JPS59193356A - 全ＩｇＥ濃度の螢光光度分析及びそのための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は１９８３年３月１７日出願の特許願第４７６４
５１号、１９８３年１月３１日出願の特許願第４６２５
８５号、１９８２年１１月２６日出願の特許願第４４４
．６２２号及び１９８２年１０月１３日出願の特許願第
４３４０６１号の部分的継続である。

本発明は、血清中の全ＩｇＥｔｆｆ１度を測定するため
にアレルギー性症候群を示す患者の血清を分析するため
の方法及び試薬に関するものである。特に、本発明は向
上した速度と正確性のもとて全ＩＣＩＥＩ’１度を測定
するための方法及び試薬に関するものであって、その結
果は、アレルギー性疾患の鑑定及び個人が感性であると
思われる異なるアレルゲンの同定において、高い信頼度
で使用することができる。

患者の血清中のアレルギー特異性ＩｇＥ濃度を識別し且
つ定量するための放射分析法及び螢光光度法は商槃的に
行なわれており、たとえばＲＡＳ丁試鹸どして公知であ
る。米国特許第ＲＥ−２９／１７４月：３５５５１４３
＠；３６４８３４６＠；３７２０７６０号及び３９６６
８９８号は、これらの方ｄ１及びそのための試薬に門す
るものである。

液体中の抗原及び抗体を識別し且つ定量するための酵素
的免疫学的方法も広く用いられており、たとえば、ＩＥ
　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ及びＥｆＡとして公知である。

酵素的分析法に対する基礎技術及びそれに対する試薬は
、たとえば、米国特許ＲＥ−２９１６９号：３６５４０
９０号；３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８６
７５１７＠、４０１６０４３号及び４０９８８７６号に
開示されている。たとえばＰＨＡＤＥＢＡＳ　　□ＩＩ
ＩＥ　　ＰＲＩＳ工■標識免疫検定試験（ファーマシア
）及びＴＡＮＤＥＭ標識免疫検、定試験（ハイブリチッ
ク〉が公知である。米国特許第４３７６１１０号は、抗
原が同一の２結合部位を有している場合には単一クロー
ンからの単クローン性抗体を、あるいは抗原が同一でな
い２結合部位を有している場合には２クローンからの非
混合単クローン性抗体を使用する２部位サンドインチ方
法に関するものである。

溶液中の蛋白質の検出のための免疫検定に関する技術の
環状についての論説は、Ｒ，ローゼ（Ｒｏｓｅ）ら、“
臨床免疫学便覧″、第２版、アメリカ微生物学協会、ワ
シン１ヘン、３２７〜４２９頁、７７５〜８４．９頁（
１９８０＞及びＡ、、にラー（ｏｔｔｅｒ）ら、″８ｏ
８Ｇの免疫検定法″ユニバージティーバークブレス、ボ
ルチモア（１９８１）、並びにそれらの中の引用文献中
に与えられてＪ３す、これら両出版物の全内容をここに
参考として包含ぜしめる。Ｔ、Ａ、Ｅ、ブラッッーミル
ス（Ｐ　ｌａｔｔｓ−Ｍ　ｉ　ｌ　Ｉｓ）らによるその
中の章、パアレルギーパにａ５ける識識免疫検定法”２
８９〜・３１１頁及びその中の引用文献は、本発明の分
野についての総説を提供する。

不溶性担体に対して蛋白質を結合させるための方法が主
として記されている。米国特許第３５５１５　ｂ　ｂ　
Ｆｒ、３５５３３１０８、’ｔｏ／１８２９８号及び［
（ビー２９４７／Ｉ号中に記すように、抗体もまた不溶
性担体に対して共有結合させることができる。吸着によ
るポリスチレンへの抗体の結合は、たとえは、米国特許
第３６４６３−４６号及び７Ｉ０９２／１０８号に記さ
れ−（イル、米国特許第３７２０７６０ｊ；＝４に記す
ように、ｊ７レルケンは種々の不溶＋４１：　ｔ−ｒ；
体に対し］で共有結合さイ１いる。

Ａ、ボールソン（Ｐｏｌｓｏｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂ　１ｏｐｌｒｙｓ、Ａ　ｃｔａＪ　８２　巻、’１６
３−４１５頁（１９６４）及びＡ、ボールソンら、Ｖｏ
ｘ３ａｎｇ、第２３巻、　１０７〜１１８頁　（１９７
２）によって記されているように、ポリエチレングリコ
ールが蛋白質分画方法において用いられている。

本発明は患者の血清中の全ＩＱ　Ｅ１度を定員するため
の方法に関するものである。本発明は先ず抗１ｇＥ抗体
が付着させである不溶性担体を、抗ＩｇＥ抗体の患者の
血清中のＪｇＥとの抱合を許すに充分な時間にわたり患
者の血清と接触させる段階を包含する。次いて担体から
患者の血清を取り除く。第二に、不溶性担体に結合した
血清１ｇＥの酵素標識付けした抗ＩｇＥ抗体との抱合を
許すに充分な時間にわたって、不溶性担体を酵素標識付
（プした抗１ｇＥ抗体と接触させる。本発明において用
いる場合のフルオロゲン性酵素とは、それによって適当
な基質が化学的な反応を受けて螢光性の生成物を生成す
るような酵素と定義する。

次いで未抱合の酵素標識付は抗１ｇＥ抗体を担体から取
り除く。第三に、不溶性の担体をフルオロゲン性酵索が
存在する場合に化学反応を受（〕て螢光性の生成物を与
える基質の溶液と接触させるが、その接触は螢光生成物
を与えるために充分な時間にわたって継続づ“る。次い
で溶液中の螢光の強度を測定する。

本発明の不溶性抗１ｑＥ抗体試薬においては、抗ＩＧＥ
抗体は共有結合によっＣ又はたとえば吸収あるいは吸着
によるような非共有結合によって不溶性担体に対して付
着させることができる。不溶性担体に対して付着ざぜる
抗１すＥ抗体は、抗ＩｇＥ抗体を結合させるべき不溶性
担体の表面を乾燥前に多糖及び動物蛋白質の水溶液によ
って処理することにより調製した多糖−動物蛋白質複合
体を用いて安定化することが好ましい。抗ＩＣＥ抗体は
非共有結合によって不溶性担体に付着させることか好ま
しい。

本発明のいくつかの好適実施形態においては、不溶性担
体は不透明物質によって分離させた複数の試験区画を有
し、酵素はアルカリ性ボスファターゼであり、酵素標識
付は抗１ｇＥは１〜８重量バーセン１への１０００〜１
００００の分子量を有するポリエチレングリコールと非
イオン界面活性剤を含有する水溶液中で不溶性担体と接
触させ、且つ基質は燐ｍ４−メチルウンベリフェリルで
ある。不溶性担体に対して付着させ且つ／又は酵素に結
合させる抗Ｉ（ＩＥ抗体は親和力クロマトグラフィーで
精製した多クローン性抗体、単クローン性抗体又は好ま
しくは複数の異なるクローンからの異なる単クローン性
抗体の混合物である多クローン性抗体とすることができ
る。

アレルギー反応の有効な治療に対する鍵は、障りとなる
アレルゲン又はアレルゲン類の正確な識別と脱感作投与
量を決定づ゛るための患者の滴定である。一般に、還元
したアレルゲン抽出物を抗原特異性１（ＩＧ（ブロッキ
ング抗体）の顕著な生産並びにザブレツサＴリンパ球の
顕著な生産及び、／又は活性化を生じさせるために充分
な量で注射する。しかしながら、そのｍは顕著なアレル
ギー反応を生しさせるに足るものであってはならない。

抗原特異性１ｏＥを増大した濃度で生産する１こめには
、ｌｑＧ及びザプレツサＩｑＥ生産は、アレルギー反応
を妨げるような釣合いにあることが肝要である。

脱感作投薬の濃度と巾は、アレルギー反応を受ける患者
に特異的な多くの要因に依存する。それ故、適当な投与
量を決定するために患者を滴定することが必要である。

この手順の遂行には種々の標準的な方法を用いることか
できる。一般的に行なわれる方法の例はレミン１〜ンの
調剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ−ｓ　　Ｐ　ｂａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ　　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）　　１３４４
〜１３５２頁に記されている。しかしながら、本発明以
前に使用し１９だ方法は、適切な開始投与量範囲の程度
のおおよその近似より以上であるためには、特異性と正
確性に欠けている。その上、従来の方法は愚者の血清中
の全１（Ｉ　Ｅ１度を決定するために有効な手順を提供
することはなぐ、その結果としで、アレルゲン特異性１
（Ｉ　Ｅ１度の決定を全［＋　Ｅｉｌｉｆ１度に相関さ
せるための有効な方策を提供しない。ＰＲＩＳＴ試験は
完了に数日を要し且つＴＡＮＤＥＭ試験はまる１日を要
する。

それに対して、本発明の試験は大きな正確性を伴なって
２時間程度の短かい時間で完了させることができる。

本発明の方法は、特に脱感作に使用するアレルゲン及び
診断方法のアレルゲン成分が同一のアレルゲンプロフィ
ル及び特異性を有している場合に、適当な脱感作投与量
を決定するための特異性と正確性を提供する。攻撃する
アレルゲン又はアレルゲン類の鑑別ののらに、脱感作免
疫療法手順を用いる。一般に使用する手順は、通常は最
大許容投与量（顕著なアレルギ一応答を生じさせない投
与量）に至るまで、徐々に増大するアレルゲンの投与量
を、異なる間隔で、作因に対する防護が発現するまで゛
、注射することを包含する。本発明の方法においては、
適当な脱感作投与量のより正確な査定を先ず決定するこ
とができ、従来必要とじた熟練を要づる手順を不必要な
らしめる。この処理の正確な機（ｆ４は完全には明らか
でない。アレルギー応答素制を維持するためのブースタ
ー注射は、′１〜４週の間隔で必要である。通常はブー
スター注射に対して必要な用Ｗは、初ｌｖｌアレルギー
反応の抑制に対して必要どする最大投与量よりも実質的
に人である。

