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CN104263792B - 制备头孢菌素c的发酵方法和该方法中使用的发酵培养基 - Google Patents

制备头孢菌素c的发酵方法和该方法中使用的发酵培养基 Download PDF

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CN104263792B CN201410519492.5A CN201410519492A CN104263792B CN 104263792 B CN104263792 B CN 104263792B CN 201410519492 A CN201410519492 A CN 201410519492A CN 104263792 B CN104263792 B CN 104263792B
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Abstract

本发明涉及一种制备头孢菌素C的发酵方法以及在该发酵方法中使用的发酵培养基。该方法包括如下步骤：步骤1：取顶头孢霉，经活化后，接种至种子培养基中，在pH 6.8～7.2、温度27～30℃下培养60～80小时，制备种子；步骤2：将上述步骤1制得的种子接种至发酵培养基中，在pH 5.2～5.8、温度24～29℃，发酵110～150小时；步骤3：将步骤2所得发酵液离心分离，取上层澄清液体，得到头孢菌素C上清液。本发明在发酵培养基中加入了氨基己二酸，同时优化了发酵培养基的营养组成配方以及发酵工艺条件，促进头孢菌素C的生物合成能力，并显著提高发酵效价，头孢菌素C效价达到38061～44837μg/mL，且不影响头孢菌素C的质量，具有广阔的工业应用前景。

Description

制备头孢菌素C的发酵方法和该方法中使用的发酵培养基
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种制备头孢菌素C的发酵方法以及在该发酵方法中使用的发酵培养基。
背景技术
头孢菌素C是顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)的代谢产物，是继青霉素之后的又一重要的β-内酰胺类抗生素，其结构式如下：
头孢菌素C作为头孢类抗生素半合成的前体物质，其生产水平决定着头孢类抗生素的市场供应量，对制备头孢菌素C的发酵方法的深入研究和工艺优化，有着重要的社会和经济意义。例如，优化发酵工艺，可以提高发酵效价，进而提高生产效率，降低生产成本。
对制备头孢菌素C发酵水平的影响因素主要包括发酵培养基、菌种、过程控制等，其中菌种的生产能力是最显著的影响因素，但菌种改进存在基因改造技术难度大，自然、诱变选育概率低、筛选周期长等缺陷，因此对于工业生产最有效的方式是最大限度地发掘已拥有菌种的生产能力，从发酵培养基和过程工艺条件、补料控制等着手。
目前国内外采用的发酵培养基主要为半合成培养基，除了部分无机盐外，还包括植物油、花生饼粉、淀粉、糊精和蛋氨酸等半合成有机原料，这些物料或作为碳源、或作为氮源、或作为微量元素的供应体，或兼有以上作用。总而言之头孢菌素C的发酵培养基成分复杂，如何调配这些物料最大限度地满足顶头孢霉菌体增殖和合成头孢菌素C是发酵培养基优化的原则。
此外，在发酵培养头孢菌素C的过程中，碳、氮源的补加时间和补加量对顶头孢霉合成头孢菌素C的速率起着重要作用。
段生兵等(“混合碳源发酵生产头孢菌素C过程优化”，工业微生物，2014,44(2)：1-6)采用含有淀粉、玉米浆、糊精、蛋氨酸、尿素、硫酸铵等物质的初始培养基，按照DO-state混合碳源流加策略，在发酵过程中补加混合碳源(葡萄糖+豆油)，发酵190h，头孢菌素C浓度达到36990μg/mL。
现有文献报道的头孢菌素C发酵方法发酵周期长，发酵效价不高，难以满足工业化要求。
L-α-氨基己二酸是一种氨基酸，其与半胱氨酸、缬氨酸共同组成头孢菌素C合成的前体物质，它们在三肽合成酶(ACV合成酶)的作用下缩合成δ-L-α-氨基己二酰-L-半胱氨酰-D-缬氨酸(LLD-ACV)三肽，参与到头孢菌素C的合成途径中，而ACV合成酶是其中的限速酶。L-α-氨基己二酸对ACV合成酶的影响及对最终CPC(头孢菌素C)合成量的影响还未见报道。本发明人在制备头孢菌素C的发酵过程中，在发酵培养基中分别按一定比例添加了前体物质之一的L-α-氨基己二酸、D-α-氨基己二酸或者D,L-α-氨基己二酸，发现促进了头孢菌素C的生物合成能力，并提高了发酵效价。同时，本发明人优化了种子培养基和发酵培养基的营养组成配方以及发酵工艺，使发酵效价最佳化。
发明内容
技术问题
因此，本发明的目的在于提供一种发酵效价、生产效率高的改进的制备头孢菌素C的发酵方法。
本发明的另一目的在于提供一种在所述制备头孢菌素C的发酵方法中使用的发酵培养基。
技术方案
根据本发明的一方面，提供一种制备头孢菌素C的发酵方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：取顶头孢霉，经活化后，接种至种子培养基中，在pH 6.8～7.2、温度27～30℃下培养60～80小时，制备种子，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉25～35g/L，玉米浆14～25g/L，蔗糖23～32g/L，葡萄糖8～12g/L，碳酸钙4～6g/L，以及豆油9～20mL/L；
步骤2：将上述步骤1制得的种子接种至发酵培养基中，在pH 5.2～5.8、温度24～29℃，发酵110～150小时，其中所述发酵培养基组成如下：
以去离子水为介质，氨基己二酸3～12g/L，花生粉25～45g/L，棉籽蛋白17～30g/L，谷朊粉30～50g/L，豆饼粉20～35g/L，玉米浆40～70mL/L，葡萄糖5～10g/L，蔗糖10～20g/L，蛋氨酸9～15g/L，硫酸铵10～20g/L，硫酸钙12～18g/L，碳酸钙5～9g/L，豆油70～120mL/L，以及消泡剂1～2mL/L，
