BRPI0609568A2 - detecção de ácido nucléico - Google Patents

Abstract

DETECçãO DE áCIDO NUCLéICO. A invenção fornece métodos para a detecção da quantidade de um ácido nuclélco em uma amostra. Os métodos descritos exploram a capacidade de quebrar e redirecionar uma direção de PCR, e a capacidade de parear fisicamente moléculas de ácido nucléico em uma amostra que tem uma seqüência de referência com moléculas de ácido nucléico na amostra que tem uma seqUência alvo. O redirecionamento da reação PCR permite amplificação parcial como uma etapa preparatória para outras técnicas no mesmo tubo. O pareamento pode resultar na presença de seqUência alvo ou de referência indicando uma diferença na quantidade da seqUência alvo em função da seqüência de referência. Os métodos são amplamente aplicáveis para a determinação de diferenças na quantidade de ácidos nucléicos em aplicações de diagnóstico e pesquisa.

Description

"DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção diz respeito ao campo da detecção deácido nucléico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A detecção de pequenas diferenças no conteúdo deácido nucléico é uma importante tarefa no campo do diagnós-tico molecular.

0 método mais comum usado para detectar pequenasquantidades de ácidos nucléicos é usando PCR ou RT-PCR. Es-tes métodos desempenham excepcionalmente bem para determinarse uma seqüência de interesse está presente em uma dada a-mostra ou não, mas a fim de determinar se há uma diferençaentre a concentração de duas seqüências, aproximadamente umadiferença de 2 vezes é necessária.

Análise quantitativa de ácido nucléico é usada,por exemplo, em controle de qualidade., análise de expressãogenética, monitoramento e diagnóstico médico. Aqui, são des-critos métodos que melhoram significativamente a precisãodestas medidas, abrindo novas possibilidades na ciência emedicina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção prove melhores métodospara quantificar a quantidade de uma seqüência de ácido nu-cléico em uma amostra de ácido nucléico. Os métodos reivin-dicados podem permitir a detecção precisa da quantidade deum ácido nucléico com uma dada seqüência em uma amostra, in-cluindo determinação precisa de diferenças de menos de duasvezes.

Em um aspecto, os métodos recorrem a um método dedesbalancear uma reação PCR. Quando a reação é desbalanceadadesta maneira, é criada uma assimetria entre fitas padrão ecomplementares que permite diferenciação subseqüente entreprodutos desejados e não desejados em uma reação, o que permite sensível detecção mesmo de pequenas diferenças nasquantidades da seqüência de ácidos nucléicos em amostras deácido nucléico.

Então, em uma modalidade, é provido um método dedesbalancear uma reação PCR que compreendas etapas de: a)gerar produtos em uma reação PCR que inclui a seqüência deácido nucléico original de interesse (padrão), sua seqüênciade ácido nucléico complementar, e os correspondentes primei-ro e segundo iniciadores de PCR; e b) adicionar um excessode uma seqüência de quebra de ácido nucléico que é comple-mentar a um ou outro dos primeiro e segundo iniciadores dePCR. Na discussão a seguir, a seqüência de quebra é comple-mentar ao primeiro iniciador. Quando permite-se que a se-qüência de quebra hibridize no próximo ciclo de anelamento,ela predominantemente forma pares de seqüência de quebra a-nelando no primeiro iniciador e em uma ou outra da seqüênciaoriginal (padrão) ou seu complemento, mas não ambos (depen-dendo de qual destas duas fitas tem o complemento da seqüên-cia de quebra). Produtos gerados pela extensão subseqüentesão desbalanceados de maneira tal que uma fita, tanto o pa-drão quanto seu complemento, é produzida, mas não ambas. Is-to é, mediante extensão após hibridização da(s) seqüência dequebra(s), é produzido predominantemente tanto: a) uma se-qüência original (padrão) de fita dupla com uma quebra emuma das fitas e uma seqüência de complemento de fita única,quanto b) uma seqüência de complemento de fita dupla com umaquebra em uma das fitas e uma seqüência original (padrão) defita única. A identidade cujo produto é produzido na formade fita única ou dupla é determinada por qual dos dois ini-ciadores de PCR for complementar à seqüência de quebra. Adetecção do produto de fita única permite sensivel mediçãodas quantidades originais de uma seqüência alvo.

Em um outro aspecto, é provido um método para blo-quear futura amplificação baseada em PCR em uma mistura dereação bloqueando DNA de fita dupla por meio de reticulação.A reticulação impede a amplificação e, desse modo, uma de-tecção de DNA que era de fita dupla no momento da reticula-ção . Este bloqueio de amplificação pode permitir detecçãomais sensivel de produtos que não foram reticulados. A reti-culação pode ser realizada, por exemplo, por tratamento UVou quimico.

Em um outro aspecto, é provido um método para de-terminar a quantidade de um ácido nucléico alvo em relação àquantidade de um ácido nucléico de referência em uma amostrade ácido nucléico. 0 método compreende realizar PCR em umamistura combinada do ácido nucléico referência e alvo, juntocom os iniciadores de PCR direto e reverso para ambos ácidonucléico referência e alvo. 0 iniciador PCR reverso para areferência contém uma seqüência final, isto é, idêntico auma seqüência encontrada no ácido nucléico alvo. Seguindo umdado número de ciclos de PCR, a simetria da reação é quebra-da adicionando quantidades em excesso de duas seqüências dequebra de ácido nucléico e deixando-as hibridizar nos produ-tos PCR de fita única. A primeira seqüência de quebra é com-plementar ao iniciador reverso da sonda alvo, e a segundaseqüência de quebra é complementar ao iniciador reverso dasonda de referência, mas não incluindo a região final, istoé, idêntica a uma seqüência encontrada no ácido nucléico al-vo . Depois da quebra, é detectado o remanescente da fita ú-nica alvo ou referência, de maneira tal que a quantidade dealvo na amostra original é determinada em relação à referência .

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra um esquema de quebra controladade uma reação PCR para criar um padrão de fita única (ABC) eum complemento de fita dupla (CB^1). A primeira etapa mos-tra a seqüência de DNA genômico original (também conhecidopor padrão ABC) e os respectivos iniciadores de PCR direto ereverso (A e C, respectivamente); na segunda etapa, os pro-dutos de diversos ciclos PCR são mostrados. Depois da con-clusão do número desejado de etapas PCR, o esquema mostra aadição de uma seqüência de quebra (C) complementar ao inici-ador reverso (C) em excesso aos iniciadores de PCR. Quandoresfriado, o excesso da seqüência de quebra irá ligar o ini-ciador reverso e a seqüências complementares. Ao mesmo tem-po, o iniciador direto irá ligar o complemento e a extensão,criando um complemento de fita dupla com uma quebra na jun-ção de B e C. Portanto, o padrão (ABC) permanecerá de fitaúnica.

A Figura 2 mostra um esquema de como eliminar DNAde fita dupla de um PCR subseqüente ou outra reação de de-tecção usando reticulação. A etapa 1 mostra a presença deuma seqüência tanto na forma de fita única quanto de fitadupla. Adicionar um agente de reticulação liga o DNA de fitadupla permanentemente ou semi-permanentemente, impedindo adesassociação completa durante a etapa de alta temperaturado ciclo PCR (etapa 3) . Isto impede a amplificação do DNAduplo, por exemplo, por PCR, mas não limita a amplificaçãodo DNA de fita única seletivamente.

A Figura 3 mostra um esquema de uma técnica de amplificação relativa em tubo único que pode detectar diferen-ças muito menores no conteúdo de ácido nucléico do que ante-riormente pensava-se ser possível. A etapa 1 mostra os mate-riais de inicio: duas seqüências de DNA genômicos que'dese-ja-se comparar, e respectivos iniciadores de PCR direto ereverso, com o iniciador reverso da seqüência de referênciatendo um "final" com seqüência B parcial. Depois de realizardiversos ciclos de PCR, os produtos vistos na etapa 2 serãoproduzidos. Se depois desta etapa forem adicionados inicia-dores C e F em excesso às reações, estas podem hibridizarnos iniciadores reversos e nas seqüências complementares,deixando as fitas padrão intocadas tanto pelos iniciadores Ce F recém adicionados quanto pelos iniciadores reversos pre-viamente adicionados. Então, a referência de fita única e opadrão alvo podem hibridizar mutuamente e formar um par.Qualquer referência ou padrão alvo não pareado permaneceráde fita única. A etapa 4 mostra o que acontece se o DNA defita dupla for reticulado. A reticulação só precisa aconte-cer nas seqüências C/C e pB/pB'. Se o reticulação ocorreupermanentemente ou semi-permanentemente, PCR direto pode serrealizado usando iniciadores que atravessam um sitio de re-ticulação para detectar somente o padrão de fita única (ABC,da forma mostrada).

A Figura 4 mostra um esquema de uma modalidade emque a reticulação dos pares padrão de fita dupla é seguidapor uma detecção do padrão de fita única usando PCR. A figu-ra mostra uma seleção possivel de iniciadores de PCR paraanálise adicional, em que os iniciadores diretos A e D jáforam encontrados na amostra final, da forma vista na etapa4 da figura 3, e RI e R2 foram adicionados posteriormente.Da forma mostrada, os iniciadores somente irão amplificar opadrão de fita única e não serão capazes de amplificar o pa-drão reticulado de fita dupla mostrado no topo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições:

Da forma aqui usada, um "polinucleotideo" ou "áci-do nucléico" diz respeito a uma seqüência covalentemente li-gada de nucleotideos (isto é, ribonucleotideos para RNA edesoxiribonucleotideos para DNA) na qual a posição 31 da.pentose de um nucleotideo é unida por um grupo fosfodiésterna posição 51 da pentose do próximo. 0 termo "polinucleoti-deo" inclui, sem limitação, polinucleotideo de fita única edupla. 0 termo "polinucleotideo" da forma como é aqui empre-gado abrange formas quimicamente, enzimaticamente ou metabo-licamente modificadas de polinucleotideo compreendendo, porexemplo, DNA, RNA, PNA, combinações destes e/ou polímeroscontendo um ou mais análogos de nucleotideo. Um "análogo denucleotídeo", da forma aqui usada, diz respeito a um nucleo-tideo no qual o açúcar pentose e/ou um ou mais dos ésteresde fosfato são substituídos com seus respectivos análogos.Análogos de éster fosfato exemplares incluem, mas sem limi-tações , alquilfosfonatos, metilfosfonatos, fosforamidatos,fosfotriésteres, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforos-selenoatos, fosforodisselenoatos, fosforoanilotioatos, pli-osf oroani lida tos,- f osf oroamidatos, boronof osf atos, etc. , in-cluindo todos contra-ions associados, se presente. Na defi-nição de "análogo de nucleotideo" também estão incluídos mo-nômeros de nucleobase que podem ser polimerizados em análo-gos de polinucleotideo nos quais o éster fosfato DNA/RNAe/ou espinha dorsal de éster de fosfato de açúcar é substi-tuído com um tipo diferente de ligação. São adicionalmenteincluídos nos "análogos de nucleotideo" núcleotideos nosquais a fração nucleobase não é convencional, isto é, diferede um de G, A, T, U ou C. Por exemplo, nucleotideos haloge-nados, tal como bromodesoxiuridina, podem ser empregados. Nogeral, uma nucleobase não convencional terá a capacidade deformar ligações de hidrogênio com pelo menos uma fração nu-cleobase presente em uma fita de polinucleotideo contra-direcional adjacente ou de prover uma base que não interagee não interfere.

