CN104472904A - 虫草属菌种发酵物在提高牛乳风味物质、维生素或必需氨基酸含量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了虫草属菌种发酵物在提高牛乳风味物质、维生素或必需氨基酸含量中的应用。在饲喂量为30g/头/天、饲喂1个月时，试验组牛乳中风味物质的种类是对照组的两倍以上，风味物质总量高达对照组的20倍以上；维生素A含量提高了25％以上，维生素E含量提高了73.3％以上，必需氨基酸含量提高了12.96％。表明虫草属菌种发酵物能够有效提高牛乳中风味物质的种类和含量以及营养物质的含量，显著改善牛乳风味和品质。

Description

虫草属菌种发酵物在提高牛乳风味物质、维生素或必需氨基酸含量中的应用

技术领域

本发明涉及一种奶牛的饲养方法，具体涉及虫草属菌种发酵物在提高牛乳风味物质、维生素或必需氨基酸含量中的应用。

背景技术

随着人们生活水平的进一步提高和保健意识的增强，广大消费者不仅注重牛乳的营养价值，而且越来越更加重视牛乳的品质、风味和保健功能。人们对牛乳的消费已经从生理上对各种营养成分和卫生质量的需求上升到心理上享受。优良或独特风味的牛乳及其奶制品会使人们在感官上获得愉悦，并直接影响营养物质的消化和吸收，人们希望获得风味清香适口的好牛乳，更希望同时获得高维生素、高氨基酸含量的高品质牛乳。

目前牛乳风味己成为评价牛乳等级的重要指标，也逐渐改变人们对牛乳的传统消费观念。但奶牛业在取得产奶量大幅度提升和高饲料报酬的同时，也伴随着牛乳品质下降的负面效应，加上生产中抗生素和化学合成药物的大量使用，更加剧了牛乳品质、风味的下降。因而，消费者常常抱怨有些牛乳适口性差，有时其至伴有让人难以接受的奶腥味、奶臭味。

牛乳中的风味活性物质种类繁多，千差万别，性质各异，影响牛乳风味的因素很多，但饲料成分对奶风味的影响发挥着主要作用。

牛乳中的风味物质由具有滋味和香味活性的成分组成。其风味物质形成过程主要是乳品中蛋白质、脂肪、乳糖这三大类物质降解或每一类物质的衍生物之间相互反应生成的。

研究表明，乳脂中风味物质来源有4种：(1)风味物质不经过任何改变直接从饲料中通过血液进入牛乳中；(2)风味化合物经过酶、氧化或加热使油脂分解而形成；(3)风味化合物是通过饲料在反刍动物的瘤胃中发生生化反应后经消化吸收而产生的；(4)风味化合物是牛乳中的蛋白质和碳水化合物反应而生成的。乳中的风味化合物主要有脂肪酸、羰基化合物、酯类、萜类及硫化物(刘芳、霍贵成，乳业科学与技术，2001(4):14-17)。

牛乳中挥发性的风味物质大体上可归纳为二大类：一类是烃、醇、醛、酮、酸、酯、内酯等简单化合物；另一类是含有氧、氮、硫的杂环化合物。如呋喃及其衍生物和噻吩及其衍生物。其具体成分为：乙醛、乙醇、异戊醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯和乙酸正丁酯等。研究发现，强挥发性的物质有：辛烷、环氧乙烷、己酸、苯己酮、壬醛、辛酸、十二烷、十三烷、2一癸醛、2.4(E)一十二烯醛、2一亚甲基一环戊醇、癸酸等。都是牛乳中风味物质的重要成分，这些化合物除有独特的风味外，还对人体的健康起很大作用(Nursten H E，International Journal o f DiaryTeach,1997(50):48-55)。

奶牛饲养是个复杂的问题，诸多因素影响着牛乳品质、风味。因此，研究开发既能保证奶产量和饲料转化效率，又能提高牛乳品质、风味的饲料添加剂或饲料配方，生产安全优质牛乳，己成为国内外研究开发的热点。

