CN105734167A - 多重靶核酸检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测样品中两个或两个以上靶核酸的方法，其包括向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游外引物、下游外引物、探针和两组或两组以上上游内引物和下游内引物。本发明还提供了用于所述方法的试剂盒。

Description

多重靶核酸检测方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域。更具体地说，本发明涉及使用通用探针和多组通用或非通用引物在样品中检测多重靶核酸的方法。

背景技术

现代分子诊断领域中，尽量在少量的检测样品中多种核酸内容物中的微小差异是一项重要的工作，而且希望能够在简化的程序和操作中能针对各种类型的病毒或细菌同时做检测。

使用荧光探针监测核酸扩增反应的方法是本领域已知的。基于PCR的分析的自动化系统可利用PCR过程期间对产物扩增给出的荧光信号进行实时检测。这类方法的关键是使用携带报告基团或标记物的经修饰的寡核苷酸。

检测少量核酸最常用的方法是PCR或RT-PCR。在测定给定样品中目标序列与否存在，即定性分析时，这些方法起到了重要的作用。同样的，核酸的定量分析在例如质量控制、基因表达分析、医疗监护以及诊断中大量使用。然而，现有的荧光双标记探针的使用存在相关的缺陷。例如需要使用大量昂贵的荧光标记的寡核苷酸(包括引物和/或探针)，引物和/或探针设计复杂。

因此，本领域还需要一种引物和探针的设计更简化的PCR检测方法，而且希望能够在尽量少的程序和操作中能针对各种类型的病毒或细菌同时做检测。

发明内容

本发明的方法通过采用通用探针和多组通用或非通用引物，实现对多重目标核酸的检测，能够大大简化探针和引物的设计，并且保持检查结果的真实性。

具体的，本发明提供了一种用于检测样品中两个或两个以上靶核酸的方法，其包括以下步骤。

步骤(a)，向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游外引物、下游外引物、探针和两组或两组以上上游内引物和下游内引物。

在本发明的一个方面，所述方法是一锅法，即所述含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物是一个混合物(即一个反应体系，例如所述测试发生在一个容器中)。在本发明的其它方面，所述方法也可以在两个或以上混合物中进行(即多个反应体系，例如所述测试发生在多个容器中)。

在本发明中，聚合酶是DNA聚合酶，参与DNA复制。它主要是以模板为基础，催化去氧核糖核苷酸的聚合。聚合后的分子将会组成模板链并再进一步参与配对。本发明使用的聚合物具有5'→3'的聚合酶活性。所述聚合酶具有5’→3’外切酶活性。5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部份(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。在本发明的其中一个方面，使用的聚合酶没有3'→5'外切酶活性。可用于本发明的方法的聚合酶包括TaqDNA聚合酶，TthDNA聚合酶等。

在本发明的其中一个方面，在上述本发明的方法的步骤(a)中，，每组上游内引物和下游内引物对应所述两个或两个以上靶核酸的其中一个。在本发明的其中一个方面，针对所述两个或两个以上靶核酸的其中一个提供一组对应的上游内引物和下游内引物。在本发明的其它方面，也可以针对一个靶核酸提供一组以上的上游内引物、下游内引物和探针。

在所述每组上游内引物和下游内引物中：

所述上游内引物的3’端为上游内引物靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与对应的靶核酸杂交。在本发明的其中一个方面，所述靶序列识别片段的核苷酸序列与对应的靶核酸的序列完全互补。在本发明的其中又一个方面，所述上游内引物为ARMS引物，即根据突变扩增阻滞系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)方法设计的引物。ARMS引物设计在本领域是常用的手段，可参考EP332435中的描述。

另外，所述上游内引物的5’端为上游外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与靶核酸的序列不能杂交，例如不互补。所述上游内引物的外引物重叠片段的序列与上游外引物的3’端的上游引物重叠片段相同。

