BR112021000735A2

BR112021000735A2 - acoplador de antígeno de células t com várias otimizações de construto

Info

Publication number: BR112021000735A2
Application number: BR112021000735-0A
Authority: BR
Inventors: Jonathan Lorne BRAMSON; Christopher W. Helsen; Joanne Alicia HAMMILL; Kenneth Anthony Mwawasi
Original assignee: Triumvira Immunologics Usa, Inc.; Mcmaster University
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2021-07-13
Also published as: EP3823984A1; SG11202100307WA; JP2021530971A; AU2019307905A1; EP3823984A4; AU2019307905B2; CA3104887A1; IL280049A; CN112689642A; WO2020018727A1; MX2021000541A; KR20210021593A; PH12021550114A1; JP7404279B2

Abstract

ACOPLADOR DE ANTÍGENO DE CÉLULAS T COM VÁRIAS OTIMIZAÇÕES DE CONSTRUTO. É fornecida uma molécula trifuncional, compreendendo (i) um ligante específico do alvo, (ii) um ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR e (iii) um polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T. Variantes da molécula são fornecidas, incluindo variantes que exibem expressão de superfície otimizada, eficiência de transdução e funcionalidade efetora. As variações incluem, por exemplo, diferentes ligantes que se ligam a CD3 épsilon (por exemplo, OKT3, L2K, F6A, UCHT1 e UCHT1 humanizado), diferentes domínios de sinalização e diferentes ligantes entre domínios.

Description

ACOPLADOR DE ANTÍGENO DE CÉLULAS T COM VÁRIAS OTIMIZAÇÕES DE CONSTRUTO REFERÊNCIA CRUZADA

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US N° 62/699.173, depositado em 17 de julho de 2018, Pedido Provisório US N° 62/703.037, depositado em 25 de julho de 2018, Pedido Provisório US N° 62/773.120, depositado em 29 de novembro de 2018, Pedido Provisório US N° 62/826.853, depositado em 29 de março de 2019, Pedido Provisório US N° 62/828.879, depositado em 03 de abril de 2019, Pedido Provisório US N° 62/839.235, depositado em 26 de abril de 2019, Pedido não Provisório US N° 16/442.274, depositado em 14 de junho de 2019, e Pedido Provisório US Nº 62/874.426, depositado em 15 de julho de 2019, cada um dos quais são incorporados nesse documento por referência em seus inteiros.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é incorporada nesse documento por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 17 de julho de 2019, chama-se 55247704601_SL.txt e tem 131.072 bytes.

SUMÁRIO

[003] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos que codificam um acoplador de antígeno de células T Trifuncional CD19 (CD19-TAC). Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica um acoplador de antígeno de células T Trifuncional CD19 (CD19-TAC) compreende: (a) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga seletivamente a um antígeno CD19. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica um acoplador de antígeno de células T Trifuncional CD19 (CD19-TAC) compreende: (b) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante UCHT1 que se liga a CD3. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica um acoplador de antígeno de células T Trifuncional CD19 (CD19-TAC) compreende: (c) um terceiro polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreendendo um domínio citosólico e um domínio transmembranar.

Em algumas modalidades, os componentes codificados pelo(s) primeiro, segundo e/ou terceiro polinucleotídeo(s) é(são) conectado(s) de qualquer maneira adequada, tal como em qualquer ordem adequada e/ou compreendendo qualquer ligante(s) adequado(s). Em algumas modalidades, os componentes codificados por (a), os componentes codificados por (b) e os componentes codificados por (c) são fundidos diretamente entre si ou unidos por pelo menos um ligante.

Em algumas modalidades, o ligante que se liga seletivamente ao antígeno CD19 é um fragmento variável de cadeia única (scFv). Em algumas modalidades, o ligante que se liga seletivamente ao CD19 antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 é um anticorpo de cadeia única.

Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 compreende uma mutação Y182T (SEQ ID NO: 72). Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 é uma variante humanizada do ligante UCHT1 (huUCHT1) (SEQ ID NO: 44). Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 é uma variante humanizada de UCHT1 compreendendo uma mutação Y177T (huUCHT1 (Y177T)) (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o domínio citosólico é um domínio citosólico CD4 e o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD4. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o componente codificado por (a) e o componente codificado por (c) são fundidos ao componente codificado por (b). Em algumas modalidades, o componente codificado por (b) e o componente codificado por (c) são fundidos ao componente codificado por (a). Em algumas modalidades, pelo menos um ligante une o componente codificado por (a) ao componente codificado por (b). Em algumas modalidades, o pelo menos um ligante é um ligante flexível G4S (SEQ ID NO: 73), um domínio de proteína grande, uma estrutura de hélice longa ou uma estrutura de hélice curta.

Em algumas modalidades, o pelo menos um ligante compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 (ligante flexível G4S (“G4S” revelado como a SEQ ID NO: 73)), SEQ ID NO: 32 (domínio de proteína grande), SEQ ID NO: 30 (estrutura de hélice longa) ou SEQ ID NO: 28 (estrutura de hélice curta). Em algumas modalidades, o CD3 é um complexo de TCR em uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, a ligação do CD3 induz a ativação de uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio de ativação.

[004] São revelados nesse documento, em certas modalidades, os construtos de vetor que compreendem: (a) uma sequência de ácidos nucleicos revelada nesse documento (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um CD19-TAC); e (b) um promotor funcional em uma célula de mamífero.

[005] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, células T compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos revelada nesse documento (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um CD19-TAC).

[006] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, composições farmacêuticas compreendendo a célula T revelada nesse documento e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[007] São revelados nesse documento, em certas modalidades, métodos de tratamento de câncer que expressa CD19 em um indivíduo em necessidade dos mesmos, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica revelada nesse documento (por exemplo, uma composição farmacêutica compreendendo uma célula T compreendendo qualquer sequência de ácidos nucleicos descrita nesse documento, tal como qualquer sequência de ácidos nucleicos ou sequências descritas nesse documento como codificando um acoplador de antígeno de células T Trifuncional CD19 (CD19- TAC)). Em algumas modalidades, o câncer é uma doença maligna de células B. Em algumas modalidades, o câncer é linfoma de células B, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC) ou Linfoma não Hodgkin. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via transarterial, subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, intravenosa ou intraperitoneal.

[008] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos que codificam um acoplador de antígeno de células T Trifuncional CD19 (Tri- TAC) compreendendo: (a) um primeiro polinucleotídeo que codifica um aglutinante específico para o alvo; (b) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR; e (c) um terceiro polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T; em que o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR é selecionado de OKT3, F6A ou L2K.

Em algumas modalidades, o componente codificado por (a), o componente codificado por (b) e o componente codificado por (c) são fundidos diretamente entre si ou unidos por pelo menos um ligante.

Em algumas modalidades, o componente codificado por (a) e o componente codificado por (b) são diretamente fundidos e unidos ao componente codificado por (c) por um ligante.

Em algumas modalidades, o componente codificado por (b) e o componente codificado por (c) são diretamente fundidos e unidos ao componente codificado por (a) por um ligante.

Em algumas modalidades, o pelo menos um ligante é um ligante flexível G4S (SEQ ID NO: 73), um domínio de proteína grande, uma estrutura de hélice longa ou uma estrutura de hélice curta.

Em algumas modalidades, o pelo menos um ligante tem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 (ligante flexível G4S (“G4S” revelado como a SEQ ID NO: 73)), SEQ ID NO: 32 (domínio de proteína grande), SEQ ID NO: 30 (estrutura de hélice longa) ou SEQ ID NO: 28 (estrutura de hélice curta). Em algumas modalidades, o ligante que se liga à proteína associada ao Complexo de TCR é OKT3. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada ao complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22.

Em algumas modalidades, o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR é F6A.

Em algumas modalidades, o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR é L2K.

Em algumas modalidades, o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a proteína associada ao complexo de TCR é CD3. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo se liga seletivamente a um antígeno tumoral.

Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um polipeptídeo de repetição de anqurina projetado (DARPin) ou um fragmento variável de cadeia única (scFv). Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo se liga seletivamente a um antígeno CD19, um antígeno HER2 ou um antígeno BCMA.

Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo se liga seletivamente a um antígeno HER-2 compreende um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo selecionado de Trastuzumab, Pertuzumab, Lapatinib, Neratinib, Ado-trastuzmab Emtansina, Gancotamab, Margetuximab, Timigutuzumab e Ertumaxomab.

Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo se liga seletivamente a um antígeno BCMA que compreende um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo selecionado de Belantamab mafodotina e GSK2857916. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T compreende um domínio citosólico e um domínio transmembranar.

Em algumas modalidades, o domínio citosólico é um domínio citosólico CD4 e o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD4, ou em que o domínio citosólico é um domínio citosólico de CD8 e o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD8. Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos compreendem ainda uma sequência líder.

Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, o CD3 é um complexo de TCR em uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo.

Em algumas modalidades, a ligação do CD3 induz a ativação de uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo.

Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67,

SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, ou SEQ ID NO: 61. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio de ativação.

[009] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos que codificam um acoplador de antígeno de células T Trifuncional CD19 (Tri- TAC) compreendendo: (a) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante específico para o alvo; (b) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR; e (c) um terceiro polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T; em que a sequência de ácidos nucleicos compreende adicionalmente uma sequência líder, e em que o componente codificado pelo (a), componente codificado por (b) e componente codificado por (c) são fundidos diretamente um ao outro ou unidos por pelo menos um ligante. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo se liga seletivamente a um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um polipeptídeo de repetição de anqurina projetado (DARPin) ou um fragmento variável de cadeia única (scFv). Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo se liga seletivamente a um antígeno CD19, um antígeno HER2 ou um antígeno BCMA.

Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo se liga seletivamente a um antígeno BCMA que compreende um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo selecionado de Belantamab mafodotina e GSK2857916. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a proteína associada ao complexo de TCR é selecionada de UCHT1, UCHT1 (Y182T), huUCHT1, huUCHT1 (Y177T), OKT3, F6A ou L2K.

Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada ao complexo de TCR tem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 24 ou SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a proteína associada ao complexo de TCR é CD3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T compreende um domínio citosólico e um domínio transmembranar.

Em algumas modalidades, o domínio citosólico é um domínio citosólico CD4 e o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD4, ou em que o domínio citosólico é um domínio citosólico de CD8 e o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD8. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, o componente codificado por (a) e o componente codificado por (b) são fundidos diretamente e unidos ao componente codificado por (c) por um ligante.

Em algumas modalidades, o pelo menos um ligante tem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12 (ligante flexível G4S (“G4S” revelado como a SEQ ID NO: 73)), SEQ ID NO: 32 (domínio de proteína grande), SEQ ID NO: 30 (estrutura de hélice longa) ou SEQ ID NO: 28 (estrutura de hélice curta). Em algumas modalidades, o CD3 é um complexo de TCR em uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo.

Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, em pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, ou SEQ ID NO: 61. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio de ativação.

[0010] São revelados nesse documento, em certas modalidades, polipeptídeos codificados pela sequência de ácidos nucleicos revelada nesse documento.

[0011] São revelados nesse documento, em certas modalidades, os construtos de vetor que compreendem: (a) uma sequência de ácidos nucleicos revelada nesse documento; e (b) um promotor funcional em uma célula de mamífero.

[0012] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, células T compreendendo a sequência de ácidos nucleicos revelada nesse documento.

[0013] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, composições farmacêuticas que compreendem a célula T revelada nesse documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0014] São revelados nesse documento, em certas modalidades, métodos de tratamento de um câncer em um indivíduo em necessidade dos mesmos, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica revelada nesse documento.

Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer sólido ou um câncer líquido.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de pulmão, câncer de mama, mieloma múltiplo, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer urotelial, câncer endometrial ou câncer de cólon.

Em algumas modalidades, o câncer compreende uma célula cancerígena que expressa CD19. Em algumas modalidades, o câncer é uma doença maligna de células B.

Em algumas modalidades, o câncer é linfoma de células B, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC) ou Linfoma não Hodgkin.

Em algumas modalidades, o câncer compreende uma célula cancerígena que expressa HER-2. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer de ovário ou câncer de estômago.

Em algumas modalidades, o câncer compreende uma célula cancerígena que expressa BCMA.

Em algumas modalidades, o câncer é leucemia, linfoma ou mieloma múltiplo.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo por via transarterial, subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, intravenosa ou intraperitoneal.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica está em uma forma de dosagem unitária.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende cerca de 0,5 - 2 x 109 células T.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada diariamente, semanalmente, duas vezes por semana, mensalmente, semestralmente ou anualmente.

[0015] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos que codificam um acoplador de antígeno de células T Trifuncional CD19 (CD19-TAC) compreendendo: (a) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga seletivamente a um antígeno CD19; (b) um segundo polinucleotídeo que codifica uma variante humanizada de um ligante UCHT1 (huUCHT1) compreendendo uma mutação Y177T (huUCHT1 (Y177T)) que se liga a CD3; e (c) um terceiro polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo um domínio citosólico CD4 e um domínio transmembranar CD4; em que o ligante codificado por (a), o ligante codificado por (b) e o polipeptídeo codificado por (c) são fundidos diretamente um ao outro ou unidos por pelo menos um ligante. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador, um domínio de ativação ou um domínio coestimulador e um domínio de ativação. Em algumas modalidades, o ligante que se liga seletivamente ao antígeno CD19 é um fragmento variável de cadeia única (scFv). Em algumas modalidades, o aglutinante que se liga seletivamente ao antígeno CD19 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o ligante que seletivamente liga o antígeno CD19 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 (Y177T) é um anticorpo de cadeia única. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1

(Y177T) compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 (Y177T) compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18.

[0016] Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o pelo menos um ligante é um ligante G4S flexível, um domínio de proteína grande, uma estrutura de hélice longa ou uma estrutura de hélice curta. Em algumas modalidades, o pelo menos um ligante compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, o pelo menos um ligante compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, o CD3 é expressado em uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, o

CD19-TAC compreende uma sequência da SEQ ID NO: 63 ou SEQ ID NO: 64. São reveladas nesse documento, em certas modalidades, os construtos de vetor que compreendem: (a) uma sequência de ácidos nucleicos revelada nesse documento; e (b) um promotor funcional em uma célula de mamífero. São reveladas nesse documento, em certas modalidades, composições compreendendo o vetor revelado nesse documento e um excipiente. São revelados nesse documento, em certas modalidades, polipeptídeos codificados pela sequência de ácidos nucleicos revelada nesse documento.

[0017] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos que codificam um acoplador de antígeno de células T Trifuncional HER2 (HER2-TAC) compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 ou SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 ou SEQ ID NO: 76. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio de ativação.

[0018] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos que codificam um acoplador de antígeno de células T Trifuncional BCMA

(BCMA-TAC) compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO:

61. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, em pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio de ativação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] Os novos recursos da invenção são apresentados com particularidade nas reivindicações anexas. Uma melhor compreensão dos recursos e vantagens da presente invenção será obtida por referência à seguinte descrição detalhada que estabelece modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos anexos dos quais:

[0020] A Fig. 1A é um esquema da ativação natural de células T.

[0021] A Fig. 1B é um esquema da ativação de células T baseada em CAR.

[0022] A Fig. 1C é um esquema de uma ativação de células T baseada em acoplador de antígeno de células T trifuncional (Tri-TAC).

[0023] A Fig. 1D é um esquema da ativação natural de células T.

[0024] A Fig. 1E é um esquema da ativação de células T baseada em CAR.

[0025] A Fig. 1F é um esquema da ativação de células T baseada em Tri-TAC.

[0026] A Fig. 2A é um esquema de uma configuração de Tri- TAC com o domínio UCHT1 sendo centrado entre o domínio transmembranar (TM) e o domínio de ligação a antígeno.

[0027] A Fig. 2B é um esquema de uma configuração de Tri- TAC em que o domínio UCHT1 é N-terminal, seguido pelo domínio de ligação a antígeno e o domínio transmembranar.

[0028] A Fig. 2C é um esquema de uma molécula de Tri-TAC com um domínio de ligação a antígeno genérico e um domínio UCHT1.

[0029] A Fig. 3A é um esquema de uma molécula de Tri-TAC com um domínio de ligação a antígeno genérico.

[0030] A Fig. 3B é um esquema de um Tri-TAC com um domínio de ligação a antígeno DARPin anti-HER-2.

[0031] A Fig. 3C é um esquema de um Tri-TAC com um domínio de ligação a antígeno scFv anti-CD19.

[0032] A Fig. 3D é um esquema de um Tri-TAC com um domínio de ligação a antígeno scFv anti-BCMA.

[0033] A Fig. 3E é um esquema de uma molécula de Tri-TAC com o domínio de ligação a antígeno DARPin anti-HER-2.

[0034] A Fig. 3F é um esquema de uma molécula de Tri-TAC com o domínio de ligação a antígeno scFv anti-BCMA.

[0035] As Fig. 4A-Fig. 4D exemplifica células T projetadas com um Tri-TAC ou um CAR baseado em CD28 direcionado contra HER-2 usando um DARPin. A Fig. 4A exemplifica a expressão de superfície do Tri-TAC e CAR em comparação com células T que não expressam receptor quimérico. A Fig. 4B exemplifica o crescimento de três populações de células. As Fig. 4C-Fig. 4D exemplificam a porcentagem de células manipuladas geneticamente positivas para vários marcadores de ativação de células T após estimulação com antígeno.

[0036] A Fig. 5 ilustra um modelo da estrutura da proteína CD19-TAC.

[0037] As Fig. 6A-Fig. 6J ilustram a expressão da superfície do receptor e ativação de vários DARPin Tri-TAC anti-HER-2 de controle. As células T foram manipuladas geneticamente com uma variante de Tri-TAC que carece do elemento de direcionamento (-DARPin), uma variante de Tri- TAC que carece de UCHT1 (-UCHT1) ou o Tri-TAC de comprimento total. As Fig. 6A, Fig. 6D, Fig. 6G ilustram a transdução de células T e a capacidade de ligação a Her2 (esquerda); Fig. 6B, Fig. 6E, Fig. 6H desgranulação (meio) e Fig. 6C, Fig. 6F, Fig. 6I produção de citocina (direita). A Fig. 6J ilustra que apenas o DARPin Tri-TAC anti-HER-2 de comprimento total é capaz de induzir uma resposta citotóxica.

[0038] As Fig. 7A-Fig. 7C ilustram a atividade antitumoral, toxicidade e produção de citocinas de células T manipuladas geneticamente com o DARPin Tri-TAC anti-HER-2 ou o CAR com base em CD28 DARPin anti-HER-2. Camundongos com tumores OVCAR-3 estabelecidos foram tratados com células T manipuladas geneticamente com o DARPin Tri-TAC anti-HER-2 ou o DARPin CAR anti-HER-2. A Fig. 7A exemplifica a mudança no crescimento do tumor em relação ao dia da infusão de células T (dia 35). A Fig. 7B exemplifica a mudança no peso, uma medida de toxicidade, nos mesmos camundongos. A Fig. 7C ilustra as concentrações de citocinas no soro de camundongos no dia 7 após a infusão de células T.

[0039] As Fig. 8A-Fig. 8H ilustram Tri-TACs manipulados geneticamente com várias alternativas para o domínio de recrutamento scFv-CD3 UCHT1. A Fig. 8A fornece uma representação esquemática de construtos de receptor de TAC utilizando o DARPin anti-HER-2, pareado com scFv anti-CD3 UCHT1 ou OKT3. A Fig. 8B ilustra a expressão de superfície de TAC HER-2 de células T CD8+ NGFR+ (esquerda) ou CD4+ NGFR+ (direita). AS Fig. 8C, Fig. 8C1 ilustram a produção de citocinas por TAC-células T específicas de HER-2 estimuladas com células tumorais SK-OV-3 positivas para o antígeno. A Fig. 8D ilustra a morte de células tumorais SK-OV-3 por TAC HER-2 e células T de controle de vetor (vetor transportando apenas tNGFR). Células T de controle de vetor (círculos) são comparadas com TAC-células T específicas de HER-2 com UCHT1 (quadrado) ou OKT3 (triângulo). A Fig. 8E fornece uma representação esquemática de construtos de receptor de TAC utilizando o scFv anti-CD19, pareado com scFv anti- CD3huUCHT1, F6A ou L2K. A Fig. 8F ilustra a expressão de superfície por CD19-TAC de células T CD8+ NGFR+ (esquerda) ou CD4+ NGFR+ (direita). As Fig. 8G, Fig. 8G1 ilustram a produção de citocinas por TAC-células T específicas de CD19 estimuladas com células tumorais Raji positivas para o antígeno. As células produtoras de citocinas são comparadas a partir de TAC-células T que portam huUCHT1 (quadrado), F6A (triângulo) ou L2K (diamante). A Fig. 8H ilustra a morte de células tumorais NALM-6 por CD19-TAC e células T de controle de vetor (vetor que transporta apenas tNGFR). Células T de controle de vetor (círculos) são comparadas com TAC-células

T específicas de CD19 carregando huUCHT1 (quadrado), F6A (triângulo) ou L2K (diamante).