且在发酵过程中，溶解氧浓度在30％以上；根据需要补加硫酸铵、豆油、消泡剂和氨水；
步骤3：将步骤2所得发酵液离心分离，取上层澄清液体，得到头孢菌素C上清液。
根据本发明的另一方面，在所述制备头孢菌素C的发酵方法中使用的发酵培养基，组成如下：以去离子水为介质，氨基己二酸3～12g/L，花生粉25～45g/L，棉籽蛋白17～30g/L，谷朊粉30～50g/L，豆饼粉20～35g/L，玉米浆40～70mL/L，葡萄糖5～10g/L，蔗糖10～20g/L，蛋氨酸9～15g/L，硫酸铵10～20g/L，硫酸钙12～18g/L，碳酸钙5～9g/L，豆油70～120mL/L，以及消泡剂1～2mL/L。
有益效果
本发明在发酵培养基中加入了氨基己二酸3～12g/L，同时优化了发酵培养基的营养组成配方以及发酵工艺条件，促进头孢菌素C的生物合成能力，并显著提高发酵效价，头孢菌素C效价达到38061～44837μg/mL，且不影响头孢菌素C的质量，具有广阔的工业应用前景。
附图说明
图1为发酵培养基中氨基己二酸的浓度与头孢菌素C发酵效价对应关系图。
具体实施方式
下面，更具体地说明本发明的制备头孢菌素C的发酵方法以及在该发酵方法中使用的发酵培养基。
在本说明书中，对温度作如下定义，由于在实验过程中，设定一个具体的温度，在实际操作过程中一般会浮动±0.5℃，例如25℃涵盖了25℃±0.5℃。
根据本发明，在所述制备头孢菌素C的发酵方法中，其中：
在所述步骤1中：
对所述顶头孢霉不作限定，只要其通过发酵法可以产生头孢菌素C即可。例如，所述顶头孢霉可以来源于美国模式培养物集存库(ATCC)(American Type CultureCollection)，保藏号为36225。
所述顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁10～15g/L，蛋白胨10～15g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.0～7.4；斜面培养方法为：在27℃～29℃，相对湿度40％～65％下，培养11～13天。
所述顶头孢霉经斜面培养活化后，使用无菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌悬液，接入至种子培养基中，在pH 6.8～7.2、温度27～30℃下培养60～80小时，制备种子液，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉25～35g/L，玉米浆14～25g/L，蔗糖23～32g/L，葡萄糖8～12g/L，碳酸钙4～6g/L，以及豆油9～20mL/L。
在所述步骤2中：
取上述步骤1制得的种子液，菌丝浓度为16％～22％，按照15％～20％(v/v)的接种比例接种于发酵培养基中，在pH 5.2～5.8、温度24～29℃，发酵110～150小时，其中所述发酵培养基组成如下：
以去离子水为介质，氨基己二酸3～12g/L，花生粉25～45g/L，棉籽蛋白17～30g/L，谷朊粉30～50g/L，豆饼粉20～35g/L，玉米浆40～70mL/L，葡萄糖5～10g/L，蔗糖10～20g/L，蛋氨酸9～15g/L，硫酸铵10～20g/L，硫酸钙12～18g/L，碳酸钙5～9g/L，豆油70～120mL/L，以及消泡剂1～2mL/L，
且在发酵过程中，溶解氧浓度在30％以上；根据需要补加硫酸铵、豆油、消泡剂和氨水。
在所述步骤2中，所述氨基己二酸可以为L-α-氨基己二酸、D-α-氨基己二酸或者L,D-α-氨基己二酸。根据实验，图1示出了发酵培养基中氨基己二酸的浓度与头孢菌素C发酵效价对应关系图，在所述发酵培养基中，氨基己二酸的浓度为3～12g/L，且优选为5～10g/L，最优选为5～6g/L。
在所述步骤2中，所述消泡剂可以为聚丙二醇(PPG)2000。
在本发明优选的实施方案中，所述发酵培养基组成如下：以去离子水为介质，氨基己二酸5～10g/L，花生粉28～40g/L，棉籽蛋白20～30g/L，谷朊粉32～45g/L，豆饼粉24～32g/L，玉米浆40～65mL/L，葡萄糖5.5～10g/L，蔗糖12～19g/L，蛋氨酸9～14g/L，硫酸铵11～19g/L，硫酸钙14～18g/L，碳酸钙5.5～8g/L，豆油75～115mL/L，以及PPG20001～2mL/L。
进一步优选地，所述发酵培养基组成如下：以去离子水为介质，氨基己二酸5g/L，花生粉28g/L，棉籽蛋白20g/L，谷朊粉32g/L，豆饼粉24g/L，玉米浆40mL/L，葡萄糖6g/L，蔗糖13g/L，蛋氨酸10g/L，硫酸铵11g/L，硫酸钙14g/L，碳酸钙5.5g/L，豆油75mL/L，以及PPG20001mL/L。
在发酵过程中，根据需要补加硫酸铵、豆油、消泡剂和氨水。更具体地，在发酵40～70h之间，以0.1～0.3g/L/h的速率补加硫酸铵，70h后停止补加硫酸铵；
在发酵50～120h之间，以2～5g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；
在发酵120～145h之间补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.03～0.06g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫；
在发酵过程中，发酵培养基初始pH为7.2～7.4，随着发酵进行发酵液pH逐渐下降，至5.8～5.2时，开启pH自控设备，用氨水以控制pH为5.2～5.8，所用氨水浓度优选为18％～22％(w/v)。
在所述步骤2中，发酵时间为110～150小时，优选为130～150小时，最优选为145小时；在发酵30～45h前，发酵温度为27℃～29℃，在发酵30～45h后，发酵温度为24℃～26℃。
在所述步骤3中，在发酵完成后，将步骤2所得发酵液进行离心分离，得到头孢菌素C上清液。
