剂。

在又一个方面中，两个或多个相关的标签序列在相同的基因或物质中，其中所述探针技术选自iDDS探针，iDDS-2Q探针和MacMan探针，所述系统配置用于终点检测并同步确认。

以下示例提供本领域常见的技术，并完整公开和描述如何实施本公开和声明中所涉及的方法及如何使用本文公开和声明中所涉及的探针成分和组合。除非另有说明，温度用℃表示。

示例1

使用iDDS探针以实时PCR的方法检测VancomycinA(VA)耐药肠球菌(vanAVRE)

每个试管含有包含目标的vanA基因区段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板，或从临床样品中提取的DNA。按照以下序列制备标记探针，反探针s，及引物，并以所示的终浓度来应用：

VA探针1：FAM-CTCCCGCCTTTTGGGTTATTAA-BHQ1(SEQIDNO：1)200nM，

VA反探针1：TTAATAACCCAAATGGCGGAG-BHQ1(SEQIDNO：2)150nM，

VA探针2：CFR610-CGCAACGATGTATGTCAACGA-BHQ2(SEQIDNO：3)200nM，

VA反探针2：TCGTTGACATACCTCGTTGCG-BHQ2(SEQIDNO：4)150nM，

VA正向引物：GATATTCAAAGCTCAGCAATTTGT(序列号：5)300nM，并

VA反向引物：TAGCTGCCACCGGCCTA(SEQIDNO：6)300nM。

此方法的方案和定量PCR结果会在FIGS.1-2中显示和讨论。

循环的条件：在Mx3005p仪器(Stratagene公司)实施实时PCR技术。在20ul反应体系中加入HOTSTART-ITPROBERTMqPCR预混液(USB，INC)(2x)及1微升的25mMMgcl₂。为引发热启动条件下，将管加热至95℃5分钟，随后进行60个循环的两步PCR(在95℃变性15秒，60℃退火/延伸1分钟)。

例2

采用iDDS探针以实时PCR的方法检测万古霉素B(VB)耐药肠球菌(vanBVRE)

每个试管含有一个包含靶向vanB基因区段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板，按下列序列和标记制备探针，反探针和引物，并按所示的终浓度来使用：

VB探针1：FAM-ATCGCCGTTCCCGAATTTC(SEQIDNO：7)200nM，

VB反探针1：GAAATTCGGGAACGGCCAT-BHQ-1(SEQIDNO：8)400nM，

VB探针2：CFR610-CGCCTCCGGCTTGTCAC(SEQIDNO：9)200nM，

VB反探针2：GTGACAAGCCGGTGGCG-BHQ2(SEQIDNO：10)400nM，

VB正向引物：CAAATCACTGGCCTACATTCTTAC(SEQIDNO：11)在200nM，并

VB反向引物：CAGCGTTAAGTTCTTCCGTACC(SEQIDNO：12)200nM以下。

循环条件：实时PCR按示例1中所述进行，除了在58℃的退火/延伸步骤1分钟，2步PCR50个循环。

例3

使用iDDS以实时PCR的方法检测探针阴道毛滴虫(T.vag)的重复DNA

每个试管含有包含T.vag.靶基因片段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板，或从临床样品中提取的DNA。按以下序列和标记来制备探针，反探针及引物，并以所指示的终浓度来应用：

T.vag.探针1：TET-CCTCGGAGTCTTTGAATCGG-BHQ-2(SEQIDNO：13)200nM，

T.vag.反探针1：CCGATTCATAGACTCCGAGG-BHQ-2(SEQIDNO：14)100nM，

T.vag.探针2：ROX-ACCAAGAATGGTGTAACTCGACCT-BHQ-2(SEQIDNO：15)200nM，

T.vag.反探针2：AGGTAGAGTTACACCATTCTTGGT-BHQ-2(SEQIDNO：16)100nM，

T.vag.正向引物：AATTTCCGTTTAATTTCATGGTC(SEQIDNO：17)300nM

T.vag.反向引物：TTYGTGTCTCGTGCCATAGTC(SEQIDNO：18)，在300nM的。

循环条件：实时PCR如示例1中所述，但常用50个循环的2步PCR，qPCR结果和讨论会在图3中出现。

例4

使用iDDS探针以实时PCR的方法检测在人表皮生长因子受体(EGFR)基因的L858R突变点

每个试管含有包含靶基因片段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板，按下列序列及标记制备探针，反探针，及引物。并按所示的终浓度使用：

EGFR858探针1：Q670-AGCAGTTTGGGCAGCCCAA-BHQ-2(SEQIDNO：19)250nM，

EGFR858反探针1：TTGGGCTGGCCTAACTGCT-BHQ-2(SEQIDNO：20)500nM，

EGFR的858探针2：FAM-AGCAGTTTGGGCCGCCC-3IABkFq(SEQIDNO：21)200nM，

EGFR858反探针2：GGGCGGGCCAAACGGCT-BHQ-1(SEQIDNO：22)在400nM，

EGFR858正向引物：GAAAACACCGCAGCATGTC(SEQIDNO：23)在200nM，

EGFR858的反向引物：CTGCATGGTATTCTTTCTCTTCC(SEQIDNO：24)200nM。

循环条件：实时PCR如示例1中描述，所不同的是50个循环的2步PCR，58℃退火/延伸步骤1分钟。所述的qPCR结果在图4A和图4B进行讨论。

例5

使用iDDS探针以实时PCR的方法检测人表皮生长因子受体(EGFR)19外显子缺失(D19)