[0040] As Fig. 9A-Fig. 9H ilustram o efeito de vários scFv anti-CD3 na expressão de superfície de TCR. As Fig. 9A, Fig. 9E ilustram a expressão de superfície de TCR de células T manipuladas geneticamente com qualquer vetor de controle (tNGFR), ou variantes de TAC UCHT1 OKT3. As Fig. 9B, Fig. 9F ilustram que as células T manipuladas geneticamente com TAC OKT3 reduziram significativamente a expressão de superfície de TCR em relação ao TAC UCHT1. As Fig. 9C, Fig. 9G ilustram a expressão de superfície de TCR de células T manipuladas geneticamente com vetor de controle (tNGFR), variantes de TAC huUCHT1, F6A ou L2K. As Fig. 9D, a Fig. 9H ilustra que as células T manipuladas geneticamente com TAC L2K reduziram significativamente a expressão de superfície de TCR em relação a TAC huUCHT1.

[0041] As Fig. 10A-Fig. 10B ilustram variantes de domínio de conector. O domínio do domínio de ligação a antígeno de conexão com o domínio de recrutamento de TCR é denominado domínio do conector. A Fig. 10A fornece esquemas de variantes de TAC com diferentes domínios de conector: (i) um conector flexível, (ii) um conector de domínio grande (construído a partir dos domínios 3 e 4 derivados do domínio CD4 extracelular), (iii) um conector helicoidal longo, e (iv) um conector helicoidal curto. A Fig. 10B fornece uma sequência de aminoácidos exemplificativa dos domínios representados na Fig. 10A. (SEQ ID NOS 69, 28, 30 e 32, respectivamente, em ordem de aparência).

[0042] As Fig. 11A-Fig. 11E ilustram parâmetros in vitro exemplificativas de CD19-TAC manipulados geneticamente com diferentes variantes de conector. A Fig. 11A ilustra a expressão de superfície da variante de TAC em células CD4 e CD8. A Fig. 11B ilustra a expressão de superfície de TAC que compreende conectores flexíveis em relação ao TAC que compreende conectores de domínio helicoidal ou grande. A Fig. 11C ilustra a transdução geral do TAC que compreende conectores alternativos em relação ao conector flexível. A Fig. 11D, Fig. 11E ilustram a reatividade celular relativa às células Raji positivas para o antígeno.

[0043] A Fig. 12A ilustra a citotoxicidade in vitro de variantes de BCMA-Tri-TAC manipuladas geneticamente com diferentes conectores. A Fig.12B ilustra o controle de tumor in vivo de variantes de BCMA-Tri-TAC manipuladas geneticamente com o conector flexível em comparação com o conector helicoidal curto.

[0044] As Fig. 13A-Fig. 13C ilustram propriedades de Tri- TAC scFv anti HER-2 de CD8 e Tri-TAC DARPin anti-HER-2 de CD8α. As Fig. 13A, Fig. 13C ilustram a expressão de superfície. A Fig. 13B ilustra a produção de citocinas.

[0045] As Fig. 14A-Fig. 14D fornece esquemas de variantes de Tri-TAC de CD8. O DARPin anti-HER-2 é usado como um exemplo de domínio de ligação a antígeno e o domínio de recrutamento de CD3 UCHT1 é usado como um exemplo de domínio de recrutamento. A Fig. 14A ilustra um Tri-TAC compreendendo um domínio transmembranar e um domínio citosólico de CD4 (esquerda), e regiões comparáveis de um heterodímero de CD8α/CD8β (direita). As principais regiões para a funcionalidade do correceptor (domínio rico em arginina e motivo CXCP) são destacadas. A Fig. 14B é um esquema de um Tri-TAC de CD8α compreendendo uma mutação de Cisteína para

Serina para assegurar uma distribuição de receptor monomérico e um domínio citosólico de CD8α. A Fig. 14C é um esquema de um Tri-TAC de CD8α Rβ compreendendo uma mutação de Cisteína para Serina para garantir uma distribuição de receptor monomérico e um domínio citosólico de CD8α quimérico onde a região rica em arginina de CD8α é substituída pela região rica em arginina de CD8β. A Fig. 14D é um esquema de um Tri-TAC de CD8β+Lck compreendendo uma mutação de Cisteína para Serina para garantir uma distribuição de receptor monomérico e um domínio citosólico de CD8β quimérico, onde o domínio de CD8α CXCP, que contém um motivo de ligação Lck, foi adicionado ao terminal C do domínio citosólico de CD8β.

[0046] As Fig. 15A-Fig. 15E ilustram a caracterização in vitro de variantes de Tri-TAC de CD8 em relação ao Tri-TAC prototípico contendo regiões de CD4. As Fig. 15A-Fig. 15B ilustram a expressão de superfície de variantes de Tri-TAC de CD8 em relação ao Tri-TAC prototípico. A Fig. 15C ilustra a citotoxicidade in vitro de variantes de Tri-TAC de CD8 co- cultivadas com LOX IMVI (HER-2 negativas) ou A549, SKOV3, SKBR3 ou MBA MB 231 (HER-2 positivas). A Fig. 15D ilustra a divisão celular de células T manipuladas geneticamente com as variantes de Tri-TAC de CD8 ou o Tri-TAC prototípico. A Fig. 15E ilustra a expressão de superfície de TCR de células T manipuladas geneticamente compreendendo variantes de Tri- TAC de CD8 ou Tri-TAC prototípico.

[0047] A Fig. 16 ilustra vários Tri-TACs.

[0048] A Fig. 17 ilustra a inserção de TAC-CD19 em um vetor lentiviral pCCL. A Fig. 17 ilustra os vários domínios de um TAC-CD19 (um mutante de CD8a líder, scFv FMC63, Etiqueta Myc, huUCHT1 Y177T e um domínio de correceptor de ancoragem de CD4 truncado).

[0049] A Fig. 18 ilustra a eficácia in vivo de TAC-CD19 gerado a partir de diferentes doadores.

[0050] As Fig. 19A-Fig. 19C ilustram um exemplo in vitro de citotoxicidade de TAC-CD19 contra as linhas de tumor. A Fig. 19A NALM-6 (leucemia linfoblástica aguda), Fig. 19B Jeko-1 (Linfoma de células do manto) e Fig. 19C Raji (linfoma de Burkitt).

[0051] A Fig. 19D ilustra o esquema de 3 diferentes modelos de tumor in vivo em camundongos NRG.

[0052] As Fig. 19E - Fig. 19G ilustram a eficácia in vivo de CD19-TAC em NALM-6 (leucemia linfoblástica aguda) Fig. 19E, Jeko-1 (Linfoma de Célula do Manto) Fig. 19F, e Raji (linfoma de Burkitt) Fig. 19G.

[0053] A Fig. 20A ilustra a configuração experimental de camundongos tratados com TAC-CD19 com tumor NALM-6. Após o tratamento bem sucedido, os camundongos são então desafiados novamente com células tumorais NALM-6 (CD19 positivas) ou KMS11 (CD19 negativas).

[0054] A Fig. 20B ilustra a eficácia in vivo de camundongos tratados com TAC-CD19.

[0055] A Fig. 21A ilustra o projeto experimental de avaliação do regime de dosagem e do impacto da dosagem na eficácia e na expansão celular.

[0056] A Fig. 21B ilustra a sobrevivência in vivo de camundongos com NALM-6 tratados com uma dose única ou dividida de TAC-CD19.

[0057] As Fig. 22A-Fig. 22B ilustram uma configuração experimental e dados em relação à expansão in vivo de TAC- CD19 após uma administração de dose dividida. A Fig. 22A ilustra a estratégia de marcação de regiões usada para identificar células T no sangue de camundongo. A Fig. 22B ilustra os resultados in vivo da expansão das células T no sangue.

[0058] As Fig. 23A - Fig. 23C ilustram estudos in vivo de longo prazo de TAC-CD19 em camundongos. A Fig. 23A ilustra um protocolo experimental de camundongos com NALM-6 sendo tratados com vários controles e TAC-CD19 em dois níveis de dose. A Fig. 23B ilustra a eficácia in vivo do controle versus dois níveis de dose de grupos de tratamento com TAC- CD19. A Fig. 23C ilustra a sobrevivência de longo prazo de camundongos tratados com TAC-CD19 de baixa dose.

[0059] A Fig. 24 ilustra os resultados da análise química clínica de camundongos tratados com TAC-CD19 ou células T não transduzidas.

[0060] A Fig. 25 ilustra a citocina humana liberada no sangue de camundongos após o tratamento com TAC-CD19 ou células T não transduzidas.

[0061] As Fig. 26A-Fig. 26C ilustram a eficácia de BCMA- TAC em diferentes configurações. A Fig. 26A ilustra um projeto experimental. A Fig. 26B ilustra vários controles e artigos de teste. A Fig. 26C ilustra a eficácia in vivo de vários construtos de TAC. As Fig. 26A-Fig. 26C divulgam “G4S” como SEQ ID NO: 73.

[0062] A Fig. 27 ilustra que os TACs proliferam ao encontrar o antígeno nas células, mas não quando o antígeno é apresentado em grânulos artificiais; mas os CARs proliferam independentemente se os antígenos são apresentados em grânulos ou células.

[0063] A Fig. 28A-Fig. 28B ilustram as células T manipuladas geneticamente por TAC que se expandem in vivo e fornecem proteção de longo prazo, indicando a persistência das células em um modelo de mieloma. As Fig. 28A-Fig. 28B ilustram células T-BCMA-TAC rejeitam tumores de mieloma múltiplo em um modelo de xenoenxerto KMS-11 manipulado geneticamente com NanoLuc (KMS 11-NanoLuc) (BCMApos). Após o enxerto de tumor, os camundongos foram tratados com células T-BCMA-TAC (transportando Luciferase do Vagalume). Os TAC- células T se expandem significativamente após a administração. Isso se correlaciona com a regressão do tumor. Os camundongos tratados eram resistentes ao novo desafio do tumor, indicando persistência de longo prazo das TAC-células T.

[0064] A Fig. 29 ilustra a citocina humana liberada no sangue de camundongos após o tratamento com TAC-CD19 ou células T não transduzidas.

[0065] A Fig. 30 ilustra histogramas exemplificativos da expressão da superfície do receptor por TAC em células T manipuladas geneticamente CD4 e CD8. As células foram manipuladas geneticamente com HER2 TAC de muIgG (promotor EF1α), HER2 TAC de huIgG (promotor MSCV) e HER2 TAC de muIgG (promotor MSCV). Após a manipulação genética, as células T foram coradas com um reagente específico para TAC e medidas usando citometria de fluxo. Todos os construtos mostram níveis comparáveis de expressão de superfície, com a expressão conduzida por EF1α sendo mais alta em comparação com os construtos de MSCV.

[0066] A Fig. 31 ilustra a porcentagem relativa de células T que expressam TNFα, IFNγ ou IL-2 após cocultura com células OVCAR3 (HER2 positivas) ou LOX IMVI (HER2 negativas). As células T foram manipuladas geneticamente com o HER2 TAC de muIgG (promotor EF1α), uma construção de TAC sem o domínio de ligação de HER2 (TAC de ligação ∆; promotor EF1α), o HER2 TAC de huIgG (promotor MSCV) ou o HER2 TAC de muIgG (promotor MSCV). Quando cocultivadas com LOX-IMVI (HER2neg), o TAC de ligação ∆ de controle e as células de HER2 TAC não mostram expressão significativa de citocinas. Todos os construtos manipulados geneticamente de HER2 TAC cocultivados com OVCAR3 (HER2pos) mostram capacidade similar para produzir citocinas, enquanto as células T de controle manipuladas geneticamente com TAC de ligação ∆ não mostram produção significativa de citocinas.

[0067] A Fig 32. Ilustra a eficácia in vivo de células T manipuladas geneticamente por TAC no modelo de tumor sólido OVCAR3. As células T foram manipuladas com o TAC de ligação ∆ (promotor EF1α), o HER2 TAC de muIgG (promotor EF1α), o HER2 TAC de huIgG (promotor MSCV) ou o HER2 TAC de muIgG (promotor MSCV). Os camundongos foram inoculados subcutaneamente com tumores OVCAR3 (HER-2-positivos). Esses cresceram para cerca de 100 mm3 de tamanho. Os camundongos foram então tratados com uma dose dividida de 6 milhões de HER2 TAC manipulado geneticamente, ou células T de controle de TAC de ligação ∆ com 48h de intervalo via injeção na veia da cauda. A progressão do tumor foi seguida por medições quinzenais. O TAC de ligação ∆ não mostrou controle do tumor ou regressão do tumor. Todas as células T manipuladas geneticamente com HER2 TAC mostraram progressão tumoral significativamente reduzida, incluindo regressão tumoral, em relação aos camundongos de controle. Todas as células T manipuladas geneticamente com HER2 TAC tinham atividade antitumoral similar.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0068] O câncer é um grande desafio para a saúde, com mais de 150.000 casos de câncer esperados para serem diagnosticados apenas no Canadá. Embora os pacientes com doença em estágio inicial às vezes sejam tratados com eficácia por terapias convencionais (cirurgia, radiação, quimioterapia), poucas opções estão disponíveis para pacientes com doença avançada, e essas opções são tipicamente paliativas por natureza.

[0069] A imunoterapia ativa visa empregar o sistema imunológico do paciente para limpar tumores e oferece uma opção para pacientes que falharam nas terapias convencionais. Geralmente, esse tratamento envolve a infusão de pacientes com um grande número de células T específicas de tumor. Essa abordagem provou ser bem-sucedida em estudos clínicos de fase inicial para várias doenças, incluindo melanoma, mieloma, leucemia, linfoma e sarcoma sinovial. Como exemplo específico, vários estudos clínicos demonstraram que a imunoterapia com células T é curativa em pacientes com melanoma avançado, confirmando a utilidade dessa abordagem. Adicionalmente, os pacientes que sofrem de leucemia linfocítica crônica (LLC) e leucemia linfoblástica aguda (LLA) também foram efetivamente tratados e curados com imunoterapia com células T.

[0070] Um desafio importante enfrentado pela aplicação clínica da terapia de células T adotivas é a fonte das células T. Tipicamente, as células T isoladas de um paciente com tumor são cultivadas em grande número ex vivo e são administradas de volta ao paciente para induzir uma resposta imune antitumoral robusta. A especificidade do tumor é alcançada por: (i) isolamento de células T específicas do tumor de ocorrência natural do paciente; ou (ii) manipular geneticamente células T em volume do sangue periférico para expressar receptores específicos de tumor. As células T específicas de tumor de ocorrência natural são raras e isolar tais células em quantidades terapêuticas de pacientes com câncer é um procedimento trabalhoso e caro. Em contraste, está se tornando mais eficiente para manipular geneticamente células T periféricas prontamente disponíveis com receptores específicos de tumor por meio de manipulação genética. Técnicas foram desenvolvidas para esse processo de manipulação genética, que são clinicamente viáveis, e vários ensaios clínicos demonstraram a viabilidade e a eficácia das células T manipuladas geneticamente para o tratamento do câncer.

[0071] Até esse ponto, a maioria das terapias de células T manipuladas geneticamente envolvendo a modificação genética das células T produzem: (i) expressão forçada do receptor de células T (TCR); ou (ii) um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para alvos de antígeno no tumor. Até o momento, os receptores de antígenos quiméricos usados para manipular geneticamente células T consistem em: (i) um domínio de direcionamento, usualmente uma variável de fragmento de cadeia única (scFv); (ii) um domínio transmembranar; e (iii) um domínio citosólico que contém elementos de sinalização do receptor de células T e proteínas associadas. Esses receptores de antígenos quiméricos também foram referidos como “corpo T” ou “Receptor imune quimérico” (CIR), mas atualmente, a maioria dos pesquisadores usa o termo “CAR”. Uma vantagem da abordagem de CAR é que ela permite que as células imunes de qualquer paciente sejam direcionadas contra qualquer alvo desejável de uma maneira independente do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Isso é atraente, pois a apresentação de MHC costuma ser defeituosa nas células tumorais.

[0072] Os CARs são considerados em termos modulares e os cientistas gastaram um tempo considerável investigando a influência de diferentes domínios de sinalização citoplasmática na função do CAR. CARs convencionais geralmente compartilham dois componentes principais: (i) o domínio citoplasmático zeta de CD3, que contém motivos de ativação de imunotirosina (ITAMs) críticos para a ativação de células T; e (ii) componentes de receptores coestimuladores que desencadeiam importantes vias de sobrevivência, tal como a via Akt.

[0073] Os CARs de primeira geração empregaram um único domínio de sinalização de CD3ζ ou FcεRIγ. Os CARs de segunda geração combinaram o domínio de sinalização de CD3ζ com o domínio citoplasmático de receptores coestimuladores da família de receptores de CD28 ou TNFR. A maioria das células T manipuladas geneticamente por CAR que atualmente estão sendo testadas na clínica emprega CARs de segunda geração, onde CD3ζ é acoplado ao domínio citoplasmático de CD28 ou CD137. Esses CARs de segunda geração demonstraram atividade antitumoral em tumores CD19 positivos. Os CARs de terceira geração combinaram vários domínios coestimuladores, mas há preocupação de que os CARs de terceira geração possam perder a especificidade do antígeno.

[0074] Embora as células T manipuladas geneticamente por

CAR tenham mostrado uma promessa considerável na aplicação clínica, elas contam com um método sintético para substituir o sinal de ativação nativo que é fornecido pelo receptor de células T (TCR). Uma vez que esse receptor sintético não dispensa todos os componentes de sinalização associados ao TCR (ex. ITAMs em CD3γ, CD3δ, CD3ε), permanece incerto se as células T são ativadas de forma otimizada pelo CAR ou como a ativação do CAR afeta a diferenciação das células T (exemplo progressão para a memória). Além disso, uma vez que os domínios de sinalização do CAR estão desconectados de seus parceiros reguladores naturais pela própria natureza da estrutura do CAR, há um risco inerente de que os CARs possam levar a um baixo nível de ativação constitutiva, o que poderia resultar em toxicidades fora do alvo. Portanto, a natureza sintética do CAR prototípico pode interromper os mecanismos canônicos que limitam a ativação do TCR e pode sustentar a toxicidade grave frequentemente associada a doses terapêuticas de células T do CAR convencionais.

[0075] Dadas essas limitações, é preferível redirecionar células T para atacar tumores por meio de seu TCR natural. Para essa finalidade, foi criada uma classe de proteínas recombinantes denominadas “Engajadores de células T biespecíficas” (BiTEs). Essas proteínas empregam fragmentos de anticorpos biespecíficos para reticular receptores TCR de células T com antígenos alvo. Isso leva à ativação eficiente das células T, desencadeando citotoxicidade. De forma similar, anticorpos biespecíficos foram gerados para atingir esse objetivo e alguns cientistas simplesmente ligaram os anticorpos anti-CD3 a anticorpos específicos do tumor, empregando ligação química. Embora essas proteínas biespecíficas tenham demonstrado alguma atividade in vitro, a produção de GMP, meia-vida biológica curta e biodisponibilidade limitada representam desafios significativos para o uso bem-sucedido dessas moléculas no tratamento do câncer. Adicionalmente, essas moléculas também falham em recapitular adequadamente a sinalização natural do TCR porque não envolvem os correceptores do TCR (CD8 e CD4).

[0076] Em vista do acima, permanece a necessidade de receptores quiméricos com atividade e segurança intensificadas.

[0077] Um receptor quimérico alternativo, denominado receptor de acoplador de antígeno de célula T trifuncional (Tri-TAC ou TAC), foi desenvolvido, que emprega uma biologia distinta para direcionar a célula T para atacar tumores. Enquanto o CAR é um receptor totalmente sintético que une componentes do complexo de sinalização do receptor de células T (TCR), o receptor de TAC redireciona o TCR para alvos tumorais e recapitula a estrutura de sinalização de TCR nativa. Por exemplo, em algumas modalidades, os TACs revelados nesse documento ativam a sinalização natural do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) através do receptor de células T (TCR), enquanto retêm o direcionamento irrestrito ao MHC. Além disso, os TACs revelados nesse documento recrutam o receptor de células T (TCR) em combinação com a estimulação do correceptor. Além disso, em algumas modalidades, os Tri-TACs revelados nesse documento mostram atividade e segurança intensificadas. Certa terminologia

[0078] O termo “célula T”, como usado nesse documento, refere-se a um tipo de linfócito que desempenha um papel central na imunidade mediada por células. As células T, também conhecidas como linfócitos T, distinguem-se de outros linfócitos, tais como células B e células exterminadoras naturais, pela presença de um receptor de células T (TCR) na superfície da célula. Existem vários subconjuntos de células T com funções distintas, incluindo, mas não se limitando a, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memória, células T reguladoras e células T exterminadoras naturais.

[0079] O termo “acoplador de antígeno de célula T” ou TAC é usado alternadamente com “acoplador de antígeno de célula T trifuncional” ou Tri-TAC e se refere a uma construção de ácido nucleico ou polipeptídeo manipulada geneticamente que, quando expressada em uma célula T, ajuda a facilitar o direcionamento da célula T para um antígeno particular. Em algumas modalidades, o TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) um ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de receptor de células T (TCR) e (c) um domínio de sinalização de receptor de células T.