本発明の方法は抗■９Ｅ抗体か付着させである不溶性担
体を、患者の血清中の１９Ｅとの抗ＩｇＦ抗体の抱合を
６１ずに充分な時間にわたって、患者の面ンｉと接触さ
せ、次いで担体から愚者の血清を除く段階を包含する。

この手順にｄ５いて患者の血清は、担持した抗ＩｇＥ抗
体との接触以前に希釈しないことか好ましい。保温時間
は実質的な抱合を生しきヒ゛るために充分な時間でなけ
ればならないが、その時間は湿度に関係する。ｊ芭当な
保温時間は１５５〜５０゛Ｃの範囲内の温Ｉ臭で１５−
１８０分であり、好適な接融時間は２０〜４０”Ｃの範
囲内の温度で３０〜１２０分である。

抗１ｇＥ抗体が付着させである不溶性担体は本発明の重
要な局面である。抗［Ｅ抗体は多くの源泉から入手する
ことかでき、それらを生産するだめの方法学は公知であ
って、多くの特許及び前記出版物中ｔこ記されている。

好適な抗１ｇＥ抗体は免疫を与えた哺乳動物の血清から
、又は複数のハイブリドーマクローンから取得した親和
力精製多クローン性抗体である。

単一のクローンから誘導した単クローン性抗体を使用づ
′ることもできるか、部位特異性についての欠点を有し
ている。結合部位を封鎖する如何なる構造形態又は立体
障害も全部の抗体の結合を妨げ、場合によっては予測し
得ない変化を導ひく。

抗原が結合するゲルを用いる標準的な手順による親和力
クロマトクラフィーによって精製した多クローン性抗体
は、一つおぎの非封鎖部位と結合することができる。そ
れ故、種々のクローンから誘導した、種々の異なる結合
部位に結合する単クローン性抗体の多クローン性抗体混
合物が好適であって、米国特へ′１第４３７６１１０号
の２部位検定方法よりも大きな利点を有している。

単クローン性抗体を製造するだめの方法は１分に開発さ
れており、単りローン性抗ＩｆｌＦ抗体の製造に適りる
方法は、）Ｊツヂー（Ｄ、　Ｃａｔｔｙ）ら、″ヒトの
免疫グロブリンに対づ゛る単クローン性抗体に特に関係
づる免疫検定法にｄ−３（する抗血清“、前記８０年化
の免疫検定方法、１３３〜１５３頁及びその中の引用文
献によって記されており、その全内容を参考のためにこ
こに包含せしめる。

固体担体としては広く異なる化合物を用いることができ
るが、主として考慮すべきことは、表面への抗ＩすＦ抗
体の結合、酵素標識付は抗１ｇＥ抗体試薬による妨害の
欠如、基質どのその酵素反応及び酵素反応生成物の螢光
性である。天然及び合成の両方の有（；笈及Ｏ−無機工
台体を固体担体として使用するとかできる。適当な重合
体の例はポリエチレン、ボリア１」ピレン、ポリエチレ
ン、ポリ〈４−メヂルブヂレン）、ブチルゴム及びその
仙の合成ゴム、シリコーンコム及びシリコーン樹脂、ポ
リニスデル、ポリアミド、セルロース及びＩ？／レロー
ス誘導体くたとえば酢酸セルロース、二［・［］セル１
］−スなど）、アクリル酸エステル、メタクリル酸］１
ステ１し、ビニル重合体くたとえばポリ酢酸ビニル、ポ
リ塩化ビニル、ポリ塩化ヒニリテン、ポリフッ化ビニル
など）、ポリスチレン及びスチレングラフ１〜共重合体
、スチレン−アク１月」二］〜リル共重合体、レーヨン
、Ｊイロン、ポリビニルブチラール、ポリ小ルムーｊフ
ル１２ヒトなどを包含づる。不溶性担体として使用達−
ることかできるその他の材料はシリカゲル、珪素ウェフ
ァ−、カラス、紙、不溶性蛋白質、金属、半金属、金属
酸化物、磁気祠料、半導体材料、セルメットなどである
。

更に、ゲルを形成する物質、たとえばゼラチンのような
蛋白質、リポ多糖類、珪酸塩、アカロース、ポリアクリ
ルアミ１〜又はたとえばテキストランのようにいくつか
の水相を形成する重合体、ポリアルキレングリコール（
２〜３炭素原子を有するアルキレン）又は界ｉｊ’＋ｉ
活性剤、たとえはリン脂質のよ−５な両親媒ａ化合物、
長鎖（１２・〜２４炭素１ヰ（子）ｊ′ル４−ルアン■
ニニウム慴１な、ｖ’　ＪＢ、また含まれろ、３表面は
、望ましければ、少数の試薬と表面の間の共有結合を訂
４にめ（ご、多官能＋’１℃あるか叉１Ｊ１多官能ｆｌ
ならしめることがｒｉＪ能（あ）でｂよい、。

表面士に存在さけ゛Ｃ拮合の７：：　、ｙに用いること
が（・きる官能基はカル小酸、１ルデじド、アミン基、
シアノ基、１チレン性不飽和基、水ｎう基又はメルカプ
１へ基４「どを包含生る。抗体を各種表面に対して結合
さける））法は公知であって、文献、たとえばパ固定化
酵メ・ビ°、チハタ　イヂ日−、ハルスデットプレス、
ニューヨーク、１９７８及びＡ、−］＝１〜　　レカ　
］ノ　ス　（Ｃｕａｊｒｅｃａｓａｓ、　　Ｊ　　、　
　Ｂ　　ｉｏ、　　Ｃｔ＋ｅｍ。

２４５．３０ｂ９　（１９７０）中に詳細に記されてい
る。

結合基の１（さは結合させる化合物の伸類、結合した化
合物と表面の間の距離が結合した化合物の性質に与える
影響、結合した化合物の架橋可能性、その他に依存して
広く変えることができる。結合基は単結合であってもよ
いし、あるいは連鎖中に約１２に至るまで、通常は１０
以内の原子を有していてもよい。結合基は脂肪族、脂環
族、芳香族、複素環族、又はそれらの相合せとづること
ができる。結合基の原子の総数は水素を除いて約２０１
京子以内、通常は約１６原子以内であり、その原子は炭
素、オキシ又はオキソ、オキンー力ルボニル及び非オキ
ソ−カルボニルの両方、としての酸素、アミノ又はアミ
ドどしての窒素、あるい・はチオ又はチオノとしての硫
黄である。代表的な基はメヂレンカルボニル、スクシン
イミジル、アルファーハロアセチル、チオメチレン、グ
リシル又はポリグリシル、スクシンジオイル、マレジオ
イル、グルタルジアルキリテ゛ン、メチレンフェニルジ
アゾ及びウレイドを包含する。

本発明の好適診断用担体はポリスチレン、たどえは゛ス
チレンーアクリロニトリル共重合体のようなスチレン−
〈ビニルモノマー）共重合体を含むスチレン共重合体、
たとえはポリスチレン及びボリブ［」ピレンのようなポ
リオレフィン、並びにアクリレ−１〜及びメタクリレ−
１・共重合体並ひに共重合体を包含リ−る。抗ＩｇＥ抗
体は吸着、イオン結合、）ｉ・ンデルワールス吸着、静
電的結合、又はその他の非共有結合によって担体に結合
させることが０？　２太しい。共有結合によって担体に
結合さけることもでさる。本発明の方法に対して特に右
利な担体は複数の井戸を有するミクロタイター板から成
る。フ４戸表面又はその中のプラスチックカップ挿入物
が、不溶性担体を描成することができる。ミクロタイタ
ー板又は井戸挿入物は、それに当てる励起光又はそれに
応答して生じる螢光が、取巻いている＃ｌ）５の内容物
に達するか又は影響を及ぼすことがないように、光に対
して不透明であることが、もっとも右利である。この系
においては、各７１戸を他の井戸に無関係な試験系とし
て用いることがＣ゛きる。

抗１ｇＥ抗体の不溶性担体の表面への非共有結金的な付
着のための方法においＣは、抗Ｉｑ［Ｅ抗体を水性の緩
衝溶液中で゛、たとえばポリスチレンミクロタイター井
戸又はそれに対するポリスチレンの個々の挿入物井戸の
ような担体の表面にあてがえばよい。表面は最初にたと
えばメタノールのような洗浄液で清浄にしたのち乾燥す
る。緩衝した抗１ｇＥ抗体溶液を井戸又は挿入カップ中
に入れ、室温で゛吸着が生じるまで′、たとえば２〜１
８時間、好ましくは１６〜１８時間、４〜４０°Ｃ１好
ましくは２０〜２６℃の温度にｄ５いて保温する。

次いで井戸を希食塩水で洗ったのち乾燥する。

米国特許第４２１０４１８号に記す手順を用いて表面を
蛋白質で被覆し目つカップリング剤としてたとえはクル
クルアルデヒドを使用して、抗Ｉ９Ｆ抗体と結合さけて
もよい。更に別の方法にｄ３い−Ｃは、井戸を、たとえ
はポリエーテルイソシア太−トのような遊離イソシアナ
ート基を有づる層で被覆してもよく、次いでそれに対す
る水溶液中の抗１ｇＥ抗体の適用が必要な結合をもたら
づ゛。

