CH645726A5

CH645726A5 - Praeparat zur bestimmung von menschlichem immunoglobulin g, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung.

Info

Publication number: CH645726A5
Application number: CH776779A
Authority: CH
Inventors: Tetsuo Tomiyama; Takashi Ogura
Original assignee: Seikagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 1978-08-28
Filing date: 1979-08-27
Publication date: 1984-10-15
Also published as: FR2435040B1; GB2030293B; JPS5530655A; DE2934757A1; FR2435040A1; DE2934757C2; GB2030293A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Präparat zur Bestimmung von menschlichem Immunoglobulin G (im folgenden abgekürzt IgG), ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung. Das Präparat ist geeignet für eine qualitative und quantitative Bestimmung von menschlichem IgG, hat eine verbesserte Lagerfähigkeit und ergibt schnelle zuverlässige Ergebnisse, die gut reproduzierbar sind und eine hohe Genauigkeit aufweisen, ohne dass sie durch andere Proteine, die in der Probe enthalten sind, beeinträchtigt werden, und wobei ein einfaches Messverfahren und ein einfaches Messinstrument verwendet wird.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Präparat zur Bestimmung von menschlichem IgG aus Partikeln von synthetischem polymerem Latex mit einem Überzug von menschlichem IgG-Antikörper. Vorzugsweise bestehen die Partikel aus einem Latex eines synthetischen Polymeren vom Styroltyp ausgewählt aus der Gruppe Styrolpolymer, Styrol-copolymer und carboxylierte oder Aminogruppen enthaltende carboxylierte Derivate derselben.

Menschliches IgG ist ein Protein, das ein Molekulargewicht von etwa 160 000 hat und in einer Konzentration von 1,1-1,7 g/dl im Serum von gesunden Menschen anwesend ist.

Es ist bekanntlich eines der wichtigen Komponenten, die der Hauptfaktor für die humorale Immunität der Lebewesen darstellen.

Da der Gehalt des menschlichen IgG im Blut oder Urin variiert bei Hypogammagloburinemia, Myeloma vom G-Typus, glomerulare Unstimmigkeiten usw., ist die Bestimmung des menschlichen IgG-Gehalts sehr wichtig für die Diagnose. Das menschliche IgG ist ein Protein, das kaum die glomerulare Basismembran durchdringt, wenn jedoch der Grad der Unstimmigkeit an der glomerularen Basismembran grösser wird, geht eine grössere Menge des menschlichen IgG in den Urin über. Daher kann der Grad der Unstimmigkeit der Glomeruli der Niere erkannt werden, beispielsweise durch Bestimmung der Konzentration des menschlichen IgG im Urin. Durch Bestimmung des Verhältnisses von Albumin/ IgG kann dies noch genauer beurteilt werden. Daher ist das Albumin/IgG-Verhältnis eine wichtige Information für die Diagnose der Funktion der Glomeruli der Niere. Wie hieraus hervorgeht, ist die Bestimmung des menschlichen IgG wesentlich für die Diagnose von renalen Erkrankungen, insbesondere Glomerulonephritis, Erkennen des klinischen Verlaufs dieser Erkrankungen, Auswerten der Wirksamkeit von Arzneimitteln und für Prognosen.

Es ist daher sehr wünschenswert ein Verfahren zu entwik-keln, mit dem das menschliche IgG im Serum oder Urin mit hoher Genauigkeit und Verlässlichkeit bestimmt werden kann.

Bisher bekannte Verfahren zur Bestimmung von menschlichem IgG haben sich als nicht zufriedenstellend erwiesen. Ein derartiges bekanntes Verfahren ist beispielsweise das «Einzelradialimmunodiffusion»-Verfahren, bei dem eine mit Vertiefungen versehene Agarplatte, die menschlichen IgG-Antikörper enthält, verwendet wird, wobei die Vertiefungen mit den Proben beschickt werden und die Menge des menschlichen IgG gemessen wird aus der Ausfällungsbande, die erzeugt wird, durch die Diffusion des menschlichen IgG in der Versuchsprobe. Ferner sind elektrophoretische Verfahren auf verschiedenen Unterlagen bekannt und ein Verfahren, bei dem eine Probe ausgesalzen und anschliessend das menschliche IgG nach dem Kieldahl-Verfahren bestimmt wird.