[0080] O termo “polinucleotídeo” e/ou “sequência de ácidos nucleicos” e/ou “ácido nucleico”, como usado(s) nesse documento, refere-se a uma sequência de nucleosídeos ou monômeros de nucleotídeos que consistem em bases, açúcares e ligações entre os açúcares (cadeia principal). O termo também inclui sequências modificadas ou substituídas compreendendo monômeros de ocorrência não natural ou porções dos mesmos. As sequências de ácidos nucleicos do presente pedido podem ser sequências de ácido desoxirribonucleico (DNA) ou sequências de ácido ribonucleico (RNA) e podem incluir bases de ocorrência natural incluindo adenina, guanina, citosina, timidina e uracila. As sequências também podem conter bases modificadas. Exemplos de tais bases modificadas incluem aza e deaza adenina, guanina, citosina, timidina e uracila; e xantina e hipoxantina. Os ácidos nucleicos da presente revelação podem ser isolados de organismos biológicos, formados por métodos de laboratório de recombinação genética ou obtidos por síntese química ou outros protocolos conhecidos para a criação de ácidos nucleicos.

[0081] O termo “polinucleotídeo isolado” ou “sequência de ácidos nucleicos isolada”, como usado nesse documento, refere-se a um ácido nucleico substancialmente livre de material celular ou meio de cultura quando produzido por técnicas de DNA recombinante ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. Um ácido nucleico isolado também está substancialmente livre de sequências que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5’ e 3’ do ácido nucleico) das quais o ácido nucleico é derivado. O termo “ácido nucleico” se destina a incluir DNA e RNA e é de fita dupla ou fita simples e representa a fita de sentido ou antissentido. Além disso, o termo “ácido nucleico” inclui as sequências de ácidos nucleicos complementares.

[0082] O termo “ácido nucleico recombinante” ou “ácido nucleico manipulado geneticamente”, como usado nesse documento, refere-se a um ácido nucleico ou polinucleotídeo que não é encontrado em um organismo biológico. Por exemplo, os ácidos nucleicos recombinantes podem ser formados por métodos de laboratório de recombinação genética (tal como clonagem molecular) para criar sequências que de outra forma não seriam encontradas na natureza. Os ácidos nucleicos recombinantes também podem ser criados por síntese química ou outros protocolos conhecidos para a criação de ácidos nucleicos.

[0083] O termo “polipeptídeo” ou “proteína”, como usado nesse documento, descreve uma cadeia de aminoácidos. Um(a) polipeptídeo ou proteína dessa revelação é um peptídeo, que usualmente descreve uma cadeia de aminoácidos. O termo proteína, como usado nesse documento, também descreve uma molécula grande que compreende uma ou mais de cadeias de aminoácidos e, em algumas modalidades, é um fragmento ou u, domínio de uma proteína ou uma proteína de comprimento total. Além disso, como usado nesse documento, o termo proteína se refere a uma cadeia linear de aminoácidos ou a uma cadeia de aminoácidos que foi processada e dobrada em uma proteína funcional. A estrutura da proteína é dividida em quatro níveis distintos: (1) estrutura primária - referindo-se à sequência de aminoácidos na cadeia polipeptídica, (2) estrutura secundária - referindo-se às subestruturas locais regulares na cadeia principal do polipeptídeo, tal como hélice α e folhas β, (3) estrutura terciária - referindo-se à estrutura tridimensional de moléculas de proteína monomérica e multimérica, e (4) estrutura quaternária - referindo-se à estrutura tridimensional que compreende a agregação de dois ou mais cadeias polipeptídicas individuais que operam como uma única unidade funcional. As proteínas da presente revelação, em algumas modalidades, são obtidas por isolamento e purificação das proteínas de células onde são produzidas naturalmente, por clivagem enzimática (por exemplo, proteolítica) e/ou de forma recombinante por expressão de ácido nucleico que codifica as proteínas ou os fragmentos dessa revelação. As proteínas e/ou os fragmentos dessa revelação, em algumas modalidades, são obtida(o)s por síntese química ou outros protocolos conhecidos para a produção de proteínas e fragmentos.

[0084] O termo “polipeptídeo isolado” refere-se a um polipeptídeo substancialmente livre de material celular ou meio de cultura quando produzido por técnicas de DNA recombinante, ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente.

[0085] O termo “anticorpo”, como usado nesse documento, pretende incluir anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos de cadeia única, anticorpos quiméricos e fusões de anticorpos. O anticorpo pode ser de fontes recombinantes e/ou produzido em animais transgênicos. O termo “fragmento de anticorpo”, como usado nesse documento, pretende incluir, sem limitações, Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicorpos, diacorpos e multímeros dos mesmos, fragmentos de anticorpos multiespecíficos e Anticorpos de Domínio.

[0086] O termo “vetor”, como usado nesse documento, refere-se a um polinucleotídeo que é usado para dispensar um ácido nucleico para o interior de uma célula. Em algumas modalidades, um vetor é um vetor de expressão que compreende sequências de controle de expressão (por exemplo, um promotor) operativamente ligadas a um ácido nucleico a ser expressado em uma célula. Os vetores conhecidos na técnica incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, fagos, cosmídeos e vírus.

[0087] O termo “antígeno tumoral” ou “antígeno associado a tumor”, como usado nesse documento, refere-se a uma substância antigênica produzida em células tumorais que desencadeia uma resposta imune em um hospedeiro (por exemplo, que é apresentada por complexos MHC). Em algumas modalidades, um antígeno tumoral está na superfície de uma célula tumoral.

[0088] O termo “receptor de células T” ou TCR, como usado nesse documento, refere-se a um complexo de proteínas de membrana integral que participa da ativação de células T em resposta à ligação de um antígeno. O TCR é um heterodímero ancorado à membrana ligado por dissulfeto normalmente consistindo nas cadeias alfa (α) e beta (β ) altamente variáveis expressadas como parte de um complexo com as moléculas da cadeia CD3 invariante (grupamento de diferenciação 3). As células T que expressam esse receptor são referidas como células T α:β (ou αβ), embora uma minoria de células T expresse um receptor alternativo, formado por cadeias gama (γ ) e delta (δ) variáveis, referidas como células T γδ. CD3 é um complexo proteico composto por quatro cadeias distintas. Em mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3γ, uma cadeia CD3δ, duas cadeias CD3ε e duas cadeias CD3ζ.

[0089] Como usado nesse documento, o termo “domínio transmembranar e citosólico” refere-se a um polipeptídeo que compreende um domínio transmembranar e um domínio citosólico de uma proteína associada ao complexo do receptor de células T (TCR). Em algumas modalidades, tal domínio transmembranar e citosólico pode incluir, mas não está limitado a, domínios de proteína que (a) se associam com a jangada lipídica e/ou (b) se ligam a Lck.

[0090] Um “correceptor de TCR”, como usado nesse documento, refere-se a uma molécula que auxilia o receptor de células T (TCR) na comunicação com uma célula apresentadora de antígeno e pode ser considerada parte do primeiro sinal que leva à ativação do TCR. Exemplos de correceptores de TCR incluem, mas não estão limitados a, CD4, LAG3 e CD8.

[0091] Um “coestimulador de TCR”, como usado nesse documento, refere-se a uma molécula que intensifica a resposta de uma célula T a um antígeno e pode ser considerado como o segundo sinal que leva à ativação do TCR. Exemplos de coestimuladores de TCR incluem, mas não estão limitados a, ICOS, CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40 (CD134), CD30, CD40, antígeno associado à ficção de linfócitos 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e um ligante que se liga especificamente a CD83.

[0092] Um “coinibidor de TCR” ou “receptor de ponto de verificação”, como usado nesse documento, refere-se a uma molécula que inibe a resposta de uma célula T a um antígeno. Exemplos de coinibidores de TCR incluem, mas não estão limitados a, PD-1, TIM3, LAG-3, TIGIT, BTLA, CD160 e CD37.

[0093] Os termos “receptor”, “indivíduo”, “indivíduo”, “hospedeiro” e “paciente” são usados indistintamente nesse documento e em algumas modalidades, referem-se a qualquer indivíduo mamífero para o qual o diagnóstico, o tratamento ou a terapia é desejado(a), particularmente humanos. “Mamífero” para finalidades de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, e animais de laboratório, zoológico, esportes ou de estimação, tais como, cães, cavalos, gatos, vacas, ovelhas, cabras, porcos,

camundongos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, macacos etc. Em algumas modalidades, o mamífero é humano. Nenhum desses termos requer a supervisão de pessoal médico.

[0094] Como usado nesse documento, os termos “tratamento”, “tratando” e semelhantes, em algumas modalidades, referem-se à administração de um agente ou à realização de um procedimento para fins de obtenção de um efeito. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de afetar uma cura parcial ou completa de uma doença e/ou de sintomas da doença. “Tratamento”, como usado nesse documento, pode incluir o tratamento de um(a) doença ou distúrbio (por exemplo, câncer) em um mamífero, particularmente em um humano, e inclui: (a) prevenir a doença ou o sintoma de uma doença que ocorre em um indivíduo que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como portador (por exemplo, incluindo doenças que podem ser associadas ou causadas por uma doença primária; (b) inibir a doença, isto é, interromper seu desenvolvimento; e (c) aliviar a doença, isto é, causando a regressão da doença. O tratamento pode referir-se a quaisquer indícios de sucesso no tratamento ou na melhoria ou na prevenção de um câncer, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo, tal como redução; remissão; diminuição dos sintomas; ou tornando a condição da doença mais tolerável para o paciente; desaceleração na taxa de degeneração ou declínio; ou tornando o ponto final da degeneração menos debilitante. O tratamento ou a melhoria dos sintomas é baseado(a) em um ou mais de parâmetros objetivos ou subjetivos; incluindo os resultados de um exame por um médico. Consequentemente, o termo “tratar” inclui a administração dos compostos ou agentes da presente invenção para prevenir, retardar, aliviar, interromper ou inibir o desenvolvimento do(a)s sintomas ou condições associadas a doenças (por exemplo, câncer). O termo “efeito terapêutico” refere-se à redução, eliminação ou prevenção da doença, dos sintomas da doença ou de efeitos colaterais da doença no indivíduo.

[0095] Como usado nesse documento, as formas singulares “um”, “e” e “o/a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “um anticorpo” inclui uma pluralidade de anticorpos e a referência a “um anticorpo” em algumas modalidades inclui vários anticorpos e assim por diante.

[0096] Como usado nesse documento, todos os valores numéricos ou faixas numéricas incluem números inteiros dentro ou abrangendo tais intervalos e frações dos valores ou os inteiros dentro ou abrangendo faixas, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a uma faixa de 90-100% inclui 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 96%, 97%, etc., bem como 91,1%; 91,2%; 91,3%; 91,4%; 91,5%; etc., 92,1%; 92,2%; 92,3%; 92,4%; 92,5%; etc. e assim por diante. Em outro exemplo, a referência a uma faixa de 1-5.000 vezes inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, vezes, etc., bem como 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5, vezes, etc., 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; vezes, etc., e assim por diante.

[0097] “Cerca de” um número, como usado nesse documento, refere-se à faixa incluindo o número e variando de 10% abaixo desse número a 10% acima desse número. “Cerca de” uma faixa refere-se a 10% abaixo do limite inferior da faixa, abrangendo 10% acima do limite superior da faixa.

[0098] “Porcentagem (%) de identidade” se refere à extensão em que duas sequências (nucleotídeo ou aminoácido) têm o mesmo resíduo nas mesmas posições em um alinhamento. Por exemplo, “uma sequência de aminoácidos é X% idêntica à SEQ ID NO: Y” refere-se à % de identidade da sequência de aminoácidos à SEQ ID NO: Y e é elaborada como X% de resíduos na sequência de aminoácidos são idênticos aos resíduos de sequência revelados na SEQ ID NO: Y. Geralmente, programas de computador são empregados para tais cálculos. Programas exemplificativos que comparam e alinham pares de sequências incluem ALIGN (Myers e Miller, 1988), FASTA (Pearson e Lipman, 1988; Pearson, 1990) e BLAST com lacunas (Altschul et al., 1997), BLASTP, BLASTN ou GCG (Devereux et al., 1984).

[0099] Como usado nesse documento, o termo “ligação seletiva” refere-se à maior afinidade com a qual uma molécula (por exemplo, proteína, tal como um ligante de ligação a alvo de TAC) se liga à sua molécula alvo (por exemplo, antígeno alvo, tal como HER-2, BCMA ou CD19) por outras moléculas. Acoplador de antígeno de célula T (Tri-TAC ou TAC)

[00100] São revelados nesse documento, em certas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam um acoplador de antígeno de células T Trifuncional CD19 (Tri-TAC). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam um Tri-TAC compreendem: (a) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante específico para o alvo; (b) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a um complexo de TCR; e (c) um terceiro polinucleotídeo que codifica um domínio transmembranar e um domínio citosólico. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam um Tri-TAC não codificam um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam um Tri-TAC não codificam um domínio de coativação. Ligante específico para o alvo

[00101] O ligante específico para o alvo, também denominado domínio de ligação a antígeno, refere-se a qualquer substância ou molécula que se liga, direta ou indiretamente, a uma célula alvo. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo se liga a um antígeno na célula alvo. Em algumas modalidades, uma célula alvo é uma célula associada a um estado de doença, incluindo, mas não se limitando a, câncer, doença maligna hematológica, linfoma de grandes células B, linfoma difuso de grandes células B, linfoma primário do mediastino de células B, linfoma de células B de alto grau ou linfoma de grandes células B decorrente de linfoma folicular. Em algumas modalidades, uma célula alvo é uma célula tumoral. Em algumas modalidades, um ligante específico para o alvo se liga a um antígeno tumoral ou antígeno associado a tumor em uma célula tumoral. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, o antígeno tumoral quando proteico é uma sequência de 8 ou mais aminoácidos até a proteína completa. Em algumas modalidades, o antígeno tumoral é qualquer número de aminoácidos entre 8 e a proteína de comprimento total que compreende pelo menos um fragmento antigênico da proteína de comprimento total que é apresentado em um Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). Exemplos de antígenos tumorais incluem, mas não estão limitados a, CD19, HER-2 (erbB-2), antígeno de maturação de células B (BCMA), alfafetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionário (CEA), CA-125, MUC-1, antígeno de tumor epitelial (ETA), tirosinase, antígeno associado a melanoma (MAGE), antígeno específico da próstata (PSA), antígeno associado a glioma, gonadotrofina coriônica humana β, tireoglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptase reversa da telomerase humana, RU1, RU2 (AS), carboxil esterase intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prosteína, PSMA, survivina e telomerase, antígeno tumoral do carcinoma da próstata-1 (PCTA-1), ELF2M, elastase de neutrófilos, CD22, fator de crescimento da insulina (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I e mesotelina.

[00102] Em algumas modalidades, os ligantes específicos do alvo incluem, mas não estão limitados a, anticorpos e fragmentos dos mesmos, por exemplo, anticorpos de cadeia única, tais como anticorpos de cadeia única (scFvs), anticorpos de domínio único, peptídeos, peptidomiméticos, proteínas, glicoproteínas ou proteoglicanos que se ligam à(ao) célula e/ou antígeno alvo. Em algumas modalidades, os ligantes específicos ao alvo incluem, mas não estão limitados a, proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins), lectinas, knottins, centrinas, anticalinas ou ligantes de ocorrência natural para o antígeno tumoral, tais como, fatores de crescimento, substratos de enzimas, receptores ou proteínas de ligação. Em algumas modalidades, ligantes específicos alvo incluem compostos não proteicos que se ligam a células alvo e/ou antígenos, incluindo, mas não se limitando a, carboidratos, lipídios, ácidos nucleicos ou moléculas pequenas. Em algumas modalidades, um ligante específico para o alvo é uma repetição de anquirina projetada (DARPin) direcionada a um(a) célula e/ou antígeno alvo. Em algumas modalidades, um ligante específico para o alvo é um fragmento variável de cadeia única (ScFv) direcionado a um(a) célula e/ou antígeno alvo.

[00103] Em algumas modalidades, o antígeno tumoral é um antígeno HER-2. Em algumas modalidades, o ligante específico para HER-2 compreende um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo selecionado de Trastuzumab, Pertuzumab, Lapatinib, Neratinib, Ado-trastuzmab Emtansina, Gancotamab, Margetuximab, Timigutuzumab e Ertumaxomab. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um DARPin que se liga seletivamente a um antígeno HER-2 (erbB-2). Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um DARPin que se liga especificamente a um antígeno HER-2 (erbB- 2). Em algumas modalidades, o DARPin direcionado a HER-2 (erb-2) compreende SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.

[00104] Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7.

[00105] Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

[00106] Em algumas modalidades, o antígeno tumoral é um antígeno BCMA. Em algumas modalidades, o ligante específico para BCMA compreende um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo selecionado de Belantamab mafodotina e GSK2857916.

Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um scFv que se liga seletivamente a BCMA. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um scFv que se liga especificamente a BCMA. Em algumas modalidades, o scFv que liga BCMA compreende SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO:

34.

[00107] Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 33.

[00108] Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75%

de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34.

[00109] Em algumas modalidades, o antígeno tumoral é um antígeno CD19. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um scFv que se liga seletivamente a CD19. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um scFv que se liga especificamente a CD19. Em algumas modalidades, o scFv que se liga a CD19 compreende SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36.

[00110] Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 35.

[00111] Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36. Ligante que se liga a um complexo de TCR

[00112] Em algumas modalidades, o TAC compreende um aglutinante que se liga a uma proteína associada ao complexo de TCR. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR compreende uma substância que se liga, direta ou indiretamente, a uma proteína do TCR. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR compreende uma substância que se liga seletivamente a uma proteína do TCR. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR compreende uma substância que se liga especificamente a uma proteína do TCR. As proteínas associadas ao TCR incluem, mas não estão limitadas, à cadeia TCR alfa (α), cadeia TCR beta (β), cadeia TCR gama (γ), cadeia TCR delta (δ), cadeia CD3γ, cadeia CD3δ e cadeia CD3ε Em algumas modalidades, um aglutinante que se liga a uma proteína associada ao complexo de TCR é um anticorpo para a cadeia TCR alfa (α), cadeia TCR beta (β), cadeia TCR gama (γ), cadeia TCR delta (δ), cadeia CD3γ , Cadeia CD3δ e/ou cadeia CD3ε. Em algumas modalidades, a proteína associada a um complexo de TCR é CD3. Em algumas modalidades, a proteína associada a um complexo de TCR é CD3ε. Exemplos de anticorpos CD3 incluem, mas não estão limitados a, para. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a CD3 é um anticorpo de cadeia única, por exemplo, um fragmento variável de cadeia única (scFv). Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um TCR é um anticorpo anti-CD3, ou um fragmento do mesmo, tais como, muromonab, otelixizumab, teplizumab, visilizumab, CD3-12, MEM-57,

4D10A6, CD3D ou TR66.

[00113] Em algumas modalidades, o CD3 é um complexo de TCR em uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo. Em algumas modalidades, a ligação do CD3 induz a ativação de uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo.

[00114] Em algumas modalidades, o aglutinante que se liga a um complexo de TCR é UCHT1 ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR é UCHT1 (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou homólogos dos mesmos). Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 se liga a CD3. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 se liga seletivamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 se liga especificamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 se liga a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 se liga seletivamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 se liga especificamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 é codificado pela SEQ ID NO 13. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 compreende a SEQ ID NO 14. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 é mutado. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 compreende uma mutação Y182T (também referida como UCHT1 (Y182T)) (SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72). Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 (Y182T) se liga a CD3. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 (Y182T) se liga seletivamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 (Y182T) se liga especificamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 (Y182T) se liga a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 (Y182T) se liga seletivamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 (Y182T) se liga especificamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 (Y182T) é codificado pela SEQ ID NO 71. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 (Y182T) compreende a SEQ ID NO 72. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR é um UCHT1 humanizado (huUCHT1). Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR é huUCHT1 (SEQ ID NO 43, SEQ ID NO: 44 ou homólogos dos mesmos). Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 se liga a CD3. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 se liga seletivamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 se liga especificamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 se liga a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 se liga seletivamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 se liga especificamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 é codificado pela SEQ ID NO 43. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 compreende a SEQ ID NO 44. Em algumas modalidades, o huUCHT1 tem uma mutação Y177T (também referida como huUCHT1 (Y177T)) (SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 (Y177T) se liga a CD3. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 (Y177T) se liga seletivamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 (Y177T) se liga especificamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 (Y177T) se liga a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 (Y177T) se liga seletivamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 (Y177T) se liga especificamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 (Y177T) é codificado pela SEQ ID NO 45. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 compreende a SEQ ID NO 46.

[00115] Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13.

[00116] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

14. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

14. Em algumas modalidades, o ligante que liga um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

14.

[00117] Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 71.

[00118] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 72. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

72. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

72. Em algumas modalidades, o ligante que liga um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 72. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 72. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 72. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

72.

[00119] Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 43.

[00120] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

44. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

44. Em algumas modalidades, o ligante que liga um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

44.

[00121] Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 45.

[00122] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

46. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

46. Em algumas modalidades, o ligante que liga um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

46.

[00123] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um CD3 é OKT3. Em algumas modalidades, o ligante OKT3 se liga a CD3. Em algumas modalidades, o ligante OKT3 se liga seletivamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante OKT3 se liga especificamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante OKT3 se liga a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante OKT3 se liga seletivamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante OKT3 se liga especificamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante OKT3 de murino é codificado pela SEQ ID NO 21. Em algumas modalidades, o ligante OKT3 compreende a SEQ ID NO 22.

[00124] Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 21.

[00125] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

22. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

22. Em algumas modalidades, o ligante que liga um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

22.