更に他の、ｌ）法においては、米国特許第３７２０７６
０号に記すように臭化シアンを用いて抗１（ＩＥ抗体を
〔１〜ロキシル化祠利に結合させることができる。

もう一つの手順においては、担体表面を先ず不活性蛋白
ｙ′１て・被晋ツることができ６”　ｎこの手順をボリ
エヂレン叉はボリスヂレン管について説明するが、１戸
、ビーズなどに対しても同様に適している。この方法に
従かうと、反応性の底部に不活性蛋白で１を結合さける
。“不活性蛋白質“という用８ｎは帥疫化学的反応に関
与ぜＪ゛且っ生物学的物質に悪影響がない蛋白質を意味
する。使用することがｒきる蛋白質は、この技術分野に
おいて公知Ｃある。それらは、たとえば血）ｉ〜アルブ
ミン又は種々の動物種から１りられるグロブリンのよう
な蛋白質オイ刺を包含し、あるいはその他の均一な材料
Ｃ゛あって（’＞　Ｊζい。特に好適なものは容易に入
手しうるという辺１山でウシのガンマクロプリンとゼラ
チンである。使用する蛋白質材料は、その使用によって
本質的に連続的な表面を取得することができるために充
分に均質でなければならない。次いで抗１ｑＥ抗体を不
活性蛋白質に結合させる。

さらに詳しくは、プラスチック表面を（ａ　）表面を吸
着条件下の不活性蛋白質による吸着によって被覆し、（
ｂ）抗［ＩＥ抗体を不活性蛋白質被覆に対して付着させ
、（Ｃ）結合した部分を安定剤と接触させて抗１ｇＥ抗
体を変質に対して安定化し、且つ（ｄ　）抗■９Ｆ抗体
を実質的に変性しない乾燥条件下に反応性部を乾燥する
ことから成る方法によって処理する。

最良の結果を与えるために必要な不活性蛋白質の量は、
不活性蛋白質の伸類、表面及び抗１ｇＥ抗体の本質に依
存する。この但は、この分野の熟練者であれば容易に決
定することができよう。一般には、蛋白質の薄い被膜（
たとえば少なくとも１層の分子の厚さ〉を表面に結合さ
せる。一般に、これは生物学的に活性な物質を結合ざゼ
ることができる均一な被膜を与えるために充分な量であ
る。

不活性蛋白質は噴霧、浸漬によって、又は好ましくはた
どえは緩衝剤水溶液のような不活性蛋白質の水溶液中に
被覆条件下に表面を浸漬することによって、表面に対し
て付着させて被覆を形成さぼることが（・きる。このよ
うにしで蛋白質が表面に吸着される。燐酸塩緩衝剤水溶
液を用いることか有利である。このような緩衝剤は米国
薬局方ＸＩＸ中に記されており、一般に燐酸水素ニアＪ
リウムと燐酸二Ｔ水素カリウムを用いて調φツする。

不活↑１１蛋白質を蛋白質の変性を導くことのない吸着
条イ４下に被覆する。特定的な１）１」と温度の条件は
当該不活性蛋白質に依存する。吸着条件は、通常の１）
１」、たとえは３〜１０及び通常のンＢ度、たとえば約
２０〜３０℃を包含する。たとえは４℃稈度の低温及び
５０°Ｃ程度の高温というような、それよりも低い温１
印も高い温度も使用可能であるが、穎茗な右利性は存在
しない。実際に、５０℃を越える温度においては、蛋白
質は一般に変質する。４℃よりも低い温度においては蛋
白質を（＝Ｉ着さけることは難しい。たとえは、ウシの
ガンマ−グロブリンは一般に５〜７　（６，４が最適）
のｐＨで空温において被覆させる。

不活性蛋白質のイ」着を容易にするためには、付着する
前に比較的低い反応性の部分の表面を溶剤、界面活性剤
、酸又は塩基によって処理するとよい。

界面活性剤、望ましくは硫酸ドテシルナ１〜リウムを洗
浄剤として使用して表面を清浄にし、それを湿潤性とす
る。重合体が表面上にカルボキシル基を含有している場
合には、それを塩形成塩基、たとえばＫＯＨで処理して
塩の形態に変え、かくしてそれに電気的吸引力を高めて
吸着の増大をもたらす陰電荷を与えることが望ましいこ
とが多い。

ｊ篇基は表面の清浄化をも助ける。別の局面においては
、表面−ヒの電荷の分布を、付着させる不活性蛋白質の
ものとほぼ等（）くすることが有利である。

これは、被覆に先立って、不活性蛋白質を含有する被覆
溶液とほぼ同一のｐＨを有する緩衝剤水溶液で表面を洗
浄することによって行なわれる。

抗ＩＵＥ抗体は適当な手段によって付着させることがで
きる。公知のこのような手段は吸着、共有結合、イオン
結合及び取り込みを包含する。抗１（ＩＥ抗体を不活性
蛋白質に共有結合させるための方法は米国特許第３５５
３３１０号及び３６３９５５８８中に開示されてＪ５す
、それをここに参考どじで包含させる。不活性蛋白質に
対して共有結合さけるための好適な方法は先ず蛋白質を
アルデヒドカップリング剤で処理したのち、アルデヒド
を不活性蛋白質と抗１（ＩＥ抗体の両者に共有結合させ
ることができる条件上に、抗１ｇＥ抗体を加えることか
ら成っている。適当なアルデヒドツノツブリング剤は、
たとえばアクロレイン、メタクロ１ツイン及び２−ブチ
ナールのような、エチレン性不飽和父は複数のアルデヒ
ド基の何れか、あるいは両者を右しているものである。

たとえばグルタルアルデヒド、プロパンジアール及びフ
タンジアールのようなジアルデヒドを用いることができ
る。

これらのアルデヒドの中の一つを不活性蛋白質の表面と
接触させるとき、蛋白質は架橋によって安定化及び重合
し、且つアルデヒド活性部分が表面に固定される。これ
らの部分はカルボニル基であると思われ、それは蛋白質
粒子と抗体の間で共有結合を生成するから、抗ＨＥ抗体
のアミン基に対して高度に反応性である。

アルデヒド又はエチレン性不飽和カップリング方法もま
た、第一アミノ基を含有する他の表面に抗１ｇＥ抗体を
共有結合させるために用いることができる。たとえは、
ポリリシン被覆したポリスチレンはグルタルアルテヒ１
〜によって抗Ｉ（ＩＥ抗体に結合させることができる。

アルデヒドの代りに、たとえば２以上の下記の反応性基
を有する化合物のような他のカップリング剤を用いるこ
もできる二ニトロ基によって活性化したアソ、スルホン
酸又はフルオロ基、アジド、イミン又は適当な共鳴構造
を有する環に結合した活性クロロ基。これらの反応性の
基は、不活性蛋白質を（ｊへ成り−る物質並びにそれに
結合させるへき抗１０Ｅ抗体中の第一アミノ、スルフリ
ルヒドリル、カルホキシル 阜と反応りることがてきる。

このＪ−うなカッブリンク剤の代表的なリストは、ヒス
ーシアゾヘンザシン、ジスルホン酸、テトラゾ−〇ーノ
土二レンジアミン、シフルオロジニｊ〜ロヘンゼン、ジ
フルオロジニトロフェニルスルホン、カルボジイミド、
トルエンジイソシアノー−１へ、Ｊｉ化シアメル、ジク
ロロｌ−リアジン、過塩素酸Ｎ−１−フチルー５−メチ
ルイソＡギ１ノーゾリウムである。使用することができ
るカルボジイミドは、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−力ル
ホジイミｌ’、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボシイミｌ−塩酸化物、及び１−シクロへ
キシル−３（２−モルホリニル（４）−エチルカルボジ
イミド）−メ］へ一叫］ー１ールエンスルホナーＩ〜で
ある。

別法として、抗ＩＱＥ抗体を米国特許第３５５１５５５
号に配り一方法に従って吸着にＪ：って付着さゼること
ができる。固体担体表面を、たとえばポリエーテルイソ
シアナート被覆（ハイポ−ルー２０００、Ｗ、Ｒ，ブレ
ースエンドカンパニー、レキシントン、マサチューセッ
ツ）によって提供されるもののようなイワシアナ−１〜
結合により抗ＩｇＦ抗体に結合する材料で被覆すること
もできる。

試薬をガラス表面に結合させるための方法は公知であっ
て、たとえば゛、米国特許第４２８０９９２号中に記さ
れている。抗ＩｑＥ抗体をガラスに対して結合させる１
ｃめに用いる方法は限定的ではない。つや消しのカラス
が好ましい。抗ＩｇＦ抗体は物理的又は化学的方法によ
ってカラス表面に結合させることができる。大量の抗１
（ＩＥ抗体をカラスに強固に且つ永久的に結合さけるこ
とを望む場合には化学的な方法が好ましい。

物理的方法による結合は主として物理的な吸着（ファン
デルワールス吸着）にＪ：って達成することができる。

かくして、ガラスを抗１（ＩＥ抗体の溶液中に浸漬した
のち、物理的な結合を形成するために適づ−る時間にわ
たって、保温又は放置すればよい。溶液は一般に０，０
１〜４００ｇ／ｌ　、好ましくｔ；ｊｏ、１〜１．０（
１／ｌの濃度を有する。

浸漬処理け、たとえば、０〜４５℃の温度で１〜４８Ｍ
間行なえばよい。

適当な化学的方法としては、抗１ｏＦ抗体を、シランカ
ッブリンク剤及び、必要ならば、架橋剤の助けをかり−
Ｃ、ガラス表面、好ましくはつや消しガラス表面に結合
させることができる。ガラスと反応する官能括及び抗Ｉ
ｇＥ抗体及び／′又は架橋剤と反応する官能基の両者を
分子中に含有する如何なるシランカップリング剤を用い
てもよい。

カラスと反応り−る）※当な官能基の例は、ガラスのシ
ラノール阜と反応する曇、たとえば、アルコシシリル基
（たとえばメチキシ又は工１〜キシＭ摸したシリル阜）
などを包含する。抗１ｑＥ抗体及び／又は架橋剤と反応
する適当な官能基の例は、アミン、カポキシル及び／又
はチオール基と反応づるものりであり、たとえば、カル
ホキシル、エポキシ、ハロアルキル（たとえばクロロエ
チル及びクロロプロピル）、アルデヒド、第−及び第ニ
アミノ、チオール、インシアナート、カルホキシレー１
〜、イミノ及びニトリル（又はシアノ〉基などを包含す
る。更に特定的には、アミノ基と反応する適当な官能基
の例はカルボキシル、エポキシ、ハロアルキル及びアル
デヒド基である。カルボキシル基と反応する適当な官能
基は、たとえは第−及び第ニアミノ、並びにエポキシ基
を包含する。