下面通过实施例更具体地说明本发明，但本发明的保护范围不局限于这些实施例中。
在下面实施例中，
菌丝浓度测定：取10mL发酵液于10mL离心管中，4000r/min离心20min，计算固形物体积占发酵液总体积的比例。
头孢菌素C效价测定：采用HPLC法，色谱柱：ODS C184.6×150mm，5μm；流动相：1.0g磷酸二氢钠于1000mL甲醇、乙腈和水(按体积140:40:850)的混合液中，混合溶解，用四丁基氢氧化铵调pH至7.0，并用0.45μm微孔滤膜过滤，得到的滤液为流动相；流速：1.0mL/min，紫外检测波长：254nm，室温，进样量20μL。头孢菌素C的纯度以头孢菌素C液相峰面积占总面积的百分比计。
顶头孢霉来源于美国模式培养物集存库(ATCC)(American Type CultureCollection)，保藏号为36225。
实施例1
发酵培养基
组成如下：D-α-氨基己二酸7g/L；花生粉35g/L；棉籽蛋白22g/L；谷朊粉45g/L；豆饼粉24g/L；玉米浆48mL/L；葡萄糖7g/L；蔗糖12g/L；蛋氨酸11g/L；硫酸铵13g/L；硫酸钙14g/L；碳酸钙7g/L；豆油105mL/L；以及PPG20001mL/L。
制备：将谷朊粉与豆油混合溶解，其他原料以去离子水为溶剂溶解，溶解后混合定容于发酵罐中，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节培养基初始pH为7.2～7.4(在发酵时，随着发酵的进行，发酵液pH逐渐下降至5.2～5.8)。
制备头孢菌素C的发酵
步骤1：
取顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁12g/L，蛋白胨12g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.0；斜面培养方法为：在28℃，相对湿度40％～65％下，培养12天；
所述顶头孢霉经斜面培养活化后，使用无菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌悬液，接入种子培养基中，在pH 7.2、温度28℃下培养68小时，制备种子液，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉30g/L，玉米浆15g/L，蔗糖25g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙5g/L，以及豆油10mL/L。
步骤2：
取步骤1制备的种子液，菌丝浓度为18％～20％，按照15％(v/v)的接种比例接种至上述制备的发酵培养基中，发酵145h；在0～40h时发酵温度为28℃，40h后控制为25℃；在发酵阶段发酵液pH逐渐下降至5.3，且在发酵过程中补加氨水、硫酸铵、豆油和PPG2000；
氨水补加：在发酵液pH下降至5.3，开启pH自控系统，通过补加氨水溶液(20％，w/v)维持pH5.3，直至发酵结束；
硫酸铵补加：在发酵40～70h之间，以0.1g/L/h(以纯硫酸铵计)的速率补加硫酸铵溶液(20％，w/v)，70h后停止补加硫酸铵；
豆油补加：在发酵50～120h之间，以3g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；
消泡剂补加：在发酵120～145h之间，补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.03g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫；
整个发酵过程溶解氧浓度控制30％以上。
步骤3：
在发酵结束后，将所得的发酵液4000rpm离心20min后所得上清液即为头孢菌素C溶液。
同时，按照上述方法，检测菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C的纯度，结果示于下面表1中。
表1 实施例1的菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C检测结果
实施例2
发酵培养基
组成如下：L-α-氨基己二酸12g/L；花生粉45g/L；棉籽蛋白30g/L；谷朊粉50g/L；豆饼粉35g/L；玉米浆70mL/L；葡萄糖10g/L；蔗糖20g/L；蛋氨酸15g/L；硫酸铵20g/L；硫酸钙18g/L；碳酸钙9g/L；豆油120mL/L；以及PPG20002mL/L。
制备：将谷朊粉与豆油混合溶解，其他原料以去离子水为溶剂溶解，溶解后混合定容于发酵罐中，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节培养基初始pH为7.2～7.4。
制备头孢菌素C的发酵
步骤1：
取顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁12g/L，蛋白胨10g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.2；斜面培养方法为：在27℃，相对湿度40％～65％下，培养12天；
所述顶头孢霉经斜面培养活化后，使用无菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌悬液，接入种子培养基中，在pH 7.0、温度28℃下培养72小时，制备种子，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉25g/L，玉米浆20g/L，蔗糖28g/L，葡萄糖8g/L，碳酸钙6g/L，以及豆油15mL/L。
步骤2：
取步骤1制备的种子液，菌丝浓度为16％～18％，按照18％(v/v)的接种量接种至上述制备的发酵培养基中，发酵145h；在0～45h时发酵温度为28℃，45h后控制为25℃；在发酵阶段发酵液pH逐渐下降至5.5，且在发酵过程中补加氨水、硫酸铵、豆油和PPG2000；
