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BR112020003326A2 - produção acentuada de lipídios pela limitação de pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes - Google Patents

produção acentuada de lipídios pela limitação de pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes Download PDF

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BR112020003326A2
BR112020003326A2 BR112020003326-0A BR112020003326A BR112020003326A2 BR 112020003326 A2 BR112020003326 A2 BR 112020003326A2 BR 112020003326 A BR112020003326 A BR 112020003326A BR 112020003326 A2 BR112020003326 A2 BR 112020003326A2
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mol
source
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lipid production
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Application number
BR112020003326-0A
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Adam Burja
Jim Corona
Jose R. Garcia
Goncalo Oliveira Maia
Horst Priefert
Joachim WINDAU
Gabriel Závodský
Original Assignee
Evonik Operations Gmbh
Dsm Ip Assets B.V.
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Abstract

A presente invenção se refere a um método de produção acentuada de lipídios pela limitação de pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes durante a fermentação das células produtoras de lipídios.

Description

“PRODUÇÃO ACENTUADA DE LIPÍDIOS PELA LIMITAÇÃO DE PELO MENOS DUAS FONTES DE NUTRIENTES LIMITANTES”
[0001] A presente invenção se refere a um método de produção acentuada de lipídios pela limitação de pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes durante a fermentação das células produtoras de lipídios.
[0002] Certos microrganismos eucarióticos (como algas; fungos, incluindo levedura; e protistas) têm demonstrado ser bons produtores de ácidos graxos poli-insaturados em fermentadores. Em particular, tem sido demonstrado que altas quantidades de PUFAs (ácidos graxos poli-insaturados) podem ser obtidas quando as cepas são primeiramente cultivadas até uma alta densidade celular, e como uma segunda etapa, uma produção acentuada de lipídios é iniciada ao se reduzir a quantidade de uma fonte de nutrientes limitantes, por exemplo, a fonte de nitrogênio, ou ao se reduzir a quantidade de oxigênio dissolvido no meio (documento WO 01/54510).
[0003] Começando com essa técnica anterior, foi um objetivo da presente invenção fornecer um método com rendimentos ainda maiores de ácidos graxos poli- insaturados.
[0004] Surpreendentemente, foi constatado que melhores rendimentos de PUFAs podem ser obtidos se não somente a quantidade de uma fonte de nutrientes limitantes for reduzida, mas se, além disso, a quantidade de uma outra fonte de nutrientes limitantes for reduzida no decorrer da fermentação das células produtoras de lipídios, em que essas fontes de nutrientes limitantes são,
preferencialmente, uma fonte de nitrogênio e uma fonte de fosfato.
[0005] Assim, um primeiro objetivo da presente invenção é um método de produção de lipídios contendo ácidos graxos poli-insaturados provenientes de microrganismos, preferencialmente microrganismos eucarióticos, capazes de produzir pelo menos cerca de 10 % em peso de sua biomassa na forma de lipídios, que compreende uma fase de crescimento de densidade de biomassa e uma fase de produção de lipídio, compreendendo a) adicionar, durante a fase de crescimento de densidade de biomassa, a um meio de fermentação contendo os ditos microrganismos, uma fonte de carbono e pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes a uma taxa suficiente para aumentar a densidade de biomassa do dito meio de fermentação até pelo menos 50 g/l, e b) interromper ou reduzir significativamente o fornecimento de pelo menos duas das ditas fontes de nutrientes limitantes na fase de produção de lipídio, enquanto o fornecimento de uma fonte de carbono ainda é mantido.
[0006] Como usado na presente invenção, o termo “fonte de nutrientes limitantes” se refere a uma fonte de um nutriente (incluindo o próprio nutriente) essencial para o crescimento e divisão celular de um microrganismo em que, quando o nutriente limitante estiver privado do meio de crescimento, sua ausência substancialmente limita o crescimento ou a replicação adicional do microrganismo. Entretanto, uma vez que os outros nutrientes (e fonte de carbono) ainda estão em abundância, o organismo pode continuar a gerar e acumular produtos intracelulares e/ou extracelulares, em particular lipídios.
[0007] Essas fontes de nutrientes limitantes incluem fontes de nitrogênio, fontes de fosfato, fontes de vitamina (por exemplo, fontes de vitamina B2, fontes de pantotenato, fontes de tiamina), fontes de metais em traços (por exemplo, fontes de zinco, fontes de cobre, fontes de cobalto, fontes de níquel, fontes de ferro, fontes de manganês, fontes de molibdênio), e fontes de metais em quantidades maiores (por exemplo, fontes de magnésio, fontes de cálcio, fontes de sódio, fontes de potássio), fontes de sílica e misturas destas.