冬虫是我国名贵的真菌药物和高级补品，在我国明代以前，人们已知道应用虫草，从明代中叶开始，就受到东南亚人民的喜爱，在国际市场上享有很高的声誉。

广义上的虫草是指虫生子囊真菌侵染昆虫或节肢动物，最后形成的真菌子实体(子座)与昆虫或节肢动物的复合体。虫草属真菌约有400余种，其中最名贵的是冬虫夏草(Cordyceps sinensis)，是麦角菌科线形虫草属真菌(Ophiocordyceps)寄生于蝠蛾属(Hepialus spp.)的幼虫体内形成的复合体，是青藏高原高海拔地区的特有物种，简称“虫草”，是中国传统的名贵中药。目前世界上已发现同属“虫草属”的虫草已有三百五十种之多，其中在中国已发现过六十余种，包含冬虫夏草(C.sinensis)、北冬虫夏草(C.militaris)、大团虫草(C.ophioglossoides)、亚香棒虫草(C.hawkesii)、古尼虫草(C.gunnii)、珊瑚虫草(C.martialis)、镰刀状虫草(C.falcata)、泰山虫草(C.taishanensis)、山西虫草(C.shanxiensis)、凉山虫草(C.liangshanensis)、新疆虫草(C.gracilis)、香棒虫草(C.barnesii)、蝉花(C.sobolifera)等等。虽然已发现的品种繁多，但大多虫草都有非常强的提高免疫能力的作用。

现已先后成功开发出的虫草产品有：(1)金水宝胶囊，1987年上市，是采用从青海冬虫夏草中分离所得蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)Cs-4菌株制备而成的；(2)百令胶囊，是以沈南英等在1983年分离出的一种真菌中国被毛孢(又称中华束丝孢(Synnematum sinense Y in et Shen sp.now),冬虫夏草头孢,蝙蝠蛾多毛孢)为菌种生产的；(3)至灵胶囊，是用从冬虫夏草分离纯化出来的被孢霉菌(Mortierella sp)发酵得到的菌丝体制成的；(4)宁心宝胶囊，为从新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌虫草头孢(Cephalosporium sinensis Chen.sp.nov),经液体深层发酵所得；(5)心肝宝胶囊，是1986年以冬虫夏草新鲜标本中分离出来的虫草头孢菌,是一种真菌寄生菌粉红胶霉(Gliocladium roseum(Link)Bain)。

虫草产品在动物上的应用也获得了一些成果。特别是地顶孢霉培养物具有多种生物学功能，比如，中国文献(魏建忠等，地顶孢霉培养物对保育仔猪生产性能及免疫水平的影响，动物营养与饲料科学，2009，36(2)：33-35.)公开了地顶孢霉培养物能够提高保育仔猪的生产性能及免疫水平。

公告号为CN101797014B的中国专利文献公开了一种低胆固醇营养禽蛋的生产方法及其产品，该专利发现虫草能提高禽蛋质量内涵，生产出低胆固醇的高品质禽蛋。

公告号为CN101002592A的中国专利报道了一种古尼拟青霉新型营养型虫草饲料添加剂的生产方法，但是该专利申请是披露该虫草饲料添加剂的制备以及在动物促生长中应用。

公开号为CN 101066090B的中国专利报道了一种虫草激活强化免疫饲料添加剂，采用北虫草菌种和冬虫夏草菌种混合培养，所得复合培养物干燥后即为该饲料添加剂，该专利也没有提示或者暗示虫草饲料添加剂在奶牛中的应用。

目前有关虫草应用专利中没有涉及到可以改变牛乳风味和提高品质的内容，也没有相关文献报道。

发明内容

本发明提供了虫草属菌种发酵物在提高牛乳风味物质、维生素或必需氨基酸含量中的应用，将该虫草属菌种发酵物饲喂泌乳奶牛，能够显著提高牛乳中风味物质的种类和含量以及维生素和必需氨基酸的含量。

虫草属菌种发酵物在提高牛乳风味物质、维生素或必需氨基酸含量中的应用。

所述应用包括：将所述虫草属菌种发酵物饲喂泌乳奶牛，获取牛乳。

作为优选，以干重计，所述虫草属菌种发酵物的饲喂量为至少5g/头/天。

试验发现，虫草属菌种发酵物的饲喂量在5g/头/天以上时，即能提高牛乳中风味物质、维生素以及必需氨基酸的含量，并且，随虫草属菌种发酵物的饲喂量逐渐增加，上述效果愈加明显。

作为进一步优选，以干重计，所述虫草属菌种发酵物的饲喂量为20～40g/头/天。在该饲喂量范围内，牛乳中风味物质、维生素以及必需氨基酸的含量显著增加，牛乳风味和品质已能获得较大程度的改善。继续增加饲喂量，牛乳中风味物质、维生素以及必需氨基酸的含量有可能继续提高，也可能到达某一值后不再提高。由于本发明的虫草属菌种发酵物对奶牛并无任何毒副作用，所以增加饲喂量对奶牛本身的生产不会有任何影响。为获得相应的饲喂效果，本领域技术人员可以根据饲养条件以及饲料配方选择具体的饲喂量。