每个试管含有包含靶向EGFR基因片段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板，按以下序列和标记制备探针，反探针及引物，并按所示的终浓度使用：

D19探针1：Q670-CTCTGGATCCCAGAAGGTGAGA-BHQ-2(SEQIDNO：25)200nM，

D19反探针1：TCTCTCCTTCTGGGATCCAGAG-BHQ-2(SEQIDNO：26)400nM，

D19探针2：FAM-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC(SEQIDNO：27)200nM，

D19反探针2：GATGTTGCCTCTCTTAATTCCTTG-BHQ-1(SEQIDNO：28)400nM，

D19的正向引物：GGTAACATCCACCCAGATCA(SEQIDNO：29)200nM，

D19的反向引物：CATCGAGGATTTCCTTGTTG(SEQIDNO：30)200nM。

循环条件：实时PCR如示例1中描述，所不同的是50个循环的2步PCR进行，54℃1退火/延伸1分钟。结果野生型模板和和19缺失模板的qPCR结果在图5A-5C中展示和讨论。

例6

使用iDDS探针以实时PCR的方法检测艾柯病毒(EV)和副肠孤病毒(PV)的5′非翻译区域

所使用的模板为包含靶基因片段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸，或EV的cDNA。按以下序列和标记制备探针，反探针及引物，并按所示的终浓度使用：

EV探针1：Q670-CGGAACCGACTACTTTGGGTG-BHQ-2(SEQIDNO：31)200nM，

EV反探针1：CACCCAATGTAGTCGGTTCCG-3BHQ-2(SEQIDNO：32)400nM，

EV探针2：FAM-AAACACGGACACCCAAAGTAGTCG-IABkFQ(SEQIDNO：33)200nM，

EV反探针2：CGACTACTTTGGTTGTCCGTGTTT-IABkFQ(SEQIDNO：34)400nM，

EV正向引物：CCCCTGAATGCGGMTAAT(SEQIDNO：35)200nM，

EV反向引物：RATTGTCACCATAAGCAGCCA(SEQIDNO：36)200nM，

PV探针1：CFO560-CACTATGGATCTGATCTGGGGC-BHQ-1(SEQIDNO：37)200nM，

PV反探针1：GCCCCAGATCAGATCCTTAGTG-IABkFQ(SEQIDNO：38)400nM，

PV探针2：CFR610-CGGGTACCTTCTGGGCATC-BHQ-2(SEQIDNO：39)200nM，

PV反探针2：GATGCCCTGAAGGTACCCG-IABkRq(SEQIDNO：40)400nM，

PV正向引物：GGCCAAAAGCCAAGGTTTA(SEQIDNO：41)200nM，

PV反向引物：TTGGCCCACTAGACGTTTTT(SEQIDNO：42)200nM。

循环条件：实时PCR如示例1中所述，除了40次循环2步PCR，64℃退火/延伸1分钟。EV和PV检测结果图6-7中展示。

例7

使用iDDS探针以实时PCR的方法检测人乳头瘤病毒16(HPV-16)的L1基因

每个管中含有包含靶向HPV16基因片段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板，按以下序列和标记制备探针，并按所示的终浓度使用：

探针1：FAM-CGAGCACAGGGCCACAAT(SEQIDNO：43)200nM，

反探针1：ATTGTGGTCCTGTGCTCG-BHQ-1(SEQIDNO：44)400nM，

探针2：CFR610-GGTTACCCCAACAAATGCCA(SEQIDNO：45)200nM，

反探针2：TGGCTTTTGTTGGGGTAACC-BHQ-2(SEQIDNO：46)400nM，

HPV16正向引物：GGTTACCTCTGATGCCCAAATA(SEQIDNO：47)200nM，并

HPV16反向引物：TTTCTGAAGTAGATATGGCAGCAC(SEQIDNO：48)200nM

循环条件：实时PCR按示例1中所述，除了在58℃退火/延伸1分钟，2步PCR50个循环。

例8

使用iDDS探针以实时PCR的方法检测人乳头瘤病毒18(HPV-18)的L1基因

每个管中含有包含靶向HPV18基因片段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板，按以下序列和标记制备探针，反探针及引物，并按所示的终浓度使用：

HPV18探针1：FAM-GGTTACATAAGGCACAGGGTCATAAC(SEQIDNO：49)200nM，

HPV18反探针1：GTTATGACCCTGTCCCTTATGTAACC-BHQ-1(SEQIDNO：50)400nM，

HPV18探针2：CFR610-TTGATTATGCCAGCAAACACCA(SEQIDNO：51)200nM，

HPV18反探针2：TGGAGTTTGCTGGCATAATCAA--BHQ-2(SEQIDNO：52)400nM，

HPV18正向引物：TGTTACCTCTGACTCCCAGTTG(SEQIDNO：53)200nM，并

HPV18反向引物：TTGCCCAGGTACAGGAGACT(SEQIDNO：54)200nM。

循环条件：实时PCR按示例1中所述，除了在58℃的退火/延伸1分钟，2步PCR50个循环。

例9

采用iDDS探针以实时PCR检测季节性(SEAS)或2009年流感大流行(PDM)甲型H1N1流感，H3N2甲型流感(H3N2)，或乙型流感(FLUB)

iDDS探针靶向甲型流感基因组的血凝素(HA)基因片段的标签位点，或者靶向乙型流感基因组中的非结构蛋白1(NS1)。每个管中含有包含靶向流感A或B基因片段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板。按以下序列和标记制备探针，并按所示的终浓度使用：

