CN104988142A - 一种新型黄瓜snp分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型黄瓜SNP分子标记，所述分子标记的标号为SLAF7695，本发明利用简化基因组深度测序技术，共获得73,100个SLAF标签，通过多态性分析得到SNP、EPSNP、INDEL等3种类型的多态性标记5,355个，获得了140个与黄瓜白粉病抗性密切相关的差异标记，差异标记主要集中在第1和第6染色体上。成功定位了2个与白粉病抗病性状相关的侯选区域，得到7个与黄瓜白粉病抗性紧密连锁的特异标记，通过基因注释获得28个基因及相关注释信息，其中5个基因分别与防御应答、伤害应答和毒素分解代谢、细胞应激反应等功能相关，为探索黄瓜白粉病抗病机理和分子标记辅助选择育种提供了理论依据。

Description

一种新型黄瓜SNP分子标记

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种新型黄瓜SNP分子标记。

背景技术

黄瓜白粉病是一种广泛发生的世界性病害，是黄瓜主要叶部病害之一。其潜育期短、流行性强、周年发生，严重影响黄瓜产量与品质。目前，黄瓜白粉病的主要防治措施是化学防治，但产品农药残留量是不可忽视的安全问题，特别是利用设施栽培后，黄瓜生产的连作障碍问题越来越严重。因此，选育抗病品种仍是从根本上防治白粉病的有效途径。

分子标记技术的出现使人们对于基因的准确检测、目标基因的准确转移成为现实。研究者们利用AFLP、SSR等分子标记技术，对抗病基因进行了初步的定位，但抗病基因与分子标记的遗传距离普遍较远，说明黄瓜白粉病抗性分子机理非常复杂，更多科学问题有待于研究和探索，充分挖掘和利用这些抗性基因，将丰富黄瓜白粉病抗性育种中的抗性基因资源，并为黄瓜白粉病抗性育种中导入优良抗性基因提供重要基础。

SLAF-seq(specific length amplified fragment sequencing)技术是由高通量测序技术发展而来。通过生物信息学进行实验方案系统设计，构建SLAF-seq文库，筛选特异长度DNA片段，以高通量测序技术获得海量序列，利用软件进行数据分析比对，获得大量特异DNA片段，进而依据其序列发展出特异分子标记。SLAF-seq技术具有通量高、准确性高、成本低、周期短等突出优势，依其测序结果可直接开发大量特异分子标记。该技术可用于单体型图谱、遗传图谱、关联性图谱、多态性图谱的构建，为分子育种、系统进化、种质资源鉴定提供重要技术保障。本发明利用SLAF-seq技术开发了一批特异性强、稳定性高的黄瓜白粉病抗性特异分子标记，为育种中导入抗性优良基因进行分子标记辅助选择提供重要基础。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种新型黄瓜SNP分子标记，为探索黄瓜白粉病抗病机理和分子标记辅助选择育种提供了理论依据。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种新型黄瓜SNP分子标记，所述分子标记的标号为SLAF7695，其核苷酸序列为

TACAATTACACCGTCTAAGTTTTTTATTATTAAAATTCAGCCTAAATAAAATTGAGCTCTCAAACTTTTACTATGGAAAAATTTCTAATATTGTGCAATAACTTATTTGCCAAACACGTTCTTCTTTGTAGGACATAACTTACTTTTAAAATTAAACATTTGAAAAGTTAAACTAAACGCATCCTGAATTTAACGGTTTTATACTTTTTATCATTTGAGGTTTAGTTTCTGCAATTATGATAAGGGCAAGGGTCTAGTTTTAATATTTGCATGAATTTAAAGATTCAATTTTTAAGTTTAAGCATATAATTGCAACGGTGATCATTTTAGGAGTGATTTAGATTTTACGATTTCTATTAAGAAAAGAATAAAAACTAAAGAACCAAAAACAAGCTAATTAAGTTCTTGGGAGTTCTAAAAATGGATTCCCTCAACAACAAAGCTCAAATGATAAAAAGCCTCACACACAAATTCCAATTCCCCACATTATCATCAATCAAACAATCGACAACGACGAAGATGGAAGCGGTGCAACGACGACAGTACTTGGGAGCGGCACGGGGACAGAGGATGAAGAGGATGGAGACGACATTGGAAACGATTAAAGAAATAAGATCTCCGAGAGAAAGAGTGGTTGAAGCAACAAAAATGTGGAAGAAATCAGTGAAGAAATGGTGGAAAAACAATGGAGAGAATAAGAGGAAAGGTGGTAGAGTTGCAAAATACAAATTATATGATTTGAATTCTTCAAAACTCAAGATTTCCATCAACAATGGCTTCAAATGGATGAAGAACAACAAATGTTGACAGTTCCATCTCTTC[A/T]TTTTTAAACATCAAACAACCTGAGATTTCTTTGATTAATTAATTCATGTCCACAATTAATTACTTAATTATTTTGTAGATTTATGTAGTCAATACAAAATCAACTAAATGTATATTCTTGTATGTTTTATTCTATACTACTAATTACTCTATTTGTACACTCACTTCCATGTGTATCATTCATACATTATTTATATTCAACCTATTTTTTTAGTATTAGCCAAGCTCACTTTTGTTATTAATCCTAAAGATAATCATACAACAAATGAAGGTATATAATATAATTTTATATTTAATTGATACGATATGAACTATATATATTGTAGGCAGAAAAAAGAACAAAATAGCAAACATACCAACAATAAAAATAAATAATTATAGGAGTTATATTATATTGTGTTCAATTTTACGTTATTTTGTTTGAAATTGTCCTGAGAAACATGTAAGAAAAAAAAATCAATTCATAAACACTATGTTCAATTTTTGTGAAATAATTAATCTCTTATCTTAATAAAGATCTAATGTCACGGACTCACTTTTCCATATTTCGAAATCAAAATTGCTACAATCACAATAGG。

