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CN104136451A - 具有构象限制的单体的核酸化合物的合成和用途 - Google Patents

具有构象限制的单体的核酸化合物的合成和用途 Download PDF

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CN104136451A
CN104136451A CN201280054375.5A CN201280054375A CN104136451A CN 104136451 A CN104136451 A CN 104136451A CN 201280054375 A CN201280054375 A CN 201280054375A CN 104136451 A CN104136451 A CN 104136451A
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Abstract

用于制备核酸化合物的构象限制的核单体(CRN)的合成和用途。以高收率和多克规模制备用于治疗模式的核酸化合物的核单体的方法，所述治疗模式通过上调或下调细胞中的基因和其它基于核酸的调节系统的表达而用于治疗或预防疾病或病症。

Description

具有构象限制的单体的核酸化合物的合成和用途
技术领域
本发明涉及用于通过调节细胞中的基因和其它依赖于核酸的细胞调节系统的表达来治疗疾病的核酸化合物的合成和用途。更具体地说，本发明涉及一系列可以用于制备单链和多链核酸化合物的构象限制的核单体(CRN)的合成。
背景技术
微RNA(microRNA)的识别和评价是生物学和医学中发展最快的领域之一。微RNA被认为是保持正常细胞生理学的关键要素，因为微RNA似乎是对细胞内和细胞外事件而言关键的基因表达的中心调节因子。因此，特异性微RNA的缺损或特异性微RNA的过表达都可能导致作为疾病潜在基础的异常细胞过程。采用拮抗剂抑制异常微RNA或者用微RNA模拟物增补可能恢复细胞通信途径之间的平衡。使用含有CRN的核酸化合物的治疗方法可以直接且有效地改变微RNA的功能。
含有构象限制的核单体或CRN的核酸化合物可以用作微RNA拮抗剂。抑制特异性微RNA的治疗益处是受到微RNA控制的下游靶点的去-抑制。去-抑制允许下游靶点表达微RNA通常下调的蛋白质。因此，微RNA抑制是允许“上调”特异性基因靶点的少数几种治疗方法之一。
RNA干扰或RNAi是指抑制性小核酸分子介导的序列特异性、转录后基因沉默的细胞过程。RNAi活性分子可以是一部分与靶信使RNA的一部分同源的双链RNA或dsRNA。长dsRNA可以被Dicer酶加工成具有21至23个核苷酸的短干扰RNA或siRNA，其具有约19个碱基对和2个通常悬于各个3'-端的核苷酸的双链区域。siRNA可以与裂解siRNA的随从链或正义链的RNA诱导的沉默复合体或RISC复合体相互作用。siRNA的引导链或反义链可以结合互补靶mRNA，其随后被RISC裂解以引起基因沉默。
含有CRN的核酸化合物可以用于增加单链寡核苷酸与其预期靶点的亲和力，不论其是信使RNA或微RNA。
含有CRN的核酸化合物可以用于通过RNA干扰或翻译阻断或者经由微RNA模拟物使基因靶点沉默。它们可以用于经由微RNA拮抗剂上调基因靶点。
需要以高收率、多克规模来制备用于治疗模式的核酸化合物的核单体的有效方法，所述治疗模式通过上调或下调细胞中的基因和其它基于核酸的调节系统的表达而用于治疗或预防疾病或病症。
因此，需要用于制备具有增强的稳定性的核酸化合物的核单体的方法，所述核酸化合物可用于涉及微RNA、siRNA和/或反义RNA的多种治疗模式。
发明概述
本发明的实施方式包括：
一种用于制备具有式V的化合物的方法，
其中R1是取代基保护基团，R2是取代基保护基团，R1和R2中的一个或两个是大的取代基保护基团，R1和R2任选地连接在一起，R3是保护基团，且B是核碱基或核碱基类似物，所述方法包括提供具有式II的化合物，
通过臭氧分解或氧化转化具有式II的化合物，以及分离具有式V的化合物。B可以是尿苷或5-甲基尿苷。R1和R2可以是1,1,3,3-四烷基二硅氧烷-1,3-二基。R1和R2可以是1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷-1,3-二基。R3可以是苄基。
经臭氧分解得到具有式V的化合物的收率在具有式V的化合物为至少5克的规模下可以为至少50％。经臭氧分解得到具有式V的化合物的收率在具有式V的化合物为至少10克的规模下为至少50％。经臭氧分解得到具有式V的化合物的收率在具有式V的化合物为至少10克的规模下为至少70％。经臭氧分解得到具有式V的化合物的收率在具有式V的化合物为至少10克的规模下为至少80％。
上述方法还包括通过保护5′-羟基将具有式V的化合物转化成具有式VI的构象限制的核单体CRN，
以及用亚磷酰胺取代R3。可以用DMTr基团保护5′-羟基。B可以被转化为胞苷基、尿苷基或胸苷基。构象限制的核单体可以是嘧啶CRN。嘧啶CRN可以通过嘧啶CRN的转糖苷作用转化成嘌呤CRN。CRN可以用于制备核酸化合物。核酸化合物可以是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。核酸化合物可以是微RNA、antimir、antagomir、微RNA模拟物、微RNA前体、RNA、siRNA、DNA、RNA和DNA、usiRNA、mdRNA、短发夹RNA或shRNA、或反义寡核苷酸。本发明描述了通过合成二环糖以及使二环糖与甲硅烷基化的嘌呤反应来制备嘌呤CRN的方法。二环糖可以具有式VI，其中B被烷氧基置换。
一种CRN，其具有如下结构：
其中R是甲基，R1独立地是H、烷基或保护基团，且R2独立地是H、烷基、保护基团或亚磷酰胺基团。
一种CRN，其具有如下结构：
一种核酸化合物，其包含上面所述的CRN。该核酸化合物可以是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。
附图简述
图1：图1示出了制备本发明的构象限制的核单体或CRN的方法的实施方式。
图2：图2示出了制备本发明的构象限制的核单体或CRN的方法的实施方式。
发明详述
本发明涉及含有一个或多个构象限制的核单体的核酸化合物的合成和用途。构象限制的核单体或CRN是具有连接核糖核酸的C2'和C4'核糖碳的桥的分子。基于RNA或DNA的寡核苷酸内的CRN的取代可以增加杂交亲和性(hybridization affinity)并增强对核酸酶降解的抗性。CRN技术提供开发靶向信使RNA或微RNA的高效且特异性的基于核酸的治疗方法的直接方式。这些靶点代表通常是“无药可及的(undruggable)”或小分子或单克隆抗体“难以靶向”的疾病途径，并且适合于具有明显未满足的需求的疾病区域，如炎症、代谢性疾病和癌症。
本发明大体上涉及用于在细胞内通过基因沉默或调节依赖于核酸的细胞调节系统的功能来治疗疾病的核酸化合物。
构象限制的核单体
在一些方面，本发明的核酸化合物可以含有一个或多个有利地增强化合物在多种治疗模式中的稳定性的构象限制的核单体。
一些构象限制的核单体的合成记载于美国专利第6,833,361号；第6,403,566号和第6,083,482号。
在一些实施方式中，构象限制的核单体是单体R并具有下式：
其中X在每次出现时独立地选自O、S、CH2、C＝O、C＝S、C＝CH2、CHF或CF2；R2和R3在每次出现时独立地选自氢、OH、O-烷基、F、SH、S-烷基、S-F、CN、N3、OCH3、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、单磷酸酯、二膦酸酯、三膦酸酯、具有OH基团的氨基酸酯、糖部分，或该单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、单膦酸酯、二膦酸酯或三膦酸酯的前药，NH(CH＝O)、NH(C＝O)-C(1-22)饱和或不饱和的烷基链、环烷基、芳基或杂环；且B在每次出现时独立地是核碱基或核碱基类似物。在包含基于单体R的CRN的核酸化合物中，R2和R3可以是核酸化合物的磷酸二酯链接(phosphodiesterlinkage)。
在某些实施方式中，构象限制的核单体是单体S并具有下式：
其中X每次出现时独立地选自O、S、CH2、C＝O、C＝S、C＝CH2、CHF、CF2；Z是O；Y是CH2；R2在每次出现时独立地选自氢、F、OH或OCH3；R1和R3在每次出现时独立地选自氢、OH、P(OR)2、P(O)(OR)2、P(S)(OR)2、P(O)(SR)OR、酰基、苄氧羰基、三氟乙酰基、对硝基苯基氧基羰基、或任何适合的保护基团或用于构建寡聚物的活化基团；且R在每次出现时独立地选自H、2-氰基乙基、二异丙基氨基、烷基、烯基、炔基、或疏水性掩蔽基团，其中在(OR)2或(SR)OR的情况中R可以是彼此相同或不同的。在包含基于单体S的CRN的核酸化合物中，R1和R3可以是核酸化合物的磷酸二酯链接。
在某些实施方式中，核酸化合物可以含有任意数量的CRN。本发明的核酸化合物可以含有一个或多个单体R、和一个或多个单体S。
在一些实施方式中，B代表核碱基或核碱基类似物，其独立地选自腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，尿嘧啶，次黄嘌呤，胸腺嘧啶，7-脱氮腺嘌呤，肌苷，C-苯基，C-萘基，肌苷，唑甲酰胺，水粉菌素(nebularine)，硝基吡咯，硝基吲哚，2-氨基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，次黄嘌呤，假尿苷，5-甲基尿苷，5-丙炔基胞苷，异胞苷，异鸟嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，2-硫代嘧啶，6-硫代鸟嘌呤，4-硫代胸腺嘧啶，4-硫代尿嘧啶，O6-甲基鸟嘌呤，N6-甲基腺嘌呤，O4-甲基胸腺嘧啶，5,6-二氢胸腺嘧啶，2-硫代核糖胸腺嘧啶(2-thioribothymidine)，5,6-二氢尿嘧啶，4-甲基吲哚，亚乙烯基腺嘌呤，脱氧尿苷，以及前述物质的任何存在的脱氧类似物。
在一些实施方式中，B代表核碱基或核碱基类似物，其独立地选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、和前述物质的任何存在的脱氧类似物。
在一些实施方式中，核酸化合物可以含有一个或多个CRN和一个或多个羟甲基取代的核单体或UNA。用于合成羟甲基取代的核单体和羟甲基取代的核酸化合物的一些结构和方法可以参见PCT国际申请PCT/US2008/064417。
在另一个方面，本发明的核酸化合物可以含有核苷酸类似物，该核苷酸类似物选自2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、2'-氟-DNA单体、LNA单体、PNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、CeNA单体、ENA单体、DNA单体和INA单体。
构象限制的核单体的合成
构象限制的核单体的嘧啶类似物可以由尿苷或5-取代的尿苷核苷合成。为了合成CRN或二环核苷，可以在2′和4′位上加成碳原子。在2′和4′位上的碳原子取代基可以用于形成核苷中的2′-4′桥，从而形成二环CRN。
Sukeda等人展示了一种通过由3′位上的甲硅烷氧基保护基团经乙烯基的分子内转移而在2′位上加成碳原子的方式。参见Sukeda et al.,J.Org.Chem.Vol.65,8988-8996,2000。转移乙烯基以提供(R)-2′-乙烯基取代的核糖构型的核苷立体异构体。
在本发明的方法中，由尿苷或5-甲基尿苷核糖核苷的2,2′-脱水尿苷中间体开始，可以用单甲氧基三苯甲基(MMT)保护5′-羟基。然后，用碘化钠和甲苯磺酸(tosic acid)进行亲核开环，得到2′-脱氧-2′-碘-3′-O-二甲基乙烯基甲硅烷基-5′-MMT-O-嘧啶核糖核苷。就保护5′-羟基而言，单甲氧基三苯甲基相对于二甲氧基三苯甲基是优选的，因为单甲氧基三苯甲基在随后的乙烯基转移反应中更稳定。当自由基引发的乙烯基转移反应完成后，可以使用四丁基氟化铵(TBAF)除去残留的甲硅烷。可以使用单一纯化步骤，且该操作可放大至50克量级或更高量级的产物2′-脱氧-2′-乙烯基-5′-MMT-O-嘧啶核糖核苷。
对于3′位，3′位可以用苄基保护，可以除去MMT保护基团，并且5′位可以用戴斯-马丁高碘烷(Dess-Martin periodinane)氧化以引入4′-羟甲基。得到的具有式I的二醇化合物含有适当的2′和4′碳原子取代基，以制备一系列CRN和含CRN的分子。