SEAS探针：FAM-TTGGGTAACTGCAGCGTTGC(SEQIDNO：55)200nM，

SEAS反探针：GCAACGCAGCAGTTACCCAA--BHQ-1(SEQIDNO：56)400nM，

SEAS正向引物：GCTACCATGCTAACAACTCGAC(SEQIDNO：57)200nM，

SEAS反向引物：TCGCATTCTGGGTTTCC(SEQIDNO：58)200nM。

PDM探针：CFO560-TCCGATCACAATTGGAAAATGTC(SEQIDNO：59)200nM，

PDM反探针：GACTTTTTCCAATTGTGATCGGA-BHQ-2(SEQIDNO：60)400nM，

PDM正向引物：ATAAACACCAGCCTCCCATT(SEQIDNO：61)200nM，

PDM反向引物：GTGGCCAGTCTCAATTTTGT(SEQIDNO：62)200nM。

H3N2探针：CFR610-TATGATGTGCCGGATTATGCCT(SEQIDNO：63)200nM，

H3N2反探针：AGGCATAATCCGGCTCATCATA-BHQ-2(SEQIDNO：64)400nM，

H3N2正向引物：CCTTTTTGTTGAACGAAGCA(SEQIDNO：65)200nM，

H3N2反向引物：TCATTGTTAAACTCCAGTGTGC(SEQIDNO：66)200nM。

FLUB探针：Q670-CCGTGACCAGTCTAATTGTCTCC(SEQIDNO：67)200nM，

FLUB反探针：GGAGACATTTAGACTGGTCACGG-IABkRq(SEQIDNO：68)400nM，

FLUB正向引物：GTCAAGAGCACCGATTATCAC(SEQIDNO：69)200nM，并

FLUB反向引物：CAACCATGTCAGCTATTATGGAG(SEQIDNO：70)200nM。

在同一管包含所有四个探针和反探针，含有流感A或流感B的模板。循环条件：实时PCR按示例1中所述，除了58℃的退火/延伸1分钟，50个循环2步PCR。

例10

使用iDDS探针以实时PCR的方法检测重症复合免疫缺陷患者中的T细胞受体删除环(TRECs)

每管含有包含靶向TREC基因片段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板，或含有从临床样品中提取的DNA。按以下序列和标记制备探针，反探针及引物，并按所示的终浓度使用：

TREC探针1：FAM-TTGTAAAGGTGCCCACTCCTGT(SEQIDNO：71)200nM，

TREC反探针1：ACAGGAGTGGGCTCCTTTACAA--BHQ-1(SEQIDNO：72)400nM，

TREC探针2：的Cy5-TGCAGGTGCCTATGCATCAC(SEQIDNO：73)200nM，

TREC反探针2：GTGATGCTTAGGCACCTGCA-3IABkRq(SEQIDNO：74)400nM，

TREC正向引物：TTCAACCATGCTGACACCTC(SEQIDNO：75)200nM，并

TREC反向引物：CAGCTGCAGGGTTTAGGC(SEQIDNO：76)200nM。

同一管包含两个探针和反探针。

循环条件：实时PCR按示例1中所述，除了58℃退火/延伸1分钟，2步PCR50个循环。

例11

使用半通用探针以实时PCR的方法检测人类免疫缺陷病毒(HIV)的Gag和Pol基因。

每管包含在靶向艾滋病毒基因片段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板。按以下序列和标记制备探针，反探针及引物，并按所示的终浓度使用：

Gag探针：FAM-CTACGTAGACTAGACGTTCACCTATCCCAGTGGGAGAGAT(SEQIDNO：77)80nM，

半通用反探针：GAACGTCTAGTCTACGTAG-BHQ-1(SEQIDNO：78)320nM，

Gag引物：ATGCTGACAGGGCTATACATTCTT(SEQIDNO：79)80nM，

Pol探针：CY3-CTACGTAGACTAGACGTTCCAGAGCAGACCAGAGCA(SEQIDNO：80)80nM，和

Pol引物：AGGGGTCGTTGCCAAAGAGTGAT(SEQIDNO：81)80nM，

同一管中含有两个半通用探针和反探针。

循环条件：PCR反应按示例1中所述，不同之处在于50个循环3步PCR的进行，使用的是变性步骤为95℃15秒，退火步骤为58℃30秒，延伸步骤为72℃30秒。

例12

采用iDDS探针以实时PCR的方法检测人类的异柠檬酸脱氢酶基因IDH1或IDH2的点突变

每个试管含有包含目标IDH1或IDH2基因区段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸模板，按以下序列和标记制备探针，反探针及引物，并按所示的终浓度使用：

