CN104263787B - 一种脱除南极磷虾多肽中氟化物和灰分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种脱除南极磷虾多肽中氟化物和灰分的方法，该方法具有如下操作步骤：包含一种模拟移动床装置，以离子交换柱为操作单元，至少包括进料区，洗脱区，阳离子再生区，阴离子再生区，平衡区五个区域；南极磷虾粉经蛋白酶水解后，得磷虾多肽水溶液；通过稀释或浓缩调整多肽水溶液的固形物含量，得磷虾多肽原料液；将磷虾多肽原料液连续引入模拟移动床的区，通过阀门的定期切换，使交换柱在一个工艺循环中完成吸附、洗脱、再生、平衡的全部过程；脱除氟和盐的磷虾多肽溶液经喷雾干燥，得高品质南极磷虾多肽粉。该方法具有设备结构小、产率高、溶剂消耗少、分离能力强、污染少等优点，实现了连续性大规模工业化生产和自动控制。

Description

一种脱除南极磷虾多肽中氟化物和灰分的方法

技术领域

本发明属于多肽提取纯化技术领域，具体涉及一种脱除南极磷虾多肽中氟化物和灰分的方法。

背景技术

南极磷虾是一类海洋无脊椎动物，分布于南极水域。据统计，南极磷虾的蕴藏量为6.5-10亿吨，是人类巨大的蛋白资源宝库。磷虾干重中蛋白质含量约65-75％，其氨基酸组成合理、必需氨基酸含量高，是进行蛋白质高值化利用的重要原料。

南极磷虾多肽是采用磷虾为原料，经蛋白酶水解制备所得的水溶性小分子多肽。由整虾加工得到的磷虾粉的灰分含量一般为10～17％，氟含量一般为1800-2500ppm。再以磷虾粉为原料，通过蛋白酶水解制备磷虾多肽的过程中，虾粉中大量的灰分和氟化物会残留在多肽产品中。同时，酶解过程中需要加入酸或碱来维持体系的酸碱性稳定，从而导致磷虾多肽产品中的灰分含量进一步升高。而磷虾多肽的高氟化物和高灰分含量，严重影响了多肽作为功能性蛋白食品的开发和应用前景。

目前，已经报道的多肽脱盐工艺主要包括膜处理法(超滤、微滤、纳滤)、电渗析法、单柱离子交换法和大孔树脂法，前三种工艺是在水脱盐技术的基础上发展起来的。多肽为有机物，在溶液中带有一定的电荷，膜处理脱盐法极易发生膜被有机物污染的现象，使膜的寿命缩短，成本增加。电渗析法脱盐会引起较大的多肽损失，从而使回收率偏低，且电渗析法的成本较高。大孔树脂法的洗脱环节需要使用有机溶剂，不易实现工业化。单柱离子交换法具有回收率高、脱盐率高等优点，但是处理周期长、且会用到较多的酸和碱。

模拟移动床(SMB)技术是通过流体出入口位置的定期顺序切换，在固定床装置上模拟出固定相和流动相相对逆向循环流动，使分离体系获得较大的传质推动力，高效连续实行分离操作的一种技术。SMB技术具有设备结构小、产率高、溶剂消耗少、分离能力强、污染少等优点。将SMB技术与离子交换连用克服了固定床吸附分离技术存在的间歇操作、溶剂消耗大、产品浓度低的缺点，实现了连续性大规模工业化生产和自动控制。目前SMB技术已应用于生物、手性药物、精细化学品和食品的分离提纯中。

国外专利EP1106602B1公开了一项采用SMB技术连续纯化氨基酸的方法。国内专利CN102050865B公开了一项通过SMB技术层析纯化多肽的方法，将免疫反应性化合物与其他非本质有机成分分离。国内专利CN103787868A公开了一项采用四区SMB技术分离琥珀酸和乳酸混合物的方法。刘江丽(牛初乳中乳铁蛋白分离纯化的产业化技术参数研究，黑龙江八一农垦大学，学位论文，2011年)采用SMB技术连续分离技术对乳铁蛋白进行了分离纯化，纯度为95.8％。采用已有的SMB分离纯化蛋白和多肽的方法处理磷虾多肽，并不能达到有效脱除水溶性磷虾多肽中氟化物和灰分的目的，同时，目前国内外尚未见将SMB技术应用于脱除氟化物和灰分的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种脱除南极磷虾多肽中氟化物和灰分的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明中脱除南极磷虾多肽中氟化物和灰分的方法，包括有如下的步骤：

