BR122016002916A2 - Reagente de redirecionamento de dupla afinidade, molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica e usos do reagente de redirecionamento de dupla afinidade - Google Patents

Abstract

resumo reagente de redirecionamento de dupla afinidade, molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica e usos do reagente de redirecionamento de dupla afinidade a presente invenção se refere a anticorpos e seus fragmentos que são imunorreativos para os mamíferos, e mais particularmente, o receptor b7-h3 humano e o uso dos mesmos, particularmente no tratamento de câncer e inflamação. a invenção assim particularmente diz respeito a anticorpos humanizados b7-h3 reativos e seus fragmentos imunorreativos que são capazer de mediar, e mais preferivelmente aumentar a ativação do sistema imune contra células cancerígenas que estão associadas com uma variedade de câncers humanos. 1/1

Description

REAGENTE DE REDIRECIONAMENTO DE DUPLA AFINIDADE,

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USOS DO REAGENTE DE REDIRECIONAMENTO DE DUPLA AFINIDADE [001] O presente pedido consiste em pedido dividido do pedido de patente de invenção BR112012022210-4, depositado em 01/03/2011.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS:

[002] Esse pedido de patente reivindica a prioridade dos Números Seriais dos Pedidos de Patente Norte-

Americana	61/310.	692	(depositado	em	4	de	março	de	2010;
pendente);	61/310	.695	(depositado	em	4	de	março	de	2010;
pendente)	61/311.	057	(depositado	em	5	de	março	de	2010;

pendente), cada um desses pedidos de patente é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA:

[003] Esse pedido de patente inclui uma ou mais

Listagens de Sequência nos termos da C.F.R. 37 1.821 et seq., sendo que o conteúdo da matéria revelada pelas sequências de aminoácidos e/ou de nucleotídeos divulgados no pedido de patente está sendo apresentado em formato eletrônico.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO:

CAMPO DA INVENÇÃO [004] A presente invenção se refere a anticorpos e seus fragmentos que são imunorreativos ao mamífero, e mais particularmente, ao receptor humano de B7-H3 e a seus usos, particularmente no tratamento de câncer e inflamação. A invenção assim particularmente se refere a anticorpos humanizados reativos a B7-H3 e seus fragmentos imunorreativos que são capazes de mediar, e mais preferencialmente aumentar a ativação do sistema imune contra

2/215 as células cancerosas que estão associadas com uma variedade de cânceres humanos.

DESCRIÇÃO DA MATÉRIA RELACIONADA:

[005] O crescimento e a metástase de tumores dependem de uma ampla extensão em sua capacidade de evadir a vigilância imunológica do hospedeiro e superar as defesas do hospedeiro. A maior parte dos tumores expressa antígenos que podem ser reconhecidos a uma extensão variável pelo sistema imune do hospedeiro, mas em muitos casos, uma resposta imune inadequada é suscitada por causa da ativação ineficaz das células T efetoras (Khawli, L.A. et al. (2008)

Cytokine,

Chemokine, and

Co-Stimulatory

Fusion Proteins for the

Immunotherapy of Solid Tumors, Exper.

Pharmacol.

181:291328) .

[006]

Linfócitos T CD4+ são os organizadores essenciais da maior parte das respostas imune e autoimune dos mamíferos (Dong, C. et al. (2003) Immune Regulation by Novel

Costimulatory Molecules Immunolog. Res. 28(l) :39-48) . Foi descoberto que a ativação das células T auxiliares CD4+ é mediada através de interações coestimulatórias entre as

Células Apresentadoras de Antígeno e linfócitos T CD4+ naturais. Duas interações são requeridas (Viglietta, V. et al. (2007) Modulating Co-Stimulation Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy Adv. Immunol. 90:297-339). Na primeira interação, uma Célula Apresentadora de Antígeno deve exibir o antígeno alvo relevante ligado ao complexo de histocompatibilidade principal da célula de modo que ele possa se unir ao receptor de célula T (TCR) de um linfócito T CD4+ natural. Na segunda interação, um ligante da Célula

3/215

Apresentadora de Antígeno deve se unir a um receptor CD28 do linfócito T CD4+ (Dong, C. et al. (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(l):3948; Lindley, P.S. et al. (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation, Immunol. Rev. 229:307-321). As células T auxiliares CD4+ que experimentam ambos os sinais estimulatórios são então capazes de responder as citocinas (tais como Interleucina-2 e Interleucina-12 para desenvolver em células Th1). Tais células produzem interferon-gama (IFN-γ) e fator-alfa de necrose de tumor (TNF-α), que medeiam as respostas inflamatórias para as células alvo que expressam o antígeno alvo. A ativação da célula B e proliferação também ocorre, resultando na produção do anticorpo específico para o antígeno alvo (Bernard, A. et al. (2005) “T and B Cell Cooperation: A Dance of Life and Death Transplantation 79:S8-S11). Na ausência de ambos os sinais coestimulatórios durante envolvimento do TCR, as células T entram em um estado funcionalmente sem resposta, referidas como uma anergia clonal (Khawli, L.A. et al. (2008) “Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors, Exper. Pharmacol. 181:291-328). Em estados patológicos, as células Th1 são as protagonistas de várias doenças autoimunes específicas do órgão, tais como diabetes tipo I, artrite reumatoide, e esclerose múltipla (Dong, C. et al. (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(l):3948).

I. A SUPERFAMÍLIA B7 E B7-H3 [007] As investigações nos ligantes do receptor

CD28 levaram à caracterização de um conjunto de moléculas

4/215 relacionadas conhecidas como a superfamília B7 (Coyle, A.J. et al. (2001) “The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function, Nature Immunol. 2(3):203-209,· Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily Nature Rev. Immunol. 2:116126; Greenwald, R.J. et al. (2005) “The B7 Family Revisited, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) “Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells. Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy, Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J. Immunother. 30(3) :251-260; Agarwal, A. et al. (2008) “The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And

Tolerance Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) “CD28/B7 System of T Cell Costimulation Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al. (2004) “Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses, Microbes Infect. 6:759-766). Atualmente, há sete membros conhecidos da família: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), o ligante coestimulador induzível (ICOS-L), o ligante 1 de morte programada (PD-L1), o ligante 2 de morte programada (PD-L2), B7-H3 e B7-H4 (Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223,1-223,7).

[008] Os membros da família B7 são membros da superfamília da imunoglobulina com um domínio tipo imunoglobulina V e tipo imunoglobulina C (por exemplo, IgV

5/215

IgC) (Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126) . Os domínios IgV e IgC dos membros da família B7 são cada um codificados pelos éxons individuais, com éxons adicionais que codificam as sequências líder, os domínios da transmembrana e citoplásmicos. Os domínios citoplásmicos são curtos, variando em comprimento de 19 a 62 resíduos de aminoácidos e podem ser codificados pelos éxons múltiplos (Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands Genome Biol. 6:223,1-223,7). B7-H3 é a simples em que a forma humana principal contém dois domínios IgV-IgC paralelos extracelulares (isto é, IgV-IgCIgV-IgC) (Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of ImmuneRegulatory Ligands, Genome Biol. 6:223,1-223,7). Os membros da família B7 são previstos para formar homodímeros não covalentes, do tipo back-to-back, na superfície da célula, e tais dímeros foram encontrados com respeito a B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86).

[009] A exibição de B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) tem especificidade dupla para o receptor CD28 estimulatório e o receptor CTLA-4 (CD 152) inibitório (Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116126).

[010] Embora inicialmente pensado em compreender apenas 2 domínios Ig (IgV-IgC) (Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production, Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes, J. Immunol. 168:6294-6297), uma variável de domínio extracelular de quatro imunoglobulinas (4Ig-B7-H3) foi identificada e descobriu-se ser a forma humana mais comum

6/215 da proteína (Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Nenhuma diferença funcional foi observada entre essas duas formas, uma vez que a forma murina natural (2Ig) e a forma humana de 4Ig exibem função similar (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30) :10277-10278) . A molécula 4Ig-B7-H3 inibe a lise mediada por célula exterminadora natural de células cancerosas (Castriconi, R. et al. “Identification Of 4Ig-B7H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101 (34): 12640- 12645). Descobriu-se que a B7-H3 humana (forma 2Ig) promove a ativação da célula T e produção de IFN-γ ligando a um receptor putativo em células T ativadas (Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory

Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production Nature Immunol. 2:269-274; Xu, H. et al. (2009) “MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors, Cancer Res. 69(15):5275-6281). Ambas B7-H4 e B7-H1 são inibidores potentes de função imune quando expressas em células tumorais (Flies, D.B. et al. (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J.

Immunother. 30(3):251-260).

[011] O modo de ação da B7-H3 é complexo, já que a proteína medeia tanto a coestimulação quanto a coinibição da célula T (Hofmeyer, K. et al. (2008) The

Contrasting Role Of B7-H3, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278, Martin-Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity Semin.

7/215

Cancer Biol. 17(4) :288-298,· Subudhi, S.K. et al. (2005) “The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition, J. Mol. Med. 83:193-202) . B7-H3 se une ao transcrito 2 tipo (TREM) (TLT-2) e coestimula a ativação da célula T, mas também se une ao(s) receptor(es) como não identificado para mediar a coinibição das células T. Além disso, B7-H3, através de interações com receptor(es) desconhecidos, é um inibidor para células exterminadoras naturais e células osteoblásticas (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278). A inibição pode operar através de interações com membros das principais vias de sinalização através das quais o receptor de célula T (TCR) regula a transcrição do gene (por exemplo, fatores NFTA, NF-κΒ, ou AP1).

[012] B7-H3 coestimula a proliferação de célula T CD4+ e CD8+. B7-H3 também estimula a produção de IFN-γ e atividade lítica de CD8+ (Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production, Nature Immunol. 2:269-274; Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116126). Entretanto, a proteína também possivelmente age através de fatores NFAT (fator nuclear para células T ativadas), NFκΒ (fator nuclear kappa B) , e AP-1 (Proteína-1 Ativadora) para inibir a ativação da célula T (Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4, Immunol. Rev. 229:145-151). Acredita-se também que B7-H3 iniba Th1, Th2, ou Th17 in vivo (Prasad, D.V. et al. (2004) “Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) “B7-H3 Regulates

8/215

The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice, Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4, Immunol. Rev. 229:145-151). Diversos estudos independentes mostraram que células tumorais malignas humanas exibem um aumento marcado na expressão da proteína B7-H3 e que essa expressão aumentada estava associada com gravidade aumentada da doença (Zang, X. et al. (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition Clin. Cancer Res. 13:52715279), sugerindo que a B7-H3 é explorada pelos tumores como uma via de evasão imune (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).

[013] Moléculas que bloqueiam a habilidade de uma molécula B7 para ligar a um receptor de célula T (por exemplo, CD28) inibem o sistema imune e foram propostas como tratamentos para doença autoimune (Linsley, P.S. et al. (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated CoStimulation, Immunolog. Rev. 229:307-321). As células de neuroblastoma que expressam 4Ig-B7-H3 tratada com anticorpos anti-4Ig-B7-H3 foram mais suscetíveis a células NK. Entretanto, não está claro se essa atividade pode ser atribuída a apenas anticorpos contra a forma 4Ig-B7-H3 porque todos os anticorpos relatados produzidos contra a 4Ig-B7-H3 também se uniram à forma tipo Ig da B7H3 (Steinberger, P. et al. (2004) “Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains, J. Immunol. 172(4): 2352-2359 e Castriconi et al. (2004) “Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell9/215

Mediated Lysis, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):

12640-12645).

[014] B7-H3 não é expressa nas células B ou T em repouso, monócitos, ou células dendríticas, mas é induzida em células dendríticas por IFN-γ e em monócitos por GM-CSF (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126). O(s) receptor(es) que se une(m) ao B7-H3 não foi(foram) completamente caracterizado(s). Trabalhos recentes sugeriram que um receptor precisaria ser rápido e transitoriamente regulado em células T depois da ativação (Loke, P. et al. (2004) Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells. Arthritis Res. Ther. 6:208-214). Recentemente, o receptor de transcrito 2 tipo (TREM) (TLT-2, ou TREML2) (King, R.G. et al. (2006) Trem-Like Transcript 2 Is Expressed On Cells Of The Myeloid/Granuloid And B Lymphoid Lineage And Is Up-Regulated In Response To Inflammation, J. Immunol. 176:6012-6021; Klesney-Tait, J. et al. (2006) The TREM Receptor Family And Signal Integration, Nat. Immunol. 7:1266-1273; Yi. K.H. et al. (2009) Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4, Immunol. Rev. 229:145-151, o qual é expresso em células mieloides, foi mostrado ser capaz de se unir a B7-H3, e desta forma coestimular a ativação das células T CD8+ em particular (Zang, X. et al. (2003) B7x: A Widely Expressed B7 Family Member That

Inhibits T Cell Activation, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 100:10388-10392; Hashiguchi, M. et al. (2008) Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cell-Like Transcript 2 (TLT-2)

Is A Counter-Receptor For B7-H3 And Enhances T Cell Responses Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10495

10/215

10500; Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).

[015] Além da sua expressão em células de neuroblastoma, sabe-se também que B7-H3 humana é expressa em uma variedade de outras células cancerosas (por exemplo, cânceres gástricos, de ovário e de pulmão de células não pequenas). A expressão da proteína B7-H3 foi imunohistologicamente detectada em linhagens de célula tumoral (Chapoval, A. et al. (2001) B7-H3: A Costimulatory Molecule

For T Cell Activation and IFN-y Production, Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation, Amer. J. Physiol. Pulmão Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Castriconi et al. (2004) Identification Of 4Ig-B7-H3 As A NeuroblastomaAssociated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)

101(34):12640-12645); Sun, M. et al.

(2002) Characterization of Mouse and

Human B7-H3 Genes, J.

Immunol. 168:6294-6297).

A expressão de mRNA foi descoberta em células do coração, rim, pulmão, fígado, pâncreas, próstata, colo e osteoblasto (Collins,

M. et al. (2005) The B7 Family

Of

ImmuneRegulatory

Ligands, Genome Biol. 6:223,1-223,7).

No nível da proteína,

B7-H3 é encontrada no fígado, pulmão, bexiga, testículos, próstata, mama, placenta humana e órgãos linfoides (Hofmeyer, K.

et al.

(2008) The Contrasting Role

Of B7-H3 Proc. Natl.

Acad.

Sci. (U.S.A.) 105(30):1027710278).

II. ANTICORPOS

TERAPÊUTICOS [016] Além de seus usos conhecidos em

11/215 diagnósticos, os anticorpos foram mostrados serem úteis como agentes terapêuticos. Por exemplo, a imunoterapia, ou o uso de anticorpos para fins terapêuticos, tem sido usada nos últimos anos para tratar o câncer. A imunoterapia passiva envolve o uso de anticorpos monoclonais em tratamentos de câncer (ver, por exemplo, DEVITA, HELLMAN, E CÂNCER DE ROSENBERG: PRINCÍPIOS & PRÁTICA DE ONCOLOGIA, OITAVA EDIÇÃO (2008), DeVita, V. et al. Eds., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, pp. 537-547, 2979-2990). Esses anticorpos podem ter atividade terapêutica biológica inerente tanto pela inibição direta do crescimento ou sobrevivência da célula tumoral quanto pela sua habilidade para recrutar a atividade exterminadora de célula natural do sistema imune do corpo. Esses agentes podem ser administrados sozinhos ou em conjunto com radiação ou agentes terapêuticos. Rituximabe e Trastuzumabe, aprovados para o tratamento de linfoma de não Hodgkin e câncer de mama, respectivamente, são exemplos de tais terapêuticos. Alternativamente, os anticorpos podem ser usados para fazer conjugados de anticorpo em que o anticorpo se une a um agente tóxico e direciona aquele agente ao tumor se unindo especificamente ao tumor. Gemtuzumabe ozogamicina é um exemplo de um anticorpo aprovado conjugado usado para o tratamento de leucemia.

[017] Os anticorpos monoclonais que se unem às células cancerosas e têm usos potenciais para diagnóstico e terapia foram descritos (ver, por exemplo, os pedidos de patente a seguir que descrevem, entre outros, alguns pesos moleculares de proteínas alvo: Patente Norte-Americana n° 6.054.561 (200 kD c-erbB-2 (Her2), e outros antígenos desconhecidos de 40 a 200 KD de tamanho) e Patente Norte

12/215

Americana n° 5.656.444 (50 kD e 55 kD de proteína oncofetal)). Exemplos de anticorpos em ensaios clínicos e/ou aprovados para tratamento de tumores sólidos incluem: Trastuzumabe (antígeno: 180 kD, HER2/neu), Edrecolomabe (antígeno: 40 a 50 kD, Ep-CAM), glóbulos de gordura do leite anti-humano (HMFG1) (antígeno >200 kD, HMW Mucin),

Cetuximabe (antígenos:	150	kD e 170	kD,	receptor EGF),
Alemtuzumabe (antígeno:	21	a 28 kD,	CD52	), e Rituximabe
(antígeno: 35 kD, CD20)	.
[018] Os	alvos	de antígeno	de Trastuzumabe

(receptor Her-2), que é usado para tratar câncer de mama, e Cetuximabe (receptor EGF), que está em ensaios clínicos para o tratamento de diversos cânceres, estão presentes em alguns níveis detectáveis em um grande número de tecidos normais de adulto humano incluindo pele, colo, pulmão, ovário, fígado e pâncreas. A margem de segurança no uso desses terapêuticos é possivelmente provida pela diferença nos níveis de expressão de antígeno ou no acesso de ou atividade do anticorpo nesses locais.

[019] Outro tipo de imunoterapia é imunoterapia ativa, ou vacinação, com um antígeno presente em um(uns) câncer(es) específico(s) ou um construto de DNA que direciona a expressão do antígeno, o qual então evoca a resposta imune no indivíduo, isto é, induz o indivíduo a produzir ativamente anticorpos contra seu próprio câncer. A imunização ativa não tem sido usada com tanta frequência quanto à imunoterapia ou imunotoxinas.

[020] Diversos modelos de progressão de doença (incluindo câncer) têm sido sugeridos. Teorias variam de causa por um simples evento contagioso/ de transformação para

13/215 a evolução do tipo de tecido crescente como doença” ou como câncer” conduzindo por fim a um com capacidade totalmente patogênica ou maligna. Alguns argumentam que com câncer, por exemplo, um evento simples mutacional é suficiente para causar malignidade, enquanto outros argumentam que alterações subsequentes também são necessárias. Alguns outros têm sugerido que aumentar a carga mutacional e o grau do tumor é necessário para ambas a iniciação bem como a progressão da neoplasia através de uma continuidade de eventos de seleção de mutação no nível celular. Alguns alvos de câncer são encontrados apenas em tecidos tumorais, enquanto outros estão presentes em tecidos normais e são regulados e/ou superexpressos em tecidos tumorais. Em tais situações, alguns pesquisadores sugeriram que a superexpressão está ligada à aquisição de malignidade, enquanto outros sugerem que a superexpressão é meramente um marcador de uma tendência junto a uma via para um estado de doença aumentado.

[021] Em alguns casos, mostrou-se que os alvos de câncer, tais como oncoproteínas expressas ou superexpressas em tumores, estão presentes durante o desenvolvimento embrionário e fetal e servem como um regulador de crescimento e diferenciação. Alguns pesquisadores descobriram que a expressão dessas oncoproteínas durante o desenvolvimento embrionário e fetal parece ser restrita a tecidos específicos, e também restrita a estágios específicos do desenvolvimento. Em contraste, foi mostrado que a expressão dessas oncoproteínas no adulto está associada com superexpressão no crescimento do tumor e/ou um malfuncionamento das proteínas supressoras do tumor.

[022] Um diagnóstico ideal e/ou anticorpo

14/215 terapêutico seria específico para um antígeno presente em um grande número de cânceres, mas ausente ou presente apenas em níveis baixos em qualquer tecido normal. A descoberta, caracterização e isolamento de um novo anticorpo capaz de se unir a um antígeno que está especificamente associado com câncer(es) seriam úteis em muitas maneiras. Primeiro, o anticorpo teria atividade biológica contra tais células cancerosas e seria capaz de recrutar a resposta do sistema imune para desta forma tratar a doença. O anticorpo poderia ser administrado como um terapêutico sozinho ou em combinação com tratamentos atuais, ou usado para preparar imunoconjugados ligados aos agentes tóxicos. Um anticorpo com a mesma especificidade, mas com baixa ou nenhuma atividade biológica quando administrado sozinho, também poderia ser útil em que um anticorpo poderia ser usado para preparar um imunoconjugado com um radioisótopo, uma toxina ou um agente quimioterápico ou lipossoma contendo um agente quimioterápico, com a forma conjugada estando biologicamente ativa em virtude de o anticorpo direcionar a toxina para as células contendo antígeno.

[023] Conforme discutido acima, os anticorpos e outras moléculas que especificamente se unem a B7-H3 foram descritos (ver, Patente Norte-Americana n° 7.527.969; 7.368.554; 7.358.354; e 7.279.567; Publicações dos Pedidos de Patente Norte-Americana n°^s US 20090087416; US 20090022747; US20090018315; US2008116219; US20080081346; US 20050202536; US20030103963; US20020168762; Publicações do PCT n°^s WO 2008/116219; WO 2006/016276; WO 2004/093894; WO 04/001381; WO 2002/32375; WO 2002/10187 e WO 2001/094413; EP 1292619B; Modak, S. et al. (March 1999) Disialoganglioside GD2 And

15/215

Antigen 8H9: Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy Against Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT) And Rhabdomyosarcoma (RMS), Proceedings Of The American Association For Cancer Research Annual Meeting, Vol. 40:474 (90^th Annual Meeting Of The American Association For Cancer Research; Philadelphia, Pennsylvania, US; April 10-14, 1999; Modak, S. et al. (March 2000) “Radioimmunotargeting To Human Rhabdomyosarcoma Using Monoclonal Antibody 8H9, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41:724; Modak, S. et al. (2001) “Monoclonal Antibody 8H9 Targets A Novel Cell Surface Antigen Expressed By A Wide Spectrum Of Human Solid Tumors, Cancer Res. 61(10):4048-4054, Steinberger, P. et al. (2004) “Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains, J. Immunol. 172(4):2352-2359, Xu, H. et al. (2009) “MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors, Cancer Res. 69(15):5275-6281).

[024] Não obstante, um aspecto desejável de um diagnóstico ideal e/ou anticorpo terapêutico seria a descoberta e a caracterização de novos anticorpos capazes de mediar e, particularmente, aumentar à ativação do sistema imune contra as células cancerosas (especialmente as células cancerosas humanas) que estão associadas com uma variedade de cânceres. Tais composições também seriam úteis para descoberta de fármaco (por exemplo, moléculas pequenas) e para mais caracterização de regulação celular, crescimento, e diferenciação.

[025] Assim, apesar de todos os avanços anteriores, uma necessidade permanece para composições

16/215 melhoradas capazes de se unirem às células cancerosas e de facilitar ou mediar uma resposta imune contra as células cancerosas. Tais composições podem ser usadas para diagnosticar e tratar tais cânceres. Existe uma necessidade adicional, com base nas descobertas descritas aqui, para novas composições que especificamente reconhecem alvos duplos na superfície das células, e que podem desta forma modular, quer reduzindo ou aumentando, as capacidades de B7-H3 para mediar a ativação da célula T ou pelo reconhecimento e extermínio das células cancerosas que expressam B7-H3. Um objetivo dessa invenção é identificar tais composições. Outro objetivo é prover novos compostos para uso no ensaio de expressão de B7-H3.

[026] Conforme descrito em detalhes abaixo, a presente invenção se refere a novos anticorpos, incluindo, em particular, reagentes de redirecionamento de dupla afinidade (DART^TMs) que compreendem moduladores de ativação de célula T B7-H3, que são capazes de influenciar a ativação de célula T bem como novos anticorpos que se unem aos receptores de B7H3 de células cancerosas e facilitam ou medeiam a morte de tais células. A presente invenção é direcionada a tais composições e aos seus usos em diagnósticos e no tratamento de doenças tal como câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO:

[027] A presente invenção se refere a anticorpos e seus fragmentos que são imunorreativos ao mamífero, e mais particularmente, ao receptor humano de B7-H3 e a seus usos, particularmente no tratamento de câncer e inflamação. A invenção assim, particularmente, diz respeito a anticorpos reativos humanizados de B7-H3 e seus fragmentos

17/215 imunorreativos que são capazes de mediar e, mais preferencialmente, aumentar a ativação do sistema imune contra as células cancerosas que estão associadas com uma variedade de cânceres humanos.

[028] Em detalhe, a invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou seu fragmento imunorreativo, em que o anticorpo isolado ou o fragmento compreende um domínio variável que especificamente se une a um domínio extracelular de B7-H3, em que o anticorpo concorre para se unir a B7-H3 com quaisquer anticorpos: BRCA69D, BRCA84D, ou PRCA157.

[029] A invenção ainda diz respeito ao anticorpo isolado descrito acima ou seu fragmento imunorreativo, em que o anticorpo ou o fragmento compreende um domínio variável que compreende:

	[030]	(A)	CDR1	(SEQ ID No: 21) , CDR2	(SEQ	ID No:
23)	e CDR3 (SEQ	ID No:	25) da cadeia leve	de BRCA69D	e	CDR1
(SEQ ID N2: 29),	CDR2 (SEQ ID	No: 31)	e CDR3	(SEQ ID	1 No:	33	) da
cadeia pesada de	BRCA69D;
	[031]	(B)	CDR1	(SEQ	ID	No: 5)	, CDR2	(SEQ	ID	No:
7)	e CDR3 (SEQ ID	No: 9;	da cadeia	leve de	BRCA84D	e CDR1	(SEQ
ID	N2: 13), CDR2	(SEQ	ID no	: 15)	e	CDR3 (	SEQ ID	No:	17)	da

cadeia pesada de BRCA84D; ou

	[032]	(C) CDR1	(SEQ ID No	: 37)	, CDR2 (SEQ	ID	No:
39)	e CDR3 (SEQ	ID No: 41)	da cadeia	leve	de PRCA157	e	CDR1
(SEQ	ID No: 45),	CDR2 (SEQ ID	No: 47) e	CDR3	(SEQ ID No:	49	) da

cadeia pesada de PRCA157.

[033] A invenção ainda diz respeito a qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, em que o anticorpo se une a B7-H3 que é endogenamente expressa na superfície de uma célula cancerosa.

18/215 [034] A invenção ainda diz respeito a qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, em que o anticorpo se une a B7-H3 que está internalizada ao se unir a B7-H3 expressa na superfície da célula cancerosa.

[035] A invenção ainda diz respeito a qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, o qual é um anticorpo monoclonal humanizado.

[036] A invenção ainda diz respeito a qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, em que o anticorpo é um anticorpo modificado que compreende uma região Fc da IgG 1 humana, em que a região Fc variável da IgG 1 humana compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação à região Fc de origem do anticorpo, a(s) modificação(ões) de aminoácido compreendendo modificação(ões) de aminoácido que alteram a afinidade ou avidez da região Fc variável para ligar a um FcyR de modo que o anticorpo modificado exibe função efetora relativa ao anticorpo natural.

[037] A invenção ainda diz respeito a qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, e que a modificação da região Fc compreende:

[038]	(A)	pelo	menos uma	substituição
selecionada do grupo	consistindo	em:
(1) F243L;		(5)	Y300L;
(2) D270E;		(6)	V305I;
(3) R292P;		(7)	A330V; e
(4) S298N;		(8)	P396L;
[039]	(B)	pelo menos uma substituição de dois

resíduos de aminoácido, as substituições sendo selecionadas

19/215 do grupo consistindo em:

(1)	F243L	e	P396L;
(2)	F243L	e	R292P;
(3)	R292P	e	V305I;
[040]	(C) pelo

e de aminoácido, as menos uma substituição de três resíduos substituições sendo selecionadas

do	grupo	consistindo	em:
		(1:	F243L,	R292P e	Y300L;
		(2;	F243L,	R292P e	V305I;
		(3)	F243L,	R292P e	P396L;	e
		(4)	R292P,	V305I e	P396L;
		[041]	D) pelo	menos	uma substituição de quatro
resíduos	de	aminoácido, as	substituições	sendo selecionadas
do	grupo	consistindo	em:
		(1)	F243L,	R292P,	Y300L e	P396L;	e
		(2)	F243L,	R292P,	V305I e	P396L;

[042] ou [043] (E) uma substituição de pelo menos cinco resíduos de aminoácido:

F243L, R292P, Y300L, V305I e P396.

[044]

A invenção ainda diz respeito ao

anticorpo descrito	acima,	em que o anticorpo	compreende
substituições	de:
(A)	F243L,	R292P,	e Y300L;
(B)	L235V,	F243L,	R292P, Y300L,	e P396L;	ou
(C)	F243L,	R292P,	Y300L, V305I,	e P396L.
[045]	A invenção ainda	diz respeito	ao

anticorpo descrito anticorpo compreende:

acima, em que o [046] (A) um domínio variável que compreende

CDR1 (SEQ

ID No: 5) ,

CDR2 (SEQ ID N2: 7) e CDR3 (SEQ ID No: 9) da cadeia leve de BRCA84D e CDR1 (SEQ ID N2: 13) , CDR2 (SEQ ID

20/215

N£: 15) e CDR3 (SEQ ID NO: 17) da cadeia pesada de BRCA84D; e [047] (B) uma modificação da região Fc que compreende as substituições: L235V, F243L, R292P, Y300L, e

P396L.

[048] A invenção ainda diz respeito ao anticorpo descrito acima, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado.

[049] A invenção ainda diz respeito aos anticorpos isolados descritos acima ou seus fragmentos imunorreativos, em que o anticorpo compreende:

[050] (A) uma cadeia leve variável que tem a sequência de aminoácido de hBRCA84D-2 VL (SEQ ID N°: 89) ;

[051] (B) uma cadeia pesada variável que tem a

sequência	de aminoácido de hBRCA84D-2 VH (SEQ	ID No: 99);	e
	[052]	(C) uma	região Fc	que tem	as
substituições:	L235V, F243L, R292P, Y300L, e	P396L.
	[053]	A invenção	ainda diz	respeito a	um
hibridoma	que	secreta um	anticorpo	monoclonal	que

especificamente se une a um domínio extracelular de B7-H3, em que o anticorpo concorre para a ligação da B7-H3 com qualquer um dos anticorpos: BRCA69D, BRCA84D, ou PRCA157.

[054] A invenção ainda diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos isolados descritos acima ou fragmentos imunorreativos.

[055] A invenção ainda diz respeito a um reagente de redirecionamento de dupla afinidade (DART^TM), o reagente compreendendo:

[056] (A) uma cadeia de polipeptídeo I que compreende um domínio de ligação de epítopo VL de

21/215 imunoglobulina específico para ligar a B7-H3 e um domínio de ligação de epítopo VH específico para ligar uma molécula diferente de B7-H3; e [057] (B) uma cadeia de polipeptídeo II que compreende um domínio de ligação de epítopo VH de imunoglobulina específico para ligar a B7-H3 e um domínio de ligação de epítopo VL específico para ligar uma molécula diferente de B7-H3;

[058] em que as cadeias de polipeptídeo I e II estão associadas juntas de modo a formar domínios de ligação de epítopo funcionais capazes de se unirem a B7-H3 e a molécula diferente de B7-H3.

[059] A invenção ainda diz respeito ao reagente de redirecionamento de dupla afinidade (DART™) descrito acima, em que a molécula diferente de B7-H3 que pode ser ligada ao DART™ é um hapteno, e particularmente em que o hapteno é isotiocianato de fluoresceína.

[060] A invenção ainda diz respeito ao reagente de redirecionamento de dupla afinidade (DART™) descrito acima, em que a molécula diferente de B7-H3 que pode ser ligada pelo DART™ é um Receptor de Célula T ou o receptor NKG2D.

[061] A invenção ainda diz respeito ao reagente de redirecionamento de dupla afinidade (DART™) descrito acima, em que a molécula diferente de B7-H3 que pode ser ligada ao DART™ é um antígeno associado ao tumor, e particularmente, em que o antígeno associado ao tumor é selecionado do grupo consistindo em A33; ADAM-9; ALÇAM; BAGE; beta-catenina; CA125; Carboxipeptidase M; CD103; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD36; CD40/CD154; CD45; CD46;

22/215

CD5; CD56; CD79a/CD79b; CDK4; CEA; CTLA4; Citoqueratina 8; EGF-R; EphA2; ErbBl; ErbB3; ErbB4; GAGE-1 ; GAGE-2; GD2/GD3/GM2; gp100; HER-2/neu; papilomavírus-E6 humano; papilomavírus-E7 humano; Alfa-V-Beta-6 Integrina; JAM-3; KID3; KID31; KSA (17-1A); LUCA-2; MAGE-1 ; MAGE-3; MART; MUC

1; MUM-1; N-acetilglucosaminiltransferase; Oncostatina M;

p15; PIPA; PSA; PSMA; ROR1; sTn; receptor TNF-β; receptor

TNF-α;

receptor

TNF-γ; Receptor Transferrina; e receptor

VEGF.

[062]

A invenção ainda diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia de polipeptídeo de qualquer um dos reagentes de redirecionamento de dupla afinidade (DART^TMs) descritos acima.

[063]

A invenção ainda diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos anticorpos isolados ou fragmentos imunorreativos descritos acima ou reagentes de redirecionamento de dupla afinidade (DART^TMs) (ii) um carreador farmaceuticamente aceitável.

[064] A invenção ainda diz respeito à composição farmacêutica descrita acima, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado que compreende:

[065] (A) um domínio variável que compreende CDR1 (SEQ ID N2: 5) , CDR2 (SEQ ID N2: 7) e CDR3 (SEQ ID N2: 9) da cadeia leve de BRCA84D e CDR1 (SEQ ID N2: 13) , CDR2 (SEQ ID N2: 15) e CDR3 (SEQ ID N2: 17) da cadeia pesada de BRCA84D; e [066] (B) uma modificação da região Fc que compreende as substituições: L235V, F243L, R292P, Y300L, e

P396L.

[067] invenção ainda diz respeito à

23/215 composição farmacêutica descrita acima, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado que compreende:

[068] (A) uma cadeia leve variável que tem a sequência de aminoácido de hBRCA84D-2 VL (SEQ ID N2: 89) ;

[069] (B) uma cadeia pesada variável que tem a sequência de aminoácido de hBRCA84D-2 VH (SEQ ID N2: 99) ; e [070] (C) uma região Fc que tem as substituições: L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L.

[071] A invenção ainda diz respeito a qualquer uma das composições farmacêuticas descritas acima, as quais ainda compreendem um ou mais agentes anticâncer adicionais, e particularmente em que o agente anticâncer adicional é um agente quimioterápico, um agente terapêutico de radiação, um agente terapêutico hormonal ou um agente imunoterapêutico.

[072] A invenção ainda diz respeito ao uso de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos imunorreativos ou reagentes de redirecionamento de dupla afinidade (DART^TMs) descritos acima no diagnóstico de câncer, em que o anticorpo isolado, fragmento imunorreativo, ou DART^TM é detectavelmente rotulado.

[073] A invenção ainda diz respeito ao uso descrito acima caracterizado em que o câncer é caracterizado pela presença de uma célula cancerosa selecionada do grupo consistindo em uma célula de um tumor da glande adrenal, um câncer associado à AIDS, um sarcoma alveolar de parte mole, um tumor astrocítico, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral e da medula espinhal, um tumor cerebral metastático, um câncer de mama, tumores corporais carotídeos, um câncer cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromófobo, um carcinoma de células claras, um

24/215 câncer de colo, um câncer colorretal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de pequenas células redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixoide extraesquelético, uma fibrinogênese imperfeita do osso, uma displasia fibrosa do osso, um câncer da vesícula biliar ou do duto biliar, câncer gástrico, uma doença trofoblásica gestacional, um tumor de célula germinativa, um câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, um tumor de célula da ilhota, um Sarcoma de Kaposi, um câncer de rins, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um câncer de fígado, um linfoma, um câncer pulmonar, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um carcinoma da tireoide papilar, um tumor da paratireoide, um câncer pediátrico, um tumor da bainha do nervo periférico, um faeocromocitoma, um tumor pituitário, um câncer de próstata, um melanoma uveal posterior, um distúrbio hematológico raro, um câncer metastático renal, um tumor rabdoide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um câncer de pele, um sarcoma de tecido mole, um câncer de célula escamosa, a câncer de estômago, um sarcoma sinovial, um câncer testicular, um carcinoma tímico, um timoma, um câncer metastático da tireoide, e um câncer uterino.

[074] A invenção ainda diz respeito ao uso de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos imunorreativos ou reagentes de redirecionamento de dupla afinidade (DART^TMs) descritos acima na preparação de um medicamento para o

25/215 tratamento ou a prevenção de câncer em um paciente. A invenção ainda diz respeito a tais usos caracterizados em que o câncer é caracterizado pela presença de uma célula cancerosa selecionada do grupo consistindo em uma célula de um tumor da glande adrenal, um câncer associado à AIDS, um sarcoma alveolar de tecido mole, um tumor astrocítico, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral e da medula espinhal, um tumor cerebral metastático, um câncer de mama, tumores corporais carotídeos, um câncer cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromófobo, um carcinoma de células claras, um câncer de colo, um câncer colorretal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de pequenas células redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixoide extraesquelético, uma fibrinogênese imperfeita do osso, uma displasia fibrosa do osso, um câncer da vesícula biliar ou do duto biliar, câncer gástrico, uma doença trofoblásica gestacional, um tumor de célula germinativa, um câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, um tumor de célula da ilhota, um Sarcoma de Kaposi, um câncer de rins, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um câncer de fígado, um linfoma, um câncer pulmonar, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um carcinoma da tireoide papilar, um tumor da paratireoide, um câncer pediátrico, um tumor da bainha do nervo periférico, um faeocromocitoma, um tumor pituitário, um câncer de próstata, um melanoma uveal

26/215 posterior, um distúrbio hematológico raro, um câncer metastático renal, um tumor rabdoide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um câncer de pele, um sarcoma de tecido mole, um câncer de célula escamosa, um câncer de estômago, um sarcoma sinovial, um câncer testicular, um carcinoma tímico, um timoma, um câncer metastático da tireoide, e um câncer uterino.

[075] A invenção ainda diz respeito aos usos descritos acima, caracterizado em que o uso ainda compreende a administração de uma ou mais terapias adicionais de câncer selecionadas do grupo consistindo em quimioterapia, imunoterapia, terapia por radiação, terapia hormonal, e cirurgia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS:

[076] As figuras 1A e 1B mostram os resultados das investigações IHC conduzidas usando espécimes de tecido normal do pâncreas, fígado, pulmão e colo com BRCA84D a 0,625 pg/ml e 0,078 pg/ml (figura 1A) e tecido normal do coração, rim e adrenal com BRCA84D a 0,625 pg/ml (figura 1B).

[077] A figura 2 mostra os resultados das investigações IHC conduzidas usando espécimes de tecido canceroso do pâncreas, da mama, do colo e do pulmão com BRCA84D a 0,625 pg/ml e 0,078 pg/ml.

[078] As figuras 3A a 3D mostram morte redirecionada dependente de dose mediada pelos anticorpos da presente invenção. As figuras 3A e 3B mostram morte redirecionada dependente de dose de células de carcinoma renal A498 (com PBMC restante há 18 horas (LDH)) pelos anticorpos monoclonais reativos contra a B7-H3 (proporção efetor: alvo de 20:1) (figura 3A: BRCA68D, BRCA69D, PRCA157,

27/215

GB8, TCR-4420; figura 3B: OVCA22, BRCA84D, TDH6, TES7, TCR4420). As figuras 3C e 3D mostram morte redirecionada dependente de dose de células cancerosas pulmonares A549 (com PBMC restante há 18 horas (LDH)) por anticorpos monoclonais reativos contra a B7-H3 (proporção efetor:alvo de 30:1) (figura 3C: BRCA84D, OVCA22, PRCA157, TES7; figura 3D: TDH6, BRCA68D, BRCA69D).

[079] As figuras 4A e 4B mostram as habilidades dos anticorpos anti-B7-H3 de se unirem ao B7H3-2Ig solúvel (figura 4A) e B7H3-4Ig B7-H3 solúvel (figura 4B) (concentração do anticorpo é 100 nM). Legenda: (A) BLA8; (B) BRCA165; (C) BRCA68D; (D) BRCA69D; (E) BRCA84D; (F) GB8; (G) LUCA1; (H) LUCA50; (I) OVCA21; (J) OVCA22; (K) PA20; (L) PRCA123; (M) SG24; (N) SG27; (O) ST09; (P) TDH4 (184-192); (Q) TDH4; (R) TDH5; (S) TES7. A posição vertical da legenda correlaciona-se com a posição da curva correspondente.

[080] As figuras 5A a 5S demonstram a afinidade de ligação entre os antígenos na solução e os anticorpos monoclonais capturados (linhas sólidas; B7-H3(4Ig) 100 nM; linhas tracejadas; B7-H3, 100 nM).

[081] As figuras 6A a 6I mostram os resultados das análises de BIACORE^TM dos anticorpos B7-H3 imobilizados para B7-H3-2Ig (linhas cinza tracejadas) ou B7-H3-4Ig (linhas pretas sólidas). Os anticorpos foram titulados de 0,063 μΜ a 1 μΜ. O tempo está em segundos.

[082] A figura 7 provê uma comparação da análise de BIACORE^TM dos anticorpos PRCA157, BRCA69D, BLA8, PA20, BRCA84D, GB8 e SG27.

[083] A figura 8 provê uma análise de BIACORE^TM demonstrando que os anticorpos BRCA68D, BRCA69D, e PRCA157

28/215 não competem com BRCA84D para ligar a B7-H3 humana.

[084] As figuras 9A e 9B mostram os resultados dos estudos na habilidade dos anticorpos anti-B7-H3 da presente invenção de se tornarem internalizados ao se unirem às células cancerosas (figura 9A, células CSC da próstata; figura 9B, células pancreáticas Hs700t).

[085] As figuras 10A a 10F mostram a habilidade dos anticorpos anti-B7-H3 da presente invenção de atravessar o bloco um do outro, revelando assim a sobreposição ou epítopos distintos. Um excesso de dez vezes do anticorpo competidor foi empregado.

[086] As figuras 11A e 11B mostram o alinhamento dos resíduos de aminoácido das cadeias leves variáveis (figura 11A) ou cadeias pesadas variáveis (figura 11B) de BRCA84D e seu derivado humanizado, hBRCA84D.

[087] A figura 12 mostra as afinidades de ligação relativas dos derivados de cadeia leve hBRCA84D BRCA84D-3VL, BRCA84D-4VL e BRCA84D-5VL para a B7-H3 humana.

[088] A figura 13 mostra as afinidades de ligação relativas dos derivados de cadeia pesada BRCA84D-2VH, BRCA84D-3VH e BRCA84D-4VH para B7-H3 humana.

[089] A figura 14 mostra as afinidades de ligação relativas de (1) anticorpos contendo hBRCA84D-2VL e hBRCA84D-2VH (ensaios 1 e 2), (2) BRCA84D quimérico, (3) anticorpo contendo hBRCA84D-5VL e BRCA84D-HC quimérico e (4) anticorpo contendo hBRCA84D-5VL e hBRCA84D-2VH.

[090] A figura 15 mostra a habilidade dos anticorpos anti-B7-H3 humanizados modificados por Fc de inibir o crescimento do tumor de células do carcinoma de bexiga urinária HT-1197 in vivo em um sistema de modelo de

29/215 xenoenxerto de murino. O anticorpo hBRCA84D-2 modificado por Fc (compreendendo modificações por Fc L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L) foi administrado aos camundongos (em uma dose de 1 pg/kg, 10 pg/kg, ou 20 pg/kg) 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após o implante das células cancerosas.

[091] A figura 16 mostra a habilidade dos anticorpos anti-B7-H3 humanizados modificados por Fc de inibir o crescimento do tumor de células de carcinoma renal A498 in vivo em um sistema de modelo de xenoenxerto de murino. O anticorpo hBRCA84D-2 modificado por Fc (compreendendo modificações de Fc L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L) foi administrado aos camundongos (em uma dose de 1 pg/kg, 10 pg/kg, ou 20 pg/kg) 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias depois do implante das células cancerosas.

[092] As figuras 17A a 17D demonstram a habilidade do hBRCA84D-2 / anti-TCR DART^TM (T-DART™) de mediar a morte redirecionada das células cancerosas pulmonares SK-MES-1, células de carcinoma renal A498, células cancerosas da próstata LNCaP e células de melanoma UACC-62.

[093] As figuras 18A a 18C mostram o decaimento farmacocinético de ofanti-B7-H3 Mab1 no soro de camundongos mCD16-/-, hCD16A_FOXNl machos livres de tumor (figuras 18A e 18B). A figura 18C mostra os perfis farmacocinéticos previstos gerados usando um modelo comportamental 2 com parâmetros dos 5mg/kg de dose a 0,1, 0,5, 1,5, e 10 mg/kg.

[094] A figura 19 mostra a expressão relativa de HER2 e PRCA135 pela linhagem de câncer de bexiga HT-1197.

[095] A figura 20 mostra a afinidade de ligação das variáveis hBRCA84D do anticorpo anti-B7-H3 para as células HT-1197.

30/215 [096] As figuras 21A a 21C mostram os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para HT1197. Grupos de 8 camundongos fêmeas receberam veículo ou 10 mg/kg de controle de IgG, ou centuximabe em uma dose de 1, 5, ou 15 mg/kg ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,1, 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg (Q7D x5). As medições do tumor foram feitas a cada 3-4 dias. A figura 21A mostra a habilidade do anticorpo anti-B7-H3 Mab1 de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. Comparações versus controle IgG: Mab1 (1 e 5 mg/kg) versus controle IgG *** do dia 51 ; Mab1 (10 mg/kg) versus controle IgG ** do dia 48. A figura 21B mostra a habilidade do centuximabe de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. Cetuximabe (7 mg/kg) versus Controle IgG ** do dia 51; Cetuximabe (15 mg/kg) versus controle IgG *** do dia 58. A figura 21C compara os resultados obtidos nas doses máximas testadas.

