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CN104024423B - 用于降低抗体异质性的方法和产生其抗体的方法 - Google Patents

用于降低抗体异质性的方法和产生其抗体的方法 Download PDF

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CN104024423B CN201280031457.8A CN201280031457A CN104024423B CN 104024423 B CN104024423 B CN 104024423B CN 201280031457 A CN201280031457 A CN 201280031457A CN 104024423 B CN104024423 B CN 104024423B
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安努杰·格尔
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Abstract

本公开内容涉及一种在培养期间降低抗体的异质性的方法，其中该异质性是由于抗体的电荷变体的比例。该公开内容还包括一种在致使抗体具有降低的异质性的细胞培养系统中生长细胞的方法。在一个实施方式中，通过将二价过渡金属离子如锌（Zn2+）添加至细胞培养基以降低抗体异质性。在另一个实施方式中，通过降低细胞培养基的同渗容摩以降低抗体异质性。

Description

用于降低抗体异质性的方法和产生其抗体的方法
技术领域
本公开内容涉及提高蛋白质产量的方法，例如，大规模商业化蛋白质生产如抗体生产，使用包含细胞生长阶段和多肽产生阶段的改良的细胞培养方法。该改良的细胞培养方法控制过程特征和操作参数以获得具有改变的电荷变体/碱性变体的多肽产品。本公开内容涉及降低抗体的异质性。更具体地，该公开内容包括在细胞培养系统中生长细胞的方法，该细胞培养系统通过降低碱性变体的比例来降低电荷变体的异质性。
背景技术
无论处于商用或开发中，大部分的生物技术产品都是蛋白质治疗剂。因此，对于在细胞培养物中例如在动物细胞培养物中的蛋白质生产以及对于与该生产相关的改进方法存在较大和增长的需求。因此，大量的研究集中在可以优化多肽产量的动物细胞培养条件和方法上，即，支持高细胞密度与高效价的蛋白质的条件和方法上。
在生物制药学的单克隆抗体中通常观察到C-端赖氨酸变体。单克隆抗体异质性可以归因于各种因素，如氨基端改变（例如，对于焦谷氨酸）、C-端的不完全处理、天冬酰胺脱酰胺、磷酸化、糖基化、氧化、突变等。这些种类的变异发生在许多类型的蛋白质中并且在生物治疗药物方面可以影响它们的活性和稳定性。抗体的同质性是重要的特征并且认为其对于证明由FDA和其它管理机构所要求的药物安全性和功效是必不可少的。
重组单克隆抗体已经显示在C-端具有精氨酸（Arg）或赖氨酸（lys）的C-端异质性。当使用羧肽酶B（一种外肽酶）处理MAb的这些C-端变体时，Arg和Lys从两个抗体亚基的C-端断裂，从而消除C-端异质性。
羧肽酶（CP）是催化肽和蛋白质中的C-端肽键水解的酶。从多肽或蛋白质的C-端除去一个或几个氨基酸对该分子的生物学活性可以具有深远的影响。由于在从来自合成时的分子到来自从受试者中完全清除时的分子的时间范围内引入了各种修饰，因此MAb的异质性是常见的。研究治疗剂的修饰是重要的，由于该治疗剂可能影响制剂的活性/安全性从而导致功效损失和不良副作用的风险。
US专利号5,126,250公开了一种降低由抗体生产细胞分泌的抗体的异质性的方法。
发明内容
因此，本公开内容涉及一种降低通过细胞培养获得的抗体的异质性的方法，所述方法包括将二价过渡金属离子添加至抗体生产培养基或改变培养基的同渗容摩（渗透压摩尔浓度，osmolality）或它们的组合以获得具有降低的异质性的所述抗体；以及一种用于产生具有降低的异质性的抗体的方法，所述方法包含以下步骤：（a）在培养基中培养细胞以产生抗体，并将二价过渡金属离子添加至培养基或改变培养基的同渗容摩或它们的组合，以及（b）从培养基中回收具有降低的异质性的抗体。
