CN104988188B

CN104988188B - 一种提高脱落酸发酵产量的方法

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Publication number: CN104988188B
Application number: CN201510429182.9A
Authority: CN
Inventors: 郑珩; 刘小欢; 劳兴珍; 余永柱; 张彦; 李瑞星
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2015-07-20
Filing date: 2015-07-20
Publication date: 2019-01-22
Anticipated expiration: 2035-07-20
Also published as: CN104988188A

Abstract

本发明涉及一种脱落酸的生产方法，尤其是一种提高脱落酸发酵产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明的方法包括斜面培养、种子培养及发酵工艺，在发酵工艺中添加钼酸及其盐类的一种或者两种以上的组合，从而提高灰葡萄孢霉菌发酵产天然脱落酸的产量。与现有技术相比，本发明可克服灰葡萄孢霉菌发酵过程中的菌丝结团及发酵液粘度高等问题，提高菌株对氧的利用率，促进脱落酸的生物合成，与原始工艺相比发酵产量提高50.1％‑162.5％，脱落酸发酵水平可达2.1g/L以上。本工艺所用发酵促进剂成本低，工艺简单，便于工业应用。

Description

一种提高脱落酸发酵产量的方法

技术领域

本发明涉及一种脱落酸的生产方法，尤其是一种提高脱落酸发酵产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

脱落酸是植物五大激素之一，在植物生长发育中起多方面作用：如调节气孔开闭，抑制种子发芽，控制胚胎和种子发育成熟，涉及抗逆作用如脱水，干旱，盐胁迫，低温，病虫害和机械创伤等环境因子应答。在农业中，可用于提高作物的抗旱、抗寒、抗盐能力，在其应用领域已经有大量专利报道，如公开号为CN104671979A的专利申请公开了一种含脱落酸的拌种剂，可提高东农冬麦1号抗寒能力；公开号为CN101199284的专利申请公开了一种含脱落酸的仁用杏树花果防冻剂；公开号为CN1229015C的专利申请公开了一种含脱落酸的花期延长剂等。脱落酸的生产方法主要可以分为三类：(1)从植物中提取；(2)化学合成；(3)微生物发酵法。其中植物中提取的方法因植物中含量极低，难以大量获得，成本过高而无应用价值。人工合成脱落酸为多种光学异构体的混合物，拆分困难，活性远小于天然型的脱落酸，售价昂贵，限制了其应用。而微生物发酵法是近年来兴起的天然脱落酸生产方法，已经在工业上推广应用。微生物发酵法生产脱落酸，主要使用的是真菌，如灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)，因为该菌发酵产量比其他微生物高，这在文献中已经有较详细的报道(陆丽珍等，氨基酸和生物资源2011,33(2)：23-26)。为提高其发酵产量，人们主要对其发酵液成分、营养物质、添加前体等进行了研究。例如：日本专利JP 5836393报道了在C.rosicola液体发酵培养基中添加鸟嘌呤，可使发酵产量提高；但由于鸟嘌呤价格较昂贵，在生产过程中成本较高；日本专利JP 0260590报道了在B.cinerea液体发酵培养基中添加柑橘干果皮提取物，可提高发酵产量，但由于柑橘果皮中含有抑制真菌生长的物质，且其含量受到柑橘种类、产地等因素的影响，在发酵中较难控制其添加量。郑珩等报道(氨基酸和生物资源2002,24(4)：25-27)了添加营养物质如玉米粉、柠檬酸钠等，可以提高灰葡萄孢霉菌液体发酵产脱落酸的产量，优化后脱落酸产量可达0.212克/升。公开号为CN1182798A的专利申请公开了一种采用三级发酵方法，在第三级发酵中采用连续流加补料出料以及菌种固定化，并添加关键底物如咪唑、吗啉、吡啶及其衍生物、乙酰胺、乙酸胺、甲羟戊酸等中的任一种，使脱落酸的产量可达到1.2克/升发酵液；公开号为CN 101041837A的专利申请公开了一种通过在发酵过程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工艺来提高脱落酸的产量。公开号为CN102399827 A的专利申请则通过在发酵过程中流加乙酰辅酶A作为菌株合成脱落酸的前体物质，同时，添加生物表面活性剂吐温-20改善发酵液溶氧状况来制备天然脱落酸的方法，可以提高脱落酸的发酵产量。尽管如此，上述现有技术仍存在一些问题，如工艺较复杂，添加的底物、前体或促进剂成本高，不利于生产的成本降低等，另外，在液体发酵过程中，还容易出现菌丝体结团、发酵液粘度大、溶氧降低等缺点，使得发酵产量难以进一步提高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种提高脱落酸发酵产量的方法，解决菌丝体结团、发酵液粘度大的问题。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种提高脱落酸发酵产量的方法，包括以下步骤：

