BRPI0906309A2 - Imunoglobulina, anticorpo, uso do anticorpo e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

imunoglobulina, anticorpo, composição farmacêutica uso do anticorpo e trata-se de anticorpos que se ligam especificamente a her2/neu, e particularmente anticorpos 4ds quiméricos contra her2/neu, que possuem glicosilação reduzida quando comparados com anticorpos 4ds conhecidos. a invenção também se refere a métodos de utilização dos anticorpos 4ds e composições que compreendem os mesmos no prognóstico e terapia de doenças como câncer, diagnóstico, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios, e doença infecciosa.

Description

IMUNOGLOBULINA, ANTICORPO, USO DO ANTICORPO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS:

O presente pedido reivindica a prioridade de Pedido de Patente norte-americano No. de Série 61/041.649, depositado em 2 de abril de 2008 (pendente) , e tal pedido está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA:

O presente pedido inclui uma ou mais Listagens de Sequência de acordo com 37 C.F.R. 1.821 et seq. , que estão descritas tanto no documento quanto na mídia que pode ser lida por computador, e tais descrições que podem ser lidas por computador e documento estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO:

CAMPO DA INVENÇÃO:

A presente invenção refere-se a novos anticorpos 4D5 que se ligam especificamente a HER2/NEU, e particularmente a novos anticorpos 4D5 quiméricos a HER2/NEU, o quais possuem glicosilação reduzida e funções efetoras alteradas quando comparados com anticorpos 4D5. A invenção também se refere a métodos de utilização dos anticorpos e composições compreendendo os mesmos no diagnóstico, prognóstico e terapia de doenças como câncer, doenças autoimunes, doenças inflamatórias, e doenças infecciosas.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA:

HER2/NEU E RECEPTORES HER2/NEU

Os processos de crescimento e diferenciação celular envolvem fatores de crescimento que exercem suas ações através de receptores específicos tais como a tirosina quinases. A ligação de ligante a um receptor tirosina quinase ativa uma cascata de eventos que eventualmente resulta em

2/124 proliferação e diferenciação celular. (Carpenter et al.

(1979) Biochem. 48:193 -216; Sachs et al. (1987) Cancer Res.

47:1981-8196). Os receptores tirosina quinase podem ser classificados em vários grupos com base na similaridade de 5 sequência e características diferentes. Tal família é a família de receptores de fator de crescimento ErbB ou epidérmico, que inclui múltiplos receptores conhecidos como -'HER-I (também conhecido como érbB-1 ou EGFR) , HER-2 ou HER2/NEU (também conhecido como erbB-2, c-neu, ou pi 85) , 10 HER-3 (também conhecidos como erbB-3), e HER-4 (também conhecido como erbB-4). (Vide, por exemplo, Carpenter et al., supra; Semba et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82: 6497-6501,- Coussens et al. (1985) Science, 230:11301139, Bargmann et al. (1986) Cell 45:649-657; Kraus et al.

(1989) PNAS 86: 9193-9197; Carraway et al. (1994) J. Biol.

Chem. 269:14303-14306; e Plowman et al. (1993) Nature 366:

473-475; Tzahar et al. (1994) Biol. Chem. 269: 25226-25233).

Os receptores ErbB exercem funções importantes na propagação de sinais que regulam a proliferação, 20 diferenciação, motilidade, e apoptose celular, tanto em processos de desenvolvimento normais como em tumorigênese humana. (Slamon et al. (1989) Science 244:707-712). Por exemplo, a ativação de receptores erbB é acoplada e estimula o crescimento de MAPK-Erkl/2 a jusante e fosfoinositídeo-325 quinase (PI3K)/AKT e vias de sobrevivência. A desregulação dessas vias em câncer está associada ao avanço da doença e refratariedade à terapia. (Fukazawa et.al. (1996) J. Biol. Chem. 271 :14554-14559; Tzahar et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16:5276-5287; Lange et al . (1998) J. Biol. Chem. 273:31308.3 0 31316; Olayi_qye_ et. al_— <Ã?^9S> ^Mo?-^cel¹ · -.PArVí .3®-15.042z5A[51;

Hackel et al. (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11:184-189). A ativação de PI3K/AKT promove a sobrevivência celular e agressividade tumoral aumentada, e AKT2 foi apresentado para

3/124 ser ativado e superexpresso em cânceres de mama de superexpressão de HER2/NEU. (Shak (1999) Semin. Oncol. Suppl 12:71-77; Huang et al. (2000) Clinical Cancer Res. 7:21662174; Bacus ét al. (2002) Oncogene 21 :3532-3540).

A sinalização pela família ErbB de receptores é iniciada por ligação de ligante que ativa a homo ou heterodimerização de receptor, a fosfòrilação de tirosina recíproca das caudas citoplasmáticas, e ativação de vias de transdução de sinal intracelular. (Cirri et al. (2003} Exp.

Cell Res. 284:54). A disponibilidade de ligantes que se ligam e ativam os receptores ErbB é mediada por várias metaloproteases, tal como a família ADAM (Uma Desintegrine E Metaloprotease} de metaloproteases dependentes de zinco, que catalisa o processamento de ectodomínio de superfície celular 15 de proteínas específicas. (Vide Chang and Werb ¢2001} Trends in Cell Biology 11: 537-543; Moss and Lambert (2002) Essays in Biochemistry 38:141-153; Seals and Courtneidge (2003) Genes and Development 17:7-30). Especificamente, a família ADAM foi mostrada para clivar os ligantes responsáveis pela ativação dos receptores ErbB, tal como APP e Notch. (Blobel (2005) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6:32-43} .

Um elemento importante da família ErbB, HER2/NEU, é uma proteína receptora de 185 kDa que foi originalmente identificada como o produto do gene de transformação de 25 neuroblastomas de ratos quimicamente tratados. HER2/NEU foi amplamente investigado devido a seu papel em vários carcinomas humanos e no desenvolvimento de mamíferos. (Hynes and Stern (1994) Biochim. et Biophys.. Acta 1198:165-184; e Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995)

Nature 378:394-398).. O gene HER2/NEU humano e proteína HER2/NEU são descritos em Semba et al · (1985) Proc. Natl.

Acad. Sci. (U.S.A.) 82:6497-6501 e Yamamoto et al. (1986)

Nature 319:230-234, e a sequência está disponível no GenBank

4/124 como número de acesso X03363. HER2/NEU compreende quatro domínios: um domínio extracelular ao qual o ligante se liga; um domínio transmembrana lipofílico; um domínio tirosina quinase intracelular conservado; e um domínio de sinalização 5 carboxil-terminal que contém diversos resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. (Plowman et al. (1993) Proc.

Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1746-1750). A sequência do .domínio extracelular HER2/NEU (ECD) foi descrita por Franklin et al. (2004) Cancer Cell. 5(4):317-328, e está disponível em 10 Protein DataBank Record 1S78 (2004).

HER2/NEU funciona como um receptor de fator de crescimento e é geralmente expresso por tumores tais como câncer de mama, câncer de ovário e câncer de pulmão. HER2/NEU é superexpresso em 25 a 30% dos cânceres de mama e ovário 15 humanos, e está associado com progressão clínica agressiva e prognóstico insatisfatório nesses pacientes. (Slamon et al. (1987) Science 235:177-182; Slamon et al. (1989) Science

244:707-712). A superexpressão de HER2/NEU também foi observada em outros carcinomas, inclusive carcinomas do 20 estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas e vesícula. (Vide, por exemplo, King et al. (1985) Science 229:974; McCann et al. (1990) Cancer 65:88-92; Yonemura et al. (1991) Cancer Research 51:1034).

A ativação de HER2/NEU está correlacionada com 25 capacidade de resposta clínica reduzida à terapia hormonal em pacientes com câncer . de mama. (Wright et. al. (1989) Cancer Res. 49:2087-2090; Kurokawa & Arteaga (2001) Clin. Cancer Res. 7:4436s-42s, 4411S-4412S). Na verdade, a expressão de HER2/NEU é suficiente para transmitir resistência a anti30 estrogênio. (Benz et. al. ¢1993) Breast Cancer Res. Treat. 24:85-95). HER2/NEU, bem como HER-3, também parece estar envolvido na ocorrência de resistência hormonal em pacientes com câncer de próstata. Aproximadamente um terço dos

5/124 pacientes com câncer de próstata recebe tratamento de terapia hormonal visando interromper · a ação de androgênios testiculares e adrenais. Com câncer de mama, a resistência é inevitável. Dados recentes sugerem que os sinais que emanam 5 de HER2/NEU e HER-3 induzem um estado refratário a hormônio*' . (Mellinghoff et. al. (2004) Cancer Cell 6:517527) .

Diversas versões truncadas e unidas de HER2/NEU'são conhecidas. Por exemplo, um ECD truncado localizado no 10 citoplasma perinuclear de algumas células de carcinoma gástrico é produzido por uma transcrição alternativa gerad.a pelo uso de um sinal de poliadenilação dentro de um intron. (Yamamoto et al. (198 6) Nature 319:230-234; e Scott et al.

(1993) Mol. Cell. Biol. 13:224 7-2257). Nenhuma utilidade 15 terapêutica, de diagnóstico ou de pesquisa particular foi atribuída a êsse polipeptídeo ECD truncado. O ECD de HER2/NEU também pode ser proteoliticamente produzido a partir de células de carcinoma de mama em cultura, e é encontrado no soro de alguns pacientes portadores de câncer em que esse 2 0 pode ser um marcador de soro de câncer de mama metas tático e um prognóstico insatisfatório total. (Fetch et al. (1990)

Mol. Cell. Biol. 10:2973- 2982; Leitzel et al. (1992) J. Clin. Oncol. 10:1436-1443,- Scott et al . (1993) Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257,- e Lee and Maihle (1998) Oncogene 16:324325 3252) . Em algumas células tumorais de superexpressão de

HER2/NEU, acetato de 4-aminofenila mercúrico (ΑΡΜΑ), um ativador de metaloprotease bem conhecido, ativa as metaloproteases como ADAM1O e ADAM 15 para.clivar o. receptor HER2/NEU em duas partes: um receptor associado à membrana 3 0 truncada conhecido como p95, e um_ECD solúye 1. conhecido^cgno pl05 ou ECD10.5. (Vide, por exemplo, Molina et al. (2001) Cancer Res. 61 :4744-4749,- Publicação de Patente Norteamericana n° . 2004/0247602) . A perda do ECD torna o receptor

6/124 p95 uma tirosina quinase constitutivamente ativa, que pode emitir sinais de crescimento e sobrevivência às células cancerosas. (Vide, por exemplo, a Patente Norte-americana n’. 6.541.214).

Estudos mostraram que em células câncer de mama de superexpressão de HER2/NEU, o tratamento com anticorpos específicos a HER2/NEU em combinação com agentes quimioterápicos (por exemplo, cisplatina, doxorrubicina, taxol) provoca urna resposta citotóxica maior que o tratamento apenas com quimioterapia. (Hancock et al. (1991) Cancer Res. 51:4575-4580; Arteaga et al. (1994) Cancer 54:3758-3765; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838). Um possível mecanismo através do qual os anticorpos HER2/NEU po'dem aumentar a resposta aos agentes quimioterápicos é por meio- da modulação de expressão de proteína HER2/NEU ou mediante a interferência com reparo de DNA. (Stancovski et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:8691-8695; Bacus et al. (1992) Cell Growth & Diff. 3:401-411; Bacus et al. (1993) Cancer Res. 53:5251-5261; Klapper et al. (1997) Oncogene 14 :2099-2109,- Klapper et al. (2000) Cancer Res. 60:3384-3338; Arteaga et al. (2001)- J Clinical Oncology 19 (IBs) : 32s-40s) .

Inúmeros anticorpos monoclonais e inibidores tirosina quinase de molécula pequena que marcam HER-I ou HER2/NEU. foram desenvolvidos. Por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino conhecido como 4D5 reconhece um epítopo extracelular (aminoâcidos 52 9 a 62 7) no domínio rico em cisterna II de HER2/NEU que se situa muito próximo à região transmembrana. O tratamento de células de câncer de mama com 4D5 bloqueia parcialmente a ativação de NDF/heregulina de complexos HER2/NEU-HER-3, tal comcmedido por testes de fosfórilação de'receptor. (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci, (U.S.A.) 89:4285-4289; Sliwkowski et al. (1999) Sem. in Oncol. 26:60-70,- Ye et al. (1999) Oncogene 18:7317/124

738; Vogel et al. (2001) Oncology 61(suppl 2):37-42,- Vogel et al. (2002) Journal of Clinical Oncology 20(3}:719-726,Fujimoto-Ouchi et al. (2002) Cancer Chemother. Pharmacol. 49:211-216). A administração de 4D5 a humanos, entretanto, 5 foi uma falha clínica, pois os pacientes desenvolveram rapidamente respostas a HAMA, então formas humanizadas foram desenvolvidas. A sequência e estrutura cristalina do _Aanticorpo humanizado 4D5 foram descritas na Patente Norteamericana n^e. 6.054.2 97, Carter et al., supra, e Eigenbrot et 10 al. (1993) J. MoT. Biol. 229:969-95.

Uma forma humanizada de 4D5 conhecida como trastuzumab (vendida como Herceptin® junto à Genentech, Inc.) foi desenvolvida e aprovada para tratar cânceres que envolvem a superexpressão ou amplificação de gene de HER2/NEU, 15 inclusive câncer de mama. (Cobleigh et al. (1999) J. Clin.

Oncol. 17:2639-2648). Trastuzumab inibe a divagem mediada por ΑΡΜΑ de HER2/NEU nas porções ECD e p95 in vitro, e acredita-se que esse funcione in vitro através de diferentes mecanismos, inclusive a possível inibição de processamento de 20 HER2/NEU. (Pegram et al. (1998) Journal of Clinical Oncology (8):2659-2671,- Baselga et al. (2001) Seminars in Oncology

28(5) (suppl. 16):4-11,- Baselga et al. (2001) Annals of Oncology 12 (suppl. 1):S35-S41). A terapia com trastuzumab possui várias desvantagens, entretanto, tal como a 25 cardiotoxicidade e desenvolvimento de respostas HAHA em alguns pacientes.

Dessa maneira, ainda há a necessidade de formas novas e aprimoradas de anticorpos HER2/NEU para uso em terapias de câncer, por exemplo, anticorpos 4D5 que possuem 30 afinidade ou especificidade aumentada, potencial reduzido de respostas HAMA ou HAHA, funções efetoras alteradas, e similares.

RECEPTORES FC

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A interação de complexos anticorpo-antigeno com células do sistema imunológico resulta em uma ampla variedade de respostas, que variam de funções efetoras . como citotoxicidade dependente de anticorpo, desgranulação de 5 mastócitos, e fagocitose a sinais imunomoduladores como regulação de proliferação de linfõcitos e secreção de anticorpos. Todas essas interações são iniciadas através da ”ligação do domínio Fc de anticorpos ou complexos imunes a receptores Fc, que são receptores de superfície celular 10 especializados em células hematopoiéticas. A diversidade de respostas celulares ativadas por anticorpos e complexos imunes resulta da heterogeneidade estrutural de receptores Fc. Os receptores Fc compartilham domínios de ligação de ligante estruturalmente relacionados que presumidamente mediam a sinalização intracelular.

Os receptores Fc, elementos da superfamília de gene de imunoglobulina de proteínas, são glicoproteínas de superfície que podem ligar a porção Fc de moléculas de imunoglobulina. Cada elemento da família reconhece as imunoglobulinas de um ou mais i so tipos através de um domínio de reconhecimento na cadeia α do receptor Fc. Os receptores Fc são definidos por sua especificidade de subtipos de imunoglobulina. Os receptores Fc de igG são referidos como FcyR, para IgE como FeR, e para IgA como FcoíR . Células 25 suplementares diferentes contêm receptores Fc para anticorpos de isotipo diferente, e o isotipo do anticorpo determina quais células suplementares serão empregadas em uma determinada resposta (Billadeau et al. (2 002) J. Clin. Investigat. 2(109):161-81,- Gerber et al. (2001) Microbes „30 Infection 3 :131-1-39 Ravetch ...et-_—(200.1)-.. Rev.

Immunol. 19:275-90,- Ravetch et al. (2000) Science 290:8,4-89;

Ravetch (1994) Cell 78(4):553-560; Ravetch et al. (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492; veja também. Immunobiology:

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The Immune System in Health and Disease (4th ed. 1999), Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New York). Um sumário de vários receptores é apresentado na Tabela 1.

TABELA 1 Receptores	das regiões Fc de isotipos de Imunoglobulina
Receptor	Ligação	Tipo de Célula	Efeito de Ligação
FcCRI (CD64)	IgGl 108 M-l	Macrófagos Neutrôfilos Eosinófilos Células dendríticas	Absorção Estimulação Ativação de explosão respiratória indução de morte
FcDRII-A (CD32)	IgGl 2 x 106 M-l	Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos Células dendríticas Plaquetas Células de Langerhan	Absorção Liberação de Grânulos
FcDRII-Bl (CD32)	IgGl 2 x 106 M-l	Células B Mastócitos	Sem absorção Inibição de Estimulação _
FcüRII-B2 (CD32)	igGi 2 x 106 M-l	Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos	Absorção Inibição de Estimulação
FcDRIII (CD16)	IgGl 5 x 105 M-l	Células NK Eosinófilos Macrófagos Neutrófilos Mastócitos	Indução de morte
FcQRI	IgE 1010 ΜΙ	Mastócitos Eosinófilos Basófilos	Secreção de grânulos
FcaRI (CD89)	igAi, IgA2 107 M-l	Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos	Absorção Indução de morte

Cada receptor Fcy (FcyR) ê uma glicoproteína de membrana integral que possui domínios extracelulares relacionados a um conjunto C2 de domínios relacionados â imunoglobulina, um único domínio que atravessa a membrana e - um domínio” intrãcitoplasmáticcT de'^-'comprimento variável . Há quatro FcyRs, designados FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII 10 (CD 16), e FcyRIV. Os receptores são codificados por genes

10/124 diferentes; entretanto, a homologia extensiva entre os elementos da família sugere que esses surgiram de um progenitor comum talvez por duplicação genética.

Tanto sinais de ativação quanto inibidores são 5 transduzidos através dos FcyRs após a ligação. Essas funções diametralmente opostas AM de diferenças estruturais entre as isoformas de receptor diferentes. Dois domínios diferentes - -dentro dos domínios de sinalização citoplasmãtica do receptor denominados motivos de ativação baseados em imunorreceptor 10 composto por tirosina (itams) ou motivos inibidores baseados em imunorreceptor composto por tirosina (ITIMS) levam em consideração as diferentes respostas. O recrutamento de enzimas citoplasmáticas diferentes dessa estrutura dita·, o resultado das respostas celulares mediadas por FcyR. ;'0s 15 complexos FcyR contendo ITAM incluem FcyRl, FcyRIIA, FcyRIIIA, e FcyRIV, enquanto os complexos contendo ITIM incluem apenas FcyRIIB.

FcyRl exibe alta afinidade com a região constante de anticorpo e especificidade de isotipo restrita (Hulett and 20 Hogarth (1994) Adv Immunol 57:1-127). As proteínas FcyRII são glicoproteínas de membrana integral de 4 0 KDa que ' se ligam apenas ao igG complexado devido a uma baixa afinidade com Ig monomérico (106 M-I) . Esse receptor ê o FcyR mais amplamente expresso, presente sobre as células hematopoiéticas, 25 inclusive monócitos, macrófagos, células B, células NK, neutrófilos, mastócitos, e plaquetas. FcyRIs I possui apenas duas regiões similares à imunoglobulina em sua cadeia de ligação de imunoglobulina e, consequentemente, uma afinidade muito menor com IgG do que FcyRl . Há três genes FcyRII 30 humanos conhecidos (FcyRII-A, FcyRI_I_-B,_ .FcyRlI-Ch, sendo que todos se ligam a IgG em complexos agregados ou imunológicos. Os neutrófilos humanos expressam o gene FcyRIIA. 0 gene FcyRIIB é expresso em linfócitos B; seu domínio extracelular

11/124 é 96^ idêntico a FcyRIIA e liga os complexos IgG de maneira indistinguível.

Diferenças distintas dentro dos domínios citoplasmáticos de FcyRII-A e FcyRII-B criam duas respostas funcionalmente heterogêneas à ligação de receptor. A isoforma FcyRII-A inicia a sinalização intracelular resultando na ativação celular como fagocitose e explosão respiratória, enquanto a isoforma FcyRII-B inicia sinais inibidores, por exemplo, inibindo a ativação de célula Β. O agrupamento de FcyRIIA através de complexos imunológicos ou reticulação de anticorpo específico serve para agregar ITAMs conjuntamente com quinases associadas a receptor que facilitam a fosforilação de ITAM. A fosforilação de ITAM serve como um sítio de suporte de quinase Syk, cuja ativação resulta na ativação de substratos a jusante (por exemplo, PI3K>.* A ativação celular resulta na liberação de mediadores próinf lamatórios. Quando co-ligado ou co-agregado conjuntamente com um FcyR de ativação que possui um ITAM, tal como FcyRIIA ou FctRI, o ITIM em FcyRlIB se torna fosforiladó e recruta o domínio SH2 da inositol fosfatase contendo homologia src 2 (SHIP) , que, por sua vez, é fosforilada e se associa a She (Ott (2002) J. Immunol. 162(9) : 4430-4439; Yamanshi et al. (1997) Cell 88:205; Carpino et al. (1997) Cell 88:197). SHIP hidrolisa os mensageiros de fosfoinositol liberados como uma consequência de ativação de tirosina quinase mediada por FcyR contendo ITAM, consequentemente impedindo o influxo de Ca++ intracelular, e suavizando a capacidade de resposta celular à ligação de FcyR. Dessa maneira, a ativação de célula B, proliferação de célula B e secreção de anticorpo sao abortadas, e a fagocitose mediada por infra-regulada (Tridandapani et al. (2002) J. Biol. Ghent. 277 (7) :5082-89) .

Especificamente, a co-agregação de FcyRIIA com FcyRlIB resulta na infra-regulação de fosforilação de Akt,

12/124 gue é uma serina- treonina quinase que estã envolvida na regulação celular e serve para suprimir a apoptose, e a coagregação de FcyRIIB com o receptor FccRI de IgE de alta afinidade em mastócitos resulta na inibição de desgranulação 5 induzida por antígeno, mobilização de cálcio, e produção dé citocina (Long (1999) Annu Rev. Immunol 17:875; Metcalfe et al. (1997) Physiol. Rev. 77:1033). A co-agregação de FcyRIIB e do receptor de célula B (BCR) resulta na inibição de sinalização mediada por BCR, e inibição de progressão de 10 ciclo celular e sobrevivência celular. Embora inúmeras funções efetoras da inibição mediada por FcyRIIB de sinalização de BCR. sejam mediadas através de SHIP, recentemente foi demonstrado que as células B ativadas por lipopolissacarídeo (LPS) de camundongos deficientes SHIP 15 exibem inibição mediada por FcyRIIB significativa de mobilização de cálcio, produção de ins (1-, 4,5) P3, e fosforilação de Erk e Akt (Brauweiler et al. (2001) Journal of Immunology 167 (1) : 204-211) .

O tamanho de FcyRIII varia entre 40 e 80 kDa em 20 camundongos e seres humanos, devido à heterogeneidade dentro dessa classe. Dois seres humanos codificam duas transcrições, FcyRIIIA, uma glicoproteína de membrana integral, e FcyRIIIB, uma versão ligada a glicosilfosfatidil-inositol (GPI). Um gene de murino codifica um FcyRIII homólogo ao FcyRIIIA 25 humano que atravessa a membrana. O FcyRIII compartilha características estruturais com cada um dos outros dois FcyRs. Conforme FcyRII, FcyRIII se liga a IgG com baixa afinidade e contém os dois domínios similares a Ig extracelulares correspondentes. FcyRIIIA é expresso em macrófagos, mastócitos, e o único FcyR lulas NK. O ’FcyRIIIB ligado a GPI é atualmente conhecido para ser expresso apenas em neutrófilos humanos.

FcyRlV (também conhecido como mFcRIV) requer a

13/124 associação da cadeia gama FcR para expressão e função ótimas em células mieloides; seu potencial de sinalização também é aumentado por um motivo YEEP citoplasmático que recruta a molécula adaptadora Crk-L e fosfatidilinositol-3- OH quinase.

FcyRIV se liga, de preferência, a anticorpos E de imunoglobulina do alótipo b (IgEb) bem como anticorpos lgG2a e IgG2b. A ligação de FcyRIV por complexos imunes antígenoIgEb promove a fagocitose mediada por macrófagos, apresentação de antígeno às células T, produção de citocinas 10 pró-inflamatórias e a fase posterior de reações alérgicas cutâneas (Hirano et al. (2007) Nature Immunology 8:762-771). FcyRIV é um receptor recentemente identificado, conservado em todas as espécies de mamíferos com afinidade intermediária e especificidade de subclasse restrita (Nimmerjahn et al.

(2005) Immunity 23:41-51; Mechetina et al. (2002)

- Immunogenetics 54:463-468; Davis et al. (2002) Immunol Rev 190:23-36). FcRIII e FcRIV são FcRs de ativação fisiologicamente importantes para mediar a doença inflamatória ativada por anticorpos citotóxicos ou complexos 20 imunes patogênicos. FcRIV é encontrado em células dendríticas, macrófagos, monócitos e neutrófilos.

Apesar de todos os avanços, ainda há a necessidade de anticorpos anti-HER2/NEU que propiciem uso terapêutico no tratamento de auto-imunidade, câncer, doença inflamatória, 2 5 e/ou transplante, e exibam capacidade aprimorada para mediar a função efetora dos receptores Fc. A presente invenção está volta para essas e outras necessidades.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO:

As realizações da invenção apresentam vários 3 0 polipeptídeos, por exemplo, um polipeptídeo que compreende um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, um polipeptídeo que compreende uma cadeia leve de imunoglobulina que possui a

14/124 sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, e um polipeptídeo que compreende uma cadeia leve de imunoglobulina 4D5 quimérica e substituição de N65S. Outras realizações fornecem um polipeptídeo que compreende uma cadeia pesada de 5 imunoglobulina que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, um polipeptídeo que compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina que possui uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 13, e um polipeptídeo que 10 compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina 4D5 que compreende várias substituições.

Os polipeptídeos podem ser anticorpos, e podem se ligar especificamente a HER2/NEU humano. Os polipeptídeos e anticorpos podem compreender um domínio Fc variante, que 15 compreende uma ou mais modificações, que podem conferir uma alteração de fenótipo ao polipeptídeo ou anticorpo, inclusive função efetora alterada, ligação aumentada ou reduzida a um FcyR, etc. As realizações da invenção também fornecem polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos e anticorpos, 20 vetores que compreendem os polinucleotídeos, e células hospedeiras que compreendem ps vetores. Métodos de produção dos polipeptídeos e anticorpos, bem como método de tratamento de várias doenças e distúrbios, também são fornecidos.

Particularmente, a invenção apresenta um 2 5 polipeptídeo que compreende uma cadeia leve de imunoglobulina 4D5 quimérica que compreende uma substituição N65S, e particularmen te as realizações de tal polipeptídeo em. que o polipeptídeo compreende um domínio variável de cadeia . leve que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou da 30 SEQ ID NO: 2. _ --·’**' - A invenção refere-se particularmente às realizações de tais polipeptídeos em que o polipeptídeo é um anticorpo, e mais particularmente, um anticorpo que compreende um domínio

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Fc variante que possui pelo menos uma modificação no domínio Fc. A invenção refere-se particularmente às realizações em que a modificação compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste em L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I, e P396L.

A- invenção refere-se adicionalmente às realizações de tais anticorpos em que a modificação no domínio Fc compreende:

(A) pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste em F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V, e P396L;

(B) pelo menos duas substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em F243L e P396L; F243L e R292P; e R292P e V305I;

(C) pelo menos três substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em F243L, R292P e Y300L; F243L, R292P e V305I; F243L, R292P e P396L; e R292P, V3051 e P396L; ou (D) pelo menos quatro substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em F243L, R292P, Y300L e P396L; e F243L, R292P, V305I e P396L; e mais particularmente se refere a anticorpos em que a modificação no domínio Fc compreende:

(1} F243L, R292P, e Y300L·;

(2) L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L; ou (3) F243L, R292P, Y300L, V305I, e P396L.

A invenção refere-se adicionalmente às realizações de tais anticorpos em que o domínio Fc variante exibe, quando comparado com um domínio Fc de ocorrência natural:

(A) citotoxicidade^mediada por célula_dependen£e de anticorpo aumentada (ADCC);

(B) ligação aumentada a FcyRlIA ou a FcyRlIIA;

(C) ligação reduzida a FcyRIIB; ou

16/124 (D) ligação aumentada a FcyRIIB.

A invenção refere-se adicionaltnente a um polipeptrdeo que compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende um domínio variável que possui 5 uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 13.

A invenção refere-se adicionalmente a um polipeptrdeo que compreende uma -cadeia pesada de imunoglobulina 4D5 que compreende:

10	(A)	pelo	menos uma substituição	selecionada a
	partir do grupo que	consiste em: F243L, D270E,	R292P, S298N,
	Y300L, V305I,	A33 0V	e P396L;
	(B)	pelo	menos duas substituições	selecionadas a
	partir do grupo que	consiste em:
15.	(1)	F243L	e P396L·;
	(2)	F243L	e R292P; e
	(3)	R292P	e V305I;
	(C)	pelo	menos três substituições	selecionadas a
	partir do grupo que	consiste em:
20	(1)	F243L,	R292P e Y300L;
	(2)	F243L,	R292P e V305I;
	(3)	F243L,	R292P e P396L; e
	(4)	R292P,	V305I e P396L;
	(D)	pelo i	nenos quatro substituições	selecionadas a
25	partir do grupo que	consiste em:
5	(1)	F243L,	R292.P, Y300L e P396L; e
	(2)	F243L,	R292P, V305I e P396L; ou
	(E)	pelo	menos substituições F243L,	R292P, Y300L,

V305I e P396.