附图说明
为了可以容易地理解该公开内容并且投入实际应用，现在将参考示例性实施方式，如参照附图示出的。附图连同下文的详细描述并入说明书中并且形成说明书的一部分，用来进一步示出实施方式并说明各种原理和优点，根据本公开内容，其中：
图1示出了在存在和不存在锌离子的情况下，在第264h即第11天碱性变体的%差异（抗体1）。
图2a示出了在存在和不存在锌离子的情况下，在第168h即第7天碱性变体的%差异（抗体1）。
图2b示出了在存在和不存在镁离子的情况下，在第168h即第7天碱性变体的%差异（抗体1）。
图3示出了在含有锌离子的低同渗容摩（240-260mOsm/Kg）培养基和310-320mOsm/Kg的同渗容摩的生产培养基中，在第168h即第7天碱性变体的%差异（抗体1）。
图4示出了在存在和不存在锌离子的情况下，在第168h即第7天碱性变体的%差异（抗体2）。
图5示出了在含有锌离子的低同渗容摩（240-260mOsm/Kg）培养基和同渗容摩范围（310-320mOsm/Kg）的生产培养基中碱性变体的%差异（抗体3）。
图6示出了使用不同初始同渗容摩的培养基的总碱性变体的%差异（抗体1）。
图7示出了在存在和不存在锌离子（1mM）的情况下，在第168h即第7天碱性变体的%差异（抗体1）。
图8示出了在存在和不存在锌离子（0.5mM）的情况下，在第168h即第7天碱性变体的%差异（抗体1）。
图9示出了在存在和不存在锌离子的情况下，在第168h即第7天碱性变体的%差异（抗体3）。
图10示出了在存在和不存在锌离子的情况下，在第168h即第7天碱性变体的%差异（抗体4）。
图11示出了在存在和不存在锌离子的情况下，在第168h即第7天碱性变体的%差异（抗体1）。
图12示出了在存在和不存在锌离子的情况下，在第192h即第8天碱性变体的%差异（抗体3）。
注释：在对照中，没有添加锌离子。
具体实施方式
本公开内容涉及一种降低通过细胞培养获得的抗体的异质性的方法，所述方法包括将金属离子添加至抗体生产培养基或改变培养基的同渗容摩或它们的组合以获得具有降低的异质性的所述抗体。
在本公开内容的实施方式中，该异质性是由于抗体的电荷变体的比例；并且其中通过降低抗体的C-端上的赖氨酸残基的比例来降低异质性。
在本公开内容的另一个实施方式中，针对比例在约75%至约100%的范围内的抗体通过进行所述方法降低异质性。
在本公开内容的又一个实施方式中，该抗体是天然产生的抗体或者选自包括单克隆抗体、修饰的抗体、抗体衍生物和抗体片段、或它们的任何组合的组中的重组抗体。
在本公开内容的又一个实施方式中，通过降低约3%至约30%的抗体的碱性变体比例和提高约5%至约25%的主峰/0赖氨酸以降低异质性。
在本公开内容的又一个实施方式中，该二价过渡金属离子是在约0.05mM至约1.5mM浓度范围内的Zn+2。
在本公开内容的又一个实施方式中，改变培养基的同渗容摩以提供约240mOsm/Kg至约260mOsm/Kg范围内的同渗容摩。
在本公开内容的又一个实施方式中，该培养是补料式分批培养（fed batchculturing）；并且包括哺乳动物细胞培养，优选中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系培养。
在本公开内容的又一个实施方式中，首先在细胞培养的细胞生长阶段然后在细胞培养的多肽生产阶段进行金属离子的添加；或其中在细胞的所述培养之前的初始阶段进行金属离子的添加。
本公开内容进一步涉及一种用于产生具有降低的异质性的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：（a）在培养基中培养细胞以产生抗体，并将二价过渡金属离子添加至培养基或改变培养基的同渗容摩或者它们的组合，以及（b）从培养基中回收具有降低的异质性的抗体。
在本公开内容的实施方式中，在约0.5x106细胞/ml至约0.6x106细胞/ml的浓度范围内培养该细胞。
在本公开内容的另一个实施方式中，在约36℃至约38℃的温度范围内进行培养。