[00126] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um CD3 é F6A. Em algumas modalidades, o ligante F6A se liga a CD3. Em algumas modalidades, o ligante F6A se liga seletivamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante F6A se liga especificamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante F6A se liga a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante F6A se liga seletivamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante F6A se liga especificamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante F6A de murino é codificado pela SEQ ID NO 23. Em algumas modalidades, o ligante F6A compreende a SEQ ID NO 24.

[00127] Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 23.

[00128] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

24. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

24. Em algumas modalidades, o ligante que liga um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

24.

[00129] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um CD3 é L2K. Em algumas modalidades, o ligante L2K se liga a CD3. Em algumas modalidades, o ligante L2K se liga seletivamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante L2K se liga especificamente a CD3. Em algumas modalidades, o ligante L2K se liga a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante L2K se liga seletivamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante L2K se liga especificamente a CD3ε. Em algumas modalidades, o ligante L2K de murino é codificado pela SEQ

ID NO 25. Em algumas modalidades, o ligante L2K compreende a SEQ ID NO 26.

[00130] Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 25.

[00131] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

26. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

26. Em algumas modalidades, o ligante que liga um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a um complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

26. Domínio transmembranar e domínio citosólico

[00132] Em algumas modalidades, um acoplador de antígeno de células T inclui um polipeptídeo do domínio de sinalização de receptor de células T. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende um domínio citosólico. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende um domínio transmembranar e um domínio citosólico. Em algumas modalidades, o domínio citosólico e os domínios transmembranares são opcionalmente unidos por um ligante. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T compreende um domínio de correceptor TCR. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T não compreende um domínio de coestimulador de TCR. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende um domínio transmembranar e/ou um domínio citosólico de um correceptor de TCR. Em algumas modalidades, o correceptor de TCR é CD4, CD8, LAG3 ou uma variação quimérica dos mesmos.

[00133] Em algumas modalidades, o correceptor TCR é CD4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende os domínios transmembranar e citosólico do correceptor CD4 codificado pela SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende os domínios transmembranar e citosólico do correceptor CD4 compreendendo SEQ ID NO: 18.

[00134] Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17.

[00135] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

18. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio itosólico compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

[00136] Em algumas modalidades, o correceptor de TCR é CD8. Em algumas modalidades, o correceptor TCR é CD8α. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende os domínios transmembranar e citosólico do correceptor CD8α codificado pela SEQ ID NO:

37. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende os domínios transmembranar e citosólico do correceptor CD8α compreendendo SEQ ID NO: 38.

[00137] Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 37.

[00138] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

38. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[00139] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende uma quimera de sequências ou domínios de correceptores. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende uma quimera de CD8α e CD8β, em que a região rica em arginina de CD8α é substituída pela região rica em arginina de CD8β. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T compreende os domínios transmembranar e citosólico da quimera do correceptor CD8α+R(β) codificada pela SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T compreende os domínios transmembranar e citosólico da quimera do correceptor CD8α+ R(β) fornecida pela SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende uma quimera de CD8α e CD8β, o domínio CD8α CXCP, que contém um motivo de ligação de Lck, é afixado ao terminal C do domínio citosólico de CD8β. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T compreende os domínios transmembranar e citosólico da quimera do correceptor CD8β+Lck codificada pela SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T compreende os domínios transmembranar e citosólico da quimera do correceptor CD8β+Lck fornecida pela SEQ ID NO: 42.

[00140] Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39.

[00141] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

40. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e c domínio itosólico compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[00142] Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, o terceiro polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 41.

[00143] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

42. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e o domínio citosólico compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar e domínio itosólico compreendem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

[00144] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T compreende um domínio de coestimulador de TCR. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é ICOS. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é CD27. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é CD28. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é 4-1BB (CD137). Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é OX40 (CD134). Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é CD30. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é CD40. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é o antígeno associado à ficção de linfócitos 1 (LFA-1). Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é CD2. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é CD7. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é LIGHT. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é NKG2C. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é B7-H3. Em algumas modalidades, o coestimulador de TCR é um ligante que se liga especificamente a CD83.

[00145] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende um domínio transmembranar e/ou um domínio citosólico de um coinibidor de TCR. Em algumas modalidades, o coinibidor de TCR é PD-1. Em algumas modalidades, o coinibidor de TCR é TIM3. Em algumas modalidades, o coinibidor de TCR é LAG-3. Em algumas modalidades, o coinibidor de TCR é TIGIT. Em algumas modalidades, o coinibidor de TCR é BTLA. Em algumas modalidades, o coinibidor de TCR é CD160. Em algumas modalidades, o coinibidor de TCR é CD37.

[00146] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR inclui um domínio citosólico e um domínio transmembranar de um correceptor de TCR ou proteína coestimuladora. Em algumas modalidades, o domínio citosólico e o domínio transmembranar são do mesmo correceptor ou coestimulador ou de diferentes correceptores ou coestimuladores. Em algumas modalidades, o TAC compreende ainda outros polipeptídeos que atuam direta ou indiretamente para direcionar ou ativar a célula T. Ligantes, conectores e configurações

[00147] Em algumas modalidades, um ácido nucleico revelado nesse documento está na ordem de (1) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante específico para o alvo; (2) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a um complexo de TCR; (3) um terceiro polinucleotídeo que codifica um domínio transmembranar e um domínio citosólico. Em algumas modalidades, um ácido nucleico revelado nesse documento está na ordem de (1) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante específico para o alvo; (2) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a um complexo de TCR; (3) um terceiro polinucleotídeo que codifica um domínio transmembranar e um domínio citosólico, em que a ordem é da extremidade 5’ para a extremidade 3’. Em algumas modalidades, um ácido nucleico revelado nesse documento está na ordem de (1) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante específico para o alvo; (2) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a um complexo de TCR; (3) um terceiro polinucleotídeo que codifica um domínio transmembranar e um domínio citosólico, em que a ordem é da extremidade 3’ para a extremidade 5’. Em algumas modalidades, um ácido nucleico descrito nesse documento está na ordem de (1) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a um complexo de TCR; (2) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante específico para o alvo; (3) um terceiro polinucleotídeo que codifica um domínio transmembranar e um domínio citosólico. Em algumas modalidades, um ácido nucleico descrito nesse documento está na ordem de (1) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a um complexo de TCR; (2) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante específico para o alvo; (3) um terceiro polinucleotídeo que codifica um domínio transmembranar e um domínio citosólico, em que a ordem é da extremidade 5’ para a extremidade 3’. Em algumas modalidades, um ácido nucleico descrito nesse documento está na ordem de (1) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a um complexo de TCR; (2) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante específico para o alvo; (3) um terceiro polinucleotídeo que codifica um domínio transmembranar e um domínio citosólico, em que a ordem é da extremidade 3’ para a extremidade 5’.

[00148] Em algumas modalidades, o primeiro ácido nucleico codifica um primeiro polipeptídeo, o segundo ácido nucleico codifica um segundo polipeptídeo e o terceiro ácido nucleico codifica um terceiro polipeptídeo. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo, o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo são fundidos diretamente. Por exemplo, o ligante específico para o alvo e o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T são ambos fundidos ao ligante que se liga ao complexo de TCR. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo, o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo são unidos por pelo menos um ligante. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são diretamente fundidos e unidos ao terceiro polipeptídeo por um ligante. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo e o terceiro polipeptídeo são diretamente fundidos e unidos ao primeiro polipeptídeo por um ligante.

[00149] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante peptídico. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende de 1 a 40 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende de 1 a 30 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende de 1 a 15 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende de 1 a 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende de 1 a 6 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende 30 a 40 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende 32 a 36 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende 5 a 30 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende 5 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende 15 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende 20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende 25 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende 30 aminoácidos.

[00150] Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende um ligante G4S3 (SEQ ID NO: 74). Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende SEQ ID NOs: 11, 12, 15, 16, 19, 20 ou variantes ou fragmentos das mesmas.

[00151] Em algumas modalidades, o ligante peptídico que une o ligante específico para o alvo ao ligante que se liga a um complexo de TCR (por exemplo, UCHT1) é conhecido como o conector para distinguir este domínio de proteína de outros ligantes no Tri-TAC. O conector é de qualquer tamanho. Em algumas modalidades, o conector entre o ligante que se liga a um complexo de TCR e um ligante específico para o alvo é uma hélice curta compreendendo SEQ ID NO ID: 28. Em algumas modalidades, o conector entre o ligante que liga um complexo de TCR e um ligante específico para o alvo é uma hélice curta codificada pela SEQ ID NO ID: 27. Em algumas modalidades, o conector entre o ligante que se liga a um complexo de TCR e um ligante específico para o alvo é uma hélice longa que compreende a SEQ ID NO ID: 30. Em algumas modalidades, o conector entre o ligante que se liga a um complexo de TCR e um ligante específico para o alvo é uma longa hélice codificada pela SEQ ID NO ID: 29. Em algumas modalidades, o conector entre o ligante que se liga a um complexo de TCR e um ligante específico para o alvo é um domínio grande que compreende SEQ ID NO ID: 32. Em algumas modalidades, o conector entre o ligante que se liga a um complexo de TCR e um ligante específico para o alvo é um domínio grande codificado pela SEQ ID NO ID: 31.

[00152] Em algumas modalidades, um ácido nucleico revelado nesse documento compreende uma sequência líder. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5, 47 ou 49. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5, 47 ou 49. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5, 47 ou 49. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5, 47 ou 49. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5, 47 ou 49. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5, 47 ou 49. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, 47, ou 49.

[00153] Em algumas modalidades, um ácido nucleico revelado nesse documento compreende uma sequência líder. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, 48 ou 50. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, 48 ou 50. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, 48 ou 50. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, 48 ou 50. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, 48 ou 50. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, 48 ou 50. Em algumas modalidades, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 48 ou 50.

[00154] O Tri-TAC é contemplado como estando presente em várias configurações e combinações de (a) ligante específico para o alvo, (b) um ligante que se liga a um complexo de TCR e (c) um domínio de sinalização de TCR, como revelado nesse documento.

[00155] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) um anticorpo de cadeia única (scFv) que se liga a CD3ε e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) UCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) OKT3 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4.

Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4.

[00156] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) UCHT1, e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) OKT3 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4.

[00157] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) UCHT1, e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4.

Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) OKT3 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4.

[00158] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) UCHT1, e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) huUCHT1, e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) OKT3, e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) F6A, e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4.

[00159] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) UCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) OKT3 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4.

[00160] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) UCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) OKT3 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4.

[00161] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) um anticorpo de cadeia única (scFv) que se liga a CD3ε e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) UCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8.

Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) OKT3 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8.

[00162] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) UCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD4. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) OKT3 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8.

[00163] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) UCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) OKT3 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um scFv, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8.

[00164] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) UCHT1, e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) UCHT1 (Y182T), e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ligante específico para o alvo, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) OKT3 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um DARPin específico para HER-2, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8.

[00165] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) UCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) OKT3, e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para BCMA, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8.

[00166] Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a)

um ScFv específico para CD19, (b) UCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) UCHT1 (Y182T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) huUCHT1 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) huUCHT1 (Y177T) e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) OKT3 e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) F6A e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8. Em algumas modalidades, o Tri-TAC compreende (a) um ScFv específico para CD19, (b) L2K e (c) um domínio transmembranar e um domínio citosólico do correceptor CD8.

[00167] Em algumas modalidades, o Tri-TAC atrai CD3 e TCR para as regiões de jangada lipídica da membrana e traz Lck para a proximidade do TCR, similar à ligação natural do MHC.

[00168] Em algumas modalidades, o TAC revelado nesse documento é o DARPin Tri-TAC anti-HER-2 (também referido como configuração 1; SEQ ID NO: 1 e 2) inclui, na ordem: i) a sequência líder de Tri-TAC anti-HER-2 (sinal de secreção) (SEQ ID NO: 5 e 6); ii) DARPin específico para o antígeno HER-2 (SEQ ID NO: 7 e 8);

iii) etiqueta Myc (SEQ ID NO: 9 e 10); iv) Conector (SEQ ID NO: 11 e 12); v) UCHT1 (SEQ ID NO: 13 e 14); vi) Ligante (SEQ ID NO: 15 e 16); vii) CD4 (SEQ ID NO: 17 e 18).

[00169] Em algumas modalidades, o TAC revelado nesse documento é um HER2-TAC. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 65.

[00170] Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 66. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 66. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 66. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 66. Em algumas modalidades, o HER2-TAC é uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

66. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 66. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.

[00171] Em algumas modalidades, o TAC revelado nesse documento é um HER2-TAC. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 67.

[00172] Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, o HER2-TAC é uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

68. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.

[00173] Em algumas modalidades, o TAC revelado nesse documento é um HER2-TAC. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 75.

[00174] Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 76. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 76. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 76. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 76. Em algumas modalidades, o HER2-TAC é uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:

76. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 76. Em algumas modalidades, o HER2-TAC compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76.

[00175] Em algumas modalidades, o TAC revelado nesse documento é um BCMA-TAC. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, 57, 59 ou 61. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de sequência identidade com a SEQ ID NO: 55, 57, 59 ou 61. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, 57, 59 ou 61. Em algumas modalidades,

o BCMA-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, 57, 59 ou 61. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, 57, 59 ou 61. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, 57, 59 ou 61. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 55, 57, 59 ou 61.

[00176] Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, 58, 60 ou 62. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, 58, 60 ou 62. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, 58, 60 ou 62. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, 58, 60 ou

62. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo em pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, 58, 60 ou 62. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, 58, 60 ou 62. Em algumas modalidades, o BCMA-TAC compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, 58, 60 ou 62.

[00177] Em algumas modalidades, o TAC revelado nesse documento é um CD19-TAC. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 63.

[00178] Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, o CD19-TAC compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64. Polipeptídeos e construtos de vetor

[00179] São revelados nesse documento, em certas modalidades, polipeptídeos codificados pela sequência de ácidos nucleicos conforme revelado nesse documento. Também são revelados nesse documento os vetores que compreendem a sequência de ácidos nucleicos como revelado nesse documento. Em algumas modalidades, os vetores compreendem adicionalmente um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é funcional em uma célula de mamífero. Os promotores, regiões de DNA que iniciam a transcrição de uma sequência de ácidos nucleicos particular, são bem conhecidos na técnica. Um “promotor funcional em uma célula de mamífero” refere-se a um promotor que conduz a expressão da sequência de ácidos nucleicos associada em uma célula de mamífero. Um promotor que conduz a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos é referido como sendo “operacionalmente conectado” à sequência de ácidos nucleicos.

[00180] Uma variedade de vetores de dispensação e veículos de expressão são empregados para introduzir ácidos nucleicos descritos nesse documento em uma célula.

[00181] São revelados nesse documento, em certas modalidades, polinucleotídeos compreendidos em um vetor para fornecer um construto de vetor, também referido nesse documento como um vetor. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um vetor que compreende: a. um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante específico para o alvo; b. um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR; c. um terceiro polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T; e d. um promotor que é funcional em uma célula de mamífero.

[00182] Em algumas modalidades, o alvo do ligante específico para o alvo liga-se a HER-2, BCMA ou CD19. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um DARPin que se liga seletivamente a um antígeno HER-2 (erbB- 2). Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um DARPin que se liga especificamente a um antígeno HER-2 (erbB-2). Em algumas modalidades, o DARPin direcionado a HER-2 (erb-2) compreende SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um scFv que se liga seletivamente a BCMA. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um scFv que se liga especificamente a BCMA. Em algumas modalidades, o scFv que se liga a BCMA compreende a SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um scFv que se liga seletivamente a CD19. Em algumas modalidades, o ligante específico para o alvo é um scFv que se liga especificamente a CD19. Em algumas modalidades, o scFv que se liga a CD19 compreende SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 36.

[00183] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é UCHT1, UCHT1 humanizado (huUCHT1), OKT3, F6A ou L2K. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é UCHT1 ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é UCHT1 e é codificado pela SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é UCHT1 e compreende a SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o ligante UCHT1 que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR tem uma mutação Y182T (UCHT1 (Y182T)) e é codificado pela SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é UCHT1 (Y182T) e compreende a SEQ ID NO: 72. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é UCHT1 humanizado (huUCHT1) ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é UCHT1 humanizado (huUCHT1) e é codificado pela SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é huUCHT1 e compreende SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, o ligante huUCHT1 que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR tem uma mutação Y177T (huUCHT1 (Y177T)) e é codificado pela SEQ ID NO: 45. Em algumas modalidades, o ligante que se liga uma proteína associada a um complexo de TCR é huUCHT1 (Y177T) e compreende a SEQ ID NO: 46.

[00184] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é OKT3 ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é OKT3 e é codificado pela SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é OKT3 e compreende a SEQ ID NO: 22.

[00185] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é F6A ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é F6A e é codificado por SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é F6A e compreende SEQ ID NO: 24.

[00186] Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é L2K ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é L2K e é codificado por SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, o ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR é L2K e compreende SEQ ID NO: 26.

[00187] Em algumas modalidades, a proteína associada a um complexo de TCR é CD3. Em algumas modalidades, a proteína associada a um complexo de TCR é CD3ε.

[00188] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do domínio de sinalização de TCR compreende um domínio transmembranar e/ou um domínio citosólico de um correceptor de TCR. Em algumas modalidades, o correceptor de TCR é CD4, CD8, LAG3 ou uma variação quimérica do mesmo.

[00189] Em algumas modalidades, o primeiro polinucleotídeo e o terceiro polinucleotídeo são fundidos ao segundo polinucleotídeo e a sequência de codificação é operacionalmente conectada ao promotor. Em algumas modalidades, o segundo polinucleotídeo e o terceiro polinucleotídeo são fundidos ao primeiro polinucleotídeo e a sequência de codificação é operacionalmente conectada ao promotor. Em algumas modalidades, o vetor é projetado para expressão em células de mamíferos, tais como células T. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral.

[00190] Em algumas modalidades, os vetores que são úteis compreendem vetores derivados de lentivírus, vírus de células-tronco de murino (MSCV), vírus da varíola, oncoretrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados. Outros vetores de dispensação que são úteis compreendem vetores derivados de vírus herpes simplex, transposons, vírus vaccinia, vírus do papiloma humano, vírus da imunodeficiência símia, HTLV, vírus espumoso humano e variantes dos mesmos. Outros vetores que são úteis compreendem vetores derivados de espumavírus, retrovírus do tipo B de mamífero, retrovírus do tipo C de mamífero, retrovírus do tipo C de ave, retrovírus do tipo D de mamífero e retrovírus do tipo HTLV/BLV. Um exemplo de um vetor lentiviral útil nas composições e nos métodos revelados é o vetor pCCL4.

[00191] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico recombinante ou manipulado geneticamente. Em algumas modalidades, o(s) primeiro, segundo e/ou terceiro polinucleotídeo(s) é(são) polinucleotídeos recombinantes ou manipulados geneticamente. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos descritos nesse documento são modificados ou mutados para otimizar a função do polipeptídeo codificado e/ou da função, da atividade e/ou da expressão do acoplador de antígeno de células T. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um polipeptídeo.

[00192] Em algumas modalidades, modificações são feitas nas sequências de polinucleotídeos, incluindo sequências de vetores e sequências de polipeptídeo reveladas nesse documento. As modificações incluem substituição, inserção ou eliminação de nucleotídeos ou aminoácidos ou alteração das posições relativas ou ordem dos nucleotídeos ou aminoácidos. Expressão em Células T

[00193] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, células T manipuladas geneticamente compreendendo as sequências de ácidos nucleicos reveladas nesse documento ou os vetores revelados nesse documento. São reveladas nesse documento, em certas modalidades, células T humanas manipuladas geneticamente para expressar um Tri-TAC revelado nesse documento. Em algumas modalidades, a célula T expressa um Tri-TAC revelado nesse documento. Ainda são reveladas nesse documento, células T transduzidas ou transfectadas com acoplador de antígeno de célula T ou um vetor compreendendo um Tri-TAC. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T isolada.

[00194] Em algumas modalidades, as células T humanas manipuladas geneticamente para expressar um Tri-TAC demonstram funcionalidade equivalente a um CAR convencional in vitro. Em algumas modalidades, as células T manipuladas geneticamente com o Tri-TAC demonstram funcionalidade superior a um CAR convencional in vitro. São reveladas nesse documento, em algumas modalidades, células T humanas manipuladas geneticamente com um Tri-TAC que demonstram segurança intensificada em comparação com CARs tradicionais. Em algumas modalidades, as células T humanas manipuladas geneticamente para expressar um Tri-TAC demonstram segurança intensificada em comparação com os CARs tradicionais.

[00195] As células T, em algumas modalidades, são obtidas a partir de uma série de fontes, incluindo, mas não se limitando a sangue (por exemplo, células mononucleares de sangue periférico), medula óssea, tecido do timo, tecido do linfonodo, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um sítio de infecção, tecido do baço ou tumores. Em algumas modalidades, as células T são células T autólogas. Em algumas modalidades, as células T são obtidas a partir de uma linha celular de células T. Em algumas modalidades, as células T são obtidas de doadores (células T alogênicas). Em algumas modalidades, as células T são obtidas por diferenciação de células-tronco embrionárias ou adultas ou de células-tronco pluripotentes induzidas. Em algumas modalidades, independentemente da fonte de células T, as células T foram modificadas de modo que faltem a expressão de um TCR endógeno e/ou permanentemente ou temporariamente faltem a expressão de moléculas de MHC/HLA (células T doadoras universais). Em algumas modalidades, as células T são autólogas em relação ao indivíduo. Em algumas modalidades, as células são alogênicas, singênicas ou xenogênicas em relação ao indivíduo.