"Polinucleotideo" também abrange um pequeno poli-nucleotideo, freqüentemente chamado de um oligonucleotideo(por exemplo, um iniciador ou uma sonda). Um polinucleotideotem um "51-terminal" e um "3f-terminal" em virtude de liga-ções polinucleotideo fosfodiéster ocorrerem no 51 carbono e3' carbono do anel pentose dos mononucleotideos substituin-tes. 0 final de um polinucleotideo no qual uma nova ligaçãoseria em um 51 carbono é seu nucleotideo 51 terminal. 0 fi-nal de um polinucleotideo no qual uma nova ligação seria emum 3f carbono é seu nucleotideo 3f terminal. Um nucleotideoterminal, da forma aqui usada, é o nucleotideo na posiçãofinal do 31-terminal ou 5'-terminal. Da forma aqui usada,pode-se dizer que uma seqüência de polinucleotideo, mesmo seinterna a um polinucleotideo maior (por exemplo, uma regiãode seqüência em um polinucleotideo), também pode-se dizerque tem extremidades 51- e 3'-.

Da forma aqui usada, o termo "quimicamente modifi-cado" , quando usado no contexto de um nucleotideo, diz res-peito a um nucleotideo com uma diferença em pelo menos umaligação quimica com relação a um nucleotideo padrão ATP,CTP, GTP, UTP, dATP, dCTP, dGTP ou dTTP. A "modificação qui-mica" não diz respeito à modificação que ocorre quando umnucleotideo é incorporado em um polinucleotideo por ligaçãofosfodiéster 51 até 3 ?.

Da forma aqui usada, o termo "hibridização" é usado em referência à interação fisica de fitas de polinucleo-tideo complementares (incluindo parcialmente complementares)pela formação de ligações de hidrogênio entre nucleotideoscomplementares quando as fitas são arranjadas antiparalelasmutuamente. Hibridização e a resistência à hibridização (is-to é, a resistência da associação entre fitas de polinucleo-tideo) são impactadas por muitos fatores bem conhecidos natecnologia, incluindo o grau de complementaridade entre ospolinucleotideos e o rigor das condições envolvidas, que sãoafetadas por condições tais como a concentração de sais, apresença de outros componentes (por exemplo, a presença ouausência de polietileno glicol), a mo laridade das fitas quehibridizam e o conteúdo G+C das fitas de polinucleotideo,todas as quais resultam em uma temperatura de fusão caracte-rística (Tm) do hibrido formado.

Da forma aqui usada, quando diz-se que um polinu-cleotídeo "hibridiza" em um outro polinucleotideo, significaque os dois polinucleotideos formam um hibrido antiparaleloligado em hidrogênio em condições de alta severidade. A hi-bridização exige complementaridade de seqüência parcial oucompleta entre os polinucleotideos que hibridizam. Quandodiz-se que um polinucleotideo não hibridiza em um outro po-linucleotideo, significa que há complementaridade de seqüên-cia insuficiente entre o dois polinucleotideos para formarum hibrido ligado em hidrogênio, ou que nenhum hibrido seforma entre os dois polinucleotideos em condições de altaseveridade. Da forma aqui usada, "hibridização especifica"diz respeito à ligação, duplicação, ou hibridização de umamolécula de ácido nucléico somente para uma seqüência alvode ácido nucléico e não para outras moléculas de ácido nu-cléico não alvo em uma mistura de seqüência de ácido nucléi-co alvo e não alvo.

Da forma aqui usada, os termos "baixa severidade","severidade média", "alta severidade" ou "condições de seve-ridade muito alta" descrevem condições para hibridização elavagem de ácido nucléico. Orientação para realizar reaçõesde hibridização pode ser encontrada em Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, que é aqui incorporado pela referência em sua inte-gra . Métodos aquosos e não aquosos são descritos naquela re-ferência e ambos podem ser usados. Condições de hibridizaçãoespecificas aqui referidas são como segue: (1) condições dehibridização de baixa severidade em 6X cloreto de só-dio /citrato de sódio (SSC) em cerca de 45 °C, seguido porduas lavagens em 0,2X SSC, SDS 0,1 % pelo menos em 50 °C (atemperatura das lavagens pode ser aumentada até 55 °C paracondições de baixa severidade); (2) condições de hibridiza-ção de severidade média em 6X SSC em cerca de 45 °C, seguidopor uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, SDS 0,1 % a 60 °C; (3)condições de hibridização de alta severidade em 6X SSC emcerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0, 2XSSC, SDS 0,1 % em 65 °C; e (4) condições de hibridização deseveridade muito alta são 0,5 M fosfato de sódio, SDS 7 % em65 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, SDS 1 %em 65 °C.

Da forma aqui usada, um polinucleotideo "isolado"de uma amostra é uma seqüência de polinucleotideo de ocor-rência natural naquela amostra que foi removida do seu ambi-ente celular ou não celular normal. Assim, um polinucleoti-deo "isolado" que estava em um ambiente celular normal podeestar em uma solução sem célula ou ser colocada em um ambi-ente celular diferente. Similarmente, um polinucleotideo xxi-solado" que estava em um ambiente não celular normal podeestar em uma solução sem célula diferente ou ser colocada emum ambiente celular.

Da forma aqui usada, os termos "sangue", "plasma"e "soro" abrangem expressamente frações ou partes processa-das destes. Similarmente, quando uma amostra é tirada de umabiópsia, esfregão, esfregaço, etc, a "amostra" abrange ex-pressamente uma fração processada ou parte derivada da bióp-sia, esfregão, esfregaço,. etc.

Da forma aqui usada no contexto de uma amostra,,uma amostra que é obtida "pelo menos parcialmente" de umadada fonte compreende pelo menos um componente de amostraobtido de uma fonte como esta.

Seqüências "complementares", da forma aqui usada,dizem respeito a seqüências nas quais alinhamento antipara-lelo justapõe resíduos A em uma fita com resíduos T ou U eresíduos G com C na outra fita de maneira tal que pares debase ligada em hidrogênio A:T, A:U e G:C ligados em hidrogê-nio possam se formar.. Estes são os pares base "Watson-Crick"padrão que ocorrem na vasta maioria de híbridos DNA e RNA invivo. Da forma aqui usada, e a menos que de outra forma in-dicada, o termo "complementar", quando usado para descreveruma primeira seqüência de nucleotideo em relação a uma se-gunda seqüência de nucleotideo, diz respeito à capacidade deum oligonucleotideo ou polinucleotideo, compreendendo a pri-meira seqüência de nucleotideo, hibridizar e formar uma es-trutura duplex sob certas condições com um oligonucleotideoou polinucleotideo compreendendo a segunda seqüência de nú-cleo tideo, como será mais bem entendido pelos versados natécnica. Seqüências "complementares" também podem incluir,ou ser formadas inteiramente, por pares base não Watson-Crick e/ou pares base formados por nucleotideos não naturaise modificados, até o ponto em que as exigências anteriorescom relação à sua capacidade de hibridizar sejam satisfeitas.

Os termos "complementar", "completamente comple-mentar" e "substancialmente complementar" podem ser aqui u-sados com relação à correspondência de base entre a fitasentido e a fita antisentido de um híbrido de ácido nucléicode dupla fita. Um hibrido "completamente complementar" temcada nucleotídeo em uma fita base pareada com sua contrapar-te justaposta na fita oposta. Em um hibrido "substancialmen-te complementar", as duas fitas podem ser completamente com-plementares, ou elas podem incluir um ou mais, mas, preferi-velmente, não mais que 10, pares base não correspondentesmediante hibridização, embora retendo a capacidade de hibri-dizar sob as condições usadas nos métodos aqui descritos.

Uma "anormalidade cromossômica", da forma aqui u-sada, diz respeito a qualquer desvio na composição ou estru-tura do DNA de um cromossomo daquela composição ou estruturaque mais prevalece em uma dada população. Isto inclui, massem limitações, deleções, mutações, duplicações, rearranjos,modificações covalentes, dissomia uniparental e estrutura decrornatina alterada. Os métodos aqui descritos são adequadospara detectar, entre outros, contagem anormal de cromossomos(por exemplo, Down, Klinefelter, Patau, Edward, Turner, Tri-ple-X, XYY, etc.) e contagem anormal de seqüência (uma anor-malidade em que somente uma parte de um cromossomo está pre-sente em quantidades anormais).

0 termo "oligonucleotídeo" é definido como uma mo-lécula composta por dois ou mais desoxiribonucleotideos e/ouribonucleotideos, preferivelmente, mais que três. Seu tama-nho exato dependerá de muitos fatores que, por sua vez, de-pendem das últimas função e uso do oligonucleotideo. Oligo-nucleotideos para uso nos métodos aqui descritos têm, maisfreqüentemente, 15 até 600 nucleotideos de comprimento. Otermo "iniciador", da forma aqui usada, diz respeito a umoligonucleotideo, se ocorrer naturalmente, conforme em umadigestão de restrição purificada ou produzido sinteticamen-te , que é capaz de agir como um ponto de iniciação de sínte-se de ácido nucléico que depende de padrão. O iniciador podeser tanto de fita única quanto de fita dupla e deve ser su-ficientemente grande para preparar a síntese do produto deextensão desej ado na presença da polimerase escolhida. 0comprimento exato do iniciador dependerá de muitos fatores,incluindo temperaturas de hibridização e polimerização, fon-te do iniciador e o método usado. Por exemplo, para aplica-ções de diagnóstico, dependendo da complexidade da seqüênciaalvo, o oligonucleotideo iniciador tipicamente contém 15-25ou mais nucleotideos, embora ele possa conter menos ou maisnucleotideos. Os fatores envolvidos na determinação do com-primento apropriado do iniciador são facilmente identifica-dos pelos versados na técnica.

Da forma aqui usada, "um indivíduo" diz respeito aum su j ei to humano, bem. como a um suj ei to não humano, taiscomo um mamifero, um invertebrado, um vertebrado, um rato,um cavalo, um cão, um gato, uma vaca, um galinha, um pássa-ro, um camundongo, um roedor, um primata, um peixe, um sapo,um veado, um fundo, uma levedura, uma bactéria, e um virus.Os exemplos aqui não significam um limite à metodologia dapresente invenção para um sujeito humano somente, já que acorrente metodologia também é usada nos campos da medicinaveterinária, ciências animais, laboratórios de pesquisa esemelhantes.

Da forma aqui usada, "diagnóstico" diz respeito àcapacidade de demonstrar uma maior probabilidade de um indi-víduo ter uma condição ou condições especificas. Diagnósticotambém diz respeito à capacidade de demonstrar uma maiorprobabilidade de um indivíduo não ter uma condição especifi-ca. Mais particularmente, "diagnóstico" diz respeito à capa-cidade de demonstrar uma maior probabilidade de um indivíduoter uma condição se comparada com uma segunda condição. Maisparticularmente, "diagnóstico" diz respeito a um processopor meio do qual há uma maior probabilidade de um indivíduoser apropriadamente caracterizado como tendo uma condição("verdadeiro positivo") ou é apropriadamente caracterizadocomo não tendo uma condição ("verdadeiro negativo") ao mesmotempo em que minimiza a probabilidade de o indivíduo ser i-napropriadamente caracterizado com a dita condição (11 falsopositivo") ou inapropriadamente caracterizado com não sendoafligido com a dita condição ("falso negativo").