Das «EinzelradiaIimmunodiffusion»-Verfahren besitzt eine niedrige Empfindlichkeit und hat deshalb den Nachteil, dass die Konzentration an menschlichem IgG nur unterhalb einer gewissen Grenze in der Probe bestimmt werden kann. Bei dem elektrophoretischen Verfahren muss die Konzentration des menschlichen IgG oberhalb einer gewissen Grenze liegen, und es sind aufwendige Ausstattungen einschliesslich eines elektrophoretischen Apparates und einer Auswertungseinrichtung erforderlich. Das Kjeldahl-Verfahren hat den Nachteil, dass die Operation kompliziert ist.

Wenn diese bekannten Verfahren angewandt werden, muss insbesondere bei der Bestimmung des menschlichen IgG im Urin dieser 100-1000fach konzentriert werden, weil der Gehalt an menschlichem IgG im Urin sehr niedrig ist. Dies erfordert einen hohen Arbeits- und Zeitaufwand.

Bei einem weiteren Verfahren wird eine umgekehrte passive Hemagglutinationsreaktion (RPHA) verwendet zur Bestimmung von IgG, die hinsichtlich der Empfindlichkeit gleich ist dem Radioimmunoassayverfahren. Da bei diesem Verfahren rote Blutzellen von Tieren als Träger verwendet werden, hat sie den Nachteil, dass bei der Herstellung von Antikörper sensibilisierten roten Blutzellen eine Vorbehandlung der roten Blutzellen, wie Fixierung der roten Blutzellen und Behandlung der roten Blutzellen mit Bindemitteln wie Glutaraldehyd oder Tanninsäure, notwendig sind. Da bei den tatsächlichen Messungen bei den als Antikörper für die roten Blutzellen verwendeten Träger nicht spezifische Reaktionen auftreten, ist es notwendig eine Absoptionsbehandlung mit

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den roten Blutzellen durchzuführen sowie ein Kontrollverfahren unter Verwendung von Zellen, die mit Tanninsäure behandelt sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die vorstehend genannten Nachteile zu vermeiden und ein Verfahren zur Bestimmung von menschlichen IgG unter Verwendung einer einfachen Vorrichtung und einer einfachen Messoperation, bei der zuverlässige Ergebnisse mit hoher Genauigkeit erhalten werden, zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind das im Anspruch 1 beschriebene Präparat, das im Anspruch 8 beschriebene Verfahren zur Bestimmung von IgG und das im Anspruch 10 dargelegte Verfahren zur Herstellung des Präparates.

Das erfindungsgemässe Präparat hat ferner eine überlegene Lagerbeständigkeit und die Messung wird nicht beeinträchtigt durch andere Proteine, die in der Probe enthalten sein können. Wie ferner gefunden wurde, kann das genannte Präparat einfach hergestellt werden und nicht nur in Form eines Latex, sondern auch als Trockenprodukt gelagert werden.

Menschliches IgG ist eine Hauptkomponente eines Serumproteins und wird auch im Urin gefunden. Das Ausgangsprodukt des menschlichen IgG, das verwendet wird zur Herstellung von menschlichen IgG-Antikörper gemäss dem Präparat der Erfindung kann hergestellt werden nach an sich bekannten Verfahren. Beispielsweise kann es erhalten werden in gereinigter Form nach einem Verfahren, bei dem eine Äthanolfraktion aus dem menschlichen Serum behandelt wird mit Trichloressigsäure, Ammoniumsulfat sowie Ionen-austauschchromatographie. Es kann auch im Handel verfügbares menschliches IgG verwendet werden.