在本公开内容的又一个实施方式中，该抗体是天然产生的抗体或者选自包括单克隆抗体、修饰的抗体、抗体衍生物和抗体片段、或它们的任何组合的组中的重组抗体。
在本公开内容的又一个实施方式中，该异质性是由于抗体的电荷变体的比例；并且其中通过降低抗体的C-端上的赖氨酸残基的比例进行降低异质性。
在本公开内容的又一个实施方式中，针对比例在约75%至约100%的范围内的抗体通过进行所述方法降低异质性。
在本公开内容的又一个实施方式中，通过降低约3%至约30%的抗体的碱性变体比例和提高约5%至约25%的主峰/0赖氨酸降低异质性。
在本公开内容的又一个实施方式中，该培养是补料式分批培养；并且包括哺乳动物细胞培养，优选中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系培养。
在本公开内容的又一个实施方式中，金属离子是在约0.05mM至约1.5mM浓度范围内的Zn+2。
在本公开内容的又一个实施方式中，改变培养基的同渗容摩以提供约240mOsm/Kg至约260mOsm/Kg范围内的同渗容摩。
在本公开内容的又一个实施方式中，在约30℃至约32℃的温度范围内，首先在培养的细胞生长阶段然后在培养的多肽生产阶段进行金属离子的添加，或其中在细胞的所述培养之前的初始阶段进行金属离子的添加。
在本公开内容的又一个实施方式中，细胞生长阶段具有约12x106细胞/ml至约13x106细胞/ml的范围内的细胞浓度，并且其中多肽生产阶段具有约13x106细胞/ml至约15x106细胞/mL的范围内的细胞浓度。
在本公开内容的实施方式中，优选以七水合硫酸锌的形式使用该二价锌离子。其它锌化合物可以包括，而不限于，ZnH2、Zn(OH)2、Zn(NO3)2·6H2O、和ZnCl2。
在本公开内容的实施方式中，在没有使用酶除去赖氨酸残基的情况下，通过降低抗体的C-端上赖氨酸残基的比例进行降低异质性。
本公开内容克服了现有技术的局限性以提供用于降低抗体的异质性的方法。本公开内容的目的是提供用于提高蛋白质生产的方法，例如大规模的商业化蛋白质生产如抗体生产，使用包含细胞生长阶段和多肽生产阶段的改良的细胞培养方法。
在本公开内容的另一个目的中，通过添加金属离子如Zn+2来降低抗体的碱性变体。
在公开内容的又一个目的中，锌离子的浓度是在0.05-1.5mM的范围内。
在本公开内容的又一个目的中，通过降低生产培养基的同渗容摩降低抗体的碱性变体。
本公开内容的又一个目的包括在细胞培养系统中生长细胞的方法，该细胞培养系统通过提高主峰/0赖氨酸的形成降低电荷变体的异质性，其中在抗体的任何链的C-端上基本上存在0个赖氨酸。
本公开内容的又一个目的是细胞培养基中的碱性变体降低3-30%。
因此，本公开内容提供了提高蛋白质生产的方法，例如大规模的商业化蛋白质生产如抗体生产，使用包括细胞生长阶段和多肽生产阶段的改良的细胞培养方法。
本公开内容进一步描述了降低抗体的微异质性（microheterogeneity）。更具体地，该公开内容包括在细胞培养系统中生长细胞的方法，该细胞培养系统通过降低碱性变体的形成降低电荷变体的异质性。
本公开内容涉及一种用于通过培养哺乳动物细胞并从培养基或/和细胞中分离MAb来生产具有改变的碱性变体比例的单克隆抗体的方法。
在本公开内容的实施方式中，通过添加0.05-1.5mM范围内的金属离子如Zn+2和通过使用240-260mOsm/Kg的同渗容摩范围内的生产培养基降低抗体的碱性变体。
本公开内容的又一个实施方式降低通常与标准生产程序相关的抗体的碱性变体的%。有利地，该公开内容通过较大量的含有期望质量的产品尤其是生物仿制（biosimilar）抗体的回收提供了经济和商业效益。
术语定义
术语“抗体”包括抗体或抗体衍生物或它们的片段并且该抗体的规格还应用于本公开内容的抗体制备。在抗体片段中抗体的功能等价物或同源体包括含有免疫球蛋白结合域或模拟该结合域的肽以及Fc区或与Fc区同源的区或它的至少部分的任何多肽。包括含有免疫球蛋白结合域的嵌合分子或融合至另一个多肽的等价物。
