CN101698836B - 一种谷氨酰胺转胺酶发酵过程中补料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种谷氨酰胺转胺酶发酵过程中的补料方法，特别涉及一种提高谷氨酰胺转胺酶发酵过程中溶氧的补料方法。在吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus CCTCC No.M203062)发酵8h-16h，通过流加氮比为1.0-1.5的葡萄糖(800g/L)与蛋白胨(800g/L-1200g/L)的混合液控制比生长速率为0.15h-1，16h-24h，通过流加混合液控制比生长速率为0.10h-1。此方法一方面避免氮源被谷氨酰胺转胺酶交联，影响了发酵过程中的溶氧水平；另一方面通过流加氮源的方式，提高了菌体的生物量。该方法的效果是显著的，生物量提高125-140％，酶活提高了58-63％。
Description
技术领域
本发明涉及发酵过程中的补料方法，尤其是一种提高谷氨酰胺转胺酶发酵过程中溶氧的补料方法。
背景技术
微生物谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，MicrobialTransglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG)其生物学功能是直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC No.M203062)，对其进行了发酵条件优化以及探讨了MTG由酶原到成熟酶的活化机制。研究室的前期研究结果表明，MTG在营养菌丝的的生长阶段并不分泌，而是在分化形成气生菌丝时才开启动和分泌，因此提高菌体量，对于促进产酶有很重要的作用。
流加技术是能控制或改变培养基中的一种或一种以上的营养成分的浓度，这样在细胞生长或产物形成对底物浓度受限敏感的工艺过程中使用比较理想，还可以做到用较确定的营养成分来代替复杂的营养源流加培养是提高菌体浓度的传统方法。对于利用补料发酵生产MTG，已有报道(许晓娟.吸水链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的补料研究.中国生物工程杂志，2009，29(5)：78-82)，通过流加碳源提高酶的产量，取得一定效果，但是该方法存在一个问题，补加碳源导致发酵液黏度较大，溶氧水平较低，限制了菌体的生长和产酶。本发明利用补料的方式降低发酵液黏度，未见文献报道。
发明内容
针对谷氨酰胺转胺酶发酵过程中溶氧较低的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种谷氨酰胺转胺酶发酵过程中补料的方法，提高了菌体的生物量和谷氨酰胺转胺酶的产量。
为解决上述问题，本发明提供的谷氨酰胺转胺酶发酵过程中补料的方法，是在菌体生长期流加碳源和有机氮源的混合液；谷氨酰胺转胺酶发酵过程中，单独流加碳源提高菌体的生物量，单独流加有机氮源避免谷氨酰胺转胺酶将发酵液中未利用的氮源交联，导致发酵液粘稠，将这两种技术结合，提高了发酵液中溶氧水平，菌体生物量和谷氨酰胺转胺酶的产量都相应提高。
本发明技术方案的原理如下：在吸水链霉菌发酵过程中，谷氨酰胺转胺酶会使发酵液中蛋白质氮源交联，导致发酵液黏稠，严重的影响了溶氧水平，对于微生物生长有很大影响，进而影响酶的产量。本发明通过降低初始发酵培养基中的氮源浓度，减轻了因蛋白质氮源作为反应底物被交联而引起的发酵液粘稠现象，通过流加氮源、碳源的方法为菌体生长和产酶提供营养。发酵前期，营养菌丝生长，MTG并不分泌，8小时后，菌体开始分泌谷氨酰胺转胺酶，在此期间通过流加一定碳氮比的营养液的方法，提高菌体生长期溶氧水平及底物利用效率，提高MTG产量。
所述的方法中，生产菌株可为吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)、茂原链霉菌(Streptoverticilluim mobaraense)，其中优选菌为吸水链霉菌菌种(Streptomyces hygroscopicus)由武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No.M203062，该菌种在(谷氨酰胺转胺酶高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产谷氨酰胺转胺酶，专利号ZL03152956.9)中公开。
所述的方法中，微生物优选培养基为：斜面培养基(g/L)，麦芽汁50(10oBe)，酵母膏5，葡萄糖5，琼脂20，pH 7.0；种子培养基(g/L)，玉米淀粉20，蛋白胨20，酵母膏5，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，无水磷酸二氢钾2，pH7.0；初始发酵培养基(g/L)，葡萄糖10，蛋白胨10g，酵母膏5g，无水硫酸镁2g，磷酸氢二钾3.75g，无水磷酸二氢钾0.25g，碳酸钙5g，pH8.0。
所述的方法中，微生物培养条件为，接一铲生长良好的斜面培养物至装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇瓶转速为200r/min，温度32℃，培养时间24h。以6％的接种量接入3L全自动发酵罐(LiFlus GMBioTRON，Korea)中，装液量为1.5L，设定通气量1.25vvm，搅拌转速700r/min，温度控制在32C，对发酵过程的pH不进行控制。