分别地，本发明提供了虫草属菌种发酵物在提高牛乳风味物质含量中的应用。

所述风味物质包括以下(1)、(2)或(3)中的至少一种：

(1)在GC-MS图谱中，保留时间为8～15min的低级烷酸，如：乳酸、己酸等；

(2)在GC-MS图谱中，保留时间为15～20min的烷基酸、烷基醛或烷基酮类物质，如：辛酸、癸醛、麦芽酚系列物质(包括麦芽酚、5-羟基麦芽酚)、呋喃酮系列物质(包括4-羟基二氢呋喃-2(3H)-酮、5-(羟甲基)二氢呋喃-2(3H)-酮)等；

(3)在GC-MS图谱中，保留时间为20～40min的高级烷烃、高级烯烃、高级烷基醛、高级烷基酰胺或高级烷酸及其酯类物质，如：角鲨烯、葵酸、顺-十八碳烯酸、棕榈酸系列衍生物(包括棕榈酸、棕榈醛、棕榈酰胺、棕榈酸甘油酯)等。

所述GC-MS图谱的检测条件为：

仪器型号：Thermo ISQ 1301；

气相色谱条件：规格为30×0.32mm×0.5μm的HP-5毛细管柱；

程序升温:起始温度为40℃，保温4min，然后以5℃/min上升到100℃，保留2min，再以10℃/min上升到220℃，保留5min进样口温度250℃，检测器温度280℃，载气为高纯氮气。

与未饲喂所述虫草属菌种发酵物的奶牛相比，饲喂虫草属菌种发酵物后，奶牛所产牛乳中出现了新的风味物质，这些风味物质主要是麦芽酚系列物质、呋喃酮系列物质以及棕榈酸系列衍生物。

如未作特殊说明，本发明中，所述低级烷酸是指碳原子个数在1～6的烷酸，所述高级烷烃、高级烯烃或高级烷酸及其酯类物质是指碳原子个数大于6的烷烃、烯烃或烷酸及其酯类物质。试验发现，饲喂量为30g/头/天、喂饲1个月时，从试验组牛乳样品检测到22个风味物质特征峰，而从对照组牛乳样品仅检测到10个风味物质特征峰，试验组牛乳样品中的风味物质总量远远高于对照组；喂饲2个月时，从试验组牛乳样品检测到28个风味物质特征峰，而从对照组牛乳样品仅检测到13个风味物质特征峰。试验组牛乳样品中的风味物质总量远远高于是对照组。表明虫草属菌种发酵物能有效增加牛乳中风味物质的种类和含量，显著改善牛乳风味。除此之外，牛乳中维生素和必需氨基酸的含量也显著增加。因此，本发明还提供了虫草属菌种发酵物在提高牛乳维生素或必需氨基酸含量中的应用。

作为优选，所述维生素为维生素A、维生素E或维生素D中的至少一种。试验发现，饲喂量为30g/头/天、喂饲1个月时，试验组牛乳样品中的维生素A含量比对照组提高了25％，维生素E含量比对照组提高了73.3％；喂饲2个月时，试验组牛乳样品中的维生素A含量比对照组提高了36.8％，维生素E含量比对照组提高了46.7％；饲喂期间，从对照组牛乳样品中测定不到维生素D，而从试验组牛乳样品中能测定到维生素D。表明虫草属菌种发酵物能有效增加牛乳中维生素的含量，显著改善牛乳品质。

作为优选，所述必需氨基酸为天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸或组氨酸中的至少一种。试验发现，饲喂量为30g/头/天、喂饲1个月时，试验组牛乳样品中必需氨基酸含量比对照组提高了12.96％，其中，天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸以及组氨酸的含量比对照组提高了43.6％；风味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)的含量比对照组提高了41.87％。表明虫草属菌种发酵物能有效增加牛乳中必需氨基酸的含量，显著改善牛乳风味和品质。