氨水补加：在发酵液pH下降至5.5，开启pH自控系统，通过补加氨水溶液(20％，w/v)维持pH5.5，直至发酵结束；
硫酸铵补加：在发酵40～70h之间，以0.2g/L/h(以纯硫酸铵计)的速率补加硫酸铵溶液(20％，w/v)，70h后停止补加硫酸铵；
豆油补加：在发酵50～120h之间，以2g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；
消泡剂补加：在发酵120～145h之间，补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.04g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫；
整个发酵过程溶氧浓度控制30％以上。
步骤3：
在发酵结束后，将所得的发酵液4000rpm离心20min后所得上清液即为头孢菌素C溶液。
同时，按照上述方法，检测菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C的纯度，结果示于下面表2中。
表2 实施例2的菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C检测结果
实施例3
发酵培养基
组成如下：D-α-氨基己二酸10g/L；花生粉40g/L；棉籽蛋白25g/L；谷朊粉45g/L；豆饼粉32g/L；玉米浆65mL/L；葡萄糖9g/L；蔗糖19g/L；蛋氨酸14g/L；硫酸铵19g/L；硫酸钙17g/L；碳酸钙8g/L；豆油115mL/L；以及PPG20001.5mL/L。
制备：将谷朊粉与豆油混合溶解，其他原料以去离子水为溶剂溶解，溶解后混合定容于发酵罐中，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节培养基初始pH为7.2～7.4。
制备头孢菌素C的发酵
步骤1：
取顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁10g/L，蛋白胨10g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.4；斜面培养方法为：在29℃，相对湿度40％～65％下，培养11天；
所述顶头孢霉经斜面培养活化后，使用无菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌悬液，接入种子培养基中，在pH 7.0、温度29℃下培养72小时，制备种子，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉30g/L，玉米浆20g/L，蔗糖30g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙5g/L，以及豆油10mL/L。
步骤2：
取步骤1制备的种子液，菌丝浓度为18％～20％，按照15％(v/v)的接种比例接种至上述制备的发酵培养基中，发酵145h；在0～35h时发酵温度为28℃，35h后控制为25℃；在发酵阶段发酵液pH逐渐下降至5.3，且在发酵过程中补加氨水、硫酸铵、豆油和PPG2000；
氨水补加：在发酵液pH下降至5.3，开启pH自控系统，通过补加氨水溶液(20％，w/v)维持pH5.3，直至发酵结束；
硫酸铵补加：在发酵40～70h之间，以0.2g/L/h(以纯硫酸铵计)的速率补加硫酸铵溶液(20％，w/v)，70h后停止补加硫酸铵；
豆油补加：在发酵50～120h之间，以4g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；
消泡剂补加：在发酵120～145h之间，补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.04g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫；
整个发酵过程溶氧浓度控制30％以上。
步骤3：
在发酵结束后，将所得的发酵液4000rpm离心20min后所得上清液即为头孢菌素C溶液。
同时，按照上述方法，检测菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C的纯度，结果示于下面表3中。
表3 实施例3的菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C检测结果
实施例4
发酵培养基
组成如下：L-α-氨基己二酸5g/L；花生粉28g/L；棉籽蛋白20g/L；谷朊粉32g/L；豆饼粉24g/L；玉米浆40mL/L；葡萄糖6g/L；蔗糖13g/L；蛋氨酸10g/L；硫酸铵11g/L；硫酸钙14g/L；碳酸钙5.5g/L；豆油75mL/L；以及PPG20001mL/L。
制备：将谷朊粉与豆油混合溶解，其他原料以去离子水为溶剂溶解，溶解后混合定容于发酵罐中，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节培养基初始pH为7.2～7.4。
制备头孢菌素C的发酵
步骤1：
取顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁15g/L，蛋白胨15g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.4；斜面培养方法为：在28℃，相对湿度40％～65％下，培养12天；
所述顶头孢霉经斜面培养活化后，使用无菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌悬液，接入种子培养基中，在pH 7.0、温度30℃下培养64小时，制备种子，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉35g/L，玉米浆25g/L，蔗糖32g/L，葡萄糖12g/L，碳酸钙4g/L，以及豆油20mL/L。