[097] As figuras 22A e 22B mostram a expressão relativa de HER2 e PMSA pela linhagem de câncer de bexiga HT1376.

[098] A figura 23 mostra os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para HT-1376. Grupos de camundongos receberam veículo ou 1,0 mg/kg de anticorpo antiB7-H3 Mab1 (Q7D x4).

[099] A figura 24 mostra os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para AGS. Grupos de camundongos receberam veículo ou 10 mg/kg de anticorpo antiB7-H3 Mab1 em uma dose de 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg (Q7D x5).

[0100] A figura 25 mostra os resultados de um ensaio de citotoxicidade in vitro de células cancerosas

31/215 pulmonares A54 9 em incubação com anticorpos anti-B7-H3 variáveis hBRCA84D, chBRCA84D e hBRCA84 (Fc Varl) (Proporção E:T = 25:1 ; Efetor = PBMC Humano; leitura do Ensaio LDH).

[0101] A figura 26 mostra os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para A549. Grupos de camundongos receberam veículo ou 1,0 mg/kg de anticorpo antiB7-H3 Mab1 (Q7D x4).

[0102] A figura 27 mostra os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para CaLu3. Grupos de camundongos receberam veículo ou 0,5, 1, ou 5 mg/kg (Q7D x5) de anticorpo anti-B7-H3 Mab1 ou controle IgG (10 mg/ml).

[0103] As figuras 28A a 28C mostram os resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas de melanoma LOX-IMVI. Grupos de 8 camundongos fêmeas receberam veículo ou 5 mg/kg de controle IgG, ou Docetaxel em uma dose de 5, 10 ou 20 mg/kg ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg.A figura 28A mostra a habilidade do anticorpo anti-B7H3 Mab1 de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. A figura 28B mostra a habilidade de Docetaxel de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. A figura 28C compara os resultados obtidos nas doses máximas testadas.

[0104] A figura 29 mostra o resultado de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas de melanoma UACC-62. Grupos de camundongos receberam veículo ou 5 mg/kg de controle IgG, ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg.

[0105] As figuras 30A a 30C mostram os

32/215 resultados de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas da próstata 2rv. Grupos de 8 camundongos

fêmeas receberam	veículo	ou	10	mg/kg de controle	IgG, ou
Trastuzumabe em	uma dose	de	1,7	ou 15 mg/kg	ou	anticorpo
anti-B7-H3 Mab1	em uma dose	de	0,5, 1,5, ou	10	mg/kg. A

figura 30A mostra a habilidade do anticorpo anti-B7-H3 Mab1 de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. A figura 30B mostra a habilidade de Trastuzumabe de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor no modelo de xenoenxerto de murino. A figura 30C compara os resultados obtidos nas doses máximas testadas.

[0106] A figura 31 mostra os resultados de um ensaio de citotoxicidade in vitro de células cancerosas renais A498 em incubação com anticorpos anti-B7-H3 variáveis hBRCA84D, chBRCA84D e hBRCA84 (Fc Varl) (Proporção E:T = 25:1 ; Efetor = PBMC Humano; leitura de Ensaio LDH).

[0107] A figura 32 mostra o resultado de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas renais A498. Grupos de camundongos receberam veículo ou 10 mg/kg de controle IgG, ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,1, 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg. Centuximabe (anticorpo anti-EGRF) foi administrado a um grupo de controle de camundongos em doses de 1,7, ou 15 mg/kg.

[0108] As figuras 33A e 33B mostram o resultado de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas renais 786-0 comparadas a centuximab. Grupos de camundongos receberam veículo ou 10 mg/kg de controle IgG, ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,1, 0,5, 1,5, ou 10 mg/kg. Centuximabe (anticorpo anti-EGRF) foi administrado a um grupo de controle camundongos em doses de 1,7, ou 15

33/215 mg/kg.

[0109] A figura 34 mostra o resultado de uma análise de xenoenxerto de murino para células cancerosas renais 786-0 comparadas a paclitaxel. Grupos de camundongos receberam veículo ou 5 mg/kg de controle IgG, ou anticorpo anti-B7-H3 Mab1 em uma dose de 0,1, 0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg. Paclitaxel foi administrado a um grupo de controle de tais oito camundongos em uma dose de 2,5 mg/kg.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:

[0110] A presente invenção se refere a anticorpos e seus fragmentos que são imunorreativos ao mamífero, e mais particularmente, ao receptor humano de B7-H3 e a seus usos, particularmente no tratamento de câncer e inflamação. A invenção assim particularmente diz respeito aos anticorpos humanizados reativos de B7-H3 e seus fragmentos imunorreativos que são capazes de mediar, e mais preferencialmente aumentar a ativação do sistema imune contra as células cancerosas que estão associadas com uma variedade de cânceres humanos.

I. TÉCNICAS GERAIS [0111] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado o contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, as quais estão dentro da habilidade do assunto. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tais como, CLONAGEM MOLECULAR: UMA MANUAL DE LABORATÓRIO, Terceira Edição (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEO: MÉTODOS E APLICAÇÕES (Métodos em Biologia Molecular), Herdewijn, P.,

34/215

Ed., Human Press, Totowa, NJ; SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEO (Gait, M.J., Ed., 1984); MÉTODOS EM BIOLOGIA MOLECULAR, Human Press, Totowa, NJ; BIOLOGIA CELULAR: UM CADENO DE LABORATÓRIO (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY; CULTURA CELULAR ANIMAL (Freshney, R.I., Ed., 1987); INTRODUÇÃO À CULTURA DE CÉLULA E TECIDO (Mather, J.P. E Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY; CULTURA DE CÉLULA E TECIDO: PROCEDIMENTOS DE LABORATÓRIO (Doyle, A. et al, Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; MÉTODOS EM ENZIMOLOGIA (Academic Press, Inc.) New York, NY; GUIA DE WEIR DE IMUNOLOGIA EXPERIMENTAL (Herzenberg, L.A. et al Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY; VETORES DE TRANSFERÊNCIA DE GENE PARA CÉLULAS DE MAMÍFERO (Miller, J.M. et al Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; PROTOCOLOS ATUAIS EM BIOLOGIA MOLECULAR (Ausubel, F.M. et al, Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; PCR: A REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE, (Mullis, K. et al, Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; PROTOCOLOS ATUAIS EM IMUNOLOGIA (Coligan, J.E. et al, eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; PROTOCOLOS CURTOS EM BIOLOGIA MOLECULAR (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; IMUNOBIOLOGIA 7 (Janeway, C.A. et al 2007) Garland Science, London, UK; Anticorpos (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; ANTICORPOS: UMA ABORDAGEM PRÁTICA (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); ANTICORPOS MONOCLONAIS: UMA ABORDAGEM PRÁTICA (Shepherd, P. et al Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; USANDO ANTICORPOS: UM MANUAL DE LABORATÓRIO (Harlow, E. et al Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; OS ANTICORPOS (Zanetti, M. et al Eds. 1995)

35/215

Harwood Academic Publishers, London, UK); e DEVITA, HELLMAN,

E CÂNCER DE ROSENBERG:	PRINCÍPIOS &	PRÁTICA DE	ONCOLOGIA,
OITAVA EDIÇÃO, DeVita,	V. et al.	Eds.	2008,	Lippincott
Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.
II. DEFINIÇÕES
[0112] Como	usado aqui,	o	termo	B7-H3 se

refere a um membro da família de proteínas B7 humanas, uma proteína de membrana tipo I com domínios tipo Ig também conhecidos como CD276. O termo 2Ig-B7-H3 denota a forma de B7-H3 que apenas compreende dois domínios tipo Ig; o termo 4Ig-B7-H3 denota a forma de B7-H3 que compreende quatro domínios tipo Ig (ver, Sun, M. et al. (2002) Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297; Steinberger et al. (2004), Molecular Characterization Of Human 4Ig-B7-H3, A Member Of The B7 Family With Four Ig-Like Domains,” J. Immunol. 2004, 172(4):2352-2359 e Castriconi et al. (2004) Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis;” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645). O antígeno TES7 (WO 2008/066691) é um antígeno que divide as características do 4Ig-B7-H3. Consequentemente, os anticorpos que especificamente se unem ao TES7 se unem à 4Ig-B7-H3. O antígeno TES7 pode ter mais que um epítopo diferente, e epítopos podem ser não lineares. Vários anticorpos anti-B7-H3 são conhecidos por se unirem aos epítopos não lineares, incluindo alguns apenas presentes na isoforma de 4Ig-B7-H3. Acredita-se atualmente que TES7 pode ser superexpresso em certas células cancerosas em comparação às suas contrapartes de tecido normal.

36/215 [0113] Agonistas, antagonistas, e outros moduladores da função de B7-H3 são expressamente incluídos dentro do escopo dessa invenção. Esses agonistas, antagonistas e moduladores são polipetídeos que compreendem um ou mais dos locais determinantes antigênicos de B7-H3, ou compreendem um ou mais fragmentos de tais locais, variáveis de tais locais, ou peptidomiméticos de tais locais. Esses compostos modulatórios agonísticos, antagonísticos e de B7H37 são providos em forma linear ou cíclica, e opcionalmente compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido que não é comumente encontrado na natureza ou pelo menos um isóstero de amida. Esses compostos podem ser glicosilados.

[0114] Mais especificamente, os termos moduladores de B7-H3, como usados aqui, são definidos como qualquer composto que (1) seja capaz de interromper ou bloquear a interação entre a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3; (2) seja capaz de ligarse a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3; (3) contenha um local antigênico que possa ser usado na elevação de anticorpos capazes de ligarem-se a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3;

(4) contenha um local antigênico que possa ser usado no rastreamento dos anticorpos capazes de ligarem-se a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3;

(5) contenha um local antigênico que possa ser usado na elevação de anticorpos capazes de interromper ou bloquear a interação entre a B7-H3 humana e seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3; (6) contenha um local antigênico que possa ser usado no rastreamento dos anticorpos capazes de interromper ou bloquear a interação entre a B7-H3 humana e

37/215 seus ligantes naturais ou um anticorpo anti-B7-H3. Os moduladores de B7-H3 podem ser agonistas de B7-H3” ou antagonistas de B7-H3” dependendo se sua atividade aumenta a ativação da célula T ou inibe a ativação da célula T, respectivamente.

[0115] Os agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 incluem variáveis de B7-H3, antagonistas peptídeos de B7-H3, peptidomiméticos, e moléculas pequenas, anticorpos anti-B7-H3 e variáveis de imunoglobulina, variáveis de aminoácido de B7-H3 humana incluindo variáveis de substituição de aminoácido, deleção e adição, ou qualquer combinação deles, e imunoglobulinas quiméricas. Os agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 dessa invenção são baseados na identificação dos domínios de B7-H3 envolvidos na ligação da B7-H3 humana em seus ligantes naturais ou anticorpos anti-B7-H3. Assim, a invenção provê agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 com estruturas moleculares que duplicam ou imitam um ou mais dos domínios de ligação anti-B7-H3 de B7-H3 humana.

[0116] Conforme usado aqui, o termo variável de B7-H3” denota qualquer variável de aminoácido de B7-H3 humana, incluindo variáveis de substituição de aminoácido, deleção e adição, ou qualquer combinação deles. A definição engloba moléculas quiméricas tais como B7-H3 humana / quimeras não humanas e outras moléculas híbridas. Também está incluído na definição qualquer fragmento de uma molécula variável de B7-H3 que compreende o variável ou região(ões) híbridas(s) da molécula.

[0117] Conforme usado aqui, um anticorpo” é uma molécula de imunoglobulina capaz de se unir especificamente a

38/215 um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um local de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme usado aqui, o termo engloba não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também seus fragmentos (tais como Fab, Fab, F(ab)2 Fv), cadeia simples (ScFv), seus mutantes, variáveis de ocorrência natural, proteínas de fusão compreendendo uma porção do anticorpo com um local de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, BiTEs®, moléculas de DART^TM e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida.

[0118] O termo BiTEs (ligadores de célula T biespecíficos) se refere a uma molécula de cadeia de simples que tendo dois domínios de ligação de antígeno, um dos quais se une ao antígeno de célula T e o segundo se une a um antígeno presente na superfície de um alvo (WO 05/061547; Baeuerle, P et al. (2008) BiTE®: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells” Drugs of the Future 33:137-147; Bargou, et al. (2008) Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody ,” Science 321:974977) .

[0119] O termo DART^TM (reagente de redirecionamento de dupla afinidade) se refere a uma molécula de imunoglobulina que compreende pelo menos duas cadeias de polipeptídeo que se associam (especialmente através de uma interação covalente) para formar pelo menos dois locais de ligação de epítopo, os quais podem reconhecer os mesmos ou

39/215 diferentes epítopos. Cada uma das cadeias de polipeptídeo de um DART^TM compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina, mas essas regiões não interagem para formar um local de ligação de epítopo. Antes, a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de uma (por exemplo, a primeira) das cadeias de polipeptídeo de DART^TM interage com a região variável de cadeia leve de imunoglobulina de uma cadeia de polipeptídeo (por exemplo, a segunda) de DART^TM diferente para formar um local de ligação do epítopo. Similarmente, a região variável de cadeia leve de imunoglobulina de uma (por exemplo, a primeira) das cadeias de polipeptídeo de DART^TM interage com a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina de uma cadeia de polipeptídeo (por exemplo, a segunda) de DART^TM diferente para formar um local de ligação de epítopo. Os DART^TMs podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos, etc., assim sendo capazes de se unirem simultaneamente a um, dois, três ou mais epítopos diferentes (os quais podem ser dos mesmos ou de antígenos diferentes). Os DART^TMs podem ser adicionalmente monovalentes, bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes, hexavalentes, etc., assim sendo capazes de se unirem simultaneamente a uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais moléculas. Esses dois atributos dos DART^TMs (isto é, grau de especificidade e valência podem ser combinados, por exemplo, para produzir anticorpos biespecíficos (isto é, capazes de ligar dois epítopos) que são tetravalentes (isto é, capazes de ligar quatro conjuntos de epítopos), etc. As moléculas de DART^TM estão descritas nas Publicações de PCT WO 2006/113665, WO 2008/157379, e WO 2010/080538.

40/215 [0120] O termo anticorpo monoclonal” se refere a uma população de anticorpo homogêneo em que o anticorpo monoclonal é compreendido de aminoácidos (de ocorrência natural ou não) que estão envolvidos na ligação seletiva de um antígeno. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um local antigênico simples. O termo anticorpo monoclonal” engloba não apenas anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais de comprimento total, mas também seus fragmentos (tais como Fab, Fab”, F(ab”)2 Fv), cadeia simples (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção do anticorpo, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida e a habilidade de se unir a um antígeno. Não se destina a ser limitado no que se refere à fonte do anticorpo ou a maneira em que é feito (por exemplo, por hibridoma, seleção de fagos, expressão recombinante, animais transgênicos, etc.). O termo inclui imunoglobulinas totais bem como os fragmentos etc. descritos acima sob a definição de anticorpo”.

[0121] O termo anticorpo humanizado” se refere a uma molécula quimérica, geralmente preparada usando técnicas recombinantes, tendo um local de ligação de antígeno derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana e a estrutura restante da imunoglobulina da molécula com base na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. O local de ligação de antígeno pode compreender quer domínios variáveis completos fundidos em domínios constantes ou apenas as regiões de determinação de complementaridade (CDRs)

41/215 enxertadas em regiões de estruturas apropriadas nos domínios variáveis. Os locais de ligação de antígeno podem ser do tipo selvagem ou modificado por uma ou mais substituições de aminoácido. Isso elimina a região constante como um imunógeno em indivíduos humanos, mas a possibilidade de uma resposta imune para a região variável externa permanece (LoBuglio, A.F. et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Outra abordagem foca não apenas na provisão de regiões constantes derivadas de humanos, mas na modificação das regiões variáveis bem como na reformulação delas tão perto quanto possível à forma humana. Sabe-se que as regiões variáveis de ambas as cadeias leve e pesada contêm três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) que variam em resposta aos antígenos em questão e determinam a capacidade de ligação, flanqueadas por quatro regiões de estrutura (FRs) que são relativamente conservadas em uma espécie dada e que provê putativamente um suporte para as CDRs. Quando anticorpos não humanos são preparados com respeito a um antígeno particular, as regiões variáveis podem ser reformuladas ou humanizadas através do enxerto de CDRs derivadas de anticorpo não humano nas FRs presentes no anticorpo humano a ser modificado. A aplicação dessa abordagem a vários anticorpos foi relatada por Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of

42/215

Framework Residues On Loop Conformation Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity , ” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo, ” Bio/Technology 9:266-271 ; Co, M. S. et al. (1991) Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) Humanization Of An Anti-pl85her2 Antibody For Human Cancer Therapy Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; e Co, M.S. et al. (1992) Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148: 1 149-1154. Em algumas realizações, os anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo humanizado de camundongo que contém todas as seis CDRs dos anticorpos do camundongo). Em outras realizações, os anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quarto, cinco, seis) que são alteradas com relação ao anticorpo original, que também denominados uma ou mais CDRs derivadas de” uma ou mais CDRs do anticorpo original.

[0122] Conforme usado aqui, um anticorpo ou um polipeptídeo é dito especificamente ligar uma região de outra molécula (isto é, um epítopo) se ele reagir ou associar mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com aquele epítopo relativo aos epítopos alternativos. Por exemplo, um anticorpo que especificamente se une a um epítopo de B7-H3 é um anticorpo que se une a esse

43/215 epítopo de B7-H3 com maior afinidade, adivez, mais prontamente e /ou com maior duração do que se une com outros epítopos de B7-H3 ou epítopos de não B7-H3. Também é entendido pela leitura dessa definição que, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que se une especificamente a um primeiro alvo ou não pode especificamente ou preferencialmente se unir a um segundo alvo. Como tal, ligação específica” não necessariamente requer (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, referência à ligação significa ligação específica”.

[0123] Conforme usado aqui, o termo imunologicamente ativo” em referência a um epítopo sendo ou permanecendo imunologicamente ativo” se refere à habilidade de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-B7-H3) de se unir ao epítopo em condições diferentes, por exemplo, depois de o epítopo ter sido submetido à redução e condições de desnaturantes.

[0124] Funções biológicas diferentes estão associadas com anticorpos anti-B7-H3, incluindo, mas não limitado a uma ou mais de: uma habilidade para especificamente se unir a B7-H3 (e em particular molécula de B7-H3 que são expressas nas superfícies das células cancerosas, incluindo, mas não limitado a, rim, próstata ou pulmão, células cancerosas); uma habilidade de inibir competitivamente ligação preferencial de um anticorpo antiB7-H3 conhecido para B7-H3, incluindo a habilidade de preferencialmente se unir ao mesmo epítopo de B7-H3 ao qual o anticorpo original preferencialmente se une; uma habilidade de se unir a uma porção de B7-H3 que é exposta na superfície

44/215 de uma célula viva in vitro ou in vivo; uma habilidade de se unir a uma porção de B7-H3 que é exposta na superfície de células cancerosas vivas, tais como, mas não limitado a, células cancerosas da próstata, do pulmão ou do rim; uma habilidade de liberar um agente quimioterápico em células cancerosas (tais como células cancerosas do rim, próstata, ou pulmão) expressando B7-H3 em sua superfície; e/ou uma habilidade de liberar um agente terapêutico ou marcador detectável em células cancerosas expressando B7-H3 em sua superfície. Conforme discutido aqui, os polipeptídeos (incluindo anticorpos) da invenção podem ter qualquer uma ou mais dessas características.

[0125] Um anticorpo equivalente a anti-B7-H3” ou polipeptídeo equivalente a anti-B7-H3” se refere a um anticorpo ou um polipeptídeo tendo uma ou mais funções biológicas associadas com um anticorpo anti-B7-H3, tal como, por exemplo, especificidade de ligação.

[0126] Conforme usado aqui, o termo agente” se refere a um composto biológico, farmacêutico ou químico. Exemplos não limitantes incluem molécula orgânica ou inorgânica complexa, a peptídeo, uma proteína, um oligonucleotídeo, um anticorpo, um derivado de anticorpo, fragmento de anticorpo, um derivado de vitamina, um carboidrato, uma toxina, ou um composto quimioterápico. Vários compostos podem ser sintetizados, por exemplo, por moléculas pequenas e oligômeros (por exemplo, oligopeptídeos e oligonucleotídeos) , e compostos orgânicos sintéticos com base em várias estruturas de núcleo. Além disso, as várias fontes naturais podem prover compostos para triage, tais como extratos vegetais e animais, e similares.

45/215 [0127] Os agentes que são empregados nos métodos dessa invenção podem ser aleatoriamente selecionados ou racionalmente selecionados ou projetados. Conforme usado aqui, um agente é dito ser aleatoriamente selecionado quando o agente é escolhido sem consideração anterior ou conhecimento do aminoácido específico ou outras porções químicas envolvidas na associação da molécula com seu(s) parceiro(s) de ligação natural(is) ou anticorpos conhecidos. Um exemplo de um agente aleatoriamente selecionado é um agente que é identificado através do uso e triage de uma biblioteca química ou uma biblioteca combinatória de peptídeo.

[0128] Conforme usado aqui, um agente é dito ser racionalmente selecionado ou projetado quando o agente é escolhido em uma base não aleatória que leva em consideração a sequência do local alvo e/ou sua conformação em conexão com a ação do agente. Com relação aos agentes anti-B7-H3, acredita-se atualmente que há pelo menos três epítopos em B7H3 contra os quais os anticorpos podem ser elevados e, portanto, pelo menos três locais de ação para os agentes que bloqueiam a interação B7-H3/anti-B7-H3. Essa invenção também engloba agentes que agem nos locais de interação entre B7-H3 e seu parceiro de ligação natural, embora outros ligantes e seus locais ativos interativos com B7-H3 também sejam englobados dentro do escopo dessa invenção, se atualmente conhecido ou identificado posteriormente. Os agentes podem ser racionalmente selecionados ou racionalmente projetados pela utilização das sequências de peptídeo que compõem os locais de contato do receptor/ligante e/ou complexo de anticorpo B7-H3/anti-B7-H3. Por exemplo, um agente peptídeo

46/215 racionalmente selecionado pode ser um peptídeo cuja sequência de aminoácido é idêntica a um epítopo que aparece em B7-H3 conforme ele é exposto na superfície de uma célula viva em seu ambiente natural. Tal agente reduzirá ou bloqueará a associação do anticorpo anti-B7-H3 com B7-H3, ou a associação de B7-H3 com seu ligante natural, conforme desejado, através da ligação ao anticorpo anti-B7-H3 ou ao ligante natural.

[0129] Conforme usado aqui, o termo rotulado, com relação a um anticorpo, pretende englobar rotulagem direta do anticorpo através de acoplamento (isto é, ligando fisicamente) uma substância detectável, tal como um agente radioativo ou um fluoróforo (por exemplo, ficoeritrina (PE) ou isotiocianato de fluoresceína (também conhecido como fluoroisotiocianato ou FITC)) ao anticorpo, bem como rotulagem indireta da sonda ou anticorpo pela reatividade com uma substância detectável.

[0130] Conforme usado aqui, o termo associação, com relação a um anticorpo, inclui anexo covalente e não covalente ou ligação de um agente (por exemplo, agente quimioterápico) ao anticorpo. O anticorpo pode estar associado com um agente (por exemplo, agente quimioterápico) pela ligação direta ou ligação indireta através do anexo a uma plataforma comum, de modo que o anticorpo direciona a localização do agente à célula cancerosa a qual o anticorpo se une e em que o anticorpo e o agente não dissociam substancialmente em condições psicológicas de modo que o agente não é direcionado para a mesma célula cancerosa a qual o anticorpo se une ou de modo que a potência do agente não seja reduzida.

[0131] O termo amostra biológica engloba uma

47/215 variedade ser usado de tipos de amostra obtida de um indivíduo e pode em um ensaio de diagnóstico ou monitoramento. A definição engloba saliva, sangue e outras amostras líquidas de origem biológica, amostras de tecido sólido tais como um espécime de biópsia ou culturas de tecido ou células derivadas deles, e sua progenitura, por exemplo, células obtidas a partir de amostra de tecido coletada de um indivíduo com suspeita de ter câncer, em realizações preferidas de tecido do ovário, pulmão, próstata, pâncreas, colo, e mama.

A definição também inclui amostras que foram manipuladas de qualquer maneira depois de sua obtenção, tal como por tratamento com reagentes, solubilização, ou enriquecimento para certos componentes, tais como proteínas ou polinucleotídeos, ou incorporando em uma matriz sólida ou semissólida para fins de seccionamento. O termo amostra biológica” engloba uma amostra clínica, e também inclui células em cultura, sobrenadantes de célula, lisados de célula, soro, plasma, fluido biológico, e amostras de tecido.

[0132] termo célula hospedeira” inclui uma célula individual ou cultura de célula que pode ser ou tenha sido um recipiente para vetor(es) para incorporação de inserções de polinucleotídeo. As células hospedeiras incluem progenitura de uma célula hospedeira simples, e a progenitura pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula original devido à mutação natural, acidental ou deliberada.

Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com polinucleotídeo(s) dessa invenção.

[0133] Conforme usado aqui, o termo atraso no desenvolvimento da metástase” significa adiar, impedir,

48/215 reduzir, retardar, estabilizar e/ou postergar o desenvolvimento da metástase. Essa demora pode ser de diferentes períodos de tempo, dependendo do histórico do câncer e/ou do indivíduo que está sendo tratado. Conforme está evidente para alguém especialista na matéria, uma demora suficiente ou significativa pode, na realidade, englobar prevenção, em que o indivíduo não desenvolve a metástase.

[0134] Conforme usado aqui, uma quantidade eficaz” de uma composição farmacêutica, em uma realização, é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados incluindo, sem limitação, resultados clínicos tais como encolhimento no tamanho do tumor (no contexto de câncer, por exemplo, câncer de mama ou próstata), retardo do crescimento de célula cancerosa, atraso no desenvolvimento de metástase, diminuição dos sintomas resultantes da doença, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuição da dose de outras medicações requeridas para tratar a doença, aumento do efeito de outra medicação tal como através de focalização e/ou internalização, atraso no progresso da doença, e/ou prolongamento da sobrevivência dos indivíduos. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para fins dessa invenção, uma quantidade eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para reduzir a proliferação de (ou destruição) células cancerosas e para reduzir e/ou atrasar o desenvolvimento, ou crescimento, de metástases de células cancerosas, quer diretamente ou indiretamente. Em algumas realizações, uma quantidade eficaz de um fármaco, composto, ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro fármaco, composto, ou

49/215 composição farmacêutica. Assim, uma quantidade eficaz” pode ser considerada no contexto de administração de um ou mais agentes quimioterápicos, e pode-se considerar que um agente simples é dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é alcançado. Enquanto as necessidades individuais variam, determinação de faixas ideiais de quantidades eficazes de cada componente está dentro da habilidade do assunto. As dosagens típicas compreendem de 1 a 100 mg/kg/peso corporal. As dosagens mais preferidas compreendem de 10 a 100 mg/kg/peso corporal.

[0135] Conforme usado aqui, um agente ou molécula de ácido nucleico, anticorpo, composição ou célula, etc., é dito ser isolado” quando aquela molécula de ácido nucleico, agente, anticorpo, composição, ou célula, etc. é substancialmente separada das moléculas de ácido nucleico contaminantes, anticorpos, agentes, composições, ou células, etc. naturalmente presentes em sua fonte original.

[0136] O termo indivíduo” se refere a um animal vertebrado, preferencialmente um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não são limitados a, humanos, animais de fazenda, animais esportivos, animais de estimação, primatas, camundongos e ratos. Na realização mais preferida, o termo indivíduo significa um humano.

[0137] Os termos polipeptídeo,” oligopeptídeo,” peptídeo” e proteína” são usados alternadamente aqui para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido pelos não aminoácidos.

50/215

Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tais como conjugação com um componente de rotulagem. Também estão incluídos na definição, por exemplo, os polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na matéria. Entende-se que, porque os polipeptídeos dessa invenção são baseados em um anticorpo, os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias simples ou como cadeias associadas.

[0138] Também são englobados dentro do escopo da invenção os peptidomiméticos dos agonistas, antagonistas e moduladores de peptídeo B7-H3 (incluindo anticorpos anti-B7H3) descritos aqui. Tais peptidomiméticos incluem peptídeos em que pelo menos um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que não é comumente encontrado na natureza, tal como o isômero D do aminoácido ou uma espécie N-alquilada do aminoácido. Em outras realizações, os peptidomiméticos são construídos pela substituição de pelo menos uma ligação de amida (-C(=O)-NH-) em um agonista, antagonista ou moduladores de peptídeo B7-H3 com um isóstero de amida. Isóstero de amido adequados incluem -CH2-NH-, -CH2S-, -CH2-S(O)-, -CH2-S(O)2-, -CH2-CH2- -CH=CH- (forma E ou Z), -C(=O)-CH2- -CH(CN)-NH--C(OH)-CH2-, e -O-C(=O)-NH-. As ligações de amida em um agonista, antagonista ou modulador de peptídeo de B7-H3 que são candidatos adequados para substituição com isósteros de amida incluem ligações que são hidrolisáveis pelas esterases ou proteases endógenas do

51/215 sujeito pretendido do tratamento com agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7-H3.

[0139] Conforme usado aqui, o termo substancialmente puro” se refere ao material que é pelo menos 50% puro (isto é, livre de contaminantes), mais preferencialmente pelo menos 90% puro, mais preferencialmente pelo menos 95% puro, mais preferencialmente pelo menos 98% puro, mais preferencialmente pelo menos 99% puro, e mais preferencialmente mais que 99% puro.

[0140] Conforme usado aqui, o termo toxina” se refere a qualquer substancia que efetua uma resposta adversa dentro de uma célula. Por exemplo, uma toxina direcionada a uma célula cancerosa teria um efeito adverso, às vezes prejudicial, incluem, mas maitansinoide, monometila auristatina Patentes 6.333.410; 6.596.757;

caliqueamicina, doxorrubicina), E; ricina, difteria, e tiuxetano conjugado ou (por exemplo, ⁹⁰Y; ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac, etc .) .

[0141] Conforme na célula cancerosa.

não são limitados uma auristatina (por (MMAE), auristatina de

E (AE), etc.) (tais

Norte-Americanas n°^s

6.340.701; 6.372.738;

7.276.497;

7.585.857

Exemplos de toxinas a, um taxano, um exemplo, auristatina de monometila F (MMAF) , como aquelas descritas nas 5.208.020; 5.416.064;

6.436.931; 6.441.163;

7.851.432), uma (por exemplo, catepsina B ou toxina da exemplo, tóxico ¹⁸⁸Re, ²¹¹At, ²¹²Bi, ²¹³Bi, usado aqui, os termos ou uma antraciclina um análogo CC-1065, docetaxel;

gelonina, exotoxina Pseudomonas,

RNase; anticorpos radiomarcados (por marcado com um radioisótopo ¹⁸⁶Re, tratamento” ou tratando” significa uma abordagem para obter

52/215 um resultado benéfico ou desejado incluindo, e preferencialmente, um resultado clínico benéfico ou desejado. Tais resultados clínicos benéficos ou desejados, mas não são limitados a, um ou mais dos seguintes: redução da proliferação de (ou destruição) células cancerosas ou outras doenças, redução da metástase de células cancerosas encontradas em cânceres, encolhimento do tamanho do tumor, diminuição dos sintomas resultantes da doença, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuição da dose de outras medicações requeridas para tratar a doença, atraso na progressão da doença, e/ou prolongamento da sobrevivência de indivíduos.

[0142] Conforme usado aqui, o termo câncer pretende englobar cânceres caracterizados pela presença de uma célula cancerosa selecionada do grupo consistindo em uma célula de um tumor da glande adrenal, um câncer associado à AIDS, um sarcoma alveolar de tecido mole, um tumor astrocítico, câncer de bexiga (carcinoma de célula escamosa e carcinoma de célula transicional), câncer ósseo (adamantinoma, cistos ósseos aneurismáticos, osteocondroma, osteossarcoma), câncer cerebral e da medula espinhal, um tumor cerebral metastático, um câncer de mama, tumores corporais carotídeos, um câncer cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de células renais cromófobo, um carcinoma de células claras, um câncer de colo, um câncer colorretal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de pequenas células redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixoide extraesquelético, uma fibrinogênese imperfeita do osso, uma displasia fibrosa do osso, um câncer da vesícula biliar ou do duto biliar,

53/215 câncer gástrico, uma doença trofoblásica gestacional, um tumor de célula germinativa, um câncer de cabeça e pescoço, carcinoma hepatocelular, um tumor de célula da ilhota, um sarcoma de Kaposi, um câncer de rins (nefroblastoma, carcinoma célula renal papilar), uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um câncer de fígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), um linfoma, um câncer pulmonar, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mieloma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um carcinoma da tireoide papilar, um tumor da paratireoide, um câncer pediátrico, um tumor da bainha do nervo periférico, um faeocromocitoma, um tumor pituitário, um câncer de próstata, um melanoma uveal posterior, um distúrbio hematológico raro, um câncer metastático renal, um tumor rabdoide, um rabdomiossarcoma, um sarcoma, um câncer de pele, um sarcoma tecido mole, um câncer de célula escamosa, um câncer de estômago, um sarcoma sinovial, um câncer testicular, um carcinoma tímico, um timoma, um câncer metastático da tireoide, e um câncer uterino (carcinoma da cérvix, carcinoma endometrial, e leiomioma).

III. MÉTODOS DE FABRICAÇÃO DE ANTICORPOS E POLIPEPTÍDEOS [0143] Os métodos de fabricação de anticorpos monoclonais são conhecidos na matéria. Um método que pode ser empregado é o método Kohler, G. et al. (1975) Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity Nature 256:495-497 ou sua modificação.

54/215

Tipicamente, anticorpos monoclonais são desenvolvidos em espécies não humanas, tais como camundongos. Em geral, um camundongo ou rato é usado para imunização, mas outros animais também podem ser usados. Os anticorpos são produzidos através da imunização dos camundongos com uma quantidade imunogênica de células, extratos de célula, ou preparações de proteína que contenham B7-H3 humana. O imunógeno pode ser, mas não é limitado a, células primárias, linhagens de célula cultivadas, células cancerosas, ácidos nucleicos ou tecidos. Em uma realização, células de carcinoma pulmonar humano são usadas. As células usadas para imunização, por exemplo, testículos humanos ou adenocarcinoma pancreático ou células de estômago, podem ser cultivadas por um período de tempo (por exemplo, pelo menos 24 horas) antes de seu uso como um imunógeno. As células (por exemplo, células de testículos humanos, estômago, ou adenocarcinoma pancreático) podem ser usadas como imunógenos por elas mesmas ou em combinação com um adjuvante não desnaturante, tal como Ribi. Em geral, as células devem se mantidas intactas e preferencialmente viáveis quando usadas como imunógenos. As células intactas podem permitir que os antígenos sejam mais bem detectados do que as células rompidas pelo animal imunizado. O uso de adjuvantes desnaturantes ou ásperos, por exemplo, adjuvante de Freud, pode romper as células e, portanto, ser desencorajado. O imunógeno pode ser administrado várias vezes em intervalos periódicos tais como quinzenalmente ou semanalmente, ou pode ser administrado de tal maneira para manter viabilidade no animal (por exemplo, em um recombinante de tecido).

[0144] Em uma realização, os anticorpos

55/215 monoclonais que se unem a B7-H3 são obtidos usando células hospedeiras que superexpressam B7-H3 como um imunógeno. Tais células incluem, a título de exemplo e não por limitação, células de carcinoma pulmonar humano e células cancerosas de colo humano.

[0145] Para monitorar a resposta do anticorpo, uma pequena amostra biológica (por exemplo, sangue) pode ser obtida do animal e testada para titulação do anticorpo contra o imunógeno. O baço e/ou diversos linfonodos grandes podem ser removidos e dissociados em células simples. Se desejado, as células do baço podem ser selecionadas (depois da remoção das células não especificamente aderentes) aplicando uma suspensão de célula em uma placa ou em uma cavidade revestida com o antígeno. As células B, que expressam imunoglobulina ligada à membrana específica para o antígeno, se unirão à placa, e não são lavadas com o resto da suspensão. As células B resultantes, ou todas as células do baço dissociadas, podem então ser fundidas com células do mieloma (por exemplo, X63Ag8.653 e aquelas de Salk Institute, Centro de Distribuição de Célula, San Diego, CA). Polietileno glicol (PEG) pode ser usado para unir baço e linfócitos com células de mieloma para formar um hibridoma. O hibridoma é então cultivado em um meio seletivo (por exemplo, hipoxantina, aminopterina, meio de timidina, também conhecido como meio HAT”). Os hibridomas resultantes são então colocados em placas limitando a diluição, e são ensaiados para a produção de anticorpos que se unem especificamente ao imunógeno, usando, por exemplo, rastreamento de FACS (separação de célula ativada por fluorescência) ou imuno-histoquímica (IHC). Os hibridomas que secretam anticorpo monoclonal selecionado são então

56/215 cultivados quer in vitro (por exemplo, em garrafas de cultura de tecido ou reatores de fibra oca), ou in vivo (por exemplo, como ascite em camundongos).

[0146] Como outra alternativa para a técnica de fusão de célula, as células B imortalizadas pelo Vírus Epstein-Barr (EBV) podem ser usadas para produzir anticorpos monoclonais da presente invenção. Os hibridomas são expandidos e subclonados, se desejado, e sobrenadantes são ensaiados para atividade anti-imunogênica através de procedimentos de ensaio convencionais (por exemplo, FACS,

IHC, radioimunoensaio, imunoensaio de enzima, imunoensaio de fluorescência, etc.).

[0147] Em outra alternativa, anticorpo monoclonal anti-B7-H3 e quaisquer outros anticorpos equivalentes podem ser sequenciados e produzidos de forma recombinante por quaisquer meios conhecidos no asssunto (por exemplo, humanização, uso de camundongos transgênicos para produzir anticorpos completamente humanos, tecnologia de exibição de fago, etc.). Em uma realização, o anticorpo monoclonal anti-B7-H3 é sequenciado e a sequência de polinucleotídeo é então clonada em um vetor para expressão ou propagação. A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro.

[0148] A sequência de polinucleotídeo de anticorpo monoclonal anti-B7-H3 e quaisquer outros anticorpos equivalentes pode ser usada para manipulação genética para gerar um anticorpo humanizado, para melhorar a afinidade ou outras características do anticorpo. O princípio geral na

57/215 humanização de um anticorpo envolver reter a sequência básica da porção de ligação do antígeno do anticorpo, enquanto troca o restante não humano do anticorpo com sequências de anticorpo humano. Há quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal. São elas: (1) determinar o nucleotídeo e sequência de aminoácido prevista dos domínios variáveis leves e pesados do anticorpo de partida (2) projetar o anticorpo humanizado, isto é, decidir qual região da estrutura do anticorpo usar durante o processo de humanização (3) humanizar as metodologias/técnicas atuais e (4) transfectar e expressar o anticorpo humanizado. Ver, por exemplo, Patentes Norte-Americanas n°^s 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; and 6.331.415.

[0149] Um número de moléculas de anticorpo humanizado compreendendo um local de ligação de antígeno derivado de uma imunoglobulina não humana foi descrito, incluindo anticorpos quiméricos que têm regiões V de roedores ou roedores modificados e suas regiões de determinação de complementaridade associada (CDRs) unidas aos domínios humanos constantes (ver, por exemplo, Winter et al. (1991) “Man-made Antibody,

Nature

349:293-299; Lobuglio et (1989) “Mouse/Human

Chimeric

Antibot monoclonal In

Kinetics And Immune

Response, Proc.

Natl. Acad.

Sci.

:4220-4224 (1989),

Shaw et al.

(1987) “Characterization Of

Mouse/Human

Chimeric Antibody monoclonal (17-1 A)

To

A Colon Cancer Tumor-Associated

Antigen, J. Immunol.

138:4534-4538, e Brown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Antibody monoclonal, Cancer Res. 47:3577-3583). Outras referências descrevem CDRs de roedores enxertadas em uma

58/215 região de estrutura de suporte humano (FR) antes da fusão com um domínio constante de anticorpo humano apropriado (ver, por exemplo, Riechmann, L.

Antibodies for Therapy, al. (1988) “Reshaping et al. (1988/ “Reshaping Human

Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et

Human Antibodies: Grafting An

Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; e Jones et al.

(1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In

A Human Antibody With From A Mouse, Nature 321:522-525).

Outra referência descreve CDRs de roedores suportadas pelas regiões de estrutura de roedores recombinantemente folheada.

Ver, por exemplo, Publicação de Patente Europeia n° 519.596.

Essas moléculas humanizadas são projetadas para minimizar a resposta imunológica indesejada para as moléculas de anticorpo anti-humano de roedor, que limita a duração eficácia das aplicações terapêuticas daquelas porções em recipientes humanos.

Outros métodos de humanização dos anticorpos que também podem ser utilizados são descritos por

Daugherty et al.

(1991) “Polymerase

Chain Reaction

Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And

Rapid Expression

Of A Murine

Antiboy monoclonal Directed Against

The CD18

Component Of

Leukocyte

Integrins, Nucl. Acids

Res.

: 24712476 e nas

Patentes

Norte-Americanas n°^s

180.377;

6.054.297; 5.997.867;

5.866.692.

[0150] invenção também engloba fragmentos de região variável de cadeia simples (scFv) de anticorpos dessa invenção, tais como mu-anti-B7-H3.

Os fragmentos de região variável de cadeia simples são feitos através da ligação de regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada usando um peptídeo de ligação pequeno. Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding

Proteins, Science 242:42359/215

426) descrevem exemplo de peptídeos de ligação que abrem caminho aproximadamente

3,5 nm entre o terminal carbóxi de uma região variável o terminal amino de outra região variável. Os ligantes de outros sequencias foram projetados e usados (Bird et al.

(1988) “Single-Chain Antigen-Binding

Proteins, Science 242:423-426). Os ligantes podem, por sua vez, ser modificados para funções adicionais, tais como fixação de fármacos ou fixação para suportes sólidos. As variáveis de cadeia simples podem ser produzidas quer de forma recombinante ou sintética. Para produção sintética de scFv, um sintetizador automático pode ser usado. Para produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado contendo polinucleotídeo que codifica o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, eucariótica, tal como células de levedura, planta, inseto ou mamífero, ou procariótica, tal como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam o scFv de interesse podem ser feitos através de manipulações de rotina tais como ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando técnica de purificação de proteína padrão conhecida na matéria.

[0151] A invenção inclui modificações a anticorpos e polipeptídeos que se unem a B7-H3 e seus agonistas, antagonistas, e moduladores, incluindo anticorpos e polipeptídeos funcionalmente equivalentes que não afetam significativamente suas propriedades e variáveis que tiveram atividade aumentada ou diminuída. A modificação de polipeptídeos é prática de rotina na matéria e não precisa ser descrita em detalhes aqui. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservadoras de resíduos de aminoácido, um ou mais exclusões

60/215 ou adições de aminoácidos que não mudam significativamente prejudicialmente a atividade funcional, ou uso de análogos químicos. Os resíduos de aminoácido que podem ser substituídos de forma conservadora um pelo outro incluem, mas não são limitados a: glicina/alanina; valina/isoleucina/ leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutâmico; serina/treonina; lisina/arginina; e fenilalanina/triosina. Esses polipeptídeos também incluem polipeptídeos glicosilados e não glicosilados, bem como polipeptídeos com outras modificações pós-traducional, tais como, por exemplo, glicosilação com diferentes açúcares, acetilação, e fosforilação. Preferencialmente, as substituições de aminoácido seriam conservadoras, isto é, o aminoácido substituído possuiria propriedades químicas similares como aquele do aminoácido original. Tais substituições conservadoras são conhecidas na matéria, e exemplos foram providos acima. A modificação de aminoácidos pode variar de alteração ou modificação de um ou mais aminoácidos para completar o reprojeto de uma região, tal como a região variável. Mudanças na região variável podem alterar a afinidade e/ou especificidade de ligação. Outros métodos de modificação incluem usar técnicas de acoplamento conhecidas na matéria, incluindo, mas não limitado a, meios enzimáticos, substituição e quelação oxidativa. As modificações podem ser usadas, por exemplo, para anexar os rótulos para imunoensaio, tais como o anexo de porções radioativas para radioimunoensaio. Os polipeptídeos modificados são feitos usando procedimentos estabelecidos na matéria e podem ser selecionados usando ensaios padronizados conhecidos na matéria.

61/215 [0152] A invenção também engloba proteínas de fusão compreendendo um ou mais fragmentos ou regiões dos polipeptídeos e anticorpos dessa invenção. Em uma realização, um polipeptídeo de fusão está previsto que compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos de região variável de cadeia leve e pelo menos 10 aminoácidos de região variável de cadeia pesada. Em outra realização, um polipeptídeo de fusão contém uma região constante de imunoglobulina heteróloga. Em outra realização, o polipeptídeo de fusão contém uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo produzido de um hibridoma publicamente depositado. Para fins dessa invenção, uma proteína de fusão de anticorpo contém um ou mais domínios de polipeptídeo que especificamente se unem a B7-H3 e outra sequência de aminoácido a qual não está anexada na molécula natural, por exemplo, uma sequência heteróloga ou uma sequência homóloga de outra região.

[0153] Um polipeptídeo anti-B7-H3, e outros agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 podem ser criados pelos métodos conhecidos no assunto, por exemplo, de forma sintética ou recombinante. Um método de produção de agonistas, antagonistas e moduladores de peptídeo B7-H3 envolve síntese química do polipeptídeo, seguido pelo tratamento em condições oxidantes apropriadas para obter a conformação natural, isto é, as ligações de dissulfeto corretas. Isso pode ser realizado usando metodologias bem conhecidas daqueles técnicos no assunto (ver, por exemplo, Kelley, R. F. et al. (1990) em: MÉTODOS E PRINCÍPIOS DA ENGENHARIA GENÉTICA, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) SÍNTESE DE

62/215

PEPTÍDEO DE FASE SÓLIDA, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; ver também Patentes Norte-Americanas n°^s 4.105.603; 3.972.859; 3.842.067; e 3.862.925).