Da forma aqui usada, o termo "correspondente a"diz respeito a um nucleotideo em uma primeira seqüência deácido nucléico que se alinha com um dado nucleotideo em umaseqüência de referência de ácido nucléico quando a primeiraseqüência de ácido nucléico e a seqüência de referência deácido nucléico estão alinhadas. Alinhamento é realizado, porexemplo, pelos versados na técnica, usando suporte lógicoprojetado com este propósito. Como um exemplo de nucleoti-deos que "correspondem", o T na posição 11 da seqüência 5!-GTATCACTGA TAAAGGAGAA-31 (SEQ ID NO: 1) "corresponde ao" Nu-cleotideo T na posição 27.091 de Gen Bank Accession # GI:1552506 de TCRB, e vice versa. 0 termo "correspondente" tam-bém diz respeito, por exemplo, ao relacionamento entre doisparceiros de ligação específicos - isto é, um elemento de umpar parceiro de ligação "corresponde ao" outro elemento detal par.

Da forma aqui usada, a frase "próximo à quantidadede referência ou seqüência alvo presente", quando usada emrelação à concentração de sonda, significa que a concentra-ção da sonda ou sondas discutidas é igual em 80% à concen-tração da seqüência de referência ou alvo, qualquer uma quepossa ser discutida.

Da forma aqui usada, uma "sonda" diz respeito a umtipo de oligonucleotideo tendo ou contendo uma seqüência queé complementar a um outro polinucleotideo, por exemplo, umpolinucleotideo alvo ou um outro oligonucleotideo. As sondaspara uso nos métodos aqui descritos são, de forma ideal, me-nores que ou iguais a 600 nucleotideos em comprimento, tipi-camente, entre 4 0-600 nucleotideos.Da forma aqui usada, a frase "sondas pareadas" dizrespeito a duas sondas que são fisicamente associadas ou li-gadas mutuamente. Sondas pareadas podem ser ligadas mutua-mente pela associação de duas frações de parceiros de liga-ção da forma como o termo é aqui definido, incluindo, massem limitações, ligação por meio da formação de híbridos deácido nucleico, ligação por meio de ligações quimicas cova-lentes, ou ligação por meio de interações proteina-proteina.0 termo "sondas pareadas" abrange não somente sondas thatsão pareadas em um relacionamento 1:1, mas também sondas as-sociadas em relacionamentos de maior ordem, por exemplo,1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, etc. (isto é, uma molécu-la de uma sonda pareando com 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 molécu-las , etc. de uma segunda sonda), desde que a razão seja co-nhecida ou pelo menos constante para um dado conjunto desondas. Uma "sonda não pareada" é uma sonda (por exemplo,uma primeira sonda) que não é fisicamente associada ou liga-da a uma outra (por exemplo, uma segunda) sonda-. 0 "parea-mento" pode ocorrer por meio de um ou mais moléculas adapta-doras.

Da forma aqui usada, as frases "tornar sondas hi-bridizadas resistentes à detecção" e "tornar sondas pareadasresistentes à detecção" dizem respeito ao tratamento de son-das hibridizadas ou pareadas de maneira tal que elas não se-jam substancialmente detectadas no método de detecção de á-cido nucleico empregado para detectar sonda não pareada. Por"não substancialmente detectado" entende-se que sondas hi-bridizadas ou.pareadas tratadas para torná-las resistentes àdetecção contribuem com menos de 10% e, preferivelmente, menos de 2 % do sinal no método de detecção de ácido nucléico empregado para detectar sonda não pareada. A frase "tornar sondas hibridizadas resistentes à detecção" é equivalente aos termos "ocultar" ou "seqüestrar" quando aplicados às sondas. Exemplos não limitantes de tratamentos que tornam sondas hibridizadas resistentes à detecção incluem reticula-ção quimica e por UV de sonda em seqüência alvo ou de referência ou em uma outra sonda, ou a remoção fisica das ditas sondas hibridizadas ou pareadas.

Da forma aqui usada, "parceiro de ligação" ou "fração de parceiro de ligação" diz respeito a um elemento de um par de ligação especifico. Um par de ligação especifico é um par de frações que especificamente se liga mutuamente sob um dado conjunto de condições; "ligação especifica" diz respeito à ligação de um elemento do par ao outro elemento dq par para a exclusão substancial da ligação de outras frações presentes naquele ambiente.

Da forma aqui usada, a frase "condições que permitem que uma primeira fração de parceiro de ligação interaja com uma segunda fração de parceiro de ligação" diz respeito àquelas condições ambientais que.favorecem a interação fisica e/ou quimica de dois elementos de um par de ligação especifico . Tais condições irão variar dependendo da natureza da interação do par de ligação, mas pode ser determinada pelos versados na técnica. Condições exemplares incluem condições hibridizantes da forma aqui descrita ou da forma conhecida na tecnologia, por exemplo, condições de alta severidade ouabaixo, quando, por exemplo, os parceiros de ligação são seqüências de ácidos nucléicos complementares. Tais condições também incluem a ausência substancial de seqüências competidoras, incluindo seqüências presentes em uma amostra de ácido nucléico para a qual a quantidade de uma seqüência alvo deve ser determinada. Nos métodos aqui descritos, a etapa de colocar frações de parceiro de ligação ou sondas compreen-dendo-as em condições que permitem que a interação de uma primeira fração de parceiro de ligação com uma segunda fração de parceiro de ligação possa ser realizada como uma etapa separada, por exemplo, seguindo sondas de contato com a-mostra de ácidos nucléicos, ou ela pode ocorrer durante tal contato.

Da forma aqui usada, o termo "ácido nucléico alvo" diz respeito a um polinucleotideo cuja quantidade deve ser determinada em uma amostra em relação a um "ácido nucléico de referência". Um "ácido nucléico alvo" contém uma seqüência conhecida de pelo menos 20 nucleotideos, preferivelmen-te, pelo menos 50 nucleotideos, mais preferivelmente, entre 80 até 500 nucleotideos, mas pode ser maior. Um "ácido nucléico alvo" da invenção pode ser um polinucleotideo de o-corrência natural (isto é, existente na natureza sem intervenção humana), ou um polinucleotideo recombinante (isto é, existente somente com intervenção humana), incluindo, mas sem limitações, DNA genômico, DNAc, DNA plasrryidico, RNA total, RNAm, RNAt, RNAr. O polinucleotideo alvo também inclui produtos amplificados dele próprio, por exemplo, como em uma reação em cadeia de polimerase. Da forma aqui usada, um "po-linucleotideo alvo" ou "ácido nucléico alvo" pode conter um nucleotideo modificado que pode incluir fosforotioato, f os-fito, derivativos modificados de átomo de anel e semelhantes. Seqüência alvo de ácido nucléico necessariamente difere da seqüência de referência de ácido nucléico, de maneira tal que seqüências alvo e de referência de ácido nucléico não podem hibridizar mutuamente sob condições rigorosas.

Da forma aqui usada, o termo "reticulação" diz respeito à ligação covalente de uma sonda em uma outra, seguindo uma interação fisica especifica entre as duas sondas.

"Homologia" ou "identidade" ou "similaridade" dizem respeito à similaridade de seqüência entre duas seqüências de ácido nucléico ou entre duas seqüências de polipep-tideo. Homologia pode ser determinada comparando uma posição em cada seqüência que pode ser alinhada com propósitos de comparação. Quando diversas posições de uma seqüência comparada são ocupadas pelas mesmas bases ou aminoácidos, então, as .moléculas são homólogas naquela seqüência. Um grau de homologia entre seqüências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas seqüências. Uma seqüência "não relacionada" ou "não homóloga" compartilha menos de 40% de identidade, embora, preferivelmen-te, menos de 25% de identidade, com uma outra seqüência.

Da forma aqui usada, o termo "fluido biológico" diz respeito a um liquido tirado de uma fonte biológica e inclui, por exemplo, sangue, soro, plasma, cuspe, fluido de limpeza, fluido cerebroespinhal, urina, sêmen, suor, lágrima, saliva, e semelhantes.Da forma aqui usada, a frase "resistente a cliva-gem de nuclease" significa que uma dada sonda de ácido nu-cléico contém uma ou mais modificações químicas ou atributos estruturais que a tornam menos suscetível à clivagem de nuclease que uma seqüência similar sem a modificação ou atributo estrutural. Exemplos não limitantes incluem mudanças nas ligações fosfodiéster, por exemplo, a inclusão de uma ligação tiol e a presença de estrutura secundária, por exemplo, de fita dupla contra de fita única por toda ou parte da molécula da sonda. Por "menos suscetível", entende-se pelo menos 10% menos eventos de clivagem em relação à sonda não modificada sob as mesmas condições de clivagem de nuclease.

Da forma aqui usada, o termo "aneuploidia" diz respeito ao estado de ter um número de cromossomo que não é um múltiplo do número haplóide para a espécie. Por exemplo, uma célula diplóide ou organismo com um número total de cromossomos que é diferente de (por exemplo, tanto maior que quanto menor que) um múltiplo de duas vezes o número haplóide de cromossomos, será aneuplóide.

Da forma aqui usada, "reação em cadeia de polime-rase" ou "PCR" diz respeito a um método in vitro para amplificar uma seqüência padrão de polinucleotideo especifico. A reação PCR envolve uma série repetitiva de ciclos de temperatura e é realizada tipicamente em um volume de 10-100 \iL.

A mistura de reação compreende NTPds (cada um dos quatro desoxinucleotideos ATPd, CTPd, GTPd, e TTPd), inicia-dores, tampões, DNA polimerase, por exemplo, uma DNA polime-rase termoestável, e polinucleotideo padrão. Uma reação PCRpode consistir de, por exemplo, 5 até 100 "ciclos" de desna-turação e síntese de uma molécula de polinucleotídeo.

Uma "seqüência grampo", da forma aqui usada, compreende duas seqüências autocomplementares que podem formar uma região tronco de fita dupla separada por uma seqüência laço. As duas regiões do oligonucleotídeo que compreendem a região tronco de fita dupla são substancialmente complementar es mutuamente, resultando em auto-hibridização. Entretanto, o tronco pode incluir uma ou mais não correspondências, inserções, voltas laterais, ou deleções. A "seqüência grampo" , da forma aqui usada, pode compreender adicionalmente região (s) de fita única que estendem-se a partir do segmento tronco de fita dupla.

DESCRIÇÃO

DESBALANCEANDO UMA REAÇÃO PCR EM UM MOMENTO FAVORÁVEL PARA PERMITIR O REDIRECIONAMENTO DO PROCESSO

Embora PCR seja uma metodologia comumente aceita em biologia molecular, a idéia básica por trás desta metodologia mudou muito pouco nos últimos 20 anos. O motivo básico para isto é que PCR tem serviu bem à comunidade da biologia molecular. Ela é uma ferramenta que pode detectar quantidades extremamente baixas de seqüências de ácido nucléico e ela pode ainda prover uma grosseira análise quantitativa. Entretanto, um dos problemas recorrentes com PCR tem sido em torno da formação de inúmeros subprodutos na mistura PCR final que torna estes produtos PCR não utilizáveis em muitas aplicações.

É aqui descrito um método pelo qual a reação PCRpode ser seletivamente desbalanceada- Da forma aqui usada, o termo "não balanceamento" ou "desbalanceamento" com relação a PCR diz respeito ao uso de PCR ou uma variante de PCR para produzir um produto de amplificação contendo tanto ácidos nucléicos de fita única quanto de fita dupla, isto é, para criar tanto um padrão de fita única quanto um complemento de fita dupla ou para criar um padrão de fita dupla e um complemento de fita única. 0 propósito deste desbalanceamento é facilitar a diferenciação entre o padrão e seu complemento, desse modo permitindo reações à jusante com um, mas não com o outro.

