CN104914176A - 一种定量分析微量血干血滤纸片上视黄醇及其前体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测视黄醇及其前体的方法，包括以下步骤：（1）从样品中萃取视黄醇和/或其前体；（2）HPLC分离视黄醇和/或其前体；（3）MS/MS定量检测；所述样品是干血滤纸片标本，采用的萃取剂为三氯甲烷。本发明利用滤纸片作为载体吸附微量血，制成干血滤纸片，克服了以往收集血清检测视黄醇时静脉血采集时取血多，人群依从性差，动物模型抽血死亡，标本不方便远距离运送等困难。本发明基质效应小、在标准曲线中的浓度范围内分析的线性关系良好、检出限较低、灵敏度高、准确性好、精密度高，与HPLC方法检测血清视黄醇结果具有相关性，并同时同步分析样品中视黄醇及其前体含量，为全面评估体内视黄醇水平提供了方法。
Description
技术领域
本发明涉及微量血干血滤纸片中视黄醇及其前体的分析检测方法。
背景技术
血液中视黄醇均需从动植物食品中摄入，由其前体物质：β-胡萝卜素、视黄醇乙酸酯和视黄醇棕榈酰酯在肠粘膜和肝细胞中转化形成，共同存在于血液中。只有综合视黄醇及其前体的含量信息才能全面衡量体内视黄醇的水平。
目前，普遍采用用荧光、紫外线分光光度法和高效液相色谱仪(Highperformance liquid chromatography，HPLC)定量分析血清或血浆中视黄醇，前两种方法萃取步骤繁琐，结果受杂质影响大；而HPLC法可对血清中复杂组分进行分离，其检测敏感性与特异性相对较高，但多数仅开发了检测视黄醇的方法，少有分析其多种前体的方法。
此外，以上技术所需静脉血量均较大，约1-2ml，对于人群则必须抽取静脉血，对于实验动物也须取静脉血，有的甚至需处死后取血，无论对于人群，还是对于动物，其依从性均较差，且标本不便于远距离运送，这为分析人群和动物模型视黄醇及其前体水平，研究其生理病理功能带来较大困难。Whatman滤纸片能稳定、均一、定量吸附血液，是一款通过美国FDA验证通过的体外二级诊断用产品。通过采集微量血，吸附于Whatman滤纸片上，形成干血滤纸片，以便于标本的采集、保存和运输，也可弥补基层或部分缺乏高端检测仪器及其操作人员的不足而不能分析视黄醇水平，同时已证实视黄醇可稳定存在干血滤纸片中。因此，采集微量血制成干血滤纸片是广泛分析人群和动物模型视黄醇水平的理想标本。然而，这种标本血液标本甚少(约10μL)，且在其中的含量甚微，而传统HPLC的灵敏度相对低，不能分析。目前国际、国内仍缺乏分析利用干血滤纸片定量分析视黄醇及其前体的方法。
串联质谱(tandem mass spectrometry，MS/MS)仪具有高选择性、高灵敏度的优势，是近年来飞速发展的技术，与HPLC对复杂样品的高分离浓缩、高通量能力的优点结合起来，对微量生物样品多组分同步分析具有突出优势，为解决这一技术难题提供了可能。但文献中对串联质谱中分析视黄醇及其前体的各项参数报道较少，且仪器厂家、型号的差异，导致没有现成的检测参数可以采用，必须根据本研究单位自己优化确定。此外，HPLC对视黄醇及其前体的分离方法的报道也较少，且分析时间较长，约30min，不利于大样本分析。同时，提取干血滤纸片视黄醇及其前体的方法尤为重要，是能有效检测的前提，它将影响整个方法的灵敏度。但目前国际、国内仍缺乏分析从干血滤纸片中提取视黄醇及其前体的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量分析微量血干血滤纸片中视黄醇及其前体的方法。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
一种检测视黄醇及其前体的方法，包括以下步骤：
(1)从样品中萃取视黄醇和/或其前体；
(2)HPLC分离视黄醇和/或其前体；
(3)MS/MS定量检测；
所述样品是干血滤纸片标本，采用的萃取剂为三氯甲烷。
上述萃取步骤包括蛋白变性步骤，采用试剂为含有0.1％BHT和0.025mmol/LKOH的甲醇。
上述从样品中萃取视黄醇和/或其前体包括以下步骤：
①血片溶解：将载有微量血的干血滤纸片用打孔器打出直径3.2mm(即3.2μl的全血)圆形滤纸血片，置于1.5ml EP管中，加入100μl含0.1％BHT作为抗氧化剂的去离子水，室温振摇，1000rpm，2min，充分溶解血液；
