BRPI0918178B1

BRPI0918178B1 - Anticorpos monoclonais para tratamento de câncer

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Publication number: BRPI0918178B1
Application number: BRPI0918178-4A
Authority: BR
Inventors: Ugur Sahin; Özlem Türeci; Rita Mitnacht-Kraus; Michael Koslowski
Original assignee: Johannes Gutenberg- Universität Mainz; Ganymed Pharmaceuticals Ag
Priority date: 2008-09-16
Filing date: 2009-09-16
Publication date: 2021-04-06
Also published as: NZ596490A; JP2012502938A; HK1253579A1; EP3312198A1; NO2342234T3; CN104628858B; HRP20180262T1; AU2009294896A1; EP2342234B1; ES2659718T3; LT2342234T; IL242204B; CN104628858A; BRPI0918178A8; NZ591004A; MX357010B; EP2342234A2; CN102164963A; US8946388B2; TR201802090T4

Abstract

anticorpos monoclonais para tratamento de câncer a presente invenção provê anticorpos úteis como terapêutica para tratamento e/ou evitar doenças associadas a células que expressam gt468, incluindo doenças relacionadas a tumor como câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer hepatocelular, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer esofágico, câncer de cabeça & pescoço, câncer de rim, em particular carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer de fígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placental, câncer cervical, e câncer de tiróide, e as formas metastáticas dos mesmos. em uma modalidade, a doença de tumor é câncer metastático no pulmão.

Description

ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA TRATAMENTO DE CÂNCER

Terapias de câncer baseadas em anticorpo têm sido introduzidas com sucesso na clinica em emergiram como a terapêutica mais promissora em oncologia durante a última década.

Terapias à base de anticorpo para câncer têm o potencial de especificidade mais elevada e perfil de feito colateral mais baixo em comparação com drogas convencionais. O motivo é uma distinção precisa entre células normais e neoplásicas por anticorpos e o fato de que seu modo de ação se baseia em mecanismos anti-tumor imunológicos menos tóxicos, como ativação de complemento e recrutamento de células imunes citotóxicas.

Os alvos para terapias baseadas em anticorpo necessitam ter qualidades especificas, que formam a base para discriminação adequada entre células normais e neoplásicas. Obviamente, um alvo com restrição exclusiva a células de tumor e totalmente não detectável em tecidos normais é ideal para o desenvolvimento de terapêutica de anticorpo eficiente e segura. Em outro aspecto, uma superexpressão de alto nível pode ser a base para a janela terapêutica e efeitos colaterais baixos exemplificados pelo tipo de receptor de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2) que como resultado de amplificação de gene é um bom alvo para o anticorpo trastuzumab (Herceptina).

Outros alvos para anticorpos que já são aprovados ou em desenvolvimento clinico para terapia de tumor têm qualidades distintas, que não são baseadas em uma superexpressão numérica de moléculas alvo em células de tumor. No caso de anticorpos ao proteoglicano MUC-1, um epítopo de repetição de peptídeo na espinha dorsal do alvo é subglicosilada em células de tumor e desse modo altera para sua cópia normal. No caso de anticorpos para CD20 (rituximab), CD52 (Campath-1H) e CD22 (epratuzumab), alvos de anticorpo têm níveis de expressão comparáveis em células de tumor e linfócitos normais. Aqui, a ablação de células normais pelo anticorpo é tolerável uma vez que células tronco negativas-alvo recuperam o repertório de linfócito normal. Outros exemplos de acessibilidade diferencial de alvos de anticorpo são antígeno carcinoembrional (CEA) e carboanidrase IX (CA9). Os dois antígenos são expressos em epitélios normais de cólon e rim, respectivamente. Entretanto, anticorpos de imageamento rotulados radioativamente distinguem bem entre tecido normal e de tumor, e anticorpos citotóxicos são bem tolerados. Isso é mais provavelmente devido a uma expressão restrita de CA9 e CEA no lado luminal de tecido epitelial normal onde anticorpos de IgG não têm acesso. Além disso, a molécula de adesão de célula epitelial de antigeno (Ep-CAM) pertence a essa categoria. Como uma molécula de adesão de célula homotipica para células epiteliais é localizada no espaço intercelular. De forma intrigante, embora anticorpos anto-Ep-CAM de alta afinidade sejam muito tóxicos, anticorpos de afinidade intermediária são bem tolerados. Isso spere acessibilidade do alvo Ep-CAM em células normais, porém também indica que cinética de ligação de anticorpo pode abrir uma janela terapêutica.

Oito anticorpos foram aprovados para tratamento de doenças neoplásicas, a maioria deles, entretanto, em linfoma e leucemia (Adams, G. P. & Weiner, L. M. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 1147-1157). Somente três mAbs, a saber, Herceptina, avastina e Erbitux, tratam de tipos de câncer sólido, que respondem por mais de 90% de mortalidade evocada por câncer. A necessidade médica restante substancial, mAbs aprovados beneficio clinico significativo já forneceram e seu sucesso comercial considerável motivou uma onda de abordagens inovadoras equilibradas não somente para desenvolver terapias à base de anticorpo para grupos estendidos de pacientes como também para melhorar sua eficácia (Brekke, O.H. & Sandlie, I. (2003) Nat. Rev. Drp. Discov. 2, 52-62; Carter, P. (2001) Nat. Rev. Cancer 1, 118-129).

Um dos desafios a serem dominados para o avento da próxima geração de terapêutica de câncer baseada em anticorpo upgraded é a seleção de moléculas alvo apropriadas, que é a chave para um perfil de eficácia/toxicidade favorável.

Os anticorpos atuais disponíveis para o tratamento de cânceres sólidos devido à expressão de seus alvos em tecidos normais não exploram suficientemente a potência cumulativa de modos de ação incorporados em moléculas de anticorpo. Her2/neu, por exemplo, o alvo de Herceptina, é expresso em muitos tecidos humanos normais incluindo músculo do coração (Crone, S. A., Zhao, Y. Y., Fan, L., Gu, Y., Minamisawa, S., Liu, Y., Peterson, K. L., Chen, J. , Kahn, R., Condorelli, G. e outros. (2002) Nat. Med. 8, 459-465) . Como conseqüência, Herceptina foi projetado com uma potência imunológica reduzida e não pode ser dada na dose eficaz máxima, devido à toxicidade de outro modo inaceitável. Esse "embotamento de uma faca potencialmente afiada limita a eficácia terapêutica de Herpecetina.

Além da falta de expressão em tecidos normais relevantes em toxicidade, expressão elevada e robusta na superfície das células de tumor e apresentação de uma função de promoção de tumor são características desejáveis para um alvo de anticorpo ideal (Houshmand, P. & Zlotnik, A. (2003) Curr. Opin. Cell Biol. 15, 640-644).

Utilizando uma abordagem de validação experimental e exploração de dados integrados para a descoberta de novos alvos para terapia de anticorpo de câncer os requerentes identificaram GT468. GT468 é um gene especifico de placenta que é frequentemente aberrantemente ativado e altamente expresso em uma variedade de tipos de tumor, em particular câncer de mama. O silêncio mediado por RNAi de GT468 em células de câncer de mama de MCF-7 e BT-549 prejudica profundamente a motilidade, migração e invasão e induz um bloco de ciclo de célula G1/S com ab-rogação quase completa de proliferação. O abate de GT468 é associado à expressão diminuída de ciclina D1 e fosforilação reduzida de AΚΤ cinase. Além disso, GT468 é localizada na superfície de células de câncer e é acessível para anticorpos que antagonizam funções biológicas dessa molécula.

GT468 tem várias propriedades que a tornam um alvo altamente atraente para anticorpos terapêuticos. Sendo um antígeno de diferenciação de uma linhagem de célula que aparece no corpo humano somente em tal estado excepcional como gravidez, está tão ausente de tecidos relevantes em toxicidade saudável como um auto-antígeno pode possivelmente estar. Sua elevada prevalência em uma variedade de entidades de tumor tornaria um número amplo de pacientes elegíveis para tratamento com terapias de alvejar GT468. No caso de câncer de mama, por exemplo, 82% das pacientes carregam esse alvo. Her2/neu, ao contrário, o alvo de Herceptina, o único mAb disponível para tratamento desse tipo de câncer, é superexpresso somente em 20-25% de pacientes com câncer de mama (Slamon, D. J., Godolphin, W. , Jones, L. A., Holt, J. A., Wong, S. G. , Keith, D. E., Levin, W. J., Stuart, S. G., Udove, J., Ullrich, A. e outros. (1989) Science 244, 707-712). Para câncer de pulmão e para câncer gástrico, nos quais GT468 é expresso em 42 e 58% dos casos respectivamente, não há tratamento com mAb aprovado até o presente devido à falta de alvos apropriados nesses tipos de câncer.

GT468 é alvejado por anticorpos em células vivas e tais anticorpos podem precipitar efeitos antitumorais como inibição de proliferação. GT468 está envolvido não somente em proliferação como também motilidade de célula, migração e invasão. Mais interessante, todos esses atributos não contribuem substancialmente para o fenótipo de tumor porém são também propriedades inerentes do trofoblasto humano, cujas características fisiológicas são para crescer rápido e invadir eficientemente o tecido do útero. Espera-se que mAbs contra GT468 possa ser construído, que interfira com todas essas funções de uma vez no topo de seu potencial para mediar funções efetoras imunes como ADCC e CDC.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê genericamente anticorpos úteis como terapêutica para tratamento e/ou prevenção de doenças associadas a células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizados por associação de GT468 com sua superfície de célula, incluindo doenças relacionadas a tumor como câncer, em particular câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer hepatocelular, câncer de colón, câncer pancreático, câncer esofágico, câncer de cabeça & pescoço, câncer de rim, em particular carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer de fígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placental, câncer cervical, e câncer de tiróide, e as formas metastáticas dos mesmos. Em uma modalidade, a doença de câncer é câncer metastático no pulmão.

Em um aspecto a invenção refere-se a um anticorpo tendo a capacidade de ligar-se a GT468. Os anticorpos descritos aqui são preferivelmente anticorpos monoclonais isolados que específicamente se ligam a um epítopo presente em GT468, preferivelmente um epítopo localizado no domínio extracelular de GT468, mais preferivelmente SEQ ID Nos: 3-10 e 35-82. preferivelmente, o anticorpo tem a capacidade de se ligar a GT468 localizado na superfície da célula e preferivelmente se liga a um ou mais epítopos localizados no domínio extracelular de GT468, preferivelmente nos resíduos de aminoácido 23-212 de GT468, e mais preferivelmente se liga a um epítopo localizado em uma das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3-10 e 35-82. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é específico para uma ou mais das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3-10 e 35-82. Em várias modalidades, o anticorpo tem a capacidade de se ligar a um peptídeo que compreende aminoácidos 29 a 119, preferivelmente aminoácidos 29 a 212 e mais preferivelmente aminoácidos 23 a 212 da SEQ ID NO: 2.

Anticorpos monoclonais abrangidos pela presente invenção incluem anticorpos IgA, IgG1-4, IgE, IgM, e IgD. Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo IgG1, mais particularmente um IgGl, kappa ou IgG1, isotipo lambda. Em outra modalidade o anticorpo é um anticorpo IgG3, mais particularmente um IgG3, kappa ou IgG3, isotipo lambda. Ainda em outra modalidade o anticorpo é um anticorpo IgG4, mais particularmente um IGG4, kappa ou IgG4, isotipo lambda. Ainda em outra modalidade o anticorpo é um anticorpo IgA1 ou IgA2. Ainda em outra modalidade o anticorpo é um anticorpo IgM.

Em uma modalidade o anticorpo da invenção se liga a um ou mais dos peptideos de acordo com SEQ ID os: 75-79. Em uma modalidade, o anticorpo se liga ao peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 75 e/ou o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 7 6, mais preferivelmente se ao peptídeo de acordo com SEQ ID NO:75 e o peptídeo de acordo com SEQ ID NO:76. Em outra modalidade, o anticorpo se liga ao peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 77 e/ou o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 78 e/ou o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 79, mais preferivelmente se ligam ao peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 78 e o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 79 ou se liga ao peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 77, o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 78 e o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 79.

Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é obtido utilizando o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 4 ou o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 80 para imunização. Em outra modalidade, o anticorpo da invenção é obtido utilizando o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 6 ou o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 81 para imunização. Preferivelmente, o anticorpo da invenção se liga a um ou mais dos peptideos.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo que se liga ao peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 75 e/ou o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 76, mais preferivelmente se ligam ao peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 75 e o peptídeo de acordo com SEQ ID NO:75 é obtido utilizando o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 4 ou o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 80 para imunização. Em outra modalidade, o anticorpo que se liga ao peptídeo de acordo com SEQ ID NO:77 e/ou o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 7 8 e/ou o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 79, mais preferivelmente se ligam ao peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 78, e o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 79 ou se liga ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 77, o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 78 e o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 79 é obtido utilizando o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 6 ou o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 81 para imunização.

Em uma modalidade, o anticorpo da invenção se liga a um ou mais peptídeos de acordo com as SEQ ID NOs:61-66. Em uma modalidade, o anticorpo se liga ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 61 e/ou o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 62, mais preferivelmente se ligam ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 61 e o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 62. Em outra modalidade, o anticorpo se liga ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 64 e/ou o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 65, mais preferivelmente se ligam ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 64 e o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 65. Em outra modalidade, o anticorpo se liga ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 65 e/ou o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 66, mais preferivelmente se ligam ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 65 e o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 66.

Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é obtido utilizando o peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 82 para imunização. Preferivelmente, o anticorpo da invenção se liga ao peptídeo. O peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 82 tem um ligador GS de terminal-C que foi adicionado para auxiliar na formação de uma ligação de dissulfeto entre aminoácidos 1 e 16 do peptídeo. Esse peptídeo lembra presumivelmente a conformação nativa de GT468. Anticorpos produzidos pelo hibridoma 51-1A-1 que foram obtidos utilizando o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 82 para imunização mostraram forte atividade de inibição em proliferação e formação de colônia de células de câncer que expressam GT468.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo que se liga ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 64 e/ou o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 65, mais preferivelmente se ligam ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 64 e o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 65 ou o anticorpo que se liga ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 65 e/ou o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 66, mais preferivelmente se ligam ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 65 e o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 66 é obtido utilizando o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 82 para imunização.

Em uma modalidade, o anticorpo da invenção se liga a um ou mais dos peptídeos de acordo com as SEQ ID Nos: 57-60. em uma modalidade, o anticorpo se liga ao peptídeo de acordo com SEQ ID Nos; 75 e/ou o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 58 e/ou o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 59, mais preferivelmente se ligam ao peptídeo de acordo com SEQ ID NO:57 e o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 58 e o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO:59. Em outra modalidade, o anticorpo se liga ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 59 e/ou o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 60, mais preferivelmente se ligam ao peptídeo de acordo com a SEQ ID NO: 59 e o peptídeo de acordo com a SEQ ID NO:60.

Preferivelmente, o anticorpo da invenção se liga a células de câncer, em particular células dos tipos de câncer mencionados aqui, e preferivelmente não se liga substancialmente a células não cancerosas, mais preferivelmente não se liga substancialmente a células não cancerosas diferentes de células placentais e células de testículos. Preferivelmente, a ligação do anticorpo a células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula como células de câncer media o extermínio das células e/ou inibe uma ou mais atividades de tais células como motilidade,migração, invasão, proliferação e/ou formação de colônia. Preferivelmente, o anticorpo inibe proliferação e/ou formação de colônia das células.

O extermínio de células e/ou inibição de uma ou mais atividades de células, em particular proliferação de célula e formação de colônia, pelo anticorpo da invenção é preferivelmente induzida por ligação do anticorpo a GT468 expresso pelas células e/ou sendo associado à superfície de célula das células. Tal extermínio de células e/ou inibição de uma ou mais atividades de células pode ser utilizado terapeuticamente como descrito aqui. Em particular, o extermínio de células e/ou inibição de proliferação de células e/ou inibição de formação de colônia de células podem ser utilizados para tratamento ou prevenção de câncer, incluindo metástase de câncer. A inibição de motilidade, migração, invasão, proliferação e/ou formação de colônia de células pode ser utilizada, em particular, para tratamento ou prevenção de metástase de câncer e o espalhamento metastático de células de câncer.

As células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula são preferivelmente células de câncer e são, em particular, selecionadas do grupo que consiste em células de câncer tumorigênico das seguintes doenças de câncer: câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer hepatocelular, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer esofágico, câncer de cabeça & pesco, câncer de rim, em particular carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer de fígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placental, câncer cervical, e câncer de tiróide, e as formas metastáticas dos mesmos. Em uma modalidade, a doença de câncer e câncer metastático no pulmão.

O anticorpo da invenção pode ser ligado a uma ou mais frações efetoras terapêuticas, por exemplo, radiorrótulos, citotoxinas, enzimas terapêuticas, agentes que induzem apoptose, e similares para fornecer citotoxicidade direcionada, isto é, extermínio de células de tumor.

Preferivelmente, o anticorpo da invenção media extermínio de células por induzir lise mediada por citotoxicidade dependente de complemento (CDC), lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), apoptose, adesão homotípica, e/ou fagocitose, preferivelmente por induzir lise mediada por CDC e/ou lise mediada por ADCC. Entretanto, a presente invenção também inclui modalidades em que o anticorpo exerce sua atividade como descrito aqui como extermínio de células e/ou inibição de uma ou mais atividades de células, por exemplo, proliferação de células e/ou formação de colônia, sem induzir lise mediada por citotoxicidade dependente de complemento (CDC), lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), apoptose, adesão homotípica e/ou fagocitose. Por exemplo, o anticorpo da invenção também pode exercer um efeito simplesmente por ligar-se a GT468 na superfície da célula, desse modo, por exemplo, bloqueando a proliferação das células. Em uma modalidade o anticorpo da invenção não induz lise mediada por CDC de células.

Preferivelmente, lise mediada por ADCC de células ocorre na presença de células efetoras, que em modalidades específicas são selecionadas a partir do grupo que consiste em monócitos, células mononucleares, células NK e PMNs, e fagocitose por macrófagos.

Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo da invenção tem a atividade de inibir ou reduzir proliferação de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula, preferivelmente células de câncer como células de câncer de mama. Essa atividade pode ser medida in vitro por determinar proliferação de células de câncer que expressam GT468 em um ensaio utilizando bromodesoxiuridina (5-bromo-2-desoxiuridina, BrdU). BrdU é um nucleosídeo sintético que é um análogo de timidina e pode ser incorporado no DNA recentemente sintetizado de células de replicação (durante a fase S do ciclo de células), substituindo por timidina durante replicação de DNA. A detecção do produto químico incorporado utilizando, por exemplo, anticorpos específicos para BrdU indica células que estavam ativamente repicando seu DNA. As linhagens de células BT-549, Caov-3, EFO-21, SK-BR-3, MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 podem ser utilizadas como células de câncer que expressam GT468. Em uma modalidade preferida, o anticorpo da invenção inibe ou reduz a proliferação de uma ou mais das linhagens de célula SK-BR-3, MCF-7 e MDA-MB-468, preferivelmente inibe ou reduz proliferação de ambas as linhagens de células SK-BR-3 e MCF-7, e mais preferivelmente inibe ou reduz a proliferação de todas as linhagens de células SK-BR-3, MCF-7 e MDA-MB-468. Anticorpos preferidos da invenção nesse aspecto são selecionados do grupo que consiste em (i) anticorpos produzidos por e/ou obteníveis a partir das hibridomas 35-48B-1, 35-50A-2a, 38-10B-1, 38-1A-1, 45-2A-1, 45-8A-2, 48-3B-1, 48-4Α-1, 49-3Α-1, 51-1A-1, 53-13Α-2, 53-29Α1, 56-4Α-2, 62-9Β-1, 78Η11 1Η6 e 44-3A-2, (ii) anticorpos que são formas quimerizadas ou humanizadas dos anticorpos de acordo com (i), e (iii) anticorpos tendo a especificidade dos anticorpos de acordo com (i) e, em particular, anticorpos compreendendo a porção de ligação de antigeno ou sitio de ligação de antigeno, em particular a região variável dos anticorpos de acordo com (i). anticorpos particularmente preferidos da invenção nesse aspecto são selecionados do grupo que consiste em (i) anticorpos produzidos por e/ou obteníveis a partir dos hibridomas 35-48B-1, 48-3B-1, 51-1A-1, e 56-4A-2, (ii) anticorpos que são formas quimerizadas ou humanizadas dos anticorpos de acordo com (i) , e (iii) anticorpos tendo a especificidade dos anticorpos de acordo com (i) e em particular, anticorpos compreendendo a porção de ligação de antigeno ou sítio de ligação de antigeno, em particular a região variável, dos anticorpos de acordo com (i).

Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo da invenção tem a atividade de inibir ou reduzir a formação de colônias de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula, preferivelmente células de câncer como células de câncer de mama. Essa atividade pode ser medida in vitro em um ensaio clonogênico. As linhagens de células BT-549, Caov-3, EFO-21, SK-BR-3, MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 podem ser utilizadas como células de câncer que expressam GT468. Um ensaio clonogênico é uma técnica de microbiologia para estudar a eficácia de agentes específicos sobre a sobrevivência e proliferação de células.é freqüentemente utilizado em laboratórios de pesquisa de câncer para determinar o efeito de drogas ou radiação sobre células de tumor em proliferação. O experimento envolve três principais etapas: (i) aplicar um tratamento a uma amostra de células, em particular células de câncer, (ii) revestir as células em um vaso de cultura de tecido e (iii) permitir que as células cresçam. As colônias produzidas são fixas, coloridas e contadas. A formação de colônia é de importância com relação à formação de metástases se células de tumor individuais colonizarem órgãos. A atividade de inibição dos anticorpos indica seu potencial em suprimir a formação de metástases. Os anticorpos tendo a atividade de inibir ou reduzir a formação de colônia em um ensaio clonogênico são particularmente úteis para tratar ou prevenir metástase e o espalhamento metastático de células de câncer, em particular dos tipos de câncer mencionados aqui. Anticorpos preferidos da invenção nesse aspecto são selecionados do grupo que consiste em (i) anticorpos produzidos por e/ou obteníveis dos hibridomas 51G6 2H3 2B4, 78H11 1H6, 16-5B-1, 22-1A-1, 29-8B-1, e 51-1 A-1, (ii) anticorpos que são formas quimerizadas ou humanizadas dos anticorpos de acordo com (i) e (iii) anticorpos tendo a especificidade dos anticorpos de acordo com (i) e em particular, anticorpos compreendendo a porção de ligação de antígeno ou sítio de ligação de antígeno, em particular a região variável, dos anticorpos de acordo com (i). anticorpos particularmente preferidos da invenção nesse aspecto são selecionados do grupo que consiste em (i) anticorpos produzidos por e/ou obteníveis dos hibridomas 51G6 2H3 2B4, 29-8B-1, e 51-1 A-1, (ii) anticorpos que são formas quimerizadas ou humanizadas dos anticorpos de acordo com (i), e (iii) anticorpos tendo a especificidade dos anticorpos de acordo com (i) e em particular anticorpos compreendendo a porção de ligação de antígeno ou sítio de ligação de antígeno em particular a região variável, dos anticorpos de acordo com (i) .

Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo da invenção tem a atividade de inibir ou reduzir a proliferação de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula como explicado acima e tem a atividade de inibir ou reduzir a formação de colônia de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula como explicado acima. Anticorpos preferidos da invenção nesse aspecto são selecionados do grupo que consiste em (i) anticorpos produzidos por e/ou obteníveis do hibridoma 51-1A-1, (ii) anticorpos que são formas quimerizadas ou humanizadas dos anticorpos de acordo com (i), e (iii) anticorpos tendo a especificidade dos anticorpos de acordo com (i) e em particular, anticorpos compreendendo a porção de ligação de antígeno ou sítio de ligação de antígeno em particular a região variável, dos anticorpos de acordo com (i).

Em uma modalidade a invenção refere-se a anticorpos que (i) se ligam a células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula, e (ii) não se ligam a células não expressando GT468 e/ou não sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula. Os anticorpos da invenção preferivelmente (i) mediam extermínio e/ou inibem a proliferação de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula, e (ii) não mediam extermínio e/ou não inibem proliferação de células não expressando GT468 e/ou não sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula.

O anticorpo da invenção pode ser um anticorpo monoclonal, quimérico, humano ou humanizado ou um fragmento de um anticorpo e pode ser selecionado do grupo que consiste em um IgG1, um IgG2, preferivelmente IgG2a e IgG2b, um IgG3, um IgG4, um IgM, um IgA1, um IgA2, um IgA secretor, um IgD, e um anticorpo IgE.

Anticorpos da invenção incluem anticorpos totalmente humanos. Tais anticorpos podem ser produzidos em um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para GT468 por ser submetido à recombinação V-D-J e comutação de isotipo. Tal animal transgênico pode ser também um coelho transgênico para a produção de anticorpos policlonais como revelado no documento US 2003/0017534.

A ligação de um anticorpo da invenção ao antígeno GT468 pode mediar o extermínio de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula (por exemplo, uma célula de tumor), por exemplo por ativação do sistema de complemento, e/ou pode inibir proliferação de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula (por exemplo, uma célula de tumor). Alternativamente, ou além de mediar extermínio de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula e/ou inibir proliferação de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula, a ligação de um anticorpo da invenção ao antígeno de GT468 pode inibir motilidade, migração, formação de colônia e/ou invasão de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula (por exemplo, uma célula de tumor) e desse modo, pode inibir espalhamento metastático de células de tumor. O extermínio de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula pode ocorrer por um ou mais dos seguintes mecanismos: citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula; apoptose de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula; fagocitose de célula efetora de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula; ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo de célula efetora (ADCC) de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula.

De acordo com todos os aspectos da invenção, GT468 é preferivelmente GT468 humano, preferivelmente tendo a seqüência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 2, mais preferivelmente tendo a seqüência de aminoácido do domínio extracelular da seqüência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO:2, em particular tendo a seqüência de aminoácido que cobre de aminoácidos 23 a 212 da SEQ ID NO: 2.

Em modalidades preferidas específicas, o anticorpo da invenção se liga a epítopos nativos de GT468 presente na superfície de células vivas como aquelas de SDEQ ID Nos; 310 e 35-82. Em modalidades preferidas adicionais, o anticorpo da invenção é específico para células de câncer, preferivelmente células de câncer de mama. Preferivelmente, o anticorpo da invenção é específico para células de câncer que expressam GT468 como as linhagens de célula BT-549, Caov-3, EFO-21, SK-BR-3, MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 e não se liga a células de câncer não expressando GT468 como células de câncer gástrico Np-C4.

Em certas modalidades da invenção, GT468 é expresso em e/ou associado à superfície de células.

Anticorpos da invenção podem ser obtidos por um método que compreende a etapa de imunizar um animal com uma proteína ou peptídeo tendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 2-10 e 35-82, ou um fragmento imunogênico ou derivado do mesmo, ou um ácido nucléico ou célula hospedeira que expressa a proteína ou peptídeo, ou fragmento imunogênico ou derivado do mesmo. Preferivelmente, um anticorpo da invenção é específico para as proteínas acima mencionadas, peptídeos ou fragmentos imunogênicos ou derivados dos mesmos. No contexto de uma proteína ou peptídeo utilizado em imunização, um derivado se refere a uma variante de tal proteína ou peptídeo que tem as mesmas propriedades imunogênicas que a proteína ou peptídeo da qual é derivado. Em particular, o derivado de uma proteína ou peptídeo quando utilizado em imunização para a produção de anticorpos, em particular anticorpos monoclonais, provê anticorpos tendo a mesma especificidade que anticorpos obtidos ao utilizar a proteína ou peptídeo em imunização. Por exemplo, tal derivado pode incluir a deleção, substituição ou adição de um ou mais aminoácidos. Em particular, pode incluir a adição de um ou mais aminoácidos como cisteína na extremidade-N ou extremidade-C ou ambos.

Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo da invenção é produzido por um clone tendo o número de acessão DSM ACC2822 (4E9-1H9), DSM ACC2826 (9B6-2A9), DSMACC2824 (59D6-2F2), DSM ACC2825 (61C11-2B5), DSM ACC2823 (78H11-1H6), DSM ACC2895 (22-1A-1), DSM ACC2893 (22-2A-1), DSM ACC2896 (22-9B-1), DSM ACC2897 (23-33A-1), DSM ACC2891 (23-19A-1), DSM ACC2894 (F11#33F7D12), DSMACC28 92 (4A12 2D4 1A10), DSM ACC2898 (4E9 1D12 2D4), DSM ACC2961 (42H11 IC11 2B2), DSM ACC2962 (51G6 2H3 2B4), DSM ACC2943 (16-5B-1), DSM ACC2956 (20-11A-1), DSM ACC2947 (29-1A-2), DSM ACC2964 (29-8B-1), DSM ACC2959 (35-48B-1), DSM ACC2963 (35-50A-2a), DSM ACC2957 (38-10B-1), DSM ACC2958 (38-1A-1), DSM ACC2948 (44-3A-2), DSM ACC2949 (45-2A-1), DSM ACC2950 (45-8A-2), DSM ACC2951 (48-3B-1), DSM ACC2952 (48-4A-1), DSM ACC2946 (49-3A-1), DSM ACC2945 (49-8A-1), DSM ACC2944 (51-1A-1), DSM ACC2953 (53-13A-2), DSM ACC2955 (53-29A-1), DSM ACC2960 (54-4B-2), DSM ACC2954 (56-4A-2), ou DSM ACC3001 (62-9B-1).

Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é acoplado a um agente terapêutico como uma toxina, um radioisótopo, uma droga ou um agente citotóxico.