1)向南极磷虾粉中加入蒸馏水，其中磷虾粉和水的质量比为1:6～15，调节混合液pH值，再向混合液中加入蛋白酶进行水解，水解温度为40～60℃，水解时间为2～12h；水解结束后加热终止酶解反应，离心，得上清液，即为磷虾多肽水溶液；

2)制备模拟移动床装置，模拟移动床装置包括有进料区ⅰ、洗脱区ⅱ、阳离子再生区ⅲ、阴离子再生区ⅳ、平衡区ⅴ；其中，洗脱区位于阳离子再生区和进料区中间；阴离子再生区位于平衡区和阳离子再生区中间；进料区位于洗脱区和平衡区中间；其中进料区由不少于3根的阳离子交换柱和不少于3根的阴离子交换柱交替串联组成，洗脱区由不少于1根的阳离子交换柱和不少于1根的阴离子交换柱组成，阳离子再生区由不少于1根的阳离子交换柱组成，阴离子再生区由不少于1根的阴离子交换柱组成，平衡区由不少于1根的阳离子交换柱和不少于1根的阴离子交换柱组成；

3)将南极磷虾多肽水溶液连续引入模拟移动床ⅰ区的进口，脱除氟化物和灰分后的产物由ⅰ区的出口流出；ⅰ区的洗脱液由ⅱ区进口流入，ⅱ区流出的含有磷虾多肽的洗脱液重新汇入ⅰ区再次进行脱除氟化物和灰分处理；其中ⅰ区和ⅱ区的离子柱依次通过ⅲ区、ⅳ区和ⅴ区进行再生和平衡处理；离子柱在ⅲ区和ⅳ区用再生液进行再生活化，在ⅴ区用平衡液进行平衡清洗；ⅴ区使用的平衡液为去离子水；ⅲ区的离子再生液为2％～4％HCl溶液，ⅳ区用离子再生液为2％～4％NaOH溶液；

4)脱除氟化物和灰分的磷虾多肽溶液经喷雾干燥，得到南极磷虾多肽粉；

其中，步骤1)中南极磷虾粉中的脂质含量为1-20％；蛋白酶为食品级木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶中的一种或几种；

步骤2)中进料区和洗脱区的数目为两个或以上；

步骤2)中阳离子交换柱中树脂为强酸型或弱酸性阳离子交换树脂，阴离子交换柱中树脂为强碱性或弱碱性阴离子交换树脂；

步骤3)中磷虾多肽原料液以逆流方式与离子交换柱的固相接触，进料流速为1～8BV/h，洗脱流速为1～8BV/h，再生流速为1～8BV/h，平衡流速为1～8BV/h；

步骤4)中喷雾干燥的条件如下：进风温度为120～160℃，出风温度为80～120℃；

本发明中未经脱除氟化物和灰分的磷虾多肽粉末中氟含量为350～450mg/kg，灰分含量为7～15％；经SMB技术脱除氟化物和灰分后的磷虾多肽中氟含量为2～10mg/kg，灰分含量≤4％，蛋白含量≥90％。本发明通过阀门的定期切换，使交换柱在一个工艺循环中完成吸附、洗脱、再生、平衡的全部过程。该方法具有设备结构小、产率高、溶剂消耗少、分离能力强、污染少等优点，实现了连续性大规模工业化生产和自动控制。

附图说明

图1：为本发明的一种模拟移动床脱除南极磷虾多肽中氟化物和灰分的装置图；其中，阴影填充的交换柱为阳离子交换柱；空白填充的交换柱为阴离子交换柱；

图2：为本发明的另一种模拟移动床脱除南极磷虾多肽中氟化物和灰分的装置图，其中，阴影填充的交换柱为阳离子交换柱；空白填充的交换柱为阴离子交换柱。

具体实施方式

本发明提供了一种操作简便化、工艺连续化、成本低廉化的同步脱除南极磷虾多肽中氟化物和灰分的方法。该方法生产周期短、脱盐程度高、产品回收率和纯度高，为应用于大规模的工业化生产提供了理论依据。