チオール基と反応する適当な官能基は、チオール、エポ
キシ、ハロアルキル及びアルデヒド基なとを包含する。

抗１ｇＥ抗体をガラスに結合させる際には、シランカッ
プリング剤を架橋剤と併用し又は併用せずに使用するこ
とができる。架橋剤はシランカップリング剤の種類と結
合すべき抗１ａＥ抗体の種類に従って選択することがで
きる。シランカップリング剤と抗１（ＩＥ抗体を架橋す
ることができる如何なる架橋剤をも用いてもよい。この
ような架橋剤としては、シランカップリング剤のアミン
、カルボキシル又はチオール基を免疫学的に活性な物質
のアミン、カルボキシル又はチオール基と架（ｎさせる
ことができる化合物、たとえはチオール基とチオール基
間、又はアミノ基とチオール基間の架橋を与えることが
できる化合物を挙けることかできる。アミノ基同土間の
架橋か可能な適当な化合物の例は脂肪族ジアルデヒド（
たとえばクリオキ→ブール、マロンアルテヒド、スクシ
ンアルデヒ１−、グルタルアルテヒ１〜）及びジクロロ
トリアジン（たとえば２−アミノ−４，６−シクロロー
Ｓ−１〜リアジン）なとである。チオール基間土間の適
当な架橋剤は、たとえば、シマレイミド化合物（たどえ
ばＮ、Ｎ’−−０−フェニレンジマレイミド、Ｎ、Ｎ−
−−ｍ−フェニレンジマレイミド）である。アミノ基と
チオール基の間の適当な架橋剤は、たとえば、マレイミ
ドカルボキシル−Ｎ−ヒトロギシスクシンイミトエステ
ル（たとえばｎｌ−マレイミドベンソイル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル、及びヒドロキシスクシン
イミドエステル〉である。

抗Ｉ（ＩＥ抗体に対する固体担体として本発明の方法に
おいて有用な吸着剤は公知である。適当な材料を以下に
挙げる： 吸着剤及び吸収剤 非イオン性セルロース たどえば、ウオットマン（クリフトン、ニコージャーシ
ー州、米国〉品種− ＣＦ−１，長繊維粉末 ＣＦ−１１，中織紐粉末 ｃ　ｃ　−３１’Ｅ）　、微粒子状粉末ＣＣ−４，１’
Ｏ，微粒子粉末 たとえは、ヒオーラッド（リッチモンド・カリポルニア
州、米国）品種− セレックスｏＮ　１．粉末 セレックス■４　”１０　、粉末 シリカゲル たとえは、ウオッ１〜マン品種−８Ｇ８１　、充填紙：
又はビオ−ラッド品種− ヒＡ−ジノδＡ又はビオ−シル　ＨＡ ヒ１〜］二１キシルう７パタイ１−・〈ヒオーラツド）
アルミノー：酸性、塩基性又は中性品種（ヒオー′ノッ
（−ン アルミナＣ−ガンマゲル（ビオ−ラッド）リン酸カルシ
ウム ヒト［に１〜ジプロピルテキストラン たとえば、）？−マシア（ビスカタ［ンエー、ニューシ
ャーシー州、米国） い、８７アケツ、ユ■ｌ−Ｈ２０ デキス１−ラン（ファーマシア） ＵＮ　Ｍデキストラン（ファーマシア）アルキル たとえは、ファーマシア品種ーオクチルセファロ−ス■
Ｃ１−４Ｂ又はフェニル−セファロールＣ　１−４　　
Ｂ たとえば、マイルスリサーチプロダクツ（エルカールト
，インジアナ州，米国）品種−ω−アミノアルキルアガ
ロース レクヂンアガロース〈マイルスリサーチプロダクツ）、
ポリーＬーリシンアガロース（マイルスリサーチプロダ
ク゛ソン プラスチックス、たとえはポリスチレン、ポリエチレン
及びポリプロピレン 隙イオン　換物質 ジエチルアミノエチル（ＣＥＡＥ）セルロースＩことえ
は、ウオッ１〜マン品（重− ＤＥ−１の，粉末 ＤＥ−１　１０，粉末 Ｄ　Ｅ　−　２　２０，繊維質 Ｄ　Ｅ−２　３（ｉｏ　、繊維質 ＤＥ−３２■，乾燥、微粒子状 ｏ　Ｅ　−　５　２（Ｅ）　、湿潤，微粒子状ＤＥー８
１０，紙 たとえば、ヒオーラツド品種ーセレックス　Ｄ。

繊維質 ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ＞アカロースたとえば
、じオーラッド品種−　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅビオグル■△ ジエチルアミノエチル＜　１）　Ｅ　Ａ　Ｅ　）テキス
［〜ランたとえ（Ｊ、ファーマシア品種−ＤＥＡＥセノ
アデックス■，ビート状 ア，７，，．ヤツ，．ゎヮア．−ユ■４８（７アー７シ
ア） エクテオラレルロース たとえは、ウオッ１〜マン品種− Ｅ　Ｔ’−１　１■，粉末 Ｅ　１’　−　４　１■，粉末（高純度）１玉　ｌ　−
　８　１■　、　躬（ たとえば、ヒＡーラッ１〜品（トーヒレックス■［。

繊維状 １〜リエヂルアミノエチル（　Ｔ　Ｅ　Ａ　Ｅ　）セル
ロースたとえば、ビオ−ラット品種−セレックス■−１
−　。

繊帷状 ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）−アミノ（ＱＡ
Ｉヨ）、セルロース ｔｃおえ（よ１．３オーツツＦ’　１ｍ　’ｔ’ｆｉ−
ゎウツウユの（ＱＡＥ）、１維状 ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）−アミノ（ＱＡ
Ｅ）デキストラン たとえは、ファーマシア品種−ＱＡＥ−セファデックユ
■ ヘンゾイル化ジエチルアミンエチルセルロースたとえば
、ビオ−ラッド品種−セレックス■ＢＤ、繊維状 陽イオン交換ｖＪ料 リン酸セルロース たとえは、ウォットマン品種− Ｐ−１■、フロック Ｐ−１１０，粉末 Ｐ−４１０，粉末（高純度〉 Ｐ−８１■１紙 カルボキシメチルセルロース たとえば、ウオッ１へマン品種− ＣＭ−１■、フロック ＣＭ−１１■、粉末 ＣＭ−２２■、繊維状 い＝１　−　２　３’Ｐ’　　、　　　芽％ｆＩｉｌｆ
４人ＣＭ　−３２０，乾燥、微粉子状 ＣＭ　−５２■、　！！ｉ！潤、微粒子状ＣＭ−ε３２
■９紙 たとえば、ヒＡ−ラット品種−セレックス［Ｆ］Ｃへ４
．　損率（を才人 カルホ１ジメチルテキス］〜ラン たとえは、ファーマシア品種−ＣＭ−セファデックメり 繊維状 カルボニ１−ジメチルアカロース たとえば、ヒＡ−ラット品種−ＣＭヒオグノρたとえば
、ファーマシア品種−〇Ｈ−セノ１０−ス”　　４　　
Ｂ スルホプロピルデキストラン たとえば、ファーマシア品種−８Ｐ−セファデックス［
Ｆ］ 抗１ｐＥ抗体を異なる粒径の重合体担体粒子に対して化
学的にカップリングすなわち結合させることによって生
成せしめる試薬は、たとえば、米国特許第３８８２２２
５Ｍ：３９５７９３１号；３８２５５２５号；３６２９
５５８号：　３５６５９８７号；３５５３３１０号；　
３４０７０７６号；３２３６７３２号：　３０９６２５
０号：４０９２１１４号：４１４０６６２号；　／１．
２１０７２３号；４２２６７４７＠；４．２５９３１３
号；３０８８８７５号；３７６６０１３号＋３６１９３
７１号；３８０９６１３号＋３８５３９８７号；　３９
６３４４１号：３５５１５５５号；及び３（３４９３４
６号、オランダ特許７２０１３０８号：並びに英国特許
第１２５７２６３号によって公知である。

重合１イービードへの抗１（ＩＥ抗体の共有結合が望ま
しい場合には、ヒートに対しＣ、ヒートに結合させるへ
き抗１ｇＥ抗体上のアミン、アミド又はスルボンｊ７ミ
１〜基と反応させることができる基、たとえば、クロロ
ペンシル、り１］ロアセチル、クロロエチル力ルボニル
、り［］ロエエチスルホニル、アクリロイル又はビニル
ースルボニル塁を、じ−１この生成後に、維持している
モノマーを使用することが好ましい。

