CN104328135A

CN104328135A - 鸭坦布苏病毒e蛋白和ltb的融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN104328135A
Application number: CN201410569393.8A
Authority: CN
Inventors: 侯竹美
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2014-10-23
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2034-10-23
Also published as: CN104328135B

Abstract

本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗，即筛选获得鸭坦布苏病毒E蛋白具有优势抗原表位的DomainIII结构域，并通过Lingker与肠毒素LTB组成新型融合蛋白LTB-Es，并以该融合蛋白作为抗原来制备鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗。本发明中鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1；其中一种核苷酸序列为SEQIDNO:2。本发明利用原核表达载体构建了能表达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。将重组表达的蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，可使免疫后鸭群获得免疫保护。

Description

鸭坦布苏病毒E蛋白和LTB的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白和LTB的融合蛋白及其应用。

背景技术

我国是世界养鸭大国，鸭肉年生产总量约占世界总量的70%，自2000年的186.6万吨增长到2008年的258.1万吨，年均增长率约3.8%，大大高于世界平均水平。鸭坦布苏病毒是2010年在中国率先发现的一种新发病毒，主要引起鸭群采食量和产蛋大幅下降、卵巢出血、神经症状等，因此初期该病又称为鸭出血性卵巢炎、产蛋下降综合征等。通过病毒分离、基因解析，目前鸭坦布苏病毒定位于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒的恩塔亚病毒群。据不完全统计，在蛋鸭和肉鸭主产区，约有1.2亿只蛋鸭和1500多万只肉鸭发生该病，累计经济损失超过50亿元。同时作为新发病毒，目前尚无商业化的鸭坦布苏病毒疫苗面世。

鸭坦布苏病毒为单股正链RNA病毒，基因组10990bp，95-10278bp为ORF区域，编码3个结构蛋白（衣壳蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E）和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，其中包膜蛋白E具有较高免疫原性，含有多个重要的细胞受体结合位点，并能引起强烈和持久的免疫反应，是黄病毒属病毒的主要基因工程疫苗开发候选蛋白。黄病毒包膜E蛋白按其空间结构可分为Domain I、Domain II和Domain III三个结构域，其中Domain III结构域可被病毒的中和抗体识别，且基因大小适中，更适于用于基因工程亚单位疫苗开发。Chu等构建了表达西尼罗病毒E蛋白结构域III的重组质粒，并用寡脱氧核苷酸(CpG-DNA)作为佐剂，腹腔注射途径免疫BALB/C小鼠，结果获得高滴度的西尼罗病毒中和抗体，表明辅以佐剂西尼罗病毒E蛋白Domain III可使小鼠产生免疫应答，具有疫苗开发的潜力。

产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）产生不耐热肠毒素（heat-labile entero toxin，LT）具有良好的免疫原性和免疫佐剂作用，其又分为A亚（LTA）和B亚基（LTB）。LTB是LT的免疫原性部位，是受体结合部位，具有良好的免疫佐剂作用，已有多篇文献报道其用于疫苗的免疫佐剂。李润成等（2009年）将肠毒素LTB蛋白基因与口蹄疫VP1蛋白基因进行融合表达，发现LTB可有效促进口蹄疫VP1蛋白的免疫效果，增效明显。余兴龙等将LTB与猪圆环病毒ORF2基因融合表达制备的融合蛋白制成基因工程亚单位，免疫后也取得理想的免疫效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白和LTB的融合蛋白，即通过筛选获得优势抗原表位的鸭坦布苏病毒E蛋白Domain III部分，并通过Lingker（GGGSGGGS）与肠毒素LTB组成新型融合蛋白LTB-Es，并以该融合蛋白作为抗原来制备鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗。

本发明首先提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白Domain III和LTB的融合蛋白LTB-Es，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明还提供一种鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗，其中的抗原为上述的新型融合蛋白LTB-Es，其浓度为0.1-0.5mg/ml之间；

本发明的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗，其制备步骤如下：

1）将新型融合蛋白LTB-Es基因插入表达载体中，构建成表达重组质粒；

2）将构建的表达重组质粒转化宿主菌,构建了能表达新型融合蛋白LTB-Es的重组基因工程菌；用该重组基因工程菌表达出新型融合蛋白LTB-Es；

3）对重组表达的LTB-Es蛋白进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。

本发明利用pET30a（+）表达性载体构建了能表达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了26kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫14日龄鸭群，免疫后可以使鸭群获得免疫保护。

具体实施方式

申请人在获得一个具有免疫特性的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es，并进一步通过大肠杆菌稀有密码子优化获得其基因，然后通过pET30a（+）原核表达载体构建出能表达蛋白LTB-Es的大肠杆菌BL21(DE3)重组基因工程菌，通过对工程菌的诱导、超声破碎、蛋白纯化、定量、与佐剂配比等制备和生产方法制备出了鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗。

