CN108384873A

CN108384873A - 用于西瓜绿凤凰杂交种子纯度鉴定的ssr标记及方法

Info

Publication number: CN108384873A
Application number: CN201810160859.7A
Authority: CN
Inventors: 阿门; 卢霞; 张雪来; 司龙亭
Original assignee: Jiangsu Green Harbor Modern Agriculture Development Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Green Harbor Modern Agriculture Development Co Ltd
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2018-08-10

Abstract

本发明提供了一种用于西瓜绿凤凰杂交种子纯度鉴定的SSR标记及方法。具体步骤为用改良的CTAB法分别提取绿凤凰父本、母本以及待测F1幼苗叶片的基因组DNA；琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测所提DNA的质量与浓度；以上述提取的DNA为模板，用SSR标记ClSSR01623进行PCR扩增；对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；对电泳结果进行分析。杂交品种绿凤凰中扩增出同时含有父母本带型的杂合条带119/110bp，可以很清晰的鉴定西瓜杂交品种绿凤凰的纯度。本发明的方法建立一种快速、高效鉴定西瓜杂交品种绿凤凰种子纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定时间，节省鉴定成本，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。

Description

用于西瓜绿凤凰杂交种子纯度鉴定的SSR标记及方法

技术领域

本发明涉及一种用于西瓜品种绿凤凰杂交种子纯度鉴定的SSR标记及其方法，属于生物技术领域。

背景技术

西瓜（Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai）属葫芦科(Cucurbitaceae) 西瓜属（Citrullus），为异花授粉植物，其果实脆嫩，味甜多汁，营养丰富，富含多种矿物质和维生素，广泛在各地栽培种植。我国是西瓜最大的生产国和消费国（Ren et al., 2014），自20 世纪80 年代以来，西瓜杂交品种在我国迅速普及推广，栽培面积逐年扩大，已成为增加农民收入和促进农村经济发展的重要作物之一（刘子记等, 2016;周先林等, 2011）。

种子纯度是种子质量的重要指标，种子纯度在95%以下属于劣质种子，会明显降低作物的产量和品质，给生产造成严重损失（周先林等, 2011; 李丽等, 2015 ）。因此，西瓜杂交种种子在包装销售前必须通过纯度检测，这对保证种子质量和提高生产效益具有重要意义。当前西瓜纯度鉴定主要方法是传统的田间小区种植鉴定法，整个鉴定过程周期长、费时费工、占地面积较大，且易受环境影响导致鉴定结果不准确，不能满足当年生产需要(方淑桂等, 2009; 栾雨时等, 1998)。

近年来，随着测序技术的迅速发展，使得从基因组水平上检测杂交种纯度成为可能。分子标记技术能够从DNA 水平上检测子代与亲本间的微小差异，不受时空限制，可以大大缩短检测时间（谭美莲等, 2012）。在真核生物基因组中，SSR 标记具有数量丰富、分布均匀、操作方便、共显性遗传、稳定性好等有优点，是进行杂交种纯度鉴定的理想标记类型。西瓜基因组已经完成测序，有很多开发的SSR标记。周贤达等（2012）以3个西瓜杂交一代品种及其亲本为试验材料，利用EST-SSR 标记对西瓜杂交种纯度进行了快速鉴定。刘子记等用SSR标记对小型西瓜品种“美月”做了纯度鉴定，鉴定结果与田间鉴定一致。分子标记技术的发展为高效、准确检测西瓜品种纯度提供技术支撑。

绿凤凰为本公司（江苏绿港现代农业发展有限公司）自主研发的一代杂交种，拥有完全自主知识产权的新品种，是以“L55”为母本，“F92”为父本育成的早熟黄瓤礼品型西瓜品种。该品种田间生长势较强，易坐果，抗逆性、抗病性中，适宜江苏省及类似生态条件地区栽培。近年来，绿凤凰已逐步成为礼品西瓜主栽品种，栽培面积逐年扩大。因此，开发出能快速、高效鉴定绿凤凰种子纯度的SSR分子标记技术将保证该优良品种的经济效益最大化，具有较高的商业应用前景。

发明内容

为了克服西瓜杂交种纯度的鉴定周期长、费时费工、占地面积大，易受环境影响等田间小区种植鉴定法的不足，本发明的目的在于提供用于西瓜品种绿凤凰杂交种子纯度鉴定的SSR引物，并建立一种快速、高效、准确的鉴定西瓜品种绿凤凰杂交种子纯度鉴定的方法。