[0154] Os polipeptídeos da invenção podem ser convenientemente preparados usando síntese de peptídeo de fase sólida (Merrifield, B. (1986) Síntese de Fase Sólida,” Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

[0155] Ainda em outra alternativa, os anticorpos completamente humanos podem ser obtidos através do uso de camundongos comercialmente disponíveis que foram projetados para expressar proteínas de imunoglobulina humana específicas. Os animais transgênicos que são projetados para produzir resposta imune mais desejável (por exemplo, anticorpos completamente humanos) ou mais robusta também podem ser usados para gerar anticorpos humanos ou humanizados. Exemplos de tal tecnologia são XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA) e HUMAB-MOUSE® e TC MOUSE™ (ambos da Medarex, Inc., Princeton, NJ).

[0156] Em uma alternativa, os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante e expressos usando qualquer método conhecido na matéria. Os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante primeiro isolando os anticorpos feitos de animais hospedeiros, obtendo a sequência de gene e usando a sequência de gene para expressar o anticorpo de forma

63/215 recombinante em células hospedeiras (por exemplo, células CHO) . Outro método que pode ser empregado é expressar a sequência de anticorpo em plantas (por exemplo, tabaco) ou leite transgênico. Os métodos adequados para expressar os anticorpos de forma recombinante em plantas ou leite foram descritos (ver, por exemplo, Peeters et al. (2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants, Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice, Int. Rev. Immunol 13:65-93; e Pollock et al. (1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies, J. Immunol Methods 231:147-157) . Os métodos adequados para fazer derivados de anticorpos, por exemplo, humanizado, cadeia simples, etc. são conhecidos na matéria. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser feitos de forma recombinante por tecnologia de exibição de fago (ver, por exemplo, Patentes Norte-Americanas n°^s 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; 6.265.150; e Winter, G. et al. (1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology Annu. Rev. Immunol. 12.433-455).

[0157] Os anticorpos ou proteína de interesse podem ser submetidos ao sequenciamento por degradação de Edman, que é bem conhecido daqueles técnicos no assunto. A informação do peptídeo gerada da espectrometria de massa ou degradação de Edman pode ser usada para projetar sondas e iniciadores que são usados para clonar a proteína de interesse.

[0158] Um método alternativo de clonar a proteína de interesse é através de filtração usando B7-H3 purificada ou porções dela para células que expressam o anticorpo ou a proteína de interesse. B7-H3 existe em uma

64/215 forma 2Ig e como uma forma 4Ig. A sequência de aminoácido da forma 2Ig da B7-H3 humana é (SEQ ID N°:l):

MLRRRGSFGM GVflVGAALGA LWFCLTGALE VQVPEDPWA LVGTDATLCC SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE PNKDLRPGDT VTITCSSYRG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG LFDVHSVLRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHGSVTITGQ PMTFPPEALW VTVGLSVCLI ALLVALAEVC WRKIKQSCEE ENAGAEDQDG EGEGSKTALQ PLKHSDSKED DGQEIA [0159]

A sequência de cDNA que codifica a forma

2Ig da B7-H3 humana é (SEQ ID N°:2):

atgctgcgtc ctgtggttct ctggtgggca gcacagctca gagggccagg gcacagggca acctgcttcg ccctactcga gtgaccatca gggcagggtg ttgtttgatg ctggtgcgca cctatgacat gcactgctgg gagaatgcag cctctgaaac ggcggggcag gcctcacagg ccgatgccac acctcatctg accagggcag acgcatccct tgagcatccg agcccagcat cgtgctccag tgcccctgac tgcacagcgt accccgtgct tccccúcaga tggccútggc gagctgagga actctgacag ccctggcatg agccctggag cctgtgctgc gcagctgaca cgcctatgcc gaggctgcag ggatttcggc gaccctggag ctaccggggc tggcaacgtg cctgcgggtg gcagcaggat ggccctgtgg tttcgtgtgc ccaggatggg caaagaagat ggtgtgcatg gtccaggtcc tccttctccc gatattaaac aaccgcacgg cgcgtgcgtg agcgctgccg cccaacaagg taccctgagg accacgtcgc gtgttgggtg gcgcacggct gtgaccgtgg tggagaaaga gagggagaag gatggacaag tgggtgcagc GtgaagacGG ctgagcctgg agctggtgta ccctcttccc tggcggacga tcagcctgca acctgcggcc ctgaggtgtt agatggccaa cgaatggtat ctgtcaccat ggctgtctgt tcaaacagag gctccaagac aaatagcc cctgggagca agtggtggca cttcagcctg cagctttgct ggacctgctg gggcagcttc ggtggccgct aggggacacg ctggcaggat cgagcagggc ctacagctgc cacagggcag ctgtctcatt ctgtgaggag agccctgcag [0160]

A sequência de aminoácido da forma 2Ig de B7-H3 humana (SEQ ID N°:l) (mostrada em negrito e sublinhada abaixo) está completamente incluída na forma 4Ig de B7-H3 humana (SEQ ID N2:76):

MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGALE VQVPEDPWA LVGTDATLCC 5FSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVH5FA EGCDQGSAYA NFTALFPDLL AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSTRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE PNKDLRPGDT VTITCSSYQG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG

65/215

LFDVHSILRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHSSVTITPQ RSPTGAVEVQ VREDPWALV GTDATLRCSF SPEPGF9LAQ LNLIWQLTDT KQLVHSFTEG RDQGSAYAKR TAI.FPDLLAQ GtJASLRLQRV RVADEGSFTÇ FVSIRDFGSA AVSLQVAAPY SKPSMTLEPN KDLRPGDTVT ITCSSYRGYP EAEVTWQPGQ GVPLTGWVTT SQMANEQGLF DVHSVLRWL GANGTYSCLV RNFV1QQPAB GSVTITGQPM TFPPEALWVT VGLSVCLIAL LVAIAFVCWR KIKQSCEEEM AGAEDQDGEG EGSKTALQPL KHSDSKEDDG QEIA [0161] A sequência de cDNA que codifica a forma 4Ig da B7-H3 humana é (SEQ ID N2:77); os resíduos que codificam a forma 2Ig de B7-H3 são mostrados em negrito e sublinhado:

atqctgügtc qgcggqqcaq ccctqqcatq gqtqtgcatq tgqqtgcagc cctgggagca ctqtgqttCÍt qcctcacaqq aqccctqqaq gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggcâ ctggtgggca gcacagctcti gugggccagg gcacagggca acctgcttcg üüütàütíga gtgaccatca gggcagggtg ttgtttgatg ctggtgcgca agaagcccca ccgatgccac acctcatctg accagggcag acgcatccct tgagcatccg agcccagcat cgtgctccag tgcccctgac tgcacagcat accccgtgct caggagccgt cctgtgctgc gcagctgaca cgcctatgcc gaggctgcag ggatttcggc gaccctggag ctaccagggc tggcaacgtg cctgcgggtg gcagcaggat tccttctccc gataccaaac aaccgcacgg cgcgtgcgtg agcgctgccg cccaataagg taccctgagg accacgtcgc gtgctgggtg gcgcacagct ctgagcctgg agctggtgca ccctcttccc tggcggacga tcagcctgca aeetgeggee ctgaggtgtt agatggccaa caaatggcac ctgtcaccat cttcagcctg cagctttgct ggacctgctg gggcagcttc ggtggccgct aggggaeaeg ctggcaggat cgagcagggc ctacagctgc cacaccccag

ggçaççqatg ccaccctgcg ctqetncttci tcccaggaqç ütggçttüag ciatgqçaQaq ctciacctca tctqgçagçt gagagacacc aaacaggtgg tgçacagttt cacçgaagge eqqqa.cea.qq gcaqcgeeta tageeaacegc asg-geactct tggaggaüüt gatggaaaaa qqcaatgcax eectqaqqct qeaqeqoqtq cqtatqqeqg acgaqggcag cttcacctqc ttcqtgajgca tccgqqattt oqqcaqogct gccgtcagcc tgcaggtggc cgctccctae

atcacgtgczt ccagctaccg gggctaccct gaggctgagg tgttctggca ggatgqgcag ggtgtgc.ç.cc tgac-tggcaa cgtgaccaaq tcgcagatgg ccaaCqagca gggct.tgt.tt, gatgtgcaca gcgtcctgog ggtqgtgctg ggtgcgaatg geacctacag ctgcctgqtg cgcaaccccg tgctgããgca ggatgõgcac ggctctgtca ccatcacãgg gcãgcctatg acatteccee eagagqcect qtgqqtgacc qtqqggctgt otqtctqtet cattqcactg ctqqtgqccc tgqctxteqt qtqctqgaqa aaqatcaaac agagctgtga ggagqagaat qcagqagctq aqqaccaqqa tqqqqaqqga gaaggctcca agacagccct gcagcctctg aaacactctg acagcaaaga agatqatgga caagaaatag cc [0162] 0 Procedimento de filtração pode ser conduzido pela obtenção de uma biblioteca de cDNA dos tecidos ou células que expressam B7-H3, superexpressando os cDNAs em um segundo tipo de célula, e triando as células transfectadas do segundo tipo de célula para uma ligação específica a B7

66/215

H3. As descrições detalhadas dos métodos usados na clonagem de genes de mamífero codificando para proteínas de superfície de célula através de filtração podem ser encontradas na matéria (ver, por exemplo, Aruffo, A. et al. (1987) Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Célula Expression System,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 e Stephan, J. et al. (1999) Selective Cloning Of Célula Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation,” Endocrinol. 140:5841 -5854).

[0163] cDNAs que codificam os anticorpos antiB7-H3, e outros agonistas, antagonistas e moduladores de peptídeo B7-H3 podem ser obtidos por transcrição reversa dos mRNAs de um tipo de célula particular de acordo com os métodos padronizados na matéria. Especificamente, mRNA pode ser isolado usando várias enzimas líticas ou soluções químicas de acordo com os procedimentos estabelecidos em Sambrook et al. supra ou extraídos por resinas de ligação de ácido nucleico comercialmente disponíveis seguindo as instruções anexas providas pelos fabricantes (por exemplo, Qiagen, Invitrogen, Promega). Os cDNAs sintetizados são então introduzidos em um vetor de expressão para produzir o anticorpo ou proteína de interesse em células de um segundo tipo. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras quer como epissomas ou como uma parte integral do DNA cromossômico. Os vetores de expressão adequados incluem, mas não são limitados a, plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, adenovírus associados, retrovírus, e cosmídeos.

[0164] Os vetores contendo os polinucleotídeos

67/215 de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer número de meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção, emprego de cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras substâncias; bombardeamento de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso tal como vaccinia vírus). A escolha de vetores introdutores ou polinucleotídeos frequentemente dependerá dos aspectos da célula hospedeira.

[0165] Quaisquer células hospedeiras capazes de superexpressar os DNAs heterólogos podem ser usadas com o fim de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitantes de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem, mas não são limitados a, células COS, HeLa, e CHO. Preferencialmente, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível de cerca de 5 vezes mais alto, mais preferencialmente 10 vezes mais alto, ainda mais preferencialmente 20 vezes mais alto do que aquele do anticorpo endógeno ou proteína de interesse correspondente, se presente, nas células hospedeiras. O rastreamento das células hospedeiras para uma ligação específica a B7-H3 é efetuado por um imunoensaio ou FACS. Uma célula superexpressando o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.

[0166] Várias técnicas também estão disponíveis que podem agora ser empregadas para produzir agonistas, antagonistas, e moduladores de peptídeo B7-H3 mutante que codifica para adições, exclusões ou mudanças na sequência de aminoácido da proteína resultante relativa à molécula do agonista, antagonista ou modulador do peptídeo B7-H3 de

68/215 principal.

[0167] A invenção inclui polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácido dos anticorpos dessa invenção. Os polipeptídeos dessa invenção podem ser feitos por procedimentos conhecidos na matéria. Os polipeptídeos podem ser produzidos por proteolítico ou outra degradação dos anticorpos, por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos simples ou de fusão) conforme descrito acima ou por síntese química. Os polipeptídeos dos anticorpos, especialmente os polipeptídeos mais curtos até cerca de 50 aminoácidos, são convenientemente feitos por síntese química. Os métodos de síntese química são conhecidos na matéria e estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, um polipeptídeo anti-B7-H3 poderia ser produzido por um sintetizador de polipeptídeo automático empregando o método de fase sólida.

IV. MÉTODOS PARA RASTREAMENTO DE POLIPEPTÍDEOS E ANTICORPOS MONOCLONAIS [0168] Vários métodos podem ser usados para rastrear os polipeptídeos e anticorpos monoclonais que se unem a B7-H3. Entende-se que ligação se refere à ligação específica biológica ou imunologicamente relevante, e não se refere à ligação não específica que pode ocorrer, por exemplo, quando uma imunoglobulina é usada em uma concentração muito alta contra um alvo não específico. Em uma realização, os anticorpos monoclonais são rastreados para ligação com a B7-H3 usando técnica de rastreamento padrão. Dessa maneira, o anticorpo monoclonal anti-B7-H3 foi obtido. Os hibridomas preferidos da presente invenção são aqueles que produzem anticorpos BRCA69D, BRCA84D ou PRCA157.

69/215 [0169] Os anticorpos monoclonais adicionais que se unem a B7-H3 podem ser identificados. Para este fim, os anticorpos monoclonais são rastreados por sua habilidade diferencial de se unir em tecidos cancerosos, mas não em células não cancerosas. Em uma realização, os anticorpos monoclonais que se unem a B7-H3 e que também têm reação cruzada a células ou tecidos cancerosos humanos, mas não em células ou tecidos normais no mesmo grau, são selecionados. Um método que pode ser empregado para rastreamento é imunohistoquímica (IHC). Técnicas de imuno-histoquímica padrão são conhecidas daqueles especialistas medianos na matéria. Ver, por exemplo, MÉTODOS DE CULTURA DE CÉLULA ANIMAL (J.P. Mather e D. Barnes, eds., Academic Press, NY, Vol. 57, Ch. 18 e 19, pp. 314-350, 1998). Amostras biológicas (por exemplo, tecidos) podem ser obtidas a partir de biópsias, autópsias, ou necropsia. Para verificar se B7-H3 está presente apenas em células cancerosas, os anticorpos anti-B7-H3 podem ser usados para detectar a presença de B7-H3 nos tecidos dos indivíduos com câncer, enquanto outros tecidos não cancerosos do indivíduo que sofre de câncer ou tecidos de indivíduos sem câncer são usados como um controle. O tecido pode ser integrado em uma substância sólida ou semissólida que previne dano durante o congelamento (por exemplo, agarose gel ou OCT) e então seccionado para tingimento. Os cânceres de diferentes órgãos e em diferentes graus podem ser usados para rastrear anticorpos monoclonais. Exemplos de tecidos que podem ser usados para fins de rastreamento incluem, mas não são limitados a, ovário, mama, pulmão, próstata, colo, rim, pele, tireoide, cérebro, coração, fígado, estômago, nervo, vasos sanguíneos, osso, trato digestivo superior e pâncreas.

70/215

Exemplos de diferentes tipos de câncer que podem ser usados para fins de rastreamento incluem, mas não são limitados a, carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, adenossarcomas, linfomas, e leucemias.

[0170] Ainda em outra alternativa, as linhagens de células cancerosas tais como HMEC (BioWhittaker CC-2251), HUVEC (células edoteliais primárias), BT-474 (ATCC# HTB-20), MCF7 (ATCC# HTB22), MDA-MB- 175-VII (ATCC# HB-25), MDA-MB-361 (ATCC# HB-27), SKBR3 (ATCC# HTB-30), A549 (ATCC# CCL-185), Calu-3 (ATCC# HTB-55), SKMES-I (ATCC# HTB-58), ES-2 (ATCC# CRL-1978) , SKOV3 (ATCC# HTB- 77) , Panc-1 (ATCC# CRL-1469) , AsPC-I (ATCC# CRL-1682), HPAF-II (ATCC# CRL- 1997), Hs700T (ATCC# HTB- 174), Colo205 (ATCC# CCL-222), HT-29 (ATCC# HTB38), SW480 (ATCC# CCL-228), SW948 (ATCC# CCL-237), 293 (ATCC # CRL-1573), 786-0 (ATCC# CRL-1932), A498 (ATCC# HTB-44), Caki-2 (ATCC# HTB-47), COS-7 (ATCC# CRL-1651), RL-65 (ATCC # CRL-10345), SV-T2 (ATCC# CCL-163,1), 22RV1 (ATCC# CRL-2505), DU145 (ATCC# HTB-81), LNCaP (ATCC# CRL-1740), PC-3 (ATCC# CRL-1435), HT29 (ATCC# HTB-38), Hs746T (ATCC# HTB- 135), NCIN87 (ATCC# CRL-5822) e células normais de seus respectivos tecidos podem ser usadas para rastrear os anticorpos monoclonais que são específicos para tecido canceroso. Primeiro, ou passagem baixa, as culturas de célula derivadas de tecidos normais de diferentes órgãos incluindo, mas não limitado a, rim, ovário, mama, pulmão, próstata, colo, rim, pele, tireoide, músculo liso da aorta, e células edoteliais podem ser usadas como controles negativos. As células cancerosas ou não cancerosas podem ser desenvolvidas em lâminas de vidro ou lamelas, ou em superfícies plásticas, ou preparadas em um dispositivo CellArray^TM, conforme descrito

71/215 em WO 01/43869, e rastreado para a ligação do anticorpo usando IHC conforme descrito acima para os tecidos.

Alternativamente, as células podem ser removidas da superfície de crescimento usando meios não proteolíticos e giradas em um pélete, que é então integrado e tratado como tecidos para análise de

IHC conforme descrito acima. As células podem ser inoculadas em animais imunodeficientes, um tumor deixado crescer, e então esse tumor pode ser colhido, integrado e usado como uma fonte de tecido para análise de

IHC. Em outra alternativa, as células simples podem ser rastreadas por incubação com o anticorpo primário, um anticorpo repórter secundário ligado a uma molécula fluorescente e então analisado usando uma máquina de classificação de célula ativada fluorescente (FACS).

[0171]

Qualquer um dos diversos sistemas de detecção pode ser utilizado para detectar a ligação dos anticorpos à seção do tecido.

Tipicamente, imuno-histoquímica envolve a ligação de um anticorpo primário ao tecido e então um anticorpo secundário reativo contra a espécie do anticorpo primário exemplo,

DAB). Um foi gerado e conjugado a um marcador detectável (por peroxidase de rábano, HRP, ou diaminobenzedina, método alternativo que pode ser usado são anticorpos complementares de imagem de espelho policlonal ou polyMICA^TM (Anticorpos Complementares de Imagem de Espelho policlonal;

The Binding Site Limited, Birmingham, UK; Mangham, D.C. et al. (1999) “Novel Immunohistochemical Detection System Using

Mirror Image Complementary Antibodies (MICA),” Histopathology 35(2) :129-33) . A técnica de PolyMICA™ pode ser usada para testar a ligação dos anticorpos primários (por exemplo, anticorpos anti-B7-H3) ao tecido normal e canceroso. Diversos

72/215 tipos de kits de Detecção de polyMICA™ estão comercialmente disponíveis: n° do produto HK004.D é um kit de Detecção de polyMICA™ que usa cromógeno DAB; n° do produto. HK004.A é um kit de Detecção de polyMICA™ que usa cromógeno AEC. Alternativamente, o anticorpo primário pode ser diretamente rotulado com o marcador detectável.

[0172] A primeira etapa no rastreamento de IHC para selecionar um anticorpo apropriado é a ligação dos anticorpos primários elevados em camundongos (por exemplo, anticorpos anti-B7-H3) a um ou mais imunógenos (por exemplo, amostras de células ou tecido). Em uma realização, a amostra de tecido são seções de tecido congelado de diferentes órgãos. As amostras de células ou tecido podem ser cancerosas ou não cancerosas.

[0173] Os tecidos congelados podem ser preparados, seccionados, com ou sem fixação, e IHC realizado por qualquer uma variedade de métodos conhecidos de alguém familiar com a técnica (ver, por exemplo, Stephan et al. (1999) “Distribution And Function Of The Adhesion Molecule BEN During Rat Development, Dev. Biol. 212:264-277 e Stephan et al. (1999) Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation, Endocrinology 140:5841-5854).

V. MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-B7H3 [0174] Qualquer um dos diversos métodos pode ser usado para caracterizar os anticorpos anti-B7-H3. Um método é identificar o epítopo ao qual ele se une. 0 mapeamento do epítopo está comercialmente disponível de várias fontes, por

73/215 exemplo, Pepscan Systems (Lelystad, The Netherlands). O mapeamento do epítopo pode ser usado para determinar a sequência a qual um anticorpo anti-B7-H3 se une. O epítopo pode ser um epítopo linear, isto é, contido em um trecho simples de aminoácidos, ou um epítopo conformacional formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que podem não ser necessariamente contidos em um trecho simples.

[0175] Peptídeos de comprimentos variados (por exemplo, preferencialmente pelo menos 4 a 6 aminoácidos de comprimento) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, de forma recombinante) e usados para ligar os ensaios com o anticorpo anti-B7-H3. O epítopo ao qual o anticorpo anti-B7H3 se une pode ser determinado em um rastreamento sistemático usando peptídeos sobrepostos derivados da sequência extracelular e determinando a ligação pelo anticorpo anti-B7-H3.

[0176] Ainda outro método que pode ser usado para caracterizar um anticorpo anti-B7-H3 é usar ensaios de competição com outros anticorpos conhecidos por se unirem ao mesmo antígeno, isto é, B7-H3 para determinar se os anticorpos anti-B7-H3 se unem ao mesmo epítopo como os outros anticorpos. Exemplos de anticorpos comercialmente disponíveis para B7-H3 podem estar disponível e podem ser identificados usando os ensaios de ligação ensinados aqui. Os ensaios de competição são bem conhecidos daqueles técnicos no assunto, e tais procedimentos e dados ilustrativos são detalhados ainda nos Exemplos. Os anticorpos anti-B7-H3 podem ser ainda caracterizado pelos tecidos, tipo de câncer ou tipo de tumor ao qual eles se unem.

[0177] Outro método de caracterização dos anticorpos anti-B7-H3 é pelo antígeno ao qual eles se unem.

74/215

Os anticorpos anti-B7-H3 foram usados em Western blots com lisados de célula de vários cânceres humanos. Conforme é conhecido de alguém especialista na matéria, Western blotting pode envolver lisados de célula contínuas e/ou frações de célula em um gel desnaturante ou não desnaturante, transferência de proteínas para papel de nitrocelulose, e então sondagem da mancha com um anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-B7-H3) para ver quais proteínas são ligadas pelo anticorpo. B7-H3 está associada com vários cânceres humanos de diferente tecidos incluindo, mas não limitado, colo, mama, ovário, pâncreas e pulmão.

VI. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE CÂNCER USANDO ANTICORPOS ANTI-B7-H3 E MODULADORES DE B7-H3 [0178] Os anticorpos monoclonais para B7-H3 feitos pelos métodos descritos aqui podem ser usados para identificar a presença ou ausência de células cancerosas em uma variedade de tecidos, incluindo, mas não limitado a, ovário, mama, pulmão, próstata, colo, rim, pâncreas, pele, tireoide, cérebro, coração, fígado, estômago, nervo, vasos sanguíneos, osso, e trato digestivo superior. Os anticorpos monoclonais para B7-H3 feitos pelos métodos descritos aqui também podem ser usados para identificar a presença ou ausência de células cancerosas, ou o seu nível, que estão circulando no sangue depois de sua liberação de um tumor sólido. Tal antígeno em circulação pode ser um antígeno B7-H3 intacto, ou o seu fragmento que retém a habilidade de ser detectado de acordo com os métodos ensinados aqui. Tal detecção pode ser efetuada pela análise de FACS usando métodos padronizados comumente usados na matéria.

[0179] Esses usos podem envolver a formação de

75/215 um complexo entre B7-H3 e um anticorpo que se une especificamente em B7-H3. Exemplos de tais anticorpos incluem, mas não são limitados a, aqueles anticorpos monoclonais anti-B7-H3 produzidos pelos hibridomas BRCA84D, BRCA69D, e PRCA157. A formação de tal complexo pode ser in vitro ou in vivo. Sem estar limitado pela teoria, o anticorpo monoclonal anti-B7-H3 pode se unir a B7-H3 através do domínio extracelular de B7-H3 e pode então ser internalizado.

[0180] Em uma realização preferida dos métodos de diagnóstico dessa invenção, o anticorpo carrega uma etiqueta detectável. Exemplos de etiquetas que podem ser usadas incluem um agente radioativo ou um fluoróforo, tal como isotiocianato de ficoeritrina ou fluoresceína (também conhecidos como fluoroisotiocianato ou FITC).

[0181] Conforme com outros anticorpos conhecidos usados comercialmente para diagnóstico e fins terapêuticos, o antígeno alvo dessa invenção é amplamente expresso em tecido normal. Ele também é regulado em alguns tumores. Portanto, as dosagens particulares e vias de administração dos anticorpos dessa invenção, conforme usados para diagnósticos ou agentes terapêuticos, será adaptado ao tumor particular ou estado de doença em questão, bem como ao indivíduo particular que está sendo tratado.

[0182] Um método de uso dos anticorpos para diagnóstico é imageamento do tumor in vivo ligando o anticorpo a um agente radioativo ou radio-opaco, administrando ao indivíduo e usando um aparelho de raios-X ou outra máquina de imageamento para visualizar a localização do anticorpo marcado na superfície das células cancerosas que expressam o antígeno. O anticorpo é administrado em uma

76/215 concentração que promove a ligação em condições fisiológicas.

[0183] Técnicas in vitro para detecção de B7-H3 são rotina na matéria e incluem ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs), imunoprecipitações, imunofluorescência, imunoensaio de enzima (EIA), radioimunoensaio (RIA), e análise Western blot.

[0184] Nos aspectos dessa invenção, os métodos de imagem radiológica de tumores ou neoplasmas, ou de medição da eficácia de um método de tratamento com um anticorpo radiomarcado, compreendendo a etapa de administrar um anticorpo específico do tumor, radiomarcado, a um indivíduo seguindo a prática dessa invenção. O anticorpo radiomarcado pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal compreendendo um radiomarcador, preferencialmente selecionado do grupo consistindo em Tecnécio-99m, Índio-111, Iodo-131, Rênio-186, Rênio-188, Samário-153, Lutécio-177, Cobre-64, Escândio-47, Ítrio-90. Os anticorpos monoclonais marcados com radionuclídeos terapêuticos tais como Iodo-131, Rênio-188, Hólmio-166, Samário-153 e Escândio-47, que não comprometem a imunorreatividade de anticorpos e não são quebrados in vivo, são especialmente preferidos. A pessoa especialista na matéria apreciará que outros isótopos radioativos são conhecidos, e podem ser adequados para aplicações específicas. A imagem radiológica pode ser conduzida usando Tomografia Computadorizada por Emissão de Fóton Único (SPECT - Single Photon Emission Computer Tomography), Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET - Positron Emission Tomography), Tomografia Computadorizada (CT - Computer Tomography) ou Imageamento por Ressonância Nuclear (MRI - Magnetic Resonance Imaging). Imageamento correlativo, que permite definição

77/215 anatômica maior de localização de metástases localizadas por imagem de radioimunoensaio, também é contemplado.

[0185] Em outros métodos, as células cancerosas são removidas e o tecido preparado por imuno-histoquímica pelos métodos bem conhecidos na matéria (por exemplo, integração em um composto de congelamento, congelamento e seccionamento, com ou sem fixação; fixação e parafina integrada com ou sem vários métodos de recuperação e contracoloração de antígeno). Os anticorpos monoclonais também podem ser usados para identificar células cancerosas em diferentes estágios de desenvolvimento. Os anticorpos também podem ser usados para determinar quais tumores dos indivíduos expressam o antígeno em sua superfície em um nível predeterminado e usando anticorpos anticorpos podem são assim candidatos direcionados contra o reconhecer tanto os para imunoterapia dito antígeno. Os cânceres primários quanto os em metástase que expressam B7-H3. Conforme usado aqui, a detecção pode incluir detecção qualitativa e/ou quantitativa, e pode incluir comparação do nível medido em uma célula normal para nível aumentado de expressão de B7-H3 em células cancerosas.

[0186] A invenção também provê métodos de auxílio para diagnóstico de câncer caracterizado pelas células cancerosas que expressam B7-H3 em um indivíduo usando qualquer anticorpo que se une a B7-H3 e quaisquer outros métodos que podem ser usados para determinar o nível de expressão de B7-H3. Conforme usado aqui, os métodos para auxiliar a diagnóstico” significam que esses métodos ajudam a fazer uma determinação clínica com relação à classificação, ou natureza, do câncer, e pode ou não ser conclusiva com

78/215 respeito ao diagnóstico definitivo. Consequentemente, um método para auxiliar o diagnóstico de câncer pode compreender a etapa de detecção do nível de B7-H3 em uma amostra biológica do indivíduo e/ou determinação do nível de expressão de B7-H3 na amostra. Os anticorpos que reconhecem o antígeno, ou sua porção, também podem ser usados para criar imunoensaios diagnósticos para detectar o antígeno liberado ou secretado das células cancerosas vivas ou mortas em fluidos corporais, incluindo, mas não limitado a, sangue, saliva, urina, fluido pulmonar, ou fluido ascítico.

[0187] Nem todas as células em um tumor de interesse particular expressarão B7-H3, e as células cancerosas em outros tecidos podem expressar B7-H3, assim um indivíduo deveria ser rastreado para a presença ou ausência de B7-H3 em células cancerosas para determinar a utilidade da imunoterapia no indivíduo. Os anticorpos anti-B7-H3 feitos pelos métodos descritos aqui podem ser usados para determinar se um indivíduo diagnosticado com câncer pode ser considerado um candidato para imunoterapia usando anticorpos direcionados contra B7-H3. Em uma realização, um tumor canceroso ou uma amostra de biópsia pode ser testado para expressão de B7-H3, usando anticorpos direcionados contra B7-H3. Os indivíduos com células cancerosas que expressam B7-H3 são candidatos adequados para imunoterapia usando anticorpos direcionados contra B7-H3. A coloração com anticorpo anti-B7-H3 também pode ser usada para distinguir os tecidos cancerosos dos tecidos normais.

[0188] Métodos de uso de anticorpos anti-B7-H3 para fins de diagnóstico são úteis tanto antes quando depois de qualquer forma de tratamento anticâncer, por exemplo,

79/215 quimioterapia ou radioterapia, para determinar quais tumores são mais prováveis de responder a um dado tratamento, prognóstico para indivíduo com câncer, subtipo do tumor ou origem da doença metastática, e progressão da doença ou resposta ao tratamento.

[0189] As composições dessa invenção também são adequadas para diagnóstico de estados de doença diferentes de câncer, usando os métodos geralmente descritos acima na aplicação com outras células doentes (não cancerosas). Os estados de doença adequados para uso nos métodos dessa invenção incluem, mas não são limitados a, doenças ou distúrbios associados com respostas inflamatórias ou autoimunes em indivíduos. Os métodos descritos acima podem ser usados para modular respostas inflamatórias ou autoimunes em indivíduos. Doenças e condições resultantes de inflamação e distúrbios autoimunes que podem ser submetidos a diagnóstico e/ou tratamento usando as composições e métodos da invenção incluem, por meio de ilustração e não de limitação, esclerose múltipla, meningite, encefalite, acidente vascular encefálico, outros traumas cerebrais, doença do intestino inflamatório incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn, miastenia grave, lúpus, artrite reumatoide, asma, diabetes juvenil aguda, demência por AIDS, aterosclerose, nefrite, retinite, dermatite atópica, psoríase, isquemia do miocárdio e lesão pulmonar mediada por leucócito aguda.

[0190] Ainda outras indicações para uso diagnóstico e/ou terapêutico de anticorpos e outros agentes terapêuticos da invenção incluem administração a indivíduos com risco de rejeição de órgão ou enxerto. Nos últimos anos,

80/215 tem havido uma melhora considerável na eficiência de técnicas de cirurgia para transplante de tecidos e órgãos tais como pele, rim, fígado, coração, pulmão, pâncreas e medula óssea. Talvez o problema notável principal seja a falta de agentes satisfatórios para induzir imunotolerância no beneficiário para o órgão ou aloenxerto transplantado. Quando células ou órgãos alogênicos são transplantados em um hospedeiro (isto é, o doador e o donatário são indivíduos diferentes da mesma espécie), o sistema imune do hospedeiro é suscetível a montar uma resposta imune para antígenos externos no transplante (hospedeiro versus doença do enxerto) levando à destruição do tecido transplantado.

[0191] Os usos descritos em qualquer lugar dessa aplicação para anticorpos anti-B7-H3 também englobam o uso de outros agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 conforme descrito aqui. Em tais realizações, o agonista, antagonista ou outro modulador não anticorpo de B7-H3 é substituído para o anticorpo B7-H3 nas etapas descritas, e alterações dentro do escopo do perito comumente especializado são feitas para adaptar o método para a composição modulatória de B7-H3 substituída.

[0192] Os anticorpos monoclonais para B7-H3 feitos pelos métodos descritos aqui podem ser usado para identificar a presença ou ausência de células-tronco cancerosas humanas em uma variedade de tecidos. Foi levantada a hipótese de as células-tronco cancerosas (CSCs) desempenharem um papel no crescimento do tumor e metástase (Ghotra, V.P. et al. (2009) “The Cancer Stem Cell Microenvironment And Anti-Cancer Therapy “ Int. J. Radiat. Biol. 85(11):955-962; Gupta, P.B. et al. (2009) “Cancer Stem

81/215

Cells: Mirage Or Reality? Nat. Med. 15(9): 1010-1012;

Lawson, J.C. et al. (2009) “Cancer Stem Cells In Breast Cancer And Metastase “ Breast Cancer Res. Treat. 118(2):241254; Hermann, P.C. et al. (2009) “Pancreatic Cancer Stem Cells— Insights And Perspectives Expert Opin. Biol. Ther.

9(10):1271-1278; Schatton, T. et al. (2009) “Identification And Targeting Of Cancer Stem Cells, Bioessays 31(10):10381049; Mittal, S. et al. (2009) “Cancer Stem Cells: The Other Face Of Janus, Amer. J. Med. Sci. 338(2):107- 112; Alison, M.R. et al. (2009) “Stem Cells And Lung Cancer: Future Therapeutic Targets? Expert Opin. Biol. Ther. 9(9):11271141; Charafe-Jauffret, E. et al. (2009) “Breast Cancer Stem Cells: Tools And Models To Rely On, BMC Cancer 9:202;

Scopelliti, A. et al. (2009) “Therapeutic Implications Of Cancer Initiating Cells, Expert Opin. Biol. Ther. 9(8): 1005-1016; Publicação do PCT WO 2008/091908). Sob esta hipótese, as CSCs proveem um subconjunto de células distintas, pequenas dentro de cada tumor que são capazes de autorregeneração indeterminada e de desenvolvimento na(s) célula(s) de tumor mais adultas que são relativamente limitadas em capacidade de replicação. Foi levantada a hipótese de que essas células-tronco cancerosas podem ser mais resistente a agentes quimioterápicos, radiação ou outras condições tóxicas, e assim, persistirem depois de terapias clínicas e crescimento posterior em tumores secundários, metástase ou ser responsável por recidiva. Foi sugerido que as CSCs podem elevar as células-tronco do tecido normal ou de células progenitoras de tecido mais diferenciado.

[0193] As células-tronco cancerosas humanas têm diversas características de definição. Tais características

82/215 estão descritas na Publicação do

PCT WO 2008/091908 e são incorporadas aqui por referência.

Os anticorpos monoclonais para alvos na superfície da célula em células-tronco cancerosas podem ser usados para identificar a presença ou ausência de células-tronco cancerosas em uma variedade de tecidos.

Os anticorpos monoclonais para

B7-H3 feitos pelos métodos descritos aqui também podem ser usados para identificar a presença ou ausência de células-tronco cancerosas, ou o nível das células-tronco cancerosas em uma amostra ou tecido ou em circulação depois de sua liberação de um tumor sólido.

Tal antígeno em circulação pode ser um antígeno B7-H3 intacto, ou seu fragmento que retém habilidade de ser detectado de acordo com os métodos ensinados aqui.

Tal detecção pode ser efetuada pela análise

FACS usando métodos padronizados comumente usados na matéria.

Em outra realização, tal detecção pode ser efetuada pela análise imuno-histoquímica de amostras de tecido usando métodos padronizados comumente usados na matéria.

[0194]

Esses usos podem envolver a formação de um complexo entre B7-H3 um anticorpo que se une especificamente a B7-H3 em células-tronco cancerosas.

Exemplos de tais anticorpos incluem, mas não são limitados a, aqueles anticorpos anti-B7-H3 monoclonais produzidos pelos hibridomas BRCA84D, BRCA69D, e PRCA157. A formação de tal complexo pode ser in vitro ou in vivo.

[0195]

Os usos descritos nessa aplicação que dizem o seu uso para anticorpos anti-B7-H3 também englobam o uso de outros agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 conforme descrito aqui para o uso da identificação e tratamento de células-tronco cancerosas.

Em tais realizações,

83/215 anticorpos anti-B7-H3 e outros agonistas, antagonistas e moduladores de B7-H3 são usados para identificação, diagnóstico ou tratamento terapêutico de células-tronco cancerosas usando métodos similares descritos, e alterações dentro do escopo do perito especializado comum são feitas par adaptar o método para a identificação/diagnóstico ou tratamento das células-tronco cancerosas.

VII. COMPOSIÇÕES PREFERIDAS DA PRESENTE INVENÇÃO [0196] A presente invenção engloba composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo anticorpos anti-B7-H3, polipeptídeos derivados de anticorpos anti-B7-H3, polinucleotídeos compreendendo sequência que codifica anticorpos anti-B7-H3, e outros agentes conforme descrito aqui. Conforme usadas aqui, as composições ainda compreendem um ou mais anticorpos, polipeptídeos e/ou proteínas que se unem a B7-H3, agonistas, antagonistas, moduladores de B7-H3, e/ou um ou mais polinucleotídeos compreendendo sequências que codificam um ou mais anticorpos, polipeptídeos e proteínas que se unem a B7-H3.

[0197] A invenção ainda provê para conjugados de qualquer agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7H3, e estruturas químicas adicionais que suportam a função ou as funções pretendida do particular agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7-H3.

[0198] Esses conjugados incluem agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7-H3 covalentemente ligado a uma macromolécula tal como qualquer matriz de suporte sólido, insolúvel usada nos procedimentos de diagnóstico, rastreamento ou purificação discutido aqui. Os materiais de matriz adequados incluem qualquer substância que

84/215 seja quimicamente inerte, tenha alta porosidade e tenha grandes números de grupos funcionais capazes de formar ligações covalentes com ligantes de peptídeo. Exemplos de materiais de matriz e procedimento para preparação de conjugados de ligante estão descritos em Dean et al. (Eds) CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE: UMA ABORDAGEM PRÁTICA, IRL Press (1985); Lowe, Introduction to Affinity Chromatography, EM Work et al. (eds) TÉCNICAS DE LABORATÓRIO EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR, Vol. 7, Parte II, North-Holland (1979); Porath et al, Biospecific Affinity Chromatography, in Neurath, H. et al. (eds), AS PROTEÍNAS, 3rd ed., Vol. 1, pp. 95-178 (1975); e Schott, H. CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE, Macel Dekker, Inc. NY (1984).

[0199] Também são providos aqui conjugados de agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7-H3 e qualquer porção repórter usada nos procedimentos diagnósticos discutidos aqui. Os agentes de agonista, antagonista ou modulador de peptídeo B7-H3, polipeptídeos e proteínas dessa invenção, incluindo anticorpos anti-B7-H3, são ainda identificados e caracterizados por qualquer (um ou mais) dos seguintes critérios:

[0200] (A) uma habilidade para se unir especificamente a B7-H3 (e em particular moléculas B7-H3 que são expressas nas superfícies das células cancerosas, incluindo, mas não limitado a, células cancerosas do rim, próstata, ou pulmão);

[0201] (B) uma habilidade para inibir competitivamente ligação preferencial de um anticorpo antiB7-H3 conhecido para B7-H3, incluindo a habilidade de se unir preferencialmente ao mesmo epítopo de B7-H3 ao qual o

85/215 anticorpo original preferencialmente se une;

[0202] (C) uma habilidade de se unir a uma porção de B7-H3 que é exposta na superfície de uma célula viva in vitro ou in vivo;

[0203] (D)uma habilidade de se unir a uma porção de B7-H3 que é exposta na superfície de células cancerosas vivas que expressam B7-H3;

[0204] (E) uma habilidade de liberar um agente quimioterápico nas células cancerosas (tais como células cancerosas do rim, próstata, ou pulmão) expressando B7-H3 em sua superfície; e/ou [0205] (F) uma habilidade de liberar um agente terapêutico ou marcador detectável em células cancerosas (tais como, mas não limitado a, células cancerosas da próstata) expressando B7-H3 em sua superfície.

[0206] Um anticorpo preferido da invenção exibirá coloração de IHC diferencial com relação ao tecido não canceroso, normal, e, além disso, será capaz de testar em modelos de primatas (e, particularmente, macaco caranguejeiro) de eficácia do anticorpo. Os anticorpos preferidos da presente invenção adicionalmente exibirão níveis desejáveis de afinidade e especificidade de antígeno.

Os anticorpos preferidos da presente invenção adicionalmente exibirão níveis desejáveis de atividade imunomodulatória e internalização celular.

[0207] Em algumas realizações, o anticorpo da invenção é um anticorpo que é produzido por hibridoma BRCA84D, BRCA69D, ou PRCA157, ou sua progenitura. A presente invenção também engloba várias formulações de anticorpos produzidos por esses hibridomas depositados e anticorpos

86/215 equivalentes ou fragmentos de polipeptídeo (por exemplo, Fab, Fab, F(ab)2 Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, cadeia simples (scFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, anticorpos humanizados, e qualquer outra configuração modificada de qualquer desses anticorpos ou equivalentes que compreendem um antígeno (B7-H3), local de reconhecimento da especificidade requerida. A invenção também provê anticorpos humanos que mostram uma ou mais das características biológicas de um membro da família anti-B7-H3. Os anticorpos equivalentes da família anti-B7-H3 (incluindo anticorpos humanizados e anticorpos humanos), fragmentos de polipeptídeo, e polipeptídeos compreendendo qualquer um desses fragmentos são identificados e caracterizados por qualquer (um ou mais) dos cinco critérios descritos acima. As sequências de domínio variável humanizado exemplar e de murino de um anticorpo anti-B7-H3 são providas na Publicação do PCT WO 2008/066691. Tais sequências são providas por meio de ilustração e não limitação, e sequências diferentes, bem como fragmentos e variáveis de sequências providas, estão englobadas dentro do escopo dessa invenção.

[0208] BRCA84D, BRCA69D, e PRCA157 são os anticorpos B7-H3 preferidos da presente invenção devido aos seus perfis IHC de tecido normal claros, tumor mais forte/IHC normal diferencial, ligação de moderada a forte (BIACORE^TM)/IHC), reatividade cruzada a B7-H3 de macacos caranguejeiros e atividade potente para moléculas DART^TM universais (UDART^TMs) com relação a outros anticorpos. Em realizações particularmente preferidas, a invenção engloba variáveis quiméricas e humanizadas desses anticorpos

87/215 preferidos, bem como variáveis naturais e quiméricas e humanizadas desses anticorpos preferidos que possuem regiões conforme descrito abaixo. engloba moléculas DART^TM que ligação de epítopo de tais em conjunto com região(ões) de une(m) ao receptor de célula T, antígeno associado ao

Fc modificadas adicionalmente regiões de particularmente epítopo que se NKG2D, ou a um tal como fluoresceína (por fluoresceína (também conhecidos

FITC).

[0209] Em algumas polipeptídeos e proteínas da invenção que se anticorpos, polipeptídeos e proteínas que

A invenção possuem as anticorpos, ligação de receptor de tumor ou a um hapteno exemplo, isotiocianato de como fluoroisotiocianato ou realizações, os anticorpos, unem a B7-H3 são competitivamente inibem a ligação preferencial de um anticorpo anti-B7-H3 especificado aqui para B7-H3. Em algumas realizações, os anticorpos, os polipeptídeos e as proteínas preferencialmente se unem ao mesmo epítopo em B7-H3 conforme o anticorpo muanti-B7-H3 preferencialmente se une.

[0210]

Consequentemente, a invenção provê qualquer dos seguintes (ou composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo qualquer dos seguintes): (a) um anticorpo produzido pela célula hospedeira com um número de depósito identificado acima ou sua progenitura; (b) uma forma humanizada de tal anticorpo; (c) um anticorpo compreendendo uma ou mais das regiões variáveis de cadeia leve e/ou cadeia pesada de tal anticorpo; (d) um anticorpo quimérico compreendendo regiões variáveis homólogas ou derivadas de regiões variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de tal anticorpo, e regiões constantes homólogas ou derivadas de

88/215 regiões constantes de uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo humano; (e) um anticorpo compreendendo uma ou mais das CDRs de cadeia leve e/ou cadeia pesada (pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, ou seis) de tal anticorpo; (f) um anticorpo compreendendo uma cadeia leve e/ou uma pesada de tal anticorpo; (g) um anticorpo humano que é equivalente a tal anticorpo. Uma forma humanizada do anticorpo pode ou não ter CDRs idênticas ao anticorpo original, ou anticorpo produzido por uma célula hospedeira com um número de depósito identificado acima. A determinação das regiões de CDR está bem dentro da habilidade na matéria. Em algumas realizações, a invenção provê um anticorpo que compreende pelo menos uma CDR que é substancialmente homóloga a pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos 5 CDRs de um anticorpo produzido por um dos hibridomas depositados acima identificados (ou, em algumas realizações substancialmente homólogas a todas as 6 CDRs de um desses anticorpos, ou derivados de um desses anticorpos), ou anticorpo produzido pela célula hospedeira com um número de depósito identificado acima. Outras realizações incluem anticorpos que têm pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDR(s) que são substancialmente homólogas a pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de um anticorpo produzido de um hibridoma depositado conforme identificado aqui, ou derivados de tal anticorpo. Entende-se que, para fins dessa invenção, a especificidade de ligação e/ou atividade total (que pode ser em termos de liberação de um agente quimioterápico a ou em células cancerosas para reduzir o crescimento e/ou proliferação de células cancerosas, para induzir a morte de célula apoptótica na célula cancerosa,

89/215 para retardar o desenvolvimento da metástase, e/ou tratamento paliativamente) é geralmente retida, embora a extensão da atividade possa variar comparada a um anticorpo produzido por um hibridoma depositado (pode ser maior ou menor). A invenção também provê métodos de fabricação de qualquer um desses anticorpos. Métodos de fabricação de anticorpos são conhecidos na matéria e são descritos aqui.