第一步、对灰葡萄孢霉菌进行斜面培养3-5天，培养温度24-30℃；

第二步、经斜面培养的灰葡萄孢霉菌进行种子培养48-72小时，培养温度24-28℃；

第三步、经种子培养的灰葡萄孢霉菌进行发酵培养8-11天，培养温度24-28℃，培养时添加浓度为0.01-200mM的发酵促进剂,所述发酵促进剂为钼酸或钼酸盐中的至少一种；

第四步、经发酵培养的灰葡萄孢霉菌提取纯化,得到高产量的脱

落酸。

上述方法在发酵工艺中添加钼酸及其盐类的一种或者两种以上的组合，从而提高灰葡萄孢霉菌发酵产天然脱落酸的产量。上述方法中的灰葡萄孢霉菌As 3.4584，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

本发明通过以下技术方案进一步解决技术问题，所述第一步中，斜面培养采用PDA平板培养基。

所述第二步中，种子培养基的成分按重量百分比如下，葡萄糖1-3％，MgSO₄ 0.01-0.1％，KCl 0.01-0.1％，KH₂PO₄ 0.01-0.1％，谷氨酸单钠盐0.1-0.5％，FeSO₄·7H₂O0.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.5mg/L，CuSO₄·5H₂O 4.0mg/L，余量的水。

所述第三步中，发酵培养基的成分如下，蔗糖或葡萄糖

10-40/L，一水合柠檬酸1-10g/L，吐温-801-30g/L，玉米粉或玉米浆1-15g/L，豆油1-25g/L，山芋粉1-15g/L，钼酸盐1-100mM。所述钼酸盐为钼酸钠、钼酸钾、钼酸铵、钼酸钙、钼酸亚铁、钼酸镁、钼酸铜、钼酸锌中的至少一种，钼酸盐单独在121℃灭菌25min，在发酵过程中一次或分次添加至发酵培养基中。所述钼酸盐的添加量为0.01-200mM。

将含有灰葡萄孢霉菌的种子培养基以1％-10％的接种量接种至发酵培养基培养。

所述第四步中，提取纯化是将发酵后产物离心，收集发酵液，用盐酸调节pH至2-4，加入等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后，结晶得产品。

本发明利用钼酸盐可以一定程度上抑制菌丝生长，诱导菌丝从丝状变为短棒状或小球形，显著分散菌丝，改变菌丝形态，降低发酵液粘度，提高菌株对氧的利用率，大幅提高脱落酸的产量。本发明提高菌株对氧的利用率，促进脱落酸的生物合成，与原始工艺相比发酵产量提高50.1％-162.5％，脱落酸发酵水平可达2.1g/L以上。本工艺所用发酵促进剂成本低，工艺简单，便于工业应用。

附图说明

图1为本发明一个实施例中的效果对比图，A图为未加钼酸盐的菌丝生长情况，B图为添加钼酸盐后的菌丝生长情况。可以看出加入钼酸盐后菌丝更分散，不易结团，从而改善了菌丝与培养基之间的氧气及养分交换，促进了发酵产量的提高。

具体实施方式

实施例中所用灰葡萄孢霉菌As 3.4584，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，以下不再赘述。

实施例1

菌种活化用培养基为土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：称取新鲜土豆200g，洗净后去皮切成小块并煮沸30min，四层-八层纱布过滤，后加入葡萄糖20g和琼脂20g，充分溶解后补水至1L，121℃灭菌20min。将冻干保存的灰葡萄孢霉菌挑取到活化平板上，26℃培养活化5天。将活化后的菌体用无菌刮刀挑取到液体种子培养基中，打碎搅匀，置于26℃下，摇瓶培养72小时(200rpm)。液体种子培养基组成为(每升中含)：葡萄糖20g，MgSO₄ 0.2g，KCl0.5g，KH₂PO₄ 0.8g，谷氨酸单钠盐3.0g，FeSO₄·7H₂O0.5mg，ZnSO₄·7H₂O2.5mg，CuSO₄·5H₂O4.0mg。