本发明利用选取的32对西瓜SSR标记对亲本DNA进行扩增、电泳，筛选有多态性的引物，成功选取到SSR标记ClSSR01623，正向引物序列：

5'- AGAGGAAACCTTGCAGCTTG - 3'，反向引物序列：5'- TCCTTCCTGTGGATGTAGGC - 3'，可以用来清晰区分绿凤凰父母本的带型（图1），并对父母本的PCR扩增产物进行测序，测序结果（图2），发现在母本中扩增出110bp的序列（SEQ ID N0.3），父本中扩增出119bp的序列（SEQ ID N0.4）。

本发明提供的用于西瓜杂交品种绿凤凰种子纯度鉴定的方法，具体步骤如下：

（1）分别提取绿凤凰父本、母本以及待测F1幼苗叶片的基因组DNA；

（2）用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测所提DNA的质量与浓度

（3）以上述提取的DNA为模板，选择SSR引物ClSSR01623进行PCR扩增；

（4）对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

（5）对电泳结果进行分析：

绿凤凰的SSR标准图谱为同时具有两个亲本特异性条带的图谱，在父本中扩增出119bp的特异性条带，母本中扩增出110bp的特异性条带。被检测的种子的电泳图谱与绿凤凰标准图谱一致时，鉴定为绿凤凰。

本发明中，PCR扩增采用25μl反应体系，包括12.5μl 2×Taq MasterMix，μl DNA提取物，10μM的正反向引物各1μl，9.5μl ddH2O。PCR扩增的程序为：94℃预变性2min，[94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s]，35个循环，72℃延伸2min，然后反应保持在16℃。

本发明中，所述电泳的检测方法为：在25μl PCR产物加入3μl loading Buffer，取1μl上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测。

本发明的有益效果：本发明筛选出的SSR标记ClSSR01623，在父本中扩增出119bp的特异性条带，母本中扩增出110bp的特异性条带，而在杂交品种绿凤凰中扩增出同时含有父母本带型的杂合条带119/110bp，且条带清晰，遗传性稳定，可将西瓜杂交品种绿凤凰与其父母本种子、其他混杂种子区分开来，快速检测出西瓜杂交品种绿凤凰的纯度。通过本发明，只需简单提取西瓜叶片基因组DNA，然后进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可有效的鉴定西瓜杂交品种绿凤凰的纯度。本发明避免了传统田间小区鉴定周期长、费时费工、占地面积大等的不足，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，大大缩短鉴定时间，节省鉴定成本，提高鉴定准确度，具有较强的商业应用价值。

附图说明

图1为利用ClSSR01623引物进行SSR标记扩增的绿凤凰亲本与杂交品种的电泳图。

图2为绿凤凰父母本测序结果。

其中：图1中M表示500bp的Marker。图2中绿凤凰父母本各测序两次，分别表示为1、2；其中前20个碱基为前引物序列，后20个碱基为后引物反向序列。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

（一）材料与方法

1. 植物材料

本研究使用西瓜杂交品种绿凤凰与其母本、父本的种子为实验材料，根据江苏绿港现代农业发展公司（简称绿港）实验方法进行播种和管理。

2. DNA的提取与检测

利用改良的CTAB法，从21天左右新鲜植物叶片中提取西瓜基因组DNA。所述改良的CTAB法包括以下步骤：

1）取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中2min，然后利用组织研磨仪磨样；

2）在磨好的样中加入600µl CTAB，55℃水浴15min；

3）12000rpm离心5min，吸取500µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入250µl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；

4）13000rpm离心90s，取350µl上清于另一新的1.5ml离心管中，加入在-20℃条件下提前预冷的无水乙醇600µl、加入60µl乙酸铵，混匀，放-20℃冰箱1h；

5）13000rpm离心5min，倒掉上清液，室温放置；

6）待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH₂O溶解DNA。

琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA的质量与浓度。

3. PCR扩增及检测

PCR扩增在中国华盛公司LY96G ThermocyclerTM扩增仪上进行，反应体系为25μL，包括12.5μl 2×Taq MasterMix，1μl DNA提取物，10μM的正反向引物各1μl，9.5μl ddH2O。PCR扩增的程序为：94℃预变性2min，[94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s]，35个循环，72℃延伸2min，然后反应保持在16℃。在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离PCR扩增的片段，进行银染，并在白光下显现。

4. 具有多态性的标记筛选及纯度鉴定

选取32对西瓜SSR标记（Zhu et al., 2016），利用亲本筛选具有多态性引物。通过标记进行亲本DNA的扩增，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选出可以明显区分父母本的标记，即为有多态性的标记。