A invenção refere-se adicionalmente à provisão de tal polipeptídeo em que o polipeptídeo é um anticorpo.

A invenção refere-se adicionalmente à provisão dos anticorpos descritos acima, em que o anticorpo compreende

17/124 adicionalmente uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende um domínio variável que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, OU SEQ ID NO: 13.

A invenção refere-se adicionalmente ã provisão dos anticorpos descritos acima, em que o anticorpo compreende:

(A) pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste em: F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V e P396L;

(B) pelo menos duas substituições selecionadasa partir do grupo que consisteem:

(1) F243L e P396L,- (2) F243L e R292P;e (3) R292P e V305I;

(C) pelo menos três substituições selecionadasa partir do grupo que consiste em:

(1) F243L, R292P e Y300L;

(2) F243L, R292P e V305I;

(3) F243L, R292P e P396L; e (4) R292P, V305I e P396L;

(D) pelo menos quatro substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em:

(1) F243L, R292P, Y300L e P396L; e (2) F243L, R292P, V305I e P396L; ou (E) pelo menos substituições F243L, R292P, Y300L,

V305I e P396.

A invenção refere-se adicionalmente à provisão dos anticorpos descritos, acima em que a cadeia leve de imunoglobulina compreende um domínio variável que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID_NQ: 4 e a cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 OU SEQ ID NO:13.

A invenção refere-se adicionalmente ã provisão dos

18/124 anticorpos descritos acima em que o anticorpo é um fragmento F(ab')2, um fragmento F(ab), um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo monoclonal ou um anticorpo bivalente.

A invenção refere-se adicionalmente ao uso dos anticorpos descritos acima na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer em um paciente, e particularmente, em que o câncer é um câncer de expressão de HER2/NEU e em .que o anticorpo se liga a HER2/NEU humano.

A invenção refere-se adicionalmente a um método de tratamento de câncer, o qual compreende a administração, a um paciente com necessitade do mesmo, de uma quantidade eficaz dos anticorpos descritos acima, e particularmente, em que o câncer é um câncer de expressão de HER2/NEU e em que> o anticorpo se liga a HER2/NEU humano.

A invenção refere-se adicionalmente ao uso de tais anticorpos em que o tratamento compreende adicionalmente a etapa de administrar um segundo agente terapêutico simultânea ou sequencialmente com o anticorpo, em que o segundo agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em um agente anti-angiogênico, um agente anti-neoplásico, um agente quimioterãpico, e um agente citotóxico.

Vantagens e características adicionais da presente invenção tornar-se-ão óbvias a partir da seguinte descrição detalhada, desenhos e exemplos, que ilustram as realizações preferidas da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra um alinhamento de sequência que compara as sequências da região variável de cadeia leve de um anticorpo 4D5 quimérico de uma realização preferida (SEQ ID NO: 4) com anticorpos 4D5 de murinos (SEQ ID NO: 3) e humanizados {SEQ ID NO; 5).

A Figura 2 mostra uma comparação entre as sequências das cadeias pesadas de Fc (WT) de ocorrência

19/124 natural ch4D5 (SEQ ID NO: 7), ch4D5-FcMTl (MTl) (SEQ ID NO: 9), ch4D5-FcMT2 (MT2) (SEQ ID NO: 11), e Ch4D5-FcMT3 (MT3) {SEQ ID NO: 13). As CDRs são indicadas com barras pretas mostradas abaixo dos resíduos pertinentes.

A Figura 3 mostra uma análise BIACore de ligação de Fc de ocorrência natural ch4D5 {painel A), ch4D5 {painel B) e trastuzumab (painel C).

,A Figura 4 mostra o efeito de ch4D5 sobre a proliferação de células SKB R3 in vitro.

A Figura 5 mostra a atividade antitumoral aumentada de vários anticorpos das presentes realizações em camundongos não-transgênicos.

A Figura 6 mostra a atividade antitumoral aumentada de vários anticorpos das presentes realizações em camundongos transgênicos hCD16A.

A Figura 7 mostra a função de tnFcRIV e hCD16A em inibição de crescimento tumoral por vários anticorpos das presentes realizações em camundongos nao-transgênicos e transgênicos.

A Figura 8 mostra a atividade antitumoral aumentada de vários anticorpos das presentes realizações em camundongos transgênicos hCD16A.

A Figura 9 ilustra marcações imunoistoquímicas representativas de células de várias linhagens de células cancerosas para HER2/NEU. Os vários painéis representam as diferentes linhagens celulares, ou seja. Painel A: MDA-MB435; Painel B:. MDA-MB-231; Painel C: A549; Painel D: OVCAR-â; Painel E: MCF-7; Painel F: BT-20; Painel G: HT-29; Painel H: ZR75-1; Painel I: JIMT-I; Painel J: MDA-MB-4S3; Painel K; BT474 ; Painel L: SKBR-3; e Paine 1_M ymSKOV-3 . .

A Figura 10 mostra os resultados de ensaios ADCC realizados para testar a capacidade de vários anticorpos ch4D5 das presentes realizações mediarem ADCC em linhagens de

20/124 células cancerosas (MDA-MB-435 no Painel A; MDA-MB-231 no Painel B) que possuem níveis de expressão de HER2/NEU muito baixos ou nenhum (pontuação DAKO de 0).

A Figura 11 mostra os resultados de ensaios ADCC 5 realizados para testar a capacidade de vários anticorpos ch4D5 das presentes realizações mediarem ADCC em linhagens de células cancerosas (A549 no Painel A; OVCAR-8 no Painel B;

_ MCF-7 no Painel C; BT-20 no Painel D; HT-29 no Painel E) que possuem baixos níveis de expressão de HER2/NEU (pontuação 10 DAKO de 1+).

A Figura 12 mostra os resultados de ensaios ADCC realizados para testar a capacidade de vários anticorpos ch4D5 das presentes realizações mediarem ADCC em linhagens· de células cancerosas (ZR75-1 no Painel A; JIMT-I no Painel B) 15 que possuem níveis de expressão de HER2/NEU moderados (pontuação DAKO de 2+).

A Figura 13 mostra os resultados de ensaios ADCC realizados para testar a capacidade de vários anticorpos ch4D5 das presentes realizações mediarem ADCC em linhagens de 20 células cancerosas (MD A-MB-453 no Painel A; BT-474 no Painel B; SKBR-3 no Painel C; mSKOV-3 no Painel D) que possuem altos níveis de expressão de HER2/NEU (pontuação DAKO de 3 + ) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção apresenta novos anticorpos e 25 métodos para o tratamento, diagnóstico e prognóstico de alguns cânceres utilizando anticorpos contra HER2/NEU. Em partia presente invenção apresenta anticorpos antiHER2/NEU, que são particularmente úteis . como .agentes citotóxicos seletivos de células de superexpressão de 3 0 HER2/NEU, por exemplo, anticorpos 4 D5 quiméricos,,.^contra HER2/NEU, que possuem glicosilação reduzida e funções efetoras alteradas quando comparados com anticorpos 4D5 conhecidos. A invenção também apresenta métodos de utilização

21/124 dos anticorpos e composições que compreendem os mesmos no diagnóstico, prognóstico e terapia de doenças como câncer, doenças auto-imunes, doenças inflamatórias, e doença infecciosa.

Será feita agora referência em detalhes às realizações atualmente preferidas da invenção, as quais, conjuntamente com os desenhos e os seguintes exemplos, servem para explicar os princípios da invenção. -Essas realizações são descritas em detalhes suficientes para permitir que os 10 elementos versados na técnica pratiquem a invenção, e deve ser entendido que outras realizações podem ser utilizadas, e que alterações estruturais, biológicas, e químicas podem ser feitas sem que se abandone o caráter e âmbito da presente invenção. Exceto onde definido em contrário, todos os termos 15 técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado comumente entendido por um elemento versado na técnica ao qual essa invenção pertence. Um elemento versado na técnica pode se referir a textos de referência geral para tais definições ou para descrições detalhadas de técnicas 20 discutidas aqui. Esses textos incluem Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. , eds., John Wiley & Sons, and supplements through March 2008), Molecular Cloning: A Laboratory Manual {Sambrook and Russell, 3rd ed. , 2001);

Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual (Selvin & Ha, 25 eds., Cold Spring Harbor Press, 2008); Current Protocols in Nucleic acid Chemistry (Beaucage et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 2000); Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds., John Wiley & Sons, N. . Y.,. .and supplements through March 2008), Making and Using Antibodies: A Practical 30 Handbook (Howard & Kaser, eds.., CRC,_2006B Using^ Antibodies.:.,,.. ^; A Laboratory Manual'(Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Press,

1999); Binding and Kinetics for Molecular Biologists (Goodrich & Kugel, Cold Spring Harbor Press, 2007); Current

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Protocols in Pharmacology (Enna et al., eds . , John Wiley & Sons, N. Y., and supplements through March 2008), The Pharmacological Basis of Therapeutics (Goodman &. Gilman, 11th ed. , 2006) , and Remington: The Science and Practice of

Pharmacy (Lippincott Williams & Wilkins, 21st edition ¢2005}, por exemplo.

a. Definições

Tal como aqui empregado, o termo ADCC refere-se à Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo, uma reação 10 mediada por célula in vitro em que as células citotóxicas não-específicas que expressam FcyRs (por exemplo, células monocíticas como células destruidoras naturais (NK) e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado sobre uma célula alvo e subsequentemente causam lise da célula alvo.

Tal como aqui empregado, o termo anticorpo refere-se a anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos sintéticos, anticorpos quiméricos, anticorpos policlonais., anticorpos camelizados, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, fragmentos de anticorpo imunologicamente ativos (por exemplo, fragmentos de anticorpo capazes de se ligarem a um epítopo, por exemplo, fragmentos Fah, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos contendo um domínio VL· ou VH ou uma região 25 determinante complementar (CDR) que se liga de maneira imunoespecífica a um antígeno, etc.), anticorpos bifuncionais ou multifuncionais, Fvs biespecíficos ligados a dissulfeto (sdFv), anticorpos intracelulares, e anticorpos bivalentes, e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um desses. Em 30 particular, o termo anticorpos__pretende incluir .moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologic amente ativos de moléculas de imunoglobulina, ou seja, moléculas que contêm um sítio de ligação a antígeno. As moléculas de imunoglobulina

23/124 podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, igE, igM, IgD, IgA e igY) , classe (por exemplo, igGj, lgG₂, lgG₃, lgG₄, igAi e IgA₂) ou subclasse (Vide, por exemplo, Publicação de Patente norte-americana Nos.: 20040185045; 20050037000; 20050064514;. 20050215767; 20070004909; 20070036799; 20070077246; e 20070244303).

A referência a um receptor de antígeno de células B ou BCR é destinada, à referência ao receptor de antígeno de células B, que inclui um componente de ligação ao antígeno de imunoglobulina de membrana (mlg), ou uma porção biologicamente ativa desse (ou seja, uma porção capaz de se ligar a um ligante e/ou capaz de se associar com um componente transdutor) , e componentes transdutores CD7 9á e CD79b, ou porções biologicamente ativas desses (ou seja, uma porção capaz de transduzir um sinal intracelular e/ou capaz d_{e se} associar com uma porção de ligação a ligante extracelular).

Tal como aqui empregado, o termo câncer refere-se a um neoplasmo ou tumor resultante de crescimento descontrolado anormal de células. Tal como aqui empregado, câncer inclui, explicitamente, leucemias e linfornas. Em algumas realizações, câncer se refere a um tumor benigno, que permaneceu localizado. Em outras realizações, câncer se refere a um tumor maligno, que invadiu e destruiu estruturas de corpo adjacentes e se espalhou para sítios distantes. Em algumas realizações, o câncer está associado a um antígeno de câncer específico.

Os termos doença proliferativacelular e doença proliferativa referem-se a doenças que estão associadas a algum grau de proliferação celular- anormal;.-Em.-^unia realização, a doença proliferativa celular é câncer.

O termo quimérico, quando se refere a anticorpos, refere-se a um anticorpo em que uma porção de uma cadeia

24/124 pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a um anticorpo de uma espécie (por exemplo, camundongo) ou classe ou subclasse de anticorpo, enquanto a porção restante é idêntica ou homóloga a um anticorpo de outra espécie (por exemplo, humano) ou 5 classe ou subclasse de anticorpo, desde que essas exibam a atividade biológica desejada. Os anticorpos quiméricos de interesse neste caso incluem anticorpos primatizados que compreendem, sequências de ligação a antígeno de domínio variável derivadas de um primata não-humano (por exemplo, Old 10 World Monkey, Ape, etc.) e sequências de região constante humanas.

Tal como aqui empregado, o termo Região Determinante de Complementaridade ou CDR refere-se aos resíduos de aminoácido de um domínio variável de anticorpo 15 que são necessários para a ligação ao antígeno. Cada domínio variável tipicamente possui três regiões CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3.

Tal como aqui empregado, o termo molécula de anticorpo bivalente refere-se a um complexo de duas ou mais 2 0 cadeias de polipeptídeos ou proteínas, cada uma das quais compreende pelo menos um domínio VL e VH ou fragmento desses, em que ambos os domínios estão compreendidos dentro de uma única cadeia de polipeptídeo. Em algumas realizações uma molécula de anticorpo bivalente inclui moléculas que 25 compreendem um Fc ou um Fc de domínio-dobradiça. As ditas cadeias de polipeptídeo no complexo podem ser iguais ou diferentes, ou seja, a molécula de anticorpo bivalente pode ser um homo-multimero ou um hetero-multímero. Em - aspectos específicos, uma molécula de anticorpo bivalente inclui 30 dímeros ou tetrâmeros ou as_ ditas ^^cadeias-. .de^^-pplipeptídeo contendo tanto um domínio VL quanto VH. As cadeias de polipeptídeo individuais que compreendem as proteínas multiméricas podem ser covalentemente ligadas a pelo menos um

25/124 outro peptídeo do multímero por ligações dissulfeto entre cadeias.

Tal como aqui empregado, os termos distúrbio e doença são utilizados de maneira intercambiãvel para se referir a uma condição em um indivíduo. Em particular, o termo doença auto-imune é utilizado de maneira intercambiãvel com o termo distúrbio auto-imune para se referir a uma condição em um indivíduo caracterizada por lesão celular, de tecido e/ou órgão causada por uma reação imunológica do indivíduo em suas próprias células, tecidos e/ou órgãos. O termo doença inflamatória é utilizado de maneira intercambiãvel com o termo distúrbio inflamatório para se referir a uma condição em um indivíduo caracterizada por inflamação, de preferência, inflamação crônica. Os distúrbios auto-imunes podem ou não estar associados com inflamação. Ademais, a inflamação pode ou não ser causada por um distúrbio auto-imune. Dessa maneira, alguns distúrbios podem ser caracterizados como distúrbios auto-imunes e inflamatórios.

O termo célula efetora tal como aqui empregado, refere-se a uma célula do sistema imunológico que expressa um ou mais receptores Fc e media uma ou mais funções efetoras. As células efetoras incluem, porém sem caráter limitativo, monócitos, macrófagos, neutrõfilos, células dendríticas, eosinófilos, mastócitos, plaquetas, células B, grandes linfócitos granulares, células de Langerhans, células destruidoras naturais (NK), e podem ser de qualquer organismo inclusive, porém sem caráter limitativo, humanos, camundongos, ratos, coelhos, e macacos.

O termo célula efetora ..refere-se a. atividades biológicas atribuíveis ã interação de uma região Fc de anticorpo com um receptor Fc ou ligante. Um anticorpo pode possuir uma ou mais funções efetoras. Os exemplos nao26/124 limitadores de funções efetoras de anticorpo incluem a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), ligação Clq, a citotoxicidade dependente de complemento (CDC), a infra-regulação de receptores de 5 superfície celular (por exemplo, receptor de células B; BCR) , a opsonização, a opsonofagocitose, a ligação celular, e o rpsetamento. As funções efetoras incluem aquelas que operam .. após a ligação de um antígeno e aquelas que operam independentemente de ligação de antígeno.

Tal como aqui empregado, o termo epítopo se refere àquela porção de um polipeptídeo ou proteína ou uma molécula não-proteica que é imunoespecificamente ligada por um anticorpo. Um epítopo pode possuir atividade imunogênica, de modo que esse produza uma resposta de produção de 15 anticorpo em um animal. A capacidade de um epítopo se ligar imunoespecificamente a um anticorpo pode ser determinada, por exemplo, por um imunoensaio. Os epítopos não precisam ser necessariamente imunogênicos.

Os termos receptor Fc ou FcR são utilizados 2 0 neste caso para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Um FcR exemplificative é um FcR humano de sequência nativa. Um FcR pode ser um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, FcyRIII_f ,e FcyRIV, inclusive 25 variantes alélicas e formas alternativamente unidas desses receptores, por exemplo, há pelo menos dois receptores FcyRII conhecidos, FcyRIIA e FcyRIIB. O termo FcR também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de igGs maternos para o feto.

0 Tal como anui empregado, . o, ternio ¹¹ região. Fc é utilizado para definir uma região c-terminal de uma cadeia pesada de IgG. Embora os limites possam variar um pouco, a região Fc de cadeia pesada IgG humana é definida para se

27/124 estender a partir de Cys226 até a terminação carboxi. A região Fc de IgG compreende dois domínios constantes, Cn₂ e Chs . 0 domínio Ch2 de uma região Fc IgG humana (também referido como domínio 0γ2) geralmente se estende a partir do aminoácido 231 até o aminoácido 338, e o domínio C_Hj de uma região Fc IgG humana geralmente se estende a partir dos aminoácidos 342 a 447.

O termo sítio de glicosilação refere-se a um resíduo ou resíduos de aminoácido que são reconhecidos por uma célula de mamífero como um local para a fixaçao de resíduos de açúcar. Os resíduos de aminoácidos aos quais carboidratos, tal como oligossacarídeos, são fixados são geralmente resíduos de asparagina (ligação N) , seriría (ligação O) , e treonina (ligação O) . Os sítios específicos de fixação geralmente possuem uma sequência característica de aminoácidos, referida como uma sequência de sítio de glicosilação. A sequência de sítio de glicosilação de glicosilação ligada a N é: Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer um dos aminoácidos convencionais exceto prolina. A região Fc. de IgG humana possui dois sítios de glicosilação ligados a N, um em cada domínio C_H2, na asparagina na posição 297 (Asn 297).

Tal como aqui empregado, o termo resposta a HAMA refere-se à resposta ao Anticorpo Anti-Camundongo Humano, que é uma resposta imunogênica deletéria que ocorre quando um sistema imunológico humano reconhece um anticorpo de murino como estranho e ataca o mesmo. Uma resposta HAMA pode causar choque tóxico ou morte. Os anticorpos quiméricos e humanizados reduzem a probabilidade de uma resposta HAMA reduzindo as porções não-humanas de anticorpos administrados, .--porém ainda ' há potencial ’para uma resposta imunológica de resposta ao Anticorpo Anti-Humano Humano (resposta HAHA ) a tais anticorpos.

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Os termos cadeia pesada, cadeia leve. (CL), região variável de .cadeia leve (VL), região variável de cadeia pesada (VH), região de moldura (FR), domínio constante de cadeia pesada (CH), domínio constante de 5 cadeia leve (CL·) referem-se a domínios em imunoglobulinas de ocorrência natural e os domínios correspondentes de proteínas de ligação sintéticas (por exemplo, recombinantes) (por exemplo, anticorpos humanizados). A unidade estrutural básica de imunoglobulinas de ocorrência natural (por exemplo, 10 igG) é um tetrâmero que possui duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Geralmente, a imunoglobulina de ocorrência natural é expressa como uma glicoproteína de aproximadamente 150 KDa, embora IgG também possa ser produzida em uma forma não-glicosilada. A porção amino-terminal (N) de cada cadeia 15 inclui uma região variável de aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. A porção carbóxi- terminal ( C ) de cada cadeia define uma região constante, com as cadeias leves possuindo um único domínio constante e as cadeias 20 pesadas geralmente possuindo três domínios constantes e uma região de dobradiça. Dessa maneira, a estrutura das cadeias leves de uma molécula IgG de ocorrência natural é N-VL-CL-C e a estrutura de cadeias pesadas de IgG é N-VH-CH1-H-CH2-CH3-C (onde H é a região de dobradiça) . As regiões variáveis de uma 25 molécula de IgG consistem nas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que contêm os resíduos em contato com o antígeno e segmentos não-CDR, referidos como segmentos de moldura, que mantêm a estrutura e determinam o posicionamento das alças de CDR. Dessa maneira, os domínios 30 VL e VH possuem a estrutura N-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4Tal como aqui empregado, o termo ácido nucleico heterólogo denota DNA, RNA, etc., que é introduzido em uma

29/124 célula hospedeira. O ácido nucleico pode ser derivado de qualquer uma entre uma variedade de fontes inclusive DNA genômico, mRNA, cDNA, DNA sintético e fusões ou combinações desses. O ácido nucleico pode incluir um polinucleotideo da mesma célula ou tipo celular que a célula hospedeira ou receptora ou um polinucleotídeo de um tipo celular diferente, por exemplo, de um mamífero ou planta, e pode, opcionalmente, incluir genes marcadores ou de seleção, por exemplo, gènes resistentes a antibiótico, genes resistentes a temperatura, etc.

O termo região de dobradiça é geralmente definido como se estendendo de Glu216 a Pro230 de IgGl humana. As regiões de dobradiça de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgGl ao colocar o primeiro e o último resíduos de cisteína que formam ligações S-S entre cadeias pesadas nas mesmas posições.

Tal como aqui empregado, o termo humanizado possui o seu significado normal na técnica. Em termos gerais, a humanização de um anticorpo não-.humano envolve a substituição das sequências CDR de regiões VL e VH de imunoglobulina não-humana em regiões de moldura humanas. Ademais, tal como aqui empregado, anticorpos humanizados podem compreender substituições e mutações adicionais nas regiões CDR e/ou de moldura introduzidas para aumentar a afinidade, ou para outros propósitos. Por exemplo, a substituição de resíduos de moldura não-humanos na sequ^^nci^a humana pode aumentar a afinidade. Os domínios variáveis resultantes possuem sequências CDR não-humanas e sequências de moldura derivadas de sequência(s) de moldura de anticorpo humana(s) ou uma sequência de consensohumana. Uma variedade 'de' regiões“de'moldura humanas diferentes pode ser utilizada individualmente ou em combinação como uma base de um anticorpo humanizado.

30/124

Tal como aqui empregado, o termo agente itnunomodulador e variações desse se refere a um agente que modula um sistema imunológico do hospedeiro. Em algumas realizações, um agente imunomodulador é um agente imunossupressor. Em algumas outras realizações, um agente imunomodulador é um agente imunoestimulante. Os agentes imunomodadores incluem, porém sem caráter limitativo, pequenas moléculas, peptídeos, polipeptídeos, proteínas dé fusão, anticorpos, moléculas inorgânicas, agentes miméticos, e moléculas orgânicas.

Tal como aqui empregado, o termo se liga imunoespecificamente refere-se à ligação específica exibida entre um anticorpo e o epítopo que esse reconhece. Tal ligação irá exibir tipicamente um KD de pelo menos aproximadamente 0,1 mM, mais geralmente, pelo menos aproximadamente .1 μΜ, de preferência, pelo menos aproximadamente 0,1 μΜ ou menos, e com mais preference, 0,01 μΜ ou menos. De preferência, os anticorpos da invenção se ligam imunoespecif icamente a proteínas com alta afinidade (por exemplo, baixo KD).

Um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um antígeno pode se ligar a outros peptídeos ou polipeptídeos com menor afinidade como determinado, por exemplo, por imunoensaios, BIAcore, ou outros ensaios conhecidos no estado da técnica. De preferência, as moléculas que se ligam especificamente a um antígeno não reagem de maneira cruzada com outras proteínas. As moléculas que se ligam especificamente a um antígeno podem ser identificadas, por exemplo, por imunoensaios, BIAcore, ou outras técnicas conhecidas pelos elementos versados na técnica

O . termo- -Antibody Engineering Technology Art tal como aqui empregado refere-se à tecnologia descrita nos Pedido de Patente Provisório Norte-americanos n°. 60/781.564;

31/124

60/945.523; 61/015.106; depositados em 19 de dezembro de 2007, e 61/019.051 depositado em 04 de janeiro de 2008; US 20040185045; US 20040197347; US 20040197866; US 20050037000; US 20050064514; US 20050215767; US 20060134709; US 20060177439; US 20070004909; US 20070036799; US 20070037216; US 20070077246,- US 20070244303; US 20080044429; US 20080050371; 11/869,410; 11/952,568; Patente Norte-americana n°. 7.112.439; WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; ou PCT/US07/86793

O termo anticorpo monoclonal tal como aqui empregado refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores, e o termo anticorpo policlonal tal como aqui empregado se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos heterógenos.. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, dirigidos contra um único epítopo. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais sao vantajosos pelo fato de que esses podem, ser sintetizados sem contaminação por outros anticorpos. O termo monoclonal indica o caráter dos anticorpos como obtidos a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e nao deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular.

Tal como aqui empregado, os termos ácidos nucleicos e sequências de nucleotídeo incluem moléculas de dna (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) , moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) , combinações de moléculas de DNA e RNA ou moléculas de^DNA/RNA-híbridas, e análogos de moléculas de DNA ou RNA. Tais análogos podem ser gerados utilizando, por exemplo, análogos de nucleotídeo, que incluem, porém sem

32/124 caráter limitative, inosina ou bases tritiladas. Tais análogos também podem compreender moléculas de DNA ou RNA compreendendo cadeias principais modificadas que emprestam atributos benéficos às moléculas como, por exemplo, resistência a nuclease ou uma capacidade aumentada a membranas celulares cruzadas. Os ácidos nucleicos ou sequências de nucleotídeo podem ser de cadeia simples, cadeia dupla, podem conter tanto porções de cadeia simples como cadeia dupla, e podem conter porções de cadeia tripla, porém, 10 de preferência, DNA de cadeia dupla.

Identidade de sequência substancial, tal como aqui empregado, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências (por exemplo, domínios) que possuem pelo menos aproximadamente 80% de identidade com resíduo de aminoácido, 15 de preferência, pelo menos aproximadamente 90%, ou pelo menos aproximadamente 95% de identidade quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima. A identidade de sequência entre duas sequências similares (por exemplo, regiões variáveis de anticorpo) podem ser medidas por 20 algoritmos como aqueles de Smith & Waterman, 1981, Adv. ApplMath. 2:482 [local homology algorithm], Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443 [homology alignment algorithm], Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 [search for similarity method], ou Altschul et al., 25 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 [BLAST algorithm]. Quando utiliza-se qualquer um dos algoritmos mencionados acima, os parâmetros padrão (para comprimento de janela, penalidade de lacuna, etc.) são utilizados. Diz-se que uma sequência de aminoácido é «substancialmente similar a uma segunda 30 sequência quando o grau de identidade de sequência Jorpelo menos aproximadamente. 70% idêntico,⁷ dê“ preferência, pelo ^'mênos' aproximadamente 80%, ou pelo menos aproximadamente 90%, ou ainda pelo menos aproximadamente 95%, idêntico. Afirma se

33/124 que uma sequência de ácido nucleico ê substancialmente similar a uma segunda sequência quando: (1) o grau de identidade de sequência for pelo menos aproximadamente 70% idêntico, de preferência, pelo menos aproximadamente 80%, ou pelo menos aproximadamente 90%, ou' ainda pelo menos aproximadamente 95%, idêntico, ou a sequência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que é pelo menos aproximadamente 70% idêntico, de preferência, pelo menos aproximadamente 80%, ou pelo menos aproximadamente 9 0%, ou ainda pelo menos aproximadamente 95%, idêntico ao polipeptídeo codificado pela segunda sequência. As sequências que são substancialmente idênticas também são substancialmente similares.

Quando se refere a anticorpos, a atribuição de aminoácidos a cada domínio está de acordo com Kabat, Sequences Of Proteins Of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. , 1987 and 1991), que esta expressamente aqui incorporado a título de referencia. Ao longo do presente relatório descritivo, a numeração dos resíduos em uma cadeia pesada igG é aquela do índice EU como em Kabat, e se refere à numeração do anticorpo EU IgGl hu mano.

B. Anticorpos

A presente invenção inclui particularmente anticorpos quiméricos e polipeptídeos que se ligam especificamente a HER2/NEU, de preferência, HER2/NEU humano. Os anticorpos possuem glicosilação reduzida comparados com anticorpos 4D5 conhecidos como 4D5 de murino e trastuzumab, devido à remoção de' um sítio de glicosilação na região 30 variável da cadeia leve. Em part icular, os_anticorpos.são desprovidos.de-um-sítio de glicosilação na região variável da cadeia leve, que no 4D5 de murino nativo compreende uma sequência N-R-S nas posições 65, 66 e 67. De preferência, os

34/124 anticorpos possuem afinidade de ligação aumentada para

HER2/NEÜ, e, com mais preferência, ps anticorpos possuem função efetora aumentada, comparados com um anticorpo 4D5 nativo.