Ein Antikörper des menschlichen IgG, der erhalten werden kann durch Anwendung der vorstehend erwähnten Verfahren, kann hergestellt werden durch Verabreichen des IgG als Antigen an Tiere, die die Fähigkeit besitzen, Antikörper zu bilden, wie beispielsweise Meerschweinchen, Kaninchen oder Ziegen, wobei übliche Verfahren zur Immunisierung angewandt werden und das Blut der immunisierten Tiere entnommen und der Antikörper des menschlichen IgG aus dem erhaltenen Blut abgetrennt wird.

Bei diesem Verfahren kann ein beliebiges Tier, das die Fähigkeit zur Produktion von Antikörper hat, verwendet werden. Um jedoch eine grosse Menge an Antikörper zu erhalten, wird die Verwendung von grossen Tieren bevorzugt. Im allgemeinen sind Kaninchen oder Ziegen gut geeignet. Die Abtrennung des menschlichen IgG-Antikörpers aus dem Antiserum kann nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise wird das Antiserum ausgesalzen und eine Adsorptionseluierung unter Verwendung eines unlöslichen Antigens wird wiederholt.

Für das erfindungsgemässe Präparat können verschiedene synthetische Latexpartikel verwendet werden, z.B. Polymere oder Copolymere, die einen solchen Latex bilden, z.B. Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol, Aminogruppen enthaltendes carboxyliertes Polystyrol, Polyvinyltoluol, Styrol-Butandien-copolymer, carboxyliertes Styrol-Butadiencopolymer, Styrol-Divinylbenzolcopolymer, Vinyltoluol-tert.-Butylstyrol-copolymer, Polyester, Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polyacrylonitril, Acrylnitril-Butadien-Styrolcopolymer, Polyvinylacetat-acrylat, Polyvinylpryrrolidon und Vinylchlorid-acrylatcopolymer.

Bevorzugt werden Partikel aus einem Latex eines Polymeren vom Styroltypus, ausgewählt aus der Gruppe von Styrol-polymer, Styrolcopolymer, wie ein Copolymeres von Styrol mit beispielsweise Chlorstyrol, Methylmethacrylat und Viny-Iidenchlorid, und carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Derivaten derselben. Diese Partikel au.«

synthetischem polymerem Latex können verwendet werden nach einer Vorbehandlung der Oberfläche mit einem nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittel. Vorzugsweise wird ein nichtionogenes oberflächenaktives Mittel vom Typus Äthylenoxid auf der Oberfläche dieser Partikel adsorbiert nach dem Verfahren, das beschrieben ist in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 9716/76 (26. Januar 1976). Beispiele von geeigneten nichtionogenen oberflächenaktiven Mitteln vom Äthylenoxidtyp sind Blockcopolymere von Äthylenoxid und Polyoxypropylenglykol, Polyoxäthylen-alkyläther und Polyoxyäthylenalkylaryläther.

Die erfindungsgemässen Latexpartikel haben vorzugsweise einen durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 0,01-10, insbesondere 0,1-1 Jim. Um die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse zu erhöhen, wird es bevorzugt, Partikel zu verwenden, die hinsichtlich ihrer Teilchengrösse in einem relativ engen Bereich liegen. Das spezifische Gewicht der Latexpartikel beträgt vorzugsweise 0,9-1,4, insbesondere 1,1-1,3 um. Bei einer Messung unter Verwendung einer Agglutina-tionsreaktion auf einer gleitenden Glasplatte können Latexpartikel verwendet werden, deren spezifisches Gewicht in einem weiten Bereiche liegt. Bei der Anwendung der Mikroti-termethode werden vorzugsweise Latexpartikel verwendet, die ein spezifisches Gewicht von mindestens 1,1 haben.

