CN105274116B

CN105274116B - 一种制备人源化抗体的核酸分子及其应用

Info

Publication number: CN105274116B
Application number: CN201510686616.3A
Authority: CN
Inventors: 刘作华; 葛良鹏; 刘雪芹; 邹贤刚; 丁玉春; 黄勇; 杨松全; 游小燕; 林保忠; 吴梦
Original assignee: Chongqing Camab Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chongqing Jin Bo Bo Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2015-10-21
Filing date: 2015-10-21
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2035-10-21
Also published as: CN105274116A; WO2017067042A1

Abstract

本发明提供了一种核酸分子，包括了人免疫球蛋白基因或其片段，其特征在于还包括：人CD79基因序列。本发明克服了人类免疫球蛋白基因在不同物种中由于BCR与Igα和Igβ相互作用不兼容性的问题，同时其表达的人源化抗体无需进行二次改造。

Description

一种制备人源化抗体的核酸分子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种核酸分子及其在人源化抗体制备中的应用。

背景技术

抗体是一类重要的生物医药制品，在人类疾病的预防和治疗过程中发挥了重要的作用。治疗性抗体的发展经历了鼠源抗体、嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体和全人源化抗体等不同的发展阶段。全人源化抗体(Full Humanized Antibody)，是指经过基因改造或转基因动物免疫而获得的与人源抗体蛋白质序列完全一致的抗体。全人源化抗体由于不含动物蛋白，因此副作用较低，作用效果更好，已成为当前和未来抗体工程的主要研究和发展方向。转基因动物全人源化抗体(Transgenic Humanized Antibody)是指将人类免疫球蛋白基因全部或部分通过转基因或转人工染色体技术，转移至动物基因组中[动物内源的抗体基因缺失(或失活)]，使动物表达人类抗体，从而获得全人源化抗体。

通过体外对人的免疫球蛋白基因进行改造，转入动物体内，再用抗原免疫改造后的动物获得高亲和力的抗体是目前人源化抗体研发的一项重要技术，截止目前，美国FDA已批准7个利用该方法制备的人源化抗体。当前主流的方法是将人类的免疫球蛋白重链和轻链基因替代动物自身的免疫球蛋白重链和轻链基因，使其在动物体内进行重排生成人类的抗体蛋白。但随着研究的深入，发现转入的人类免疫球蛋白基因片段虽然能在动物体内重排和表达，但其产生人抗体蛋白的性能要低于未经基因改造前的动物自身抗体生产效果。以小鼠为例，其原因主要是当抗体在B细胞发育的初级阶段作为B细胞表面受体(BCR)时，其与鼠源的信号蛋白Igα和Igβ的相互作用并不是最优的(即鼠源BCR与鼠源的Igα和Igβ或人BCR与人的Igα和Igβ相互作用效果是最好的)，因此影响了抗体的类型转换、亲和力成熟和B细胞发育为成熟的生产抗体的浆细胞。为克服这一难题，Lee等(Nature biotechnology，2014；32(4)：356-363)将三个人免疫球蛋白基因(IgH，Igκ和Igλ)的可变区替代小鼠的免疫球蛋白可变区，而恒定区使用小鼠免疫球蛋白的相应片段，利用这种策略可克服上述提到的问题，获得可变区为人源，恒定区为鼠源的嵌合抗体，再通过下游的改造将鼠源的恒定区改造为人源的恒定区，得到全人源化抗体。这种方法存在的缺点是需要进行二次改造才能获得全人源化抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可在动物体内进行重排表达人源化抗体的核酸分子，该核酸分子克服了人类免疫球蛋白基因在不同物种中由于BCR与Igα和Igβ相互作用不兼容性的问题，同时相对背景技术中提到的Lee采用的方法，其表达的人源化抗体无需进行二次改造。

本发明提供了一种核酸分子，包括了人免疫球蛋白基因或其片段，以及人CD79基因序列。

上述CD79基因序列包括CD79α蛋白肽和CD79β蛋白肽的编码序列。CD79α蛋白肽和CD79β蛋白肽的氨基酸序列分别如SED ID NO.3和SED ID NO.2所示。

上述人CD79基因序列如SED ID NO.1所示。

上述转入的人CD79序列可位于人免疫球蛋白基因载体上或转入小鼠或猪的基因组中。优选的，上述人CD79序列位于人Ig核酸分子两端中的任意一端。所述人CD79序列位于人免疫球蛋白V区的前端或C区后端。

上述核酸分子中CD79基因序列的结构如图1-1所示。CD79在上述核酸分子中位置如图1-2所示。所述核酸分子的结构如图1-3所示。

优选地，上述人免疫球蛋白抗体基因或其片段为人免疫球蛋白抗体重链基因。本发明不需对人免疫球蛋白基因进行内部改造。

上述人免疫球蛋白基因包括了人免疫球蛋白重链基因的V区基因、D区基因、J区基因。上述人免疫球蛋白重链基因还可以包括hCμ、hCγ、hCα、hCδ和/或hCξ重链基因和/或人的3’一调控区(hLCR)等。