[0211] A invenção também provê polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácido dos anticorpos da invenção. Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende uma ou mais regiões variáveis da cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo. Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende uma ou mais das CDRs de cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo. Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende três CDRs da cadeia leve e/ou cadeia pesada do anticorpo. Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido do anticorpo que tem qualquer dos seguintes: pelo menos 5 aminoácidos contíguos de uma sequência do anticorpo original, pelo menos 8 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 15 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 20 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 25 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos, em que pelo menos 3 dos aminoácidos são de uma região variável do anticorpo. Em uma realização, a região variável é de uma cadeia leve do anticorpo original. Em outra realização, a região variável é de uma cadeia pesada do anticorpo. Em outra realização, os 5 (ou mais) aminoácidos contíguos são de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do anticorpo.

90/215 [0212]

Em algumas realizações dessa invenção, as células dessa invenção que expressam B7-H3, uma porção de B7H3, anticorpos anti-B7-H3 ou outros polipeptídeos de ligação de B7-H3 dessa invenção são administradas diretamente a um indivíduo para modular atividade biológica de B7-H3 in vivo.

[0213]

Os anticorpos anti-B7-H3 preferidos da presente invenção são

BRCA84D,

BRCA69D e PRCA157, todos os tais anticorpos são anticorpos de murino para a molécula

B7H3 humana. As sequências de aminoácido que codificam polinucleotídeo da cadeia leve variável cadeia pesada variável de BRCA84D,

BRCA69D e PRCA157 são mostradas abaixo junto aos domínios

CDR1, CDR2 e CDR3 respectivos de cada cadeia. Aqueles técnicos no assunto, portanto, serão capazes de construir anticorpos que têm tais CDRs, bem como seus derivados, capazes de ligar aos epítopos por

BRCA84D, BRCA69D e PRCA157.

A. SEQUÊNCIAS DE BRCA84D [0214] (1) SEQUÊNCIAS DE CADEIA

LEVE BRCA84D [0215]

Sequência de aminoácido de Cadeia Leve

Variável BRCA84D

DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGS GTKLEIK [0216]

Sequência de Polinucleotídeo Codificando

Cadeia Leve Variável BRCA84D (SEQ ID N2:4):

gacattgcga gtcacctgca gggcaatctc cgcttcacag gaagacttgg gggacaaagt tgacccagtc aggccagtca ctaaagcact gcagtggatc cagagtattt tggaaataaa tcaaaaattc gaatgtggat gatttactcg tgggacagat ctgtcagcaa a atgtccacat actaatgtag gcatcctacc ttcactctca tataacaact cagtaggaga cctggtatca ggtacagtgg ccatcaacaa atccattcac cagggtcagc acagaaacca agtccctgat tgtgcagtct gttcggctcg [0217] CDRi de Cadeia Leve Variável BRCA84D (SEQ

ID N2:5) : KASQNVDTNVA

91/215 [0218] Sequência de Polinucleotideo Codificando

CDRi de Cadeia Leve Variável BRCA84D (SEQ ID N°: 6) :

aaggecagtc agaatglgga laclaatgta gce

	[0219]	CDR2 de Cadeia	Leve Variável	BRCA84D (SEQ
ID N2;7) :	SASYRYS
	[0220]	Sequência de	Polinucleotideo	Codificando
CDR2 de	BRCA84D	Cadeia Leve	Variável (SEQ	ID N2:8):
tcggcatcct	accggtacag	t
	[0221]	CDR3 de Cadeia	Leve Variável	BRCA84D (SEQ
ID N2:9):	QQYNNYPFT
	[0222]	Sequência de	Polinucleotideo	Codificando
CDR3 de	Cadeia Leve Variável	BRCA84D (SEQ	ID N°:10) :
cagcaatata	acaactatcc	attcacg
	[0223]	(2) SEQUÊNCIAS	DE CADEIA PESADA BRCA84D
	[0224]	Sequência de aminoácido de Cadeia Pesada

Variável BRCA84D (SEQ ID N°:ll):

DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY

ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGR

EN1YYG3RLD YWGQGTTLTV 3S [0225]

Sequência de Polinucleotideo Codificando

Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID N2: 12) :

gatgtgcagc tcctgtgcag ccagagaagg gcagacacag tggtggagtc cctctggatt ggctggagtg tgaagggccg tgggggaggc cactttcagt ggtcgcatac attcaccatc ttagtgcagc agctttggaa attagtagtg tccagagaca ctggagggtc tgcactgggt acagtagtgc atcccaagaa ccggaaactc tcgtcaggct catctactat caccctgttc ctgcaaatga ccagtctaag gtútgaggac gaaaacattt actacggtag taggcttgac tcctca acggccatgt attactgtgg aagagggagg tactggggcc aaggcaccac tútcacagtc [0226] CDRi de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID N°:13): FGMH [0227] Sequência de Polinucleotideo Codificando

CDRi de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID N°:14):

tttggaatgcac

92/215 [0228] CDR2 de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID N°:15) : YISSDSSAIYYADTVK [0229] Sequência de Polinucleotídeo Codificando

CDR₂ de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID N°:16):

tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag [0230] CDR3 de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID N°:17): GRENIYYGSRLDY [0231]

Sequência de Polinucleotídeo Codificando

CDR3 de Cadeia Pesada Variável BRCA84D (SEQ ID N°:18) :

gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactac

B. SEQUÊNCIAS de BRCA69D [0232] (1) SEQUÊNCIAS DE CADEIA LEVE BRCA69D [0233]

Sequência de aminoácido de

Cadeia Leve

Variável BRCA69D (SEQ ID N°:19):

DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIK [0234]

Sequência de Polinucleotídeo Codificando

Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ ID N2_:20):

gatatccaga atcagttgca gatggaactg aggttcagtg gaagatattg ggcaccaaac tgacacagac gggcaagtca ttaaactcct gcagtgggtc ccacttactt tggaaatcaa tacatcctcc ggacattagt gatctactac tggaacagat ttgccaacag a ctgtctgcct aattatttaa acatcacgat tattctctca ggtaatacgc ctctgggaga actggtatca tacactcagg ccattgacaa ttcctccgac cagagtcacc gcagaaacca agtcccatca cctggagcaa gttcggtgga [0235] CDRi de Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ

ID N°:21) : RASQDISNYLN [0236] Sequência de Polinucleotídeo Codificando

CDRi de Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ ID N£:22): agggcaagtc aggacattag taattattta aac [0237] CDR₂ de Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ ID N2:23): YTSRLRS [0238] Sequência de Polinucleotídeo Codificando

93/215

CDR₂ de

Cadeia

Leve

BRCA69D (SEQ

ID tacacatcac gàttacactc [0239]

CDR3 de Cadeia Leve Variável BRCA69D (SEQ

QQGNTLPPT [0240]

Sequência de Polinucleotídeo Codificando

CDR₃ de

Cadeia Leve Variável BRCA69D caacagggta atacgcttcc tccgacg [0241] (2) SEQUÊNCIAS DE CADEIA

PESADA BRCA69D [0242]

Sequência de aminoácido de Cadeia Pesada

Variável BRCA69D

QVQLQQSGAE LARPGASVKL

IYPGDGDTRY TQKFKGKATL

IPRLHYFDVW GAQTTVTV$$

SCKASGYTFT SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRG [0243]

Sequência de Polinucleotídeo Codificando

Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID caggttcagc tcctgcaagg cctggacagg actcagaagt atgcaactca attccacggc tccagcagtc cttctggcta gtctggaatg tcaagggcaa geagcttggc tttggtactt tggggctgag cacctttact gattgggact ggccacattg atútgaggac cgatgtctgg ctggcaagac agctactgga atttatcctg actgcagata tctgcggtct ggcgcaggga ctggggcttc tgcagtgggt gagatggtga aatcctccag attactgtgc ccacggtcac agtgaagttg aaaacagagg tactaggtac cacagcctac aagaagaggg cgtctcctca [0244]

CDRi de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID NO:29): SYWMQ [0245]

Sequência de Polinucleotídeo Codificando

CDRi de Cadeia agctactgga tgcag [0246]

CDR₂ de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID NO; 31) : TIYPGDGDTR YTQKFKG [0247]

Sequência de Polinucleotídeo Codificando actatttatc ctggagatgg tgatactagg tacactcag aagttcaagg gc [0248]

CDR3 de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID NO;33): RGIPRLWVFD V

94/215 [0249] Sequência de Polinucleotideo Codificando

CDR₃ de Cadeia Pesada Variável BRCA69D (SEQ ID N°_:34) :

agagggattc cacggctttg gtacttcgat gtc

C. SEQUÊNCIAS DE PRCA157 [0250] (1) PRCA157 CADEIA LEVE SEQUÊNCIAS

Sequência de aminoácido de Cadeia Leve Variável

PRCA157 (SEQ ID N°:35):

DIQMTQSFAS LSVSVGETVT ITCFASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG GGTNLEIK [0251] Sequência de Polinucleotideo Codificando

Cadeia Leve Variável PRCA157 (SEQ ID NO_:36):

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc attacatgtc gagcaagtga gagtatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat acaaaaacct taccagaggg tgtgccatca aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct gaagattttg ggagatatta ctgtcaacat cattatggta ctcctccgtg gacgttcggt ggaggcacca acctggaaat caaa

	[0252]	CDRI de Cadeia	. Leve Variável	PRCA157 (SEQ
ID NO: 37) :	RASESIYSYLA
	[0253]	Sequência de	Polinucleotideo	Codificando
CDRi de	Cadeia	Leve Variável	PRCA157 (SEQ	ID NO;38):
cgagcaagtg	agagtatt	ta cagttattta gca
	[0254]	CDR2 de Cadeia	Leve Variável	PRCA157 (SEQ
ID NO;39) :	NTKTLPE
	[0255]	Sequência de	Polinucleotideo	Codificando
CDR2 de	Cadeia	Leve Variável	PRCA157 (SEQ	ID NO;40):
aatacaaaaa	ccttaccaga g
	[0256]	CDR3 de Cadeia	Leve Variável	PRCA157 (SEQ
ID NO;41) :	QHHYGTPPW
	[0257]	Sequência de	Polinucleotideo	Codificando
CDR3 de	Cadeia	Leve Variável	PRCA157 (SEQ	ID NO;42):

95/215 caacatcatt atggtactcc tccgtgg

[0258]	(2) SEQUÊNCIAS DE CADEIA PESADA PRCA157
[0259]	Sequência de aminoácido de Cadeia Pesada
Variável PRCA157	(SEQ ID N2:43):

EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGHSWVRQT PDKRLEWVAT INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD GGAMDYWGQG TSVTVSS [0260] Sequência de Polinucleotideo Codificando

Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID N2;44):

gaggtgcagc cctgaaactc tgtcttgggt attaatagtg attcaccatc gcagtctgaa gggggagcta aggtggagtc tcctgtgcag tcgccagact gtggaagtaa tccagagaca gtctgaggac tggactactg ggggggagac cctctggatt ccagacaaga cacctactat atgccaagaa acagccatgt gggtcaagga ttagtgaagc cactttcagt ggctggagtg ccagacagtt caccctttac attactgtgc acctcagtca ctggagggtc tcctatggca ggtcgcaacc tgaaggggcg ctgcaaatgc aagacatgac ccgtctcctc a [0261]

CDRi de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID N2:45): SYGME [0262] Sequência de Polinucleotideo Codificando

CDRi de Cadeia

Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID N°:46):

tcctatggca tgtct [0263] CDR₂ de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID N2:47): VATINSGGSN TYYPDSLKG [0264] Sequência de Polinucleotideo Codificando

CDR₂ de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID N°:48) :

gtcgcaacca ttaatagtgg tggaagtaac acctactatc cagacagttt gaagggg [0265] CDR3 de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID N2:49): HDGGAMDY [0266] Sequência de Polinucleotideo Codificando

CDR₃ de Cadeia Pesada Variável PRCA157 (SEQ ID N£:50) : catgacgggg gagctatgga ctac

D. ANTICORPOS B7-H3 PROJETADOS POR FC [0267] Em função imune tradicional, a interação

96/215 dos complexos de anticorpo-antígeno com células do sistema imune resulta em uma grande variedade de respostas, variando de funções efetoras tais como citotoxicidade dependente do anticorpo, desgranulação de mastócitos, e fagocitose para sinais imunomodulatórios tais como proliferação de linfócito de regulação e secreção de anticorpo. Todas essas interações são iniciadas através da ligação do domínio Fc dos anticorpos ou complexos imune para receptores de célula especializados em células hematopoiéticas. A diversidade de respostas celulares desencadeadas pelos anticorpos e complexos imune resulta da heterogenicidade estrutural dos três receptores Fc: FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32), e FcyRIII (CD 16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) e FcyRIII (CD 16) são receptores de ativação (isto é, aumento do sistema imune); FcyRIIB (CD32B) é um receptor de inibição (isto é, atenuação do sistema imune) . A sequência de aminoácido da região Fc da IgGl Fc é mostrada abaixo (como SEQ ID N°:51, numerada de acordo com Kabat et al, SEQUENCE OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5^th Ed. Public Health Service, NIH, MD (1991), expressamente incorporada aqui por referência, e a seguir referida como Kabat EU):

[0268]	SEQ ID	NP: 51
PAPELLGGPS 230	VFLFPPKFKD 240	TLMISRTPEV 250	TCWVDVSHE 260	DPEVKFNWYV 270
DGVEVHNAKT 280	KPREEQYNST 290	YRWSVLTVL 300	HQDWLNGKEY 310	KÇKVSNKALP 320
AFIEKTlSKft 330	KGOFREPQVy 340	TLFFSREEMT 350	KNQVSLTCLV 360	KGFYFSDIftV 370
EWE5NGQFEM 380	NYKTTFFVLD 390	SDGSFFLYSK 400	LTVDKSFWQQ 410	gnvfscsvmh 420
EALHNHYTQK 430	SLSLSPGK 440

[0269]

Os resíduos 230 a 341 são a região Fc

97/215

CH2. Os resíduos 342 a 447 são a região Fc CH3.

[0270] A presente invenção inclui anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreende uma região Fc variável tendo uma ou mais modificação de aminoácidos (por exemplo, substituições, exclusões, inserções) em uma ou mais porções, modificações que aumentam a afinidade e avidez da região Fc variável para um FcyR (incluindo FcyRs de ativação e inibitórios). Em algumas realizações, as ditas uma ou mais modificações de aminoácido aumentam a afinidade da região Fc variável para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA. Em outra realização, a região Fc variável ainda especificamente se une a FcyRIIB com uma afinidade menor do que a região Fc do anticorpo principal comparável (isto é, um anticorpo que tem a mesma sequência de aminoácido como o anticorpo da invenção exceto para as uma ou mais modificações de aminoácido na região Fc). Em algumas realizações, tais modificações aumentam a afinidade da região Fc variável para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA e também aumentam a afinidade da região Fc variável para FcyRIIB com relação ao anticorpo principal. Em outras realizações, as ditas uma ou mais modificações de aminoácido aumentam a afinidade da região Fc variável para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA mas não alteram a afinidade da região Fc variável para FcyRIIB com relação à região Fc do anticorpo principal. Em outra realização, as ditas uma ou mais modificações de aminoácido aumentam a afinidade da região Fc variável para FcyRIIIA e FcyRIIA, mas reduz a afinidade para FcyRIIB com relação ao anticorpo principal. Afinidade e/ou avidez resulta em ligação detectável à atividade relacionada a FcyR ou FcyR em células que expressam baixos níveis do FcyR quando a atividade de ligação da molécula principal (sem a região Fc modificada)

98/215 não pode ser detectada nas células. Em outras realizações, a molécula modificada exibe ligação detectável em células que

expressam	antígenos	alvo	do	receptor não FcyR	em	uma
densidade	de	30.000	a	20.000	moléculas/célula,	em	uma
densidade	de	20.000	a	10.000	moléculas/célula,	em	uma
densidade	de	10.000	a	5.000	moléculas/célula,	em	uma
densidade	de 5	.000 a 1	. 000	moléculas/célula, em uma	densidade

de 1.000 a 200 moléculas/célula ou em uma densidade de 200 moléculas/célula ou menos (mas pelo menos 10, 50, 100 ou 150 moléculas/célula).

[0271] Em outra realização, as ditas uma ou mais modificações para os aminoácidos da região Fc reduzem a afinidade e avidez do anticorpo para um ou mais receptores FcyR. Em uma realização específica, a invenção engloba anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a dita região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação a uma região Fc tipo selvagem, região Fc variável que apenas se une a um FcyR, em que o dito FcyR é FcyRIIIA. Em outra realização específica, a invenção engloba anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a dita região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação à região Fc tipo selvagem, região Fc variável que apenas se une a um FcyR, em que o dito FcyR é FcyRIIA.

[0272] Preferencialmente, as propriedades de ligação das moléculas da invenção são caracterizadas por ensaios funcionais in vitro para determinar uma ou mais funções de célula efetora de mediador FcyR (Ver Seção 5.2.7). As afinidades e propriedades de ligação das moléculas, por exemplo, anticorpos, da invenção para um FcyR podem ser

99/215 determinadas usando ensaios in vitro (ensaios com base bioquímica ou imunológica) conhecidos na matéria para determinar as interações do anticorpo-antígeno ou Fc-FcyR, isto é, ligação específica de um antígeno em um anticorpo ou ligação específica de uma região Fc para um FcyR, respectivamente, incluindo, mas não limitado a, ensaio ELISA, ensaio de ressonância de plasma de superfície, ensaios de imunoprecipitação. Em realizações mais preferidas, as moléculas da invenção têm propriedades de ligação similares em modelos in vivo (tais como aqueles aqui descritos e revelados) como aqueles em ensaios com base in vitro. Entretanto, a presente invenção não exclui as moléculas da invenção que não exibem o fenótipo desejado em ensaios com in vitro, mas não exibem o fenótipo desejado in vivo.

[0273] Em algumas realizações, as moléculas da invenção compreendendo uma região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) no domínio CH3 da região Fc, que é definida como uma extensão dos aminoácidos 342 a 447. Em outras realizações, as moléculas da invenção compreendendo uma região Fc variável compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) no domínio CH2 da região Fc, que é definida como uma extensão dos aminoácidos 231 a 341. Em algumas realizações, as moléculas da invenção compreendem pelo menos duas modificações de aminoácido (por exemplo, possuindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido), em que pelo menos tal modificação esteja na região CH3 e pelo menos tal modificação

100/215 esteja na região CH2. A invenção ainda engloba modificação de aminoácido na região articular. Em uma realização particular, a invenção engloba modificação de aminoácido no domínio CH1 da região Fc, que é definida como a extensão dos aminoácidos 216 a 230.

[0274] Em realizações particularmente preferidas, a invenção engloba moléculas compreendendo uma região Fc variável em que a dita variável confere ou tem uma atividade ADCC aumentada e/ou uma ligação aumentada para FcyRIIA (CD32A), conforme medida usando métodos conhecidos de alguém especialista na matéria e exemplificados aqui. Os ensaios ADCC usados de acordo com os métodos da invenção podem ser dependentes de NK ou dependentes de macrófago.

[0275] Em realizações particularmente preferidas, a invenção engloba moléculas compreendendo uma região Fc variável em que a dita variável confere ou tem uma atividade ADCC aumentada e/ou uma ligação aumentada para FcyRIIIA (CD16A), conforme medida usando métodos conhecidos de alguém especialista na técnica exemplificada aqui. Os ensaios ADCC usados de acordo com os métodos da invenção podem ser dependentes de NK ou dependentes de macrófago.

[0276] As variáveis Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras modificações de Fc, tais como aquelas descritas nas Patentes Norte-Americanas n°^s 7.632.497; 7.521.542; 7.425.619; 7.416.727; 7.371.826; 7.355.008; 7.335.742; 7.332.581; 7.183.387; 7.122.637; e 6.737.056; nas Publicações de PCT n°^s WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; e em WO 04/063351; e em Presta, L.G. et al. (2002) “Engineering Therapeutic

101/215 antibodies for improved function,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):487-490, Shields, R.L. et al. (2002) “Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII e antibody-dependent cellular toxicity, J. Biol. Chem. 26,277(30):26733-26740 e Shields, R.L. et al. (2001) “High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, e FcRn e design of IgG1 variants com improved binding to the Fc gamma R,” J. Biol. Chem. 276(9) :6591-6604) . A invenção engloba a combinação de uma variável Fc da invenção com outras modificações de Fc para prover propriedades aditivas, sinérgicas ou novas para o anticorpo modificado. Preferencialmente, as variáveis Fc da invenção aumentam o fenótipo da modificação com o qual elas são combinadas. Por exemplo, se uma variável Fc da invenção é combinada com um mutante conhecido por ligar FcyRIIIA com uma afinidade maior que uma região Fc tipo selvagem comparável, a combinação com um mutante da invenção resulta em um maior aperfeiçoamento de vezes na afinidade de FcyRIIIA.

[0277] A invenção engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreende uma região Fc variável, em que a região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) relativa a uma região Fc tipo selvagem, de modo que a molécula tenha uma função efetora aumentada relativa a uma molécula compreendendo uma região Fc tipo selvagem, contanto que a região Fc variável não tenha ou não seja apenas uma substituição em qualquer uma ou mais das posições 243, 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285,

102/215

286,	289,	290,	292,	293,	294,	295,	296,	298,	300,	301,	303,
305,	307,	309,	312,	320,	322,	326,	329,	330,	332,	331,	333,
334,	335,	337,	338,	339,	340,	359,	360,	373,	376,	416,	419,
430,	434,	435,	437,	438,	439.	Em uma	realização específica, a

invenção engloba tais anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) relativa a uma região Fc tipo selvagem, de modo que a molécula se ligue a um FcyR com uma afinidade alterada relativa a uma molécula compreendendo uma região Fc tipo selvagem, contanto que a região Fc variável não tenha ou não seja apenas uma substituição em qualquer uma ou mais das

posições	243,	255,	258, 267, 269,	270,	276,	278,	280,	283,
285,	289,	292,	293,	294, 295, 296,	300,	303,	305,	307,	309,
320,	322,	329,	332,	331, 337, 338,	340,	373,	376,	416,	419,
434,	435,	437,	438,	439 e não tenha uma	alanina	e qualquer

uma das posições 256, 290, 298, 312, 326, 333, 334, 359, 360,

ou 430;	uma	asparagina na	posição	268; uma	glutamina	na
posição	2 72;	uma glutamina,	serina,	ou ácido	aspártico	na
posição	286;	uma serina na	posição	2 90; uma	metionina	na
posição	301;	uma metionina,	glutamina, ácido	glutâmico,	ou
arginina	na	posição 320; um	ácido glutâmico na	posição 322;

uma asparagina, serina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico na posição 326; uma lisina na posição 330; uma glutamina na posição 334; um ácido glutâmico na posição 334; uma metionina na posição 334; uma histidina na posição 334; uma valina na posição 334; uma leucina na posição 334; uma glutamina na posição 335; uma lisina na posição 335; ou uma treonina na posição 339.

103/215 [0278] A invenção também engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreendem uma região Fc variável, em que a região Fc variável compreende tais anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a região Fc variável não tem ou não é apenas uma substituição em qualquer uma ou mais das posições 268, 269, 270, 272, 276,

278,	283,	285,	286,	289,	292,	293,	301,	303,	305, 307,	309,
320,	331,	333,	334,	335,	337,	338,	340,	360,	373, 376,	416,
419,	430,	434,	435,	437,	438 ou 439	e não tem	uma histidina,

glutamina, ou tirosina na posição 280; uma serina, glicina, treonina ou tirosina na posição 290, uma asparagina na posição 294, uma lisina na posição 295; uma prolina na posição 296; uma prolina, asparagina, ácido aspártico, ou valina na posição 298; ou uma leucina ou isoleucina na posição 300. Em outra realização, a invenção engloba tais anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação à região Fc tipo selvagem, de modo que a molécula se une a um FcyR com uma afinidade reduzida com relação à molécula compreendendo uma região Fc tipo selvagem contanto que a região Fc variável não tenha ou não seja

apenas uma substituição em qualquer uma ou mais da posições
243,	252,	254,	265,	268,	269, 270,	278,	289, 292, 293,	294,
295,	296,	298,	300,	301,	303, 322,	324,	327, 329, 333,	335,
338,	340,	373,	376,	382,	388, 389,	414,	416, 419, 434,	435,
437,	438,	ou	439.	Ainda	em outra	realização, a invenção

engloba tais anticorpos compreendendo uma região Fc variável, em que a região Fc variável compreende pelo menos uma modificação de aminoácido com relação à região Fc tipo selvagem, de modo que a molécula se une a FcyR com uma

104/215 afinidade aumentada com relação à molécula compreendendo uma região Fc tipo selvagem contanto que a região Fc variável não tenha e não seja apenas uma substituição em qualquer uma ou mais da posições 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398, ou 430.

[0279] A invenção também engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreendem uma região Fc variável, em que a região Fc variável não inclui ou não são apenas uma substituição em qualquer uma ou mais das posições

330, 243, 247, 298, 241,

240, 244, 263, 262, 235, 269, ou

328 e não tem uma leucina na posição 243, uma asparagina na posição 298, uma leucina na posição 241, isoleucina ou uma alanina na posição 240, uma histidina na posição

244, uma valina na posição

330, ou uma isoleucina na posição

328 .

[0280]

A invenção particularmente engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreendem uma aumentada e/ou região Fc afinidades variável alteradas com para ativação e/ou inibitórios, em que a função efetora receptores de região Fc variável compreende: (a) qualquer 1,

2, 3, 4, 5, ou 6 das seguintes substituições: S239D, S298A,

A330L, I332E, E333A, ou K334A;

ou (b) qualquer uma das combinações de substituições: (1)

S298A, E333A, e K334A; (2) S239D e I332E; ou (3) S239D, A330L e I332E.

[0281] A invenção particularmente engloba anticorpos que especificamente se une a B7-H3 que compreende uma região Fc variável com função efetora aumentada e/ou afinidades alteradas para ativação e/ou receptores inibitórios, em que a região Fc variável compreende uma

105/215

substituição:
[0282]	(1)	na	posição	288	com asparagina, na
posição 330 com	serina e	na	posição	396	com leucina;
[0283]	(2)	na	posição	334	com ácido glutâmico,
na posição 359 com asparagina, e na	posição 366 com serina;
[0284]	(3)	na	posição	316	com ácido aspártico,
na posição 378	com valina, e na	posição 399 com ácido
glutâmico;
[0285]	(4)	na	posição	247	com leucina, e uma
substituição na	posição	421	com lisina;
[0286]	(5)	na	posição	392	com treonina, e na
posição 396 com	leucina;
[0287]	(6)	na	posição	221	com ácido glutâmico,
na posição 270	com ácido	glutâmico,	na posição 308 com

alanina, na posição 311 com histidina, na posição 396 com leucina, e na posição 402 com ácido aspártico;

[0288]	(7)	na	posição 419	com histidina,	e uma
substituição na	posição	396	com leucina;
[0289]	(8)	na	posição 240	com alanina,	e na
posição 396 com	leucina;
[0290]	(9)	na	posição 410	com histidina,	e na

posição 396 com leucina;

[0291] (10) na posição 243 com leucina, na posição 305 com isoleucina, na posição 378 com ácido aspártico, na posição 404 com serina, e na posição 396 com leucina;

[0292] (11) na posição 255 com isoleucina, e na posição 396 com leucina;

[0293] (12) na posição 370 com ácido glutâmico e na posição 396 com leucina;

106/215 [0294] (13) na posição 270 com ácido glutâmico;

[0295] ou [0296] (14) qualquer combinação das substituições acima (1) a (12).

[0297] Em uma realização específica, a invenção engloba um anticorpo que especificamente se une a B7-H3 que compreende uma região Fc variável que compreende a substituição: F243L, R292P, e Y300L. Ainda em uma realização específica, a invenção engloba um anticorpo que especificamente se une a B7-H3 que compreende uma região Fc variável que compreende a substituição: L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L. Ainda em uma realização específica, a invenção engloba um anticorpo que especificamente se une a B7-H3 que compreende uma região Fc variável que compreende a substituição F243L, R292P, Y300L, V305I, e P396L.

[0298] Ainda em uma realização específica, a invenção engloba um anticorpo que especificamente se une a B7-H3 que compreende uma região Fc variável que compreende uma substituição na posição 396 com leucina, na posição 270 com ácido glutâmico e na posição 243 com leucina. Em outra realização específica, a molécula ainda compreende uma ou mais modificações de aminoácido tais como aquelas descritas aqui.

[0299] A invenção particularmente engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreende uma região Fc variável com função efetora aumentada e/ou afinidades alteradas para receptores de ativação e/ou inibitórios, que têm uma modificação de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 119, 125, 132, 133, 141, 142, 147, 149, 162, 166, 185, 192, 202, 205, 210, 214, 215, 216,

107/215

217,	218,	219,	221,	222,	223,	224,	225,	227,	229,	231,	232,
233,	235,	240,	241,	242,	243,	244,	246,	247,	248,	250,	251,
252,	253,	254,	255,	256,	258,	261,	262,	263,	268,	269,	270,
272,	274,	275,	276,	279,	280,	281,	282,	284,	287,	288,	289,
290,	291,	292,	293,	295,	298,	301,	303,	304,	305,	306,	307,
308,	309,	310,	31 1,	312,	313,	315,	316,	317,	318,	319,	320,
323,	326,	327,	328,	330,	333,	334,	335,	337,	339,	340,	343,
344,	345,	347,	348,	352,	353,	354,	355,	358,	359,	360,	361,
362,	365,	366,	367,	369,	370,	371,	372,	375,	377,	378,	379,
380,	381,	382,	383,	384,	385,	386,	387,	388,	389,	390,	392,
393,	394,	395,	396,	397,	398,	399,	400,	401,	402,	404,	406,
407,	408,	409,	410,	411,	412,	414,	415,	416,	417,	419,	420,
421,	422,	423,	424,	427,	428,	431,	433,	435,	436,	438,	440,
441,	442,	443,	446,	ou 447. Preferencialmente	tais	mutações

resultam em moléculas que foram conferidas com função mediada por célula efetora e, opcionalmente, têm uma afinidade alterada por um FcyR conforme determinado usando métodos descritos e exemplificados aqui e conhecidos de alguém especialista na matéria.

[0300] A invenção particularmente engloba anticorpos que especificamente se unem a B7-H3 que compreende uma região Fc variável com função efetora alterada e/ou afinidades alteradas para receptores de ativação e/ou inibição, que tem:

[0301] (I) uma modificação de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328, ou 330 e mais preferencialmente uma ou mais das seguintes modificações: V240A, V240I, F241L, F243L, P244H, S298N, L328I, A330V; em que tais anticorpos exibem função efetora alterada com relação aos anticorpos que

108/215 têm uma região Fc tipo selvagem que carece de tal modificação;

[0302] (II) uma modificação de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 268,

283,	285,	286,	289,	292,	293,	301,
333,	334,	335,	337,	338,	340,	360,
434,	435,	437,	438	ou 439 e	mais

303,

373, preferencialmente mais

269,

270,	272,	276,	278,
305,	307,	309,	331,
376,	416,	419,	430,

uma ou das seguintes modificações: D280H, D280Q, D280Y,

K290G,

K290S,

K290T,

K290Y, E294N, Q295K,

Y296P, S298D,

S298N,

S298P,

S298V,

Y300I, Y300L; em que tais anticorpos exibem função efetora alterada com relação aos anticorpos que têm uma região Fc tipo selvagem que carece de tal modificação;

[0303] (III) uma modificação de aminoácido em

uma	ou mais das	seguintes	posições:	255,	256,	258,	267,	268,
269,	270,	272,	276,	278,	280,	283,	285,	286,	289,	290,	292,
293,	294,	295,	296,	298,	300,	301,	303,	305,	307,	309,	312,
320,	322,	326,	329,	330,	332,	331,	333,	334,	335,	337,	338,
339,	340,	359,	360,	373,	376,	416,	419,	430,	434,	435,	437,

438, 439, e mais preferencialmente uma ou mais das seguintes

modificações:	T256A,	H268N,	E272Q,	N286D,	N286Q,	N286S,
K290A,	K290S,	S298A,	R301M,	D312A,	K320E,	K320M,	K320Q,
K320R,	K322E,	K326A,	K326D,	K326E,	K326N,	K326S,	A330K,
A339T,	E333A,	K334A,	K334E,	K334H,	K334L,	K334M,	K334Q,
K334V,	T335K,	T335Q,	T359A,	K360A,	E430A;	em que tais

anticorpos exibem função efetora alterada com relação aos anticorpos que têm uma região Fc tipo selvagem que carece de tal modificação;

[0304] (IV) uma modificação de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 252, 254, 265, 268, 269, 270,

278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322,

109/215

324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389,

414, 416, 419, 434, 435, 437, 438, ou 439; em que tais anticorpos exibem função efetora reduzida com relação aos anticorpos que têm uma região Fc tipo selvagem que carece de tal modificação;

[0305] (V) uma modificação de aminoácido em uma ou mais das seguintes posições: 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334,

337, 340, 360, 378, 398, ou 430; em que tais anticorpos exibem função efetora aumentada com relação aos anticorpos que têm uma região Fc tipo selvagem que carece de tal modificação;

[0306] ou [0307] (VI) uma modificação de aminoácido em uma

ou mais	das seguintes	posições	: R255A, T256A,	E258A,	S267A,
H268A,	H268N,	E272A,	E272Q,	N276A,	D280A,	E283A,	H285A,
N286A,	N286D,	N286Q,	N286S,	K290A,	K290S,	R301M,	K320E,
K320M,	K320Q,	K320R,	K322E,	K326A,	K326D,	K326E,	K326S,
A330K,	P331A,	T335Q,	S337A, E430A;	em que tais anticorpos
exibem	função	efetora	aumentada com	relação	aos anticorpos
que têm uma	região	Fc tipo	selvagem que	carece	de tal
modificação.

[0308] Em outras realizações, a invenção engloba o uso de qualquer variável Fc conhecida na matéria, tal como aquelas descritas em Jefferis, B.J. et al. (2002) “Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models, Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) “Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function, Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) “Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit

110/215

Complement, J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) “High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants Com Improved Binding To The Fc gamma R, J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2 000) “Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc, J. Immunol. 164:417884; Reddy, M.P. et al. (2000) “Elimination Of Fc ReceptorDependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Antibody monoclonal To Human CD4, J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) “In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies, Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) “Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities, Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) “Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions, Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) “Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains, J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) “Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-IH, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92: 1 1980-84;

Jefferis, R. et al. (1995) “Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation, Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) “OligosaccharideProtein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors, FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al.

111/215 (1994) A Non-Activating Humanized Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo, Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma Rll, Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG, J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) Localization Of The Binding Site

For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG, Nature 332:563-564; Patente Norte-Americana n^os 5.624.821; 5.885.573; 6.194.551; 7.276.586; e 7.317.091; e Publicações de PCT WO 00/42072 e PCT WO 99/58572.

[0309] A invenção engloba moléculas compreendendo regiões Fc variáveis consistindo em ou compreendendo qualquer uma das mutações listadas na tabela abaixo na Tabela 1.

Tabela 1 Modificações Fc Exemplares
Substituições de um Local Único
S1321	F241W	D265N	D280Q	Y296T	D312A	L328I	K334E
A162 V	F241Y	D265Q	D280Y	N2 97D	W313F	L328K	K334H
S219Y	F241Y	D265T	G281D	N297E	N315I	L328M	K334I
K222N	F243D	D265V	G281K	N297I	E318K	L328N	K334L
H224L	F243H	D265Y	G281P	N297S	K320E	L328P	K334M
T225S	F243L	V2 6 6A	G281Y	S298A	K32 0M	L328Q	K334N
P228E	F243L	V266I	V282M	S298D	K32 0Q	L328R	K334Q
P228G	F243Q	V2 6 6M	E283A	S298N	K32 0R	L328S	K334V
P228K	F243R	V266T	V284E	S298N	K322E	L328T	T335K
P228Y	F243W	S267A	V284L	S298N	V323I	L328V	T335Q
P23 0A	F243Y	H2 6 8A	V284N	S298P	N325A	L328W	I336E
P230E	P244H	H2 6 8N	V284T	S298V	N325D	L328Y	I336K
P230G	P245A	D270E	V284Y	T2 9 9A	N325E	A3 3 01	I336Y

112/215

Tabela 1 Modificações Fc Exemplares
P230Y	P247G	P2 71A	H2 85A	T299D	N325F	A3 3 OK	S337A
A231E	P247L	P271D	N2 86A	T299E	N325G	A3 3 OL	A339T
A231G	P247V	P271E	N286D	T299F	N325H	A330S	M352L
A231K	K24 8M	P271F	N286S	T299G	N325I	A3 3 0V	T359A
A231P	R255A	P271G	K2 88N	T299H	N325K	A3 3 OY	T359N
A231Y	T256A	P271H	K2 90A	T299I	N325L	P331A	K3 6 0A
P232E	E258A	P271I	K2 90G	T299K	N325M	I332A	T366N
P232G	V2 62A	P271K	K290S	T299L	N325P	I332D	T366S
P232K	V262E	P271L	K2 90T	T299M	N325R	I332E	F372Y
P232Y	V262F	P271M	K2 90Y	T299N	N325S	I332F	F372Y
E233D	V262I	P271N	P291D	T299P	N325T	I332G	I377F
E233G	V262T	P271Q	P291E	T299Q	N325V	I332H	I377N
L234I	V2 63A	P271R	P291G	T299R	N325W	I332K	V379L
L235D	V263I	P271S	P291H	T299S	N325Y	I332L	V3 7 9M
S239D	V263M	P271T	P291I	T299V	K32 6A	I332M	K392R
S239E	V263T	P271V	P291Q	T299W	K32 6D	I332N	P396H
S239N	V2 64A	P271W	P291T	T299Y	K326E	I332P	P396L
S239Q	V264E	P271Y	R292G	Y300I	K326E	I332Q	L398V
V24 0A	V264F	E272A	R292L	Y300L	K32 6N	I332R	S400P
V240I	V264I	E272Q	E294N	R301M	K326S	I332S	D4 01V
V240M	V264R	V273I	Q295K	R301M	K326T	I332T	S407I
V240T	V264T	F275L	Y296D	V302I	L32 8A	I332V	K414N
F241E	V264W	F275W	Y296E	S304D	L328D	I332W	E430A
V241I	D265F	F275Y	Y296H	S304H	L328E	I332Y
F241L	D265H	N2 7 6A	Y296N	S304L	L328F	E333
F241R	D265I	D2 80A	Y296P	S304N	L328G	K334A
F241S	D265L	D280H	Y296Q	S304T	L328H	K334E
Substituições de dois locais
I332E, A330L	S239N / I332Q	V279L, P395S	P396L, P217S
I332E, L328D	S239Q / I332D	V284A, F372L	P396L, P227S
I332E, L328E	S239Q / I332E	K288N, K326N	P396L, V323I
I332E, L328H	S239Q / I332N	K288N, A330S	P396L, V240A
I332E, L328I	S239Q / I332Q	K290E, L142P	P396L, L242F
I332E, L328M	V240I, V281M	K290E, P227S	P396L, P244H
I332E, L328N	F241L, E258G	K290T, G371D	P396L, T250A

113/215

Tabela 1 Modificações Fc Exemplares
I332E, L328Q	F241L / V262I	P291S, P353Q	P396L, R255L
I332E, L328T	F243L, E318K	R292P, V305I	P396L, E258D
I332E, L328V	F243I, V379L	S298A / I332E	P396L, H268D
I332E, N297D	P243L / V264I	S298N, W381R	P396L, H268N
I332E, N297E	K246T, Y319F	S298N, S407R	P396L, V303I
I332E, N297S	K246T, P396H	K317N, F423- DEL	P396L, K326I
S166N, K409R	P247H, G285E	K326E, K320E	P396L, V305L
P232S, S304G	P247L, I377F	K326E, A330T	P396L, L358P
S239D / I332D	P247L, E389G	K326E, G385E	P396L, K370E
S239D / I332E	P247S, P396L	A3 30V, Q419H	P396L, S375C
S239D / I332N	P247L, L398Q	K334E, E233D	P396L, V379M
S239D / I332Q	P247L, L406F	K334N, K246I	P396L, N384K
S239E / D265N	P247L, N421K	K334E, K288M	P396L, K392T
S239E / D265Q	L251F, F372L	K334E, R292L	P396L, S400F
S239E / I332D	L251F, S415I	K334E, E308D	P396L, L410H
S239E / I332E	R255L, E318K	K334E, E380D	P396L, Q419H
S239E / I332N	R255Q, K326E	K334N, P396L	P396L, Q419L
S239E / I332Q	E258D, N384K	A339V, Q347H	P396L, V427A
S239N / I332D	V263Q, E272D	K370N, S440N	D399E, G402D
S239N / I332E	V264I / I332E	T394M, V397M	D399E, M428L
S239N / I332N	H268D, E318D	P396L, K210M
Substituições de três locais
V185M, R292L, D399E	P217S, A378V, S408R	K218R, G281D, G385R
S192T, M252L, R301C	P247L, I253N, K334N	P247L, A330T, S440G
V125L, V215I, S408I	D312E, K327N, I378S	T355N, P387S, H435Q
R292L, T359N, P396L	E216D, E345K, S375I	P247L, A431V, S442F
F275I, K334N, V348M	K288N, A330S, P396L	A378V, N390I, V422I
F243L, R255L, E318K	G316D, A378V, D399E	V282E, V369I, L406F
K334E, T359N, T366S	N315I, V379M, T394M	V397M, T411A, S415N
K288N, A330S, P396L	P247L, W313R, E388G	T223I, T256S, L406F
F243I, V379L,	R301H, K340E, D399E	K246N, P396L,

114/215

Tabela 1 Modificações Fc Exemplares
G42 0V		Q419R
A231V, Q386H, V412M	K326I, P396L, S408N	P217A, T359A, P396L
E216D, K334R, S375I	K210M, K261N, P396L	V215I, K290V, P396L
T335N, P387S, H435Q	A330V, G427M, K438R	V263Q, E272D, Q419H
K246I, Q362H, K370E	K222E, V263Q, S298N	N276Y, T393N, W417R
K334E, E380D, G446V	E233G, P247S, L306P	D270E, G316D,R416G
V303I, V369F, M428L	S219T, T225K, D270E	D270E, K392T, P396L
K246E, V284M, V3 08A	R292P, F243L, V305I	R255L, D270E, P396L
E293V, Q295E, A327T	V284M, R292L, K370N	V240A, D270E, P396L
Y319F, P352L ,P396L	D270E, K370E, P396L	270E, P396L, Q419HD
K290T, N390L, P396L	P247L, D270E, N421K	S239D, A330L, I332E
N297D, A330Y, I332E	Y296D, N297D, I332E	S239D, A330Y, I332E
N297D, T299L, I332E	Y296E, N297D, 1332E	S239D, I332E, A330I
N297D, T299I, I332E	Y296H, N297D, I332E	S239D, N297D, I332E
N297D, T299L, I332E	Y296N, N297D, I332E	S239D, S298A, I332E
N297D, T299V, I332E	Y296Q, N297I, I332E	S239D, V2641I, I332E
F243L, V262I, V264W	Y296T, N297D, I332E	S239E, N297D, I332E
D265F, N297E, I332E	P230A, E233D, I332E	S239E, V2641, I332E
D265Y, N297D, I332E	P244H, P245A, P247V	S239N, A330L, I332E
V264E, N297D, I332E	V264I, A330Y, I332E	S239N, A330Y, I332E
V264I, A330L, I332E	V264I, S298A, I332E	S239Q, V264I, I332E

115/215

Tabela 1 Modificações Fc Exemplares
Substituições de quatro locais
A141V, H268L, K288E, P291S	T256S, V305I, K334E, N390S
E258D, T289A, H310Y, Y407V	D280E, S354F, A431D, L441I
K334E, T359N, T366S, Q386R	P343S, P353L, S375I, S383N
K326Q, K334E, T359N, T366S	E269K ,K290N, Q311R, H433Y
K288R, T307A, K344E, P396L	K290E, V369A, T393A, P396L
V273I, K326E, L328I, P396L	K210N, K222I, K320M, P396L
F275L, Q362H, N384K, P396L	S219T, T225K, D270E, K360R
V282L, A330V, H433Y, T436R	P243L, S254T, A330V, N361D
R255L, D270E,Y300L, P396L,	F243L, D270E, K392N, P396L
R255L, D270E, R292G, P396L	F243L, R255L, D270E, P396L
V284M, S298N, K334E, R355W	S239D, D265F, N297D, I332E
D265Y, N297D, T299L, I332E	S239D, D265H, N297D, I332E
F241E, F2430, V262T, V264F	S239D, D265I, N297D, I332E
F241E, F243R, V262E, V264R	S239D, 0265L, N297D, I332E
F241E, F243Y, V262T, V264R	S239D, D265T, N297D, I332E
F241L, F243L, V262I, V264I	S239D, D265V, N297D, I332E
F241R, F2430, V262T, V264R	S239D, D265Y, N297D, I332E
F241W, F243W, V262A, V264A	S239D, N297D, I332E, A330Y
F241Y, F243Y, V262T, V264T	S239D, N297D, I332E, K326E
N297D, I332E, S239D, A330L	S239D, N297D, I332E, L235D
N297D, S298A, A330Y, I 332E	S239D, V264I, A330L, I332E
S239D, A330Y, I332E, K326E	S239D, V264I, S298A, I332E
S239D, A330Y, I332E, K326T	S239E, V264I, A330Y, 1332 E
S239D, A330Y, I332E, L234I	S239D, A330Y, I332E, V264T
S239D, A330Y, I332E, L235D	S239D, A330Y, I332E, V266I
S239D, A330Y, I332E, V240I
Substituições de cinco locais
V284M, S298N, K334E, R355W, R416T	K147T, Y202M, F275I, K334N, V348M
P217S, V305I, I309L, N390H, P396L	T335N, K370E, A378V, T394M, S424L
F243L, V305I, A378D, P396L, F404S	P244H, L358M, V379M, N384K, V3 97M
K222N, T335N, K370E, A378V, T394M	P244A, K326I, C367R, S375I, K447T
L235P, S304G, V305I, V323I, V382M	C229Y, A287T, V379M, P396L, L443V

116/215

Tabela 1 Modificações Fc Exemplares
F241E, F2430, V262T, V264E, I332E	F241R, F243Q, V262T, V264R, I332E
F241E, F243R, V262E, V264R, I332E	S239E, V264I, S298A, A330Y, I332E
F241E, F243Y, V262T, V264R, I332E
Substituições de mais de cinco locais
D221E, D270E, V308A, Q311H, P396L, G402D
T215P, K274N, A287G, K334N, L365V, P396L
F241Y, F243Y, V262T, V264T, N297D, I332E
N297D, T299F, I332E, N297D, T299H, I332E
D221Y, M252I, A330G, A339T, T359N, V422I, H433L
S239D, N297D, I332E, A330Y, F241S, F243H, V262T, V264T
K133M, F149Y, K205E, R214I, K218E, S383N, N384K, T256N, V262L

[0310] Em realizações específicas, a região Fc variável de tais anticorpos anti-B7-H3 tem:

[0311] (1) uma leucina na posição 247, uma lisina na posição 421 e um ácido glutâmico na posição 270;

[0312] (2) uma treonina na posição 392, uma leucina na posição 396, um ácido glutâmico na posição 270, e uma leucina na posição 243;

[0313] (3) uma histidina na posição 419, uma leucina na posição 396, e um ácido glutâmico na posição 270;

[0314] (4) uma histidina na posição 419, uma leucina na posição 396, um ácido glutâmico na posição 270, e uma leucina na posição 243;

		[0315]	(5)	uma	alanina na posição 240, uma
leucina	na	posição	396,	e um	ácido glutâmico na posição 270;
		[0316]	(6)	uma	lisina na posição 255 e uma
leucina	na	posição	3 96;
		[0317]	(7)	umaa	lisina na posição 255, uma
leucina	na	posição	396,	e um	ácido glutâmico na posição 270;

117/215 [0318] (8) uma lisina na posição 255, uma leucina na posição 396, um ácido glutâmico na posição 270, e uma lisina na posição 300;

[0319] (9) uma lisina na posição 255, uma leucina na posição 396, um ácido glutâmico na posição 270, e uma glicina na posição 292;

[0320] (10) uma lisina na posição 255, uma leucina na posição 396, um ácido glutâmico na posição 270, e

uma leucina na posição	243;
[0321] (11	) um	ácido	glutâmico na posição	370,
uma leucina na posição	396,	e um	ácido glutâmico na posição
270;
[0322] (12	) um	ácido	glutâmico na posição	270,

um ácido aspártico na posição 316, e uma glicina na posição

416;	[0323]	(13)	uma	leucina	na posição 243, uma
prolina	na posição	292,	uma	isoleucina	na posição 305, e uma
leucina	na posição	396;
	[0324]	(14)	uma	leucina na	posição 243, um ácido

glutâmico na posição 270, uma asparagina na posição 392 e uma leucina na posição 396;

[0325] (15) uma leucina na posição 243, uma leucina na posição 255, um ácido glutâmico na posição 270 e uma leucina na posição 396;

[0326] (16) uma glutamina na posição 297;

[0327] ou [0328] (17) qualquer combinação das substituições (1) a (16) anteriores.