Depois de diversos ciclos PCR, uma mistura de reação contém um sortimento de produtos. Uma maneira de desba-lancear a reação neste estágio é introduzir um excesso do complemento completo ou parcial nos iniciadores direto ou reverso (ou potencialmente, ambos). 0 iniciador com excesso adicionado é aqui referido como a "seqüência de quebra" ou "seqüência de quebra". Se for permitido que esta seqüência de quebra hibridize nos produtos PCR padrão de fita única, metade dos produtos irão se tornar de fita dupla, enquanto a outra metade permanecerá de fita única (Figura 1). Notar que o complemento ou padrão de fita dupla não será uma fita continua, mas, em vez disto, irá exibir uma quebra na seqüência onde a seqüência de quebra encontra a extensão do iniciador original, isto é, não complementado pela seqüência de quebra .

Portanto, por meio deste simples método de desba-lancear a reação PCR final, o método diferencia entre osprodutos PCR pretendidos e seus complementos.

NOCAUTEANDO ÁCIDOS NUCLEICOS DE DETECÇÃO FUTURA POR PCR OU OUTROS MÉTODOS QUE EXIGEM DNA DE FITA ÚNICA

Uma vez que foi alcançado um estado em que os produtos desejados são de fita única e os produtos não desejados são de fita dupla, pode-se encerrar os ácidos nucleicos de fita dupla por reticulação permanente ou semipermanente (isto é, estável) (Figura 2) . DNA reticulado de fita dupla será subseqüentemente um ator inerte na maioria das reações que exigem uma forma de fita única, tais como hibridização de ácido nucléico, interação com certos pigmentos fluorescentes específicos para ácidos nucleicos de fita única, PCR e várias formas modificadas de PCR.

Portanto, o que foi alcançado essencialmente por meio da reticulação é a inibição de atividade adicional pelos complementos agora desnecessários e o isolamento do produto desejado para teste adicional ou outros usos.

USANDO DESBALANCEAMENTO PCR E RETICULAÇÃO PARA DETECTAR PEQUENAS DIFERENÇAS EM CONTEÚDO DE ÁCIDO NUCLÉICO

Detectar pequenas diferenças no conteúdo de.ácido nucléico ou prover quantificação precisa de ácidos nucleicos de baixa concentração é um importante objetivo para uma ampla faixa de abordagens de diagnóstico e pesquisa. O método descrito a seguir compara a concentração relativa de dois ácidos nucleicos eliminando os antecedentes comuns por meio de pareamento estequiométrico (que não precisa ser um a um). A descrição que segue discute o pareamento um a um de ácidos nucleicos e diz respeito a propósitos de ilustração para Fi-gura 3 e a notação usada na Figura 3.

Para esta abordagem, assume-se que os dois ácidos nucléicos, um alvo (ABC) e uma referência (DEF) a ser comparados mutuamente estão em baixas concentrações. Relizando PCR, a quantidade das seqüências desejadas pode ser aumentada. Agora, assume-se que esta etapa PCR é realizada de maneira tal que o iniciador reverso (Ff) para a referência foi modificado para incluir uma parcial seqüência (pB), isto é, aproximadamente equivalente a uma região no padrão alvo (B). Por aproximadamente equivalente, entende-se que um complemento da seqüência parcial aproximadamente equivalente (pB1) irá ligar uma região desejada da seqüência original no padrão alvo (B). Este iniciador reverso para o padrão referência é chamado pBF1.

Depois de diversas etapas PCR, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, etc, os produtos mostrados na Etapa 2 da Figura 3 serão encontrados na mistura. A dificuldade reside em que muitas análises futuras são proibidas pela presença de inúmeros fragmentos que podem se ligar ao nosso produto de-sej ado, inibindo muitas metodologias posteriores. É aqui que o desbalanceamento da reação PCR se torna importante.

Adicionando complementos em excesso (C, F) tanto no iniciador reverso do alvo (C) quanto no iniciador reverso da referência (F1) e estabelecendo condições de hibridiza-ção, o fitamento duplo destes iniciadores é favorecido. Se as condições forem corretas, uma extensão subseqüente no i-niciador reverso irá duplicar a fita na região pB com um complemento pB1. C e F são chamados de seqüências de quebra.As seqüências de quebra não irão parar com o fitamento duplo de ambos iniciadores reversos em condições de hibridizção/extensão. Eles também irão se ligar aos padrões de complemento (C1BfAf e pBFT E'D')/ e no padrão referência haverá uma pequena extensão para duplicar a fita na seqüência pB. Ambos iniciadores diretos não permanecerão inativos. Eles também irão eventualmente (embora estatisticamente mais tarde em função de concentrações relativas) encontrar os padrões complemento e, por hibridização e extensão, eles irão duplicar a fita no resto do padrão complemento com uma pequena descontinuação na nova fita dupla onde a extensão dos iniciadores diretos encontra as seqüências de quebra.

Agora que os iniciadores de quebra de concentração mais alta e os iniciadores diretos fizeram seu trabalho, os padrões originais encontram tempo e espaço para se ligar mutuamente e se estender em uma razão predefinida 1 por 1. 0 que permanece está mostrado na Etapa 3 da Figura 3 - Em função do pareamento 1 por 1 dos padrões originais, se houver um excesso do alvo, haverá ABCs de fita única de resto. Se houver um excesso do referência, haverpa DEFpB1 de fita única de resto. Mesmo se a reação de pareamento padrão não for perfeita, a diferença com relação ao padrão alvo e referência aumentará mantendo a diferença absoluta e reduzindo os antecedentes comuns em quantidades absolutas iguais.

Uma próxima etapa é "ocultar" os ácidos nucléicos de fita dupla de reações adicionais. Isto pode ser realizado, por exemplo, removendo-os fisicamente de forma seletiva, degradando-os enzimaticamente, ou reticulando-os. Na Etapa 4da Figura 3, é mostrada a "ocultação" dos ácidos nucléicos de fita dupla reticulando-os mutuamente de forma permanente ou semi-permanente. Se o método de detecção que segue for especifico para DNA de fita única ou DNA que é capaz de se tornar de fita única, removeu-se com sucesso interações de todas as entidades de fita dupla.

Uma ferramenta de detecção que funciona bem depois da reticulação permanente ou semi-permanente é PCR. Grandes diferenças relativas mesmo de pequenas quantidades de ácido nucléico podem ser facilmente detectadas por PCR, embora se-ja necessário impedir reticulação adicional de moléculas de fita dupla para PCR. Na descrição precedente, os iniciadores diretos tanto para o padrão alvo quanto para o padrão referência (A e D, respectivamente) já estão presentes. Somente há uma necessidade de adicionar novos iniciadores reversos (Figura 4).

A metodologia anterior pode ser simplesmente modificada de maneira tal que o alvo e a referência sejam reversos, ou para focar na recuperação dos complementos, em vez de as seqüências do padrão original.

Em uma outra modalidade, pode-se criar sistemas em que o ácido nucléico de referência com o qual o alvo está sendo comparado seja parte de uma diluição padrão com concentração conhecida. Isto irá permitir ligação precisa de concentrações de ácido nucléico determinando entre quais duas concentrações padrão o ácido nucléico alvo cai e, potencialmente, considerando as quantidades relativas finais de alvo e referência, e estimando, por exemplo, a distância deambos padrões.

AMOSTRA DE ÁCIDO NUCLEICO:

A amostra de ácido nucleico às quais os métodos aqui descritos são aplicados pode ser proveniente de qualquer origem. Freqüentemente, a amostra pode ser um material biológico que é isolado de seu ambiente natural e contém um polinucleotideo. Uma amostra pode consistir de polinucleotideo purificado ou isolado, ou ela pode compreender uma amostra biológica, tais como uma amostra de tecido, uma amostra de fluido biológico, ou uma amostra celular compreendendo um polinucleotideo. Um fluido biológico inclui, como exemplos não limitantes, sangue, plasma, cuspe, urina, fluido cere-broespinhal, fluido de limpeza, e amostras de leucoforese. Uma amostra de ácido nucleico pode ser derivada de uma fonte planta, animal, bacteriana ou viral. Amostras podem ser obtidas a partir de diferentes fontes, incluindo, mas sem limitações, amostras de diferentes indivíduos, diferentes estágios de desenvolvimento do mesmo indivíduo ou de diferentes indivíduos, diferentes indivíduos doentes (por exemplo, indivíduos com câncer ou suspeita de um distúrbio genético), indivíduos normais, diferentes estágios de doença do mesmo ou diferentes indivíduos, indivíduos suj eitos a diferentes tratamentos de doença, indivíduos sujeitos a diferentes fatores ambientais, ou indivíduos com predisposição a uma patologia, ou indivíduos com exposição a um agente infeccioso de doença (por exemplo, HIV).

Amostras também podem ser obtidas a partir de tecidos, células ou outras fontes contendo polinucleotideo emcultura in vitro. As amostras em cultura podem ser tiradas de fontes incluindo, mas sem limitação, culturas (por exemplo, tecido ou células) mantidas em diferentes meios e condições (por exemplo, pH, pressão ou temperatura), culturas (por exemplo, tecido ou células) mantidas por diferentes períodos de comprimento, culturas (por exemplo, tecido ou células ) tratadas com diferentes fatores ou reagentes (por exemplo, um candidato a medicamento, ou um modulador), ou culturas de diferentes tipos de tecido ou células.

Adicionalmente, amostras podem ser obtidas como um produto de síntese de polinucleotideo.

A amostra compreende preferivelmente ácido nucléi-co isolado de uma fonte da forma supradescrita. Métodos para isolar ácidos nucléicos de fontes biológicas são bem conhecidos e irão diferir dependendo da natureza da fonte. Os versados na técnica podem prontamente isolar ácido nucléico de uma fonte à medida em que for necessária para os métodos aqui descritos. Em alguns casos, pode ser vantaj oso fragmentar as moléculas de ácido nucléico na amostra de ácido nucléico. A fragmentação pode ser aleatória, ou ela pode ser especifica, à medida em que é alcançada, por exemplo, usando restrição de digestão de endonuclease. Métodos para fragmentação aleatória são bem conhecidos na tecnologia e incluem, por exemplo, digestão limitada de DNAse, tratamento alcalino e cisalhamento fisico.

Em uma modalidade, a amostra é coletada de uma fêmea grávida, por exemplo, uma mulher grávida. Neste caso, a amostra pode ser analisada usando os métodos aqui descritospara diagnosticar, de forma pré-natal, anormalidades cromos-sômicas no feto. A amostra pode ser coletada de fluidos biológicos, por exemplo, o sangue, soro, plasma, ou alguma fração destes. Em uma modalidade preferida, a amostra consiste em ácido nucléico purificado isolado do sangue de uma mulher grávida.