例如，上述核酸分子的基因簇如图2所示(黑框位置为导入的人CD79序列)。

通过以上的改造，上述核酸分子能够形成B细胞发育的信号传递体，并有利于IgM细胞直接转化为IgG细胞，以及亲和力成熟。

一种表达载体，包含上述核酸分子。一种细胞，包含上述核酸分子或上述载体。一种动物，如鼠、猪等，包含上述核酸分子。一种人源化抗体，由上述核酸分子重排、编码制得。

上述核酸分子或载体或细胞在制备人源化抗体中的应用。上述核酸分子或载体或细胞在制备转基因动物中的应用。

将经过上述改造的人免疫球蛋白基因转入动物体内获得转人免疫球蛋白转基因动物，或进一步与自身免疫球蛋白基因不表达的动物进行杂交获得只表达人抗体蛋白的基因工程动物。利用抗原免疫转入人免疫球蛋白基因(重链、轻链)的动物，获得全人源化抗体。例如：

采用上述核酸分子或载体或细胞制备转基因动物的方法，包括以下步骤：

(1)所述核酸分子的获得；

(2)将所述核酸分子构建入载体；

(3)向宿主细胞(包括干细胞，诱导干细胞和体细胞)或胚胎导入含有所述核酸分子的载体；

(4)将含有人Ig的细胞植入宿主动物的胚胎内(嵌合体制备)或体细胞克隆；

(5)繁育杂合、纯合的转人Ig基因的动物(包括与宿主内源免疫球蛋白基因失活的动物杂交)。

上述宿主动物为哺乳动物，如鼠、兔、猪、牛、羊、鸡、马等。上述载体为人工染色体(如酵母，细菌)、噬菌体、质粒等。上述载体导入宿主细胞的方法，包括电穿孔、病毒感染、脂质体转染和显微注射等。

有益效果

1.本发明生产的全人源化抗体具有高亲和力。

2.本发明可利用一种转基因动物品系产生不同类型的各种抗体，且本发明适用于多种动物。

3.本发明的宿主自身免疫球蛋白不表达或在检测限度以下。

4.本发明基因重排效率高，VDJC重排、突变和利用率与人体一致。

5.本发明直接生产全人源化抗体，不需进行二次改造，体内表达量可达到健康成人水平。

6.本发明不需对人免疫球蛋白基因进行内部改造。

附图说明

图1-1转人CD79基因结构图

图1-2转人CD79基因结构和筛选基因

图1-3转人CD79基因和hIg位置结果图。

图2实施例1的改造后人免疫球蛋白重链基因簇结构图

图3实施例1人免疫球蛋白Kappa轻链基因簇结构图

图4实施例1人免疫球蛋白lambda轻链基因簇结构图

图5实施例1小鼠免疫球蛋白重链基因簇

图6实施例1敲除小鼠免疫球蛋白重链基因的基因打靶

图7实施例1小鼠免疫球蛋白轻链基因簇

图8实施例1敲除小鼠免疫球蛋白轻链基因的基因打靶

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

将改造的人免疫球蛋白基因转入小鼠体内，再免疫含有人免疫球蛋白基因的小鼠获得全人源化抗体，具体步骤如下：

1.人免疫球蛋白基因的优化改造

1)人免疫球蛋白重链基因的改造

将人CD79基因通过同源重组转入含人Ig的YAC或BAC载体上，构建人免疫球蛋白重链基因的基因簇如图2所示(黑框位置为导入的人CD79基因序列)。包括了依次为人免疫球蛋白重链基因的V区、D区、J区，hIgHC μ、hIgHC δ、hIgHC γ3、hIgHC γ1、hIgHC α1、hLCR、hCD79。hCD79的内部结构如图1-1所示，其基因序列如SED ID NO.1所示；包括了CD79α蛋白肽和CD79β蛋白肽的编码序列；CD79α蛋白肽和CD79β蛋白肽的氨基酸序列分别如SED IDNO.3和SED ID NO.2所示。

2)人免疫球蛋白Kappa轻链基因的改造

人免疫球蛋白kappa轻链基因包括了人免疫球蛋白kappa轻链基因全部或部分V区、J区、C区，以及KDE区。基因簇如图3所示。

3)人免疫球蛋白lambda轻链基因的改造

人免疫球蛋白lambda轻链基因包括了人免疫球蛋白lambda轻链基因全部或部分V区、J区和C区，同时在末端加入了增强子结构。基因簇如图4所示。

2.人源化抗体转基因小鼠的培育

1)转人免疫球蛋白重链基因小鼠的培育

利用已有的常规转基因技术将步骤1的1)中构建的人免疫球蛋白重链基因转入小鼠体内。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白重链转基因小鼠。

