CN102058881B - 预防肠道病毒71型感染的基因重组疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预防肠道病毒71型感染的基因重组疫苗及其制备方法，所述感染包括手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病，我们以大肠埃希氏菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)为免疫增强佐剂、EV71病毒外壳蛋白VP1中的两段线性中和表位SP55和SP70为抗原，用基因工程技术构建LTB-SP55-SP70融合基因的原核表达质粒，在大肠埃希菌中进行表达，并对重组表达产物进行纯化，制成EV71病毒基因工程疫苗。

Description

预防肠道病毒71型感染的基因重组疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种疫苗及其制备方法。特别涉及用于预防肠道病毒71型(EV71病毒)感染所致手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病的基因重组疫苗及其制备方法。 

技术背景

手足口病是由小RNA病毒科，肠道病毒属病毒引起的，现已成为危害婴幼儿健康和公共卫生安全的重要传染病。手足口病主要由肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16(Cox.A16)引起。感染EV71和Cox.A16所引起的临床症状难于区别。感染EV71常常并发严重神经炎症，包括病毒性脑膜炎，脑炎，以及类似小儿麻痹的瘫痪，引起的肺水肿、肺出血经常导致婴幼儿快速死亡。手足口病从感染到出现症状通常为36天。病人常在口中发现疮，手掌、脚底出现皮肤红疹。有些病例，主要是小于3岁的婴幼儿，会出现严重的并发症，短期发烧后突然恶化，并快速死亡。 

目前尚无有效的疫苗或药物可防止手足口病。 

自1974年首次报道EV71以来，EV71已在世界范围内引起多次爆发流行。近10年来，EV71病毒的流行在亚太地区猖獗，不仅发病人数多，而且死亡病例多。中国大陆地区于1981年由上海首次报道手足口病，此后北京、山东、广东等十几个省份均有本病爆发流行的报道。2007年山东临沂等地区发生手足口病流行，发病39606例，死亡14例。根据最新的疫情监测结果显示，截至5月16日，2010年全国累计报告病例553263例，发病率41.66/10万，重症7993例，死亡335例；报告病例数较去年同期(365630例)相比，增加51.32％。自2008年5月2日起，卫生部将手足口病纳入法定丙类传染病管理。 

流行病学资料显示，Cox.A16一般和EV71相伴流行，在流行过程中，考虑到Cox.A16多导致无症状感染，可能在流行中所占实际比例更高。2008年安徽阜阳手足口病疫情发生后，中国疾病预防控制中心在全国范围内病例标本的实验室检测结果显示，在582个手足口病例阳性标本中，EV71占54.5％，Cox.A16占17.4％。2010年全国31个省份共报告实验室诊断病例14650例，其中EV71阳性7867例(53.70％)，CoxA16阳性4579例(31.26/％)，其它肠道病毒阳性2204例(15.04％)。在7993例重症病例中，3249例为实验室诊断病例，其中86.21％为EV71感染，3.76％为CoxA16感染，10.03％为其他肠道病毒感染；335例死亡病例中，256例为实验室诊断病例，其中EV71感染239例，CoxA16感染2例，其他肠道病毒感染15例。 

由EV71或Cox.A16引起的手足口病反复爆发可能是新的基因型在世界范围内传播所致。对1970～2004年全球EV71分离株的分子流行病学分析显示，EV71病毒分为3个基因型，即A，B，C型，8个基因亚型，即B1-B4和C1-C4亚型。对1983年～2003年福岛地区(Fukushima，Japan)Cox.A16分离株进行遗传重建显示，Cox.A16分离株形成了3个不同的遗传簇(A，B，C)。近几年从中国大陆手足口病轻症病例和重症病例标本中分分离到的EV71病毒主要为C4亚型，Cox.A16病毒主要为C型。 

EV71和Cox.A16病毒颗粒均为二十面体立体对称的球形结结构，无包膜和突起。病毒粒子的衣壳由60个亚单位构成，后者又是由4种衣壳蛋白(VP1-VP4)拼装成的五聚体样结构。抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上，而VP4包埋在病毒外壳的内侧。EV71和Cox.A16病毒基因组均为7400～7420个核苷酸的单股正链RNA，基因组中仅有一个开放读码框，编码含约2190～2200个氨基酸的多聚蛋白，在其两侧为5’和3’-非编码区(UTRs)，在其3’-UTRs区的末端含有一个长度可变的poly-A。多聚蛋白可进一步水解成P1、P2、P3前体蛋白。P1前体蛋白编码VP1、VP2、VP3、VP4病毒外壳蛋白；P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白(2A-2C和3A-3D). 