②蛋白变性：取步骤①所得血斑标本，加入200μl含有0.1％BHT和0.025mmol/LKOH的甲醇变性沉淀蛋白质，漩涡震荡2min；
③萃取：以300μl三氯甲烷作为萃取剂，取步骤②所得的所有溶液，在其中加入萃取剂，室温振摇2min，离心13200rpm，8min；
④小心吸取含视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯、β-胡萝卜素的有机溶剂层(底层)180μl，氮气吹干。加入100μl流动相充分溶解。HPLC-MS/MS上机检测。
上述HPLC分离视黄醇和/或其前体步骤中，采用C8色谱柱，甲醇∶CH2CL2＝95∶5(v/v)为流动相，以0.2ml/L等度流速，保持柱温20℃进行液相分离。
上述MS/MS定量检测步骤中，以APCI离子源作为离子源，MRM质谱检测参数采用表1所示。
表1 MS/MS定量检测优化参数
| compounds | Q1(m/z) | Q3(m/z) | DP | EP | CEP | CE | CXP |
| 视黄醇 | 269.3 | 93.3 | 44.28 | 4.70 | 13.96 | 34.72 | 2.56 |
| 视黄醇乙酸酯 | 269.3 | 93.3 | 44.28 | 4.70 | 13.96 | 34.72 | 2.56 |
| 棕榈酰酯 | 269.3 | 93.3 | 44.28 | 4.70 | 13.96 | 34.72 | 2.56 |
| β-胡萝卜素 | 536.9 | 95.1 | 54.32 | 4.13 | 27.21 | 65.00 | 2.98 |
| d6-视黄醇乙酸酯 | 274.5 | 88.3 | 63.89 | 5.08 | 15.31 | 31.00 | 2.96 |
上述MS/MS定量检测步骤中，MRM质谱检测参数的筛选包括以下步骤：
I.多反应检测模式(Multiple reaction model，MRM)离子对选择
鉴定准分子离子：通过Analyst软件，开启装有化合物的针泵Syringe Pump(10μL/min)，注入单一标准品工作液(5μg/ml)，选择Q1 Scan，Positive(正离子)扫描，根据视黄醇及其前体分子量，输入质量扫描范围：视黄醇m/z200-300，视黄醇乙酸酯m/z 200-400，视黄醇棕榈酰酯m/z 250-550，β-胡萝卜素m/z 200-550，d6-视黄醇棕榈酰酯m/z 250-350，扫描时间2min，鉴定准分子离子，即母离子Q1的质荷比参数；
观察到所有样品待测离子都出现在Q1 Scan中，检查Q1信号的稳定性，以便于质谱参数的优化。Q3扫描，即产物离子扫描模式确定离子强度最高的2-3个碎片离子Q3。
II.MRM质谱检测参数的优化
监测化合物信号的稳定性以后，采用Q1 SIM扫描，输入准分子离子m/z，对其DP、EP和CEP进行优化；具体方法是在Ramp Parameter Settings窗口下选择DP，点击Start得到一个离子的电压曲线图，以DP值作为X轴，信号强度作为Y轴，取信号强度最高时对应的DP作为其的优化值，记录每一个离子优化的DP值，回到Edit Ramp，重复此过程对EP和CEP进行优化；
用确定的Q1/Q3离子对来优化CE和CXP：选择MRM模式，输入观察到的Q1/Q3离子对m/z，用优化的DP、EP和CEP的值，点击Edit Ramp钮，选择CollisionEnergy设定起始值及终止值和步距：按Start或Acquire开始扫描，形成以CE值作为X轴，信号强度作为Y轴，取信号强度最高时对应的CE作为这一碎片离子的CE优化值；先优化CE再重复此过程优化CXP；
换用阴离子模式，比较阴、阳离子模式各化合物的离子强度，取强者为后续实验使用的模式。
本发明中，通过MultiQuant 2.0.2软件，以峰面积积分法对MS/MS定量检测数据进行分析，计算峰面积，完成HPLC-MS/MS定量检测数据的收集；以d6-视黄醇棕榈酰酯为内标，以普通标准品与内标的峰面积比为纵坐标，以二者浓度比为横坐标绘制标准曲线，构建HPLC-MS/MS内标定量分析方法。
有益效果
1.本发明利用滤纸片(如Whatman滤纸)作为载体吸附微量血，制成干血滤纸片，克服了以往收集血清检测视黄醇时静脉血采集时取血多，人群依从性差，动物模型抽血死亡，标本不方便远距离运送等困难。