A análise de DNA do plasma sangüíneo revelou que ele é composto principalmente de pequenos fragmentos de DNA e de forma interessante, o tamanho médio do fragmento foi maior em mulheres grávidas do que em mulheres não grávidas. Adicionalmente, parece que os fragmentos fetais no DNA do plasma de mulheres grávidas foi menor em média do que em fragmentos maternos (Chan et al. , 2004, Clin. Chem. 50:88-92). Métodos para o isolamento de ácido nucléico do sangue, soro ou frações processadas deles são bem conhecidas na tecnologia . Métodos de isolamento de ácidos nucléicos do sangue ou soro são descritos em, por exemplo, Chen et al. , 1996, Nature Med. 2: 1033-1035 and Lo et al., 1997, Lancet 350:485-487. A referência Lo et al. especificamente reconheceu a presença de DNA fetal em plasma e soro materno. Adicionalmente, Dhallan et al. (2004, J.A.M.A. 291: 1114-1119) e WO 95/08646 descreve métodos para enriquecer DNA fetal por soro materno. Embora tal enriquecimento não sej a necessário para as modalidades de diagnóstico pré-natal aqui descritas, o potencial para tal enriquecimento pode ser vantajoso em alguns aspectos dos métodos aqui descritos. Céluas fetais também podem ser selecionadas e obtidas a partir da circulação materna (ve ja, por exemplo, Bischof f et al. , Hum. Re-prod. Update 8, 493-500 (2002) e Merchant et al. , Hum. Re-prod. Update 8, 509-521 (2002), e pode servir como uma fonte para seqüências de ácidos nucléicos alvo e referência. Por exemplo, céluas fetais sortidas podem servir como a fonte para seqüências alvo e de referências obtidas por PCR (veja, por exemplo, Geifman-Holtzman et al., Am. J. Obstet. Gyne-col. 174:818-22 (1996)). Se o feto é macho, então uma outra abordagem é usar uma seqüência de referência do cromossomo Y; tais seqüências podem ser obtidas de DNA fetal sem célula na circulação materna (veja, por exemplo, Sekizawa et al. , Am. J. Pharmacogenomics 1:111-7 (2001).

Além da detecção precoce de defeitos de nascença, os métodos aqui descritos podem ser aplicados a uma detecção de qualquer anormalidade na representação de seqüências genéticas no genoma. Mostrou-se que DNA de plasma e soro sangüíneo de pacientes com câncer contém quantidades detectá-veis de DNA de tumor (Chen et al., 1996, Nature Med. 2: 1035; Nawroz et al., 1996, Nature Med. 2: 1035-1037). Tumores são caracterizados por aneuploidia ou números inapropri-ados de seqüências genéticas ou mesmo cromossomos inteiros. Assim, a detecção de uma diferença na quantidade de uma dada seqüência em uma amostra de um indivíduo pode ser usada no diagnóstico de câncer.

Ácido nucleico alvo:

Os métodos aqui descritos facilitam a detecção de diferenças na quantidade de um ácido nucleico alvo em função de uma seqüência de referência de ácido nucleico. Ácidos nucléicos alvos incluem qualquer seqüência nucléica que estáassociada com uma diferença na representação de seqüência em individuos saudáveis em função de indivíduos doentes. DNA genômico é especialmente usado como uma fonte de ácidos nu-cléicos alvo e de referência. Assim, uma seqüência de ácido nucléico alvo pode ser uma seqüência em um cromossomo que é mal representada em uma doença, por exemplo, uma seqüência em um cromossomo notado na Tabela 1.

Seqüências alvo também incluem, por exemplo, seqüências conhecidas por existir em um estado polimórfico. Seqüências alvo também podem incluir, por exemplo, seqüências conhecidas por ser amplificadas ou sobre-representadas não em todo o indivíduo, mas em certas células do indivíduo, da forma que é vista, por exemplo, em células de alguns cân-ceres.

Finalmente, seqüências alvo também incluem seqüências em investigação, por exemplo, para expressão genética diferencial. A quantidade de um RNA transcrito pode ser medida em relação a uma seqüência de referência aplicando os métodos aqui descritos em uma amostra contendo produtos de reação de transcrição reversa do RNA fonte de interesse.

Ácido nucléico de referência:

0 ácido nucléico de referência exigido nos métodos aqui descritos é uma seqüência em função da qual a quantidade de uma seqüência alvo é comparada. Mais freqüentemente, uma seqüência de referência será uma com uma representação conhecida ou esperada na amostra de ácido nucléico. Por DNA genômico, por exemplo, uma seqüência de referência pode ser uma seqüência que está presente em uma única cópia por geno-ma, por exemplo, em indivíduos heterozigotos ou em duas cópias, por exemplo, em indivíduos homozigotos. Onde a seqüência alvo deve ser medida em RNA, por exemplo, para determinar o nível de expressão de uma dada mensagem, a referência pode ser, por exemplo, uma seqüência de gene construtivo, por exemplo, GAPDH, actina ou uma seqüência histona, ou uma outra seqüência para a qual o nível é conhecido, ou pelo menos que é conhecido por ser relativamente invariante.

Mais freqüentemente, uma seqüência de referência será uma que já está presente em uma amostra biológica, pre-ferivelmente, em uma representação conhecida. Por exemplo, quando desej a-se investigar a quantidade de uma seqüência associada com um distúrbio genético, tal como trissomia de cromossomo 21 indicativa de síndrome de Down, a seqüência de referência será uma seqüência não presente no cromossomo 21, enquanto a seqüência alvo será uma seqüência presente no cromossomo 21. Neste exemplo, onde a seqüência de referência está presente em duas cópias (uma seqüência de homozigoto), se descobre-se que a seqüência alvo é mais abundante em soro materno que a seqüência de referência usando os métodos aqui descritos, os dados serão indicativos de síndrome de Down no feto.

Alternativamente, a seqüência de referência pode ser uma que é pontuda na amostra em uma quantidade conhecida ou constante e que difere da seqüência alvo. Esta abordagem dará resultados que indicam a quantidade de seqüência alvo relativa somente à quantidade de seqüência de referência externa pontuda, mas pode ser usada para normalizar entre a-mostras os niveis de uma outra seqüência de referência que é interna à amostra. 0 uso de seqüências padrão internas é especialmente usado para determinar e corrigir diferenças na eficiência da amplificação, conforme é, no geral, conhecido na tecnologia.

Sondas:

Sondas para uso nos métodos aqui descritos irão dizer respeito ao padrão alvo e de referência ou complemento amplificado de fita única, dependendo de qual conjunto está sob investigação adicional. Estas sondas podem ser cópias exatas de PCR amplificado ou complementos da seqüência originais, ou eles podem exibir modificações introduzidas durante as etapas PCR iniciais. Sonda alvo irá corresponder à seqüência sob investigação que foi derivada de uma seqüência alvo. Sonda de referência irá corresponder à seqüência sob investigação que foi derivada da seqüência de referência. Parceiros de ligação:

Em cada caso, uma sonda também irá compreender uma região ou fração que permite o pareamento fisico de sondasalvo e de referência sob certas condições.

A região ou fração (referida como uma "fração de parceiro de ligação") que permite pareamento fisico irá compreender um dispositivo para ligar especificamente uma sonda (sob certas condições) a uma sonda que liga uma outra seqüência de ácido nucléico. Esta capacidade da sonda alvo se ligar à sonda de referência permite a "remoção" ou seqüestro de um número proporcional de sondas alvo e referência. Esta "remoção" permite a detecção de seqüência alvo ou de refe-rência não pareada que é indicativa de uma diferença na quantidade de uma seqüência em função da outra na amostra de ácido nucléico.

Em um aspecto preferido, uma região ou fração para ligar uma sonda de referência em uma sonda alvo é feita incorporando um elemento correspondente de um par parceiro de ligação especifica em cada um de uma sonda alvo e referência . Parceiros de ligação podem interagir, por exemplo, por hibridização (envolvendo ligação por hidrogênio), interações de proteina, ligação covalente, ligação iônica, interações van der Waals e interações hidrofóbicas. Os parceiros de ligação irão, necessariamente, se ligar mutuamente com uma es-tequiometria bem definida. É desnecessário dizer que os parceiros dé ligação se ligam com estequiometria 1:1. Em vez disto, o que é importante é que a estequiometria seja conhecida . Por exemplo, avidina liga biotina com estequiometria até 8:1. Entretanto, a estequiometria biotina:avidina realmente observada pode variar dependendo das influências de obstáculos estéricos ocasionados pelas seqüência(s) de ácido nucléico anexas. Entretanto, para uma dada sonda biotinila-da, espera-se que a estequiometria de avidina ou ligação de estreptavidina permaneça constante.

Parceiros de ligação usados nos métodos aqui descritos são preferivelmente capazes de se ligar mutuamente de forma condicional. Por "capaz de se ligar mutuamente de forma condicional" entende-se que a ligação de um parceiro com o outro pode ser manipulada de maneira tal que ligação detecta vel somente ocorra quando desej a-se que ela ocorra. Oaspecto condicional pode ser manipulado, por exemplo, por mudança de temperatura, sal ou algum outro parâmetro fisico ou quimico do ambiente. Por exemplo, diminuir a temperatura de uma solução abaixo da Tm para um par de ligação de ácido nucléico torna o par capaz de se ligar mutuamente. Ligação condicional também pode ser alcançada pela competição para os sitios de ligação por competidores facilmente "removíveis". Por competidores "removíveis" entende-se moléculas que competem para a ligação de sondas mutuamente, mas que podem ser tanto fisicamente removidas ou tornadas inertes quando deseja-se permitir que sondas liguem-se mutuamente.

Ligação condicional também pode ser alcançada por meio da adição de um catalisador que ocasiona a ligação. Por exemplo, a exposição de seqüências complementares compreendendo núcleosideos halogenados a UV pode resultar na reticulação covalente das seqüências. Agentes químicos de reticulação também são conhecidos pelos versados na técnica.

Em uma modalidade, os parceiros de ligação são seqüências de ácido nucléico substancialmente complementares compreendidas pelas respectivas sondas. Neste aspecto, o parceiro de ligação da seqüência de ácido nucléico em uma sonda é capaz de hibridizar no parceiro de ligação da seqüência de ácido nucléico na outra sonda em um dado conjunto de condições.

Parâmetros similares àqueles considerados no desenho das seqüências de iniciadores de PCR são considerados no desenho das seqüências do parceiro de ligação das seqüências de ácido nucléico para incluir nas sondas da forma aqui des-crita. Por exemplo, os versados na técnica irão considerar o impacto de comprimento e conteúdo G+C no comportamento de hibridização das seqüências do parceiro de ligação. Freqüentemente, embora não necessariamente, a seqüência parceiro de ligação de uma sonda que usa um ácido nucléico como um parceiro de ligação será de igual ou menor (por exemplo, pelo menos um nucleotideo ou ainda menor) comprimento que aquela parte de uma sonda que liga a seqüência de referência ou alvo.

Parceiros de ligação podem alternativamente ser elementos respectivos de qualquer par de ligação especifica que é compatível com o ambiente exigido para hibridização de ácido nucléico. Isto é, as frações do parceiro de ligação também podem interagir por meio de dispositivo diferente de hibridização. Por exemplo, as frações do parceiro de ligação podem ser um par de frações que se liga mutuamente por meio de interações covalentes ou não covalentes. Exemplos de tais frações de parceiros de ligação incluem, mas sem limitações: biotina-estreptavidina, biotina-avidina, pares receptor-elemento de ligação, pares de motivo de heterodimerização (por exemplo, motivos ziper de leucina complementar, motivos complementares hélice-volta-hélice, etc.), interações anti-geno-anticorpo, interações aptâmero-elemento de ligação, ou reações quimicas multicomponente. Métodos para a ligação de parceiros de ligação de ácido não nucléico em sondas são bem conhecidos na tecnologia. Adicionalmente, os versados na técnica podem determinar prontamente se o ambiente exigido para hibridização de ácido nucléico tem um efeito adverso nas frações do parceiro de ligação ou em suas capacidades dese ligar mutuamente.