突变IDH1iDDS探针1：FAM-CATAGGTCATGATGCTTATGGGGA-BHQ1(SEQIDNO：82)200nM，

突变IDH1iDDS反探针1：TCCGCATAAGCATGATGACCTATG-BHQ1(SEQIDNO：83)200nM，

突变IDH1iDDS探针2：CFR610-CCATAAGCATGACAAGCTATGATG-BHQ2(SEQIDNO：84)150nM，

突变IDH1iDDS反探针2：CATCATAGGTTGTCTTGCTTATGG-BHQ2(SEQIDNO：85)400nM，

IDH1正向引物：GGCTTGTGAGTGGATGGGTA(SEQIDNO：86)200nM，

IDH1反向引物：AAAACATGCAAAATCACATTAT(SEQIDNO：87)200nM。

突变IDH2iDDS探针1：FAM-CCATTGGCAAGGACGCCC-BHQ1(SEQIDNO：88)150nM，

突变IDH2iDDS反探针1：GGGCGTGCTTGCCTATGG-BHQ1(SEQIDNO：89)400nM，

突变IDH2iDDS探针2：CFR610-CCATTGGCATGGACGCCC-BHQ2(SEQIDNO：90)150nM，

突变IDH2iDDS反探针2：GGGCGTGCATGCCTATGG-BHQ2(SEQIDNO：91)400nM，

IDH2的正向引物：CACTATTATCTCTGTCCTCA(SEQIDNO：92)200nM，并

IDH2反向引物：AGACAAGAGGATGGCTA(SEQIDNO：93)200nM。

第1突变IDH1探针选择性地包括一种或多种有增强结合作用的核苷酸，例如LNAs以及BNAs。

循环条件：实时PCR如示例1中所述，但退火/延伸步骤的温度设定在50-62℃变化，持续1分钟，具体使用什么温度取决于同一管中采用哪种探针组合。

应当强调的是，本公开中强调的实施例，尤其是“优选”的实施例，仅是实施的可能示例，仅仅是为了能够清晰理解本公开内容的原理。在不脱离本公开的精神和原则的基础上，可以对上述实施例(多个)进行改变和修改。本公开包括所有这些修改和变化，并且本公开受以下权利要求所保护。

Claims

1.多探针系统，其用于在实时PCR或其它扩增方法中改善属、种、基因或其它相关核酸靶标的检测中的信号发出和/或可靠性，所述系统包括：

(i)两个或更多探针，其与样品中两个或更多相关标签序列互补，所述探针具有作为信号放大器的相同标记，或具有用于确认检测的不同标记，或既具有相同标记又具有不同标记；其中，所述探针包括一个或更多选自由以下组成的组的探针：反探针系统：iDDS探针，iDDS-2Q探针，MacMan探针，Flip探针，通用探针，半通用探针，ZIPR探针，和G-Force探针；和

(ii)两个侧翼引物组分，其包括两个引物，一个引物或一个引物-探针，或两个引物-探针。

2.权利要求1的多探针系统，其中所述探针或反探针还包括一个或更多合成核苷酸。

3.权利要求2的多探针系统，其中所述合成核苷酸是LNA或BNA核苷酸。

4.权利要求1的多探针系统，其中所述系统还包括选自由以下组成的组的一个或更多备选探针：TaqMan探针，分子信标探针，Scorpion探针，LUX探针，Sunrise探针和双杂交探针；或者其中所述系统包含的一个探针被所述备选探针替代。

5.权利要求1的多探针系统，其中所述两个或更多相关标签序列选自由以下组成的基因或物种的组：耐万古霉素肠球菌(Enterococcus)(VRE)的vanA基因，VRE的vanB基因，GenBank：L23861.1的阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)特异性重复序列，EGFR858突变位点，EGFR外显子19缺失位点，肠道病毒(Enterovirus)或副肠孤病毒(Parechovirus)的5′UTR区或其组合，人乳头瘤病毒16(HPV-16)的L1基因，人乳头瘤病毒18(HPV-18)的L1基因，流感A的HA基因或者流感B的NS1基因或其组合，人T细胞受体切除环(TREC)的DNA，HIV-1的Gag和Pol基因，和人异柠檬酸脱氢酶基因IDH1和IDH2外显子4突变位点。

6.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是GenBank登录号M97297.1的vanA基因核酸序列，所述系统包括：在大约核苷酸7316至大约核苷酸7381的区域和在大约核苷酸7438到大约核苷酸7488的区域中特异于vanA编码区序列(CDS)的一对侧翼引物，或在大约核苷酸7368至大约核苷酸7413的区域和在大约核苷酸7407至大约7451的区域中特异于vanACDS的两个iDDS探针：反探针系统，或其组合。

7.权利要求6的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：5所示的正向引物序列，和

SEQIDNO：6所示的反向引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：1所示的第一iDDS探针序列，

SEQIDNO：2所示的第一iDDS反探针序列，

SEQIDNO：3所示的第二iDDS探针序列，和

SEQIDNO：4所示的第二iDDS反探针序列；和

其中所述探针用荧光团标记或用荧光团和淬灭剂标记，并且所述反探针用淬灭剂标记。

8.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是GenBank登录号CP003351.1的vanB基因核酸序列，所述系统包括：在大约核苷酸2839810至大约核苷酸2840049的区域和大约核苷酸2839810至大约核苷酸2840049的区域中特异于vanB编码区序列(CDS)的一对侧翼引物，或在大约核苷酸2839878至大约核苷酸2839958的区域和大约核苷酸2839936至大约2839995的区域中特异于vanBCDS的两个iDDS探针：反探针系统，或其组合。

9.权利要求8的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：11所示的正向引物序列，和

SEQIDNO：12所示的反向引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：7所示的第一iDDS探针序列，