使用的PCR鉴定引物为：

PCR 1

For：TGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTC

Rev：TTGCTTAACTCCACACCTGCTCCTG

PCR product size：329bp

PCR2

For：TTGAGGAGACTGTCCATCCTTCAC

Rev：GAGAGGGCATCTTGGTCTTCTTTC

PCR product size：471bp

使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(I1886)和sigma(A8792)，以健康成年人和健康小鼠血清作为对照。

2)转人免疫球蛋白kappa轻链基因小鼠的培育

利用已有的常规转基因技术将步骤1的2)中构建的人免疫球蛋白kappa轻链基因转入小鼠体内。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白kappa轻链转基因小鼠。

使用的PCR鉴定引物为：

PCR 1：

FOR：TGCTCTGACCTCTGAGGACCTGTCTGTA

Rev：TTCAGGCAGGCTCTTACCAGGACTCA

PCR product size：616bp

PCR 2：

For：CACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACT

Rev：GAGGAAAGAGAGAAACCACAGGTGC

PCR product size：596bp

使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(K3502)和sigma(A7164)，以健康成年人和健康小鼠血清作为对照。

3)转人免疫球蛋白lambda轻链基因小鼠的培育

利用已有的常规转基因技术将步骤1的3)中构建的人免疫球蛋白lambda轻链基因转入小鼠体内。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白lambda轻链转基因小鼠。

使用的PCR鉴定引物为：

PCR 1：

For：AGCACAATGCTGAGGATGTTGCTCC

Rev：ACTGACCCTGATCCTGACCCTACTGC

PCR product size：562bp

PCR 2：

FOR：CTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCAGG

REV：GAGAGTGCTGCTGCTTGTATATGAGCTGCA

PCR product size：462bp

使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(L1645)和sigma(A5175)，以健康成年人和健康小鼠血清作为对照。

4)免疫球蛋白重链基因敲除小鼠的培育(图5、图6)

利用Crispr/Cas9技术，构建免疫球蛋白重链基因敲除小鼠。选择小鼠免疫球蛋白重链基因的IgHC μ作为基因敲除位点(敲除位点及基因敲除效果见图6)，获得免疫球蛋白重链基因敲除小鼠。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的免疫球蛋白重链基因敲除小鼠。

使用的PCR鉴定引物为：

PCR：

For：AGCACCATTTCCTTCACCTGGAAC

Rev：CAAGGAGCAAATGACCATGTCTGG

PCR产物：760bp。然后用BstEII酶切，基因打靶的是753bp，没有基因打靶的是500bp和260bp的两条带。

使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(M8644)和sigma(A8786)，以健康成年人和健康小鼠血清作为对照。

5)免疫球蛋白kappa轻链基因敲除小鼠的培育(图7、图8)

利用常规基因敲除技术，敲除小鼠免疫球蛋白kappa轻链基因的整个恒定区(C)，获得免疫球蛋白Kappa轻链基因敲除小鼠。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得小鼠免疫球蛋白kappa轻链基因敲除小鼠。

使用的PCR鉴定引物为：

PCR1：

For：CCCTTCCCTAGCCAAAGGCAACTA

Rev：CACAACGGGTTCTTCTGTTAGTCC

PCR product size：466

PCR 2：

For：CACACCTCCCCCTGAACCTGAAAC

Rev：GTTGTGGGTAGTGCCCAGCCTTGC

PCR product size：464bp

使用的ELISA鉴定的抗体为：SouthemBiotech(1170-01)和SouthernBiotech(1170-05)，以健康成年人和健康小鼠血清作为对照。

6)杂交组合获得人源化抗体转基因小鼠

将第二步1)，2)，3)，4)，5)步获得的小鼠进行杂交繁育，经过PCR和ELISA检测，最终获得高表达人免疫球蛋白，而不表达(或低表达)鼠免疫球蛋白的的人源化抗体转基因小鼠用于下一步的研究。

3.全人源化抗体的获得

1)OVA免疫第2步6)获得的人源化抗体转基因小鼠

选择8周龄的小鼠进行免疫。

初免：

①用PBS稀释OVA(Sigma A7641)抗原，终浓度为5mg/ml，加入50ug CpG(ODN1826，tlrl-1826，Invivogen)，加入适量氢氧化铝(vac-alu-50，Invivogen)，使氢氧化铝浓度为1％。

②将①中准备好的抗原0.75mL与CFA佐剂(Sigma F5881)按1∶1混合，用MIXPAC^TM注射器使之乳化，每只小鼠，注射剂量为200ul(0.5mg)，进行皮下注射免疫。