式I的二醇化合物可以通过本领域已知的多种方法进行制备。在某些实施方式中，R是H或甲基。
本领域中尚不知晓由具有式I的二醇化合物以高收率和多克规模得到CRN核单体的稳健途径。
具有式I的二醇的2′-乙烯基取代基必须转化成可以与4′取代基形成共价桥的反应性基团。获得CRN的一种方式是将2′-乙烯基取代基转化成2′-羟甲基取代基。在进行该转化的过程中，明显的问题是如何在多克规模的核单体下实现2′-羟甲基取代基的高收率。
例如，对式I的二醇的4′-羟甲基和5′-羟基加成甲磺酸酯基团的保护不足以承受用例如四氧化锇处理式I的二醇以将2′-乙烯基取代基转化成2′-羟甲基取代基。一般而言，仅能获得低收率。
而且，具有式I的二醇化合物的2′-乙烯基取代基可能不能通过臭氧分解充分转化成2′-羟甲基取代基。在实践中，仅能在不足克量级的小规模下获得低收率，从而使该方法不可行。不希望受到任何特定理论的约束，其可能是3′-苄基保护基团在臭氧分解下表现出反应性，或者其它原因。
在一些方面，本发明提供了以高收率和多克规模由式I的二醇化合物得到CRN核单体的成功路径。
已发现，对于臭氧分解和其它转化路径意想不到的有利的稳定中间体可以是具有式II的受保护的化合物
其中5′-羟基被大的取代基R1保护，4′-羟甲基被大的取代基R2保护，3′-羟基被取代基R3保护，且B是核碱基或核碱基类似物。取代基R1和R2任选地如虚线所示被连接起来。
在一些实施方式中，取代基R1和R2中的一个是大的取代基。
在一些实施方式中，对于臭氧分解和其它转化路径有利的稳定中间体可以是具有式III的受保护的化合物
其中5′-羟基和4′-羟甲基被1,1,3,3-四烷基二硅氧烷-1,3-二基保护，R4是烷基，Bn是苄基，且B是核碱基或核碱基类似物。在某些实施方式中，R4是异丙基。
在一些实施方式中，核碱基是尿苷或5-甲基尿苷，且受保护的化合物可以具有式IV
其中R是氢或甲基，iPr是异丙基，且5′-羟基和4′-羟甲基被1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷-1,3-二基(TIPDS或TIPS)保护。
用于位置R1和R2的大的取代基的实例包括三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)。
用于位置R1和R2的大的取代基的实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)(双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)。
具有式II、式III或式IV的受保护的化合物就臭氧分解和2′-乙烯基取代基的其它转化路径而言可以是有利地稳定的。当臭氧分解时，式IV的化合物转化成具有式V的化合物
具有式II、式III或式IV的受保护的化合物的意想不到的有利的稳定性可以包括减少3′-苄基保护基团对臭氧分解的敏感性以及其它。通过臭氧分解转化2′-乙烯基取代基的初始收率可以是50％或更大，伴随着2′-乙烯基形式的40％回收率，其可以被进一步氧化，得到多达90％的收率。
通过使用具有式II、式III或式IV的受保护的化合物作为起始点，可以在高规模下以高收率实现2′-乙烯基取代基的转化，从而在高规模下以高收率合成CRN。
具有式II、式III或式IV的受保护的化合物可以通过如下转化成CRN：(a)臭氧分解2′-乙烯基取代基得到2′-羟甲基取代基，(b)使2′-羟甲基取代基酰化以得到完全受保护的核苷，(c)通过用缓冲的四丁基氟化铵除去TIPDS基团再生成二醇形式，(d)使再生成的二醇形式的4′-羟甲基取代基和5′-羟基甲磺酰化，(e)使2′-位脱酰化，以及(f)使α-4′-甲磺酰基-O-取代基与2′-羟甲基取代基缩合以形成二环结构。此时，部分受保护的二环核苷
可以采用另外的步骤进行亚磷酰胺化。
例如，在一些实施方式中，亚磷酰胺基团可以通过如下进行加成：(f1)用氢替换3′-苄基，(g1)用适合于亚磷酰胺化学的基团例如4,4′-二甲氧基三苯甲基(DMTr)基团保护剩余的β-4′-羟甲基取代基，以及(h1)加成3′-亚磷酰胺基团以获得CRN亚磷酰胺，
在另一些实施方式中，可以通过如下加成亚磷酰胺基团：(f2)用氢替换3′-苄基，(g2)加成3′-三乙基甲硅烷基，以及(h2)将4′-酰基转化成苄基氨基或苄基胞苷。此时，部分受保护的二环核苷可以采用另外的步骤进行亚磷酰胺化。通过这种途径，可以制备3′-亚磷酰胺化的CRN的各种胸苷、胞苷和尿苷形式。
在另外的实施方式中，具有式II、式III或式IV的受保护的化合物可以通过如下转化成CRN：(a)臭氧分解2′-乙烯基取代基得到2′-羟甲基取代基，(b)使2′-羟甲基取代基甲磺酰化，(c)通过用缓冲的四丁基氟化铵除去TIPDS基团而再生成二醇形式，以及(d)使α-4′-羟甲基-取代基与2′-甲磺酰基-O取代基缩合以形成二环结构。此时，该部分受保护的二环核苷
可以用另外的步骤亚磷酰胺化。
在一些实施方式中，可以进行下列反应：
在又一些实施方式中，可以进行下列反应：
在另一些实施方式中，可以进行下列反应：
其中TES是三乙基甲硅烷基。
图1示出用于制备本发明的构象限制的核单体或CRN的方法的实施方式。
图2示出用于制备本发明的构象限制的核单体或CRN的方法的实施方式。
在又一些实施方式中，嘌呤核糖核苷可以通过嘧啶CRN的转糖苷作用实现。
在另一些实施方式中，嘌呤CRN核单体可以通过合成二环糖并与甲硅烷基化的嘌呤反应来制备。
制备各种有机基团和保护基团的方法是本领域中已知的，并且它们的使用和修饰通常在本领域技术人员的能力范围内。参见，例如Stanley R.Sandler and Wolf Karo，Organic Functional Group Preparations(1989)；Greg T.Hermanson,Bioconjugate Techniques(1996)；Leroy G.Wade,Compendium OfOrganic Synthetic Methods(1980)；保护基团的实例参见T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups In Organic Synthesis(3rd ed.1991)。参见，例如Helmut Vorbrüggen,Handbook of Nucleoside Synthesis(2001)。
构象限制的核单体
在一些方面，本发明提供一系列CRN化合物。
在一些实施方式中，CRN化合物具有如下结构
其中R是甲基，R1独立地是H、烷基或保护基团，且R2独立地是H、烷基、保护基团、或亚磷酰胺基团。
本发明的CRN化合物可以借鉴本领域中的技术通过本文公开的方法进行制备。
在一些实施方式中，本发明的CRN化合物是亚磷酰胺5-甲基胞苷CRN
含有CRN核单体的核酸化合物
含有一个或多个CRN的本发明的核酸化合物可以是微RNA、antimir、antagomir、微RNA模拟物、或微RNA前体或前-微RNA。
在一些实施方式中，本发明的核酸化合物可以是能够用于靶向微RNA的单链反义分子。
在又一些实施方式中，本发明的核酸化合物可以是微RNA模拟分子，其是RNA复合体(RNA complex)。
在某些实施方式中，本发明的核酸化合物可以是大的干预性非编码RNA(intervening noncoding RNA；lincRNA)或Piwi-相互作用RNA(Piwi-interacting RNA；piRNA)。
含有一个或多个CRN的本发明的核酸化合物可以是RNA、DNA、RNA和DNA、usiRNA、siRNA、mdRNA、短发夹RNA或shRNA、或反义寡核苷酸。
在一个方面，本发明提供了包含第一链和与第一链互补的第二链的核酸化合物，其中第一链和第二链可以退火以形成双链区域，并且其中双链区域包含一个或多个错配，并且其中第一链或第二链的一个或多个核单体是构象限制的核单体。
在一些实施方式中，本发明的核酸化合物可以具有一起构成RNA双链体(duplex)的两条链。RNA双链体可以由反义链(又称为引导链或第一链)和随从链(又称为正义链或第二链)组成。
在又一些实施方式中，本发明的核酸化合物可以是单链RNA分子，例如反义RNA，或功能性RNA(fRNA)，或非编码RNA(ncRNA)，或小时序RNA(small temporal RNA；stRNA)，或微RNA(miRNA)，或小核RNA(snRNA)，或短干扰RNA(siRNA)，或小核仁RNA(snRNA)，或核糖体RNA(rRNA)，或转移RNA(tRNA)，或任意前述RNA的前体RNA。
此外，本文中所用的术语dsRNA意指与用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其它术语同义，例如部分双链RNA(meroduplex RNA；mdRNA)、带切口的dsRNA(nicked dsRNA；ndsRNA)、带间隙的dsRNA(gapped dsRNA；gdsRNA)、短干扰核酸(siNA)、siRNA、微-RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰取代的寡核苷酸、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的dsRNA、或转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)。
在某些实施方式中，本发明的核酸化合物的核酸化合物链的核单体的1％至75％可以是构象限制的核单体。
核酸化合物可以具有长度为8至60个核单体的链。核酸化合物可以具有长度为10至40个核单体的链。
核酸化合物可以具有10至23个碱基对、或12至21个碱基对、或14至21个碱基对、或15至21个碱基对、或16至21个碱基对的双链区域。
在一些实施方式中，核酸化合物可以是RISC激活剂，其中第一链具有约15个核苷酸至约25个核苷酸；或者是Dicer底物，其中第一链具有约26个核苷酸至约40个核苷酸。
在某些实施方式中，核酸化合物可以含有一个或多个5-甲基尿苷(核糖胸苷)、一个或多个2-硫代核糖胸苷、或一个或多个通用结合的(universal-binding)核苷酸、或一个或多个G夹(G clamps)。通用结合的核苷酸的实例包括C-苯基，C-萘基，肌苷，唑甲酰胺，1-β-D-呋喃核糖基-4-硝基吲哚，1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚，1-β-D-呋喃核糖基-6-硝基吲哚和1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯。
在又一些实施方式中，核酸化合物可以进一步含有在第一链、第二链或第三链中的一个或多个的一端或两端上的末端帽(terminal cap)取代基。末端帽的实例包括烷基、无碱基(abasic)、脱氧无碱基、甘油基、二核苷酸、无环核苷酸或反向脱氧核苷酸部分。
核酸化合物可以进一步含有一个或多个修饰的核苷酸间链接，如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酸酯、亚磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、3'-氨基氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯(selenophosphate)或硼烷磷酸酯(boranophosphate)链接。
在核酸化合物中，正义链、反义链或这两种链的5'-末端可以是羟基或磷酸酯。
核酸化合物可以是具有两个平末端(blunt-end)的双官能核酸化合物。
核酸化合物可以含有一个或多个羟甲基取代的核单体和一个或多个构象限制的核单体。
在核酸化合物中，第一链和第二链可以通过核单体的非配对区域连接。