步骤2：
取步骤1制备的种子，菌液浓度为20％～22％，按照15％(v/v)的接种量接种至上述制备的发酵培养基中，发酵145h；在0～30h时发酵温度为28℃，30h后控制为25℃；在发酵阶段发酵液pH逐渐下降至5.5，且在发酵过程中补加氨水、硫酸铵、豆油和PPG2000；
氨水补加：在发酵液pH下降至5.5，开启pH自控系统，通过补加氨水溶液(20％，w/v)维持pH5.5，直至发酵结束；
硫酸铵补加：在发酵40～70h之间，以0.3g/L/h(以纯硫酸铵计)的速率补加硫酸铵溶液(20％，w/v)，70h后停止补加硫酸铵；
豆油补加：在发酵50～120h之间，以5g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；
消泡剂补加：在发酵120～145h之间，补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.03g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫；
整个发酵过程溶氧浓度控制30％以上。
步骤3：
在发酵结束后，将所得的发酵液4000rpm离心20min后所得上清液即为头孢菌素C溶液。
同时，按照上述方法，检测菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C的纯度，结果示于下面表4中。
表4 实施例4的菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C检测结果
实施例5
发酵培养基
组成如下：L-α-氨基己二酸8g/L；花生粉35g/L；棉籽蛋白20g/L；谷朊粉35g/L；豆饼粉29g/L；玉米浆53mL/L；葡萄糖8g/L；蔗糖15g/L；蛋氨酸12g/L；硫酸铵15g/L；硫酸钙18g/L；碳酸钙7g/L；豆油100mL/L；以及PPG20001.5mL/L。
制备：将谷朊粉与豆油混合溶解，其他原料以去离子水为溶剂溶解，溶解后混合定容于发酵罐中，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节培养基初始pH为7.2～7.4。
制备头孢菌素C的发酵
步骤1：
取顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁12g/L，蛋白胨15g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.3；斜面培养方法为：在27℃，相对湿度40％～65％下，培养12天；
所述顶头孢霉经斜面培养活化后，使用无菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌悬液，接入种子培养基中，在pH 6.8、温度28℃下培养78小时，制备种子，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉30g/L，玉米浆25g/L，蔗糖28g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙5g/L，以及豆油15mL/L。
步骤2：
取步骤1制备的种子，菌液浓度为16％～18％，按照20％(v/v)的接种比例接种至上述制备的发酵培养基中，发酵145h；在0～30h时发酵温度为29℃，30h后控制为26℃；在发酵阶段发酵液pH逐渐下降至5.5，且在发酵过程中补加氨水、硫酸铵、豆油和PPG2000；
氨水补加：在发酵液pH下降至5.5，开启pH自控系统，通过补加氨水溶液(20％，w/v)维持pH5.5，直至发酵结束；
硫酸铵补加：在发酵40～70h之间，以0.1g/L/h(以纯硫酸铵计)的速率补加硫酸铵溶液(20％，w/v)，70h后停止补加硫酸铵；
豆油补加：在发酵50～120h之间，以4g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；
消泡剂补加：在发酵120～145h之间，补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.05g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫；
整个发酵过程溶氧浓度控制30％以上。
步骤3：
在发酵结束后，将所得的发酵液4000rpm离心20min后所得上清液即为头孢菌素C溶液。
同时，按照上述方法，检测菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C的纯度，结果示于下面表5中。
表5 实施例5的菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C检测结果
实施例6
发酵培养基
组成如下：D-α-氨基己二酸6g/L；花生粉30g/L；棉籽蛋白25g/L；谷朊粉40g/L；豆饼粉32g/L；玉米浆59mL/L；葡萄糖5.5g/L；蔗糖17g/L；蛋氨酸13g/L；硫酸铵17g/L；硫酸钙15g/L；碳酸钙5.5g/L；豆油115mL/L；以及PPG20002mL/L。
制备：将谷朊粉与豆油混合溶解，其他原料以去离子水为溶剂溶解，溶解后混合定容于发酵罐中，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节培养基初始pH为7.2～7.4。
制备头孢菌素C的发酵
步骤1：
取顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁10g/L，蛋白胨12g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.2；斜面培养方法为：在28℃，相对湿度40％～65％下，培养13天；