Das erfindungsgemässe Präparat zur Bestimmung des menschliche IgG kann in einfacher Weise hergestellt werden. Erfindungsgemäss wird ein synthetischer polymerer Latex in einer Konzentration von 0,05-5% mit menschlichen Latex-Antikörper in einer Konzentration von 0,0001-1% in einem Puffer in einem pH-Bereich von 5-10, insbesondere 6,5-8 bei einer Temperatur von 4-40 °C zusammengebracht werden. Die Vereinigung der Komponenten kann beispielsweise durchgeführt werden durch mässiges Rühren während 30 min bis etwa 24 h.

Der Puffer kann beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung (M/60 Phosphatpuffer pH 7,2) sein, enthaltend 0,15 M NaCl (abgekürzt als PBS) und eine Glycin-gepufferte Salzlösung. Um eine nicht spezifische Agglutination zu verhindern, kann gewünschtenfalls 0,001-0,1% eines Proteins zu einer Antikörperlösung zugefügt werden. Nach dem Überziehen der Partikel werden diese mehrere Male gewaschen durch Zentrifugieren in einer neutralen Salzlösung wie in einer Gly-cin-gepufferten Salzlösung oder PBS. Schliesslich können die mit dem IgG-Antikörper überzogenen Partikeln in Form einer Suspension in einem Verdünnungsmittel aufbewahrt werden. Das Verdünnungsmittel ist vorzugsweise eine Mischung, die erhalten wird durch Zugabe von 0,1% BSA zu einer gepufferten Salzlösung oder zu PBS. Bevorzugt wird ferner zu dem Verdünnungsmittel 0,01-0,5% Natriumazid (NaN.i) zugegeben.

Das erfindungsgemässe Präparat zur Bestimmung von menschlichem IgG kann, wie vorstehend beschrieben, in Form eines Latex vorliegen, jedoch auch in Form eines getrockneten Produktes. Das Trockenprodukt kann erhalten werden durch Zugabe eines Stabilisators wie einer Aminosäure (z.B. Glycin oder Natriumglutamat) oder Dextran zu dem oben genannten Verdünnungsmittel, Suspendieren des mit menschlichem IgG-Antikörper überzogenen Latex in dem Verdünnungsmittel und Lyophilisieren der Suspension. Die anzufindenden Mengen der Aminosäure und des Dextrans liegen bei etwa 1,2-4 bzw. 1,6-6 Gewichtsteilen pro Gewichtsteil der Latexpartikel.

Das erfindungsgemässe Präparat zur Bestimmung des menschlichen IgG hat sowohl in Form eines Latex als auch als Trockenprodukt eine gute Stabilität. Das Trockenprodukt kann über längere Zeit räumegelagert werden beispielsweise mehrere Jahre.

Gemäss der Erfindung wird ferner ein Verfahren vorge5

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schlagen zur Bestimmung von menschlichem IgG, wobei dieses qualitativ oder quantitativ bestimmt wird im menschlichen Urin oder Serum unter Verwendung des vorgenannten erfindungsgemässen Präparates.

Für die Bestimmung können an sich bekannte Verfahren angewandt werden, beispielsweise die Bestimmung von IgG im Serum oder Urin nach dem Mikrotiterverfahren. Gemäss diesem Verfahren wird eine bestimmte Menge eines Verdünnungsmittels, wie dies vorstehend erwähnt wurde, portionenweise auf eine Mikroplatte gegeben und dann eine bestimmte Menge der zu untersuchenden Probe wie Serum oder Urin in die Vertiefung der Platte gegeben, und aufeinander folgend mit einem Verdünnungsmittel behandelt. Andererseits kann eine Verdünnungsserie in derselben Weise hergestellt werden unter Verwendung eines Standardantigens. Dann wird eine bestimmte Menge eines mit menschlichem IgG-Antikörper sensitiviertes Latex zugefügt und gemischt. Nachdem eine gewisse Zeit bei Zimmertemperatur stehengelassen wurde, wird der Endpunkt der Agglutination festgestellt, und die absolute Menge des IgG kann bestimmt werden durch Vergleich mit der Reihe des Standardantigens.