用筛选到的具有多态性的标记，进行西瓜杂交品种绿凤凰的扩增，进行其纯度鉴定。

（二）结果与分析

1. 所选材料的基因组DNA的检测分析

使用超微量紫外可见分光光度计（DeNovix DS-11）对本研究所提取的96个（其中父母本各1个，F1群体94个）西瓜叶片基因组DNA进行浓度检测，发现提取的DNA浓度均高于100ng/μl，而且OD260/OD280基本都在1.8~2.0之间。取不同浓度DNA用 2%的琼脂糖电泳检测，电泳图清晰明亮，无明显拖尾，说明提取的DNA质量较好。所以，提取到的高质量西瓜叶片基因组DNA，适用于PCR扩增、SSR等分子标记的生物学试验。

2. PCR扩增与纯度鉴定

利用选取的32对西瓜SSR标记对亲本DNA进行扩增、电泳，筛选有多态性的引物。成功选取到SSR标记ClSSR01623，可以用来清晰区分绿凤凰父母本的带型（图1），并对父母本的PCR扩增产物进行测序，测序结果见图2，发现在母本中扩增出110bp的序列（SEQ ID N0.3），父本中扩增出119bp的序列（SEQ ID N0.4）。

上述SSR标记ClSSR01623的序列为：正向引物序列：5'- AGAGGAAACCTTGCAGCTTG -3'（SEQ ID N0.1），反向引物序列：5'- TCCTTCCTGTGGATGTAGGC - 3'（SEQ ID N0.2）

绿凤凰母本序列SEQ ID N0.3：agaggaaaccttgcagcttgaagaaatcaaagaagaagaagaagaaga

agaagaactaagacagtgttttacgtggttcggctaagatcagcctacatccacaggaagga

绿凤凰父本序列SEQ ID N0.4：agaggaaaccttgcagcttgaagaaatcaaagaagaagaagaagaaga

agaagaagaagaagaactaagacagtgttttacgtggttcggctaagatcagcctacatccacaggaagga

利用ClSSR01623标记对西瓜杂交品种绿凤凰群体扩增进行纯度鉴定，结果见图1，图中可以清晰的看出，在父本中扩增出119bp的特异性条带，母本中扩增出110bp的特异性条带，被检测种子的电泳图谱均与绿凤凰标准图谱一致，为同时具有两个亲本特异性的条带119/110bp（图1），表明西瓜杂交品种绿凤凰纯度达到了100%，所用SSR标记ClSSR01623可以高效稳定的鉴定西瓜杂交品种绿凤凰的纯度。

<110> 江苏绿港现代农业发展有限公司

<120> 用于西瓜绿凤凰杂交种子纯度鉴定的SSR标记及方法

<140>201810160859.7

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agaggaaacc ttgcagcttg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccttcctgt ggatgtaggc 20

<210> 3

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agaggaaacc ttgcagcttg aagaaatcaa agaagaagaa 40

gaagaagaag aagaactaag acagtgtttt acgtggttcg 80

gctaagatca gcctacatcc acaggaagga 110

<210> 4

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaggaaacc ttgcagcttg aagaaatcaa agaagaagaa 40

gaagaagaag aagaagaaga agaactaaga cagtgtttta 80

cgtggttcgg ctaagatcag cctacatcca caggaagga 119

Claims

1.用于西瓜绿凤凰杂交种子纯度鉴定的SSR标记，其特征在于，包括正向引物序列：5'-AGAGGAAACCTTGCAGCTTG - 3'，反向引物序列：5'-

TCCTTCCTGTGGATGTAGGC - 3'。

2.一种采用权利要求1所述引物，用于西瓜绿凤凰杂交种子纯度鉴定的SSR标记方法，其特征在于，按如下的步骤进行：

（1）用改良的CTAB法提取绿凤凰父本、母本以及待测F1幼苗叶片的基因组DNA；

（2）用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测所提DNA的质量与浓度；

（4）对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

（5）对电泳结果进行分析。

3.据权利要求2所述的用于西瓜绿凤凰杂交种子纯度鉴定的SSR标记方法，其特征在于，所述步骤（3）中PCR扩增的反应体系为25μL，包括12.5μl 2×Taq MasterMix，1μl DNA提取物，10μM的正反向引物各1μl，9.5μl ddH2O；PCR扩增的程序为：94℃预变性2min，[94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s]，35个循环，72℃延伸2min，然后反应保持在16℃。

4.据权利要求2或者3所述的用于西瓜绿凤凰杂交种子纯度鉴定的SSR标记方法，其特征在于，对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%；在25μl PCR产物加入3μl loading Buffer，取1μl上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测。

5.一种利用如权利要求2～4任一所述的用于西瓜绿凤凰杂交种子纯度鉴定的SSR标记方法，其特征在于，绿凤凰的SSR标准图谱为同时具有两个亲本特异性条带110/119bp的图谱，在父本中扩增出119bp的特异性条带，母本中扩增出110bp的特异性条带，被检测种子的电泳图谱与绿凤凰标准图谱一致时，鉴定为绿凤凰。