As frações do parceiro de ligação também podem interagir indiretamente por meio de uma "molécula adaptadora". Da forma aqui usada, uma molécula adaptadora é qualquer molécula que é capaz de se ligar especificamente nas frações do parceiro de ligação, desse modo, ligando por meio de pontes , as seqüências de sonda de referência e alvo. Em uma modalidade, a molécula adaptadora compreende seqüências de á-cidos nucleicos que podem hibridizar em frações do parceiro de ligação de ácido nucléico da primeira e da segunda sonda. A molécula adaptadora pode ser de fita única, de fita dupla ou de fita dupla com uma ou mais pro j eções. Conforme um e-xemplo não limitante de um adaptador, um ácido nucléico de fita dupla com duas diferentes projeções de fita única pode ser usado - uma proj eção será substancialmente complementar a uma seqüência do parceiro de ligação na sonda alvo, e o outro será substancialmente complementar a uma seqüência do parceiro de ligação na sonda de referência. A molécula adaptadora também pode compreender múltiplos ácidos nucleicos.

Usando uma molécula adaptadora, é preferível que os sitios que interagem com as frações do parceiro de ligação sejam capazes de distinguir entre as frações do parceiro de ligação da primeira e da segundo sonda. Também é preferível que a razão da primeira e segunda sondas com as quais cada molécula adaptadora pode interagir seja um número definido. Em uma modalidade, a molécula adaptadora é capaz de ligar a primeira e a segunda sonda em uma razão de 1:1.

Não é necessário que uma molécula adaptadora inte-raja com a primeira e segunda sondas em uma razão 1:1. Em modalidades alternativas, uma única molécula adaptadora pode se ligar em múltiplas cópias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, etc.) da primeira e da segunda sondas. Por exemplo, a molécula adaptadora pode compreende um suporte sólido contendo uma pluralidade de sitios com os quais a primeira e segunda sondas podem interagir especificamente. Conforme um exemplo não limitante, a fração de parceiro de ligação da primeira sonda pode consistir de um final poly-A, e a fração de parceiro de ligação da segunda sonda pode consistir de um final poly-C. A molécula adaptadora pode compreender um suporte sólido, por exemplo, microesferas, compreendendo uma pluralidade de oligonucleotideos poly-T e poly-G, aos quais a primeira e segunda sondas podem interagir especificamente por meio de suas frações do parceiro de ligação, respectivamente . Em uma outra modalidade alternativa, mais de uma (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, etc.) molécula adaptadora pode ser empregada.

Seqüestro ou Remoção de complexos de Sonda Alvo : Referência

Os métodos aqui descritos exploram a formação de complexos entre uma sonda de referência e uma sonda alvo. A fim de detectar moléculas de sonda não complexadas ou "de resto", moléculas de sonda depois que as sondas são ligadas mutuamente, pode ser vantajoso remover, "esconder" ou seqüestrar os complexos de sonda alvo:referência. Há diversas maneiras de realizar esta remoção, "ocultação" ou seqüestro.

Um abordagem é "esconder" os complexos de sondaalvo:referência da detecção. Isto pode ser alcançado por re-ticulação permanente das sondas alvo:referência de uma maneira tal que ela interfira em um método de detecção. Por exemplo, se PCR for usado para a detecção de sondas não pareadas, seqüências complementares na sonda alvo e de referência podem ser usadas para ligá-las e este duplex pode ser reticulado por dispositivo quimico ou físico, tal como UV, mitomicina C, ou outros previamente descritos. Se os inicia-dores para uma detecção forem desenhados para sobrepor o sítio de reticulação permanente ou puderem ser encontrados em lados opostos dos sítios de reticulação, amplificação de PCR de sondas pareadas será inibida, assim, somente sondas não pareadas serão amplificadas e, assim, detectadas.

Introduzir núcleosídeos halogenados (por exemplo, nos iniciadores de PCR ou seqüências de quebra) pode melhorar eficiências de reticulação UV (veja website da Qiagen) . Outras modificações químicas usadas em núcleosídeos ou nu-cleotídeos incluem, como exemplos não limitantes, tiolação, amidação e biotinilação. Mais de um (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais) iniciador na reação pode ser modificado, se desejado, incluindo diferentes modificações em diferentes iniciadores. Também podem ser usados reticuladores químicos, tais como mitomicina C (Bizanek et al. Biochemistry 1992, 31, 3084-3091) ou derivados dele, oxido nítrico (Caulfield et al. Chem Res Toxicology, 16(5):571-574, 2003), conjugados CPI pirrola/imidazola (Bando et al., J. Am. Chem. Soe, 2003, 125, 3471-3485), carzinofilina, bizelesina, nitrogênio mostarda, netropsina ou derivativos destes. Da forma exposta,os híbridos reticulados não são padrões efetivos para detecção, por exemplo, por PCR. Portanto, PCR usando iniciadores que amplificam sondas ou seqüências alvo e/ou referência i-rão gerar produtos de amplificação somente quando há seqüência padrão não reticulada. Da forma aqui discutida com relação aos métodos de detecção final, iniciadores de amplificação devem ser desenhados de forma que eles irão tanto hibri-dizar na região na qual sondas ficam reticuladas quanto de forma que a seqüência de amplificação irá conter a região reticulada, inibindo, assim, a extensão da fita PCR. Em ambos casos em que a presença de sonda reticulada irá interferir com a amplificação de PCR e, portanto, a leitura do PCR irá corresponder às seqüências não reticularas por meio destes métodos.

Detecção de sondas não pareadas:

Depois do pareamento fisico das sondas alvo e de referências em proporção à quantidade de seqüência alvo presente , os métodos aqui descritos exigem uma detecção de sondas não pareadas. Esta detecção pode ser realizada por uma de diversas diferentes abordagens.

Um método para detectar sonda não pareada usa amplificação de reação em cadeia de polimerase (PCR) de moléculas de sonda que estão disponíveis para servir como padrões de amplificação. PCR é bem conhecido na tecnologia, e usa um padrão termoestável que depende de polimerase e iniciadores de oligonucleotideo que anelam no ácido nucléico padrão em fitas opostas em ciclos de anelamento do inicia-dor, extensão do iniciador e separação de fita para gerarnúmeros que aumentam exponencialmente de cópias duplicadasde uma seqüência padrão. Veja, por exemplo, Mullis et al.,patente U.S. 4.683.202.

Detecção PCR de sondas não pareadas pode ser rea-lizada por meio do uso de iniciadores de PCR quem amplificamas seqüências de sonda não paredas. Iniciadores de PCR podemser desenhados para explorar a natureza de sondas não parea-das. Por exemplo, onde as sondas alvo e de referência se li-gam mutuamente por meio de hibridização de identificadoresde seqüência complementar, um dos iniciadores usados paraamplificação de sonda não pareada pode ser desenhado paraser complementar ao identificador da seqüência. Se, por e-xemplo, as sondas alvo e de referência são reticuladas mutu-amente depois da hibridização dos identificadores de seqüên-cia complementar, os identificadores das moléculas reticula-das não estarão disponíveis para ligação do iniciador de am-plificação, que irá excluir sondas reticuladas da amplifica-ção usando um iniciador que hibridiza no identificador. Umaabordagem como esta irá deixar somente as sondas não parea-das disponíveis para amplificação e subseqüente detecção.

A detecção do produto PCR indicativo de sonda nãopareada e uma diferença na quantidade de ácido nucleico alvopode ser por qualquer dispositivo comumente usado para de-tectar produtos PCR. Por exemplo, PCR pode incorporar um nú-cleo tideo ou iniciador fluorescente ou radioidentificado, edetecção de fluorescência ou isótopo pode ser usada para ob-ter uma leitura. Alternativamente, um método em tempo real,tais como os métodos TaqMan™ e Molecular Beacon, ou métodosrelacionados, podem ser usados.

No ensaio TaqMan (veja, por exemplo, patente U.S.5.723.591), dois iniciadores de PCR flanqueiam uma oligonu-cleotideo de sonda central. 0 oligonucleotideo-sonda compre-ende duas frações fluorescentes. Durante a etapa de polime-rização do processo PCR, a polimerase cliva o oligonucleoti-deo-sonda . A clivagem faz com que as duas frações fluores-centes fiquem fisicamente separadas, o que ocasiona uma mu-dança no comprimento de onda da emissão fluorescente. À medida em que mais produtos PCR são criados, a intensidade doscomprimentos de onda inéditos aumenta.

Molecular Beacons (veja, patente U.S. 6.277.607;6.150.097; 6.037.130) são uma alternativa ao TaqMan. Molecu-lar Beacons passam por uma mudança conformacional medianteligação a um padrão complementar. A mudança conformacionaldo Beacon aumenta a distância fisica entre uma fração fluo-róforo e uma fração finalizadora no Beacon. Este aumento nadistância fisica ocasiona o efeito do finalizador a ser re-duzido, aumentando, assim, o sinal derivado do fluoróforo.

Outras tecnologias PCR fluorescentes e enzimáticasaplicáveis, tais como Scorpions™ (Solinas et al., 2001, Nu-cleic Acids Res. 29:e96), iniciadores Sunrise™ (Nazarenko etal. , 1997, Nucleic Acids Res., 25, 2516-2521), e DNAzimastambém podem ser usadas.

Detecção de sondas não pareadas com base em PCRtambém pode usar eletroforese capilar para detecção rápida.No geral, onde eletroforese capilar é usada, a amplificaçãode uma seqüência incorpora um nucleotideo ou iniciador fluo-rescente que é, então, detectado à medida em que a amostrapassa pelo capilar.

Eletroforese capilar também pode ser usada sem anecessidade de amplificação de PCR se o sinal provenientedas sondas não pareadas for suficiente para um sinal confiá-vel . Alternativamente, podem ser usados identificadores deflúorescência ou identificadores de flúorescência "estivado-res" que seletivamente ligam sondas não pareadas. Por iden-tificadores de flúorescência "estivadores" entende-se enti-dades que podem ligar um número pré-determinado de identifi-cadores de flúorescência tanto diretamente quanto por meiode moléculas adaptadoras para ajudar na detecção. Um aindaoutro método é adicionar enzimas inativas que podem ser ati-vadas mesmo diretamente, ou por meio de moléculas adaptado-ras pelas sondas não pareadas seletivamente. Então, ativida-de de enzima pode ser detectada por uma mudança na cor, flú-ores cência ou leitura similar. Outros métodos de detecçãopodem incluir identificação radioativa e outros métodos.Anormalidades de Cromossomo e Doença:

Nos métodos aqui descritos, desvios de uma razão1:1 do gene alvo para o de referência indicam uma provávelanormalidade cromossômica. Exemplos não limitantes de anor-malidades cromossômicas que são associadas com doenças e quepodem ser avaliadas usando o método de acordo com os métodosaqui descritos são providos na Tabela 1 a seguir._

Tabela 1. Anormalidades Cromossômicas e Doença <table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table>No geral, avaliação da dosagem da seqüência decromossomo ou gene é realizada em conjunto com outras avali-ações, tais como avaliações clinicas de sintomas de pacien-te. Por exemplo, avaliação pré-natal pode ser particularmen-te apropriada quando os pais têm um histórico de abortos es-pontâneos, nascimentos de criança morta e morte neonatal, ouquando idade materna avançada, resultados de marcador de so-ro materno anormal, ou um histórico familiar de anormalida-des cromossômicas está presente. Teste pós-natal pode serapropriado onde há múltiplas anormalidades congênitas, mani-festações clinicas consistentes com sindrornes cromossômicasconhecidas, retardamento mental não explicado, amenorréiaprimária e secundária, infertilidade, e semelhantes.