dsRNA分子可以是具有两条链或更多链条的部分双链RNA或mdRNA。例如，mdRNA可以具有'A'(第一或反义)链、'S1'(第二)链和'S2'(第三)链，其中'S1'链和'S2'链互补并且与'A'链的非重叠区域形成碱基对(bp)(例如，mdRNA可以具有A:S1S2的形式)。S1、S2或更多的链一起实质上包含结合'A'链的正义链。通过'S1'和'A'链的退火形成的双链区域与通过'S2'和'A'链的退火形成的双链区域是不同的且非重叠的。mdRNA分子是“带间隙的”分子，表示0个核苷酸至最多约10个核苷酸的“间隙”。在一些实施方式中，A:S1双链体通过由'A'链中的至少一个未配对的核苷酸(最多至约10个未配对的核苷酸)产生的间隙与A:S2双链体分开，所述至少一个未配对的核苷酸位于A:S1双链体和A:S2双链体之间并且与'A'、'S1'或'S2'链中的一个或多个的3'-端的任意一个或多个未配对的核苷酸不同。在一些实施方式中，A:S1双链体通过A:S1双链体和A:S2双链体之间的0个核苷酸的间隙(即切口，其中在多核苷酸分子中仅两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开或缺失)与A:B2双链体分开，这也被称为带切口的dsRNA(ndsRNA)。例如，A:S1S2可以由具有至少两个合并共计约14个碱基对至约40个碱基对的双链区域的dsRNA组成，并且该双链区域被任选地具有平末端的约0至约10个核苷酸的间隙分开，或者A:S1S2可以包含具有至少两个被至多10个核苷酸的间隙分开的双链区域的dsRNA组成，其中至少一个双链区域包含约5个碱基对至13个碱基对。
核酸分子的合成
核酸分子可以通过重组产生、化学合成或其组合来制备。寡核苷酸(例如某些修饰的寡核苷酸或缺少核糖核苷酸的寡核苷酸的部分)可以使用本领域中已知的方案来合成，例如Caruthers et al.,Methods in Enzymol.211:3-19,1992；Thompson et al.,PCT公开号WO99/54459；Wincott et al.,Nucleic Acids Res.23:2677-2684,1995；Wincott et al.,Methods Mol.Bio.74:59,1997；Brennan et al.,Biotechnol Bioeng.61:33-45,1998；和Brennan,美国专利第6,001,311号中描述的。可以使用如Usman et al.,J.Am.Chem.Soc.109:7845,1987；Scaringe et al.,Nucleic Acids Res.18:5433,1990；和Wincott et al.,Nucleic Acids Res.23:2677-2684,1995；Wincott et al.,MethodsMol.Bio.74:59,1997中描述的步骤进行RNA(包括本发明的某些dsRNA分子及其类似物)的合成。
在某些实施方式中，本发明的核酸分子可以被单独合成并在合成后例如通过连接(ligation)(Moore et al.,Science256:9923,1992；Draper et al.,PCT公开号WO93/23569；Shabarova et al.,Nucleic Acids Res.19:4247,1991；Bellon et al.,Nucleosides&Nucleotides16:951,1997；Bellon et al.,Bioconjugate Chem.8:204,1997)或通过合成或脱保护后的杂化而连接在一起。
非核苷酸连接体可以由无碱基核苷酸、聚酯、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃、或其它聚合化合物(例如，聚乙二醇，如具有2至100个乙二醇单元的聚乙二醇)组成。具体实例包括Seela and Kaiser,NucleicAcids Res.18:6353,1990以及Nucleic Acids Res.15:3113,1987；Cload andSchepartz,J.Am.Chem.Soc.113:6324,1991；Richardson and Schepartz,J.Am.Chem.Soc.113:5109,1991；Ma et al.,Nucleic Acids Res.21:2585,1993以及Biochemistry32:1751,1993；Durand et al.,Nucleic Acids Res.18:6353,1990；McCurdy et al.,Nucleosides&Nucleotides10:287,1991；Jaschke et al.,Tetrahedron Lett.34:301,1993；Ono et al.,Biochemistry30:9914,1991；Arnoldet al.,PCT公开号WO89/02439；Usman et al.,PCT公开号WO95/06731；Dudycz et al.,PCT公开号WO95/11910以及Ferentz and Verdine,J.Am.Chem.Soc.113:4000,1991所描述的那些。
在一些实施方式中，本发明的dsRNA分子(其可以被进一步修饰)的合成包括：(a)第一(反义)链的合成和各自与第一链的非重叠区域互补的第二(正义)链和第三(正义)链的合成；以及(b)在适于获得dsRNA分子的条件下对第一链、第二链和第三链一起进行退火。在另一个实施方式中，dsRNA分子的第一链、第二链和第三链的合成是通过固相寡核苷酸合成法。在又一个实施方式中，dsRNA分子的第一链、第二链和第三链的合成是通过固相串联寡核苷酸合成法。
核酸分子可以含有碱基、糖、磷酸酯、或其任意组合的取代或修饰。对核酸分子的碱基、磷酸酯或糖部分的取代和化学修饰的一些实例在以下给出：参见，例如Eckstein et al.,PCT公开号WO92/07065；Perrault et al.,Nature344:565,1990；Pieken et al.,Science253:314,1991；Usman andCedergren,Trends in Biochem.Sci.17:334,1992；Usman et al.,Nucleic AcidsSymp.Ser.31:163,1994；Beigelman et al.,J.Biol.Chem.270:25702,1995；Burgin et al.,Biochemistry35:14090,1996；Burlina et al.,Bioorg.Med.Chem.5:1999,1997；Thompson et al.,Karpeisky et al.,Tetrahedron Lett.39:1131,1998；Earnshaw and Gait,Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)48:39-55,1998；Verma and Eckstein,Annu.Rev.Biochem.67:99-134,1998；Herdewijn,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.10:297,2000；Kurreck,Eur.J.Biochem.270:1628,2003；Dorsett and Tuschl,Nature Rev.Drug Discov.3:318,2004；PCT公开号WO91/03162；WO93/15187；WO97/26270；WO98/13526；美国专利号5,334,711；5,627,053；5,716,824；5,767,264；6,300,074。
修饰可以包括核苷间链接，如硫代磷酸酯或代替尿苷的5-甲基尿苷。
在一个实施方式中，本发明的特征在于取代的或修饰的dsRNA分子，如磷酸酯骨架修饰，其包含一个或多个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化物氨基甲酸酯、羧甲基、氨基乙酸酯(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、磺胺、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛或烷基甲硅烷基取代基。
一些寡核苷酸骨架修饰在Hunziker and Leumann,Nucleic AcidAnalogues:Synthesis and Properties,in Modern Synthetic Methods,VCH,331-417,1995；以及Mesmaeker et al.,ACS,24-39,1994中给出。
治疗方法
在另一个方面，本发明提供了用于减少基因的表达或者用于减少细胞的基于内源性核酸的调节系统的功能的方法，该方法包括对细胞施用如本文所述的核酸化合物，其中核酸化合物减少细胞中基因的表达。
在另一个方面，本发明提供了用于减少细胞的基于内源性核酸的调节系统的功能的方法，该方法包括对细胞施用如本文所述的核酸化合物，其中核酸化合物减少细胞中基于内源性核酸的调节系统的功能。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或控制受试者中与异常核酸表达相关、相关联的和/或由异常核酸表达造成的疾病或病况的方法，该方法包括对需要治疗或控制的受试者施用本文所公开的核酸化合物，其中核酸化合物减少核酸的表达或功能，从而治疗或控制所述疾病或病况。
定义
本文所用的术语“连接”包括在两个化学实体之间(例如，RNA和羟甲基取代的核单体之间)直接的共价链接或者在两个化学实体之间间接(例如通过连接体)的共价链接。
本文所用的术语“核碱基类似物”是指取代的或未取代的含氮母体杂芳环，其能够与互补的核碱基或核碱基类似物形成Watson-Crick氢键。示例性的核碱基类似物包括但不限于7-脱氮腺嘌呤、肌苷、烟云杯伞素、硝基吡咯、硝基吲哚、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、5-丙炔基胞苷、异胞苷、异鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、O6-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5,6-二氢胸腺嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、4-甲基吲哚、亚乙烯基腺嘌呤。其它示例性的核碱基类似物可以参见Fasman,1989,PracticalHandbook of Biochemistry and Molecular Biology,pp.385-394,CRC Press,Boca Raton,Fla.，及其中引用的参考文献，这些文献通过引用并入本文。
本文所用的术语“核单体(nucleomonomer)”意指包含与(2)第二实体共价连接的(1)碱基的实体。核单体可以连接形成低聚物，该低聚物以序列特异性方式结合至核酸中的靶序列或互补碱基序列。核单体可以是核苷、核苷酸、非核苷酸或非核苷(例如，羟甲基取代的核单体)。
本文所用的术语“构象限制的核单体”、“构象限制的核苷酸”可以互换使用，并且是指具有二环糖部分(例如二环核糖)且其中糖部分的C2’和C4’桥接(例如，单体R)或者C3’和C5’桥接(例如，单体Q)的核单体。
本文所用的术语“羟甲基取代的核单体”、“羟甲基核单体”、“羟甲基单体”、“无环核单体”、“无环单体”、“无环羟甲基取代的核单体”可以通篇互换使用。
本文所用的术语“RISC长度”或“RISC长度RNA复合体”意指具有少于25个碱基对的核酸分子。
本文所用的术语“悬端(overhang)”(例如，3’-端悬端或3’悬端)意指核酸化合物的未配对区域，其可以含有所有的核苷酸、非核苷酸(例如，羟甲基取代的核单体)或核苷酸和非核苷酸的组合。
本文所用的术语“Dicer长度”或“Dicer长度RNA复合体”意指具有25个或更多个碱基对，一般为25至40个碱基对的核酸分子。
本文所用的术语“双官能核酸化合物”或“双官能RNA复合体”或“双官能dsRNA”表示具有正义链和反义链的核酸化合物，其中正义链和反义链各自与同一靶RNA的不同区域(即第一区域和第二区域)互补，或者各自与至少两个不同靶RNA的区域互补。
本文所用的术语“种子区域”或“种子序列”是指通过抑制翻译和/或mRNA降解而在基因调节中涉及到的微RNA的区域，或者siRNA中类似于微RNA的种子区域的引导链中的部分。
“核糖核酸”或“RNA”意指包含至少一个核糖核苷酸分子的核酸分子。本文所用的“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖部分的2′-位具有羟基的核苷酸。术语RNA包括双链(ds)RNA、单链(ss)RNA、分离的RNA(如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组生产的RNA)、改变的RNA(其通过添加、删除、取代或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA)或者其任意组合。例如，如此改变的RNA可以包含非核苷酸物质的添加，如在RNA分子的一端或两端、在RNA的一个或多个核苷酸的内部或者其任意组合处的添加。本发明的RNA分子中的核苷酸也可以包含非标准的核苷酸，如天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸、化学修饰的核苷酸、脱氧核苷酸或其任意组合。这些改变的RNA可以被称为类似物或者含标准核苷酸的RNA的类似物(即，本文所用的标准核苷酸被认为是腺嘌呤、胞苷、胍、胸苷和尿苷)。