本发明中，所述虫草属菌种发酵物是由虫草属真菌经液体发酵或固体发酵获得的；可以是液体发酵菌液，可以是利用液体发酵固形物制备成的菌粉，也可以是固体发酵物。

所述虫草属菌种培养物可通过以下发酵方法制备获得：

(1)液体种子发酵：将活化后的虫草属真菌接种于一级发酵罐中，进行种子培养，获得种子液；

所述接种量优选为8～12％，所述种子培养的参数控制在：温度25℃，通气量1.00L/(L·min)，培养时间84h。

(2)液体发酵：将种子液接种于二级发酵罐中，进行发酵，获得虫草属真菌液体发酵菌液；

所述种子液的接种量优选为8～12％，所述发酵的的参数控制在：温度25℃，通气量1.00L/(L·min)，培养时间84h。

(3)固体发酵：将所述虫草属真菌液体发酵菌液接种于固体培养基中，平铺后进行固体发酵，获得虫草属真菌固体培养物。

所述虫草属真菌液体发酵菌液的接种量优选为15％，平铺后物料厚度保持在3cm左右，所述固体发酵的参数控制在：温度恒定25℃，湿度70％，发酵时间165～170h；待菌丝长满固体培养基后，培养结束。

所述虫草属真菌液体发酵菌液可直接作为本发明的虫草属菌种发酵物，用于饲喂奶牛；也可对其进行离心，收集菌丝和固形物，将该菌丝和固形物置于45℃热风干燥至水分降至8wt％以下，粉碎，获得虫草属真菌液体发酵菌粉，该菌粉也可作为本发明的虫草属菌种发酵物物，用于饲喂奶牛。

所述虫草属真菌固体培养物经60℃热风干燥至水分降至8wt％以下，粉碎，也可作为本发明的虫草属菌种发酵物，用于饲喂奶牛。

可采用如下的液体培养基配方进行液体种子发酵和液体发酵：蔗糖2.0％、蛋白胨0.4％、酵母浸出粉0.3％、玉米粉0.5％、MgS0₄7H₂O 0.02％、K₂HP0₄0.04％。自然pH。

可采用如下的固体培养基配方进行固体发酵：土豆淀粉83％、玉米粉10％，白砂糖2％、蛋白胨2％、蚕蛹粉2.5％、硫酸镁0.2％、柠檬酸铵0.2％、磷酸二氢钾0.1％、维生素B1100mg、水，pH值5～7。

所述虫草属真菌为古尼虫草(Cordyceps.gunnii)菌种、冬虫夏草(C.sinensis)菌种、北冬虫夏草(C.militaris)菌种、亚香棒虫草(C.hawkesii)菌种、新疆虫草(C.gracilis)菌种、大团虫草(C.ophioglossoides)菌种或蝉花(C.sobolifera)菌种中的至少一种。

如未作特殊说明，本发明所指虫草属真菌是指从虫草中分离得到的寄生真菌，该寄生真菌形成相应虫草中的子座。

这六类虫草是目前市场上最为常见、最具代表性的虫草，申请人发现这六类虫草属真菌均能有效提高牛乳中风味物质的含量。

所述古尼虫草菌种可选用地顶孢霉(Acremonium terricola)，所述冬虫夏草菌种可选用中国被毛孢(Synnematium sinense sp.)，所述北冬虫夏草菌种可选用蛹草拟青霉(Paecilomyces militaris)，所述亚香棒虫草菌种可选用霍克斯拟青霉(Paecilomyceshawkesii)，所述新疆虫草菌种可选用羽束梗孢霉(Paraisaria sp.)，所述大团虫草菌种可选用大团囊菌(Elaphomyces granulatus)，所述蝉花菌种可选用蝉白僵菌(Beauveriasobolifera)。

作为优选，所述虫草属真菌为地顶孢霉(Acremonium terricola)。与其他虫草属真菌的发酵物相比，地顶孢霉发酵物能够获得更好的饲喂效果。

本发明还提供了一种改善牛乳风味和品质的方法，包括：将虫草属菌种发酵物饲喂泌乳奶牛，获取风味物质和营养物质含量均提高、风味物质种类增加的牛乳；

所述虫草属菌种发酵物是由虫草属真菌经液体发酵或固体发酵获得的；

所述虫草属真菌为古尼虫草(Cordyceps.gunnii)菌种、冬虫夏草(C.sinensis)菌种、北冬虫夏草(C.militaris)菌种、亚香棒虫草(C.hawkesii)菌种、新疆虫草(C.gracilis)菌种、大团虫草(C.ophioglossoides)菌种或蝉花(C.sobolifera)菌种中的至少一种。