DETECTANDO DOENÇAS E DISTÚRBIOS

Da forma exposta, os métodos aqui descritos podemdetectar diferenças entre concentrações de ácido nucléico.Como. tal, os métodos podem ser usados para detectar doençase distúrbios que são ligados a uma instabilidade genética emconcentrações de DNA ou RNA. Para fazer isto, é necessáriosomente definir qual é o desvio do normal que descreve a do-ença . Dados os seguintes cenários possíveis, seguem exemplosde soluções potenciais usando os métodos expostos:A concentração alvo é normalmente igual a uma referência in-terna, mas no caso de doença, a concentração do alvo relati-vo à referência diminui ou aumenta:

0 alvo e a referência neste caso, uma vez extraídode uma amostra biológica, são equivalentes ao alvo e refe-rência, respectivamente, na análise exposta. As amostras i-niciais são preparadas de uma maneira tal que as quantidadesrelativas de alvo e de referência sejam mantidas, permitin-do, portanto, que se desempenhem as etapas descritas na se-ção anterior. A etapa de detecção PCR final detecta se o al-vo e a referência interna são iguais ou, alternativamente,se há um desvio na concentração do alvo se comparado com areferência. Este conhecimento é indicativo da presença ouausência subjacente de uma doença ou distúrbio.

A concentração alvo é normalmente menor (maior)que uma referência interna, mas no case da doença, a concen-tração do alvo fica relativamente maior (menor) que a refe-rência interna:

Neste caso, o alvo e a referência, uma vez extraí-dos de uma amostra biológica, são equivalentes ao alvo e re-ferência, respectivamente, na análise exposta. As amostrasiniciais são preparadas de uma maneira tal que as quantida-des relativas de alvo e referência sejam mantidas, permitin-do, portanto, que se realizem as etapas descritas na seçãoanterior. A etapa de detecção PCR final detecta se a concen-tração alvo é maior ou menor que aquela da referência inter-na. Este conhecimento é indicativo da presença ou ausênciasubjacente de uma doença ou distúrbio.

A concentração alvo é normalmente menor (maior)que uma concentração limite X, mas no caso da doença, a con-centração do alvo fica maior (menor) que a concentração li-mite X:

Neste caso, o alvo, uma vez extraido de uma amos-tra biológica, é equivalente ao alvo na análise exposta. Areferência é um padrão externo adicionado na concentraçãolimite X. As amostras iniciais são preparadas de uma maneiratal que as quantidades relativas do alvo e referência sejammantidas, permitindo, portanto, que se realizem as etapasdescritas na seção anterior. A etapa de detecção PCR finaldetecta se a concentração alvo é maior ou menor que aquelada referência, que está na concentração limite X. Este co-nhecimento é indicativo da presença ou ausência subjacentede uma doença ou distúrbio.

DETECTANDO SÍNDROME DE DOWN OU OUTROS DISTÚRBIOSGENÉTICOS DO DNA FETAL LIVRE ENCONTRADO NO SORO OU PLASMAMATERNO

1 entre 20 bebês nascem com um distúrbio genético.Sindrome de Down é o distúrbio cromossômico mais comum afe-tando cerca de 1 em 750 nascimentos (Tabela 2). A incidênciada Sindrome de Down aumenta com o aumento da idade média naqual mulheres dão à luz crianças.

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Tabela 2. Incidência e herança de aneuploidia fetal.

Sindrome de Down é ocasionada por trissomia 21 -uma ocorrência de três em vez das duas cópias normais docromossomo 21. Pacientes da sindrome de Down sofrem de re-tardamento mental, defeito cardiaco, morte prematura, e de-formidades anatômicas; a maioria exige um cuidado por toda avida. Eles representam um imenso esforço emocional, fisico efinanceiro para as familias e para a sociedade. Portanto,muitas mulheres desejam uma escolha a cerca de trazer aomundo uma criança com sindrome de Down ou de se preparar e-mocionalmente para o nascimento.

Sindrome de Down é um exemplo de uma doença naqual a detecção precoce é desejável. Os testes usados hojesão amniocentese, amostra de vilosidade crônica (CVS), amos-tra de cordão umbilical, biópsia fetal, e triagem de soromaterno, urina, e ultra-som.

Amniocintese é um teste invasivo que exige uma bi-ópsia com agulha guiada por ultra-som do fluido amnióticoque envolve o feto por meio do abdome da mãe. Células fetaisdo fluido amniótico são colocadas em cultura e os cromosso-mos são visualizados por hibridização fluorescente in-situ(FISH). Resultados levam de 2-4 semanas. Amniocintese somen-te é recomendada entre 15 e 18 semanas de gravidez. Ela im-plica em uma chance de 1% de aborto espontâneo e em um li-geiro aumento no risco de distúrbios do limbo. Estima-se quea amniocintese tenha uma sensitividade de 99,3% e uma espe-cificidade de 99,9%.

Triagens de soro para Sindrome de Down são testesnão-invasivos que medem o nivel de marcadores de soro parti-cular. Marcadores incluem alfa-fetoproteina (AFP), gonado-tropina crônica humana (hCG), estriol não conjugado, inibinaA, e PAPP-A. A maioria dos marcadores são testados entre a16a e a 18a semana de gravidez, e suas combinações têm menosde 75% de sensitividade em uma especificidade de 95%.

Em 1979, descobriu-se que sangue materno contémcélulas vermelhas do sangue fetal (fRBC), mas nenhum diag-nóstico comercial até hoj e utilizou este conhecimento. Em1997, DNA fetal livre também foi encontrado em soro e plasmade sangue materno (patente U.S. 5.641.268). Entretanto, es-tas células e DNA fetais são diluídas em quantidades signi-ficativas de células e DNA materno (Lo et al., J. Hum Genet.1998 62, 768-75), complicando a detecção de anormalidadesgenéticas fetais.

No entanto, hipotetizou-se que DNA fetal livre en-contrado em soro e plasma de sangue materno está presente emconcentrações relativas médias (se comparado ao DNA materno)de até 20-25% em média (Dhallan et al., JAMA 291:1114-1119,2004. Benachi, Clin Chem 51:1-3, 2004. Lo et al, Am J HumGenet 64:218-224, 1999). Uma mistura de DNA 20% fetal, 80%materno de uma mãe saudável e um feto com Sindrome de Downirá resultar em um conteúdo de DNA de 21 cromossomos 10%maior que um conteúdo de cromossomo de referência, por exem-plo, conteúdo de DNA de 10 cromossomos. Esta diferença de10% pode ser detectada pelos métodos expostos.

Uma vez que o DNA livre foi isolado do soro ouplasma do sangue materno, pode-se-realizar um método da for-ma aqui descrita sobre ele para determinar as quantidadesrelativas da seqüência alvo e de referência. Para detecçãode Sindrome de Down, por exemplo, escolhe-se uma seqüênciaalvo no cromossomo 21 e uma seqüência de referência em qual-quer outro cromossomo, por exemplo, cromossomo 10. A questãooperativa é se a concentração da seqüência alvo é igual àconcentração da seqüência de referência, indicativa de umfeto saudável, ou se a seqüência alvo pode ser encontrada emexcesso se comparada com a seqüência de referência, que éindicativa da Sindrome de Down. Os resultados da metodologiaexposta provêem uma medida desta concentração relativa, pro-vendo um método para detectar Sindrome de Down fetal de umaamostra de sangue materno. Esta abordagem é aplicável em umaampla faixa de tais distúrbios genéticos.

É provida descrição de métodos e materiais adicio-nais que suportam adicionalmente os novos métodos aqui des-critos na patente U.S. 11/036.833, depositada em 14 de ja-neiro de 2005 e no pedido de patente U.S. 60/622.522, depo-sitado em 27 de outubro de 2004, a integra de ambos os quaisé aqui incorporada pela referência.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Detecção da quantidade de uma seqüênciade Cromossomo 18 em relação a uma seqüência de Cromossomo 10usando imobilização de biotina da referência.

Os métodos aqui descritos são aplicados na detec-ção de trissomia 21 em soro materno como segue. As sondasalvo e de referência usadas são como segue (nomenclatura écomo está na Figura 3):

Seqüência alvo de 18q:

51-GAGGAGACCAGGGGCTCAAGTGAGCCCCTCCGAGGGGATGGCTGTGCTGCAGCAGAGATATGACTAGAGACAACCCTCCT

GGGCCGACTGCTAGAGAACA

GCAGCGCCACTGTTGCGTCT

- 3' (SEQ ID N0:2)

onde a primeira linha será equivalente à seqüência A, a se-gunda e terceira linhas são equivalentes à seqüência B, aterceira linha também é equivalente à pB, e a quarta linha éequivalente a C da forma mostrada na Figura 3.Seqüência de referência de lOp:

5 ' -

ACAAGCTGCAAGCTCACGAC

TTACCATTCCGTAACGCTTTTATGGGCTCTGATGACCGAGGTCTCAATGTCGATTGGGTGGT

- 3' (SEQ ID NO:3)

onde a primeira linha é equivalente à seqüência D, a segundalinha é equivalente à seqüência E, e a terceira linha é e-quivalente à seqüência F da forma mostrada na Figura 3.

As seqüências anteriores são amplificadas primeiropor PCR. Os iniciadores usados são:

Iniciador direto alvo (A): 5' - GAGGAGACCAGGGGCTCAAG - 3'(SEQ ID NO: 4)

Iniciador reverso alvo (C): 5' - AGACGCAACAGTGGCGCTGC - 3'(SEQ ID NO:5)

Iniciador direto de referência (D): 5'ACAAGCTGCAAGCTCACGAC - 3'

(SEQ ID NO: 6)

Iniciador reverso de referência (pBF'): 5'GGGCCGACTGCTAGAGAACAACCACCCAATCGACATTGAG - 3! (SEQ ID NO:7)

A primeira metade do iniciador reverso de referên-cia é uma seqüência 20bp que é equivalente à seqüência daterceira linha da seqüência alvo da forma mostrada anterior-mente. Notar que esta é a seqüência pB de acordo com a Figu-ra 3 .

Para esta etapa de amplificação de PCR, começa-secom 5 jíL de seqüências alvo e de referência servindo comopadrões, então adiciona-se 10 de solução do iniciador com450 nM de cada iniciador, e 15pL de uma mistura PCR 2X (porexemplo, tampão IV de Advanced Biotechnologies) . Condiçõesde ciclagem PCR exemplares são como segue:

a. 95 °C por 15 minutos (enzima ativada, se necessário)

b. ciclar 10-20 vezes o seguinte:

i) 94 °C por 20 segundos

ii) 55 °C por 30 segundos

iii) 72 °C por 40 segundos

c. Manter em 4 °C

Depois de retomar a mistura pós-PCR exposta, adi-ciona-se as seqüências de quebra em 10 \iM concentração finalda forma supradescrita:

Seqüência de quebra alvo (C) : 5! GCAGCGCCACTGTTGCGTCT - 3 ' (SEQ ID NO : 8 )

Seqüência de quebra de referência (F) : 5fCTCAATGTCGATTGGGTGGT - 3 '(SEQ ID NO : 9)

Isto é seguido por um outro ciclo de aquecimento:d. 95 °C por 15 minutos (enzima ativada, se necessário)

e. somente uma vez, realizar o seguinte:

i) 94 °C por 20 segundos

ii) 55 °C por 30 segundos

iii) 72 °C por 40 segundos

iv) 55 °C por 1 hora

v) 72 °C por 40 segundos

f. Manter em 4 °C

Então, para a mistura PCR desbalanceada pode-seadicionar um dimero mitomicina da forma mostrada a seguir(imagem do dimero tirada de Paz et al., J Med Chem, 47:3308-3319, 2004) em uma concentração final de 100 uM:

O dimero mitomicina é ativado usando pH ácido (pH4,0) e as amostras são incubadas por 3 horas para alcançarmáxima eficiência de reticulação. Depois da etapa de reticu-lação, pH neutro é restabelecido para permitir uma outra re-ação PCR.