[0008] Essas fontes de metais em traços e as fontes de metais em quantidades maiores incluem sais sulfato e cloreto desses metais (por exemplo, MgSO4*7H2O; MnCl2*4H2O; ZnSO4*7H2O; CoCl2*6H2O; Na2MoO4*2H2O; CuSO4*5H2O; NiSO4*6H2O; FeSO4*7H2O; CaCl2; K2SO4; KCI; e Na2SO4) e misturas destes.
[0009] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, as ditas “pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes” são uma fonte de nitrogênio e uma fonte de fosfato. – Nessa modalidade preferencial, além da(s) fonte(s) de nitrogênio e da(s) fonte(s) de fosfato, o fornecimento de fontes adicionais de nutrientes limitantes pode ser interrompido ou significativamente reduzido na fase de produção de lipídio, bem como, porém preferencialmente, as outras fontes de nutrientes limitantes estão presentes em abundância na fase de produção de lipídio.
[0010] Assim, uma matéria preferencial da presente invenção é um método de produção de lipídios contendo ácidos graxos poli-insaturados provenientes de microrganismos, preferencialmente microrganismos eucarióticos, capazes de produzir pelo menos cerca de 10 % em peso de sua biomassa na forma de lipídios, que compreende uma fase de crescimento de densidade de biomassa e uma fase de produção de lipídio, compreendendo a) adicionar, durante a fase de crescimento de densidade de biomassa, a um meio de fermentação contendo os ditos microrganismos, uma fonte de carbono e pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes a uma taxa suficiente para aumentar a densidade de biomassa do dito meio de fermentação até pelo menos 50 g/l, e b) interromper ou reduzir significativamente o fornecimento de pelo menos duas das ditas fontes de nutrientes limitantes na fase de produção de lipídio, enquanto o fornecimento de uma fonte de carbono ainda é mantido, em que as ditas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes são uma fonte de nitrogênio e uma fonte de fosfato.
[0011] Ao interromper ou reduzir significativamente o fornecimento das ditas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes, as quantidades disponíveis das ditas fontes de nutrientes limitantes caem para concentrações em que os microrganismos produtores de lipídios são privados das ditas fontes de nutrientes limitantes. Isso significa que os microrganismos poderiam absorver mais daquelas fontes de nutrientes limitantes do que estão disponíveis no meio, ou seja, o fornecimento das fontes de nutrientes limitantes é menor do que a quantidade de fontes de nutrientes limitantes que os microrganismos poderiam consumir. A privação da primeira dessas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes normalmente iniciará a fase de produção de lipídio, caso esse início da fase de produção de lipídio não tenha sido realizado anteriormente por outros meios.
[0012] De acordo com a invenção, a fonte de nitrogênio pode ser orgânica, inorgânica ou uma mistura destas. As fontes preferenciais de nitrogênio de acordo com a invenção são amônia, ureia, nitrato, nitrito, aminoácidos, em particular glutamato, sais inorgânicos de amônio, mais preferencialmente sulfato de amônio ou hidróxido de amônio, e com a máxima preferência hidróxido de amônio, e misturas destes. A fonte de nitrogênio também pode ser fornecida na forma de meios complexos, por exemplo, extrato de peptona ou levedura, preferencialmente contendo componentes conforme anteriormente mencionado.
[0013] A principal ou única fonte de nitrogênio é, com mais preferência, selecionada entre amônia e sais inorgânicos de amônio, e é, em especial, principalmente ou somente amônia, ou principalmente ou somente hidróxido de amônio.
[0014] De acordo com a invenção, “principal fonte de nitrogênio” significa que a respectiva fonte fornece pelo menos 50 %, preferencialmente pelo menos 70 %, mais preferencialmente pelo menos 90 %, dos equivalentes molares de nitrogênio.
[0015] As fontes preferenciais de fosfato de acordo com a invenção são ácido fosfórico e sais inorgânicos de fosfato, por exemplo, fosfato de amônio, cálcio, sódio ou potássio ou sais correspondentes de hidrogenofosfato e di-
hidrogenofosfato, e misturas destes. Também, a fonte de fosfato pode ser fornecida na forma de meios complexos, preferencialmente contendo componentes conforme anteriormente mencionado.