在脊髓灰质炎灭活疫苗和减毒活疫苗的启发下，已经有针对手足口病的灭活疫苗和减毒活疫苗的研究，并已取得了一些进展，但距离临床应用尚不成熟。曾有EV71福尔马林灭活疫苗成功地控制EV71在保加利亚传播的报道，但未见再次使用灭活疫苗的报道。中国台湾何美乡筛选了一株适于制备EV71灭活疫苗的病毒株YN3-4a，病毒产量高、免疫原性强、交叉保护谱广、子代病毒稳定性高。在弱毒活疫苗的研制方面，中国台湾余俊强使用EV71和Cox.A16弱毒柱免疫小鼠 获得了对EV71强毒株的免疫保护，表明具有交叉保护功能。日本MInetaro Arita采用反向遗传学技术拯救弱毒株EV71(S1-3’)，免疫短尾猴后，神经毒力降低，而具有广谱的交叉保护活性。减毒活疫苗方面，由于对EV71和Cox.A16毒力决定基团至今不清，尚无进展。 

在传统疫苗研究的同时，亚单位疫苗的实验室研究取得了可喜的进展。采用毕赤酵母、大肠埃希氏菌、昆虫细胞、沙门氏菌、百日咳细菌等表达了EV71和Cox.A16的结构蛋白VP1，并利用病人阳性血清证实表达的VP1蛋白具有免疫原性。昆虫细胞和沙门氏菌表达的VP1结构蛋白以及使用VP1基因研制的DNA疫苗免疫小鼠后能诱导对EV71或Cox.A16感染的保护。 

联想到口服型脊髓灰质炎病毒疫苗的成功应用，以及近年来在黏膜免疫和口服疫苗研究的进展，包括我国最新批准上市的幽门螺旋杆菌口服基因工程疫苗的成功案例，可见EV71口服型基因工程疫苗的研制已经并不遥远。 

尽管进行了有关EV71和Cox.A16疫苗的开发工作，但是目前仍然未开发出有医药商业应用价值的疫苗。 

发明内容

针对目前手足口病的流行态势，为了更好的预防手足口病的爆发，本发明人经过不懈的努力，设计并构建了EV71融合表达蛋白。在此基础上，本发明的发明人开发了用于预防EV71感染的口服疫苗。经实验证明，本发明的疫苗或者药剂具有有效的免疫活性和/或攻毒保护能力。 

所以，本发明一方面提供了用于针对EV71感染的疫苗，所述疫苗结构中包括EV71的SP55和SP70两个蛋白，以及LTB蛋白。 

进一步的，本发明提供了一种用于预防EV71感染的口服型疫苗。 

再一方面，本发明还提供了一种制备针对EV71感染口服型疫苗的方法。 

再另一方面，本发明提供本发明的疫苗在制备预防EV71感染口服型疫苗中的用途。 

具体而言，本发明提供一种能有效预防EV71病毒感染引起的手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病的基因重组口服疫苗及其制备方法。 

本发明预防EV71病毒感染的重组口服疫苗是一种由LTB-SP55-SP70融合而成的 基因重组口服疫苗，它以大肠埃希氏菌不耐热肠毒素B亚单位LTB为免疫增强佐剂、EV71病毒外壳蛋白VP1中的两段多肽SP55和SP70为抗原，根据大肠埃希氏菌的嗜好对密码子进行优化，基因合成后采用基因工程技术构建rLTB-SP55-SP70的原核表达系统，得到的基因重组疫苗。通过基因工程技术制备的融合基因原核表达系统及其产物，使该疫苗具有表达产物中同时含有重组佐剂rLTB及rSP55和rSP70重组病毒蛋白抗原，从而能对EV71病毒感染引起的手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等相关疾病具有免疫预防效果，并且还具有制备方法简便可靠，生产成本较为低廉，使用方便、安全等特点。 