作为优选，以干重计，所述虫草属菌种发酵物的饲喂量为不少于5g/头/天。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用含所述虫草饲料添加剂的饲料饲喂泌乳奶牛，在饲喂量为30g/头/天、饲喂1个月时，试验组牛乳中风味物质的种类是对照组的两倍以上，风味物质总量高达对照组的20倍以上；试验组牛乳中维生素A含量比对照组提高了25％以上，维生素E含量比对照组提高了73.3％以上，试验组牛乳中必需氨基酸含量比对照组提高了12.96％，其中，天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸以及组氨酸的含量比对照组提高了43.6％；风味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)的含量比对照组提高了41.87％。表明虫草属菌种发酵物能够有效提高牛乳中风味物质的种类和含量以及营养物质的含量，显著改善牛乳风味和品质。

说明书附图

图1为喂饲虫草欣康1个月时试验组奶牛所产牛乳中风味物质测定的GC-MS图谱；

其中，Relative Abundance表示相对丰度，time(min)表示时间(分钟)，下同；

图2为喂饲虫草欣康1个月时对照组奶牛所产牛乳中风味物质测定的GC-MS图谱；

图3为喂饲虫草欣康1个月时试验组奶牛所产牛乳中必需氨基酸测定图谱；

Retention Time表示保留时间，minutes表示分钟，Name表示(相应保留时间处的)氨基酸名称，其中，Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg依次表示天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸，NH3表示氨基，下同；

图4为喂饲虫草欣康1个月时对照组奶牛所产牛乳中必需氨基酸测定图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1地顶孢霉培养物(虫草欣康)的制备

1、地顶孢霉培养物的制备

(1)地顶孢霉液体发酵菌液制备

①菌种：地顶孢霉(Acremonium terricola)

②液体发酵培养基

一级种子液体发酵培养基：600g白砂糖、200g酵母粉、10g MgSO₄、10g KH₂PO₄，溶解于20L水，自然pH；121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。

二级种子液体发酵培养基：6000g白砂糖、2000g黄豆粉、2000g酵母粉、100gMgSO₄,100g KH₂PO₄，溶解于200L水，自然pH；121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。

(3)液体发酵

液体种子发酵：液体发酵控制参数为温度25℃，通气量1.00L/(L·min)，接种量10％，300L气升式发酵罐装液量67％，发酵时间84h。

液体发酵：液体发酵控制参数为温度25℃，通气量1.00L/(L·min)，接种量10％，300L气升式发酵罐装液量67％，发酵时间84h。

(4)地顶孢霉固体培养物制备

①固体发酵培养基：玉米粉55％、小麦次粉5％、豆粕25、花生粕5％、麦麸9.8％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.05％；自然pH，100℃蒸汽灭菌6h，备用。

②固体发酵：将新鲜地顶孢霉菌液与固体培养基按照重量比15％搅拌接种，平铺在浅盘上发酵，物料厚度3cm，温度恒定25℃，湿度70％，发酵时间168h。

③干燥粉碎:收集地顶孢霉固体培养物，60℃热风干燥至水分降至8wt％以下，粉碎装袋，密封，避光储藏。

④质量分析

测定结果见表1：

表1 地顶孢霉固体培养物质量检验结果

检测项目	检测值
		水分％	5.8
蛋白质％	27.8
		虫草多糖％	3.3
腺苷mg/kg	652
		麦角甾醇mg/kg	627

实施例2地顶孢霉培养物(虫草欣康)对牛乳风味的影响

(1)试验动物：试验组和对照组分别10头奶牛，胎次与产奶量一致。

(2)饲喂量

试验组：每头成年奶牛日饲10kg精饲料，精饲料中添加0.3％的地顶孢霉固体培养物(虫草欣康)；

对照组：每头成年奶牛日饲10kg精饲料，精饲料中不添加虫草欣康；

日精饲料配方为：玉米52％、麦麸5％、玉米皮5％、豆粕8％、棉籽粕12％、菜籽粕8％、DDGS3％、石粉2％、氧化镁0.3％、尿素1％、食盐0.7％、小苏打1％、磷酸氢钙1％、预混料1％。

(3)试验步骤

①开始饲喂前，观察泌乳奶牛3天，记录其进食量、产奶量；

②按照第(2)部分的内容饲喂试验组和对照组，饲养过程中，按照养殖场管理制度，记录每组奶牛的产奶量、采食、粪便、健康状况。

③于实验开始后第30、60天分别取牛乳样品，测定牛乳中风味物质含量。

(4)牛乳中风味物质测定方法

仪器型号：Thermo ISQ 1301；

气相色谱条件：HP-5(30×0.32mm×0.5um)毛细管柱；

程序升温:起始温度为40℃，保温4min，然后以5℃/min上升到100℃，保留2min，再以10℃/min上升到220℃，保留5min进样口温度250℃，检测器温度280℃，载气为高纯氮气。