[0016] A principal ou única fonte de fosfato é, preferencialmente, selecionada entre ácido fosfórico e sais inorgânicos de fosfato, em particular di-hidrogenofosfato de potássio, e misturas destes.
[0017] Consequentemente, “principal fonte de fosfato” significa que a respectiva fonte de fosfato fornece pelo menos 50 %, preferencialmente pelo menos 70 %, mais preferencialmente pelo menos 90 %, dos equivalentes molares de fosfato.
[0018] A limitação das primeiras dessas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes preferencialmente inicia a fase de produção de lipídio. Assim, de acordo com a invenção, o início da fase de produção de lipídio em uma modalidade preferencial da invenção é definido como sendo o momento em que, no decorrer da fermentação, a concentração da primeira dessas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes no meio cai abaixo de 0,01 mol/l.
[0019] De modo mais geral, o início da fase de produção de lipídio corresponde ao momento em que o crescimento adicional dos microrganismos essencialmente cessa e, então, os microrganismos começam a acumular intensamente lipídios nas células. – Como mencionado anteriormente, a fase de produção de lipídio não precisa ser necessariamente iniciada pela redução da concentração de uma fonte de nutrientes limitantes. Alternativamente, pode ser iniciada, por exemplo, também pela limitação da quantidade de oxigênio dissolvido no meio de fermentação.
[0020] Em uma modalidade preferencial da invenção, as quantidades de ambas as ditas duas fontes de nutrientes limitantes caem para concentrações no decorrer da fermentação, de modo que os microrganismos produtores de lipídios no meio sejam privados de ambas as ditas fontes de nutrientes limitantes durante pelo menos 30 % do tempo da fase de produção de lipídio, preferencialmente durante pelo menos 40, 50 ou 60 % do tempo da fase de produção de lipídio, especialmente durante pelo menos 70, 80 ou 90 % do tempo da fase de produção de lipídio.
[0021] Na presente invenção, os microrganismos no meio são preferencialmente privados de ambas as ditas fontes de nutrientes limitantes por pelo menos os últimos 30 % do tempo da fase de produção de lipídio, preferencialmente por pelo menos os últimos 40, 50 ou 60 % do tempo da fase de produção de lipídio, mais preferencialmente por pelo menos os últimos 70, 80 ou 90 % do tempo da fase de produção de lipídio.
[0022] Alternativamente ou além disso, os microrganismos no meio são, preferencialmente, privados de ambas as ditas fontes de nutrientes limitantes por pelo menos as últimas 30 horas da fase de produção de lipídio, preferencialmente por pelo menos as últimas 40, 50 ou 60 horas da fase de produção de lipídio, mais preferencialmente por pelo menos as últimas 70, 80 ou 90 horas da fase de produção de lipídio.
[0023] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, as concentrações de ambas as ditas duas fontes de nutrientes limitantes caem abaixo de 0,01 mol/l,
preferencialmente abaixo de 0,005 mol/l, em particular abaixo de 0,003 mol/l, e/ou abaixo do limite de detecção daquelas fontes de nutrientes limitantes no decorrer da fermentação, respectivamente.
[0024] Na presente invenção, as concentrações das ditas ambas fontes de nutrientes limitantes preferencialmente caem abaixo de 0,01 mol/l, mais preferencialmente abaixo de 0,005 mol/l, especialmente abaixo de 0,003 mol/l, em particular a zero e/ou abaixo do limite de detecção daquelas fontes de nutrientes limitantes, dentro de 40 horas, preferencialmente dentro de 30 horas, mais preferencialmente dentro de 20 horas, após o início da fase de produção de lipídio. Uma vez que, preferencialmente, o início da fase de produção de lipídio ocorre quando a concentração da primeira das pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes cai abaixo de 0,01 mol/l, isso significa que a concentração da segunda fonte de nutrientes limitantes preferencialmente cai abaixo de 0,01 mol/l, preferencialmente abaixo de 0,005 mol/l, especialmente abaixo de 0,003 mol/l, em particular a zero e/ou abaixo do limite de detecção, até 40 horas, preferencialmente até 30 horas, em particular até 20 horas depois da concentração da primeira fonte de nutrientes limitantes cai.