发酵培养基组成为：蔗糖20/L，一水合柠檬酸6g/L，吐温-8010g/L，玉米粉3g/L，豆油10g/L，山芋粉10g/L。将配置好的发酵培养基分成2组，其中一组不加发酵促进剂，作为空白对照；另一组在培养基中加入发酵促进剂钼酸钠5mmol/L。每组按体积分别接种5％的液体种子，在27.5℃，200转/分振荡培养8天，测得钼酸钠组脱落酸产量为1.26g/L，而不加发酵促进剂的对照组产量为0.77g/L，比对照产量提高了63.6％。结果如图1所示，A为对照组，B为实施例，添加了钼酸盐的B培养皿中的菌丝体较A培养皿中的菌丝体分散明显。

实施例2

菌种活化及种子培养方法同实施例1。发酵培养基组成为：蔗糖30/L，一水合柠檬酸4g/L，吐温-805g/L，玉米粉4g/L，豆油6g/L，山芋粉15g/L。将配置好的发酵培养基分成2组，其中一组不加发酵促进剂，作为空白对照；另一组配制100mmol/L钼酸镁溶液，灭菌后在发酵0h、12h、24h、48h时分4次，分别加入发酵液体积2.5％的钼酸镁溶液。这两组的发酵条件为：液体种子接种量10％，培养温度为24℃，200转/分振荡培养10天，测得钼酸镁组脱落酸产量为2.1g/L，而不加发酵促进剂的对照组产量为0.80g/L，比对照产量提高了162.5％。

实施例3

菌种活化及种子培养方法同实施例1。发酵培养基组成为：蔗糖10/L，一水合柠檬酸10g/L，吐温-8015g/L，玉米粉5g/L，豆油15g/L，山芋粉5g/L。将配置好的发酵培养基分成2组，其中一组不加发酵促进剂，作为空白对照；另一组加入发酵促进剂0.1mmol/L钼酸以及5mmol/L钼酸亚铁，接种液体种子5％，培养温度为26℃，200转/分振荡培养10天，测得钼酸镁组脱落酸产量为1.7g/L，而不加发酵促进剂的对照组产量为0.84g/L，比对照产量提高了103.3％。

实施例4

菌种活化及种子培养方法同实施例1。发酵培养基组成为：蔗糖40/L，一水合柠檬酸3g/L，吐温-805g/L，玉米浆3g/L，豆油5g/L，山芋粉5g/L。将配置好的发酵培养基分成2组，其中一组不加发酵促进剂，作为空白对照；另一组在培养基中发酵促进剂0.5mmol/L钼酸铵，然后在发酵20h以及30h时分别加入0.5mmol/L钼酸钾溶液作为发酵促进剂。这两组接种液体种子量均为5％，培养温度为28℃，200转/分振荡培养11天，测得加入发酵脱落酸产量为1.88g/L，而不加发酵促进剂的对照组产量为0.74g/L，比对照产量提高了154.1％。

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims

1.一种提高脱落酸发酵产量的方法，包括以下步骤：

第三步、经种子培养的灰葡萄孢霉菌进行发酵培养8-11天，培养温度24-28℃，培养时添加浓度为1.5-200mM的发酵促进剂，所述发酵促进剂为钼酸或钼酸盐中的至少一种；

第四步、经发酵培养的灰葡萄孢霉菌提取纯化，得到高产量的脱落酸。

2.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于：所述第一步中，斜面培养采用PDA平板培养基。

3.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于：所述第二步中，种子培养基的成分按重量百分比如下，葡萄糖1-3%，MgSO₄0.01-0.1% ，KCl 0.01-0.1% ，KH₂PO₄0.01-0.1%，谷氨酸单钠盐0.1-0.5%，FeSO₄·7H₂O 0.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.5mg/L，CuSO₄·5H₂O 4.0mg/L，余量的水。

4.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于：所述第三步中，发酵培养基的成分如下，蔗糖或葡萄糖 10-40g/L，一水合柠檬酸 1-10g/L，吐温-80 1-30g/L，玉米粉或玉米浆 1-15g/L，豆油 1-25g/L，山芋粉 1-15g/L，钼酸盐1.5-200mM。

5.根据权利要求4所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于：所述钼酸盐为钼酸钠、钼酸钾、钼酸铵、钼酸钙、钼酸亚铁、钼酸镁、钼酸铜、钼酸锌中的至少一种，钼酸盐单独在121℃灭菌25min，在发酵过程中一次或分次添加至发酵培养基中。

6.根据权利要求4所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于：将含有灰葡萄孢霉菌的种子培养基以1%-10%的接种量接种至发酵培养基培养。

7.根据权利要求1所述提高脱落酸发酵产量的方法，其特征在于：所述第四步中，提取纯化是将发酵后产物离心，收集发酵液，用盐酸调节pH至2-4，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后，结晶得产品。