所述下游内引物包括3’端的下游外引物靶序列识别片段，其核苷酸序列可与靶细胞特异性结合(例如与靶核酸的序列互补)，所述下游内引物的5’端为下游外引物重叠片段，其序列与靶核酸的序列不能杂交，例如不互补。所述下游内引物的外引物重叠片段的序列与下游外引物的3’端的引物重叠片段相同。

在本发明的上述方法中，所述两组或两组以上的上游内引物和下游内引物中各组的上游外引物重叠片段的序列相同，各组的探针结合片段的序列相同，以及各组的下游外引物重叠片段的序列相同。

在上述本发明的方法的步骤(a)中，所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭。所述探针可特异性与所述上游内引物和下游内引物的扩增产物中包含对应序列的片段杂交。在本发明的其中一个方面，其中所述探针的核苷酸序列与所述上游内引物的探针结合片段相同或少一个或数个核苷酸。由此，在上游外引物以由上游外引物(或上游内引物)和下游外引物(或下游内引物)限制两侧的扩增产物为模板的退火和延长反应中，所述探针可特异性与所述扩增产物杂交，具有5’→3’外切活性的聚合酶可水解与该扩增产物结合的探针。

在本发明的方法中，所述上游外引物的3’端为上游外引物重叠片段，其与前述上游内引物的5’端的所述外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补。在本发明的方法中，所述下游外引物的3’端为下游外引物重叠片段，其与前述下游内引物的5’端的所述外引物重叠片段相同，所述下游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补。在本发明的上述方法中，所述两组或两组以上的上游内引物和下游内引物中各组的上游外引物重叠片段的序列相同，以及各组的下游外引物重叠片段的序列相同。因此，在本发明的方法中，可以只提供一个上游外引物和一个下游外引物。

本发明的方法还包括步骤(b)，其中实施多个循环扩增步骤，其中每个所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤。杂交步骤包括使引物与其对应的核酸模板特异性退火杂交。核酸延长步骤包括在聚合酶的催化下,引物延伸和生成自模板衍生的扩增产物。在步骤(b)中，还包括测量报告基团的信号的步骤，由此对靶核酸进行检测。

在本发明的其中一个方面，其中步骤(b)中所述杂交步骤在约45-72℃下进行，优选在约55-65℃下进行，最优选为在约59-62℃下进行。

在步骤(b)中，当靶核酸为双链DNA时，循环扩增步骤还可包括变性步骤，其中双链DNA模板退火，变成单链，由此引物可与模板上的靶序列特异性杂交。在本发明的其中一个方面，其中步骤(b)中所述变性步骤在约90-96℃下进行，优选在约94-96℃下进行，最优选为在约95℃下进行。

在本发明的其中一个方面，其中步骤(b)中所述核酸延长步骤在约55-78℃下进行，优选在约60-75℃下进行，最优选为在约60-72℃下进行。

在本发明中，所述多个循环扩增步骤可分为第一扩增阶段和第二扩增阶段。在第一扩增阶段中(例如为约第1-10个循环)可得到以靶核酸为模板，由上游内引物与下游内引物限定的扩增产物。在第二扩增阶段中(例如为约第11-30至40个循环)可得到以第一扩增阶段得到的扩增产物为模板，由上游外引物与下游外引物限定的扩增产物。

在本发明的方法中，所述3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团的探针在完整的情况下，例如游离在反应溶液中，或是虽然与靶核酸模板杂交和结合，但是未被聚合酶的外切活性将标记了报告基团或淬灭基团的碱基切除的情况下，报告基团或淬灭基团之间发生能量转移，使得从报告染料的荧光发射至少部分或完全淬灭。在本发明的方法中，在以由上游外引物和下游外引物限制两侧的扩增产物为模板的退火和延长反应中，当探针可以识别和结合对应探针结合片段的扩增产物的片段，上游外引物与模板退火，在聚合酶的作用下延伸，此时具有5’→3’外切活性的聚合酶可水解与该扩增产物结合的探针，由此释放报告基团和/或淬灭基团，产生信号。在本发明的其中一个方面，其中在所述核酸延长步骤测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。