本发明具有以下有益效果：

有助于黄瓜白粉病抗性基因定位，为黄瓜白粉病抗性育种中的分子标记辅助选择提供依据。

附图说明

图1为本发明实施例新型黄瓜SNP分子标记的核苷酸序列表。

图2为本发明实施例中SLAF标签在染色体上的分布图。

图3为本发明实施例中第1染色体上深度分布图。

图4为本发明实施例中多态性标记在各染色体上的分布图。

图5为本发明实施例中差异标记在各染色体上的分布图。

图6为本发明实施例中第1染色体上差异比值整体分布图。

图7为本发明实施例中第1染色体差异标记遗传图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

图1为本发明实施例中分子标记的核苷酸序列表，其中两对引物分别是：

F：  5′ ATGGAGACGACATTGGAAACG 3′  580

R：  5′ ATGGAAAAGTGAGTCCGTGA 3′  1367

本发明实施例中以抗病材料BK2为父本、感病材料H136为母本，根据其接种白粉病后的抗/感表现，利用BSA法在前期构建的F₂群体中，挑取50个抗白粉病和感白粉病的家系组成抗/感白粉病池。材料均种植于浙江省农业科学院杨渡试验基地。将亲本BK2、H136及F₂群体株系在可调控温度、湿度的智能温室内盆栽。于黄瓜幼苗一叶一心期，采用喷雾接种法，接种浓度为1×10⁴-1×10⁶个孢子/ml。接种后每三天观察、记录一次发病情况，共记录15天。然后根据抗/感白粉病的表现型结果，挑取高抗和高感的家系各50个组成抗/感白粉病池。

实施例

取两叶一心期的材料嫩叶，采用改良的SDS法提取其基因组DNA，稀释至60ng/μL，经1％琼脂糖电泳检测浓度。利用酶切预测软件SLAF_Predict系统分析黄瓜基因组，根据其GC含量、重复序列和基因特点等确定酶切方案、切胶范围及测序量，以保证分子标记的密度和均匀性。

分别取基因组DNA各500ng，加0.6U Mse I(NEB，Hitchin，Herts，UK)、T4DNA连接酶(NEB)、ATP(NEB)和Mse I接头(NEB)在37℃下反应15h，65℃退火1h，然后加限制性内切酶Hae III和Bfa I在37℃下反应3h。反应结束后用Quick Spin column(Qiagen)纯化酶切产物，并用33μL EB回溶。以回收的酶切产物为模板进行PCR反应，反应体系25μL，包括模板DNA 100ng、10×buffer 2.5μL、2.5mmol/L、dNTP 2μL、5U/μL的Taq DNA合成酶(NEB)0.3μL、10μmol/L MseI引物2μL、ddH20加至25μL。PCR产物经E.Z.N.A.Cycle Pure Kit(Omega)纯化后，加入Mse I、T4 DNA连接酶、ATP及Solexa接头，37℃下反应5h。利用Quick Spin Column Qiagen)纯化产物，2％琼脂糖胶电泳。利用Gel Extraction Kit(Qiagen)回收琼脂糖胶中230-250bp的条带，并以其为模板，在含Phusion Master Mix(NEB)和Solexa引物混合物中进行PCR扩增，扩增产物经纯化后用Illumina GAIIx(Illumina，San Diego，CA，USA)测序。