Em um aspecto adicional a invenção refere-se a um hibridoma capaz de produzir o anticorpo da invenção. Hibridomas preferidos são aqueles tendo o no. de acessão DSM ACC2822 (4E9-1H9), DSM ACC2826 (9B6-2A9), DSM ACC2824 (59D6-2F2), DSM ACC2825 (61C11-2B5), DSM ACC2823 (78H11-1H6), DSM ACC2895 (22-lA-l), DSM ACC2893 (22-2A-1), DSM ACC2896 (22-9B-1), DSM ACC2897 (23-33A-1), DSM ACC2891 (23-19A-1), DSM ACC2894 (F11#33F7D12), DSM ACC2892 (4A12 2D4 1A10), DSM ACC2898 (4E9 1D12 2D4), DSM ACC2961 (42H11 IC11 2B2), DSM ACC2962 (51G6 2H3 2B4), DSM ACC2943 (16-5B-1), DSM ACC2956 (20-11A-1), DSM ACC2947 (29-1A-2), DSM ACC2964 (29-8B-1), DSM ACC2959 (35-48B-1), DSM ACC2963 (35-50A-2a), DSM ACC2957 (38-10B-1), DSM ACC2958 (38-1A-1), DSM ACC2948 (44-3A-2), DSM ACC2949 (45-2A-1), DSM ACC2950 (45-8 A-2), DSM ACC2951 (48-3B-1), DSM ACC2952 (48-4A-1), DSM ACC2946 (49-3A-1), DSM ACC2945 (49-8A-1), DSM ACC2944 (51-1A-1), DSM ACC2953 (53-13A-2), DSM ACC2955 (53-29A-1), DSM ACC2960 (54-4B-2), DSM ACC2954 (56-4A-2), ou DSM ACC3001 (62-9B-1).

Anticorpos da invenção são designados aqui se referindo à designação do anticorpo e/ou por se referir ao clone que produz o anticorpo, por exemplo, 4E9-1H9.

Preferivelmente, os anticorpos da invenção têm a capacidade de discriminar variantes de GT468 expressas por tipos de células diferentes incluindo células de câncer e células não malignas.

Os anticorpos da invenção mediam, preferivelmente, extermínio de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula por ligar-se a GT468. Preferivelmente GT468 é expresso na superfície das células. Em uma modalidade, anticorpos da invenção induzem citotoxicidade dependente de complemento (CDC), por exemplo, pelo menos aproximadamente 20-40% de lise mediada por CDC, preferivelmente aproximadamente 40-50% de lise mediada por CDC, e mais preferivelmente mais do que 50% de lise mediada por CDC de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula. Alternativamente ou além de induzir CDC, anticorpos da invenção podem induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula na presença de células efetoras (por exemplo, monócitos, células mononucleares, células NK e PMNs). anticorpos da invenção podem ter a capacidade de induzir apoptose de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula, induzem adesão homotípica de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula e/ou induzem fagocitose de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula na presença de macrófagos. Os anticorpos da invenção podem ter uma ou mais das propriedades funcionais descritas acima. Preferivelmente, anticorpos da invenção induzem lise mediada por CDC e lise mediada por ADCC de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula enquanto não induzem lise mediada por CDC das células. Células alvo exemplares para anticorpos da presente invenção incluem, porém não são limitadas a, células de câncer que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula. Em uma modalidade preferida específica, o extermínio de células mediadas por anticorpos da invenção é específico de GT468, isto é, anticorpos da invenção mediam extermínio, preferivelmente lise mediada por CDC e/ou ADCC, de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula, porém não mediam extermínio de células não expressando GT468 e/ou não sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula. Os anticorpos descritos acima podem ser utilizados para mediar extermínio de células de tumor no tratamento ou prevenção de câncer como câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer hepatocelular, câncer de colón, câncer pancreático, câncer esofágico, câncer de cabeça & pescoço, câncer de rim, em particular carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer de fígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placental, câncer cervical, e câncer de tiróide, e as formas metastáticas dos mesmos. Em uma modalidade, a doença de câncer é câncer metastático no pulmão.

Anticorpos da invenção podem ser derivados de espécie diferente, incluindo, porém não limitados a camundongo, rato, coelho, porquinho-da-índia e ser humano. Os anticorpos da invenção também incluem moléculas quiméricas nas quais uma região constante de anticorpo derivada de uma espécie, preferivelmente ser humano, é combinada com o sítio de ligação de antigeno de outra espécie. Além disso, anticorpos da invenção incluem moléculas humanizadas nas quais os sítios de ligação de antígeno de um anticorpo derivado de uma espécie não humana são combinados com regiões de estrutura e constante de origem humana.

Anticorpos da invenção incluem anticorpos policlonais e monoclonais e incluem anticorpos IgG2a (por exemplo, IgG2a, K, X), IgG2b (e.g. IgG2b, K, X), IgG3 (e.g. IgG3, K, X) e IgM. Entretanto, outros isotipos de anticorpo são também abrangidos pela invenção, incluindo anticorpos IgG1, IgA1, IgA2, IgA secretor, IgD, e IgE. Os anticorpos podem ser anticorpos inteiros ou fragmentos de ligação de antigeno dos mesmos incluindo, por exemplo, Fab, F(ab')2/ fragmentos Fv de cadeia única ou anticorpos biespecíficos.
Além disso, os fragmentos de ligação de antigeno incluem proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação compreendendo (i) um polipeptídio de domínio de ligação (como uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve) que é fundido a um polipeptídio de região de articulação de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região de articulação, e (iii) uma região constante CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região constante de CH2. Tais proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação são adicionalmente reveladas nos documentos US 2003/0118592 e US 2003/0133939.

Anticorpos da presente invenção dissociam preferivelmente de GT468 com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de aproximadamente 1-100nM ou menos. Preferivelmente, anticorpos da invenção não reagem de forma cruzada com antígenos de superfície de célula relacionados e desse modo não inibem sua função.

Em modalidades preferidas, anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados por uma ou mais das seguintes propriedades:

a) Especificidade para GT468;
b) Uma afinidade de ligação a GT468 de aproximadamente 100 nM ou menos, preferivelmente, aproximadamente 5-10 nM ou menos e mais preferivelmente aproximadamente 1-3 nM ou menos,
c) A capacidade de mediar um alto nível de CDC em células CD55/59 negativas ou CD55/59 positivas;
d) A capacidade de inibir o crescimento de células que expressam GT468 e/ou são caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula;
e) A capacidade de induzir apoptose de células que expressam GT468 e/ou são caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula;
f) A capacidade de induzir adesão homotipica de células que expressam GT468 e/ou são caracterizadas pela associação de GT468 com sua superfície de célula;
g) A capacidade de induzir ADCC de células que expressam GT468 e/ou são caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula na presença de células efetoras;
h) A capacidade de prolongar a sobrevivência de um sujeito tendo células de tumor que expressam GT468 e/ou são caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula;
i) A capacidade de esgotar células que expressam GT468 e/ou são caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula;
j) A capacidade de esgotar células que expressam níveis baixos de GT468 e/ou são caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula e/ou
k) A capacidade de agregar GT468 na superfície de células vivas.

Os anticorpos anti-GT468 da presente invenção podem ser derivatizados, ligados a ou co-expressos com outras especificidades de ligação. Em uma modalidade específica, a invenção provê uma molécula biespecífica ou multiespecífica que compreende pelo menos uma primeira especificidade de ligação para GT468 (por exemplo, um anticorpo anti-GT468 ou mimético do mesmo), e uma segunda especificidade de ligação para uma célula efetora, como uma especificidade de ligação para um receptor Fc (por exemplo, um receptor Fc-gama, como RI Fc-gama, ou qualquer outro receptor Fc) ou um receptor de célula T, por exemplo, CD3.

Por conseguinte, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas que se ligam tanto a GT468 como a um receptor de Fc ou um receptor de célula T, por exemplo, CF3. Os exemplos de receptores de Fc são receptor de IgG, receptor de Fc-gama (FcyR), como FCyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). Outros receptores de Fc, como receptores de IgA (por exemplo, FcaRI), também podem ser alvejados. O receptor de Rc é preferivelmente localizado na superfície de uma célula efetora, por exemplo, um monócito, macrófago ou uma célula mononuclear ativada. Em uma modalidade preferida, as moléculas biespecificas e multiespecificas se ligam a um receptor de Fc em um sitio que é distinto do sitio de ligação de imunoglobulina Fc (por exemplo, IgG ou IgA) do receptor. Portanto, a ligação das moléculas biespecificas e multiespecificas não é bloqueada por níveis fisiológicos de imunoglobulinas.

Ainda em outro aspecto, anticorpos anti-GT468 da invenção são derivatizados, ligados a ou co-expressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um fragmento de Fab'). Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, como outro anticorpo (por exemplo, para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecifico), uma citotoxina, ligando celular ou antígeno (por exemplo, para produzir um imunoconjµado, como uma imunotoxina). Um anticorpo da presente invenção pode ser ligado a outras frações terapêuticas, por exemplo, um radioisótopo, uma droga anti-câncer de molécula pequena, uma citosina recombinante ou quimocina. Por conseguinte, a presente invenção abrange uma grande variedade de conjµados de anticorpo, moléculas biespecificas e multiespecificas e proteínas de fusão, todos os quais se ligam a células que expressam GT468 e/ou a células sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula e que podem ser utilizados para alvejar outras moléculas a tais células.

Genericamente, para fins da presente invenção, todos os derivados de anticorpo como conjµados de anticorpo, moléculas biespecificas e multiespecificas, e proteínas de fusão descritas aqui são abrangidas pelo termo "anticorpo".

Em um aspecto adicional, a invenção também prevê proteínas de ligação de GT468 derivadas de domínios não imunoglobulina, em particular proteínas de cadeia única. Tais proteínas de ligação e métodos para sua produção são descritas, por exemplo, em Binz e outros (2005) Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268, aqui incorporada a título de referência. Deve ser entendido que o ensinamento dado aqui com relação à imunoglobulina ou moléculas de ligação derivadas de imunoglobulina se aplica também correspondentemente a moléculas de ligação derivadas de domínios de não imunoglobulina. Em particular, o uso de tais moléculas de ligação derivadas de domínios de não imunoglobulina é possível para bloquear GT468 de células que expressam o alvo e/ou sendo caracterizado por associação do alvo com sua superfície de célula e desse modo, para originar efeitos terapêuticos como revelado aqui para anticorpos da invenção, em particular a inibição de uma ou mais atividades de células de tumor como revelado aqui como proliferação. Embora não obrigatório, é possível conferir funções efetoras de anticorpos a tais moléculas de ligação de imunoglobulina por, por exemplo, fusão à região Fc de anticorpos.

A presente invenção abrange genericamente o tratamento e/ou diagnóstico de doenças, em particular doenças de tumor, por alvejar GT468 expresso por células e/ou sendo associado à superfície de células. Esses métodos fornecem a detecção seletiva e/ou erradicação de tais células desse modo minimizando efeitos adversos para células normais não expressando GT468 e/ou não sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula. Doenças preferidas para uma terapia ou diagnóstico são aquelas nas quais as células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula são envolvidas como doenças de tumor, em particular doenças de câncer como aquelas descritas aqui.

Em um aspecto, a presente invenção provê composições, por exemplo, kits/composições farmacêuticas e de diagnóstico, compreendendo um anticorpo ou uma combinação de anticorpos da invenção. Uma composição farmacêutica da invenção pode compreender um veiculo farmaceuticamente aceitável e pode opcionalmente compreender um ou mais adjuvantes, estabilizadores, etc. em uma modalidade especifica, a composição inclui uma combinação de anticorpos que se ligam a epítopos distintos ou que possuem características funcionais distintas, como induzir CDC e/ou ADCC e induzir apoptose. Nessa modalidade da invenção, anticorpos podem ser utilizados em combinação, por exemplo, como uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais anticorpos monoclonais anti-GT468. Por exemplo, anticorpos anti-GT468 tendo atividades diferentes, porém complementares podem ser combinados em uma terapia única para obter um efeito terapêutico desejado. Em uma modalidade preferida, a composição inclui um anticorpo anti-GT468 que media CDC combinado com outro anticorpo anti-GT468 que induz apoptose. Em outra modalidade, a composição inclui um anticorpo anti-GT468 que media extermínio altamente eficaz de células alvo na presença de células efetoras, combinado com outro anticorpo anti-GT468 que inibe o crescimento de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula.

A presente invenção também inclui a administração simultânea ou seqüencial de dois ou mais anticorpos anti-GT468 da invenção, em que preferivelmente pelo menos um dos anticorpos é um anticorpo anti-GT468 quimérico e pelo menos um anticorpo adicional é um anticorpo anti-GT468 humano, os anticorpos se ligando a epítopos iguais ou diferentes de GT468. Preferivelmente, um anticorpo GT468 quimérico da invenção é administrado primeiramente seguido pela administração de um anticorpo anti-GT468 humano da invenção, em que o anticorpo anti-GT468 humano é preferivelmente administrado por um período de tempo prolongado, isto é, como terapia de manutenção.

Anticorpos, conjµados, moléculas biespecíficas/multiespecíficas e composições da presente invenção podem ser utilizadas em uma variedade de métodos para inibir crescimento de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizados por associação de GT468 com sua superfície de célula e/ou seletivamente exterminar células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizados por associação de GT468 com sua superfície de célula por contatar as células com uma quantidade eficaz do anticorpo, conjµado, molécula ou composição biespecífica/multiespecífica, de tal modo que o crescimento da célula seja inibido e/ou a célula seja exterminada. Em uma modalidade, o método inclui extermínio da célula que expressa GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula, opcionalmente na presença de células efetoras, por exemplo, por CDC, apoptose, fagocitose, ou por uma combinação de dois ou mais desses mecanismos. As células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula que podem ser inibidas ou exterminadas utilizando os anticorpos da invenção incluem células de câncer.

Anticorpos, conjµados, e moléculas e composições biespecíficas/multiespecíficas da presente invenção podem ser utilizadas para tratar e/ou evitar uma variedade de doenças que envolvem células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula por administração dos anticorpos a pacientes que sofrem dessas doenças. Doenças exemplares que podem ser tratadas (por exemplo, melhoradas) ou impedidas incluem porém não são limitadas a doenças tumorigênicas. Os exemplos de doenças tumorigênicas que podem ser tratadas e/ou evitadas, incluem doenças de câncer como câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer hepatocelular, câncer de colón, câncer pancreático, câncer esofágico, câncer de cabeça & pescoço, câncer de rim, em particular carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer de fígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placental, câncer cervical, e câncer de tiróide, e as formas metastáticas dos mesmos. Em uma modalidade, a doença de câncer é câncer metastático no pulmão.

Em um aspecto a invenção refere-se a um método de inibir uma ou mais atividades selecionadas entre motilidade, migração, invasão, crescimento (proliferação) e formação de colônia, preferivelmente crescimento e/ou formação de colônia de uma célula que expressa GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula, compreendendo contatar a célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo, conjµado, molécula ou composição biespecífica/multiespecífica da invenção. GT468 é preferivelmente expresso na superfície da célula.

Em um aspecto adicional a invenção refere-se a um método de tratar ou evitar uma doença ou distúrbio envolvendo células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula compreendendo administrar a um sujeito um anticorpo, conjµado, molécula ou composição biespecífica/multiespecífica da invenção, preferivelmente a doença ou distúrbio é uma doença relacionada a tumor, e em modalidades especificas é selecionada do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer hepatocelular, câncer de colón, câncer pancreático, câncer esofágico, câncer de cabeça & pescoço, câncer de rim, em particular carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer de fígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placental, câncer cervical, e câncer de tiróide, e as formas metastáticas dos mesmos. Em uma modalidade, a doença de câncer é câncer metastático no pulmão. GT468 é preferivelmente expresso na superfície das células.

A presente invenção pode envolver o uso dos agentes e composições descritos aqui para um tratamento profilático e/ou terapêutico de doenças de tumor, isto é, para tratar um paciente tendo uma doença de tumor ou estando em risco de desenvolver uma doença de tumor. Em um aspecto, a invenção provê métodos para inibir crescimento de tumor compreendendo a administração de um ou mais dos agentes e composições descritas aqui.

Preferivelmente, os agentes e composições descritos aqui são administrados em um modo tal que a substância terapeuticamente ativa não seja distribuída ou não seja substancialmente distribuída a um tecido ou órgão onde as células quando o tecido ou órgão está livre de tumores expressam substancialmente GT468 e/ou são caracterizados por expressão de GT468 com sua superfície de célula como tecido de placenta e/ou tecido de testículos. Para essa finalidade, os agentes e composições descritos aqui podem ser administrados localmente.

Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo como descrito aqui para uso nos métodos de tratamento descritos aqui. Em uma modalidade, a invenção provê uma composição farmacêutica como descrito aqui para uso nos métodos de tratamento descritos aqui.

Em uma modalidade específica da invenção, o sujeito sendo administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um agente quimoterapêutico, radiação ou um agente que modula, por exemplo, aumenta ou inibe, a expressão ou atividade de um receptor Fc, por exemplo, um receptor Fc-gama, como citosina. Citosinas típicas para administração durante tratamento incluem fator de estimular colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimular colônia de macrófago-granulócito (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) e fator de necrose de tumor (TNF). Agentes terapêuticos típicos incluem, entre outros, agentes anti-neoplásicos como doxorrubicina, cisplatina, tgaxotere, 5-fluoruracil, metotrexat, gemzitabin e ciclofosfamida.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma estratégia de imunização para imunizar animais não humanos como camundongos com GT468 humano ou um fragmento de peptídeo do mesmo para obter anticorpos. Peptídeos preferidos para imunização são aqueles selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2-10 e 35-82, ou derivados dos mesmos. Por conseguinte, em modalidades preferidas, os anticorpos da invenção são aqueles obtidos por imunização utilizando peptídeos selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2-10 e 35-82, ou derivados dos mesmos. Analogamente, anticorpos para GT468 podem ser gerados em um animal não humano transgênico como um camundongo transgênico. O animal não humano transgênico pode ser um camundongo transgênico tendo um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve codificando todo ou uma porção de um anticorpo.

Animais não humanos trangênicos bem como selvagens podem ser imunizados com um preparado purificado ou enriquecido de antígeno GT468 e/ou ácidos nucléicos e/ou células que expressam GT468 ou um fragmento de peptídeo do mesmo. Preferivelmente, o animal não humano é capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para GT468 (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgM) por serem submetidos à recombinação de V-D-J e comutação de isotipo. A comutação de isotipo pode ocorrer, por exemplo, por comutação de isotipo clássica ou não clássica.

Por conseguinte, ainda em outro aspecto, a invenção provê células B isoladas a partir de um animal não humano como descrito acima. As células B isoladas podem se então imortalizadas por fusão a uma célula imortalizada para fornecer uma fonte (por exemplo, um hibridoma) de anticorpos da invenção. Tais hibridomas (isto é, que produzem anticorpos da invenção) são também incluídos no escopo da invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a métodos para diagnóstico, detecção ou monitoração de uma doença de tumor compreendendo a detecção de e/ou administração da quantidade de GT468 ou células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizado por associação de GT468 com sua superfície de célula em uma amostra biológica isolada de um paciente utilizando um anticorpo da invenção. A amostra biológica pode ser isolada de um paciente tendo uma doença de tumor, com suspeita de ter ou ficar doente com uma doença de tumor ou ter potencial para uma doença de tumor.

Em uma modalidade do método para diagnóstico, detecção ou monitoração de uma doença de tumor de acordo com a invenção, uma amostra biológica e/ou uma amostra de controle/referência é de um tecido ou órgão correspondendo ao tecido ou órgão que deve ser diagnosticado, detectado ou monitorado com relação à afecção por uma doença de tumor; por exemplo, a doença de tumor que deve ser diagnosticada, detectada ou monitorada é câncer de mama e a amostra biológica e/ou amostra de controle/referência é tecido da mama. Tais tecidos e órgãos são descritos aqui, por exemplo, com relação a diferentes doenças de tumor e cânceres.

Em uma modalidade dos métodos para diagnóstico, detecção ou monitoração de uma doença de tumor a amostra biológica é de um tecido ou órgão em que as células quando o tecido ou órgão está livre de tumores não expressam substancialmente GT468 e/ou não são caracterizados por associação substancial de GT468 com sua superfície de célula. Preferivelmente o tecido é um tecido diferente de tecido de placenta ou tecido de testículo.

Tipicamente, o nível de uma molécula alvo em uma amostra biológica é comparado com um nível de referência, em que um desvio do nível de referência é indicativo da presença e/ou estágio de uma doença de tumor em um sujeito. O nível de referência pode ser um nível como determinado em uma amostra de controle (Por exemplo, de um tecido saudável ou sujeito) ou um nível mediano de sujeitos saudáveis. Um "desvio" do nível de referência designa qualquer alteração significativa, como um aumento ou diminuição em pelo menos 10%, 20% ou 30%, preferivelmente pelo menos 40% ou 50% ou ainda mais. preferivelmente, a presença de GT468 ou células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula na amostra biológica ou uma quantidade de GT468 ou células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula na amostra biológica que é aumentada em comparação com um nível de referência indica a presença de uma doença de tumor.

Tipicamente, a detecção e/ou determinação da quantidade nos métodos da invenção envolve o uso de anticorpos rotulados que especificamente se ligam a uma molécula alvo.

Em um aspecto específico, a presente invenção refere-se a um método para detecção, isto é, determinar, a posição ou sítio, de uma doença de tumor, por exemplo, um tecido ou órgão específico, que compreende administrar um anticorpo da presente invenção que é acoplado a um rótulo detectável a um paciente. A rotulação de um tecido ou órgão no paciente pode indicar a presença de ou risco para uma doença de tumor no tecido ou órgão.

Como exemplificado aqui, anticorpos da invenção podem ser obtidos diretamente de hibridomas que expressam o anticorpo, ou podem ser clonados e recombinantemente expressos em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula CHO, ou uma célula linfocitica). Exemplos adicionais de células hospedeiras são microorganismos, como E. coli e fungos, como levedura. Alternativamente, podem ser produzidos recombinantemente em uma planta ou animal não humano transgênico. Entretanto, a presente invenção também prevê modalidades onde os anticorpos são produzidos por imunização ou vacinação utilizando estratégias de imunização como revelado aqui in situ em um paciente.

Células de hibridoma preferidas para produzir anticorpos da invenção são aquelas depositadas no DSMZ (nhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha) tendo as seguintes designações e números de acesso:

1. 4E9-1H9, no. de acessão DSM ACC2822, depositado em 13 de março de 2007;
2. 9B6-2A9, no. de acessão DSM ACC2826, depositado em 13 de março de 2007;
3. 59D6-2F2, no. de acessão DSM ACC2824, depositado em 13 de março de 2007;
4. 61C11-2B5, no. de acessão DSM ACC2825, depositado em 13 de março de 2007;
5. 78H11-1H6, no. de acessão DSM ACC2823, depositado em 13 de março de 2007;
6. 22-1A-1, no. de acessão DSM ACC2895, depositado em 11 de março de 2008;
7. 22-2A-1, no. de acessão DSM ACC2893, depositado em 11 de março de 2008;
8. 22-9B-1, no. de acessão DSM ACC2896, depositado em 11 de março de 2008;
9. 23-33A-1, no. de acessão DSM ACC2897, depositado em 11 de março de 2008;
10. 23-19A-1, no. de acessão DSM ACC2891, depositado em 11 de março de 2008;
11. F11#33F7D12, no. de acessão DSM ACC2894, depositado em 11 de março de 2008;
12. 4A12 2D4 1A10, no. de acessão DSM ACC2892, depositado em 11 de março de 2008;
13. 4E9 1D12 2D4, no. de acessão DSM ACC2898, depositado em 11 de março de 2008;
14. 42H11 1C11 2B2, no. de acessão DSM ACC2961, depositado em 1° de setembro, 2008;
15. 51G6 2H3 2B4, no. de acessão DSM ACC2962, depositado em 1° de setembro, 2008 ;
16. 16-5B-1, no. de acessão DSM ACC2943, depositado em 1° de setembro, 2008;
17. 20-11 A-1, no. de acessão DSM ACC2956, depositado em 1° de setembro, 2008;
18. 29-1A-2, no. de acessão DSM ACC2947, depositado em 1° de setembro, 2008;
19. 29-8B-1, no. de acessão DSM ACC2964, depositado em 2 de setembro de 2008;
20. 35-48B-1, no. de acessão DSM ACC2959, depositado em 1° de setembro, 2008;
21. 35-50A-2a, no. de acessão DSM ACC2963, depositado em 1° de setembro, 2008;
22. 38-10B-1, no. de acessão DSM ACC2957, depositado em 1° de setembro, 2008;
23. 38-1 A-1, no. de acessão DSM ACC2958, depositado em 1° de setembro, 2008;
24. 44-3A-2, no. de acessão DSM ACC2948, depositado em 1° de setembro, 2008;
25. 45-2A-1, no. de acessão DSM ACC2949, depositado em 1° de setembro, 2008;
26. 45-8A-2, no. de acessão DSM ACC2950, depositado em 1° de setembro, 2008;
27. 48-3B-1, no. de acessão DSM ACC2951, depositado em 1° de setembro, 2008;
28. 48-4A-1, no. de acessão DSM ACC2952, depositado em 1° de setembro, 2008;
29. 49-3A-1, no. de acessão DSM ACC2946, depositado em 1° de setembro, 2008;
30. 49-8A-1, no. de acessão DSM ACC2945, depositado em 1° de setembro, 2008;
31. 51-1A-1, no. de acessão DSM ACC2944, depositado em 1° de setembro, 2008;
32. 53-13A-2, no. de acessão DSM ACC2953, depositado em 1° de setembro, 2008;
33. 53-29A-1, no. de acessão DSM ACC2955, depositado em 1° de setembro, 2008;
34. 54-4B-2, no. de acessão DSM ACC2960, depositado em 1° de setembro, 2008;
35. 56-4A-2, no. de acessão DSM ACC2954, depositado em 1° de setembro, 2008;
36. 62-9B-1, no. de acessão DSM ACC3001, depositado em July 16, 2009;

Anticorpos preferidos da invenção são aqueles produzidos por e obteníveis a partir dos hibridomas descritos acima e as formas quimerizadas e humanizadas dos mesmos. Anticorpos preferidos adicionais da invenção são aquelas tendo a especificidade dos anticorpos produzidos por e obteníveis a partir dos hibridomas acima descritos e, em particular, aqueles compreendendo a porção de ligação de antígeno ou sítio de ligação de antígeno, em particular a região variável, dos anticorpos produzidos por e obteníveis a partir dos hibridomas descritos acima.

Em modalidades preferidas, anticorpos, em particular formas quimerizadas de anticorpos de acordo com a invenção incluem anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia pesada (CH) compreendendo uma seqüência de aminoácidos derivada de uma região constante de cadeia pesada humana como a seqüência de aminoácido representada por SQ ID NO: 17 ou 2 4 ou um fragmento do mesmo. Em modalidades preferidas adicionais, anticorpos, em particular formas quimerizadas de anticorpos de acordo com a invenção incluem anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia leve (CL) compreendendo uma seqüência de aminoácidos derivada de uma região constante de cadeia leve humana como a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 ou 22 ou um fragmento da mesma. Em uma modalidade particular preferida, anticorpos em particular formas quimerizadas de anticorpos de acordo com a invenção incluem anticorpos que compreendem um CH compreendendo uma seqüência de aminoácidos derivada de um CH humano como a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 ou 24 ou um fragmento do mesmo e que compreendem um CL compreendendo uma seqüência de aminoácidos derivada de um CL humano como a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 ou 22 ou um fragmento do mesmo.

Um CH compreendendo a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 pode ser codificada por um ácido nucléico que compreende a seqüência de ácidos nucléicos representados por SEQ ID NO: 20. Um CH compreendendo a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24 pode ser codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácidos nucléicos representada por SEQ ID NO: 23. Um CL compreendendo a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 pode ser codificado por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácidos nucléicos representada por SEQ ID NO: 19. Um CL compreendendo a seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 pode ser codificada por um ácido nucléico que compreende a seqüência de acido nucléico representada por SEQ ID NO: 21.

"Fragmento" ou "fragmento de uma seqüência de aminoácidos" como utilizado acima se refere a uma parte de uma seqüência de anticorpo, isto é, uma seqüência que representa a seqüência de anticorpo encurtada na extremidade N e/ou C, que quando substitui a seqüência de anticorpo em um anticorpo retém a ligação do anticorpo a GT468 e preferivelmente funções do anticorpo como descrito aqui, por exemplo, lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC. Preferivelmente, um fragmento de uma seqüência de aminoácido compreende pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos resíduos de aminoácido a partir da seqüência de aminoácido. Os fragmentos de seqüências de aminoácido descritas aqui podem ser codificados por fragmentos respectivos de seqüências de ácido nucléico codificando as seqüências de aminoácidos.

A presente invenção também se refere a ácidos nucléicos que compreendem genes ou seqüências de ácido nucléico codificando anticorpos ou partes dos mesmos, por exemplo, uma cadeia de anticorpo, como descrito aqui. Os ácidos nucléicos podem ser compreendidos em um vetor, por exemplo, um plasmídeo, cosmídio, vírus, bacteriófago ou outro vetor utilizado, por exemplo, convencionalmente em engenharia genética. O vetor pode compreender genes adicionais como genes marcadores que permitem a seleção do vetor em uma célula hospedeira adequada e sob condições adequadas. Além disso, o vetor pode compreender elementos de controle de expressão que permitem expressão adequada das regiões de codificação em hospedeiros apropriados. Tais elementos de controle são conhecidos pelo técnico e podem incluir um promotor, um cassete de junção e um códon de iniciação de translação.

Preferivelmente, o ácido nucléico da presente invenção é operativamente ligado as seqüências de controle de expressão acima permitindo expressão em células eucarióticas ou procarióticas. Elementos de controle que asseguram expressão em células eucarióticas ou procarióticas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

Os métodos para construção de moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção, para construção de vetores compreendendo as moléculas de ácido nucléico acima, para introdução dos vetores em células hospedeiras apropriadamente escolhidas, para causar ou obter a expressão são bem conhecidos na arte.

Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende um ácido nucléico ou vetor como revelado aqui.

Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra que GT468 é um marcador de linhagem trofoblástico ativado de forma aberrante em células de câncer. (A) RT-PCR de 35 ciclos de ponto final em tecidos normais, amostras de câncer de mama primárias e linhagens de célula de câncer (1, MCF-7; 2, MDA-MB-4 35S; 3, BT-549; 4, MDA-MB-231; 5, SNU-16; 6, LCLC-103H; 7, KYSE-510; 8, KYSE-30; 9, EFO-27; 10, TOV-21G; 11, TOV-112D; 12, CAOV-3; 13, EFO-21; 14, FU-OV-1; 15, LNCAP; 16, CAPAN-2). (B) RT-PCR em tempo real de 40 ciclos quantitativo em tecidos normais (1, testículo; 2 placenta; 3 cérebro; 4 pulmão; 5 mama; 6 cólon; 7 fígado, 8; estomago; 9 rim; 10 próstata; 11 pâncreas; 12 ovário; 13 baço; 14 pele; 15 miocárdio; 16 endométrio; 17 resto. PBMCs; 18 PBMSs prolif; 19 glândula adrenal), espécimes de câncer de mama primários e (C) linhagens de célula de câncer. (D) análise RT-PCR em tempo real quantitativo de silêncio GT468 mediado por siRNA em células de câncer de mama MCV-7 e BT-549. (E) análise de western blot de diminuição mediada por siRNA de expressão de proteína GT468. Células de controle não foram tratadas ou transfectadas com um duplex não silencioso misturado (ns-siRNA). (F) análise de western blot de níveis de proteína GT468 em tecidos humanos normais e neoplásicos. (G) imunoistoquímica de seções derivadas de tecido de mama humana normal (esquerdo) e câncer de mama (direito) utilizando um anticorpo específico de GT468.
A Figura 2 mostra que GT468 é uma proteína associada à superfície de célula. (A) Coloração de células de câncer de mama MCF-7 e BT-549 fixadas com metanol e (B) não fixadas com anticorpo de termo-C/anti468 após transfecção com siRNA específico de GT468 (siRNA#l) ou siRNA de não silencioso (ns-siRNA).
A Figura 3 mostra que a expressão GT468 promove motilidade, migração e invasao de células de câncer de mama. (A) análise de quimiocinese (motilidade) em ensaios de migração Transwell com 5% FCS adicionado à câmara superior bem como inferior foi analisada após 12 h. (B) análise de quimiotaxia de células MCF-7 e BT-549 em ensaios de migração Transwell 12 h após 5% FCS foi adicionado à câmara inferior somente para obter um gradiente. (C) análise de invasão quimiotáctica em Matrigel 24 h após 5% CFS como quimioatraente ter sido adicionado à câmara inferior.
Figura 4 mostra que a expressão de GT468 promove proliferação de células de câncer de mama. (A) análise de proliferação em células MCF-7 e BT-549 72 h após abate ser iniciado por dúplex de siRNA específicas de GT468. (B) análise de ciclo de célula de células 72 h após iniciação de silencioso GT468 mostrado como gráfico de barra de frações de células em estados de ciclo de célula diferentes. (C) Apoptose de células como determinado por coloração de Annexin V 72 horas após transfecção com siRNA. Como controle positivo para coloração de Annexin V as células foram tratadas com 6 uM de Camptotecina por 12 h.
A Figura 5 mostra que GT468 é alvejado por anticorpos de antagonizar função. A análise de proliferação de células de MCF-7 e BT-549 após incubação com quantidades diferentes de anticorpo anti-GT468 e anticorpo de controle (controle de isotipo) por 48 h.
A Figura 6 mostra que Ciclina D1 e AKT cinase estão envolvidas em função de GT468. (A) análise de RT-PCR em tempo real quantitativa e (B) análise de western blot de Dl após as células serem tratadas por 72 h com dúplex de siRNA específicos de GT468. A análise de western blot de fosforilação Ser473 AKT após (C) 72 horas de abate de GT468 e após (D) 1 h de tratamento com anticorpo de termo-C/anti-GT468.
A Figura 7 mostra um teste ELISA de peptídeo para determinar a especificidade de anticorpos criados contra GT468 em sobrenadantes de hibridoma. Sobrenadantes de hibridoma são somente reativos com peptídeos utilizados para imunização.
A Figura 8 mostra coloração de células CHO transfectadas com uma construção GT468-eGFP por sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos criados contra GT468. Os sobrenadantes de hibridoma colorem especificamente células que expressam GT468-eGFP.
A Figura 9 mostra que GT468 é alvejado por anticorpos monoclonais de antagonizar função. A análise de proliferação de linhagens de célula de câncer diferentes após incubação com sobrenadantes de hibridoma por 72 h.
A Figura 10 mostra que lisado bruto (CrELISA) (A) ou ELISA especifico de peptídeo (B) para determinar a especificidade de anticorpos criados contra GT468 em sobrenadantes de hibridoma. Sobrenadantes de hibridoma somente são reativos com o lisado de GT468 (A) ou o peptídeo respectivo utilizado para imunização (B).
A Figura 11 mostra uma análise citométrica de fluxo Para determinar a especificidade de anticorpos criados contra GT468 em sobrenadantes de hibridoma. Todos os sobrenadantes de hibridoma mostraram coloração específica de células transfectadas com GT468, ao passo que nenhuma coloração foi observada em células transfectadas simuladas.
A Figura 12 mostra um teste de Western blot para determinar a especificidade de anticorpos criados contra GT468 em sobrenadantes de hibridoma. Todos os sobrenadantes de hibridoma mostraram reatividade específica com lisados de células HEK293 transfectadas com plasmídeo de expressão pcDNA3.1 GT468, ao passo que lisados de células transfectadas simuladas não mostraram sinal. O sinal desvanecido de sobrenadante de hibridoma 23-33A-1 no lisado simulado é devido a derramamento do lisado GT468 HEK.
Figura 13. ELISA de peptídeo para identificar epítopos de ligação de anticorpo na proteína GT468.
Sobrenadantes de hibridoma 22-1A-1, 23-33A-1, e 23-19A-1 mostraram cada um, ligação a dois peptideos de sobreposição indicando reatividade com um epitopo linear de GT468. Os padrões de ligação de 22-2A-1 e 22-9B-1 indicam reatividade a um epitopo de conformação (epitopo descontinuo) da proteína GT468.
A Figura 14 mostra que GT468 é alvejado por anticorpos monoclonais de antagonizar função. A análise de proliferação de linhagens de célula de câncer diferentes após incubação com sobrenadantes de hibridoma purificado por 72 h ou 120 h.
A Figura 15 mostra uma análise citométrica de fluxo para determinar a especificidade de anticorpos criados contra GT468 em sobrenadantes de hibridoma. Sobrenadantes de hibridoma mostraram coloração específica de células transfectadas GT468aall6-212, ao passo que nenhuma coloração foi observada em células tranfectadas simuladas.
A Figura 16 A, B mostra uma análise citométrica de fluxo para determinar a ligação específica dos anticorpos monoclonais com células de tumor não fixas expressando endogenamente GT468 (células de câncer de mama MCF-7, MDA-MB-468 e SK-BR-3). Células de câncer gástrico Np-C4 não expressando GT468 foram utilizadas como controle negativo. Os anticorpos são capazes de se ligar a células de tumor que expressam GT468.
A Figura 17 mostra um teste de Western blot para determinar a especificidade de anticorpos criados contra GT468 em sobrenadantes de hibridoma. Todos os sobrenadantes de hibridoma mostraram reatividade especifica com lisados de células HEK293 transfectadas com um plasmídeo de expressão de GT468, ao passo que lisados de células transfectadas simuladas não mostraram sinal.
A Figura 18 mostra que GT468 é alvejado por anticorpos monoclonais de antagonizar função. A análise de proliferação de linhagens de célula de câncer diferentes após incubação com sobrenadantes de hibridoma purificado por 72 h.
A Figura 19 mostra um ensaio clonogênico para análise da atividade de inibição de anticorpos monoclonais para GT468 em formação de colônia de células SK-BR-3 expressando endogenamente GT468. A incubação das células com anticorpo reduziu ou inibiu a formação de colônia.
A Figura 20 A-B mostra a quantificação de expressão de GT468 em tecidos normais utilizando RT-PCR em tempo real. Os tecidos de três indivíduos foram testados para cada tipo de tecido normal. Somente quantidades residuais de transcritos GT468 poderiam ser detectados em tecidos normais após 40 ciclos de RT-PCR. O único tecido normal que excede o corte de expressão (linha tracejada, expressão média de todos os tecidos normais + 3 STDs (99% percentil)) foram placenta e testículos. Barras de erro, STD. Além de câncer de mama (vide a figura 1), expressão elevada de GT468 foi encontrada em amostras de câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de célula renal, câncer hepático, sarcoma, câncer de tiróide, e câncer de cabeça e pescoço.
A Figura 21 mostra a análise western blot de expressão de GT468 em linhagens de célula de câncer. A expressão de GT468 foi detectada em células HEK293 transfectadas com plasmídeo de expressão de GT468 (controle positivo), SK-BR-3 (câncer de mama), BEWO (coriocarcinoma placental), JAR (coriocarcinoma placental), HCT-15 (câncer de cólon), LnCaP (câncer de próstata), HeLA (câncer cervical), MDA-MB-468 (câncer de mama), JEG-3 (coriocarcinoma placental), JIMT-1 (câncer de mama), LA1-55n (Neuroblastoma), PC-3 (câncer de próstata), BT-20 (câncer de mama), e NC1-H929 (mieloma), MelHO (melanoma maligno) e NpC4 (câncer gástrico) foram testados negativos.
A Figura 22 mostra que GT468 é alvejado por anticorpos monoclonais de antagonizar função. Análise de proliferação de células de câncer de mama MDA-MB-468 positiva de GT468 e células de câncer gástrico NpC4 negativa de GT468 após incubação com sobrenadantes de hibridoma purificado por 72 h.
A Figura 23 mostra que Western blot para determinar a especificidade de anticorpos criados contra GT468 em sobrenadantes de hibridoma. Sobrenadantes de hibridoma mostraram reatividade específica com lisados de células HEK293 transfectadas com um plasmídeo de expressão GT468, ao passo que lisados de células transfectadas simuladas não mostraram sinal.
A Figura 26 mostra o tratamento com anticorpos monoclonais anti-GT468 atenua crescimento de tumor xenoenxerto de coriocarcinoma placental BEWO em camundongos nude. Após injeção de células BEWO s.c. os animais foram tratados com anticorpos monoclonais purificados (200 μg) duas vezes por semana por 2 semanas.
A Figura 25 mostra um teste ELISA de peptídeo para identificar epítopos de ligação de anticorpo na proteína GT468. Sobrenadantes de hibridoma 29-8B-1, 35-48B-1, 44-3A-2, 49-3A-1, 4908A-1, 51-1A-1, 53-13A-2 e 62-9B1 cada mostraram ligação a um ou mais peptídeos de sobreposição indicando reatividade a um epítopo linear de GT468. Os padrões de ligação de 29-1A-2 e 54-4B-2 indicam reatividade a um epítopo de conformação (epítopo descontínuo) da proteína GT468.
A Figura 26 mostra o tratamento com anticorpos monoclonais anti-GT468 impede significativamente o espalhamento metastático de células de câncer de mama MCF-7 em ensaios de metástase experimental. Após injeção de 1x106 células MCF-7 i.v. os animais foram tratados com anticorpos monoclonais purificados (200 μg) duas vezes por semana.a carga de tumor metastático nos pulmões de animais foi determinada 5 semanas após inoculação por PCR quantitativo utilizando oligonucleotídeos específicos para DNA microsatélite humano.

Definição dos Termos

Para que a presente invenção possa ser mais facilmente entendida, certos termos são primeiramente definidos. Definições adicionais são expostas em toda a descrição detalhada.

O termo "GT468" se refere preferivelmente a GT468 humano, e em particular a (i) um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica a seqüência de amino da SEQ ID NO: 2 como um ácido nucléico compreendendo a seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1 ou (ii) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e inclui quaisquer variantes das seqüências, em particular mutantes, variantes de junção, conformações, isoformas, variantes alélicos, variantes de espécie e homólogos de espécie, em particular aqueles que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica se refere a uma alteração na seqüência normal de um gene, cuja importância freqüentemente não é clara. O seqüenciamento completo de gene identifica freqüentemente inúmeras variantes alélicas para um dado gene. Um homólogo de espécie é uma seqüência de ácido nucléico ou aminoácido com uma espécie diferente de origem a partir daquela de uma seqüência dada de acido nucléico ou aminoácido. O termo "GT468" abrangerá (i) variantes de junção de GT468, (ii) variantes modificadas pós translação de GT468, incluindo particularmente variantes com glicosilação diferente como status de N-glicosilação, (iii) variantes de conformação GT468, (iv) variantes relacionadas a câncer GT468 e não relacionados a câncer GT468.

Em uma modalidade, o termo "GT468" se refere à porção de GT468 que corresponde ao domínio extracelular ou ectodomínio e preferivelmente se refere à seqüência de aminoácidos de GT468 não incluindo o domínio hidrofóbico terminal-N. o termo "GT468" inclui uma proteína compreendendo aminoácidos 29 a 119, preferivelmente aminoácidos 29 a 212 e mais preferivelmente aminoácidos 23 a 212 da SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos correspondentes de uma variante de SEQ ID NO: 2.

De acordo com a presente invenção, os temos "domínio extracelular" ou "ectodomínio" com relação a GT468 se referem à porção de GT468 que é encontrada em associação à superfície de células que expressam GT468. Preferivelmente, o "domínio extracelular" ou "ectodomínio" está presente no compartimento extracelular. O "domínio extracelular" ou "ectodomínio" de GT468 se refere preferivelmente à porção de GT468 de comprimento total que não tem o domínio hidrofóbico terminal-N. de acordo com a invenção, o termo "domínio hidrofóbico" com relação a GT468 se refere à porção de GT468 não fazendo parte do domínio extracelular e preferivelmente incluindo uma seqüência hidrofóbica localizada próxima à extremidade-N de GT468. O "domínio hidrofóbico" de GT468 pode incluir uma seqüência precedendo a seqüência hidrofóbica e sendo localizada na extremidade terminal-N de GT468. Com relação à SEQ ID NO: 2, o domínio hidrofóbico terminal-N compreende preferivelmente aminoácidos 1 a 22. Será entendido que quaisquer domínios hidrofóbicos ou seqüências identificadas para os polipeptídios GT468 da presente invenção são identificados de acordo com critérios rotineiramente empregados na técnica para identificar domínios ou seqüências hidrofóbicas. Os limites exatos de um domínio hidrofóbico podem variar porém mais provavelmente em não mais do que aproximadamente 5 aminoácidos em qualquer extremidade do domínio como inicialmente identificado aqui. Opcionalmente, portanto, um domínio extracelular de um polipeptídio GT468 pode conter de aproximadamente 5 ou menos aminoácidos em cada lado do domínio hidrofóbico/domínio extracelular como identificado aqui.

"superfície celular" é utilizado de acordo com seu significado normal na técnica, e desse modo inclui o exterior da célula que é acessível à ligação por proteínas e outras moléculas.

A expressão "GT468 expresso na superfície de células" significa que GT468 expresso por células é encontrado em associação à superfície das células.

GT468 é associado à superfície de células se for localizado na superfície das células e é acessível à ligação por anticorpos específicos de GT468 adicionados às células. Em modalidades preferidas, uma célula sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula é uma célula expressando GT468. Deve ser entendido que no caso onde GT468 é expresso por células, o GT468 associado à superfície das células pode somente ser uma porção do GT468 expresso, em particular o domínio extracelular do mesmo como definido acima.

De acordo com a invenção GT468 não é substancialmente expresso em uma célula e/ou não é substancialmente associado a uma superfície de célula se o nível de expressão e/ou associação for mais baixo em comparação com expressão e/ou associação em células de planta ou tecido de placenta. preferivelmente, o nível de expressão e/ou associação é menor do que 10%, preferivelmente menor do que 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ou 0,05% da expressão e/ou associação em células de placenta ou tecido de placenta ou ainda mais baixo. Preferivelmente, GT468 não é substancialmente expresso em uma célula e/ou não é substancialmente associado a uma superfície de célula se o nível de expressão e/ou associação exceder o nível de expressão e/ou associação em tecido não canceroso, não tumorigênico de qualquer um ou mais entre cérebro, pulmão, mama, cólon, fígado, estomago, rim, próstata, pâncreas, ovário, baço, pele, miocárdio e endométrio em não mais do que 2 vezes, preferivelmente 1,5 vez, e preferivelmente não excede o nível de expressão e/ou associação no(s) tecido(s) não tumorigênico, não canceroso. Preferivelmente, GT468 não é substancialmente expresso em uma célula e/ou não é substancialmente associado a uma superfície de célula se o nível de expressão ou associação estiver abaixo do limite de detecção e/ou se o nível de expressão ou associação estiver demasiadamente baixo para permitir ligação por anticorpos específicos de GT468 adicionados às células.

De acordo com a invenção GT468 é expresso em uma célula e/ou é associado a uma superfície de célula se o nível de expressão e/ou associação exceder o nível de expressão e/ou associação em tecido não canceroso não tumorigênico de um ou mais entre cérebro, pulmão, mama, cólon, fígado, estomago, rim, próstata, pâncreas, ovário, baço, pele, miocárdio e endométrio, preferivelmente em mais de 2 vezes, preferivelmente 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou 10000 vezes. Preferivelmente, GT468 é expresso em uma célula e/ou é associado a uma superfície de célula se o nível de expressão ou associação estiver acima do limite de detecção e/ou se o nível de expressão ou associação estiver elevado o bastante para permitir ligação por anticorpos específicos de GT468 adicionados às células. Preferivelmente, GT468 expresso em uma célula é expresso ou exposto na superfície da célula.

O termo "raft" se refere a microdomínios de membrana ricos em colesterol e esfingolipídio localizados na área de folheto externa da membrana de plasma de uma célula. A capacidade de certas proteínas nos associarem tais domínios e sua capacidade de formar "agregados" ou "agregados focais" pode afetar a função da proteína. Por exemplo, a translocação de moléculas de GT468 em tais estruturas, após ser ligada por anticorpos da presente invenção, cria uma alta densidade de complexos de anticorpo-antígeno GT468 nas membrana de plasma. Tal densidade elevada de complexos de anticorpo-antígeno GT468 pode permitir ativação eficiente do sistema de complemento durante CDC.

De acordo com a presente invenção, o termo "doença" se refere a qualquer estado patológico, incluindo câncer, em particular aquelas formas de câncer descritas aqui.

"Doenças associadas a células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula" significam, de acordo com a invenção, que expressão e/ou associação em células de um tecido ou órgão doente é preferivelmente aumentada em comparação com o estado em um tecido ou órgão saudável. Um aumento se refere a um aumento em pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1000%, pelo menos 10000% ou ainda mais. Em uma modalidade, expressão e/ou associação com a superfície de célula é somente encontrada em um tecido doente, enquanto a expressão em um tecido saudável é reprimida. De acordo com a invenção, doenças associadas a células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula incluem doenças de tumor como doenças de câncer. Além disso, de acordo com a invenção, doenças de tumor como doenças de câncer são preferivelmente aquelas onde as células de tumor ou células de câncer expressam GT468 e/ou são caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula.

Como utilizado aqui, uma "doença de tumor", "doença relacionada a tumor" ou "doença tumorigênica" inclui uma doença caracterizada por crescimento celular aberrantemente regulado, proliferação, diferenciação, adesão e/ou migração que pode resultar na produção de ou tendência a produzir tumores e/ou metástase de tumor. Por "célula de tumor" quer se dizer uma célula anormal que cresce por uma proliferação celular rápida, descontrolada e continua a crescer após o estímulo que iniciou o novo crescimento cessar.

Por "tumor" quer se dizer um grupo anormal de células ou um crescimento de tecido por uma proliferação celular rápida, descontrolada e continua a crescer após o estímulo que iniciou o novo crescimento cessar. Tumores mostram falta parcial ou total de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e normalmente formam uma massa distinta de tecido, que pode ser benigna, pré-maligna ou maligna.

Preferivelmente, uma "doença de tumor", "doença relacionada a tumor" ou "doença tumorigênica" de acordo com a invenção é uma doença de câncer, isto é, uma doença maligna e uma célula de tumor é uma célula de câncer. Preferivelmente, uma "doença de tumor", "doença relacionada a tumor" ou "doença tumorigênica" é caracterizada por células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula e uma célula de tumor expressa GT468 e/ou é caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula.

Uma célula que expressa GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula é preferivelmente uma célula de tumor ou célula de câncer, preferivelmente dos tumores e cânceres descritos aqui. Preferivelmente, tal célula é uma célula diferente de uma célula placental e/ou célula de testículo.

Doenças de câncer ou cânceres preferidos de acordo com a invenção são selecionados do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer hepatocelular, câncer de colón, câncer pancreático, câncer esofágico, câncer de cabeça & pescoço, câncer de rim, em particular carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer de fígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placental, câncer cervical, e câncer de tiróide, e as formas metastáticas dos mesmos. Em uma modalidade, a doença de câncer é câncer metastático no pulmão.

De acordo com a invenção, um "carcinoma" é um câncer que começa na camada de revestimento (células epiteliais) de órgãos.

Coriocarcinoma é um câncer maligno, trofoblástico e agressivo, normalmente da placenta. É caracterizado por difusão hematogenosa prematura para os pulmões.

Um sarcoma é um câncer do tecido conectivo (osso, cartilagem, gordura) resultando em proliferação de mesoderma. Isso está em contraste com carcinomas, que são de origem epitelial.

Carcinoma de célula renal também conhecido com câncer de célula renal ou adenocarcinoma de célula renal é um câncer de rim que se origina no revestimento do túbulo convoluto próximo, os tubos muito pequenos no rim que filtram o sangue e removem produtos residuais. Carcinoma de célula renal é de longe o tipo mais comum de câncer de rim em adultos e o mais letal de todos os tumores genitourinários. Subtipos distintos de carcinoma de célula renal são carcinoma de célula renal de célula clara e carcinoma de célula renal papilar. Carcinoma de célula renal de célula clara é a forma mais comum de carcinoma de célula renal. Quando visto em um microscópio, as células que compõem o carcinoma de célula renal de célula clara parecem muito pálidas ou claras. Carcinoma de célula renal papilar é o segundo subtipo mais comum. Esses cânceres formam projeções semelhantes a dedo (chamadas papilas) em alguns, se não na maioria, dos tumores.

Por "metástase" quer se dizer a difusão de células de câncer a partir de seu sitio original para outra parte do corpo. A formação de metástase é um processo muito complexo e depende do desprendimento de células malignas a partir do tumor primário, invasão da matriz extracelular, penetração das membranas basais endoteliais para entrar na cavidade do corpo e vasos, e então, após serem transportadas pelo sangue, infiltração de órgãos alvo. Finalmente, o crescimento de um novo tumor no sitio alvo depende de angiogênese. Metástase de tumor ocorre freqüentemente mesmo após a remoção do tumor primário porque as células ou componentes de tumor podem permanecer e desenvolver potencial metastático. Em uma modalidade, o termo "metástase" de acordo com a invenção se refere a "metástase distante" que se refere a uma metástase que é distante do tumor primário e o sistema de linfonodo regional.

As células de um tumor secundário ou metastático são como aquelas no tumor original. Isso significa, por exemplo que, se o câncer de ovário metastatizar o figado, o tumor secundário é composto de células de ovário anormais, não de células de fígado anormais. O tumor no fígado é então chamado câncer de ovário metastático não câncer de fígado.

O termo "tratamento de uma doença" inclui curar, encurtar a duração, melhorar, evitar, diminuir ou inibir o avanço ou piora, ou evitar ou retardar o início de uma doença ou os sintomas da mesma.

O termo "paciente" significa, de acordo com a invenção, um ser humano, um primata não humano ou outro animal, em particular um mamífero como uma vaca, cavalo, porco, carneiro, cabra, cão, gato ou um roedor como um camundongo e rato. Em uma modalidade particularmente preferida, o paciente é um ser humano.

De acordo com a presente invenção, uma amostra pode ser qualquer amostra útil de acordo com a presente invenção, em particular uma amostra biológica como amostra de tecido, incluindo fluidos corpóreos e/ou uma amostra celular e pode ser obtida no modo convencional como por biopsia de tecido, incluindo biópsia de punção, e por tirar sangue, aspirado bronquial, esputo, urina, fezes ou outros fluidos corpóreos. De acordo com a invenção, o termo "amostra biológica" também inclui frações de amostras biológicas.

O termo "anticorpo" se refere a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto, ou uma porção de ligação de antigeno das mesmas. O termo "anticorpo" também inclui todas as formas recombinantes de anticorpos, em particular dos anticorpos descritos aqui, por exemplo, anticorpos expressos em procariotas, anticorpos não glicosilados, e quaisquer fragmentos de anticorpo de ligação de antigeno e derivados como descrito aqui. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinar complementaridade (CDR), intercalada com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR) . Cada VH e VL é composto de três CDRs e quatro FRs, dispostas de extremidade amino para extremidade carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um dominio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

O termo "anticorpo humanizado" se refere a uma molécula tendo um sitio de ligação de antígeno que é substancialmente derivado de uma imunoglobulina a partir de uma espécie não humana, em que a estrutura de imunoglobulina restante da molécula se baseia na estrutura e/ou seqüência de uma imunoglobulina humana. O sitio de ligação de antigeno pode compreender domínios variáveis completos fundidos sobre domínios constantes ou somente as regiões de determinar complementaridade (CDR) enxertadas sobre regiões de enxerto apropriadas nos domínios variáveis. Sítios de ligação de antígeno podem ser do tipo selvagem ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, modificados para lembrar mais de perto imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contem todos os seis CDRs a partir do anticorpo de camundongo) . Outras formas têm uma ou mais CDRs que são alteradas com relação ao anticorpo original.

O termo "anticorpo quimérico" se refere àqueles anticorpos onde uma porção de cada das seqüências de aminoácidos de cadeias pesadas e leve é homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie especifica ou pertencendo a uma classe especifica, enquanto o segmento restante da cadeia é homóloga a seqüências correspondentes em outro. Tipicamente a região variável de cadeias leve e pesada simula as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos, enquanto as porções constantes são homólogas a seqüências de anticorpos derivados de outra. Uma vantagem clara a tais formas quiméricas é que a região variável pode ser convenientemente derivada de fontes atualmente conhecidas utilizando células B prontamente disponíveis ou hibridomas a partir de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas, por exemplo, de preparados de células humanas. Embora a região variável tenha a vantagem de facilidade de preparação e a especificidade não é afetada pela fonte, a região constante sendo humana, é menos provável eliciar uma resposta imune a partir de um sujeito humano quando os anticorpos são injetados do que o faria a região constante de uma fonte não humana. Entretanto, a definição não é limitada a esse exemplo específico.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de ligação"), como utilizado aqui, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de ligar especificamente a um antígeno. Foi mostrado que a função de ligação de antigeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos no termo "porção de ligação de antigeno" de um anticorpo incluem (i) fragmentos de Fab, fragmentos monovalentes consistindo em domínios VL, VH, CL e CH; (ii) fragmentos de F(ab')2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) fragmentos de Fd consistindo nos domínios VH e CG; (iv) fragmentos de Fv consistindo nos domínios VL e VJ de um braço único de um anticorpo, (v) fragmentos de dAb (Ward e outros, (1989) Nature 341: 544-546), que consistem em um domínio VH; (vi) regiões de determinar complementaridade isoladas (CDR) e (vii) combinações de duas ou mais CDRs isoladas que podem ser opcionalmente unidas por um ligador sintético. Além disso, embora os dois domínio do fragmento de Fv, VL e VH, são codificados por genes separados, podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um ligador sintético que permite que os mesmos sejam feitos como uma única cadeia de proteína na qual o par de regiões VL e VH forma moléculas monovalentes (conhecida como cadeia única Fv (scFv) ; vide, por exemplo, Bird e outros (1988) Science 242: 423-426; e Huston e outros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia -única são também destinados a serem abrangidos no termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Um exemplo adicional são proteínas de fusão de ímunoglobulina de domínio de ligação compreendendo (i) um polipeptídio de domínio de ligação que é fundido a um polipeptídio de região de articulação de ímunoglobulina, (ii), uma região constante de cadeia pesada de ímunoglobulina CH2 fundida à região de articulação, e (iii) uma região constante de cadeia pesada de ímunoglobulina CH3 fundida com a região constante CH2. O polipeptídio de domínio de ligação pode ser uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve. As proteínas de fusão de ímunoglobulina de domínio de ligação são adicionalmente reveladas em US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na arte, e os fragmento são selecionados para utilidade do mesmo modo como o são anticorpos intactos.

O termo "epítopo" significa um determinante de proteína capaz de se ligar a um anticorpo, em que o termo "ligação" aqui se refere preferivelmente a uma ligação especifica. Epítopos normalmente consistem em agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativa como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e normalmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Epítopos de conformação e não conformação são distinguidas em que a ligação com o primeiro, porém não com o último é pedida na presença de solventes de desnaturar.

O termo "epítopo descontínuo" como utilizado aqui, significa um epítopo de conformação em um antígeno de proteína que é formado de pelo menos duas regiões separadas na seqüência primária da proteína.