样品处理：采用固相微萃取(SPME)技术分离牛乳中的挥发性成分，取牛乳样品10g，放置密闭容器中，添加3g NaCl，40℃加热40min，取样，采用气质联用色谱测定挥发性成分。

(5)测定结果

喂饲1个月时的风味物质测定数据分别见表2，试验组风味物质测定的GC-MS图谱见图1，对照组风味物质测定的GC-MS图谱见图2，喂饲2个月时的测定数据见表3。

表2 喂饲1个月时的风味物质测定结果

表3 喂饲2个月时的风味物质测定结果

以上结果看出：

(1)喂饲1个月时，从试验组牛乳样品检测到22个风味物质特征峰，而从对照组牛乳样品仅检测到10个风味物质特征峰。试验组牛乳样品中的风味物质总量远远高于是对照组。

(2)喂饲2个月时，从试验组牛乳样品检测到28个风味物质特征峰，而从对照组牛乳样品仅检测到13个风味物质特征峰。试验组牛乳样品中的风味物质总量远远高于是对照组。

两次测定结果显示，对照组样品的风味物质检测出10-13个左右，试验组风味物质检测出22-28个，试验组的风味物质多于对照组，是对照组的2倍以上。试验组含量是对照组数倍以上。

说明试验组牛乳中的风味物质多于对照组，牛乳风味好于对照组。

实施例3地顶孢霉培养物(虫草欣康)对牛乳中维生素和必需氨基酸的影响

(1)试验动物：试验组和对照组分别10头奶牛，胎次与产奶量一致。

(2)饲喂量

试验组：每头成年奶牛日饲10kg精饲料，精饲料中添加0.3％的地顶孢霉固体培养物(虫草欣康)；

对照组：每头成年奶牛日饲10kg精饲料，精饲料中不添加虫草欣康；

日精饲料配方为：玉米52％、麦麸5％、玉米皮5％、豆粕8％、棉籽粕12％、菜籽粕8％、DDGS3％、石粉2％、氧化镁0.3％、尿素1％、食盐0.7％、小苏打1％、磷酸氢钙1％、预混料1％。

(3)试验步骤

①开始饲喂前，观察泌乳奶牛3天，记录其进食量、产奶量；

②按照第(2)部分的内容饲喂试验组和对照组，饲养过程中，按照养殖场管理制度，记录每组奶牛的产奶量、采食、粪便、健康状况。

③于实验开始30、60天分别去牛乳样品，测定牛乳中维生素和必需氨基酸含量。

(4)维生素A、E的测定方法

①色谱参考条件：

色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或具同等性能的色谱柱。

流动相：甲醇。

流速：1.0mL/min。

检测波长：维生素A：325nm；维生素E：294nm。

柱温：35℃±1℃。

进样量：20μL。

②维生素A、E标准曲线的绘制

分别准确吸取维生素A标准储备液0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL于50mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为1.00μg/mL、2.00μg/mL、3.00μg/mL、4.00μg/mL、5.00μg/mL。

分别准确吸取维生素E标准储备液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL于50mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL。

分别将维生素A、E标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)。以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素A、E标准工作液浓度为横坐标，分别绘制维生素A、E标准曲线。

③维生素A、E试样的测定

将试液(A管)注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)，根据各自标准曲线得到待测溶液中维生素A、E的浓度。

(5)维生素D的测定

①维生素D待测液的净化

色谱参考条件：

色谱柱：硅胶柱，150mm×4.6mm，或具同等性能的色谱柱。

流动相：环己烷与正己烷按体积比1：1混合，并按体积分数0.8％加入异丙醇。

流速：1mL/min。

波长：264nm。

柱温：35℃±1℃。

进样体积：500μL。

净化方法：取约0.5mL维生素D标准储备液于10mL具塞试管中，在40℃±2℃的氮吹仪上吹干。残渣用5mL正己烷振荡溶解。取该溶液50μL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D保留时间。

然后将500μL待测液(B管)注入液相色谱仪中，根据维生素D标准溶液保留时间收集维生素D馏分于试管C中。将试管C置于40℃±2℃条件下的氮吹仪中吹干，取出准确加入1.0mL甲醇，残渣振荡溶解，即为维生素D测定液。