本文所用的术语“dsRNA”和“RNA复合体”是指任何包含至少一个核糖核苷酸分子且能够例如通过以序列特异性方式促进RNA干扰(“RNAi”)或基因沉默来抑制或下调基因表达的核酸分子。本发明的dsRNAs(mdRNAs)可以是适合用于Dicer的物质或用于与RISC缔合以通过RNAi介导基因沉默的物质。本发明的dsRNA分子的实例在本文所述的序列表中提供。dsRNA的一条或两条链可以进一步包含末端磷酸基团，如5'-磷酸基团或5',3'-二磷酸基团。本文所用的dsRNA分子除了至少一个核糖核苷酸以外还可以进一步包括取代、化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方式中，dsRNA分子在多达约100％的核苷酸位置上包含核糖核苷酸。
此外，本文所用的术语“RNAi”意在表示与用于描述序列特异性RNA干扰如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传的其它术语同义。例如，本发明的dsRNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平或其任意组合上通过表观遗传方法使基因沉默。
本文所用的术语“基因”，尤其是在用于RNAi的“靶基因”或“基因靶点”语境时，意指以下核酸分子：所述核酸分子编码RNA或这种基因(包括信使RNA(mRNA，又被称为编码用于多肽的结构基因))的转录产物、这种基因的mRNA剪接变体、功能性RNA(fRNA)或非编码RNA(ncRNA)如小时序RNA(stRNA)、微RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、短干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)和它们的前体RNA。这些非编码RNA可以用作dsRNA介导的RNAi的靶核酸分子以改变功能性或调节性细胞过程所涉及的靶RNA的活性。
本文所用的“基因沉默”是指通过靶向抑制细胞中的基因表达而导致的部分或完全功能缺失，其也可以被称为靶基因表达的RNAi“敲减”、“抑制”、“下调”或“降低”。根据情况和要解决的生物学问题，可以优选部分地降低基因表达。或者，可能希望尽可能多地降低基因表达。沉默的程度可以通过本文所述的以及本领域已知的方法来确定(参见，例如，PCT公开号WO99/32619；Elbashir et al.,EMBO J.20:6877,2001)。根据检测法，基因表达的量化允许检测本发明包括预防和治疗方法在内的某些实施方式所期望的各种抑制量，其能够在mRNA水平或蛋白质水平或活性上将靶基因敲减例如等于或大于基准水平(即正常水平)或其它对照水平的10％、30％、50％、75％、90％、95％或99％，其中所述其它对照水平包括可能与特定疾病状态或靶向治疗的其它状况有关的升高的表达水平。
化学定义
此外，应当理解，衍生自本文所述的结构和取代基的各种组合的个体化合物或化合物组被本申请公开的程度如同单独描述每个化合物或化合物组。因此，对具体结构或具体取代基的选择在本发明的范围内。如本文所述，所有数值范围包括所述范围内的全部数值。因此，C1-C4的范围可理解为包括值1、2、3和4，因此包括C1、C2、C3和C4。
本文所用的术语“烷基”是指含有1-22个碳原子(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个碳原子)的饱和、支链或直链、取代或未取代的脂肪族基团。这一定义适用于其它基团中的烷基部分，举例来说，例如烷氧基、烷酰基、芳烷基和下文定义的其它基团。本文所用的术语“环烷基”是指含有3至12个碳原子的饱和、取代或未取代的环状烷基环。
本文所用的术语“烯基”是指具有2至22个碳原子和至少一个碳-碳双键的不饱和、支链或直链、取代或未取代的烷基或环烷基。本文所用的术语“炔基”是指具有2至22个碳原子和至少一个碳碳三键的不饱和、支链或直链、取代或未取代的烷基或环烷基。
本文所用的术语“烷氧基”是指与氧原子共价键合的烷基、环烷基、烯基或炔基。本文所用的术语“烷酰基”是指-C(＝O)-烷基，其也可以被称为“酰基”。本文所用的术语“烷酰基氧基”是指–O-C(＝O)-烷基基团。本文所用的术语“烷基氨基”是指–NRR'基团，其中R和R'各自为氢或烷基，且R和R'中的至少一个是烷基。烷基氨基包括其中R和R'形成环的基团，如哌啶基。术语“烷基氨基烷基”是指–烷基-NRR'。
本文所用的术语“芳基”是指在每个环中具有4至12个原子的任何稳定的单环、双环或多环碳环体系，其中至少一个环是芳香性的。芳基的一些实例包括苯基、萘基、四氢-萘基、茚满基和联苯基。当芳基取代基是双环的且一个环是非芳香性的，可以理解连接是与芳香环连接。芳基可以是取代或未取代的。
本文所用的术语“杂芳基”是指每个环中具有4至12个原子的任何稳定的单环、双环或多环碳环体系，其中至少一个环是芳香性的且含有1至4个选自氧、氮和硫的杂原子。杂芳基的一些实例包括吖啶基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基和四氢喹啉基。杂芳基包括含氮杂芳基的N-氧化物衍生物。
本文所用的术语“杂环”或“杂环基”是指具有5至22个原子的芳香族或非芳香族环体系，其中1至4个环原子是选自氧、氮和硫的杂原子。因此，杂环可以是杂芳基或其二氢或四氢形式。
本文所用的术语“芳酰基”是指衍生自芳香族羧酸如取代的苯甲酸的芳基基团。本文所用的术语“芳烷基”是指与烷基键合的芳基，例如苄基。
本文所用的术语“羧基”表示式–C(＝O)OH或-C(＝O)Oˉ基团。本文所用的术语“羰基”和本文所用的“酰基”是指其中氧原子双键键合至碳原子的基团>C＝O。本文所用的术语“羟基”是指-OH或-Oˉ。本文所用的术语“腈”或“氰基”是指–CN。术语“卤素”或“卤代”是指氟(-F)、氯(–Cl)、溴(-Br)和碘(-I)。
本文所用的术语“环烷基”是指含有3至12个碳原子的饱和环烃环体系，其可以是任选取代的。示例性实施方式包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基和环己基。在某些实施方式中，环烷基是环丙基。在另一实施方式中，(环烷基)烷基在环部分含有3至12个碳原子且在烷基部分含有1至6个碳原子。在某些实施方式中，(环烷基)烷基是环丙基甲基。烷基任选地被1至3个选自卤素、羟基和氨基的取代基取代。
本文所用的术语“烷酰基”和“烷酰基氧基”分别是指-C(O)-烷基基团和–O-C(＝O)-烷基基团，各自均任选地含有2至10个碳原子。烷酰基和烷酰基氧基的具体实施方式分别是乙酰基和乙酰氧基。
本文所用的术语“炔基”是指具有2至10个碳原子且具有至少一个碳碳三键的不饱和的支链、直链或环状烷基，其是通过从母体炔烃的单个碳原子移除一个氢原子衍生得到的。示例性炔基包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、4-戊炔基、1-辛炔基、6-甲基-1-庚炔基、2-癸炔基等。炔基可以是取代的或未取代的。
单独或联合使用的术语“羟基烷基”是指如前面所定义的烷基，其中一个或几个氢原子(优选一个氢原子)被羟基取代。实例包括羟甲基、羟乙基和2-羟基乙基。
本文所用的术语“氨基烷基”是指–NRR'基团，其中R和R'可以独立地是氢或(C1-C4)烷基。
术语“烷基氨基烷基”是指通过烷基连接的烷基氨基(即，具有通式结构-烷基-NH-烷基或-烷基-N(烷基)(烷基)的基团)。这样的基团包括但不限于单-和二-(C1-C8烷基)氨基C1-C8烷基，其中各个烷基可以相同或不同。
术语“二烷基氨基烷基”是指连接至烷基的烷基氨基。实例包括但不限于N,N-二甲基氨基甲基、N,N-二甲基氨基乙基、N,N-二甲基氨基丙基等。术语二烷基氨基烷基也包括桥接烷基部分被任选取代的基团。
术语“卤代烷基”是指被一个或多个卤代基团取代的烷基，例如氯甲基、2-溴乙基、3-碘丙基、三氟甲基、全氟丙基、8-氯壬基等。
本文所用的术语“羧基烷基”是指取代基-R10-COOH，其中R10是亚烷基；且“羰基烷氧基烷基”是指–R10-C(＝O)OR11，其中R10和R11分别是亚烷基和烷基。在某些实施方式中，烷基是指具有1至6个碳原子的饱和的直链或支链烃基基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基戊基、正己基等。亚烷基与烷基相同，除了该基团是二价的。
术语“烷氧基”包括与氧原子共价连接的取代的和未取代的烷基、烯基和炔基。在一个实施方式中，烷氧基含有1至约10个碳原子。烷氧基的实施方式包括但不限于甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基。取代的烷氧基的实施方式包括卤代烷氧基。在另一实施方式中，烷氧基可以被诸如烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸根(phosphate)、膦酸根(phosphonato)、亚膦酸根(phosphinato)、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、烷基亚磺酰基、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香基或杂芳香基部分。示例性卤素取代的烷氧基包括但不限于氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基和三氯甲氧基。
术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的亚烷基。例如，甲氧基乙基(CH3OCH2CH2-)和乙氧基甲基(CH3CH2OCH2-)都是C3烷氧基烷基。
在本文中单独或联合使用的术语“芳酰基”是指衍生自芳香族羧酸(如任选取代的苯甲酸或萘甲酸)的芳基基团。
本文所用的术语“芳烷基”是指通过烷基(优选含有1至10个碳原子的烷基)与2-吡啶环或4-吡啶环键合的芳基。优选的芳烷基是苄基。
本文所用的术语“羧基”表示式–C(＝O)OH或–C(＝O)Oˉ基团。
本文所用的术语“羰基”是指其中氧原子与碳原子双键键合的基团-C＝O。
本文所用的术语“三氟甲基”是指-CF3。
本文所用的术语“三氟甲氧基”是指-OCF3。
本文所用的术语“羟基”是指–OH或–Oˉ。
本文所用的术语“腈”或“氰基”是指–CN基团。
本文单独或联合使用的术语“硝基”是指-NO2基团。
本文所用的术语“氨基”是指–NR9R9基团，其中R9可以独立地是氢、烷基、芳基、烷氧基或杂芳基。本文所用的术语“氨基烷基”表示与“氨基”相比更详细的选择，是指-NR′R′基团，其中R′可以独立地是氢或(C1-C4)烷基。术语“二烷基氨基”是指连接有两个可以相同或不同的烷基的氨基。
术语“烷酰基氨基”是指后面连有-N(H)-的含有-C(＝O)-基团的烷基、烯基或炔基，例如乙酰基氨基、丙酰基氨基和丁酰基氨基等。
术语“羰基氨基”是指-NR′-CO-CH2-R′基团，其中R′可以独立地选自氢或(C1-C4)烷基。
本文所用的术语“氨基甲酰氧基(carbamoyl)”是指-O-C(O)NH2。
本文所用的术语“氨基甲酰基(carbamyl)”是指其中氮原子与羰基直接键合的官能团，即，如在-NR″C(＝O)R″或-C(＝O)NR″R″中所示，其中R″可以独立地为氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基。
术语“烷基磺酰基氨基”是指-NHS(O)2R12基团，其中R12是烷基。
本文所用的术语“卤素”是指溴、氯、氟或碘。在一个实施方式中，卤素是氟。在另一个实施方式中，卤素是氯。
术语“杂环”是指被任选取代的、饱和的、部分饱和的或完全饱和的、芳香或非芳香环基团，其为4至7元单环或7至11元二环体系，在至少一个含碳原子环中具有至少一个杂原子。杂环上的取代基可以选自上面对芳基所给出的那些取代基。含杂原子的杂环基团上的每个环可以具有1、2或3个选自氮、氧或硫的杂原子。在杂环中给出的多个杂原子可以相同或不同。