O termo "molécula biespecífica" pretende incluir qualquer agente, por exemplo, uma proteína, peptídeo ou complexo de peptídeo ou proteína, que tem duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode se ligar a, ou interagir com (a) um antígeno de superfície de célula, e (b) um receptor Fc na superfície de uma célula efetora. O termo "molécula multiespecífica" ou "molécula heteroespecífica" pretende incluir qualquer agente, por exemplo, uma proteína, peptídeo, ou complexo de proteína ou peptídeo, que tem mais de duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode se ligar a, ou interagir com (a) um antígeno de superfície de célula, (b) um receptor de Fc na superfície de uma célula efetora, e (c) pelo menos outro componente. Por conseguinte, a invenção inclui, porém não é limitada a moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas e outras multiespecíficas que são dirigidas a GT468, e a outros alvos, como receptores de Fc em células efetoras. O termo "anticorpos biespecíficos" também inclui diacorpos. Diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíficos nos quais os domínios de VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídio única, porém utilizando um ligador que é demasiadamente curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, desse modo forçando os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno (vide, por exemplo, Holliger, P., e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90; 6444-6448; Poljak, R.J., e outros (1994) Structure 2: 1121-1123).

A presente invenção também inclui derivados dos anticorpos descritos aqui que para fins da invenção são abrangidos pelo termo "anticorpo". O termo "derivados de anticorpo" se refere a qualquer forma modificada de um anticorpo, por exemplo, um conjµado do anticorpo e outro agente ou anticorpo. Como utilizado aqui, um anticorpo é "derivado de" uma seqüência de linha germinativa específica se o anticorpo for obtido de um sistema por imunizar um animal ou por selecionar uma biblioteca de genes de imunoglobulina, e em que o anticorpo selecionado é pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, ainda mais preferivelmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em seqüência de aminoácido à seqüência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo derivado de uma seqüência de linha germinativa especifica não exibirá diferenças de mais de 10 aminoácidos, mais preferivelmente não mais do que 5, ou mesmo mais preferivelmente não mais do que diferença de 4, 3, 2, ou 1 aminoácido a partir da seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinativa.

Como utilizado aqui, o termo "heteroanticorpos" se refere a dois ou mais anticorpos, derivados dos mesmos, ou regiões de ligação de antígeno ligadas juntas, pelo menos dois dos quais têm especificidades diferentes. Essas especificidades diferentes incluem uma especificidade de ligação para um receptor de Fc em uma célula efetora, e uma especificidade de ligação para um antígeno ou epítopo em uma célula alvo, por exemplo, uma célula de tumor.

Os anticorpos descritos aqui podem ser anticorpos humanos. O termo "anticorpo humano", como utilizado aqui, pretende incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por seqüências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese específica do local ou aleatória in vitro ou por mutação in vivo somática).

O termo "anticorpo monoclonal" como utilizado aqui se refere a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Um anticorpo monoclonal exibe uma especificidade de ligação única e afinidade para um epítopo específico. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano, por exemplo, camundongo, fundida com uma célula imortalizada.

O termo "anticorpo recombinante" como utilizado aqui, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meio recombinante como (a) anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico com relação aos genes de imunoglobulina ou um hibridoma preparado a partir dos mesmos, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, de uma transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos de combinação recombinantes, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva junção de seqüências de gene de imunoglobulina com outras seqüências de DNA.

O termo "transfectoma", como utilizado aqui, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam um anticorpo, como células CHO, células NS/O, células HEK293, células HEK293T, células de plantas ou fungos, incluindo células de levedura.

Como utilizado aqui, um anticorpo "heterólogo" é definido em relação a um organismo transgênico produzindo tal anticorpo. Esse termo se refere a um anticorpo tendo uma seqüência de aminoácidos ou uma seqüência de ácido nucléico de codificação que corresponde àquele encontrado em um organismo não consistindo no organismo transgênico, e sendo genericamente derivado de uma espécie diferente do organismo transgênico.

Como utilizado aqui, um "anticorpo hetero híbrido" se refere a um anticorpo tendo cadeias leves e pesadas de origens de organismo diferentes. Por exemplo, um anticorpo tendo uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve de murino é um anticorpo hetero híbrido.

Os anticorpos descritos aqui são preferivelmente isolados. Um "anticorpo isolado" como utilizado aqui, pretende se referir a um anticorpo que seja substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente se liga a GT468 é substancialmente livre de anticorpos que especificamente ligam antigenos diferentes de GT468). Um anticorpo isolado que especificamente se liga a um epitopo, isoforma ou variante de GT468 humano pode, entretanto, ter reatividade cruzada com outros antigenos relacionados, por exemplo, de outras espécies (por exemplo, homólogos de espécie de GT468). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos. Em uma modalidade da invenção, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" se refere a anticorpos tendo especificidades diferentes e sendo combinados em uma composição bem definida.

O termo "ligação" de acordo com a invenção se refere preferivelmente a uma ligação específica. "Ligação específica" significa que um agente como um anticorpo se liga mais forte a um alvo (predeterminado) como um antígeno ou um epitopo para o qual é específico em comparação com a ligação com outro alvo. Uma gente se liga mais forte a um primeiro alvo em comparação com um segundo alvo se ligar com o primeiro alvo com uma constante de dissociação (KD) que é mais baixa do que a constante de dissociação para o segundo alvo. Preferivelmente a constante de dissociação (KD) para o alvo ao qual o agente se liga especificamente é mais do que 10 vezes, preferivelmente mais do que 20 vezes, mais preferivelmente mais do que 50 vezes, ainda mais preferivelmente mais do que 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes ou 1000 vezes mais baixo do que a constante de dissociação (KD) para o alvo ao qual o agente não se liga especificamente. Tipicamente, o anticorpo se liga com uma afinidade que corresponde a um KD de aproximadamente 1 x 10-7 ou menos, e se liga com o antígeno predeterminado com uma afinidade correspondendo a um KD que é menos duas ordens de magnitude mais baixo do que sua afinidade para ligação com um antigeno não especifico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno predeterminado ou um antígeno estreitamente relacionado.

O termo "KD" (M) , como utilizado aqui, pretende se referir à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação de antígeno-anticorpo específica.

Como utilizado aqui, "isotipo" se refere à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgG1) que é codificada por genes de região constante de cadeia pesada.

Como utilizado aqui, "comutação de isotipo" se refere ao fenômeno pelo qual a classe, ou isotipo, de um anticorpo muda de uma classe Ig para uma das outras classes Ig.

O termo "ocorrência natural" como utilizado aqui como aplicado a um objeto se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma seqüência de polinucleotídeo ou polipeptídio que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.

O termo "rearranjado" como utilizado aqui se refere a uma configuração de um local de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve em que um segmento V é posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J em uma conformação codificando essencialmente um domínio VH ou VL completo, respectivamente. Um local de gene de imunoglobulina rearranjado (anticorpo) pode ser identificado por comparação com o DNA de linha germinativa; um local rearranjado terá pelo menos um elemento de homologia de nonâmero/heptâmero recombinado.

O termo "não rearranjado" ou "configuração de linha germinativa", como utilizado aqui em referência a um segmento V se refere à configuração de o segmento V não é recombinado de modo a ser imediatamente adjacente a um segmento D ou J.

O termo "molécula de ácido nucléico" como utilizado aqui pretende incluir as moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucléico pode ser de fita única ou fita dupla, porém preferivelmente é DNA de fita dupla.

Os ácidos nucléicos descritos de acordo com a invenção foram preferivelmente isolados. O termo "ácido nucléico isolado" significa de acordo com a invenção que o ácido nucléico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo, por reação de cadeia de polimerase (PCR), (ii) produzido de forma recombinante por clonagem, (iii) purificado, por exemplo, por clivagem e fracionamento eletroforético-gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo, por sintese química. Um ácido nucléico isolado é um ácido nucléico que é disponível para manipulação por técnicas de DNA recombinantes.

Ácidos nucléicos podem, de acordo com a presente invenção, estarem presentes individualmente ou em combinação com outros ácidos nucléicos, que podem ser homólogos ou heterólogos. Em modalidades preferidas, um ácido nucléico é funcionalmente ligado a seqüências de controle de expressão que podem ser homólogas ou heterólogas com relação ao ácido nucléico onde o termo "homólogo" significa que o ácido nucléico também é funcionalmente ligado à seqüência de controle de expressão naturalmente e o termo "heterólogo" significa que o ácido nucléico não é funcionalmente ligado à seqüência de controle de expressão naturalmente.

Um ácido nucléico, como ácido nucléico expressando RNA e/ou proteína ou peptídeo, e uma seqüência de controle de expressão são "funcionalmente" ligados entre si, se forem covalentemente ligados entre si de tal modo que a expressão ou transcrição do ácido nucléico está sob o controle ou sob a influência da seqüência de controle de expressão. Se o ácido nucléico deve ser traduzido em uma proteína funcional, então, com uma seqüência de controle de expressão funcionalmente ligada a uma seqüência de codificação, a indução da seqüência de controle de expressão resulta em transcrição do acido nucléico,sem causar deslocamento de quadro na seqüência de codificação ou a seqüência de codificação não sendo capaz de ser traduzida na proteína ou peptídeo desejado.

O termo "seqüência de controle de expressão" compreende de acordo com a invenção promotores, sítios de ligação de ribossomo, intensificadores e outros elementos de controle que regulam a transição de um gene ou translação de um mRNA. Em modalidades específicas da invenção, as seqüências de controle de expressão podem ser reguladas. A estrutura exata de seqüências de controle de expressão pode variar como uma função da espécie ou tipo de célula, porém genericamente compreende seqüências não transcritas 5' e não traduzidas 5' e 3' que estão envolvidas em iniciação de transcrição e translação, respectivamente, como caixa TATA, seqüência de capeamento, seqüência CAAT, e similar. Mais especificamente, as seqüências de controle de expressão não transcritas 5' compreendem uma região promotora que inclui uma seqüência promotora para controle de transcrição do ácido nucléico funcionalmente ligado. As seqüências de controle de expressão também podem compreender seqüências intensificadoras ou seqüências ativadoras a montante.

De acordo com a invenção o termo "promotor" ou "região promotora" se refere a uma seqüência de ácido nucléico que é localizada a montante (5') da seqüência de ácido nucléico sendo expressa e controla a expressão da seqüência por fornecer sitio de ligação e reconhecimento para RNA-polimerase. A "região promotora" pode incluir sítios de ligação e reconhecimento adicionais para fatores adicionais que estão envolvidos na regulação de transcrição de um gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procariótico ou eucariótico. Além disso, um promotor pode ser "induzível" e pode iniciar transcrição em resposta a um agente de indução ou pode ser "constitutivo" se transcrição não for controlada por um agente de indução. Um gene que está sob o controle de um promotor induzivel não é expresso ou somente expresso até um ponto pequeno se um agente de indução estiver ausente. Na presença do agente de indução o gene é ligado ou o nivel de transcrição é aumentado. Isso é mediado, em geral, por ligação de um fator de transcrição especifico.

Promotores que são preferidos de acordo com a invenção incluem promotores para SP6, T3 e T7 polimerase, promotor de RNA U6 humano, promotor CMV, e promotores híbridos artificiais dos mesmos (por exemplo, CMV) onde uma parte ou partes são fundidas a uma parte ou partes de promotores de genes de outras proteínas celulares como, por exemplo, GAPDH humano (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), e incluindo ou não incluído (um) intron(s) adicional(is) .

De acordo com a invenção, o termo "expressão" é utilizado em seu significado mais geral e compreende a produção de RNA ou de RNA e proteína/peptideo. Também compreende expressão parcial de ácidos nucléicos. Além disso, a expressão pode ser realizada de forma transiente ou estável.

Em uma modalidade preferida, uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção está presente em um vetor, onde apropriado com um promotor, que controla expressão do ácido nucléico. O termo "vetor" é utilizado aqui em seu significado mais geral e compreende qualquer veiculo intermediário para um ácido nucléico que permite que o ácido nucléico, por exemplo, seja introduzido em células procarióticas e/ou eucarióticas e, onde apropriado, seja integrado em um genoma. Vetores desse tipo são preferivelmente replicados e/ou expressos nas células. Vetores compreendem plasmídeos, fagemids, bacteriófagos ou genomas virais. O termo "plasmídeo" como utilizado aqui se refere genericamente a uma construção de material genético extra cromossômico, normalmente um duplex de DNA circular, que pode replicar independentemente de DNA cromossômico.

Como o vetor para expressão de um anticorpo, de um tipo de vetor no qual a cadeia pesada de anticorpo e cadeia leve estão presentes em vetores diferentes ou um tipo de vetor no qual a cadeia pesada e a cadeia leve estão presentes no mesmo vetor pode ser utilizado.

Os ensinamentos dados aqui com relação a seqüências de aminoácidos e ácido nucléico específicas, por exemplo, aquelas mostradas na listagem de seqüência, deve ser interpretado de modo a se referir também a modificações das seqüências específicas resultando em seqüências que são funcionalmente equivalentes às seqüências específicas, por exemplo seqüência de aminoácido que apresentam propriedades idênticas ou similares àquelas das seqüências de aminoácido especificas e seqüências de ácido nucléico codificando seqüências de aminoácido que apresentam propriedades idênticas ou similares àquelas das seqüências de aminoácido codificadas pelas seqüências de acido nucléico especificas. Similarmente, o ensinamento dado aqui com relação a anticorpos específicos ou hibridomas que produzem anticorpos específicos deve ser interpretado de modo a se referir também a anticorpos caracterizados por uma seqüência de aminoácido e/ou seqüência de ácido nucléico que é modificada em comparação com a seqüência de aminoácido e/ou seqüência de ácido nucléico dos anticorpos específicos, porém sendo funcionalmente equivalentes. Uma propriedade importante é reter a ligação de um anticorpo a seu alvo ou sustentar funções efetoras de um anticorpo. Preferivelmente, uma seqüência modificada com relação a uma seqüência específica, quando substitui a seqüência específica em um anticorpo retém ligação do anticorpo com GT468 e preferivelmente funções do anticorpo como descrito aqui, por exemplo, lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC.

Será reconhecido por aqueles versados na técnica que em particular as seqüências da CDR, regiões hiper variáveis e variáveis podem ser modificadas sem perder a capacidade de ligar GT468. Por exemplo, regiões de CDR serão idênticas ou altamente homólogas às regiões de anticorpos especificados aqui. Por "altamente homólogo" considera-se que de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 4, como 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições podem ser feitas nas CDRs. Além disso, as regiões hiper variáveis e variáveis podem ser modificadas de modo que mostrem homologia substancial com as regiões de anticorpos especificamente reveladas aqui.

Deve ser entendido que os ácidos nucléicos específicos descritos aqui também incluem ácidos nucléicos modificados para fins de otimizar o uso de códon em uma célula ou organismo hospedeiro específico. Diferenças em uso de códon entre organismos podem levar a uma variedade de problemas referentes à expressão de gene heterólogo. A otimização de códon por alterar um ou mais nucleotídeos da seqüência original pode resultar em uma otimização da expressão de um ácido nucléico, em particular em otimização de eficácia de translação, em um hospedeiro homólogo ou heterólogo no qual o ácido nucléico deve ser expresso. Por exemplo, se ácidos nucléicos derivados de regiões constantes de codificação e humana e/ou regiões de estrutura de anticorpos devem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, por exemplo, para preparar anticorpos quiméricas ou humanizadas, pode ser preferido modificar os ácidos nucléicos para fins de otimização de uso de códon, em particular se os ácidos nucléicos, opcionalmente fundidos com ácidos nucléicos heterólogos como ácidos nucléicos derivados de outros organismos como descrito aqui, devem ser expressos em células de um organismo diferente de ser humano como camundongo ou hamster. Por exemplo, as seqüências de ácido nucléico que codificam regiões constantes de cadeia pesada e leve humana como aquelas de acordo com SEQ ID Nos: 19 e 20, respectivamente, podem ser modificados para incluir uma ou mais, preferivelmente pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 e preferivelmente até 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 ou 100 ou mais substituições de nucleotideo resultando em um uso otimizado de códon, porém não resultando em alteração da sequência de aminoácido. Tais substituições de nucleotideo se referem preferivelmente a substituições de nucleotideos nas SEQ ID Nos: 19 e 20, respectivamente, selecionados das substituições mostradas no seguinte alinhamento de SEQ ID NOS: 19 e 20, respectivamente, com suas cópias modificadas e não resultando em alteração na seqüência de aminoácido codificado ou se referem a substituições correspondentes em posições correspondentes em outras seqüências de ácido nucléico que codificam regiões constantes de cadeia leve e pesada humana, respectivamente. Preferivelmente, todas as substituições mostradas nos seguintes alinhamentos das SEQ ID Nos: 19 e 20, respectivamente, com suas cópias modificadas não resultante em alteração na seqüência de aminoácido codificada são efetuadas em seqüências de ácido nucléico codificando regiões constantes de cadeia leve e pesada humana, respectivamente.

Alinhamento de SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 21:

Alinhamento de SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 23:

Além disso, pode ser desejado de acordo com a presente invenção modificar as seqüências de aminoácidos descritas aqui, em particular aquelas de regiões constantes de cadeia pesada humana para adaptar a seqüência a um alótipo desejado, por exemplo, um alótipo encontrado na população caucasiana. Tais modificações são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste nas seguintes substituições de aminoácido na SEQ ID NO: 17 ou em posições correspondentes em outras regiões constantes de cadeia pesada humana: K93R, D235E e L237M. Preferivelmente, todas essas modificações são incluídas em seqüências de aminoácido de regiões constantes de cadeia pesada humana.

De acordo com a presente invenção, o termo "posições correspondentes se refere a nucleotídeos ou resíduos de aminoácido que em um alinhamento de seqüência de duas seqüências de proteína ou ácido nucléico são alinhadas entre si.

De acordo com a presente invenção, uma variante, derivado, forma modificada ou fragmento de uma seqüência de ácido nucléico, seqüência de aminoácidos, ou peptídeo tem preferivelmente uma propriedade funcional da seqüência de ácido nucléico, seqüência de aminoácido, ou peptídeo, respectivamente, do qual foi derivado. Tais propriedades funcionais compreendem a interação com ou ligação a outras moléculas. Em uma modalidade, uma variante, derivado, forma modificada ou fragmento de uma seqüência de ácido nucléico, seqüência de aminoácido, ou peptídeo é imunologicamente equivalente à seqüência de ácido nucléico, seqüência de aminoácido, ou peptídeo, respectivamente, do qual foi derivado.

Preferivelmente o grau de identidade entre uma seqüência de ácido nucléico específica e uma seqüência de ácido nucléica que é modificada com relação a ou que é uma variante da seqüência de ácido nucléico específica será pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, ou mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Com referência a variante de ácido nucléico GT468, o grau de identidade é preferivelmente dado para uma região de pelo menos aproximadamente 300, pelo menos aproximadamente 400, pelo menos aproximadamente 450, pelo menos aproximadamente 500, pelo menos aproximadamente 550, pelo menos aproximadamente 600 ou pelo menos aproximadamente 630 nucleotídeos. Em modalidades preferidas, o grau de identidade é dado para o comprimento total da seqüência de ácido nucléico de referência como as seqüências de ácido nucléico dadas na listagem de seqüência. Preferivelmente as duas seqüências são capazes de hibridizar e formar um duplex estável entre si, com hibridização preferivelmente sendo realizado sob condições que permitem hibridização especifica entre polinucleotideos (condições rigorosas). Condições rigorosas são descritas, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook e outros, Editores, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989 ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel e outros, Editores, John Wiley & Sons, Inc., Nova York e se referem, por exemplo, à hibridização a 65°C em tampão de hibridização (3.5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinil pirrolidona, 0,02% de albumina de soro bovino, 2.5 mM NaH2P04 (pH 7) , 0.5% SDS, 2mM EDTA) . SSC é 0.15 M cloreto de sódio/0.15 M citrato de sódio, pH 7. Após hibridização, a membrana para a qual o DNA foi transferido é lavada, por exemplo, em 2 x SSC em temperatura ambiente e então em 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS em temperaturas de até 68°C.

Para fins da presente invenção, "variantes" de uma seqüência de aminoácido compreendem variantes de inserção de aminoácido, variantes de deleção de aminoácido e/ou variantes de substituição de aminoácido.

Preferivelmente, o grau de similaridade, preferivelmente identidade entre uma seqüência de aminoácido especifica e uma seqüência de aminoácido que é modificada com relação a ou que é uma variante da seqüência de aminoácido especifica como entre seqüências de aminoácido mostrando homologia substancialmente será pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, ou mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Com relação a variantes de polipeptidio GT468, o grau de similaridade ou identidade é fornecido preferivelmente para uma região de pelo menos aproximadamente 100, pelo menos aproximadamente 120, pelo menos aproximadamente 140, pelo menos aproximadamente 160, pelo menos aproximadamente 180, pelo menos aproximadamente 200, pelo menos aproximadamente 210 ou 212 aminoácidos. Em modalidades preferidas, o grau de similaridade ou identidade é dado para o comprimento total da seqüência de aminoácidos de referência como as seqüência de aminoácido dadas na listagem de seqüência.

Todas as seqüências modificadas descritas ou variantes de seqüência estão compreendidas no escopo da presente invenção.

"Similaridade de seqüência" indica a percentagem de aminoácidos que são idênticas ou que representam substituições de aminoácido conservativas. "Identidade de seqüência" entre duas seqüências de polipeptídio ou ácido nucléico indica a percentagem de aminoácidos ou nucleotídeos que são idênticos entre as seqüências.

A "percentagem de identidade" é obtida após o melhor alinhamento, essa percentagem sendo puramente estatística e as diferenças entre as duas seqüências sendo distribuídas aleatoriamente e através de seu comprimento inteiro. Comparações de seqüência entre duas seqüências de nucleotideo ou aminoácidos são convencionalmente realizadas por comparação dessas seqüências após ter alinhado as mesmas de forma ótima, a comparação sendo realizada por segmento ou por "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de seqüência. O alinhamento ótimo das seqüências para comparação pode ser produzido, além de manualmente, por intermédio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por intermédio de algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por intermédio do método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ou por intermédio de programas de computador que utilizam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

A percentagem de identidade é calculada por determinar o número de posições idênticas entre as duas seqüências sendo comparadas, dividindo esse número pelo número de posições comparadas e multiplicando o resultado obtido por 100 de modo a obter a percentagem de identidade entre essas duas seqüências.

"Substituintes conservativas" podem ser feitas, por exemplo, com base em similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, (a) aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolína, fenil alanina, triptofano e metionina; (b) aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; (c) aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina, e histidina; e (d) aminoácidos negativamente carregados (acídicos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

Substituições tipicamente podem ser feitas nos grupos (a)-(d). Além disso, glicina e prolina podem ser substituídas entre si com base em sua capacidade de romper a-hélices. Algumas substituições preferidas podem ser feitas entre os seguintes grupos: (i) S e T; (ii) P e G; e (iii) A, V, L e I. dado o código genético conhecido, e técnicas de DNA recombinante e sintética, o cientista versada pode facilmente construir DNAs codificando as variantes de aminoácido conservativas.

A presente invenção compreende anticorpos nos quais alterações foram feitas na região Fc para alterar as propriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos. Tais alterações podem resultar em uma diminuição ou aumento de ligação Clq e CDC ou de ligação FcyR e ADCC. As substituições podem, por exemplo, ser feitas em um ou mais dos resíduos de aminoácido da região constante de cadeia pesada, desse modo causando uma alteração em uma função efetora enquanto retém a capacidade de ligar-se ao antígeno em comparação com o anticorpo modificado, conforme US 5.624.821 e US 5.648.260.

A meia-vida in vivo de anticorpos pode ser melhorada modificando e epítopo receptor de recuperação do domínio constante Ig ou um domínio constante semelhante à Ig de tal modo que a molécula não compreenda um domínio de CH2 intacto ou uma região Fc Ig intacto, conforme US 6.121.022 e US 6.194.551. a meia-vida in vivo pode ser adícionalmente aumentada fazendo mutações na região Fc, por exemplo, por substituição de treonina por leucina na posição 252, por substituição de treonina por serina na posição 254, ou por substituição de treonina por fenil alanina na posição 256, conforme US 6.277.375.

Além disso, o padrão de glicosilação de anticorpos pode ser modificado para alterar a função efetora dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos podem ser expressos em um transfectoma que não adiciona a unidade de fucose normalmente ligada a Asn na posição 297 da região Fc para aumentar a finidade da região Fc para receptores-Fc que, por sua vez, resultará em um ADCC aumentado dos anticorpos na presença de células NK, cf. Shield e outros (2002) JBC, 277: 26733. Além disso, a modificação de galactosilação pode ser feita para modificar CDC.

Alternativamente, em outra modalidade, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma seqüência de codificação de anticorpo anti-GT468, como por mutagênese de saturação, e os anticorpos anti-GT468 modificados resultantes podem ser selecionados para atividade de ligação.

O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") como utilizado aqui, pretende se referir a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos pretendem se referir não somente à célula em questão especifica como a progénie de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer em gerações seguintes devido à mutação ou influências ambientais, tal progénie pode não ser, na realidade, idêntica à célula de origem, porém são ainda incluídas no escopo do termo "célula hospedeira" como utilizado aqui. Células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, como células CHO, células NS/O, e células linfocíticas.

Como utilizado aqui, o termo "sujeito" inclui qualquer animal humano ou não humano. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, carneiros, cães, vaca, galinhas, anfíbios, repteis, etc.

O termo "animal transgênico" se refere a um animal tendo um genoma que compreende um ou mais transgenes, preferivelmente transgenes de cadeia pesada e/ou leve, ou transcromossomos (integrados ou não integrados no DNA genômico natural do animal) e que é preferivelmente capaz de expressar os transgenes. Por exemplo, um camundongo transgênico pode ter um transgene de cadeia leve humano e um transgene de cadeia pesada humano ou trasncromossomo de cadeia pesada humano, de tal modo que o camundongo produza anticorpos anti-GT468 humanos quando imunizados com antigeno GT468 e/ou células que expressam GT468. O transgene de cadeia pesada humano pode ser integrado no DNA cromossômico do camundongo, como é o caso para camundongos transgênicos, por exemplo, camundongo HuMAb, como camundongos HCo7 ou HJCol2, ou o transgene de cadeia pesada humano pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para camundongos transcromossômicos (por exemplo, KM) como descrito em WO 02/43478. Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos podem ser capazes de produzir isotipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos a GT468 (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgE) por ser submetido à recombinação de V-D-J e comutação de isotipo.

"Reduzir" ou "inibir" como utilizado aqui significa a capacidade de causar uma diminuição geral, preferivelmente de 5% ou mais, 10% ou mais, 20% ou mais, mais preferivelmente de 50% ou mais, e mais preferivelmente de 75% ou mais, no nivel, pro exemplo no nivel de proliferação de células.

A frase "inibir atividade de uma célula" ou frases similares incluem uma inibição de atividade completa ou essencialmente completa da célula e uma redução na atividade da célula. Preferivelmente, a inibição de atividade de uma célula reduz crescimento de célula de tumor e/ou induz morte de célula de tumor e desse modo tem um efeito de inibir tumor ou destruir tumor.

Mecanismos de ação de mAb

Embora o que se segue forneça considerações em relação ao mecanismo subjacente à eficácia terapêutica de anticorpos da invenção não deve ser considerado como limitando de modo algum a presente invenção.

Os anticorpos descritos aqui podem interagir com componentes do sistema imune, preferivelmente através de ADCC ou CDC. Anticorpos da invenção também podem ser utilizados para alvejar cargas úteis (por exemplo, radioisótopos, drogas ou toxinas) para matar diretamente células de tumor ou podem ser utilizados de forma sinérgica com agentes quimioterapêuticos tradicionais, atacando tumores através de mecanismos de ação complementares que podem incluir respostas imunes anti-tumor que podem ter sido comprometidas devido a efeitos colaterais citotóxicos de quimioterapêuticos em linfócitos T. Entretanto, anticorpos da presente invenção também podem exercer um efeito simplesmente por ligar-se a GT468 na superfície de célula, desse modo, por exemplo, bloqueando a proliferação das células.

Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo

ADCC descreve a capacidade de matar células de células efetoras como descrito aqui, em particular linfócitos, que exige preferivelmente que a célula alvo seja marcada por um anticorpo.

ADCC ocorre, preferivelmente quando anticorpos se ligam a antigenos em células de tumor e os domínios de anticorpo Fc engatam receptores Fc (FcR) na superfície de células efetoras imunes. Várias famílias de receptores de Fc foram identificadas, e populações de células específicas expressam caracteristicamente receptores Fc definidos. ADCC pode ser vista como um mecanismo para induzir diretamente um grau variável de destruição imediata de tumor que leva à apresentação de antígeno e a indução de respostas de célula T dirigidas a tumor. Preferivelmente, a indução in vivo de ADCC levará a respostas de célula T dirigidas para tumores e respostas de anticorpo derivadas de hospedeiro.

Citotoxicidade dependente de complemento

CDC é outro método de matar células que pode ser dirigido por anticorpos. IgM é o isotipo mais eficaz para ativação de complemento. IgG1 e IgG3 são ambos também mitos eficazes em dirigir CDC através da via de ativação de complemento clássica. Preferivelmente, nessa cascata, a formação de complexos de anticorpo-antígeno resulta na exposição de múltiplos sítios de ligação Clq em proximidade estreita nos domínios CH2 de moléculas de anticorpo participantes como moléculas de IgG (Clq é um de três subcomponentes do complemento C1) . Preferivelmente, esses sítios de ligação Clq expostos convertem a interação IgG-Clq anteriormente de baixa afinidade em uma de alta avidez, que desencadeia uma cascata de eventos que envolvem uma série de outras proteínas de complemento e leva à liberação proteolítica dos agentes de ativação/quimiotáticos de célula efetora C3a e C5a. Preferivelmente, a cascata de complemento termina na formação de um complexo de ataque de membrana, que cria poros na membrana de célula que facilitam a passagem livre de água e solutos para dentro e para fora da célula.

Produção de anticorpos

Anticorpos da invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora procedimentos de hibridização de célula somática sejam preferidos em princípio, outras técnicas para produzir anticorpos monoclonais podem ser empregadas, por exemplo, transformação oncogênica ou viral de B-linfócitos ou técnicas de exibição de fagos utilizando bibliotecas de genes de anticorpo.