Os anticorpos compreendem uma cadeia leve de imunoglobulina 4D5 quimérica desprovida de um sítio de glicosilação ligado a N nas posições 65, 66 e 67 da região variável de cadêiã leve. Em uma realização particular, õs anticorpos compreendem uma modificação, de preferência, uma 10 substituição, na posição 65 da região variável da cadeia leve (VL). Em uma realização preferida, os anticorpos compreendem uma cadeia leve codificada pela sequência de ácido nucleicó da SEQ ID NO: 1, ou compreendem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. As sequências de ácido nucleicó e aminoácido de 15 uma cadeia leve preferida da presente invenção são apresentadas abaixo:

Sequência de ácido nucleicó de cadeia leve quimérica (SEQ ID NO: 1):

gacatcgtga Tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc 60 atcacctgca Aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca 120 ggacattctc Ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg Gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagacctgg Cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg 300 ggtaccaagg Tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgegt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gütag ^4 5

Sequência de aminoácido de cadeia leve quimérica (SEQ ID NO: 2) :

DIVMTOSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLTYS ASFRYTGVPD 60 RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFTFPP 120 SDEQBKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD εΤΥδΙ,άάΤΙ,Τ 18 0 LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC _ 214

Esses anticorpos que possuem uma modificação nas posições 65 da região VL são desprovidas de um sítio de glicosilação ligado a N encontrado no anticorpo 4D5 de murino nativo, tal como pode ser observado na Figura 1, que mostra

35/124 uma comparação exemplificativa entre as sequências de aminoácido de região VL de um anticorpo 4D5 quimérico que possui uma modificação N65S (SEQ ID NO; 4) , e os anticorpos 4D5 de murinos nativos (SEQ TD NO: 3) e humanizados (SEQ ID

NO: 5) . Em outra realização preferida, os anticorpos compreendem uma modificação N65S na região VL, e, de preferência, possuem uma sequência de aminoácido de região VL ' da SEQ ID NO: 4. Essas sequências são apresentadas abaixo: A sequência de aminoácido de região VL murina nativa {SEQ ID NO: 3):

DIVMTQSHK F RFTGNRSGT D	MSTSVGDRV ITCKASQDV TAVAWYQQK S N P FTFTISSVQ EDLAVYYCQ HYTTPPTFG A Q G Sequência de aminoácido de	GHSPKLLIY s GTKLEIKRA região VL	ASFRYTGVP 60 D 109 quimérica (SEQ
ID NO: 4)
DIVMTQSHK F RFTGSRSGT D	MSTSVGDRV ITCKASQDV TAVAWYQQK S N P FTFTISSVQ EDLAVYYCQ HYTTPPTFG A Q G Sequência de aminoácido	GHSPKLLIY s GTKVEIKRT de região	ASFRYTGVP 60 D 109 VL humanizada

(SEQ ID NO: 5):

	DIQMTQSPS LSASVGDRV ITCRASQDV TAVAWYQQK GKAPKLLIY ASFLESGVP	60
	S T N P S S RFSGSRSGT FTLTISSLQ EDFATYYCQ HYTTPPTFG GTKVEIKRT D P Q Q	109
15	Em uma realização, a cadeia pesada possui uma
	região Fc de ocorrência natural 4D5 murina, de preferencia,
	codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID	NO: 6,
	ou possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7 sequências são apresentadas abaixo:	Essas
20	Cadeia pesada que possui a sequência de	ácido
	nucleico de região Fc de .ocorrência natural (SEQ ID NO:	6) :
	caggttcag tgcagcagt tggccctga ctggtgaag caggggcct actcaagtt c c g c c g	60
	. tcctgtaca cttctggct. -caacatcaà,. gacacctatj r.tccactggg-. gaaacagag g t a a t g	120
	cctgaacag gcctggaat gattggaag atttatcct ccaatggct tactagata g g g a a t	ieo
	gacccaaag tccaggaca ggccactat acagcagac catcctcca cacagccta t a c a a c	24 0

36/124

ctgcaagtc	gccgcctga	atctgagga	actgccgtc	attactgct	ccggtgggg	300
a	c	c	t	c	a
ggggacggc	tctatgcta	ggactactg	ggtcaggga	cctccgtga	cgtgagctc	360
t	t	g	g	c	c
gcctccacc	agggcccat	ggtcttccc	ctggcaccc	cctccaaga	cacctctgg	420
a	c	c	t	9	9
* ggcacagcg	ccctgggct	cctggtcaa	gactacttc	ccgaaccgg	gacggtgtc	480
g	9	9	c	t	9
tggaactca	gcgccctga	cagcggcgt	cacaccctc	cggctgtcc	acagtcctc	54 0
g	c	g	c	t	a
ggactctac	ccctcagca	cgtggtgac	gtgccctcc	gcagcttgg	cacccagac	600
t	g	c	a	g	c
tacatctgc.	acgtgaatc	caagcccag	aacaccaag	tggacaaga	agttgagcc	660
a	a	c	g	9	c
aaatcttgt	acaaaactc	cacatgccc	ccgtgccca	cacctgaac	cctgggggg	720
9	a	a	g	t	a
ccgtcagcc	tcctcttcc	cccaaaacc	aaggacacC	tcatgatct	ccggacccc	780
t	σ	c	C	c	t
gaggtcaca	gcgtggtgg	ggacgtgag	cacgaagac	ctgaggtca	gttcaactg	840
t	t	c	c	a	9
tacgtggac	gcgtggagg	gcataatgc	aagacaaag	cgcgggagg	gcagtacaa	900
g	t	c	c	a	c
agcacgtac	gtgtggtaa	cgtcctcac	gtcctgcac	aggactggc	gaatggcaa	960
c	g	c	c	t	9
gagtacaag	gcaaggtat	caacaaagc	ctcccagcc	ccatcgaga	aaccatctc	1020
t	c	c	c	a	c
aaagccaaa	ggcagcccc	agaaccaca	gtgtacacc	tgcccccat	ccgggatga	1080
g	g	g	c	c	g
ctgaccaag	accaggtca	cctgacctg	ctggtcaaa	gettetate	cagcgacat	1140
a	g	□	9	c	c
gccgtggag	gggagagca	tgggcagcc	gagaacaac	acaagacca	gcctcccgt	1200
t	a	g	t	c	g
ctggactcc	acggctcct	cttcctcta	agcaagcüc	ccgtggaca	gagcaggtg	1260
g	t	c	a	a	9
cagcagggg	acgtcttct	atgctccgt	atgcatgag	ctctgcaca	ccactacac	1320
a	c	9	g	a	g
cagaagagc	tctccctgt	tccgggtaa	tga			1353

cea

Cadeia pesada possuindo sequência de aminoácido de

região Fe	de ocorrência natural (SEQ	ID NO: 7 )
QVQLQQSGP	LVKPGASLK	SCTASGFNI	DTYIHWVKQ	PEQGLEWIG	IYPTNGYTR	60
Λ E	L	K .	R	R	Y
DPKFQDKAT	TADTSSNTA	LQVSRLTSE	TAVYYCSRW	GDGFYAMDY	.gqgasvtvs	120
I	Y	D	G	W	S
• ASTKGPSVF	LAPSSKSTS	GTAALGCLV	DYFPEPVTV	WNSGALTSG	htfpavlqs	180
P	G	K	S	V .	s
GLYSLSSW	VPSSSLGTQ	YICNVNHKP	NTKVDKRVE	KSCDKTHTC	PCPAPELibG	240
T	T	S	P	P	G
PSVFLFPPK	KDTLMISRT	EVTCVWDV	hedpevkfn	YVDGVEVHN	KTKPREEQY	300
. P	:P	- S · - -	'W -· - - “	=Α- ' ·— -	N·
STYRWSVL	VLHQDWLNG	EYKCKVSNK	LPAPIEKTI	KAKGQPREP	VYTLPPSRD	360
T	K	A	S	Q .	E
LTKNQVSLT	LVKGFYPSD	AVEWESNGQ	ΕΝΝΥΚΤΤΡΡ	LDSDGSFFL	SKbTVDKSR	4^0
C	I	P	V	Y	W

37/124

QQGNVFSCS MHEALHNHY QKSLSLSPG . . 4 50

V T K

Em outras realizações, a cadeia pesada é uma variante de uma cadeia pesada de anticorpo 4D5 de murino, de preferência, que compreende uma região Fc variante, e, com mais preferência, que compreende uma região Fc variante como 5 FcMTl, FcMT2, ou FCMT3. Essas sequências são apresentadas

abaixo:	Cadeia	pesada	que possui sequência de	ácido
nucleico	de região	Fc variante FcMTl	(SEQ TD NO: 8):
caggttcag	tgcagcagt	tggccctga	ctggtgaag	caggggcct	actcaagtt	60
c	c	9	c	c	9
tcctgcaca	cttctggct	çaacatcaa	gacacctat	tccactggg	gaaacagag	120
9	t	a	a	t	g
cctgaacag	gcctggaat	gattggaag	atttatcct	ccaatggct	tactagata	180
9	g	g	a	a	t
gacccaaag	tccaggaca	ggccactat	acagcagac	catcctcca	cacagccta	240
t	a	c	a	a	c
ctgcaagtc	gccgcctga	atctgagga	actgccgtc	attactgct	ccggtgggg	300
a	c	c	t	c	a
ggggacggc	tctatgcta	ggactactg	ggtcaggga	cctccgtga	cgtgagctc	360
t	t	9	g	c	c
gcctccacc	agggcccat	ggtcttccc	ctggcaccc	cctccaaga	cacctctgg	420
a	c	c	t	9	9
ggcacagcg	ccctgggct	cctggtcaa	gactacttc	ccgaaccgg	gacggtgtc	480
9	g	g	c	t	9
tggaactca	gcgccctga	cagcggcgt	cacaccttc	cggctgtcc	acagtcctc	54 0
9	c	g	c	t	a
ggactctac	ccctcagca	cgtggtgac	gtgccctcc	gcagcttgg	caeccagac	600
t	g	c	a	9	c
tacatctgc	acgtgaatc	caagcccag	aacaccaag	tggacaaga	agttgagcc	660
a	a	c	9	9	c
aaatcttgt	acaaaactc	cacatgccc	ccgtgccca	cacctgaac	cctgggggg	720
9	a	a	g	t	a
ccgtcagtc	tcctcttac	cccaaaacc	aaggacacc	tcatgatct	ccggacccc	780
t	c	c	c	c	t
gaggtcaca	gcgtggtgg	ggacgtgag	caçgaagac	ctgaggtca	gttcaactg	840
t	t	c	c	a	9
tacgtggac	9*=gtggagg	gcataatgc	aagacaaag	cgccggagg	gcagtacaa	900
9	t	c	c	a	c
agcacgctc	gtgtggtca	catcctcac	gtcctgcac	aggactggc	gaatggcaa	96 0
c	g	c	c	t	9
gagtacaag	gcaaggtct	caacaaagc	ctcccagcc	ccatcgaga	aaccatctc	1020
t	c	c	c	a	c
aaagccaaa	ggcagcccc	agaaccaca	gtgtacacc	tgcccccat	ccgggatga	1080
g -	- g X-, - ...-7-.	g-	c	' c	9
ctgaccaag	accaggtca	cctgacctg	ctggtcaaa	gcttctatc	cagcgacat	1140
a	9	c	9	α	c
gccgtggag	gggagagca	tgggcagcc	gagaacaac	acaagacca	gcctctcgt	1200
t	a	g	t	c	9

38/124 ctggactcc acggctcct cttcctcta agcaagctc ccgtggaca gagcaggtg1260 g t c a ag cagcagggg acgtcttct atgctccgt atgcatgag ctctgcaca ccactacac1320 a c g g ag cagaagagc tctccctgt tccgggtaa tga1353 c ca

Cadeia pesada que possui sequência de aminoácido de

região Fc	variante	FcMTl (SEQ ID NO:	9} :
QVQLQQSGP	LVKPGASLK	SCTASGFNI	DTYIHWVKQ	PEQGLEWIG	IYPTNGYTR	60
E	L·	K	R	R	Y
DPKFQDKAT	TADTSSNTA	LQVSRLTSE	TAVYYCSRW	GDGFYAMDY	GQGASVTVS	.120
I	Y	D	G	W	S
ASTKGPSVF	LAPSSKSTS	GTAALGCLV	DYFPEPVTV	WNSGALTSG	HTFPAVLQS	180
P	G	K	S	V	S
GLYSLSSW	VPSSSLGTQ	YICNVNHKP	NTKVDKRVE	KSCDKTHTC	PCPAPELLG	240
T	T	S	P	P	G
PSVFLLPPK	KDTLMISRT	EVTCWVDV	HEDPEVKFN	YVDGVEVHN	KTKPPEEQY	300
P	P	s	W	A	N
STLRWSIL	VLHQDWLNG	EYKCKVSNK	LPAPIEKTT	KAKGQPREP	VYTLPPSRD	360
T	K	A	S	0	E
LTKNQVSLT	LVKGFYPSD	AVEWESNGQ	ENNYKTTPL	LDSDGSFFL	SKLTVDKSR	420
C	I	P	V -	Y	W
QQGNVFSCS	MHEALHNHY	QKSLSLSPG				450
V	T	K
	Cadeia	pesada *	que possui sequência de	ácido
nucleico	de região	Fc variante FcMT2	(SEQ ID NO: 10):
caggttcag	tgcagcagt	tggccctga	ctggtgaag	caggggact	actcaagtt	60
c	c	9	c	c	g
tcctgtaca	cttctggct	caacatcaa	gacacctat	tccactggg	gaaacagag	120
g	t	a	a	t	9
cctgaacag	gcctggaat	gattggaag	atttatcct	ccaatggct	tactagaca	180
g	g	9	a	a	t
gacccaaag	tccaggaca	ggccactat	acagcagac	catcctcca	cacagccta	240
t	a	c	a	a	c
ctgcaagtc	gccgcctga	atctgagga	actgccgtc	attactgct	ccggtgggg	300
a	c	c	t	c	a
ggggacggc	tctatgcta	ggactactg	ggtcaggga	cctccgtga	cgtgagctc	360
t	t	9	9	c	c
gcctccacc	agggcccat	ggecttcac	ctggcaccc	cctccaaga	cacctctgg	420
a	c	c	t	9	9
ggcacagcg	ccctgggct	cctggtcaa	gactacttc	ccgaaccgg	gacggtgtc	480
g	9	9	c	t	9
tggaactca	gcgccctga	cagcggcgt	cacaccttc	cggctgtcc	acagtcctc	54 0
g	G	g	c	t	a
ggactctac	ccctcagca	cgtggtgac	gtgccctcc	gcagcttgg	cacccagac	600
t	g	c	a	9	c
tacatctgc	acgtgaatc	caagcccag	aacaccaag	tggacaaga	agttgagcc	6 6 0
a	a	c	9	9- —-	_c __
aaatcttgt-	'âcããáactc-	cacatgccc	ccgtgccca	cacctgaac	'cgtgggggg	‘720'
g	a	a	g	t	a
ccgtcagta	tcctcttac	cccaaaacc	aaggacacc	tcatgatat	ccggacccc	780
t	c	c	c	c	t
gaggtcaca	gcgtggtgg	ggacgtgag	cacgaagac	ctgaggtca	gttcaaatg	840

39/124

t	t	c	c	a	9
tacgtggac	gcgtggagg	gcataatgc	aagacaaag	cgccggagg	gcagtacaa 900
g	t	c	c	a	C
agcacgctc	gtgtggtca	cgtcctcac	gtcctgcac	aggactggc	gaatggcaa 960
c	g	c	c	t	9
gagtacaag	gcaaggtct	caacaaagc	ctcccagcc	ccatcgaga	aaccatctc 1020
t	c	c	c	a	c
aaagccaaa	ggcagcccc	agaaccaca	gtgtacacc	tgcccccat	ccgggatga 1080
9	9	9	c	c	9
ctgaccaag	accaggtca	cctgacctg	ctggtcaaa	gcttctatc	cagcgacat 1140
a	9	c	9	c	c
gccgtggag	gggagagca	tgggcagcc	gagaacaac	acaagacca	gcctctcgt 1200
t	a	9	t	c	9
ctggactcc	acggctcct	cttcctcta	agcaagctc	ccgtggaca	gagcaggtg 1260
9	t	c	a	a	9
cagcagggg	acgtcttct	atgctccgt	atgcatgag	ctctgcaca	ccactacac L320
a cagaagagc c	c tctccctgt c	9 tccgggtaa a	9 tga	a 1353	g
região Fc	Cadeia pesada que possui sequência < variante FcMT2 (SEQ ID NO: 11):	àe aminoácido de
QVQLQQSGP	LVKPGASLK	SCTASGFNI	DTYIHWVKQ	PEQGLEWIG	IYPTNGYTR 60
Ξ	L	K	R	R	Y
DPKFQDKAT	TADTSSNTA	LQVSRLTSE	TAVYYCSRW	GDGFYAMDY	GQGASVTVS 120
Γ	Y	D	G	W	S
ASTKGPSVF	LAPSSKSTS	GTAALGCLV	DYFPEPVTV	WNSGALTSG	HTFPAVLQS 180
P	G	K ‘	S	V	S
GLYSLSSW	VPSSSLGTQ	YICNVNHKP	NTKVDKRVE	KSCDKTHTC	PCPAPELVG 240
T	T	S	P	P	G
PSVFLLPPK	KDTLMISRT	EVTCVWDV	HEDPEVKFN	YVDGVEVHN	KTKPPEEQY 300
P	P	s	W	A	N
STLRWSVL	VLHQDWLNG	EYKCKVSNK	LPAPIEKTI	KAKGQPREP	VYTLPPSRD 360
T	K	A	S	Q	E
LTKNQVSLT	LVKGFYPSD	AVEWESNGQ	ENNYKTTPL	LDSDGSFFL	SKLTVDKSR 420
C QQGNVFSCS V	I MHEALHNHY T	P QKSLSLSPG K	V	Y	W 450
	Cadeia	pesada c	jue possui sequência de ácido
nucleico	de região	Fc variante FcMT3	(SEQ ID :	NO: 12) :
caggttcag	tgcagcagt	tggccctga	ctggtgaag	caggggcct	actcaagtt 60
c	c	g	c	c	9
tcctgtaca	cttctggct	caacatcaa	gacacctat	tccactggg	gaaacagag 120
9	t	a	a	t	9
cctgaacag	gcctggaat	gattggaag	atttatcct	ccaatggct	taccagata 180
9	9	g	a	a	t
gacccaaag	tccaggaca	ggccactat	acagcagac	catcctcca	cacagccta 240
t	a	c	a	a	c
ccgcaagtc	gccgcctga _	.atctgagga	actgccgtc	attactgct	ccggtgggg 300
a	c	c	t : '	. c	a - -
ggggacggc	tctatgcta	ggactactg	ggtcaggga	cctccgtga	çgtgagctc 360
t	t	9	9	C	c
gcctccacc	ag99cccat	ggtcttccc	ctggcaccc	cctccaaga	cacctctgg 420
a	c	c	t	9	9

40/124

ggcacagcg	ccctgggct	cctggtcaa	gactacttc	ccgaaccgg	gacggtgtc	480
	g	g	g	c	t	9
	tggaactca g	gcgccctga c	cagcggcgt g	cacaccttc c	cggctgtcc t	acagtcctc a	54 0
	ggactatac t	ccctcagca g	cgtggtgac c	gtgccctcc a	gcagcttgg 9	cacccagac c	600
4	tacatctgc	acgtgaatc	caagcccag	aacaccaag	tggacaaga	agctgagcc	660
1	a	a	c	9 '	g	c
	aaatcttgt g	acaaaactc a	cacatgccc a	ccgtgccca 9	cacctgaac t	cctgggggg a	720
	ccgtcagtc t	tcctcttac c	cccaaaacc c	aaggacacc c	tcatgatct C	ccggacccc t	780
	gaggtcaca t	gcgtggtgg t	ggacgtgag; c	cacgaagac c	ctgaggtca a	gttcaactg g	840 -
	tacgtggacg	gcgtggagg t	gcataatgc c	aagacaaag c	cgccggagg a	gcagtacaa c	900
	agcacgctc c	gtgtggtca g	cgtcctcac c	gtcctgcac c	aggactggc t	gaatggcaa 9	960
	gagtacaag t	gcaaggtct c	caacaaagc c	ctcccagcc c	ccatcgaga a	aaccatctc c	1020
	aaagccaaa	ggcagcccc	agaaccaaa	gtgtacacc	tgcccccat	ccgggatga	1080 >
	g	g	g	c	c	9
	ctgaccaag a	accaggtca g	cctgacctg c	ctggtcaaa g	gcttctatc c	cagcgacat c	1140
	gccgtggag	gggagagca	tgggcagcG	gagaacaac	acaagacca	gcctcccgt	1200
	t	a	9	t	c	9
	ctggactcc g	acggctcct t	cttcctcta c	agcaagctc a	ccgtggaca a	gagcaggtg 9	1260
	□agcagggg a cagaagagc C ' região Fc	acgtcttct atgctccgt atgcatgag ctctgcaca c g g a tctccctgt tccgggtaa tga ca - - Cadeia pesada que possui sequência c : variante FCMT3 (SEQ ID NO: 13):	ccactacac 1320 g 1353 ie aminoácido de
	QVQUQQSGP E	LVKPGASLK L	SCTASGFNI K	DTYIHWVKQ R	PEQGLEWIG R	IYPTNGYTR Y	60
	DPKFQDKAT I	TADTSSNTA Y	bQVSRLTSE D	TAVYYCSRW G	GDGFYAMDY W	GQGASVTVS S	120
	ASTKGPSVF P	LAPSSKSTS G	GTAALGCLV K	DYFPEPVTV S	WNSGALTSG V	HTFPAVLQS s	180
	GLYSLSSW	VPSSSLGTQ	YICNVNHKP	NTKVDKRVE	KSCDKTHTC	PCPAPELLG	240
	T	T	S	P	P	G
	PSVFLLPPK	KDTLMISRT	EVTCVWDV	HEDPEVKFN	YVDGVEVHN	KTKPPEEQY	300
•	P	P	s	W	A	N
	STLRWSVL T	VLHQDWLNG K.	EYKCKVSNK A.. .	LPAPIEKTI S	KAKGQPREP Q	VYTI.PPSRD E	360
	bTKNQVSLT	LVKGFYPSD	AVEWESNGQ	ENNYKTTPP	LDSDGSFFL	SKLTVDKSR	420
	C QQGNVFSCS	I MHEALHNHY	P QKSLSLSPG	V	Y	w	450
_.... - ......	- v -··-	T’· “ Em uma	K ' ~·- ·· ..... - ------- ------- realização, uma cadeia pesada 4D5 variante

possui uma modificação na região Fc, e é codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ TD NO: 8 ou compreende a

41/124 sequência de aminoâcido da SEQ ID NO: 9, ou é codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO; 10 ou compreende a sequência, de aminoâcido da SEQ ID NO: 11, ou é codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO; 12 ou compreende a sequência de aminoâcido da SEQ ID NO; 13. De preferência, os anticorpos compreendem a cadeia pesada codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, e SEQ ID NO: 12, ou compreendem uma sequência de aminoâcido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 13.

Em uma representação, um anticorpo anti-HER2/NEU compreende uma cadeia leve de imunoglobulina que possui uma modificação N65S na região VL, e uma cadeia pesada de imunoglobulina que possui uma região Fc modificada. De preferência, um anticorpo anti-HER2/NEU compreende uma cadeia leve que possui a sequencia de aminoâcido da SEQ ID NO: 2, e uma cadeia pesada que possui uma sequencia de aminoâcido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 13. Em algumas representações, um polipeptídeo da invenção compreende adicionalmente um domínio constante de cadeia leve fundido com um domínio variável de cadeia leve, que em algumas representações compreende pelo menos SEQ ID NO: 4. Em outras representações, o anticorpo ê modificado, um fragmento, ou um fragmento modificado.

Os anticorpos 4D5 quiméricos foram construídos de acordo com as várias representações da invenção, para aumentar a ligação de modo a ativar os receptores de baixa afinidade, e não alteram, ou apenas aumentam minimamente, a ligação ao receptor inibidor de baixa afinidade CD32B (FcyRII-B). Os anticorpos incluem os seguintes anticorpos otimizados por Fc e de ocorrência natural:

42/124 • Fc de ocorrência natural ch4D5, que possui uma > cadeia leve que possui uma sequência de aminoácido da SEQ ID \ NO: 2, e uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7. Fc de ocorrência natural ch4D5 5 possui uma substituição N65S na cadeia leve, que resulta em uma cadeia leve desglicosilada.

• ch4D5-FcMTl, que possui uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, e uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácido da SEQ

I

ID NO: 9. ch4D5-FcMTl possui uma substituição N65S na cadeia leve, que resulta em um ma cadeia leve desglicosilada, e substituições F243L, R292P, Y300L, V305I, e P396L na cadeia pesada (todas numeradas de acordo com Rabat). ch4D5-FcMTl exibe um aumento de 10 vezes na ligação a CD16A (FcyRTII-Á) humano, e a ligação a CD16-158^phe é aumentada de maneira proporcionalmente maior do que a ligação a CD16-158^val • ch4D5-FcMT2, que possui uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, e uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácido da SEQ 20 ID NO: 11. ch4D5-FcMT2 possui uma substituição N65S na cadeia leve, que resulta em uma cadeia leve desglicosilada, e substituições L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L na cadeia pesada (todas numeradas de acordo com Kabat). Esse anticorpo é um refinamento adicional do anticorpo ch4D5-FcMTl, e possui 25 propriedades de ligação CD16A similares, porém também possui uma redução mais favorável na ligação a CD32B (FcyRTI-B).

• ch4D5-FcMT3, que possui uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, e uma cadeia pesada que possui uma sequência de aminoácido da SEQ 30 . ID NO: 13. -ch4D5-FcMT3~possui umasubstituição-N6 5Sna“cadeia leve, que resulta em uma cadeia leve desglicosilada, e substituições F243L,. R292P, e Y300L na cadeia pesada (todas

43/124 numeradas de acordo com Rabat) . Esse anticorpo é um refinamento adicional do anticorpo ch4D5-FcMTi, e possui propriedades de ligação CD16A similares, porém também possui uma redução mais favorável na ligação a CD32B (FcyRIi-B).

• ch4D5-Ag • ch4D5-N297Q, que possui uma cadeia leve que possui uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, e uma cadeia pesada que possui üma substituição (numeradas de acordo com Kabat).

Uma comparação das sequências de cadeia pesada do Fc de ocorrência natural ch4D5 e as variantes otimizadas por Fc ch4D5-FcMTl, ch4D5-FcMT2, e ch4D5-FcMT3 são mostradas na Figura 2. As CDRs são indicadas com barras pretas mostradas abaixo dos resíduos pertinentes.

Os polipeptídeos (especialmente anticorpos) contemplados pela presente invenção podem compreender toda ou parte de qualquer sequência de aminoácido da presente invenção. Por exemplo, em uma representação um polipeptídeo compreende uma cadeia leve de imunoglobulina 4D5 murina que possui uma substituição N65S, e em outra representação um polipeptídeo compreende uma variante de cadeia pesada de imunoglobulina 4D5 murina. Em outra representação, um polipeptídeo compreende um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, ou uma cadeia leve de imunoglobulina que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em outra representação, o polipeptídeo compreende um domínio Fc variante, ou uma cadeia pesada de imunoglobulina que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7,. SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO.: 11,-. .ou, SEQ, ID--NO: - 13,· _-ou -.uma. -cadeia pesada de imunoglobulina 4D5 que compreende as substituições F243L, R292P, e Y300L.

44/124

Os polipeptídeos (especialmente anticorpos) contemplados pela presente invenção podem estar em um complexo uns com os outros ou com outros polipeptídeos de não-imunoglobulina (por exemplo, enzimas, hormônios, proteínas estruturais, etc.). Por exemplo, uma representação pode fornecer um complexo de polipeptídeos que compreende dois polipeptídeos, em que um dos ditos polipeptídeos compreende uma cadeia -pesada, e o outro- polipeptídeo compreende uma cadeia leve variante, ou em que ambos os 10 polipeptídeos compreendem as mesmas sequências. A complexação pode ser mediada por qualquer técnica adequada, inclusive por dimerização/multimerização em um domínio de dimerização/multimerização como aqueles descritos aqui-, ou interações covalentes (como através de uma ligação dissulfeto) (que em alguns contextos faz parte de um domínio de dimerização, por exemplo, um domínio de dimerização pode conter uma sequência zíper de leucina e cisteína). Em outra representação, uma composição pode compreender polipeptídeos e/ou polinucleotídeos da invenção, por exemplo, uma 20 composição pode compreender uma pluralidade de qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos. Uma composição que compreende um polinucleotídeo ou polipeptídeo pode estar sob a forma de um kit ou um artigo de fabricação (opcionalmente embalado com instruções, tampões, etc.) .

Também é contemplado que as variantes de polipeptídeo (e em variantes de anticorpo particulares) podem ser preparadas. As variantes de polipeptídeo podem possuir modificações de sequência (por exemplo, substituições, deleções e/ou adições) em posições desejadas dentro de suas 3 0 sequências de aminoãcido relativas à sequência_ de^aminoácj-do nativa. Os elementos versados na técnica irão avaliar que as mudanças de aminoãcido podem alterar os processos póstraducionais do anticorpo ou polipeptídeo, tal como alterar o

45/124 número ou posição de sítios de glicosilação ou alterar as características de. ancoramento de membrana. Em uma representação preferida, as variantes de anticorpo· e polipeptídeo são variantes de região Fc.

As variantes podem possuir a mesma atividade ou atividade alterada quando comparado com um anticorpo ou polipeptídeo nativo. Por exemplo, pode ser desejado que a variante possua a mesma atividade, porém que essa seja modificada de maneira que fique mqfÍs estável ou possua uma meia-vida mais longa in vivo, por exemplo, ao conjugar o anticorpo com albumina ou um epítopo de ligação ao receptor de salvamento, tal como descrito, por exemplo, na Patente Norte-americana n°. 5.739.277. Ou, por exemplo, pode- ser desejado que um anticorpo possua uma afinidade de ligação aumentada ao antígeno, porém a mesma função efetora como um anticorpo nativo, ou. pode ser desejado que um anticorpo possua a mesma afinidade de ligação ao antígeno, porém uma função efetora reduzida. A atividade pode ser testada, por exemplo, utilizando ensaios in vitro como ensaios ELISA, ensaios de ressonância plasmônica de superfície, ensaios de ligação de proteína radiomarcado (RIA), ou ensaios de imunoprecipitação. .