示例性抗体分子是完整的免疫球蛋白分子和包含抗体结合部位（paratope）的免疫球蛋白分子的那些部分，包括称为Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、和F(v)、以及N-聚糖结构的那些部分。
抗体描述了血清的功能成分并且通常是指多个分子（多个抗体或多个免疫球蛋白、多个片段等）或一个分子（抗体分子或免疫球蛋白分子）。抗体分子能够结合至特异的抗原决定簇（抗原或抗原表位）或与抗原决定簇（抗原或抗原表位）反应，该抗体分子进而可以致使诱导免疫学效应机理。单个抗体分子通常被认为是单特异性的，并且抗体分子的组合可以是单克隆的（即，由相同的抗体分子组成）或多克隆的（即，由与相同的抗原或明显不同的抗原上的相同或不同的表位反应的不同抗体分子组成）。该明显不同的抗体分子组成的多克隆抗体可以被称作“成员（member）”。每个抗体分子具有能够特异性结合至其相应抗原的唯一结构，并且所有天然抗体分子都具有相同的整体基本结构（两个相同的轻链和两个相同的重链）。
异质性被定义为其中分泌抗体具有各种离散的生物化学形式的现象，例如，但不限于，抗体重链中的一个或两个的羧基端上另外的一个或多个氨基酸或者由于氨基酸修饰而引起该抗体的整体电荷分布的差异。
如在本文中使用的，短语“多肽”或“多肽产物”分别与术语“蛋白质”和“蛋白产物”是同义的，并且，在本领域中通常理解为是指经由连续的肽键连接的至少一个氨基酸链。在某些实施方式中，“感兴趣的蛋白质”或“感兴趣的多肽”等是由已经转化至宿主细胞的外源核酸分子所编码的蛋白质。在某些实施方式中，其中已经转化的宿主细胞的外源DNA编码“感兴趣的蛋白质”，外源DNA的核酸序列决定氨基酸序列。在某些实施方式中，“感兴趣的蛋白质”是由宿主细胞的内源核酸分子编码的蛋白质。在某些实施方式中，使用外源核酸分子（该外源核酸分子可以，例如，包含一个或多个调节序列和/或编码增强感兴趣的蛋白质的表达的蛋白质）通过转染宿主细胞改变这种感兴趣的内源蛋白质的表达。
如在本文中使用的，“抗体变体”是指具有不同于亲本抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。优选地，该抗体变体包括具有在自然界中未发现的氨基酸序列的重链可变区或轻链可变区。这种变体必然具有低于100%的序列一致性或者相似于亲本抗体。在优选的实施方式中，该抗体变体将具有约75%至低于100%、更优选约80%至低于100%、更优选约85%至低于100%、更优选约90%至低于100%、以及最优选约95%至低于100%的氨基酸序列同一于或相似于亲本抗体的任一重链或轻链可变区的氨基酸序列的氨基酸序列。相对于该序列的同一性或相似性在本文中定义为候选序列中的氨基酸残基与亲本抗体残基同一（即，相同的残基）的百分比，在对齐序列并且引入间隔后，如果需要，以达到最大百分比序列同一性。
如在本文中使用的术语“培养介质”、“细胞培养基”和“培养基”是指包含滋养生长动物细胞如哺乳动物细胞的营养物的溶液，并且也可以指与细胞结合的培养基。（通常可以使用的商用培养基如培养基Hyclone CDM4NS0、Hyclone CDM4Mab、Invitrogen CDOptiCHO和Lonza Power CHO）。
优选的哺乳动物宿主是CHO细胞并且优选的发酵模式是补料式分批。其它细胞系的实例是NS0（非分泌型）和BHK（幼仓鼠肾脏）。
用于基因改造的（genetically engineering）细胞和/或细胞系以表达感兴趣的蛋白质的方法和载体是本领域技术人员所熟知的。基因工程技术包括，但不限于，表达载体、靶同源重组和基因激活。可选地，在异源控制元件（如，例如，不天然引导该多肽产生的启动子）的控制下表达该蛋白质。例如，该启动子可以是引导哺乳动物多肽表达的强病毒性启动子（例如，CMV，SV40）。该宿主细胞可以或不可以正常地产生该蛋白质。例如，该宿主细胞可以是已经基因改造的CHO细胞以产生蛋白质，是指编码蛋白质的核酸已经被引入CHO细胞中。
本领域技术人员将确认应当培养特定细胞系的温度和/或浓度。例如，大部分哺乳动物细胞，例如，CHO细胞，在约35℃至39℃的范围内，优选地在37℃生长良好，然而通常在27℃培养昆虫细胞。