表面の基は、反応性のヒート表面基及び抗１９Ｆ抗体と
反応する２官能性結合基によって、抗ＩｇＥ抗体に対し
て結合させることができる。。

ヒースは通常は１種以上のビニル七ツマ−を標準的な方
法によって重合させることによって調製する。車台さぜ
且つ、／又は任意のｉＪ合で相ｑに月つ／又は他の七ツ
アーど共重合させて所望（す！パ−ス゛をｈえることが
できる適当なビニル七ノン−は、たとえばモノヒニリデ
ン炭素環式Ｅツマ−１たとえば、スブーレン、アルファ
ーメチルスチレン、ａｒ−（ｔ−ブチル）スチレン、ａ
ｌ’−メチルスチレン、ａｒ、　ａｌ’−ジメチルスチ
レン、８１゛−クロロスチレン、ａｒ−（ｔ−アミル〉
スチレン、ａｌ’−）′ロモスチレン、ａｒ−フルオロ
スチレン、ａｒ−（ｔ−アミル）スチレン、ａｒ−ノロ
モスチレン、ａｔ゛−フフレオーロスチレン、旧゛−シ
アノスチレン、ａｒ−メトキシスチレン、ａｒ−エチル
スチレン、ａｒ−ヒトロキシメチルスチレン、ａｒ−工
１〜キシスチレン、ａｒ−クロロ−ａｒ−メチルスチレ
ン、ａ：・、ａ１゛−ジクロロスヂレン、ａｒ、　ａｒ
−ジフルオロスチレン、ビニルナフタレン、及びその伯
の２６以下の炭素原子を有するかかる乳化重合可能な七
ツマー；重合して非成膜性重合体を与えるアルフッ・、
ヘーターエチレン性不飽和カルボン酸のエステル、たと
え（Ｊ、メタクリル０）メチル、メタクリル酸クロロエ
チル、メタクリル酸１）−ブチル、メタクリル酸エチル
、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸イソプロピル
、メタクリル酸フェニル、クロロアク１ノル（Ｐｔブヂ
ル、クロロアクリル酸シクロヘキシル、クロロアクリル
酸エチル、クロロアクリル酸メチル、クロロアクリル酸
イゾブロビル及び重合させて硬ｒ′１の重合体を牛じさ
ゼることができるその他のかかる］−スプル；非重合性
カルボン酸のアルファ、ぺ一ターエヂレン性不飽和エス
テル、たとえば、安応香酸ビニル、１〜ルイル酸ビニル
、旧゛−エチル安息香酸ビニル、ａｒ−エチル安息香酸
アリル、ｉ〜リメチル酢酸ビニル、ピパリン酸ビニル、
トリクロロ酢酸ビニル及び不飽和部分が２〜１４炭素原
子を有し且つ酸部分が２〜１２炭素原子を有しているそ
の他のかかる七ツマ−；たとえば、１２以−トの炭素原
子を有するニトリルのような、アルファ、ヘーター土チ
レン性不飽和二１〜リル；たとえはＪＲ化ヒビニル臭化
ビニルなどのような、その他の重合性ビニルモノマーを
包含する。

好ｊ商方法においては、たとえは井戸表面のような不溶
性担体上の抗１ｇＥ抗体を、井戸表面上に動物蛋白！１
−サツカリド複合体を形成する緩衝剤水溶液で安定化す
る。好適なＭｙ１溶液は０．０５〜１，０重量の水溶性
動物蛋白質を含有する。適当な水溶性蛋白質はウシの血
清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒ１〜（Ｈ３Ａ）、ウザギ（
Ｒ８Ａ）、ヤキ（ＧＳＡ）、ヒツジ（ＳＳＡ）、ウマ（
＋−１０３Ａ　）などの血清アルブミン：上記の動物の
血清ガンマ−グロブリン；及びたとえばオバルブミン、
フイブリノグン、トロンビン、ｉ〜ランスフェリン、糖
蛋白質のようなその仙の動物蛋白質を包含する。

好適な水溶性動物蛋白質はウシの血清アルブミンである
。溶液は０．１〜５重員％の１種以上の水溶性サツカリ
ドをも含有する。適当なサツカリドはソルビトール、ス
クロース、マルトース、廿ロビオース、ラクトース、マ
ユ１ヘース、アニロースなどを包含する。７８′ａ、は
６〜８のｐＨを有する０゜０１〜０．５ｆｖ１１．Ｊ　
ン’６９ｍ緩’ｆＭ′ａ（ＰＢＳ　）　ヲ栴成するため
に充分なリン酸塩及びたとえば０．０１〜０．１重量％
のす（ヘリウムアジドのような防腐剤を含有する。

本発明の方法の第一段階に先立って予備洗浄段階を行な
うことが好ましい。予備洗浄段階においては、担体表面
を０．０００１〜０．５重量％の水溶性蛋白質を含有す
る水性の絽面した洗浄液と接触さぜる。この予ＩＭ１洗
浄段階は、水溶性蛋白質が水溶性動物蛋白質である場合
に、特に有利である。本発明の好適洗浄液は０．０００
１〜０．０５のリンｉ′ｌ！塩モル漕度、６〜８の＋＞
Ｈを有し且つｏ、ｏｏｉ〜０．１重量％の非イオン界面
活性剤及び０．０００１〜０．５重量％の水溶性蛋白質
を含有する水性のリンＣ！塩緩衝剤溶液である。適当な
非イＡン界面活性剤は、たとえば、ラウリル、セチル、
オレイル、ステアリル、及びｉ〜リテシルボリΔキシエ
チレンエーテルのようなポリオキシェｆ、ツェーヶ／、
（ＢＲＩ。［Ｆ］、：、３え（よポ。

オキシエブレンソルヒタンモノラウレー１へ、モノパル
ミゾ−１−、モノステアレーＩ〜、モノオレエー１へ及
び１へリオレエー１〜のようなポリオキシエチレンソル
ビタン類（丁ＷＥＥＮＣ’）；及びその他のポリオキシ
エチレンエーテル類（丁ＲＩ　Ｔ　ＯＮ＠　＞を包含す
る。好適な非イオン界面活性剤は４０のエチｌノンオキ
シド単位を有するオクチルフェノキシポリエトキシエタ
ノール（トリトンＸ−４０５、ロームエンドハース社）
である。適当な水溶性蛋白質はウシ＜ＳＳＡ）、ヒ１〜
（１」ｓＡ）、ウサギ（ＲＳ△）、Ａ７ギ（ＧＳ△）、
ヒツジ（ＳＳＡ）、ウマ＜　１−１０８　Ａ　）などの
血清アルフミン：上記の動物の血清カシマーグロブリン
：及Ｄ”たとえばオヴアルブミン、フィブリノゲン、［
−ロンビン、（−ランスフェリン、糖蛋白質のようなそ
の他の動物蛋白質を包含する。

緩衝剤溶液は、０．００５〜２．５型苗％の動物蛋白質
、０．５〜５重屯％の非イオン界面活性剤、１０〜２０
重量％の塩化ナトリウム、０．５〜５重市％の安定剤及
び０．０２−０．０５Ｍのリン酸塩溶液を与えるために
充分なリン酸塩から成る本発明の試薬濃厚液から調製す
ることが有利である。ｌ）Ｈは６〜８とすることができ
る。好適な緩ｍ溌厚液は約０．５重最％の動物蛋白質、
０．１重量％の１へり１〜ンＸ−４０５非イΔン界面活
性剤、１．７車量％の塩化す１−リウム及び２重量％の
す（〜リウムアシド、０．０１〜１のリン酸塩を含有し
［］つ７．４の１）１」を有し−（いる、。

不溶性１１３体にイ」着しでいる抗［Ｆ抗体との血ｆ′
ＪＩＱＥの抱合か生じたのらに、患者の血清をそれから
１１！り除く。過剰の液体を除いたのち、固体表面を、
たとえは前記のもののような、適当な洗）争溶液Ｃ洗浄
する。

本発明の方法の第二の段階は、不溶性１１１体をノルオ
ログン酵崇て標識イ」（）した抗ＩｑＦ抗体と接触させ
ることから成る。保温は不）Ｈ性担体十の抗ＩｇＥ抗体
と抱合した血清１（Ｉ　Ｆ　（若し存在づる場合には）
の酵累標識イ」（）抗１！ｌｌ［Ｅ抗体との抱合を訂づ
に充分４ζ時間継続り−る。保湿後に、過剰の液体を除
き、不溶性担体の表面を第一の段階に対して先に記した
ように弱含塩溶液で洗浄して、非抱合抗体を取り除く。

担体を前記の本光明の好適洗浄溶液で洗浄づることか好
ましい。

抗■ｇＥ抗体は前記のものと同一であっても異なってい
てもよいが、単クローン性抗体であることが好ましい。

フルオログン酵素及びそれを抗体の能力を害なうことな
く抗ＩｇＥ抗体に結合させて選択的に■９Ｆと抱合させ
るための方法は、この技術分野で公知である。適当な酵
素及びそれを抗体に結合さゼるための方法は、たとえば
、米国特許第４１９０４９６号に記されており、その内
容を参者としてここに編入せしめる。好適なフルＡログ
ン酵素及びそれに相応する適当な基質は、セイヨウワサ
ビ過酸化物、ベルオギシダーゼ及びそれに対する適当な
基質としての小モハニリン酸又は４−ヒドロキシ−３−
メトキシフェニル酢酸、ベーターカラク１〜シターゼ及
びそれに対ターる適当なＮ　ＩＭとし−Ｃの４−メチル
ウンベリフェリル−ベーターＤ−ガラクｌ〜シト、アル
カリ性小スファターゼ及びそれに対する適当な基質とし
てのリン酸４−メチルウンベリフェリル並びにたとえば
リン酸４−カルボキシ−ウンベリフェリル及びリン酸ウ
ンベリフェリル、４−カルボギシフ７ルキル」ニスチル
なとである。