本发明的模拟移动床装置包括进料区ⅰ、洗脱区ⅱ、阳离子再生区ⅲ、阴离子再生区ⅳ和平衡区ⅴ五个区域。模拟移动床装置中包含两种类型的离子交换柱(阳离子交换柱和阴离子交换柱)。其中，洗脱区位于阳离子再生区和进料区中间；阴离子再生区位于平衡区和阳离子再生区中间；进料区位于洗脱区和平衡区中间；其中进料区由不少于3根的阳离子交换柱和不少于3根的阴离子交换柱交替串联组成，洗脱区由不少于1根的阳离子交换柱和不少于1根的阴离子交换柱组成，阳离子再生区由不少于1根的阳离子交换柱组成，阴离子再生区由不少于1根的阴离子交换柱组成，平衡区由不少于1根的阳离子交换柱和不少于1根的阴离子交换柱组成。通过不同阀门的定期切换控制原料液、洗脱液、再生液和平衡液的流入和流出，达到脱除多肽原料液中氟化物和灰分的目的。

当磷虾多肽原料液流入ⅰ区，可以使有机多肽组分与无机组分(氟化物和灰分)分开。在离子交换柱中，多肽组分的吸附能力较弱，而无机组分中的阴阳离子分别在阴离子交换柱和阳离子交换柱中进行交换。多肽组分先于无机组分流出ⅰ区。收集纯度较高的产物，将纯度较低的产物重新汇入ⅰ区进行脱除氟化物和灰分的处理。洗脱液流入ⅱ区，将残余在柱子间隙中的多肽组分洗出，含有多肽组分的洗脱液汇入ⅰ区。两股不同的再生液分别流入ⅲ区和ⅳ区，对离子交换柱进行再生处理，再生液经反渗透后用于原料液磷虾多肽的制备。平衡液流入ⅴ区，将离子交换柱中残余的再生液洗出，平衡流出液汇入再生液。

当前周期进行切换时(以图1为例说明)，所有柱子分别向流体流动的相反方向移动两根，ⅰ区的7、8号柱子进入ⅱ区；ⅱ区的5、6号柱子分别进入ⅲ区和ⅳ区再生；ⅲ区和ⅳ区的4、3号柱子进入ⅴ区进行平衡；ⅴ区的1、2号柱子进入ⅰ区，成为ⅰ区的最后两根柱子。

本发明的方法，可以通过增加部分区域的重复区域或部分区域的交换柱数目，提高生产量。

实施例1

1)取南极磷虾粉5kg，向磷虾粉中加入蒸馏水60L，向混合液中加入2M HCl，调节混合液的pH值至7.5，升温至45℃，向混合液中加入中性蛋白酶75g，在反应釜中恒温搅拌10h，加热至100℃终止酶反应，离心，得上清液；通过真空浓缩使上清液的固形物含量达到10％，真空度为0.08MPa，温度为40～80℃，得磷虾多肽原料液；

2)如附图1所示，选用12根交换柱的模拟移动床装置；洗脱液为去离子水；阴离子再生液1为2％～4％NaOH溶液，阳离子再生液2为2％～4％HCl溶液；平衡液为去离子水；

3)原料液的进料流速为4BV/h；洗脱液的流速为2.4BV/h；再生液1和再生液2的流速为1.6BV/h；平衡液的流速为1.6BV/h；切换时间为75min；

4)收集ⅰ区流出的高纯度产物，喷雾干燥(进风温度120℃，出风温度80℃)后，即得低氟、低灰分的高品质磷虾多肽粉。

本发明中未经脱除氟化物和灰分的磷虾多肽粉末中氟含量为350～450mg/kg，灰分含量为7～15％；经SMB技术脱除氟化物和灰分后的磷虾多肽中氟含量为2～10mg/kg，灰分含量≤4％，蛋白含量≥90％，蛋白回收率≥80％。