SEQIDNO：8所示的第一iDDS反探针序列，

SEQIDNO：9所示的第二iDDS探针序列，和

SEQIDNO：10所示的第二iDDS反探针序列；和

10.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是GenBank登录号L23861.1的阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)(T.vag.)的重复核酸序列，所述系统包括：在大约核苷酸580至大约核苷酸639的区域和在大约核苷酸678至大约核苷酸737的区域中特异于T.vag.序列的一对侧翼引物，或在大约核苷酸623至大约核苷酸659的区域和在大约核苷酸645至大约686的区域中特异于T.vag.序列的两个iDDS探针：反探针系统，或其组合。

11.权利要求10的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：17所示的正向引物序列：和

SEQIDNO：18所示的反向引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：13所示的第一iDDS探针序列，

SEQIDNO：14所示的第一iDDS反探针序列，

SEQIDNO：16所示的第二iDDS探针序列，和

SEQIDNO：16所示的第二iDDS反探针序列；和

12.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是GenBank登录号NW_004078029.1的野生型(WT)EGFR核酸序列或L858R突变EGFR核酸序列或两者，所述系统包括：在大约核苷酸55207745至大约核苷酸55207805的区域和在大约核苷酸55207824至大约核苷酸55207884的区域中特异于EGFRDNA序列的一对侧翼引物，或在大约核苷酸55207792至大约55207832的区域中特异于所述WT或突变EGFR序列的两个iDDS探针：反探针系统，或其组合。

13.权利要求12的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：23所示的正向引物序列，和

SEQIDNO：24所示的反向引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：19所示的WTiDDS探针序列，

SEQIDNO：20所示的WTiDDS反探针序列，

SEQIDNO：21所示的突变iDDS探针序列，和

SEQIDNO：22所示的突变iDDS反探针序列；和

14.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是GenBank登录号NW_004078029.1的人类EGFR基因中的可变外显子19缺失突变序列及相邻的参照序列，所述系统包括：在大约核苷酸55242321至大约核苷酸55242414和大约55242489-55242537的区域中特异于所述EGFR序列的一对侧翼引物，或分别在大约核苷酸55242412至大约核苷酸55242444和大约核苷酸55242458至大约核苷酸55242489的区域中特异于EGFRWT或缺失突变靶序列的两个iDDS探针：反探针。

15.权利要求14中多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：29所示的正向引物序列，和

SEQIDNO：30所示的反向引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：25所示的第一iDDS探针序列，

SEQIDNO：26所示的第一iDDS反探针序列，

SEQIDNO：27所示的第二iDDS探针序列，和

SEQIDNO：28所示的第二iDDS反探针序列；和

16.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是GenBank登录号HQ728259.1的肠道病毒(EV)序列或GenBank登录号EF051629.2的副肠孤病毒(PV)的核酸序列的5’-非翻译区，所述系统包括：在大约核苷酸446至大约核苷酸487和在大约核苷酸583至大约核苷酸642的区域中特异于EVDNA的一对侧翼引物，和在大约核苷酸420至大约核苷酸461和在大约核苷酸641至大约核苷酸680的区域中特异于PVDNA的一对侧翼引物，或在大约核苷酸527至大约核苷酸603的区域中特异于所述EV序列的两个iDDS探针：反探针系统，或在大约核苷酸530至大约核苷酸590和在大约核苷酸556至大约核苷酸616的区域中特异于所述PV序列的两个iDDS探针：反探针系统，或其组合。

17.权利要求16的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：35所示的正向EV引物序列，和

SEQIDNO：36所示的反向EV引物序列，

SEQIDNO：41所示的PV正向引物序列，和

SEQIDNO：42所示的PV反向引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：31所示的第一EViDDS探针序列，

SEQIDNO：32所示的第一EViDDS反探针序列，

SEQIDNO：33所示的第二EViDDS探针序列，

SEQIDNO：34所示的第二EViDDS反探针序列，

SEQIDNO：37所示的第一PViDDS探针序列，

SEQIDNO：38所示的第一PViDDS反探针序列，

SEQIDNO：39所示的第二PViDDS探针序列，和

SEQIDNO：40所示的第二PViDDS反探针序列，和

18.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是GenBank登录号EU430688.1的人乳头瘤病毒16(HPV16)L1基因核酸序列，所述系统包括：在大约核苷酸938至大约核苷酸1020和在大约核苷酸1077至大约核苷酸1155的核苷酸区域中特异于L1CDS的一对侧翼引物，或在大约核苷酸1020至大约核苷酸1050和大约核苷酸1032至大约核苷酸1063的区域中特异于L1CDS的两个iDDS探针：反探针系统，或其组合。

19.权利要求18的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：47所示的正向引物序列，和

SEQIDNO：48所示的反向引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：43所示的第一iDDS探针序列，

SEQIDNO：44所示的第一iDDS反探针序列，

SEQIDNO：45所示的第二iDDS探针序列，和

SEQIDNO：46所示的第二iDDS反探针序列，和

20.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是GenBank登录号EU834744.1的人乳头瘤病毒18(HPV18)L1基因核酸序列，所述系统包括：在大约核苷酸1032至大约核苷酸1103和在大约核苷酸1196至大约核苷酸1287的区域中特异于HPV18CDS的一对侧翼引物，或在大约核苷酸1098至大约核苷酸1160和在大约核苷酸1125至大约核苷酸1185的区域中特异于HPV18CDS的两个iDDS探针：反探针系统，或其组合。

21.权利要求20的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：53所示的正向引物序列，和

SEQIDNO：54所示的反向引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：49所示的第一iDDS探针序列，