2.本发明将视黄醇及其各前体的特异分析与HPLC-MS/MS技术优化结合，提供了分析视黄醇及其前体(β-胡萝卜素、视黄醇乙酸酯和视黄醇棕榈酰酯)质谱分析中分子离子峰、碎片离子峰、解簇电压、碰撞能量、碰撞室入口电压和出口电压等参数，获得最佳MS/MS分析条件；在色谱分析中，优化了固定相、流动相、柱温等色谱分离条件；计算所获得的各物质峰面积确定了最适萃取方法，首次建立了从滤纸片上提取视黄醇及其前体(β-胡萝卜素、视黄醇乙酸酯和视黄醇棕榈酰酯)的方法。
3.本发明克服了现有分析方法灵敏度低，不能分析微量血视黄醇及其前体的困难；本发明基质效应小、在标准曲线中的浓度范围内分析的线性关系良好、检出限较低、灵敏度高、准确性好、精密度高，与HPLC方法检测血清视黄醇结果具有相关性，并同时同步分析样品中视黄醇及其前体含量，为全面评估体内视黄醇水平提供了方法。
附图说明
图1不同色谱柱分离色谱图；A-C8色谱柱分离色谱图，B-C18色谱柱采样图
图2不同流动相下视黄醇及其前体的色谱图(A：纯乙腈作为流动相所获色谱图；B：纯甲醇作为流动相所获色谱图；C：甲醇∶二氯甲烷＝95∶5作为流动相所获色谱图；D：甲醇∶二氯甲烷＝90∶10作为流动相所获色谱图；E：甲醇∶水＝95∶5作为流动相所获色谱图；F：甲醇∶水＝90∶10作为流动相所获色谱图
图3不同流动相下视黄醇及其前体的离子强度
图4柱温对视黄醇及其前体的分离度、离子强度的影响
图5离子源对视黄醇及其前体的信号强度的影响
图6去离子水对干血斑中视黄醇及其前体萃取效果的影响
图7萃取试剂对视黄醇及其前体峰面积的影响
图8变性试剂对视黄醇及其前体峰面积的影响
图9视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素标准曲线(A-视黄醇，B-视黄
醇乙酸酯，C-棕榈酰酯，D-β-胡萝卜素)
图10 HPLC-MS/MS与HPLC方法测定视黄醇结果的相关性
R：Retinol，RA：Retinyl acetate，RP：Retinyl palmitate，β-c：β-carotene d6-RA：d6-Retinyl acetate。
具体实施方式
实施例1
(一)材料和方法
| 主要试剂 | 生产厂家 |
| 全反式视黄醇标准品 | 美国Sigma公司 |
| 视黄醇乙酸酯标准品 | 美国Sigma公司 |
| 视黄醇棕榈酰酯标准品 | 美国Sigma公司 |
| β-胡萝卜素标准品 | 美国Sigma公司 |
| 3，5-二叔丁基-4-羟基甲苯 | 美国Sigma公司 |
| 三氯甲烷(HPLC级) | 美国fisher公司 |
| 甲醇(HPLC级) | 美国fisher公司 |
| 19，19，19，20，20，20-d6-视黄醇乙酸酯 | 美国CIL公司 |
试剂配制：视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯标准品溶解于含抗氧化剂3，5-二叔丁基-4-羟基甲苯(Butylated hydroxytoluene，BHT)0.1％(w/v)的甲醇溶液中，β-胡萝卜素标准品溶解于含BHT 0.1％(w/v)的二氯甲烷中，配制成浓度分别为5mg/ml，2mg/ml，2mg/ml，5mg/ml的储存液，用含0.1％(w/v)BHT的甲醇稀释1000倍后即为工作液，工作液每周新鲜配制，避光，-20℃保存。
稳定同位素标记的19，19，19，20，20，20-d6-视黄醇乙酸酯作为内标，用含BHT0.1％(w/v)的甲醇溶解，0.1μmol/L作为工作液浓度。
1.HPLC-MS/MS分析干血滤纸片中视黄醇及其前体方法的建立
1.1干血滤纸片的制备
人群标本采集：采集手指或足跟末梢血；
动物标本采集：大白鼠：尾静脉刺破采血；小白鼠：尾末端剪破收集流出血液；
将以上所采集血液滴注于Whatman滤纸片；血滤纸片避光、常温晾干后，立即存放于-20℃冰箱保存。
1.2MS/MS定性分析方法的构建及条件优化
①多反应检测模式(Multiple reaction model，MRM)离子对选择