在公开内容的一个实施方式中，使用本公开内容的方法产生的蛋白质是抗体或其抗原结合片段。如在本文中使用的，术语“抗体”包括含有至少一个并且通常两个VH区或其部分、和/或至少一个并且通常两个VL区或其部分的蛋白质。在某些实施方式中，抗体是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链是通过例如二硫键互相连接的。抗体或其部分可以获自任何来源，包括，但不限于，啮齿动物、灵长类（例如，人类和非人类灵长类）、鲨鱼等，或者它们可以是重组产生的，例如，嵌合、人化等，和/或体外产生，例如通过本领域技术人员所熟知的方法。
在优选的实施方式中，本公开内容的细胞培养是在摇瓶（30ml工作容积）和/或生物反应器（1L/50L）中进行的，并且使用补料式分批模式。在补料式分批培养中，最初提供具有300-310mOsm/Kg的同渗容摩的哺乳动物宿主细胞和培养基并且定期供给营养物（氨基酸、葡萄糖和维生素）。在37±1℃使用0.5-0.6x106细胞/ml的初始细胞计数开始进行产物发酵，第一个3-4天用于生长细胞。下一步包括降低温度至31±1℃并且两次间歇地添加锌离子，使得添加的总量达到0.05-1.5mM（一次在生长阶段的第3天/第4天注射并且另一次在生产阶段的第6/7/8天注射）。根据本公开内容的实施方式的抗体制备，优选至少90%、优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的修饰抗体、其衍生物或片段缺少C-端赖氨酸残基，尤其是取决于重链（其通常可以包含赖氨酸）的总数。由于抗体可以具有多个潜在地包含C-端赖氨酸的链，应理解缺少赖氨酸的数量百分比涉及潜在地具有C-端赖氨酸的所有链。显示了单克隆抗体在C-端赖氨酸的存在下是异质的。在另一个实施方式中，本公开内容的细胞培养是在摇瓶（30ml工作容积）和/或生物反应器（1L/50L）中进行的，并且使用补料式分批模式。在优选的补料式分批培养中，最初提供具有240-260mOsm/Kg的降低的同渗容摩的哺乳动物宿主细胞和培养基，并且定期供给营养物（氨基酸、葡萄糖和维生素）。通过使用MilliQ/WFI稀释培养基降低培养基的同渗容摩。在37±1℃使用0.5-0.6x106细胞/ml的初始细胞计数开始进行产物发酵，第一个3-4天用于生长细胞。下一步包括降低温度至31±1℃并且两次间歇地添加0.1mM的浓度的锌离子（一次在生长阶段的第3/4天注射并且另一次在生产阶段的第5/6/7/8天注射）。根据本公开内容的实施方式的抗体制备，优选至少90%、优选至少95%、更优选至少99%、最优选100%的修饰的抗体、或衍生物其片段缺少C-端赖氨酸残基，尤其是取决于重链（其通常可以包含赖氨酸）的总数。由于抗体可以具有多个潜在地包含C-端赖氨酸的链，应理解缺少赖氨酸的数量百分比涉及潜在地具有C-端赖氨酸的所有链。显示了单克隆抗体在C-端赖氨酸的存在下是异质的。
为了说明和描述的目的，提出了本公开内容的具体实施方式的上述描述。不意图将该公开内容穷尽或限制为公开的精确形式。鉴于上文的教导各种变型和改变都是可以的。此外，可以进行许多变型以使具体情形、材料、物质的组合、过程、一个或多个处理步骤适应本公开内容的目的、精神和范围。所有这些变型都在所附权利要求的范围内。
借助于以下实施例进一步详细说明了本申请的技术。然而，该实施例不应解释为限制本公开内容的范围。
实施例：
本公开内容公开了具有降低的异质性的抗体的生产。抗体-1是抑制血管内皮细胞生长因子A（VEGF-A）的人化单克隆抗体。抗体-2是干扰HER2/neu受体（抗her2抗体）的单克隆抗体。抗体-3是抑制TNF的人化单克隆抗体，抗体-4是抗CD6。
实施例1：
使用锌离子以降低抗体-1的碱性变体或提高抗体-1的主峰/0赖氨酸
提供具有300-310mOsm/Kg的同渗容摩的培养基并且使用0.5-0.6x106/ml浓度的细胞接种并且使其生长。在细胞计数在第4天达到12-13x106/ml之后，将温度从37℃转变至31℃。以0.1mM的浓度提供锌的第一次注射。在第8天时，当细胞计数是13-15x106/ml时，以0.1mM的浓度提供锌的另一次注射。使得进行直到第11天。观察到的异质性列在以下表中。