SEQIDNO：50所示的第一iDDS反探针序列，

SEQIDNO：51所示的第二iDDS探针序列，和

SEQIDNO：52所示的第二iDDS反探针序列，和

22.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是流感A或B核酸序列，所述系统包括四组侧翼引物和相关iDDS探针：反探针，其包括：

(i)第一组，在大约核苷酸25至大约核苷酸95和在大约核苷酸225至大约核苷酸295的区域中特异于GenBank登录号CY069381.1的H1N1季节性流感A的血凝素(HA)CDS的一对侧翼引物，和在大约核苷酸185至大约核苷酸245的区域中特异于HACDS的iDDS探针：反探针系统；

(ii)第二组，在大约核苷酸878至大约核苷酸938和在大约核苷酸971至大约核苷酸1061的区域中特异于GenBank登录号FJ969540.1的2009H1N1大流行性流感A的HACDS的一对侧翼引物，和在大约核苷酸920至大约核苷酸980的区域中特异于HACDS的iDDS探针：反探针系统；

(iii)第三组，在大约核苷酸285至大约核苷酸345和在大约核苷酸370至大约核苷酸430的区域中特异于GenBank登录号CY120904的H3N2流感A的HACDS的一对侧翼引物，和在大约核苷酸329至大约核苷酸389的区域中特异于HACDS的iDDS探针：反探针系统；和

(iv)第四组，在大约核苷酸770至大约核苷酸830和在大约核苷酸892至大约核苷酸952的区域中特异于GenBank登录号JQ034241.1的流感B的NS1CDS的一对侧翼引物，和在大约核苷酸831至大约核苷酸891的核苷酸区域中特异于HACDS的iDDS探针：反探针系统。

23.权利要求22的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：57所示序列的第一组正向引物和SEQIDNO：58所示序列的第一组反向引物，

SEQIDNO：61所示序列的第二组正向引物和SEQIDNO：62所示序列的第二组反向引物，

SEQIDNO：65所示序列的第三组正向引物和SEQIDNO：66所示序列的第三组反向引物，和

SEQIDNO：69所示序列的第四组正向引物和SEQIDNO：70所示序列的第四组反向引物；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：55所示序列的第一组iDDS探针和SEQIDNO：56所示序列的第一组iDDS反探针，

SEQIDNO：59所示序列的第二组iDDS探针和SEQIDNO：60所示序列的第二组iDDS反探针，

SEQIDNO：63所示序列的第三组iDDS探针和SEQIDNO：64所示序列的第三组iDDS反探针，

SEQIDNO：67所示序列的第四组iDDS探针和SEQIDNO：68所示序列的第四组iDDS反探针，

24.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是源自GenBank登录号NW_004078079.1的人14号染色体的DNA的切除的T细胞受体切除环(TREC)核酸序列，所述系统包括：在大约核苷酸3941495至大约核苷酸3941555和在大约核苷酸3853115至大约核苷酸3853175的区域中特异于所述TREC序列的一对侧翼引物，或在大约核苷酸3941545至大约核苷酸3941580和在大约核苷酸3853091至大约核苷酸3853120的区域中特异于所述TREC序列的两个iDDS探针：反探针系统，或其组合。

25.权利要求24的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：75所示序列的正向引物，和

SEQIDNO：76所示序列的反向引物，

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：71所示序列的第一iDDS探针，

SEQIDNO：72所示序列的第一iDDS反探针，

SEQIDNO：73所示序列的第二iDDS探针，和

SEQIDNO：74所示序列的第二iDDS反探针，和

26.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是GenBank登录号JX244938.1的人类免疫缺陷病毒(HIV)Gag核酸序列和GenBank登录号KC462191.1的人免疫缺陷病毒(HIV)Pol基因核酸序列，所述系统包括：在大约核苷酸790至大约核苷酸850的区域中特异于GagCDS的侧翼引物，在大约核苷酸729至大约核苷酸789的区域中特异于GagCDS的第一半通用探针：反探针系统，在大约核苷酸1423至大约核苷酸1483的区域中特异于PolCDS的侧翼引物，和在大约核苷酸1305至大约核苷酸1365的区域中特异于PolCDS的第二半通用探针：反探针系统，或其组合。

27.权利要求26的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：79所示序列的Gag引物，和

SEQIDNO：81所示序列的Pol引物，

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：77所示序列的Gag半通用探针，

SEQIDNO：80所示序列的Pol半通用探针，

SEQIDNO：78所示序列的半通用反探针，和

其中所述探针用荧光团标记，并且所述反探针用淬灭剂标记。

28.权利要求5的多探针系统，其中所述相关标签序列是GenBank登录号NT_005403.17的人IDH1或GenBank登录号NC_000015.9的IDH2基因的点突变，所述系统包括：在大约核苷酸59322435至大约核苷酸59322519和在大约核苷酸59322545至大约核苷酸59322614的区域中特异于IDH1DNA的一对侧翼引物，和在大约核苷酸90631711至大约核苷酸90631770和在大约核苷酸90631981至大约核苷酸90632040的区域中特异于IDH2DNA的一对侧翼引物，或在大约核苷酸59322510至大约核苷酸59322550的区域中特异于IDH1序列中的突变、或在大约核苷酸90631818至大约核苷酸90631857特异于IDH2序列中的突变的两个iDDS探针：反探针系统，或其组合。

29.权利要求28的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：86所示的正向IDH1引物序列，和

SEQIDNO：87所示的反向IDH1引物序列，

SEQIDNO：92所示的正向IDH2引物序列，和

SEQIDNO：93所示的反向IDH2引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：82所示的第一突变IDH1iDDS探针序列或具有一个或更多合成核苷酸的序列，