[0025] Alternativamente ou além disso, as concentrações das ditas ambas fontes de nutrientes limitantes estão abaixo de 0,01 mol/l, preferencialmente abaixo de 0,005 mol/l, especialmente abaixo de 0,003 mol/l, em particular a zero e/ou abaixo do limite de detecção daquelas fontes de nutrientes limitantes, pelo menos durante a segunda metade completa da fase de produção de lipídio, mais preferencialmente pelo menos durante os 60, 70 ou 80 % finais completos do tempo da fase de produção de lipídio.
[0026] Alternativamente ou além disso, as concentrações das ditas ambas fontes de nutrientes limitantes estão abaixo de 0,01 mol/l, preferencialmente abaixo de 0,005 mol/l, especialmente abaixo de 0,003 mol/l, em particular zero e/ou abaixo do limite de detecção daquelas fontes de nutrientes limitantes, pelo menos durante as últimas 20 horas da fermentação, mais preferencialmente pelo menos durante as últimas 40 horas da fermentação, em particular pelo menos durante as últimas 60 horas da fermentação.
[0027] Em uma modalidade da invenção durante a fase de produção de lipídio, nenhuma quantidade adicional das pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes, em particular da(s) fonte(s) de nitrogênio e da(s) fonte(s) de fosfato, é adicionada. – No entanto, uma vez que a depleção daquelas fontes de nutrientes limitantes não necessariamente ocorre ao mesmo tempo, também nessa modalidade da invenção é possível e provável que as concentrações de ambas as pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes caiam abaixo de 0,01 mol/l em diferentes pontos no tempo. Porém, uma vez que o fornecimento das ditas fontes de nutrientes limitantes é interrompido na fase de produção de lipídio, as concentrações das ditas fontes de nutrientes limitantes preferencialmente caem a zero no decorrer da fermentação nessa modalidade da invenção.
[0028] Em uma modalidade adicional da presente invenção, o fornecimento de uma das pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes é interrompido antes que o fornecimento da segunda das pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes seja interrompido. Em particular, o fornecimento da segunda fonte de nutrientes limitantes pode ser interrompido até 30 horas depois, em particular até 20 ou até 10 horas depois do fornecimento da primeira fonte de nutrientes limitantes.
[0029] Em uma modalidade adicional da presente invenção, o fornecimento das fontes de nutrientes limitantes ainda é continuado na fase de produção de lipídio, mesmo após a redução de suas concentrações, mais ou menos durante a fase completa de produção de lipídio. Nessa modalidade, as fontes de nutrientes limitantes são adicionadas em quantidades tão pequenas que as células não voltarão para a fase de crescimento. Isso é preferencialmente realizado alimentando-se as ditas fontes de nutrientes limitantes em quantidades tais que as células ainda sejam privadas dessas fontes de nutrientes limitantes; preferencialmente, na presente invenção, as fontes de nutrientes limitantes não excedem uma concentração de 0,01 mol/l, em particular uma concentração de 0,005 mol/l, especialmente uma concentração de 0,003 mol/l, na fase de produção de lipídio. O benefício dessa modalidade é que ainda alimentar esses componentes em pequenas quantidades na fase de produção de lipídio pode ajudar a evitar o estresse metabólico nas células e isso pode evitar o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ERO) dentro das células e, dessa forma, impedir um possível aumento da degradação oxidativa dos lipídios da forma que estão contidos nas células.
[0030] A adição das ditas fontes de nutrientes limitantes e da fonte de carbono pode ocorrer na forma de um procedimento em batelada, em batelada alimentada, contínuo, em “bolus” e/ou semicontínuo. O fornecimento de uma ou mais das fontes de nutrientes limitantes também pode ser combinado com o fornecimento da alimentação de carbono. O “fornecimento” das fontes de nutrientes limitantes e da fonte de carbono compreende o fornecimento ativo, bem como o passivo. Isso significa, por exemplo, que se a(s) fonte(s) de nutriente limitante e/ou a fonte de carbono estiverem presentes em uma quantidade suficiente no meio de batelada no início da fermentação, elas não necessariamente precisam ser fornecidas ativamente no decorrer da fermentação. Correspondentemente, “o fornecimento é interrompido” significa que o(s) respectivo(s) composto(s) não está(estão) mais disponível(is) no meio.
[0031] Porém, em uma modalidade preferencial da invenção, pelo menos a adição da fonte de carbono é realizada ativamente no decorrer da fermentação, preferencialmente mesmo após o início da fase de produção de lipídio.