[00196] Em algumas modalidades, uma vez obtidas, as células T são opcionalmente enriquecidas in vitro. Em algumas modalidades, uma população de células é enriquecida por seleção positiva ou negativa. Além disso, as células T são opcionalmente congeladas ou criopreservadas e, em seguida, descongeladas posteriormente.

[00197] Em algumas modalidades, as células T são ativadas e/ou expandidas antes ou após a introdução do Tri-TAC nas células T. Em algumas modalidades, as células T são expandidas pelo contato com uma superfície tendo afixado às mesmas um agente que estimula um sinal associado ao complexo CD3/TCR e um ligante que estimula uma molécula coestimuladora na superfície das células T. Em algumas modalidades, as células T são expandidas pelo contato com um ou mais de agentes solúveis que estimulam a sinalização do complexo de CD3/TCR e a sinalização da molécula coestimuladora.

[00198] Em algumas modalidades, as células T são transduzidas ou transfectadas com sequências de ácidos nucleicos. As células T transduzidas ou transfectadas expressam proteínas codificadas pelas sequências de ácidos nucleicos transfectadas ou transduzidas. Um ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula por meios físicos, químicos ou biológicos. Os meios físicos incluem, mas não estão limitados à(ao), microinjeção, eletroporação, bombardeio de partículas, lipofecção e precipitação de fosfato de cálcio. Os meios biológicos incluem o uso de vetores de DNA e RNA.

[00199] Os vetores virais, incluindo vetores retrovirais, são usados para introduzir e expressar um ácido nucleico em uma célula T. Os vetores virais incluem vetores derivados de lentivírus, Vírus de Células-Tronco de Murino (MSCV), vírus da varíola, Vírus do Herpes Simplex I, adenovírus e vírus adenoassociados. O vetor inclui opcionalmente um promotor que conduz a expressão da molécula de ácido nucleico transduzida em uma célula T (por exemplo, um promotor CMV, promotor eF1a ou promotor MSCV).

[00200] Qualquer ensaio adequado é usado para confirmar a presença e/ou expressão da sequência de ácidos nucleicos transduzida e/ou do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico na célula T. Os ensaios incluem, mas não estão limitados a, Southern e Northern blotting, RT-PCR e PCR, ELISA, Western blotting e citometria de fluxo.

[00201] Uma célula T que expressa um TAC aumentou a ativação de células T na presença de um antígeno em comparação com uma célula T que não expressa um TAC e/ou em comparação com uma célula T que expressa um CAR tradicional. O aumento da ativação das células T é verificado por vários métodos, incluindo, mas não se limitando a, aumento da morte da linha de células tumorais, aumento da produção de citocinas, aumento da citólise, aumento da desgranulação e/ou aumento da expressão de marcadores de ativação, tal como CD107α, IFNγ, IL2 ou TNFα. Em algumas modalidades, os aumentos são medidos em uma célula individual ou em uma população de células.

[00202] Os termos “aumentado” ou “aumentando”, como usados nesse documento, referem-se a pelo menos 1%, 2%, 5%, 10%, 25%, 50%, 100% ou 200% de aumento em uma célula T ou população de células T que expressam um TAC em comparação com uma célula T ou população de células T que não expressam um TAC e/ou em comparação com uma célula T ou população de células T que expressam um CAR tradicional. Composições Farmacêuticas

[00203] São reveladas nesse documento, em certas modalidades, composições farmacêuticas compreendendo uma célula T manipulada geneticamente revelada nesse documento (transduzida com e/ou expressando um TAC) e um carreador farmaceuticamente aceitável. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, tampões tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes; carboidratos, tais como, glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos, tal como glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tal como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); ou conservantes. Em algumas modalidades, as células T manipuladas geneticamente são formuladas para administração intravenosa.

[00204] As composições farmacêuticas são administradas de uma maneira apropriada para a doença a ser tratada (ou prevenida). A quantidade e a frequência de administração são determinadas por tais fatores como a condição do paciente, e o tipo e a gravidade da doença do paciente, embora as dosagens apropriadas sejam determinadas por estudos clínicos. Quando “uma quantidade imunologicamente eficaz”, “uma quantidade eficaz antitumoral”, “uma quantidade eficaz de inibição de tumor” ou “quantidade terapêutica” é indicada, a quantidade precisa das composições da presente invenção a ser administrada é determinada por um médico levando em consideração as diferenças individuais em idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástase e condição do paciente (indivíduo).

[00205] Em algumas modalidades, as células T modificadas e/ou composições farmacêuticas descritas nesse documento são administradas em uma dosagem de 101 a 1015 células por kg de peso corporal, 104 a 109 células por kg de peso corporal, opcionalmente 105 a 108 células por kg de peso corporal peso, 106 a 107 células por kg de peso corporal ou 105 a 106 células por kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro dessas faixas. Em algumas modalidades, as células T modificadas e/ou composições farmacêuticas descritas nesse documento são administradas em uma dosagem superior a 101 células por kg de peso corporal. Em algumas modalidades, as células T modificadas e/ou composições farmacêuticas descritas nesse documento são administradas em uma dosagem menor que 1015 células por kg de peso corporal.

[00206] Em algumas modalidades, as células T modificadas e/ou composições farmacêuticas descritas nesse documento são administradas a uma dosagem de 0,5 x 106 células, 2 x 106 células, 4 x 106 células, 5 x 106 células, 1,2 x 107 células, 2 x 107 células, 5 x 107 células, 2 x 108 células, 5 x 108 células, 2 x 109 células, 0,5-2000 x 106 células, 0,5-2 x 106 células, 0,5-2 x 107 células, 0,5-2 x 108 células ou 0,5-2 x 109 células, incluindo todos os valores inteiros dentro dessas faixas.

[00207] Em algumas modalidades, as composições de células T são administradas várias vezes nessas dosagens. Em algumas modalidades, a dosagem é administrada uma única vez ou várias vezes, por exemplo diariamente, semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente, a cada hora, ou é administrada na recorrência, recidiva ou progressão do câncer a ser tratado. As células, em algumas modalidades, são administradas usando técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (ver, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988).

[00208] A composição farmacêutica é substancialmente livre de, por exemplo, não há níveis detectáveis de um contaminante, por exemplo, selecionado do grupo que consiste em endotoxina, micoplasma, lentivírus competente para replicação (RCL), p24, ácido nucleico VSV-G, gag de HIV,

esferas revestidas de anti-CD3/anti-CD28 residuais, anticorpos de camundongo, soro humano agrupado, albumina de soro bovino, soro bovino, componentes de meio de cultura, célula de empacotamento de vetor ou componentes de plasmídeo, uma bactéria, um fungo, micoplasma, IL-2 e IL-7.

[00209] Em algumas modalidades, as células T manipuladas geneticamente reveladas nesse documento são administradas a um indivíduo e o sangue é subsequentemente retirado (ou aferese realizada), as células T daí são ativadas e reinfundidas no paciente com células T manipuladas geneticamente. Esse processo, em algumas modalidades, é realizado várias vezes a cada poucas semanas. As células T são ativadas a partir de retiradas de sangue de 10 cm3 a 400 cm3. As células T são ativadas a partir de amostras de sangue de 20 cm3, 30 cm3, 40 cm3, 50 cm3, 60 cm3, 70 cm3, 80 cm3, 90 cm3 ou 100 cm3.

[00210] As células T modificadas/manipuladas geneticamente e/ou composições farmacêuticas são administradas por métodos incluindo, mas não se limitando a, inalação de aerossol, injeção, infusão, ingestão, transfusão, implantação ou transplante. As células T modificadas e/ou composições farmacêuticas são administradas a um indivíduo por via transarterial, subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa (i.v.), por infusão intravenosa (i.v.) ou intraperitoneal. As células T modificadas/manipuladas geneticamente e/ou composições farmacêuticas das mesmas são administradas a um paciente por injeção intradérmica ou subcutânea. As células T modificadas/manipuladas geneticamente e/ou composições farmacêuticas das mesmas são administradas por injeção i.v. As células T modificadas/manipuladas geneticamente e/ou composições farmacêuticas das mesmas são injetadas diretamente em um tumor, nódulo linfático ou sítio de infecção.

[00211] As células T modificadas/manipuladas geneticamente, células T e/ou composições farmacêuticas são administradas em um volume de cerca de 5 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 35 mL, 40 mL, 45 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 110 mL, 120 mL, 130 mL, 140 mL, 150 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL ou 500 mL.

[00212] As células T modificadas/manipuladas geneticamente, células T e/ou composições farmacêuticas são administradas em um volume maior que no máximo cerca de 5 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 35 mL, 40 mL, 45 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 110 mL, 120 mL, 130 mL, 140 mL, 150 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL ou 500 mL.

[00213] As células T modificadas/manipuladas geneticamente, células T e/ou composições farmacêuticas são administradas em um volume de pelo menos cerca de 5 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 35 mL, 40 mL, 45 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 110 mL, 120 mL, 130 mL, 140 mL, 150 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL ou 500 mL.

[00214] Uma composição farmacêutica é preparada por métodos conhecidos per se para a preparação de composições farmaceuticamente aceitáveis que são administradas a indivíduos, de modo que uma quantidade eficaz de células T seja combinada em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável. Veículos adequados são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical

Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, 20ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 2000). Nessa base, as composições incluem, embora não exclusivamente, soluções das substâncias em associação com um ou mais de carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, e contidos em soluções tamponadas com um pH adequado e iso-osmótico com os fluidos fisiológicos.

[00215] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem composições essencialmente inertes quimicamente e não tóxicas que não interferem com a eficácia da atividade biológica da composição farmacêutica. Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados incluem, mas não estão limitados a, água, soluções salinas, soluções de glicerol, cloreto de N-(1(2,3-dioleiloxi)propil)N,N,N- trimetilamônio (DOTMA), diolesilfosfotidil-etanolamina (DOPE) e lipossomas. Em algumas modalidades, essas composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, juntamente com uma quantidade adequada de carreador, de modo a fornecer a forma para administração direta ao paciente.

[00216] As composições farmacêuticas incluem, sem limitação, pós liofilizados ou soluções ou suspensões injetáveis estéreis aquosas ou não aquosas, que podem conter ainda antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam as composições substancialmente compatíveis com os tecidos ou o sangue de um pretendido destinatário. Outros componentes que podem estar presentes em tais composições incluem água, tensoativos (como Tween), álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais, por exemplo. As soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos, comprimidos ou soluções ou suspensões concentradas.

[00217] Uma composição farmacêutica revelada nesse documento é formulada em uma variedade de formas e administrada por uma série de meios diferentes. Uma formulação farmacêutica é administrada por via oral, retal ou parenteral, em formulações contendo carreadores, adjuvantes e veículos convencionalmente aceitáveis, como desejado. O termo “parenteral”, como usado nesse documento, inclui técnicas de injeção e infusão subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intraesternal. A administração inclui injeção ou infusão, incluindo administração intra- arterial, intracardíaca, intracerebroventricular, intradérmica, intraduodenal, intramedular, intramuscular, intraóssea, intraperitoneal, intratecal, intravascular, intravenosa, intravítrea, epidural e subcutânea, inalatória, transdérmica, transmucosal, sublingual, bucal e tópica (incluindo epicutânea, dérmica, por enema, por colírio, por colírio auditivo, intranasal, vaginal). Em algumas modalidades exemplificativas, uma via de administração é por meio de uma injeção, tal como uma injeção intramuscular, intravenosa, subcutânea ou intraperitoneal.

[00218] As formulações líquidas incluem uma formulação oral, uma formulação intravenosa, uma formulação intranasal, uma formulação ocular, uma formulação ótica, um aerossol e semelhantes. Em certas modalidades, uma combinação de várias formulações é administrada. Em certas modalidades, uma composição é formulada para um perfil de liberação prolongada. Métodos de tratamento e uso

[00219] São revelados nesse documento, em certas modalidades, métodos de uso de Tri-TACs revelados nesse documento no tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade dos mesmos. Em algumas modalidades, um ligante específico para o alvo dos TACs revelados nesse documento se liga a um antígeno tumoral ou antígeno associado a tumor em uma célula tumoral. Em algumas modalidades, um ligante específico para o alvo dos TACs revelados nesse documento se liga seletivamente a um antígeno tumoral ou antígeno associado a tumor em uma célula tumoral. Em algumas modalidades, um ligante específico para o alvo dos TACs revelados nesse documento se liga especificamente a um antígeno tumoral ou antígeno associado a tumor em uma célula tumoral. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é um antígeno tumoral. Exemplos de antígenos tumorais incluem, mas não estão limitados a, CD19, HER-2 (erbB-2), antígeno de maturação de células B (BCMA), alfafetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionário (CEA), CA-125, MUC-1, antígeno de tumor epitelial (ETA), tirosinase, antígeno associado a melanoma (MAGE), antígeno específico da próstata (PSA), antígeno associado a glioma, gonadotrofina coriônica humana β, tireoglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptase reversa da telomerase humana, RU1, RU2 (AS), carboxil esterase intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prosteína, PSMA, survivina e telomerase, antígeno tumoral de carcinoma da próstata-1 (PCTA-1), ELF2M, elastase de neutrófilos, CD22, fator de crescimento da insulina (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I e mesotelina.

[00220] São revelados nesse documento, em certas modalidades, métodos de tratamento de um câncer que expressa um antígeno alvo em um indivíduo em necessidade dos mesmos, compreendendo a administração às células T manipuladas geneticamente individuais reveladas nesse documento. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é CD19. Em algumas modalidades, o método de tratamento de um câncer que expressa CD19 em um indivíduo em necessidade do mesmo compreende a administração às células T manipuladas geneticamente individuais compreendendo um TAC compreendendo um ligante direcionado a CD19. Em algumas modalidades, exemplos de cânceres que são tratados por um TAC compreendendo um ligante direcionado a CD19 incluem, mas não estão limitados a, doenças malignas de células B. Em algumas modalidades, exemplos de cânceres que são tratados por um TAC compreendendo um ligante direcionado a CD19 incluem, mas não estão limitados a, linfomas de células B, leucemia linfoblástica aguda (LLA) e leucemia linfocítica crônica (LLC). Em algumas modalidades, exemplos de cânceres que são tratados por um TAC compreendendo um ligante direcionado a CD19 incluem, mas não estão limitados a, linfoma não-Hodgkin (NHL).

[00221] Em algumas modalidades, o antígeno alvo é HER-2. Em algumas modalidades, o método de tratamento de um câncer em que uma célula cancerígena expressa HER-2 em um indivíduo em necessidade do mesmo compreende a administração às células T manipuladas geneticamente individuais compreendendo um TAC compreendendo um ligante direcionado a HER-2. Em algumas modalidades, exemplos de cânceres que são tratados por um TAC compreendendo um ligante direcionado a HER-2 incluem, mas não estão limitados a, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer de ovário e câncer de estômago.

[00222] Em algumas modalidades, o antígeno alvo é BCMA. Em algumas modalidades, o método de tratamento de um câncer em que uma célula cancerígena expressa BCMA em um indivíduo em necessidade do mesmo compreende a administração às células T manipuladas geneticamente individuais compreendendo um TAC compreendendo um ligante direcionado a BCMA. Em algumas modalidades, exemplos de cânceres que são tratados por um TAC compreendendo um ligante direcionado a BCMA incluem, mas não estão limitados a(à), leucemia, linfomas e mieloma múltiplo.

[00223] É ainda revelado nesse documento o uso de uma célula T manipuladas geneticamente revelada nesse documento na preparação de um medicamento para tratar o câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo. Também é revelado nesse documento o uso de uma mistura de células T compreendendo células modificadas e não modificadas, ou compreendendo diferentes populações de células modificadas com ou sem células não modificadas. Um habilitado na técnica entenderia que uma quantidade terapêutica de células T modificadas não precisa ser de natureza homogênea.

[00224] Em algumas modalidades, as células T manipuladas geneticamente reveladas nesse documento são parte de uma terapia de combinação. Em algumas modalidades, a eficácia de uma revelação de terapia nesse documento é avaliada várias vezes. Em algumas modalidades, os pacientes são estratificados com base em uma resposta a um tratamento revelado nesse documento. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento determina a entrada em um estudo.

[00225] Em algumas modalidades, os cânceres que são células T manipuladas geneticamente tratadas compreendendo qualquer um dos TAC revelados nesse documento incluem qualquer forma de doença neoplásica.

Em algumas modalidades, exemplos de cânceres que são tratados incluem, mas não estão limitados a, câncer de mama, câncer de pulmão e leucemia, por exemplo, leucemia de linhagem mista (LLM), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia linfoblástica aguda (LLA). Em algumas modalidades, exemplos de cânceres que são tratados incluem, mas não estão limitados à, linfoma de grandes células B, linfoma difuso de grandes células B, linfoma primário do mediastino de células B, linfoma de células B de alto grau ou linfoma de grandes células B decorrentes de linfoma folicular.

Outros cânceres incluem carcinomas, blastomas, melanomas, sarcomas, cânceres hematológicos, doenças malignas linfoides, tumores benignos e malignos e doenças malignas.

Em algumas modalidades, o câncer compreende tumores não sólidos ou tumores sólidos.

Em algumas modalidades, os cânceres que são tratados incluem tumores que não são vascularizados, ou ainda não substancialmente vascularizados, bem como tumores vascularizados.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer sólido ou compreende um tumor sólido.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer líquido ou compreende um tumor líquido.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de cólon, mieloma múltiplo, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer urotelial, câncer endometrial ou um melanoma.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de pulmão.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de mama.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de cólon.

Em algumas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo.

Em algumas modalidades, o câncer é um glioblastoma.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer gástrico.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de ovário.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de estômago.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer colorretal.

Em algumas modalidades, o câncer é câncer urotelial.

Em algumas modalidades, o câncer é um câncer endometrial.

Em algumas modalidades, o câncer é um melanoma.

Tabela 1. Tabela de Sequências SEQ ID NO Descrição Nucleotídeo/Aminoácido SEQ ID NO: 1 Configuração de Tri TAC 1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 2 Configuração de Tri TAC 1 Aminoácido SEQ ID NO: 3 Configuração de Tri TAC 2 Nucleotídeo SEQ ID NO: 4 Configuração de Tri TAC 2 Aminoácido SEQ ID NO: 5 muIgG líder (sinal de secreção) Nucleotídeo SEQ ID NO: 6 muIgG líder (sinal de secreção) Aminoácido SEQ ID NO: 7 DARPin específico para antígeno Her2 Nucleotídeo SEQ ID NO: 8 DARPin específico para antígeno Her2 Aminoácido SEQ ID NO: 9 Etiqueta Myc Nucleotídeo SEQ ID NO: 10 Etiqueta Myc Aminoácido SEQ ID NO: 11 Ligante 1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 12 Ligante 1 Aminoácido SEQ ID NO: 13 UCHT11 Nucleotídeo SEQ ID NO: 14 UCHT12 Aminoácido SEQ ID NO: 15 Ligante 2 Nucleotídeo SEQ ID NO: 16 Ligante 2 Aminoácido SEQ ID NO: 17 Domínio de CD43 Nucleotídeo SEQ ID NO: 18 Domínio de CD44 Aminoácido SEQ ID NO: 19 Ligante com base em CD4 Nucleotídeo SEQ ID NO: 20 Ligante com base em CD4 Aminoácido SEQ ID NO: 21 OKT3 Nucleotídeo SEQ ID NO: 22 OKT3 Aminoácido SEQ ID NO: 23 F6A Nucleotídeo SEQ ID NO: 24 F6A Aminoácido SEQ ID NO: 25 L2K Nucleotídeo SEQ ID NO: 26 L2K Aminoácido SEQ ID NO: 27 Conector de Hélice Curta Nucleotídeo SEQ ID NO: 28 Conector de Hélice Curta Aminoácido SEQ ID NO: 29 Conector de Hélice Longa Nucleotídeo SEQ ID NO: 30 Conector de Hélice Longa Aminoácido

SEQ ID NO: 31 Conector de Domínio Grande Nucleotídeo SEQ ID NO: 32 Conector de Domínio Grande Aminoácido SEQ ID NO: 33 ScFv específico para antígeno BCMA Nucleotídeo SEQ ID NO: 34 ScFv específico para antígeno BCMA Aminoácido SEQ ID NO: 35 ScFv específico para antígeno CD19 Nucleotídeo SEQ ID NO: 36 ScFv específico para antígeno CD19 Aminoácido SEQ ID NO: 37 Domínio de CD8α Nucleotídeo SEQ ID NO: 38 Domínio de CD8α Aminoácido SEQ ID NO: 39 Domínio de CD8α+R(β) Nucleotídeo SEQ ID NO: 40 Domínio de CD8α+R(β) Aminoácido SEQ ID NO: 41 Domínio de CD8α+Lck Nucleotídeo SEQ ID NO: 42 Domínio de CD8α+Lck Aminoácido SEQ ID NO: 43 huUCHT1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 44 huUCHT1 Aminoácido SEQ ID NO: 45 huUCHT1 (Y177T) Nucleotídeo SEQ ID NO: 46 huUCHT1 (Y177T) Aminoácido SEQ ID NO: 47 huIgG Nucleotídeo SEQ ID NO: 48 huIgG Aminoácido SEQ ID NO: 49 huCD8a Nucleotídeo SEQ ID NO: 50 huCD8a Aminoácido SEQ ID NO: 51 3625 scFv de BCMA Vh-Vl Nucleotídeo SEQ ID NO: 52 3625 scFv de BCMA Vh-Vl Aminoácido SEQ ID NO: 53 3625 scFv de BCMA Vl-Vh Nucleotídeo SEQ ID NO: 54 3625 scFv de BCMA Vl-Vh Aminoácido SEQ ID NO: 55 3625 TAC Hélice Vh-Vl de huUCHT1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 56 3625 TAC Hélice Vh-Vl de huUCHT1 Aminoácido SEQ ID NO: 57 3625 TAC Hélice Vl-Vh de huUCHT1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 58 3625 TAC Hélice Vl-Vh de huUCHT1 Aminoácido SEQ ID NO: 59 3625 TAC G4S Vh-Vl de huUCHT1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 60 3625 TAC G4S Vh-Vl de huUCHT1 Aminoácido SEQ ID NO: 61 3625 TAC G4S VL-VH de huUCHT1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 62 3625 TAC G4S VL-VH de huUCHT1 Aminoácido SEQ ID NO: 63 CD19-TAC Nucleotídeo SEQ ID NO: 64 CD19-TAC Aminoácido SEQ ID NO: 65 HER2 TAC de huIgG huUCHT1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 66 HER2 TAC de huIgG huUCHT1 Aminoácido SEQ ID NO: 67 HER2 TAC de CD8a huUCHT1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 68 HER2 TAC de CD8a huUCHT1 Aminoácido SEQ ID NO: 69 Conector Flexível Aminoácido SEQ ID NO: 70 Conector Flexível Nucleotídeo SEQ ID NO: 71 UCHT1 (Y182T) Nucleotídeo SEQ ID NO: 72 UCHT1 (Y182T) Aminoácido SEQ ID NO: 73 Ligante flexível G4S Aminoácido

SEQ ID NO: 74 Ligante G4S3 Aminoácido SEQ ID NO: 75 HER2 TAC de muIgG huUCHT1 Nucleotídeo SEQ ID NO: 76 HER2 TAC de muIgG huUCHT1 Aminoácido SEQ ID NO: 77 Ligante G4S3 Nucleotídeo 1 Cadeia leve, nucleotídeos 1-324; Ligante, nucleotídeos 325- 387; Cadeia pesada, nucleotídeos 388-750; 2 Cadeia leve, aminoácidos 1-108; Ligante, aminoácidos 109- 128; Cadeia pesada, aminoácidos 129-250; 3 Ligante extracelular, nucleotídeos 1-66; Domínio transmembranar, nucleotídeos 67-132; Domínio citosólico, nucleotídeos 133-254; 4 Ligante extracelular, aminoácidos 1-22; Domínio transmembranar, aminoácidos 23-44; Domínio citosólico, aminoácidos 45-84.