O sistema de animal preferido para preparar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Sócios de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.

Outros sistemas de animais preferidos para preparar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais são o sistema de rato e o de coelho (por exemplo, descrito em Spieker-Polet e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), vide também Rossi e outros, Am J Clin. Pathol. 124: 294 (2005)).

Ainda em outra modalidade preferida, anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra GT468 podem ser gerados utilizando camundongos transgênicos ou transcromossômícos que carregam partes do sistema imune humano em vez do sistema de camundongo. Esses camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos conhecidos como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente mencionados aqui como "camundongos transgênicos." A produção de anticorpos humanos em tais camundongos transgênicos pode ser executada como descrito em detalhe para CD20 em WO2004 035607.

Ainda outra estratégia para gerar anticorpos monoclonais é isolar diretamente genes que codificam anticorpos a partir de linfócitos produzindo anticorpos de estratégia definida, por exemplo, vide Babcock e outros, 1996; uma estratégia nova para gerar anticorpos monoclonais a partir de linfócitos isolados, únicos que produzem anticorpos de estratégia definida. Para detalhes de engenharia de anticorpo recombinante, vide também Welschof e Kraus, Recombinant antibodies for câncer therapy ISBN-0-89603-918-8 e Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Imunizações

Para gerar anticorpos para GT468, camundongos podem ser imunizados com peptídeos conjµados com veiculo derivados da seqüência GT468, um preparado enriquecido de antigeno GT468 recombinantemente expresso ou fragmentos do mesmo e/ou células que expressam GT468, como descrito. Alternativamente, camundongos podem ser imunizados com DNA codificando GT468 humano de comprimento total (por exemplo, SEQ ID NO; 1) ou fragmentos do mesmo, em particular aqueles codificando SEQ ID Nos. 3-10 e 35-82. No evento de que imunizações utilizando um preparado parcial ou enriquecido do antígeno de GT468 não resulte em anticorpos, camundongos também podem ser imunizados com células que expressam GT468, por exemplo, uma linhagem de células, para promover respostas imunes.

A resposta imune pode ser monitorada durante o curso do protocolo de imunização com amostras de soro e plasma sendo obtidas por sangrias retroorbitais ou de veia de cauda. camundongos com titulos suficientes de imunoglobulina anti-GT468 podem ser utilizados para fusões. Camundongos podem ser reforçados por via intraperitoneal ou via intravenosa com GT468 expressando células 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço para aumentar a taxa de hibridomas que secretam anticorpo especifico.

Geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais

Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais a GT468, esplenócitos e células de linfonodo a partir de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos em uma linhagem de célula imortalizada apropriada, como uma linhagem de célula de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser então selecionados para a produção de anticorpos específicos de antígeno. Cavidades individuais podem ser então selecionadas por ELISA para hibridomas que secretam anticorpo. Por análise de FACS e Imunofluorescência utilizando células que expressam GT468, anticorpos com especificidade para GT468 podem ser identificados. Os hibridomas que secretam anticorpo podem ser revestidos novamente, selecionados novamente, e se ainda positivos para anticorpos monoclonais anti-GT468 podem ser subclonados por limitar diluição. Os subclones estáveis podem ser então cultivados in vitro para gerar anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.

Geração de transfectomas que produzem anticorpos monoclonais

Anticorpos da presente invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinantes e métodos de transfecção de gene como são bem conhecidos na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202) .

Por exemplo, em uma modalidade, o(s) gene(s) de interesse, por exemplo, genes de anticorpo, podem ser ligados em um vetor de expressão como plasmídeo de expressão eucariótica como utilizado pelo sistema de expressão de gene GS revelado nos documentos WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338 841 ou outros sistemas de expressão bem conhecidos na técnica. O plasmídeo purificado com os genes de anticorpo clonado podem ser introduzidos em células hospedeiras eucarióticas como células CHO, células NS/O, células HEK293T ou células HEK293 ou alternativamente outras células eucarióticas como células derivadas de planta, células fúngicas ou de levedura. O método utilizado para introduzir esses genes podem ser métodos descritos na técnica como eletroporação, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após introdução desses genes de anticorpo nas células hospedeiras, células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Essas células representam os transfectomas que podem ser então amplificados para seu nível de expressão e aumentados para produzir anticorpos. Anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir desses sobrenadantes de cultura e/ou células.

Alternativamente, os genes de anticorpo clonados podem ser expressos em outros sistemas de expressão, incluindo células procarióticas, como microorganismos, por exemplo, E. coli. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais não humanos transgênicos, como em leite de cabra e coelhos ou em ovos de galinhas, ou em plantas transgênicas; vide, por exemplo, Verma, R., e outros (1998) J. Immunol. Meth.216: 165-181; Pollock, e outros (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; e Fischer, R., e outros (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Uso de seqüências de anticorpo parcial para expressar anticorpos intactos (isto é, humanização e quimerização). a) Quimerização

Anticorpos monoclonais de murino podem ser utilizados como anticorpos terapêuticos em seres humanos quando rotulados com toxinas ou isótopos radioativos. Anticorpos de murino não rotulados são altamente imunogênicos no homem quando aplicados repetitivamente levando à redução do efeito terapêutico. A principal imunogenicidade é mediada pelas regiões constantes de cadeia pesada. A imunogenicidade de anticorpos de murino no homem pode ser reduzida ou totalmente evitada se anticorpos respectivos forem quimerizados ou humanizados. Anticorpos quiméricos são anticorpos, cujas porções diferentes são derivadas de espécie de animal diferente, como aqueles tendo uma região variável derivada de um anticorpo de murino e uma região constante de imunoglobulina humana. A quimerização de anticorpos é obtida por junção das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpo de murino com a região constante de cadeia pesada e leve humana (por exemplo, como descrito por Kraus e outros, em Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for câncer therapy ISBN-0-89603-918-8). Em uma modalidade preferida anticorpos quiméricos são gerados por junção de região constante de cadeia leve-kappa humana com região variável de cadeia leve de murino. Em uma modalidade também preferida anticorpos quiméricos podem ser gerados por junção de região constante de cadeia leve-lambda humana com região variável de cadeia leve de murino. As regiões constante de cadeia pesada preferida para geração de anticorpos quiméricos são IgG1, IgG3 e IgG4. outras regiões constantes de cadeia pesada preferida para geração de anticorpos quiméricos são IgG2, IgA, IgD e IgM.

b) Humanização

Anticorpos interagem com antigenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácido que são localizados nas seis regiões de determinar complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). Por esse motivo, as seqüências de aminoácidos nas CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que seqüências fora de CDRs. Como as seqüências de CDR são responsáveis pela maioria das interações de anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que simulam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos por construir vetores de expressão que incluem seqüências de CDR a partir do anticorpo de ocorrência natural específico enxertado sobre seqüências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L. e outros (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. e outros (1986) Nature 321: 522525; e Queen, C. e outros (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 86: 10029-10033). Tais seqüências de estrutura podem ser obtidas de bancos de dados de DNA públicos que incluem seqüências de gene de anticorpo de linha germinativa. Essas seqüências de linha germinativa diferirão de seqüências de gene de anticorpo maduro porque não incluirão genes variáveis totalmente montados, que são formados por junção de V(D)J durante maturação de célula B. as seqüências de gene de linha germinativa também diferirão das seqüências de um anticorpo de repertório secundário de alta afinidade em individual uniformemente através da região variável. Por exemplo, mutações somáticas são relativamente não freqüentes na porção terminal amino de região de estrutura 1 e na porção terminal carbóxi da região de estrutura 4. Além disso, muitas mutações somáticas não alteram significativamente as propriedades de ligação do anticorpo. Por esse motivo, não é necessário obter a seqüência de DNA inteira de um anticorpo especifico para recriar um anticorpo recombinante intacto tendo propriedades de ligação similares àquelas do anticorpo original (vide WO 99/45962). Seqüências de cadeia pesada e leve parciais que cobrem as regiões CDR são tipicamente suficientes para essa finalidade. A seqüência parcial é utilizada para determinar qual variável de linha germinativa e segmentos de gene de junção contribuiram para os genes variáveis de anticorpo recombinados. A seqüência de linha germinativa é então utilizada para preencher porções ausentes das regiões variáveis. Seqüências lideres de cadeia pesada e leve são clivadas durante maturação de proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para acrescentar seqüências ausentes, seqüências de cDNA clonados podem ser combinadas com oligonucleotídeos sintéticos por ligação ou amplificação PCR. Alternativamente, a região variável inteira pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleotídeos de sobreposição curtos e combinados por amplificação de PCR para criar um clone de região variável totalmente sintética. Esse processo tem certas vantagens como eliminação ou inclusão ou sítios de restrição específicos, ou otimização de códons específicos.

As seqüências de nucleotídeo de transcritos de cadeia pesada e leve a partir de hibridomas são utilizadas para projetar um conjunto de sobreposição de oligonucleotídeos sintéticos para criar seqüências V sintética com capacidades de codificação de aminoácido idênticas como as seqüências naturais. As seqüências de cadeia kappa e pesada sintéticas podem diferir das seqüências naturais em três modos; séries de bases de nucleotídeo repetidas são interrompidas para facilitar síntese de oligonucleotídeo e amplificação de PCR; sítios de iniciação de translação ótimos são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); e sítios Hindlll são construídos a montante dos sítios de iniciação de translação.

Para regiões variáveis de cadeia pesada e leve, a codificação otimizada e não codificação correspondente seqüências de fita são divididas em 30-50 nucleotídeos aproximadamente no ponto médio do oligonucleotídeo de não codificação correspondente. Desse modo, para cada cadeia, os oligonucleotídeos podem ser montados em conjuntos de fita dupla de sobreposição que cobrem segmentos de 150-400 nucleotídeos. Tipicamente, um conjunto de oligonucleotídeo de região variável única será dividido em dois grupos que são separadamente amplificados para gerar dois produtos de PCR de sobreposição. Esses produtos de sobreposição são então combinados por amplificação de PCR para formar a região variável completa. Pode ser também desejável incluir um fragmento de sobreposição da região constante de cadeia pesada ou leve na amplificação de PCR para gerar fragmentos que podem ser facilmente clonados nas construções de vetor de expressão.

As regiões variáveis de cadeia pesada e leve quimerizadas ou humanizadas reconstruídas são então combinadas com promotor clonado, líder, iniciação de translação, região constante, 3' não traduzido, poliadenilação e seqüências de terminação de transcrição para formar construções de vetor de expressão. As construções de expressão de cadeia leve e pesada podem ser combinadas em um único vetor, co-transfectado, transfectado em série, ou separadamente transfectado em células hospedeiras que são então fundidas para formar uma célula hospedeira que expressa as duas cadeias. Plasmídeos para uso em construção de vetores de expressão para IgGk humano são descritos. Os plasmídeos podem ser construídos de modo que seqüências de cDNA de cadeia leve kappa V e pesada V amplificada por PCR podem ser utilizadas para reconstruir minigenes de cadeia leve e pesada completos. Esses plasmídeos podem ser utilizados para expressar anticorpos totalmente humano, ou IgG1 quimérico, Kappa, ou IgG4, kappa. Plasmídeos similares podem ser construídos para expressão de outros isotipos de cadeia pesada, ou para expressão de anticorpos compreendendo cadeias leves de lambda.

Desse modo, em outro aspecto da presente invenção, as características estruturas dos anticorpos anti-GT468 da invenção, são utilizadas para criar anticorpos anti-GT468 humanizados estruturalmente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, como ligação a GT468. Mais especificamente, uma ou mais regiões de CDR de anticorpos monoclonais de camundongo podem ser combinados de forma recombinante com regiões de estrutura humana conhecidas e CDRs para criar anticorpos anti-GT468 humanizados, construídos de forma recombinante, adicionais da presente invenção.

Ligação a células que expressam antígeno

A capacidade do anticorpo de ligar GT468 pode ser determinada utilizando ensaios de ligação padrão, como aqueles expostos nos exemplos (por exemplo, ELISA, Western blot, Imunofluorescência e análise citométrica de fluxo).

Isolamento e caracterização de anticorpos

Para purificar anticorpos anti-GT468, hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascos de giro de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal, alternativamente, anticorpos anti-GT468 podem ser produzidos em biorreatores baseados em diálise. Sobrenadantes podem ser filtrados e, se necessário, concentrados antes de cromatografia de afinidade com proteína G-sefarose ou proteína A-sefarose. IgG eluído pode ser verificado por eletroforese de gel e cromatografia de liquido de alto desempenho para assegurar pureza. A solução de tampão pode ser permutada em PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 utilizando coeficiente de extinção de 1.43. Os anticorpos monoclonais podem ser formados em alíquotas e armazenados a -80°C.

Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-GT468 selecionados se ligam a epítopos exclusivos mutagênese dirigida a sítio ou dirigida a múltiplos sítios pode ser utilizada.

Determinação de isotipo

Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, ELISAs de isotipo com vários kits comerciais (por exemplo, Zymed, Roche Diagnostics) podem ser executadas. Cavidades de placas de microtítulo podem ser revestidas com Ig de anti-camundongo. Após bloqueio, as placas são reagidas com anticorpos monoclonais ou controles de isotipo purificados, em temperatura ambiente por duas horas. As cavidades podem ser então regidas com IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG32 de camundongo, IgA ou sondas conjµadas de peroxidase específica de IGM de camundongo. Após lavagem, as placas podem ser reveladas com substrato ABTS (1 mg/ml) e analisadas em OD de 405-650. Alternativamente, o kit de isotipagem de anticorpo monoclonal de camundongo IsoStrip (Roche, No. Do cat. 1493027) pode ser utilizado como descrito pelo fabricante.

Análise citométrica de fluxo

Para demonstrar a presença de anticorpos anti-GT468 em soros de camundongos imunizados ou ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam GT468, a citometria de fluxo pode ser utilizada. Linhagens de célula que expressam GT468 naturalmente ou após transfecção e controles negativos sem expressão de GT468 (cultivados sob condições de crescimento padrão) podem ser misturadas com várias concentrações de anticorpos monoclonais em sobrenadantes de hibridoma ou em PBS contendo 1% de FBS, e podem ser incubados a 4°C por 30 min. após lavagem, o anticorpo anti IgG rotulado com Alexa647 ou APC pode se ligar ao anticorpo monoclonal ligado por GT648 sob as mesmas condições que a coloração de anticorpo primária. As amostras podem ser analisadas por citometria de fluxo com um instrumento FACS utilizando propriedades de dispersão lateral e luz para comportar em células vivas, únicas. Para distinguir anticorpos monoclonais específicos de GT468 a partir de aglutinantes não específicos em uma medição única, o método de co-transfecção pode ser empregado. Células transientemente transfectadas com plasmídeos codificando GT468 e um marcador fluorescente pode ser colorido como descrito acima. Células transfectadas podem ser detectadas em um canal de fluorescência diferente do que células coloridas com anticorpo. Como a maioria das células transfectadas expressa os dois transgenes, anticorpos monoclonais específicos de GT468 se ligam preferencialmente a células que expressam marcador de fluorescência, ao passo que anticorpos não específicos se ligam em uma razão comparável com células não transfectadas. Um ensaio alternativo utilizando microscopia de fluorescência pode ser utilizado além de ou em vez do ensaio de citometria de fluxo. Células podem ser coloridas exatamente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência.

Microscopia de imunofluorescência

Para demonstrar a presença de anticorpos anti-GT468 em soros de camundongos imunizados ou ligação de anticorpos monoclonais com células vivas que expressam GT468, a análise de microscopia de imunoflorescência pode ser utilizada. Por exemplo, linhagens de célula que expressam GT468 espontaneamente ou após transfecção e controles negativos sem expressão de GT468 são cultivadas em lâminas de câmara sob condições de crescimento padrão em meio DMEM/F12, suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (FCS), 2 mM de L=-glutamina, 100 IU/ml de penicilina e 100 μ/ml de estreptomicina. As células podem ser então fixas com metanol ou paraformaldeído ou deixadas não tratadas. As células podem ser então reagidas com anticorpos monoclonais contra GT468 por 30 min. a 25°C. Após lavagem, as células podem ser reagidas com um anticorpo secundário IgG anti-camundongo rotulado com Alexa555 (Molecular Probes) sob as mesmas condições. As células podem ser então examinadas por microscopia de fluorescência.

Os níveis de GT468 totais em células podem ser observados quando células são fixadas por metanol ou fixadas por paraformaldeído e permeabilizadas com Triton X-100. Em células vivas e não permeabilizadas, a localização superficial de células fixadas com paraformaldeído de GT468 pode ser examinada. Adicionalmente o alvejamento de GT468 em junções apertadas pode ser analisado por co-coloração com marcadores de junção apertada como ZO-1. Além disso, os efeitos de ligação de anticorpo em localização de GT468 na membrana de célula podem ser examinados.

Western blot

IgG anti-GT468 pode ser adicionalmente testado em relação à reatividade com antígeno GT468 por Western blotting. Resumidamente, extratos de célula de células que expressam GT468 e controles negativos apropriados podem ser preparados e submetidos a sulfato de dodecil de sódio (SDS) eletroforese de gel de poliacrilamida. Após eletroforese, os antígenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação de IgG pode ser detectada utilizando peroxidase de IgG anti-camundongo e revelados com substrato ECL.

Imunohistoquímica

IgGs de camundongo anti-GT468 podem ser adicionalmente testados em relação à reatividade com antígeno GT468 por Imunoistoquimica em um modo bem conhecimento pela pessoa versada, por exemplo, utilizando criosseções fixadas com acetona ou paraformaldeido ou seções de tecido embebidas em parafina fixas com paraformaldeido a partir de amostras de tecido com câncer ou tecido sem câncer obtidas de pacientes durante procedimentos cirúrgicos de rotina ou de camundongos com tumores xenoenxertados inoculados com linhagens de célula que expressam espontaneamente ou após transfecção de GT468. Para imunocoloração, anticorpos reativos a GT468 podem ser incubados seguido por anticorpos anti-coelho de cabra ou anti-camundongo de cabra conjµados com peroxidase da raiz forte (DAKO) de acordo com as instruções do vendedor.

Atividades de matar célula e fagocitica de anticorpos in vitro

Além de se ligar especificamente a GT468, anticorpos anti-GT468 podem ser testados por sua capacidade em mediar fagocitose e extermínio de células que expressam GT468 e/ou ser caracterizados por associação de GT468 com sua superfície de célula. O teste de atividade de anticorpo monoclonal in vitro fornecerá uma tiragem inicial antes do teste de modelos in vivo.

Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) :
Resumidamente, as células polimorfonucleares (PMNs), células NK, monócitos, células mononucleares ou outras células efetoras, de doadores saudáveis podem ser purificadas por centrifpação de densidade de Ficoll Hypaque, seguida por lise de eritrócitos de contaminação. As células efetoras lavadas podem ser suspensas em RPMI suplementado com soro de vitelo fetal inativado a calor a 10% ou alternativamente com soro humano inativado a calor a 5% e misturado com células alvo rotuladas 51Cr que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula, em várias razões de células efetoras para células alvo. Alternativamente, as células alvo podem ser rotuladas com um ligando de intensificar fluorescência (BATDA). Um quelato altamente fluorescente de európio com o ligando de intensificação que é liberado de células mortas pode ser medido por um fluorímetro. Outra técnica alternativa pode utilizar a transfecção de células alvo com luciferase. Amarelo lúcifer adicionado pode ser então oxidado por células viáveis somente. IgGs de anti-GT468 purificados podem ser então adicionados em várias concentrações. IgG humano irrelevante pode ser utilizado como controle negativo. Ensaios podem ser realizados por 4 a 20 horas a 37°C dependendo do tipo de célula efetora utilizada. As amostras podem ser ensaiadas para citólise por medição de liberação de 51Cr ou a presença do quelato de EuTDA no sobrenadante de cultura. Alternativamente, luminescência resultando da oxidação de amarelo lúcifer pode ser uma medida de células viáveis.

Anticorpos monoclonais anti-GT468 podem ser também testados em várias combinações para determinar se citólise é intensificada com múltiplos anticorpos monoclonais.

Citotoxicidade dependente de complemento (CDC)

Anticorpos anti-GT468 monoclonais podem ser testados em relação a sua capacidade de mediar CDC utilizando uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, soro para complemento pode ser obtido de sangue em um modo conhecido pela pessoa versada. Para determinar a atividade de CDC de mAbs, diferentes métodos podem ser utilizados. Liberação de 51Cr pode, por exemplo, ser medida ou permeabilidade elevada de membrana pode ser avaliada utilizando um ensaio de exclusão de iodeto de propídio (PI). Resumidamente, células alvo podem ser lavadas e 5 x 105/ml pode ser incubado com várias concentrações de mAb por 10-30 min. em temperatura ambiente ou a 37°C. soro ou plasma pode ser então adicionado a uma concentração final de 20% (v/v) e as células incubadas a 37°C por 20-30 min. todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução de PI em um tubo FACS. A mistura pode ser então analisada imediatamente por análise de citometria de fluxo utilizando FACSArray.

Em um ensaio alternativo, a indução de CDC pode ser determinada em células aderentes. Em uma modalidade desse ensaio, células são semeadas 24 h antes do ensaio com uma densidade de 3 x l04/cavidade nas placas de microtitulo de fundo plano de cultura de tecido. No dia seguinte o meio de crescimento é removido e as células são incubadas em triplicatas com anticorpos. As células de controle são incubadas com meio de crescimento ou meio de crescimento contendo 0,2% de saponina para a determinação de lise de background e lise máximo, respectivamente. Após incubação por 20 min. em temperatura ambiente sobrenadante é removido e plasma humano a 20% (v/v) ou soro em DMEM (pré-aquecido a 37°C) é adicionado às células e incubado por outros 20 min. a 37°C. Todas as células de cada amostra são adicionadas a solução de iodeto de propídio (10 μg/ml) . Então, sobrenadantes são substituídos por PBS contendo 2,5 μg/ml de brometo de etídio e emissão de fluorescência após excitação a 520 nm é medida a 600 nm utilizando um Tecan Safire. A percentagem de lise específica é calculada como a seguir: % de lise específica = (amostra de fluorescência -background de fluorescência)/ (lise máxima de fluorescência - background de fluorescência) x 100.

Inibição de proliferação de célula por anticorpos monoclonais

Para testar a capacidade de iniciar apoptose, anticorpos anti-GT468 monoclonais pode, por exemplo, ser incubadas com células de tumor positivo GT468 ou células de tumor transfectadas com GT468 a 37°C por aproximadamente 20 horas. As células podem ser colhidas, lavadas em tampão de ligação de Annexin-V (BD biosciences), e incubadas com Annexin V conjµado com FITC ou APC (BD biosciences) por 15 min. no escuro. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução PI (10 μg/ml em PBS) em um tubo FACS e avaliadas imediatamente por citometria de fluxo (como acima). Alternativamente, uma inibição geral de proliferação de célula por anticorpos monoclonais pode ser detectada com kits comercialmente disponíveis. O kit de proliferação de célula DELFIA (Perkin-Elmer, no. Do cat. AD0200) é um imunoensaio não isotópico com base na medição de incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante síntese de DNA de células de proliferação em microplacas. BrdU incorporado é detectado utilizando anticorpo monoclonal rotulado com európio. Para permitir detecção de anticorpo, as células são fixas e DNA desnaturado utilizando solução Fix. Anticorpo não ligado é retirado por lavagem e indutor DELFIA é adicionado para dissociar ions de európio a partir do anticorpo rotulado em solução, onde formam quelatos altamente fluorescentes com componentes do indutor DELFIA. A fluorometria resolvida em tempo utilizando fluorescência medida na detecção - é proporcional à sintese de DNA na célula de cada cavidade.

Estudos pré-clínicos.

Anticorpos monoclonais que se ligam a GT468 também podem ser testados em um modelo in vivo (por exemplo, em camundongos deficientes imunes com tumores xenoenxertados inoculados com linhagens de célula expressando GT468, possivelmente após transfecção) para determinar sua eficácia em controlar o crescimento de células de tumor que expressam GT468.

Estudos in vivo após xenoenxertar células de tumor que expressam GT468 em camundongos imunocomprometidos ou outros animais podem ser realizados utilizando anticorpos da invenção. Anticorpos podem ser administrados em camundongos sem tumor seguido por injeção de células de tumor para medir os efeitos dos anticorpos para evitar a formação de tumores ou sintomas relacionados a tumor. Os anticorpos podem ser administrados em camundongos com tumor para determinar a eficácia terapêutica de anticorpos respectivos para reduzir crescimento de tumor, metástase ou sintomas relacionados a tumor. A aplicação de anticorpo pode ser combinada com aplicação de outras substâncias como drogas cistostáticas, inibidores de fator de crescimento, bloqueadores de ciclo de célula, inibidores de angiogênese ou outros anticorpos para determinar eficácia sinérgica e toxicidade potencial de combinações. Para analisar os efeitos colaterais tóxicos mediados por anticorpos da invenção animais podem ser inoculados com anticorpos ou reagentes de controle e rigorosamente investigados em relação a sintomas possivelmente relacionados a terapia de anticorpo de GT468. Efeitos colaterais possíveis de aplicação in vivo de anticorpos GT468 incluem particularmente toxicidade em tecidos que expressam GT468 incluindo placenta. Anticorpos que reconhecem GT468 em ser humano e em outras espécies, por exemplo, camundongos, são particularmente úteis para prever efeitos colaterais em potencial mediados por aplicação de anticorpos GT468 monoclonais em seres humanos.

Mapeamento de epitopo

Mapeamento de epitopos reconhecidos por anticorpos da invenção pode ser realizado como descrito em detalhe em "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) de Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 e em „Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 de Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

I. Moléculas biespecificas/multiespecificas que se ligam a GT468

Ainda em outra modalidade da invenção, anticorpos para GT468 podem ser derivatizados ou ligados a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um fragmento Fab') para gerar uma molécula biespecífica ou multiespecífica que se liga a múltiplos sítios de ligação ou epitopos alvo. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, como outro anticorpo, peptídeo ou mimética de ligação.

Por conseguinte, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para GT468 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epitopo alvo. Em uma modalidade especifica da invenção, o segundo epitopo alvo é um receptor Fc, por exemplo, Fc-gamaRI humano (CD64) ou um receptor alfa-Fc humano (CD89) ou um receptor de célula T, por exemplo, CD3. Portanto, a invenção inclui moléculas biespecificas e multiespecificas capazes de ligar-se tanto a células efetoras que expressam Fc-gamaR, Fc-alfaR ou Fc-epsilonR (por exemplo, monócitos, células polimorfonucleares macrofagesor (PMNs)), e a células alvo que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula. Essas moléculas biespecificas e multiespecificas podem alvejar células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula para células efetoras e pode acionar atividades de célula efetora medidas por receptor Fc, como fagocitose de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citosina, ou geração de ânion superóxido.

Moléculas biespecificas e multiespecificas da invenção podem incluir ainda uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-GT468. Em uma modalidade, a terceira especificidade de ligação é uma porção de fator anti-intensificação (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida em atividade citotóxica e desse modo aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porção de fator anti-intensificação" pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligando que se liga a uma molécula dada, por exemplo, um antígeno ou um receptor, e desse modo resulta em uma intensificação do efeito dos determinantes de ligação para o receptor Fc ou antígeno de célula alvo. A "porção de fator anti-intensificação" pode ligar um receptor Fc ou um antígeno de célula alvo. Alternativamente, a porção de fator anti-intensificação pode se ligar a uma entidade que é diferente da entidade à qual as primeira e segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção de fator anti-intensificação pode ligar uma célula T citotóxica (Por exemplo, através de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imune que resulta em uma resposta imune aumentada contra a célula alvo).

Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou uma cadeia única Fv. O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento miniomo do mesmo como um Fv ou uma construção de cadeia única como descrito em Ladner e outros, US 4.946.778. o anticorpo também pode ser uma proteína de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação como revelado em US2003/0118592 e US2003/0133939.

Em uma modalidade moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção compreendem uma especificidade de ligação para um Fc-gamaR ou um Fc-alfaR represente na superfície de uma célula efetora, e uma segunda especificidade de ligação para um antígeno de célula alvo, por exemplo, GT468.

Em uma modalidade, a especificidade de ligação para um receptor Fc é fornecida por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não é bloqueada por imunoglobulina humana G (IgG). Como utilizado aqui o termo "receptor IgG" se refere a qualquer um dos oitos genes de cadeia gama localizados no cromossomo 1. Esses genes codificam um total de doze isoformas de receptor solúvel ou trasmembrana que são agrupados em três classes de receptor gama-Fc: Fc-gamaRI (CD64), Fc-gamaRII (CD32), e Fc-gamaRIII (CD16). Em uma modalidade preferida, o receptor Fc-gama é um Fc-gamaRI de alta afinidade humana.

A produção e caracterização desses anticorpos monoclonais preferidos são descritas por Fanger e outros em WO 88/00052 e em US 4.954.617. Esses anticorpos se ligam a um epitopo de Fc-gamaRI, Fc-gamaRII ou Fc-gamaRIII em um sitio que é distinto do sitio de ligação Fcy do receptor e, desse modo, sua ligação não é bloqueada substancialmente por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-Fc-gamaRI específicos úteis na presente invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. Em outras modalidades, o anticorpo receptor anti-Fcy é uma forma humanizada de anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 é descrita em Graziano, R. F. e outros (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 e WO 94/10332. A linhagem de célula de produção de anticorpo H22 foi depositada no American Type Culture Collection em 4 de novembro de 1992 sob a designação HA022CL1 e tem o número de acessão No. CRL 11177.