Então, alíquotas das amostras reticuladas do ex-posto são usadas em um outro ciclo de PCR. Uma vez que o PCRanterior e, por conseguinte, a solução, já contém os inicia-dores diretos necessários, precisa-se somente adicionar doisnovos iniciadores reversos (Figura 4) . Estes são, por exemplo:

Iniciador RI: 5 1 - AGGAGGGTTGTCTCTAGTCA - 3 '(SEQ ID NO : 10)Iniciador R2: 5 ' - GGGCCGACTGCTAGAGAACA - 3 1(SEQ ID NO : 11)

Usando os inéditos iniciadores reversos, os inici-adores diretos antigos e a aliquota da amostra provenienteda mistura reticulada, adiciona-se, então, mistura PCR 2X emvolumes iguais para realizar um ciclo de PCR em tempo realusando sondas Taqman multiplexadas para detectar a concen-tração relativa do alvo e as sondas de seqüência. Novamente,um ciclo a quente de amostra PCR é:

a. 95 °C por 15 minutos (enzima ativa, se necessário)

b. correr 50 vezes o seguinte:

i) 94 °C por 20 segundos

ii) 55 °C por 30 segundos

iii) 72 °C por 40 segundos

c. Manter em 72 °C por 15 segundos

d. Manter em 4 °C

OUTRAS MODALIDADES

Outras modalidades ficarão evidentes para os ver-sados na técnica. Deve-se entender que a descrição detalhadaantecedente é provida para esclarecimento somente e é mera-mente exemplar. O espirito e o escopo da presente invençãonão são limitados aos exemplos anteriores, mas são abrangi-dos pelas reivindicações anexas.Listagem de Seqüência

<110> Zoragen, Inc.szasz, Nora

<120> "DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO"

<130> 201695-2018

<140> Não cedido ainda<141> 23-03-2006

<150> us 60/664.853<151> 24-03-2005

<160> 11

<170> Patentin versão 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gtatcactga taaaggagaa

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gaggagacca ggggctcaag tgagcccctc cgaggggatg gctgtgctgc agcagagatatgactagaga caaccctcct gggccgactg ctagagaaca gcagcgccac tgttgcgtct

<210> 3

<211> 82

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

acaagctgca agctcacgac ttaccattcc gtaacgcttt tatgggctct gatgaccgaggtctcaatgt cgattgggtg gt

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pnmer pcr

<400> 4

gaggagacca ggggctcaag

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial<220><223> primer PCR

<400> 5agacgcaaca gtggcgctgc

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer PCR

<400> 6

agacgcaaca gtggcgctgc

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer PCR

<400> 7

gggccgactg ctagagaaca

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Complemento do primer PCR

<400> 8

gcagcgccac tgttgcgtct

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Complemento do primer PCR

<400> 9

ctcaatgtcg attgggtggt

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer PCR

<400> 10

aggagggttg tctctagtca<210> 11<211> 20<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> pnmer pcr

<400:> 11

gggccgactg ctagagaaca

Claims (43)

1. Método de desbalanceamento de uma reação em ca-deia de polimerase, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) amplificar uma seqüência de ácido nucléico pa-drão e seu complemento realizando um ou mais ciclos de umareação em cadeia de polimerase usando um primeiro iniciadorque hibridiza no complemento do padrão; e(b) adicionar uma seqüência de quebra que é com-plementar ao primeiro iniciador, em que a seqüência de que-bra é adicionada em excesso se comparado com a quantidade doprimeiro iniciador.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de quebra, o pri-meiro iniciador, ou o segundo iniciador compreendem um nu-cleotideo halogenado.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(c) anelar o segundo iniciador no complemento dafita padrão; e(d) estender o segundo iniciador, em que o comple-mento da fita padrão é convertido em um produto de fita du-pla, e a fita padrão permanece de fita única.

4. Método para amplificar seletivamente uma se-qüência de ácido nucléico padrão de fita única em uma mistu-ra contendo tanto ácidos nucléicos padrão de fita únicaquanto de fita dupla, CARACTERIZADO pelo fato de que compre-ende :(a) ácidos nucléicos de reticulação de fita duplana mistura; e(b) amplificar a seqüência de ácido nucléico pa-drão de fita única e seu complemento realizando um ou maisciclos de uma reação em cadeia de polimerase usando um pri-meiro iniciador que hibridiza no padrão e um segundo inicia-dor que hibridiza no complemento do padrão.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico de fita du-pla compreende um nucleotideo halogenado.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que a reticulação é realizada u-sando luz ultravioleta.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que reticulação é realizada usan-do um reticulador quimico.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que o reticulador quimico é sele-cionado do grupo que consiste em mitomicina, carzinofilina,bizelesina, nitrogênio mostarda, netropsina, e derivativosdestes.

9. Método para determinar qual de um ácido nucléi-co alvo e de um ácido nucléico de referência está presenteem maior quantidade em uma amostra, CARACTERIZADO pelo fatode que compreende:(a) amplificar os ácidos nucléicos alvo e de refe-rência pela reação em cadeia de polimerase usando um inicia-dor direto e um iniciador reverso para o alvo e um iniciadordireto e um iniciador reverso para a referência, em que oiniciador reverso para a referência compreende uma seqüênciafinal que é idêntica a uma parte da seqüência alvo;(b) adicionar uma primeira seqüência de quebra queé complementar ao iniciador reverso para o alvo, e adicionaruma segunda seqüência de quebra que é complementar a umaparte, mas não à seqüência final do iniciador reverso para areferência; e(c) detectar a presença de alvo ou referência defita única, em que a presença de alvo de fita única indicaque uma maior quantidade de alvo estava presente na amostraoriginal, e a presença de referência de fita única indicaque uma maior quantidade de referência estava presente naamostra original.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende adicio-nalmente, depois da adição da primeira e segunda seqüênciasde quebra, mas antes da etapa de detectar:anelar o iniciador reverso para o alvo no comple-mento do alvo; anelar o iniciador reverso para a referênciano complemento da referência; e anelar a seqüência final doiniciador reverso para a referência no alvo; eestender os iniciadores reversos para o alvo e areferência e a seqüência final do iniciador reverso para areferência; em que o complemento do alvo, o complemento da referência e pelo menos um parte do alvo e pelo menos umaparte da referência são, cada uma, convertidas em um produtode fita dupla, e qualquer alvo ou referência excesso perma-nece de fita única.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido nucléico de fita du-pla compreende um nucleotideo halogenado.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que ácidos nucléicos de fita du-pla são reticulados depois da adição da primeira e segundaseqüências de quebra, mas antes da etapa de detecção.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que a reticulação é realizada u-sando luz ultravioleta.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que reticulação é realizada usan-do uma reticulação quimica.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14,CARACTERIZADO pelo fato de que a reticulação quimica é sele-cionada do grupo que consiste em mitomicina, carzinofilina,bizelesina, nitrogênio mostarda, netropsina, e derivativosdestes.

16. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de detecção é reali-zada usando reação em cadeia de polimerase.

17. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de detectar é reali-zada usando fluorescência, eletroforese capilar, radioativi-dade, ou atividade de enzima.

18. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é uma amostra bio-lógica .

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra biológica é sele-cionada do grupo que consiste em sangue, soro/ plasma, umaamostra de biópsia, um esfregão, um esfregaço, cultura celu-lar, RNA, e DNAc.

20. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra não é uma amostrabiológica.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é obtida de uma mu-lher grávida.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de ácido nucleicoalvo ou referência é uma seqüência de ácido nucleico fetal.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que uma diferença entre a quanti-dade de seqüências de referência de ácido nucleico é rela-cionada a uma anormalidade cromossômica no feto.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADO pelo fato de que a diferença . é relacionada àSindrome de Down no feto.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADO pelo fato de que a diferença é relacionada àsindrome de Turner, sindrome de Edward, sindrome de Patau,sindrome de Klinefelter, sindrome Triplo-X, ou sindrome XYYno feto.

26. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que uma diferença entre a quanti-dade de seqüências de ácidos nucléicos alvo e de referênciaé relacionada com uma aneuploidia.

27. Método, de acordo com a reivindicação 2 6,CARACTERIZADO pelo fato de que aneuploidia é relacionada aocâncer.

28. Método para determinar qual de um ácido nu-cléico alvo e de um ácido nucléico de referência está pre-sente em maiores quantidades em uma amostra, CARACTERIZADOpelo fato de que compreende:(a) amplificar os ácidos nucléicos alvo e de refe-rência realizando um ou mais ciclos de uma reação em cadeiade polimerase;(b) desbalancear a reação em cadeia de polimerasepara prover uma mistura dos produtos de amplificação, a ditamistura contendo tanto ácidos nucléicos de fita única quantode fita dupla;(c) reticular ácidos nucléicos de fita dupla namistura; e(d) detectar a presença de alvo ou referência defita única, em que a presença de alvo de fita única indicaque uma maior quantidade de alvo estava presente na amostraoriginal, e a presença de referência de fita única indicaque uma maior quantidade de referência estava presente naamostra original.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que reticulação é realizada usan-do luz ultravioleta.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que reticulação é realizada usan-do uma reticulação quimica.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30,CARACTERIZADO pelo fato de que reticulação quimica é sele-cionada do grupo que consiste de mitomicina, carzinofilina,bizelesina, nitrogênio mostarda, netropsina, e derivativosdestes.

32. Método, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de detectar é reali-zada usando reação em cadeia de polimerase.

33. Método, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de detectar é reali-zada usando fluorescência, eletroforese capilar, radioativi-dade, ou atividade de enzima.

34. Método, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é uma amostra bio-lógica .

35. Método, de acordo com a reivindicação 34,CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra biológica é sele-cionada do grupo que consiste em sangue, soro, plasma, umaamostra de biópsia, um esfregão, um esfregaço, cultura celu-lar, RNA, e DNAc.

36. Método, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra não é uma amostrabiológica.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35,CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é obtida de uma mu-lher grávida.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de ácido nucléicoalvo ou de referência é uma seqüência de ácido nucléico f e-tal.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que uma diferença entre a quanti-dade seqüências de ácidos nucléicos alvo e de referência érelacionada a uma anormalidade cromossômica no feto.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que a diferença é relacionada àsindrpme de Down no feto.

41. Método, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que a diferença é relacionada àsindrome de Turner, sindrome de Edward, sindrome de Patau,sindrome de Klinefelter, sindrome Triple-X, ou sindrome XYYno feto.

42. Método, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que uma diferença entre a quanti-dade de seqüências de ácidos nucléicos alvo e de referênciaé relacionada a uma aneuploidia.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que aneuploidia é relacionada aocâncer.