EXEMPLOS

[00226] Os seguintes exemplos são dados com a finalidade de ilustrar várias modalidades da invenção e não se destinam a limitar a presente invenção de qualquer forma. Os presentes exemplos, juntamente com os métodos descritos nesse documento, são atualmente representativos de modalidades preferidas, são exemplificativos e não se destinam a ser limitações ao escopo da invenção. As alterações nos mesmos e outros usos que estão abrangidos pelo espírito da invenção, como definido pelo escopo das reivindicações, ocorrerão aos habilitados na técnica. Exemplo 1. Caracterização da tecnologia de Tri-TAC

[00227] Uma visão geral da tecnologia Tri-TAC é fornecida nas Fig. 1A-Fig. 1C.

[00228] A Fig. 1A mostra um exemplo de ativação de células T CD8 com base na comontagem de diferentes receptores e seus parceiros proteicos associados. Inicialmente, o complexo principal de histocompatibilidade I apresenta um antígeno (hélice). Isso é reconhecido por um complexo de receptor de células T (TCR) capaz de se ligar ao antígeno. O complexo de TCR contém várias subunidades individuais. Os domínios α/β são capazes de interagir diretamente com o antígeno apresentado no MHC-I. Os domínios α/β, então, interagem com vários outros domínios (ε, γ, δ e ζ), todos os quais participam da ativação de células T por meio de vários domínios de ativação intracelular. O complexo de TCR interage com MHC-I simultaneamente com o correceptor CD8. O correceptor CD8 liga-se ao MHC-I de uma maneira independente do antígeno. O CD8 interage diretamente com a Lck, uma proteína quinase importante para ativar o complexo de receptor TCR. A interação de CD8 e Lck também garante sua associação com microdomínios de jangadas lipídicas (porção de membrana), que são hipotetizados para organizar e encapsular outras porções de sinalização relevantes (esferas escuras). Estágios posteriores de ativação levam ao recrutamento de CD28. Se essa cascata de interação ocorrer várias vezes em paralelo, as células T tornam-se ativadas e podem exercer seus efeitos citotóxicos.

[00229] A Fig. 1B fornece uma visão geral dos receptores de antígenos quiméricos (CAR). CARs buscam reproduzir o mecanismo complexo de ativação de células T combinando vários domínios de ativação principais, tais como CD3ζ e CD28 em uma única molécula manipulada geneticamente sinteticamente. O CAR então interage diretamente com um antígeno de escolha usando domínios de ligação específicos. É representada nesse documento uma proteína de repetição de anquirina (DARPin). Acredita-se que várias dessas interações ocorrendo em paralelo levam à ativação de células T.

[00230] A Fig. 1C é uma visão geral da tecnologia de Tri- TAC que simula o processo de ativação natural. O Tri-TAC foi desenvolvido para recapitular melhor a sinalização natural por meio do TCR, ao mesmo tempo que mantém o direcionamento irrestrito do MHC. A ativação de células T ocorre após a ligação de MHC pelo TCR e correceptor de células T (CD4 ou CD8), que se ligam simultaneamente a regiões conservadas dentro da molécula de MHC. Os correceptores estão localizados especificamente em “jangadas lipídicas”, microdomínios de membrana que são particularmente importantes para a formação do complexo de sinal de TCR. Além de garantir a localização correta no microdomínio do complexo de ativação de TCR, esses correceptores também se ligam diretamente a Lck, uma proteína quinase que é crucial para a ativação de células T. Nenhum dos receptores quiméricos tradicionais ou proteínas bifuncionais envolvem as moléculas de correceptor ou Lck. Uma molécula foi criada onde as regiões transmembranar e intracelular do correceptor CD4, que se localizam na jangada lipídica e se ligam a Lck, respectivamente, foram fundidas ao anticorpo de cadeia única que se liga a CD3 (UCHT1; SEQ ID NO: 13, 14 e homólogos do mesmo). Essa construção é projetada para atrair a molécula de CD3 e o TCR para regiões de jangadas lipídicas e trazer Lck para a proximidade do TCR, similar à ligação natural ao MHC. Para direcionar esse receptor, uma repetição de anquirina projetada (DARPin) foi ligada à quimera CD4-UCHT1 para gerar um acoplador de célula T trifuncional-antígeno (Tri-TAC). Nesse exemplo, o DARPin era específico para o proto-oncogene, HER-2 (erbB-2).

[00231] Múltiplas configurações de Tri-TAC são possíveis

(Fig. 2A e Fig. 2B). Na configuração 1 (Fig. 2A), o domínio de ligação a antígeno é localizado no terminal N, conectado ao domínio de ligação do ligante CD3 e, em seguida, ao domínio do correceptor. Na configuração 2 (Fig. 2B), o domínio de ligação do ligante CD3 é localizado no terminal N, conectado ao domínio de ligação a antígeno que, por sua vez, se conecta ao domínio do correceptor.

[00232] Múltiplas classes de domínios de ligação do ligante podem ser incorporadas na molécula de Tri-TAC (Fig. 3A-Fig. 3D). Os exemplos nesse documento ilustram um esquema geral de uma configuração 1 de Tri-TAC (Fig. 3A), um Tri TAC com um DARPin específico para HER-2 (Fig. 3B), um Tri TAC com um scFv específico para CD19 (Fig. 3C), e um Tri TAC com um scFv específico para BCMA (Fig. 3D).

[00233] As Fig. 4A-Fig.4D ilustram a funcionalidade de um Tri-TAC com o DARPin específico para HER-2. As células T humanas foram manipuladas geneticamente para expressar o Tri-TAC como revelado nesse documento ou um CAR convencional com o mesmo DARPin. Foi determinado que, em todos os aspectos, as células T manipuladas geneticamente com o Tri- TAC demonstraram funcionalidade pelo menos equivalente a um CAR convencional. Interessantemente, em relação a 2 parâmetros (produção de TNF-α e mobilização de CD107a), foi observado que o Tri-TAC foi mais ativo do que um CAR convencional em algumas circunstâncias.

[00234] A Fig. 4A mostra a expressão de superfície de DARPin Tri TAC anti-HER-2 em comparação com DARPin CAR Anti HER-2 e células T de controle. Os receptores quiméricos foram detectados por incubação com HER-2 recombinante. O DARPin Tri-TAC anti-HER-2 foi bem expressado na superfície das células T manipuladas geneticamente. A Fig. 4B mostra o crescimento das culturas de células T manipuladas geneticamente. As células T foram ativadas com Dynabeads anti-CD3/anti-CD28 e manipuladas geneticamente com lentivírus que codificam o Tri-TAC, CAR ou nenhum receptor (controle). Após 2 semanas, o CAR e as culturas de controle cresceram para números similares, enquanto as culturas Tri- TAC cresceram um pouco mais lentamente. As Fig. 4C e Fig. 4D mostram os atributos funcionais das células T manipuladas geneticamente. As células T manipuladas geneticamente para expressar o Tri-TAC ou o CAR com o DARPin HER-2 foram estimuladas com antígeno ligado à placa. As células T manipuladas geneticamente para expressar Tri-TAC e CAR poderiam elaborar todas as funções medidas (produção de TNF- α, produção de IFN-γ e mobilização de CD107a, as Fig. 3C e Fig. 3D). As células T manipuladas geneticamente com o Tri- TAC exibiram frequências elevadas de células positivas para CD107a após estimulação em relação às células T manipuladas geneticamente com um CAR (Fig. 3D), sugerindo citotoxicidade intensificada em uma base por célula.

[00235] As Fig. 6A-Fig.6J fornecem dados que confirmam a importância do domínio de ligação do ligante e do domínio de ligação do CD3 UCHT1 para a funcionalidade de Tri-TAC. As células T foram manipuladas geneticamente com o Tri-TAC de comprimento total contendo o DARPin HER-2 (Fig. 6G, Fig. 6H, Fig. 6I, linha inferior), uma variante de Tri-TAC que carece de DARPin (Fig. 6A, Fig. 6B, Fig. 6C, linha superior), ou uma variante de Tri-TAC que carece de UCHT1 (Fig. 6D, Fig. 6E, Fig. 6F, linha do meio). Todas as três populações de células T manipuladas geneticamente foram estimuladas com células tumorais HER-2-positivas. As células T manipuladas geneticamente com o Tri-TAC de comprimento total poderiam produzir IFN-g, TNF- e IL-2 após a estimulação, enquanto as variantes não conseguiram produzir qualquer citocina após a estimulação. As três populações de células T também foram cocultivadas com células D2F2/E2 (que expressam HER-2) ou células D2F2 (HER-2-negativas) em um efetor:alvo de 4:1 (Fig. 6J). As células T manipuladas geneticamente com Tri-TAC de comprimento total demonstraram morte robusta contra células D2F2/E2, mas não mataram as células D2F2. As outras variantes de Tri-TAC que carecem de DARPin ou UCHT1 não exibiram morte.

[00236] As Fig. 7A-Fig. 7C mostram os resultados de camundongos tratados com controle de vetor (NGFR), DARPin CAR anti-HER-2 ou DARPin Tri-TAC anti-HER-2. Um modelo de camundongo com xenoenxerto foi usado. Células tumorais OVCAR-3 foram administradas a camundongos por via subcutânea e deixadas crescer até que os tumores atingissem um tamanho de 100 - 200 mm3. A Fig. 7A mostra a progressão relativa do tumor normalizada para o tamanho do tumor no dia do tratamento. As células T manipuladas geneticamente com DARPin Tri-TAC anti-HER-2 causaram uma diminuição rápida no volume do tumor, o controle não teve efeito e as células de CAR retardaram o crescimento do tumor e mostraram uma redução retardada no tamanho do tumor. A Fig. 7B ilustra mudanças relativas no peso corporal após a infusão de células T. As células de controle e de DARPin Tri-TAC anti-HER-2 manipuladas geneticamente não mostram alterações significativas no peso corporal do camundongo após o tratamento. Em contraste, os camundongos tratados com DARPin CAR anti-HER-2 apresentam perda significativa de peso corporal, indicativa de toxicidade grave. A Fig. 7C ilustra as concentrações de citocinas no soro de camundongos no dia 7 após a infusão de células T. Os níveis de citocina foram maiores em camundongos tratados com CAR em comparação com camundongos tratados com Tri-TAC. Exemplo 2. Substituições de UCHT1 influenciam a função de Tri-TAC

[00237] As Fig. 8A-Fig. 8H ilustram a funcionalidade de Tri-TACs com domínios de ligação de CD3 alternativos. Os domínios estão listados nas Fig. 8A e Fig. 8E. Tri-TACs contendo UCHT1 (Fig. 8B), OKT3 (Fig. 8B) e huUCHT1 (Fig. 8F) exibiram expressão de superfície elevada, enquanto os Tri- TACs contendo F6A (Fig. 8F) e L2K (Fig. 8F) revelaram expressão superficial inferior. As células que expressam o Tri-TAC contendo OKT3 exibiram baixa produção de citocinas (Fig. 8C, Fig. 8C1) e citotoxicidade intermediária (Fig. 8D) após a ligação de Tri-TAC. As células que expressam o Tri- TAC contendo F6A exibiram forte produção de citocinas (Fig. 8G, Fig. 8G1) e citotoxicidade (Fig. 8H) após a ligação de Tri-TAC. As células que expressam o Tri-TAC contendo L2K exibiram baixa produção de citocinas (Fig. 8G, Fig. 8G1) e citotoxicidade intermediária (Fig. 8H).

[00238] As Fig. 9A-Fig. 9H ilustram a expressão de superfície de TCR em células T manipuladas com diferentes variantes de Tri-TAC mostradas nas Fig. 8A e Fig. 8E. As células T manipuladas geneticamente com as variantes de Tri- TAC compreendendo OKT3 (Fig. 9A, Fig. 9E e Fig. 9B, Fig. 9F) ou L2K (Fig. 9C, Fig. 9G e Fig 9D, Fig. 9H) exibiram expressão de superfície de TCR inferior em relação às células T manipuladas geneticamente com Tri-TACs compreendendo UCHT1 ou huUCHT1, respectivamente. Em contraste, as células T manipuladas geneticamente com a variante de Tri TAC compreendendo F6A não revelaram regulação negativa de TCR em relação ao Tri TAC carregando huUCHT1 (Fig. 9C, Fig. 9G e Fig. 9D, Fig. 9H). A substituição de F6A reduziu a expressão da superfície do receptor de Tri-TAC, mantendo a produção moderada de citocinas e citotoxicidade. A substituição L2K reduziu moderadamente a expressão de superfície e reduziu a produção de citocinas, mas manteve a citotoxicidade intermediária. A substituição OKT3 resultou em expressão de superfície por Tri-TAC elevada, baixa produção de citocinas e citotoxicidade intermediária. Esses dados indicam que a expressão de superfície por Tri-TAC e as funções efetoras de células T não são inerentemente proporcionais e que as substituições de domínio de Tri-TAC, em alguns casos, alteram as funções efetoras independentemente dos níveis de expressão de superfície. É concebível que uma variante do TAC com citotoxicidade reduzida e baixa expressão de superfície possa ter valor em certas aplicações clínicas.

[00239] Em muitos casos, as substituições de scFv atenuaram a capacidade da célula T manipulada geneticamente de elaborar IFN-γ, TNF-α e IL-2, mas as células T manipuladas geneticamente retiveram a capacidade de matar células alvo. A produção excessiva de citocinas tem sido associada a eventos adversos em ambientes clínicos, limitando as tecnologias de CAR atuais para doenças potencialmente fatais. A capacidade de modificar as moléculas de TAC para reduzir sua produção de citocinas, mantendo a citotoxicidade moderada, permitirá a geração de receptores de Tri TAC com o nível exato de reatividade necessário para satisfazer a eficácia clínica e segurança.

[00240] A capacidade da variante de Tri-TAC compreendendo OKT3 para suprimir a expressão de superfície de TCR e a produção de citocinas, enquanto retém a citotoxicidade, pode ser de grande valor em situações alogênicas em que a supressão de TCR pode suprimir a doença do enxerto contra o hospedeiro.

[00241] Esses dados demonstram que as substituições de scFv de UCHT1 influenciam a função de Tri-TACs. Outras modificações resultarão em Tri-TACs úteis em várias aplicações (por exemplo, oncologia, autoimunidade, alergia). Exemplo 3. Introduzindo vários ligantes conectando o ligante que se liga a um complexo de TCR ao domínio do ligante de ligação ao alvo

[00242] As Fig. 10A-Fig. 10B ilustram várias variantes de TAC com diferentes ligantes conectando o ligante que se liga a um complexo de TCR e o domínio de ligante de ligação ao alvo. O conector flexível permite a movimentação entre os dois domínios. O conector de domínio grande contém dois domínios dobrados e é muito grande e rígido. Os conectores de hélice pequena e longa também introduzem rigidez, mas são menos restritivos quando comparados ao ligante de domínio grande.

[00243] As Fig. 11A-Fig.11E ilustram o impacto da substituição do conector na expressão de superfície por Tri- TAC, eficiência de transdução de Tri-TAC e produção de citocinas após a ligação de Tri-TAC. As Fig. 11A e Fig. 11B mostram que os ligantes helicoidais intensificam a expressão de superfície e a eficiência de transdução quando comparados ao ligante flexível, enquanto o conector de domínio grande intensifica a eficiência de transdução, mas não a expressão de superfície. As Fig. 11D, Fig. 11E ilustram a produção de citocinas por células que expressam Tri-TACs com hélice curta, hélice longa ou conectores de domínio grande.

[00244] A Fig. 12A ilustra citotoxicidade in vitro intensificada de células T que expressam Tri-TACs com o conector de hélice curta. A Fig. 12B ilustra o controle de tumor in vivo intensificado de células T que expressam Tri- TACs com o conector de hélice curta. O conector helicoidal curto foi associado com alta citotoxicidade in vitro e controle eficaz do tumor in vivo. Exemplo 4. Introduzindo um domínio citosólico de CD8α/β

[00245] A Fig. 13A ilustra a expressão de superfície por Tri-TAC de CD8α pareado com um scFv anti-HER-2 ou Fig. 13C DARPin anti-HER-2. A Fig. 13B ilustra a produção de citocinas por células T que expressam Tri-TAC de CD8α pareado com um scFv anti-HER-2 ou DARPin anti-HER-2.

[00246] A Fig. 14A ilustra um monômero de Tri-TAC de CD4 e um heterodímero de CD8α/β. Os correceptores de TCR, CD4 e CD8, carregam domínios funcionais que são importantes para a funcionalidade do correceptor. Essas regiões incluem a região rica em arginina que é considerada importante para a associação da jangada lipídica e o motivo CXCP necessário para a ligação de Lck. Ao contrário do CD4, que é um monômero, o correceptor CD8 é um heterodímero composto por uma subunidade α e uma subunidade β (Fig. 14A). Ambas as subunidades de CD8 α e β contêm regiões ricas em arginina, mas apenas a subunidade α contém o motivo CXCP.

[00247] As Fig. 14B-Fig. 14D fornecem esquemas de variantes de Tri-TAC que incorporam elementos do correceptor

CD8 mostrado na Fig. 14A. A cisteína responsável pela dimerização de CD8α e CD8β foi substituída por uma alanina em todas as variantes de Tri-TAC de CD8. A Fig. 14B é um esquema de um Tri-TAC de CD8α compreendendo uma mutação de Cisteína para Serina para assegurar uma distribuição de receptor monomérico e um domínio citosólico de CD8α. A Fig. 14C é um esquema de um Tri-TAC de CD8α+Rβ compreendendo uma mutação de Cisteína para Serina para garantir uma distribuição de receptor monomérico e um domínio citosólico de CD8α quimérico onde a região rica em arginina de CD8α é substituída pela região rica em arginina de CD8β. A Fig. 14D é um esquema de um Tri-TAC de CD8β+Lck compreendendo uma mutação de Cisteína para Serina para garantir uma distribuição de receptor monomérico e um domínio citosólico de CD8β quimérico, onde o domínio de CD8α CXCP, que contém um motivo de ligação Lck, foi adicionado ao terminal C do domínio citosólico de CD8β.