[0329]

Em algumas realizações, as moléculas da invenção ainda compreendem um ou mais locais de glicosilação,

118/215 de modo que uma ou mais porções de carboidrato sejam covalentemente anexadas à molécula. Preferencialmente, as moléculas da invenção com um ou mais locais de glicosilação e/ou uma ou mais modificações na região Fc conferem ou têm uma função efetora mediada por anticorpo aumentado, por exemplo, atividade ADCC aumentada, comparado a um anticorpo principal. Em algumas realizações, a invenção ainda compreende moléculas compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos que são direta ou indiretamente conhecidas por interagir com uma porção de carboidrato do anticorpo, incluindo, mas não limitado a, aminoácidos nas posições 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299, e 301. Aminoácidos que direta ou indiretamente interagem com uma porção de carboidrato de um anticorpo são conhecidos na matéria, ver, por exemplo, Jefferis et al. , 1995 Immunology Letters, 44:111-7, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[0330] Em outra realização, a invenção engloba moléculas que foram modificadas pela introdução de um ou mais locais de glicosilação em um ou mais locais das moléculas, preferencialmente sem alterar a funcionalidade das moléculas, por exemplo, ligando a atividade ao antígeno alvo ou FcyR. Os locais de glicosilação podem ser introduzidos na região variável e/ou constante das moléculas da invenção. Conforme usado aqui, locais de glicosilação” incluem qualquer sequência de aminoácido em um anticorpo ao qual um oligossacarídeo (isto é, carboidratos contendo dois ou mais açúcares simples ligados juntos) se anexará específica e covalentemente. As cadeias laterais de oligossacarídeo são tipicamente ligadas à coluna vertebral através de ligações de

119/215

N ou O. A glicosilação ligada ao N se refere à fixação de uma porção de oligossacarídeo à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. A glicosilação ligada ao O se refere à fixação de uma porção de oligossacarídeo a um hidroxiaminoácido, por exemplo, serina, treonina. As moléculas da invenção podem compreender um ou mais locais de glicosilação, incluindo locais de glicosilação ligados ao N e ligados ao O. Qualquer local de glicosilação para glicosilação ligada ao N ou ligada ao O conhecido na matéria pode ser usado de acordo com a invenção imediata. Um local de glicosilação exemplar ligado ao N que é de acordo com os da presente invenção é a sequência de aminoácido: Asn-X-Thr/Ser, em que X pode ser qualquer aminoácido e Thr/Ser indicada uma treonina ou uma serina. Tal local ou locais podem ser introduzidos em uma molécula da invenção usando métodos bem conhecidos na matéria ao quais essa invenção pertence (ver, por exemplo, MUTAGÊNESE IN VITRO, DNA RECOMBINANTE: UM CURSO RÁPIDO, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman e Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Um método exemplar para introduzir um local de glicosilação em uma molécula da invenção pode compreender: modificação ou mutação de uma sequência de aminoácido da molécula de modo que seja obtida a sequência desejada Asn-XThr/Ser.

[0331] Em algumas realizações, a invenção engloba métodos de modificação do conteúdo de carboidrato de uma molécula da invenção adicionando ou excluindo um local de glicosilação. Os métodos para modificar o conteúdo de carboidrato dos anticorpos são bem conhecidos na matéria e englobados dentro da invenção, ver, por exemplo, Patente

120/215

Norte-Americana n° 6.218.149; EP 0 359 096 B1; Publicação Norte-Americana n° US 2002/0028486; WO 03/035835; Publicação Norte-Americana n° 2003/0115614; Patente Norte-Americana n° 6.218.149; Patente Norte-Americana n° 6.472.511; todas as quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Em outras realizações, a invenção engloba métodos de modificação do conteúdo de carboidrato de uma molécula da invenção excluindo uma ou mais porções de carboidrato endógeno da molécula. Em uma realização específica, a invenção engloba a mudança do local de glicosilação da região Fc de um anticorpo, modificando as posições adjacentes para 297. Em uma realização específica, a invenção engloba modificar a posição 296 de modo que a posição 296 e não a posição 297 seja glicosilada.

[0332] A função efetora também pode ser modificada por técnicas tais como pela introdução de um ou mais resíduos de cisteína na região Fc, desta forma permitindo que ocorra a formação de ligação de dissulfeto intercadeia nessa região, resultando na geração de um anticorpo homodimérico que pode ter a capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada por complemento aumentada e ADCC (Caron, P.C. et al. (1992) Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies” J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity” J. Immunol. 148(9):2918-2922. Os anticorpos homodiméricos com atividade antitumor aumentada também podem ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais conforme descrito em Wolff, E.A. et al.

(1993) Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor

121/215

Activity In Nude Mice Cancer Research 53:2560-2565. Alternativamente, um anticorpo pode ser projetado, o qual tem regiões Fc duplas e podem, desta forma, ter lise complementar aumentada e capacidades de ADCC (Stevenson, G.T. et al. (1989) A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).

E. DART^TM (REAGENTE DE REDIRECIONAMENTO DE DUPLA

AFINIDADE) DE B7-H3 [0333] Conforme discutido acima, a presente invenção adicionalmente engloba moléculas de DART™ (reagente de redirecionamento de dupla afinidade) que compreendem pelo menos duas cadeias de polipeptídeo que formam pelo menos dois locais de ligação de epítopo, pelo menos um dos quais especificamente se une a B7-H3.

[0334] Em realizações preferidas, a primeira cadeia de polipeptídeo do DART^TM compreende:

[0335] (i) um domínio (A) compreendendo uma região de ligação de um domínio variável de cadeia leve de uma primeira imunoglobulina (VL1) específica para um epítopo (1) ;

[0336] (ii) um domínio (B) compreendendo uma região de ligação de um domínio variável de cadeia pesada de uma segunda imunoglobulina (VH2) específica para um epítopo (2); e [0337] (iii) um domínio (C).

[0338] A segunda cadeia de polipeptídeo de tal

DART^TM compreende:

[0339] (i) um domínio (D) compreendendo uma região de ligação de um domínio variável de cadeia leve da

122/215 segunda imunoglobulina (VL2) específica para epítopo (2);

[0340] (ii) um domínio (E) compreendendo uma região de ligação de um domínio variável de cadeia da primeira imunoglobulina (VH1) específica para epítopo (1); e [0341] (iii) um domínio (F).

[0342] Os domínios de DART^TM (A) e (B) não se associam um com o outro para formar um local de ligação de epítopo. Similarmente, os domínios de DART^TM (D) e (E) não se associam um com o outro para formar um local de ligação de epítopo. Em vez disso, os domínios de DART^TM (A) e (E) se associam para formar um local de ligação que se une ao epítopo (1); os ditos domínios de DART^TM (B) e (D) se associam para formar um local de ligação que se une ao dito epítopo (2). Os domínios (C) e (F) são covalentemente associados juntos.

[0343] Cada cadeia de polipeptídeo da molécula de DART^TM compreende um domínio VL e um domínio VH, os quais são covalentemente ligados de modo que domínios são restritos a partir da automontagem. A interação de duas das cadeias de polipeptídeo produzirá dois pareamentos VL-VH, formando dois locais de ligação de epítopo, isto é, uma molécula bivalente. Nem o domínio VH ou VL é restrito a qualquer posição dentro da cadeia de polipeptídeo, isto é, restrito ao terminal amino (N) ou carbóxi (C), nem são os domínios restritos em suas posições relativas de um para o outro, isto é, o domínio VL pode ser um N-terminal para o domínio VH e vice-versa. A única restrição é que a cadeia de polipeptídeo complementar esteja disponível a fim de formar DART^TMs funcionais. Onde os domínios VL e VH são derivados do mesmo anticorpo, as duas cadeias de polipeptídeo complementar podem ser idênticas. Por

123/215 exemplo, onde os domínios de ligação são derivados de um anticorpo específico para o epítopo A (isto é, o domínio de ligação é formado de uma interação VLa-VHa) , cada polipeptídeo compreenderá um VHA e um VLA. Homodimerização de duas cadeias de polipeptídeo do anticorpo resultará na formação de dois locais de ligação VLa-VHa, resultando em um anticorpo monoespecífico bivalente. Onde os domínios VL e VH são derivados de anticorpos específicos para diferentes antígenos, a formação de um DART^TM biespecífico funcional requer a interação de duas cadeias de polipeptídeo diferentes, isto é, a formação de um heterodímero. Por exemplo, para um DART^TM biespecífico, uma cadeia de polipeptídeo compreenderá um VLA e um VLB; homodimerização da dita cadeia resultará na formação de dois locais de ligação VLa-VHb, que sem ligação ou de ligação imprevisível. Em contraste, onde duas cadeias de polipeptídeo diferentes são livres para interagir, por exemplo, em um sistema de expressão recombinante, uma compreendendo um VLA e um VHB e a outra compreendendo um VLb e um VHa, dois locais de ligação diferentes formarão: VLa-VHa e VLb-VHb. Para todos os pares de cadeia de polipeptídeo de DART^TM, o possível desalinhamento ou desligamento de duas cadeias é uma possibilidade, isto é, interação dos domínios VL-VL ou VH-VH; entretanto, a purificação de diacorpos funcionais é facilmente gerenciada com base na imunoespecificidade do local de ligação devidamente dimerizado, usando qualquer afinidade com base no método conhecido na matéria ou exemplificado aqui, por exemplo, cromatografia de afinidade.

[0344] Uma ou mais das cadeias de polipeptídeo do DART^TM pode opcionalmente compreender um domínio Fc ou sua

124/215 porção (por exemplo, um domínio CH2, ou domínio CH3) . O domínio Fc ou sua porção pode ser derivado de qualquer isótipo ou alótipo de imunoglobulina incluindo, mas não limitado a, IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. Em realizações preferidas, o domínio Fc (ou sua porção) é derivado de IgG. Em realizações específicas, o isótipo IgG é IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 ou seu alótipo. Em uma realização, a molécula de diacorpo compreende um domínio Fc, Fc domínio que compreende um domínio CH2 e domínio CH3 independentemente selecionado de qualquer isótipo de imunoglobulina (isto é, um domínio Fc compreendendo o domínio CH2 derivado de IgG, e o domínio CH3 derivado de IgE, ou o domínio CH2 derivado de IgG1 e o domínio CH3 derivado de IgG2, etc.). O domínio Fc pode ser projetado em uma cadeia de polipeptídeo compreendendo a molécula de diacorpo da invenção em qualquer posição relativa a outros domínios ou porções da dita cadeia de polipeptídeo (por exemplo, the domínio Fc, ou sua porção pode ser cterminal para ambos os domínios VL e VH do polipeptídeo da cadeia; pode ser n-terminal para ambos os domínios VL e VH; ou pode ser N-terminal para um domínio e c-terminal para outro (isto é, entre dois domínios da cadeia de polipeptídeo)).

[0345] Os domínios Fc nas cadeias de polipeptídeo das moléculas de

DART^TM preferencialmente dimerizam, resultando na formação de uma molécula de DART^TM que exibe propriedades tipo imunoglobulina, por exemplo, interações

Fc-FcyR.

Fc compreendendo diacorpos pode ser dímeros, por exemplo, compreendidos de duas cadeias de polipeptídeo, cada compreendendo um domínio VH, um domínio VL e um domínio Fc. A dimerização das ditas cadeias de

125/215 polipeptídeo resulta em um DART^TM bivalente compreendendo um domínio Fc, embora com uma estrutura distinta daquela de um anticorpo bivalente não modificado. Tais moléculas de DART^TM exibirão fenótipos alterados com relação a uma imunoglobulina tipo selvagem, por exemplo, meia vida de soro alterada, propriedades de ligação, etc. Em outras realizações, moléculas de DART^TM compreendendo domínios Fc podem ser tetrâmeros. Tais tetrâmeros compreendem duas cadeias de polipeptídeo mais pesadas”, isto é, uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio VL, um VH e um Fc, e duas cadeias de polipeptídeo mais leves”, isto é, cadeia de polipeptídeo compreendendo um VL e um VH. As cadeias mais leves e mais pesadas interagem para formar um monômero, e os ditos monômeros interagem através de seus domínios Fc não pareados para formar uma molécula tipo Ig. Tal DART^TM tipo Ig é tetravalente e pode ser monoespecífico, biespecífico ou tetraespecífico.

[0346] A formação de uma molécula de diacorpo tetraespecífica conforme descrito acima requer a interação de quatro cadeias de polipeptídeo diferentes. Tais interações são difíceis para alcançar com eficiência dentro de um sistema de produção recombinante de célula simples, devido a muitas variáveis de despareamentos de cadeia potencial. Uma solução para aumentar a probabilidade de despareamento é projetar mutações tipo botões-em-furos” nos pares de cadeia de polipeptídeo desejados. Tais mutações favorecem a heterodimerização acima da homodimerização. Por exemplo, com respeito às interações Fc-Fc, uma substituição de aminoácido (preferencialmente, uma substituição com um aminoácido compreendendo um grupo lateral volumoso formando um botão”,

126/215 por exemplo, triptofano) pode ser introduzida no domínio CH2 ou CH3 de modo que a interferência estérica prevenirá a interação com um domínio similarmente mutado e obrigará o domínio mutado a parear com um domínio no qual uma mutação complementar, ou confortável tenha sido projetada, isto é, o furo” (por exemplo, uma substituição com glicina). Tais conjuntos de mutações podem ser projetados em qualquer par de polipeptídeos compreendendo a molécula de diacorpo, e ainda, projetados em qualquer porção das cadeias de polipeptídeos do dito par. Os métodos de engenharia de proteína para favorecer a heterodimerização acima da homodimerização são bem conhecidos na matéria, em particular com relação à engenharia de moléculas tipo imunoglobulina, e estão englobados aqui (ver, por exemplo, Ridgway et al. (1996) Knobs-Into-Holes Engineering Of Antibody CH3 Domain For Heacy Chain Heterodimerization, Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, J. Mol. Biol. 270: 26-35, e Xie et al. (2005) A New Format Of Biespecific Antiboy: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, J. Immunol. Methods 296:95101; cada qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0347] A invenção também engloba moléculas de diacorpos compreendendo domínios Fc variáveis ou Fc articulares variáveis (ou sua porção), domínio Fc variável que compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição, inserção ou exclusão) relativo a um domínio Fc tipo selvagem comparável ou domínio Fc articular (ou sua porção). Moléculas compreendendo domínios Fc

127/215 variáveis ou domínios Fc articulares (ou sua porção) (por exemplo, anticorpos) normalmente têm fenótipos alterados relativos às moléculas compreendendo domínios Fc tipo selvagem ou domínios Fc articulares ou suas porções. O fenótipo variável pode ser expresso conforme a meia-vida de soro alterada, estabilidade alterada, suscetibilidade alterada a enzimas celulares ou função efetora alterada conforme ensaiada em ensaio de pendente de macrófago ou dependente de NK. As modificações de domínio Fc identificadas como função efetora de alteração são descritas acima.

[0348] A presente invenção também engloba moléculas compreendendo um domínio articular. O domínio articular pode ser derivado de qualquer isótipo ou alótipo de imunoglobulina incluindo IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. Em realizações preferidas, o domínios articular é derivado de IgG, em que o isótipo de IgG é IgG1 , IgG2, IgG3 ou IgG4, ou seu alótipo. Os ditos domínios articulares podem ser projetados em uma cadeia de polipeptídeo compreendendo a molécula de diacorpo com um domínio Fc de modo que a molécula de diacorpo compreende um domínio Fc articular. Em certas realizações, o domínio Fc e articular são independentemente selecionados de qualquer isótipo de imunoglobulina conhecido na matéria ou exemplificados aqui. Em outras realizações, o domínio Fc e articular são separadamente por pelo menos outro domínio da cadeia de polipeptídeo, por exemplo, o domínio VL. Os domínios articulares, ou opcionalmente o domínio Fc articular, podem ser projetados em um polipeptídeo da invenção em qualquer posição relativa a outros domínios ou porções da dita cadeia de polipeptídeo. Em certas realizações, uma cadeia de

128/215 polipeptídeo da invenção compreende um domínio articular, domínio articular que está no C-terminal da cadeia de polipeptídeo, em que a dita cadeia de polipeptídeo não compreende um domínio Fc. Ainda em outras realizações, uma cadeia de polipeptídeo da invenção compreende um domínio Fc articular, domínio Fc articular que está no C-terminal da cadeia de polipeptídeo. Em outras realizações, uma cadeia de polipeptídeo da invenção compreende um domínio Fc articular, domínio Fc articular que está N-terminal da cadeia de polipeptídeo.

[0349] Cada domínio da cadeia de polipeptídeo do DART^TM, isto é, o domínio VL, VH e Fc pode ser separado por um ligante de peptídeo. O ligante de peptídeo pode ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 aminoácidos de comprimento. Em certas realizações, a sequência de ligante de aminoácido é GGGSGGGG (SEQ ID N°:52) codificada pela sequência de ácido nucleico ggaggcggat ccggaggcgg aggc (SEQ ID N°:53). As cadeias de polipeptídeo da molécula de DART^TM podem ser projetadas para compreender pelo menos um resíduo de cisteína que interagirá com um resíduo de cisteína de contraparte em uma segunda cadeia de polipeptídeo do DART^TM para formar uma ligação de dissulfeto intercadeia. Tais ligações de dissulfeto intercadeia servem para estabilizar a molécula de DART^TM, desta forma melhorando a expressão e recuperação nos sistemas recombinantes, resultando em uma formulação estável e consistente, e melhorando a estabilidade do produto isolado e/ou purificado in vivo. O resíduo de cisteína pode ser introduzido como um aminoácido simples ou como parte de uma sequência de aminoácido maior, por exemplo, um domínio articular, em qualquer porção da cadeia de polipeptídeo. Em

129/215 uma realização específica, o resíduo de cisteína pode ser projetado para ocorrer no C-terminal da cadeia de polipeptídeo. Em algumas realizações, o resíduo de cisteína é introduzido na cadeia de polipeptídeo dentro da sequência de aminoácido LGGC. Em uma realização específica, o C-terminal das cadeias de polipeptídeo compreendendo a molécula DART^TM da invenção compreende a sequência de aminoácido LGGC (SEQ ID N°:54). Em outra realização, o resíduo de cisteína é introduzido no polipeptídeo dentro de uma sequência de aminoácido compreendendo um domínio articular, por exemplo, EPKSCDKTHTCPP (SEQ ID N2:55) ou ESKYGPPCPS (SEQ ID N2:56). Em uma realização específica, o C-terminal de uma cadeia de polipeptídeo da molécula de DART^TM da invenção compreende a sequência de aminoácido de um domínio articular de IgG, por exemplo, SEQ ID N°:55 ou SEQ ID N°:56. Em outra realização, o C-terminal de uma cadeia de polipeptídeo de uma molécula de DART^TM da invenção compreende a sequência de aminoácido VEPKSC (SEQ ID N°:57), que pode ser codificada pela sequência de nucleotídeo gttgagccca aatcttgt (SEQ ID N°:58). Em outras realizações, o resíduo de cisteína é introduzido na cadeia de polipeptídeo dentro da sequência de aminoácido LGGCFNRGEC (SEQ ID N°:59), que pode ser codificada pela sequência de nucleotídeo ctgggaggct gcttcaacag gggagagtgt (SEQ ID N°:60). Em uma realização específica, o C-terminal de uma cadeia de polipeptídeo compreendendo o DART^TM da invenção compreende a sequência de aminoácido LGGCFNRGEC (SEQ ID N°:59). Ainda em outras realizações, o resíduo de cisteína é introduzido na cadeia de polipeptídeo dentro da sequência de aminoácido FNRGEC (SEQ ID N°:61), que pode ser codificada pela sequência de nucleotídeo ttcaacaggg gagagtgt (SEQ ID N°:62). Em uma

130/215 realização específica, o C-terminal de uma cadeia de polipeptídeo compreendendo o DART^TM da invenção compreende a sequência de aminoácido FNRGEC (SEQ ID N°: 61).

[0350] Em certas realizações, a molécula de diacorpo compreende pelo menos duas cadeias de polipeptídeo, cada uma que compreende uma sequência de aminoácido LGGC (SEQ ID N°:54) e são covalentemente ligadas pela ligação de dissulfeto entre os resíduos de cisteína nas sequências LGGC (SEQ ID N°:54). Em outra realização específica, a molécula de diacorpo compreende pelo menos duas cadeias de polipeptídeo, uma que compreende a sequência FNRGEC (SEQ ID N°:61) enquanto a outra compreende um domínio articular (contendo pelo menos um resíduo de cisteína), em que as ditas pelo menos duas cadeias de polipeptídeo são covalentemente ligadas por uma ligação de dissulfeto entre o resíduo de cisteína em FNRGEC (SEQ ID N°:61) e um resíduo de cisteína no domínio articular. Em aspectos particulares, o resíduo de cisteína responsável por uma ligação de dissulfeto localizada no domínio articular é Cys-128 (conforme numerado de acordo com Kabat EU; localizado no domínio articular de uma cadeia pesada de IgG intacta, não modificada) e o resíduo de cisteína de contraparte em SEQ ID N^o:23 é Cys-214 (conforme numerado de acordo com Kabat EU; localizado no C-terminal de uma cadeia leve de IgG intacta, não modificada) (Elkabetz et al. (2005) “Cysteines In CHI Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains” J. Biol. Chem. 280: 14402-14412). Ainda em outras realizações, o pelo menos um resíduo de cisteína é projetado para ocorrer no N-terminal da cadeia de aminoácido. Ainda em outras realizações, o pelo menos um resíduo de cisteína é projetado para ocorrer na porção do ligante da cadeia de

131/215 polipeptídeo da molécula de diacorpo. Ainda em realizações, o domínio VH ou VL é projetado para compreender pelo menos uma modificação de aminoácido com relação ao domínio VH ou VL parental de modo que a dita modificação de aminoácido compreende uma substituição de um aminoácido parental com cisteína.

[0351] Ainda em outro aspecto dessa realização, o domínio (C) da primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido VEPKSC (SEQ ID N°:57), derivada do domínio articular de uma IgG humana, e que pode ser codificada pela sequência de nucleotídeo gttgagccca aatcttgt (SEQ ID N°:58). Em outro aspecto dessa realização, o domínio (F) da segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido VEPKSC (SEQ ID N°:57). Em certos aspectos dessa realização, o domínio (C) da primeira cadeia de polipeptídeo compreende os 6 aminoácidos do C-terminal da cadeia leve kappa humana, FNRGEC (SEQ ID N°:61); e o domínio (F) da segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido VEPKSC (SEQ ID N°:57) ou um domínio articular. Em outros aspectos dessa realização, o domínio (F) da segunda cadeia de polipeptídeo compreende os 6 aminoácidos do Cterminal da cadeia leve kappa humana, FNRGEC (SEQ ID N°:61); e o domínio (C) da primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido VEPKSC (SEQ ID N°: 57) ou um domínio articular.

[0352] Conforme serão apreciados em vista do anterior, os polipeptídeos individuais de um DART^TM biespecífico podem formar duas espécies de homodímeros e uma espécie de heterodímero. Em uma realização da presente invenção, um polipeptídeo carregado pode ser adicionado ao C

132/215 terminal de um, ou mais preferencialmente, ambos os polipeptideos DART™. Ao selecionar os polipeptideos carregados da carga oposta para os polipeptideos individuais do DART™ biespecifico, a inclusão de tais polipeptideos carregados favorece a formação de heterodimeros e diminui a formação de homodimeros. Preferencialmente, um polipeptídeo positivamente carregado conterá um conteúdo substancial de arginina, glutamina, histidina e/ou lisina (ou misturas de tais aminoácidos) e um polipeptídeo negativamente carregado conterá um conteúdo substancial de aspartato ou glutamato (ou uma mistura de tais aminoácidos). Os polipeptideos positivamente carregados que contêm um conteúdo substancial de lisina e polipeptideos negativamente carregados que contêm um conteúdo substancial de glutamato são particularmente preferidos. A fim de maximizar a atração eletrostática entre tais polipeptideos opostamente carregados, é preferido empregar os polipeptideos capazes de assumir espontaneamente uma conformação helicoidal.

[0353] Assim, em uma realização preferida, uma bobina E positivamente carregada estará anexa a um dos polipeptideos que estão sendo usados para formar um DART™ biespecífico e uma bobina K negativamente carregada estará anexa ao segundo dos polipeptideos de DART™s. Uma bobina E particularmente preferida terá a sequência: (EVAALEK)4 [isto é (SEQ ID N2;63) EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK]. Uma bobina K particularmente preferida terá a sequência: (KVAALKE)4 [isto é (SEQ ID N2:64) KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE].

[0354] Um polipeptídeo de DART™ preferido que possui tal bobina E terá a sequência geral: [Domínio VL] — [GGGSGGGG]— [Domínio VH] - [ (EVAALEK) ₄] - GGGNS, onde VL é o

133/215 domínio de Ig leve variável de DART^TMs, GGGSGGGG é SEQ ID N°:52, VH é o domínio de LG pesado variável de DART^TMs, (EVAALEK)4 é SEQ ID N°:63, e GGGNS é SEQ ID N°:65. Um polipeptídeo de DART^TM preferido que possui tal Bobina K terá a sequência geral: [Domínio VL]— [GGGSGGGG]— [Domínio VH] — [(KVAALKE)4]— GGGNS, onde VL é o domínio de LG leve variável de DART^TMs, GGGSGGGG é SEQ ID N°:52, VH é o domínio de LG pesado variável de DART^TMs, (KVAALKE)4 é SEQ ID N£:64, e GGGNS é SEQ ID N^:::65.

[0355] Ainda em uma realização, as regiões FHC podem ser ligadas às bobinas E e/ou K dos DART^TMs de bobina E ou bobina K. Além disso, a separação entre as regiões Fc e o domínio VH de DART^TM de um DART^TM contendo Fc é desejável em casos em que um arranjo menos separado de tais domínios resulta em interação diminuída entre tais domínios e seus ligantes de ligação ou caso contrário interfere na montagem de DART^TM. Embora os separadores de qualquer sequência de aminoácido possam ser empregados, é desejável empregar os separadores que formem bobinas helicoidais, de modo a estender de forma máxima e projetar o domínio Fc para longe dos domínios variáveis. Porque os polipeptídeos enrolados descritos acima de carga oposta adicionalmente funcionam para promover a formação heterodimérica, tais moléculas são separadores particularmente preferidos. Tais moléculas de FcDART^TM contendo bonina proveem benefícios similares àqueles de Fc-DART^TMs, incluindo meia-vida de soro melhorada e recrutamento de função efetora. Os polipeptídeos da bobina E e bobina K descritos acima são particularmente preferidos para essa finalidade. Assim, em uma realização preferida, o DART^TM contendo Fc de bobina E terá a sequência general:

134/215 [Domínio VL] — [GGGSGGGG]—[Domínio VH]- [(EVAALEK)4]—GGG— Domínio Fc começando com D234 (numeração Kabat), onde VL é o domínio de LG leve variável de DART^TMs, GGGSGGGG é SEQ ID NP:52, VH é o domínio de LG pesado variável de DART^TMs e (EVAALEK)4 é SEQ ID N°:63. Similarmente, em uma realização preferida, o DART^TM contendo Fc de bobina K terá a sequência geral: [Domínio VL]— [GGGSGGGG]— [Domínio VH]— [(KVAALKE)4]— GGG—Domínio Fc começando com D234 (numeração Kabat), onde VL é o domínio de LG variável de DART^TMs, GGGSGGGG é SEQ ID N°:51, VH é o domínio de LG pesado variável de DART^TMs e (KVAALKE)4 é SEQ ID NP:64.

[0356] Conforme indicado acima, uma molécula de DART^TM contendo bobina ou uma molécula de DART^TM contendo Fc contendo bobina pode conter apenas um separador de bobina simples, ou ela pode conter mais que um de tais separadores (por exemplo, dois separadores, preferencialmente de carga oposta, dos quais um é ligado a cada um do domínio VH dos polipeptídeos de DART^TMs). Ao ligar a região Fc em tal(is) molécula (s) separadora(s), a habilidade em fazer versões bivalente, tetravalente, etc. das moléculas de Fc-DART^TM por troca de cadeia é aumentada. As moléculas de Fc-DART^TM podem assim ser produzidas que formem monômeros ou dímeros dependendo de se o Domínio Fc é ligado a um ou ambos os domínios VH de DART^TM.

1. VERSATILIDADE DAS MOLÉCULAS B7-H3 DE DART^TM [0357]

Os DART^TMs biespecíficos da invenção podem simultaneamente ligar dois epítopos distintos e separados. Em certas realizações, os epítopos são do mesmo antígeno. Em outras realizações, os epítopos são de antígenos diferentes. Em realizações preferidas, pelo menos um local de

135/215 ligação de epítopo é específico para um determinante expresso em uma célula efetora imune (por exemplo, CD3, CD 16, CD32, CD64, receptor de célula T, etc.), que é expressa em linfócitos T, células exterminadoras naturais (NK) ou outras células mononucleares. Em uma realização, a molécula de DART^TM se une ao determinante de célula efetora e também ativa a dita célula efetora. Neste sentido, as moléculas de DART^TM da invenção podem exibir funcionalidade tipo LG independente de se elas ainda compreendem um domínio Fc (por exemplo, conforme ensaiado em qualquer ensaio de função efetora conhecido na matéria ou exemplificado aqui (por exemplo, ensaio ADCC)). Em certas realizações, o DART^TM biespecífico da invenção liga tanto um antígeno de câncer em uma célula tumoral quanto um determinante de célula efetora enquanto ativa a dita célula. Em realizações alternativas, o

DART^TM biespecífico ou molécula de DART^TM da invenção pode inibir a ativação de um alvo, por exemplo, efetor, célula ao unir simultaneamente, e assim ligar, um receptor de ativação e inibitório na mesma célula (por exemplo, ligar ambos CD32A e CD32B, BCR e CD32B, ou IgERI e CD32B) conforme descrito acima (ver,

Seção do

Histórico). Ainda em um aspecto dessa realização, o DART^TM biespecífico pode exibir propriedades antivirais ligando simultaneamente dois epítopos neutralizantes em um vírus (por exemplo, epítopos

RSV;

epítopos WNV tais como

2. MOLÉCULAS

E16 e E53).

UNIVERSAIS B7-H3 DE DART^TM [0358]

Em uma realização, as moléculas de

DART^TM biespecífico da invenção podem ser construídas para compreender um domínio de ligação de epítopo que especificamente se une a

B7-H3 e um segundo domínio de

136/215 ligação de epítopo que especificamente se une a um hapteno, por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (também conhecidos como fluoroisotiocianato ou FITC) . Tal DART^TM serve como um adaptador universal (UDART™), capaz de coligar B7-H3 com moléculas que interagem com parceiros de ligação de conjugados de fluoresceína. Por exemplo, o braço reativo de FITC do DART^TM pode ser usado para ligar um anticorpo marcado com FITC que é ligado a um alvo não B7-H3 envolvido em agrupamento intercelular, recrutamento intercelular, recrutamento livre de célula, alvos múltiplos, etc. A versão Fc Fv/humano de camundongo quimérico da antifluoresceína MAb, 4420 pode ser empregada como uma fonte de domínios de CDR específico de FITC (Gruber, M. et al. (1994) Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli,” J. Immunol. 152(11):53685374).

3. MOLÉCULAS B7-H3 DE DART^TM DE CÉLULA-ALVO ESPECÍFICA [0359] As moléculas de DART^TM biespecífico da invenção oferecem oportunidades únicas para atingir os tipos de célula específicos. Por exemplo, o DART^TM biespecífico ou molécula de DART^TM pode ser projetado para compreender uma combinação de locais de ligação de epítopo que reconhecem um conjunto de antígenos únicos para uma célula alvo ou tipo de tecido. Adicionalmente, onde um ou ambos os antígenos individuais é/são bastante comuns separadamente em outro tecido e/ou tipos de célula, domínios de ligação de baixa afinidade podem ser usados para construir o DART^TM ou a molécula de DART^TM. Tais domínios de ligação de baixa afinidade serão incapazes de se unirem ao epítopo individual

137/215 ou antígeno com avidez suficiente para fins terapêuticos. Entretanto, onde ambos os epítopos ou antígenos estão presentes em uma célula alvo simples ou tecido, a avidez do DART^TM ou molécula de DART^TM para a célula ou tecido, com relação a uma célula ou tecido que expressa apenas um dos antígenos, será aumentada de modo que a dita célula ou tecido possa ser eficazmente direcionado pela invenção. Tal molécula biespecífica pode exibir ligação aumentada a um ou ambos de seus antígenos alvo em células que expressam ambos os ditos antígenos com relação a um DART^TM monoespecífico ou um anticorpo com uma especificidade para apenas um dos antígenos.

[0360] Por exemplo, os DART^TMs específico de B7H3 da presente invenção podem ser construídos para compreender um domínio que é um ligante de ligação para um receptor do Grupo Exterminador Natural 2D (NKG2D). O receptor de NKG2D é expresso em Células exterminadoras naturais humanas (e outro mamífero) (Bauer, S. et al. (1999) Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA,” Science 285(5428):727-729,· Jamieson, A.M. et al. (2002) The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1) :19-29) bem como em todas as células T CD8⁺ (Groh, V. et al. (2001) Costimulation Of CD8ae T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells” Nat. Immunol. 2(3):255-260, Jamieson, A.M. et al. (2002) The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1): 19-29). Tais ligantes de ligação, e particularmente aqueles que não são expressos em células normais, incluem a molécula de histocompatibilidade

138/215 (Η60) , o produto do gene 1 recém-induzível por ácido retinoico (RAE-1), e o transcrito 1 tipo proteína de ligação de UL16 de murino (MULT1) (Raulet D.H. (2003) Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands ,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) Altered NKG2D

Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells, Blood 106: 1711-1717).

Os ligantes adicionais reativos com NKG2D humano incluem as moléculas MICA e MICB relacionadas à cadeia de classe I MHC polimórficas (Diefenbach, A. et al. (1999) Natural Killer

Cells: Stress Out, Turn On, Tune In, Curr. Biol. 9(22):R851R8533; Bauer, S. et al. (1999) Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA, Science 285(5428):727-729,- Stephens, H.A. (2001) MICA AND MICB Genes: Can The Enigma Of Their Polymorphism Be Resolved? Trends Immunol. 22:378-385. A sequência de MICA é SEQ ID N-:66:

MGLGPVFLLL AGIFPFAPPG AAAEPHSLRY NLTVLSWDGS VQSGFLTEVH

LDGQPFLRÇD RQKCRAKPQG QWAEDVLGNK TWDRETRDLT GNGKDLRMTL

AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE IHEOTSTR5S QEFYYDGELF L50NLETKEW

TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTT1Y HAMHADCIjQE LRRYLKSGW LRRTVPPMVH VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHFVPSGKV LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FVIIIFYVRC CKKKT3AAEG PELV3LQVLD QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA [0361] A sequência de MICB é SEQ ID N2:67:

PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ FFLRYDRQKR RAKPQGQWAE DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCEIHED S3TRG3RHFY YDGELFLSQll LETQESTVPQ SSRAQTLAMN VTWFWKEDAH KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVWVICSEV SEGNITVTCR ASSFYPRWIT LTWRQDGVSL SHNTQQWGDV LPDGNGTYQT WVATRIRQGE EQRFTÇYMEH SGNHGTtíPVF SGKALVLQSQ RTDFFYVSAA MFCFVIIIIL CVFCCKKKTS AAEGP [0362]

Alternativamente, as moléculas de DART™

139/215 da presente invenção podem ser construídas para compreender um domínio que é um ligante de ligação para o receptor de célula T (TCR) ou para CD3 (o correceptor de célula T) . O TCR é expresso naturalmente por células T CD4 + ou CD8+, e permite tais células reconhecer peptideos antigênicos que são ligados e apresentados por proteínas MHC de classe I ou classe II de células de apresentação de antígeno. Reconhecimento de um complexo de pMHC (peptídeo-MHC) por um TCR inicia a propagação de uma resposta imune celular que leva à produção de citocinas e à lise da célula de apresentação de antígeno (ver, por exemplo, Armstrong, K.M. et al. (2008) “Conformational Changes And Flexibility In TCell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes, Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) “Selection Of

Human Antibody Fragmentos Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy, Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation, Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes, Am. J. Ther. 12(6) :534-550) . CD3 é o receptor que se une ao TCR (Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer, Immunology 129(2): 170-177; Guy, C.S. et al. (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR: CD 3 Complex, Immunol. Rev. 232(1):721 ; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity, Curr. Opin. Immunol. 21(6):648657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 2009 Jun 9) “Bispecific TCell Engaging Antibodies For Cancer Therapy, Cancer Res.

140/215

9(12):4941-4944,· Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) “T Cell Activation; Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders, L. et al. (2003) “Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309).

[0363] Ao construir tais moléculas de DART^TM para adicionalmente compreender pelo menos um domínio de ligação de epítopo capaz de se unir a, por exemplo, um receptor presente na superfície de uma célula alvo, tais moléculas de DART^TM serão moléculas de DART^TM e assim serão capazes de se ligar às células alvo e desta forma causar a exibição das células alvo do ligante de ligação para o receptor do Grupo Exterminador Natural 2D (NKG2D) ou para o TCR (seja qual for que estiver presente no DART^TM de ligação de célula alvo) (ver, por exemplo, Germain, C. et al. (2008) “Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein, Prot. Engineer. Design Selection 21(11) :665-672) . Tais DART^TMs podem ser usados para redirecionar qualquer célula alvo desejada em uma célula que seja alvo de lise de célula mediada por célula NK ou citotoxicidade mediada por célula T. Em uma realização, o domínio de ligação do epítopo do DART^TM capaz de se unir a um receptor presente na superfície de uma célula alvo é um epítopo que se une a um antígeno associado ao tumor de modo a redirecionar tais células cancerosas em substratos para a lise de célula mediada por célula NK ou citotoxicidade mediada por célula T. De interesse particular são antígenos associados a tumor que é um antígeno de câncer de mama, um antígeno de câncer de ovário, um antígeno de câncer de próstata, um antígeno de câncer cervical, um antígeno de carcinoma pancreático, um antígeno de câncer pulmonar, um

141/215 antígeno de câncer de bexiga, um antígeno de câncer de cólon, um antígeno câncer de testículo, um antígeno de câncer de glioblastoma, um antígeno associado com uma malignidade de célula B, um antígeno associado com mieloma múltiplo, um antígeno associado com linfoma de não Hodgkins, ou um antígeno associado com leucemia linfocítica crônica.

[0364] Os antígenos adequados associados ao tumor para tal uso incluem A33 (um antígeno de carcinoma colorretal; Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991998); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(l):6-9);

BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6) :577-84), beta-catenina (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9), CA125 (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2): 167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell

Ther. 40(4):139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8( 3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard,

X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD36 (Ge,

Y. 2005 Lab Hematol. l l(l):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48; Chu, P.G. et al.

2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2) :97-106); CD 103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA

142/215 (antígeno carcinoembriônico; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CTLA4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2) :206- 13); EGF-R (receptor do fator de crescimento epidérmico; Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32); Erb (ErbB1 ; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57) :8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5): 1325-38); GAGE (GAGE-1 ; GAGE-2;

Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1):123-8); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10): 1018-25); gp100 (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 2 9 ( 6):616-27); HER-2/neu (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); papilomavírus-E6 humano/papilomavírus-E7 humano (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; KSA (17-lA) (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); MAGE (MAGE- 1 ; MAGE-3; (Bodey, B.

2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6) :577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; MUC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); Nacetilglucosaminiltransferase (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6; 1473(1):21-34); p15 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); PSA (antígeno específico da próstata; Cracco, CM. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); receptor TNF (receptor TNF-α, receptor TNF-β; ou receptor TNF-γ; van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. l(4):327-64); ou receptor VEGF (O'Dwyer. P.J. 2006

143/215

Oncologist. 11(9):992-8).

[0365] Os antígenos adicionais associados ao tumor para tal uso (e publicações descrevendo anticorpos especificamente reativos para tais antígenos) incluem ADAM-9 (Publicação de Patente Norte-Americana n° 2006/0172350; Publicação do PCT n° WO 06/084075); ALCAM (Publicação do PCT n° WO 03/093443) ; Carboxipeptidase M (Publicação de Patente Norte-Americana n° 2006/0166291); CD46 (Patente NorteAmericana n° 7.148.038; Publicação do PCT n° WO 03/032814); Citoqueratina 8 (Publicação do PCT n° WO 03/024191); receptores de Efrina (e, em particular, EphA2 (Patente NorteAmericana n° 7.569.672; Publicação do PCT n° WO 06/084226); Integrina Alfa-V-Beta-6 (Publicação do PCT n° WO 03/087340); JAM-3 (Publicação do PCT n° WO 06/084078); KID3 (Publicação do PCT n° WO 05/028498) ; KID31 (Publicação do PCT n° WO 06/076584); LUCA-2 (Publicação de Patente Norte-Americana n° 2006/0172349; Publicação do PCT n° WO 06/083852); Oncostatina M (Receptor Beta de Oncostatina) (Patente Norte-Americana n° 7,572,896; Publicação do PCT n° WO 06/084092); PIPA (Patente Norte-Americana n° 7.405,061; Publicação do PCT n° WO 04/043239); ROR1 (Patente Norte-Americana n° 5.843.749); e o Receptor Transferrina (Patente Norte-Americana n° 7.572.895; Publicação do PCT n° WO 05/121179).

[0366] Também de interesse são os antígenos específicos para agentes infecciosos particulares, por exemplo, agentes virais incluindo, mas não limitado a, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), gripe, papiloma vírus humano (HPV), pé e boca (coxsackieviruses), o vírus da raiva, vírus simples da herpes (HSV), e os agentes causadores da gastroenterite, incluindo

144/215 rotavírus, adenovírus, calicivírus, astrovírus e vírus Norwalk; agentes bacterianos incluindo, mas não limitado a, E. coli, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Hemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis e Streptococcus pneumoniae, agente fúngicos e parasitas tais como Giardi.