鉴定准分子离子：通过Analyst软件，开启装有化合物的针泵Syringe Pump(10μL/min)，注入单一标准品工作液(5μg/ml)，选择Q1 Scan，Positive(正离子)扫描，根据视黄醇及其前体分子量，输入质量扫描范围：视黄醇m/z 200-300，视黄醇乙酸酯m/z 200-400，视黄醇棕榈酰酯m/z 250-550，β-胡萝卜素m/z200-550，d6-视黄醇棕榈酰酯m/z 250-350，扫描时间2min，鉴定准分子离子，即母离子Q1的质荷比参数。
观察到所有样品待测离子都出现在Q1 Scan中，检查Q1信号的稳定性，以便于质谱参数的优化。Q3扫描，即产物离子扫描模式确定离子强度最高的2-3个碎片离子Q3。
②MRM质谱检测参数的优化
监测化合物信号的稳定性以后，采用Q1SIM扫描，输入准分子离子m/z，对其DP、EP和CEP进行优化。具体方法是在Ramp Parameter Settings窗口下选择DP，点击Start得到一个离子的电压曲线图，以DP值作为X轴，信号强度作为Y轴，取信号强度最高时对应的DP作为其的优化值。记录每一个离子优化的DP值。回到Edit Ramp，重复此过程对EP和CEP进行优化。
用确定的Q1/Q3离子对来优化CE和CXP：选择MRM模式，输入观察到的Q1/Q3离子对m/z，用优化的DP、EP和CEP的值，点击Edit Ramp钮，选择CollisionEnergy设定起始值及终止值和步距：按Start或Acquire开始扫描，形成以CE值作为X轴，信号强度作为Y轴，取信号强度最高时对应的CE作为这一碎片离子的CE优化值。先优化CE再重复此过程优化CXP。
换用阴离子模式，比较阴、阳离子模式个化合物的离子强度，取强者为后续实验使用的模式。
1.3HPLC-MS/MS定性、定量方法的建立
(1)HPLC-MS/MS定性方法的构建
①MS/MS定性分析方法转化为液质连用的方法
②色谱分析条件的建立与优化：
根据视黄醇及其前体具有疏水性的化学性质，准备C18(XR-ODS II 75mm×2.0mm I.D.，3μm，Shimadzu，Kyoto，Japan)、C8(Zobax C8 eclipse plus150mm×2.1mm I.D，3.5μm，Agilent，CA，USA)等色谱柱。平衡色谱柱，时间为5～10倍柱体积。以纯甲醇为流动相，0.2ml/min等度分离，扫描20min，观察各化合物色谱峰形及保留时间。取分离度(resolution，R)大，且不小于1.5，保留时间较短者为理想的色谱柱。
R＝2(tR2-tR1)/(W1+W2)
tR：保留时间
W：峰宽＝峰结束时间-峰起始时间
ii)流动相的优化
流动相的组成
由于视黄醇及其脂类在甲醇中溶解度较高，β-胡萝卜素易溶于二氯甲烷，微溶于溶于甲醇，遂以甲醇与二氯甲烷(CH2CL2，HPLC级，Fisher Scientific)为初始流动相组成进行调节，分别以甲醇∶CH2CL＝90∶10及95∶5(v∶v)、纯甲醇、甲醇∶水＝95∶5及90∶10(v∶v)、纯乙腈为流动相，等度流速分离同一份标准品混合液中各化合物，比较离子峰峰型、分离度、离子强度，选择视黄醇与其乙酸酯分离度大于1.5、最后流出化合物保留时间≤10min、峰型好、离子强度高的流动相及其组成。
酸碱度对视黄醇及其前体检测的影响
在以上优化的流动相中加入甲酸，使其终浓度为0.01％，调节流动相的酸碱度，以便化合物的离解，在质谱检测中有更好的灵敏度，其余检测条件相同，比较加入前后视黄醇及其前体的保留时间、离子强度及分离度。
iii)色谱柱温度的选择
以上优化的流动相，流速0.2ml/min，其余检测条件相同，考察色谱柱温度分别为20℃、30℃、40℃时视黄醇及其前体的检测情况，选择分离度及离子强度高的温度为后续实验色谱柱温度。
③离子源的选择
调用以上质谱分析方法，使用上述HPLC优化的条件，先在ESI离子源的作用下分析，然后换用大气压化学离子化(atmospheric chemical ionization，APCI)离子源，比较相同浓度标准品的不同离子源作用下的离子强度，以高者确定随后使用的离子源。
(2)HPLC-MS/MS定量方法的建立
通过MultiQuant 2.0.2软件，以峰面积积分法对各化合物及同位素标记标准品进行分析，计算峰面积，完成HPLC-MS/MS定量检测数据的收集。
以d6-视黄醇棕榈酰酯为内标，以普通标准品与内标的峰面积比为纵坐标，以二者浓度比为横坐标绘制标准曲线，构建HPLC-MS/MS内标定量分析方法。