[00248] As Fig. 15A-Fig. 15D ilustram vários atributos fenotípicos e funcionais das variantes de Tri-TAC baseadas em CD8 em relação ao Tri-TAC prototípico. As Fig. 15A-Fig. 15B ilustram a expressão de superfície de variantes de CD8 Tri TAC em relação ao Tri-TAC prototípico. A expressão de superfície foi comparável entre os diferentes Tri-TACs. A Fig. 15C ilustra a citotoxicidade in vitro de variantes de CD8 Tri TAC cocultivadas com LOX IMVI (HER-2 negativo) e A549, SKOV3, SKBR3 ou MBA MB 231 (todas são HER-2 positivas). Todas as células T manipuladas geneticamente com Tri-TACs exibiram citotoxicidade. A Fig. 15D ilustra a divisão celular de células T manipuladas geneticamente com as variantes de Tri-TAC de CD8 ou o Tri-TAC prototípico (Fig. 15D). A Fig.

15E ilustra a expressão de superfície de TCR de células T manipuladas geneticamente compreendendo variantes de Tri-TAC de CD8 ou o Tri-TAC prototípico. Todas as variantes de Tri- TAC tiveram um efeito similar na expressão de TCR. Enquanto o correceptor CD4 demonstrou boa expressão de superfície e funcionalidade com o scFv e DARPin anti HER-2, a construção de CD8α mostrou atividade apenas no contexto do domínio de ligação a antígeno de DARPin. Ao testar diferentes domínios citosólicos de CD8α, todas as configurações continham os atributos de sequência principal relatados associados à funcionalidade de correceptor (região rica em arginina e CXCP). Todos os construtos CD8α/β mostraram desempenho similar quando comparados ao protótipo CD4. Isso enfatiza que a retenção de propriedades bioquímicas específicas, tais como a afinidade de jangada lipídica e a ligação de Lck, é mais importante para determinar o desempenho do Tri TAC do que uma sequência de polipeptídeos citosólica específica.

[00249] O crescimento de células T manipuladas geneticamente com Tri-TACs de CD8α+R(β) e CD8β+Lck foi significativamente prejudicado em relação ao crescimento de células T manipuladas geneticamente com as outras variações. Apesar de um impacto significativo no crescimento, todos esses Tri-TACs exibiram uma capacidade comparável de ativar células T. O crescimento reduzido de Tri-TACs de CD8α+R(β) e CD8β+Lck pode ser vantajoso para certas aplicações onde a expansão máxima de células T não é desejável. Exemplo 5. Desenvolvimento de uma construção de CD19-TAC

[00250] A Fig. 16 ilustra o desenvolvimento passo a passo de uma construção de CD19-TAC. Várias gerações de vetores lentivirais são criadas com várias alterações nos elementos de configuração para garantir a especificidade de CD19, expressão de TAC adequada e produção de lentivírus de grau GMP. Cada caixa representa um vetor lentiviral e especifica os 3 principais elementos de configuração: (A) o domínio de ligação a antígeno, (B) o domínio de ligação de TCR/CD3 e (C) o domínio do correceptor. As áreas sombreadas indicam domínios que foram submetidos a modificações durante o processo de desenvolvimento do vetor.

[00251] O TAC na primeira etapa compreende uma proteína de repetição de anquirina projetada específica para HER-2 (DARPin), um scFv específico para CD3 UCHT1 de murino e um polipeptídeo de CD4 transmembranar e citosólico flexível. O TAC é clonado em um vetor lentiviral pCCL4.

[00252] Para gerar um Tri-TAC específico para CD19, o DARPin específico para HER-2 foi substituído por um polipeptídeo compreendendo um peptídeo líder de CD8a N- terminal fundido a um scFv anti-CD19. As cadeias pesadas e leves do scFv de CD19 foram conectadas através da região ligante de glicina-serina.

[00253] O domínio UCHT1 foi substituído por uma versão humanizada (huUCHT1) para reduzir a imunogenicidade. Essa construção de TAC exibiu níveis de expressão de superfície superiores do que seu precursor.

[00254] Para melhorar adicionalmente mais a expressão do receptor na superfície celular das células T sem prejudicar a funcionalidade, duas modificações separadas foram avaliadas em paralelo. Para aumentar a estabilização de cadeia única, o ligante G4S (SEQ ID NO: 73) usado no scFv anti-CD19 foi substituído pelo ligante Whitlow mais estruturado. Separadamente, uma mutação Y177T foi introduzida no domínio huUCHT1. Ambas as estratégias intensificaram a expressão do receptor de TAC, e um receptor foi gerado com o ligante Whitlow e a mutação Y177T.

[00255] A Fig. 17 ilustra uma inserção de CD19-TAC em um vetor lentiviral pCCL. O vetor pCCL apresenta um sistema promotor bidirecional com ∆NGFR (hu) sob o controle do promotor mCMV e a expressão de TAC sendo conduzida pelo promotor EF-1α. O ∆NGFR (hu) é um CD271 humano truncado (membro da superfamília 16 do receptor do fator de necrose tumoral), com domínio transmembranar, mas sem o domínio de sinalização citosólico. O produto de expressão ∆NGFR (hu) é usado para quantificar a transdução lentiviral. O quadro de leitura aberto de CD19-TAC#921 é ampliado para mostrar os elementos principais da construção de TAC: O CD8α líder, cadeia única de FMC63 (scFv anti-CD19), a Etiqueta c-Myc de humano, o huUCHT1 (Y177T) e o domínio de ∆CD4. A mutação huUCHT1 (Y177T) foi identificada examinando mutações pontuais introduzidas aleatoriamente em resíduos da interface de ligação de CD3 épsilon UCHT1 de murino. Em uma tela, a mutação (Y177T) foi identificada com sucesso. A mutação (Y177T) resulta em melhor expressão de superfície por Tri TAC enquanto retém a ativação de células T. O ∆CD4 não tem os quatro domínios extracelulares do tipo imunoglobulina CD4 e retém o ligante extracelular, domínios transmembranar e citosólico.

[00256] Para gerar um vetor lentiviral de grau GMP, a construção de CD19-Tri-TAC foi clonado em um novo vetor lentiviral sob o controle de um promotor MSCV. A construção de CD19-Tri-TAC é a mesma mostrada na Fig. 17. Exemplo 6. Capacidade de fabricar células T que expressam

CD19-TAC a partir de diferentes materiais de doadores

[00257] A Fig. 18 ilustra a eficácia de células T que expressam CD19-TAC fabricadas a partir de múltiplos doadores. As células T que expressam CD19-TAC foram produzidas usando células T de três doadores diferentes e testadas no modelo de tumor NALM-6. Camundongos com tumores NALM-6 estabelecidos foram tratados com uma dose única de 4 x 106 células T que expressam CD19-TAC. Os camundongos de controle apresentaram crescimento rápido do tumor, com todos os camundongos atingindo o ponto final no término do estudo. Os produtos de células T dos Doadores 1 e 2 resultaram em controle completo em todos os camundongos. O produto de células T do doador 3 resultou em controle robusto do tumor em todos os camundongos e controle de longo prazo em 2/4 camundongos tratados. O estudo confirma que a rejeição do tumor é alcançada por células T que expressam CD19-TAC derivadas de vários doadores saudáveis. Os resultados do modelo de tumor NALM-6 na Fig. 18 sugerem que o CD19-TAC eficaz é produzido a partir de múltiplos materiais de fonte de doador. Exemplo 7. Citotoxicidade in vitro e eficácia in vivo de células T que expressam CD19-TAC

[00258] Para avaliar a capacidade do CD19-TAC de envolver efetivamente várias células CD19 positivas, as células T modificadas com Tri-TAC foram co-cultivadas com NALM-6 (leucemia linfoblástica aguda), Raji (linfoma de Burkitt) ou Jeko-1 (Linfoma de células do manto). As células NALM-6, Jeko-1 e Raji foram manipuladas geneticamente com luciferase de vagalume intensificada para permitir o rastreamento da carga tumoral in vitro e no animal vivo por meio de formação de imagens de bioluminescência.

[00259] As Fig. 19A-Fig. 19C ilustram a morte de linhas de células tumorais por células T que expressam CD19-TAC. Os efeitos foram dependentes da dose e aumentaram com o aumento das razões efetor-para-alvo (E:T). Como controles negativos, as células modificadas com ∆TAC (sem um domínio de ligação a antígeno) ou células T não transduzidas foram usadas. Esses resultados demonstram que as células T que expressam CD19- TAC matam as células tumorais CD19 positivas.

[00260] As Fig. 19 D-Fig. 19G ilustram a configuração e o resultado de um estudo in vivo avaliando a eficácia de CD19-TAC em camundongos enxertados com tumores líquidos NALM-6 (leucemia linfoblástica aguda), Raji (linfoma de Burkitt) ou Jeko-1 (linfoma de células do manto). Para iniciar os tumores NALM-6, Raji e Jeko-1, os camundongos foram inoculados com células NALM-6, Raji ou Jeko-1 e alojados 4 ou 7 dias, respectivamente, para permitir o enxerto de tumores. No dia 4 ou 7, as células T que expressam CD19-TAC foram administradas como uma injeção intravenosa na veia da cauda. A carga tumoral foi medida em intervalos semanais e os dados são representados graficamente como a radiação média [p/s/cm^2/sr].

[00261] As Fig. 19E-Fig. 19G ilustram que as células T manipuladas geneticamente com CD19-TAC são eficazes na indução de regressão tumoral e controle de tumor de longo prazo em tumores líquidos NALM-6 (leucemia linfoblástica aguda), Raji (linfoma de Burkitt) ou Jeko-1 (linfoma de células do manto).

[00262] Os resultados dos modelos de tumor NAML-6, Raji ou Jeko-1 nas Fig. 19A - Fig. 19G sugerem que CD19-TAC é eficaz em uma variedade de modelos de tumor positivo para CD19. Exemplo 8. Persistência de células T que expressam CD19-TAC e imunidade tumoral duradoura

[00263] As Fig. 20A- Fig. 20B ilustram a persistência da imunidade tumoral e a resistência ao novo desafio em camundongos que receberam células T que expressam CD19-TAC. Camundongos com tumores NALM-6 estabelecidos foram tratados com células T que expressam CD19-TAC.

[00264] A Fig. 20A ilustra a configuração experimental para determinar a persistência de CD19-TAC em camundongos. Os camundongos foram primeiro inoculados com células NALM- 6, que após um período de enxerto de 4 dias foram tratados com CD19-TAC. Todos os camundongos apresentaram regressão do tumor e controle completo do tumor. 56 dias após o tratamento inicial, os camundongos foram desafiados novamente com tumores líquidos NALM-6 (CD19 positivo) ou KMS11 (CD19 negativo). Em todos os casos, camundongos naïve são coinjetados com células tumorais e usados como controles negativos. A carga tumoral é acompanhada por meio de sinal de luminescência.

[00265] Fig. 20B: Camundongos portadores de tumores NALM- 6 estabelecidos foram tratados com células T que expressam CD19-TAC dadas como dose dividida totalizando 4 x 106 células manipuladas geneticamente. Como controles, um grupo de animais não tratados foi usado. Após a ACT, os camundongos tratados apresentaram respostas antitumorais duráveis. Em contraste, os camundongos de controle mostraram aumentos exponenciais nas massas tumorais e atingiram o ponto final relacionado à carga tumoral. No dia 56 após ACT, os camundongos foram novamente desafiados com células tumorais NALM-6 (CD19 positivas) ou células tumorais KMS11 (CD19 negativas). Os camundongos tratados com CD19-TAC permanecem protegidos das células tumorais NALM-6 (CD19 positivas), mas não das células tumorais KMS11 (CD19 negativas).

[00266] Os resultados de experimentos de novo desafio nas Fig. 20A e Fig. 20B sugerem que CD19-TAC, em alguns casos, se diferencia em células de memória de vida longa que retêm propriedades antitumorais. Exemplo 9. Expansão in vivo e dependência da dose de células T que expressam CD19-TAC.

[00267] As Fig. 21 e a Fig. 22 ilustram a dependência da dose, regime de dose (dividido ou único) e expansão de células T que expressam CD19-TAC em um modelo de câncer NALM-

6. A Fig. 21A ilustra a configuração experimental. Os camundongos receberam uma dose única de células T que expressam CD19-TAC no dia quatro após a inoculação do tumor ou uma dose dividida distribuída com sete dias de intervalo. Múltiplas doses de células T que expressam CD19-TAC foram testadas: 0,5 x 106, 1 x 106 e 4 x 106 células. Fig. 21B grupos de controle de camundongos recebem 4 x 106 células não transduzidas, ou meio de congelamento (controle de veículo).

[00268] A Fig. 21B ilustra a sobrevivência de camundongos após injeção de NALM-6 e injeção de CD19-TAC. A promoção da sobrevivência dependente da dose foi observada nos grupos de dose única e de dose dividida, com a maior dose de administração única limitando o crescimento do tumor e promovendo a sobrevivência do camundongo.

[00269] A Fig 22A ilustra a estratégia de marcação de regiões usada para avaliar a proliferação de células T. As células foram selecionadas primeiro com base na dispersão frontal e lateral para selecionar a população de linfócitos. Células singleto foram identificadas por meio de uma área de dispersão frontal sobre a marcação de regiões na altura. As células vivas foram identificadas por meio de marcação de regiões próximas de IV. As células humanas foram identificadas por meio de uma marcação de regiões de hCD45. O subconjunto de células resultante foi ainda dividido em células CD3 positivas. Essas células foram então submetidas à marcação de regiões em CD4/CD8 e Proteína L. A estratégia de marcação de regiões também continha muCD45_1 para identificar células sanguíneas de murino. CD19 foi incluído para corar células NALM-6.

[00270] Fig. 22B expansão de células T em camundongos após a transferência de células T adotivas de dose dividida (ACT). Após a ACT, as amostras de sangue foram coletadas regularmente e analisadas por citometria de fluxo. Os valores foram normalizados para o número total de células T presentes no sangue após ACT1. Os valores também foram normalizados para o número total de células CD45.1+(murino) para contabilizar as diferenças na coleta de sangue. As células T em camundongos tratados com células manipuladas geneticamente com CD19-TAC mostraram se expandir em camundongos receptores dentro de aproximadamente 1-2 semanas após a primeira ACT (Fig. 22B). As células não transduzidas não se expandiram (Fig. 22B).

[00271] Os resultados das várias doses, regime de dosagem (Fig 21B) e contagens de células T (Fig 22B) sugerem que a eficácia do CD19-TAC é dependente da dose, que as células T modificadas se expandem in vivo e que essa expansão é específica para células manipuladas geneticamente com CD19- TAC em animais portadores de tumores positivos para CD19. Exemplo 10. Eficácia in vivo, Eficácia de Longo Prazo e Tratamento de Segurança com CD19-TAC

[00272] As Fig. 23- Fig. 25 demonstram a segurança e a eficácia em longo prazo (Fig. 23) e na ausência de qualquer toxicidade associada ao tratamento agudo (Fig. 24-Fig. 25).

[00273] A Fig. 23A ilustra a configuração do experimento. Os camundongos foram injetados com 0,5 x 106 células NALM-6 manipuladas geneticamente com luciferase intensificada, que puderam enxertar por 4 dias. Os camundongos são então tratados com dois níveis de dose (4 e 12 x 106 células manipuladas geneticamente) de células T manipuladas geneticamente com CD19-TAC em uma administração de dose única. O crescimento do tumor foi então seguido através de medições regulares de luminescência. A saúde do camundongo foi avaliada regularmente por meio da inspeção do comportamento e das características físicas do camundongo (aparência, motilidade, integridade do pelo).

[00274] A Fig. 23B ilustra a carga tumoral por meio de luminescência após o tratamento com veículo sozinho (meio de congelamento), células de controle não manipuladas geneticamente (dose total de células T igual à dose total de células T do grupo de tratamento manipuladas geneticamente mais alta) e 4 ou 12 x 106 células T manipuladas geneticamente com CD19-TAC. Ambos os controles mostram crescimento rápido do tumor e nenhuma eficácia antitumoral. A dose de controle resulta em um retardo no crescimento do tumor em relação ao veículo sozinho, presumivelmente devido à competição entre a alta dose de células T e células tumorais por nichos de enxerto. As células T manipuladas geneticamente mostram regressão do tumor em todos os casos. Os grupos de tratamento com altas doses mostram controle total do tumor em todos os casos. O grupo de tratamento 4 x 106 mostra 3 camundongos com controle completo, um com crescimento do tumor retardado e um com carga tumoral controlada, mas alta.

[00275] A Fig. 23C ilustra a sobrevivência geral dos diferentes grupos de tratamento. Em ambos, o veículo e os camundongos de controle não modificados, todos os camundongos sucumbem ao tumor em 23 a 35 dias, respectivamente. No caso de tratamento com alta dose de CD19- TAC, todos os camundongos desenvolvem sintomas de GvHD e sucumbem ao GvHD em 61 dias. O GvHD é uma consequência do próprio modelo do camundongo e não do tratamento com células T modificadas. Camundongos de baixa dose mostram sobrevivência de 3 camundongos até o final do estudo em 90 dias, um camundongo sucumbe à alta carga tumoral, um camundongo sucumbe ao GvHD.

[00276] As Fig. 24 e Fig. 25 ilustram os parâmetros de química clínica e os níveis de citocinas de camundongos de controle de veículo, não manipulados geneticamente e tratados com CD19-TAC (4 e 12 x 106 células de CD19-TAC eficazes manipuladas geneticamente). Os camundongos foram acompanhados por 33 dias com amostras de sangue colhidas 5, 12 e 33 dias após a ACT. Apenas os camundongos tratados com CD19-TAC sobreviveram por 33 dias. Os camundongos de controle de veículo sucumbiram à carga tumoral antes que uma terceira amostra de sangue pudesse ser coletada, as células não manipuladas geneticamente foram sacrificadas no início do dia 26, imediatamente antes de os camundongos atingirem o ponto final relacionado à carga tumoral. Todas as amostras de sangue foram analisadas para vários parâmetros de química clínica e níveis de citocinas.

[00277] A Fig. 24 ilustra que nos dias 5 e 12 os camundongos tratados com CD19-TAC não apresentam nenhum parâmetro que seja significativamente maior em comparação com os grupos de controle. No dia 33, todos os camundongos tratados mostram parâmetros de química clínica comparáveis com os pontos de tempo do tratamento inicial, com exceção da Alanina Aminotransferase (ALT) e Aspartato Aminotransferase (AST), onde alguns camundongos experimentam níveis elevados, similares aos camundongos tratados com células não manipuladas geneticamente amostradas no dia 26.

[00278] A Fig. 25 ilustra a resposta da citocina no dia 5, 12 e 33. No dia 5 após ACT de CD19-TAC, mas não os camundongos de controle mostram elevação em todas as citocinas testadas. O aumento de citocinas está de acordo com uma resposta inflamatória de células T manipuladas geneticamente com CD19-TAC que reconhecem e reagem a células tumorais NALM-6 positivas para antígeno. Após sua reação inicial, no dia 12, os níveis de citocinas diminuem, o que se correlaciona com a regressão do tumor induzida e, geralmente, baixa carga tumoral. No dia 12, os níveis de citocinas entre os tratados com CD19-TAC são similares ou inferiores aos das células T não manipuladas geneticamente, exceto para IL10. No estágio posterior, todos os camundongos tratados com células T não transduzidas ou manipuladas geneticamente com CD19-TAC mostram um aumento nas citocinas, presumivelmente associado ao início de GvHD. Ver também a

Fig. 29, que ilustra a resposta de citocinas nos dias 5, 12, 26 e 33.

[00279] Os resultados do acompanhamento de longo prazo de camundongos tratados com CD19-TAC e seu perfil de química clínica demonstram que as células T manipuladas geneticamente são seguras para uso e não mostram qualquer indicação de toxicidade causada especificamente pela manipulação genética com CD19-TAC. Os resultados do estudo das citocinas demonstram uma resposta inflamatória precoce associada à eficácia antitumoral, seguida por uma queda em todos os níveis de citocinas, sugerindo uma resposta inflamatória controlada. Exemplo 11. Eficácia in vivo de várias variantes de BCMA- Tri-TAC

[00280] A Fig. 26 ilustra um estudo de eficácia in vivo de vários construtos de BCMA-Tri-TAC. A Fig. 26A ilustra a configuração experimental geral. 1 milhão de células tumorais KMS11 manipuladas geneticamente com luciferase (positivas para BCMA) foram enxertadas por 12 dias. Os camundongos foram então tratados com uma única dose eficaz de 4 milhões de construtos de BCMA e controles (Fig. 26B). A carga tumoral foi avaliada regularmente por meio de medições de luminescência. Todos os camundongos que mostraram regressão do tumor e controle do tumor foram então desafiados novamente no dia 25 após ACT com 1 milhão de células KMS11.

[00281] Fig. 26C: Após a ACT, os camundongos de controle exibiram um rápido crescimento de células tumorais atingindo o ponto final associado ao tumor em 19 a 25 dias. Em contraste, todos os camundongos tratados com BCMA-TAC apresentaram regressão tumoral inicial. O controle do tumor variou entre os construtos com o G4S (SEQ ID NO: 73) 3625VH- VL mostrando o nível mais baixo de controle do tumor inicial e Hélice Curta 3625 VL-VH mostrando o nível mais alto de controle do tumor inicial. Após novo desafio, a maioria de todos os construtos que mantiveram o controle do tumor até o dia 25 permaneceram protegidos contra novo desafio.