Modificações substanciais na função ou identidade imunológica podem ser realizadas ao selecionar modificações que se diferem significativamente em seu efeito a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da modificação, por exemplo, tal como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. A análise de aminoácido de varredura também pode ser empregada para identificar um ou mais aminoácidos ao „ longo de uma sequência contígua, por exemplo, tal como descrito por Cunningham and Wells (1969) Science 244:1081-1085. Entre os

46/124 aminoâcidos de varredura preferidos estão aminoãcidos neutros relativamente pequenos, tal como alanina, glicina, serina, e cisteína. Ά alanina é tipicamente um aminoácido de varredura preferido entre esse grupo, pois é o aminoãcido mais comum, e é frequentemente encontrado em posições enterradas e expostas, e devido ao fato de esse eliminar a cadeia lateral além do beta-carbono e ser menos propenso a alterar a conformação de cadeia principal da variante. Se a substituição de alanina não produzir quantidades adequadas de variante, um aminoácido isotérico pode ser utilizado. Ademais, qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo ou polipeptídeo pode ser substituído, geralmente por serina, para aumentar a estabilidade oxidativa da molécula e impedir a reticulação aberrante. Entretanto, em algumas circunstâncias, particularmente quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo como um fragmento Fv, ligação/ligações de cisteína pode (m) ser· adicionada(s) ao anticorpo ou polipeptídeo para aumentar a sua estabilidade.

BI. Variantes de Domínio Fc

Os polipeptídeos da presente invenção podem possuir domínios de Fc variantes. A modificação do domínio Fc normalmente resulta em um fenótipo alterado, por exemplo, meia-vida de soro alterada, estabilidade alterada, suscetibilidade alterada a enzimas celulares ou função efetora alterada. Pode ser desejado modificar o anticorpo da invenção com relação ã função efetora, para aumentar a eficácia do anticorpo no tratamento de. câncer,_por exemplo. A redução ou eliminação da função efetora é desejada em alguns casos, por exemplo, no caso de anticorpos__cujo mecanismo de ação envolve o bloqueio ou antagonismo, porém não morte das células contendo um antígeno alvo. A função efetora aumentada é geralmente desejada quando dirigida a células indesejadas,

47/124 tais como células tumorais e estranhas, em que os FcyRs são expressos em baixos níveis, por exemplo, células B específicas de tumor com baixos níveis de FcyRIIB (por exemplo, linfoma não-Hodgkins, CLL, e linfoma de Burkitt). Nas ditas representações, as moléculas da invenção com atividade de função efetora conferida ou alterada são úteis para o tratamento e/ou prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção em que se deseja uma eficácia aumentada da atividade de função efetora.

Em algumas representações, as moléculas da invenção compreendem uma ou mais modificações aos aminoácidos do domínio Fc, que reduzem a afinidade e avidez da região Fc e, dessa maneira, a molécula da invenção, para um ou mais receptores FcyR. Em outras representações, as moléculas da invenção compreendem uma ou mais modificações aos aminoácidos da região Fc, que aumentam a afinidade e avidez da região Fc e, dessa maneira, a molécula da invenção, para um ou mais receptores FcyR. Em outras representações, as moléculas compreendem um domínio Fc variante em que a dita variante confere ou media a atividade de ADCC aumentada e/ou uma ligação aumentada a FcyRIIA, relativa a uma molécula que não compreende o domínio Fc ou compreende um domínio Fc de ocorrência natural. Em representações alternativas, as moléculas compreendem um domínio Fc variante em que a dita variante confere ou media atividade ADCC reduzida (ou outra função efetora) e/ou uma ligação aumentada a FcyRIIB, relativa a uma molécula que não compreende domínio Fc ou compreende um domínio.Fc de ocorrência natural.

Em algumas representações, a invenção inclui moléculas que compreendem uma região ..Fc variantetal região Fc variante não mostra uma ligação deteçtável a nenhum FcyR, relativa a uma molécula comparável que compreende a região Fc de ocorrência natural. Em outras representações, a invenção

48/124 inclui moléculas que compreendem uma região Fc variante, tal região Fc variante se liga apenas a um único FcyR, de preferência, um entre FcyRIIA, FcyRIIB, ou FcyRIIIA.

Os polipeptídeos da presente invenção podem compreender afinidades alteradas de um receptor Fey de ativação e/ou inibidor. Em uma representação, o anticorpo ou polipeptídeo compreende uma região Fc variante que possui afinidade aumentada com FcyRIIB e afinidade reduzida com FcyRIIIA e/ou FcyRIIA, relativa a uma molécula comparável com uma região Fc de ocorrência natural. Em outra representação, os polipeptídeos da presente invenção compreendem uma região Fc variante, que possui afinidade reduzida com FcyRIIB e afinidade aumentada com FcyRIIIA e/ou FcyRIIA, relativa a uma molécula comparável com uma região Fc de ocorrência natural. Ainda em outra representação, os polipeptídeos da presente invenção compreendem uma região Fc variante que possui afinidade reduzida com FcyRIIB e afinidade reduzida com FcyRIIIA e/ou FcyRIIA, relativa a uma molécula comparável com uma região Fc de ocorrência natural. Ainda em outra representação, os polipeptídeos da presente invenção compreendem uma região Fc variante, que possui afinidade inalterada com FcyRIIB e afinidade reduzida (ou aumentada) com FcyRIIIA,e/ou FcyRIIA, relativa a uma molécula comparável com uma região Fc de ocorrência natural.

Em algumas representações,. a invenção inclui imunoglobulinas que compreendem uma região Fc variante com uma afinidade alterada com FcyRIIIA e/ou FcyRIIA de modo que a imunoglobulina possua uma função aumentada, por exemplo, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo. Exemplos não-limitativos de funções.......celulares efetoras incluem citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose dependente de anticorpo, fagocitose, opsonização, opsonofagocitose, ligação celular,

49/124 rosetamento, ligação Clq, e citotoxicidade mediada por célula dependente de complemento.

Em uma representação preferida, a alteração em afinidade ou função efetora é pelo menos duas vezes, de preferência, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos seis vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos nove vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos cinquenta vezes, ou pelo menos cem vezes, com relação a uma molécula comparável que compreende uma região Fc de ocorrência natural. Em outras representações da invenção, a região Fc variante se liga imunoespecificamente a um ou mais FcRs com pelo menos 65%, de preferência, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%,. OU 250% mais afinidade com relação a uma molécula que compreende uma região Fc de ocorrência natural. Tais medidas podem -ser ensaios in vivo ou in vitro, e em uma representação preferida são ensaios in vitro como ELISA ou ensaios de ressonância plasmônica de superfície.

Em representações diferentes, as moléculas compreendem um domínio variante Fc em que a dita variante agoniza pelo menos uma atividade de um receptor FcyR, ou antagoniza pelo menos uma atividade de um receptor FcyR. Em uma representação preferida, as moléculas compreendem uma variante que agoniza (ou antagoniza) uma ou mais atividades de FcyRIIB, por exemplo, sinalização mediada por receptor de célula B, ativação de células B, proliferação de células B, produção de anticorpos, influxo de cálcio intracelular de células B, progressão de ciclo celular, inibição mediada por FcyRIIB de sinalização de FcERI, fosforilação de FcyRIIB, recrutamento de SHIP, fosforilação de SHIP e assoçiação com She, ou atividade de uma ou mais moléculas a jusante (por exemplo, quinase MAP, JNK, p38, ou Akt) na via de transdução de sinal FcyRIIB. Em outra representação, as moléculas

50/124 compreendem uma variante que agoniza (ou antagonize) uma ou mais atividades de FcERI, por exemplo, ativação de mastócitos, mobilização de cálcio, desgranulação, produção de citocina, oü liberação de serotonina.

Em algumas representações, as moléculas compreendem um domínio Fc que compreende domínios ou regiões de dois ou mais isotipos IgG (por exemplo, IgGl, lgG2, IgG3 e lgG4). Os vários isotipos IgG exibem propriedades físicas e funcionais diferentes que incluem meia-vida de soro, fixação de 10 complemento, afinidades de ligação de FcyR e atividades de função eEetora (por exemplo ADCC, CDC, etc.) devido a diferenças na sequência de aminoácidos de seus Fcs de dobradiça e/ou domínio, por exemplo, tal como descrito em Flesch and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156;

Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; Bruggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166:1351-1361. Esse tipo de domínio Fc variante pode ser utilizado individualmente, ou em combinação com uma modificação de aminoácido, para afetar 20 a função efetora mediada por Fc e/ou atividade de ligação. Em combinação, a modificação de aminoácido e região de dobradiça IgG/Fc pode exibir funcionalidade similar (por exemplo, afinidade aumentada com FcyRIIA) e pode atuar de maneira adicional ou, com mais preferência, de maneira sinergística 25 para modificar a funcionalidade efetora na molécula da invenção, relativa a uma molécula da invenção que compreende uma região Fc de ocorrência natural. Em outras representações, a modificação de aminoácido e região Fc IgG pode exibir funcionalidade oposta (por exemplo, afinidade 30 aumentada e reduzida com FcyRIIA, respectivamente) ^e pode atuar para mitigar ou reduzir seletivamente uma funcionalidade específica na molécula da invenção, relativa a uma molécula da invenção que não compreende uma região Fc ou

51/124 compreende uma região Fc de ocorrência natural do mesmo isotipo.

Em uma representação específica preferida, as moléculas compreendem uma região Fc variante, em que a dita região Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoãcido relativa a uma região Fc de ocorrência natural, de modo que a dita molécula possua uma afinidade alterada com um FcR, desde que . a dita região Fc variante não possua uma substituição nas posições que fazem um contato direto com FcyR baseado na análise cristalográfica e estrutural de interações Fc-FcR como aquelas descritas por Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-273. Exemplos de posições dentro da região Fc que fazem um contato direto com FcyR são os resíduos de aminoácido 234-239 (região de dobradiça), resíduos de aminoácido 265-269 (alça B/C), resíduos de aminoácido 297-299 (alça C'/E), e resíduos de aminoácido 327332 (alça F/G) . Em algumas representações, as moléculas da invenção compreendendo regiões Fc variantes compreendem uma modificação de pelo menos um resíduo que não faz contato direto com um FcyR baseado em análise estrutural e cristalográfica, por exemplo, não esta dentro do sítio de ligação Fc-FcyR.

Os domínios Fc variantes são bem conhecidos no estado da técnica, e qualquer variante de Fc conhecida pode ser utilizada na presente invenção para conferir ou modificar a função efetora exibida por uma molécula da invenção que compreende um domínio Fc (ou porção desse) como funcionalmente avaliado, por exemplo, em um ensaio dependente de NK ou dependente de macrófago. Por exemplo, as variantes de domínio Fc identificadas como alterando ^a função^ ef et oras são descritas em Antibody Engineering Technology Art, e qualquer variante adequada descrita aqui pode ser utilizada nas presentes moléculas.

52/124

Em algumas representações, as moléculas compreendem uma região Fc variante, que possui umá ou mais modificações de aminoácido em uma ou mais regiões, tal/tais modificação/modificações altera(m) (em relação a uma região Fc de ocorrência natural) a Razão de Afinidades da região Fc variante com um FcyR de ativação (como FcyRIIA ou FcyRIIIA) relativa a um FcyR de inibição (como FcyRIIB):

Alteração de Ocorrente Natural para Variante em Afinidade com FcyR_Activating

Razão de Afinidades =

Alteração de Ocorrente Natural para Variante em Afinidade com FcyRinhibiting

Em que uma variante de Fc possui uma Razão de Afinidades maior que 1, os métodos da invenção possuem uso particular para fornecer um tratamento terapêutico ou profilático de uma doença, distúrbio, ou infecção, ou a melhora de um sintoma dessa, em que uma eficácia aumentada de função celular efetor (por exemplo, ADCC) mediada por FcyR é desejada, por exemplo, câncer ou doença infecciosa. Em .que uma variante de Fc possui uma Razão de Afinidades menor que 1, os métodos da invenção possuem uso particular para fornecer um tratamento terapêutico ou profilático de uma doença, distúrbio, ou infecção, ou a melhora de um sintoma dessa, em que uma eficácia reduzida de função celular efetora mediada por FcyR é desejada, por exemplo, distúrbios autoimunes ou inf lamatórios. A Tabela 2 apresenta mutações simples, duplas, triplas, quádruplas e quintuples se sua Razão de Afinidades for maior ou menor que 1. Os dados de ligação específica de várias mutações estão apresentados na Tabela 3, e mais informações referentes a essas mutações . . ..‘ir . -- tr-²·'' podem'ser encontradas em Antibody Engineering Technology Art. Tabela 2: Mutações únicas e Múltiplas Exemplificativas apresentadas por razão de Afinidades_____

53/124

Razão	Única	Dupla	Tripla	Quádrupla	Quíntupla
>1	F243L	F243L· &	F243L, P247L &	L234F, F243L·,	L235V, F243L,
		R292P	N421K	R292P & Y300L	R292P, Y300L &
	D2 7 0E				P396L
		F243L &	F243L, R292P &	L235I, F243L,
	R292G	Y300L	Y300L	R292P & Y300L	L235P, F243L,
					R292P, Y300L &
	R292P	F243L &	F243L, R292P &	L235Q, F243L,	P396L
		P3 96L	V305I	R292P & Y300L
					F243L, R292P,
		D270E &	F243L, R292P &	F243L, P247L,	V305I,Y300L
		P3 96L ·	P396L	D270E & N421K	&. P396L
-		R292P &	F243L, Y300L &	F243L, R255L,
		Y300L	P396L	D270E A P396L
		R292P &	P247L, D270E Ec	F243L, D270E,
		V305I	N421K	G316D & R416G
		R292P &	R255L, D270E &	F243L, D270E,
		P396L	P396L	K392T & P396L
		Y300L &	D270E, G316D &	F243L, D270E,
		P396L	R416G	P396L. & Q419H
		P396L &	D270E, K392T &	F243L, R292P,
		Q419H	P396L	Y300L,& P396L
			D270E, P396L &	F243L, R292P,
			Q419H	V305I & P396L
			V284M, R292L &	P247L, D270E,
			K370N	Y300L & N421K
			R292P, Y300L &	R2S5L, D270E,
			P396L·	R292G & P395L
				R255L, D270E,
				Y300L & P396I·
				D270E, G316D,
				P396L & R416G

Tabela 2: Mutações únicas e Múltiplas Exemplificativas apresentadas por razão de Afinidades________________________________

Razão	Única	Dupla	Tripla	Quádrupla	Quíntupla
<1	Y3 00L P396L	F243L & P396L P247L & N421 K R255L & P396L R292P & V305I K392T & P396L P396L & Q419H - - ' '	F243L, R292P & V305I		---

Tabela 3: Informações de Ligação Detalhadas de Variantes Fc

Exempl i f icativas.

Rasõo-------de

54/124

				Afinidades CD16A/CD32B VI58 |F158
Razão de Afinidades > 1 ______
Classe I: Ligação Aumentada a CD16; Ligação Reduzida a CD32B_____
F243L	4,79	3,44	0,84	5,70	4,10
F243L P247L D270E N421K	2,30	3,45	0,32	7,19	10,78
F243L P247L N421K	1,89	1,71	0, 17	11, 12	10,06
F243L R255L D270E P396L	1,75	1,64	0,38	4,61	4,32
F243L D270E G316D R416G	1,50	1,34	0,20	7, 50	6,70
F243L D270E K392T P396L	3,16	2,44	0,44	7, 18	S, 55
F243L D270E P39SL Q419H	1,46	1,15	0,26	5, 62	4,42
F243L R292P	4,73		0, 12	39,4
F243L R292P	4	1,67	0,16	25	10,44
F243L R292P P300L	6,69	2,3	0,32	20,9	7,19
F243L R292P V305I	2,56	1,43	ND	>25	>25
F243L R292P V305I P396L	5,37	2,53	0,40	13,43	6,33
P247L D27QE N421K	1,89	2,46	0,58	3,26	4,24
R255L D270E R292G P396L	1,39	1,30	0,65	2,14	2,00
R255L D270E Y300L P396L	1,52	1,74	0,87	1,75 __	2,00
R255L D270E P396L	1,34	1,65	0,87	1,54	1,90
D270E	1,25	1,48	0,39	3,21	3,79
D270E G316D R416G	2,18	2,49	0,78	2,79	3,19
D270E K392T P396L	1, 81	2,28	0,79	2,29	2,89
D270E P396L	1, 38	1,65	0,89	1,55	1,85
D270E P396L G316D R416G	1, 22		1,07	1,14
D270E P396L Q419H	1, 64	2,00	0,68	2,41	2,94
V284M R292P K370N	1, 14	1,37	0,37	3,1________	3,7
R292G	1,54		0,25	6,2_____
R292P	2,90		0,25	11,60
R292P V305I	1,32	1,28	0, 37	3,6	3,46
Classe II: Ligação Reduzida a CD16; Ligação Muito Reduzida a CD32B
R292P		0,64	0,25		2,56
R292P F243L		0,6	0, 12		5,00
Classe III: Ligação Aumentada a CD16; Ligação Não-Alterada a CD32ti
F243I R292P Y300L V305I P396L	10,9	3,12	1,05	10,4	2,97
F243L R292P Y300L P396L	10,06	5,62	1,07	9,40	5,25
R292P V305I P396L	1,85	1,90	0,92	2,01	2, 07
Classe IV: Ligação Muito Aumentada a CD16; Ligação Aumei CD32B __	itada a
F243L R292P Y300L V305I P396L	10,06	8,25	1,38	7,29
D270E G316D P396L R416G	1,22		1,07	1,14
Razao de Afinidades < 1_____
Classe V: Ligação Não-alterada a'CD16; Ligação aumentada a	;P32B
R255L P396L	1,09		2,22	0,49
Y300L	1,01		1,18		0, 99
Classe VI: Ligação Aumentada- a CDl 6;-~Ligação Muito Aumei CD32B- — ’ _____________________________	atada a
F243L P396L	1,49	1,60	2,22	0,67	0,72
P247L N421K	1,29	1,73	2, 00	0,65	0,87
R255L P3 96L		1,39	2,22	0,49	0,63

55/124

R292P V3 05I	1,59	2,11	2,67	0,60	0,79
K392T P396L	1,49	1,81	2,35	0,63	0,77
P396L	1,27	1,73	2,58	0,49	0,67
P396L Q419H	1,19	1,19	1,33	0,89	0,89

Classe VII: Ligação Reduzida a CD16; Ligação Aumentada / Nãoalterada a CD3 2B_____________________________________________

D270E G316D P396L R416G | |0,94 |l,07 | _____| 0,88

Em outras representações, as moléculas compreendem uma região Fc variante que possui uma ou mais substituições de aminoãcido, tais substituições alteram (em relação a uma região Fc de ocorrência natural) a ligação da região Fc 5 variante, por exemplo, aumentam a ligaçao a um FcyR de ativação (como FcyRIIA ou FcyRiiiA) e/ou reduzem a ligação a um FcyR de inibição (como FcyRIIB). Vãrias mutações Fc que possuem uma ou mais alterações de aminoãcido foram elaboradas e analisadas por ressonância plasmônica de superfície para 10 koff< tal como mostrado na Tabela 4. As constantes de taxa de dissociação para ligar os vários FcyR foram determinadas por análise BIAcore e diretamente comparadas com aquelas do Fc de ocorrência natural, com a razão (x = WT k_O£f/mutant k_oEf) indicada nas colunas à direita da Tabela 4 com relação a cada

FcyR testado.

Tabela 4: Comparação de Mutantes Fc koff Of ocorrência natural _____________	com Fc de
M	Alteração(ões) de Aminoãcido	CD16A V	CD16A F	CD32A R	CD32B
Um Aminoãc:	Ldo ___	_____
1	F24 3L								4,8	3,4	0,6	0,8
2?	vk·'. ς -κ>· ’	D27 ÓE			V				ι73'χζ	.'.tj *·>!*··»· *9 «sW £-/5 ;·Γ'	MM í ? YTSj	;õdz-A···· 0-,4-/
3			R2 9 2P						2,4	1, 6	0,7	0,3
4				S298 N					Nd	Nd,	Nd,^^*
5					Y3 0 0L				1, o	1,2	2,9	1,2
6						V30. 51			cT/ÊT’	;ío	1,3	1,2
7							A3 3 OV		0, 6	1,2	0,4	0,3

55/124

8...						: ..λ ...		P3 9 6L	1,3	1,7	1,6'
Dois Aminoácidos
9	F24 3L							P3 9 6L	2,2	2,0	1,5	1, 6
10	F24 3L.		R2 9 2P						o	1,7	0,5	0,2
11			R29 2P			V30 51			1,3	1,3	0,8	0,4
Três Aminoácidos
12	F24 3L		R2 9 2P '		Y30 0L				7,4	4., 6	1,0	o
13	F24 3L		R29 2P	í·.	.’., ,	V30 51'	i	L		1-, 4 .	0,2 .....	0,1
14	F24 3L		R29 2P					P3 9 6L	6,3	3,4	1,4	0,4
15			R29 2P			V30 51		P3 9 6L	1,9	1, 9	1,5	0,9
Quatro Aminoácidos
16	F24 3L		R29 2P		Y3 0 0L			P3 9 6L	10,1	5,6	1,7	1,1 '
17	F24 3L		R2 9 2P			V3 0 51		P3 9 6L	4,0	2,3	0,8	0,4
Cinco Aminoácidos
18	F24 3L		R2 9 2P		Y30 0L	V3 0 51		P39 6L	10, 1	m CO	3,2	1,4

Abreviações: M, Número de Mutante; nd, nenhuma ligação detectável; nt, não testado. Valores com 80% de diferença (> 0,8 vez) do ocorrente natural em cada direção estão em negrito. Sombreado indica mutantes Fc identificados diretamente por exibição de levedura; todos os outros mutantes foram construídos por mutagênese sítio-dirigida.

Também há uma orientação extensiva em Antibody

Engineering Technology Art referente às modificações desejadas. As modificações exemplificativas que podem ser desejadas em algumas circunstâncias são apresentadas abaixo:

Em uma representação específica, em regiões Fc variantes, quaisquer modificações de aminoácido (por exemplo, substituições) em qualquer uma das posições 235; ' 240; 241; 243; 244; 247; 262; 263; 269; 298; 328; ou 330 e, de ’ preferência) ' um ~oü^{_ 7}màis dos seguintes~’rêsíduosT -A240; 1240;

L241; L243; H244; N298; 1328 ou V330. Em uma representação específica diferente, em regiões Fc variantes, quaisquer

57/124 modificações de aminoácido (por exemplo, substituições) em qualquer uma das posições 268; 269; 270; 272; 276; 278;283;

285; 286; 289; 292; 293; 301; 303; 305; 307; 309; 331/333;

334; 335; 337; 338; 340; 360; 373; 376; 416; 419; 430;434;

435; 437; 438 ou 439 e, de preferência, um ou maisdos seguintes resíduos: H280; Q280; Y280; G290; S290; T290; Y290; N294; K295; P296 ; D298; N298; P298; V298; 1300 ou L300.

Em uma representação preferida, em regiões Fc variantes que se ligam a um FcyR com uma afinidade alterada, 10 quaisquer modificações de aminoácido (por exemplo, substituições) em qualquer uma das posições 255; 256; 258 ; 267; 26 8; 26 9; 27 0; 272; 2 76; 27 8; 2 80; 283; 28 5; 28 6 ; 289 ;

290; 292; 293; 294; 295; 296; 298; 300; 301; 303 ; 305;307;

9; 312; 3 20; 3 22; 326; 3 29; 330; 332; 3 31; 333 ; 334; 3 35 ;

337; 338; 339; 340; 359; 360; 373; 376; 416; 419; 430;434;

435; 437; 438 ou 43 9. De preferência, a região Fc variante possui qualquer um dos seguintes resíduos: A256; N268; Q272; D286; Q286; S286; A290; S290; Ά298; M301; A312; E320;M320;

Q320; R320; E322; A326; D326; E326; N326; S326; K330;T339;

A333; A334; E334; H334; L334; M334; Q334 ; V334; K335;Q335;

A359; A360 OU A43 0.

Em uma representação diferente, em regiões Fc variantes que se ligam a um FcyR (através de sua região. Fc) com uma afinidade reduzida, quaisquer modificações de 25 aminoácido (por exemplo, substituições) em qualquer uma das posições 252; 254; 265; 268; 269; 270; 278; 289; 292;293;

294; 295; 296; 298; 300; 301; 303; 322; 324; 327; 329;333;

335; 338; 340; 373; 376; 382; 388; 389; 414; 416; 419;434;

435; 437; 438 ou 439^

0 Em uma representação diferente, em regiões Fc variantes que^-'sé I'rgam á um FcyR (através dê suã rêgiãb' Fc) com uma afinidade aumentada, quaisquer modificações de aminoácido (por exemplo, substituições) em qualquer uma das

58/124 posições 280; 283; 285; 286; 290; 294; 295;' 298; 300; 301; 305; 307; 309; 312; 315; 331; 333 ; 334; 337; 340; 360; 378; 398 ou 430. Em uma representação diferente, em regiões Fc variantes que se ligam a FcyRIIA com uma afinidade aumentada, qualquer um dos seguintes resíduos: A255; A256; A258; A267; A268; N268; A272; Q272; A276; A280; A2 83 ; A285; A286; D286; Q286; S286; A290; S290; M301; E320; M320; Q320; R320; E322 ; A326; D326; E326; S326; K330; A331; Q335; A337 ou A430.

Em outras representações, a invenção inclui o uso de qualquer variante de Fc conhecido no estado da técnica, tal como aquelas descritas em Jefferis et al. (2002) Immunol Lett 82:57-65; Presta et al. (2002) Biochem Soc Trans 30:48790; Idusogie et al. (2001) J Immunol 166:2571-75; Shields- et al. (2001) J Biol Chem 276:6591-6604; Idusogie et al. (2000) J Immunol 164:4178-84; Reddy et al. (2 0 00) J Immunol 164:1925-33; Xu et al. (2000) Cell Immunol 200:16-26; Armour et al. (1999) Eur J Immunol 29:2613-24; Jefferis et al. (1996) Immunol Lett 54:101-04; Lund et al. (1996) J Immunol 157:4963-69; Hutchins et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 92:11980-84,- Jefferis et al. (1995) Immunol Left. 44:111-17; Lund et al. (1995) FASEB J 9:115-19; Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537-43; Lund et al. (1992) Mol Immunol 29:53-59; Lund et al. (1991) J. Immunol 147:2657-62; Duncan et al. (1988) Nature 332:563-64,- Patente Nos. US 5.624.821; 5.885.573; 6.194.551; 7.276.586; e 7.317.091; e Publicações PCT WO 00/42072 e PCT WO 99/58572.

As variantes preferidas incluem uma ou mais modificações em qualquer uma das posições 228; 230; 231; 232; 233; 234; 235; 239; 240; 241; 243; 244,- 245; 247; 262; 263; 264; 265,·266; 271; 273; 275; 281,y 28££_ 291 ;_296 ; 29? ;__2 98 ; 299; 302; 304; 305; 313; 323; 325;326; 328; 330 ou 332.

As variantes particularmente preferidas incluem uma ou mais modificações selecionadas a partir dos grupos A-AI:

59/124

A.	22 8E;	228K;	228Y ou 228G;
B.	23 0A;	23 0E;	230Y ou 230G;
C.	231E;	231K;	231Y; 23IP ou 231G;
D.	23 2E;	232K;	232Y; 232G;
E.	23 3D;
F.	2341	OU 234F;
G.	23 5D;	235Q;	235P; 2351 OU 235V;
H..	239D;	23 9E;	239N ou 23 9Q;
I.	24 0A;	24 01;	240M ou 240T;
J.	243R;	243;	243Y; 243L; 243Q; 243W; 243H ou 2431;
K.		244H;
L.		24 5A;
M.	247G;	24 7V	ou 247L;
N.	262A;	262E;	2621; 262T; 262E ou 262F;
O.	263A;	2631;	263M OU 263T;
P.	2 64F;	264E;	264R; 2641; 264A; 264T ou 264W;
Q.	2 65F;	26 5Y;	265H; 2651; 265L; 265T; 265V; 265N

ou 26 5Q;

R. 266A; 2661; 266M ou 266T;

	s	271D; 271E; 271N; 271Q; 271K; 271R; 271S;
271T;	271H;	271A; 271V; 271L; 2711; 271F; 271M; 271Y; 271W ou
271G;	T	2731;
	U	275L OU 275W;
	V	281D; 281K; 281Y OU 281P;
	W	284E; 284N; 284T; 284L; 284Y ou 284M;
	X	291D; 291E; 291Q;. 291T; 291H; 2911 ou 291G;
	Y	299A; 299D; 299E; 299F;. 299G; 299H; 2991;
29 9K;	299L;	299M; 299N; 299P; 299Q; 299R; 299S; 299V; .299W OU
2 99Y;		____________. — . ----- -
	’ Z	3021;
	AA	304D; 304N; 304T; 304H OU 304L
	AB	. 3051;

60/124

AC. 313F;

AD. 3231;

AE. 325A; 325D; 325E; 325G; 325H; 3251;325L;

325K; 325R; 3255; 325F; 325M; 325T; 325V; 325Y; 325W ou 325P;

AF. 3.2 8D; 328Q; 328K; 328R; 328S; 328T;328V;

3281; 328Y; 328W; 328P; 328G; 328A; 328E; 328F; 328H; 328M OU 328N;

AG. 330L;. 330Y; 3301 OU 33 0V;

AH. 332A; 332D; 332E; 332H; 332N; 332Q;332T;

332K; 332R; 332S; 332V; 332L; 332F; 332M; 332W; 332P; 332G OU

332Y; e

AI. 336Ξ; 336K OU 336Y.