1.4视黄醇及其前体的萃取方法的优化
(1)血片溶解的研究
将干血滤纸片标本用标准打孔器打出直径3.2mm(即3.2μl的全血)圆形滤纸血片3个，置于1.5ml EP管中，加入100μl含0.1％BHT作为抗氧化剂的去离子水，室温振摇，1000rpm，2min，充分溶解血液；同时与未加去离子水的方法进行比较获取血斑中视黄醇及乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素的色谱峰面积。
(2)选择适当的蛋白变性试剂，确定最佳用量
取3个直径3.2mm血斑标本3份，分别加入200μl不同试剂：乙腈、甲醇、乙醇，均含0.1％BHT和0.025mmol/L KOH，变性、沉淀蛋白质，漩涡震荡2min，加入500μl正丁醇漩涡震荡2min，充分萃取视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯、β-胡萝卜素。比较获取血斑中视黄醇及乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素的色谱峰面积。选择色谱峰面积大的蛋白变性试剂为最佳使用试剂，为本方法采用。
确定了最适试剂变性、沉淀蛋白质后，用50μl，100μl，150μl，200μl的量分别实验，测定视黄醇及其前体峰面积，确定其最佳用量。
(3)选择最优的萃取试剂
在优化了的变性试剂作用下，再比较常用萃取试剂乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷，对视黄醇及其前体的萃取效果，并在适宜的萃取试剂作用下，分别以100μl，300μl，500μl，700μl用量，选择其萃取视黄醇及其前体量最适用量。
1.5萃取效率的计算
采用以上优化的提取方法，以含有0.1％BHT及0.025mmol/L KOH的甲醇200μl变性沉淀蛋白质，CHCL3300μl萃取标准品混合液中的视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯和β-胡萝卜素，计算萃取效率。
1.6统计学处理
采用SASS14.1统计软件处理数据，计量资料用表示，如果成正态分布，方差齐同，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析，否则用秩和检验。
2.HPLC-MS/MS定量分析干血滤纸片中视黄醇及其前体的方法学评价
2.1评估基质效应(Matrix Effects)
基质指的是样品中被分析物以外的组分，常常对分析过程有显著干扰，并影响分析结果的线性、准确性和精密度，特别在不使用同位素内标时将更加明显。这些影响和干扰被称为基质效应，因此需要考察方法的基质效应。
表2.1基质效应实验分组及步骤
用APCI离子源检测，根据峰面积，计算基质效应公式如下：
Matrix Effects(％)＝(A-B)/C×100％[2]
A：样品基质中添加的相同含量视黄醇的峰面积
B：样品基质中视黄醇的峰面积
C：在纯溶剂中视黄醇的峰面积
2.2线性范围、最低检测限的考察
以普通标准品与同位素内标的峰面积比为纵坐标，以二者浓度比为横坐标绘制标准曲线，构建HPLC-MS/MS内标定量分析方法。
用流动相配制具有浓度梯度的混合标准溶液，其中视黄醇浓度为：0μg/ml、0.00406μg/ml、0.01625μg/ml、0.065μg/ml、0.26μg/ml、0.52μg/ml和5.2μg/ml，视黄醇乙酸酯和棕榈酰酯浓度为：0μg/ml、0.00156μg/ml、0.0625μg/ml、0.025μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml和2.0μg/ml，β-胡萝卜素浓度为：0μg/ml、0.00336μg/ml、0.0134μg/ml、0.054μg/ml、0.215μg/ml、0.43μg/ml和4.3μg/ml，制作成干血滤纸片。
按部分1优化的方法溶解干血斑，沉淀蛋白质，萃取、吹干、溶解，检测，计算各离子峰积分面积，以化合物及其与同位素标准品积分面积比值为纵坐标，以二者浓度比值为横坐标，绘制内标法标准曲线，计算相关系数R。
以信/噪比(N/S)≥3界定为最低检测限，以信/噪比(N/S)≥10界定为最低定量限，计算视黄醇及其类似物的最低检测限和最低定量限。