实施例2

1)取南极磷虾粉10kg，向磷虾粉中加入95％乙醇100L，在反应釜中搅拌6h，离心取沉淀，真空干燥得脱脂磷虾粉；

2)取脱脂虾粉5kg，向脱脂虾粉中加入蒸馏水50L，向混合液中加入2M HCl，调节混合液pH值至8.0，升温至50℃，向混合液中加入碱性蛋白酶80g，在反应釜中恒温搅拌8h，加热至100℃终止酶反应，离心，得上清液；通过真空浓缩使上清液的固形物含量达到20％，真空度为0.08MPa，温度为40～80℃，得磷虾多肽原料液；

3)如附图2所示，选用20根交换柱的模拟移动床装置；洗脱液为去离子水；再生液1为2％～4％NaOH溶液，再生液2为2％～4％HCl溶液；平衡液为去离子水；

4)原料液的进料流速为3BV/h，ⅰ区的13～16号柱子流速为3BV/h，17～20号柱子流速为6BV/h；洗脱液的流速为5BV/h；再生液1和再生液2的流速为3BV/h；平衡液的流速为3BV/h；切换时间为60min；

5)收集ⅰ区流出的高纯度产物，喷雾干燥(进风温度130℃，出风温度85℃)后，即得低氟、低灰分的高品质磷虾多肽粉。

本发明中未经脱除氟化物和灰分的磷虾多肽粉末中氟含量为350～450mg/kg，灰分含量为7～15％；经SMB技术脱除氟化物和灰分后的磷虾多肽中氟含量为2～10mg/kg，灰分含量≤4％，蛋白含量≥90％，蛋白回收率≥80％。结果表明，ⅰ区和ⅱ区增加交换柱后，切换时间缩短了15min，单位时间内的处理量增加了一倍，产品纯度和得率不受影响。

Claims (5)

1.一种脱除南极磷虾多肽中氟化物和灰分的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：

1)向南极磷虾粉中加入蒸馏水，其中磷虾粉和水的质量比为1:6～15，调节混合液pH值，再向混合液中加入蛋白酶进行水解，水解温度为40～60℃，水解时间为2～12h；水解结束后加热终止酶解反应，离心，得上清液，即为磷虾多肽水溶液；

2)制备模拟移动床装置，模拟移动床装置包括有进料区ⅰ、洗脱区ⅱ、阳离子再生区ⅲ、阴离子再生区ⅳ、平衡区ⅴ；其中，洗脱区位于阳离子再生区和进料区中间；阴离子再生区位于平衡区和阳离子再生区中间；进料区位于洗脱区和平衡区中间；其中进料区由不少于3根的阳离子交换柱和不少于3根的阴离子交换柱交替串联组成，洗脱区由不少于1根的阳离子交换柱和不少于1根的阴离子交换柱组成，阳离子再生区由不少于1根的阳离子交换柱组成，阴离子再生区由不少于1根的阴离子交换柱组成，平衡区由不少于1根的阳离子交换柱和不少于1根的阴离子交换柱组成；

所述的进料区和洗脱区的数目为两个或以上；

所述的阳离子交换柱中树脂为强酸型或弱酸性阳离子交换树脂，阴离子交换柱的树脂为强碱性或弱碱性阴离子交换树脂；

3)将南极磷虾多肽水溶液连续引入模拟移动床ⅰ区的进口，脱除氟化物和灰分后的产物由ⅰ区的出口流出；ⅰ区的洗脱液由ⅱ区进口流入，ⅱ区流出的含有磷虾多肽的洗脱液重新汇入ⅰ区再次进行脱除氟化物和灰分处理；其中ⅰ区和ⅱ区的离子柱依次通过ⅲ区、ⅳ区和ⅴ区进行再生和平衡处理；离子柱在ⅲ区和ⅳ区用再生液进行再生活化，在ⅴ区用平衡液进行平衡清洗；

其中南极磷虾多肽水溶液以逆流方式与离子交换柱的固相接触，进料流速为1～8BV/h，洗脱流速为1～8BV/h，再生流速为1～8BV/h，平衡流速为1～8BV/h；

4)脱除氟化物和灰分的磷虾多肽溶液经喷雾干燥，得到南极磷虾多肽粉。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中南极磷虾粉中的脂质含量为1-20％；蛋白酶为食品级木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶或碱性蛋白酶中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中ⅲ区的离子再生液为2％～4％HCl。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中ⅳ区的离子再生液为2％～4％NaOH。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中喷雾干燥的 条件如下：进风温度为120～160℃，出风温度为80～120℃。