Nach einer anderen Ausführungsform der Messung gemäss der Erfindung wird eine gewisse Menge einer Probe auf eine gleitende Glasplatte getropft und ungetrennt eine bestimmte Menge einer Lösung eines menschlichen IgG bekannter Konzentration tropfenweise zugefügt. Eine bestimmte Menge des mit menschlichem IgG-Antikörper sen-sitivierten Latex wird zu allen Proben zugegeben und anschliessend einer mässigen Oszillation unterworfen. Durch Auswerten des erhaltenen Agglutinationsverhaltens kann die Konzentration des menschlichen IgG in der Probe qualitativ innerhalb weniger Minuten bestimmt werden.

Das erfindungsgemässe Präparat zur Messung des menschlichen IgG in Form eines Latex oder eines Trockenproduktes ist überlegen gegenüber Präparaten, die erhalten werden durch Aufbringen von menschlichen IgG auf rote Blutzellen oder einen anderen Träger, weil der Träger selbst keine Antigenizität aufweist, und keine nichtspezifische Reaktionen ausser den erwünschten Antigenantikörperreak-tionen stattfinden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass menschlicher IgG-Antikörper direkt und in einfacher Weise auf einen Latex aufgebracht werden kann durch Eintauchen einer Antikörperlösung in den Latex ohne Verwendung eines Binders und dass das Produkt eine ausgezeichnete Lagerbeständigkeit aufweist.

Das Verfahren zur Bestimmung von IgG unter Verwendung von Latex der mit menschlichem IgG-Antikörper sensibilisiert ist, erlaubte die Messung von mehr als 1 [i.g (1 x 10~9g) IgG pro ml, und es kann eine gleiche oder höhere Empfindlichkeit erreicht werden als bei dem Radioimmunoassayver-fahren, das als dasjenige Verfahren betrachtet wird, das die höchste Sensibilität aufweist.

Da das erfmdgungsgemässe Präparat nicht mit anderen Proteinen ausser menschlichem IgG reagiert und der unsensi-bilisierte Latex überhaupt nicht mit IgG reagiert, kann gesagt werden, dass der menschliche IgG-Antikörper an den Latex gebunden ist.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung im einzelnen.

Beispiel A

Herstellung von menschlichem IgG-Antikörper

Menschliches IgG hergestellt von Miles Laboratories Inc., USA, wurde als Antigen verwendet. Es wurde gelöst in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 4 mg pro ml. Die Lösung wurde gemischt mit einer gleichen Menge von «vollständigem Freund's»-Adjuvans. Die Mischung wurde intramuskulär injiziert in einer Menge von 0,2 ml bis 5

Teile bei vier gesunden Kaninchen im Gewicht von 2,0-2,5 kg und 3 Wochen später wurde die Injektion in derselben Weise wiederholt. Nach 2 Wochen wurden 1 ml einer 0,2%igen menschlichen IgG-Salzlösung intravenös injiziert. 3 Wochen nach der letzten Injektion wurde das gesamte Blut aus der Karotidenarterie der Kaninchen entnommen und in üblicherweise zentrifugiert. Das erhaltene Antiserum wurde 30 min bei 56 °C gehalten, wobei 20 ml Antiserum erhalten wurden. Das erhaltene Antiserum bildet eine einzelne Bande mit einem Antigen gemäss dem Ouchtalony-Verfahren und gemäss Immunoelektrophorese und hieraus folgt, dass es sich um einen einzigen Antikörper handelt.

Beispiel B

Herstellung von unlöslichem menschlichem IgG

250 mg menschliches IgG wurde gelöst in 5 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,0) und 2,5% Glutaraldehyd wurde unter Rühren tropfenweise zu der IgG-Lösung zugegeben bis sich ein gelbliches Gel bildete. Die Mischung wurde bei Zimmertemperatur 3 h stehengelassen. Die Ausfällung wurde abgetrennt, homogenisiert, mit PBS und dann mit einem Gly-cin-Salzsäurepuffer (pH 2,8) und dann wider mit PBS gewaschen und dann unterhalb — 20 °C aufbewahrt.