表-1
图1示出了以上结果。
实施例2：
使用锌离子以降低抗体-1的碱性变体或提高抗体-1的主峰/0赖氨酸
以补料式分批模式进行细胞培养。在补料式分批培养中，最初提供哺乳动物宿主细胞和培养基，并且定期供给营养物。使用0.5-0.6x106/ml的浓度的细胞接种培养基并使其生长。在细胞计数达到12-13x106/ml（在第3天）之后，将温度从37℃转变至31℃，然后以0.1mM的浓度供给锌离子的第一次注射。当细胞计数达到13-15x106/ml（在第6天）时以0.1mM的浓度供给另一次注射，并且使烧瓶发酵直到第7天。在另一个培养基中，供给镁离子对于碱性变体没有显示差异，给出该实施例作为阴性对照。观察的异质性列在以下表中：
表-2
图2示出了以上结果。
实施例3:
使用含有锌离子的低同渗容摩生产培养基以降低抗体1的碱性变体或提高抗体1 的主峰/0赖氨酸
以补料式分批模式进行细胞培养。在培养中，最初提供哺乳动物宿主细胞和低同渗容摩培养基，并且定期供给营养物。使用0.5-0.6x106/ml的细胞接种该培养基并使其生长。在细胞计数达到12-13x106/ml（在第3天）之后，将温度从37℃转变至31℃，然后以0.1mM的浓度供给锌离子的第一次注射。当细胞计数达到13-15x106/ml时（在第6天）以0.1mM的浓度供给另一次注射并且使其进行发酵直到第7天。
观察到的同渗容摩列在以下表中。
表3
图3示出了以上结果。
实施例4：
使用锌离子以降低抗体2的碱性变体或提高抗体2的主峰/0赖氨酸
以补料式分批模式进行细胞培养。最初提供哺乳动物宿主细胞和培养基（含有低同渗容摩）的培养物，并定期供给营养物。使用0.5-0.6x106/ml的细胞接种该培养基并使其生长。在细胞计数达到12-13x106/ml（在第3天）之后，将温度从37℃转变至31℃，然后以0.1mM的浓度供给锌离子的第一次注射。当细胞计数达到13-15x106/ml时（在第6天），以0.1mM的浓度加入另一次注射，并且使其发酵直到第7天。观察到的异质性列在以下表中。
表4
图4示出了以上结果。
实施例5：
使用低同渗容摩生产培养基以降低抗体3的碱性变体或提高抗体3的主峰/0赖氨 酸
在大规模生物反应器中进行细胞培养并且使用补料式分批模式。在补料式分批培养中，最初提供哺乳动物宿主细胞和低同渗容摩的培养基，并且定期供给营养物。在该试验中使用0.5-0.6x106/ml的细胞接种生物反应器并使其生长。在细胞计数达到12-13x106/ml（在第3天）之后，将温度从37℃转变至31℃，然后以0.1mM的浓度供给锌离子的第一次注射。当细胞计数达到13-15x106/ml时（在第5天）以0.1mM的浓度供给另一次注射，并且使其发酵直到第12天。
观察到的同渗容摩列在以下表中。
表5
图5示出了以上结果。
实施例6：
使用低同渗容摩生产培养基以降低抗体1的碱性变体或提高抗体1的主峰/0赖氨 酸
以补料式分批模式进行细胞培养。在补料式分批培养中最初提供哺乳动物宿主细胞和低同渗容摩的培养基，并且定期供给营养物。使用含有不同浓度的初始同渗容摩的三种培养基。使用0.5-0.6x106/ml的细胞接种该培养基并使其生长。使得该分批发酵直到第7天。培养基显示，随着初始培养基的同渗容摩的降低，碱性变体的总%降低。在细胞系的生长曲线中没有看到差异。观察到的碱性变体随着同渗容摩降低的减少列在以下表中。
表6
图6示出了以上结果。
实施例7：
使用锌离子以降低抗体-1的碱性变体或提高抗体-1的主峰/0赖氨酸
以补料式分批模式进行细胞培养。在补料式分批培养中最初提供哺乳动物宿主细胞和培养基（包括1mM锌离子）并且定期供给营养物。以0.5-0.6x106/ml的细胞接种该培养基并使其生长。在细胞计数达到12-13x106/ml之后，将温度从37℃转变至31℃，并且使烧瓶发酵直到第7天。观察到的异质性的降低列在以下表中。
表7
图7示出了以上结果。
实施例8：
使用锌离子以降低抗体-1的碱性变体或提高抗体-1的主峰/0赖氨酸