[0367] Em algumas realizações, as moléculas da invenção são projetadas para compreender um padrão de glicosilação alterado ou uma glicoforma alterada com relação à porção comparável da molécula modelo. As glicoformas projetadas podem ser úteis para uma variedade de finalidades, incluindo, mas não limitado a, função efetora de aumento. As glicoformas projetadas podem ser geradas por qualquer método conhecido de alguém especialista na matéria, por exemplo, ao usar cepas de expressão variante ou projetada, por coexpressão com uma ou mais enzimas, por exemplo, Nacetilglicosaminiltransferase III DI (GnTI11), expressando um DART^TM da invenção em vários organismos ou linhagens de célula de vários organismos, ou modificando o(s) carboidrato(s) depois de o DART^TM ter sido expresso e purificado. Os métodos para gerar glicoformas projetadas são conhecidos na matéria, e incluem, mas não são limitados a, aqueles descritos em Umana et al. (1999) “Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgG1 Com Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al. (2001) “Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII,”

145/215

Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al. (2002) “Lack Of Fucose On Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al. (2003) “The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgG1 Complex-Type Oligosaccharides Show The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity,” J Biol Chem 278:3466-3473) US 6.602.684; USSN 10/277.370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnologia Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, NJ); tecnologia de engenharia de glicosilação GlycoMAb^TM (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland); cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Ver, por exemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al. (2004) “Fucose Depletion From Human IgG1 Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between IgG1 E FcGammaRIIIA, JMB, 336: 1239-49 cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[0368] A invenção ainda engloba incorporação de aminoácidos não naturais para gerar os DART^TMs da invenção. Tais métodos são conhecidos para aqueles técnicos no assunto tais como aqueles que usam a maquinaria bissintética natural para permitir a incorporação de todos os aminoácidos não naturais em proteínas, ver, por exemplo, Wang et al. (2002) “Expanding The Genetic Code, “ Chem. Comm. 1:1-11; Wang et al. (2001) “Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli, “ Science, 292: 498-500; van Hest et al. (2001) “Protein-Based Materials, Toward A New Level Of Structural Control,” Chem.

146/215

Comm. 19:1897-1904, cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Estratégias alternativas focam em suas enzimas responsáveis pela biossíntese de amino aciltRNA, ver, por exemplo, Tang et al. (2001) “Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host, J. Am. Chem. Soc. 123(44):11089-11090, Kiick et al. (2001) “Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli, FEBS Lett. 502(12):25-30, cada qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em algumas realizações, a invenção engloba métodos de modificação de um domínio VL, VH ou Fc de uma molécula da invenção adicionando ou excluindo um local de glicosilação. Os métodos para modificar o carboidrato de proteínas são bem conhecidos na matéria e englobam a invenção, ver, por exemplo, Patente Norte-Americana No. 6.218.149, EP 0 359 096 B1; Publicação Norte-Americana n° US 2002/0028486, WO 03/035835; Publicação Norte-Americana n° 2003/0115614; Patente Norte-Americana No. 6.218.149; Patente Norte-Americana No. 6.472.511; todas as quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

VIII. MÉTODOS DE USO DE MODULADORES DE B7-H3 E ANTICORPOS ANTI-B7-H3 PARA FINS TERAPÊUTICOS [0369] Os anticorpos monoclonais para B7-H3 podem ser usados para fins terapêuticos em indivíduos com câncer ou outras doenças. A terapia com anticorpos anti-B7-H3 pode envolver formação de ambos os complexos in vitro e in vivo como descrito acima. Em uma realização, o anticorpo monoclonal anti-B7-H3 pode se unir a e reduzir a proliferação de células cancerosas. Entende-se que o anticorpo é

147/215 administrado em uma concentração que promove ligação em condições fisiológicas (por exemplo, in vivo). Em outra realização, os anticorpos monoclonais para B7-H3 podem ser usados para imunoterapia direcionada às células cancerosas de tecidos diferentes com cólon, pulmão, mama, próstata, ovário, pâncreas, rim e outros tipos de câncer como sarcoma. Em outra realização, o anticorpo monoclonal anti-B7-H3 sozinho pode ligar e reduzir a divisão de células na célula cancerosa. Em outra realização, anticorpo monoclonal anti-B7-H3 pode ligar as células cancerosas e retardar o desenvolvimento de metástases. Em ainda outra realização, um indivíduo com câncer recebe tratamento paliativo com anticorpo anti-B7-H3. 0 tratamento paliativo de um indivíduo com câncer envolve tratar ou diminuir os sintomas adversos da doença, ou sintomas iatrogênicos resultantes de outros tratamentos dados para a doença sem afetar diretamente o progresso do câncer. Isto inclui tratamentos para alívio de dor, suporte nutricional, problemas sexuais, sofrimento psicológico, depressão, fadiga, distúrbios psiquiátricos, náusea, vômito, etc.

[0370] Em tais situações, o anticorpo anti-B7-H3 pode ser administrado com agentes que intensificam ou direcionam uma resposta imune do próprio indivíduo, como um agente que fortalece ADCC.

[0371] Ainda em outra realização, o anticorpo anti-B7-H3 pode ser conjugado ou associado com uma molécula radioativa, toxina (por exemplo, caliqueamicina), molécula quimioterápica, lipossomas ou outros veículos contendo compostos quimioterápicos e administrados para um indivíduo com necessidade de tal tratamento para alvejar esses

148/215 compostos na célula cancerosa contendo o antígeno reconhecido pelo anticorpo e desse modo eliminar células cancerosas ou doentes. Sem ser limitado a qualquer teoria particular, o anticorpo anti-B7-H3 é internalizado pela célula portando B7H3 em sua superfície, conjugada para a célula dessa maneira distribuindo a porção para induzir o efeito terapêutico. Em ainda outra realização, uma terapia adjuvante o anticorpo pode ser empregado como cirúrgica de na hora da remoção um câncer expressando o desenvolvimento da antígeno a fim metástase. O anticorpo de retardar pode também ser administrado antes indivíduo com um da cirurgia (terapia neoadjuvante) em tumor expressando o antígeno a fim um de diminuir o tamanho do tumor e dessa maneira possibilitar ou simplificar a cirurgia, poupar tecido durante a cirurgia, e /ou diminuir o desfiguramento resultante.

[0372] Dosar o ciclo da célula é considerado na prática desta invenção. Em tais realizações, um agente quimioterápico é usado para sincronizar o ciclo da célula do tumor ou outras células doentes alvo em um estágio prédeterminado. Subsequentemente, a administração do anticorpo anti-B7-H3 desta invenção (sozinho ou em uma porção terapêutica adicional) é feita. Em realizações alternativas, um anticorpo anti-B7-H3 é usado para sincronizar o ciclo da célula e reduzir a divisão das células antes da administração de uma segunda fase de tratamento; a segunda fase pode ser a administração de um anticorpo anti-B7-H3 e/ou uma porção terapêutica adicional.

[0373] Os agentes quimioterápicos incluem moléculas radioativas, toxinas, também referidas como citotoxinas ou agentes citotóxicos, que inclui qualquer

149/215 agente que seja prejudicial para a viabilidade de células cancerosas, agentes e lipossomas ou outras vesículas contendo compostos quimioterápicos. Exemplos de agentes quimioterápicos apropriados incluem, mas não são limitados a, 1-deidrotestosterona, 5-fluorouracil decarbazina, 6 mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleucina, agentes alquilantes, alopurinol de sódio, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos, cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), diaminodicloroplatina, antraciclinas, antibióticos, antimetabólitos, asparaginase, BCG vivo (intravesicular), fosfato de sódio de betametasona e acetato de betametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, bussulfano, leucouorina de cálcio, caliqueamicina, capecitabina, carboplatina, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), Clorambucil, Cisplatina, Cladribina, Colcicina, estrógenos conjugados, Ciclofosfamida,

Ciclotosfamida,

Citarabina,

Citarabina, citocalasina

B,

Citoxano,

Dacarbazina,

Dactinomicina, dactinomicina (anteriormente actinomicina) daunirrubicina

HCL, citrato de daunorrucbicina, denileucina diftitox,

Dexrazoxano,

Dibromomanitol, diidroxiantracindiona,

Docetaxel, dolasetromesilato, doxorrubicina HCL, dronabinol, e. coli Lasparaginase, emetina, epoetina alfa,

Erwinia L-asparaginase, estrógenos esterificados, estradiol, fosfato de sódio de estramustina, brometo de etidio, etinil estradiol, etidronato, fator de citrororo etoposídeo, fosfato de etoposídeo, filgrastim, floxuridina, fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracil, flutamida, ácido folínico, gemcitabina

HCL, glicocorticoide, acetato de goserelina,

150/215 gramicidina D, granisetron HCL, hidroxiureia, idarrubicina HCL, ifosfamida, interferona alfa-2b, irinotecan HCL, letrozol, leucovorina de cálcio, acetato de leuprolídeo, levamisol HCL, lidocaína, lomustina, maitansinoide, mecloretamina HCL, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalan HCL, mercaptipurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreotídeo, ondansetrona HCL, paclitaxel, pamidronato de dissódio, pentostatina, pilocarpina HCL, plimicina, polifeprosano 20 (com implante de carmustina), porfimer de sódio, procaína, procarbazina HCL, propanolol, rituximabe, sargramostim, estreptozotocina, tamoxifeno, taxol, teniposídeo, tenoposídeo, testolactona, tetracaína, tioepa clorambucila, tioguanina, tiotepa, topotecan HCL, citrato de toremifeno, trastuzumabe, tretinoina, valrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, e tartarato de vinorelbina.

[0374] Em uma realização preferida, a citotoxina é especialmente eficaz em dividir ou rapidamente dividir células, de tal maneira que não dividir as células são relativamente liberadas de efeitos tóxicos.

[0375] Os anticorpos da invenção podem ser internalizados dentro das células de carcinoma ou doentes às quais eles se ligam e são, desta maneira, particularmente úteis para aplicações terapêuticas, por exemplo, distribuição nas toxinas das células que necessitam ser internalizadas por suas atividades adversas. Exemplos de tais toxinas incluem, mas não são limitados a, saporina, caliqueamicina, auristatina, e maitansinoide.

151/215 [0376] Os anticorpos ou polipeptídeos da invenção podem ser associados (incluindo conjugados ou ligados) a uma molécula radioativa, uma toxina, ou outros agentes terapêuticos, ou a lipossomas ou outras vesículas contendo agentes terapêuticos covalentemente ou não covalentemente, diretamente ou indiretamente. O anticorpo pode ser ligado a uma molécula radioativa, a toxina, ou a molécula quimioterapêutica em qualquer lugar ao longo do anticorpo desde que o anticorpo seja capaz de se unir ao seu alvo B7-H3.

[0377] Uma toxina ou um agente quimioterápico pode ser administrado concomitantemente com (antes, depois, ou durante a administração), ou acoplado (por exemplo, covalentemente ligado) a um anticorpo monoclonal apropriado diretamente ou indiretamente (por exemplo, através de um grupo ligante, ou, alternativamente, através de uma molécula de ligação com locais de acoplamento apropriados, como uma molécula de plataforma como descrito na Patente NorteAmericana n° 5.552.391). A toxina e o agente quimioterápico da presente invenção podem ser acoplados diretamente às proteínas alvo particulares usando métodos conhecidos na matéria. Por exemplo, uma reação direta entre um agente e um anticorpo é possível quando cada um possui um substituinte capaz de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleofílico, como um grupo amino ou sulfidrila, como um pode ser capaz de reagir com um grupo contendo carbonila, como um anidrido ou um ácido haleto, ou com um grupo alquila contendo um bom grupo de partida (por exemplo, um haleto) no outro.

152/215 [0378] Os anticorpos ou polipeptídeos podem também ser ligados a um agente quimioterápico através de um microveículo. O termo microveículo se refere a uma partícula biodegradável ou não biodegradável que é insolúvel na água e que tem um tamanho de menos do que cerca de 150 pm, 12 0 pm ou 100 pm em tamanho, mais comumente menos que cerca de 50 a 60 pm, preferivelmente menos do que cerca de 10, 5, 2,5, 2 ou 1,5 pm. Os microveículos incluem nanoveículos, que são microveículos tendo um tamanho de menos do que cerca de 1 pm, preferivelmente menos do que cerca de 500 nm. Tais partículas são conhecidas na matéria. Os microveículos de fase sólida podem ser partículas formadas de polímeros biocompatíveis de ocorrência natural, polímeros sintéticos ou copolímeros sintéticos, que podem incluir ou excluir microveículos formados de agarose ou agarose de ligação cruzada, como também outros materiais biodegradáveis conhecidos na matéria.

Os microveículos biodegradáveis de fase sólida podem ser formados de polímeros que poli(láctico), são ácido degradáveis (por poli(glicólico) e exemplo, ácido copolímeros dos mesmos) ou que causam erosão (por exemplo, poli(ortoésteres), como 3,9-dietilideno-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecano (DETOSU) ou poli(anidridos), como poli(anidridos) de ácido sebácio) sob condições fisiológicas mamíferas.Os microveículos podem também ser de fase líquida (por exemplo, óleo ou baseado em lipídeo), como lipossomas, iscomas (complexos de estimulação de imunidade, que são complexos estáveis de colesterol, e fosfolipídeo, saponina adjuvante ativa) sem antígeno, ou gotículas ou moléculas encontradas em emulsões de óleo em água ou água em óleo, providas de

153/215 microveículos de fase líquida são biodegradáveis. Os microveículos de fase líquida biodegradáveis tipicamente incorporam um óleo biodegradável, um número dos quais são conhecidos na matéria, incluindo esqualeno e óleos vegetais. Os microveículos são tipicamente esféricos na forma, mas microveículos que se desviam da forma esférica são também aceitáveis (por exemplo, elipsoide, formato de roda, etc.). Devido a sua natureza insolúvel (com respeito à água), os microveículos são soluções filtráveis da água e baseadas na água (aquosas).

[0379] O anticorpo ou polipeptídeo conjugados da presente invenção podem incluir um ligante bifuncional que contém ambos, um grupo capaz de se acoplar a um agente tóxico ou agente quimioterápico e um grupo capaz de se acoplar a um anticorpo. Um ligante pode funcionar como um espaçador para distanciar um anticorpo de um agente a fim de evitar interferência com as capacidades de ligação. Um ligante pode ser clivável ou não clivável. Um ligante também serve para aumentar a reatividade química de um substituinte ou de um agente ou um anticorpo, e desse modo aumentar a eficiência de acoplamento. Um aumento em reatividade química pode também facilitar o uso de agentes, ou grupos funcionais em agentes, que de outra maneira não seria possível. O ligante bifuncional pode ser acoplado ao anticorpo por meios que são

conhecidos	na técnica. Por exemplo, um ligante contendo uma
porção de	éter ativo, como um éster N-hidroxossuccinimida,
pode ser	usado para acoplar aos resíduos de lisina no

anticorpo através de uma ligação de amida. Em outro exemplo, um ligante contendo uma amina nucleofílica ou resíduo de hidrazina pode ser acoplado a grupos aldeído produzidos pela

154/215 oxidação glicolítica de resíduos de carboidrato de anticorpo. Em adição a esses métodos diretos de acoplamento, o ligante pode ser indiretamente acoplado ao anticorpo por meio de um veículo intermediário como um aminodextrano. Nessas realizações o ligante modificado é através de lisina, carboidrato, ou um veículo intermediário. Em uma realização, o ligante é acoplado sitio- seletivamente para libertar resíduos de tiol na proteína. Porções que são apropriadas para acoplamento seletivo aos grupos tiol em proteínas são bem conhecidas na técnica. Exemplos incluem compostos de dissulfito, compostos de a-halocarbonila e a-halocarboxila, e maleimidas. Quando uma função de amina nucleofílica está presente na mesma molécula como um grupo α-halo carbonila ou carboxila, existe o potencial para ciclização ocorrer através de alquilação intramolecular da amina. Métodos para prevenir esse problema são bem conhecidos da pessoa de habilidade comum na técnica, por exemplo, através da preparação de moléculas em que as funções de amina e α-halo são separadas por grupos inflexíveis, como grupos arila ou transalcenos, que fazem a indesejável ciclização estereoquimicamente desfavorável. Ver, por exemplo, Patente Norte Americana No. 6.441.163 para preparação de conjugados de maitansinoides e anticorpo através de uma porção de dissulfeto.

[0380] Um dos ligantes cliváveis que podem ser usados para a preparação de conjugados de anticorpo-fármaco é um ligante de ácido instável baseado em ácido cis-aconítico que tira vantagem do ambiente acídico de diferentes compartimentos intracelulares como os endossomas encontrados durante a endocitose mediada por receptor e as lipossomas.

155/215

Ver, por exemplo, Shen, W.C. et al. (1981) (cis-Aconityl

Spacer Between Daunomycin And Macromolecular Carriers: A

Model Of pH-Sensitive Linkage Releasing

Drug From A

Lysosomotropic

Conjugado” Biochem. Biophys.

Res. Comtnun.

102:1048-1054 (1981)) para a preparação de conjugados de daunorrubicina com veículos macromoleculares; Yang et al (1988) Pharmacokinetics And

Mechanism Of Action Of

Doxorubicin-Antibody monoclonal

9.2.27 Conjugate Directed

To

A Human Melanoma Proteoglycan”

J. Natl. Cane. Inst. 80:11541159) para a preparação de conjugados de daunorubicina para um anticorpo anti-melanoma; Dillman et al. (1988) (^Superiority Of An Acid-Labile Daunorubicin-Antibody monoclonal Immunoconjugate Compared To Free Drug” Câncer Res. 48:6097-6102) para usar um ligante ácido-instável em uma forma similar para preparar conjugados de daunorubicina com um anticorpo de anti- célula T; e Trouet et al. (1982) A Covalent Linkage Between Daunorubicin And Proteínas That Is Stabela In Serum And Reversible By Lysosomal Hydrolases, As Required For A Lysosomotropic Drug-Carrier Conjugate: In Vitro And In Vivo Studies” Proc. Natl. Acad. Sci. (E.U.A.) 79:626-629) para ligar daunorubicina a um anticorpo através de um braço espaçador de peptídeo.

[0381] Um anticorpo (ou polipeptídeo) desta invenção pode ser conjugado (ligado) a uma molécula radioativa ou toxina por qualquer método conhecido na técnica. Para uma discussão de métodos para anticorpo marcado radioativamente (ver, Cancer Therapy with Monoclonal Antibodies,

D.M. Goldenberg (Ed.) CRC Press, Boca Raton, 1995). Toxinas apropriadas incluem taxanos, maitansinóides, auristatinas (por exemplo, monometil auristatina (MMAE), monometil

156/215 auristatina F (MMAF), auristatina E (AE), etc) (como aquelas descritas nas Patentes Norte Americanas Nos. 5.208.020;

5.416.064; 6.333.410; 6.340.701; 6.372.738; 6.436.931;

6.441.163; 6.596.757; 7.276.497; 7.585.857; ou 7.851.432), caliqueamicina, antraciclinas (por exemplo, doxorrubicina),

CC-1065 análogo, docetaxel,;

catepsina B ou E;

ricina, gelonina, Pseudomonas exotoxina, difteria toxina, e RNase; tiuxetano ou radioisótopo tóxico (como ⁹⁰Y; ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, i88Re, ²¹¹At,²¹²Bi,²¹³Bi, ²²⁵Ac, etc.).

[0382] Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado a um segundo anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado como descrito na Patente Norte-Americana n° 4.676.980. A formação de anticorpos reticulados pode alvejar o sistema imune para tipos de células específicos, por exemplo, células doentes ou de câncer expressando B7-H3.

[0383] Esta invenção também provê métodos de retardar o desenvolvimento de metástases em um indivíduo com câncer (incluindo, mas entre outros, câncer de próstata, pulmão, ou rim) usando um anticorpo anti-B7-H3 ou outras realizações que ligam à B7-H3 em combinação com um agente quimioterápico, ou ligadas a um agente quimioterápico. Em algumas realizações, o anticorpo é uma forma humanizada ou quimérica de um anticorpo anti-B7-H3 não humano.

[0384] Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser empregado como terapia adjuvante na ocasião da remoção cirúrgica de um câncer expressando o antígeno a fim de retardar o desenvolvimento de metástases. O anticorpo ou anticorpo associado com um agente quimioterápico pode também ser administrado antes da cirurgia (terapia neoadjuvante) em um indivíduo com um tumor expressando o antígeno a fim de

157/215 diminuir o tamanho do tumor e dessa maneira possibilitar ou simplificar a cirurgia, poupar tecido durante a cirurgia, e /ou diminuir o desfiguramento resultante.

[0385] Em ainda outra realização, quaisquer uma das composições de ligação B7-H3 descritas aqui podem ligar a B7-H3-expressando células cancerosas e induzir uma resposta ativa imune contra as células cancerosas expressando B7-H3. Em alguns casos, a resposta ativa imune pode causar a morte das células cancerosas (por exemplo, ligação de anticorpo às células cancerosas induzindo a morte de células apoptóticas), ou inibir o crescimento (por exemplo, bloquear a progressão do ciclo das células) das células cancerosas. Em outros casos, qualquer um dos novos anticorpos descritos aqui podem se ligar a células cancerosas e anticorpo dependente de citotoxicidade celular (ADCC) podem eliminar células cancerosas às quais o anti-B7-H3 se liga. Por conseguinte, a invenção provê métodos de estimular uma resposta imune compreendendo administrar qualquer uma das composições descritas aqui.

[0386] Em alguns casos, a ligação de anticorpo pode também ativar ambas as resposta celular e tumoral e recrutar mais células exterminadoras naturais ou produção aumentada de citocinas (por exemplo, IL-2, IFN-gamma, IL-12, TNF-alfa, TNF-beta, etc.) que ainda ativam um sistema imune do indivíduo para destruir as células cancerosas. Em ainda outra realização, o anticorpo anti-B7-H3s pode se ligar às células cancerosas, e macrófagos ou outra célula fagocítica podem opsonizar as células cancerosas.

[0387] Várias formulações de anticorpos anti-B7H3s ou fragmentos dos mesmos podem ser usadas para

158/215 administração. Em algumas realizações, o anticorpo anti-B7H3s ou fragmentos do mesmo podem ser administrados puros. Em adição ao agente farmacologicamente ativo, as composições da presente invenção podem conter veículos apropriados farmaceuticamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares que são bem conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz ou que facilita o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente para distribuição para o local de ação. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência, ou atuar como um diluente. Excipientes apropriados incluem, mas não são limitados a agentes de estabilização, agentes umidificantes e emulsificantes, sais para variar a osmolaridade, agentes encapsulantes, tampões, e intensificadores de penetração na pele.

[0388] Formulações apropriadas para administração parenteral incluem soluções dos compostos ativos na forma solúvel na água, por exemplo, sais solúveis na água. Em adição, suspensões dos compostos ativos como apropriado para suspensões de injeção oleosa podem ser administrados. Solventes ou veículos lipofílicos apropriados incluem óleos graxos, por exemplo, óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintético, por exemplo, etil oleato ou triglicerídeos. Suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão e incluem, por exemplo, carboximetil celulose de sódio, sorbitol, e/ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode

159/215 também conter estabilizadores. Lipossomas podem também ser usados para encapsular o agente para distribuição na célula.

[0389] A formulação farmacêutica para administração sistêmica, de acordo com a invenção pode ser formulada para administração enteral, parenteral ou tópica. Na verdade, todos os três tipos de formulação podem ser usados simultaneamente para realizar administração sistêmica do ingrediente ativo. Excipientes como também formulações para distribuição parenteral e não parenteral de fármacos são estabelecidas em remington: the Science And Practice Of Pharmacy, 21^a Edição, Lippincott Williams & Wilkins Publishing (2005). Formulações apropriadas para administração oral incluem cápsulas de gelatina dura ou mole, pílulas, comprimidos, incluindo comprimidos revestidos, elixires, suspensões, xaropes ou inalações e formas de liberação controlada dos mesmos. Geralmente, esses agentes são formulados para administração por injeção {por exemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc.), embora outras formas de administração (por exemplo, oral, mucosal, etc) podem ser também usadas. Por conseguinte, os anticorpos anti-B7-H3 são preferivelmente combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis como solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, e similares.

[0390] 0 regime de dosagem particular, isto é, dose, horário e repetição, dependerá do indivíduo particular e do histórico médico daquele indivíduo. Geralmente, uma dose de pelo menos cerca de 100 pg/kg do peso corporal, mais preferivelmente pelo menos cerca de 250 pg/kg do peso corporal, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 750 pg/kg do peso corporal, ainda mais preferivelmente pelo

160/215 menos cerca de 3 mg/kg do peso corporal, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 5 mg/kg do peso corporal, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 mg/kg do peso corporal é administrado.

[0391] Considerações empíricas, como a média de vida, geralmente contribuirão para a determinação da dosagem. Anticorpos, que são compatíveis com o sistema imune humano, como anticorpos humanizados ou anticorpos totalmente humanos, podem ser usados para prolongar a média de vida do anticorpo e para prevenir o anticorpo de ser atacado pelo sistema imune do hospedeiro. A frequência da administração pode ser determinada e ajustada durante o curso da terapia, e é baseada na redução do número de células cancerosas, mantendo a redução de células cancerosas, reduzindo a proliferação de células cancerosas, ou retardando o desenvolvimento de metástase. Alternativamente, formulações de liberação contínua sustentada do anticorpo anti-B7-H3s podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para realização de liberação sustentada são conhecidos na técnica.

[0392] Em uma realização, dosagens para anticorpos anti-B7-H3 podem ser determinadas empiricamente em indivíduos que receberam uma ou mais administrações. Indivíduos recebem dosagens aumentadas de um anticorpo antiB7-H3. Para acessar a eficácia do anticorpo anti-B7-H3s, um marcador de estado de doença de câncer específica pode ser seguido. Esses incluem medições diretas do tamanho do tumor através de apalpar ou observação visual, medições indiretas do tamanho do tumor por raio X ou outras técnicas de formação de imagem; um melhoramento como acessado por biópsia direta do tumor e exame microscópico da amostra do

161/215 tumor; a medição de um marcador indireto do tumor (por exemplo, PSA para câncer de próstata), uma diminuição na dor ou paralisia; fala, visão, respiração e outras deficiências associadas com o tumor melhoradas; apetite melhorado; ou um aumento na qualidade de vida como medido pelos testes aceitos ou prolongamento da sobrevivência. Será evidente para a pessoa especialista na matéria que a dosagem vai variar dependendo do indivíduo, do tipo de câncer, o estágio do câncer, se o câncer começou a metástase em outro local no indivíduo, e os tratamentos passados e atuais sendo usados.

[0393] Outras formulações incluem formas de distribuição apropriadas conhecidas na técnica incluindo, mas não limitadas a, veículos como lipossomas. Ver, por exemplo, Mahato et al. (1997) Cationic Lipid-Based Gene Delivery Systems: Pharmaceutical Perspectives” Pharm. Res. 14:853-859.

Preparações lipossomais incluem, mas não são limitados a, citofectinas, vesículas multilamelares e unilamelares.

[0394] Em algumas realizações, mais de um anticorpo pode estar presente. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Tais composições podem conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco anticorpos diferentes que são reativos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, ou adenossarcomas. Anticorpo anti-B7-H3 pode ser misturado com um ou mais anticorpos reativos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, ou adenossarcomas em órgãos incluindo, mas não limitados a ovário, mama, pulmão, próstata, cólon, rim, pele, tireoide, osso, trato digestivo superior, e pâncreas. Em uma realização, uma mistura de anticorpo diferente anti-B7-H3s é usada. Uma mistura de

162/215 anticorpos, como eles são muitas vezes denotados na técnica, pode ser particularmente útil para tratar uma ampla faixa da população de indivíduos.

[0395] Tendo agora descrito geralmente a invenção, a mesma será mais prontamente entendida através da referência aos exemplos a seguir, que são providos a título de ilustração e não são destinados a ser limitantes da presente invenção a menos que especificado.

EXEMPLO 1

INVESTIGAÇÕES DE IMUNOISTOCOMPATABILIDADE [0396] Um painel de 49 mAbs foi gerado a partir de célula de tumor / imunizações de célula progenitora fetal. Os anticorpos foram avaliados por sua capacidade de exibir diferencial IHC corante de tecido de tumor em relação ao tecido normal, não canceroso, capacidade de uso em primata (e particularmente macaco cinomólogo) modelos de eficácia de anticorpo, níveis de afinidade de especificidade e níveis de antígenos de atividade imunomoduladora e internalização celular. 21 das mAbs foram inicialmente identificadas por análise e/ou ligação de MS para células B7-H3-CHO. As 28 mAbs restantes foram identificadas re-escaneando a biblioteca por ELISA com proteína B7-H3. Características de 46 dos 49 membros do painel são providas na Tabela 2.

Tabela 2
Nome	Isótipo	IHC	Ensaio ATCC	Internaiização	u- DART™	Análise BIACORE™	Ligaçao de Cino B7-H3
BRCA84D	IgGl/k	2a	2	+	+	+	+ +
TDH6	IgGl/k	2a	1	+	+	+/-	+
TES7	IgGl/k	2a	1	+	+	+	-
BRCA68D	IgGl/k	2b	3	+	+	+ +	+ +
BRCA69D	IgGl/k	2b	3	+	+	+ +	+ +
GB 8	IgGl/k	2b	3	+	+	+	+ +

163/215

Tabela 2
Nome	Isótipo	IHC	Ensaio ATCC	Internalização	U- DARTTM	Análise BIACORE™	Ligação de Cino B7-H3
SG2 7	IgG2b/k	2b	1		+	+	+
OVCA22	IgG1/k	2c	3	+	+	+/-	+
PRCA157	IgG1/k	2c	2	+	+		+ +
BLA8	IgG1/k	2c		+/-	+	+ +	+ +
KID35	IgG1/k	2c	2				+ +
LUCA50	IgG2a/k	2c	1			+	+ +
OVCA21	IgG1/k	2c	1		+	+	+
PRCA135	IgG1/k	2c	3		+		+ +
SG24	IgG2a/k	2c	3			+ +	+ +
TDH5	IgG1/k	2c	3		+	+ +	+ +
BCCA66	IgG1/k	2c	2		+		-
RECA13	IgG1/k	2c	3		+		-
RECA9	IgG1/k	2c	3		+		-
PRCA123	IgG1/k	2c/3	3		+		+ +
BRCA126	IgG1/k	3/F
BRCA192	IgG1/k	3/F
BRCA34	IgG1/k	3/F
KID1	IgG1/k	3/F	ND	+	+		+
KID13	IgG2a/k	3/F	3				+ +
LU14	IgG2b/k	3/F					-
LUCA1	IgG1/k	3/F	1	+	+	+ +	+ +
MCLY42	IgG2a/k	3/F					+ +
MCLY46	IgG1/k	3/F					+ +
OVCA4 0	IgG1/k	3/F					+ +
PA2 0	IgG1/k	3/F		+		+ +	-
PA4 0	IgG2b/k	3/F	3				-
PA41	IgG1/k	3/F	3
PR06	IgG1/k	3/F	2				-
RECA22	IgG1/k	3/F	3		-		+
SAL3	IgG2a/k	3/F			+ + +		+ +
SG2 0	IgG1/k	3/F					+
SG2 9	IgG1/k	3/F					+ +
SKIN2	IgG1/k	3/F	3		+ + +		+ +
ST05	IgG2b/k	3/F	3		+ +		+
TDH3 6	IgG1/k	3/F	2				+ +
TDH3 7	IgG1/k	3/F	3				+
TDH4	IgG1/k	3/F			+ + +	+ +	+ +
TDH4 0	IgG2b/k	3/F	3				+ +
TDH44	IgG2b/k	3/F					+ +
OVCA2 5	IgG1/k	3/F	3				+

[0397] A coloração do IHC confirmou que o paine compreende anticorpos que extrairam um tumor forte para

164/215 diferencial de ligação de tecido normal em muitos dos anticorpos identificados, exibiram uma faixa de propriedades de ligação por análise de BIACORE™, exibiram reatividade para variação de epítopos de sobreposição e não sobreposição e exibiram uma faixa de especificidade para 4Ig vs. 2Ig B7-H3. As características dos nove melhores candidatos são mostradas na Tabela 3 e Tabela 4.

Tabela 3
Nome	Tecido Normal	Câncer de Cólon	Câncer de Pulmão	Câncer de Próstata	Câncer de mama
BRCA84D	Cólon 1+ Pulmão 1+ Fígado 1+	1231 *	1130	112	1111
TDH6	Cólon 1+ Panc 1+ Rim 1+ Pulmão 1+ Fígado 1+	1110 *	1010	111	1011
TES7		1,5	1,75	3	3
BRCA68D	Panc 1+ Rim 1+ Pulmão 1+ Fígado 2+	2321 *	3332	333	3333
BRCA69D	Cólon 1+ Panc 1+ Rim 1+ Fígado 1+	2231 *	3231	333	3333
GB8
SG27	Cólon 1+ Panc 1+ Rim 1+ Fígado 1+	1221 *	1120	222	1122
OVCA22	Cólon 2+ Panc 2+ Fígado 2+	1122	3131 **	222	3233
PRCA157	Cólon 2+ Fígado 2+ Pele 2+	2231 *	3231	3333	2333
* + str também; ** str 3+

Tabela 4
Nome	Especificidade 2Ig/4Ig	Grupo Epítopo
BRCA84D	41g/2Ig	1

165/215

TDH6	41g/2Ig	2
TES7	4Ig	3
BRCA68D	4Ig/2Ig	4
BRCA69D	4Ig/2Ig	4
GB8	4Ig/2Ig	5
SG2 7	4Ig/2Ig	6
OVCA22	4Ig	7
PRCA157	4Ig/21g	8

[0398] A tabela 5 provê um sumário dos perfis de atividade desses anticorpos.

Tabela 5
Nome	Coloraç ão de tecido normal	Diferencial Tumor/Normal	Tecido Tumor Positiv o	Reativi dade cruzada cino	IHC *	Ligação BIACORET M	Atividade UDART™
BRCA84D	1	1	Tumor Estroma bv	Positiv o (não 1:1)	78	++	++
TES7	1	1	Tumor Estroma bv	negativ o	1250	+	++
BRCA68D	3	3	Tumor	Positiv o (1:1)	20	+++	++
BRCA69D	3	3	Tumor Estroma	Positiv o (1:1)	20	+++	++
GB8	2/3 (Adrena l ND)	3/4	Tumor Estroma	ND, + recomb.	625	+	+
SG2 7	2/3	ND	ND	ND,+ recomb.	2000 0	+	+
OVCA22	1	1	Tumor Estroma	Negativ o + recomb.	2500	+	++
PRCA157	2	3	Tumor Estroma bv	Positiv o (1:1)	20	ND	++
* Concentração ideial em ng/ml; ND, Não Determinado

[0399] Uma análise das atividades dos anticorpos mostrados na Tabela 6 revelou que seus respectivos perfis diferiam e que cada anticorpo foi associado com ambas as vantagens e desvantagens relativas uma a outra (Tabela 6).

Tabela 6

166/215

Anticorpo	Vantagens	Desvantagens
BRCA84D	#1 coloração do tecido normal #1 diferencial de tumor/normal tumor de coloração, estroma, BV Afinidade média, local de ligação único (ligação titulável)	Reatividade cruzada de cino não 1:1
BRCA68D	#3 coloração do tecido normal #3 diferencial de tumor/normal Reatividade cruzada de cino 1: 1 Alta afinidade Atividade potente de UDARTTM	Apenas tumor de coloração
BRCA69D	#3 coloração do tecido normal #3 diferencial de tumor/normal Reatividade cruzada de cino 1:1 tumor de coloração, estroma alta afinidade atividade potente de UDARTTM
PRCA157	#2 coloração do tecido normal #3 diferencial de tumor/normal Reatividade cruzada de cino 1:1 Tumor de coloração, estroma, BV atividade potente de UDARTTM	BIACORE™
TES7	#1/2 coloração do tecido normal #1/2 diferencial de tumor/normal tumor de coloração, estroma, BV 4Ig específico Atividade potente de UDARTTM	Sem Reatividade cruzada de cino baixa afinidade
OVCA22	#1/2 coloração de tecido normal #1/2 diferencial de tumor/normal baixa afinidade tumor de coloração, estroma 4Ig específico Atividade potente de UDARTTM	Sem Reatividade cruzada de cino baixa afinidade
GB8	#2/3 coloração de tecido normal (adrenal não determinado) #3/4 diferencial de	Reatividade cruzada de cino não determinada baixa afinidade

167/215

Tabela 6
Anticorpo	Vantagens	Desvantagens
	tumor/normal tumor de coloração, estroma Atividade de UDARTTM modesta
SG2 7	#2/3 coloração de tecido normal diferencial de tumor/normal não determinado Atividade de UDARTTM modesta	Reatividade cruzada de cino não determinada baixa afinidade

[0400] Por causa de BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D e PRCA157 exibirem perfis de IHC de tecido normal mais limpos, diferencial de IHC de ligação de tumor/normal mais forte, moderada a forte (BIACORE^TM / IHC), reatividade cruzada a B7H3 de macacos cionomólogos, e atividade de UDART^TM potente, essas espécies de anticorpos foram selecionadas para desenvolvimento adicional. Esses anticorpos diferiram de TES7 e OVCA2, que exibiram baixa afinidade (no ensaio de BIACORE^TM), e a reatividade não cruzada para B7-H3 de macacos cinomólogos. Esses anticorpos diferiram de SG27, que exibiu baixa afinidade (no ensaio de BIACORE^TM), desempenho de IHC inferior (ligação fraca) e atividade de UDART^TM inferior. Esses anticorpos diferiram de GB8, que exibiu baixa afinidade (no ensaio de BIACORE^TM), diferencial de IHC de tumor/normal deficiente, e atividade de UDART^TM inferior.

[0401] Usando células de controle positivo Caki2 e Hs700T, as investigações de IHC revelaram que cada um dos anticorpos exibiu uma concentração ideal diferente e uma concentração diferencial diferente em relação uma a outra (Tabela 7).

Tabela 7
Anticorpo	Concentração de IHC ideial	Concentração de IHC diferencial
BRCA84D	0,625 pg/ml	0,078 pg/ml
BRCA68D	0,156 pg/ml	0,0195 pg/ml

168/215

BRCA69D	0,156 pg/ml	0,0195 pg/ml
PRCA157	0,078 pg/ml	0,0195 pg/ml
TES7	5 pg/ml	1,25 pg/ml
OVCA22	10 pg/ml	2,5 pg/ml *
GB8	1,25 pg/ml	0,625 pg/ml
SG2 7	20 pg/ml	Não Determinada **
TDH6	20 pg/ml	Não Determinada ***
* OVCA22 apenas mostrou a ligação às células caki2, não mostrou a ligação às células Hs700T.Decisão de otimização com base na ligação de células caki2. ** Porque SG27 não mostrou resultados da análise de titulação consistente entre dois operadores, baixa afinidade de concentração diferencial não foram determinadas. *** Estudo TDH6 não feito devido à afinidade muito baixa para células de controle positivo.

[0402] Usando as concentrações ideais e diferenciais indicadas na Tabela 7, as respostas de IHC dos anticorpos B7-H3 em tecidos de ser humano foram determinadas. Os resultados dessas análises para Adrenal, Fígado, Pancreática, Rim, Pulmão e Cólon são mostradas nas Tabelas 8A-8B e Tabelas 9A-9B (todos os anticorpos exibiram respostas de IHC negativas para o tecido do coração).

Tabela 8A: B7H3 mAb IHC em Concentração Ideial em Tecidos Humanos
mAb	Adrenal	Fígado	Pâncreas
BRCA84D 0,625 pg/ml	Negativo	Células de revestimento sinusoidais ++ Hepatócitos +, 5 a 10%	Epitélio + 5% Fibra ++
BRCA68D 0,156 pg/ml	Córtex +++	Células de revestimento sinusoidais ++ Hepatócitos ++ (m)	Epitélio + Fibra ++
BRCA69D 0,156 pg/ml	Córtex +++	Hepatócitos ++ (m)	Epitélio + Fibra ++
TES7 5 g/ml	Córtex +	Células de revestimento sinusoidais +	Epitélio + 5% Fibra ++
OVCA2 2 10 pg/ml	Córtex +	Células de revestimento sinusoidais ++ Hepatócitos + (m)	Epitélio + 5% Fibra ++
PRCA157 0,078 pg/ml	Córtex ++	Células de revestimento sinusoidais ++ Hepatócitos + (m)	Epitélio + 5% Fibra ++

169/215

GB8 1,25 pg/ml

Não Determinado

Células de revestimento sinusoidais ++ Hepatócitos + (m)

Epitélio + Fibra ++

Tabela 8B: B7H3 mAb IHC em Concentração Ideial em Tecidos Humanos
mAb	Rim	Pulmão	Cólon
BRCA84D 0,625 pg/ml	Negativo	Epitélio + (5 a 10%)	Epitélio +
BRCA68D 0,156 pg/ml	Fibroblasto +, raro	Epitélio +	Mucosa ++
BRCA69D 0,156 pg/ml	Fibroblasto +, raro	Epitélio +	Mucosa +
TES7 5 g/ml	Negativo	Negativo	Epitélio +
OVCA2 2 10 pg/ml	Fibroblasto +	Negativo	Epitélio +
PRCA157 0,078 pg/ml	Negativo	Negativo	Mucosa +
GB8 1,25 pg/ml	Negativo	Epitélio +	Mucosa +

Tabela 9A: B7H3 mAb IHC em Concentração Diferencial em Tecidos Humanos
mAb	Adrenal	Fígado	Pâncreas
BRCA84D 0,078 pg/ml	Negativo	Células de revestimento sinusoidais +	Fibra + (rara)
BRCA68D 0,0195 pg/ml	Córtex ++	Hepatócitos + (m)	Fibra +
BRCA69D 0,0195 pg/ml	Córtex ++	Hepatócitos + (m)	Fibra +
TES7 1,25 pg/ml	Fibroblasto +	Células de revestimento sinusoidais +	Epitélio +, 5% Fibra ++
OVCA22 2,5 pg/ml	Fibroblasto +	Células de revestimento sinusoidais +	Fibra +
PRCA157 0,0195 pg/ml	Não determinado	Células de revestimento sinusoidais + Hepatócitos + (m)	Fibra +
GB8 0,625 pg/ml	Não determinado	Células de revestimento sinusoidais ++ Hepatócitos + (m)	Fibra +

Tabela 9B: B7H3 mAb IHC em Concentração Diferencial em Tecidos Humanos

170/215

mAb	Rim	Pulmão	Cólon
BRCA84D 0,078 pg/ml	Negativo	Negativo	Epitélio +
BRCA68D 0,0195 pg/ml	Negativo	Fibrina + (rara)	Mucosa +
BRCA69D 0,0195 pg/ml	Negativo	Negativo	Mucosa +
TES7 1,25 pg/ml	Negativo	Negativo	Epitélio +
OVCA22 2,5 pg/ml	Negativo	Negativo	Epitélio +
PRCA157 0,0195 pg/ml	Negativo	Negativo	Mucosa +
GB8 0,625 pg/ml	Negativo	Negativo	Mucosa +

[0403] As investigações conduzidas usando espécies de câncer mostraram que os anticorpos B7-H3 da presente invenção poderiam ser usados para identificar um diagnóstico de câncer em fontes múltiplas de tecido (Tabela 10). Na Tabela 10, os números indicam o número de sinais de mais (1 = +, 2 = ++, 3 = + + + ) ; cada número se referindo a uma amostra testada diferente.

Tabela 10
mAbs	pg/ml	Câncer de Próstata	Câncer de Mama	Câncer de Pulmão	Câncer de Cólon
BRCA84D	0,625 pg/ml	2, 2, 1	3,3,3,3	2,3, 2(estroma), Kb.v.)	2(estroma), 3 3 3 (estroma)
0,078 pg/ml	0, 2, 3, 2	1 (estroma), 1 (estroma), 1 (estroma), 2, 3	1, 1,0, 1	2, 2(estroma), 1 (estroma), 2(estroma)
BRCA68D	0,156 pg/ml	2, 3, 3, 3	2, 3, 3, 3	3,3,2,2	3,3,3,3
0,0195 pg/ml	0, 1, 1, 1	0, 0, 2, 2, 1	0, 1, 1,0	1, 1, 1, 1
BRCA69D	0,156 pg/ml	3,3,3	3,3,3,3,3	3,3,2, 2(estroma)	3,3,3,3

171/215

Tabela 10
mAbs	pg/ml	Câncer de Próstata	Câncer de Mama	Câncer de Pulmão	Câncer de Cólon
		0, 1,2, 1	1,2, 1, 1	1, 1,0, 1	K1(b.v.), 2(estroma), 1, 1
GB8	1,25 pg/ml	2,3,1	2, 2,1,2	3, 3, 0, 0	2(estroma), 2, 2,2
0,625 pg/ml	0, 1, 1	0, 0, 0, 0, 1	1, 0, 0, 0	1 (estroma), 1 (estroma), 0, 0
TES7	5 pg/ml	2, 3, 2, 3	1 (estroma), 3, 3,3,2	3,2, 1 (estroma), 1(b.v.)	3,3,2,2
1,25 (pg/ml	1,2, 2, 3	1 (estroma), 2, 3, 3, 2	3, 1, 1 (estroma), l (b.v.)	3, 2(estroma), 2(estroma), 2
OVCA22	10 pg/ml	3, 2, 2, 1	1 (estroma), 2, 2, 3, 3	3,2, 1 (estroma), 0	1 (estroma), 1, 1, 2(estroma)
2,5 pg/ml	1, 1,3, 1	1 (estroma), 1 (estroma), 1 (estroma), 3, 2 , 2	2, 1, 0, 0	1,0, 2(estroma), 0
PRCA157	0,078 pg/ml	2, 2, 2, 3	1,2, 2,3,3	2, 2, 1 (estroma), Kb.v.)	3 3 2(estroma), 2(estroma)
0,0195 ug/ml	0, 1,2, 1	1 (estroma), 0, 2, 1 (estroma)	0, 1, 0, 0	1, 1, 1 (estroma), 1 (estroma)

[0404] Para células cancerosas de próstata, mama, cólon e pulmão tratadas com o anticorpo B7-H3 BRCA84D, corante de amostra de tumor estava presente nas células do tumor e células estromais, incluindo a vasculatura do tumor. Em algumas amostras de tumor, a coloração estromal foi mais forte do que as células do tumor. Quando BRCA84D mAb foi

172/215 titulado para concentração inferior, alguns caos mostraram coloração reduzida nas células do tumor, mas ainda mantendo corante estromal forte. Mediante coloração com BRCA84D em 0,625 pg/ml, células cancerosas de próstata exibiram um IHC de 3/3+; células cancerosas de mama exibiram um IHC de 4/4+; células cancerosas de cólon exibiram um IHC de 4/4+ e células cancerosas de pulmão exibiram um IHC de 4/4+. Mediante coloração com BRCA84D a 0,078 pg/ml, as células cancerosas da próstata exibiram um IHC de 3/4+; células cancerosas de mama exibiram um IHC de 5/5+; células cancerosas de cólon exibiram um IHC de 4/4+ e células cancerosas de pulmão exibiram um IHC de 3/4+.