②维生素D测定液的测定

参考色谱条件：

色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或具同等性能的色谱柱。

流动相：甲醇(4.7)。

流速：1mL/min。

检测波长：264nm。

柱温：35℃±1℃。

进样量：100μL。

③标准曲线的绘制

分别准确吸取维生素D₂(或D₃)标准储备液0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL于100棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混匀。此标准系列工作液浓度分别为0.200μg/mL、0.400μg/mL、0.600μg/mL、0.800μg/mL、1.000μg/mL。

分别将维生素D₂(或D₃)标准工作液注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)。以峰高(或峰面积)为纵坐标，以维生素D₂(或D₃)标准工作液浓度为横坐标分别绘制标准曲线。

④维生素D试样的测定

吸取维生素D测定液(C管)100μL注入液相色谱仪中，得到峰高(或峰面积)，根据标准曲线得到维生素D测定液中维生素D₂(或D₃)的浓度。

维生素D回收率测定结果记为回收率校正因子f，代入测定结果计算公式(2)，对维生素D含量测定结果进行校正。

(6)分析结果的表述

①维生素A含量的计算

维生素A含量按(1)计算：

$X_A=\frac{\mathrm{Cs}\×10/2\×5\×100}{m}...\left(1\right);$

式中：

X_A：试样中维生素A的含量，单位为微克每百克(μg/100g)；

Cs：从标准曲线得到的维生素A待测液的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

m：试样的质量，单位为克(g)。

注：1μg视黄醇＝3.33IU维生素A。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

②维生素D含量的计算

维生素D含量按(2)计算：

$X_D=\frac{\mathrm{Cs}\×10/7\×2\×2\×100}{m\×f}...\left(2\right);$

式中：

X_D：试样中维生素D₂(或D₃)的含量，单位为微克每百克(μg/100g)；

Cs：从标线得到的维生素D₂(或D₃)待测液的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

m：试样的质量，单位为克(g)；

f：回收率校正因子。

注：试样中维生素D的含量以维生素D₂和D₃的含量总和计。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

③维生素E含量的计算

维生素E含量按(3)计算：

$X_E=\frac{\mathrm{Cs}\×10/2\×5\×100}{m\×1000}...\left(3\right);$

式中：

X_E：试样中维生素E(α-生育酚)的含量，单位为毫克每百克(mg/100g)；

Cs：从标准曲线得到的维生素E待测液的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

m：试样的质量，单位为克(g)。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

(7)牛乳中必需氨基酸测定

①样品采集

采集奶牛乳汁，用冷冻离心机在4℃、3000r·min^-1离心20min，弃掉上层的脂肪和离心管底的沉淀，取中间乳清进行氨基酸检测。

②仪器

高效液相色谱仪(waters公司),C18色谱柱：venusil-AA分析柱(4.6mm×250mm×5μm)。

③酸水解检测17种氨基酸

样品处理：准确量取200μL牛乳样品于长颈试管中，加入6mol·L^-1浓盐酸10mLmL，酒精喷灯灼烧封口。将样品封口放于烘箱(110℃)24h，将试管口打破，倒出水解液于烧杯中，用氢氧化钠调pH至8～9之间。然后移于50mLmL容量瓶定容，烧杯充分润洗。将定容液过滤至锥形瓶中，用5mLmL针管吸出滤液，用微孔滤膜过滤至2mLmL小管内。

衍生化：取200μL样品放入1mL样品管中，加入100μL三乙胺-乙睛溶液摇匀后静止，加入100μL异硫氰酸苯酯-已腈用封口膜封口静置反应1h，加入400μL正己烷，混匀后静止10min，分层后吸取下层溶液200μL到样品瓶中，加入800μL稀释液，混匀后静止5min。待仪器平衡后,取40μL进样分析,同时取标准品5μL进样。

谷氨酰胺的BTI保护反应：取100μL丙氨酸-谷氨酰胺二肽标准品或样品溶液，加入100μL新配制的BTI-乙腈溶液，并加入25μL的呲啶水溶液(50mmol·L^-1)，混合均匀后充氮，50℃反应4h，室温吹干备用。

水解：向BTI处理过的样品中加入200μL的6mol·L^-1浓盐酸于管内，高温封管后，110℃水解24h，切开封管口，室温氮气吹干。

异硫氰酸苯脂(PITC)衍生：酸水解样用100μL的乙腈-吡啶-三乙胺-水(10:5:2:3)缓冲液溶解,氮气吹干后加入250μL的同样缓冲液，并加20μL异硫氰酸苯脂，50℃反应1h后，加入正己烷200μL，混匀，静置分层，从下层吸取200μL移入3mL样品管中，加入2800μL稀释液，混匀后即可上机分析。