二免：

①初免后第16天进行二免，用PBS稀释抗原，终浓度为2.5mg/ml，加入25ug CpG，加入适量氢氧化铝，使氢氧化铝浓度为1％。

②将①中准备好的抗原0.75mL与IFA佐剂按1∶1混合，用MIXPAC^TM注射器使之乳化，每只小鼠注射剂量为200ul(0.25mg)，进行腹腔注射免疫。

三免：

①二免第16天后进行三免，用PBS稀释抗原，终浓度为1.25mg/ml，加入12.5ugCpG，加入适量氢氧化铝，使氢氧化铝浓度为1％。

②直接注射抗原蛋白，按①中方法配制，每只小鼠注射剂量为200ul(0.25mg)进行腹腔注射免疫。

2)小鼠抗体检测

第3次免疫后10天，分别取编号为4115，4116，4117号小鼠取血进行ELISA检测，以健康成年人和野生型小鼠作为对照，分别检测免疫后小鼠血清中鼠IgG的含量和人IgG的含量，结果如下：

①小鼠IgG的含量检测

使用试剂盒为小鼠IgG ELISA试剂盒(Abcam，ab157719)

4115：检测限度以下

4116：检测限度以下

4117：检测限度以下

健康成年人：检测限度以下

野生型小鼠：0.8mg/ml

结果显示：免疫后的人源化抗体小鼠的鼠源IgG表达量极低。

②小鼠血清中人IgG的检测

使用试剂盒为人IgG ELISA试剂盒(Abcam，ab100547)

4115：9.8mg/ml

4116：8.7mg/ml

4117：7.5mg/ml

健康成年人：10.2mg/ml

野生型小鼠：＜0.1ng/ml

结果显示：免疫后的人源化抗体小鼠的人源IgG表达量较高。

③OVA抗体亲和力测定

选取3556号小鼠，将其脾细胞和杂交瘤细胞融合，筛选单克隆抗体，ELISA筛选表达量最高的3个细胞克隆，利用竞争性ELISA检测法(CEB459Ge，Cloud-Clone Corp)进行抗OVA抗体亲和力检测，结果显示最高亲和力的抗体为280pM。

实施例2

将改造后的人免疫球蛋白基因转入以猪为宿主动物(免疫球蛋白基因敲除猪)得到以下结果：

猪血液中人IgG的表达检测：选择PCR检测阳性的205，206两头转入上述基因的转基因猪，采血，分离血清，检测血液中人IgG的表达量，以健康成年人和同月龄的普通猪作为对照。使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(I1886)和sigma(A8792)。

结果如下：

4115：0.5mg/ml

4116：0.1mg/ml

4117：0.2mg/ml

健康成年人：10.2mg/ml

普通猪：＜0.1ng/ml

结果显示：转入的基因能在猪体内表达人的抗体重链蛋白。

本发明对人免疫球蛋白基因的改造方案，在其它哺乳动物中同样适用，例如，猪、兔、羊、马等作为宿主动物同样可实现本发明所述全人源化抗体表达的有益效果。

Claims

1.一种核酸分子，包括了人免疫球蛋白基因，其特征在于还包括：人CD79基因序列；CD79 基因的结构依次包括 CD79β启动子、CD79β序列、 CD79α序列、polyA信号；所述人CD79基因如 SEDIDNO.1 所示。

2.如权利要求 1 所述的核酸分子，CD79α蛋白肽如SEDIDNO.3所示，CD79β蛋白肽如SEDIDNO.2所示。

3.权利要求 1或2所述的核酸分子，所述人CD79 基因位于核酸分子两端中的任意一端。

4.如权利要求1所述的核酸分子，所述人免疫球蛋白基因包括 IgH的V区基因、D区基因、J区基因。

5.如权利要求1 所述的核酸分子，所述人免疫球蛋白重链基因还包括 hCγ、hCα、hCδ和/ 或 hCξ重链基因和/或hLCR。

6.如权利要求 1 所述的核酸分子，所述人CD79基因位于人免疫球蛋白V区的前端或C区后端。

7.一种载体，包含如权利要求 1-6任意所述核酸分子。

8.权利要求1-6任一所述核酸分子或权利要求7所述载体在制备转基因动物中的应用。

9.采用权利要求1-6任一所述核酸分子或权利要求7所述载体制备转基因动物的方法，包括以下步骤：

（1）所述核酸分子的获得；

（2）将所述核酸分子构建入载体；

（3）向宿主细胞或胚胎导入含有所述核酸分子的载体；

（4）将含有人 Ig 的细胞植入宿主动物的胚胎内或体细胞克隆；

（5）繁育杂合、纯合的转人Ig基因的动物。