所述顶头孢霉经斜面培养活化后，使用无菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌悬液，接入种子培养基中，在pH 7.2、温度30℃下培养68小时，制备种子，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉25g/L，玉米浆15g/L，蔗糖30g/L，葡萄糖12g/L，碳酸钙4g/L，以及豆油20mL/L。
步骤2：
取步骤1制备的种子，菌液浓度为18％～20％，按照18％(v/v)的接种比例接种至上述制备的发酵培养基中，发酵145h；在0～40h时发酵温度为29℃，40h后控制为24℃；在发酵阶段发酵液pH逐渐下降至5.3，且在发酵过程中补加氨水、硫酸铵、豆油和PPG2000；
氨水补加：在发酵液pH下降至5.3，开启pH自控系统，通过补加氨水溶液(20％，w/v)维持pH5.3，直至发酵结束；
硫酸铵补加：在发酵40～70h之间，以0.2g/L/h(以纯硫酸铵计)的速率补加硫酸铵溶液(20％，w/v)，70h后停止补加硫酸铵；
豆油补加：在发酵50～120h之间，以3g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；
消泡剂补加：在发酵120～145h之间，补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.04g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫；
整个发酵过程溶氧浓度控制30％以上。
步骤3：
在发酵结束后，将所得的发酵液4000rpm离心20min后所得上清液即为头孢菌素C溶液。
同时，按照上述方法，检测菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C的纯度，结果示于下面表6中。
表6 实施例6的菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C检测结果
实施例7
发酵培养基
组成如下：DL-α-氨基己二酸3g/L；花生粉25g/L；棉籽蛋白17g/L；谷朊粉30g/L；豆饼粉20g/L；玉米浆40mL/L；葡萄糖5g/L；蔗糖10g/L；蛋氨酸9g/L；硫酸铵10g/L；硫酸钙12g/L；碳酸钙5g/L；豆油70mL/L；以及PPG20001mL/L。
制备：将谷朊粉与豆油混合溶解，其他原料以去离子水为溶剂溶解，溶解后混合定容于发酵罐中，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节培养基初始pH为7.2～7.4。
制备头孢菌素C的发酵
步骤1：
取顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁15g/L，蛋白胨12g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.3；斜面培养方法为：在29℃，相对湿度40％～65％下，培养11天；
所述顶头孢霉经斜面培养活化后，使用无菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌悬液，接入种子培养基中，在pH 6.8、温度30℃下培养72小时，制备种子，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉35g/L，玉米浆20g/L，蔗糖28g/L，葡萄糖8g/L，碳酸钙5g/L，以及豆油15mL/L。
步骤2：
取步骤1制备的种子，菌液浓度为16％～18％，按照20％(v/v)的接种量接种至上述制备的发酵培养基中，发酵145h；在0～35h时发酵温度为27℃，35h后控制为25℃；在发酵阶段发酵液pH逐渐下降至5.8，且在发酵过程中补加氨水、硫酸铵、豆油和PPG2000；
氨水补加：在发酵液pH下降至5.8，开启pH自控系统，通过补加氨水溶液(20％，w/v)维持pH5.8，直至发酵结束；
硫酸铵补加：在发酵40～70h之间，以0.3g/L/h(以纯硫酸铵计)的速率补加硫酸铵溶液(20％，w/v)，70h后停止补加硫酸铵；
豆油补加：在发酵50～120h之间，以4g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；
消泡剂补加：在发酵120～145h之间，补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.03g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫；
整个发酵过程溶氧浓度控制30％以上。
步骤3：
在发酵结束后，将所得的发酵液4000rpm离心20min后所得上清液即为头孢菌素C溶液。
同时，按照上述方法，检测菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C的纯度，结果示于下面表7中。
表7 实施例7的菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C检测结果
实施例8
发酵培养基
组成如下：L-α-氨基己二酸6g/L；花生粉28g/L；棉籽蛋白30g/L；谷朊粉45g/L；豆饼粉29g/L；玉米浆45mL/L；葡萄糖6g/L；蔗糖13g/L；蛋氨酸13g/L；硫酸铵13g/L；硫酸钙16g/L；碳酸钙7.5g/L；豆油95mL/L；以及PPG20001mL/L。
制备：将谷朊粉与豆油混合溶解，其他原料以去离子水为溶剂溶解，溶解后混合定容于发酵罐中，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节培养基初始pH为7.2～7.4。
制备头孢菌素C的发酵
步骤1：
取顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁12g/L，蛋白胨12g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.4；斜面培养方法为：在29℃，相对湿度40％～65％下，培养11天；