2.3准确性评价
采用回收实验，计算回收率以评价该方法的准确性。
取混合抗凝全血980μl 3份为基线样本，分别加入已知浓度的浓缩视黄醇及其前体标准品混合溶液0μl，10μl，20μl，再分别加入生理盐水20μl，10μl，0μl配制成三种不同浓度待测物的1000μl全血，按照第一部分方法处理和定量分析。
执行三次重复试验，计算每一标本视黄醇及其前体的平均值。
回收率＝实际测定浓度/理论浓度×100％
2.4精密度
重复性试验检测浓度适中的同一标本，平行处理10份，计算批内分析物均值、标准差及变异系数；连续考察5d，计算批间分析物均值、标准差及变异系数，评价HPLC-MS/MS方法的精密度。
2.5方法学比较
1)血清维生素A测定
采用传统高效液相色谱法(HPLC)测定。将0.5-1.0ml待测全血离心5min，转速4000rpm，吸取上层血清200μl于2ml Ep管中，加入无水乙醇200μl充分混匀，再加入正己烷1000μl充分混匀(至少漩涡震荡2min)，离心13200rmp 8min，小心吸取上层液体500μl，置水浴箱中(40″C)用氮气吹干。加入流动相(甲醇∶水＝97∶3)100μl，充分溶解后吸取20μl上机检测。检测波长315nm，流速1.4ml/min，保留时间3.8min。根据标准曲线，计算公式如下：维生素A含量(μmol/L)＝峰面积×4.42540093×0.001+6.519)/286.4。所用仪器为美国Waters 2487UV检测器/1525二元泵/Breeze色谱工作站/Symmetry Shield RP183.9×150mm色谱柱[6，7]。
2)通过对50例6月-70月儿童干血滤纸片中视黄醇水平的分析，将本方法与传统HPLC法结果进行相关性分析，以视黄醇水平本实验结果为纵坐标，HPLC法结果为横坐标，绘制回归曲线，计算相关系数。
(二)结果
1.(1)视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素、d6-视黄醇乙酸酯母离子及子离子的选择及质谱检测参数的优化
(2)HPLC-MS/MS定性方法的构建
1)色谱柱的选择
由于视黄醇和视黄醇乙酸酯与视黄醇棕榈酰酯具有相同的质谱条件，不能通过质谱分析区分，因而必须采用HPLC进行分离。
以甲醇作为流动相，0.3ml/min的流速，柱温30℃，5μl上样，分别用C18和C8的色谱柱分离化合物形成的色谱图。视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯和β-胡萝卜素在C8色谱柱的保留时间分别为2.47min，2.75min，8.01min和9.18min，在10min内即可分离检测出视黄醇及其前体；使用C18色谱柱，视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯和β-胡萝卜素的保留时间分别为1.61min，2.26min，8.70min和18.84min，较C8色谱柱长，不利于临床大批量样本的检测，因此选择C8色谱柱用于化合物的分离(图1)。
3)流动相对各化合物检出的影响
①不同流动相组成对视黄醇及其前体分离度的影响(图2)
色谱图中视黄醇和视黄醇乙酸酯与视黄醇棕榈酰酯、β-胡萝卜素之间的保留时间差异显著，分离度均大于2，提示视黄醇棕榈酰酯、β-胡萝卜素均能得到很好的分离，但视黄醇及其乙酸酯的保留时间比较接近，且其质谱检测条件相同，因此需对二者的分离度进行考察。调整流动相的组成，分别为纯乙腈、纯甲醇、甲醇∶CH2CL2体积比95∶5及90∶10、甲醇∶水体积比95∶5及90∶10，0.2ml/L等度流速，柱温30℃，视黄醇与视黄醇乙酸酯的分离度分别为0.6±0.02，1.8±0.03，1.6±0.02，1.5±0.02，2.0±0.10，3.2±0.16，如图2所示。在纯乙腈中，视黄醇与其乙酸酯未完全分离，不能用于其定量分析；在加入水的流动相中，视黄醇棕榈酰酯、β-胡萝卜素的保留时间过长，大于10min，也不便于临床批量标本检测。因此，纯甲醇、甲醇∶CH2CL2＝95∶5及90∶10(v/v)的溶液可以作为的后续方法学优化的备选流动相。
②不同流动相组成对化合物离子强度的影响