示例性单环杂环基团包括吡咯烷基、吡咯基、吲哚基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、哌啶基、哌嗪基、氮杂环庚三烯基(azepinyl)、嘧啶基、哒嗪基、四氢吡喃基、吗啉基、二氧杂环己基、三嗪基和三唑基。优选的二环杂环基团包括苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、吲唑基、苯并异噻唑基、异二氢吲哚基和四氢喹啉基。在更具体的实施方式中，杂环基团可以包括吲哚基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯烷基、吡啶基和嘧啶基。
两个或更多个核酸序列之间的“同一性百分比”是在考虑间隙数和优化两个或更多个序列的排列需要引入的每个间隙的长度的情况下，序列共有的相同位置数的函数(即同一性％＝相同位置数/位置总数x100)。序列的比较和两个或更多个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法如BLAST和Gapped BLAST程序在其缺省参数下来完成(例如，BLASTN，参见Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)。
本文所用的“适体”或“核酸适体”意指特异性地结合至靶分子的核酸分子，其中该核酸分子具有这样的序列：该序列包含被自然环境中的靶分子识别的序列。或者，适体可以是结合至靶分子的核酸分子，其中该靶分子不能自然结合至核酸。靶分子可以是任何受关注的分子。例如，适体可以用于结合蛋白质的配体结合域，从而阻止天然存在的配体与蛋白质之间的相互作用。存在一个非限制性实例，并且本领域技术人员可以认识到使用本领域中普遍已知的技术可以容易地生成其它实施方案(参见，例如，Gold et al.,Annu.Rev.Biochem.64:763,1995；Brody and Gold,J.Biotechnol.74:5,2000；Sun,Curr.Opin.Mol.Ther.2:100,2000；Kusser,J.Biotechnol.74:27,2000；Hermann and Patel,Science287:820,2000；和Jayasena,ClinicalChem.45:1628,1999)。
本文所用的术语“取代的”是指具有一个或多个取代或取代基的原子，所述取代或取代基可以相同或不同，且可以包括氢取代基。因此，本文所用的术语烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷酰基氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、杂环、芳酰基和芳烷基是指包括取代的变体的基团。取代的变体包括直链、支链和环状的变体以及具有置换与基团的任何碳原子连接的一个或多个氢的一个或多个取代基的基团。可以与基团的碳原子连接的取代基包括烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷酰基氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、杂环、芳酰基、芳烷基、酰基、羟基、氰基、卤代、卤代烷基、氨基、氨基酰基、烷基氨基酰基、酰氧基、芳氧基、芳氧基烷基、巯基、硝基、氨基甲酰基、氨基甲酰氧基和杂环。例如术语乙基包括但不限于-CH2CH3、-CHFCH3、-CF2CH3、-CHFCH2F、-CHFCHF2、-CHFCF3、-CF2CH2F、-CF2CHF2、-CF2CF3，以及上面所述的其它变体。代表性取代基包括-X、-R6、-O-、＝O、-OR、-SR6、-S-、＝S、-NR6R6、＝NR6、-CX3、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-S(＝O)2O-、-S(＝O)2OH、-S(＝O)2R6、-OS(＝O)2O-、-OS(＝O)2OH、-OS(＝O)2R6、-P(＝O)(O-)2、-P(＝O)(OH)(O-)、-OP(＝O)2(O-)、-C(-O)R6、-C(＝S)R6、-C(＝O)OR6、-C(＝O)O-、-C(＝S)OR6、-NR6-C(＝O)-N(R6)2、-NR6-C(＝S)-N(R6)2、和-C(＝NR6)NR6R6，其中每个X独立地是卤素；且每个R6独立地是氢、卤素、烷基、芳基、芳基烷基、芳基芳基、芳基杂烷基、杂芳基、杂芳基烷基、NR7R7、-C(＝O)R7、和-S(＝O)2R7；且每个R7独立地是氢、烷基、烷基、炔基、芳基、芳基烷基、芳基杂烷基、芳基芳基、杂芳基或杂芳基烷基。含取代基的芳基，不论是具有一个还是多个取代，可以以对位(p-)、间位(m-)或邻位(o-)构象或其任意组合连接。一般而言，取代基可进一步被任意原子或原子组取代。
仅出于举例的目的，核单体在链中的位置可以如下描述，其中X表示任意类型的核单体(例如，核苷、修饰的核苷酸、RNA、DNA、羟甲基取代的核单体或构象限制的核单体)，且数字表示核单体在链中的位置。例如，X1表示以下的链从链的5’-端开始计数的位置一；X7表示以下的链从链的5’-端开始计数的位置七。或者，X1、X2和X3表示以下的链的5’-端处的最后3个位置，X1至X10表示链的5’-端处的最后十个位置。Xn可表示位置11至60(或n＝1至60)，因此当n为20(或X20)时，这表示链从链的5’-端开始计数的位置20。
5’X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn 3’
为了确定核单体在链(下面示出的示例链)中的位置，可采取相同的方法从链的3’-端开始计数。对于以下的链，核单体在链中的位置可以如下描述：其中X表示任意类型的核单体(例如，核苷、修饰的核苷酸、RNA、DNA、羟甲基取代的核单体或构象限制的核单体)，且数字表示核单体在链中的位置。例如，X1表示以下的链从链的3’-端开始计数的位置一；X7表示以下的链从链的3’-端开始计数的位置七。或者，X1、X2和X3表示以下的链的3’-端处的最后3个位置，X1至X10表示链的3’-端处的最后十个位置。Xn可表示位置11至60(或n＝1至60)，因此当n为20(或X20)时，这表示链从链的3’-端开始计数的位置20。
5’Xn-X10-X9-X8-X7-X6-X5-X4-X3-X2-X1 3’
其它实施方式
本文所引用的所有的出版物、非专利出版物、参考文献、专利、专利出版物、专利申请和其它文献均以其整体通过引用吗，明确地并入本文。
虽然已经与某些实施方式相关地描述了本发明，但是阐述的许多细节仅出于举例描述的目的，对本领域技术人员而言，本发明包括其它实施方式并且本文所描述的一些细节在不脱离本发明的情况下可以被大量改动是显然的。本发明包括这些其它实施方式、修改和等同体。尤其是，本发明包括各个示例性组件和实例的特征、术语或元素的任意组合。
使用的可选方式例如“或”应被理解为表示可选方式中的一种、两种或其任意组合。
应当理解本文所用的术语“一种(a)”和“一种(an)”是指所列举的组件中的“一种或多种”。本文中在描述本发明和在权利要求书中使用的术语“一种(a)”、“一种(an)”、“该(the)”和其它类似术语被解释为包括单数和复数两种形式。
术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放性术语，其表示例如“包括但不限于”。因此，诸如“包含”、“具有”、“包括”和“含有”的术语被解释为包括性，而非排他性。本文所用的术语“包括”和“包含”是开放性的，并作为同义使用。
本文列举的数值范围独立地是指落在该范围内的每个以及任意单独的值，如同其被单独地列举在本文中，不管该范围内的一些数值是否被明确列举出来。例如，范围“4至12”包括但不限于值5、5.1、5.35和任意其它大于等于4且小于等于12的全部值、整数值、小数值或有理值。本文所应用的具体值应当理解为示例性的，而非限制本发明的范围。
本文列举的碳原子数的范围独立地是指落在该范围内的每个以及任意单独的值，如同其被单独地列举在本文中，不管该范围内的一些数值是否被明确列举出来。例如，术语“C1-24”包括但不限于C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23和C24物质。
本文提供的技术术语的定义应被解释成包括而非列举本领域技术人员已知的与这些术语相关的含义，且并非旨在限制本发明的范围。本文提供的技术术语的定义应被解释成优先于本领域中的其它定义或在其它定义与本文所提供的定义相冲突的程度上通过引用并入本文中的定义。
本文所给出的实例以及本文所用的示例性语言仅用于举例说明的目的，且并不旨在限制本发明的范围。
当给出一系列实例时，如适合用于本发明的一系列化合物或分子时，对于本领域技术人员而言显然的是，所列举的化合物或分子的混合物也是适合的。
实施例
实施例1
2,2′-脱水-5-甲基尿嘧啶的合成
将5-甲基尿苷(56.0g，217mmol)和碳酸二苯酯(69.7g，325mmol)溶于DMF(250mL)中，之后向该溶液中添加碳酸氢钠(1.82g，22mmol)。将得到的悬浮液浸在油浴中并在搅拌下于110℃加热2.5-3小时，直到观察到CO2放出停止。冷却至室温后，将反应混合物浓缩至一半体积，然后缓慢倾倒至快速搅拌的二乙醚(800mL)中，产生白色固体。在倒出醚之后，将白色固体用额外的新鲜的醚(3x500mL)洗涤。将得到的固体滤出，并用醚洗涤。通过将分离的白色固体溶于热甲醇(250mL)中并使溶液冷却至室温而进行最终沉淀。通过添加醚(250mL)，然后在0℃下冷却过夜而将产物沉淀出来。通过过滤分离白色固体，并在高真空下干燥，得到2,2′-脱水-5-甲基尿嘧啶(39.2g，75％)，为白色粉末。
实施例2
1-[5-O-(4-甲氧基三苯甲基)-2-脱氧-2-乙烯基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]-胸腺嘧 啶的合成
将2,2′-脱水-5-甲基尿嘧啶(41.0g，171mmol)、对甲苯磺酸一水合物(32.5g，171mmol)和NaI(25.6g，171mmol)在丙酮(700mL)中的悬浮液在55℃下搅拌4h。冷却至室温之后，将得到的沉淀物滤出并用丙酮洗涤。将收集的滤液浓缩至约20％体积。然后以每份大约5mL添加饱和的Na2S2O3(50mL)，振摇和声波处理混合物直到呈褐色的溶液逐渐变成淡黄色溶液。将得到的沉淀物滤出，并将分离的滤液在真空下浓缩，得到黄色胶粘性泡沫。然后将残余物溶于乙腈(350mL)中，之后通过过滤除去额外的白色沉淀物。将分离的滤液在真空下浓缩，得到粗产物1-(2-脱氧-2-碘-β-D-呋喃核糖基)-5-甲基尿嘧啶，为黄色泡沫(62.2g粗产物)。将粗产物1-(2-脱氧-2-碘-β-D-呋喃核糖基)-5-甲基尿嘧啶(62.2g，169mmol)溶于无水吡啶(800mL)，并添加4-甲氧基三苯甲基氯(57.4g，186mmol)。使反应混合物在室温、氮气下搅拌过夜。将溶液在真空下浓缩，然后在EtOAc(400mL)和水(400mL)之间分配。分离后，将水层用额外的EtOAc(400mL)洗涤。将合并的有机相用盐水(400mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下蒸发至干。将得到的泡沫状褐色残余物在高真空下干燥过夜，得到115.9g的粗中间体1-[5-O-(4-甲氧基三苯甲基)-2-脱氧-2-碘-β-D-呋喃核糖基]5-甲基尿嘧啶。将该粗物质(115.9g，181mmol)溶于甲苯(1.5L)中，之后添加DMAP(6.63g，54mmol)和TEA(75mL，543mmol)。将得到的反应混合物在氮气下搅拌10分钟，之后通过加料漏斗滴加氯二甲基乙烯基甲硅烷(75mL，543mmol)。
将反应在室温、氮气下搅拌1小时，然后通过添加MeOH(20mL)淬灭。待将溶液另外搅拌10分钟之后，将混合物蒸发至半固体残余物，然后将其在EtOAc(1600mL)和冷盐水(1800mL)之间分配。分离后，将有机层用额外的冷盐水(1800mL)洗涤。然后将合并的水层用EtOAc(500mL)反萃取。将合并的有机相用冷盐水(1L)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并蒸发至干，得到粗中间体1-[5-O-(4-甲氧基三苯甲基)-2-脱氧-2-碘-3-(二甲基)乙烯基甲硅烷基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]-胸腺嘧啶3(112g)，为棕色泡沫。将该物质用于乙烯基转移反应，生成1-[5-O-(4-甲氧基三苯甲基)-2-脱氧-2-乙烯基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]-胸腺嘧啶4。