Grup o	Variante	Grup o	Variante
1	A330L / I332E	54	S239D / D265L / N297D / I332E
2	D265F / N297E / I332E	55	S239D / D265T / N297D / Γ332Ε
3	D265Y / N297D / I332E	56	S239D / D265V / N297D / I332E
4	D265Y / N297D / T299L / I332E	57	S239D / D265Y / N297D / I332E
5	F241E / F243Q / V262T / V264F	58	S239D / 1332D
6	F241E / F243Q / V262T / V264E / I332E	59	S239D / I332E
7	F241E / F243R / V262E / V264R	60	S239D / I332E / A330I
8	F241E / F243R / V262E / V264R / I332E	61	S239D / 1332N
9	F241E / F243Y / V262T / V264R	62	S239D / I332Q
10	F241E / F243Y / V262T / V264R / I332E	63	S239D / N297D / I332E
11	F241L / F243L / V262T / V264I	64	S239D ./ N297D / 1332E -/ A33 0Y
12	F241L / V262I	65	S239D / N297D / I332E / A3310Y ,Á-F241.. F243H·/ V262T / V264T
13	F241R / F243Q / V262T / V264R	66	S239D / N297D / 1332E / K326E
14	F241R / F243Q / V262T /	67	S 2 3 9D / N2 97D / I332E /

61/124

	V264R / T332E		L23 5D __.
15	F241 W / F243 Η / V262A / V264A	68	S239D / S298A / I332E
16	F241Y / F243Y / V262T / V264T	69	S23 9D / V2 64I 1 A3 3 0L / I33 2E
17	F241Y / F243Y / V262T / V264T / N297D / Σ332Ε	70	S239D / V264I / I332E
18	F243L / V262I / V264W	71	S239D / V264I / S298A / I332E
19	P243L / V264I	72	S239E / D265N
20	L328D / I332E	73	S239E / D265Q
21	L328E / I332E	74	S239E / I332D
22	L328H / I332E	75	S239E / I332E
23	L328I / I332E	76	S239E / I332N
24	L328M / I332E	77	Ξ239Ε / I332Q
25	L328N / I332E	78	S239E / N297D / I332E
26	L328Q / I332E	79	S239E / V264I / A330Y ' / 1332 E
27	L328T / I332E	80	S239E / V264I / 1332 E
28	L328V / I332E	81	S239E / V264I / S298A / A330Y / I332E _
29	N297D / A330Y / I332E	82	S239N / A330L / I332E __
30	N297D / I332E	83	S239N / A330Y / I332E
31	N297D / I332E / S239D / A3 3OL	84	S239N / I332D
32	N297D / S298A / A330Y / I 332E	85	S239N / I332E
33	N297D / T299L / I332E	86	S239N / I332N
34	N297D / T299F / I332E / N297D / T299H / I332E	87	S239N / 1332Q
35	N297D / T299I / I332E	88	S239N1 S298A / I332E
36	N297D / T299L / I332E	89	S239Q / I332D
37	N297D / T299V / I332E	90	S239Q / I332E
38	N297E / I332E	91	S239Q / I332N ____
39	N297S I I332E	92	S239Q / I332Q
40	P230A / E233D / I332E	93	S239Q / V2641 / I332E___
41	P244H / P245A / P247V	94	S298A / I332E __
42	S239D / A330L· / I332E	95	V264È / N297D / I332E___
43	S239D / A330Y / I332E	96	V2641 / A330L / I332E __.
44	S239D / A330Y ./ T332E / K326E	97_____	V264I / A330Y / I332E
45	S239D / A330Y / I332E / K326T ___ ___	98	V264I / I332E
46	S239D / A330Y / I332E / L234I	99	V264I / S298A / I332E
47	S239D / A330Y / I332E / L235D	100	Y296D / N297D / T332E

62/124

48	S239D V240I	/	A330Y	J	I332E	/	101	Y296E	/	N297D /	1332 E
49	S239D V264T	/	A330Y	/	I332E	/	102	Y296H	/	N297D /	I332E
50	S239D V266I	/	A330Y	/	I332E	/	103	Y2 9 6N	/	N297D /	I332E
51	S239D I332E	/	D265F	/	N2 97D	/	104	Y296Q	/	N297I /	I332E
52	S239D I332E	/	D265H	/	N2 97D	/	105	Y296T	/	N297D /	I332E.
53	S239D I332E	/	D265I	/	_N297D	/

A função efetora pode ser modificada por técnicas como aquelas descritas em Antibody Engineering Technology Art, ou por outros meios. Por exemplo, resíduos(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, permitindo 5 assim a formação de ligação dissulfeto entre cadeias nessa região, resultando na geração de um anticorpo homodimérico que pode possuir capacidade de internalização aprimorada e/ou morte celular mediada por complemento aumentada e ADCC. Veja, Caron et al. (1992) J. Exp Med. 176:1191-1195; and B. Shopes (1992) J..Immunol. 148:2918-2922. Os anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumoral aumentada também podem ser preparados utilizando reticuladores heterobifuncionais como descrito em Wolff et al. (1993) Cancer Research 53:2560-2565. Alternativamente, um anticorpo pode ser elaborado que possui 15 regiões Fc duplas e pode possuir desse modo capacidades de lise de complemento e ADCC aumentadas. Stevenson et al. (1989) Anti-Cancer Drug Design 3:219-230.

B2 . MODIFICAÇÕES DE SEQUÊNCIA

Geralmente, as modificações de sequência podem ser 20 a substituição, deleção, ou adição de um ou mais resíduos no anticorpo ou polipeptídeo que resulta em uma alteração na sequência* de _aminoácido quando--comparada ^com a sequência nativa. A diretriz para determinar qual resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído ou deletado sem afetar

63/124 adversamente a atividade desejada pode ser encontrada ao comparar a sequência do anticorpo ou polipeptídeo com aquela de moléculas de proteína conhecidas homólogas e reduzindo o número de alterações dè sequência de aminoácido feitas nas regiões de alta homologia. A variação permitida pode ser determinada ao realizar sistematicamente inserções, deleções ou- substituições de aminoáçidos na sequência e testar as variantes resultantes para atividade exibida pela sequência nativa inteira ou madura.

As substituições de aminoácido podem envolver a substituição conservadora ou não-conservadora de um ou mais resíduos. Tais substituições são bem conhecidas no estado da técnica, por exemplo, uma substituição conservadora acarreta a substituição de um aminoácido por outro aminoácido que possui propriedades estruturais e/ou químicas similares,-tal como a substituição de uma leucina por uma serina. As substituições não-conservadoras geralmente acarretam a substituição de um aminoácido por outro aminoácido que possui propriedades estruturais e/ou químicas diferentes, por exemplo, um aminoácido acídico (por exemplo, Glu ou Asp) pode ser substituído por um aminoácido básico (por exemplo, Lys ou Asn) .

Um tipo particularmente preferido de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo original (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano), para obter um anticorpo variante que possui propriedades biológicas aprimoradas relativas ao anticorpo original. Uma maneira conveniente para gerar tais variantes substitucionais envolve a maturação de afinidade utilizandq^. exibição de,.-.-fagos Brevemente, diversos sítios de região hipervariável são modificados para gerar todas as substituições amino possíveis em cada sítio, as variantes de anticorpo geradas desse modo

64/124 são exibidas em fagos, e as variantes exibidas'em fagos são então analisadas para sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). Para identificar sítios de região hipervariãvel candidatos para modificação, mutagênese de varredura de alanina podem ser realizadas para identificar resíduos de região hipervariãvel que contribuem significativamente para a ligação de antigeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígenoanticorpo para identificar os pontos de contato entre o anticorpo e seu antigeno. Tais resíduos de contato e resíduos adjacentes são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido ã varredura como descrito aqui e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relativas podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

A modificação também pode envolver a incorporação (por exemplo, por substituição ou adição) de aminoácidos nãonaturais, por exemplo, por métodos tais como aqueles descritos, por exemplo, em Wang et al. (2002) Chem. Comm. 1:1-11; Wang et al. (2001) Science 292:498-500; and van Hest et al. (2001) Chem. Comm. 19:1897-1904. Estratégias alternativas se concentram nas enzimas responsáveis (pela biossíntese de amino acil-tRNA, tal como descrito, por exemplo, em Tang et al. (2001) J. Am. Chem. 123 (44) :1108911090; and Kiick et al. (2001) FEBS Lett. 505 (3):465.

Em uma representação preferida, .pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 resíduos, de .aminoácido , £oram.._- modificados. Adicionalmente ou alternativamente, tais modificações. podem ser caracterizadas possuindo não mais que 1, 2, 3, 4, .5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50

65/124 resíduos de aminoácido modificados. Em uma representação particularmente preferida, pelo menos 1, porém não mais que dez resíduos foram modificados. Adicionalmente ou alternativamente, tais modificações podem ser caracterizadas 5 possuindo não mais que 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 resíduos de aminoácido modificados. As modificações podem ser todas as substituições, todas as deleções, todas as adições, ou qualquer combinação de substituições, deleções ou adições.

As variantes de sequência de aminoácido que codificam moléculas de ácido nucleico podem ser preparadas por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica. Esses métodos incluem, porém sem caráter limitative, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de 15 sequência de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio dirigida) , mutagênese de seleção por restrição, mutagênese PCR, e mutagênese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não-variante do anticorpo.

B3. Outras Modificações

As variantes de polipeptídeo (especialmente variantes de anticorpo) da presente invenção incluem análogos e derivados que são modificados, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula desde que tal ligação 25 covalente permita que o anticorpo mantenha sua imunoespecificidade de ligação a epítopo. Por exemplo, porém sem caráter limitative, os derivados e análogos dos anticorpos, incluem aqueles que_, foram adicionalmente modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, 30 peguilação, f osf orilaçao, amidaçãe,derivatizaçãopor grupos, de proteção/bloqueio conhecidos, divagem proteolítica, ligação a uma unidade de anticorpo celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma entre inúmeras modificações químicas pode

66/124 ser realizada por técnicas conhecidas, inclusive, porém sem caráter limitativo, clivagem química específica, acetilação, formiláçao, síntese metabólica na presença de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o análogo ou derivado pode conter um ou mais aminoácidos não-naturais.

Os anticorpos e polipeptídeos podem ser modificados ao introduzir um ou mais sítios de glicosilação nos anticorpos, deletar um ou mais sítios de glicosilação dos, ou deslocar um sítio de glicosilação existente sobre os anticorpos, de preferência, sem alterar a funcionalidade desejada dos anticorpos, por exemplo, atividade de ligação. Os sítios de glicosilação podem ser introduzidos na, ou deletados da, região variável e/ou constante dos anticorpos, por métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo,· um sítio de glicosilação pode ser introduzido em um anticorpo da invenção ao modificar ou realizar a mutação de uma sequência de aminoácido do anticorpo de modo que a sequência desejada (por exemplo, Asn-X-Thr/Ser) seja obtida, e um sítio de glicosilação pode ser deslocados ao modificar a posição 296 na região Fc, de modo que a posição 296 e não posição 297 seja glicosilada. Os métodos de modificação do teor de carboidrato (glicosilação) de proteínas são bem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, tal como descrito na Patente Nos. U.S. 6.472.511 e 6.218.14 9; Publicação de Patente 2 Nos. U.S. 20030115614 e 20020028486; EP 0359096 Bl; e WO 03/035835.

Em algumas representações, as moléculas da invenção são elaboradas para compreender um .padrão , de glicosilação alterado ou uma glicoforma alterada. As glicoformas elaboradas podem ser úteis para uma jfariedade .de propósitos,. inclusive, porém, sem caráter limitativo, aprimorar a função efetora. As glicoformas elaboradas podem ser geradas por qualquer método conhecido por um elemento versado na técnica,

67/124 por exemplo, utilizando cepas de expressão elaboradas ou variantes, por co-expressão com uma ou mais enzimas,, por exemplo, N-acetilglucosaminiltransferase III (GnT-III), por expressão de um anticorpo da invenção em vários organismos ou 5 linhagens celulares de vários organismos, ou por modificação do(s) carboidrato(s) depois de o anticorpo ser expresso e purificado. Os métodos de geração de glicoformas elaboradas são conhecidos no estado da técnica, e incluem, porém, sem caráter limitative, aqueles descritos, por exemplo, em 10 Okazaki et al. (2004) JMB 336:1239-1249; Shinkawa et al.

(2003) J Biol Chem 278:3466-3473; Shields et al. (2002) J

Biol Chem 277:26733-26740; Davies et al. (2001) Biotechnol

Bioeng 74:288-294; Umana et al. (1999) Nat. Biotechnol

17:176-180; Patente Norte-americana n°. 6.602.684; Publicação 15 de Patente Nos. U.S. 20030157108, 20030115614, e 20030003097;

WO 02/311140; WO 02/30954; WO 01/292246; WO 00/61739; tecnologia Potillegent™ disponível junto ã Biowa, Inc. (Princeton, Nj) ; e tecnologia de glicosilação GlycoMAb™ disponível junto à GLYCART biotechnology AG (Zurich, Suíça). 20 B4 . CONJUGADOS DE POLIPEPTÍDEOS

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser fundidos de maneira recombinante ou quimicamente conjugados (inclusive conjugações covalentes e não-covalentes) com polipeptídeos heterólogos ou porções desses para gerar 25 proteínas de fusão. De preferência, o polipeptídeo da presente invenção (especialmente um anticorpo) é fundido com pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 30 aminoácidos do polipeptídeo heterõlogo para_gerar uma proteína de fusão desejada. A fusão não precisa necessariamente ser direta, porém pode ocorrer através de sequências ligantes. Os polipeptídeos da presente invenção

68/124 também podem ser fixados a suportes sólidos ou matrizes semisólidas, que são particularmente úteis para ímunoensaios ou purificação do antígeno alvo. Tais -suportes e matrizes incluem, porém sem caráter limitative, vidro, celulose, poliacrilamida, microesferas de agarose, microesferas de acrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno. A fixação pode ser realizada, por exemplo, por métodos descritos em Methods in Enzymology, 44 (1976).

Os anticorpos e polipeptídeos podem ser conjugados com um agente terapêutico para modificar uma determinada resposta biológica, afetar (por exemplo, aumentar) a meiavida de soro do agente terapêutico, ou marcar o agente terapêutico com um subconjunto particular de células. Esses também podem ser fundidos com sequências de marcadores (por exemplo, um peptídeo hexa-histidina ou üm marcador sinalizador) para facilitar a purificação. As técnicas de conjugação de tais porções terapêuticas com anticorpos são bem conhecidas; veja, por exemplo, Hellstrom et al, , Antibodies For Drug Delivery, em Controlled Drug Delivery (2nd ed. , Robinson et al, (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc .) .

As proteínas de fusão adicionais podem ser geradas através das técnicas de embaralhamento de genes, embaralhamento de motivos, embaralhamento de éxons, e/ou embaralhamento de códons (coletivamente referido como embaralhamento de DNA) . O embaralhamento de DNA pode ser empregado para alterar as atividades de moléculas da invenção (por exemplo, anticorpos com afinidades maiores e taxas de dissociação menores) . Os anticorpos e polipeptídeos da invenção, ou seus ácidos nucleicosde. codificação,,. podem ..ser., adicionalmente alterados ao serem submetidos a mutagênese aleatória por PCR sujeita a erros, inserção de nucleotídeo aleatória ou outros métodos antes da recombinação. Uma ou

69/124 mais porções de um polinucleotídeo que codifica uma molécula da, podem ser recombinadas com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos, etc., de uma ou mais moléculas heterólogas.

B5. Fragmentos a invenção apresenta adicionalmente um anticorpo e outros fragmentos de polipeptídeo. Tais fragmentos podem ser truncados na terminação N ou terminação C, ou podem ser desprovidos de tais resíduos internos, por exemplo, quando comparados com um anticorpo ou proteína nativa inteira. Alguns fragmentos podem ser desprovidos de resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma atividade biológica desejada. Esses fragmentos podem ser preparados'por qualquer uma . entre inúmeras técnicas convencionais. '· Os fragmentos de peptídeo desejados podem ser quimicamente sintetizados. Uma abordagem alternativa envolve gerar fragmentos de anticorpo ou polipeptídeo por digestão enzimática, por exemplo, ao tratar a proteína com uma enzima conhecida para clivar proteínas em sítios definidos por resíduos de aminoácido particulares, ou ao digerir o DNA com enzimas de restrição adequadas e isolar o fragmento desejado. Ainda outra técnica adequada envolve o isolamento e amplificação de um fragmento de DNA que codifica um anticorpo ou fragmento de polipeptídeo desejado, por reação em cadeia da polimerase (PCR) . Os oligonucleotídeos que definem as terminações desejadas do fragmento de DNA são empregados nos iniciadores 5' e 3' na PCR. De preferência, os fragmentos de anticorpo e polipeptídeo compartilham pelo menos . uma atividade biológica e/ou atividade imunológica com o anticorpo ou polipeptídeo nativo descrito .aqui . . __.------,

Em algumas representações, um polipeptídeo da invenção compreende adicionalmente um domínio de dimerização, que pode compreender uma sequência de dimerização, e/ou

70/124 sequência que compreende um ou mais resíduos de morecisteína. Em algumas representações, o domínio de dimerização ficará localizado entre um domínio variável de cadeia pesada ou cadeia leve de anticorpo e pelo menos uma porção de uma proteína capsidial viral, e uma ou mais ligações dissulfeto e/ou uma única sequência de dimerização podem estar presentes no domínio de dimerização para proporcionar uma exibição bivalente. Em algumas representações, as cadeia pesadas de um F(ab)₂ serão dimerizadas em um domínio de dimerização que não inclui uma região de dobradiça. O domínio de dimerização pode compreender uma sequência zíper de leucina.

Em outra representação, os fragmentos de polipeptídeo da presente invenção compreendem uma sequência de aminoácido de pelo menos 5 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 30 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 60 contíguos amino resíduos, pelo menos 70 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos contíguos 80 resíduos de amincácido, pelo menos contíguos 90 resíduos de aminoácido, pelo menos contíguos 100 resíduos de aminoácido, pelo menos contíguos 125 resíduos de aminoácido, pelo menos 150 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos contíguos 175 resíduos de aminoácido, pelo menos contíguos 200 resíduos de aminoácido, ou pelo menos contíguos 250 resíduos . de aminoácido da sequência de aminoácido de outro polipeptídeo. Em uma representação específica^ um fragmento^ d_e__ um polipepjLÍdeo mantém pelo menos uma função do polipeptídeo.

B6 , ANTICORPOS Bivalentes e daRTs

Os anticorpos bivalentes e reagentes de remarcação

71/124 de afinidade dupla (darts) também são fornecidos, pela presente invenção. Os anticorpos bivalentes e DARTs compreendem domínios de ligação ao antígeno geralmente derivados dos anticorpos e polipeptídeos da invenção. O 5 desenho e construção de anticorpos bivalentes e DARTs é descrito, por exemplo, no Pedido de Patente Norte-americano Provisório n° . 61/019.051 depositado em. 04 de janeiro de 2008 e 60/945.523 depositado em 21 de junho de 2007; Pedido de Patente Norte-americano n° . 11/409.339 depositado em 17 de 10 abril de 2006; Marvin et ai. (2005) Acta Pharmacol. Sin.

26:649-658; Olafsen et al. (2004) Prot.. Engr. Des. Set. 17:21-27; Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448. Cada cadeia de polipeptídeo de uma molécula de anticorpo bivalente compreende um domínio V_L e um 15 domínio V_H, dos mesmos anticorpos ou anticorpos diferentes, que são covalentemente ligados de modo que os domínios sejam limitados pela automontagem. A interação de duas cadeias de polipeptídeo irá produzir dois emparelhamentos Vl-V_h, formando dois sítios de ligação ao epítopo, ou seja, uma 20 molécula bivalente. O domínio V_H ou Vl não é confinado em qualquer posição dentro da cadeia de polipeptídeo, nem os domínios estão restritos em suas posições relativas um ao outro; a única restrição é que a cadeia de polipeptídeo complementar esteja disponível para formar o anticorpo 25 bivalente funcional. Os domínios podem ser separados por um ligante de peptídeo, e as cadeias de polipeptídeo podem ser elaboradas para compreender pelo menos um resíduo de cisteína em çada cadeia, de modo que as ligações dissulfeto entre cadeias possam ser formadas para estabilizar o anticorpo 30 bivalente. _ : .. Onde os domínios V_L e V_K são derivados do mesmo anticorpo, as duas cadeias complementares podem ser idênticas, resultando em um anticorpo monoespecific©

72/124 bivalente, ou podem ser diferentes, resultando em um anticorpo biespecífico bivalente (por exemplo, um que se liga a dois epítopos diferentes no mesmo antígeno). Onde os domínios V_L e V_H são derivados de anticorpos específicos para 5 antígenos diferentes, a formação de um anticorpo bivalente biespecífico funcional exige a interação de duas cadeias de polipeptídeo diferentes, ou seja, a formação de um heterodímero. Em uma representação particular, pelo menos um sítio de ligação de epítopo do anticorpo bivalente ê específico para um antígeno em uma célula particular, tal como uma célula B ou célula T, uma célula fagocítica, uma célula destruidora natural (NK) ou uma célula dendrítica.

Em várias representações, uma ou mais cadeias de polipeptídeo do anticorpo bivalente compreendem um domínio 15 Fc. Os domínios Fc nas cadeias de polipeptídeo das moléculas de anticorpo bivalente, de preferência, são dimerizados, resultando na formação de uma molécula de anticorpo bivalente que exibe propriedades similares à imunoglobulina, por exemplo, interações Fc-FcyR. Os anticorpos bivalentes 20 compreendendo Fc podem ser dímeros, por exemplo, compreendidos de duas cadeias de polipeptídeo, cada uma compreendendo um domínio V_H, um domínio Vl e um domínio Fc. Em várias representações, uma ou mais cadeias de polipeptídeo do anticorpo bivalente compreendem um domínio de dobradiça, 25 que pode ser derivado de qualquer isotipo ou alotipo de imunoglobulina inclusive IgA, IgD, IgG, IgE e TgM. Em representações preferidas, o domínio de dobradiça é derivado de igG, onde o isotipo IgG é igGl, lgG2,-IgG3 ou IgG4, ou um alotipo desse. O domínio de dobradiça pode ser elaborado em 30 uma cadeia de polipeptídeo em qualquer posição .irelativa-.a . ~ outros domínios ou porções da cadeia, e em algumas circunstâncias pode ser elaborado conjuntamente com um domínio Fc de modo que a molécula de anticorpo bivalente

73/124 compreenda um domínio Fc de dobradiça.

Em outras representações, as moléculas de anticorpo bivalente que compreendem os domínios Fc podem ser tetrâmeros, que podem compreender duas cadeias de polipeptídeo mais pesadas (ou seja, uma cadeia de polipeptídeo que compreende uma V_L, uma V_H e um domínio Fc) , e duas cadeias de polipeptídeo mais leves (ou seja, uma cadeia de polipeptídeo que compreende uma V_L e uma V_H) . Tais cadeias mais leves e mais pesadas podem interagir para formar um monômero, e interagir através de seus domínios Fc nãoemparelhados para formar uma molécula similar à Ig, que pode ser uma molécula DART. Tal anticorpo bivalente similar à Ig é tetravalente e pode ser monoespecífico, biespecífico ou tetraespecífico. A espécie DART similar à Ig possui propriedades exclusivas, pois seus domínios podem ser projetados para se ligarem ao mesmo epítopo (para formar um DART similar à Ig específico mono-epítopo tetravalente capaz de se ligar a quatro moléculas de antígeno idênticas), ou a epítopos ou antígenos diferentes. Por exemplo, os seus domínios podem ser projetados para que se liguem a dois epítopos do mesmo antígeno (para formar um DART similar à Ig específico bi-epítopo específico mono-antígeno tetravalente), ou a epítopos de moléculas de antígeno diferentes para formar um DART similar à Ig tetravalente que possui um par de sítios de ligação específicos para um primeiro antígeno e um segundo par de sítios de ligação específicos para um segundo antígeno). As moléculas híbridas que possuem combinações de tais atributos podem ser facilmente produzidas.

Embora não se pretenda ficar limitado a um mecanismo de ação particular, as. moléculas de ... anticorpo bivalente da invenção exibem eficácia terapêutica aumentada relativa aos anticorpos terapêuticos conhecidos no estado da técnica, em parte, devido à capacidade de o anticorpo

74/124 bivalente se ligar imunoespecificamente a uma célula alvo que expressa um antigeno particular (por exemplo, FcyR) em níveis reduzidos, por exemplo, devido ã capacidade de o anticorpo bivalente permanecer por mais tempo sobre a célula alvo devido a uma maior avidez da interação anticorpo bivalenteepítopo. Dessa maneira, os anticorpos bivalentes da invenção possuem utilidade particular no tratamento, prevenção ou administração de uma doença ou distúrbio, tal como câncer, em uma subpopulaçao, onde o antigeno alvo é expresso em baixos níveis na população de célula alvo.

Devido a sua valência aumentada, baixas taxas de dissociação e rápida depuração da circulação (para anticorpos bivalentes de tamanho pequeno, a ou abaixo de -50 kDa) ,· as moléculas de anticorpo bivalente conhecidas no estado da técnica também mostram uso particular no campo’ dé formação de imagens de tumores. (Fitzgerald et al. (1997) Protein Eng.

10:1221). A reticulação de células diferentes é de importância particular, por exemplo, a reticulação de células T citotâxicas em células tumorais. (Staerz et al. (1985) Nature 314:628-631; Holliger et al. (1996) Protein Eng.

9:299-305). Os domínios de ligação a epítopo de anticorpo bivalente também podem ser dirigidos a uma determinante de superfície de qualquer célula efetora imunológica como CD3, CD16, CD32, ou CD64, esses são expressos em linfõcitos T, células destruidoras naturais (NK) ou outras células mononucleares. Em muitos estudos, o anticorpo bivalente que se liga às determinantes de célula efetora, por exemplo, receptores Fc-y (FcyR), também f oi _ obtido para . .ativar-a célula efetora. (Holliger et al. (1996) Protein Eng. 9:299305; Holliger et al. (1999) Cancer ___Res ^..59.^2909-2 916^Norma intente, a ativação de célula efetora é ativada pela ligação de um anticorpo ligado a antigeno a uma célula efetora através da interação Fc-FcyR; dessa maneira, nesse

75/124 aspecto, as moléculas de anticorpo bivalente da invenção podem exibir funcionalidade similar à Ig independente de essas compreenderem um domínio Fc. Mediante a reticulação de tumor e células efetoras, o anticorpo bivalente não só introduz a célula efetora nas proximidades das células tumorais, tal como também resulta em destruição efetiva de tumor. Cao and Lam (2003) Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-97.

As moléculas de anticorpo bivalente da presente invenção podem ser produzidas utilizando uma variedade de métodos, inclusive síntese de proteína desde o início e expressão recombinante de ácidos nucleicos que codificam as proteínas de ligação. As sequências de acido nucleico desejadas podem ser produzidas por métodos recombinant es (ροτ* exemplo, mutagênese PCR de uma variante anteriorménte preparada do polinucleotídeo desejado) ou por' síntese de-DNA em fase sólida. De preferência, são utilizado métodos de expressão recombinante. Em um aspecto, a invenção proporciona um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica uma V_H e/ou V_L de CD16A; em outro aspecto, a invenção proporciona um polinucleotídeo que compreende uma sequência que codifica uma Vh e/ou de CD32B. Devido a degeneraçao do código genético, uma variedade de sequências de ácido nucleico codificam cada sequência de aminoácido de imunoglobulina, e a presente invenção inclui todos os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de ligaçao aqui descritas.

B7, Produção de Anticorpos

Os anticorpos das representações preferidas da invenção podem ser produzidos ou obtidos em qualquer uma entre uma variedade de maneiras. Por exemplo, tais anticorpos podem ser 'obtidos a partir de plasma, de maneira sintética, recombinante ou transgênica, através da célula (por exemplo, cultura de hibridoma) , etc. A produção de proteínas

76/124 sintéticas foi descrita, por exemplo, em Dawson et al. (2000) Ann. Rev Biochem. 69:923-960; Wilken et al. (1998) Curr.

Opin. Biotechnol. 9(4):412-426,- and Kochendoerfer et al. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (6):665-671.

A produção de anticorpos recombinantès e transgênicos foi descrita, por exemplo, em Wang et al. (2007) IDrugs 10 (8):562-565; Hagemeyer et al. (2007) Semin. Thromb. Hemost. 33 (2) :185-195; Rasmussen et al. (2007) Biotechnol.

Lett. 29(6):845-852,- Gasser et al. (2007) Biotechnol. Lett.

(2) :201-212,- Aubrey et al. (2006) J. Soc. Biol. 200(4):345354; Laffly et al. (2006) J. Soc. Biol. 200 (4):325-343,Jefferis (2005) Biotechnol Prog. 21(1):11-16,- Smith et al. (2004) J. Clin. Pathol. 57 (9) :912-917; Kipriyanov et al. (2004) Mol Biotechnol. 26(1):39-60,- Fischer et al. (2003)

Vaccine 21(7-8):820-825,- Maynard et al. (2000) Ann. Rev,

Biomed. Eng. 2:339-376; Young et al. ¢1998) Res. Immunol. 149 (6):609-610,- e Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9 (4) :395-402.

A produção de anticorpos através de cultura celular (por exemplo, hibridoma) foi descrita, por exemplo, em Laffly et al. (2006), supra; Aldington et al. (2007) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sei. 848(1);64-78; S.S. Farid (2006) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sei. 848 (1):8-18,- Birch et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58(56):671-685,- Even et al. (2006) Trends Biotechnol. 24 (3):105108; Graumann et al. (2006) Biotechnol. J. l(2}:164-86;

Patente Norte-americana n” . 7,112,439; e Publicações de

Patentes Norte-americanas n°. 20070037216 e 20040197866..

Os anticorpos podem ser produzidos através de métodos de exibição de fagos, tal como ague 1 es ⁵ÇTÁA——~ exemplo, em Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-86; Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-58;

77/124

Persic et al. (1997) Gene 187:9-18; Burton et al. (1994)

Advances in Immunology 57:191-280; Publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Patente Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908;5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516,637; 5,780.225;

5.658.727; 5.733.743 e 5,969.108. A tecnologia de exibição de fagos também pode ser utilizada para aumentar a afinidade de um anticorpo com seu antígeno. A tecnologia, referida como maturação de afinidade, emprega mutagênese ou deslocamento e re-seleção de CDR utilizando o antígeno^ cognato para identificar os anticorpos que se ligam com maior afinidade ao antígeno quando comparados com o anticorpo inicial ou original. Veja, por exemplo, Glaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903; Wu et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et al. (1995) J. Immunology 155:1994; Schier et al. (1996) J. Mol. Bio. 263:551.