在本发明的其中一个方面，所述探针具有约15-50个碱基，优选为约18-35个碱基。

在本发明的其中一个方面，其中步骤(b)中所述核酸延长步骤和杂交步骤在相同温度下进行。例如，在杂交步骤之后即升温至进行下一个循环的变性步骤的温度，在此升温过程中即实现了引物延伸。

在本发明的其中一个方面，其中所述报告基团为荧光报告基团。在本发明的其中一个方面，所述报告基团选自荧光素染料(例如FAM、JOE和HEX)，罗丹明染料(例如R6G、TAMRA、ROX)，和花青染料(例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)。

在本发明的其中一个方面，其中所述淬灭基团选自荧光素染料(例如FAM、JOE和HEX)，罗丹明染料(例如R6G、TAMRA、ROX)，和花青染料(例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)。

本发明还提供了用于实施前述本发明的方法的试剂盒。

在本发明的其中一方面，提供了上述用于检测样品中两个或两个以上靶核酸的试剂盒，其包括：上游外引物、下游外引物、探针和两组或两组以上上游内引物和下游内引物，

其中，每组上游内引物和下游内引物中:

所述上游内引物的3’端为上游内引物靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与对应的靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应该靶核酸的待测位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与对应的靶核酸的所述待测位点目标碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为上游外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与对应的靶核酸的序列不互补；在所述靶序列识别片段和所述外引物重叠片段之间具有探针结合片段；

所述下游内引物的3’端为下游引物靶序列识别片段，其核苷酸序列与对应的靶核酸的序列互补，所述下游引物的5’端为下游外引物重叠片段，其序列与靶核酸的序列不互补；

其中所述两组或两组以上的上游内引物和下游内引物中各组的上游外引物重叠片段的序列相同，各组的探针结合片段的序列相同，以及各组的下游外引物重叠片段的序列相同；

其中所述上游外引物的3’端为上游引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述上游外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

所述下游外引物的3’端为下游引物重叠片段，其与下游内引物的5’端的下游外引物重叠片段相同，所述下游外引物的5’端与靶核酸不互补，

以及

其中所述探针的核苷酸序列与所述上游内引物的探针结合片段相同或少一个或数个核苷酸，并且所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭。

在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中还包括具有5’→3’外切活性的聚合酶。在本发明的其中一个方面，所述聚合酶没有3'→5'外切酶活性。

本发明的试剂盒可用于微生物分型的检测。所述微生物可选自病毒或细菌，例如HBV、HPV等。

该用于检测样品中靶核酸的试剂盒中其它组成如前述本发明的方法中定义或限定。

定义：

术语"引物"一般指的是在具有催化与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件(例如具有聚合酶和互补序列的模板，以及在合适的温度)下能够作为沿着互补链合成的起始点的寡核苷酸。在聚合反应体系中，引物可以为一条或多条。术语“引物对”表示一组或一对引物，其包括与扩增的核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物(有时称为“正向”或“上游”)以及与扩增的序列的3'末端杂交的3'反义引物(有时称为“反向”或“下游”)。

术语“碱基配对”或"互补"是指公知的Watson-Crick碱基配对，包括双链DNA中碱基对腺嘌呤-胸腺嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间，或者RNA/DNA杂交分子中腺嘌呤-尿嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间的配对，以及非常规核苷酸或衍生物之间的类似组合。术语核酸序列的互补物指的是当与核酸序列对应以便一条序列的5'末端与另一条的3'末端配对时处于"反向平行结合"的寡核苷酸。例如，序列5'-AGTTC-3'与序列5'-GAACT-3'是互补的。术语"完全互补的"等指的是在反向平行链之间具有完美的Watson-Crick碱基配对(在多核苷酸双螺旋中没有错配)的互补序列。然而，互补有时不是完全的，例如可以包含错配碱基对或不匹配碱基。术语"部分互补"、"部分互补的"、"非完全互补"或"非完全互补的"等指的是反向平行多核苷酸链之间的任何碱基比对小于100％完全的(例如，在多核苷酸双螺旋中存在至少一个错配或不匹配碱基)，但仍能形成比较稳定的双链结构的情况。例如，反向平行多核苷酸链之间的碱基比对可以是至少99％、95％、90％，或之间的任何值。