本发明的疫苗其结构由LTB-SP55-SP70表示，其氨基酸序列列在序列表序列8，和本发明疫苗结构对应的核苷酸序列列在序列表序列7， 

本发明疫苗结构中的LTB-SP55-SP70其各自的氨基酸序列列在序列表序列2，4，6中，其对应的核苷酸序列列在序列表序列1，3，5中。 

技术方案 

本发明提供了EV71病毒感染的重组口服疫苗的制备方法及其效果鉴定步骤：1)大肠埃希氏菌LTB基因、EV71病毒SP55和SP70基因的密码子优化、合成和测序；2)rLTB-SP55-SP70基因合成后，用Nde I和Xho I进行双酶切，切下片段跟进行了同样双酶切的pET30a载体连接，构建原核表达质粒；3)重组蛋白rLTB-SP55-SP70表达，SDS-PAGE电泳和BioRad凝胶图像分析系统确定表达情况和产量；4)DEAE阴离子交换层析和Ni-NTA亲和层析法纯化rLTB-SP55-SP70；5)rLTB-SP55-SP70水溶液即可直接制成口服滴丸；6)rLTB-SP55-SP70还可经冷冻干燥与药用赋性剂磷酸钙混合后制备成口服胶囊。 

有益效果 

本发明通过重组蛋白rLTB-SP55-SP70的原核表达和纯化，提供一种预防EV71病毒感染引起的手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等相关疾病的多价口服基因工程疫苗，并采用GM1-ELISA、免疫后小鼠血清抗体体外中和实验等方法，证实该疫苗中rLTB保持有佐剂活性，口服后产生的特异性抗体能够有效中和病毒对细胞的感染。 

本发明方法制备的重组蛋白rLTB-SP55-SP70是一种无害人体的细菌和病毒融合 蛋白，制备方法安全可靠、成本较低、易于推广应用。 

本发明预防EV71病毒感染的基因重组口服疫苗是以口服滴丸或口服胶囊供人们服用，故使用方便，可避免注射引起的疼痛和不适，也可避免使用针头和针筒，减少了污染的可能性；制造成本低，利于推广应用。 

附图说明

图1大肠埃希氏菌LTB基因密码子优化后核苷酸序列和氨基酸序列： 

图2 EV71病毒SP55和SP70基因密码子优化后核苷酸序列和氨基酸序列 

图3大肠埃希氏菌LTB基因和EV71病毒SP55和SP70基因的LTB-SP55-SP70融合基因核苷酸和氨基酸序列。表达载体克隆设计。 

图4 rLTB-SP55-SP70蛋白SDS-PAGE胶. 

具体实施方式

实施例1 

本发明预防EV71病毒感染的重组口服疫苗是一种LTB-SP55-SP70融合基因的重组口服疫苗，它以大肠埃希氏菌不耐热肠毒素B亚单位LTB为免疫增强佐剂、EV71病毒外壳蛋白VP1中的两段多肽SP55和SP70为抗原，根据大肠埃希氏菌的嗜好对密码子进行优化，基因合成后采用基因工程技术构建rLTB-SP55-SP70的原核表达系统，获得高纯度重组表达产物的EV71病毒基因工程疫苗。 

本发明研制基因工程疫苗对抗原及其基因的选择：所有EV71病毒均有编码SP55和SP70的基因，具有序列保守、表达量高、表面分布、大分子量和颗粒结构、抗原性强等特点，故将这两个蛋白作为EV71基因工程疫苗首选抗原；这两段基因是中和抗原决定簇，其中SP70更强些，可以诱发机体产生具有保护性中和抗体。 

本发明基因工程疫苗采用口服疫苗的理由是：注射免疫通常是诱生血清抗体；而EV71因为是肠道感染病毒，所以通过口服疫苗在诱生血清抗体的同时，还可以诱生机体产生针对EV71的黏膜免疫。因此，采用EV71病毒口服疫苗能更有效的产生免疫保护作用。 

基因工程疫苗虽具有抗原成分明确、副作用小等优点，但单一蛋白抗原构成的疫苗免疫效果往往较差。近年有不少研究资料证明，大肠埃希氏菌不耐热肠毒素(LT)有很强的黏膜免疫佐剂活性。LT分别由亚单位A(LTA)和B(LTB)组成， 其中LTA是LT的毒性部位，LTB功能则是黏附细胞，并无毒性。已有不少文献报道，LTB有很强的诱导黏膜免疫的活性，是良好的粘膜免疫佐剂。 