Os anticorpos monoclonals podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos pelos elementos versados na técnica, por exemplo, métodos de hibridoma, tal como descrito, por exemplo, em Kohler et al. (1975) Nature 256:495, Kozbor et al, (1983) Immunology Today 4:72, ou Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, ou métodos de.DNA recombinante,· tai como descrito, por exemplo, na Patente Norte-americana n . 4.816.567, ou os anticorpos podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo em fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et ai. (1991) Nature 352:624-628 and Marks et.al. (1991) J. Mol, Biol, 222:581-597, por exemplo. Vários procedimentos bem conhecidos no estado da^técnica.^.podem—ser . utilizados para-· a-- produção de anticorpos policlonais com um antígeno de interesse. Por exemplo, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com um antígeno

78/124 de interesse ou derivado desse, inclusive, porém, sem caráter limitativo, coelhos, ovelha, cabras, cães, ' camundongos, ratos, e porquinhos da índia, e após permitir uma resposta imunológica, os anticorpos podem ser identificados a partir do soro dos animais imunizados.

Os anticorpos biespecíficos também podem ser produzidos, por exemplo, através da co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde duas cadeias possuem especificidades diferentes, seguido por purificação da molécula desejada utilizando cromatografia de afinidade, tal como descrito por Milstein et al. (1983)

Nature 305:537-39, WO 93/08829, Traunecker et al. (1991) EMBO J. 10:3655-59. Em uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antigeno) são fundidos com as sequências de domínio constante de imunoglobulina, por exemplo, com um domínio constante de cadeia pesada, compreendendo pelo menos parte da dobradiça, regiões C_HZ, e C_H3. Os ácidos nucleicos que codificam essas fusões podem ser inseridos nos mesmos vetores de expressão ou vetores de expressão diferentes, e são expressos em um organismo hospedeiro adequado.

Os anticorpos inteiramente completamente humanos (também referidos como anticorpos completamente humanos) podem ser produzidos utilizando camundongos transgenicos. que são incapazes de expressar genes de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina endógenos, porém, que podem expressar genes de cadeia pesada e leve humanos. Os camundongos transgênicos são imunizados de maneira normal com um antígeno selecionado, por exemplo, todo ou uma porção de um_ polj-peptídep ^.da „ invenção. . Os---~trãhsgenes de imunoglobulina humanos identificados pelos camundongos transgênicos são rearranjados durante a diferenciação de célula B, e subsequentemente se

79/124 submetem à mudança de classe e mutação somática. Dessa maneira, utilizando tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e igE terapeuticamente úteis. Um sumário dessa tecnologia de produção de anticorpos humanos é descrito, por exemplo, em Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93, e na Patente Norte-americana n^q. 5.633.425, Os anticorpos inteiramente humanos também podem ser produzidos utilizando outras - técnicas conhecidas, inclusive bibliotecas de exibição de fagos, tal como descrito por Hoogenboom and Winter (1991) J. Mol. Biol. 227:381 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581. Os anticorpos inteiramente humanos também podem ser obtidos comercialmente junto à, por exemplo, Abgenix, Inc. (Freemont, Calif) -and Genpharm (San Jose, Calif), Os anticorpos inteiramente humanos que identificam um epítopo selecionado podem ser gerados utilizando uma técnica referida como seleção guiada. Nessa abordagem um anticorpo monoclonal não-humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é utilizado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que identifica o mesmo epítopo, tal como descrito, por exemplo, por Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899-903.

A presente invenção também inclui polinucleotídeos que codificam as moléculas da invenção, inclusive os polipeptídeos e anticorpos, bem como vetores que compreendem os polinucleotídeos, e células hospedeiras que compreendem os vetores. Os polinucleotídeos que codificam as moléculas da invenção podem ser obtidos, e a sequência de nucleotídeo dos polinucleotídeos determinada, por qualquer método conhecido no estado da técnica, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, mutagênese sítio dirigida, PCR, etc. Em uma representação; -as “bibliotecas ' humanas ou quaisquer outras bibliotecas ma técnica, podem ser avaliadas por técnicas padrão conhecidas, para clonar .os ácidos nucleicos que

80/124 codificam as moléculas da invenção.

B8 . Caracterização de Anticorpos

Os anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados em uma variedade de maneiras. Em particular, os anticorpos da invenção podem ser avaliados para .a capacidade de se ligarem imunoespecificamente a um antigeno, por exemplo, HER2/NEU, ou, onde a molécula compreende um domínio .Fc (ou porção desse) para a capacidade de exibir interações Fc-FcyR, ou seja, ligação específica de um domínio Fc (ou porção desse) a um FcyR. Tal ensaio pode ser realizado em solução (por exemplo, Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-421), em microesferas (Lam (1991) Nature 354:82-84), em microplaquetas (Fodor (1993) Nature 364:555-556), em bactérias (Patente Norte-americana n°. 5.223.409), em esporos (Patentes Norte-americanas n° . 5.571.698; 5.403.484; e

5.223.409), em plasmídeos (Cull et al - (1992) Proc. Natl.

Acad. Sei. (U.S.A.) 89:1865-1869) ou em fagos (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 87 :6378-6382; e Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301310) . As moléculas que foram identificadas para se ligarem imunoespecificamente a um antigeno podem ser avaliadas para sua especificidade e afinidade com o antigeno.

Os imunoensaios que podem ser utilizados para analisar a ligação imunoespecifica, reatividade cruzada, e interações Fc-FcyR incluem, porém, sem caráter limitativo, sistemas de ensaio competitivos e não-competitivos que utilizam técnicas como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio de imunoadsorção ligado a enzima), imunoensaios tipo sanduíche, ensaios de ímunoprecipitaçao, reaçoes.^de _r precipitinaréãções dé precipitina de difusão em gel, ensaios imunocromatográficos, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento,

81/124 ensaios imunoradiométricos, imunoensaios fluorescentes, e imunoensaios de proteína A, etc. (Vide, por exemplo, Ausubel et al._t 2008, Current Protocols in Molecular Biology).

A afinidade de ligação de um antígeno alvo é tipicamente medida ou determinada por ensaios de anticorpoantígeno padrão, tal como ensaios competitivos Biacore, ensaios de saturação, ou imunoensaios como ELISA ou RIA.

De preferência, a classificação celular ativada por fluorescência (FACS), que utilize qualquer uma das técnicas conhecidas pelos elementos versados na técnica, é utilizada para ensaios imunológicos ou funcionais para caracterizar as moléculas da invenção. Os classificadores de fluxo são capazes de examinar rapidamente um grande número de células individuais que foram ligadas, por exemplo, opsonizadas, por moléculas da invenção (por exemplo, 10 a 100 milhões de células por hora). Adicionalmente, os parâmetros específicos utilizados para a otimização de comportamento de anticorpo, incluem, porém sem caráter limitativo, concentração de antígeno, tempo de competição cinética, ou vigor de FACS, cada um desses pode variar para selecionar as moléculas de anticorpo que exibem propriedades de ligação específica. Citômetros de fluxo para classificar e examinar células biológicas são bem conhecidos no estado da técnica. Os citômetros de fluxo conhecidos são descritos, por exemplo, na Patente Nos. U.S. 4.347.935; 5.464.581;5.483.469; 5.602.039; 5.643.796; e 6.211.477,. Outros citômetros de fluxo conhecidos são o sistema FACS Vantage™ vendido por Becton Dickinson and Company, e o sistema COPAS™ vendido por Union Biometrica.

Os ensaios baseados em ressonância plasmônica de superfície podem ser utilizados para caracterizar. os parâmetros cinéticos* dé um domínio de ligaçao ao antígeno ou ligação de Fc-FcyR. Qualquer método conhecidos pelos versados na técnica pode ser utilizado, por exemplo, a tecnologia

82/124 descrita, por exemplo, em Dong et al. (2002) Review in Mol.

Biotech. 82:303-323; Mullet et al. (2000) Methods 22:77-91;

Rich et al. (2000) Current Opinion in Biotechnology 11:54-61; Fivash et al. ¢1998} Current Opinion in Biotechnology 9.-97101; e Patente Nos. U.S. 6.373.577; 6.289.286; 5.322.798;

5.341.215; e 6.268.125. Os dados são utilizados para representar as curvas de ligação e determinar constantes de taxa, por exemplo, Ko_n, Koff, e a constante de ligação de equilíbrio aparente Kd, por exemplo, tal como descrito, por exemplo, em Myszka (1997} Current Opinionin Biotechnology 8:50-57; O’Shannessy et al. (1996) Analytical Biochemistry 236:275-283; Morton et al. (1995) Analytical Biochemistry 227:176-185; Fisher et al. (1994) Current Opinion.,, in Biotechnology 5:389-95,- 0'Shannessy (19 94) Current Opinion in Biotechnology 5:65-71; e Chaiken et al. (1992) Analytical Biochemistry 201:197-210. Nas representações preferidas, os parâmetros cinéticos determinados utilizando uma análise SPR podem ser u sados como uma medida preditiva de como uma molécula irá funcionar em um ensaio funcional, por exemplo,

ADCC.

A caracterização de ligação a FcyR por moléculas que compreendem um domínio Fc ou porção desse) e/ou que compreendem um domínio de ligação de epítopo específico P^ara um FcyR pode ser realizada de acordo com os métodos descritos em Antibody Engineering Technology Art. Os ensaios de funções de célula efetora são bem conhecidos, por exemplo, tal como descrito em Abdul-Majid et al. (2002) Scand. J. Immunol.

55:70-81; Perussia et al. (2000) Methods Mol. Biol. 121:179192; Lehmann et al. (2000) J. Immunol. Methods 243(1-2):229242; Ping et al. (1998} Immunity 8:403-411; Baggiplini t^al.

.. (1998) -ExperientÍã4’4 {Í0) : 841-848;” Brown (1994) Methods Cell Biol. 45:147-164; and Munn et al. (1990) J. Exp. Med. 172:231-237.

83/124

Por exemplo, os ensaios de fagocitose mediada por FcyR podem ser realizados utilizando monócitos humanos, ao medir a capacidade de as células THP-1 realizarem fagocitose de eritrõcitos de ovelha opsonizados por IgG flucreseeinada (SRBC) pór métodos anteriormente descritos em Tridandapani et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:20480-20487, óu utilizando um ensaio de opsonofagocitose dependente de anticorpo (ADCP) como descrito por Bedzyk et al. (1989) J. Biol, Chem. 264(3):1565-1569. Os métodos padrão conhecidos pelos elementos versados na técnica podem ser utilizados para raractarizar a ligação de Clq e mediação de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) por moléculas da invenção que compreendem domínios Fc ou porções desses). Por exemplo, para determinar a ligação de Clq, um ELISA de ligação de Clq pode ser realizado, e para avaliar a ativação de complemento, um ensaio de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) pode ser realizado, por exemplo, tal como descrito em GazzanoSantoro et al. (1996) J. Immunol. Methods 202:163.

Em outra representação, as moléculas da invenção podem ser avaliadas para atividade ADCC mediada por FcyR em células efetoras, por exemplo, células destruidoras naturais, utilizando qualquer método padrão conhecido pelos elementos versados na técnica e descritos, por exemplo, em Weng et al. (2003) J. Clin. Oncol. 21:3940-3947; Perussia et al. (2000)

Methods Mol. Biol. 121:179-192; Ding et al. (1998) Immunity

8:403-411. Em uma representação preferida específica, um ensaio fluorimétrico com resolução temporal é utilizado para medir a atividade de ADCC contra células alvo marcadas de maneira fluorescente, tal como descrito, por exemplo, em Blomberg et al. (1996) Journal of Immunological^Methods.,.

193:199-206. As-célulás alvo utilizadas nos ensaios ADCC da invenção incluem, porém sem caráter limitative, linhagens de células de câncer de mama, por exemplo, SK-BR-3 com número de

84/124 acesso ATCC HTB-30 (Tremp et al. (1976) Cancer .Res. 33-41); linfócitos B; células derivadas de linfoma de Burkitts, por exemplo, células Raji com numero de acesso ATCC CCL-86 (Epstein et al. (1965) J. Natl. Cancer Inst. 34:231-240), e células Daudi com número de acesso ATCC CCL-213 (Klein et al. ¢1968) Cancer Res. 28:1300-1310). As células alvo devem ser identificadas pelo sítio de ligação ao antígeno da molécula que será avaliada. De preferência, as. células efetoras utilizadas nos ensaios ADCC da invenção são células mononucleares de sangue periférico (PBMC) que são, de preferência, purificadas a partir de sangue humano normal, utilizando métodos padrão conhecidos por um elemento versado na técnica, por exemplo, utilizando centrifugação · de gradiente de densidade Ficoll-Paque.

C. Métodos de Tratamento à Composições Farmacêuticas a administração das composições (por exemplo, anticorpos e polipeptideos) da presente invenção podem ser para um propósito profilático ou terapêutico, ou alternativamente podem ser utilizados para propósitos de diagnóstico. Diz-se que as composições da presente invenção são administradas para um propósito terapêutico se a quantidade administrada for fisiologicamente significativa para proporcionar uma terapia para uma manifestação real da doença. Quando fornecido terapeuticamente, o composto é_r- de preferência, fornecido na identificação (ou pouco depois) de um sintoma de doença real. A administração terapêutica do composto serve para atenuar a gravidade de tal doença ou para reverter seu progresso. Afirma-se que as composições da presente invenção são administradas para um propósito profilático se a quantidade administrada for fisiologicamente^significativa parã fórnecer uma terapia para uma doença ou condição potencial. Quando fornecido profilaticamente, o composto é, de preferência, fornecido

85/124 antes de qualquer sintoma. A administração profilática do composto serve para prevenir ou atenuar qualquer avanço ou recorrência subsequente da doença.

A estipulação de uma terapia ou tratamento se 5 refere a quaisquer indícios de sucesso no tratamento ou melhora de uma lesão, patologia ou condição, inclusive qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo como abatimento, remissão, redução de sintomas ou torna a lesão, patologia ou condição mais tolerável ao paciente, redução na taxa de 10 degeneração ou declínio, tornando o ponto de degeneração final menos debilitante, ou melhora o bem-estar físico ou mental do paciente. O tratamento ou melhora de sintomas pode esta baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos, inclusive os resultados de um exame físico, exame neuropsiquiátricos, 15 e/ou uma avaliação psiquiátrica.

Os indivíduos preferidos para o tratamento incluem animais, com mais preferência, espécies de mamíferos como seres humanos ou outros primatas, e animais domésticos como cães, gatos e similares, submetidos a uma doença e outras 20 condições patológicas. Um paciente se refere a um indivíduo, de preferência, mamífero (inclusive o ser humano}.

Algumas representações da presente invenção referem-se a composições farmacêuticas que compreendem um ou mais agentes terapêuticos, e a métodos de administração de 25 uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes terapêuticos, que são capazes de tratamento profilático e/ou terapêutico de distúrbios. O termo agente terapêutico se refere a qualquer agente que possui um efeito terapêutico para tratar de maneira profilática ou terapêutica um 30 distúrbio. Os agentes terapêuticos exemplificativos _incluem os anticorpos e polipeptídeos da presente invenção, bem como outros agentes terapêuticos que podem ser administrados em combinação com, ou conjugado a, um anticorpo ou polipeptídeo.

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Em um.a representação preferida, o agente terapêutico é um anticorpo da presente invenção, e, de preferência, é um fragmento de anticorpo, um anticorpo bivalente, um DART similar à Ig, ou uma proteína de fusão.

As moléculas da invenção são particularmente úteis para o tratamento e/ou prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção onde uma função de célula efetora (por exemplo, ADCC) mediada por FcyR é desejada (por exemplo, câncer, doença infecciosa). Por exemplo, as moléculas da invenção podem se ligar a um antígeno de superfície celular e um FcyR (por exemplo, FcyRIIIA) em uma célula efetora imune (por exemplo, célula NK), estimulando a função efetora (por exemplo, ADCC, CDC, fagocitose, opsonização, etc.) contra a dita célula. Em algumas representações, os anticorpos e polipeptídeos da invenção são especialmente adequados para o tratamento de cânceres. A eficácia da terapia de anticorpo monoclonal padrão depende do polimorfismo de FcyR do indivíduo. Carton et al. (2002) Blood 99:754- 758; Weng et al. (2003) J Clin Oncol. 21(21):3940-3947. Esses receptores são expressos sobre a superfície das células efetoras e mediam ADCC. Alelos de alta afinidade aprimoram a capacidade das células de mediar ADCC. Os anticorpos e polipeptídeos da invenção podem compreender um domínio Fc variante que exibe afinidade aumentada com FcyR (relativa a um domínio Fc de ocorrência natural) em células efetoras, formando dessa maneira melhores reagentes de imunoterapia para pacientes independentemente de seu polimorfismo FcyR.

Para propósitos de diagnóstico, os anticorpos ou polipeptídeos podem ser acoplados a uma substância detectável, de modo que esses possam ser utilizados.,^ por, exemplo,., para - monitorar o^_ desenvolvimento ou progresso de uma doença, distúrbio ou infecção. Os exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas (por exemplo, peroxidase

87/124 de raiz-forte, beta-galactosidase, etc.), grupos protéticos (por exemplo, avidina/biotina), materiais fluorescentes (por exemplo, umbeliferona, fluoresceína, ou ficoeritrina), materiais luminescentes (por exemplo, luminol), materiais bioluminescentes (por exemplo, luciferase ou aequorina), materiais radioativos (por exemplo, carbon-14, manganês-54, estrôncio-85 ou zinco-65), metais de emissão de põsitron, e íons de metal paramagnêtico não-radioativo. A substância detectável pode ser acoplada ou conjugada diretamente às moléculas da invenção ou indiretamente através de um intermediário (por exemplo, um ligante), utilizando técnicas conhecidas.

Cl. Distúrbios Tratáveis

Distúrbios exemplificativos que podem ser tratados por várias representações da presente invenção incluem, porém, sem caráter 'limitative, distúrbios proliferativos, distúrbios proliferativos celulares, e câncer, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios, e doenças infecciosas. Em várias representações, a invenção inclui métodos e composições para o tratamento, prevenção ou administração de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais moléculas (anticorpos ou polipeptídeos) que se ligam a um antígeno da doença. Por exemplo, as moléculas da invenção são particularmente úteis para a prevenção, inibição, redução de crescimento ou regressão de tumores primários, metástase de células·cancerosas, e doenças infecciosas. Embora não pretendendo se limitara um mecanismo de ação particular, as moléculas da invenção mediam a função efetora resultando em depuração de tumor, redução de tumor ou uma combinação desses. Em representações alternativas, os anticorpos bivalentes da invenção mediam a atividade terapêutica mediante a reticulação de antígenos de superfície

88/124 celular e/ou receptores e apoptose aumentada ou sinalização reguladora de crescimento negativo.

Os anticorpos com uma afinidade reduzida com FcyRIIB ,e. uma afinidade aumentada com FcyRIIIA e/ou FcyRIIA podem resultar em uma resposta de ativação aumentada mediante a ligação de FcyR e possuem assim eficácia terapêutica para o tratamento e/ou prevenção de câncer. Os exemplos nãolimitativos de cânceres tratáveis pelos métodos aqui incluem linfoma mieloide agudo, carcinoma adrenal, adenocarcinoma, câncer basal, câncer de bexiga, câncer nos ossos, sarcoma ósseo e de tecido conjuntivo, câncer cerebral, câncer de mama, câncer bronquial, câncer cervical, ícoriocarcinoma, leucemia linfocitica crônica, leucemia mielogenosa crônica, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer do endométrio, câncer de esôfago, câncer ocular, câncer de tubo de falópio, câncer de vesícula, câncer gastrointestinal, glioma, leucemia de células pilosas, hepatoma, doença de Hodgkin, câncer das vias biliares intra-hepáticas, câncer nas articulações, sarcoma de Kaposi, câncer de rim, câncer de laringe, câncer de fígado, leucemia, câncer pulmonar, leucemia linfoblãstica, linfoma, mesotelioma maligno, medulobastoma, melanoma, mesotelioma, câncer de ouvido médio, mieloma múltiplo, mieloma, mixosarcoma, câncer da cavidade nasal, câncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma Não-Hodgkin, câncer pulmonar de. célula não-pequena, câncer nasal, câncer· da cavidade oral, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de peritônio, câncer de faringe, câncer de glândula pituitária, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de glândulas salivares, câncer de pele, sarcoma de tecido mole, carcinoma de células escamosas, câncer de estômago,' câncer testicular, câncer de tiroide, câncer urinário, câncer uterino, câncer vaginal, câncer vesicular, câncer de vulva, e tumor de Wilm.

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Em algumas representações, o câncer é um câncer hematopoiético ou relacionado. ao sangue, tal como linfoma, leucemia, mieloma, malignidades linfoides, câncer de baço, e câncer dos linfonodos. Em uma representação preferida, o câncer é um câncer associado à célula B, como, por exemplo, linfoma de grau elevado, intermediário ou baixo (inclusive linfoma de célula B como, por exemplo, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de grandes células, linfoma folicular, linfoma de Hodgkin, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal, linfoma de célula B de tecido linfoide associado à mucosa, linfoma não-Hodgkin, linfoma linfocítico pequeno, e linfornas de células T) e leucemias (inclusive leucemia linfocítica crônica, tal como leucemia de célula B (linfócitos CD5+ B) , leucemia mieloide crônica, leucemia linfoide, tal como leucemia linfoblastica aguda, mielodisplasia, leucemia mieloide, tal como leucemia mieloide aguda, e leucemia secundária), mieloma múltiplo, tal como malignidade de célula de plasma, e outros cânceres hematológicos e/ou associados às células B ou células· T. Outros cânceres exemplificativos são cânceres de células hematopoiéticas adicionais, inclusive leucócitos polimorf©nucleates, tal como basófilos, eosinófilos, neutrôfilos e monócitos, células dendríticas, plaquetas, eritrócitos e células destruidoras naturais. '

Em algumas representações, o câncer que será tratado é o câncer de mama, câncer de próstata, câncer uterino, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer de endométrio, carcinoma adrenal, ou câncer pulmonar de células não-pequenas. Em algumas representações, o câncer é o câncer de mama ou câncer de próstata. Em algumas representações^ o câncer ' é ' um câncer êm^ que HER2/NÊÚ é superexpresso. Em uma representação específica, um anticorpo ou polipeptídeo da invenção inibe ou reduz o crescimento de células cancerosas

90/124 em pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 35%, pelo menos 30%, pelo menos 5 25%, pelo menos 20%, ou pelo menos 10% em relação¹ ao crescimento de células cancerosas na ausência do anticorpo ou polipeptídeo da invenção.

Os anticorpos com uma afinidade aumentada com FcyRIIB e uma afinidade reduzida com FcyRIIIA e/ou FcyRIlA 10 podem resultar em uma resposta de ativação reduzida mediante a ligação de FcyR e, desse modo, possuem eficácia terapêutica para o tratamento e/ou prevenção de inflamação e doença autoimune. Os exemplos de distúrbios auto-imunes que podemser tratados pelos métodos aqui incluem, porém, sem caráter 15 limitativo, alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolípide, doença de Addison auto-imune, doenças auto-imunes da glândula adrenal; anemia hemolítica auto-imune, hepatite auto-imune, ooforite auto-imune e orquite, trombocitopenia auto-imune, doença de Behcet, 20 penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, dermatite relacionada a espru celíaco, síndrome de fadiga crônica (CFIDS), polineuropatia inflamatória desmielinizante crônica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, doença por crioaglutinina, doença de Crohn, lúpus discoide, 25 crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Graves, Guillain-Barre, tireoidite de’ Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, pürpura trombocitopênica idiopática (ITP), neuropatia IgA, artrite juvenil, líquen plano, lúpus eritematoso, doença de Meniere, 30 doença de tecido conjuntivo misto, esclerose múltipla,

------ mias tenia grave, 'pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policrondrite, gíndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e

91/124 dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoríatica, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, artrite reumatoide, sarcoidose, escleroderma, síndrome de Sjogren, síndrome do homem rígido, 5 lúpus eritematoso e sistêmico, arterite de Takayasu, arteriste temporal/arterite de células gigantes, diabetes melito tipo 1 ou imune-mediado, colite ulcerativa, uveíte, vasculitide como vasculite dermatite herpetiforme, vitiligo, e granulomatose de Wegener.

Os exemplos não-limitativos de distúrbios inflamatórios tratáveis pelos métodos aqui incluem distúrbios inflamatórios imune-mediados (IMIDs), que são condições inflamatórias causadas e sustentadas por uma resposta imunológica patológica específica de antigeno. Entre esses distúrbios estão vários tipos de doenças alérgicas, tal como asma, febre do feno, e urticaria, artrite, tal como osteoartrite e artrite reumatoide, inflamação crônica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), distúrbios de tecido conjuntivo, fibrose, doença de rejeição ao enxerto e enxerto contra hospedeiro, doença inflamatória do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa), osteolise inflamatória, diabetes insulino-dependente, fibrose pulmonar, retinite, artropatia indiferenciada, espondiloartropatia indiferenciada, e uveíte. As moléculas da invenção»' que compreendem pelo menos um domínio de ligação ao epítopo específico para FcyRlIB e/ou um domínio Fc variante com uma afinidade aumentada com FcyRlIB e uma afinidade reduzida com FcyRIIIA também podem ser utilizadas para prevenir a rejeição de transplantes.

Os polipeptídeos anti-inflamatórios da presente i-—- invenção irão; de^pi-éférência/ reduzir a inflamação em um animal em pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%,. pelo menos 80%, pelo, menos 75%, pelo menos

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70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 45%, pelo menos 4 0%, pelo menos 4 5%, pelo menos 3 5%, pelo, menos 30%, pelo menos 25%, pelo menos 20%, ou pelo menos 10% em relação à inflamação em um que não recebe tais polipeptídeos.

Em algumas representações, os polipeptídeos da invenção são tóxicos a um agente infeccioso, aumentam a resposta imunológica contra o dito agente ou aumentam a função efetora contra o dito agente,, com relação à resposta imunológica na ausência da dita molécula. As doenças infecciosas que podem ser tratadas ou impedidas pelas moléculas da invenção são causadas por agentes infecciosos que incluem, porém sem caráter limitativo, bactérias, fungos, protozoários, e vírus s. As doenças bacterianas exemplify cat ivas não-limitativas incluem aquelas causadas’-'por Bacillus antracis (anthrax), Borrelia burgdorferi (doença de Lyme), Candida, clamídia, cólera, difteria, E. coli. Enterococcus faecials, Heliobacter pylori, Klebsiella pneumoniae,.legionella, micobactéria, micoplasma, Neisseria, pertussis, plague, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, S. pneumonia, Salmonella, estafilococos, estreptococos, e tétano. Doenças causadas por protozoários não-limitativas incluem, aquelas causadas por kokzidioa, leishmania, malaria, ou Trypanosoma.

Os exemplos de doenças virais incluem aquelas causadas por adenovirus, arbovirus, coronavirus, vírus coxsackie, citomegalovírus, ebola, echinovírus, echovirus, endotoxina (LPS), enterovirus, vírus Epstein Barr, vírus da hepatite (por exemplo, hepatite tipo A, hepatite tipo B, hepatite tipo C, hepatite murina), vírus herpes (por exemplo, herpes simples tipo I (HSV-I) , herpes simples^_tipo_II_ III, vírusherpesgamã de murino) , vírus da imunodeficiência humana tipo I (hiv-i) , vírus da imunodeficiência humana tipo II (Hiv-Ii) , huntavírus, influenza, vírus da leucemia (por

93/124 exemplo, leucemia murina, leucemia felina, etc.); vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus do papiloma, papovavírus, poliovirus, vírus sincicial respiratório, retrovirus, rinovírus, peste bovina, rotavirus, vírus da rubéola, varíola, vírus 1 linfotrópico da célula T, vaccinia, catapora, e agentes de doenças virais como meningite viral, encefalite, ou dengue.

C2. Formulações

As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos de preparação de composições farmaceuticamente úteis, e podem incluir um veículo e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável. As composições podem estar sob qualquer forma adequada, por exemplo, comprimidos, pílulas, pós, pastilhas, saches, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (como’um sólido ou em um meio líquido} , pomadas contendo, por exemplo, até 10%, em peso, do composto ativo, cápsulas de gelatina macias e duras, supositórios, soluções injetáveis estéreis, e pós embalados estéreis, apenas para mencionar algumas alternativas nãolimitativas. Tais composições podem ser preparadas por qualquer método conhecido, por exemplo, ao misturar o ingrediente ativo com o(s) veículo(s) ou excipiente (s) sob condições estéreis.

Os ingredientes ativos também podem ser formulados para fornecer uma liberação rápida, sustentada ou retardada do ingrediente ativo após a administração ao paciente empregando procedimentos conhecidos no estado da técnica. As características físicas e químicas das composições da invenção podem ser modificadas ou otimizadas de acordo com o elemento versado na técnica, dependendo do _modo de administração e’’da”' doença ou distúrbio particular que serã tratado. As composições podem ser fornecidas em formas de dosagem unitária, em um recipiente vedado, ou como parte de

94/124 um kit, que pode incluir instruções de uso e/ou uma pluralidade de formas de dosagem unitária.