[0405] O fígado normal foi tratado com B7-H3 anticorpo BRCA68D, e a coloração foi vista nos hepatócitos e Células de revestimento sinusoidais. Pâncreas normal corado com B7-H3 anticorpo BRCA68D exibiram coloração multifocal na fibra de colágeno e epitélio. Células adrenais normais tratadas com B7-H3 anticorpo BRCA68D, exibiram coloração no córtex. Mediante coloração com BRCA68D a 0,156 pg/ml, células cancerosas gástricas, renais e ovarianas todas exibiram um IHC de 5/5+.

[0406] Análises de coloração de IHC adicional foram conduzidas em amostras de tecidos de câncer gástrico, de rim e ovariano. Os resultados de cada análise são mostrados na Tabela 12. Na Tabela 11, os números indicam o número de sinais de mais (1= +, 2= ++, 3 = + + + ); cada número se referindo a uma amostra testada diferente.

Tabela 11
mAbs	pg/ml	Câncer gástrico	Câncer de rim	Câncer de ovário
BRCA84D	0,625 pg/ml	2,1,2,2,2	1,2,1,1,1	0,3,1,2,2
0,078 pg/ml	1,0,0,1,0	0,1,0,1,0,1	0,2,0,1,1

173/215

BRCA68D	0,156 pg/ml	3,2,3,3,3	3,3,2,3,3,3	2,3,3,2,2
0,0195 pg/ml	2,1,2,1,1	2,2,2,2,2,2	1,2,2,1,1
OVCA22	10 pg/ml	3,1,3,1,1	3,1,2,3,0,2	2,3,2,1,1
2,5 pg/ml	2,0,2,1,0	2,1,1,2,0,1	1,2,1,0,1
TES7	5 pg/ml	2,1,3,2,1	2,3,1,2,2,1	1,3,1,2,2
1,25 pg/ml	2,0,2,1,1	2,2,1,1,1,1	1,3,1,2,2

[0407] No sumário, todas as mAbs testadas mostraram vários graus de intensidade de coloração em fígado, pâncreas, cólon e pulmão normais. Figura 1A mostra os resultados das investigações de IHC conduzidas usando espécimes de tecido de pâncreas, fígado, pulmão e cólon normais com BRCA84D a 0,625 pg/ml e 0,078 pg/ml. A coloração do fígado foi relativamente restrita em Células de revestimento sinusoidais (fibroblasto e células kupffer) com BRCA84D e TES7. OVCA22 mostrou coloração de hepatócito de membrana além daquela das Células de revestimento sinusoidais em concentração ideal. Entretanto, a coloração em hepatócitos desapareceu na concentração diferencial. Todas as outras mAbs mostraram coloração em hepatócitos incluindo coloração de membrana ou citoplasma em ambas as concentrações, ideal e diferencial. A coloração do pâncreas foi observada em fibra de colágeno principalmente e uma percentagem pequena do epitélio (células acinar ou/e células de dutos intercaladas).

A coloração no epitélio diminuiu ou desapareceu em concentração diferencial.

A coloração do cólon foi relativamente restrita na membrana apical do epitélio de cripto e fibroblasto na mucosa. Nenhuma ligação foi observada em nódulos linfoides do cólon. O pulmão mostrou coloração muito fraca e desigual no epitélio com BRCA84D, BRCA68D,

174/215

BRCA69D e GB8. Entretanto, a coloração desapareceu na concentração diferencial. Nenhuma coloração foi observada no pulmão com TES7, OVCA22 e PRCA157 em ambas as concentrações. A coloração do córtex adrenal foi observada com quase todas as mAbs em concentração ideal, exceto BRCA84D. A coloração em adrenal obviamente diminuiu com TES7 e OVCA22 em concentração diferencial. Coloração do coração e rim não mostraram coloração óbvia com todas as mAbs (Figura IB). Em vista dessas propriedades, BRCA84D foi considerada a melhor das mAbs, seguida em ordem por (2) TES7, (3) OVCA22, (4) o grupo BRCA68D, BRCA69D e PRCA157, e por último (5) GB8.

[0408] Todas as mAbs incluídas no estudo mostraram coloração positiva em 4 tipos de câncer na concentração ideal. Na concentração diferencial, BRCA84D ainda manteve boa coloração no câncer de próstata, câncer de mama, e câncer de cólon. TES7 mantiveram coloração boa em 4 tipos de estudo de câncer. As mAbs remanescentes mostraram várias intensidades de coloração em diferentes tipos de tumor. Coloração de amostra de tumor foi observada em células do tumor e células estromais, incluindo vasculatura. Algumas amostras de tumor mostraram coloração positiva somente na vasculatura, isto é, BRCA84D, BRCA69D, TES7, e PRCA157. Alguns tumores mostraram coloração estromal mais forte do que a coloração da célula do tumor. Quando mAbs foram tituladas para concentração mais baixa nessas amostras, alguns casos mostraram coloração diminuída ou nenhuma nas células do tumor, mas ainda mantiveram coloração estromal forte. Em geral, em termos de expressão em tecidos normais de ser humano e expressão diferencial em tecidos normais vs. de tumor, a ordem de mAb a partir do melhor desempenho de IHC

175/215 para o pior desempenho é como a seguir: (1) BRCA84D, (2) TES7, (3) OVCA22, (4) o grupo BRCA68D, BRCA69D e PRCA157, e por último (5) GB8. A tabela 12 e a figura 2 mostram resultados para anticorpo BRCA84D.

Tabela 12
Tipo de Tecido Canceroso	BRCA84D 0,625 pg/ml	BRCA84D 0,078 pg/ml
Próstata	3/3 +	3/4 +
Mama	4/4 +	5/5 +
Cólon	4/4 +	4/4 +
Pulmão	4/4 +	3/4 +

EXEMPLO 2

REATIVIDADE CRUZADA B7-H3 DE MACACO CINOMÓLOGO [0409] A sequência de macacos cinomólogos B7-H3 compartilha aproximadamente 90% de homologia para sua equivalente humana, sugerindo que o macaco cinomólogo é um excelente modelo para interações humanas B7-H3. Investigações foram conduzidas para avaliar a reatividade cruzada de B7H3 de candidatos BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D,

TES7, OVCA22 e PRCA157 com adrenal, fígado, rim, pâncreas e pulmão como também um caso de placenta de prazo natural de macaco cinomólogo, a fim de comparar qualquer reatividade cruzada com a intensidade de coloração e padrões de coloração observados para tecidos de seres humanos.

[0410] A concentração de coloração para cada Mab testado é a concentração ideal que foi determinada em células de controle positivo Caki-2 e Hs700T (ver, Tabela 8). Cabra comercial anti-humana B7-H3 (reação cruzada com cino) foi selecionada como um anticorpo de controle positivo para tecido de placenta de cinomólogo corado. Controles de isótopos correspondentes foram aplicados em cada execução dos experimentos. Os resultados dessas investigações são

176/215 mostrados na Tabela 13.

Tabela 13
mAb	Adrenal(2)	Fígado(2)	Pâncreas( 2)	Rim(2)	Pulmão(2 )	Placenta(l )
BRCA84D 0.625 pg/ml	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	1/2 Epitélio 1+	Células deciduais 2+ Células Mesenquima is negativo
BRCA68D 0.156 pg/ml	Córtex 3+	2/2 Hepatócit os l+(m) Células de revestiment o sinusoida is 1 +	1/2 Fibra 2+ Epitélio 1+	Fibroblast o 1 +	Negativo	Células deciduais, vilos, Células Mesenquima is 3+
BRCA69D 0.156 pg/ml	Córtex 2+	1/2 Hepatócit os l+(m)	1/2 Epitélio 1+	Fibroblast o 1+ raro	Negativo	Células deciduais 2+, vilos, Células Mesenquima is 2 +
TES7 5 pg/ml	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo
OVCA22 10 pg/ml	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	negativo	Negativo
PRCA157 0.078 pg/ml	Córtex 1+	1/2 Hepatócit os l+(m)	Negativo	Negativo	Negativo	Células deciduais 2+, vilos, Células Mesenquima is 1+
Nota: BRCA84D mostrou coloração negativa no fígado e pâncreas em até 5 pg/ml. Embora OVCA22 não se una ao tecido cino em IHC, ligação modesta foi observada para cino recombinante B7H3 em células CHO. Classificação de IHC em tecidos normais é negativa, sistema de grau 1+, 2+ e 3+ 4; m=membrana; 2/2= 2 de 2 casos, % = 1 de 2 casos

[0411] A investigação de coloração IHC de BRCA84D (0,625 μg/ml) em placenta de cinomólogo exibiu coloração em células deciduais, mas não em vilosidades. Nenhuma coloração foi observada em fígado e pâncreas de cino, entretanto, coloração de células sinusoidais foi observada em

177/215 fígado de ser humano e fibra localizada e a coloração de epitélio foi observada no tecido do pâncreas de ser humano.

[0412] A investigação coloração IHC de BRCA68D (0.156 pg/ml) em placenta de cinomólogo exibiu coloração em células deciduais, células mesenquimais (endotélio e fibroblastos) e vilosidades. A coloração estava presente na membrana de hepatócitos e citoplasma de fibroblastos de fígado, como também em fibra pancreática em no citoplasma de epitélio pancreático. Desse modo, tecido pancreático e de fígado de ser humano e cino exibem padrões de coloração similares com BRCA68D.

[0413] Resumindo, BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D e PRCA157 todos mostraram reatividade cruzada em tecidos de cino. BRCA84D não mostrou coloração em fígado e pâncreas de macaco; tal coloração foi observada em tecidos pancreáticos e de fígado de ser humano. BRCA68D e BRCA69D mostraram intensidade de coloração similar e padrões de coloração em tecidos de macaco. Embora BRCA68D, BRCA69D e PRCA157 mostraram padrão de coloração comparável com os tecidos de ser humano, a intensidade de coloração não é idêntica aos tecidos de ser humano em condições ideais. TES7 e OVCA22 não mostraram qualquer coloração em tecidos de macaco em condições ideais.

[0414] Um resumo dos resultados comparativos de coloração de IHC em tecido de cinomólogo e de tecido de ser humano é provido na Tabela 14.

Tabela 14
mAb	Adrenal	Fígado	Pâncreas	Rim	Pulmão	Placenta
BRCA84D 0,625 pg/ml Cinomólog o	Negativ o	Negativo	Negativo	Negativo	1/2 Epitélio 1 +	Células deciduais 2 + Células Mesenquima

178/215

Tabela 14
mAb	Adrenal	Fígado	Pâncreas	Rim	Pulmão	Placenta
						is negativo
BRCA84D 0,625 pg/ml Humano	Negativ o	2/2 Células de revestimen to sinusoida is 2+, Hepatócit os 1+ 5 a 10%	Epitélio 1+, 5%, fibre2+	Negativo	Epitélio 1+, 510%	Células deciduais 1+, vilos, Células Mesenquima is 1+
BRCA68D 0,156 pg/ml Cinomólog o	Córtex 3 +	2/2 Hepatócit os 1+(m) Células de revestimen to sinusoida is 1 +	1/2 Fibra 2+ Epitélio 1+	Fibroblas to 1+	Negativo	Células deciduais, vilos, Células Mesenquima is 3+
BRCA68D 0,156 pg/ml Humano	Córtex 3+	Células de revestimen to sinusoida is 2+, Hepatócit os 2+(m)	Epitélio 1+ Fibra 2+	Fibroblas to 1+ raro	Epitélio 1+	Células deciduais 3+, vilos, Células Mesenquima is 3+
BRCA69D 0,156 pg/ml Cinomólog o	Córtex 2+	1/2 Hepatócit os 1+(m)	1/2 Epitélio 1+	Fibroblas to 1+ raro	Negativo	Células deciduais 2+, vilos, Células Mesenquima is 2 +
BRCA69D 0,156 pg/ml Humano	Córtex 3+	Hepatócit os 2+(m)	Epitélio 1+ Fibra 2+	Fibroblas to 1+ raro	Epitélio 1+	Células deciduais 3+, vilos, Células Mesenquima is 3 +
PRCA157 0,078 pg/ml Cinomólog o	Córtex 1+	1/2 Hepatócit os l +(m)	Negativo	Negativo	Negativo	Células deciduais 2+, vilos, Células mesenquima is 1 +

179/215

Tabela 14
mAb	Adrenal	Fígado	Pâncreas	Rim	Pulmão	Placenta
PRCA157 0,078 pg/ml Humano	Córtex 2 +	Células de revestimen to sinusoida is 2+, Hepatócit os 1+(m)	Epitélio 1+ 5% Fibra 2+	Negativo	Negativo	Não determinad o

EXEMPLO 3

B7-H3 mAbs SE UNE A MÚLTIPLAS LINHAGENS DE CÉLULAS

CANCEROSAS ATCC [0415] Descobriu-se que os anticorpos da presente invenção são capazes de se unirem a múltiplas linhagens de células cancerosas contidas nas coleções da American Type Culture Collection. A tabela 15 e a tabela 16 resumem os resultados da ligação.

Tabela 15
Anticorpo
Linhagens de Célula	BLA0 8	BRCA68D	BRCA69D	BRCA84D	PRC AI 57
Linhagens Humanas Normais
HMEC	++/+++	+ + +	+ + +	+ +
HUVEC	ND	+ +	+/++	+/-	+ / + +
Linhagens Humanas de Câncer de Mama
BT474	+ + +	+ +	++/+++	+/++	++/+++
MCF7	+ + +	+ +	++/+++	+	+ +
MDA175	ND
MD A361	ND	+ +		+/+/-	+ +
SKBR3	+ + +		+ +
Linhagens Humanas de Câncer de Pulmão
A549	+ + +	+/+/-	+/-		+/-
Calu3	+ + +	+/++	+		+/++
SKMES1	+ + +	+ +	++/+++	+/++	+ +
Linhagens Humanas de Câncer de Ovário
ES-2	+ + +	+/-
SKOV3	+ + +	+ +	+/++	+/+/-	+ +
Linhagens Humanas de Câncer Pancreático
Pane-1	++/+++	+/++	+/++	+/+/-	+/++
AsPC-1	+ + +
HPAFII	+ + +

180/215

Hs700T	+ + +	++/+++		+++	+++
	Linhagens Humanas	de Câncer de	Cólon
Colo205	ND
HT-29	+ + +	+	+		+
SW480	+ + +	+/-		+ /-
SW948	ND	+	+
	Linhagens Humanas	de Câncer de Rim
293	+ + +	+ +	+ +	+	++/+++
786-0	+ + +	+ +	+ +	+	++/+++
A498	+ + +	+ +	+ +	+ +	++/+++
Caki2	+ + +	+ + +	+ + +	+ +	++/+++
Linhagens de Célula Nao Humana
Cos7	+ + +	+	+/++	+/-	+/++
RL65	-
SVT2	ND
Linhagens Humanas de Câncer de Próstata
22Rvl	+ + +
DU 145	+ + +	+	+	+	+/+/-
LNCaP	+ + +	+ +	+ +	+ I++	++/+++
PC3	+ + +	+/+/-	+/-	+/-	+/-
TDH	ND	+/+/-	+/+/-		+
Linhagens Humanas de Câncer de Estômago
HS746T	ND	+/++	+/++	+	+ +
N87	ND	+/++	+/++	+/-	+/++

Tabela 16
Anticorpo
Linhagens de células	TDH0 6	OVCA22	GB8	SG2 7	TES7
Linhagens Humanas Normais
HMEC
HUVEC	+/+/-		+ /-	+ /-
Linhagens Humanas de Câncer de Mama
BT474	+ / + +	+	+ +	+ / + +	+ / + +
MCF7	+	+	+ +	+ /+1-	+
MDA175		+ +
MD A3 61	+/+/-				+
SKBR3		+ +
Linhagens Humanas de Câncer de Pulmão
A549
Calu3			+
SKMES1	+/++	+/-		+	+
Linhagens Humanas de Câncer de Ovário
ES-2
SKOV3	+				+/+/-
Linhagens Humanas de Câncer Pancreático
Pane-1	+/+/-		+	+/-	+/+/-

181/215

AsPC-1
HPAFII		+
Hs700T	+	+ + +	+ + +	+	+ + +
Linhagens Humanas de Câncer de Cólon
Colo205		+
HT-29	+	+/+/-			+/+/-
SW480	+/-	+ + +
SW948	+/-	+
Linhagens Humanas de Câncer de Rim
293	+/+/-		+	+/+/-	+
786-0	+		+*	+/-	+
A498	+		+/++		+/++
Caki2	+ +	+	+ + +	+/++	+ +
Linhagens de Célula Nao Humana
Cos7	+		+ / + /- *	+/-
RL65
SVT2
Câncer de Próstata Humano
22Rvl		+
DU 145	+/-	+
LNCaP	+/+/-	+	+*	+/+/-	+
PC3
TDH		+ + +	+/-		+/-
Linhagens Humanas de Câncer de Estômago
HS746T	+		+/+/-	+/-	+/-
N87		+/+/-	+/-

EXEMPLO 4

EXTERMÍNIO REDIRECIONADO DE B7-H3 MABS [0416] Os anticorpos da presente invenção se unem a B7-H3 presente na superfície de células cancerosas. Usando métodos convencionais como anticorpos podem ser rotulados com fluoresceína, como descrito acima. Usando tais moléculas rotuladas são incubadas na presença de moléculas UDART^TM tendo um domínio de ligação de epítopo que liga para o receptor da célula T e uma ligação de epítopo que liga para fluoresceína (TCR-UDART™), elas podem ligar para moléculas

DART^TM e desta maneira as localizam para a superfície de

182/215 células que expressam B7-H3 e causam extermínio redirecionado.

A. EXTERMÍNIO REDIRECIONADO DE CÉLULAS DE CARCINOMA

RENAL A498 [0417] Para demonstrar tal extermínio redirecionado, anticorpos B7-H3 rotulados de fluoresceína foram incubados com tais moléculas de TCR-UDART^TM e a capacidade das moléculas para mediar citotoxicidade de células de carcinoma renal A498 foi avaliada (Tabela 17). Com base nos resultados alcançados, os candidatos do topo foram concluídos como sendo: RECA13, BRCA68D, BRCA69D e TDH6.

Tabela 17: Extermínio Redirecionado de Células de Carcinoma Renal A498
mAb	Sem UDART™	Com TCR-UDART™	FACS
	Meio	Meio	MFI
BCCA66	-1,04	46,39	43,30
BLA8	1,35	49,19	50
BRCA165	0	5,11	5,46
BRCA52	0	55,53	41,7
BRCA68D	0	36,89	83,7
BRCA69D	0	54,71	84,1
BRCA84D	0	72,40	30,6
GB8	4,00	42,00	17,9
KID1	0,38	52,08	18,5
KID13	26,39	58,20
KID35	-1,68	7,62
LUCA1	9,85	52,73	52,9
OVCA21	-0,85	47,59	6,04
OVCA22	0,36	38,66	53,9
OVCA2 5	-2,86	16,70
PA4 0	-0,46	40,54
PRCA123	0	56	130
PRCA135	0	55	127
PRCA157	0	39,14	58,8
RECA13	0	38,62	39,8
RECA22	-0,24	51,74	99,90
RECA9	0	62	50,1
SAL3	4,94	52,23	60,5
SG24	-2,25	42,00
SG2 7	-3,98	0,21
SKIN2	3,11	56,44	45,8
ST05	2,91	37,84	36,7
TDH3 6	-1,03	53,52	155,00

183/215

TDH3 7	0,05	65,21	47,50
TDH4	5,09	50,63	45,9
TDH4 0	-0,65	44,55
TDH5	2,92	49,60	28,8
TDH6	0	70,10	19,5
TES7	6,23	52,89	17,5
[0418]	As células A498 de carcinoma renal foram

incubadas com diferentes concentrações de anticorpos monoclonais reativos contra B7-H3 a fim de determinar o extermínio redirecionado dependente da dose mediada pelos anticorpos. Os resultados dos experimentos (Figuras 3A-3B) mostraram que o extermínio redirecionado era dependente da dose.

B. EXTERMÍNIO REDIRECIONADO DE CÉLULAS CANCEROSAS DE PULMÃO A549 [0419] Para ainda demonstrar tal extermínio redirecionado, os anticorpos B7-H3 rotulados de fluoresceína foram incubados com as moléculas TCR-UDART^TM descritas acima ou com moléculas UDART^TM tendo um domínio de ligação de epítopo que liga para CD 16 e um domínio de ligação de epítopo que liga para fluoresceína (CD 16-UDART™), e a capacidade das moléculas mediarem citotoxicidade de células cancerosas de pulmão A549 foi avaliada (Tabela 18). Os resultados dos experimentos (Figuras 3C-3D) mostraram que o extermínio redirecionado foi dependente da dose. Com base nos resultados alcançados, os candidatos de topo foram concluídos como sendo: BLA8, BRCA68D, BRCA69D e BRCA84D.

Tabela 18: Extermínio Redirecionado de Células de Câncer de Pulmão A549
mAb	Sem DART™	Com TCRUDART™	Com UDARTTM CD 16	FACS
	Meio	Meio	Meio	MFI
BCCA66	1,89	25,17	8,22	36,1

184/215

Tabela 18: Extermínio Redirecionado de Células de Câncer de Pulmão A549
mAb	Sem DART™	Com TCRUDART™	Com UDART™ CD 16	FACS
	Meio	Meio	Meio	MFI
BLA8	-7,70	10,97	3,68	34,7
BRCA52	0	27,63		37
BRCA68D	-4,42	13,45	15,95	58,3
BRCA69D	0	24,25		60,5
BRCA84D	0	15,33		25
GB8	-8,68	2,44	-4,65	17
KID1	0	22,93		41
LUCA1	0	14,65		53
OVCA21	-2,43	18,90	7,22	31,5
OVCA22	0	32,90		61
PRCA123	7,68	29,88	17,31	79,4
PRCA135	-6,58	22,72	8,14	75,6
PRCA157	0,02	18,63	18,24	44,3
PSMA	-0,70	5,58	9,94
RECA13	0,86	17,39	11,90	34,4
RECA22	3,71	20,49	19,35	74,3
RECA9	7,01	26,89	31,80	44,3
SAL3	0	31,80		67,4
SKIN2	-0,08	8,65	9,33	41,9
ST05	-10,36	9,28	1,71	54,7
TDH3 6	6,79	24,12	24,08	107
TDH3 7	6,93	22,57	23,37	42,3
TDH4	-6,26	10,07	2,21	32,4
TDH4 0	4,87	22,01	24,90	53,3
TDH5	-5,08	9,35	-2,85	27,1
TDH6	0	19,09		21,3
TES7	0	19,35		15,7

C. EXTERMÍNIO REDIRECIONADO DE CÉLULAS CANCEROSAS

DE PRÓSTATA LNCAP [0420] Para ainda demonstrar tal extermínio redirecionado, os anticorpos B7-H3 rotulados de fluoresceína foram incubados com as moléculas TCR-UDART™ descritas acima ou com moléculas UDART™ tendo um domínio de ligação de epítopo que liga à CD 16 e um domínio de ligação de epítopo que liga para fluoresceína (CD 16-UDART™”), e a capacidade das moléculas para mediar citotoxicidade de células

185/215 cancerosas de próstata LNcap foi avaliada (Tabela 19). Com base nos resultados alcançados, os candidatos de topo foram concluídos como sendo: BRCA68D, BRCA69D, BRCA84D e PRCA157.

Tabela 19: Extermínio Redirecionado de Células de Câncer de Próstata LNcap
mAb	Sem DART™	Com TCR-UDARTTM	Com UDART™ CD16	FACS
	Meio	Meio	Meio	MFI
BCCA4	-2,96	13,29	2,47	5,1
BCCA66	-2,13	13,42	16,40	41
BLA8	4,32	14,97	24,00	48,4
BRCA165	3,59	57,26	12,02	7,6
BRCA183D	-4,65	43,09	35,30	7,6
BRCA52	32,34	71,23	48,28	42,5
BRCA68D	-1,40	23,00	21,91	86,9
BRCA69D	40,08	78,02	60,55	92,4
BRCA84D	20,11	78,70	41,27	16,4
GB8	-6,25	14,04	10,76	22
KID1	54,65	91,87	67,86	44,8
KID13	15,86	69,21	47,85
KID133	27,51	45,65	47,12	120
KID24	-4,26	34,13	41,17	14,5
KID35	14,17	64,01	33,05
KID47	11,34	39,49	15,02	10,8
KID8	16,98	58,80	34,77	5,5
LUCA1	47,40	89,31	67,15	73
LUCA17	23,18	26,90	35,87	11,1
LUCAT1	8,25	22,36	21,49	6,9
LUCAT7	26,50	38,29	44,77	8,7
MCL12	26,62	35,59	46,38	17,6
MEL2	6,57	29,90	31,40	19
OVCA21	12,07	26,81	31,30	41
OVCA22	45,09	96,50	77,30	113
OVCA2 5	16,14	63,26	32,39
PA22	1,73	57,70	9,89	8,9
PA3 3	8,99	34,49	48,14	9,4
PA4 0	38,42	73,07	63,65
PRCA123	9,96	14,39	18,38	125
PRCA135	-3,75	8,89	13,64	123
PRCA157	1,05	17,07	15,43	16,4
PSMA	11,52	31,38	34,79
PSMA	52,82	71,19	66,04
RECA13	5,86	22,55	15,40	37
RECA22	7,33	24,65	23,54	22,5
RECA9	27,67	52,54	45,14	5,3
SAL1	2,76	17,87	44,52	6,5

186/215

Tabela 19: Extermínio Redirecionado de Células de Câncer de Próstata LNcap
mAb	Sem DARTTM	Com TCR-UDART™	Com UDARTTM CD16	FACS
	Meio	Meio	Meio	MFI
SAL2	8,71	30,68	29,17	14,5
SAL3	43,79	92,60	76,46	105
SG24	12,64	66,82	44,99
SG2 7	1,37	55,30	16,96
SKIN2	-2,04	14,81	24,23	73,8
SPL16	9,97	29,90	23,74	5,2
ST05	-1,48	21,11	24,97	61,3
TDH2 8	-4,23	18,55	15,04	13,3
TDH3 6	3,58	19,61	19,79	199
TDH3 7	7,90	18,78	25,22	57,3
TDH4	14,48	37,96	54,64	45,2
TDH4 0	8,51	44,55	43,87	79,3
TDH5	7,35	48,71	38,15	29,1
TDH6	4,50	54,59	19,73	41,7
TES7	50,15	94,47	73,40	22,4

EXEMPLO 5

CAPACIDADE DE MABS B7-H3 SE UNIR A B7H3-2IG SOLÚVEL E B7H3-4IG SOLÚVEL [0421] Como discutido acima, B7-H3 existe em ambas, uma forma contendo domínio 4Ig (B7H3-4Ig) e uma forma contendo domínio 2Ig (B7H3-2Ig). Os anticorpos anti-B7-H3 da presente invenção foram testados por suas capacidades para se unir a B7H3-2Ig solúvel (Figura 4A) e B7H3-4Ig B7-H3 solúvel (Figura 4B). Descobriu-se que os anticorpos exibem uma ampla faixa de características de ligação. Descobriu-se que os anticorpos PRCA123, TDH5, BLA8, BRCA68D e SG24 exibem a ligação mais forte para anticorpos B7H3-2Ig e descobriu-se que os anticorpos TES7, LUCA50, BRCA165, OVCA22, ST09 e PA20 exibem a ligação mais fraca para B7H3-2Ig solúvel. Descobriuse que os anticorpos PRCA123, BRCA69A, BLA8 e BRCA68D exibem a ligação mais forte para B7H3-4Ig solúvel e descobriu-se que

187/215 os anticorpos TES7, 0VCA21, BRCA 165 e ST09 exibem a ligação mais fraca para B7H3-4Ig solúvel.

EXEMPLO 6

LIGAÇÃO DE AFINIDADE DE ANTÍGENOS EM SOLUÇÃO PARA ANTICORPOS MONOCLONAIS CAPTURADOS [0422] A fim de demonstrar a afinidade de ligação entre antígenos em solução e anticorpos monoclonais capturados, anticorpos foram capturados fragmentos de IgG Fcespecífico Fab2 imobilizados em um nível de 100-200 RU. Antígenos B7-H3 e B7-H3(4Ig) foram injetados sobre anticorpos capturados em uma concentração de 100 nM (taxa de fluxo 20 μΐ/min por 120 seg, e a ligação foi medida. Respostas de ligação foram normalizadas para o mesmo nível de mAb capturada e a resposta de ligação para o controle do anticorpo m2B6 (mlgGl) foi subtraída como vazia. Os resultados dessa análise (Figuras 5A-5S; linhas sólidas; B7H3(4Ig) 100 nM; linhas pontilhadas; B7-H3, 100 nM)) demonstraram que os anticorpos da presente invenção exibiram forte ligação a B7-H3(4Ig).

EXEMPLO 7

ANÁLISE DE BIACORE™: TITULAÇÃO DE B7-H3 MABS PARA B7-H3 IMOBILIZADA [0423] A fim de demonstrar as afinidades de ligação relativas de B7-H3-2Ig e B7-H3-4Ig para os anticorpos da presente invenção, uma análise de BIACORE™ foi realizada. Os anticorpos B7-H3 da presente invenção foram permitidos ligar para B7-H3-2Ig imobilizada ou para B7-H3-4Ig e a titulação de ligação durante o tempo foi acessada (Figuras 6A-6I). Descobriu-se que TDH5, PRCA123, BLA8, BRCA69 têm alta afinidade para ambas B7-H3-2Ig e B7-H3-4Ig. Entretanto,

188/215 descobriu-se que seu(s) epítopo(s) é(são) principalmente barrado(s) na molécula B7-H3-4Ig, com apenas um pouco estando disponível. Descobriu-se que OVCA22 tem uma afinidade muito baixa para ambas B7-H3-2Ig e B7-H3-4Ig com seu epítopo estando igualmente disponível em ambas as moléculas. Entretanto, é provável que somente a forma B7-H3-4Ig proveja proximidade suficiente para ligação bivalente de anticorpo (fora de taxa baixa), enquanto que a B7-H3-2Ig pode ser ligada só monovalentemente. Descobriu-se que TDH6 tem apenas qualquer afinidade nesse formato, com ligação para 2Ig provável ser não específica. Descobriu-se que TES7 e PA20 são anticorpos específicos B7-H4-4Ig com afinidade baixa. TES7 provavelmente tem uma baixa na taxa e uma fora da taxa mais elevada do que PA20. BRCA84D foi descoberto ser um anticorpo de afinidade intermediária com uma possibilidade de sítios de múltiplas ligações em ambos B7-H3-2Ig e B7-H3-4Ig. Com base na análise de BIACORE ™, BRCA84D devido seu sítio de ligação incomum foi considerado um dito anticorpo. TES7 e PA20 foram considerados candidatos para ligação específica pra superfícies de antígenos de alta densidade, e um de anticorpo de alta afinidade-baixa especificidade (por exemplo, BRCA69D ou outro).

[0424] A figura 7 provê uma comparação de análise de BIACORE^TM de anticorpos PRCA157, BRCA69D, BLA8, PA20, BRCA84D, GB8 e SG27, ilustrando que o anticorpo antiB7-H3s da presente invenção pode exibir uma variação de propriedades de ligação.

[0425] A figura 8 demonstra a especificidade de não competição de diversos dos anticorpos anti-B7-H3s da presente invenção. No experimento, moléculas B7-H3 de ser

189/215 humano foram incubadas na presença de anticorpo BRCA84D e submetidas à análise de BIACORE™. Depois de aproximadamente 3 minutos um segundo anticorpo anti-B7-H3 foi adicionado para a reação. Se o segundo anticorpo competiu com BRCA84D, ele encontrou os sítios B7-H3 ocluíram e foram incapazes de ligar. Os resultados indicam que os anticorpos BRCA68D, BRCA69D, e PRCA157 não competem com BRCA84D para ligação para B7-H3 de ser humano.

EXEMPLO 8 mAbs ANTI-B7-H3 INTERNALIZAM NAS LINHAGENS DE CÉLULAS CSC E ATCC [0426] A capacidade do anticorpo anti-B7-H3s da presente invenção se tornar internalizado mediante ligação para células cancerosas foi investigada. Células CSC de próstata e células pancreáticas Hs700t foram incubadas com um anticorpo anti-B7-H3. A viabilidade das células foi determinada depois da incubação na presença de um anticorpo secundário anticamundongo saporina-conjugado que será tóxico para as células se ligado ao anticorpo primário e internalizado. Os resultados desta investigação para células CSC de próstata (Figura 9A) e para células pancreáticas Hs700t (Figura 9B) demonstram a capacidade dos anticorpos da presente invenção se tornarem internalizados nas células.

EXEMPLO 9

LIGAÇÃO DE B7-H3 mAb E ANÁLISE DE BLOQUEIO CRUZADO POR ELISA [0427] A fim de explorar a reatividade cruzada dos anticorpos da presente invenção e os epítopos reconhecidos por tais anticorpos, a extensão da ligação ocorrendo na presença de um anticorpo competidor B7-H3 foi

190/215 medida. Os resultados desta análise são mostrados nas Figuras 10A-10F, e mostram que BRCA68D compete com BRCA69D. TES7 e OVCA22 foram também descobertos para competir um com o outro, mas TES7 e não OVCA22 foi descoberto também para competir com ambos BRCA68D e BRCA69D. GB8 foi descoberto para competir com SG27 para ligação para B7-H3-2Ig mas não para B7-H3-4Ig. Os dados são resumidos na Tabela 20 e mostram pelo menos quatro epitopos distintos para B7-H3-4Ig (isto ê, o epítopo reconhecido por SG27, o epítopo reconhecido por GB8, o epítopo reconhecido por OVCA22 e TES7, e o epítopo reconhecido por BRCA68D, BRCA69D e TES7) e pelo menos dois epitopos para B7-H3-2Ig (isto é, o epítopo reconhecido por SG27 e GB8, e o epítopo reconhecido por BRCA68D e BRCA69D).

Tabela 20

Sumário de Análise de Bloqueio Cruzado mAb B7-H3 por ELISA

Anticorpo Competidor	Anticorpo (Porcentagem de ligação vs. MIgG)
B7-H3 4Ig	B7-H3-2Ig
GB 8	BRCA 69D	BRCA 68D	TES7	OVCA 22	GB 8	BRCA 6 9D	BRCA 68D
GB 8	50,211	119,105	108,948	87,480	98,142	26,618	84,408	94,710
TES7	111,234	109,390	108,425	1,605	16,268	100,645	90,734	99,515
OVCA22	121,783	112,322	100,813	3,371	2,048	100,423	87,991	102,766
TDH6	105,591	105,065	100,494	99,839	96,701	100,089	66,086	100,728
SG2 7	101,266	103,021	97,763	78,331	87,789	64,421	89,927	94,225
BRCA68D	105,934	40,284	43,144	4,815	102,655	98,888	7,635	7,425
BRCA69D	102,558	66,291	71,441	4,334	96,928	94,952	17,346	17,059
MIgG	100,000	100,000	100,00	100,000	100,000	100,000	100,000	100,000

191/215

Os atributos do anticorpo chave anti-B7-H3s da presente invenção são mostrados na Tabela 21. Com base em sua coloração diferencial exibida de tecidos normais e de câncer, suas capacidades para ligar B7-H3-4Ig como também B7-H3-2Ig, suas afinidades de ligação são medidas pela análise BIACORE™ descrita acima e suas capacidades para ligar para cinomólogos B7H3, anticorpos, BRCA68D, BRCA69D, BRCA84D, e PRCA157 foram julgados ser os anticorpos mais preferidos. Tabela 21
MAb	BRCA 84D	TDH 6	TES7	BRCA 68D	BRCA 69D	GB8	SG 27	OVCA 22	PRCA 157
Isótipo	Gl/k	Gl/k	Gl/k	Gl/k	Gl/k	Gl/k	2b/k	Gl/k	Gl/k
IHC	2a	2a	2a	2b	2b	2b	2b	2c	2c
Matriz ATCC	2	1	1	3	3	3	1	3	2
Tecido Normal
Cólon	1 +	1 +			1 +		1 +	2 +	2 +
Pulmão	1 +	1 +		1 +
Fígado	1 +	1 +		2 +	2 +		1 +	2 +	2 +
Rim		1 +		1 +	1 +		1 +
Pâncreas		1 +		1 +			1 +	2 +
Pele									2 +
Tecido Canceroso
Cólon	1231*	1110*	1,5	2321*	2231*		1221*	1122	2231*
Pulmão	1130	1010	1,75	3332	3231		1120	3131**	3231
Próstata	112	111	3	333	333		222	222	333
Mama	1111	1011	3	3333	3333		1122	3233	2333
Internaliza- ção	+	+	+	+	+	+	+	+	+
U-DART™	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Especificidad e	4Ig 2Ig	4Ig 2Ig	4Ig	4Ig 2Ig	4Ig 2Ig	4Ig 2Ig	4Ig 2Ig	4Ig	4Ig 2Ig
Grupo Epítopo	A	B	C	D	D	E	F	G	H
BIACORE™	+	+ /-	+	+ +	+ +	+	+	+	+ /-
Ligação de B7-H3 Cinomóloga	++	+		++	++	++	+	+	++
Notes: * Indica a coloração do estroma ** coloração do estroma 3+

EXEMPLO 10

ANTICORPO HUMANIZADO ANTI-B7-H3S [0428] O anticorpo monoclonal BRCA84D foi humanizado a fim de produzir anticorpos (genericamente

192/215 designados aqui como hBRCA84D) oferecendo potencial terapêutico de ser humano aprimorado. As sequências da cadeia leve variável, e a cadeia pesada variável, e suas respectivas sequências de aminoácidos e polinucleotídeos do anticorpo humanizado resultante (designado aqui como hBRCA84D-l) são providas abaixo:

[0429] Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada (SEQ ID N2:68):

blQLTQSPSE LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS

ASYRYSGVPE EFSGSG3GTD FTLTI33LQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIK [0430] Sequência de Polinucleotídeos Codificando

Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada (SEQ ID NR:69):

gacatccagc cagagtgacc cctggtatca gcctcctacc tggcaccgac ccacctacta ggcaccaagc tgacccagtc atcacatgca gcagaagcct ggtactccgg ttcaccetga ctgccagcag tggaaatcaa cccctccttc aggcctccca ggcaaggccc cgtgccttcc ccatctccag tacaacaact ctgtctgcct gaacgtggac ctaagctgct aggttctccg cctgcagcct accctttcac ccgtgggcga accaacgtgg gatctactcc gctccggctc gaggacttcg cttcggccag [0431]

Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada

CDRi (SEQ ID N°:70): KASQNVDTNVA [0432]

Sequência de Polinucleotídeos Codificando

Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 CDRi (SEQ ID NR:71):

aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc [0433] Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada

CDR2 (SEQ ID N2:72)	: SASYRYS
[0434]	Sequência de Polinucleotídeos Codificando

Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR₂ (SEQ ID NR:73 tcggcatcct accggtacag t

[0435]

Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada

CDR₃ (SEQ ID N2:74) :

QQYNNYPFT

193/215 [0436] Sequência de Polinucleotideos Codificando

Cadeia Leve Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR3 (SEQ ID N°:75):

cagcaatata acaactatcc attcacg [0437] Sequência de Aminoácidos de Cadeia Pesada

Variável BRCA84D-1 Humanizada (SEQ ID NR:80):

evqlvesggg lvqpggslrl scaasgftfs sfgmhwvrqa pgkglewvay ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCARGR ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS [0438] Sequência de Polinucleotideos Codificando

Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada (SEQ ID NR:81):

gaggtgcagc cctgagactg tgcactgggt atctcctccg gttcàücatc actccetgcg gagaatatct cgtgaccgtg tggtcgagtc tcttgcgccg ccgccaggct actcctccgc tcccgggaca ggacgaggac actacggctc tcctct tggcggagga cctccggcrt ccaggcaagg catctactac acgccaagaa accgccgtgt ccggctggat ctggtgcagc caccttctcc gactggaatg gccgacaccg ctccct gt ac act act goge tattggggcc ctggcggctc agcttcggca ggtggcctac tgaagggcag ctgcagatga cagaggccgg agggcaccac [0439]

Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1

Humanizada CDRi (SEQ ID NR: 82) : ^FG™ [0440] Sequência de Polinucleotideos Codificando

Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada CDRi (SEQ ID

NR-83) · tttggaatgcac [0441] Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1

Humanizada CDR₂ (SEQ ID N°:84) : YISSDSSAIYYADTVK [0442] Sequência de Polinucleotideos Codificando

Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR₂ (SEQ ID

NR·85) · tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag [0443] Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1

Humanizada CDR₃ (SEQ ID NR: 86) : GRENIYYGSFLDY [0444] Sequência de Polinucleotideos Codificando

Cadeia Pesada Variável BRCA84D-1 Humanizada CDR3 (SEQ ID

NR_:87) : gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactac

194/215 [0445] Figuras 11A-11B mostram o alinhamento dos resíduos de aminoácidos de cadeias leves variáveis (Figura 11 A) ou cadeias pesadas variáveis (Figura 11B) de BRCA84D e seu derivado humanizado, hBRCA84D.

[0446] A fim de obter espécies de hBRCA84D que exibem afinidade melhorada para B7-H3 de ser humano, polinucleotídeos codificando cadeias leves ou pesadas de hBRCA84D-l (isto é, hBRCA84D-lVL ou hBRCA84D-1VH, respectivamente) foram submetidas à mutagênese e derivados de cadeia leve hBRCA84D-l mudados hBRCA84D-2VL, hBRCA84D-3VL, hBRCA84D-4VL, hBRCA84D-5VL, e hBRCA84D-6VL e derivados de cadeia pesada hBRCA84D-l mudados hBRCA84D-2VH, hBRCA84D-3VH, e hBRCA84D-4VH foram isolados e caracterizados. As sequências de aminoácidos e polinucleotídeos das cadeias leves e pesadas variáveis desses anticorpos são apresentadas abaixo:

[0447] hBRCA84D-2VL (SEQ ID NP:89):

DIQLTQSPSE LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIK [0448] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-2VL (SEQ ID N°: 90) :

gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g [0449] hBRCA84D-3VL (SEQ ID NP:91):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ ΥΝΝΥΡΓΤΚΰΰ GTKLEIK [0450] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-3VL (SEQ ID NP:92) :

195/215 gacatccagc cagagtgtcc cctggtatca gcctcctacc tggcaccgac ccacctacta ggcaccaagc tgacccagtc gtcacatgca gcagaagcct ggtactccgg ttcaccctga ctgccagcag tggaaatcaa cccctccttc aggcctccca ggcaaggccc cgtgccttcc ccatctccag tacaacaact g ctgtctgcct gaacgtggac ctaagctgct aggttctccg cctgcagcct accctttcac ccgtgggcga accaacgtgg gatctactcc gctccggctc gaggacttcg cttcggccag [0451] hBRCA84D-4VL (SEQ ID N£:93):

DIQLTQSPSF L3ASVGDRVT ITCKA3QNVD ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP GTKLEIK

TNVAWYQQKP GQAPKLLIY3

EDFATYYCQQ YNNYPITTFGQ (SEQ [0452]

Polinucleotídeo

Codificando hBRCA84D-4VL gacatccagc cagagtgacc cctggtatca gcctcctacc tggcaccgac ccacctacta ggcaccaagc tgacccagtc atcacatgca gcagaagcct ggtactccgg ttcaccctga ctgccagcag tggaaatcaa cccctccttc aggcctccca ggccaggccc cgtgccttcc ccatctccag tacaacaact g ctgtctgcct gaacgtggac ctaagctgct aggttctccg cctgcagcct accctttcac ccgtgggcga accaacgtgg gatctactcc gctccggctc gaggacttcg cttcggccag [0453]

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD ASVRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP GTKLEIK

TNVAWYQQKP GQAPKALIYS

EDEATYYCQQ YNNYPFTFGQ (SEQ [0454]

Polinucleotídeo

Codificando hBRCA84D-5VL gacatccagc cagagtgacc cctggtatca gcctcctacc tggcaccgac ccacctacta ggcaccaagc tgacccagtc atcacatgca gcagaagcct ggtactccgg ttcaccctga ctgccagcag tggaaatcaa cccctccttc aggcctccca ggccaggccc cgtgccttcc ccatctccag tacaacaact g

ctgtctgcct gaacgtggac ctaaggcgct aggttctccg cctgcagcct accctttcac ccgtgggcga accaacgtgg gatctactcc gctccggctc gaggacttcg cttcggccag [0455]

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP GTKLEIK

TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS

EDFAEYYCQQ YNNYPFTFGQ (SEQ [0456]

Polinucleotídeo

Codificando hBRCA84D-6VL

196/215 gacatccagc cagagtgacc cctggtatca gcctcctacc tggcaccgac ccgagtacta ggcaccaagc tgacccagtc atcacatgca gcagaagcct ggtactccgg ttcaccctga ctgccagcag tggaaatcaa cccctccttc aggcctccca ggcaaggccc cgtgccttcc ccatctccag tacaacaact ctgtctgcct gaacgtggac ctaagctgct aggttctccg cctgcagcct accctttcac ccgtgggcga accaacgtgg gatctactcc gctccggctc gaggacttcg cttcggccag [0457] hBRCA84D-2VH (SEQ ID NP:99):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTES SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV ΞΞ [0458] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-2VH (SEQ ID NP: 100) :

gaggtgcagc cctgagactg tgcactgggt atctcctccg gttcaccatc actccctgcg gagaatatct cgtgaccgtg tggtcgagtc tcttgcgccg ccgccaggct actcctccgc tcccgggaca ggacgaggac actacggctc tcctct tggcggagga cctccggctt ccaggcaagg catctactac acgccaagaa accgccgtgt ccggctggat ctggtgcagc caccttctcc gactggaatg gccgacaccg ctccctgtac actactgcgg tattggggcc ctggcggctc agcttcggca ggtggcctac tgaagggcag ctgcagatga cagaggccgg agggcaccac [0459] hBRCA84D-3VH (SEQ ID N°:101):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAMYYCGRGR ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS [0460] Polinucleotídeo Codificando hBRCA84D-3VH (SEQ ID NP: 102) :

gaggtgcagc cctgagactg tgcactgggt atctcctccg gttcaccatc actccctgcg gagaatatct cgtgaccgtg tggtcgagtc tcttgcgccg ccgccaggct actcctccgc tcccgggaca ggacgaggac actacggctc tcctct tggcggagga cctccggctt ccaggcaagg catctactac acgccaagaa accgccatgt ccggctggat ctggtgcagc caccttctcc gactggaatg gccgacaccg ctccctgtac actactgcgg tattggggcc ctggcggctc agcttcggca ggtggcctac tgaagggcag ctgcagatga cagaggccgg agggcaccac [0461] hBRCA84D-4VH (SEQ ID NP:103):

EVQLVESGGG LVQPGGSLFL SCAASGFTFS SFGMHWVFQA PGKGLEWVAY ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRSED TAVYYQARGR ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS

197/215 [0462]

Polinucleotideo Codificando hBRCA84D-4VH (SEQ ID N°:104):

gaggtgcagc cctgagactg tgcactgggt atctcctccg gttcaccatc actccctgcg gagaatatct cgtgaccgtg tggtcgagtc tcttgcgccg ccgccaggct actcctccgc tcccgggaca gagcgaggac actacggctc tcctct tggcggagga cctccggctt ccaggcaagg catctactac acgccaagaa accgccgtgt ccggctggat ctggtgcagc caccttctcc gactggaatg gccgacaccg ctccctgtac actactgcgc tattggggcc ctggcggctc agcttcggca ggtggcctac tgaagggcag ctgcagatga cagaggccgg agggcaccac [0463] A tabela 22 lista a cadeia leve variável hBRCA84D e mutações de cadeia pesada variáveis estudadas, os números se referem ao sistema de numeração de Kabat utilizado nas Figuras 11A e 11B.