Ainda em outras modalidades preferidas, a especificidade de ligação para um receptor Fc é fornecida por um anticorpo que se liga a um receptor IgA humano, por exemplo um receptor Fc-alfa (Fc-alfaRI (CD89)), cuja ligação é preferivelmente não bloqueada por imunoglobulina humana A (IgA). O termo "receptor de IgA" pretende incluir o produto de gene de um alfa-gene (Fc-alfaRI) localizado no cromossomo 19. Esse gene é conhecido como codificando várias isoformas de transmembrana alternativamente unidas de 55 a 110 kDa. Fc-alfaRI (CD89) é constitutivamente expresso em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofilicos e neutrofilicos, porém não em populações de células não efetoras. Fc-alfaRI tem afinidade média tanto para IgA1 como IgA2, que é aumentada mediante exposição à citosinas como (Morton, H. C. e outros (1996) Criticai Reviews in Immunology 16: 423-440). Quatro anticorpos monoclonais específicas de Fc-alfaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que ligam Fc-alfaRI fora do domínio de ligação de ligando de IgA, foram descritas (Monteiro, R. C. e outros. (1992) J.Immunol. 148: 1764).

Fc-alfaRI e Fc-gamaRI são receptores de acionamento preferidos para uso na invenção porque (1) são expressos principalmente em células efetoras imunes, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) são expressos em níveis elevados (por exemplo, 5.000 - 100.000 por célula); (3) são mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocitose); (4) mediam apresentação de antígeno intensificada de antigenos, incluindo auto-antígenos, direcionados para os mesmos.

Em outra modalidade a molécula biespecífica é compreendida de dois anticorpos monoclonais de acordo com a invenção que têm atividades funcionais complementares, como um anticorpo predominantemente trabalhando por induzir CDC e outro anticorpo predominantemente trabalhando por induzir apoptose.

Um "anticorpo especifico de célula efetora" como utilizado aqui se refere a um anticorpo ou fragmento de anticorpo funcional que liga o receptor Fc de células efetoras. Anticorpos preferidos para uso na presente invenção ligam o receptor Fc de células efetoras em um sitio que não é ligado por imunoglobulina endógena.

Como utilizado aqui, o termo "célula efetora" se refere a uma célula imune que é envolvida na fase efetora de uma resposta imune, ao contrário das fases cognitiva e de ativação de uma resposta imune. Células imunes exemplares incluem células de origem mielóide ou linfóide, por exemplo, linfócitos (por exemplo, células B e células T incluindo células T citoliticas (CTLs), células exterminadoras, células exterminadoras naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastócitos, e basófilos. algumas células efetoras expressam receptores Fc específicos e realizam funções imunes específicas. Em modalidades preferidas, uma célula efetora é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), por exemplo, um neutrófilo capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressam FcR são envolvidos em extermínio específico de células alvo e apresentar antígenos a outros componentes do sistema imune, ou ligação a células que apresentam antígenos. Em outras modalidades, uma célula efetora pode realizar fagocitose de um antígeno alvo, célula alvo, ou microorganismo. A expressão de um Fcr específico em uma célula efetora pode ser regulada por fatores humorais como citosinas. Por exemplo, verificou-se que a expressão de Fc-gamaRI é regulada ascendentemente por interferon gama (IFN-γ) . Essa expressão intensificada aumenta a atividade citotóxica de células contendo Fc-gamaRI contra alvos. Uma célula efetora pode realizar fagocitose ou lise de um antígeno alvo ou uma célula alvo.

Célula alvo" significará qualquer célula indesejável em um sujeito (por exemplo, um ser humano ou animal) que pode ser alvejado por um anticorpo da invenção. Em modalidades preferidas, a célula alvo é uma célula expressando ou superexpressando GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula. Células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associaçao de GT468 com sua superfície de célula tipicamente incluem células de tumor.

Moléculas biespecificas e multiespecíficas da presente invenção podem ser feitas utilizando técnicas químicas (vide, por exemplo, D. M. Kranz e outros (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5807), técnicas de "polidoma" (vide US 4.474.893, de Reading), ou técnicas de DNA recombinante.

Em particular, moléculas biespecificas e multiespecíficas da presente invenção podem ser preparadas por conjµar as especificidades de ligação constituintes, as especificidades de ligação anti-GT468 e anti-FcR, utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multiespecífica pode ser gerada separadamente e então conjµada entre si. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulação pode ser utilizada para conjµação covalente. Os exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetí1-tioacetato (SATA), 5,5' -ditiobis(2-ácido nitobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)cicloexano-l-carboxilato (sulf-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky e outros. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA e outros. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Outros métodos incluem aqueles descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78,118-132); Brennan e outros (Science (1985) 229: 81-83), e Glennie e outros. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Agentes de conjµação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis da Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação são anticorpos, as mesmas podem ser conjµadas através de ligação de salfidrila das regiões de articulação de extremidade C das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particularmente preferida, a região de articulação é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, preferivelmente um, antes da conjµaçâo.

Alternativamente, as duas especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Esse método é particularmente útil onde a molécula biespecífica e multiespecífica é um mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligando x proteína de fusão Fab. Uma molécula biespecífica e multiespecífica da invenção, por exemplo, uma molécula biespecífica pode ser uma molécula de cadeia única, como um anticorpo biespecífico de cadeia única, uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecificas e multiespecificas podem ser também moléculas de cadeia única ou podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Os métodos para preparar moléculas bi e multiespecificas são descritos por exemplo em US 5.260.203; US 5.455.030; US 4.881.175; US 5.132.405; US 5.091.513; US 5.476.786; US 5.013.653; US 5.258.498; e US 5.482.858.

A ligação das moléculas biespecificas e multiespecificas a seus alvos específicos pode ser confirmada por ensaio imunosorvente ligado por enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), análise FACS, um bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento), ou um ensaio de western blot. Cada desses ensaios detecta genericamente a presença de complexos de anticorpo-proteína de interesse específico por empregar um reagente rotulado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de anticorpo-Fcr podem ser detectados utilizando, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado por enzima que reconhece e especificamente se liga aos complexos de anticorpo-Fcr. Por exemplo, o anticorpo pode ser radioativamente rotulado e utilizado em um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Março de 1986) . O isótopo radioativo pode ser detectado por tal meio como o uso de um contador-y ou um contador de cintilação ou por auto-radiografia.

II. Imunoconjµados

Em outro aspecto, a presente invenção apresenta um anticorpo anti-GT468 conjµado com um agente ou fração terapêutica, como uma citotoxina, uma droga (por exemplo, um imunossupressor) ou um radioisótopo. Tais conjµados são mencionados aqui como "imunoconjµados". Imunoconjµados que incluem uma ou mais citotoxinas são mencionados como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial a, e em particular mata células. Os exemplos incluem taxol, citocalasin B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, colchicin, doxorubicina, daunorubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- desidrotestosterona, glicocorticóides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos.

Agentes terapêuticos apropriados para formar imunoconjµados da invenção incluem, porém não são limitados a, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6 tioguanina, citarabina, fludarabin, 5- fluorouracil decarbazina), agentes de alquilação (por exemplo, meclortamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC), e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). Em uma modalidade preferida, o agente terapêutico é um agente citotóxico ou um agente radiotóxico. Em outra modalidade, o agente terapêutico é um imunossupressor. Ainda em outra modalidade, o agente terapêutico é GM-CSF. Em uma modalidade preferida, o agente terapêutico é doxorubicina, cisplatina, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida ou ricina A.

Anticorpos da presente invenção também podem ser conjµados com um radioisótopo, por exemplo, iodo-131, ítrio-90 ou índio-111, para gerar radiofarmacêuticos citotóxicos para tratar um distúrbio relacionado com GT468, como um câncer. Os conjµados de anticorpo da invenção podem ser utilizados para modificar uma resposta biológica dada, e a fração de droga não deve ser interpretada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a fração de droga pode ser uma proteína ou polipeptídio que possui uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento ativo da mesma, como abrin, ricina A, pseudomonas exotoxina, ou toxina de difterina; uma proteína como fator de necrose de tumor ou interferon-y; ou modificadores de resposta biológica como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1", interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimular colônia de macrófago granulócito ("GM-CSF"), fator de estimular colônia de granulócito ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.

Técnicas para conjµar tal fração terapêutica com anticorpos são bem conhecidas, vide, por exemplo, Arnon e outros, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drµs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld e outros, (eds.), pág. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom e outros, "Antibodies For Drµ Delivery", em Controlled Drµ Delivery (2a Ed.), Robinson e outros. (eds.), pág. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera e outros, (eds.), pág. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin e outros, (eds.), pág. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe e outros, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjµates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

Em uma modalidade adicional, os anticorpos de acordo com a invenção são ligados a um quelador-ligador, por exemplo, tiuxetano, que permite que o anticorpo seja conjµado com um radioisótopo.

III. Composições farmacêuticas

Em outro aspecto a presente invenção provê uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos da presente invenção. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais como aquelas reveladas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Em uma modalidade, as composições incluem uma combinação de múltipoos anticorpos isolados (por exemplo, dois ou mais) da invenção que atuam por mecanismos diferentes, por exemplo, um anticorpo que predominantemente atua por induzir CDC em combinação com outro anticorpo que predominantemente atua por induzir apoptose.

Composições farmacêuticas da presente invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição da presente invenção com pelo menos um agente antiinflamatório ou pelo menos um agente imunossupressor. Em uma modalidade tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes antiinflamatórios, como uma droga esteroidal ou uma NSAID (droga antiinflamatória não esteroidal). Agentes preferidos incluem, por exemplo, aspirina e outros salicilatos, inibidores de Cox-2, como rofecoxib (Vioxx) e celecoxib (Celebrex), NSAIDs como ibuprofeno (Motrin, Advil), fenoprofeno (Nalfon), naproxeno (Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenaco (Voltaren), piroxicam (Feldene), cetoprofeno (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumetone (Relafen), etodolac (Lodine), oxaprozin (Daypro), e indometacina (Indocin).

Em outra modalidade, tais agentes terapêuticos incluem agentes que levam a esgotamento ou inativação funcional de células T reguladoras como ciclofosfamide de dose baixa, anticorpos anti-CTLA4, anticorpos anti-IL2 ou receptores anti-IL.

Ainda em outra modalidade, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais quimioterapêuticos, como derivados de Taxol, taxotere, gemcitabina, 5-Fluoruracil, doxorubicina (Adriamicina), cisplatina (Platinol), ciclofosfamida (Citoxano, Procytox, Neosar). Em outra modalidade, anticorpos da presente invenção podem ser administrados em combinação com agentes quimioterapêuticos, que mostram preferivelmente eficácia terapêutica em pacientes que sofrem de câncer de mama, pulmão, gástrico e/ou de ovário, ou outros tipos de câncer, por exemplo, como descrito aqui.

Ainda em outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com radioterapia e/ou célula tronco periférico autólogo ou transplante de medula óssea.

Ainda em outra modalidade, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos selecionados de anticorpos anti-CD25, anticorpos anti-EPCAM, anti-EGFR, anti-Her2/neu, e anticorpos anti-CD40.

Ainda em uma modalidade adicional, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com um anticorpo anti-C3b(i) para aumentar a ativação de complemento.

Como utilizado aqui, "veiculo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardar absorção e isotônicos, e similares que são fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente o veículo é apropriado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, por exemplo, anticorpo, molécula biespecífica e multiespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto a partir da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

Um "sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto de origem e não transmite nenhum efeito toxicológico indesejável (vide, por exemplo, Berge, S.M., e outros, (1977), J. Pharm. Scie. 66:1-19).

Os exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, hidroiódico, fosforoso e similar, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos como ácidos mono- e dicarboxilicos alifáticos, ácidos alcanóicos substituídos por fenila, ácidos alcanoicos hidroxi, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino terrosos, como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, como N,Ν'-dibenziletileno diamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanol amina, etilenodiamina, procaína e similar.

Uma composição da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na arte. Como será reconhecido pelo técnico especializado, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos, e sistemas de distribuição microencapsulada. Polímeros biocompatíveis biodegradáveis podem ser utilizados, como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicolico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação de tais formulações são genericamente conhecidos por aqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drp Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Mareel Dekker, Inc., Nova York, 1978.

Para administrar um composto da invenção por certas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para evitar sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um sujeito em um veiculo apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções salina e de tampão aquoso. Lipossomas incluem emulsões CGF de água em óleo em água bem como lipossomas convencionais (Strejan e outros (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na arte. Exceto até onde qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, o uso do mesmo nas composições farmacêuticas da invenção é considerado. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

Composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis de acordo com as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada apropriada para concentração elevada de droga. O veiculo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e Polietileno glicol liquido, e similar), e misturas apropriadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho exigido de partícula no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição, absorção prolongada das composições injetáveis pode ser ocasionada por incluir na composição um agente que retarda absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporar o composto ativo na quantidade exigida em um solvente apropriado com uma ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido por microfiltração de esterilização.

Genericamente, as dispersões são preparadas por incorporar o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem a vácuo e liofilização que fornece um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução anteriormente filtrada estéril do mesmo.

Regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica) . Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas com o passar do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem como utilizada aqui se refere a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação ao veiculo farmacêutico exigido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção é determinada por e diretamente dependente de (a) as características exclusivas do composto ativo e o efeito terapêutico específico a ser obtido, e (b) as limitações inerentes na técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Os exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, como ácido ascórbico, cloridreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similar; (2) antioxidantes solúveis em óleo, como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol e similar; e (3) agentes de quelação de metal, como ácido cítrico, ácido tetracético etilenodiamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similar.

Para as composições terapêuticas, formulações da presente invenção incluem aquelas apropriadas para administração oral,nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos conhecidos na arte de farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado com um material de veículo para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do sujeito sendo tratado, e do modo de administração especifico. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material de veículo para produzir uma forma de dosagem única será genericamente aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico.

Genericamente, de cem por cento, essa quantidade variará de aproximadamente 0,01 por cento a aproximadamente noventa e nove por cento de ingrediente ativo, preferivelmente de aproximadamente 0,1 por cento a aproximadamente 70 por cento, mais preferivelmente de aproximadamente 1 por cento a aproximadamente 30 por cento.

As formulações da presente invenção que são apropriadas para administração vaginal também incluem pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações de pulverização contendo tais veículos como são conhecidos na técnica como sendo apropriados. Formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de composições da presente invenção incluem pós, pulverizações, ungüentos, pastas, cremes, loções, géis, soluções, adesivos e inalantes. O composto ativo pode ser misturado sob condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável e com quaisquer preservativos, tampões ou propelentes que podem ser exigidos.

As frases "administração parenteral" e "administrado parenteralmente" como utilizado aqui significam modos de administração diferentes de administração enteral e tópica, normalmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intarcapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinal, epidural e intraesternal.

Os exemplos de veículos aquosos e não aquosos apropriados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, poliois (como glicerol, propileno glicol, Polietileno glicol, e similar) e misturas apropriadas dos mesmos, óleos vegetais, como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila. Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos.

Essas composições podem conter também adjuvantes como preservativos, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, paraben, clorobutanol, ácido sórbico fenol, e similar. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, como açúcares, cloreto de sódio e similar nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser ocasionada pela inclusão de agentes que retardam absorção como monoestearato de alumínio e gelatina.

Em uma modalidade os anticorpos monoclonais da invenção são administrados em forma cristalina por injeção subcutânea, cf. Yang e outros (2003) PNAS, 100 (12): 69346939. Quando os compostos da presente invenção são administrados como produtos farmacêuticos, em humanos e animais, podem ser dados individualmente ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,01 a 99,5% (mais preferivelmente, 0,1 a 90%) de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Independente da via de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser utilizados em uma forma hidratada apropriada, e/ou composições farmacêuticas da presente invenção, são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica.

Níveis de dosagem efetivos dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente especifico, composição, e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições específicas da presente invenção empregadas, via de administração, tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico sendo empregado, duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições específicas empregadas, idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos no estado da técnica médica.

Um médico ou veterinário versado no assunto pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica exigida. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia iniciar doses dos compostos da invenção empregados na composição farmacêutica em níveis inferiores àquele exigido para obter o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem até que o efeito desejado seja obtido. Em geral, uma dose diária apropriada de uma composição da invenção será aquela quantidade do composto que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz dependerá genericamente dos fatores descritos acima. Prefere-se que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea, preferivelmente administrada próxima ao sitio do alvo. Se desejado, a dose diária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente em intervalos apropriados durante todo o dia, opcionalmente, em formas de dosagem unitária. Embora seja possível para um composto da presente invenção ser administrado individualmente, é preferível administrar o composto como uma formulação farmacêutica (composição).

Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ser administrados por infusão, preferivelmente infusão contínua lenta durante um longo período, como mais de 24 horas, para reduzir efeitos colaterais tóxicos. A administração também pode ser executada por infusão contínua durante um período de 2 a 24 horas, como de 2 a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes conforme necessário, por exemplo, após meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ajustada por medir a quantidade de anticorpos anti-GT468 monoclonais em circulação mediante administração em uma amostra biológica utilizando anticorpos antiidiotípicos que alvejam os anticorpos anti-GT468.

Ainda em outra modalidade, os anticorpos são administrados por terapia de manutenção, como, por exemplo, uma vez por semana por um período de 6 ou mais meses.

Ainda em outra modalidade, os anticorpos de acordo com a invenção podem ser administrados por um regime que inclui uma infusão de um anticorpo contra GT468 seguido por uma infusão de um anticorpo contra GT468 conjµado com um radioisótopo. O regime pode ser repetido, por exemplo, 7 a 9 dias após.

Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, como os dispositivos revelados nos documentos norte-americanos US 5,399,163; US 5,383,851; US 5,312,335; US 5,064,413; US 4,941,880; US 4,790,824; ou US 4,596,556. Os exemplos de implantes bem conhecidos e módulos úteis na presente invenção incluem aqueles descritos em US 4,487,603, que revela uma bomba de micro-infusão implantável para dispensar medicação em uma taxa controlada; US 4,486,194, que revela um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; US 4,447,233, que revela uma bomba de infusão de medicação para distribuir medicação em uma taxa de infusão precisa; US 4,447,224, que revela um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para distribuição de droga continua; US 4,439,196, que revela um sistema de distribuição de droga osmótica tendo compartimentos de múltiplas câmaras; e US 4,475,196, que revela um sistema de distribuição de droga osmótica.

Muitos outros desses implantes, sistemas de distribuição e módulos são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção podem ser formulados para assegurar distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira de sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofilicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção cruzem a BBB (se desejado), os mesmos podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricar lipossomas, vide, por exemplo, US 4,522,811; US 5,374,548; e US 5,399,331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais frações que são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, e desse modo aumentam a distribuição de droga alvejada (vide, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J.Clin. Pharmacol. 29: 685). Frações de alvejar exemplares incluem float ou biotina (vide, por exemplo, US 5.416.016 de Low e outros); manosides (Umezawa e outros (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (P.G. Bloeman e outros (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais e outros (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); e receptor de proteína de tensoativo A (Briscoe e outros (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134).

Em uma modalidade da invenção, os compostos terapêuticos da presente invenção são formuladas em lipossomas. Em uma modalidade mais preferida, os lipossomas incluem uma fração de alvejar. Em uma modalidade mais preferida, os compostos terapêuticos nos lipossomas são distribuídos por injeção de bolo a um sítio próximo à área desejada, por exemplo, o sítio de um tumor. A composição deve ser fluida até o ponto em que existe capacidade de colocação fácil em seringa. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenagem e deve ser preservada contra a ação de contaminação de microorganismos como bactérias e fungos.

Em uma modalidade adicional, anticorpos da presente invenção podem ser formulados para evitar ou reduzir seu transporte através da placenta. Isso pode ser feito por métodos conhecidos na arte, por exemplo, por PEGuilação dos anticorpos ou pelo uso de fragmentos F(ab)2'. Referências adicionais podem ser feitas a "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjµates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; e a "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz para terapia de tumor pode ser medida por respostas de tumor objetivas que podem ser completas ou parciais. Uma resposta completa (CR) é definida como não clinica, radiológica ou outra evidência de doença. Uma resposta parcial (PR) resulta de uma redução em tamanho de tumor agregado maior do que 50%. Tempo mediano até progressão é uma medida que caracteriza a durabilidade da resposta de tumor objetivo.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" para terapia de tumor também pode ser medida por sua capacidade de estabilizar o avanço da doença. A capacidade de um composto inibir câncer pode ser avaliada em um sistema de modelo de animal preditivo de eficácia em tumores humanos. alternativamente, essa propriedade de uma composição pode ser avaliada por examinar a capacidade do composto em inibir crescimento de célula ou apoptose por ensaios in vitro conhecidos por um técnico versado no assunto. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outro modo melhorar os sintomas em um sujeito. Um técnico versado no assunto é capaz de determinar tais quantidades com base em tais fatores como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição especifica ou via de administração selecionada.

A composição deve ser estéril e fluido até o ponto em que a composição seja distribuivel por seringa. Além de água, o veiculo pode ser uma solução salina tamponada isotônica, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e Polietileno glicol líquido e similar), e misturas apropriadas dos mesmos. Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento com lecitina, por manutenção de tamanho exigido de partícula no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. Absorção de longo prazo das composições injetáveis pode ser ocasionada por incluir na composição um agente que retarda absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.

Quando o composto ativo é adequadamente protegido, como descrito acima, o composto pode ser administrado por via oral, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável.

IV. Usos e Métodos da Invenção

Os anticorpos (incluindo imunoconjµados, biespecificos/multiespecíficos, composições e outros derivados descritos aqui) da presente invenção têm inúmeras utilidades terapêuticas envolvendo o tratamento de distúrbios envolvendo células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula. Por exemplo, os anticorpos podem ser administrados em células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo, ou em sujeitos humanos, por exemplo, in vivo, para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios como aqueles descritos aqui. Como utilizado aqui, o termo "sujeito" pretende incluir animais humanos e não humanos que respondem aos anticorpos contra GT468. Sujeitos preferidos incluem pacientes humanos tendo distúrbios que podem ser corrigidos ou melhorados por matar células doentes, em particular células caracterizadas por um padrão de expressão alterado de GT468 e/ou um padrão de associação alterado de GT468 com sua superfície de célula comparada com células normais.

Por exemplo, em uma modalidade, anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para tratar um sujeito com um distúrbio tumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizado pela presença de células de tumor que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula incluindo, por exemplo, câncer de mama. Os exemplos de doenças tumorigênicas que podem ser tratadas e/ou evitadas abrangem todos os cânceres que expressam GT468 e entidades de tumor incluindo câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer hepatocelular, câncer de colón, câncer pancreático, câncer esofágico, câncer de cabeça & pescoço, câncer de rim, em particular carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer de fígado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placental, câncer cervical, e câncer de tiróide, e as formas metastáticas dos mesmos. Esses cânceres podem estar em estágios inicial, intermediário ou avançado, por exemplo, metástase. Em uma modalidade, a doença de câncer é câncer metastático no pulmão.

As composições farmacêuticas e métodos de tratamento descritos de acordo com a invenção também podem ser utilizados para imunização ou vacinação para evitar uma doença descrita aqui.

Em outra modalidade, anticorpos da invenção podem ser utilizados para detectar níveis de GT468 ou formas específicas de GT468, ou níveis de células que contêm GT468 em sua superfície de membrana, cujos níveis podem ser então ligados a certas doenças ou sintomas de doença como descrito acima. Alternativamente, os anticorpos podem ser utilizados para esgotar ou interagir com a função de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula, desse modo indicando essas células como importantes mediadores da doença. Isso pode ser obtido por contatar uma amostra e uma amostra de controle com o anticorpo anti-GT468 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e GT468. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e GT468 são detectados e comparados na amostra e uma amostra de controle, isto é, uma amostra de referência.

Anticorpos da presente invenção podem ser inicialmente testados em sua atividade de ligação associada a usos terapêuticos ou diagnósticos in vitro. Por exemplo, os anticorpos podem ser testados utilizando ensaios citométricos de fluxo como descrito aqui.

Além disso, a atividade dos anticorpos em desencadear pelo menos uma atividade de célula efetora mediada por efetor, incluindo inibir o crescimento de e/ou matar células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula, pode ser ensaiadas. Por exemplo, a capacidade dos anticorpos em desencadear CDC e/ou apoptose pode ser ensaiada. Protocolos para ensaiar para CDC, adesão homotipica, clustering molecular ou apoptose são descritos aqui.

Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para eliciar in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes atividades biológicas: inibir o crescimento de e/ou diferenciação de uma célula expressando GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula; matar uma célula que expressa GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula; mediar fagocitose ou ADCC de uma célula expressando GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula na presença de células efetoras; mediar CDC de uma célula expressando GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula na presença de complemento; mediar apoptose de uma célula expressando GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula; induzir adesão homotípica; e/ou induzir translocação em rafts de lipídeo mediante ligação de GT468.

Em uma modalidade específica, os anticorpos são utilizados in vivo ou in vitro para tratar, evitar ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas a GT468. Os exemplos de doenças relacionadas a GT468 incluem, entre outras, cânceres como câncer de mama, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer hepatocelular, câncer de colón, câncer pancreático, câncer esofágico, câncer de cabeça & pescoço, câncer de rim, em particular carcinoma de célula renal, câncer de próstata, câncer de figado, melanoma, sarcoma, mieloma, neuroblastoma, coriocarcinoma placental, câncer cervical, e câncer de tiróide, e as formas metastáticas dos mesmos. Em uma modalidade, a doença de câncer é câncer metastático no pulmão.

Vias apropriadas de administração das composições de anticorpo da invenção in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas por aqueles com conhecimentos comuns.

Como descrito acima, anticorpos anti-GT468 da invenção podem ser co-administrados com um ou outro mais agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico, agente antiangiogeneico ou um agente imunossupressor para reduzir a indução de respostas imunes contra os anticorpos da invenção. O anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. No caso mencionado por último (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou simultaneamente com o agente ou pode ser co-administrado com as outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anti-câncer, por exemplo, radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes anti-neoplásicos como listado acima. A co-administração dos anticorpos anti-GT468 da presente invenção com agentes quimioterapêuticos fornecem dois agentes anti-câncer que operam através de mecanismos diferentes fornecendo um efeito citotóxico a células de tumor. Tal co-administração pode resolver problemas devido a desenvolvimento de resistência a drogas ou uma alteração na antigenicidade das células de tumor que tornaria as mesmas não reativas com o anticorpo.

Em outra modalidade especifica da invenção, o sujeito sendo administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um agente antiagiônico incluindo anticorpos alvejando VEGF ou VEGFR e um ou mais compostos quimicos que inibem angiogênese. O pré-tratamento com ou aplicação paralela dessas drogas pode melhorar a penetração de anticorpos em tumores de volume.

Em outra modalidade específica da presente invenção, o sujeito sendo administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um composto que inibe sinalização de receptor de fator de crescimento anticorpos monoclonais que se ligam ao receptor EGFR bem como compostos químicos que inibem a sinalização iniciada pelo EGFR, Her1 ou receptor Her2/neu.

Células efetoras alvo-específicas, por exemplo, células efetoras ligadas a composições (por exemplo, anticorpos, moléculas multiespecificas e biespecíficas) da invenção também podem ser utilizadas como agentes terapêuticos. Células efetoras para alvejar podem ser leucócitos humanos como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células exterminadoras naturais e outras células contendo receptor IgA ou IgG. Se desejado, células efetoras podem ser obtidas do sujeito a ser tratado. As células efetoras especificas de alvo podem ser administradas como uma suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável. O número de células administradas pode estar na ordem de 108 a 109 porém variará dependendo da finalidade terapêutica. Em geral, a quantidade será suficiente para obter localização na célula alvo, por exemplo, uma célula de tumor que expressa GT468 e/ou sendo caracterizada por associação de GT468 com sua superfície de célula, e efetuar extermínio de célula, por exemplo, por fagocitose. As vias de administração também podem variar.

A terapia com células efetoras específicas de alvo pode ser executada em combinação com outras técnicas para remoção de células alvejadas. Por exemplo, terapia anti-tumor utilizando as composições da invenção e/ou células efetoras armadas com essas composições pode ser utilizada em combinação como quimioterapia. Adicionalmente, a imunoterapia de combinação pode ser utilizada para orientar duas populações efetoras citotóxicas distintas em direção à rejeição de célula de tumor. Por exemplo, anticorpos anti-GT468 ligados a anti-Fc-RI ou anti-CD3 podem ser utilizados em combinação com agentes de ligação específicos de receptor IgA ou IgG.

Moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção também podem ser utilizadas para modular níveis Fc-gamaR ou Fc-alfaR em células efetoras, como por capeamento e eliminando receptores na superfície da célula. Misturas de receptores anti-Fc também podem ser utilizados para essa finalidade.

As composições (por exemplo, anticorpos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjµados) da invenção que têm sítios de ligação de complemento, como porções de IgG1, -2, ou -3 ou IgM que ligam complemento, também podem ser utilizadas na presença de complemento. Em uma modalidade, tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo células alvo com um agente de ligação da invenção e células efetoras apropriadas pode ser suplementado pela adição de complemento ou complemento contendo soro. Fagocitose de células alvo revestidas com um agente de ligação da invenção pode ser aperfeiçoada por ligação de proteínas de complemento. Em outra modalidade células alvo revestidas com as composições da invenção também podem ser lisadas por complemento. Ainda em outra modalidade, as composições da invenção não ativam complemento.

As composições da presente invenção também podem ser administradas juntamente com complemento. Por conseguinte, compreendidas no escopo da invenção estão composições compreendendo anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e soro ou complemento. Essas composições são vantajosas em que o complemento é localizado em proximidade estreita aos anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas.

Alternativamente, os anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas da invenção e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente. A ligação das composições da presente invenção com células alvo pode causar translocação do complexo de anticorpo-antígeno GT468 em rafts de lipídeo da membrana de célula. Tal translocação cria uma alta densidade de complexos de anticorpo-antígeno que pode ativar eficientemente e/ou aumentar CDC.