以补料式分批模式进行细胞培养。使用0.5-0.6x106/ml的细胞接种含有0.5mM的锌离子的培养基，并且使用营养物定期供给培养物。在细胞计数达到12-13x106/ml之后，将温度转变至31℃并使烧瓶发酵直到第7天。观察到的异质性的降低列在以下表中。
表8
图8示出了以上结果。
实施例9
使用锌离子以降低抗体-3的碱性变体或提高抗体-3的主峰/0赖氨酸
采用补料式分批模式进行细胞培养。使用0.5-0.6x106/ml接种该培养基并使其生长。在细胞计数达到12-13x106/ml之后将温度从37℃转变至31℃，并且以0.1mM的浓度供给锌离子的第一次注射并且在第6天供给其它注射并使其发酵直到第7天。观察到的异质性列在以下表中。
表9
试验 时间（h） 0赖氨酸（%） 碱性（L1+L2）% Zn供给（培养的天数）
对照 168 55.9 30.4
Zn供给瓶 168 60.5 23.3 第3天和第6天
图9示出了以上结果。
实施例10：使用锌离子以降低抗体-4的碱性变体或提高抗体-4的主峰/0赖氨酸
以补料式分批模式进行细胞培养。在补料式分批培养中最初提供哺乳动物宿主细胞和培养基并定期供给营养物。使用0.5-0.6x106/ml的浓度的细胞接种培养基并使其生长。在细胞计数达到12-13x106/ml（在第3天）之后，将温度从37℃转变至31℃并且以0.1mM的浓度供给锌离子的第一次注射，随后当细胞计数达到13-15x106/ml时（在第6天）以0.1mM的浓度供给另一次注射并且使其发酵直到第7天。观察到的异质性的降低列在以下表中。
表10
试验 时间（h） 0赖氨酸（%） 碱性（L1+L2）% Zn供给（培养的天数）
对照 168 58.9 23.3
Zn供给瓶 168 64.5 18.3 第3天和第6天
图10示出了以上结果。
实施例11
使用锌离子以降低抗体-1的碱性变体或提高抗体-1的主峰/0赖氨酸
以补料式分批模式进行细胞培养。使用营养物定期供给Hyclone CDM4Mab培养基。使用0.5-0.6x106/ml的细胞接种该培养基并使其生长。在细胞计数达到12-13x106/ml（天）之后，将温度从37℃转变至31℃，然后以0.15mM的浓度供给锌离子的第一次注射，随后在第6天供给另一次注射，并且使其发酵直到第7天。观察到的异质性的降低列在以下表中：
表11
试验 时间（h） 0赖氨酸（%） 碱性（L1+L2）% Zn供给（培养的天数）
对照 168 40.7 45.6
Zn供给瓶 168 46.3 37.4 第3天和第6天
图11示出了以上结果。
实施例12
使用锌离子以降低抗体-3的碱性变体或提高抗体-3的主峰/0赖氨酸
以补料式分批模式进行细胞培养。用营养物定期提供Invitrogen CDOptiCHO培养基。使用0.5-0.6x106/ml的细胞接种该培养基并使其生长。在细胞计数达到12-13x106/ml（第3天）之后，将温度从37℃转变至31℃并以0.1mM的浓度供给锌离子的第一次注射，随后在第6天供给另一次注射，并且使其发酵直到第8天。观察到的异质性的降低列在以下表中：
表12
试验 时间（h） 0赖氨酸（%） 碱性（L1+L2）% Zn供给（培养的天数）
对照 192 61.5 23
Zn供给瓶 192 65.6 19.2 第3天和第6天
图12示出了以上结果。

Claims (21)

1.一种通过降低抗体C端的赖氨酸残基比例来降低通过细胞培养所获得的抗体的异质性的方法，所述方法包括将Zn2+离子添加至产生所述抗体的培养基中或降低所述培养基的同渗容摩至240～260mOsm/Kg的范围内或者它们的组合以获得具有降低的异质性的所述抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述异质性是源于所述抗体的电荷变体的比例。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，针对75％至100％范围内的抗体比例，通过进行所述方法降低所述异质性。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体是天然产生的抗体或者选自包括单克隆抗体、修饰的抗体、抗体衍生物和抗体片段、或它们的任何组合的组中的重组抗体。