向粗产物3(125.7g，173.4mmol)在苯(1.7L)中的溶液中添加2,2′-偶氮双(2-甲基丙腈)(17.09g，104mmol)和六甲基二锡(25.18mL，121.42mmol)。将得到的溶液浸于油浴中，并在回流下搅拌加热2.5h，之后将混合物从热源移除，使其冷却至室温。然后添加另外的2,2′-偶氮双(2-甲基丙腈)(8.55g，52.04mmol)和六甲基二锡(12.59mL，60.71mmol)，并将反应加热回到回流。在搅拌额外的2.5h后，将混合物从热源移除，并在室温下搅拌过夜。然后将反应在真空下浓缩并溶于THF(1.7L)中。将四丁基氟化铵在THF(1M，260.19mL，260.19mmol)中的溶液添加到反应混合物中。待将混合物在室温下搅拌1h之后，蒸发THF以产生260.31g粗反应混合物。将该粗物质通过SiO2色谱法(50/50EtOAc/Et2O)纯化，得到4(23.4g，25％)。ES/MS(M-H)m/z：539。
实施例3
1-[3-O-苄基-2-脱氧-2-乙烯基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸腺嘧啶的合成
在氮气下将化合物4(22.5g，42mmol)溶于THF(140mL)中，在冰浴中冷却至-10℃，之后分份添加氢化钠(60％，分散在矿物油中)(5.0g，125mmol)。将反应混合物搅拌30分钟，之后缓慢滴加苄基溴(4.95mL，42mmol)。在-10℃下继续搅拌1h，之后使反应容器在4℃下保持搅拌18h。采用LCMS(参见下面的谱图)监测反应的进展。然后趁冷将反应混合物用水(5mL，滴加)淬灭，之后添加EtOAc(150mL)和水(150mL)。经相分离后，将水层用EtOAc(100mL)反萃取。将合并的有机相用饱和NaHCO3(200mL)、水(200mL)和盐水(200mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩，得到27.6g粗产物1-[5-O-(4-甲氧基三苯甲基)-3-O-苄基-2-脱氧-2-乙烯基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸腺嘧啶。将该物质直接溶于EtOAc(70mL)中，在冰浴中冷却至0℃，之后添加1M HCl在EtOAc(200mL)中的溶液。待将反应混合物用210mL2M NaOH缓慢中和2h之后，且经相分离之后，将有机层用盐水(200mL)洗涤，干燥并浓缩。将粗产物通过SiO2色谱法纯化(10％-60％ACN/DCM v/v)，得到1-[3-O-苄基-2-脱氧-2-乙烯基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸腺嘧啶5，为白色泡沫(7.75g，53％)。ES/MS(M-H)m/z：357。
实施例4
1-[3-O-苄基-4-C-羟甲基-2-脱氧-2-乙烯基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸腺嘧啶 的合成
将Dess-Martin过碘烷(11.0g，26mmol)在DCM(145mL)中的溶液添加到0℃下的醇5在DCM(145mL)中的溶液中，并将混合物剧烈搅拌2.5h。将反应混合物用DCM(100mL)和4％Na2S2O3水溶液(400mL)稀释，然后搅拌15min。分离后，将水层用DCM(200mL)反萃取，然后将合并的有机相用饱和NaHCO3(400mL)、盐水(400mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干。将得到的白色泡沫溶于1,4-二氧杂环己烷(145mL)中。添加甲醛(37％水溶液)(25mL，325mmol)和氢氧化钠溶液(65mL，2M)，然后将混合物剧烈搅拌15h。添加饱和的NaHCO3(20mL/1.5g的醇5)，搅拌5min之后将悬浮液蒸发至干，用乙腈(150mL)悬浮(在声波处理下)并共蒸发，在甲醇(100mL)中悬浮并在硅胶上蒸发。将残余物上样到薄硅藻土垫上，通过用1L的DCM:MeOH＝7:3过滤来预纯化产物。将产物通过硅胶色谱法纯化(0-15％MeOH/DCM)，得到1-[3-O-苄基-4-C-羟甲基-2-脱氧-2-乙烯基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸腺嘧啶6，为白色泡沫(5,5g，67％)。ES/MS(M-H)m/z：387。
实施例5
1-[4',5'-(1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-3-O-苄基-2-脱氧-2-乙烯基 -β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸腺嘧啶的合成
将二醇6(5.5g，14mmol)溶于无水吡啶(50mL)中，并在N2气氛、室温下滴加1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(6.33mL，20.0mmol)。继续搅拌3h，然后在减压下除去溶剂，并将残余物在EtOAc和饱和NaHCO3之间分配。将水层用EtOAc反萃取，并将合并的有机层用水、盐水洗涤，干燥并蒸发至干。将粗产物通过硅胶色谱法纯化(0-60％EtOAc/己烷v/v)，得到1-[4',5'-(1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-3-O-苄基-2-脱氧-2-乙烯基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸腺嘧啶7，为白色泡沫(7.7g，86％)。ES/MS(M-H)m/z：630。
实施例6
1-[4',5'-(1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-3-O-苄基-2-脱氧-2-羟甲基 -β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸腺嘧啶的合成
将化合物7(2g，3.17mmol)在干CH2Cl2(63mL)中的溶液在干冰/丙酮浴中冷却至-78℃。使含臭氧的空气在冷却的溶液中鼓泡60分钟(压缩空气流速为5SCFH，且O3生产速率为12.5mmol/h或0.6g/h)。然后将溶液添加到冷却的硼氢化钠(0.959g，25.4mmol)在MeOH(63mL)中的混合物(0℃)中，并使其在室温下反应20min。将反应用柠檬酸(2.4g，12.7mmol)淬灭，并在真空中蒸发至干。将粗残余物溶解在EtOAc(60mL)中，并用水(2x60mL)洗涤。将合并的水相用EtOAc(40mL)反萃取，然后将合并的有机层用(60mL)盐水洗涤，随后经Na2SO4干燥，过滤，并蒸发至白色膜。将该粗物质通过硅胶色谱法纯化(20％-80％EtOAc/己烷v/v)，得到化合物1-[4',5'-(1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-3-O-苄基-2-脱氧-2-羟甲基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸腺嘧啶8(1.01g，50％)。ES/MS(M-H)m/z：633。对于8的合成，还获得60％的收率。
实施例7
1-[3-O-苄基-4-C-羟甲基-2-脱氧-2-乙酰氧基甲基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸 腺嘧啶的合成
在氮气气氛下，向8(1.72g，2.72mmol)在干吡啶(30mL)中的溶液中滴加乙酸酐(0.31mL，3.26mmol)。在室温下继续搅拌过夜。在真空中除去溶剂，并将残余物在EtOAc(150mL)和饱和NaHCO3(150mL)之间分配。将水层用额外的EtOAc(100mL)反萃取，并将合并的有机层用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，并蒸发至干。将粗产物通过SiO2柱色谱法纯化(10％-60％EtOAc/己烷v/v)，得到中间体乙酸酯(1.28g，70％)，为白色泡沫。在室温下将纯化的乙酰化的8(1.28g，1.9mmol)溶于TBAF缓冲液(通过将1M AcOH(50mL)在THF中的溶液添加到1M TBAF(50mL)在THF中的溶液中来制备)中。搅拌1h后，减压除去溶剂，并将残余物在SiO2柱色谱法上纯化(0-5％MeOH/DCM)，得到1-[3-O-苄基-4-C-羟甲基-2-脱氧-2-乙酰氧基甲基-β-D-核糖-呋喃戊糖基]胸腺嘧啶9(0.63g，77％)，为灰白色泡沫。ES/MS(M-H)m/z：433。
实施例8
(1R,3R,4R,8S)-1-苯甲酰基氧基甲基-8-苄氧基-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2,6-二氧 杂双环[3,2,1]辛烷的合成
在室温、氮气气氛下向化合物9(0.64g，1.46mmol)在无水吡啶(15mL)中的溶液中滴加甲磺酰氯(0.25mL，3.22mmol)。将混合物在环境温度下搅拌过夜。减压除去溶剂，并将残余物在EtOAc(100mL)和饱和NaHCO3(80mL)之间分配。将水层用EtOAc(60mL)反萃取，并将合并的有机相用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，并浓缩成胶。从乙腈(2x50mL)中共蒸发出粗产物，其无需进一步纯化即可用于下一步骤中。将粗产物二甲磺酸酯溶于二氧杂环己烷/水混合物(15mL)中，并添加2M氢氧化钠(15mL)。在室温下搅拌20min之后，将反应容器转移到油浴中并在60℃下加热1h。减压除去溶剂，并将残余物在EtOAc(100mL)和饱和NaHCO3(80mL)之间分配。将水层用额外的EtOAc(2x40mL)反萃取，之后将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤、经Na2SO4干燥，并蒸发至干。将粗产物用SiO2色谱法纯化(0-10％MeOH在DCM中的溶液v/v)，得到闭环二环中间体(0.59g，89％)，为白色泡沫。将二环中间体(0.715g，1.6mmol)溶于DMF(60mL)中，并添加苯甲酸钠(0.68g，4.7mmol)。将溶液加热至130℃，持续5h，然后冷却至室温过夜。通过过滤移除固体物质，并用DMF充分洗涤。将合并的洗涤液真空浓缩至呈褐色的固体。将该固体物质溶于DCM(100mL)中，并通过过滤移除额外的沉淀物。将分离出的物质通过硅胶色谱法纯化(2％-5％MeOH在DCM中的溶液v/v)，得到(1R,3R,4R,8S)-1-苯甲酰基氧基甲基-8-苄氧基-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷10(0.70g，93％)，为白色泡沫。ES/MS(M-H)m/z：477。
实施例9
(1S,3R,4R,8S)-8-羟基-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶- 基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷的合成
向10(0.43g，0.9mmol)在1:1THF/水(12mL)中的溶液中添加2MNaOH(3mL)。将该浑浊的溶液在室温下搅拌90分钟，之后添加AcOH(0.5mL)。将得到的混合物真空浓缩成固体，并通过硅胶色谱法纯化(5％-10％MeOH/DCM v/v)，得到中间体(1S,3R,4R,8S)-8-苄氧基-1-羟甲基-3-(胸腺嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷(0.29g，77％)，为白色泡沫。将该物质溶于MeOH(8mL)中，之后添加甲酸铵(0.14g，2.3mmol)和Pd(OH)2/C(0.125g)。将悬浮液加热至回流3h，然后冷却至室温。将冷却的溶液通过硅藻土床过滤，然后用额外的MeOH(100mL)充分洗涤。将滤液浓缩成泡沫(0.22g)，并干燥。然后将该粗核苷溶于无水吡啶(15mL)中，并添加DMTrCl(0.34g，1.0mmol)。使溶液在氮气气氛下搅拌过夜，然后真空浓缩成粘稠的物质，将其在EtOAc(60mL)和盐水(100mL)之间分配。将有机层用额外的盐水(100mL)洗涤，然后经Na2SO4干燥。将粗产物通过硅胶色谱法纯化(5％-10％梯度的MeOH/DCM v/v)，得到(1S,3R,4R,8S)-8-羟基-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷11(0.4g，88％)，为白色泡沫。ES/MS(M-H)m/z：585。