SEQIDNO：83所示的第一突变IDH1iDDS反探针序列，

SEQIDNO：84所示的第二突变IDH1iDDS探针序列，

SEQIDNO：85所示的第二突变IDH1iDDS反探针序列

SEQIDNO：88所示的第一突变IDH2iDDS探针序列，

SEQIDNO：89所示的第一突变IDH2iDDS反探针序列，

SEQIDNO：90所示的第二突变IDH2iDDS探针序列，和

SEQIDNO：91所示的第二突变IDH2iDDS反探针序列，和

30.权利要求5的多探针系统，其中的一个或更多探针配置用于在靶标检测中顺序使用或单独使用。

31.权利要求1的多探针系统，其中至少一个相关标签序列选自由以下组成的基因或物种的组：

(1)GenBank登录号NM_004985的KRAS基因的外显子2，密码子12或密码子13或两者的突变位点，

(2)GenBank登录号NM_004333.4的BRAF基因的密码子600突变位点，

(3)GenBank登录号CP000438的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)algD基因，

(4)GenBank登录号NC_018513.1的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)复合物recA基因，

(5)GenBank登录号NC_015947的嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)23S基因，

(6)GenBank登录号EU188842.1无色杆菌属(Achromobacter)物种OXA-114样基因，

(7)GenBank登录号CP003194的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的femA基因，

(8)GenBank登录号AB033763.2的金黄色葡萄球菌mecA基因，

(9)GenBank登录号L07855.2的鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)复合的基因间的间隔区基因或GenBank登录号DQ866771.1的龟分枝杆菌(Mycobacteriumchelonae)或两者，和

(10)GenBank：HG313848.1的脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)(MCAG)基因间的间隔区基因。

32.权利要求31的多探针系统，其中所述相关标签序列是人KRAS基因的参照序列和在外显子2，密码子12或13的相邻突变区，所述系统包括：在大约核苷酸144至大约核苷酸204的区域中特异于KRAS序列的侧翼引物，在大约核苷酸231至大约核苷酸291的区域中特异于WTKRAS序列的ZIPR参照探针，和在大约核苷酸205至大约核苷酸230的区域中特异于密码子12或密码子13中假定的突变序列的WTiDDS探针。

33.权利要求32的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：92所示的正向引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：93所示的iDDS探针序列或具有一个或更多合成核苷酸的序列，

SEQIDNO：94所示的iDDS反探针序列，

SEQIDNO：95所示的参照ZIPR探针序列，和

SEQIDNO：96所示的ZIPR反探针序列，和

其中所述iDDS探针用荧光团标记或用荧光团和淬灭剂标记，所述iDDS反探针用淬灭剂标记，所述ZIPR探针用荧光团标记，并且所述ZIPR反探针用淬灭剂标记。

34.权利要求31的多探针系统，其中所述相关标签序列是人BRAF基因的密码子600中的突变位点或者是BRAF的WT参照序列或是两者，所述系统包括：在大约核苷酸1785至大约核苷酸1844和在大约核苷酸1876至大约核苷酸1935的区域中特异于BRAF序列的一对侧翼引物，在大约核苷酸1845至大约核苷酸1875的区域中的V600E突变iDDS探针和WTiDDS探针。

35.权利要求34的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：97和SEQIDNO：98所示的引物序列；

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：99所示的突变iDDS探针序列或具有一个或更多合成核苷酸的序列，或两者的组合，

SEQIDNO：100所示的突变iDDS反探针序列，

SEQIDNO：101所示序列的WTiDDS探针，和

SEQIDNO：102所示序列的WTiDDS反探针，和

36.权利要求31的多探针系统，其中所述相关标签序列是一般与囊性纤维化相关的至少一种细菌物种，所述系统包括八组侧翼引物或相关iDDS探针：反探针系统或两者，其包括：

(i)第一组，在大约核苷酸1595235至大约核苷酸1595294和在大约核苷酸1595355至大约核苷酸1595414的区域中特异于GenBank登录号CP000438.1的铜绿假单胞菌algD基因的一对侧翼引物，或在大约核苷酸1595295至大约核苷酸1595354的区域中特异于铜绿假单胞菌algD基因的iDDS探针：反探针系统，或其组合；

(ii)第二组，在大约核苷酸869329至大约核苷酸869388和在大约核苷酸869460至大约核苷酸869519的区域中特异于GenBank登录号NC_018513.1的洋葱伯克霍尔德氏菌复合物recA基因的一对侧翼引物，或在大约核苷酸869389至大约核苷酸869448的区域中特异于洋葱伯克霍尔德氏菌复合物recA基因的iDDS探针：反探针系统，或其组合；

(iii)第三组，在大约核苷酸368121至大约核苷酸368180和在大约核苷酸368216至大约核苷酸368275的区域中特异于GenBank登录号NC_015947的嗜麦芽糖寡养单胞菌23S基因的一对侧翼引物，或在大约核苷酸368179至大约核苷酸368215的区域中特异于嗜麦芽糖寡养单胞菌23S基因的iDDS探针：反探针系统，或其组合；

(iv)第四组，在大约核苷酸230至大约核苷酸289和在大约核苷酸350至大约核苷酸409的区域中特异于GenBank登录号EU188842.1的无色杆菌属物种OXA-114样基因的一对侧翼引物，或在大约核苷酸290至大约核苷酸349的核苷酸区域中特异于无色杆菌属物种OXA-114样基因的iDDS探针：反探针系统，或其组合；