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述抗体的碱性变体比例异质性的降低为3％至30％，且抗体主峰/0赖氨酸的提高为5％至25％。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述Zn2+离子在0.05mM至1.5mM浓度范围内。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养是补料式分批培养并且是哺乳动物细胞培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞培养是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系培养。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，首先在所述细胞培养的细胞生长阶段以及其次在所述细胞培养的多肽生产阶段进行所述Zn2+离子的添加；或者其中，在所述细胞的所述培养之前的初始阶段进行所述Zn2+离子的添加。
10.一种通过降低抗体C端的赖氨酸残基比例来生产具有降低的异质性的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在培养基中培养用于产生所述抗体的细胞，并且将Zn2+离子添加至所述培养基或降低所述培养基的同渗容摩至240～260mOsm/Kg的范围内或者它们的组合；以及
(b)从所述培养基中回收具有降低的异质性的所述抗体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，在0.5x106细胞/ml至0.6x106细胞/ml的浓度范围内培养所述细胞。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，在36℃至38℃的温度范围内进行所述培养。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述抗体是天然产生的抗体或者选自包括单克隆抗体、修饰的抗体、抗体衍生物和抗体片段、或它们的任何组合的组中的重组抗体。
14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述异质性是源于所述抗体的电荷变体的比例。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，针对75％至100％范围内的抗体比例，通过进行所述方法降低所述异质性。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述抗体的碱性变体比例异质性的降低为3％至30％，且抗体主峰/0赖氨酸的提高为5％至25％。
17.根据权利要求10所述的方法，其中，所述培养是补料式分批培养并且是哺乳动物细胞培养。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞培养是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系培养。
19.根据权利要求10所述的方法，其中，所述Zn2+离子在0.05mM至1.5mM浓度范围内。
20.根据权利要求10所述的方法，其中，在30℃至32℃范围内的温度下，首先在所述培养的细胞生长阶段以及其次在所述培养的多肽生产阶段进行所述Zn2+离子的添加；或者其中，在所述细胞的所述培养之前的初始阶段进行所述Zn2+离子的添加。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述细胞生长阶段具有12x106细胞/ml至13x106细胞/ml范围内的细胞浓度；并且其中，所述多肽生产阶段具有13x106细胞/ml至15x106细胞/mL的范围内的细胞浓度。
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