Em representações particulares, os agentes terapêuticos podem ser incorporados em uma composição, -por, 5 por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartícuias, microcápsulas, de células recombinantes capazes de expressar o anticorpo ou proteína de fusão, endocitose mediada por receptor (Vide, por exemplo, Wu and Wu (19 87) J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construção de um ácido nucleico como parte de um vetor retroviral ou outro vetor, etc. Em outra representação particular, os agentes terapêuticos são fornecidos como um pó liofilizado seco ou concentrado isento dê água em um recipiente hermeticamente vedado e podem ser reconstituídos, por exemplo, com água ou solução salina até a 15 concentração adequada para administração a um indivíduo. ·

De preferência, o agente terapêutico é fornecido como um pó liofilizado estéril seco em um recipiente hermeticamente vedado em uma dosagem unitária ,de pelo menos 5 mg, com mais preferência, pelo menos 10 mg, pelo menos 15..mg, 2 0 pelo menos 25 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 4 5 mg, pelo menos 5 0 mg, ou pelo menos 75 mg. O pó liofilizado pode ser armazenado entre 2 e 8 °C em seu recipiente original e as moléculas, devem ser administradas de maneira parenteral dentro de doze horas, de preferência, dentro de 6 horas, 25 dentro de cinco horas, dentro de 3 horas, ou dentro de uma hora após a reconstituição. Em uma representação alternativa, os agentes terapêuticos são fornecidos em forma líquida em um recipiente hermeticamente vedado que indica a quantidade e concentração do agente terapêutico. De preferência, a forma 30 líquida é fornecida em um recipiente hermeticamente vedado de pelo mènos ‘l ~mg/ml, com mais preferência, pelo menos 2.5 mg/ml, pelo menos 5 mg/ml, pelo menos 8 mg/ml, pelo menos 10 mg/ml, pelo menos 15 mg/kg, pelo menos 25 mg/ml, pelo menos

95/124 mg/ml, pelo menos 100 mg/ml, pelo menos 150 mg/ml, pelo menos 200 mg/ml das moléculas.

C3 - Kits

As composições também podem ser incluídas em um kit. O kit pode incluir, em aspectos não-limitativos, uma composição farmacêutica que compreende um agenté terapêutico, instruções para administração e/ou outros componentes. Em representações preferidas, o kit pode incluir uma composição pronta para administração. Os recipientes dos kits podem incluir um frasco, dosador, embalagem, compartimento, ou outros tipos de recipientes, dentro dos quais um componente pode ser colocado. O recipiente pode incluir ãreas de marcação sobre sua superfície. As áreas de marcação, por exemplo, podem ser uma palavra, uma frase, uma abreviação, uma figura, ou um símbolo. Os recipientes podem dispensar uma quantidade predeterminada do componente (por exemplo, as composições da presente invenção) . A composição pode ser dispensada em um spray, um aerossol, ou em uma forma líquida ou forma semi-sólida. Os recipientes podem possuir mecanismos de aspersão, bomba, ou aperto. Em alguns aspectos, o kit pode incluir uma seringa para administrar as composições da presente invenção.

Onde houver mais de um componente no kit (esses podem ser embalados juntos) , o kit também irá conter geralmente um segundo, terceiro ou outros recipientes adicionais dentro dos quais os componentes adicionais podem ser separadamente colocados. Os kits da presente invenção também podem incluir um recipiente que aloja os componentes em estreito confinamento em escala comercial. Tais recipientes podem incluir recipientes plásticos mo^,dadQS_ P^or injeção ou a sopro' dentro dos quais os frascos, dosadores, ou embalagens desejados são mantidos, um kit também pode incluir instruções para empregar os componentes do kit bem como o uso

96/124 de quaisquer outras composições, compostos, agentes, ingredientes ativos, ou objetos não incluídos no kit. As instruções podem incluir variações que podem, ser implementadas. As instruções podem incluir uma explicação de como aplicar,- utilizar, e manter os produtos ou composições, por exemplo.

C4 . Administração e Dosagem

Uma variedade de vias de administração das composições da presente invenção está disponível. Tal modo particular selecionado irá depender, naturalmente, do agente terapêutico particular selecionado, seja a administração para a prevenção, o diagnóstico, ou o tratamento de doença, a gravidade do distúrbio médico que é tratado e a dosagem requerida para eficácia terapêutica. Os métodos déssa invenção podem ser praticados utilizando qualquer modo de administração que é aceitável do ponto de vista médico, e produzem níveis eficazes dos compostos ativos sem causar efeitos adversos clinicamente inaceitáveis. Tais modos de administração incluem, porém, sem caráter limitativo, oral, bucal, sublingual, inalação, por mucosa, retal, intranasal, tópica, ocular, periocular, intraocular, transdérmica, subcutânea, intra-arterial, intravenosa, intramuscular, parenteral, ou metodologias de infusão. Em uma representação específica, pode ser desejado administrar as composiçoes farmacêuticas da invenção localmente à área necessitada de tratamento; isso pode ser realizado, por exemplo, e nãó a título de limitação, por infusão local, por injeção, ou por meio de um implante, sendo que o dito implante é um material poroso, não-poroso, ou gelatinoso, que inclui membranas, tal como membranas de sialastic, ou fibras. _ , .---.^==^.-Tai--como ’ aqui empregado, o termo quantidade terapeuticamente eficaz significa a quantidade total de cada componente ativo da composição farmacêutica ou método que é

97/124 suficiente para mostrar um benefício significativo ao paciente, ou seja, a cura ou melhora de condições crônicas, uma redução nos sintomas, um aumento na taxa de cura de tais condições, ou uma alteração detectãvel nos níveis de uma substância no tecido tratado ou circundante, Quando aplicado a um ingrediente ativo individual, administrado separadamente, o termo s.e . refere àquele ingrediente individualmente. Quando aplicado a uma combinação, o termo se refere a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, sejam administradas em combinação, em série, ou simultaneamente.

O programa de dosagem e quantidades eficazes para usos terapêuticos e profiláticos, ou seja, o regime- de dosagem, irá depender de uma variedade de fatores, inclusive o estágio da doença ou condição, a gravidade da doença- ou condição, o estado geral de saúde do paciente, a condição física do paciente, idade e similares. A eficácia terapêutica e toxicidade das composições podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos, farmacológicos e toxicolõgicos padrão em culturas celulares ou animais experimentais. Por exemplo, há inúmeros métodos de determinação de ED₅q (^a dose terapeuticamente eficaz em 50 porcento da populaçao) e LD₅q (a dose letal de 5 0 porcento da população) . A razão de dose entre efeitos terapêuticos e tóxicos é o índice terapêutico, e essa pode ser expressa como a razão ED_5O/LD₅o· As composições que exibem altos índices terapêuticos sao preferidas. Os dados obtidos de ensaios de cultura celular ou estudos com animais podem ser utilizados para formular uma faixa de dosagéns para uso humano. A dosagem está, de preferência, dentro de uma faixa de concentrações que inclui — O EDso _com pouca~<5ü nenhuma toxicidade, e pode variar dentro dessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada, sensibilidade do paciente, e a via de administraçao.

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O regime de dosagem também leva em consideração os parâmetros farmacocinéticos bem conhecidos no estado da técnica, ou seja, a taxa de absorção, biodisponibilidade, metabolismo, depuração, e similares (Vide, por exemplo, Hidalgo-Aragones (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617; Groning (1996) Pharmazie 51 :337-341; Fotherby (1996) Contraception 54:59-69; Johnson (1995) J. Pharm. Sei. 84:1144-1146; Rohatagi (1995) Pharmazie 50:610-613; Brophy (1983) Eur. J. Clin. Pharmacol. 24:103-108; o Remington mais recente, supra). O estado da técnica permite que o clínico avalie o regime de dosagem para cada paciente, agente terapêutico e doença ou condição individual tratada. Administrações únicas ou múltiplas das composições da presente invenção podem ser administradas dependendo ' da dosagem e frequência como exigido e tolerado pelo paciente. A duração do tratamento profilático e terapêutico irá variar dependendo da doença ou condição particular que será tratada. Algumas doenças exigem tratamento agudo enquanto outras requerem terapia a longo prazo. Se a administração ^;.não estiver sobre uma base diária, por exemplo, se as injeções forem administradas . a cada número de alguns dias, a cada número de algumas semanas, ou a cada número de alguns meses, então mais agente terapêutico pode ser incluído em cada administração, de modo que a liberação diária do agente- seja adequada para satisfazer as necessidades terapêuticas.

Em uma representação preferida, os agentes terapêuticos da invenção são administrados em regimes de dosagem metronômica, tanto por infusão contínua como administração frequente sem períodos de descanso prolongados. Tal administração metronômica pode envolver a_ ^dosagem- em intervalos- constantes' sem períodos de descanso. Tipicamente os agentes terapêuticos, em agentes citotóxicos particulares, são utilizados em doses menores. Tais regimes de dosagem

99/124 incluem a administração diária crônica de doses relativamente baixas durante períodos de tempo prolongados, que podem reduzir os efeitos colaterais tóxicos e eliminar os períodos de descanso. Kamat et al. (2007) Cancer Research 67:281-88.

Em algumas representações, . os agentes terapêuticos são administrados por infusão de baixa dose ou contínua crônica que varia de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 2 dias, a aproximadamente 1 semana, a. aproximadamente 2 semanas, a aproximadamente 3 semanas, a aproximadamente 1 10 mês, a aproximadamente 2 meses, a aproximadamente 3 meses, a aproximadamente 4 meses, a aproximadamente 5 meses, a aproximadamente 6 meses. A programação de tais regimes de dose pode ser otimizada pelo oncologista especialista.

. Para anticorposincluídos pela invenção, a dosagem 15 administrada a um paciente é tipicamente 0,0_L001 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente. De preferência, a dosagem administrada a um paciente fica compreendida entre 0,0001 mg/kg ^e 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg -e 5 mg/kg, 0,0001 e 2 mg/kg, 0,0001 e 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 20 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg a 0,25 mg/kg, 0,0001 a 0,15 mg/kg, 0,0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 a 0,5 mg/kg, 0,01 a 0,25 mg/kg ou 0,01 a 0,10 mg/kg do peso corporal do paciente. A dosagem e frequência de administração podem ser reduzidas ou alteradas ao aumentar a penetração de 25 tecido dos anticorpos por modificações como, por exemplo, lipidação. Em uma representação, a dosagem dos anticorpos administrados a um paciente é 0,01 mg a 1000 mg/dia, quando utilizados como terapia com agente único. Em outra representação os anticorpos são utilizados em combinação com 30 outras composições terapêuticas e a dosagem administrada a um ___-paciente - é--menor⁷*'que ” quando as ditas moléculas forem utilizadas como uma terapia com agente único. Em um exemplo preferido, um indivíduo é tratado com anticorpos na faixa

100/124 entre aproximadamente 0,1 a 30 mg/kg de peso corporal, uma vez por semana durante aproximadamente Uma a dez semanas, de preferência,· entre duás e oito semanas, com mais preferência, entre aproximadamente tr~es e' sete semanas, e com ainda mais preferência, durante aproximadamente quatro, cinco,. ou' seis semanas.

C5 . Terapias de Combinação

A invenção compreende adicionalmente a administração dos anticorpos ou polipeptídeos da invenção em combinação com outras terapias conhecidas pelos elementos versados na técnica para o tratamento ou prevenção de câncer, doença auto-imune, inflamação, ou doença infecciosa, inclusive, porém sem caráter limitative, quimioterãpias padrão e experimentais atuais, terapias hormonais, terapias biológicas, imunoterapias, terapias de radiação, ou cirurgia. Em algumas representações, os anticorpos ou polipeptídeos da invenção podem ser administrados em combinação com uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um ou mais agentes terapêuticos conhecidos pelos elementos versados na técnica para o tratamento e/ou prevenção de câncer, doença auto-imune, doença infecciosa ou intoxicação.

Tal como aqui empregado, o termo combinação refere-se ao uso de mais de um agente terapêutico. O uso do termo combinação não limita a ordem na qual os agentes terapêuticos são administrados a um indivíduo com um distúrbio, nem significa que os agentes sao administrados exatamente ao mesmo tempo, porém significa que um anticorpo ou. polipeptídeo da invenção e o outro agente são administrados a um mamífero em uma sequência e dentro de um intervalo de tempo de. modo que o anticorpo ou polipeptídeo da invenção possa'—atuar conjuntamente com outro agente para fornecer, um benefício aumentado ao contrário do que ocorrería se esses fossem administrados de outro modo. Por exemplo,

101/124 cada agente terapêutico (por-exemplo, quimioterapia, terapia de radiação, terapia hormonal ou terapia biológica) pode ser administrado ao mesmo tempo- ou sequencialmente em qualquer ordem em pontos diferentes de. tempo; entretanto, se não forem 5 administrados ao mesmo tempo, esses poderíam. ser administrados suficientemente quase ao mesmo tempo, para proporcionar o efeito terapêutico ou profilático, desejadoCada agente terapêutico pode ser administrado separadamente, em qualquer forma adequada e por qualquer via adequada, por 10 exemplo, um pela via oral e um pela via parenteral.

Em várias representações, um primeiro agente terapêutico pode ser administrado antes (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 15 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou subsequente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 20 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas após) a administração de um segundo agente terapêutico (ou subsequente) a um indivíduo com um distúrbio. Em representações preferidas, dois ou mais agentes são administrados na mesma visita do paciente, ou não mais 25 que 12 horas de intervalo, não mais que 24 horas de intervalo, ou não mais que 48 horas de intervaloEm algumas representações, os agentes terapêuticos são ciclicamente administrados a um indivíduo. A terapia de ciclo envolve a admin is tração de um primeiro agente durante 3 0 um período de tempo, seguida pela administração de um_segpndo.. ..- agente e/ou terceircT agente durante um período de tempo e repetindo essa administração sequencial. A terapia de ciclo pode reduzir o desenvolvimento de resistência a uma ou mais

102/124 terapias, evitar ou reduzir os efeitos colaterais de uma das terapias, e/ou aprimorar a eficácia do tratamento. Os ciclos exemplificativos são aproximadamente uma vez por semana, aproximadamente uma vez a cada dez dias, uma vez a cada duas semanas, e aproximadamente uma vez a cada três semanas. Cada ciclo pode compreender pelo menos uma semana de descanso, pelo menos duas semanas de descanso, pelo menos três semanas de descanso. O número de ciclos administrados é de aproximadamente um a aproximadamente doze ciclos, mais tipicamente de aproximadamente dois a aproximadamente dez ciclos, e mais tipicamente de aproximadamente dois a aproximadamente oito ciclos.

Em uma representação para o tratamento de um distúrbio proliferativo celular, um anticorpo ou polipeptídeo da presente invenção ê conjugado, ou administrado em combinação com, outro agente terapêutico, como, porém sem caráter limitative, um agente alquilante ípor exemplo, mecloretamina ou cisplatina), inibidor de angiogênese, antraciclina (por exemplo, daunorrubicina/daunomicina ou doxorrubicina) , antibiótico (por exemplo, dactinomicina, bleomicina, ou antramicina), anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF como bevacizumab (vendido como AVASTIN® por Genentech, Inc.), um anticorpo anti-EGFR como panitumumab (vendido como VECTIBIX™ por Amgen, Inc.), ou um anticorpo anti-integrina como natal izumab (vendido como TYSABRI® por Biogen Idee and Elan Pharmaceuticals, Inc.)), um antimetabolito (por exemplo, metotrexato ou 5-fluorouracil), um agente anti-mi tótico (por exemplo, vincristina ou paclitaxel) , uma citotoxina (por exemplo, um agente citostático ou citocidal) , um agente deterapia^ hormona1. (por exemplo, um -modürãdóirde receptor de eslrogênio seletivo (por exemplo, tamoxifeno ou raloxifeno), inibidor de aromatase, análogo de liberação de hormônio luteinizante, agente

103/124 progestacional, adrenocorticosteroide, estrogênio, androgenic, agente anti-estrogênio, agente de bloqueio de receptor de androgênio, inibidor de 5-alfa redutase, inibidor de produção adrenal, etc.), um inibidor de metaloprotease de matriz, um elemento radioativo (por exemplo, alfa-emissores, gama-emissores, etc.), ou quaisquer outros agentes terapêuticos

Os angiogênese (fragmento exemplos não-limitativos de inibidores de adequados incluem ABT-627; angiostatina de plasminogênio); angiozima; antitrombina antiangiogênica III; Bay 12-9566; benefina; bevacizumab; BMS275291; bisfosfonatos; inibidor derivado de cartilagem (CDI), CAI; fragmento CD59 de complemento; CEP-7055; Col '3; combretastatin A-4; endostatina (fragmento XVIII de inibidores de farnesil transferase (FTI), de fibronectina; gro-beta; halofuginona;

fragmento de hexassacarídeo; HMV833;

gonadotropina ccriônica humana (hCG); IM-862; alfa/beta/gama interferon; proteína induzível por interferon (IP-10); interleucina-12; kringle 5 (fragmento de plasminogênio);

colágenc); fragmento heoannases;

marimastat; inibidores de metaloproteinase (TIMPs); 2metoxiestradiol; MMI 270 (CGS 27023A) ; MoAb IMC-IC1 1; neovastat; NM-3; panzem, PI-88; inibidor de ribonuclease placental; inibidor de ativador de plasminogênio; fator plaquetãrio 4 (PF4); prinomastat; fragmento de prolactina

16kDa; proteína relacionada a proliferina (PRP); ^PTK 787/ZK 222594; retinoides; solimastat; esqualamina, SS 3304, 5416; SU6668; SU1 1248; tetraidrocortisol-Ξ;

tetratiomolibdato; tãlidomida; trombospondina-1 (TSP-D; TNP470,- fator-beta transformador de crescimento (TGF-b); vasculostatina; -vasostatina (fragmento de calreticulina) ;

3D6126; e ZD 6474.

Os exemplos não-1imitatives de anticorpos

104/124 adicionais para o tratamento de um distúrbio proliferativo celular incluem anticorpos para 17-1A, ανβ3, AFP, CD3, CD18, CD20, CD22, CD33, CD44, CD52, CEA, CTLA-4, proteínas associadas a DNA, receptor EGF, Ep-CAM, GD2-gângliosideo, gp Illb/Illa, gp72, HER2, HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, IgE, gangliosideo GD3, MUC-I, nuC242, antígeno PEM, antígeno SK-I, antígeno tumoral CA125, antígeno tumoral MUC1, VEGF, e receptor VEGF.

Em uma representação diferente, um anticorpo ou polipeptídeo da presente invenção pode ser administrado em combinação com um agente terapêutico ou agentes para o tratamento de um distúrbio inflamatório, tais como, porém sem caráter limitative, anticorpos, agentes anticolinérgicos, beta-agonistas, metilxantinas, fármacos anti-inflamatorios não-esteroidais (NSAIDs) (por exemplo, aspirina, ibuprofeno, celecoxib ou diclofenac), e fármacos anti-inflamatorios esteroidais (por exemplo, glucocorticoides, dexametasona, cortisonas, prednisona ou eicosanoides). Os anticorpos adicionais podem ser qualquer anticorpo para o tratamento de doença inflamatória, tais como, porém sem caráter limitative, anticorpos para alpha4beta7, beta2-integrina, CBL, CD2, CD3, CD4, CDlla, CDII/18, CD14, CD18, CD23, CD25, CD40L, CD64 (FcR) , CD80, CD 147, Complemento (CS), E-selectina, Fact VII, gpllbllla, ICAM-3, IgE, IL-4, IL-S, IL-8, TNF-alfa, e VLA-4.

Em uma representação adicional, um anticorpo ou polipeptídeo da presente invenção pode ser administrado em combinação com um agente ou agentes terapêuticos para o tratamento de um distúrbio auto-imune, como, porém sem caráter limita, anticorpos, brequinar, ciclofosfamida, ciclosporina A, moduladores de receptor de citocina, .desoxispergual ina;· ieflunomida, antibióticos macrolídeos, malononitrilo amidas (por exemplo, leflunamida), meüotrexato, metilprednisolona, mizoribina, micofenolato mofetil,

105/124 rapamicina (sirolimo), esteroides, e moduladores de receptor de célula T. Os anticorpos adicionais podem ser qualquer anticorpo adequados para o tratamento de um distúrbio autoimune, exemplos não-limitativos incluem anticorpos contra receptor a4b7 integrina, antígeno CBL, CD2, CD4, CD23, CD4 0, CD80, FcRI, Interferon Gama, ΙΒ-8, inosina monofosfato desidrogenase, interleucina-1 beta ICE, quinase P38MAP, e

TNF.

Em ainda outra representação, um anticorpo ou polipeptídeo da presente invenção pode ser administrado em combinação com um agente ou agentes terapêuticos para o tratamento de uma doença infecciosa, como, porem sem caráter limitative, um antibiótico, agente anti-füngica, ou antiviral. Os antibióticos que podem ser utilizados em combinação com as moléculas da invenção incluem, porém, sem caráter limitative, 2,4 diaminopirimidinas (por exemplo, brodimoprima) , aminoglicosídeos (por exemplo, apramicina, neomicina, ou espectinomicina), anfenicóis (por exemplo, cloranfenicol) , anfomicinas, ansamicinas (por exemplo, rifamida e rifampina), bacitracinas, carbacefens (por exemplo, loracarbef) , carbapenemzs (por exemplo, biapenem e imipenem), cefalosporinas (por exemplo, cefalexina ou cefadroxil), cefamicinas (por exemplo, cefbuperazona, cefmetazol, e cefminox) , claritromicinas, eritromicinas, lincosamidas (por exemplo, clindamicina e lincomicina), macrolídeos (por exemplo, tobramicina), monobactamas (por exemplo, carumonama), nitrofuranas (por exemplo, furaitadona, e cloreto de furazólio) , oxacefemas (por exemplo, flomoxef e moxalactam) , penicilinas, quinolonas (por exemplo, ofloxacina ou ciprofloxacina) , sulfonamidas ___ . benzilsulf amida;- ^:e — súifacitína) , ^—sul fonas (por exemplo, diatimosulfona, glucosulfona de sódio, e solasulfona) , e tetraciclinas (por exemplo, apiciclina e clortetraciclina).

106/124

Os agentes antifúngicos que podem ser utilizados em combinação com as moléculas da invenção incluem, porém, sem caráter limitativo, anfotericina B, butoconazol, ciclopirox, clotrimazol, econazol, fluconazól, flucitosina, griseofuldina, haloprogrina, intratecal, itraconazól, cetoconazol, miconazol, naftifina, nistatina, terbinafina, terconazol, tioconazol, e undecilenato. Os agentes antivirais úteis que podem ser utilizados em combinação com as moléculas da' invenção incluem, porém, sem caráter limitativo, inibidores de transcriptase reversa não-núcleosideo, análogos de nucleosídeo, inibidores de transcriptase reversa de nucleosídeo, e inibidores de protease. Exemplos nãolimitativos de tais agentes são aciclovir, adefovir, alfa interferons, amantadina, amprenavir, clevadina, entecavir, foscarnet, gangciclovir, idoxuridina, indinavir, lopinavir, pleconaril, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, trifluridina, vidarabina, e zidovudina.

C6 . Demonstração de Utilidade Terapêutica

As composições farmacêuticas, agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção são, de preferência, testadas in vitro, em um sistema de cultura celular, e em um organismo de modelo, tal como um sistema de modelo animal roedor, para a atividade terapêutica desejada antes do uso em humanos. Por exemplo, os ensaios que podem ser utilizados para determinar se a administração de uma composição farmacêutica especifica for desejada, incluem ensaios de cultura celular em que uma amostra de tecido de paciente se desenvolve em cultura, e fica exposto ou, de outro modo, em contato com uma composição farmacêutica da invenção, e o efeito de tal composição sobre a amostra de tecido é observada. A amostra ^teci^pode ser obtida por - biopse· ' -dõ; paciente” Esse teste permite a identificação da(s) molécula(s) profilático(s) ou terapêutico(s) terapeuticamente mais eficaz para cada

107/124 paciente individual, ensaios in vitro representativas de distúrbio auto-imune

Em várias representações específicas, podem ser realizados com células tipos de células envolvidos em um ou inflamatório (por exemplo, células

T) , para determinar se uma composição farmacêutica da invenção possui um efeito desejado sobre tais tipos de células.

Os sistemas de modelo animal incluem, porém, sem caráter limitative, ratos, camundongos, galinhas, vacas, macacos, porcos, cães, coelhos, etc. Qualquer sistema animal bem conhecido no estado da técnica pode ser utilizado. Em uma representação específica da invenção, combinações de agentes profiláticos e/ou terapêuticos são testadas em um sistema de modelo de camundongo. Os modelos animais preferidos para uso nos métodos da invenção são, por exemplo, camundongos transgênicos que expressam FcyRs humanos em células efetoras de camundongo, por exemplo, qualquer modelo de camundongo descrito na Patente Norte-americana n^e . 5.877.396 pode ser utilizado na presente invenção.

₂Q A atividade anti -inflamatõria pode ser determinada utilizando vários modelos animais experimentais e espontâneos de artrite inflamatória é conhecido no estado da técnica e descrito em Crofford LJ. e Wilder R.L., Arthritis and Autoimmunity in Animals, em Arthritis and Allied Conditions:

A Textbook of Rheumatology, McCarty et [alpha]/.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993) . Por exemplo, modelos de artrite induzida por adjuvante como artrite induzida por carrageenan-, xymosan-, ou colágeno em ratos, hamste coelhos, cães e porcos, são úteis no estudo de atividade anti-inflamatõria, e a inibição de edema de pata induzida por carrageenanemrat oscuina àvaliaçao ih vivo primária p atividade anti-inflamatõria da maioria dos NSAIDs, e e considerada preditiva de eficácia humana, Esses modelos são

108/124 descritos, por exemplo, em Winter et al. (1962) Proc. Soc. Exp. Biol Med, 111:544-47; e Hansra et al. (2000) Inflammation 24(2):141-55. Os modelos animais de doença inflamatória do intestino também podem ser utilizados para avaliar a eficácia de terapias da invenção, por exemplo, os modelos descritos, por exemplo, em Strober (1985) Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S; Kim et al. (1992) Scand. J. Gastroentrol. 27:529-37). Nesses modelos, colite ulcerativa e doença de Crohn podem ser induzidos em animais por administração oral de polissacarídeos sulfatados, sulfato de dextrano ou irritantes químicos.

A eficácia no tratamento de distúrbios auto-imunes pode ser avaliada utilizando modelos animais para distúrbios auto-imunes como diabetes tipo 1, auto-imunidade de tiroide, lúpus eritematoso sistêmico, e glomerulonefrite, por exemplo, os modelos descritos em Flanders et al. (1999) Autoimmunity 29:235-46; Krogh et al. (1999) Biochimie 81 :511-15; Foster (1999) Semin. Nephrol- 19:12-24, etc.

A atividade anti-câncer dos agentes terapêuticos também pode ser determinada utilizando vários modelos animais experimentais para o estudo de câncer como o modelo de camundongo SCID, camundongos transgênicos ou camundongos nus com xenoenxertos humanos, e outros modelos animais como hamsters, coelhos, etc. conhecidos no estado da técnica e descritos em Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd) ; and Anticancer Drug. Development Guide’ (1997 ed. Teicher). Os modelos animais preferidos são modelos de xenoenxerto d^camundo^g^^ AP linhagens de célula-tumoral que podem'ser utilizados como uma fonte de tumores em xenoenxerto incluem, porém, sem caráter limitative, Células SKBR3 e MCF7, que podem ser derivadas de

109/124 pacientes com adenocarcinoma de mama. Essas células possuem receptores erbB2 e prolactina. As células SKBR3 foram utilizadas rotineiramente na técnica como ADCC e modelos de tumor em xenoenxerto. Alternativamente, as células OVCAR3 derivadas de um adenocarcinoma ovariano humano podem ser utilizadas como uma fonte de tumores em xenoenxerto.

Os agentes terapêuticos da invenção são, de preferência, testados in vitro, e então in vivo, para a atividadeterapêutica ou profilática desejada, antes do uso em humanos. Os agentes terapêuticos e métodos podem ser avaliados utilizando células de uma linhagem celular tumoral ou maligna. Muitos ensaios padrão na técnica podem ser utilizados para avaliar tal sobrevivência e/ou crescimento; por exemplo, a proliferação celular pode ser avaliada ao medir a incorporação H-timidina, por contagem celular direta, por detecção de alterações na atividade transcricional de genes conhecidos como proto-oncogenes (por exemplo, fos, myc) ou marcadores de ciclo celular; a viabilidade celular pode ser avaliada por coloração com azul de tnpano, a diferenciação pode ser avaliada visualmente baseada em alterações em morfologia, crescimento e/ou formação de colônia reduzida em agar macio ou formação de rede tubular na membrana basal tridimensional ou preparação de matriz extracel, etc.

Os dados obtidos dos ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagem dos agentes terapêuticos para uso em humanos. A dosagem de tais agentes está, de preferência, dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem

ED_S0 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode_variar dentro dessa faixa-dependendo da forma de dragem empregada e a via de administração utilizada. Para qualquer agente Utilizado no método da invenção, a dose terapeuticamente

110/124 eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura celular. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração de plasma circulante que inclui o IC_£O {ou seja, a concentração do composto de teste que realiza uma inibição da metade dos sintomas) como determinado em cultura celular. Tais informações podem ser utilizadas para determinar de maneira mais precisa as doses úteis em humanos. Os níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho.

D. Outros Métodos

Dl . TERAPIA DE GENE

Em uma representação específica, os ácidos nucleicos que compreendem sequências que codificam moléculas da invenção, são administrados para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas associados a uma doença, distúrbio, ou infecção, por meio de terapia genetica. A terapia genética refere-se à terapia realizada pela administração a um indivíduo de um ácido nucleicó expresso ou passível de expressão. Nessa representação da invenção, os ácidos nucleicos produzem seu anticorpo codificado ou proteína de fusão que media um efeito terapêutico ou profilático. Quaisquer métodos para terapias de genes disponível na técnica podem ser utilizados, por exemplo, os métodos descritos, por exemplo, em Goldspiel et al. (1993) Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; and Morgan and Anderson .(1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217.