若采用基因工程技术，将大肠埃希氏菌LTB、EV71病毒外壳蛋白VP1中的两段多肽SP55和SP70分别重组表达，必然使得生产工艺复杂，增加生产成本。因此，本实施例将LTB、SP55和SP70三个基因串联成为LTB-SP55-SP70这样一个融合基因，然后构建LTB-SP55-SP70原核表达系统。LTB-SP55-SP70原核表达系统重组表达产物为rLTB-SP55-SP70，其分子中同时含有粘膜免疫佐剂LTB以及SP55和SP70抗原，不仅可因LTB这一分子内佐剂的存在而提高蛋白的免疫原性，并可有效地降低生产成本而有利于产业化。此外，还对r LTB-SP55-SP70免疫原性、表达产量和提纯方法、佐剂活性、口服免疫小鼠后预防EV71感染的效果等进行了验证，表达后r LTB-SP55-SP70产量可达细菌总蛋白的24.3％，其中rLTB仍保持有佐剂活性，口服免疫后可使小鼠产生特异性抗体，在体外细胞中和实验中可有效中和病毒对细胞的感染。其结果表明，rLTB-SP55-SP70可用于预防EV71病毒感染的基因重组口服疫苗。 

本实施例预防EV71病毒感染的基因重组口服疫苗的制备方法包含以下的步骤：1)大肠埃希氏菌LTB基因、EV71病毒SP55和SP70基因的密码子优化、合成和测序；2)rLTB-SP55-SP70基因合成后，分别用限制性内切酶Nde I和Xho I进行消化，收集目的片段与同样用限制性内切酶处理的pET30a载体进行连接，构建重组表达质粒；3)重组蛋白rLTB-SP55-SP70表达，SDS-PAGE电泳和BioRad凝胶图像分析系统确定表达情况和产量；4)DEAE阴离子交换层析和Ni-NTA亲和层析法纯化rLTB-SP55-SP70蛋白。此外还采用GMI-ELISA法对rLTB-SP55-SP70分子中的rLTB佐剂活性进行鉴定；将高纯度基因重组蛋白免疫BALB/c小鼠，检测其特异性抗体，并采用体外病毒中和实验评价该重组抗原对BALB/c小鼠初步的免疫保护力。 

本实施例中大肠埃希氏菌LTB基因、EV71病毒SP55和SP70基因均通过基因合成获得；本实施例中所用的一切实验用材料和试剂及相关设备均可从各自国内外相关产业公司或国外公司国内销售代理公司购得。在微生物学、分子生物学等技术领域的专业人员，均可重复本实施例中的制备方法并进行试用。 

上述人工合成的融合基因LTB-SP55-SP70的制备方法是由宝生物工程(大连)有 限公司直接基因合成。 

上述原核表达载体pET30a购自Novagen公司，E.coli BL21(DE3)购自北京博迈德科技发展有限公司。将上述合成基因的目的基因LTB-SP55-SP70与pET30a载体均用Nde I和Xho I限制性内切酶进行消化处理，用T4 DNA连接酶16℃连接，获得目的重组表达质粒； 

一、连接反应 

1、将pET30a载体和人工合成的LTB-SP55-SP70基因片段用Nde I和Xho I两种限制性内切酶进行消化处理，收集目的片段。 

2、将50ng双酶切后的pET30a载体与5～8倍摩尔量的目的基因片段加入到0.5ml无菌Eppendorf管中。 

3、加双蒸水补充体积到8μl，然后加入10×T4 DNA Ligase buffer 1μl，T4 DNA Ligase 1μl，混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底，于16℃保温1小时。 

同时做二组对照反应，其中对照组一仅有双酶切后的pET30a载体片段而无外源DNA；对照组二仅有双酶切后的外源DNA片段而没有载体片段。 

二.感受态细胞的制备 

1.挑取E.coli BL21(DE3)单菌落接种于1ml无菌LB培养液中，37℃ 210转摇床2-3小时。 

2.取0.05～0.1ml培养的新鲜菌液转种到50ml无菌LB培养液中，37℃剧烈震荡，直到A600达到0.5。 

3.在无菌条件下将培养物转移到50ml无菌离心管中，4℃ 4,000rpm离心10min。 

4.弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干，此操作为无菌条件下。 

5.取15ml 0.1M预冷的无菌氯化钙溶液重悬沉淀，冰水浴中放置10～15min，4℃ 4,000rpm离心10min。 

6.弃上清，沉淀重悬于5ml(含0.1M预冷的无菌氯化钙溶液，15％的无菌甘油)溶液中轻柔混匀，冰水浴中放置10min。 

7.将菌液分装于无菌EP管中，-80℃或液氮冻存。 

8.取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH₂O(阴性对照)和1μl纯质粒(阳性对照)进行转化(见后)，以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落 生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。 