Beispiel C

Reinigung von menschlichem IgG-Antikörper

Es wurde eine gleiche Menge einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung zu dem Antiserum zugefügt und gut gemischt. Die Mischung wurde 30 min bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die erhaltene Ausfällung wurde durch Zentrifuge abgetrennt, gewaschen mit 0,5 gesättigter Ammoniumsulfatlösung und dann gegenüber PBS dialysiert. Dann wurde zu dem Dialysat ein unlösliches menschliches IgG zugefügt und die Mischung 30 min bei Zimmertemperatur stehengelassen, zentrifugiert, wobei eine überstehende Flüssigkeit und einer Ausfällung erhalten wurden. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde nochmals unlösliches menschliches IgG zugefügt und die Mischung dann in derselben Weise behandelt. Die beiden Ausfällungen wurden kombiniert und mit PBS gewaschen. Dann wurde ein Glycin-Salzsäurepuffer (pH 2,8) zugefügt. Die Mischung wurde 5 min geschüttelt und durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Ausfällung wurde wieder behandelt mit dem Glycin-Salzsäurepuffer. Die erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten wurden kombiniert und dialysiert gegenüber PBS, wobei gereinigte Antikörper erhalten wurde.

Ausführungsbeispiel I

Herstellung von Latex, sensibilisiert mit menschlichem IgG-Antikörper

Polystyrollatex (ein Produkt von Takeda Chemical Indu-stry Co., Ltd., SDL 59, spezifisches Gewicht 1,14, Partikeldurchmesser 0,9 Mikron) wurde verdünnt mit PBS, so dass die Konzentration der Partikel 0,25% betrug und dann eine gleiche Menge eines gereinigten Antikörpers 60fach verdünnt mit PBS zugefügt. Die Mischung wurde 2 h auf 37° C gehalten und dann zentrifugiert. Die Latexpartikel wurden abgetrennt, gewaschen mit PBS und dann mit einem Verdünnungsmittel. Dann wurden die Latexpartikel suspendiert in einer Konzentration von 0,25% unter Verwendung eines Verdünnungsmittels, wobei sich ein Latex, sensibilisiert mit menschlichem IgG-Antikörper bildete.

Wenn eine Lösung menschliches IgG zu dem sensibilisierten Latex zugefügt wird, erfolgt Agglutination. Jedoch erfolgt keine Agglutination, wenn Albumin, ßi-Mikroglobulin, Immi-noglobulin M und Imminoglobulin A zugefügt werden.

Das verwendete Verdünnungsmittel enthielt 0,07% BSA und 0,1% Natriumazid.

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Ausführungsbeispiel 2 Bestimmung von menschlichem IgG

Ein Verdünnungsmittel in einer Menge von 0,025 ml wurde in die Vertiefungen einer Mikroplatte vom V-Typus eingegeben und 0,025 ml Serum oder Urin verdünnt, mit einem geeigneten Verdünnungsmittel zu der ersten Probe zugefügt und fortlaufend weiter verdünnt mit einem Verdünnungsmittel gemäss einem reihenweise zweifachen Verdünnungsverfahren. Andererseits wurden 0,025 ml einer Standardlösung enthaltend 0,1 (ig menschliches IgG pro ml zu der ersten Probe einer anderen Reihe zugefügt und in derselben Weise verdünnt. Dann wurden 0,025 ml des Latex sensibilisiert mit dem menschlichen IgG-Antikörper in die Vertiefungen gegeben und nach ausreichendem Mischen bei Zimmertemperatur mehr als 10 h stehengelassen, wobei der Endpunkt der Agglutination beobachtet wurde. Wenn eine Antigenanti-körperreaktion stattfand, wurden die Latexpartikel auf der gesamten Oberfläche der Probeflüssigkeit dispergiert. Wenn keine Antigenantikörperreaktion erfolgte, sammelten sich die Latexpartikel in der Mitte jeder Probe. Auf diese Weise konnte der Endpunkt der Agglutination ermittelt werdèn.