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

实施例 1 鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es 的获得

1、利用生物软件对鸭坦布苏代表毒株ZJ-6（GenBank登录号：JF459991.1）的包膜蛋白E进行抗原表位分析，选定E蛋白抗原性较强Domain III位置（ 303-410aa ）与LTB序列进行拼接，中间设计Lingker（GGGSGGGS）进行连接，获得一种新型鸭坦布苏病毒E蛋白Domain III和LTB的融合蛋白LTB-Es，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，并利用在线生物软件DNAWorks进行大肠杆菌稀有密码子优化，获得融合蛋白LTB-Es的核苷酸序列SEQ ID NO:2。

将新获得的融合蛋白LTB-Es的核苷酸序列进行全基因合成，同时两端分别加上BamH I和Hind III酶切位点。

实施例 2 基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得

1、上述全基因合成的融合蛋白LTB-Es基因用BamH I和Hind III双酶切后连入pET30a载体相应的酶切位点，构建pET30a/Es表达载体。

2、用CaCl₂法将pET30a/Es表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50μg/ml卡那霉素的琼脂平板，37℃过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamH I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵培养至0.6～0.8时加入0.3mM IPTG诱导4～5小时，离心收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同时设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在26kD处多出一条蛋白条带，与重组蛋白理论分子量一致，表达量约为30%以上。经鸭坦布苏病毒抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌，命名为LE株。

实施例 3 发酵、纯化与鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗的制备规程

1 菌毒种

1.1 制造用菌种为鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗生产菌LE株；检测用的强毒株为鹅源坦布苏SD株。

1.2 生产用菌种标准

1.2.1 形态和生化特性

含有卡那霉素的LB琼脂平板上过夜培养，在培养板上呈现圆形、边缘整齐、突起、乳白色有光泽的光滑菌落，革兰氏染色后，镜下显示为革兰氏阴性短杆菌；生化试验结果均为葡萄糖发酵+，吲哚试验+，甲基红试验 +，VP -，枸橼酸利用试验 -。

1.2.2 培养特性可在含有卡那霉素的培养基中生长。

1.2.3 鉴别检验

1.2.3.1 PCR检测将本菌的LB液体培养物3μl做模板，用以下PCR引物进行PCR扩增，应能扩增出418bp左右的片段。

P1: 5′- CTCTCAGAAAAAAGCGAT -3′

P2： 5 ′- CAGGATGAAGGAGTCACC-3′

扩增的条件如下：94℃ 5min变性，94℃ 30S，50℃ 30S，72℃ 1min，30个循环，72℃延伸10min。

1.2.3.2 Western-blot检测将LB固体培养平板上的重组菌单菌落接种于5ml 含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀值在0.6～1.0之间时加入0.8mM的IPTG诱导，持续培养4小时，收集菌体，用PBS重悬后高压匀质破碎，8000 r/min离心去沉淀，上清液与抗鸭坦布苏病毒阳性血清进行Western-blot试验，应出现特异性条带。

1.2.4 纯粹用适宜培养基检查，应纯粹。

1.2.6 基础种子代次 F5~F8代。

1.2.7 保存冻干菌种，-20℃，保存期为2年。

疫苗制造及半成品检验

2.1 生产用种子制备

2.1.1 一级种子繁殖和鉴定将冻干菌种分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养 8~10小时，然后划线接种于含卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养16~18小时，作为一级种子。在2～8℃保存，不超过14天；在培养基上传代，应不超过2代。

2.1.2 二级种子繁殖在一级种子中选取符合1.2.1项标准的典型菌落10个混合于少量LB培养液中，接种于含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养8～10小时，进行纯粹检验，应纯粹。置2～8℃保存，应不超过3天。

2.2 制苗用培养基为改良LB培养基，每1000 ml培养基中含胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10 g，葡萄糖 5g，MgSO₄ ∙ 7H₂O 5g。

2.3 制苗用抗原液制备

2.3.1 菌液培养用培养罐通气培养，按培养罐容积装入适量培养基（70%左右）及消泡剂，灭菌后按培养基量的5％接种二级种子菌液，37℃通气培养，待菌液的OD₆₀₀值达到7.0时，加入8g/L的 α-乳糖诱导，再继续培养6～8小时。使用20%NaOH调节pH在7.0，通过转速关联控制溶氧在20%以上。当溶氧迅速上升时，流加补料。

2.3.2 破菌培养结束后，离心收集菌体。收集的菌体用PBS清洗2次，将收集的菌体用PBS制成10%的悬液，在4℃下用高压匀浆机破碎细菌。破碎后的菌液，8000r/min，离心15分钟，收集上清液。

2.3.3 镍柱层析纯化收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后即得重组蛋白液。

2.3.4 灭活将纯化的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度为0.2%，37℃灭活12小时，以灭活残存的大肠杆菌。取少量样品进行半成品检验。2～8℃保存，不超过7天；-15℃以下保存，不超过60天。