Em um aspecto preferido, uma composição da^invençao compreende ácidos .^nucleicos que codificam um anticorpo, anticorpo bivalente, ou proteína de fusão da invenção, sendo que os ditos ácidos nucleicos fazem parte de um vetor de

111/124 expressão que expressa o anticorpo em um hospedeiro adequado. Em particular, tais ácidos nucleicos possuem promotores, de preferência, promotores heterólogos, operavelmente ligados à região de codificação de anticorpo, sendo que o dito promotor 5 ê induzível ou constitutivo, e, opcionalmente, específico de tecido. Em outra representação particular, as moléculas de ácido nucleico são utilizadas onde as sequências de codificação de anticorpo e quaisquer outras sequências desejadas são fíanqueadas por regiões que promovem 10 recombinação homóloga em um sitio desejado no genoma, fornecendo dessa maneira, expressão intracromossomal dos ácidos nucleicos que codificam anticorpo, tal como descrito em Koller and Smithies (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:8932-35; and Zijlstra e? [alpha]/. (1989) Nature 342:435

38 .

A administração dos ácidos nucleicos a um indivíduo pode ser direta, em tal caso o indivíduo é diretamente exposto ao ácido nucleico ou vetores de condução de ácido nucleico, ou indireta, em tal caso, as células são, primeiro, 20 transformadas com os ácidos nucleicos in vitro, então transplantadas no indivíduo. Essas duas abordagens sã conhecidas, respectivamente, tal como em terapia de genes in vivo ou ex vivo.

Em uma representação específica, um polinucleotideo 25 que codifica um polipeptídeo da presente invenção é administrado in vivo, onde esse é expresso para produzir o polipeptídeo codificado. Isso pode ser realizado por qualquer um entre inúmeros métodos, tal como por infecção utilizando vetores retrovirais ou outro vetor viral (como descrito, por 30 exemplo, na Patente Norte-americana n . 4.980.²⁸⁶/.-4 aí. (1993) MethEnzymol217:581 -599Γ Salmons' and Gunzberg ~~^(1993) Human Gene Therapy 4:129-141; Grossman and Wilson (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devei. 3:110-114; Kozarsky

112/124 and Wilson (1993) Current Op. in Genetics and Dev. 3:499-503; Walsh et al. (1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300; Bout et al. (1994) Human Gene Therapy 5:3-10; Boesen et al. (1994) Biotherapy 6:291-302; Clowes et al. (1994) J. Clin.

Invest. 93:644-651; Klein et al. (1994) Blood 83:1467- 1473; e Patente Norte-americana η*. 5.436.146), ou por injeção direta de DNA descoberto, ou mediante o uso de bombardeio de micropartículas (por exemplo, uma pistola gênica), ou revestimento com lipídeos ou receptores de superfície celular 10 ou agentes de transfecção, encapsulação em lipossomas, micropartículas, ou microcápsulas, ou ao administrar os mesmos em ligação a um peptídeo que é conhecido por entrar no núcleo ou em ligação a um antígeno submetido a endocitose mediada por receptor (como descrito, por exemplo, em Wu and 15 Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432; Joliot et al. (1991)

Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868; WO 92/06180; WO 92/22635; W092/20316; W093/14188; WO 93/20221) (que podem ser utilizados para marcar tipos de células que expressam especificamente os receptores), etc.

Um ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula antes da administração in vivo da célula recombxnante resultante, por exemplo, tal como descrito em WO 94/08598; Rheinwald (1980) Meth. Cell Bio. 21A:229; Pittelkow and Scott (1986) Mayo Clinic Proc. 61:771; Stemple and Anderson (1992)

Cell 7 1: 973-985. . As células recombinantes resultantes podem ser administradas a um indivíduo por vários métodos conhecidos no estado da técnica. As células sanguíneas recombinantes (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras) são, de preferência, administradas de maneira 30 intravenosa. A quantidade de células prevista para^Jiso depende do efeito, desejado, estado do'paciente, etc., e pode ’’''ser determinada por um elemento versado na técnica. As células dentro das quais um ácido nucleico pode ser

113/124 introduzido para propósitos de terapia de gene inclui qualquer tipo de célula disponível desejado, e incluem, porém, sem caráter limitative, células epiteliais, células endoteliais, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células sanguíneas como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitosvárias célulastronco ou células progenitoras, em particular células-tronco hematopoiéticas ou progenitoras, por exemplo, tal como obtido 10 da medula óssea, sangue do cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, etc. Em uma representação preferida, a célula utilizada para terapia de gene é autóloga ao indivíduo.

D2 . Terapia de Vacina

Em algumas representações, os anticorpos da invenção podem ser utilizados para induzir uma resposta imunológica contra um agente antigênico ou imunogênico, inclusive, porém sem caráter limitative, contra antígenos cancerosos e antígenos de doença infecciosa. As composiçoes 2 0 de vacina da invenção compreendem um ou mais agentes antigênicos ou imunogênicos contra os quais se deseja uma resposta, em que o um ou mais agentes antigênicos ou imunogênicos são revestidos com um anticorpo da invenção. As composições de vacina da invenção são particularmente 25 eficazes para provocar uma resposta imunológica, de preferência, uma resposta imunológica protetora contra o agente antigênico ou imunogênico, que pode ser um vírus contra o qual se deseja uma resposta imunológica,_ ou um antígeno derivado-de outros patógenos virais ou não-virais.

0 Ainda em outras representações, a invenção^_inclui células patogênicas ou vírus, de preferência, vírus 'atenuados, que expressam o anticorpo sobre sua superfície. A invenção inclui adicionalmente métodos para induzir a

114/124 tolerância em um indivíduo ao administrar uma composição da invenção. De preferência, uma composição adequada para induzir a tolerância em um indivíduo, compreende um agente antigênico ou imunogênico revestido com um anticorpo da invenção.

D3. Marcação de Lipossomas ou Outros Microcarreadores e

Nanocarreadores

Em algumas representações, os anticorpos da invenção podem ser utilizados para preparar lipossomas marcados para liberação de uma composição terapêutica desejada (por exemplo, agentes anti-câncer) a uma célula alvo (por exemplo, uma célula de câncer de próstata ou outra célula de expressão HER2/NEU). A preparação e uso de imunolipossomas para liberação marcada de fármacos antitumorais é analisada em Mastrobattista et al. (19

Advanced Drug Delivery Reviews 40:103-127. Os lipossomas são estruturas vesiculares baseadas em bicamadas de lipídeo. Esses podem ser tão pequenos quanto 2 0 nm e tão grandes quanto 10 pm de diâmetro. Esses podem ser unilamelares (apenas uma bicamada envolve um núcleo aquoso) ou multi lamelares (duas ou mais bicamadas concentricamente orientadas em torno de um núcleo aquoso) . A marcação de lipossomas utilizando uma variedade de agentes de marcação (por exemplo, anticorpos da invenção) é bem conhecida no estado da técnica. Vide, por exemplo, as Patentes Norteamericanas n . 4.957.773 e 4.. 603.044. Os métodos padrão de acoplamento de agentes de marcação a lipossomas podem ser utilizados. Os lipossomas marcados por anticorpo podem ser construídos utilizando, P°^r exemplo, lipossomas que incorporam a proteína A. Veja Renneisen et al.

Biol. Chem.^26.5 :1633:7..16342,- and Leone tti^êt~aÍT (1990) Proc. Natl. Acad. sci. (U.S.A.) 87:2448-2451.

Em uma representação preferida, os lipossomas sao

115/124 formados a partir de lipídeos de formação de vesícula padrão, que geralmente incluem fosfolipídeos neutros e negativamente carregados e um esterol, tal como colesterol. A seleção de lipídeos é geralmente conduzida por consideração de, por exemplo, tamanho e estabilidade de lipossoma dos lipossomas na corrente sanguínea. Uma variedade de métodos está disponível para preparar lipossomas, tal como descrito, por exemplo, em Szoka, et al. (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng.

9:467; Patente NOS. U.S. 4.235.871; 4.501.728; e 4.837.028. Um método produz vesículas multilamelares de tamanhos heterogêneos. Nesse método, os lipídeos de formação de vesícula são dissolvidos em um solvente orgânico adequado ou sistema de solvente e secados sob vácuo ou um gás inerte para formar uma película de lipídeo fina. Caso desejado, a película pode ser redissolvida em um solvente adequado, tal como butanol terciário, e então liofilizada para formar uma mistura lipídica mais homogênea que está sob uma forma similar ao pó mais facilmente hidratado. Essa película e revestida com uma solução aquosa do fármaco marcado e o componente de marcação (anticorpo) e deixado hidratar, tipicamente durante um período de 15 a 60 minutos com agitação. A distribuição de tamanho das vesículas multilamelares resultantes pode ser deslocada em direção a tamanhos menores ao hidratar os lipídeos sob agitação mais vigorosa ou ao adicionar detergentes solubilizantes como desoxicolato.

D4 . IMUNOENSAIOS

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para detectar HER2/NEU, ou células que expressam HER2/NEU. Qualquer um entre inúmeros métodos pode scr utilizadopara realizar tal,. ^detecção. Por exemplo,“erisáíos de ligaçao imunolõgicos podem ser utilizados (Vide, por exemplo, as Patentes Norte-americanas n° . 4.366.241; 4.376.110,

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4.517.288,- e 4.837.168). Para uma análise dos imunoensaios gerais, vide também Asai (ed. 1993) Methods in Cell Biology Vol. 37, Academic Press, New York; Stites & Terr (eds. 1991) Basic and Clinical Immunology 7th Ed.

Dessa maneira, a presente invenção apresenta métodos de detecção de células que expressam HER2/NEU. Em um método, uma biopse é realizada no indivíduo e o tecido coletado é testado in vitro. O tecido ou células do tecido são então contatados, com um anticorpo anti-HER2/NEU da invenção. Quaisquer complexos imunes que resultam indicam a presença de uma proteína HER2/NEU na amostra submetida à biopse. Para facilitar tal detecção, o anticorpo pode ser radiomarcado ou acoplado a uma molécula efetora que é um marcador detectável, tal como um radiomarcador. Em outro método, as células podem ser detectadas in.vivo utilizando sistemas de formação de imagens típicos. Então, a localizaçao do marcador é determinada por qualquer um dos métodos conhecidos para detectar o marcador. Um método convencional de visualização de imagens diagnósticas pode ser utilizado. Por exemplo, isótopos paramagnéticos podem ser utilizados para MRI. A internalização do anticorpo pode ser importante para prolongar a vida dentro do organismo além daquela proporcionada por ligação extracelular, que será suscetível ã depuração pelo ambiente enzimático extracelular acoplado com depuração circulatória.

As proteínas HER2/NEU também podem ser detectadas utilizando métodos de imunoensaio padrão e os anticorpos da invenção. Os métodos padrao incluem, por exemplo, radioimunoensaio, métodos irriuúócromatográficos, imunoensaios sanduíche (inclusive ELISA) , ensaios de imunofluorescência, Western blot, - cromatografia de ’ afinidade (ligante de afinidade ligado a uma fase solida) , e detecção in situ com anticorpos marcados.

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Agora descrevendo geralmente a invenção, esses serão mais facilmente entendidos por meio de referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos a título de ilustração e não se prestam a limitar a presente invenção exceto onde 5 especificado em contrário.

EXEMPLO 1

Determinações de Afinidade BIACorb

Os parâmetros cinéticos da ligação, de anticorpos eluídos e purificados foram analisados utilizando um ensaio

BIAcore (instrumento BIAcore 1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ.) e software associado, her-2 foi imobilizado em uma das quatro células de fluxo (célula de fluxo 2) de uma superfície de chip sensor através de química de acoplamento de amina (por modificação de grupos carboximetil com mistura de

NHS/EDC) de modo que aproximadamente 1000 unidades de resposta (RU) de receptor sejam imobilizadas sobre a superfície. Apés isso, os ésteres ativos não-reagidos foram limitados com uma injeção de IM Et- NH2. Uma vez que uma superfície adequada foi preparada, ch4D5-FcWT (Fc de ocorrência natural), ch4D5, e trastuzumab (controle)foram injetados em concentrações de 6,25 - 200 nM sobre a superfície em uma taxa de fluxo de 7 0 mL/min durante 18 0 seg.

uma vez que um conjunto inteiro de dados foi coletado, as curvas de ligação resultantes foram globalmente 25 ajustadas e as constantes de taxa e constante de ligação de equilíbrio aparente foram calculadas utilizando algoritmos de computador fornecidos pelo fabricante, tal como descrito em BIAevaluation Software Handbook disponível junto à BIAcore, inc. A Figura 3 mostra os resultados gráficos da análise SPR, e as constantes calculadas são fornecidas na Tabelaji._

Tabela 5; Constantes-Cinéticas e de Equilíbrio Calculadas a partir de dados BIAcore Data Kal

Kdl (1/s)

KD (nm)

Analito

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Fc de ocorrência natural ch4D5	1,7 x 105	-3,2 X 10-7 (est. )
ch4D5	1,1 x 105	-6,3 x 10-6 (est.)	—
trastuzumab___________	1,6 x 105	1,3 X 10-4	o 00

EXEMPLO 2

APOPTQSE

Várias linhagens celulares foram incubadas durante a noite com ch4D5 e ch4D5-FcMTl. A apoptose foi analisada por 5 análise FACS, e os resultados são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6___________
	Experimento 1	Experimento 2__
Linhagens Celulares	ch4D5	ch4D5 FcMTl	ch4D5	ch4D5 FcMTl
SKBR3	35%	30%	15%	10% ______
JIM1T	10%	10% . ·	12-3 0% ‘ r	10-30%
BT474	0	0	0	.0 __________ _
MCF-7	0	0	0	0___
MDA MB 435	0	0	0 ___	0
MDA NIB 468	10%	10% ;		o— '. --- . ·
MDA^M'i>B-361s''f		0 ‘
MDA NIB 453	2 0% ;.<·	20%···
MDA MB 231	0	0	0__________	0________________
ZR-75-1	0	0	0 _	0_______________
A54 9	0	0	0	_0_________________________.
SKOV3	0	0	0 __	0_________________
HT-2 9	0	0	0	0
	19% ; ?
OVCAR-3 <	10¾ :>-·	14%	5%
ÓVCAR-8	0	0	0 ___	_0____________________
BT-20	12% - /?	10% . ... -	20% . . ' :

EXEMPLO 3

PROLIFERAÇÃO

A incorporação de [³H] timidina ( [ H] TdR) em DNA foi utilizada como um índice bioquímico de proliferação 10 celular SKBR3, para comparar os efeitos de vários anticorpos 4D5 quiméricos das presentes representações. O efeito de ch4DS-Ag, ch4D5, e Ch4D-FcMTl sobre as células CD16-158F+ e CD16- 158V+ foi estudado e comparado_cpm-.-ps--..controlesOs· resultados são mostrados na Figura 4.

EXEMPLO 4

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Atividade Antitumoral em Camundongos (Modelo de Câncer de

Mama}

A atividade antitumoral de vários anticorpos foi estudada em um modelo de câncer de mama utilizando camundongos não-transgênicos e transgênicos (hCD16A). Cinquenta camundongos Balb/c RAG2-/- não-transgênicos da colônia de reprodução MacroGenics foram injetados s.c. no dia 0 com células de câncer de mama JMT-I. Os camundongos foram divididos em cinco grupos de 10 camundongos cada, e tratados de maneira intraperitoneal (IP} semanalmente durante oito semanas com ch4D5 N297Q, Fc de ocorrência natural ch4D5, ch4D5-FcMTl, ch4D5-FcMT2, ou PBS (controle negativo). O desenvolvimento tumoral é monitorado duas vezes por semana, utilizando calibres, e o peso do tumor foi estimado pela seguinte fórmula: peso de tumor = (comprimento x largura²)/2. Os resultados são mostrados na Figura 5. Vinte e três camundongos transgênicos Balb/c RAG2-/- mCD167- hCD16A₊ da colônia de reprodução MacroGenics foram injetados s.c. no dia 0 com células de câncer de mama JIMT-I. Os camundongos foram divididos em três grupos, e tratados de maneira intraperitoneal (IP) semanalmente durante 8 semanas com Fc de ocorrência natural ch4D5 (n=8), ch4D5-FcMTl (n-8), ou PBS (controle negativo; n=7) . O desenvolvimento tumoral ê monitorado duas vezes por semana, utilizando calibres, e o peso do tumor foi estimado pela seguinte fórmula: peso de tumor = (comprimento x largura²)/2. Os resultados são mostrados na Figura 6.

EXEMPLO 5

Atividade Antitumoral em Camundongos (MoDELQ Dg—Câncer a atividade—antitumoral de vários' anticorpos foi estudada em um modelo de câncer ovariano utilizando camundongos não-transgênicos e transgênicos (hCD16A> . 22

120/124 camundongos não-transgênicos R37- N/N de colônia de reprodução MacroGenics foram injetados s.c. no dia 0 com células de câncer ovariano SKOV-3. Os camundongos foram divididos em quatro grupos, e tratados de maneira intraperitoneal (IP) semanalmente durante 8 semanas com ch4D5 N297Q (n=5) , Fc de ocorrência natural ch4D5 (n=6), ch4D5FcMTl (n=6), ou PBS (controle negativo; n=5). O desenvolvimento tumoral é monitorado duas vezes por semana, utilizando calibres, e o peso do tumor é estimado pela seguinte fórmula: peso de tumor = (comprimento x largura²)/2. Os resultados são mostrados na Figura 7, Painel A. Os camundongos transgênicos 32 R37- N/N hCD16A+ de colônia de reprodução MacroGenics foram injetados s.c. no dia 0 com células de câncer ovariano SKOV-3. Os camundongos foram divididos em quatro grupos, e tratados de maneira intraperitoneal (IP) semanalmente durante oito semanas com ch4D5 N297Q (n=8), Fc de ocorrência natural ch4D5 (n=8), ch4D5-FcMTl (n=8) , ou PBS (controle negativo; n=8) . O desenvolvimento tumoral é monitorado duas vezes por semana, utilizando calibres, e o peso do tumor foi estimado pela seguinte fórmula: peso de tumor = (comprimento x largura )/2. Os resultados são mostrados na Figura 7, Painel B. Os camundongos transgênicos 96 mCD16-/- huCDi6A FoxNl-/- (nu/nu) da colônia de reprodução MacroGenics foram injetados s.c. no dia 0 com células de câncer ovariano SKOV-3. Os camundongos foram divididos em seis grupos de 16 camundongos cada, e tratados de maneira intraperitoneal (IP) semanalmente durante oito semanas com ch4D5-FcMT3, ch4D5-FcMTl, ch4D5-FcMT4, ch4D5, ch4D5Ag, ou PBS (controle negativo)-; O desenvolvimento tumoral é monitorado duas vezes por semana, utilizando .calibres

o. peso _? do · . tumor... foi. estima do <—pe la seguinte fórmula: peso de tumor = (comprimento x largura )/2. Os resultados são mostrados na Figura 8.

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EXEMPLO 6

Ensaios de ADCC em Várias Linhagens de Células Cancerosas

A Figura 9 ilustra uma imunocoloração representativa de várias linhagens de células cancerosas para 5 HER2/NEU. As linhagens celulares foram classificadas de acordo com sua intensidade de coloração HER2/NEU como especificado no kit de teste HER2/NEU vendido como DAKO HerceptTest™ (DakoCytomation, Giostrap, Denmark): coloração de HER2/NEU inexistente (pontuação DAKO O) ,· coloração de 10 HER2/NEU fraca (pontuação DAKO 1 + ) ; coloração de HER2/NEU moderada (pontuação DAKO 2 + ) ; e coloração de HER2/NEU forte (pontuação DAKO 3+). Os vários painéis representam as várias linhagens celulares, tal como mostrado na Tabela 7

Tabela 7: Coloração DAKO de Várias Cancerosas na Figura 9	Linhagens	de	Células
Pain el	Linhagem Celular	Descrição	Sxtios/C élula	Pontua ção____
A	MDA-MB-435	Carcinoma de mama	4,7 103	X	0
B	MDA-MB-23 1	Adenocarcinoma de	mama	1, 6 104	X	0
C	A54 9	Adenocarcinoma pulmonar	3,4 104	X	1 +
D	OVCAR-8	Carcinoma de ovário	4,4 104	X	1 +
E	MCF-7	Adenocarcinoma de	mama	4,5 104	X	1+
F	BT-20	Carcinoma ductal	6,9 104	X
G	HT-2 9	Câncer Cólon/Colorretal	de	9,4 104 _	X	1 +
H	ZR75-1	Carcinoma ductal	1,4 105	X	2 +
I	JIMT-1	Carcinoma de mama	2,0 105	X	2 +
J	MDA-MB-453	Carcinoma de mama	2, 8 105	X	3 +
K	BT-474	Carcinoma ductal	. . ..	2-,0 Τ06·Τ	X	3 +
L	SKBR-3	Carcinoma de mama	3,0 106	X	3 +

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M

mSKOV-3

Câncer de ovário

4,0 x 106______

Diversos anticorpos ch4D5 inclusive anticorpos ch4D5 que possuem Domínios variantes Fc foram testados para a capacidade de mediar ADCC nas linhagens de células cancerosas, inclusive ch4D5-FcMTl, ch4D5-FcMT2, ch4D5-FcMT3, ch4D5-FcWT (Fc de ocorrência natural), ch4D5 N297Q e trastuzumab (como um controle). Os dados de ensaios válidos (SR < 20% MR, AICC < 50% MR) são apresentados na Tabela S, onde as estimativas de EC50 são consideradas válidas apenas se o modelo se ajustar a uma lise máx de >20%. Uma comparação 10 de EC50 e parâmetros de lise máx foi realizada perguntando se os valores de melhor ajuste obtidos pelos anticorpos otimizados eram estatisticamente diferentes daqueles obtidos para o anticorpo ch4D5 de ocorrência natural Fc pelo teste F de soma dos quadrados. Os dados também foram ajustados a 15 modelos de dose-resposta sigmoidais, tal como mostrado nas

Figuras 10-13.

Tabela 8 : Ensaios ADCC em Várias Linhagens Celulares________
Linhagem Celular	Anticorpo	EC50 (ng/mL )	P	Lise Max (%)	P	Figura (Painel >___________________
MDA-MB435	ch4D5-FcMTl	ND	-	5	NS	10 (A)
ch4D5-FcMT2	ND	-	13	NS
ch4D5-FcMT3	ND	-	7	NS_____
ch4D5-FcWT	ND	-	7 __	-
trastuzumab	ND	-	7	NS
MDA-MB231	ch4D5-FcMTl	4	NS	27	NS	10 (B)
ch4D5-FcMT2	12	NS	29	NS
ch4D5-FcMT3	2		24 __	NS
ch4D5-FcWT	9	-	27	-
trastuzumab ~	7	NS	22	NS_____
A54 9	ch4D5-FcMTl	14	-	34	<0,01	1Ϊ (A)
Ch4D5-FcMT2	21	-	24	<0,01
ch4D5-FcMT3-	>100 -	- '	2 3'	<0,01
Ch4D5-FcWT	ND	-	6	-
trastuzumab	ND	-	5	NS
OVCAR-8	ch4D5-FcMTl	14 _	<0, 01	43	<0,01 |11 (BJ

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	ch4D5-FcMT2	21	<0,05	40	<0,01
ch4D5-FcMT3	26	NS	36	<0,01
ch4D5-FcWT	57	-	16	-
trastuzumab	37	NS	13	NS
MCF-7	ch4D5-FcMTl	4	<0,05	55	<0,01	11 (C)
	ch4D5-FcMT2	9	NS	51	<0,01
	ch4D5-FcMT3	8	NS	48	<0,01
	ch4D5-FcWT	23	NS	32
	trastuzumab	9	-	21	NS
BT-20	ch4D5-FcMTl	42	<0,01	66	<0,01	11 (D)
	ch4D5-FcMT2	78	<0,01	62	<0,01
	ch4D5-FcMT3	67	<0,01	55	<0,01
	ch4D5-FcWT	>100	-	33	-
	trastuzumab	>100	NS	25	NS
HT-29	ch4D5-FcMTl	o	-	43	<0,01	11 (E)
	ch4D5-FcMT2	0,5		44	<0,01
	ch4D5-FcMT3	1	-	38	<0,01
	ch4D5-FcWT	ND	-	13	-
ZR75-1	ch4D5-FcMTl	14	<0,01	78	<0,01	12 (A)
	ch4D5-FcMT2	20	NS	67	<0,01
	ch4D5-FcMT3	26	<0,01	63	<0,01
	ch4D5-FcWT	38	-	38	-
	[trastuzumab	ND	-	23	<0,01	____
JIMT-1	ch4D5-FcMTl	8	NS	73	<0,01	12 (B)
	ch4D5-FcMT2	7	<0,05	7 0	<0,01
	CH4D5-FCMT3	10	NS	65	<0,01
	ch4D5-FcWT	22	-	43	-
	t ra s tuz umab	10	NS	34	NS____	____
MDA-MB-	ch4D5-FcMTl	3	<0,05	59	<0,01	13 (A)
453
	ch4D5-FcMT2	4	<0,05	58	<0,01
	ch4D5-FcMT3	6	NS	57	<0,01
	ch4D5-FcWT	11	-	45	-
	trastuzumab	3	<0,05	31	<0,01	—
BT-474	ch4D5-FcMTl	3	<0,01	73__	<0, 01	13 (B)
	ch4D5-FcMT2	3	<0,05	58	NS____
	ch4D5-FcMT3	4	<0,05	71	NS
	ch4D5-FcWT	11	-	64__	-
	trastuzumab	7	NS	60	NS____	_ -----------'
	ch4D5-FcMTl	0,4	<0,01	64 __	NS
	ch4D5-FcMT3	0,8	<0,01	61 __	NS
	ch4D5-FcWT	6	-	62		----
-	ch4D5-FcMTl_	1,2 -	NS	71 - ' _	<0,01
- --..	ch4D5-FcMT2	7	<0,05	43 .	<0,05
	ch4D5-FcMT3	0,9	<0,05	56	NS
	ch4D5-FcWT	3_______	-	58__	-___	J---

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Todas as publicações e patentes mencionadas neste relatório descritivo estão aqui incorporadas a título de referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e 5 individualmente indicado para ser incorporado a título de referência em sua totalidade. Embora a invenção seja descrita em conjunto as representações específicas dessa, será entendido que esta é passível de modificações adicionais e esse pedido pretende cobrir quaisquer variações, usos, ou 10 adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente descrição dentro da prática conhecida ou comum dentro da. técnica à qual a invenção pertence e tal como pode ser aplicado as características essenciais apresentadas anteriormente.

Claims (15)

1. (1) F243L, R292P, Y300L e P396L; e (2) F243L, R292P, V305I e P396L;

   ou (E) pelo menos cinco substituições: F243L, R292P, Y300L, V305I e P396.

   (1) F243L, R292P e Y300L;

   (1) F243L e P396L;

   (1) o dito domínio variável de cadeia leve e dito domínio variável de cadeia pesada formam um sítio de ligação a epítopo que se liga imunoespecificamente a um epítopo de HER2/neu; e (2) o dito domínio C_H2 e C_H3 formam uma região Fc que tem pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a sequência de aminoácidos de uma região Fc de ocorrência natural.

   1. IMUNOGLOBULINA, caracterizada por compreender:

   (A) um polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina 4D5 quimérica que compreende uma substituição N65S; e (B) um polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina 4D5 variante, domínio C_H2 e domínio C_H3,· em que:
2. (2) F243L, R292P e V305I;

   (2) F243L e R292P; e (3) R292P e V305I;

   (C) pelo menos três substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em:

   2/4 partir do grupo que consiste em F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V, e P396L;

   (B) pelo menos duas substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em:

   2. IMUNOGLOBULINA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada em que o dito polipeptídeo que compreende o dito domínio variável de cadeia leve possui uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4.
3. 3/4 (C) ligação reduzida a to cyRIIB; ou (D) ligação aumentada a FcyRIIB.

   (3) F243L, R292P e P396L; e (4) R292P, V305I e P396L;

   (D) pelo menos quatro substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em:

   3. IMUNOGLOBULINA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada em que o dito polipeptídeo que compreende o dito domínio variável de cadeia leve possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.
4. 4 . IMUNOGLOBULINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada em que a dita modificação da região Fc compreende pelo menos uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste em L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I, e P396L.
5. 5. IMUNOGLOBULINA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada em que a dita modificação compreende:

   (A) pelo menos uma substituição selecionada a
6. 6. IMUNOGLOBULINA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada em que o dito anticorpo compreende substituições de:

   (A) F243L, R292P, e Y300L;

   (B) L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L; ou (C) F243L, R292P, Y300L, V305I, e P396L.
7. 7. IMUNOGLOBULINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada em que o dito domínio Fc variante exibe, quando comparado com um domínio Fc de ocorrência natural:

   (A) citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo aumentada (ADCC);

   (B) ligação aumentada a FcyRIIA ou a FcyRIIIA;
8. 8. IMUNOGLOBULINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada em que o dito polipeptídeo que compreende a dita cadeia pesada de imunoglobulina que compreende um domínio variável possui uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 13.
9. 9. IMUNOGLOBULINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada em que a dita imunoglobulina é um anticorpo.
10. 10. ANTICORPO, tal como definido na reivindicação 9, caracterizado em que o dito anticorpo é um anticorpo de cadeia simples ou um anticorpo monoclonal.
11. 11. ANTICORPO, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado em que a dita imunoglobulina é um fragmento de ligação de epítopo imunologicamente ativo de um anticorpo.
12. 12. IMUNOGLOBULINA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada em que a imunoglobulina é um anticorpo bivalente.
13. 13. USO DE UM ANTICORPO, tal como definido na reivindicação 9 ou 10, do fragmento de ligação de epítopo imunologicamente ativo de um anticorpo, tal como definido na reivindicação 11, ou do anticorpo bivalente, tal como definido na reivindicação 12, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para atenuação de câncer em um paciente.
14. 14. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado em que o dito medicamento compreende adicionalmente um agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em um agente anti-angiogênico, um agente anti-neoplásico, um agente quimioterapêutico, e um agente citotóxico.
15. 15. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, tal como definido na reivindicação 9 ou 10, o fragmento de ligação de epítopo imunologicamente 5 ativo de um anticorpo, tal como definido na reivindicação 11, ou o anticorpo bivalente, tal como definido na reivindicação 12, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.