Gemäss den vorstehenden Verfahren wurde die Menge IgG gemessen bei sechs Beispielen eines lOOfach verdünnten Urins. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Bestimmung der Latexagglutination

Nr.

1

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Konzentration

Standard-IgG-Konzentration (ug/m)

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12,5

6,25

3,12

1,56

0,78

0,39

in der Probe

Agglutination

+

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(mg/1)

Gesunder Erwachsener 32 Jahre männlich

+

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2

Gesunder Erwachsener 43 Jahre männlich

+

—

4

Gesunder Erwachsener 22 Jahre männlich

+

—

2

Neurotischer Patient 47 Jahre männlich

+

über 32

Patient mit SLE 32 Jahre weiblich

+

—

16

Patient mit Glomerulonephritis 53 Jahre männl.

+

+ ■

+

-

16

+ : positiv, — : negativ

Ausführungsbeispiel 3

Bestimmung von menschlichem IgG durch «Gleitaggregation»

Polystyrollatex (ein Produkt von Dow Chemical, Partikeldurchmesser 0,22 ±0,006 Mikron, spezifisches Gewicht 1,05) wurde verdünnt mit 1% Glycin-Natriumchloridpuffer (pH 8,4) und eine gleiche Menge eines gereinigten Antikörpers zugefügt. Die Mischung wurde über Nacht bei 4°C stehengelassen und dann zur Abtrennung des Latex zentrifugiert. Der Latex wurde gewaschen einmal mit einem Glycin-Natriumchloridpuffer und dann suspendiert auf eine Konzentration von 1% in einem Glycin-Natriumchloridpuffer, enthaltend 1% BSA, wobei sich der sensibilisierte Latex bildete.

50 jj.1 einer Lösung eines menschlichen IgG in einer Konzentration von 400,200,100, 50 und 25 ng/ml wurden tropfenweise getrennt auf ein Gleitglas gegeben. Dann wurden 50 jj.1 des erhaltenen sensibilisierten Latex tropfenweise am oberen Rand zugegeben und die Reaktion unter mässigem Rühren einige Minuten beobachtet. Wenn die Konzentration des menschlichen IgG 400,200 oder 100 ng/ml betrug, trat eine Agglutination auf, jedoch erfolgte keine Agglutination bei einer Konzentration von 50 und 25 ng/ml.

Nach dem obigen Verfahren wurde der Gehalt an menschlichem IgG bestimmt in 6 Beispielen eines lOfach verdünnten Urins. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2 Agglutination des Latex

Probe

Agglutination

Konzentration in der Probe

Urin lOfach verdünnt Gesunder Erwachsener 32 Jahre männlich Gesunder Erwachsener 43 Jahre männlich weniger als 5 dito

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Tabelle 2 Agglutination des Latex

Probe

35

Agglutination

Konzentration in der Probe

Gesunder Erwachsener 22 Jahre männlich Neurotischer Patient 47 Jahre männlich Patient mit SLE 32 Jahre weiblich Patient mit Glomerulonephritis 55 Jahre männlich Kontrolle

Standard-IgG-Konzentration Agglutination dito mindestens 10

dito dito

10 + +

5 +

0,5 ±

0,1

Ausführungsbeispiel 4

Durch Behandlung in derselben Weise, wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, wurde ein Latex sensibilisiert, gewaschen und suspendiert in einem Verdünnungsmittel enthaltend 0,5% Glycin und 0,7% Dextran T-10 (ein Produkt von Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Schweden), so dass die Konzentration der Latexpartikel 1,25% betrug. Die Suspension wurde dann in üblicher Weise lyophilisiert, wobei ein Präparat von Latexpartikeln sensibilisiert mit menschlichem IgG-Antikörper erhalten wurde.