实施例10
(1S,3R,4R,8S)-8-羟基-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶- 基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷的合成
在可选的实施方式中，可如下制备(1S,3R,4R,8S)-8-羟基-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷11：
该合成(1S,3R,4R,8S)-8-羟基-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷11的路径可如上所述通过反向闭环实现，由此将被置换的甲磺酸酯安装在2′-位，而非4′位。使用标准条件在2′-羟甲基处使化合物8甲磺酰化。然后用缓冲的TBAF除去TIPS基团，然后将氢氧化钠直接添加到反应混合物中。经加热，2′甲磺酸酯被4′-羟甲基平稳置换，以良好的收率得到化合物16。现在可以容易地将该物质通过氢化和随后的三苯甲基化直接转化成化合物11。该途径大大地增加了11的收率。
实施例11
(1S,3R,4R,8S)-8-苄氧基氧基-1-羟甲基-3-(胸腺嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环 [3,2,1]辛烷
向8(1.0g，1.58mmol)在无水吡啶(30mL)中的溶液中滴加甲磺酰氯(0.16mL，2.05mmol)。将反应在室温、氮气床下搅拌3h。通过添加MeOH(2mL)淬灭反应，然后浓缩至干。将得到的粗物质在EtOAc(80mL)和饱和NaHCO3(80mL)之间分配。将水相用额外的EtOAc(60mL)萃取，并将合并的有机相用水(80mL)、盐水(80mL)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，并真空浓缩。通过SiO2纯化(20％-80％EtOAc/己烷)，得到0.94g中间体甲磺酸酯84％。将该物质溶于19ml0.5M TBAF缓冲液(1M HOAc)中并在室温下搅拌30min。然后将2M氢氧化钠(9mL)添加到反应中，然后加热至60℃保持90min。将反应冷却至室温，然后浓缩至干。将残余物在MeOH(20mL)中悬浮并在SiO2(12g)上干燥。纯化(0-10％MeOH/DCM)得到(1S,3R,4R,8S)-8-苄氧基氧基-1-羟甲基-3-(胸腺嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷16(0.35g，71％)，为白色泡沫。
实施例12
(1S,3R,4R,8S)-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-基)-2,6-二 氧杂双环[3,2,1]辛烷8-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺的合成
在室温、氮气下将化合物11(0.48g，0.82mmol)溶于无水DCM(40mL)中，然后添加二异丙基乙胺(0.86mL，4.91mmol)，然后滴加2-氰基乙基-N,N′-二异丙基氯亚磷酰胺(0.55mL，2.46mmol)。搅拌6h之后，将反应混合物用EtOAc(100mL)稀释，并用饱和NaHCO3(80mL)洗涤。将水相用EtOAc(100mL)反萃取，并将合并的有机相用盐水(150mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将粗产物用SiO2柱色谱法纯化(梯度，含0.5％TEA的66％Hex/EtOAc v/v到含0.5％TEA的66％EtOAc/己烷)，得到(1S,3R,4R,8S)-1-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷8-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰12(0.496g,77％)，为白色泡沫。ES/MS(M-H)m/z：785。
实施例13
(1S,3R,4R,8S)-8-三乙基甲硅烷基氧基-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲 基)-3-(N 4 -胸腺嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷的合成
将化合物11溶于DMF(5mL)中，并添加咪唑(0.24g，3.4mmol)，随后添加TESCl(0.29g，1.7mmol)。将反应在室温、氮气下搅拌5h。然后将混合物用EtOAc(50mL)稀释，并用饱和NaHCO3(40mL)洗涤。将水相用EtOAc(50mL)反萃取，并将合并的有机相用盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将粗产物用SiO2柱色谱法纯化(0-60％EtOAC/己烷v/v)得到(1S,3R,4R,8S)-8-三乙基甲硅烷基氧基-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(N4-胸腺嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷13(0.535，90％)，为无色油。ES/MS(M-H)m/z：699。
实施例14
(1S,3R,4R,8S)-8-三乙基甲硅烷基氧基-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲 基)-3-(N 4 -苯甲酰基5-甲基胞嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷的合成
将1,2,4-三唑(1.77g，25.6mmol)和无水乙腈(50mL)填充到烘干的吹氮烧瓶中。待1,2,4-三唑溶解后，将反应混合物在冰浴中冷却至0℃(三唑被沉淀出来)。滴加POCl3(0.53mL，5.73mmol)，并在0℃下继续搅拌10分钟。然后滴加三乙胺(4.1mL，30mmol)，使浴温保持在0℃，并将反应混合物搅拌另外30分钟。然后缓慢滴加化合物13(0.53，0.76mmol)在乙腈(15mL)中的溶液并搅拌10min。将反应混合物从冰浴取出并在氮气气氛、室温下搅拌4h。然后将混合物浓缩至其体积的约50％，在饱和NaHCO3(50mL)和EtOAc(60mL)之间分配。分离后，将水相用EtOAc(40mL)反萃取，并将合并的有机相用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，经(Na2SO4)干燥，并浓缩成油状残余物。将该残余物溶解于二氧杂环己烷(12.5mL)中，并添加浓氨水(5mL)。将反应混合物在室温下搅拌1h，之后减压除去溶剂。然后将残余物重新溶解于乙腈(2x65mL)中并共蒸发至干。将干燥的物质溶解于DMF(5mL)中，并添加苯甲酸酐(0.26，1.15mmol)。将反应混合物在室温下搅拌21h。将溶液用EtOAc(80mL)稀释，并用饱和NaHCO3(2x60mL)和盐水(60mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，并浓缩。将粗产物溶于THF(7.6mL)中，并添加TBAF(1M，在THF中)(1.15mL，1.15mmol)溶液。15分钟之后，将反应混合物用盐水(60mL)稀释，并将产物用EtOAc(2x50mL)萃取。将粗产物通过SiO2柱色谱法纯化(0-80％EtOAc/己烷v/v)，得到(1S,3R,4R,8S)-8-三乙基甲硅烷基氧基-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(N4-苯甲酰基5-甲基胞嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷14(0.5g，94％)，为白色泡沫。ES/MS(M-H)m/z：688。
实施例15
(1S,3R,4R,8S)-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(N 4 -苯甲酰基5-甲基 胞嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷8-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚 磷酰胺的合成
在室温、氮气下将化合物14(0.5g，0.72mmol)溶于无水DCM(36ml)中，添加二异丙基乙胺(0.75mL，4.33mmol)，随后滴加2-氰基乙基-N,N′-二异丙基氯亚磷酰胺(0.75mL，4.33mmol)。搅拌6h后，将反应混合物用EtOAc(100mL)稀释，并用饱和NaHCO3(80ml)洗涤。将水相用EtOAc(100mL)反萃取，并将合并的有机相用盐水(150mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，并浓缩。将粗产物用SiO2柱色谱法纯化(梯度，含0.5％TEA的66％Hex/EtOAcv/v到含0.5％TEA的66％EtOAc/己烷v/v)，得到(1S,3R,4R,8S)-1-(4,4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(N4-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶-基)-2,6-二氧杂双环[3,2,1]辛烷8-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺15(0.48g,75％)，为白色泡沫。ES/MS(M-H)m/z：889。
实施例16
靶向存活素(BIRC5)的RNA
靶向存活素(BIRC5)的序列特异性RNA示于表1和表2中。表1和表2的序列中的CRN单体被表示为“crnX”，其中X是核苷酸的单字母密码子：A、U、C或G。例如，“crnC”表示胞苷CRN。表1和表2中的CRN基于单体R。正义序列SEQ ID NO：1-10中的每一个分别与反义序列SEQID NO：11-20中的一个相结合，换言之，SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：11相结合，SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：12相结合，依此类推。
表1.靶向存活素的RNA
SEQ ID NO: 正义序列(从左至右是5’至3’)
1 CUGCCUGGCAGCCCUUUCcrnU
2 CcrnUGCCUGGCAGCCCUUUCUUcrnU
3 crnUcrnCUGCCUGGCAGCCCUUUCUUcrnU
4 CcrnUcrnGCCUGGCAGCCCUUUCUUcrnU
5 CUGCCUGGCAGCCCUUUCcrnUUU
6 CcrnUGCCUGGCAGCCCUUUCcrnUUU
7 crnCcrnUGCCUGGCAGCCCUUUCcrnUUU
8 UcrnCcrnUGCCUGGCAGCCCUUUCcrnUUU
9 GACCACCGCAUCUCUAcrnCAcrnU
10 GcrnACCACCGCAUCUCUACAcrnUUcrnU
表2.靶向存活素的RNA
SEQ ID NO: 反义序列(5’至3’)
11 AGAAAGGGCUGCCAGGCAG
12 AGAAAGGGCUGCCAGGCAGUU
13 AGAAAGGGCUGCCAGGCAGUU
14 AGAAAGGGCUGCCAGGCAGUU
15 AGAAAGGGCUGCCAGGCAGUU
16 AGAAAGGGCUGCCAGGCAGUU
17 AGAAAGGGCUGCCAGGCAGUU
18 AGAAAGGGCUGCCAGGCAGUU
19 AUGUAGAGAUGCGGUGGUC
20 AUGUAGAGAUGCGGUGGUCUU
实施例17
靶向PLK的RNA
靶向PLK1的序列特异性RNA示于表3和表4。表3和表4的序列中的CRN单体被表示为“crnX”，其中X是核碱基的单字母密码子：A、U、C或G。例如，“crnC”表示胞嘧啶CRN。表3和表4中的CRN基于单体R。正义序列SEQ ID NO：21-30中的每一个分别与反义序列SEQ ID NO：31-40中的一个相结合，换言之，SEQ ID NO：21与SEQ ID NO：31相结合，SEQ ID NO：22与SEQ ID NO：32相结合，依此类推。“d”指“脱氧”。