[00282] Os resultados desse estudo in vivo demonstram que uma variedade de construtos de BCMA-Tri-TAC são eficazes no controle de tumores líquidos KMS11 (BCMA positivo). Mas que certas configurações preferidas fornecem eficácia superior. Em geral, a região do conector helicoidal forneceu um benefício relativo quando comparada ao ligante flexível dentro da mesma configuração de scFv. Exemplo 12. In vivo de TAC-Her2

[00283] Os camundongos são inoculados no flanco traseiro com tumores sólidos OVCAR3. Os tumores podem se estabelecer e crescer até um tamanho de 100 mm3. Os camundongos são então tratados com uma injeção na cauda de células T modificadas com TAC-Her2. O volume do tumor é medido regularmente. Exemplo 13. Estudo clínico

[00284] Um estudo clínico é realizado em que indivíduos de pelo menos 18 anos de idade com linfoma difuso de grandes células B CD19-positivas que falharam em pelo menos duas linhas anteriores de terapias incluindo ASCT ou que são inelegíveis para ASCT são tratados com células T que expressam CD19-TAC. O estudo é um ensaio aberto, de braço único, fase 1/2 de dois estágios, apresentando um estágio de escalonamento de dose para determinar a dose máxima tolerada (MTD) ou dose recomendada de fase II (RPh2D), seguido por uma coorte de expansão na dose selecionada.

[00285] Após a inscrição, os indivíduos são submetidos à leucaferese para obter células T para a fabricação de células T que expressam CD19-TAC. Após a fabricação bem-sucedida, os indivíduos entram na fase de tratamento. Essa fase envolve uma quimioterapia de linfodepleção com fludarabina e ciclofosfamida, seguida por administração intravenosa (IV) de células T que expressam CD19-TAC. Após o tratamento com células T que expressam CD19-TAC, os indivíduos entram no acompanhamento pós-tratamento e são acompanhados quanto à segurança, estado da doença e sobrevivência por 2 anos após sua última dose de células T que expressam CD19-TAC. Após a conclusão do estudo, os indivíduos são acompanhados quanto à sobrevivência, toxicidade de longo prazo e segurança do vetor viral em um protocolo de acompanhamento de longo prazo separado por até 15 anos após sua última dose de células T que expressam CD19-TAC.

[00286] Em todos os grupos, a segurança é avaliada ao longo do estudo. A expansão das células T é avaliada a partir do momento da primeira dose de células T que expressam CD19- TAC até que as células não sejam mais detectáveis. A avaliação radiográfica da doença é realizada por escaneamento por tomografia por emissão de pósitrons (PET) e/ou tomografia computadorizada (TC) antes do tratamento e aproximadamente 3, 6, 9, 12, 18 e 24 meses após a última dose de células T que expressam CD19-TAC, ou até a doença progressiva, ou tratamento com terapia anticâncer adicional. Exemplo 14. Fabricação de produtos farmacológicos de células T que expressam CD19-TAC

[00287] O processo de fabricação de produtos farmacológicos de células T que expressam CD19-TAC envolve a seleção de células T CD4/CD8 a partir de um produto de leucaferese, ativação das células positivas CD4/CD8, transdução de células com um vetor lentiviral compreendendo a construção de CD19-TAC (como descrito no exemplo 5), expandindo as células transduzidas para um nível adequado para o cronograma de dosagem proposto e colhendo e criopreservando o produto final.

[00288] O material de leucaferese do paciente com seu identificador único de indivíduo associado (UPN) é recebido em um local de fabricação e recebe um número de espécime único (ISN). As células CD4/CD8 são selecionadas e criopreservadas até o início das etapas do processo de cultura.

[00289] As células T CD4/CD8 criopreservadas selecionadas positivamente são descongeladas a 37 °C, recolocadas em suspensão em meio apropriado e semeadas em bolsas de cultura com reagentes de ativação, as culturas são incubadas durante a noite a 37 °C/CO2 a 5%.

[00290] As células são transduzidas com o vetor lentiviral de CD19-TAC em uma multiplicidade apropriada de infecção (MOI) e incubadas durante a noite a 37 °C/CO2 a 5%. Nos dias subsequentes, a cultura é suplementada com meio completo para manter uma concentração de células desejada e, eventualmente, agrupadas em bolsas de transferência, peletizadas, recolocadas em suspensão e semeadas em bolsas de cultura maiores na densidade celular alvo.

[00291] Para a formulação do produto farmacológico, a suspensão de células colhidas é recolocada em suspensão em excipiente e criopreservada em um congelador de taxa controlada, em seguida, transferida para armazenamento de LN2.

[00292] O produto é enviado para o centro clínico em seu estado congelado, descongelado à beira do leito e administrado por via intravenosa.

[00293] Antes do estudo clínico, as execuções de fabricação de engenharia são realizadas incluindo todos os testes em processo e de liberação usando material de leucaferese de doador saudável. Além dos testes em processo e de liberação, estudos que apoiam os registros regulatórios são conduzidos no fármaco final dessas execuções de manipulação genética. Esses estudos incluem estabilidade pós-descongelamento, início da estabilidade a longo prazo, teste residual para assegurar a eliminação de citocinas promotoras de crescimento e avaliação precoce de testes funcionais/indicadores de potência potenciais. Exemplo 15. Desenvolvimento Pré-Clínico de Terapia de Acoplador de Antígeno de Célula T (TAC) específico para BCMA para o tratamento de doenças malignas BCMA positivas

[00294] A Fig. 27 ilustra que os TACs proliferam quando encontram o antígeno nas células, mas não quando o antígeno é apresentado em grânulos artificiais; mas os CARs proliferam independentemente se os antígenos são apresentados em grânulos ou células.

[00295] As Fig. 28A-Fig. 28B ilustram as células T manipuladas geneticamente com TAC que se expandem in vivo e fornecem proteção de longo prazo, indicando a persistência das células em um modelo de mieloma. As Fig. 28A-Fig. 28B ilustram células T-BCMA-TAC rejeitam tumores de mieloma múltiplo em um modelo de xenoenxerto KMS-11 manipulado geneticamente com NanoLuc (KMS 11-NanoLuc) (BCMApos). Após o enxerto de tumor, os camundongos foram tratados com células T-BCMA-TAC (transportando Luciferase do Vagalume). As células T-TAC se expandem significativamente após a administração. Isso se correlaciona com a regressão do tumor. Os camundongos tratados eram resistentes ao novo desafio do tumor, indicando persistência de longo prazo das TAC-células T.

[00296] Os dados ilustram que as TAC-células T destroem as células tumorais provavelmente por meio de um mecanismo que imita o processo natural de ativação das células T. A tecnologia com TAC ilustra 1) forte eficácia em líquido, 2) proliferação in vivo, 3) persistência de células T, protegendo camundongos de novo desafio e 4) expansão de células após a administração de células T. Exemplo 16. Atividade in vivo e in vitro de HER2-TAC de hu- ou muIgκ com promotor MSCV ou EF1α.

[00297] As células T CD4 e CD8 foram manipuladas geneticamente com uma variedade de vírus que expressam TAC. Um conjunto de células foi manipulado geneticamente com um lentivírus que empregou o promotor MSCV para expressar um TAC específico para HER-2 que empregou o peptídeo sinal de IgG de murino [muIgG TAC (MSCV)]. Outro conjunto de células foi manipulado geneticamente com um lentivírus que empregou o promotor MSCV para expressar um TAC específico para HER-2 que empregou o peptídeo sinal de IgG humano [huIgG TAC (MSCV)]. Um terceiro conjunto de células foi manipulado geneticamente com um lentivírus que empregou o promotor EF1α para expressar um TAC específico para HER-2 que empregou o peptídeo sinal de IgG murino [muIgG TAC (EF1α)]. Como controle negativo, uma construção de TAC sem o domínio de ligação de HER2 (domínio de ligação ∆ de TAC) foi usado. As células manipuladas geneticamente foram então caracterizadas in vitro quanto à expressão de ressurgimento e atividade específica e in vivo quanto à atividade no modelo de tumor sólido positivo para HER2 OVCAR3.

[00298] A Fig. 30 ilustra a expressão de superfície de células T de receptores de HER2 TAC líderes de IgG de humano ou de murino, sob o controle de um promotor MCSV ou EF1α. A expressão de superfície é um requisito principal para a atividade biológica e isso ilustra que a expressão dos receptores de HER2 TAC não é influenciada pela espécie fonte do peptídeo sinal de IgG.

[00299] A Fig. 31 demonstra que as células T manipuladas geneticamente com construtos de HER2 TAC líderes de IgG de humano ou de murino, sob o controle de um promotor MCSV ou EF1α induzem a produção de citocinas, quando cocultivadas com células alvo HER2 positivas (OVCAR3), mas não com células HER2 negativas (LOX IMVI). Isso ilustra que as células T manipuladas geneticamente com receptor de HER2 TAC são capazes de envolver especificamente células alvo que expressam HER2, mas não são reativas contra células negativas para o antígeno.

[00300] A Fig 32. demonstra a eficácia in vivo de construtos de HER2 TAC líderes de humano ou de murino, sob o controle de um promotor MCSV ou EF1α. Após a administração de dose dividida de células T manipuladas geneticamente, as células manipuladas geneticamente com HER2 TAC mostram um impacto significativo no crescimento do tumor, incluindo a regressão do tumor, em relação ao controle negativo de ligação ∆ de TAC. Esse experimento in vivo demonstra que todas as células manipuladas geneticamente com HER2 TAC mostram atividade significativa contra um modelo de tumor sólido in vivo.

[00301] Embora as modalidades preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas nesse documento, será óbvio para aqueles habilitados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas a título de exemplo. Numerosas variações, mudanças e substituições ocorrerão agora aos habilitados na técnica sem se afastar da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas às modalidades da invenção descritas nesse documento podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam cobertos por elas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sequência de ácidos nucleicos que codifica um acoplador Trifuncional de antígeno de célula T CD19 (TAC de CD19), caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga seletivamente a um antígeno CD19; (b) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante UCHT1 que se liga a CD3; e (c) um terceiro polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de domínio de sinalização de TCR compreendendo um domínio citosólico e um domínio transmembranar; em que os componentes codificados por (a), os componentes codificados por (b) e os componentes codificados por (c) são fundidos diretamente uns aos outros ou unidos por pelo menos um ligante.

2. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligante que se liga seletivamente ao antígeno CD19 é um fragmento variável de cadeia única (scFv).

3. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o ligante que se liga seletivamente ao antígeno CD19 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36.

4. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que o ligante UCHT1 é um anticorpo de cadeia única.

5. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o ligante UCHT1 compreende uma mutação Y182T.

6. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que o ligante UCHT1 é uma variante humanizada de UCHT1 (huUCHT1).

7. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que o ligante UCHT1 é uma variante humanizada de UCHT1 compreendendo uma mutação Y177T (huUCHT1 (Y177T)).

8. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de que o ligante UCHT1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46.

9. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizada pelo fato de que o domínio citosólico é um domínio citosólico CD4 e o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD4.

10. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizada pelo fato de que o terceiro polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18.

11. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizada pelo fato de que o componente codificado por (a) e o componente codificado por (c) são fundidos ao componente codificado por (b).

12. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizada pelo fato de que o componente codificado por (b) e o componente codificado por (c) são fundidos ao componente codificado por (a).

13. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizada pelo fato de que pelo menos um ligante une o componente codificado por (a) ao componente codificado por (b).

14. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, ou 13, caracterizada pelo fato de que pelo menos um ligante é um ligante flexível G4S (SEQ ID NO: 73), um domínio de proteína grande, uma estrutura em hélice longa ou uma estrutura em hélice curta.

15. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10 ou 13-14, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um ligante compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 28.

16. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizada pelo fato de que o CD3 é de um complexo de TCR em uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo.

17. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizada pelo fato de que a ligação do CD3 induz a ativação de uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo.

18. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizada pelo fato de que o CD19-TAC compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63.

19. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizada pelo fato de que o CD19-TAC compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64.

20. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador.

21. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio de ativação.

22. Construto de vetor, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma sequência de ácidos nucleicos conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-21; e (b) um promotor funcional em uma célula de mamífero.

23. Célula T, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácidos nucleicos conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-21.

24. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a célula T, conforme definida na reivindicação 23, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

25. Método de tratamento de um câncer que expressa CD19 em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação

24.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o câncer é uma malignidade de células B.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o câncer é linfoma de células B, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL) ou Linfoma não-Hodgkin.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25-27, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada por via transarterial, subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, intravenosa ou intraperitoneal.

29. Sequência de ácidos nucleicos que codifica um acoplador Trifuncional de antígeno de célula T (TAC Tri), caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante específico do alvo; (b) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR; e (c) um terceiro polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de domínio de sinalização do receptor de células

T; em que o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR é selecionado de OKT3, F6A ou L2K.

30. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o componente codificado por (a), o componente codificado por (b) e o componente codificado por (c) são fundidos diretamente entre si ou unidos por pelo menos um ligante.

31. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que o componente codificado por (a) e o componente codificado por (b) são diretamente fundidos e unidos ao componente codificado por (c) por um ligante.

32. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que o componente codificado por (b) e o componente codificado por (c) são diretamente fundidos e unidos ao componente codificado por (a) por um ligante.

33. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-32, caracterizada pelo fato de que pelo menos um ligante é um ligante G4S flexível (SEQ ID NO: 73), um domínio de proteína grande, uma estrutura em hélice longa ou uma estrutura em hélice curta.

34. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-33, caracterizada pelo fato de que pelo menos um ligante tem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 28.

35. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-34, caracterizada pelo fato de que o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR é OKT3.

36. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-35, caracterizada pelo fato de que o ligante que se liga a uma proteína associada ao complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22.

37. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-34, caracterizada pelo fato de que o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR é F6A.

38. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-34 ou 37, caracterizada pelo fato de que o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24.

39. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-34, caracterizada pelo fato de que o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR é L2K.

40. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-34 ou 39, caracterizada pelo fato de que o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 26.

41. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-40, caracterizada pelo fato de que a proteína associada ao complexo TCR é CD3.

42. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-41, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo se liga seletivamente a um antígeno tumoral.

43. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-42, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo é um polipeptídeo projetado de repetição de anquirina (DARPin) ou um fragmento variável de cadeia única (scFv).

44. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-43, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo se liga seletivamente a um antígeno CD19, um antígeno HER2 ou um antígeno BCMA.

45. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-44, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo se liga seletivamente a um antígeno HER-2 compreende um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo selecionado de Trastuzumab, Pertuzumab, Lapatinib, Neratinib, Ado-trastuzmab Emtansina, Gancotamab, Margetuximab, Timigutuzumab e Ertumaxomab.

46. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-44, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo se liga seletivamente a um antígeno BCMA compreende um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo selecionado de Belantamab mafodotin e GSK2857916.

47. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-44, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96 %, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 34.

48. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 47, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T compreende um domínio citosólico e um domínio transmembranar.

49. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que o domínio citosólico é um domínio citosólico CD4 e o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD4, ou em que o domínio citosólico é um domínio citosólico CD8 e o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD8.

50. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 49, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma sequência líder.

51. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 50.

52. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 51, caracterizada pelo fato de que o CD3 é de um complexo de TCR em uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo.

53. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-52, caracterizada pelo fato de que a ligação do CD3 induz a ativação de uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo.

54. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-53, caracterizada pelo fato de que o TAC Tri compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 61.

55. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-53, caracterizada pelo fato de que o TAC Tri compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 62.

56. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-55, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador.

57. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-56, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio de ativação.

58. Sequência de ácidos nucleicos que codifica um acoplador trifuncional de antígeno de célula T (TAC Tri), caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um primeiro polinucleotídeo que codifica um ligante específico do alvo; (b) um segundo polinucleotídeo que codifica um ligante que se liga a uma proteína associada a um complexo de TCR; e (c) um terceiro polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T; em que a sequência de ácidos nucleicos compreende adicionalmente uma sequência líder, e em que o componente codificado por (a), o componente codificado por (b) e o componente codificado por (c) são fundidos diretamente um ao outro ou unidos por pelo menos um ligante.

59. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo se liga seletivamente a um antígeno tumoral.

60. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-59, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo é um polipeptídeo projetado de repetição de anquirina (DARPin) ou um fragmento variável de cadeia única (scFv).

61. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-60, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo se liga seletivamente a um antígeno CD19, um antígeno HER2 ou um antígeno BCMA.

62. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-61, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo se liga seletivamente a um antígeno HER-2 e compreende um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo selecionado de Trastuzumab, Pertuzumab, Lapatinib, Neratinib, Ado-trastuzmab Emtansina, Gancotamab, Margetuximab, Timigutuzumab e Ertumaxomab.

63. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-61, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo se liga seletivamente a um antígeno BCMA e compreende um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo selecionado de Belantamab mafodotin e GSK2857916.

64. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-61, caracterizada pelo fato de que o ligante específico do alvo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 54.

65. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-64, caracterizada pelo fato de que o ligante que se liga à proteína associada ao complexo de TCR é selecionado de UCHT1, UCHT1 (Y182T), huUCHT1, huUCHT1 (Y177T), OKT3, F6A ou L2K.

66. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-65, caracterizada pelo fato de que o ligante que se liga a uma proteína associada ao complexo de TCR tem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 26.

67. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-66, caracterizada pelo fato de que a proteína associada ao complexo TCR é CD3.

68. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-67, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do domínio de sinalização do receptor de células T compreende um domínio citosólico e um domínio transmembranar.

69. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que o domínio citosólico é um domínio citosólico CD4 e o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD4, ou em que o domínio citosólico é um domínio citosólico CD8 e o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD8.

70. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-69, caracterizada pelo fato de que a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48 ou SEQ ID NO: 50.

71. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-70, caracterizada pelo fato de que o componente codificado por (a) e o componente codificado por (b) são diretamente fundidos e unidos ao componente codificado por (c) por um ligante.

72. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-70, caracterizada pelo fato de que o componente codificado por (b) e o componente codificado por (c) são diretamente fundidos e unidos ao componente codificado por (a) por um ligante.

73. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-72, caracterizada pelo fato de que pelo menos um ligante é um ligante flexível G4S (SEQ ID NO: 73), um domínio de proteína grande, uma estrutura em hélice longa ou uma estrutura em hélice curta.

74. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-73, caracterizada pelo fato de que pelo menos um ligante tem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 28.

75. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-74, caracterizada pelo fato de que a proteína associada ao complexo de TCR é CD3 e o CD3 é de um complexo de TCR em uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo.

76. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75, caracterizada pelo fato de que a ligação do CD3 induz a ativação de uma célula que expressa o segundo polinucleotídeo.

77. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-76, caracterizada pelo fato de que

TAC Tri compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 61.

78. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-76, caracterizada pelo fato de que TAC Tri compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 62.

79. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-78, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador.

80. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58-79, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio de ativação.

81. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de ser codificado pela sequência de ácidos nucleicos conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-21 ou 29-80.

82. Construto de vetor, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma sequência de ácidos nucleicos conforme definida em qualquer uma das reivindicações 29-80; e (b) um promotor funcional em uma célula de mamífero.

83. Célula T, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácidos nucleicos conforme definida em qualquer uma das reivindicações 29-80.

84. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a célula T, conforme definida na reivindicação 83, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

85. Método de tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 84.

86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.

87. Método, de acordo com a reivindicação 85 ou 86, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer sólido ou um câncer líquido.

88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85-87, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer de pulmão, um câncer de mama, mieloma múltiplo, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer colorretal, câncer urotelial, câncer endometrial ou um câncer de cólon.

89. Método, de acordo com a reivindicação 85 ou 86, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende uma célula cancerígena que expressa CD19.

90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85-86 ou 89, caracterizado pelo fato de que o câncer é uma malignidade de células B.

91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85-86 ou 89, caracterizado pelo fato de que o câncer é linfoma de células B, leucemia linfoblástica aguda (ALL),

leucemia linfocítica crônica (CLL) ou Linfoma não-Hodgkin.

92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85-86, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende uma célula cancerígena que expressa HER-2.

93. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85-86 ou 92, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer de ovário ou câncer de estômago.

94. Método, de acordo com a reivindicação 85 ou 86, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende uma célula cancerígena que expressa BCMA.

95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85-86 ou 94, caracterizado pelo fato de que o câncer é leucemia, linfoma ou mieloma múltiplo.

96. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85-95, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo por via transarterial, subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, intravenosa ou intraperitoneal.

97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85-96, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica está em uma forma de dose unitária.

98. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85-97, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende cerca de 0,5-2 x 109 de células T.

99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85-98, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada diariamente, semanalmente, duas vezes por semana, mensalmente, semestralmente ou anualmente.

100. Sequência de ácidos nucleicos que codifica um acoplador Trifuncional de antígeno de célula-T HER2 (TAC HER2), caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 ou SEQ ID NO: 75.

101. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 100, caracterizada pelo fato de que o TAC HER2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 ou SEQ ID NO: 76.

102. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 100 ou 101, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador.

103. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 100 a 102, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio de ativação.

104. Sequência de ácidos nucleicos que codifica um acoplador Trifuncional de antígeno de células T BCMA (BCMA- TAC), caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 ou SEQ ID NO: 61.

105. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 104, caracterizada pelo fato de que o TAC BCMA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 62.

106. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 104 ou 105, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio coestimulador.

107. Sequência de ácidos nucleicos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 104 a 106, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos não codifica um domínio de ativação.