São também compreendidos no escopo da presente invenção kits que compreendem as composições de anticorpo da invenção (por exemplo, anticorpos e imunoconjµados) e instruções para uso. O kit pode conter ainda um ou mais reagentes adicionais, como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou uma gente radiotóxico, ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo tendo uma atividade complementar).

Por conseguinte, pacientes tratados com composições de anticorpo da presente invenção podem ser adicionalmente administrados (antes de, simultaneamente com, ou após administração de um anticorpo da invenção) com outro agente terapêutico, como um agente citotóxico ou radiotóxico, que intensifica ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos da invenção.

Em outras modalidades, o sujeito pode ser adicionalmente tratado com um agente que modula, por exemplo, intensifica ou inibe, a expressão ou atividade de receptores Fc-gama ou Fc-alfa, por exemplo, por tratar o sujeito com uma citosina. citosinas preferidas incluem fator de estimular colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimular colônia de macrófago-granulócito (GM-CSF), interferon-y (IFN-y), e fator de necrose de tumor (TNF). Outros agentes importantes para aumentar a eficácia terapêutica dos anticorpos e composições farmacêuticas descritas aqui são β-glucanos que são homopolissacarideos de resíduos de glicose ramificada e são produzidos por uma variedade de plantas e microorganismos, por exemplo, bactérias, algas, fungos, levedura e grãos. Fragmentos de β-glucanos produzidos por organismos também podem ser utilizados. Preferivelmente, o β-glucano é um polímero de β (1,3) glicose em que pelo menos algumas das unidades de glicose de espinha dorsal, por exemplo, 3-6% das unidades de glicose de espinha dorsal, possui ramificações como ramificações β(1,6).

Em uma modalidade específica, a presente invenção provê métodos para detectar a presença de antígeno GT468 em uma amostra, ou medir a quantidade de antígeno GT468, compreendendo contatar a amostra e uma amostra de controle, com um anticorpo que se liga especificamente a GT468, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e GT468. A formação de um complexo é então detectada, em que uma formação complexa de diferença entre a amostra comparada com a amostra de controle é indicativa para a presença de antígeno GT468 na amostra.

Ainda outra modalidade, a presente invenção provê um método para detectar a presença ou quantificar a quantidade de células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula in vivo ou in vitro. O método compreende (i) administrar a um sujeito uma composição da invenção conjµada com um marcador detectável; e (ii) expor o sujeito a um meio para detectar o marcador detectável para identificar áreas contendo células que expressam GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT648 com sua superfície de célula.

Os métodos como descrito acima são úteis, em particular, para diagnóstico de doenças relacionadas a GT468 e/ou a localização de doenças relacionadas a GT468 como doenças de câncer. Preferivelmente uma quantidade de GT468 em uma amostra que é mais elevada do que a quantidade de GT468 em uma amostra de controle é indicativa para a presença de uma doença relacionada a GT468 em um sujeito, em particular um ser humano, a partir do qual a amostra é derivada.

Quando utilizado em métodos como descrito acima, um anticorpo descrito aqui pode ser dotado de um rótulo que funciona para: (i) fornecer um sinal detectável; (ii) interagir com um segundo rótulo para modificar o sinal detectável fornecido pelo primeiro ou segundo rótulo, por exemplo, FRET (Transferência de energia de ressonância de fluorescência); (iii) afetar mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforética, por carga, hidrofobicidade, formato ou outros parâmetros físicos, ou (iv) fornecer uma fração de captura, por exemplo, afinidade, anticorpo/antígeno ou complexação iônica. São adequados como rótulos estruturas, como rótulos fluorescentes, rótulos luminescentes, rótulos de cromóforo, rótulos radioisotópicos, rótulos isotópicos, preferivelmente rótulos isotópicos estáveis, rótulos isobáricos, rótulos de enzima, rótulos de partícula, em particular rótulos de partícula de metal, rótulos de partícula magnética, rótulos de partícula de polímero, moléculas orgânicas pequenas como biotina, ligandos de receptores ou moléculas de ligação como proteínas de adesão de célula ou lectinas, seqüências de rótulo compreendendo ácidos nucléicos e/ou resíduos de aminoácido que podem ser detectados pelo uso de agentes de ligação, etc. rótulos compreendem, em um modo não limitador, sulfato de bário, ácido iocetâmico, acido iopanoico, ipodato de cálcio, diatrizoato de sódio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sódio e diagnóstico de rádio, incluindo emissores de positron como flúor-18 e carbono-11, emissores de gama como iodo-123, technetio-99m, iodo-131 e índio-111, nuclides para ressonância magnética nuclear, como flúor e gadolínio.

Ainda em outra modalidade imunoconjµados da invenção podem ser utilizados para alvejar compostos (por exemplo, agentes terapêuticos, rótulos, citotoxinas, imunossupressores radiotoxinas, etc.) em células que têm GT468 associado a sua superfície por ligar tais compostos ao anticorpo. Desse modo, a invenção também provê métodos para localizar células ex vivo ou in vitro expressando GT468 e/ou sendo caracterizadas por associação de GT468 com sua superfície de célula, como células de tumor em circulação.

A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Materiais e Métodos

As técnicas e métodos mencionados aqui são realizadas em um modo conhecido por si e como descrito, por exemplo, em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, ou como descrito abaixo. Todos os métodos incluindo o uso de kits e reagentes são realizados de acordo com as informações dos fabricantes.

Tecidos e linhagens celulares

O trabalho de DNA recombinante foi feito com a permissão oficial e de acordo com as regras do governo estadual de Rheinland-Pfalz. Os tecidos foram obtidos como materiais de excesso humano durante procedimentos terapêutico ou de diagnóstico de rotina e foram armazenados a -80°C até o uso. As linhagens de célula de câncer de mama MCF-7 e BT549 foram cultivadas em DMEM/10% FCS.

Isolamento de RNA, RT-PCR e RT-PCR em tempo real

Extração de RNA, síntese de DNA de primeira fita, RT-PCR e RT-PCR em tempo real foram realizados como anteriormente descrito (Koslowski, M., Sahin, U., Huber, C. & Tureci, O. (2006) 20 Hum. Mol. Genet. 15, 2392-2399). Para análise de ponto final oligonucleotídeos específicos de GT468 (sentido 5'-AAA TTT GGC AGC TGC CTT CAC-3'; anti-sentido 5'-TGA TGC CAC ATT CAG TAA CAC-3', 60°C anelamento) foram utilizados em um RT-PCR de 35 ciclos. A análise de expressão quantitativa em tempo real foi realizada em triplicata em um RT-PCR de 40 ciclos. Após normalização em HPRT (sentido 5'-TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA-3' ; anti-sentido 5'-GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT-3', 62°C anelamento) transcritos de GT468 em amostras de tumor foram quantificadas em relação a tecidos normais utilizando cálculo AACT. A especificidade de reações de PCR foi confirmada por clonagem e seqüenciamento de produtos de amplificação a partir de amostras arbitrariamente selecionadas.

Bioinformática

Para clonagem in silico de moléculas especificas de trofoblasto uma estratégia de exploração de dados descrita em detalhe em outro lµar foi modificada e adaptada (Koslowski, M., Bell, C, Seitz, G. , Lehr, H. A., Roemer, K. , Muntefering, H., Huber, C, Sahin, U. & Tureci, O. (2004) Cancer Res. 64, 5988-5993; Koslowski, M. , Tureci, O., Bell, C, Krause, P., Lehr, H. A., Brunner, J., Seitz, G. , Nestle, F. O., Huber, C. & Sahin, U. (2002) Cancer Res. 62, 6750-6755; Koslowski, M., Sahin, U., Huber, C. & Tureci, O. (2006) Hum. Mol. Genet. 15, 2392-2399). Resumidamente, a busca de palavra chave hierárquica de GenBank foi combinada com subtração de biblioteca de cDNA digital.

Para seqüência de nucleotideo de busca de palavra-chave arquivos no GenBank foram acessados para genes anotados como sendo especificamente expressos em tecido de trofoblasto ou placenta utilizando o sistema de Busca e recuperação ENTREZ (HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez). O programa de busca-homologia de seqüência BLASTN (http://ncbi.nlm.nih.gov/blast) foi rodado seqüencialmente para cada seqüência de nucleotideo contra todas as seqüências de nucleotideos humanas para evitar redundâncias. Como um segundo filtro Northern eletrônico (eNorthern) foi realizado para todos os clones obtidos por busca de palavra-chave por busca BLAST de cada seqüência de DNA de interesse contra banco de dados EST em NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Foi levado em conta que várias bibliotecas de cDNA no domínio público não são adequadamente anotadas (Scheurle, D., DeYoung, M. P.,Binninger, D. M., Page, H., Jahanzeb, M. & Narayanan, R. (2000) Cancer Res. 60, 4037-4043).

Para subtração digital a ferramenta de xProfiler de cDNA do Projeto de anatomia de genoma de câncer em NCBI (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler) foi utilizado, que compara a expressão de gene entre dois pools (A e B) de bibliotecas de cDMA onde cada pool pode ser uma biblioteca única ou várias bibliotecas. As opções de busca para o Pool A e Pool B foram ajustadas em "Homo sapiens" para Organismo e "todas as bibliotecas EST" para Grupo de Biblioteca para buscar todas as bibliotecas de cDNA em dbEST. Todas as bibliotecas de cDNA preparadas a partir de tecido de trofoblasto e placenta que casam com os ajustes de opção de busca foram atribuídas ao Pool A excluindo bibliotecas de tecido misturado. Para o Pool B todas as bibliotecas de cDNA preparadas de tecidos normais exceto placenta, trofoblasto, testículo, ovário e feto de corpo inteiro foram selecionadas.

Para análise da região promotora de GT468) software EMBOSS CpGPlot (Rice, P., Longden, I. & Bleasby, A. (2000) Trends Genet. 16, 276-277 foi utilizado. Além disso, a análise da seqüência de protein de GT468 foi conduzida com MEMSAT3 (Jones, D. T., Taylor, W. R. & Thornton, J. M. (1994) Biochemistry 33, 3038-3049), TMpred (Hofmann, K. & Stoffel, W. (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374, 166), e GOR IV (Gamier, J. , Osguthorpe, D. J. & Robson, B. (1978) J. Mol. Biol. 120, 97-120).

Antisoros, imunofluorescência e imunoquímica

O antisoro policlonal criado contra aa 117-127 de GT468 foi gerado por um serviço de anticorpo sob encomenda (Squariz, Marl, Alemanha). A Imunoistoquimica foi realizada em criosseções de tecido utilizando o Kit de substrato NovaRED VECTO (Vector, Burlingame, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Para análise de Western blot 30 µg de proteína total extraida de células lisadas com Triton-X foi utilizado. Os extratos foram diluídos em tampão de amostra de redução (Roth, Karlsruhe, Alemanha), submetidos a SDS-PAGE e subseqüentemente eletrotransferidos sobre membrana PVDF (Pall, East Hills, NY). A imunocoloração foi realizada com anticorpos reativos para Pakt (Cell Signaling, Danvers, MA) , AKT (Cell Signaling, Danvers, MA) , ciclina D1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) e beta-Actina (Abeam, Cambridge, UK) seguido por detecção de anticorpo primário com anticorpos secundários anti-coelho de cabra e anti-camundongo de cabra conjµados com peroxidase da raiz forte (Dako, Glostrup, Dinamarca).

Duplex siRNA

O duplex siRNA GT468 (Qiagen, Hilden, Alemanha) (sentido 5'-r(CCA µA GAG UAG CCA GCA)dTdT-3', anti-sentido 5'-r(Uµ Cµ GCU ACU CUC Ap G)dAdG-3') alvejaram nucleotideos 670-690 da seqüência de mRNA GT468 (NM021796.3). como controle de Duplex siRNA misturado (sentido 5'-r(UAA Cp UAU AAU CGA CUA G)dTdT-5' anti-sentido 5'-r(CUA GUC GAU UAU AC A GUU A)dGdA-3') foi utilizado. Para estudos de silêncio GT468 células foram transfectadas com duplex siRNA 10 nM utilizando reagente de transfecção HiPerFect (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Todos os resultados foram reproduzidos com um segundo conjunto de duplex siRNA GT468 (sentido- 5'-r(GGU UCA GGA CAA AGU CCA A) dTdT-3', anti-sentido 5'-r(Uµ GAC UUU GUC Cp AAC C)dGdG-3') alvejando nucleotideos 342-362.

Análise de proliferação celular após transfecção de siRNA

24 h após transfecção com duplex siRNA 1x104 células foram cultivadas por 48 h em meio suplementado com 10% FCS. A proliferação foi analisada por medição da incorporação de BrdU em fitas de DNA recentemente sintetizadas utilizando o kit de proliferação de células DELFIA (Perkin Elmer, Boston, MA) de acordo com as instruções do fabricante em urn contador de multi-rótulos Wallac Victor2 (Perkin Elmer, Boston, MA).

Análise de ciclo de célula

Células foram cultivadas em meio suplementado com 10% FCS em concentrações variáveis. 72 h após transfecção com duplex siRNA as células foram colhidas, fixas com EtOH, e coloridas com iodeto de propidio antes da análise de teor de DNA citométrico de fluxo. As células nas fases diferentes do ciclo de célula foram quantificadas utilizando software de análise citométrico de fluxo CellQuest™ Pro (BD, Franklin Lakes, NJ) e FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Células apoptóticas foram quantificadas por coloração de Annexin V 48 h e 72 h após transfecção com siRNA.

Migração de células e ensaio de invasão in vitro

Os ensaios de migração de célula foram realizados em câmaras de transwell com 8.0 µm de membranas de poro (BD Biosciences, San Jose, CA) com células cultivadas em meio livre de soro por 12 h antes dos experimentos. Para experimentos de siRNA as células foram transferidas para condições sem soro 24 h após transfecção com duplex siRNA como descrito acima. 4xl04 células em 400 ul de meio de cultura sem soro foram adicionados à câmara superior. As câmaras inferiores continham 800 μl de meio de cultura suplementado com 5% FCS como quimioatraente. 24 h após as células que tinham migrado para o lado inferior da membrana foram fixadas em metanol gelado; as membranas foram excisadas, colocadas em lâminas de microscópio e montadas com Hoechst (Dako, Glostrup, Dinamarca) para microscopia de fluorescência. Células em cinco campos visuais aleatórios (100x de ampliação) foram contadas para cada membrana. Todos os experimentos foram feitos em triplicata. Os efeitos sobre quimiocinese de células foram analisados utilizando a mesma configuração experimental como quimioatraente adicionado à câmara tanto superior como inferior. Para ensaios de invasão in vitro as câmaras superiores foram preparadas com 100 μl de Matrigel (BD Bioscences, San Jose, NJ) diluídos a 1 mg/ml em meio isento de soro. As câmaras foram incubadas a 37°C por 5 h para gelificação.

Análise de proliferação celular após incubação com anticorpos

Linhagens de célula de câncer que expressam GT468 endogenamente BT549, Caov-3, EFO-21, MCF-7 e MDA-MB-231 foram incubadas com sobrenadante de hibridoma diluído 1:2 em meio de cultura de célula DMEM por 72 h. a proliferação foi analisada por medir a incorporação de BrdU em fitas de DNA recentemente sintetizadas utilizando o kit de proliferação de célula DELFIA (Perkin Elmer) de acordo com as instruções do fabricante em um contador de multi-rótulos Wallac Vioctor2 (Perkin Elmer).

Alternativamente, linhagens de célula de câncer que expressam GT468 endogenamente SK-BR-3 e MCF-7, respectivamente, foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma purificados com HPLC diluídos em meio de cultura de célula DMEM por 72 h ou 120 h em concentrações como indicado. A proliferação foi analisada como descrito acima.

Alternativamente, linhagens de célula de câncer que expressam GT468 endogenamente SK-BR-3, MCF-7, MDA-5 MB-468, e linhagem de célula de melanoma negativo GT468 Me1Ho como controle foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma purificados por FPLC (10 µg/ml e 50 µg/ml) diluídos em DMEM (SK-BR-3, MCF-7, MDA-MB-468) ou meio de cultura de célula RPMI (MelHo) por 72 h. a proliferação foi analisada medindo a incorporação de BrdU em fitas de DNA recentemente sintetizadas utilizando o kit de proliferação de células DELFIA (Perkin Elmer) de acordo com as instruções do fabricante em um contador de multi-rótulo Wallac Victor2 (Perkin Elmer).

Microscopia de imunofluorescência

Para demonstrar a presença de anticorpos anti-GT468 em soros de camundongos imunizados ou ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam GT468, a análise de microscopia de imunofluorescência foi utilizada. Células CHO transfectadas com GT468-eGFP foram cultivadas em lâminas de câmara sob condições de crescimento padrão em meio DMEM/F12, suplementadas com 10% de soro de vitelo fetal (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 IU/ml de penicilina e 100 µg/ml de estreptomicina. As células foram então fixas com metanol ou paraformaldeído/0,1% de Saponina. As células foram incubadas com anticorpos contra GT468 por 60 min. a 25°C. Após lavagem, as células foram incubadas com um anticorpo secundário de IgG anti-camundongo rotulado com Alexa 555 (Molecular Probes) sob as mesmas condições.

ELISA especifico de peptídeo GT468

Placas MaxiSorp ou Microwell (Nunc) foram revestidas por uma hora a 37°C com o peptídeo GT468 relevante (5 ou 10 μ/ml). O bloqueio foi executado com PBS 3% BSA durante a noite a 4°C. Após lavagem com PBS, as placas foram carregadas com sobrenadantes de hibridoma (diluidos 1:5 ou 1:10 em PBS/3% BSA ou diluídos 1:2 em 2 x PBS/6% BSA, pH 7,3) ou anticorpo purificado (diluído 1 µg/ml em PBS/3% BSA, pH 7,3) e incubados por 1 h em temperatura ambiente (agitação orbital a 90 rpm). Anticorpo secundário (IgG de anti-camundongo de cabra conjµado com H,P0< subclasses l+2a+2b+3, Jackson ImmunoResearch) em PBS 3% BSA, pH 7,3 foi adicionado após lavagem com PBS, e incubado por 1 h em temperatura ambiente com agitação orbital a 90 rpm. Após uma etapa de lavagem final com PBS, solução de substrato consistindo em 1 mM ou 1.5mM de ABTS em 100 mM de acetato de sódio (pH 5,2) foi adicionado. Imediatamente antes do uso, a solução de substrato foi suplementado com 0,3 ul por mol de 30% H2O2. A absorção a 405 nm foi medida em uma leitora de placa Tecan Safire (Tecan) após 30-60 min.

Geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos a GT468

Esplenócitos de camundongo foram isolados de animais que tinham sido imunizados anteriormente utilizando protocolos de imunização diferentes como descrito abaixo e fundidos com PEG em uma linhagem de célula de mieloma de camundongo baseado em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram então selecionados para produção de imunoglobulinas com especificidade de GT468 utilizando ELISA especifica de peptídeo, CrELISA de GT468 e células CHO transfectadas com GT468-eGFP por IF.

Suspensões de células únicas de linfócitos esplénicos de camundongos imunizados foram fundidas com células de mieloma de camundongo não secretoras P03X63Ag8U.l (ATCC, CRL 1597) (ou células de mieloma de camundongo P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) no caso de 56-4A-2 and 62-9B-1) em uma razão de 2:1 utilizando 50% PEG (Roche Diagnostics, CRL 738641). As células foram revestidas em aproximadamente 3 x 104/cavidade em placas de microtitulo de fundo Redondo, seguido por aproximadamente duas semanas de incubação em meio seletivo contendo 10% de soro bovino fetal, 2% de fusão de hibridoma e suplemento de clonagem (HFCS, Roche Diagnostics, CRL 1 363 735) mais 10 mM HEPES, 0.055 mM 2-mercaptoetanol, 50 µg/ml gentamicina e lx FLAT (Sigma, CRL H0262). Após 10 a 14 dias cavidades individuais foram selecionadas por ELISA especifica de peptídeo para anticorpos monoclonais anti-GT468. Os hibridomas de secretar anticorpo foram revestidos novamente, selecionados novamente e, se ainda positivos para anticorpos monoclonais anti-GT468, foram subclonados por diluição de limitação. Os subclones estáveis foram então cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização. Pelo menos um clone de cada hibridoma, que reteve a reatividade de células de origem (por ELISA e IF) foi escolhido.

Purificação de anticorpo monoclonal a partir de sobrenadantes de hibridoma

O anticorpo foi preparado de sobrenadantes de hibridoma por executar cromatografia de afinidade de etapa única utilizando HiTrap™ MabSelect SuRe™. Após eluição cora 100 mM de citrato, pH 3,0 - pH 4,0 dependendo do isotipo de anticorpo, as frações coletadas foram imediatamente neutralizadas com 1 M Tris, pH 8,0. Para experimentos adicionais os preparados de anticorpo foram dialisados duas vezes contra 5 L PBS, filtrados estéreis (0,2 um) e armazenados a 4°C.

Isotipaqera

Para isotipagem de sobrenadantes de hibridoma, Kit de isotipagem de anticorpo Monoclonal de camundongo IsoStrip (Roche) foi utilizado como descrito pelo fabricante.

Procedimento CrELISA utilizando lisados brutos de lisados bacterianos que expressam GT468

• Preparação dos antígenos
Bactérias XLOLR E. coli foram transformadas com plasmídeo pQE GT468 ou pQE sem inserção (será mencionado como "referência") e cultivadas em meio LB a A600 nm 0,35 E. a expressão de proteína foi induzida com 2 mM IPTG, e as células foram deixadas crescer por um período adicional de 4 h a 37°C. a indução adequada de expressão de proteína e sua cinética foram monitorados por análise de gel Coomassie. Bactérias foram giradas e suspensas novamente em um pequeno volume de PBS pH 7,2 contendo 0.1 mM de inibidor de protease AEBSF-cloridreto (AppliChem). As células foram colocadas em gelo e rompidas por sonicação (Branson Sonic Power A Smithkline) . Lisados de referência e GT468 foram diluídos a uma concentração total de proteína de 2 mg/ml em PBS contendo 0,2 mM AEBSF e 20% (v/v) de glicerol. Alíquotas foram congeladas por choque em nitrogênio e armazenadas a -70°C até uso.

• Condução do ensaio imunossorvente ligado por enzima
Antes do uso, GT468, bem como os lisados de referência, foi diluído em tampão de revestimento (100 mM HEPES, pH 7,2), a seguir transferido para placas de microcavidade Maxisorp F96 de fundo redondo (50 ul/cavidade, Nunc) e adsorvido por 2 h a 37°C.

Após imobilização de antígeno, as placas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem (50 mM Tris, 150 mM cloreto de sódio, pH 7,2) contendo 0,1% de Tween 20, e subseqüentemente duas vezes sem detergentes. Cinqüenta microlitros de soro humano diluído 1:100 foram adicionados por cavidade e incubados por 1 h em um agitador orbital em temperatura ambiente. Em alguns experimentos, soros humanos foram pré-tratados antes de submeter os mesmos ao ensaio.

Cada amostra de soro individual foi testada em duplicata em paralelo em cavidades revestidas com GT468 ou lisado de referência. As placas foram lavadas novamente como descrito acima e incubadas por 1 h em temperatura ambiente com 50 ul/cavidade de anticorpo secundário (IgG-AP anti-humano de cabra, Dianova) diluído 1:5000 em 50 mM HEPES (pH 7,4) contendo 3% (peso/v) de leite em pó. Placas foram reveladas com 100 μl/cavidade de solução de substrato [2 mg de hexaidrato de sal dissódico de fosfato 4-nitrofenila (Merck) por ml de ALP-tampão (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha)] por 30 min. em temperatura ambiente, e valores de absorvência imediatamente lidos a 405 nm em uma leitora de microplaca (Victor2 Wallac, Perkin-Elmer, Turku, Finlândia).

Análise citométrica de fluxo

Células HEK293 transfectadas com plasmídeo pcDNA3.1 de GT468 ou plasmídeo sem inserção (simulado) foram colhidas, fixas com metanol gelado, e bloqueadas com PBS/10% FCS por 30 min. as células foram incubadas com sobrenadante de hibridoma por 1 h, lavadas duas vezes com PBS/1 FCS por 10 min., e incubadas com um anticorpo secundário Cy3 anti-camundongo de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories).

Além disso, as células SK-BR-3, MCF-7, MDA-MB-468, Np-C4, ou HEK293 transfectadas com DNA de plasmídeo GT468 ou plasmídeo sem inserção (simulado) foram colhidas, e bloqueadas com PBS/5%FCS/0, 1% de azida de sódio. As células foram incubadas com sobrenadante de hibridoma ou 5 μ/ml de anticorpo purificado diluído em PBS/5% FCS/0,1% de azida de sódio por 1 h, lavado três vezes com PBS/5%FCS/0,1% azida de sódio por 5 min., e incubadas com um anticorpo secundário APC anti-camundongo de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories) . As células foram analisadas utilizando um FACSarray da Becton Dickinson.

Ensaio clonogênico

O ensaio clonogênico ou ensaio de formação de colônia é um ensaio de sobrevivência de célula in vitro para analisar a capacidade de uma célula única de crescer em uma colônia. Esse ensaio foi realizado para determinar a eficácia de anticorpos GT468 sobre a capacidade de produzir colônias. Células SK-BR-3 que expressam GT468 foram semeadas em placas de 48 cavidades (2000 células/cavidade). As células foram deixadas crescer por 2 semanas na presença de anticorpos purificados por FPLC a partir de sobrenadantes de hibridoma (45 μ/ml), todos os ensaios foram feitos em triplicata. As colônias foram fixas e coloridas com 6% de glutaraldeído (vol/vol) e 0,5% de violeta cristal (peso/vol). As fotografias foram tiras de placas coloridas e secas utilizando uma câmera compacta digital Olympus (C-750 ultra zoom) e analisadas visualmente.

Western blots

Lisados de célula inteira de células HEK293 transfectadas com plasmídeo pcDNA3.1 GT468 ou plasmídeo sem inserção (simulado) foram preparadas utilizando tampão de lise baseado em Triton-X (50mM FIEPES (pH 7,4), 30 10%(v/v) Glicerol, 1% (v/v) Triton X-100, 150mM NaCl, l,5mM MgC12, 5mM EDTA, 100mM NaF). Os extratos foram diluídos em tampão de amostra de redução (Roth), submetidos a SDS-PAGE e subseqüentemente eletrotransferidos sobre membrana PVDF (Pall). A imunocoloração foi realizada com um anticorpo policlonal reativo a GT468 (Koslowski e outros 2007) ou anticorpos purificados de FPLC a partir de sobrenadantes de hibridoma (5 μ/ml) seguido por detecção de anticorpo primário com anticorpos secundários de anti-coelho de cabra conjµados com peroxidase da raiz forte (Jackson ImmunoResearch Laboratories).

Modelo de xenoenxerto de tratamento prematuro

5xl06 de células de coriocarcinoma placental BEWO GT468 positivo foram injetadas s.c. em camundongos nude. 3 dias após inoculação de células de tumor os animais foram tratados com anticorpos monoclonais purificados (200 μ i.v., 8 animais por grupo). Os anticorpos receberam duas vezes por semana por 2 semanas. O crescimento do tumor foi monitorado utilizando paquímetro.

Ensaio de metástase experimental

Uma semana antes da injeção de células MCF-7 dependentes de estrogênio camundongos nude atimico foram preparados por implante s.c. de uma pelota de liberação co tempo de 17B-estradiol (1 mg, liberação de 60 dias; Innovative Research of America). Após injeção de 1x106 células MCF-7 i.v. animais foram tratados com anticorpos monoclonais purificados (200 μ) duas vezes por semana. PCR em tempo real foi utilizado para quantificação da carga de tumor nos pulmões de camundongos atimicos (5-8 animais por grupo) cinco semanas após injeção de células. DNA a partir dos tecidos do pulmão foi extraido utilizando Mini Kit de DNA QIAmp (Qiagen) e um fragmento de 226 bp da região alfa-satélite do cromossomo humano 17 (sentido 5'-CAG CTG ACT AAA CAG AAG CAG-3'; antisentido 5'-GAG TTG AAT GCA GTC ATC ACA G-3') foi amplificado de 200 ng de DNA. A carga de tumor (número de cópia de DNA) foi quantificada em referência a pulmões normais a partir de camundongos de controle saudáveis.

Exemplo 2: GT468 é ativado de forma aberrante e altamente expresso em vários tumores

Para identificar genes trofoblasticos específicos de placenta, uma estratégia de exploração de dados de genoma foi adaptada, que os requerentes tinham desenvolvido originalmente para identificação in silico de moléculas especificas de célula de germe (Koslowski, M., Bell, C, Seitz, G., Lehr, H. A., Roemer, K., Muntefering, H., Huber, C, Sahin, U. & Tureci, O. (2004) Cancer Res. 64, 5988-5993; Koslowski, M. , Tureci, O., Bell, C, Krause, P. , Lehr, H. A. , Brunner, J. , Seitz, G., Nestle, F. O., Huber, C. & Sahin, U. (2002) Cancer Res. 62, 6750-6755; Koslowski, M., Sahin, U., Huber, C. & Tureci, O. 30 (2006) Hum. Mol. Genet. 15, 2392-2399). Em princípio, a busca de palavra- chave hierárquica de GenBank foi combinada com subtração de biblioteca de cDNA digital para predição de genes específicos de placenta autenticamente. GT468 foi identificado por essa abordagem.

mRNA de GT468 foi investigado em um conjunto abrangente de espécies de tecido normal e neoplásico por RT-PCR de ponto final e RT-PCR em tempo real quantitativo. Foi confirmado que a expressão de GT468 é confinada à placenta. Em todos os outros espécimes de tecido normal quantidades de transcrito estão abaixo ou exatamente no limite de detecção de RT-PCR altamente sensível (figura 1A, B, C, tab. 1). A única exceção é testículo, embora com níveis de transcrito 3 a 4 logs mais baixo do que aqueles observados em placenta.
Tabela 1. Expressão de GT468 em tecidos e linhagens de célula digitadas por RT-PCR de ponto final

Em 38% (86/225) de espécimes de tumor primário através de tipos de câncer diferentes e 55% (22/40) de linhagens de célula de tumor, entretanto, a ativação aberrante desse gene com transcrição de outro modo ajustadamente controlada foi verificada. Níveis de transcrição e prevalência de GT468 foram mais elevados em câncer de mama e linhagens de célula de câncer de mama (figura 1A, B, C) . 44 de 62 (82%) amostras de câncer de mama primária marcaram positivo para expressão de GT468 (definida como pelo menos 100 vezes acima de background em tecidos normais não trofoblásticos) com 24% (15/62) mostrando baixa (100-1000 vezes), 40% (25/62) mostrando moderada (1000-10.000 vezes), e 17% (11/62 (mostrando elevada (>10.000 vezes) de expressão (figura 1B). além disso, os requerentes verificaram transcrição de GT468 em 21 de 50 (42% de amostras de câncer de pulmão bem como em câncer gástrico e de ovário (tab. 1) . A indução de GT468 não correlacionou com subtipo histológico, estágio de tumor ou tipo de tumor.