抗１０１−抗体を酵素標識付は覆るために適りる手順の
例は、カルホジイミ１〜、ジアルデヒド及び抗１９Ｆ抗
体の蛋白７１への共有結合にＪ３いて記したよう′／、
ｒ　２７３’能性カツブリンク剤の使用を包含する。カ
ツフ゛リング剤（Ｊｌ、たとえは１−王チルー３−（３
−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルボジイミドｊ篇酸］
福及び１−シクロ・′＼＝ｉニジルー３３（２−モル小
すノエチル）カルボジイミ１ヘメチールーｐーｔ〜ル玉
ンスルボブー１〜のようなカルボジイミドであることが
好ましい。その他の適当なカップリンク剤は、たとえ＋
Ｊ．アク１］レイン、メタクロレイン又は２−ブチナー
ルのよう４１丁−チレン性不飽和をイーｊ８ｊるか、あ
いはたとえはグルタルアルアヒト、ブ［１パンジアール
又はフタンジアールのような少数のアルデヒド基を有す
るアルテヒ（−カップリンク剤を包含する。その伯のカ
ップリング剤どし−（は、たとえはス／＼リン酸ジスク
シ〉・イミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、ヒス−［
２−スクシンイミドオキシ力ルホニロキシ）Ｊ−デルｊ
スル小ン、シスクシンイミジル（Ｎ、Ｎ”−シアセチル
ボ１′−シスヂン、ジヂΔビス−（スクシンイミジルプ
ロピＡ＋−１〜）、エチレングリコールビス−（スクシ
ンイミジルスフシナ−１へ）のような２官能性ＮＨ３−
Ｉメチル、たとえはＮ−５−アシド−２−二１〜［］］
ペンゾイロヤシスクシンイミト臭化（〕−アジドフェナ
シル、Ｉ）−アジドフェニルクリオキ１ノール、４−フ
ルオロ−３−二１〜［Ｊ）丁ニルアシド、Ｎ−ヒト１丁
」キシスクシンイミジル−４−アジドヘンソＩ　−１−
ｌｍ−マレイミトヘンゾイルＮ−ヒドロ４−シスクシン
イミ１〜王ステル、メチル−４−アジ１−ペンゾイミテ
−１〜・１−ＩＣ１，ｐ−ニド１」−フェニル２−ジア
ゾ〜３，３．３−１−リーノルオロピロピオ太−１−１
Ｎ−スクシンイミジル−６＝−（４−〜アンドー２−一
二トロフェニルアミノ）ヘキサノエート、スクシンイミ
ジル４〜＜　Ｎ−−マレイミドーメチル）シフ目へ１サ
ン−１−カルベキシレート、スクシンイミジル４−（ｐ
−マレイミドノコ−ニル）ノチレー１〜、Ｎ−スクシン
イミジル（／１−７シ１−）１ニルジチΔ）プロピ：４
　ｔ−１〜、Ｎ−スクシンイミジル３−＜２−ピリシル
ジチＡ）ゾ［ｊビオＪ−−１へ、Ｎ　−、−＜　４−ア
ジド−）丁ニルチオ）ノタルイミｉ〜のＪ：　′）’、
（：へ１［１２官能性試；唐；たとえば１，５−シノル
オｏ−２．／１−ジニｌ−ＩＪ　／＼ンＵン、４，４′
−ジフルオＤ　−３゜３′−シニ１〜に１シノエニルス
ルホシ・、４．．４′−シイソザオシアノー２，２′−
ジスルホン酸スヂルＩ＼ン、］）−］ノー−二レンジイ
ソヂオしアｆ−１、カルホニルヒス（Ｌ−メヂオニン１
）−二Ｉ−口ノエニルエスンル）、＝１．４”−シブＡ
ヒスフ■ニルアジド、」−リ１−リ１〜−ルビスカルホ
ナーｌへのようなホモ２官能性試桑；及びたとえばジメ
チル？ジピミデ−１〜・２＋−ＩＣ１，ジメチルスヘリ
ミデー１へ、シメチル３．３−−シヂオービスブロビン
イミｊ−ト・２１１ＣＩ、２−イミノチオラン・ＨＣＩ
のような２官能性イミド玉ステルを包含する。酵素の抗
Ｉ（ＩＥ抗体への共有結合は、上記の試薬を用いて通常
の公知の反応によって、たとえば、中性のｐＨの水溶液
中で１０℃未満の温度ｒ１８時間又は終夜にわたって行
なうことができる。

酵素標識付けした抗１（ＩＥ抗体を水溶液中で不溶性担
体に対して適用する。溶液は、反応物を保存し且つ抱合
反応を容易にするために、適当な塩と緩衝剤を含有して
いることが好ましい。たとえば、溶液はウシの血清アル
ブミン（ＢＳ△）、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）、及び
たとえは前記の洗浄溶液において便用プるポリオキシエ
チレンソルヒタンのような、穏和な界面活性剤を含有す
ることができる。ここに記した洗浄溶液を使用すること
もできる。

本発明の好適溶液は、０．０００１〜０．１、好ましく
は０．００５〜０．０５のリン酸塩モル濃度と６．０〜
８．０、好ましくは７．２〜７゜６のｐ＋−＋を有する
水性のリン酸塩緩衝溶液中でｍ１当り０．１〜：５ミク
ロクラム、好ましくはｍ１当り一１〜２ミク１１グラム
の抗ｆｇＥ抗体を包含する。

抗１ｇ［Ｅ溶液中の単列成分は、１〜８、好ましくは２
〜６重量％の濃度における、１０００〜８゜００、好ま
しくは２０ｏｏ〜／′１ｏｏｏの分子巾ヲ有するボリニ
しチレングリコールである。ポリエチレングリコールは
反応の速度と感度を著るしく増大させる。もう一つの重
要な成分は０．００１〜０．５、好ましくは０．０２〜
０．１車量％の温度にある非イオン界面活性剤である。

適当な非イオン界面活性剤は、たとえば、洗浄液につい
て先に記したしのを包含する。好適な非イオン界面活性
剤は（〜すｌ〜ンＸ−４０５でおる。界面活性剤は分析
にＪ３い−Ｃ非特異性背景螢光信号を飛程的に低下させ
る、。

本発明の好適抗１ｐＥ溶液にＪゴいて、不溶性担体と共
に溶液を保温する時間は、温度に依存する。

１５〜４０　’Ｃの温度にＪ５いては、少なくとも１５
〜１８０分の保温時間を用いることができる。好適温度
は２０へ・３０℃の範囲内であり、これらの温度に４５
いｒ３０へ・１２０分の保温時間を用いることがで゛き
る。本発明の何れの段階においても長時間の保温時間は
工稈の効率を低小さ０るＪ３それがあることは明らか（
゛ある。迅速な分析は本光明の目的で゛あるから、望ま
しい正？ｉｆ度をｈえる最低の時間が好適でＣちる。

次いで固体担体を洗浄しで、残存する、未抱合の酵素標
識イ」け抗１ｇＥ抗体を除去少る。前記の洗浄溶液が適
当である。

本発明のｂ法の第三の段階は、固体担体を、ノルオロケ
ン性酵素の存在にｄ３い−（化学反応を−受ける基質の
溶液と、螢光化合物を生じさせるために充分な時間に４
つたつで、接触させることから成る。

反応させる適当な基質及び酵素は公知であつ−（、たど
えば、米国特許第４１９０４９６号に記されている。基
質の例は相当づ−るフルオロゲン性酵素に関し−Ｃ既述
したとおりである。

固体を１０−２〜１〇−辺モル′ａ度、好ましくは１０
−’−１０−５モル濶度の九（質を含有り一；５基質の
水溶液と接触させる。基ｖ′［溶液中の好適／ニ一本付
加的試８ヘラ及び援侑剤は、たとえは、？−７７ミノ′
−２−メｆ−ル−１、、、−７　ｆ二Ｊパノールｆｇｔ
ニヤｉ剤及び措化マクンンウムを包含−リ−る。

基魯溶；１ｋをイζ溶性担体と共に債）に［生反応牛ｙ
）ｉ９　ｑｌ；＋、Ｉが生しるために光分なＩ時間にわ
たって保温りる。

１Ｂ−／ｌ（）℃の温度におい−Ｕ５−へ一２４０分の
保温時間を用いることができる。２０〜２６℃の範囲内
の温石と３０〜９０分の保温時間が好ましい。

次いＣ溶液中の螢光強度を測定覆る。、基質溶液中の螢
光の強度の測定のための装置とｈ法は、この技術分野で
常用のものである。螢光強度（、未不溶性担体十の酵素
の港ｊａの関数てあり、　１５．Ｆ１ａは患者の血７＾
中のＩｇト抗体濃度の関数Ｃ＆）る１つこの螢光の強度
を既知温度のＩｇＥ抗体を含有夛る対照溶液を用いて手
順を遂行することによって測定した強度と比較すること
により、惣名の血清中の相応りる■すＦ抗体の正確な４
９度を決定することができる。

適当な螢光光度耐（ｊパーキン−エルマー、アメリカン
イススｌ〜ルメン１〜社及びターナーテザインスによる
螢光光度計である。アラージエネデイツク螢光光度計（
アラージエネテイツク社、マウンテンピコ−、カリポル
ニア）が好適である。

本発明を更に以下の特定的であるが非制限的な実施例に
よって例証する。温度は摂氏であり１つ濃度は特にこと
わりのない限りは重用％とじτ表わブー。

１１１工 不透明なポリスチレンから成るミクロタイター板に、Ｍ
、オサリヴ７　ン（Ｎ４．　Ｏ−５ｕｌｌｉｖａ１１）
ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　３　ｉｏｃｈｅｍ、　１０
０．１００　（１９７９）の修飾手順に従って調製した
異なるクローンからの異なる全仏ヒ（〜Ｉ（ＩＥ単単口
ローン性抗体１００ミクロリッ１〜ル加える。抗体は０
．１重量％のす１〜リウムアシド防腐剤を含有する０゜
１Ｍリン酸塩緩衝溶液、ｐＨ８，５、中で使用する。

被覆］」＋７！を室温で２時聞く又は柊伎）進行さける
。被ｍ　ｌ稈の終りに、各ＩＤ中の液体を吸引にＪｚっ
で除き、担体を室温で１時間風乾する。

次いて月戸を、２．５重量？６のスフ［コース、０゜２
５重Ｌ）１冑）ｃノ）ウシの血清アルブミン、０．０５
重量％のノ１ヘリウムアジド及び１〜す１〜ンＸ４０５
を含有づ゛る０、１Ｎ・１リン酸塩緩衝溶液＜　ｆ）　
Ｂ　Ｓ　）と３０分間接触さけ、過剰の溶液を除いたの
ら、井戸を奥空乾％４４　シ且つ密封づる。かくして被
覆した井戸は思召の而）＾を全ＩｇＦ抗体に対して検定
づ−るために用いることができる。