Tabela 22
Cadeia Leve Variável	Cadeia Pesada Variável
Posição Kabat	20	21	42	46	85	Posição Kabat	84	89	93
BRCA84D	S	V	Q	A	E	BRCA84D	S	M	G
hBRCA84D-lVL	T	I	K	L	T	hBRCA84D-lVH	D	V	A
hBRCA84D-2VL	T	I	K	A	T	hBRCA84D-2VH	D	V	G
hBRCA84D-3VL	S	V	K	L	T	hBRCA84D-3VH	D	M	G
hBRCA84D-4VL	T	I	Q	L	T	hBRCA84D-4VH	S	V	A
hBRCA84D-5VL	T	I	Q	A	T
hBRCA84D-6VL	T	I	K	L	E

[0464] As afinidades de ligação relativa dos derivados da cadeia leve hBRCA84D, hBRCA84D-3VL, hBRCA84D-4VL e hBRCA84D-5VL para B7-H3 de ser humano forame determinadas pela formação de anticorpos contendo essas regiões variáveis de cadeia leve e uma cadeia pesada BRCA84D-1VH quimérica (Figura 12) . BRCA84D-5VL (K42Q, L46A) foi descoberta ter a mais alta afinidade de ligação do hBRCA84D-VL testado. BRCA84D-5VL foi desta maneira usado como a cadeia leve para investigar as afinidades de ligação relativas às cadeias pesadas hBRCA84D de hBRCA84D-lVH, hBRCA84D-2VH, hBRCA84D-3VH e hBRCA84D-4VH para B7-H3 de ser humano (Figura 13).

198/215

Descobriu-se que hBRCA84D-2VH (A93G) tem a mais alta afinidade de ligação do hBRCA84D-VH testado.

[0465] 0 aminoácido e as sequências codificando polinucleotídeos de BRCA84D-1 quimérico são como a seguir: [0466] Cadeia Leve chBRCA84D (SEQ ID N°:105):

DIAMTQSOKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALJYS asyrysgvfd rftgsgsgtd ftltinnvos edlaeyfcqq ynnypftfgs GTKLEIKRTV AAPSVFIFEE SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC [0467] Polinucleotídeo Codificando Cadeia Leve chBRCA84D (SEQ ID NP:106):

gacattgcga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag cctggtatca acagaaacca gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacaa tgtgcagtct gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacaact atccattcac gttcggctcg gggacaaagt tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag [0468] Cadeia Pesada chBRCA84D (SEQ ID NP:107):

DVQLVE3GGG ISSDSSAIYY ENIYYGSRLD VKDYFPEPVT QTYICNVNHK KPKDTLMISR YNSTYRWSV PQVYTLPPSR PVLDSDGSFF GK

LVQPGGSRKL

ADTVKGRFTI

YWGQGTTLTV VSHNSGALTS PSNTKVDRRV TPEVTCVWD LTVLHQDWLN DELTKNQVSL LYSKLTVDKS

SCAASGFTFS

SRDNPKNTLF SSASTKGPRV GVHTFPAVLQ EPKSCDKTHT VSHEDPEVKF GKEYKCKVSN TCLVKGFYPS RWQQGNVFSC

FGMHWVRQA LQMTSLRSED FPLAPSSKST SSGLYSLSSV CFPCPAPELL NWYVDGVEVH KALPAPIEKT DIAVEWESNG SVMHEALHNH

PEKGLEWVAY TAMYYCGRGR SGGTAALGCL VTVPSSSLGT GGPSVFLFPP NAKTKPREEQ ISKAKGQPRE QFENNYKTTP YTQKSLSLSP [0469]

Polinucleotídeo Codificando Cadeia Pesada

199/215 chBRCA84D (SEQ ID N2:108):

gatgtgcagc ccggaaactc tgcactgggt attagtagtg attcaccatc ccagtctaag gaaaacattt tctcacagtc caccctcctG gtcaaggact cctgaccagc tctactccct cagacctaca caagagagtt gcccagcacc aaacccaagg ggtggtggac tggacggcgt tacaacagca ctggctgaat cagcccccat ccacaggtgt ggtcagcctg tggagtggga tggtggagtc tcctgtgcag tcgtcaggct acagtagtgc tccagagaca gtctgaggac actacggtag tcctcagcct caagagcacG acttccccga ggcgtgcaca cagcagcgtg tctgcaacgt gagcccaaat tgaactcctg acaccctcat gtgagccacg ggaggtgcat cgtaccgtgt ggcaaggagt cgagaaaacc acaccctgcc acctgcctgg gagcaatggg tgggggaggc cctctggatt ccagagaagg catctactat atcccaagaa acggccatgt taggcttgac ccaccaaggg tctgggggca accggtgacg ccttcccggc gtgaccgtgc gaatcacaag cttgtgacaa gggggaccgt gatctcccgg aagaccctga aatgccaaga ggtcagcgtc acaagtgcaa atctccaaag cccatcccgg tcaaaggctt cagccggaga ttagtgcagc cactttcagt ggctggagtg gcagacacag caccctgttc attactgtgg tactggggcc cccatcggtc cagcggccct gtgtcgtgga tgtcctacag cctccagcag cccagcaaca aactcacaca cagtcttcct acccctgagg ggtcaagttc caaagccgcg ctcaccgtcc ggtctccaac ccaaagggca gatgagctga ctatcccagc acaactacaa ctggagggtc agctttggaa ggtcgcatac tgaagggccg ctgcaaatga aagagggagg aaggcaccac ttccccctgg gggctgcctg actcaggcgc tcctcaggac cttgggcacc ccaaggtgga tgcccaccgt cttcccccca tcacatgcgt aactggtacg ggaggagcag tgcaccagga aaagccctcc gccccgagaa ccaagaacca gacatcgccg gaccacgcct [0470] As afinidades de ligação relativas de anticorpos contendo: (1) hBRCA84D-2VL e hBRCA84D-2VH (dois testes), (2) BRCA84D quimérica, (3) anticorpo contendo hBRCA84D-5VL e BRCA84D-HC quimérico, e (4) anticorpo contendo hBRCA84D-5VL e hBRCA84D-2VH foram comparados. Os resultados são mostrados na Figura 14.

EXEMPLO 11

ANTICORPOS ANTI-B7-H3S HUMANIZADOS INIBEM O CRESCIMENTO DE TUMOR EM XENOENXERTOS [0471] A fim de demonstrar a capacidade dos anticorpos anti-B7-H3 humanizados para inibir crescimento de tumor in vivo, o crescimento de tumor de células de carcinoma

200/215 urinário de bexiga HT-1197 e de células de carcinoma renal A498 foi estudado em um xenoenxerto de murino. O anticorpo hBRCA84D-2 humanizado (cadeia VL hBRCA84D-2 / cadeia VL hBRCA84D-2) foi modificado para compreender uma região de Fc tendo substituições L235V, F243L, R292P, Y300L, e P396L. O Fc- modificado de anticorpo hBRCA84D-2 foi administrado para

camundongos (em	uma	dose	de	1 pg/kg,	10 qg/kg, ou 20 qg/kg) 7
dias, 14 dias,	21	dias	e	28 dias	depois	do	implante das
células cancerosas.	Os	resultados	mostram	que	em todas as

doses o anticorpo hBRCA84D-2 Fc-modificado administrado foi capaz de inibir o crescimento do tumor de células de carcinoma urinário de bexiga HT-1197 (Figura 15) e de células A498 de carcinoma renal (Figura 16).

EXEMPLO 12

REAGENTES DE REDIRECIONAMENO DE AFINIDADE DUPLA (DARTTMS) ESPECÍFICOS PARA RECEPTOR B7-H3 E DE CÉLULA T MEDEIAM EXTERMÍNIO DE CÉLULA T REDIRECIONADA POTENTE [0472] Os reagentes de redirecionamento de afinidade dupla (DART^TMs) específico para B7-H3 e o receptor de célula T- (TCR) e para o Grupo receptor de Células Exterminadoras Naturais 2D (NKG2D) foram preparadas. Tais DART^TMs têm a capacidade para localizar uma célula T (pela ligação de tal célula T para a porção de ligação de TCR de um DART^TM de ligação de TCR) ou localizar uma célula NK (por ligação de tal célula NK para a porção de ligação de NKG2D de um DART^TM de ligação de NKG2D) para o local de uma célula cancerosa (pela ligação de tal célula cancerosa à porção de ligação B7-H3- do DART^TM) . A célula T ou célula NK localizadas podem depois mediar o exterminador da célula

201/215 cancerosa em um processo denominado aqui exterminador redirecionado.

[0473] 0 reagente de redirecionamento de afinidade dupla (DART™) específico para B7-H3 e o receptor de célula T (TCR) foi considerado tendo os domínios variáveis de anti-B7-H3 de hBRCA84D-2 e domínios variáveis anti-TCR:

[04 74] Cadeia DART™ de bobina TCR VL x hBRCA84D VH-2-E (SEQ ID N2:109):

ETVLTQSPAT LSLSPGERftT L5CSATSSVS YMHWYQQKFG KAPKRWIYOT

SKLASGVPSR FSGSG3GTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG

TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSSEGMHW

VRQAPGKGLE WVAYISSDSS AIYYADTVKG RFTI3RDNAK NELYLQMWSL rdedtavyyC GrGreniyyG SrldywGQGt TVTVSSGGCG GGEVAALEKE

VAALEKEVAA LEKEVAALEK [0475]

Polinucleotídeo Codificando TCR VL x

Cadeia de bobina hBRCA84D VH-2-E DART™ (SEQ ID N°:110):

gaaattgtgt aagagccacc ggtatcagca tccaaactgg gacagaattt cttattactg accaagcttg gctggtcgag tgtcttgcgc gtccgccagg cgactcctcc tctcccggga tgacacagtc ctctcctgca gaaaccaggg cttctggggt actctcacaa tcagcagtgg

cgcctccggc ctccaggcaa gccatctact cgggacgagg caacgccaag acaccgccgt ctactacggc tgtcctccgg tcccggctgg

tccagccacc gtgccacctc aaagccccta cccatcaagg ctgtctttgt aagtgtaagt agcgctggat ttcagcggca ctccagggga tacatgcact ctatgacaca gtggatctgg tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg aggcggatcc ggcggcggag gcgagqtqca gactggtgca gcctggcggc tccctgagac ttcaccttct ccagcttcgg catgcactgg gggactggaa tgggtggcct acatctcctc acgccgacac cgtgaagggc aggttcacca aactccctgt acctgcagat gaactccctg gtactactgc ggcagaggcc gggagaatat accgtgaccg ccagggcacc

attattgggg

[0476] Cadeia de bobina hBRCA84DVL-2 x TCR VH K (SEQ ID N°:lll) :

202/215

DIQLTQSPSF ASYRYSGVPS GTKLEIKGGG WVRQAPGQGL LRSEDTAVHY [0477]

LSASVGDRVT RFSGSGSGTD SGGGGQVQ1V EWIGYINPYN CARGSYYDYD KEKVAftLKE

ITCKASQNVD FTLTISSLQP QSGAEVKKPG DVTKYNEKFK GFVYWGQGTL

Polinucleotídeo

TNVAWYQQKP

EDFATYYCQQ

ASVKVSCKAS

GRVT1TADKS VTVSSGGOGG

GKAPKALIYS YNNYPFTFGQ GYKFTSYVMH TSTAYLQMNS GKVAALKEKV

x Cadeia de bobina TCR VH - K (SEQ ID NR;112):

gacatccagc cagagtgacc cctggtatca gcctcctacc tggcaccgac ccacctacta ggcaccaagc tcagctggtg aggtctcctg tgggtgcgac tctttacaat cgattaccgc ctgagatccg tgattacgac tgacccagtc atcacatgca gcagaagcct ggtactccgg ttcaccctga ctgccagcag tggaaatcaa cagtctggag caaggccagc aggcccctgg gatgttacta ggacaaatcc aggacacggc gggtttgttt cccctccttc aggcctccca ggcaaggccc cgtgccttcc ccatctccag tacaacaact qggaqgcgga ctgaggtgaa ggttacaagt acaagggctt agtacaatga acgagcacag cgtgcactac actggggcca ctgtctgcct gaacgtggac ctaaggcgct aggttctccg cctgcagcct accctttcac tccggcggcg gaagcctggg ttaccagcta gagtggatcg gaagttcaaa cctacctgca tgtgcgagag agggactctg ccgtgggcga accaacgtgg gatctactcc gctccggctc gaggacttcg cttcggccag

gcctcagtga cgtgatgcac gatatattaa ggcagagtca gatgaacagc ggagctacta gtcactgtga

ÊÈSL^a3aagçjt. cgccgcactt aag^aaaagg tcgcagccct aaaaSFãa [0478] Um reagente de redirecionamento de afinidade dupla (DART™) específico para B7-H3 e o receptor do Grupo 2D de Exterminadores Naturais (NKG2D) foi considerado tendo os domínios variáveis anti-B7-H3 de hBRCA84D-2 e domínios variáveis anti-TCR:

[0479] Cadeia DART™ de Bobina NKG2D VL x hBRCA84D VH-2-E (SEQ ID N2: 113) :

QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY YDDLLP3GVS DRFSGSKSGT SAELAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGPV FGGGTKLTVL GGG5GGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF GMHWVFQAFG KGLEWVAYIS SDS5ATYYAD TVKGRFTI5R DNAKNSLYLQ MNSLRDEDTA VYYCGRGREN IYYGSRLDYW GQGTTVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEKE VAALEKEVA ALEK

203/215 [0480]

Polinucleotideo Codificando Cadeia DART™ de Bobina NKG2D cagtctgccc aatcaccatc ttaactggta tatgatgacc gtctggcacc aggctgatta ttcggcggag aggcgagqtg gctccctgag ggcatgcact ctacatctcc gcaggttcac atgaactccc ccgggagaat ccaccgtgac

SSSaStSgca tgactcagcc tcctgttctg ccagcagctc tactgccctc tcagccttcc ttactgtgca ggaccaagct cagctggtcg actgtcttgc gggtccgcca tccgactcct catctcccgg tgcgggacga atctactacg cgtgtcctcc aggttgctgc tttggagaag tgcctccgtg gaagcagctc ccaggaaagg aggggtctct tggccatcag gcatgggatg gaccgtccta agtctggcgg gccgcctccg ggctccaggc ccgccatcta gacaacgcca ggacaccgcc gctcceggct ggaggatgtg tctgggtctc caacatcgga ctcccaaact gaccgattct tgggctccag acagcctgaa ggaggcggat aggactggtg gcttcacctt aagggactgg ctacgccgac agaactccct gtgtactact ggattattgg gcggtggaga ctggacagtc aataatgctg cctcatctat ctggctccaa tctgaggatg tggtccagtg ccggcggcgg cagcctggcg ctccagcttc aatgggtggc accgtgaagg gtacctgcag gcggcagagg ggccagggca ,ã£SS££SS. cacttjaaaa [0481]

Cadeia de bobina hBRCA84DVL-2 x NKG2D VH

K (SEQ ID N2:

DIQLTQ3PSF

ASYRYSGVPS GTKLEIKGGG WVRQAPGKGL LRAEDTAVYY

VAALKEKVAA

LSASVGDRVT RFSGSGSGTD SGGGGDVQLV EWVAFIRYDG CAKDRGLGDG LKEKVAALKE

ITCKASQNVD FTLTISSLQP ESGGGLVKPG SWKYYADSVK TYFDYWGQGT

TNVAWYQQKP

EDFATYYCQQ

GSLRLSCAAS

GRFTISRDNS

TVTVSSGGCG

GKAPKALIYS YNNYPFTFGQ GFTFSSYGMH

KNTLYLQMNS GGKVAALKEK [0482]

Polinucleotideo

Codificando Cadeia de bobina hBRCA84DVL-2 x NKG2D VH-K (SEQ ID N2: 116) :

204/215 gacatccagc tgqcccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cetggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa qggaggcggg tocggcgqeg g&ggccaqqt acagctggtg gagtctgggg gaggcctggt caagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcgtct ggattcacot tcagtagcta tggcatgcac tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg gagtgggtgg catttatacg gtatgatgga agtaataaat actatgcaga ctccgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaattcc aagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc ctgagagctg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgaaag atcgaggttt gggggatgga acctactttg actactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaaq tgçfcccfcact Çjaaggaíjaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag [0483] A fim de demonstrar a capacidade de DART™s para mediar tal extermínio redirecionado de células cancerosas, os acima descritos hBRCA84D-2 / anti-TCR DART™ (T-DART™), hBRCA84D-2, hBRCA84D-2 (Fc-modifiçado: L235V,

F243L, R292P, Y300L, e P396L), e um controle de TCR-DART™ foram incubados em várias concentrações com células cancerosas alvo (SK-MES-1 célula cancerosas de pulmão, A498 células de carcinoma renal, LNCaP células cancerosas de próstata, ou células de melanoma UACC-62) e efetor remanescente PBMC (E:T proporção =30:1) e citotoxicidade foi determinada (Ensaio de LDH). Os resultados dessas investigações são mostrados nas Figuras 17A-17D e demonstram capacidade de hBRCA84D-2 / anti-TCR DART™ (T-DART™) para mediar extermínio redirecionado de células cancerosas.

EXEMPLO 13

PERFIL FARMACOCINÉTICO EM CAMUNONGOS SEM TUMOR [0484] O anticorpo anti-B7-H3 (Mabl) foi injetado em camundongos machos mCD16-/-, hCD16A_FOXNl (5

205/215 mg/kg; IV) e soro foi ensaiado (pré-dose e) em 2, 15, 30 min, e 1, 2, 4, 6 horas, e 1, 2, 3, 6, 8, 14, 21, e 28 dias depois da injeção. Descobriu-se que o anticorpo tem um T ½ de 10,54 dias e um de 43,493 pg/ml. A concentração de anticorpo durante o tempo foi descoberta ser bifásica, se ajustando em um modelo de dois componentes (Figuras 18A-18B). Os perfis farmacocinéticos previstos gerados usando um modelo de 2 compartimentos com parâmetros de 5 mg/kg de dose são mostrados na Figura 18C.

EXEMPLO 14

HABILIDADE DE ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE SE UNIR ÀS CÉLULAS CANCEROSAS DE BEXIGA URINÁRIA HT-1197 E PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DO TUMOR EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO [0485] O anticorpo anti-B7-H3 (Mab1) descrito acima foi acessado por sua capacidade de ligar HT-1197, uma linha de carcinoma de bexiga urinária expressando B7-H3 de ser humano. Como mostrado na Figura 19, tais células exibem maior expressão de PRCA135 do que HER2, e dessa maneira são particularmente apropriados para acessar o potencial terapêutico dos anticorpos da presente invenção para remediar tumores HT-1197. De acordo com esta conclusão, variantes de anticorpo anti-B7-H3 hBRCA84D foram encontrados sendo capazes de ligação para células HT-1197. Figura 20 mostra a afinidade de ligação de anticorpos Mab1 para células HT-1197.

[0486] Camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com células 8 x 10⁶ HT-1197. As células do tumor foram implantadas em 200 pl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab 1 foi iniciado dentro de 7 dias de implante através

206/215 de iv Q7D x5 usando doses de 0.1, 0.5, 1, 5, ou 10 mg/kg (oito camundongos fêmeas por dose) . Centuximabe (anticorpo anti-EGRF) foi administrado para um grupo de controle de camundongos em doses de 1, 5, ou 15 mg/kg (oito camundongos fêmeas por dose). Oito camundongos fêmeas foram também injetadas com veículo ou com controle de 10 mg/kg IgG. Medições de tumor foram feitas a cada 3-4 dias. Os resultados do experimento (Figura 21A) mostram que Mab 1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de bexiga urinária em modelo de enxerto murino. Figura 21B mostra os resultados obtidos usando centimab. Uma comparação das figuras 21A e 21B demonstra que os anticorpos da presente invenção são mais eficazes do que centimab par prevenir ou inibir desenvolvimento de tumor de bexiga urinária mo modelo de xenoenxerto de murino. A figura 21C compara os resultados obtidos nas doses máximas testadas.

EXEMPLO 15

HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE SE UNIR ÀS CÉLULAS CANCEROSAS DE BEXIGA URINÁRIA HT-1376 E PREVENIR OU

INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE

XENOENXERTO DE MURINO [0487] O anticorpo

TUMOR EM UM MODELO DE anti-B7-H3 (Mab1) descrito acima foi acessado por sua capacidade de ligar HT-1376, uma linha de célula de carcinoma de bexiga urinária B7-H3humana. Como mostrado nas Figuras 22A-22B, tais células exibem maior expressão de PRCA135 do que HER2 ou PMSA, e dessa maneira são particularmente apropriados para acessar o potencial terapêutico dos anticorpos da presente invenção em remediar tumores HT-1376. De acordo com essa conclusão, descobriu-se que as variáveis de anticorpo anti-B7-H3

207/215 hBRCA84D são capazes de ligação às células HT-1197. Figuras 22A-22B mostram a afinidade de ligação de anticorpos Mab1 para células HT-1197.

[0488] Camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com células 5 x 10⁶ HT-1376. As células do tumor foram implantadas em 200 pl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab 1 foi iniciado dentro de 7 dias de implante através de iv Q7D x4 em uma dose de 1 mg/kg. Os resultados do experimento (Figura 23) mostra que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de bexiga urinária no modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 16

HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE SE UNIR ÀS CÉLULAS CANCEROSAS [0489] O anticorpo anti-B7-H3 BRCA84D foi acessado através de análise de FACS por sua capacidade para ligar: células cancerosas colorretais SW480 e SW620; células cancerosas gástricas AGS; melanoma de célula M-14 e LOX IMVI; células cancerosas de próstata 22rv; e células cancerosas pancreáticas AsPC-1 e BxPc-3; e células cancerosas renais A498 e 786-0. Descobriu-se que o anticorpo é capaz de se unir a todas as tais células.

EXEMPLO 17

HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR GÁSTRICO EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO [0490] Os camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 5 x 10⁶ células AGS. As células do tumor foram implantadas em 200 pl

208/215 de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante através de iv Q7D x5 usando doses de 0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg. Os resultados do experimento (Figura 24) mostraram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor gástrico em um modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 18

HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE SE UNIR ÀS CÉLULAS CANCEROSAS DE PULMÃO E PREVENIR OU INIBIR DESENVOLVIMENTO DE TUMOR EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO [0491] As células cancerosas de pulmão A549 foram incubadas na presença de variáveis de hBRCA84D, chBRCA84D e hBRCA84 (0264 Fc) e o efeito citotóxico desses anticorpos foi determinado. Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 25, e indicam que todos os três dos anticorpos eram citotóxicos para as células A549.

[0492] Os camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 8 x 10⁶ células A549. As células do tumor foram implantadas em 200 pl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com

Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante através de iv Q7D x4 usando uma dose de 1 mg/kg. Os resultados do experimento (Figura 26) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor canceroso de pulmão no modelo de xenoenxerto de murino.

[0493] Análise de FACS foi conduzida em células cancerosas de pulmão CaLu3 a fim de determinar se tais células ligam anticorpo anti-B7-H3s. O experimento confirmou que tais células expressam B7-H3 e se unem aos anticorpos da

209/215 presente invenção. Para determinar se os anticorpos da presente invenção foram eficazes para prevenir ou inibir desenvolvimento de tumor de câncer de pulmão, camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 5 x 10⁶ de células CaLu3. As células do tumor foram implantadas em 200 pl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias de implante via iv Q7D x4 usando uma dose de 0,5, 1, ou 5 mg/kg. Os resultados do experimento (Figura 27) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer de pulmão no modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 19

HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 PARA PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR DE MELANOMA LOX EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO [0494] Os camundongos (oito fêmeas mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com células cancerosas de melanoma LOX-IMVI e depois inoculados com iv/Q7D x3 com controle de PBS, controle de IgG (5/mg/kg), Mab1 (0,5, 1, 5 ou 10 mg/kg), ou ip/BIWx2 com Doxetaxel (5, 10 ou 20 mg/kg). As células do tumor foram implantadas em 200 pl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante. Os resultados do experimento (Figuras 28A-28C) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento do tumor de câncer de melanoma em modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 20

210/215

HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 PARA PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR DE MELANOMA UACC-62 EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO [0495] Os camundongos (oito fêmeas mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com células cancerosas de melanoma UACC-62 e depois inoculados iv/Q7D x5 com controle PBS, controle IgG (5/mg/kg) ou Mab1 (0,5, 1, 5 ou 10 mg/kg). As células do tumor foram implantadas em 200 pl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante. Os resultados do experimento (Figura 29) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer de próstata no modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 21

HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR DE PRÓSTATA 22RV EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO [0496] Os camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 6 x 10⁶ 22rv de células cancerosas de próstata e depois inoculados iv/Q7D x4 com controle PBS, IgG (10 mg/kg), Mab1 (0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg; Q7D x5) ou Trastuzumabe (1,7 ou 15 mg/kg) . As células do tumor foram implantadas em 200 pl De Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL^TM. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante. Os resultados do experimento (Figuras 30A-30C) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer de próstata no modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 22

211/215

HABILIDADE DO ANTICORPO ANTI-B7-H3 DE SE UNIR ÀS CÉLULAS CANCEROSAS RENAIS E PREVENIR OU INIBIR O DESENVOLVIMENTO DE TUMOR EM UM MODELO DE XENOENXERTO DE MURINO [0497] As células cancerosas renais A498 foram incubadas na presença das variantes hBRCA84D, chBRCA84D e hBRCA84 (0264 Fc) e o efeito citotóxico desses anticorpos foi determinado. Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 31, e indicam que todos os três dos anticorpos eram citotóxicos para células A498.

[0498] As células cancerosas renais A498 foram incubadas na presença das variantes hBRCA84D, chBRCA84D e hBRCA84 (0264 Fc) e o efeito citotóxico desses anticorpos foi determinado. Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 31, e indicam que todos os três dos anticorpos eram citotóxicos para as células A498.

[0499] A análise de IHC do tecido de tumor de enxerto A498 foi conduzida usando anticorpo BRCA84D biotinilado (20 pg/ml), BRCA69D (5 pg/ml) e anticorpo antiHer2 (20 pg/ml). Descobriu-se que o anticorpo BRCA84D se une em 20 a 40% do tecido do tumor (semanalmente ou moderadamente: + ou ++); descobriui-se que BRCA69D se une em 80 a 100% do tecido do tumor (moderadamente para fortemente: ++ ou +++). Descobriu-se que o anticorpo BRCA84D se une fracamente em 40% do tecido do tumor UMUC-3 (+); descobriu-se que BRCA69D moderadamente ou fortemente se une em 70% de cada tecido de tumor (++ ou +++); descobriu-se que o anticorpo anti-Her2 variavelmente se une em 20% de tal tecido de tumor (+ -+++). Como controles, descobriu-se que o anticorpo antiHer2 se une às células SKBR-3 (+++) e descobriu-se que

212/215

BRCA84D e BRCA69D são capazes de se unir às células Hs 700T (+ + + ) [0500] Os camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 5 x 10⁶ de células cancerosas renais A498. As células de tumor foram implantadas em 200 pl de Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL™. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias de implante através de iv Q7D x5 usando doses de 0,1, 0,5,

1, 5, ou 10 mg/kg. Centuximabe (anticorpo anti-EGRF) foi administrado para um grupo de controle de camundongos em doses de 1, 7, ou 15 mg/kg. Os camundongos de controle adicional foram injetados com veículo ou com 10 mg/kg de controle de IgG. Os resultados do experimento (Figura 32) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer renal no modelo de xenoenxerto de murino.

[0501] Os camundongos (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram alternativamente implantados subcutaneamente em seus flancos com 5 x 10⁶ de células cancerosas renais 786-0. As células do tumor foram implantadas em 200 pl do Meio F12 de Ham diluído 1:1 com MATRIGEL^TM. Tratamento com Mab1 foi iniciado dentro de 7 dias do implante através de iv Q7D x5 usando doses de 0,1, 0,5, 1, 5, ou 10 mg/kg. Centuximabe (anticorpo anti-EGRF) foi administrado para um grupo de controle de camundongos em doses de 1, 7, ou 15 mg/kg.

Camundongos de controle adicional foram injetados com veículo ou com 10 mg/kg de controle IgG. Os resultados do experimento (Figuras 33A-33B) mostram que Mab1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer renal no modelo de xenoenxerto de murino.

213/215 [0502] A atividade de Mab1 foi comparada com aquela de paclitaxel, um inibidor mitótico usado em quimioterapia de câncer. Grupos de oito camundongos fêmeas (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) foram implantados subcutaneamente em seus flancos com 786-0 de células cancerosas renais e depois providos com Mab1 através de iv Q7D em doses de 0.1, 0.5, 1, 5, ou 10 mg/kg. Paclitaxel foi administrado para um grupo de controle de oito dos tais camundongos em uma dose de 2,5 mg/kg nos dias 21, 28, e 35 de estudo. Camundongos de controle adicional (sete fêmeas por grupo) foram injetados com veículo ou com 5 mg/kg de controle IgG. Os resultados do experimento (Figura 34) mostra que Mab 1 foi capaz de prevenir ou inibir o desenvolvimento de tumor de câncer renal no modelo de xenoenxerto de murino.

EXEMPLO 23

ESTUDO DE TOXICOLOGIA DE MACACOS CINOMÓLOGOS [0503] Um estudo de toxicologia de macacos cinomólogos é conduzido a fim de acessar perfil de toxicologia aguda depois de uma única dose de Mab1, determina o perfil farmacocinético para Mab1, estabelece um relacionamento de tempo vs. dose para indução de citocinas associadas com ativação de célula efetora, e acessar o efeito do tratamento do fármaco no nível dos leucócitos circulando (por exemplo, NK e células T-) .

[0504] Tal estudo pode ser projetado para envolve quatro grupos de 6 macacos (3 machos e 3 fêmeas) e para estender 7 semanas a partir do tratamento inicial para a necropsia final. O Grupo 1 compreenderia um grupo de controle que receberia somente veículo para as semanas 1 e

2. Quatro membros do Grupo 1 (dois machos e duas fêmeas)

214/215 seriam sacrificados na semana 3. Os membros remanescentes do Grupo 1 receberíam veículo adicional na semana 3 e seriam sacrificados para necropsia na semana 7. Grupos 2-4 são grupo experimentais que receberiam veículo na semana 1, e anticorpo B7-H3 (1, 30, ou 100 mg/kg, respectivamente) na semana 2. Quatro membros de cada Grupo (dois machos e duas fêmeas) seriam sacrificados na semana 3. Os membros remanescentes de cada Grupo receberiam veículo adicional na semana 3 e seriam sacrificados para necropsia na semana 7.

[0505] Todas as infusões são bem toleradas e nenhuma mortalidade ou mudanças significativas em peso corporal, sinais clínicos ou química de soro são observados. Reduções dependentes de doses em células NK circulando, mas não circulando células B e T- são observadas.

[0506] O estudo provê verificação de macaco cinomólogo como uma espécie toxicológica relevante. Quando contatado com tecido de ser humano normal, o anticorpo BRCA84D mostrou vários graus de intensidade de coloração no fígado, pâncreas, cólon, pulmão e córtex adrenal. Coloração de fígado foi relativamente restrito às células de revestimento sinusoidais (fibroblasto e células kupffer). A coloração de pâncreas foi observada principalmente na fibra de colágeno e uma pequena percentagem do epitélio (células acinar e/ou células de duto intercaladas). A coloração do cólon foi relativamente restrita na membrana apical do epitélio cripto e fibroblasto na mucosa. O pulmão mostrou coloração muito fraca e desigual no epitélio. BRCA84D mostrou boa reatividade cruzada nos tecidos de macacos cinomólogos em comparação ao perfil de tecido de ser humano com a exceção da

215/215 falta de coloração no fígado e pâncreas, e possível expressão de B7-H3 nas células pituitárias de macacos cinomólogos.

[0507] Todas as publicações e patentes mencionadas nesse relatório descritivo são aqui incorporadas por referência quanto à mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse

especificamente	e individualmente indicado para ser
incorporado por	referência em sua totalidade. Embora a

invenção tenha sido descrita em conexão com realizações específicas da mesma, será compreendido que ela é capaz de modificações adicionais e este pedido é destinado a cobrir quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo

tais desvios da	presente descrição como venha dentro da
prática habitual	conhecida dentro da técnica a qual a
invenção pertence	e como pode ser aplicado às características

essenciais daqui em diante estabelecidas.

Claims (7)

REIVINDICAÇÕES
1. (1) a dita cadeia de polipeptídeo I compreende as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 23) e CDR3 (SEQ ID NO: 25) da cadeia leve de BRCA6 9D, ou a dita cadeia de polipeptídeo II compreende as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO: 31) e CDR3 (SEQ ID NO: 33) da cadeia pesada de BRCA69D; ou (2) a dita cadeia de polipeptídeo I compreende as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3 (SEQ ID NO: 9) da cadeia leve de BRCA84D, ou a dita cadeia de polipeptídeo II compreende as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) e CDR3 (SEQ ID NO: 17) da cadeia pesada de BRCA84D; ou (3) a dita cadeia de polipeptídeo I compreende as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 39) e CDR3 (SEQ ID NO: 41) da cadeia leve de PRCA157, ou a dita cadeia de polipeptídeo II compreende as sequências

   1. REAGENTE DE REDIRECIONAMENTO DE DUPLA AFINIDADE, caracterizado por compreender:

   (A) uma cadeia de polipeptídeo I que compreende um domínio de ligação de epítopo de VL de imunoglobulina específico para se ligar a B7-H3 e um domínio de ligação ao epítopo de VH específico para se ligar a uma molécula diferente de B7-H3; e (B) uma cadeia de polipeptídeo II que compreende um domínio de ligação ao epítopo de VH de imunoglobulina específico para se ligar a B7-H3 e um domínio de ligação ao epítopo de VL específico para se ligar à dita molécula diferente de B7-H3;

   em que as ditas cadeias de polipeptídeo I e II estão associadas juntas de modo a formar domínios de ligação ao epítopo funcional capazes de se ligarem a B7-H3 e à dita molécula diferente de B7-H3, e em que:
2. 2. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito domínio de ligação ao epítopo de VL específico, para se ligar a B7-H3, compreender as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 23) e CDR3 (SEQ ID NO: 25) da cadeia leve de BRCA6 9D e o dito domínio de ligação ao epítopo de VH específico para se ligar a B7-H3 compreende as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO: 31) e CDR3 (SEQ ID NO: 33) da cadeia pesada de BRCA69D.

   2/7 de aminoácido de CDRi (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 47) e CDR3 (SEQ ID NO: 49) da cadeia pesada de PRCA157.
3. 3/7 (B) um domínio variável de cadeia pesada que possui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 99.

   3. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito domínio de ligação ao epítopo de VL específico, para se ligar a B7-H3, compreender as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3 (SEQ ID NO: 9) da cadeia leve de BRCA84D e o dito domínio de ligação ao epítopo de VH específico para se ligar a B7-H3 compreende as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 15) e CDR3 (SEQ ID NO: 17) da cadeia pesada de BRCA84D.
4. 4. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito domínio de ligação ao epítopo de VL específico, para se ligar a B7-H3, compreender as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 39) e CDR3 (SEQ ID NO: 41) da cadeia leve de PRCA157 e o dito domínio de ligação ao epítopo de VH específico para se ligar a B7-H3 compreende as sequências de aminoácido de CDR1 (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 47) e CDR3 (SEQ ID NO: 49) da cadeia pesada de PRCA157.
5. 5/7

   16. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por ainda compreender um ou mais agentes anticâncer adicionais.

   17. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação

   16, caracterizada pelo dito agente anticâncer adicional ser um agente quimioterapêutico, um agente radioterapêutico, um agente terapêutico hormonal, uma toxina ou um agente imunoterapêutico.

   18. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação caracterizado pelo dito agente anticâncer adicional ser

   17, uma toxina selecionada do grupo consistindo em: um taxano, um maitansinoide, uma auristatina, uma caliqueamicina, uma antraciclina, um análogo de CC-1065, docetaxel, uma catepsina, ricina, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina da difteria, RNase e um radioisótopo tóxico.

   19. USO

   DO

   REAGENTE DE

   REDIRECIONAMENTO

   DE DUPLA

   AFINIDADE, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

   13, no diagnóstico de câncer, caracterizado pelo dito reagente de redirecionamento de dupla afinidade ser detectavelmente marcado.

   20 .

   USO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo dito câncer se distinguir pela presença de uma célula cancerígena selecionada do grupo que consiste em uma célula de um tumor da glândula adrenal, um câncer associado a AIDS, um sarcoma alveolar de partes moles, um tumor astrocítico, um câncer de bexiga, um câncer nos ossos, um câncer do cérebro e da medula espinhal, um tumor metastático do cérebro, um câncer de mama, tumores do corpo carotídeo, um câncer cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de célula renal cromófobo, um carcinoma de células claras, um câncer de cólon, um câncer colorretal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de pequenas células redondas, um ependimoma, um tumor de

   5. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender:

   (A) um domínio variável de cadeia leve que possui a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 89; e
6. 6/7

   Ewing, um condrossarcoma mixoide extraesquelético, uma fibrogênese óssea imperfeita, uma displasia fibrosa do osso, um câncer da vesícula biliar ou do duto biliar, um câncer gástrico, uma doença trofoblástica gestacional, um tumor de célula germinativa, um câncer de cabeça e de pescoço, um carcinoma hepatocelular, um tumor de células da ilhota, um Sarcoma de Kaposi, um câncer de rim, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um câncer de fígado, um linfoma, um câncer de pulmão, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mielanoma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um carcinoma da tiroide papilar, um tumor da paratireoide, um câncer infantil, um tumor da bainha dos nervos periféricos, um pituitária, um câncer de posterior, um distúrbio metastático renal, um tumor sarcoma, um câncer de pele, feocromocitoma, um tumor da próstata, um melanoma de úvea hematológico raro, um câncer rabdoide, um rabdomiossarcoma, um um sarcoma de tecidos moles, um câncer de célula escamosa, um câncer de estômago, um sarcoma sinovial, um câncer testicular, um carcinoma do timo, um

   timoma, um câncer metastático de tiroide e um câncer de útero. 21 . USO DO REAGENTE DE REDIRECIONAMENTO DE DUPLA AFINIDADE, conforme definido em qualquer uma das

   reivindicações 1 a 13, caracterizado pela preparação de um medicamento para o tratamento de câncer em um paciente.

   22. USO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo dito câncer se distinguir pela presença de uma célula cancerígena selecionada do grupo que consiste em uma célula de um tumor da glândula adrenal, um câncer associado a AIDS, um sarcoma alveolar de partes moles, um

   6. REAGENTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender pelo menos uma porção de um domínio de Fc.

   7. REAGENTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado em que:

   (A) a dita cadeia de polipeptídeo I compreende adicionalmente um domínio de E-coil e pela dita cadeia de polipeptídeo II compreender adicionalmente um domínio de Kcoil; ou (B) a dita cadeia de polipeptídeo I compreende adicionalmente um domínio de K-coil e a dita cadeia de polipeptídeo II compreende adicionalmente um domínio de

   Ecoil.

   REAGENTE, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por:

   (A) a dita cadeia de polipeptídeo I compreender adicionalmente um domínio de E-coil e a dita cadeia de polipeptídeo II compreender adicionalmente um domínio de Kcoil; ou (B) a dita cadeia de polipeptídeo I compreender adicionalmente um domínio de K-coil e a dita cadeia de polipeptídeo II compreende adicionalmente um domínio de Ecoil.

   9. REAGENTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela dita molécula diferente de B7-H3, que pode ser ligada pelo dito reagente, ser um hapteno.

   10. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo dito hapteno ser isocianato de fluoresceína.

   11. REAGENTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela dita molécula diferente de B7-H3, que pode ser ligada através do dito reagente, ser um receptor de célula T, um correceptor de célula T i ou o receptor de NKG2D. 12 . REAGENTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela dita molécula diferente de B7-H3, que pode ser ligada através do dito reagente, ser um antígeno associado . ao tumor.

   13. REAGENTE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo dito antígeno associado ao tumor ser selecionado a partir de um grupo consistindo em A33; ADAM-9; ALÇAM; BAGE; beta-catenina; CA125; Carboxipeptidase M; CD103; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD36; CD40/CD154; CD45; CD46; CD5; CD56; CD79a/CD79b; CDK4; CEA; CTLA4; Citoqueratina 8; EGF-R; EphA2; ErbBl; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2/GD3/GM2; gplOO; HER-2/neu; papilomavírus E6 humano; papilomavírus E7 humano; Integrina Alfa-V-Beta-6 ; JAM-3; KID3; KID31; KSA (17-1A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; N-acetilglucosaminiltransferase; Oncostatina M; pl5; PIPA; PSA; PSMA; R0R1; sTn; receptor de TNF-β; receptor de TNF-α; receptor de TNF-γ; Receptor de Transferrina; e receptor de VEGF.

   14. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizada por codificar uma cadeia de polipeptídeo do reagente de redirecionamento de dupla afinidade, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

   15. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz do reagente de redirecionamento de dupla afinidade, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. 7/7 tumor astrocítico, um câncer de bexiga, um câncer nos ossos, um câncer do cérebro e da medula espinhal, um tumor metastático do cérebro, um câncer de mama, tumores do corpo carotídeo, um câncer cervical, um condrossarcoma, um cordoma, um carcinoma de célula renal cromófobo, um carcinoma de células claras, um câncer de cólon, um câncer colorretal, um histiocitoma fibroso benigno cutâneo, um tumor desmoplásico de pequenas células redondas, um ependimoma, um tumor de Ewing, um condrossarcoma mixoide extraesquelético, uma fibrogênese óssea imperfeita, uma displasia fibrosa do osso, um câncer da vesícula biliar ou do duto biliar, um câncer gástrico, uma doença trofoblástica gestacional, um tumor de célula germinativa, um câncer de cabeça e de pescoço, um carcinoma hepatocelular, um tumor de células da ilhota, um Sarcoma de Kaposi, um câncer de rim, uma leucemia, um lipoma/tumor lipomatoso benigno, um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno, um câncer de fígado, um linfoma, um câncer de pulmão, um meduloblastoma, um melanoma, um meningioma, uma neoplasia endócrina múltipla, um mielanoma múltiplo, uma síndrome mielodisplásica, um neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, um câncer de ovário, um câncer pancreático, um carcinoma da tiroide papilar, um tumor da paratireoide, um câncer infantil, um tumor da bainha dos nervos periféricos, um pituitária, um câncer de posterior, um distúrbio metastático renal, um tumor sarcoma, um câncer de pele, feocromocitoma, um tumor da próstata, um melanoma de úvea hematológico raro, um câncer rabdoide, um rabdomiossarcoma, um um sarcoma de tecidos moles, um câncer de célula escamosa, um câncer de estômago, um sarcoma sinovial, um câncer testicular, um carcinoma do timo, um timoma, um câncer metastático de tiroide e um câncer de útero.