纯甲醇、甲醇∶CH2CL2＝95∶5及90∶10(v/v)的溶液作为的流动相时，视黄醇及其酯类的离子强度依次降低，而β-胡萝卜素的离子强度逐渐增加(图3)。因此，选择甲醇∶CH2CL2＝95∶5(v/v)的混合液作为流动相，兼顾两类化合物的检出。
在含有和未含有0.1％甲酸流动相中，视黄醇及其前体的保留时间和分离度相同，离子强度的差异不具有显著性(p＞0.05)，表明0.1％甲酸对视黄醇及其前体检测的灵敏度影响小(表2)。因此，选择不含0.1％甲酸的甲醇∶CH2CL2＝95∶5(v/v)为流动相。
表2酸碱度对视黄醇及其前体离子强度的影响
3)柱温对化合物检测的影响
其他质谱及色谱条件相同，柱温20℃、30℃、40℃时，视黄醇与其乙酸酯视黄醇的分离度分别为1.70，1.48和1.24，随着柱温的升高，分离度逐渐降低，各分析物离子强度逐渐增加(图4)。考虑到定量分析首先需要化合物的良好分离，因此选择20℃的作为分析的适宜柱温。
4)APCI/ESI离子源的选择
在APCI离子源作用下，视黄醇的信号显著强于ESI离子源检测的信号(p＜0.05)，而视黄醇乙酸酯、棕榈酰酯及d6-视黄醇乙酸酯的信号则弱于ESI离子源检测的信号(p＜0.05)(详见图5)，β-胡萝卜素可能浓度较低，经两种离子源作用后离子强度无显著性差异(p＞0.05)，提示APCI离子源对视黄醇检测的灵敏度高，ESI离子源对视黄醇酯类灵敏度高。由于血液中视黄醇浓度高于其他三种前体，且VAD诊断标准主要针对视黄醇，因此选用对视黄醇检测更敏感的APCI离子源作为本实验的离子源。
(3)视黄醇及其前体的萃取方法的优化
1)血片溶解的研究
加入去离子水溶解干血斑后，提取的视黄醇及乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素分别是不加入去离子水的色谱峰面积的7.8，1.8，1.2，1.8倍，尤以视黄醇增加显著(p＜0.05)，因此从干血斑中提取视黄醇及其前体时，加入去离子水进行溶解后提取效率更高。(图6)。
2)萃取试剂的选择
干血斑中视黄醇经正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷分别萃取后测得的色谱峰面积依次增加，视黄醇乙酸酯和棕榈酰酯分别经正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取后所测得的峰面积依次减少。由于主要优化干血斑中视黄醇萃取的条件，且乙酸乙酯萃取后吹干时间过长，不利于临床快速检测，因此选择三氯甲烷作为萃取试剂。三氯甲烷100μl，300μl，500μl，700μl分别萃取干血斑中视黄醇及其前体，用量300μl时，视黄醇及其前体色谱峰面积最大(图7)，提示三氯甲烷300μl对干血斑(3个Φ3.2mm)视黄醇及其前体提取效果最好，遂以三氯甲烷300μl作为后续实验所用萃取试剂。
3)蛋白沉淀试剂的选择
分别用常见的有机溶剂甲醇、乙醇和乙腈变性、沉淀干血斑中蛋白质后，获得的视黄醇及其乙酸酯峰面积逐渐减少，β-胡萝卜素的峰面积变化无显著性差异(p＞0.05)，视黄醇棕榈酰酯经乙腈作用后峰面积最大(图8)，因此选甲醇为最佳蛋白沉淀试剂。以50μl，100μl，150μl，200μl甲醇分别作用于干血斑后，视黄醇及其前体峰面积逐渐增加，提示甲醇200μl效果最好，遂以甲醇200μl作为本实验所用萃取试剂。
以含有0.1％BHT及0.025mmol/L KOH的甲醇200μl变性沉淀蛋白质，CHCL3300μl萃取标准品混合液中的视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯和β-胡萝卜素，其萃取效率分别为84％，97％，81％，93％。
(4)HPLC-MS/MS定量方法的构建：视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素标准曲线见图9。
2.(1)基质效应
本实验检测干血斑中视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素的基质效应分别为98.0％，96.7％，90.0％和82.1％，提示本方法检测视黄醇及其前体，基质效应小。
(2)线性范围、最低检测限和最低定量