每个样品的测序有效数据量需达到50,000个以上，测序深度5×以上。利用软件SLAF_Poly.pl.对测序结果进行识别和低质量过滤，得到有效原始DNA序列数据，再利用比对软件BLAT将各样品有效数据分别进行相似度聚类，并通过深度识别，纠正测序错误，得到各样品有效序列。

参考基因组为黄瓜参考基因组，基因组组装为染色体，基因组经酶切处理打断为多个小片段，每个片段相当于一个标记位点，同一位点reads序列通过相似性聚类，形成一个group；group中高深度片段即为潜在基因型，低深度片段可能是测序错误，通过纠错策略对低深度片段进行纠正，最终获得具有1个或多个等位基因的SLAF标签。根据SLAF标签的基因组定位结果，统计SLAF标签在各染色体上的数量，绘制SLAF标签在染色体上的分布图。

对得到的SLAF标签，根据等位基因数和基因序列之间的差异进行多态性分析，获得多态性标记的类型和数量，对获得的多态性标记根据定位结果，统计其在各染色体上的分布情况。

对获得的多态性标记进行亲本数据标准化，根据亲本测序深度确定等位基因的亲本来源，选取一种基因型来源于P(H136)，另一种基因型来源于M(BK2)的多态性标记。分别计算两个群体aa、ab(感池、抗池)中来源于不同基因型的差异比值(Ratio)，根据Ratio_aa＞＝1与Ratio_ab＞＝3筛选差异标记，获得差异标记及其在染色体上的数量分布。

差异比值计算方法如下：

Maa表示aa群体来源于M的深度；Paa表示aa群体来源于P的深度；Mab表示ab体来源于M的深度；Pab表示ab群体来源于P的深度；

Ratio_aa＝Paa/Maa；当Maa＝0时Ratio_aa＝1000；Ratio_ab＝Mab/Pab；当Pab＝0时Ratio_ab＝1000。

结果与分析

采用SLAF-seq技术，获得父本BK2、母本H136及抗/感白粉病池的原始序列。经测序共获得各样品的有效reads为16,977,114条，4个样品的Reads数分别达3,293,311、4,517,307、5,073,477和4,093,019，达到预期目标。Reads长度、数量和GC含量的统计结果见表1。

表1样品数据量统计

表中：Sample：样品编号；BMK-ID：样品；Read length：使用的read长度；Read number：各样品的reads数；GC percentage：GC含量。

测序得到的有效SLAF片段，其DNA序列经与黄瓜基因组序列进行比对，获得有效的SLAF标签数量为73,100个，整体平均深度为99.11x。

根据SLAF标签的基因组定位结果，SLAF标签在各染色体上的数量分别为11,067、8,799、14,583、8,786、10,565、11,009和7,388，部分SLAF定位在scaffold，SLAF标签在基因组各染色体上分布均匀(表2)。如图2所示，横坐标表示各染色体的位置，纵坐标表示各染色体编号，颜色越深度表示此位置SLAF标签数量多，颜色

越浅表示SLAF标签数量少。图中黄色集中的区段可能是着丝粒所在位置。

表2SLAF标签在染色体上的数量统计

表中：Chr ID：染色体编号；SLAF number：SLAF标签在染色体上的数量，Other：定位在scaffold上的SLAF。

对获得的73,110个SLAF标签，绘制各染色体的SLAF标签的深度分布图，SLAF标签在第1染色体上的深度分布如图2所示，图中，横坐标表示各染色体的位置，纵坐标表示SLAF深度，当SLAF深度＞1000时图中用1000表示。

对得到的73,100个SLAF标签，根据等位基因数和基因序列之间的差异进行多态性分析，获得5,355个多态性标记，共得到6种类型的SLAF标签，其中多态性标记分为SNP、EPSNP、INDEL共3种类型。SLAF结果统计见表3。

表3各类型SLAF结果统计

表中：SNP：单核苷酸突变；EPSNP：酶切位点突变；INDEL：插入删除；No Polymorphism：没有多态性；Unknown：类型未知；Repeat：重复序列。

根据定位结果，统计多态性标记在各染色体上的数量，多态性标记在7条染色体上均有分布，在各染色体上的分布结果见表4和图3，如图3所示，横坐标表示各染色体的位置，纵坐标表示各染色体编号，颜色越深度表示此位置SLAF数量多，颜色越浅表示SLAF数量少。

表4多态性标记在各染色体上的数量统计

表中：Chr ID：染色体编号；Marker number：多态性标记在染色体上的数量，Other：定位在scaffold上的SLAF。

对得到的5，355个多态性标记，进行亲本数据标准化，根据亲本测序深度确定等位基因的亲本来源，通过差异比值Ratio，得到差异标记共140个(Ratio_aa＞＝1&&Ratio_ab＞＝3)。差异标记在染色体上数量分布统计和分布图分别见表5和图5，如图5所示，横坐标表示各染色体的位置，纵坐标表示各染色体编号，颜色越深度表示此位置SLAF数量多，颜色越浅表示SLAF数量少。