LB的配制： 

蛋白胨  10g 

酵母提取物  5g 

NaCl  0.58g 

NaOH  1∶100调pH值 

溶解并加水定容至1L，121℃×20min高压蒸汽灭菌 

0.1M氯化钙溶液的配制： 

0.1M CaCl₂

ddH₂O to 100ml 

注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理 

三.转化 

1.取100μl感受态细胞于冰水浴上融化。 

2.加入10μl连接产物，轻轻吹散混匀，冰水浴放置30min。 

3.将感受态细胞放入42℃水浴中热激90秒，后立即放入冰水浴中放置2min。 

4.加入0.9ml无菌LB溶液，于37℃恒温摇床上150rpm×45min复性。 

5.将感受态细胞4000rpm离心1min，留200μl上清将沉淀轻柔吹散，均匀涂布于含氨卞青霉素的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜。 

四.重组质粒的测序鉴定 

1.上述转化过程可通过提取核酸，用限制性内切酶筛选，获得含有重组外源DNA片段质粒的菌斑，进行小量表达。 

2.经蛋白电泳将有预期表达条带大小正确的样品，送去测序，以确定是否有外源基因LTB-SP55-SP70的插入，以及插入序列是否正确。 

上述目的重组表达产物rLTB-SP55-SP70的表达和提纯方法是： 

一、重组蛋白质的诱导表达 

1.挑取转化有质粒的单菌落，接种于1.5ml含氨卞青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养2-3小时。 

2.取0.5ml菌液保存4℃冰箱中，剩余菌液中加入1mol/L IPTG，使IPTG终浓度为1mmol，37℃，250rpm振荡培养2小时。取1ml样本作为诱导后标本， 收集菌体沉淀。 

4.将诱导后菌体沉淀用20～40μl PBS(pH＝8.0)重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热5min，SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，考马斯亮蓝染色1小时后，脱色观察结果。 

5.选取诱导成功的细菌克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于-20℃保存，准备做下一步分析及纯化。 

二.重组蛋白质为非可溶性蛋白的分离纯化 

1.在含氨卞青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基1L中，接种含pET30a-LTB-SP55-SP70的菌液，37℃，200rpm培养过夜，后加入IPTG至终浓度1mmol/L，按上述条件继续培养4-5小时； 

2.4000g离心10min收集细菌沉淀，用裂解液(0.05％Triton-X100，10mmol/L Tris·Cl，pH8.0)吹起混匀，在冰水浴中进行超声破碎(200瓦，作用20秒，间隔20秒，作用20次)； 

3.9000g离心10min，沉淀用裂解液吹起混匀，再次超声破碎； 

4.9000g离心10min，沉淀用基夜(8mol/L尿素、10mmol/L Tris·HCl，pH8.0)重悬； 

5.11000g离心10min，上清过HiS柱，用300mM咪唑洗脱目的蛋白； 

6.将洗脱的目的蛋白再用10mmol/L Tris·HCl，pH8.04℃透析2小时； 

7.透析的蛋白上DEAE阴离子层析柱，分别用100mM、200mM浓度NaCl洗脱，收集目的重组表达蛋白； 

8.将200mM NaCl洗脱的目的蛋白于-20℃保存，准备做下一步分析及纯化。 

三、重组蛋白质的复性、冻干和定量 

纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用0.01×PBS透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用BIORAD公司蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量。 

上述实验结果如下：1)含pET30a-LTB-SP55-SP70的E.coli BL21(DE3)工程菌可有效表达rLTB-SP55-SP70，产量可达细菌总蛋白的24.3％，见图4；2)经过DEAE阴离子层析及Ni-NTA亲和层析纯化，rLTB-SP55-SP70纯度可达到90％-95 ％。 