所述顶头孢霉经斜面培养活化后，使用无菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌悬液，接入种子培养基中，在pH 7.2、温度29℃下培养78小时，制备种子，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉30g/L，玉米浆25g/L，蔗糖28g/L，葡萄糖10g/L，碳酸钙5g/L，以及豆油15mL/L。
步骤2：
取步骤1制备的种子，菌液浓度为18％～20％，按照20％(v/v)的接种量接种至上述制备的发酵培养基中，发酵145h；在0～45h时发酵温度为28℃，45h后控制为26℃；在发酵阶段发酵液pH逐渐下降至5.5，且在发酵过程中补加氨水、硫酸铵、豆油和PPG2000；
氨水补加：在发酵液pH下降至5.5，开启pH自控系统，通过补加氨水溶液(20％，w/v)维持pH5.5，直至发酵结束；
硫酸铵补加：在发酵40～70h之间，以0.2g/L/h(以纯硫酸铵计)的速率补加硫酸铵溶液(20％，w/v)，70h后停止补加硫酸铵；
豆油补加：在发酵50～120h之间，以3g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；
消泡剂补加：在发酵120～145h之间，补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.06g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫；
整个发酵过程溶氧浓度控制30％以上。
步骤3：
在发酵结束后，将所得的发酵液4000rpm离心20min后所得上清液即为头孢菌素C溶液。
同时，按照上述方法，检测菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C的纯度，结果示于下面表8中。
表8 实施例8的菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C检测结果
实施例9
发酵培养基
组成如下：D-α-氨基己二酸7g/L；花生粉40g/L；棉籽蛋白27g/L；谷朊粉32g/L；豆饼粉32g/L；玉米浆59mL/L；葡萄糖10g/L；蔗糖19g/L；蛋氨酸9g/L；硫酸铵19g/L；硫酸钙15g/L；碳酸钙8g/L；豆油95mL/L；以及PPG20001.5mL/L。
制备：将谷朊粉与豆油混合溶解，其他原料以去离子水为溶剂溶解，溶解后混合定容于发酵罐中，用20％(w/v)氢氧化钠溶液调节培养基初始pH为7.2～7.4。
制备头孢菌素C的发酵
步骤1：
取顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁10g/L，蛋白胨15g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.0；斜面培养方法为：在28℃，相对湿度40％～65％下，培养12天；
所述顶头孢霉经斜面培养活化后，使用无菌水洗下一支斜面的菌苔，得到菌悬液，接入种子培养基中，在pH 7.0、温度28℃下培养72小时，制备种子，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉35g/L，玉米浆15g/L，蔗糖25g/L，葡萄糖8g/L，碳酸钙5g/L，以及豆油15mL/L。
步骤2：
取步骤1制备的种子，菌液浓度为18％～20％，按照15％(v/v)的接种量接种至上述制备的发酵培养基中，发酵145h；在0～35h时发酵温度为28℃，35h后控制为26℃，此阶段发酵液pH逐渐下降至5.8，且在发酵过程中补加氨水、硫酸铵、豆油和PPG2000；
氨水补加：在发酵液pH下降至5.8，开启pH自控系统，通过补加氨水溶液(20％，w/v)维持pH5.8，直至发酵结束；
硫酸铵补加：在发酵40～70h之间，以0.3g/L/h(以纯硫酸铵计)的速率补加硫酸铵溶液(20％，w/v)，70h后停止补加硫酸铵；
豆油补加：在发酵50～120h之间，以2g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；
消泡剂补加：在发酵120～145h之间，补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.03g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫；
整个发酵过程溶氧浓度控制30％以上。
步骤3：
在发酵结束后，将所得的发酵液4000rpm离心20min后所得上清液即为头孢菌素C溶液。
同时，按照上述方法，检测菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C的纯度，结果示于下面表9中。
表9 实施例9的菌丝浓度、头孢菌素C效价和头孢菌素C检测结果
实施例1～实施例9培养基组成、过程补料及发酵结果统计见表10。
按照本发明提供的培养基及培养方法，发酵145h发酵效价可以达到38061～44837μg/mL，较现有报道方法制备的头孢菌素C效价增长显著。在优选范围内，发酵145h发酵效价可以达到40228～44837μg/mL。在最佳培养基和最佳培养条件下，发酵145h发酵效价可以达到44837μg/mL，较文献报道(190h，发酵效价36990μg/mL)提高了21.21％。
通过对优选范围内实施例的对比发现，发酵效价的高低与氨基己二酸的加量多少有一定关系(见图1)，而与其他物料无直接对应关系。
综合来看，本发明提供的发酵培养基及对应的培养方法能显著提高顶头孢霉合成头孢菌素C的能力，且不影响头孢菌素C的质量，具有工业应用价值。

Claims (11)