実施例２ 抗Ｉｇ１抗体がｆｑ着させ−Ｃある実施例１のミクロタ
イクー板月戸製品を、ＩｇＥ抗体を含有する患者の血清
ど接触させて１時間保温する。血清を除き、ｌ０を０．
０１Ｍリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７，２）中に０．８５重
塁％の塩化す１〜リウム、０．０５申吊％の１〜す１ヘ
ンＸ４０５及び０．１重量％のすｌ〜ツリウムシド防腐
剤を含有する緩衝した洗浄溶液によって、３回洗浄する
。血清ＩｇＥ特異性抗体をミクロタイター板井戸表面に
抱合させる。

次いてミクロタイター井戸を、Ｍ、第４ノリヴアンら、
Ａ　ｎａｌｙｔｉｃａｌ　［３１ｏｃｌ］ｅｍ、、　　
１００　、　１００（１９７９）の修飾手順に従って異
なるクローンから調製した抗ヒトＩｇＥ単りローン性抗
体の混合物から成る多クロニン性抗体の１００ミクロリ
ツトルの溶液と３０分接触させ、月つアルカリ性ホスフ
ァターゼに抱合さゼる。抗体を４重量％の４、０００の
分子量を有するポリエチレングリコール、０．０５重小
児の１−リドンＸ−４０５及び０゜１重量％のナトリウ
ムアジド防賠剤を含有する０゜０１Ｍリン酸塩緩衝食塩
水（１）ｌ−１７，２＞の溶液中に加える。アルカリ性
ボスファターゼ抱合抗ヒ１〜ＩｇＥ抗体溶液をミクロタ
イター板井戸から除き、それを前記の緩衝した洗浄液で
３回洗浄する。

次いでミクロタイター板井戸に０．１２５ｍＭの塩化マ
グネシウムと０．１重量％のす１ヘリウム７　シｌ”　
ヲ含有−！Ｉ−ルＩＩ！　イオ’）　水中ＣＤ　１　、
２５　Ｍ　（７）　２−ノアミノ−２−メヂルブロパノ
ール（吋−１９，５＞中に１０−４Ｍのリン酸４−メチ
ルランへりノエリルを含有り−る基質溶液１００ミクロ
リツ１〜ルを加える。３０分後に、螢光強度を３６５　
ｎｍにおける励起と４５　Ｑ　ｎｍにおける読みによっ
て螢光光度削を用いて測定する。

この読みを既知潤度の全ＩｇＥ抗体を有する対照溶液を
用いてこの手順を繰返ずことによって測定した螢光強度
と比較づることによって、思考の血清中の全１（Ｉ　Ｅ
１度を決定する。

実施例３ 実施例１のミクロタイター板井戸製晶（抗１ｇＦ抗体が
イ」着させである〉を、０．０１Ｍリン酸塩緩衝剤水溶
液＜　　１）Ｈ７，２）　、０．８５重量％の塩化すｌ
−リウム、０．０５重０％の１〜す１ヘンＸ／１０５．
０．０１重量％のＢＳＡ、及び０．１小川％のす１〜リ
ウムアジ１〜防腐剤を含有する緩衝した洗浄液を用いて
５分間洗浄したのち、過剰のン容液を除く。予備洗浄し
たグミロタイタ−板を次（１しＩ（ＩＥ抗体を含有する
患者の血清と接触させ１時間保温する。血清を除き、井
戸を緩衝した洗浄液で３回洗浄する。

緩衝した洗浄液は、容量で１部の）農Ｆ７液に対して容
量で５０部の蒸留水又は脱イオン水を用（Ｘで、下記の
淵ν液を希釈することによって調製する。：ウシの血清
アルブミン　　　　　　　０．５重Ｍ％非イオン界面活
性剤（トリ１〜ンＸ−４０５）０．１重量％ 塩化す］〜リウム　　　　　　　　　１７　　車ｍ％す
１−リウムアシト　　　　　　　　　２　単量％リン酸
す１ヘリウム　　　　　　　　　０．０５　ＭｐＨを７
．４に調節 血清Ｉ９［抗体をミクロタイター板月戸表面に抱合させ
る。

次いでミクロタイター井戸を、Ｍ、オサリヴアンら、△
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　［３ｉｏｃｂｅｍ、　、　　１０
０　、１００（１９７９）の修飾手順（ご従って調製し
た異なるクローンからの抗ヒｌ−１（ＩＥ単り［−コー
ン性抗体の混合物に３１シ（−抱合さけたアルカ、り性
ホスファターゼの１００ミクロリツ１〜ルの溶液と３０
分間接触させる。抗体は、４重量％の／１．　ＯＯＯの
分子量を石りるポリ丁ブーレングリ］−ル（Ｐ　Ｅ　Ｇ
　４０００）、０．０５重０％の］へり１〜ンＸ　−４
０５，０゜０１重＾）（ｌε）のＢ　Ｓ△、及び０．１
重量％のす１へ１ノウムアシ１〜防戚剤を含有する０、
０１ｔｖｌリン酸塩緩ｔｊｊ食塩溶液（ｐｌ−１７，２
＞中で使用づる。アル−カリ刊ホスファターゼ抱合抗ヒ
）−１１１Ｆ抗体溶液をミグ１−］ターｒター板井戸か
ら除き、口つそれを前記の緩衝した洗浄液を用いて３回
洗浄する。

次いで゛ミグｍｌタイター板井戸に対して０．１２５ｍ
Ｍの塩化マグネシウムと０．′１重世％のす（〜リウム
アジドを含有する脱イオン水中の１．２５Ｎ４２−アミ
ノ−２−メチルプロパツール、ｐｌ−１９，５、中に１
０−”Ｍのリン酸４−メチルウンベリフ上すルを含有す
る１００マイクロリツ１〜ルの基質溶液を加える。３０
分後に、螢光強度螢光光度計により３　（３５ｎｍにａ
５りる励起と４５　Ｑ　ｎｍにおける読みを用いて測定
Ｊ−る。この読みを既知潤度の全１ｇＥ抗体を有する対
照溶液を用いてこの手順を繰り返す−ことによって測定
した強度と比較することにより、忠者の血清中の全Ｉｇ
Ｅｉｅ度を決定する。

支九乱先 不透明なポリスチレンから成るミクロタイター板に、Ｍ
、オサリウアンら、Ａ　ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ　ｉｏ
　−ｃｌ＞ｅｍ、、　　１００．１００　（１９７９）
の修飾した手順に従って調製した１００ミクロリツ１〜
ルの全抗ヒ］〜ＩｇＥ単り［コーン性抗体の溶液を加え
る。

単クローン性抗体は０１１重量％のナトリウムアジド防
腐剤を含有する０、１Ｍリン酸塩緩衝溶液中で使用する
。

被覆工程を空温で２時聞く又は終夜）進行さぜる。被覆
工程の終りに、各井戸中の液体を吸引によって除き、担
体を室温で１時間風乾する。

次いで１戸を、２．５重Ｄ％のスクロース、０゜２５千
畢宍；のウシの血清アルフミン、０．０５巾吊％のプ１
〜リウムアシ１〜及びｌ−リ１〜ンＸ４０５を含有する
０、１〜１リン酸］ハ緩衝溶液と３０分間接接触ぜ、過
剰の）ｄ液を除き、且つ井戸を真空乾燥しのち、密封り
゛る。かくして被覆した井戸は全Ｉｇ［抗体につい（−
思考の血清を検定づ−るために用いることができる。

実施例５ 抗ＩＱト抗体が付着させである実施例４のミクロタイタ
ー板井戸製品を、ＩｇｌＥ抗体を含有する思考の血清と
接触させ、１時間保温する。血清を除き、ｐｌ−ｌ　７
　、　２のＯ，，０１ＮＩ＋リン酸塩緩雨水溶液中に０
．８５１旧６のＪｎ化す１〜リウム、０．０５重量％の
（〜す１ヘンＸ４０５及び０．１重量％のナトリウムア
ジド防腐剤を含有１−る緩衝した洗浄液て川戸を３回洗
浄する。面イ＾Ｉｇｆ＝特異性抗体がミクロタイター板
井戸表面に抱合する。

次い（“ミクロタイター井戸を、Ｎ１１．オザリウアン
ら、Ａ　ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　
１００　、　１００（１９７９）の修飾手順に従ってＨ
Ｉ３　製したアルカリ性小スファターゼ抱合抗ヒト］ｑ
Ｅ単クローン性抗体の１００ミクロリツｉ〜ルの溶液と
３０分接触させ、単クローン性抗体は４ｆｆｌｆｆｉ％
の分子員４０００ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０
００）、０．０５重量％のトリトンＸ−４０５及び０．
１重量％のすｌ〜ツリウムジド防腐剤を含有する、Ｉ）
Ｈ／、２のＯ：　０１Ｍリン酸塩緩衝食塩溶液中−Ｃ使
用する。アルカリ性小スファターゼ抱合抗ヒ１へＩ９Ｆ
単クローン性抗体温液をミクロタイター板井戸から除き
、前記の緩衝洗浄液によって３回洗浄する。

次いでミクロタイター板井戸に０．１２５ｍＭの塩化マ
クネシウムと０．１重量％のす１〜リウムアジドを含有
する脱イオン水中の１．２５Ｍ２−アミノ−２−メチル
プロパツール（ｐＨ９，５）中に１０−　’　Ｍのリン
酸ウンベリフェリルを含有する１００ミクロリツトルの
基質溶液を加える。

３０分１りに、螢光光度訓を３６５　ｎｍにおける励起
と４５０　ｎｍにおｌＪる読みにより螢光強度を測定す
る。この強度の読みを既知潤度の全１（ＩＥ抗体を右す
る対照溶）１夕を用いてこの手順を繰返すことによって
測定した強度と比較することにより、思考の血清中の全
１９ＥｉｌＢ度を決定する。