(v)第五组，在大约核苷酸1410168至大约核苷酸1410227和在大约核苷酸1410228至大约核苷酸1410347的区域中特异于GenBank登录号CP003194.1的金黄色葡萄球菌femA基因的一对侧翼引物，或在大约核苷酸1410228至大约核苷酸1410287的区域中特异于金黄色葡萄球菌femA基因的iDDS探针：反探针系统，或其组合；

(vi)第六组，在大约核苷酸31680至大约核苷酸31739和在大约核苷酸31800至大约核苷酸31859的区域中特异于GenBank登录号AB033763.2的金黄色葡萄球菌的mecA基因的一对侧翼引物，或在大约核苷酸31740至大约核苷酸31799的核苷酸区域中特异于金黄色葡萄球菌mecA基因的iDDS探针：反探针系统，或其组合；

(vii)第七组，在大约核苷酸15至大约核苷酸74和在大约核苷酸135至大约核苷酸194的区域中特异于GenBank登录号L07855.2的鸟分枝杆菌复合的基因间的间隔区基因的一对侧翼引物，或在大约核苷酸75至大约核苷酸134的区域中特异于鸟分枝杆菌复合的基因间的间隔区基因的iDDS探针：反探针系统，或其组合；和

(viii)第八组，在大约核苷酸1461至大约核苷酸1520和在大约核苷酸1571至大约核苷酸1630的区域中特异于GenBank登录号DQ866771.1的龟分枝杆菌基因间的间隔区基因、并且在大约核苷酸26至大约核苷酸85和在大约核苷酸146至大约核苷酸205的区域中特异于GenBank登录号HG313848.1的脓肿分枝杆菌基因间的间隔区基因的一对共用侧翼引物，或在大约核苷酸1521至大约核苷酸1570的区域中特异于龟分枝杆菌基因间的间隔区基因的iDDS探针：反探针系统，或在大约核苷酸86至大约核苷酸145的区域中特异于脓肿分枝杆菌基因间的间隔区基因的iDDS探针：反探针系统，或其组合。

37.权利要求36的多探针系统，

其中所述引物包括：

SEQIDNO：103所示的第一组正向引物序列和SEQIDNO：104所示的第一组反向引物序列，

SEQIDNO：107所示的第二组正向引物序列和SEQIDNO：108所示的第二组反向引物序列，

SEQIDNO：111所示的第三组正向引物序列和SEQIDNO：112所示的第三组反向引物序列，

SEQIDNO：115所示的第四组正向引物序列和SEQIDNO：116所示的第四组反向引物序列，

SEQIDNO：119所示的第五组正向引物序列和SEQIDNO：120所示的第五组反向引物序列，

SEQIDNO：123所示的第六组正向引物序列和SEQIDNO：124所示的第六组反向引物序列，

SEQIDNO：127所示的第七组正向引物序列和SEQIDNO：128所示的第七组反向引物序列，和

SEQIDNO：131所示的第八组正向引物序列和SEQIDNO：132所示的第八组反向引物序列，

其中所述探针：反探针系统包括：

SEQIDNO：105所示的第一组iDDS探针序列和SEQIDNO：106所示的第一组iDDS反探针序列；

SEQIDNO：109所示的第二组iDDS探针序列和SEQIDNO：110所示的第二组iDDS反探针序列；

SEQIDNO：113所示的第三组iDDS探针序列和SEQIDNO：114所示的第三组iDDS反探针序列；

SEQIDNO：117所示的第四组iDDS探针序列和SEQIDNO：118所示的第四组iDDS反探针序列；

SEQIDNO：121所示的第五组iDDS探针序列和SEQIDNO：122所示的第五组iDDS反探针序列；

SEQIDNO：125所示的第六组iDDS探针序列和SEQIDNO：126所示的第六组iDDS反探针序列；

SEQIDNO：129所示的第七组iDDS探针序列和SEQIDNO：130所示的第七组iDDS反探针序列；

SEQIDNO：133所示的第八组龟分枝杆菌iDDS探针序列和SEQIDNO：134所示的第八组龟分枝杆菌iDDS反探针序列；

SEQIDNO：135所示的第八组脓肿分枝杆菌iDDS探针序列和SEQIDNO：136所示的第八组脓肿分枝杆菌iDDS反探针序列；或其组合；和

38.权利要求31的多探针系统，其中一个或更多探针配置用于在靶标检测中顺序使用或单独使用。

39.权利要求1的多探针系统，其中两个或更多相关标签序列在相同的基因或物种中，并且其中探针技术选自由以下组成的组：iDDS探针，iDDS-2Q探针和MacMan探针，所述系统配置用于终点检测并同时对其进行确认。

40.用于改善在属、种、基因或其他相关核酸靶标的检测中的信号发出和/或可靠性的方法，所述方法包括以下步骤：

获得来自人，动物或生物体的生物样品；

使所述生物样品与包括权利要求1的多探针系统的标记的探针和侧翼引物组分接触；和

检测经与生物样品中的靶标接触而由所述标记发出的信号；

其中，如果标记的探针包含相同的标记，所述信号被放大，从而改善所述靶标检测中的信号发出，或

其中，如果标记的探针各包含不同的标记，所述检测被确认，从而改善所述靶标检测中的可靠性；或其组合。