术语"靶核酸"、"靶序列"或"靶核酸序列"指的是要扩增、检测的寡核苷酸区域。靶序列通常具有与引物或探针互补的序列，或为位于用于扩增的两引物序列之间的序列。在本专利中，靶核酸通常是指DNA双链中的其中一条链。当描述引物或探针与靶核酸互补或相同时，其与靶核酸的DNA双链中的另外一条链是相同或互补的。

术语“模板”或“模板核酸分子”是指通过聚合酶(例如DNA聚合酶)从其合成互补核酸链的核酸链。例如，在PCR反应中引物互补、识别和结合，然后从其合成互补核酸链的核酸链。

术语"标记"指的是可用于提供可检测的信号，并且能够附着于核酸或蛋白质的任何原子或分子，或是将该信号附着核酸或蛋白质。标记可以为可被荧光、放射性、比色法、重量分析法、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。

术语"FRET"(荧光共振能量转移或型共振能量转移)通常指的是两个染料分子的电子状态之间的动态距离依赖的相互作用，其中能量从供体染料分子转移到受体染料分子而没有来自供体分子的光子发射。通常，FRET要求，(a)供体和受体分子必须紧密地接近(一般，例如)，(b)受体的吸收光谱必须与供体的荧光发射光谱重叠，以及(c)供体和受体跃迁偶极取向必须是大致并行的。

在大部分FRET应用中，供体和受体染料或报道分子和猝灭剂是不同的，在该情况下FRET可以通过受体敏化荧光的出现或供体荧光的猝灭来检测。在某些情况下，供体和受体或报道分子和猝灭剂是相同的，而FRET可以通过产生的荧光消偏振来检测。

术语"报告基团"或“报告分子”一般指的是产生可检测的辐射，例如荧光或发光辐射，的发射的部分，该发射可以被转移给足够接近的适当的FRET猝灭剂。通常，这样的分子是染料。表述"报告分子"可以与"报告分子"或"报告标记"或"FRET标记部分"可互换地使用。

术语"猝灭基团"或“猝灭分子”通常指的是减少和/或能够减少可检测的辐射，例如但不限于荧光或发光辐射，的发射的部分。表述"猝灭分子"可以与"淬灭基团"可互换地使用。通常，猝灭剂指的是能够减少光发射的任何部分。在某些方面，猝灭剂减少来源发射的可检测的辐射至少50％，可选择地至少80％，并且可选择地和最优选至少90％。一般来说，猝灭分子导致来自报道分子的荧光发射减少，由此报道分子/猝灭分子形成FRET对，并且该猝灭剂被称为"FRET猝灭剂"而该报道分子为"FRET报道分子"。术语"猝灭剂"不限于FRET猝灭剂。在一些实施方案中，猝灭剂指的是能够减少光发射的分子。如本文使用的，"猝灭"包括任何类型的猝灭，包括动态(能量转移等)和静态的(基态复合物)。还可选择地，猝灭剂可以为除光外的形式，例如热，散失从荧光染料中吸收的能量。在一些实施方案中，某些猝灭剂能够以可同FRET报道分子发射区分的波长或信号类型，和以该猝灭剂特征的波长或信号类型重新发射从FRET报道分子吸收的能量。从这方面来说，猝灭剂也可以是"标记"。