所述的方法中，补料用的营养液碳源为葡萄糖，有机氮源为蛋白胨，混合营养液中葡萄糖浓度为葡萄糖800g/L，蛋白胨浓度为800-1200g/L，其中优选蛋白胨浓度为800g/L。
所述的方法中，指数流加的方法为：发酵8h-16h，通过混合液控制比生长速率为0.15h-1；16h-24h，通过流加混合液控制比生长速率为0.10h-1。
所述的方法中，指数流加方法方程为，X、S分别为发酵罐中细胞、底物浓度，μ为比生长速率，V为发酵液体积，F为底物流加速率，SF为补加底物的浓度，YX/S为细胞对底物的得率系数，X0为培养体系的初始生物量。方程中的参数细胞比生长速率()需经过选择和优化，其他参数由分批发酵获得。需要说明的是，由于指数流加方程是时间的指数函数，实际控制流加速率比较困难，为简化操作，实验中采用阶梯式递增流加方式，每1h改变一次营养液的流加速率，基本可符合细胞生长阶段对营养的需求。
所述的方法中，谷氨酰胺转胺酶活力的测定方法为：
比色法测定酶活：以N-α-CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-γ单羟胺酸做标准曲线。1个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ单羟胺酸的酶量(U/mL)。
试剂A：100mg的N -CBZ-GLN-GLY溶解于2mL 0.2moL/L的NaOH溶液中，加入0.2mol/L pH6.0的Tris-HC缓冲液4mL，0.1mol/L羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2mL，并调节pH至6.0。
试剂B：3mol/L的HCL，12％TCA，5％FeCL3按1∶1∶1混合。
配制0-4μmol/mL的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液。取1mL试剂A与0.4mL不同浓度的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液混合，37℃水浴10分钟。加0.4mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0.4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100℃加热10分钟的离心后的上清液为空白。
酶活力(u/mL)＝(6.8548×OD525-0.0164)×稀释倍数
传统意义上发酵过程中补料的目的在于，降低底物抑制作用，提高菌体对底物的利用效率。往往采用补糖的方式降低初糖浓度过高对菌体生长的抑制作用，这种抑制作用会导致菌体生长缓慢，延滞期较长。本发明研究发现，在谷氨酰胺转胺酶的发酵过程中，菌体在8小时开始分泌谷氨酰胺转胺酶，在谷氨酰胺转胺酶的作用下，发酵液中的氮源会被交联，从而导致发酵液粘度变大，溶氧水平降低，从而影响了菌体的生长以及谷氨酰胺转胺酶的表达。为此，本发明旨在通过流加碳源和氮源混合液的方法，一方面避免氮源被谷氨酰胺转胺酶交联，影响了发酵过程中的溶氧水平；另一方面通过流加氮源的方式，实现高密度培养。该方法的效果是显著的，生物量提高125-140％，酶活提高了58-63％。
具体实施方式
实施例1：营养液中碳氮比为1∶1.0的补料方法。
补加营养液中葡萄糖浓度为800g/L，蛋白胨浓度为800g/L。
8h-16h，控制比生长速率为0.15h-1，16h-24h，控制比生长速率为0.10h-1。此方法大大改善了发酵液中的溶氧水平，溶氧在20小时降至10％，其余时间均在10％以上，发酵液粘度明显降低，发酵结束时，细胞干重48g/L，酶活达到6.74U/mL。
实施例2：营养液中碳氮比为1∶1.5的补料方法。
补加营养液葡萄糖浓度为800g/L，蛋白胨浓度为1200g/L。
8h-16h，控制比生长速率为0.15h-1，16h-24h，控制比生长速率为0.10h-1。此方法大大改善了发酵液中的溶氧水平，溶氧在20小时降至5％，其余时间均在5％以上，发酵液粘度明显降低，发酵结束时，细胞干重45g/L，酶活达到6.57U/mL。
对比例1：不补加营养液的发酵过程
溶氧在12小时即降为0，直至发酵结束未有波动，细胞干重为20g/L，发酵结束时，酶活4.1U/mL。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (3)
1.一种谷氨酰胺转胺酶发酵过程中补料的方法，其特征在于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)CCTCC No.M203062发酵生产谷氨酰胺转胺酶过程中，流加碳氮比为1.0-1.5的葡萄糖与蛋白胨的混合液控制吸水链霉菌的比生长速率，发酵8h-16h，控制比生长速率为0.15h-1，发酵16h-24h，控制比生长速率为0.10h-1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖与蛋白胨的混合液中葡萄糖浓度为800g/L，蛋白胨浓度为800-1200g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖与蛋白胨的混合液中葡萄糖浓度为800g/L，蛋白胨浓度为800g/L。
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