Ausführungsbeispiel 5

Ein Verdünnungsmittel wurde zugefügt zu einem Präparat aus Latexpartikeln, die gegenüber menschlichem IgG-Antikörper sensibilisiert wurden gemäss Ausführungsbeispiel 4. Dann wurde in derselben Weise wie in Beispiel 2 beschrieben die Menge des IgG im Serum und im Urin bestimmt. Es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.

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Wie aus den vorstehenden Ergebnissen klar hervorgeht, ist die Menge des IgG in dem Urin von Patienten, die von verschiedenen Erkrankungen befallen sind deutlich höher als diejenige im Urin von gesunden Erwachsenen. Daher ist die Bestimmung der Menge des IgG im Urin ein sehr wertvolles Mittel zur Diagnose dieser Erkrankungen.

Ferner wurde die Menge von IgG im Urin von Menschen gemessen durch Verwendung eines Latex, sensibilisiert mit menschlichem IgG-Antikörper hergestellt aus dem Antiserum einer Ziege, in derselben Weise wie im Ausführungsbeispiel 3 und den anschliessenden Ausführungsbeispielen beschrieben. Die Ergebnisse waren weitgehend dieselben wie in den vorstehenden Tabellen.

Durch Anwendung des erfindungsgemässen Präparates aus einem mit menschlichem IgG-Antikörper sensibilisierten

Latex kann die Menge IgG in kurzer Zeit ermittelt werden, wenn die Probe (menschliches Serum oder Urin) in sehr kleiner Menge von weniger als 0,03 ml vorliegt. Die Empfindlichkeit ist sehr hoch, und es kann 1 ng IgG pro ml der Probe pro 5 ml gemessen werden. Daher liefert das erfindungsgemässe Präparat wertvolle Informationen für die Diagnose von Hypogammagloburinemia, Myeloma vom G-Typus, glomeru-lare Unstimmigkeiten und andere verschiedene Erkrankungen und sein Anwendungsbereich ist sehr weit. Bei der Be-10 Stimmung von IgG im Urin war es nach den bisher bekannten Verfahren notwendig gewesen, den Urin zu konzentrieren. Mit dem erfindungsgemässen Präparat ist es möglich, den Urin ohne Konzentrierung zu verwenden. Daher ist das erfindungsgemässe Präparat besonders geeignet zur Bestimmung 15 von IgG im Urin.

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Claims

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1. Präparat zur Bestimmung von menschlichem Immunoglobulin G aus Partikeln von synthetischem polymerem Latex mit einem Überzug von menschlichem Immunoglobulin-G-Antikörper.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,01-10 um haben.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Latexpartikel ein spezifisches Gewicht von 0,9-1,4 haben.

4. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem als Stabilisator eine Aminosäure oder Dextran enthalten.

5. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Latexpartikel solche vom Styroltypus sind, ausgewählt aus der Gruppe von Styrolpolymeren, Styrolcopolyme-ren und carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden car-boxylierten Derivaten derselben.

6. Präparat nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines Latex vorliegt.

7. Präparat nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines getrockneten Latex vorliegt.

8. Verfahren zur Bestimmung von menschlichem Immunoglobulin G, dadurch gekennzeichnet, dass in menschlichem Urin oder Serum eine qualitative oder quantitative Bestimmung vorgenommen wird unter Verwendung eines Präparats aus Partikeln von polymerem synthetischem Latex mit einem Überzug von Immunoglobulin-G-Antikörper.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung nach der Mikrotitermethode durchgeführt wird.

10. Verfahren zur Herstellung eines Präparats zur Bestimmung von menschlichem Immunoglobulin G aus Partikeln von synthetischem polymerem Latex mit einem Überzug von menschlichem Immunoglobulin-G-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass ein polymerer synthetischer Latex in einer Konzentration von 0,05-5% in Kontakt gebracht wird mit einem menschlichen Immunoglobulin-G-Antikörper in einer Konzentration von 0,0001-1% in einem Puffer bei einem pH von 5-10 und bei einer Temperatur von 4-40 °C.