为证实目的重组表达产物rLTB-SP55-SP70的免疫原性及LTB的生物学活性，分别以rLTB-SP55-SP70为抗原免疫BALB/c小鼠，观察特异性抗体产生情况、以及rLTB-SP55-SP70与神经节苷酯GM1的结合能力。 

1)免疫原性检测：注射组，在小鼠皮下多点注射rLTB-SP55-SP70，每次剂量5ug/只，每隔14天注射一次，共3次，同时分别采集小鼠尾部静脉血0.5～1ml，第三次注射后14天采集小鼠眼眶静脉血1ml，分离血清，以试剂盒检测血清中特异性抗体；口服组，以rLTB-SP55-SP70通过喂饲方式，每次剂量2ug/只，每隔14天喂饲一次，共3次，同时分别采集小鼠尾部静脉血0.5～1ml，第三次喂饲后14天采集小鼠眼眶静脉血1ml，分离血清，以试剂盒检测血清中特异性抗体。 

2)LTB生物学活性检测：根据LTB能与GM1的特异性结合的特性，可用GM1-ELISA方法来检测重组表达LT蛋白是否具有生物学活性。 

(1)GM1粉剂1mg溶于2ml PBS(pH7.4)溶液中，终浓度为0.5mg/ml，分装到EP管中； 

(2)吸取12μl GM1溶液(0.5mg/ml)到3.0ml碳酸缓冲液(1.59g Na₂CO₃、2.93gNaHCO₃溶于1L去离子水)中，混匀后加到聚苯乙烯包被板条中，100μl/孔，4℃过夜； 

(3)将包被液倒掉，每孔加入170μl封闭液(含1.0％BSA的PBS溶液)，37℃作用1小时； 

(4)将封闭液倒掉，用洗液(含0.05％Tween-20的PBS溶液)洗6次，扣干； 

(5)用PBS溶液将免疫小鼠血清蛋白稀释成100μg/ml、10μg/ml及1μg/ml，将LTB蛋白稀释成100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml及10ng/ml； 

(6)每孔加入系列稀释的样品100μl，每个样品加复孔，用PBS溶液作为阴性对照，另取2孔不加样，作为空白对照； 

(7)倒掉样品液，用洗液洗6次，扣干； 

(8)每孔加入1∶6,000稀释的兔抗CT全毒素血清100μl，37℃作用1小时； 

(9)重复步骤(7)； 

(10)每孔加入1∶2,000稀释的山羊抗兔IgG-HRP 100μl，37℃作用1小时； 

(11)重复步骤(7)； 

(12)每孔加入TMB显色A液、B液各50μl，37℃显色15分钟； 

(13)每孔加入终止液50μl，混匀，以空白对照调零测定各孔A₄₅₀nm值； 

(14)临界值(cutoff)＝阴性对照A₄₅₀nm均值+0.16，样品A₄₅₀nm值≥临界值，判为阳性；样品A₄₅₀nm值＜临界值，判为阴性。 

上述实验结果如下： 

1)rLTB-SP55-SP70免疫小鼠后可产生特异性抗体，用EV71抗体检测试剂盒检测呈阳性。结果见附表1. 

2)GM1-ELISA检测：rLTB-SP55-SP70抗血清能与牛神经节苷酯GM1结合，其OD490均值高于阴性对照20倍以上，故判为有较强的神经节苷酯GM1结合能力。结果见附表2 

为证实目的重组产物rLTB-SP55-SP70的特异性抗体对病毒的中和作用，进行了体外病毒中和实验。用含有rLTB-SP55-SP70的溶液，采用皮下多点注射(5ug/0.1ml/次，共免疫3次)和灌胃(2ug/1ml/次，共3次)两种方式免疫小鼠。在三次免疫后取小鼠眼眶静脉血，分离血清，进行体外病毒中和实验。结果显示第三次免疫小鼠后，注射组和口服组小鼠特异性血清对病毒有明显的中和作用，有效的血清中和效价在1∶32稀释度以上。结果见附表3 