如本文所使用的，术语“相应于”指当一个核酸和与之比较的核酸序列比对时，第一核酸序列中的核苷酸与参比核酸序列中的给定核苷酸对准。

如本文所使用的，“聚合酶链反应”或“PCR”指一种用于扩增特定多核苷酸模板序列的体外方法。PCR反应包括一系列重复的温度循环，且通常在10-100μl的体积中进行。反应混合物包含dNTPs(四种脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一种)、引物、缓冲液、DNA聚合酶如热稳定的DNA聚合酶以及多核苷酸模板。一次PCR反应可由例如多核苷酸分子的5-100次变性和合成的“循环”组成。

本发明提供的方法克服了现有技术的检测方法的各种缺陷，获得了更大的信号动力学和更好的准确度，并且还具有以下优点：只需要考虑通用引物，特别是内引物的识别序列，大大简化了引物和探针设计，降低了难度。而且，本发明的方法通过引物和探针双重验证，能够大大增强检查结果的真实性。

附图说明

附图1扩增反应荧光PCR测试结果。

附图2扩增反应荧光PCR测试结果。

附图3扩增反应荧光PCR测试结果。

具体实施方式

通过以下实施例进一步说明本发明，但这些实施例不在任何方面限制本发明。

实施例1

1.扩增反应模板

在本实施例中，用于扩增的DNA模板包括以下商购的包含以下HPVE6/E7各亚型的核苷酸序列的标准品质粒:

HPV16：

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HPV18：

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HPV31：

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HPV6：

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HPV11：

atggaaagtaaagatgcctccacgtctgcaacatccatagaccagttgtgcaagacgtttaatctttctttgcacactctgcaaattcagtgcgtgttttgcaggaatgcactgaccaccgcagagatatatgcatatgcctataagaacctaaaggttgtgtggcgagacaactttccctttgcagcgtgtgcctgttgcttagaactgcaagggaaaattaaccaatatagacactttaattatgctgcatatgcacctacagtagaagaagaaactaatgaagatattttaaaagtgttaattcgttgttacctgtgtcacaagccgttgtgtgaaatagaaaaactaaagcacatattgggaaaggcacgcttcataaaactaaataaccagtggaagggtcgttgcttacactgctggacaacatgcatggaagacttgttaccctaaaggatatagtactagacctgcagcctcctgaccctgtagggttacattgctatgagcaattagaagacagctcagaagatgaggtggacaaggtggacaaacaagactcacaacctttaacacaacattaccaaatactgacctgttgctgtggatgtgacagcaacgtccgactggttgtggagtgcacagacggagacatcagacaactacaagaccttttgctgggcacactaaatattgtgtgtcccatctgcgcaccaaaaccataa

2.引物和带荧光标记探针的合成和标记

人工合成和标记得到以下引物或探针：

通用上游外引物：5’-TTCAAATGGGCGTTG-3’

通用下游外引物：5’-GCCGATCACTCAGATCTCG-3’

通用探针：5’-FAM-TGATCGCAGCAGT-BHQ1-3’

Hpv16特异上游内引物:

5’-ATGGGCGTTGTGATCGCAGCAGTGCTCAGAGGAGGAGGATG-3’

Hpv16特异下游内引物:

5’-TCACTCAGATCTCGCTTCCAAAGTACGAATGTCTACG-3’

Hpv18特异上游内引物:

5’-ATGGGCGTTGTGATCGCAGCAGTCCAGTGCCATTCGTGCTG-3’

Hpv18特异下游内引物:

5’-TCACTCAGATCTCGCGCTTAATTGCTCGTGACATAGA-3’

Hpv31特异上游内引物:

5’-ATGGGCGTTGTGATCGCAGCAGTACCGTTGTGTCCAGAAGAA-3’

Hpv31特异下游内引物:

5’-TCACTCAGATCTCGGTACGAGGTCTTCTCCAACA-3’