Utilizando RT-PCR em tempo real, somente quantidades residuais de transcritos de GT468 poderiam ser detectadas em tecidos normais após 40 ciclos de RT-PCR. O único tecido normal que excede o corte de expressão (linha tracejada, expressão média de todos os tecidos normais + 3 STDs (99% de percentil) ) eram placenta e testículos (figura 20A) . além de câncer de mama, os requerentes encontraram expressão elevada de GT468 em amostras de câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de célula renal, câncer hepático, sarcoma, câncer de tiróide, e câncer de cabeça e pescoço (figura 20B).

A análise de Western blot de expressão de GT468 em células HEK293 transfectadas com plasmídeo de expressão GT468 (controle positivo), SK-BR-3 (câncer de mama), BEWO (coriocarcinoma placental), JAR (coriocarcinoma placental), HCT-15 (câncer de cólon), LnCaP (câncer de próstata), HeLa (câncer cervical), MDA-MB-468 (câncer de mama), JEG-3 (coriocarcinoma placental), JIMT-1 (câncer de mama), LAl-55n (neuroblastoma), PC-3 (câncer de próstata), BT-20 (câncer de mama), e NCI-H929 (mieloma) demonstrou expressão de GT468 nessas linhagens de célula de câncer (figura 21). MelHO (melanoma maligno) e NµC4 (câncer gástrico) foram testados negativos.

Exemplo 3: GT468 é localizado na superfície de células cancerígenas e é acessível para anticorpos

Um anticorpo de coelho policlonal (term-C/anti-GT468 de coelho) contra um epítopo de peptídeo específico de GT468 (AA 117-127 da SEQ ID NO: 2) foi criado. Especificidade do anticorpo foi verificada por silêncio de gene de GT468 utilizando RNA de interferência pequena (siRNA) . Para excluir siRN de alvo experimentos de atividade foram realizadas com dois conjuntos de duplex siRNA específicos de GT468, um oligonucleotídeo não de silêncio misturado e células não transfectadas. Por transfectar linhagens de célula de câncer de mama MCF-7 e BT-549 com esses duplex siRNA uma redução estável e reprodutível de expressão de mRNA GT468 constitutiva por 80-90% em comparação com controles foi obtida (figura 1D). compatível com essa observação, a faixa de 26 kDa, detectada de acordo com o tamanho previsto de GT468 em Western blot, quase desapareceu totalmente nas duas linhagens de célula (figura 1E), provando tanto abate robusto de expressão de proteína GT468 e especificidade do anticorpo.

A coloração de Western blot de proteína GT468 em amostras de tecido humano primárias com term-C/anti-GT468 de coelho confirmou que esse gene é detectável em espécimes de câncer de mama em níveis comparáveis com placenta como o único tecido normal no qual é expresso (figura 1F). imunoistoquímica com term-C/anti-GT468 de coelho em seções de tumor de mama humano mostrou imunorreatividade específica em espécimes digitados positivos para expressão de mRNA GT468 por RT-PCR. A coloração foi confinado à população de células neoplásicas, ao passo que células epiteliais estromais e não neoplásicas adjacentes bem como tecidos normais casados de pacientes não foram reativos (figura 1G) . A imunocoloração de células de tumor foi acentuado na membrana de plasma, fornecendo evidência de que GT468 é uma proteína de superfície de célula.

Análise in silico da topologia da seqüência de proteína GT468 previu um domínio hidrofóbico que cobre AA 5 a 22 seguido por um domínio extracelular grande constituído por AA 23 a 212. Aminoácidos 29 a 119 da parte extracelular de GT468 representam um domínio de zona pelúcida (ZP) truncado. O domínio ZP é encontrado em uma variedade de proteínas semelhantes a receptor expostas extracelularmente, incluindo receptor beta-TGF tipo III, uromodulin,a glicoproteína GP2 bem como os receptores de esperma ZP2 e ZP3 (Bork, P. & Sander, C. (1992) FEBS Lett. 300, 237-240) e está envolvido em polimerização (Jovine, L. , Janssen, W. G., Litscher, E. S. & Wassarman, P. M. (2006) BMC. Biochem. 7, 11). A localização subcelular de GT468 constitutivamente expresso foi avaliada por microscopia de imunofluorescência de MCF-7 e células de câncer de mama BT-549 coloridas com term-C/anti-GT468 de coelho, que tem seu epítopo (como 117 a 127) na parte presumivelmente extracelular da proteína. As duas linhagens de célula exibiram coloração distinta na membrana de célula (figura 2A). a perda de sinal após abate induzido por siRNA de expressão GT468 confirmou a especificidade da coloração. Mais importante, a coloração de membrana específica foi observada não somente em células nativas fixas por metanol como também não fixas (figura 2B) indicando que o epítopo do anticorpo é acessível sem permeabilização da membrana de célula e desse modo suportando a topologia prevista com localização extracelular da extremidade de carbóxi.

Exemplo 4: silêncio de gene induzido por siRNA de GT468 inibe mobilidade, migração e invasão e bloqueia a proliferação de células de câncer.

Para determinar a importância biológica de GT468 em células de tumor os efeitos de seu silêncio de gene induzido por siRNA sobre funções de célula essenciais foram estudados.

Primeiramente, o desempenho de linhagens de célula de câncer de mama MCF-7 e BT-549 em ensaios de migração transwell foi investigado. A motilidade de linha de base (quimiocinese) das duas linhagens de células avaliadas por adição de 5% de FSC como quimioatraente na câmara tanto superior como inferior do sistema foi substancialmente inibido por duplex de siRNA especifico de GT468 (figura 3A). Conseqüentemente, os requerentes também observaram uma redução marcada da capacidade migratória quimiotáctica direcional das células (figura 3B). Além disso, a atividade de quimioinvasão de células foi profundamente afetada por tratamento com siRNA GT468, visto que as células não foram capazes de migrar ao longo de gradientes quimioatraentes por romper através de uma barreira de Matrigel (figura 3C).

A seguir, foi observado que a proliferação de célula de tumor como medido por incorporação de BrdU em DNA foi reduzida em 80-90% nas duas linhagens de célula por duplex de siRNA específico de GT468 (figura 4A) . a análise de ciclo de célula revelou uma parada S/G1 distinta nas células transfectadas com siRNA GT468 como a causa subjacente para o bloco de proliferação (figura 4B) . a vitalidade das células não foi afetada e a coloração para Annexin V não forneceu indicações para morte de célula apoptótica (figura 4C) .

Exemplo 5: Tratamento de células cancerígenas com anticorpos anti-GT468 inibe crescimento de célula.

Os requerentes mediram a proliferação de células MCF-7 e BT-549 incubadas com term-C/anti-GT468 de coelho e um anticorpo de controle não reativo. O alvejamento de GT468 resultou em inibição eficiente de proliferação das duas linhagens de célula em um modo dependente de concentração (figura 5).

Exemplo 6: Efeitos a jusante de silêncio induzido por siRNA e antagonização funcional induzida por anticorpo de GT468.

A proliferação e progressão de ciclo de célula em células eucarióticas são regidas por ciclinas e cinases dependentes de ciclina (CDKs). Ciclinas individuais atuam em fases diferentes do ciclo de célula por estimular as atividades de uma série de CDKs. O controle de ponto de restrição é mediado por famílias de cinase dependentes de ciclina D e E (Morgan, D.O. (1997) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 261-291; Sherr, C.J. (2000) Cancer res. 60, 3689-3695). Para investigar se silêncio de GT468 induz a disregulação de ciclo de célula observada através da alteração de expressão de ciclina, a expressão de ciclinas D1, D2, D3 e ciclina E em células de câncer de mama MCF-7 e BT-549 tratadas com siRNA de GT468 foi determinada.

De forma interessante, uma redução significativa de transcritos de ciclina Dl como medido por PCR em tempo real (figura 6A) bem como níveis de proteína de ciclina D1 em Western blot (figura 6B) ocorreu como conseqüência de abate de GT468. Nenhuma alteração em níveis de transcrição foi observada para as outras ciclinas analisadas.

Ciclina D1 é conhecida como sendo um principal regulador da progressão de G1 para S do ciclo de célula. De forma interessante, na tumorigênese de câncer de mama esporádico, a superexpressão de ciclina Dl é considerada como um evento prematuro (Caldon, C. E., Daly, R. J. , Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2006) J. Cell Biochem. 97, 261-274; Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2004) J. Mammary. Gland. Biol. Neoplasia. 9, 95-104). Ciclinas do tipo D são instáveis, e sua indução, síntese e montagem com seus sócios catalíticos dependem todas de sinalização mitogênica persistente. Desse modo, ciclinas do tipo D atuam como sensores de fator de crescimento, formando cinases ativas em resposta a fatores extracelulares (Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2004) J. Mammary. Gland. Biol. Neoplasia. 9, 95-104; Sherr, C. J. (1993) Cell 73, 1059-1065) . Em câncer de mana tem sido mostrado que a expressão de ciclina D1 é controlada através de uma via dependente de AKT/fosfatidil inositol 3-cinase (PI3K) (Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2004) J. Mammary.Gland. Biol. Neoplasia. 9, 95-104; D'Amico, M. , Hulit, J., Amanatullah, D. F., Zafonte, B. T., Albanese, C, Bouzahzah, B. , Fu, M. , Apenlicht, L. H., Donehower, L. A., Takemaru, K. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 32649-32657; Muise-Helmericks, R. C, Grimes, H. L., Bellacosa, A., Malstrom, S. E., Tsichlis, P. N. & Rosen, N. (1998) J. Biol. Chem. 273, 29864-5 29872). AKT inativa glicogênio sintase cinase-3beta (GSK-3B), desse modo aumentando a transcrição de ciclina Dl bem como seu turnover proteolitico e seus níveis de protein no núcleo (Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2004) J. Mammary. Gland. Biol. Neoplasia. 9, 95-104, Diehl, J. A., Cheng, M., Roussel, M. F. & Sherr, C. J. (1998) Genes Dev. 12, 3499-3511; Radu, A., Neubauer, V., Akagi, T., Hanafusa, H. & Georgescu, Μ. M. (2003) Mol. Cell Biol. 23, 6139-6149). Além disso, a via AKT é um regulador importante de motilidade e migração de células de câncer (Sutherland, R. L. & Musgrove, E. A. (2004) J. Mammary. Gland. Biol. Neoplasia. 9, 95-104, Cantley, L. C. (2002) Science 296, 1655-1657; Luo, J. , Manning, B. D. & Cantley, L. C. (2003) Cancer Cell 4, 257-262), duas outras funções de célula nas quais GT468 está aparentemente envolvido. Isso levou os requerentes a analisarem se GT468 tem um impacto sobre a regulação de AKT cinase em células MCF-7 e BT-549.

A fosforilação constitutiva e hiperativação de AKT consecutivo à superativação de PI3K é freqüentemente observada em células de tumor. A quantificação de níveis de Ser473 fosforilação de AKT (pAKT) subseqüente a silêncio de GT468 por tecnologia siRNA e sua antagonização funcional com term-C/anti-GT468 de anticorpo resultaram ambos em uma redução acentuada de níveis de pAKT em particular em células MCF-7 (figura 6C, D) sperindo que a ativação de AKT cinase está envolvida na execução de efeitos a jusante de GT468. De forma interessante, a regulação descendente de pAKT foi menos proeminente em células BT-549, que não têm PTEN e portanto têm um nível mais elevado de superativação de PI3K.

Exemplo 7: Anticorpos monoclonais específicos de GT468

Camundongos Balb/c ou C57/BL6 foram imunizados com peptídeos acoplados a KLH. 50 μ de peptídeos com 50 ul de Montanide ISA 50V como adjuvante foram injetados por via intraperitoneal (i.p. nos dias 1, 15, 45, e 86. A presença de anticorpos dirigidos contra GT468 em soros de camundongos foi monitorada por ELISA especifica de peptídeo nos dias 24, 57 e 92. Os camundongos com respostas imunes detectáveis foram reforçados três dias antes da esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais.

Os peptídeos tendo seqüências de acordo com SEQ ID NOS: 3-10 foram utilizados para geração de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais. Por exemplo, a imunização utilizando o peptídeo da SEQ ID NO: 3 forneceu hibridomas 4E9-1H9 e 9B6-2A9, imunização utilizando o peptídeo da SEQ ID NO: 4 forneceu hibridoma 59D6-2F2, e imunização utilizando o peptídeo de SEQ ID NO: 6 forneceu hibridomas 61C11-2B5 e 78H11-1H6.

Uma ELISA específica de peptídeo foi realizada para assegurar ligação específica dos anticorpos monoclonais. sobrenadantes de hibridoma foram testados em diluição de 1:5 ou 1:10 contra o peptídeo respectivo utilizado para imunização de camundongos. Como controle todos os sobrenadantes de hibridoma foram testados contra dois peptídeos irrelevantes. Todos os anticorpos monoclonais reagiram especificamente somente com o peptídeo respectivo utilizado para imunização de camundongos (figura 7).

A ligação específica dos anticorpos monoclonais à proteína de GT468 de comprimento total foi analisada por microscopia de imunofluorescência (IF) . 24 h após transfecção de uma construção de fusão GT468-eGFP células CHO foram coloridas com sobrenadantes de hibridoma (diluição de 1:5) . A fusão do sinal eGFP com o sinal de anticorpo anti-camundongo secundário (Alexa555) mostrou coloração somente das células transfectadas com GT468-eGFP ao passo que as células não transfectadas eram negativas (figura 8).

Para analisar o impacto dos anticorpos monoclonais se ligando a GT468 na proliferação de células de câncer, linhagens de célula de câncer que expressam GT468 endogenamente BT-549, Caov-3, EFO-21, MCF-7 e MDA-MB-231 foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma (diluição 1:2) por 72 h. a proliferação das células foi medida por incorporação de BrdU em DNA. Embora o anticorpo monoclonal 4E9 1H9 não alterasse a proliferação das células na concentração utilizada, os anticorpos 9B6 2A9 e 59D6 2F2 reduziram claramente a proliferação de todas as linhagens de célula de câncer analisadas (figura 9).

Desse modo, foi mostrado que anticorpos monoclonais podem ser produzidos que seletivamente alvejam GT468 expresso por células. Além disso, foi mostrado que anticorpos monoclonais para GT468 podem ser produzidos que inibem a proliferação de células de câncer que expressam GT468.

Exemplo 8: anticorpos monoclonais específicos de GT468 obtidos da imunização com plasmídeo pcDNA3.1 de GT468 seguido por injeção de proteína/peptídeo.

Camundongos Balb/c ou C57/BL6 foram imunizados com plasmídeo pcDNA3.1 GT468 com PEI manose como adjuvante por via intramuscular (i.m.) no dia 1 e 15. Posteriormente, 50 μ de peptídeos com 50 ul de Montanide ISA 50V como adjuvante (por via intraperitoneal) ou 150μ de proteína com adjuvante de Freund incompleto (IFA) (por via subcutânea) foram injetados nos dias 30 e 45. A presença de anticorpos dirigidos contra GT468 em soros de camundongos foi monitorada por ELISA específica de peptídeo ou CrELISA. Os camundongos com respostas imunes detectáveis foram reforçados três dias antes da esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais.

Imunização intramuscular de duas vezes utilizando DNA GT468 seguido por administração subcutânea de duas vezes de proteína GT468 recombinante resultou em hibridomas 22-1A-1, 22-2A-1, 22-9B-1, 23-33A-1 e 23-19A-1. Imunização intramuscular de duas vezes utilizando DNA GT468 seguido por administração intraperitoneal de duas vezes do peptídeo de acordo com SEQ ID NO:10 resultou em hibridoma F11#33F7D12. imunização intramuscular de duas vezes utilizando DNA GT468 seguido por administração intraperitoneal de duas vezes do peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 3 resultou em hibridomas 4A12 2D4 1A10 e 4E9 1D12 2D4 .

A seguinte tabela relaciona os anticorpos obtidos em seus isotipos.
Tabela 2. Anticorpos monoclonais obtidos por imunização com DNA GT468 seguido por injeção de peptídeo/proteína.

Um lisado bruto (CrELISA) foi realizado para assegurar ligação especifica dos anticorpos monoclonais a partir de hibridomas 22-1A-1, 22-2A-1, 22-9B-1, 23-33A-1, and 23-19A-1. Sobrenadantes de hibridoma foram testados contra o lisado de E.coli transformado com vetor de expressão pQE de GT468. Como controle, sobrenadantes de hibridoma foram tesados em lisado de E.coli transformado com plasmídeo pQE sem inserção (simulado). Todos os anticorpos monoclonais reagiram especificamente somente com lisado de GT468 específico (figura 10A) .

Uma ELISA específica de peptídeo foi executada para assegurar ligação específica dos anticorpos monoclonais a partir de hibridomas F11#33F7D12, 4A12 2D4 1A10, e 4E9 1D12 2D4. Sobrenadantes de hibridoma foram testados contra o peptídeo respectivo utilizado para imunização de camundongos. Como controle, sobrenadantes de hibridoma foram testados contra um peptídeo irrelevante. Os anticorpos monoclonais reagiram especificamente somente com o peptídeo respectivo utilizado para imunização de camundongos (figura 10B).

A ligação específica dos anticorpos monoclonais a proteína de GT468 de comprimento total foi analisada por análise citométrica de fluxo como descrito aqui. Para análise citométrica de fluxo de anticorpo monoclonal 4E9 1D12 2D4 células de HEK transfectadas de forma transiente com uma taxa de transfecção de aprox. 40% foram utilizadas. Todos os sobrenadantes de hibridoma mostraram coloração específica de células transfectadas com GT468, ao passo que nenhuma coloração foi observada em células transfectadas simuladas (figura 11).

A ligação especifica dos anticorpos monoclonais à proteína GT468 de comprimento total foi analisada por Western blot. Todos os sobrenadantes de hibridoma mostraram reatividade específica com lisados de células HEK293 transfectadas com plasmídeo de expressão pcDNA3.1 GT468, ao passo que lisados de células transfectadas simuladas não mostraram sinal (figura 12; acredita-se que o sinal desvanecido de sobrenadante de hibridoma 23-33A-1 no lisado simulado resulte do derramamento do lisado de GT468 HEK).

Uma ELISA de peptídeo foi executada para identificar epítopos na proteína GT468 à qual os anticorpos monoclonais se ligam. A seqüência de proteína GT468 completa foi sintetizada como conjunto de 51 peptídeos de sobreposição (15mers) com uma sobreposição de 11 aa. Todos os sobrenadantes de hibridoma foram testados em ELISA para ligação específica a esses peptídeos. Como controle, um peptídeo irrelevante foi utilizado. Todos os sobrenadantes mostraram ligação específica a peptídeos GT468. Sobrenadantes de hibridoma 22-1A-1, 23-33A-1 e 23-19A-1 mostraram, cada um, ligação a dois peptídeos de sobreposição indicando reatividade a um epítopo linear de GT468. Os padrões de ligação de 22-2A-1 e 22-9B-1 eram mais complexos, indicando reatividade a epítopos de conformação da proteína de GT468.

Para analisar o impacto dos anticorpos monoclonais a GT468 sobre a proliferação de células de câncer, linhagens de célula de câncer que expressam GT468 endogenamente SK-BR-3 (4A12 2D4 1A10) ou MCF-7 (4E9 1D12 2D4) foram incubadas com sobrenadantes de hibridoma purificadas por 72 h ou 120 h nas concentrações indicadas na figura 14. A proliferação de células foi medida por incorporação de BrdU em DNA. Embora o anticorpo monoclonal de controle irrelevante não alterasse a proliferação das células, anticorpos monoclonais 4A12 2D4 1A10 e 4E9 1D12 2D4 reduziram claramente a proliferação de células em um modo dependente de concentração (figura 14).

Exemplo 9: Anticorpos monoclonais específicos de GT468 obtidos utilizando estratégias de imunização diferentes

Camundongos Balb/c ou C57/BL6 foram imunizados como mostrado na tabela 3. Peptideos: 50μ de peptideos com 50ul de Montanide ISA 50V como adjuvante foram injetados por via intraperitoneal (i.p.) DNA: 25 μ de DNA de plasmídeo GT468 com PEI-manose como adjuvante foi injetado por via intramuscular (i.m.). Proteína recombinante: 150 μ de proteína GT468 com adjuvante de Freund incompleto (IFA) foi injetada por via subcutânea (s.c.). Células: 1-2 107 células HEK293 transfectadas com DNA de plasmídeo GT468 foram injetados por via intraperitoneal (i.p.). Em geral, imunógeno foi dado em cada segunda semana. Camundongos com respostas imunes detectáveis foram reforçados três dias antes da esplenectomia para geração de anticorpos monoclonais.

A seguinte tabela lista os anticorpos obtidos e seus isotipos.
Tabela 4. Anticorpos monoclonais obtidos utilizando estratégias de imunização diferentes

Esses anticorpos e dois anticorpos adicionais 78H11 1H6 (isotipo: IgG1( e 22-1A-1 (isotipo: IgG2b) obtidos nos exemplos 7 e 8, respectivamente, foram utilizados para teste adicional.

Uma ELISA específica de peptídeo utilizando o conjunto de 51 peptideos de sobreposição (15mes) com uma sobreposição de 11a mostrada na figura 13 e 25 foi realizada para identificar os epítopos da proteína GT468 que os anticorpos monoclonais estão se ligando a. sobrenadantes de hibridoma purificados foram individualmente testados na ELISA para ligação específica a todos os peptídeos. Como controle um peptídeo irrelevante foi utilizado.

Como indicado na tabela 5, 15 sobrenadantes mostram ligação específica a peptídeos de GT468. Desses 15 sobrenadantes, 13 sobrenadantes se ligaram a 1 peptídeo, ou a 2 ou 3 peptídeos adjacentes sperindo o reconhecimento de um epítopo linear de GT468, e 2 sobrenadantes se ligaram a peptídeos que, pelo menos parcialmente são não adjacentes sperindo uma definição de conformação/linear do epítopo. 9 sobrenadantes não mostraram ligação específica a peptídeos de GT468 na ELISA específica de peptídeo, entretanto, mostraram ligação no FACS ou no IF, sperindo reatividade a epítopos de conformação não lineares de GT468.
Tabela 5. Teste de anticorpos monoclonais em uma ELISA específica de peptídeo

A ligação específica de anticorpos monoclonais a partir dos hibridomas a proteína GT468 foi analisada por análise citométrica de fluxo. Células HEK293 não fixas nativas estavelmente transfectadas com Display-GT468aall6-212 ou células transfectadas simuladas foram coloridas com sobrenadantes de hibridoma purificados com FPLC (5 μ/ml).
No plasmídeo aminoácidos pDisplay-GT468aall6-212 116-212 de GT468 são terminalmente C fundidas a um domínio de transmembrana de receptor PDGF. Essa construção assegura expressão estável de GT468 aall6-212 na membrana de plasma de células. As células foram coloridas com os sobrenadantes em um estado não fixado que detecta ligação a GT468 em sua conformação nativa. Sobrenadantes de hibridoma mostraram coloração específica de células transfectadas de GT468, ao passo que nenhum coloração foi observada em células transfectadas simuladas (figura 15).

A ligação específica dos anticorpos monoclonais a partir dos hibridomas a células de tumor não fixadas expressando endogenamente GT468 foi analisada por análise citométrica de fluxo. Células de câncer de mama MCF-7, MDA-MB-468, e SK-BR-3 foram utilizadas como células de tumor que expressam endogenamente células de câncer gástrico GT468 e Nµ-C4 não expressando GT468 foram utilizadas como controle negativo. Células não fixas, nativas foram coloridas com sobrenadantes de hibridoma purificados por FPLC (5 μ/ml). Sobrenadantes de hibridoma mostraram coloração específica de células de câncer que expressam GT468 em pontos variáveis. Embora para alguns dos sobrenadantes as populações de células sejam coloridas significativamente (42H11 1C11 2B2, 22-1A-1, 35-50A-2a, 54-4B-2), somente subpopulações (aproximadamente 5% das células são positivas para outros sobrenadantes (figura 16). Isso indica a ligação a subpopulações de expressão forte. Os resultados demonstram que os anticorpos são capazes de se ligar a células de tumor que expressam GT468.

A ligação especifica dos anticorpos monoclonais em sobrenadantes de hibridoma à proteína de GT468 de comprimento total foi analisada por Western blot. Sobrenadantes de hibridoma purificadas por FPLC (5 μ/ml) mostraram reatividade especifica com lisados de células HEK293 transfectadas com um plasmídeo de expressão de GT468, ao passo que lisados de células transfectadas simuladas não mostraram sinal demonstrando que a ligação a GT468 é específica (figuras 17, 23).

A atividade inibidora de proliferação de anticorpos monoclonais de sobrenadantes de hibridoma foi analisada em ensaios de proliferação (figura 18, 22) . Células de câncer de mama que expressam endogenamente GT468 (SK-BR-3, MDA-MB-468, MCF-7) e células de melanoma MelHO de GT468 negativo ou células de câncer gástrico NµC4 foram semeadas em uma placa de 96 cavidades (5000 células/cavidade) e incubadas com sobrenadantes de hibridoma purificados por FPLC nas concentrações indicadas. Após 72 h de proliferação de células foi medida por incorporação de BrdU em DNA. Todos os valores são normalizados para células de controle não incubadas com sobrenadante de hibridoma. Nenhuma inibição de proliferação foi observada em células de controle MelHo NµC4. Sobrenadantes de hibridoma mostraram atividade inibidora de proliferação especifica em células de câncer de mama que expressam GT468 em um modo dependente de concentração em pontos variáveis. Alguns dos anticorpos (35-48B-1, 48-3B-1, 51-1A-1, 56-4A-2(mostraram efeitos significativos sobre todas as linhagens de célula de GT468 positivo testadas.

Um ensaio clonogênico foi realizado para analisar a atividade inibidora de anticorpos monoclonais a partir de hibridomas sobre formação de colônia de células SK-BR-3 que expressam endogenamente GT468. As células foram semeadas em uma placa de 48 cavidades (3000 células/cavidade) e incubadas com sobrenadantes de hibridoma purificados por FPLC (45 μ/ml). As colônias cultivadas durante um período de tempo de 14 dias foram fixas com flutaraldeído e coloridas com violeta cristal para avaliação visual. A incubação das células com anticorpo reduziu ou inibiu a formação de colônia (figura 19). A formação de colônia é de importância com relação à formação de metástase se células de tumor individuais colonizarem órgãos. A atividade inibidora dos anticorpos indica seu potencial em suprimir a formação de metástase.

Exemplo 10: Tratamento com anticorpos monoclonais anti-GT468 atenua crescimento de tumor de xenoenxerto em camundongos nude

Células de coriocarcinoma placental BEWO de GT468 positivo foram injetadas s.c. em camundongos nude e os animais tratados com anticorpos monoclonais anti-GT468 purificados. A figura 24 demonstra que o tratamento com anticorpos monoclonais anti-GT468 atenua crescimento de tumor xenoenxerto de coriocarcinoma placental BEWO em camundongos nude.

Exemplo 11: Tratamento com anticorpos monoclonais anti-GT468 reduz carga de tumor metastático nos pulmões de camundongos nude

Células de MCF-7 foram injetadas i.v. em camundongos nude atímicos pré-tratados com implante s.c. de uma pelota de liberação de tempo de 17B-estradiol e os animais tratados com anticorpos monoclonais anti-GT468 purificados. PCR em tempo real utilizado para quantificação da carga de tumor nos pulmões dos camundongos atimicos cinco semanas após injeção das células demonstrou uma redução significativa da carga de tumor metastático em pulmões de camundongos tratados com anticorpos monoclonais anti-GT468 (figura 26) .

Claims

Anticorpo caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em:
- (i) um anticorpo produzido por ou obtenível de um clone depositado de acordo com o número de acesso DSM ACC2944 (51-1A-1),
- (ii) um anticorpo que é uma forma quimerizada ou humanizada do anticorpo de acordo com (i), e
- (iii) um anticorpo que compreende a porção de ligação de antígeno ou sítio de ligação de antígeno do anticorpo de acordo com (i),
em que o referido anticorpo se liga a um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácido da SEQ ID NO.: 2 e inibe a proliferação de células que expressam o referido polipeptídeo.
Hibridoma caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em:
- (i) um hibridoma que produz o anticorpo conforme definido na reivindicação 1, e
- (ii) um hibridoma depositado de acordo com o número de acesso DSM ACC2944 (51-1A-1).
Conjugado caracterizado por compreender um anticorpo conforme definido na reivindicação 1 acoplado a um agente terapêutico, preferencialmente, em que o agente terapêutico é uma toxina, um radioisótopo, um fármaco ou um agente citotóxico.
Composição farmacêutica caracterizada por compreender um anticorpo conforme definido na reivindicação 1 e/ou um conjugado conforme definido na reivindicação 3, e um veículo farmaceuticamente aceitável.