EV71血清中和试验： 

试剂准备：DMEM培养基(已加入1％G、3％PS)、FBS(胎牛血清)；0.1％结晶紫溶液、已知滴度病毒悬液、待测血清样本 

耗材准备：24孔培养板、1000μL/200μL/20μL的枪及枪头，10mL/2mL吸管 

实验步骤： 

细胞的传代和培养：中和实验前一天将RD细胞传24孔板(一个5cm²小方瓶传2个24孔板)备用。待24孔板中RD细胞密度长至80％时即可接种。 

病毒的稀释：稀释病毒悬液至1/2×10^-5滴度。 

待测血清样本的稀释：在新的24孔板中用稀释好的病毒液将待测血清按1∶64、1∶128或1∶256倍进行稀释，稀释后于5％CO₂、37℃的培养箱中温育1h，期间每隔15min摇晃混匀一次； 

病毒-血清混合液的接种：将24孔板中细胞培养上清吸去，每孔加入200μL稀释孵育过的病毒-血清混合液(步骤3所示)，于5％CO₂、37℃的培养箱中温育1h， 期间每隔15min摇晃混匀一次；1h后每孔补加1mL DMEM培养基(含2％FBS)，继续培养。每板分别做一孔空白细胞对照和一孔只加病毒悬液的细胞对照。 

结果观察：待静置培养约72h(如培养期间细胞液体太酸，可补加适当培养基)，吸去细胞培养上清，每孔加入适量0.1％结晶紫溶液(以覆盖住孔表面为宜)，室温静置10min，吸弃上清，用蒸馏水洗一遍，吸干，观察结果。 

综上所述，rLTB-SP55-SP70能形成一种口服EV71基因工程疫苗产品而用于预防EV71感染的相关疾病。 

附表1：免疫小鼠血清EV71抗体检测结果 

实施例2： 

本实施例预防EV71感染的基因重组疫苗是将疫苗抗原LTB-SP55-SP70水溶液直接制备成口服滴丸，其水溶液的浓度可为1mg/ml；还可将LTB-SP55-SP70冷冻干燥后与药用赋形剂磷酸钙混合后制备成口服胶囊，其中的磷酸钙也有较弱的佐剂活性。每粒口服胶囊内含100～500μg，该量的大小可视不同的对象进行选择，不同的性别、不同的年龄段的人，其用量不同；甚至还可在不同的动物中以不同的剂量进行喂给。 

Claims (9)

1.一种预防手足口病的基因重组疫苗，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ IDNO.8所示的序列，结构为LTB-SP55-SP70。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，是一种细胞内佐剂基因重组口服疫苗，它以大肠埃希氏菌不耐热肠毒素B亚单位LTB为免疫增强佐剂、EV71病毒外壳蛋白VP1中的两段线性中和表位SP55和SP70为抗原，用基因工程技术构建LTB-SP55-SP70融合基因的原核表达质粒，在大肠埃希菌中进行表达，并对重组表达产物进行纯化，制成EV71病毒基因工程疫苗。

3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所说的LTB-SP55-SP70制备成口服滴丸。

4.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所说的LTB-SP55-SP70制备成口服胶囊。

5.如权利要求1所述疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：

1)大肠埃希氏菌LTB基因、EV71病毒SP55和SP70基因密码子优化、合成和测序；2)rLTB-SP55-SP70原核表达系统构建；3)rLTB-SP55-SP70重组蛋白的表达，SDS-PAGE电泳和BioRad凝胶图像分析系统确定表达情况和产量；4)DEAE阴离子交换层析和Ni-NTA亲和层析法纯化rLTB-SP55-SP70；5)采用GM1-ELISA对rLTB-SP55-SP70分子中的rLTB佐剂活性进行鉴定；6)用rLTB-SP55-SP70重组蛋白免疫BALB/c小鼠，对免疫血清的抗体产生情况进行检测，利用体外中和实验测定口服免疫的EV71病毒基因工程疫苗rLTB-SP55-SP70的免疫保护作用。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其中步骤1)所说的大肠埃希氏菌LTB具有序列表中SEQ ID NO.2所示的序列。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中所说的EV71病毒SP55和SP70，是根据大肠埃希氏菌偏好密码子优化而基因合成的EV71病毒基因序列所表达，具有序列表中SEQ ID NO.4和6所示的序列。 

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2)所构建的表达载体中，LTB是作为一种细胞内分子免疫增强佐剂。

9.一种表达权利要求1疫苗的核苷酸序列，其特征在于，为SEQ ID NO.7所示的序列。 

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