(8)测定结果

①对维生素含量影响的测定结果，结果见表4、5。

表4 喂饲1个月时牛乳样品中维生素含量测定结果

样品	维生素A(μg/kg)	维生素E(μg/kg)	维生素D(μg/mL)
				试验组牛乳样品	25	260	检测到样品峰
对照组牛乳样品	20	150	0

由表4可见，与对照组相比，试验组奶牛样品中的维生素A含量提高了25％，维生素E含量提高了73.3％，对照组和试验组奶牛样品中维生素D含量均较低，但从对照组奶牛样品中测定不到维生素D，而从试验组奶牛样品中能测定到维生素D，维生素D含量在检测限附近，提示试验组样品中维生素D的含量存在明显提高。

表5 喂饲2个月时牛乳样品中维生素含量测定结果

样品	维生素A(μg/kg)	维生素E(μg/kg)	维生素D(μg/mL)
				试验组牛乳样品	26	245	检测到样品峰
对照组牛乳样品	19	167	0

由表5可见，与对照组相比，试验组奶牛样品中的维生素A含量提高了36.8％，维生素E含量提高了46.7％，对照组和试验组奶牛样品中维生素D含量均较低，但从对照组奶牛样品中测定不到维生素D，而从试验组奶牛样品中能测定到维生素D，维生素D含量在检测限附近，提示试验组样品中维生素D的含量存在明显提高。

综上所述，虫草欣康能有效改变牛乳的风味，提高维生素A、E、D的含量。

②对必需氨基酸含量影响的测定结果

试验组必需氨基酸测定图谱见图3，对照组必需氨基酸测定图谱见图4，喂饲1个月时的必需氨基酸含量测定结果见表6，喂饲1个月时风味氨基酸的含量测定结果见表7。

表6 喂饲1个月时虫草欣康对牛乳中必需氨基酸水平的影响

由表6可见，与对照组比较，试验组牛乳样品中总必需氨基酸含量有大幅度提高，与对照组比较，试验组牛乳样品中总氨基酸含量提高了12.96％。

表7 喂饲1个月时虫草欣康对牛乳中风味氨基酸水平的影响

由表7可见，试验组牛乳样品中风味氨基酸含量有大幅度提高，与对照组比较，试验组牛乳样品中风味氨基酸含量提高了41.87％。

Claims (10)

1.虫草属菌种发酵物在提高牛乳风味物质含量中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述风味物质包括以下(1)、(2)或(3)中的至少一种：

(1)在GC-MS图谱中，保留时间为8～15min的低级烷酸；

(2)在GC-MS图谱中，保留时间为15～20min的烷基酸、烷基醛或烷基酮类物质；

(3)在GC-MS图谱中，保留时间为20～40min的高级烷烃、高级烯烃、高级烷基醛、高级烷基酰胺或高级烷酸及其酯类物质。

3.虫草属菌种发酵物在提高牛乳维生素或必需氨基酸含量中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述维生素为维生素A、维生素E或维生素D中的至少一种。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述必需氨基酸为天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸或组氨酸中的至少一种。

6.如权利要求1～5任一所述的应用，其特征在于，包括：将所述虫草属菌种发酵物饲喂泌乳奶牛，获取牛乳。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，以干重计，所述虫草属菌种发酵物的饲喂量为至少5g/头/天。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述虫草属菌种发酵物是由虫草属真菌经液体发酵或固体发酵获得的。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述虫草属真菌为古尼虫草(Cordyceps.gunnii)菌种、冬虫夏草(C.sinensis)菌种、北冬虫夏草(C.militaris)菌种、亚香棒虫草(C.hawkesii)菌种、新疆虫草(C.gracilis)菌种、大团虫草(C.ophioglossoides)菌种或蝉花(C.sobolifera)菌种中的至少一种。

10.一种提高牛乳中风味物质、维生素或必需氨基酸含量的方法，其特征在于，包括：将虫草属菌种发酵物饲喂泌乳奶牛，获取牛乳；

所述虫草属菌种发酵物是由虫草属真菌经液体发酵或固体发酵获得的；

所述虫草属真菌为古尼虫草(Cordyceps.gunnii)菌种、冬虫夏草(C.sinensis)菌种、北冬虫夏草(C.militaris)菌种、亚香棒虫草(C.hawkesii)菌种、新疆虫草(C.gracilis)菌种、大团虫草(C.ophioglossoides)菌种或蝉花(C.sobolifera)菌种中的至少一种。