実施例６ 実施例４のミクロタイター板月戸（抗１ｇＥ抗体が付着
ざけである）を、０．０１Ｍリン酸塩緩衝剤水溶）１り
（ｐｔ−１７，２＞中に０．８５重量％の塩化すトリウ
ｌ＼、０，０５重市％の１〜リドンＸ４０５．０．０１
重色％のＢＳ△、及びＯ，ｌｔｉ最％のす１ヘリウムア
シド防腐剤を含イ１する緩衝した洗浄液Ｃ５分間洗浄す
る。予備洗浄したミクロタイター板を次いで■ｇＥ抗体
を含有する患右の血清と接触さｌ！１時間保温する。血
清を除き、井戸を緩衝した洗浄液によって３回洗浄する
。

緩衝した洗浄）１々は、下記の詣厚液を容量で１部の詣
り液に対して容口で５０部の蒸留水又は説イオン水で希
釈覆ることによって、調製づ゛る。：ウシの血清アルブ
ミン　　　　　　　０．５ｍ１％゛非イオン界面活性剤
（トリ１ヘンＸ−４０５＞（）、１重量％ 塩化す１ヘリウム　　　　　　　　　１７〔−矛％すｌ
ヘリウド、アジ１ミ　　　　　　　　　２１１゜リン酸
ヲｌ〜リウム　　　　　　　　　Ｑ　、　０５　ＭｐＨ
を７．４に調節 血清１ｑＥ抗体をミクロタイター板井戸表面に抱合づ−
る。

次いでミクロクイター井戸を、ＮＩＩ　、オサリウアン
ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　１
００．　１００（１９７９）の修飾手順に従って調製し
たアルカリ性小スタフアーゼ抱合抗ヒトＩｆＪＥ単り［
］−ン性体温の１００ミクロリツｌ−ルの溶液と３０分
間接触させる。単クローン性抗体は、４　ｍ　ｆｆｌ　
’、’ｉ、の分子ｍ４０００のポリエチレンクリコール
（Ｆ′Ｅ　Ｇ４０００＞、０．０５重０％のトリ１−ン
Ｘ−４０５，０，０１手け％のＢＳＡ、及び０．１単向
％のす１ヘリウムアジド防１帛剤を含有する０、０１Ｍ
リン酸Ｊふ緩衝食塩溶液（＋）Ｈ／、２＞中で使用する
。アルカリｔ’ｌ−小スファターゼ抱合抗ヒｌ−１（Ｉ
Ｅ単クり−ン刊抗体溶液をミクロタイター仮井戸から除
き、それを前記の緩衝した洗浄液Ｃ３回洗浄り−る。

次いでミクロタイター仮用戸に刑して０．１２５　ｍ　
Ｍのｊ７Ａ化マクネシウムと０．１重量％のす１〜リウ
ムアシドを含有する税イオン水中の１．２５Ｍ　２−ア
ミノ−２−メチルプロパツール（ｐＨ９゜５）中に１０
−”　１１．ｌＩのリン酸４−メチルランへりフエリル
を含有する基質溶液１００マイクロリッ（〜ルをＩＪＩ
Ｉえる。３０分後に、螢光光度３１を用いて３６５　ｎ
ｍに６３　Ｃ：ｊる励起と４５０ｎｍにおける読みによ
って螢光強度を測定する。この読みを既知温度の全１ｇ
Ｆ抗体をイｉする対照溶液を用いてこの手順を傑り返ず
ことによって測定した強度と比較することにより、１９
者の血清中の血清全１　ｇ’　Ｅ　８度を決定ηる。

第１頁の続き 優先権主張　＠１９８４年２月３日■米国（ＵＳ）［有
］５７６５８６ ０発　明　者　マイロン・エイ・ベイグラ−アメリカ合
衆国カリフォルニア 州９４０２２０スアルトスヒルズ。

マニュエラ口一ド１４７８０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．８）抗ＩＱＥ抗体が付着させである不溶性担体を患
   者の血清と抱合を生じさせるに充分な時間にわたって接
   触させ且つ患者の血清をそれから取り除き； ｂ）不溶性担体をフルオログン性酵素で標識付けした抗
   ＩｇＥ抗体と接触させ且つ抱合していない酵素標識付は
   抗１９Ｅ抗体をそれから取り除き； Ｃ）不溶性担体をフルオロゲン酵素の存在において反応
   を受（）て螢光性の生成物を与える基質の溶液と接触さ
   せ、そして （１）この溶液中の螢光の強度を測定する、ことから成
   る患者の血清中の全ＩＣＥ淵度を鑑識し且つ定量するた
   めの方法であって、不溶性担体上の抗１ｇＥ抗体及び標
   識イ」けした抗１ｇＥ抗体はそれぞれ、親和力精製した
   多クローン性抗体又は複数の異なるクローンから誘導し
   た単クローン性抗体の混合物より成る群から選択される
   方、法。 ２、不溶性担体は不透明な材料によって分離された複数
   の反応井戸を有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、不溶性担体は不透明材Ｆ４製のミクロタイター板で
   ある特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、抗］ｏＥ抗体は複数の異なるクローンからの単クロ
   ーン性抗体の混合物である特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ５、抗１９Ｅ抗体をアルカリ性ボスファターゼによって
   標識（＝ｌすする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、基質はリン酸４−メチルランへリフエリルである特
   許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、ミクロタイター板はボリスヂレン又はスヂレンー（
   ビニルモノマー）共Ｑ合体である特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ８．不溶性担体を、段階（１））において、１０００〜
   １００００の範囲内の分子量を有するポリエチレングリ
   コールを１〜８重量％含有する水溶液中で、酵素標識付
   けした抗Ｉ（ＩＥ抗体と接触させる特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ９、水溶液は０．０１＝０．１重世％の非イオン界面活
   性剤を含有する特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、非イオン界面活性剤はオクチルフエノキシボリエ
   １−キシエタノールである特許請求の範囲第９項記載の
   方法。 １１、不溶性担体を、段階（１））において、０．０１
   〜０．１重量％の非イオン界面活性剤を含有する水溶液
   中で酵素標識付けした抗１ｇＥ抗体と接触させる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 １２、患者の血清を、段階（ａ　）において、６〜８の
   範囲内の１）ｌ−１を有し且つ非イオン界面活性剤を含
   有するリン酸塩緩衝溶液で洗浄することによって不溶性
   担体から取り除く特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３、抱合し−Ｃいない抗１ｑＥ抗体を、段階（１））
   において、６〜８の範囲内のＤＨを有し且つ非イオン界
   面活性剤を含有するリン酸緩衝溶液を用いて不溶性担体
   から取り除く特許請求の範囲第１項記載のブ〕法。 １４、不溶性担体を患者の血清と接触させる前に０゜０
   ００１〜０．５重量％の動物蛋白質を含有する水性緩衝
   溶液で予備洗浄する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １５゜可溶性動物蛋白質はウシの血清アルブミンである
   特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １（３，ａ）抗１ｇＥ抗体が（＝Ｊ着させである不透明
   ポリスチレン又はスチレン−（ヒニルモノマー）共重合
   体担体を、患者の血清と、血清１９Ｆ抗体のそれに対す
   る抱合が生じるに充分な時間にわたって接触さぜ： １））残留する患者の血清を担体から取り除き；Ｃ）担
   体を、ポリエチレンクリコール及び非イオン界面活性剤
   を含有する水溶液中でフルオロゲン性酵素で標識付けし
   た抗１ｇＥ抗体と、担体に抱合したアレルゲン特異性Ｉ
   ＶＩＥｌ＼の抗１ｇ［Ｅ抗体の抱合を生じさせる（こ充
   分な時間接触さぜ： （１）残留する患者の血清を担体から取り除き：ｅ）担
   体をフルオロゲン性酵素の存在において反応を受りて螢
   光性の生成物を与える基質の溶液と接触させ：そして ｆ）溶液の螢光の強度を測定する、 ことから成る特許請求の範囲第１項記載の方法。 １７、抗ＩすＥ抗体が付着させである不溶性担体は水溶
   性１ナツカリドと水溶性動物蛋白質を含有する水性の緩
   衝溶液で処理されである特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 １８、抗しｔＥ抗体が付着させてあり、表面上に水溶性
   サツカリドと水溶性動物蛋白質の複合体を有している不
   溶性担体。 １９、抗１（ＩＥ抗体が非共有結合（こよって不溶性担
   体の表面に付着している特許請求の範囲第１８項記載の
   不溶性担体。 ２０、不溶性担体はスチレン−（ビニル七ツマ−）共重
   合体としく−のポリスチレンである特許請求の範囲第１
   ９項記載の不溶性担体。 ２１、不溶性担体はミク〔］タイター井戸である特許請
   求の範囲第２０項記載の不溶性担体。 ２２、水溶性複合体は、抗ＩｇＥ抗体が付着させである
   不溶性担体を水溶性リーツカリドと水溶性動物蛋白質を
   含有する水性緩ｙＪ溶液℃゛処理することによって生成
   される特許請求の範囲第２０項記載の不溶性１１１体。 ２３、緩衝溶液は６〜８のｐＨを有し、０．０５〜１．
   ０重量％の水溶性動物蛋白質と０．１〜５゜０重量％の
   水溶性サツカリドを含有する０、０１〜０．５Ｍリンｔ
   ’Ｉ！塩緩衝溶液である特許請求の範囲第２２項記載の
   不溶性担体。 ２４、付着した蛋白質を伴なう不溶性担体を、６〜８の
   ｐＨを有し、０．０５〜１．０重量％の水溶性動物蛋白
   質と０．１〜５．０重量％の水溶性サツカリドを含有す
   る０、０１〜０．５Ｍリン酸塩緩衝溶液と接触させるこ
   とによって、不溶性担体に付着する蛋白質を安定化する
   ための方法。 ２５、蛋白質は抗体である特許請求の範囲第２４項記載
   の方法。 ２Ｇ、蛋白質は非共有結合によって不溶性担体に結合し
   た抗１ｑＥ抗体である特許請求の範囲第２５項記載の方
   法。