表3：靶向PLK1的RNA
SEQ ID NO: 正义序列(5'至3')
21 GAGGUCCUAGUGGACCCACGCAcrnGCC
22 AcrnGGUCCUAGUGGACCCACGCAGCCcrnG
23 crnCcrnCUAGUGGACCCACGCAGCCGGcrnCGcrnG
24 GcrnUcrnGGACCCACGCAGCCGGCGGCGcrnCcrnU
25 CUCCUGGAGCUGCACAAGAGGAGcrnGcrnA
26 CCcrnUGGAGCUGCACAAGAGGAGGAcrnAA
27 crnGGCUGCCAGUACCUGCACCGAAcrnAcrnCC
28 GACCUCAAGCUGGGCAACCUUUUcrnCcrnC
29 GCCUAAAAGAGACCUACCUCCGGAU
30 ACCUACCUCCGGAUCAAGAAGAAUG
表4：靶向PLK1的RNA
SEQ ID NO: 反义序列(5'至3')
31 GGCUGCGUGGGUCCACUAGGACCUCCG
32 CGGCUGCGUGGGUCCACUAGGACCUCC
33 CCGCCGGCUGCGUGGGUCCACUAGGAC
34 AGCGCCGCCGGCUGCGUGGGUCCACUA
35 UCCUCCUCUUGUGCAGCUCCAGGAGAG
36 UUUCCUCCUCUUGUGCAGCUCCAGGAG
37 GGUUUCGGUGCAGGUACUGGCAGCCAA
38 GGAAAAGGUUGCCCAGCUUGAGGUCUC
39 AUCCGGAGGUAGGUCUCUUUUAGGcrnCAA
40 CcrnAUUCUUCUUGAUCCGGAGGUAGGUCcrnU
实施例18
靶向因子VII的RNA
靶向因子VII的序列特异性RNA示于表5和表6。表5和表6中的CRN基于单体R。正义序列SEQ ID NO：41-50中的每一个分别与反义序列SEQID NO：51-60中的一个相结合，换言之，SEQ ID NO：41与SEQ ID NO：51相结合，SEQ ID NO：42与SEQ ID NO：52相结合，依此类推。所示“unaU”是指核碱基为U的羟甲基取代的核单体(解锁核单体UNA)。所示“mU”指经修饰的核苷酸“um”，是2'-O-甲基尿苷。
表5：靶向因子VII的RNA
SEQ ID NO: 正义序列(5'至3')
41 CCAUGUGGAAAAAUACCUAcrnUmU
42 CUGGAUUUCUUACAGUGAUmUcrnU
43 AGUGGCUGCAAAAGCUCAUcrnUcrnU
44 crnGGCAGGUCCUGUUGUUGGUmUmU
45 CcrnCAGGGUCUCCCAGUACAUmUmU
46 crnUcrnCGAGUGGCUGCAAAAGCUmUmU
47 crnGCcrnGGCUGUGAGCAGUACUGmUmU
48 crnAGGAUGAcrnCCAGCUGAUCUGmUmU
49 crnCGAUGCUGACUCCAUGUGUmUmU
50 crnGGCGGUUGUUUAGCUCUCAmUmU
表6：靶向因子VII的RNA
SEQ ID NO: 反义序列(5'至3')
51 UAGGUAUUUUUCCACAUGGmUmU
52 AUCACUGUAAGAAAUCCAGmUmU
53 AUGAGCUUUUGCAGCCACUmUmU
54 ACCAACAACAGGACCUGCCmUmU
55 AUGUACUGGGAGACCCUGGmUmU
56 AGCUUUUGCAGCCACUCGAmUmU
57 CAGUACUGCUCACAGCCGCmUmU
58 CAGAUCAGCUGGUCAUCCUmUmU
59 ACACAUGGAGUCAGCAUCGmUmU
60 UGAGAGCUAAACAACCGCCmUmU
实施例19
靶向ApoB的RNA
靶向ApoB的序列特异性RNA示于表7和表8。表7和表8中的CRN基于单体R。正义序列SEQ ID NO：61-66中的每一个分别与反义序列SEQID NO：67-72中的一个相结合，换言之，SEQ ID NO：61与SEQ ID NO：67相结合，SEQ ID NO：62与SEQ ID NO：68相结合，依此类推。
表7：靶向ApoB的RNA
SEQ ID NO: 正义序列(5'至3')
61 GGACAUUCAGAACAAGAAAUcrnU
62 ACAGAGUCCCUCAAACAGAcrnUU
63 CAUCACACUGAAUACCAAUcrnUcrnU
64 AAGGGAAUCUUAUAUUUGAUCCAcrnAcrnA
65 crnACAGAGUCCCUCAAACAGACAUGAC
66 GcrnUCUCAAAAGGUUUACUAAUAUUCcrnG
表8：靶向ApoB的RNA
SEQ ID NO: 反义序列(5'至3')
67 UUUCUUGUUCUGAAUGUCCUU
68 UCUGUUUGAGGGACUCUGUUU
69 AUUGGUAUUCAGUGUGAUGUU
70 UUUGGAUCAAAUAUAAGAUUCCCUUCU
71 GUCAUGUCUGUUUGAGGGACUCUGUGA
72 CGAAUAUUAGUAAACCUUUUGAGACUG
实施例20
CRN-Antimir-122-8a
通过本发明的方法合成了含有CRN的antimir：CRN-Antimir-122-8a。微RNA-122是显示有肝特异性并参与脂质代谢和可能的丙型肝炎病毒复制的miRNA。微RNA-122调节多种下游mRNA。CRN-Antimir-122-8a是16-mer的寡核苷酸，其与微RNA-122的5'末端互补，能够沉默微RNA-122并使下游靶去抑制。
CRN-Antimir-122-8a的结构如下：
(SEQ ID NO.73)
crnm5CsdCsdAscrnTscrnTsdGscrnTscrnm5CsdAscrnm5CsdAsdCsdTscrnm5Cscrnm5CsdA
其中，核苷酸密码子前的“crn”表示基于单体R的CRN，其中X是O，“s”表示硫代磷酸酯连接，所示crnm5C表示基于单体R的CRN，其中X是O和碱基5-甲基胞苷(m5C)，且核苷酸密码子前的“d”指脱氧核苷酸。
实施例21
含有CRN的Antimir CRN-Antimir-122-8a对小鼠mRNA的去抑制功效
在小鼠模型中证明了CRN-取代的Antimir-122对下游基因ALDOA、SLC7A、P4H4的去抑制。
在8周龄的BALB/c小鼠中对含有CRN的antimir CRN-Antimir-122-8a进行了测试。治疗组(n＝5)按10mg/kg的剂量以Q1dx3的给药时间表(每天给药，连续三天)进行静脉注射。最后一次给药后24小时进行尸检。在研究过程中监测体重和临床症状。获取肝脏和脾脏。CRN-取代的Antimir-122具有良好的耐受性。CRN-Antimir-122-8a治疗的动物的脾脏重量相对于缓冲液对照没有区别，这表明对CRN取代的Antimir没有非特异性免疫应答。
测定的终点是下游基因AldoA(醛缩酶A)、P4H4(脯氨酰4-羟化酶基因)和SLC7A1(溶质运载家族7)的表达。阴性对照是错配的Antimir-122序列。
观察到CRN取代的Antimir-122相对于缓冲液对照具有达2.5倍的肝AldoA mRNA去抑制。在相同条件下，相比于缓冲液对照，未观察到阴性对照的效果。
观察到CRN取代的Antimir-122相对于缓冲液对照具有达1.5倍的肝P4H4mRNA去抑制。在相同条件下，相比于缓冲液对照，未观察到阴性对照的效果。
观察到CRN取代的Antimir-122相对于缓冲液对照具有达1.3倍的肝SLC7A1mRNA去抑制。在相同条件下，相比于缓冲液对照，未观察到阴性对照的效果。
在施用CRN-取代的Antimir-122后，未观察到体重降低。在CRN治疗的小鼠中未观察肝和肾酶的改变。其它血清化学参数在预期的正常水平之内。

Claims (30)

1.一种制备具有式V的化合物的方法，
其中R1是取代基保护基团，R2是取代基保护基团，R1和R2中的一个或两个是大的取代基保护基团，R1和R2任选地连接在一起，R3是保护基团，且B是核碱基或核碱基类似物，所述方法包括提供具有式II的化合物，
通过臭氧分解或氧化转化具有式II的化合物，以及分离具有式V的化合物。
2.权利要求1所述的方法，其中B是尿苷或5-甲基尿苷。
3.权利要求1所述的方法，其中R1和R2是1,1,3,3-四烷基二硅氧烷-1,3-二基基团。
4.权利要求1所述的方法，其中R1和R2是1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷-1,3-二基基团。
5.权利要求1所述的方法，其中R3是苄基。
6.权利要求1所述的方法，其中通过臭氧分解得到具有式V的化合物的收率在具有式V的化合物为至少5克的规模下为至少50％。
7.权利要求1所述的方法，其中通过臭氧分解得到具有式V的化合物的收率在具有式V的化合物为至少10克的规模下为至少50％。
8.权利要求1所述的方法，其中通过臭氧分解得到具有式V的化合物的收率在具有式V的化合物为至少10克的规模下为至少70％。
9.权利要求1所述的方法，其中通过臭氧分解得到具有式V的化合物的收率在具有式V的化合物为至少10克的规模下为至少80％。
10.权利要求1所述的方法，进一步包含通过保护5′-羟基基团将具有式V的化合物转化成具有式VI的构象限制的核单体CRN，
以及用亚磷酰胺取代R3。
11.权利要求10所述的方法，其中用DMTr基团保护5′-羟基。
12.权利要求10所述的方法，其中B被转化为胞苷基、尿苷基或胸苷基。
13.权利要求10所述的方法，其中构象限制的核单体是嘧啶CRN。
14.权利要求13所述的方法，进一步包含将嘧啶CRN通过嘧啶CRN的转糖苷作用转化成嘌呤CRN。
15.权利要求10所述的方法，进一步包含使用CRN制备核酸化合物。
16.权利要求15所述的方法，其中所述核酸化合物是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。
17.权利要求15所述的方法，其中所述核酸化合物是微RNA、antimir、antagomir、微RNA模拟物、微RNA前体、RNA、siRNA、DNA、RNA和DNA、usiRNA、mdRNA、短发夹RNA或shRNA、或反义寡核苷酸。
18.一种制备嘌呤CRN的方法，所述方法包括合成二环糖以及使所述二环糖与甲硅烷基化嘌呤反应。
19.权利要求18所述的方法，其中所述二环糖具有式VI，其中B被烷氧基置换。
20.权利要求18所述的方法，进一步包含使用CRN来制备核酸化合物。
21.权利要求20所述的方法，其中所述核酸化合物是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。
22.权利要求20所述的方法，其中所述核酸化合物是微RNA、antimir、antagomir、微RNA模拟物、微RNA前体、RNA、siRNA、DNA、RNA和DNA、usiRNA、mdRNA、短发夹RNA或shRNA、或反义寡核苷酸。
23.一种CRN，其具有以下结构：
其中R是甲基，R1独立地是H、烷基或保护基团，且R2独立地是H、烷基、保护基团或亚磷酰胺基团。
24.一种CRN，其具有以下结构：
25.一种核酸化合物，其包含权利要求23所述的CRN。
26.一种核酸化合物，其包含权利要求24所述的CRN。
27.权利要求25所述的核酸化合物，其中所述核酸化合物是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。
28.权利要求25所述的核酸化合物，其中所述核酸化合物是微RNA、antimir、antagomir、微RNA模拟物、微RNA前体、RNA、siRNA、DNA、RNA和DNA、usiRNA、mdRNA、短发夹RNA或shRNA、或反义寡核苷酸。
29.权利要求26所述的核酸化合物，其中所述核酸化合物是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。
30.权利要求26所述的核酸化合物，其中所述核酸化合物是微RNA、antimir、antagomir、微RNA模拟物、微RNA前体、RNA、siRNA、DNA、RNA和DNA、usiRNA、mdRNA、短发夹RNA或shRNA、或反义寡核苷酸。
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