2.4 半成品检验

2.4.1 蛋白Es含量检测用BCA法检测上清液蛋白浓度，稀释至终浓度0.5mg/ml，无菌过滤，待用。

2.4.2 无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

2.4.3 内毒素含量检测按鲎试剂方法进行内毒素检测，内毒素含量不高于1000EU/ml者方可用于制苗。

2.5 疫苗制备

2.5.1 油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份。在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加司本-80 6份，至温度达到125~130℃时维持30分钟，冷却至室温备用。

2.5.2 水相制备取灭菌的吐温-80 4份，加检验合格的半成品96份，充分搅拌至吐温-80完全溶解。

2.5.3 乳化取油相3份置于高速剪切机内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以3600r/min乳化40分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，终浓度达到0.01%。乳化后，取样10ml加入离心管，以3000r/min离心15分钟，管底析出水相应不超过0.5ml。

2.5.4 分装定量分装，密封瓶口。

成品检验

3.1 物理性状

外观为乳白色乳剂。

剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》进行，符合规定。

装量检查按现行《中国兽药典》进行，符合规定。

3.2 无菌检验按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。

3.3 安全检验取7-14日龄健康易感鸭10只，肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml/只，观察14天，不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。

3.4 效力检验

取7-14日龄健康易感鸭20只平均分为二组，每组10只。第一组为免疫组，用本发明制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗进行颈部皮下或者肌肉注射免疫，0.5ml/只，第二组为生理盐水对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。免疫21天后各组肌肉注射鸭坦布苏强毒株SD株进行攻毒，攻毒后5日剖检，取脾脏进行分离病毒。对照组应至少8只分离病毒阳性，试验组则至少7只分离阴性。

3.5 甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行，均符合规定。

实施例 4 鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的疗效试验

将14日龄健康易感鸭60只平均分为三组，每组20只。第一组为免疫组，用本发明制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗进行颈部皮下或者肌肉注射免疫，0.5ml/只，第二组为阳性对照组，即用重组表达的单独鸭坦布苏E蛋白Domain III参照实施例4方法制备成基因工程亚单位疫苗，颈部皮下或者肌肉注射免疫，0.5ml/只，第三组为生理盐水对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。免疫21天后各组肌肉注射鸭坦布苏强毒株SD株进行攻毒，攻毒14天后统计攻毒保护率（发病只数占总只数的百分率）。其中发病标准：临床出现精神症状、剖检脾脏肿大，并可在脾脏分离出鸭坦布苏病毒。

结果表明本发明制备的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗对鸭群的被动保护期在21天以上，免疫后的鸭群在14天的攻毒保护率在100%，而阳性对照组攻毒保护率仅为60%，生理盐水对照组的攻毒保护率为0%。证明本发明的疫苗对鸭群的具有良好的临床保护效果，可进行临床推广和应用。

表 1 鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的攻毒保护试验

碱基序列：

GCGCCGCAGACCATCACCGAGCTCTGCTCTGAATACCGTAACACCCAGATCTACACCATCAACGACAAAATCCTGTCTTACACCGAATCTATGGCGGGTAAACGTGAAATGGTTATCATCACCTTCAAATCTGGTGAAACCTTCCAGGTTGAAGTCCCGGGTTCTCAACACATCGACTCTCAGAAAAAAGCGATCGAACGTATGAAAGACACCCTGCGTATCACCTACCTGACCGAAACCAAAATCGACAAACTGTGCGTTTGGAACAACAAAACCCCGAATTCTATCGCGGCGATCTCTATGAAAAACGTGCCGGGTGTTGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTTCTCCGATGTGCTCTAACACCTTCTCTCTGGTTAAAAACCCGACCGACACCGGTCACGGTACTGTGGTTGTCGAACTCTCTTACGCGGGTACCGACGGTCCGTGCCGTGTTCCTATCAGCATGTCTGCCGACCTGAACGACATGACCCCGGTTGGTCGTCTGATCACCGTTAACCCGTACGTTTCTACCTCTTCTACCGGTGCGAAAATCATGGTTGAGGTTGAGCCGCCGTTCGGTGACTCCTTCATCCTGGTTGGTTCCGGTAAAGGTCAGATCCGTTACCAGTGGCACCGTTCTGGCTCTACCATCGGTAAGGCGTTCACCTCT

氨基酸序列：

APQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMKNVPGVGGGSGGGSPMCSNTFSLVKNPTDTGHGTVVVELSYAGTDGPCRVPISMSADLNDMTPVGRLITVNPYVSTSSTGAKIMVEVEPPFGDSFILVGSGKGQIRYQWHRSGSTIGKAFTS

Claims

1.一种鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es基因，其特征在于，所述的基因的编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

4.权利要求1所述的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es基因在制备疫苗中的应用。

5.一种鸭坦布苏病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为权利要求3所述的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es。

6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es的浓度为0.1-0.5mg/ml。

7.权利要求5所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括有如下的步骤：

1）将LTB-Es基因连入原核表达载体中，构建成重组表达质粒；

2）将构建的重组表达质粒转化宿主菌,构建能表达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es的重组基因工程菌，用该重组基因工程菌表达出新型融合蛋白LTB-Es；

3）对重组表达的新型融合蛋白LTB-Es进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。