通用上游外引物和对应的上游内引物，或是通用下游外引物和对应的下游内引物中带双下划线的序列为其重叠的序列部分。

所述探针的核苷酸序列TGATCGCAGCAGT与上游内引物的探针结合片段(带下划线的序列)的相同，由此与上游内引物与下游内引物以模板中包括目标核酸的片段为模板得到的扩增产物对应的片段互补，能够特异性识别和结合以目标核酸为模板的扩增产物。

3.PCR条件和体系

使用ABI7500FAST荧光定量PCR仪进行PCT和荧光检测。

使用的DNA聚合酶为：TaqDNA聚合酶。

在反应体系中加入以下PCR反应混合物：

实施例2

在两个包含上述PCR反应混合物的体系中分别加入以下两种模板DNA：

1、HPV16标准品质粒

2、HPV6和HPV11混合标准品质粒

根据以下循环设置进行PCR：

95℃，2分钟，1个循环；

95℃，10秒，然后63℃，30秒，40个循环。

根据仪器和使用的荧光标记进行自动检测。其中设定在每个63℃30秒步骤期间采集荧光读数。

实验结果显示于图1。图1为将上述两个PCR反应收集的荧光信号合并的图。

图1显示采用HPV16标准品质粒为模板的反应具有明显的荧光信号；相反，采用HPV6和HPV11混合标准品质粒为模板的反应的信号与基线基本相同，没有显著区别。

实施例3

在两个包含上述PCR反应混合物的体系中分别加入以下两种模板DNA：

1、HPV18标准品质粒

2、HPV6和HPV11混合标准品质粒

根据以下循环设置进行PCR：

95℃，2分钟，1个循环；

95℃，10秒，然后63℃，30秒，40个循环。

根据仪器和使用的荧光标记进行自动检测。其中设定在每个63℃30秒步骤期间采集荧光读数。

实验结果显示于图2。图2为将上述两个PCR反应收集的荧光信号合并的图。

图2显示采用HPV18标准品质粒为模板的反应具有明显的荧光信号；相反，采用HPV6和HPV11混合标准品质粒为模板的反应的信号与基线基本相同，没有显著区别。

实施例4

在两个包含上述PCR反应混合物的体系中分别加入以下两种模板DNA：

1、HPV31标准品质粒

2、HPV6和HPV11混合标准品质粒

根据以下循环设置进行PCR：

95℃，2分钟，1个循环；

95℃，10秒，然后63℃，30秒，40个循环。

根据仪器和使用的荧光标记进行自动检测。其中设定在每个63℃30秒步骤期间采集荧光读数。

实验结果显示于图3。图3为将上述两个PCR反应收集的荧光信号合并的图。

图3显示采用HPV31标准品质粒为模板的反应具有明显的荧光信号；相反，采用HPV6和HPV11混合标准品质粒为模板的反应的信号与基线基本相同，没有显著区别。

在实施例中，报道分子和猝灭剂是在同一探针上，在游离状态下，该探针的所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭。当上游内引物可以识别、结合和扩增对应的HPV型DNA时，在上游外引物以由上游外引物和下游外引物限制两侧的扩增产物为模板的延长反应中，具有5’→3’外切活性的聚合酶可水解与该扩增产物结合的探针，即聚合酶可识别和切割掉标记在探针上的荧光基团，由此检测到极强的荧光信号。而另一方面，当模板没有对应HPV类型的DNA时，上游内引物或下游内引物不可以结合和扩增，因此不出现探针被水解的反应，由此不能检测到荧光信号。

实验证明本发明的设计能非常有效的在一个反应体系中检测多个待测靶核酸。

本发明提供的方法克服了现有技术的检测方法的许多缺陷，获得了更大的信号动力学和更好的准确度，并且还具有以下优点：在探针和引物设计中主要只需要考虑通用探针，大大简化了引物和探针设计，降低了难度。而且，本发明的方法通过引物和探针双重验证，能够大大增强检查结果的真实性。

其他实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见。很清楚以上详述只为澄清所设且仅作为例证。本发明的精神和范围不限于上述实施例，但为权利要求所包含。