1.一种制备头孢菌素C的发酵方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：取顶头孢霉，经活化后，接种至种子培养基中，在pH 6.8～7.2、温度27～30℃下培养60～80小时，制备种子，其中所述种子培养基组成如下：
以去离子水为介质，豆饼粉25～35g/L，玉米浆14～25g/L，蔗糖23～32g/L，葡萄糖8～12g/L，碳酸钙4～6g/L，以及豆油9～20mL/L；
步骤2：将上述步骤1制得的种子接种至发酵培养基中，在pH 5.2～5.8、温度24～29℃，发酵110～150小时，其中所述发酵培养基组成如下：
以去离子水为介质，氨基己二酸3～12g/L，花生粉25～45g/L，棉籽蛋白17～30g/L，谷朊粉30～50g/L，豆饼粉20～35g/L，玉米浆40～70mL/L，葡萄糖5～10g/L，蔗糖10～20g/L，蛋氨酸9～15g/L，硫酸铵10～20g/L，硫酸钙12～18g/L，碳酸钙5～9g/L，豆油70～120mL/L，以及消泡剂1～2mL/L，
且在发酵过程中，溶解氧浓度在30％以上；根据需要补加硫酸铵、豆油、消泡剂和氨水；
步骤3：将步骤2所得发酵液离心分离，取上层澄清液体，得到头孢菌素C上清液。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征是，在所述步骤1中，所述顶头孢霉来源于ATCC，保藏号为36225；所述顶头孢霉进行斜面培养活化，斜面培养基组成为：以去离子水为介质，麦芽汁10～15g/L，蛋白胨10～15g/L，以及琼脂22g/L，消前pH为7.0～7.4；斜面培养方法为：在27℃～29℃，相对湿度40％～65％下，培养11～13天。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征是，在所述步骤2中，取上述步骤1制得的种子液，菌丝浓度为16％～22％，按照15％～20％(体积)的接种比例接种于发酵培养基中，在pH 5.2～5.8、温度24～29℃，发酵110～150小时，其中所述发酵培养基组成如下：以去离子水为介质，氨基己二酸5～10g/L，花生粉28～40g/L，棉籽蛋白20～30g/L，谷朊粉32～45g/L，豆饼粉24～32g/L，玉米浆40～65mL/L，葡萄糖5.5～10g/L，蔗糖12～19g/L，蛋氨酸9～14g/L，硫酸铵11～19g/L，硫酸钙14～18g/L，碳酸钙5.5～8g/L，豆油75～115mL/L，以及PPG2000 1～2mL/L。
4.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征是，在所述步骤2中，取上述步骤1制得的种子液，菌丝浓度为16％～22％，按照15％～20％(体积)的接种比例接种于发酵培养基中，在pH 5.2～5.8、温度24～29℃，发酵110～150小时，其中所述发酵培养基组成如下：以去离子水为介质，氨基己二酸5～10g/L，花生粉28～40g/L，棉籽蛋白20～30g/L，谷朊粉32～45g/L，豆饼粉24～32g/L，玉米浆40～65mL/L，葡萄糖5.5～10g/L，蔗糖12～19g/L，蛋氨酸9～14g/L，硫酸铵11～19g/L，硫酸钙14～18g/L，碳酸钙5.5～8g/L，豆油75～115mL/L，以及PPG2000 1～2mL/L。
5.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是，在所述步骤2中，所述发酵培养基组成如下：以去离子水为介质，氨基己二酸5g/L，花生粉28g/L，棉籽蛋白20g/L，谷朊粉32g/L，豆饼粉24g/L，玉米浆40mL/L，葡萄糖6g/L，蔗糖13g/L，蛋氨酸10g/L，硫酸铵11g/L，硫酸钙14g/L，碳酸钙5.5g/L，豆油75mL/L，以及PPG2000 1mL/L。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的发酵方法，其特征是，在所述步骤2中，在发酵40～70h之间，以0.1～0.3g/L/h的速率补加硫酸铵，70h后停止补加硫酸铵；在发酵50～120h之间，以2～5g/L/h的速率补加豆油，120h后停止补加豆油；在发酵120～145h之间补加PPG2000进行消泡处理，补加量为0.03～0.06g/L泡沫发酵液总量，以消除泡沫。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的发酵方法，其特征是，在所述步骤2中，在发酵过程中，发酵培养基初始pH为7.2～7.4，随着发酵进行发酵液pH逐渐下降，至5.8～5.2时，开启pH自控设备，用氨水以控制pH为5.2～5.8，所用氨水浓度为18％～22％，该浓度以w/v计。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的发酵方法，其特征是，在所述步骤2中，发酵时间为130～150小时；在发酵30h前，发酵温度为27℃～29℃，之后，发酵温度为24℃～26℃。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的发酵方法，其特征是，在所述步骤2中，发酵时间为130～150小时；在发酵35h前，发酵温度为27℃～29℃，之后，发酵温度为24℃～26℃。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的发酵方法，其特征是，在所述步骤2中，发酵时间为130～150小时；在发酵40h前，发酵温度为27℃～29℃，之后，发酵温度为24℃～26℃。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的发酵方法，其特征是，在所述步骤2中，发酵时间为130～150小时；在发酵45h前，发酵温度为27℃～29℃，之后，发酵温度为24℃～26℃。
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