采用内标法，绘制视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素的标准曲线，拟合线性方程分别为：y＝4.33×10-5x+0.0681(r＝0.9998)，y＝13.2×10-5x+0.0542(r＝0.9937)，y＝5.5×10-5x+0.0178(r＝0.9976)，y＝6.74×10-5x+0.0376(r＝0.9981)，线性关系良好(线性相关系数r接近1)。其最低检测限分别为16.2ng/ml，5.3ng/ml，6.3ng/ml，53.75ng/ml，最低定量限分别为65ng/ml，21.3ng/ml，25.0ng/ml，53.75ng/ml。由于本方法仅用于痕量视黄醇及其前体的检测，因此未检测高浓度标准品，未考察高浓度区域的线性范围。
(3)准确性评价
本实验对视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素均有稳定的回收，其回收率均值分别为85.5％，84.5％，83.5％和73.5％
(4)精密度评价
视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、β-胡萝卜素批内精密度分别为4.30％，4.45％，4.35％和7.35％，连续5d检测的批间精密度分别为6.70％，4.9％，4.85％和9.40％。
(5)与传统HPLC方法测定血清视黄醇结果的相关性：见图10。
采集50例6月-70月儿童末梢血，约10μL，滴注于Whatman滤纸片制成干血滤纸片，0℃递送至实验室，保存于-20℃冰箱中。利用本发明的方法测定50例6月-70月儿童干血滤纸片中视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯、β-胡萝卜素浓度的范围分别为0.19μg/ml-0.96μg/ml(0.48±0.16μg/ml)，0.04μg/ml-0.28μg/ml(0.115±0.06μg/ml)，0.02μg/ml-0.06μg/ml(0.02±0.01μg/ml)，0.03-0.06μg/ml(0.19±0.11μg/ml)。
Claims (6)
1.一种检测视黄醇及其前体的方法，包括以下步骤：
（1）从样品中萃取视黄醇和/或其前体；
（2）HPLC分离视黄醇和/或其前体；
（3）MS/MS定量检测；
所述样品是干血滤纸片标本，采用的萃取剂为三氯甲烷。
2.如权利要求1所述的检测视黄醇及其前体的方法，所述萃取步骤包括蛋白变性步骤，采用试剂为含有0.1% BHT和0.025 mmol/L KOH的甲醇。
3.如权利要求1所述的检测视黄醇及其前体的方法，所述从样品中萃取视黄醇和/或其前体包括以下步骤：
①血片溶解：将载有微量血的干血滤纸片用打孔器打出直径3.2mm圆形滤纸血片，置于1.5ml EP管中，加入100μl含0.1% BHT作为抗氧化剂的去离子水，室温振摇，1000rpm，2min，充分溶解血液；
②蛋白变性：取步骤①所得血斑标本，加入200μl含有0.1% BHT和0.025 mmol/L KOH的甲醇变性沉淀蛋白质，漩涡震荡2min；
③萃取：以300μl三氯甲烷作为萃取剂加入步骤②所得的溶液中，室温振摇2min，离心13200 rpm，8min；
④吸取底层的有机溶剂层180μl，氮气吹干，加入100μl流动相充分溶解，用于HPLC-MS/MS检测。
4.如权利要求1所述的检测视黄醇及其前体的方法，所述HPLC分离视黄醇和/或其前体步骤中，采用C8色谱柱，甲醇:CH2CL2=95:5(v/v)为流动相，以0.2ml/L等度流速，保持柱温20℃进行液相分离。
5.如权利要求1所述的检测视黄醇及其前体的方法，所述MS/MS定量检测步骤中，以APCI离子源作为离子源；MRM质谱检测参数采用表1所示；
表1
。
6.如权利要求1所述的检测视黄醇及其前体的方法，通过MultiQuant 2.0.2 软件，以峰面积积分法对MS/MS定量检测数据进行分析，计算峰面积，完成HPLC-MS/MS定量检测数据的收集；以d6-视黄醇棕榈酰酯为内标，以普通标准品与内标的峰面积比为纵坐标，以普通标准品与内标的浓度比为横坐标绘制标准曲线，构建HPLC-MS/MS内标定量分析方法。
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