Claims (10)

1.一种用于检测样品中两个或两个以上靶核酸的方法，其包括以下步骤：

(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游外引物、下游外引物、探针和两组或两组以上上游内引物和下游内引物，

其中，每组上游内引物和下游内引物中:

所述上游内引物的3’端为上游内引物靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与对应的靶核酸杂交，另外，所述上游内引物的5’端为上游外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与对应的靶核酸的序列不互补；在所述靶序列识别片段和所述外引物重叠片段之间具有探针结合片段；

所述下游内引物的3’端为下游引物靶序列识别片段，其核苷酸序列与对应的靶核酸的序列互补，所述下游引物的5’端为下游外引物重叠片段，其序列与靶核酸的序列不互补；

其中所述两组或两组以上的上游内引物和下游内引物中各组的上游外引物重叠片段的序列相同，各组的探针结合片段的序列相同，以及各组的下游外引物重叠片段的序列相同；

其中所述上游外引物的3’端为上游引物重叠片段，其与所述上游内引物的5’端的所述上游外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

所述下游外引物的3’端为下游引物重叠片段，其与所述下游内引物的5’端的所述下游外引物重叠片段相同，所述下游外引物的5’端与靶核酸不互补，

以及

其中所述探针的核苷酸序列与所述上游内引物的探针结合片段相同或少一个或数个核苷酸，并且所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭；

(b)实施多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤；测量报告基团的信号，由此对靶核酸进行检测。

2.权利要求1的方法，其中步骤a)中所述含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物是一个混合物。

3.权利要求1的方法，其中步骤a)中所述含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物是两个或两个以上混合物。

4.权利要求1的方法，其中步骤(b)中所述多个循环扩增步骤包括第一扩增阶段和第二扩增阶段，在第一扩增阶段中可得到以靶核酸为模板，由对应的上游内引物与下游内引物限定的扩增产物，第二扩增阶段中可得到以第一扩增阶段得到的扩增产物为模板，由上游外引物与下游外引物限定的扩增产物。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中在所述核酸延长步骤测量报告基团的信号，由此对靶核酸进行检测。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述聚合酶具有5’→3’外切活性，更优选的，所述聚合酶没有3′→5′外切酶活性。

7.一种用于如权利要求1-6中任一项所述检测样品中两个或两个以上靶核酸的方法的试剂盒，其包括：上游外引物、下游外引物、探针和两组或两组以上上游内引物和下游内引物，

其中，每组上游内引物和下游内引物中:

所述上游内引物的3’端为上游内引物靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与对应的靶核酸杂交，另外，所述上游内引物的5’端为上游外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与对应的靶核酸的序列不互补；在所述靶序列识别片段和所述外引物重叠片段之间具有探针结合片段；

所述下游内引物的3’端为下游引物靶序列识别片段，其核苷酸序列与对应的靶核酸的序列互补，所述下游引物的5’端为下游外引物重叠片段，其序列与靶核酸的序列不互补；

其中所述两组或两组以上的上游内引物和下游内引物中各组的上游外引物重叠片段的序列相同，各组的探针结合片段的序列相同，以及各组的下游外引物重叠片段的序列相同；

其中所述上游外引物的3’端为上游引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述上游外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

所述下游外引物的3’端为下游引物重叠片段，其与下游内引物的5’端的下游外引物重叠片段相同，所述下游外引物的5’端与靶核酸不互补，

以及

其中所述探针的核苷酸序列与所述上游内引物的探针结合片段相同或少一个或数个核苷酸，并且所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭。

8.权利要求7的试剂盒，其中还包括具有5’→3’外切活性的聚合酶，其中所述聚合酶具有5’→3’外切活性，更优选的，所述聚合酶没有3′→5′外切酶活性。

9.权利要求7或8的试剂盒，其用于微生物检测。

10.权利要求9的试剂盒，其中所述微生物选自病毒或细菌，例如HBV、HPV等。