表5差异标记在染色体上数量分布统计

表中：Chr ID：染色体编号；Diff_Marker number：差异标记在染色体上的数量。

由表5和图5可知，差异标记在各染色体上均有分布，其中，主要集中在第1染色体和第6染色体上。超过阈值的差异标记呈现连续分布3个以上，作为相关的侯选区域。结合数据得知差异标记在第1染色体和第6染色体上均呈现连续分布。通过差异比值描述群体差异标记在第1染色体上的分布情况，结果如图6所示，横坐标表示染色体位置，纵坐标表示差异比值。图中纵坐标值在红线以上表示对应Marker与目标性状强相关，值越大关联性越强。

对分析得到的140个差异标记进行关联区域分析，共得到2个相关侯选区域，关联区域信息统计见表6。

表6关联区域信息统计表

表中：Chr ID：染色体编号；Start：侯选区域起始位置；End：侯选区域终止位置；Size：区域大小，以Mb为单位；Marker number：区域内差异标记数量；Gene number：区域内基因数量。此处将关联区域起止位置均向两端延伸了1-5K不等。

对定位得到的140个差异标记，绘制其在染色体的遗传图。在第1染色体上的关联区域如图7所示，左侧柱表示染色体，柱左侧数据表示标记的起始位置，柱右侧编号表示SLAF编号，蓝色标记为关联区域内的标记。右侧柱表示关联区域，柱右侧编号为mRNA的ID号的起始位置。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种新型黄瓜SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记的标号为SLAF7695，其核苷酸序列为

TACAATTACACCGTCTAAGTTTTTTATTATTAAAATTCAGCCTAAATAAAATTGAGCTCTCAAACTTTTACTATGGAAAAATTTCTAATATTGTGCAATAACTTATTTGCCAAACACGTTCTTCTTTGTAGGACATAACTTACTTTTAAAATTAAACATTTGAAAAGTTAAACTAAACGCATCCTGAATTTAACGGTTTTATACTTTTTATCATTTGAGGTTTAGTTTCTGCAATTATGATAAGGGCAAGGGTCTAGTTTTAATATTTGCATGAATTTAAAGATTCAATTTTTAAGTTTAAGCATATAATTGCAACGGTGATCATTTTAGGAGTGATTTAGATTTTACGATTTCTATTAAGAAAAGAATAAAAACTAAAGAACCAAAAACAAGCTAATTAAGTTCTTGGGAGTTCTAAAAATGGATTCCCTCAACAACAAAGCTCAAATGATAAAAAGCCTCACACACAAATTCCAATTCCCCACATTATCATCAATCAAACAATCGACAACGACGAAGATGGAAGCGGTGCAACGACGACAGTACTTGGGAGCGGCACGGGGACAGAGGATGAAGAGGATGGAGACGACATTGGAAACGATTAAAGAAATAAGATCTCCGAGAGAAAGAGTGGTTGAAGCAACAAAAATGTGGAAGAAATCAGTGAAGAAATGGTGGAAAAACAATGGAGAGAATAAGAGGAAAGGTGGTAGAGTTGCAAAATACAAATTATATGATTTGAATTCTTCAAAACTCAAGATTTCCATCAACAATGGCTTCAAATGGATGAAGAACAACAAATGTTGACAGTTCCATCTCTTC[A/T]TTTTTAAACATCAAACAACCTGAGATTTCTTTGATTAATTAATTCATGTCCACAATTAATTACTTAATTATTTTGTAGATTTATGTAGTCAATACAAAATCAACTAAATGTATATTCTTGTATGTTTTATTCTATACTACTAATTACTCTATTTGTACACTCACTTCCATGTGTATCATTCATACATTATTTATATTCAACCTATTTTTTTAGTATTAGCCAAGCTCACTTTTGTTATTAATCCTAAAGATAATCATACAACAAATGAAGGTATATAATATAATTTTATATTTAATTGATACGATATGAACTATATATATTGTAGGCAGAAAAAAGAACAAAATAGCAAACATACCAACAATAAAAATAAATAATTATAGGAGTTATATTATATTGTGTTCAATTTTACGTTATTTTGTTTGAAATTGTCCTGAGAAACATGTAAGAAAAAAAAATCAATTCATAAACACTATGTTCAATTTTTGTGAAATAATTAATCTCTTATCTTAATAAAGATCTAATGTCACGGACTCACTTTTCCATATTTCGAAATCAAAATTGCTACAATCACAATAGG。