[0032] A seguir, são ainda reveladas as modalidades preferenciais da invenção em que as pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes são uma fonte de nitrogênio e uma fonte de fosfato.
[0033] Em uma dessas modalidades preferenciais, as concentrações de ambas a(s) fonte(s) de nitrogênio e a(s) fonte(s) de fosfato são tão baixas que os microrganismos produtores de lipídios no meio são privados de ambas as ditas fontes de nutrientes limitantes durante pelo menos 30 % do tempo da fase de produção de lipídio,
preferencialmente durante pelo menos 40, 50 ou 60 % do tempo da fase de produção de lipídio, especialmente durante pelo menos 70, 80 ou 90 % do tempo da fase de produção de lipídio.
[0034] Na presente invenção, os microrganismos no meio são preferencialmente privados de ambas as ditas fontes de nutrientes limitantes por pelo menos os últimos 30 % do tempo da fase de produção de lipídio, preferencialmente por pelo menos os últimos 40, 50 ou 60 % do tempo da fase de produção de lipídio, mais preferencialmente por pelo menos os últimos 70, 80 ou 90 % do tempo da fase de produção de lipídio.
[0035] Alternativamente ou além disso, os microrganismos no meio são, preferencialmente, privados de ambas as ditas fontes de nutrientes limitantes por pelo menos as últimas 30 horas da fase de produção de lipídio, preferencialmente por pelo menos as últimas 40, 50 ou 60 horas da fase de produção de lipídio, mais preferencialmente por pelo menos as últimas 70, 80 ou 90 horas da fase de produção de lipídio.
[0036] Em uma outra dessas modalidades preferenciais, a quantidade da(s) fonte(s) de nitrogênio é reduzida abaixo de uma concentração de 5,6 x 10-3 mol/l (correspondendo, no caso do amônio como fonte de nitrogênio, a 0,1 g/l de amônio) e a quantidade da(s) fonte(s) de fosfato é reduzida abaixo de uma concentração de 5,4 x 10-3 mol/l (correspondendo a 0,5 g/l de fosfato) no decorrer da fermentação, preferencialmente dentro de um intervalo de não mais que 40 horas, mais preferencialmente de não mais que 30 horas, em particular não maior que 20 ou 10 horas.
[0037] Na presente invenção, a quantidade da(s) fonte(s) de nitrogênio é, preferencialmente, reduzida abaixo de uma concentração de 2,8 x 10-3 mol/l (correspondendo, no caso do amônio como fonte de nitrogênio, a 0,05 g/l de amônio) e a quantidade da(s) fonte(s) de fosfato é, preferencialmente, reduzida abaixo de uma concentração de 5,4 x 10-4 mol/l (correspondendo a 0,05 g/l de fosfato), preferencialmente dentro de um intervalo de não mais que 40 horas, mais preferencialmente de não mais que 30 horas, em particular não maior que 20 ou 10 horas.
[0038] Na presente invenção, a fase de produção de lipídio é, preferencialmente, iniciada tanto primeiramente limitando a quantidade da(s) fonte(s) de nitrogênio ou quanto primeiramente limitando a quantidade da(s) fonte(s) de fosfato ou limitando (mais ou menos) simultaneamente a quantidade da(s) fonte(s) de nitrogênio e da(s) fonte(s) de fosfato.
[0039] As concentrações molares conforme mencionadas na descrição se referem à(s) fonte(s) monovalente(s) de nitrogênio e fosfato. Fica evidente que, caso uma fonte multivalente de nitrogênio ou fosfato seja usada como alternativa ou em adição a uma fonte monovalente de nitrogênio ou fosfato, então somente uma fração correspondente da concentração molar mencionada precisa ser aplicada. Por exemplo, no caso de uma fonte bivalente, somente metade da concentração molar precisa ser aplicada etc. Além disso, também fica evidente que, caso meios complexos contendo essas fontes de nitrogênio ou fosfato sejam usadas como alternativa ou em adição a uma fonte monovalente de nitrogênio ou fosfato, então a quantidade de fontes de nitrogênio ou fosfato contidas nos meios complexos é relevante para o cálculo.
[0040] Em uma modalidade particular da invenção, a quantidade de ambas a(s) fonte(s) de nitrogênio e a(s) fonte(s) de fosfato é reduzida a zero e/ou abaixo do limite de detecção daqueles compostos dentro de um intervalo de não mais que 40 horas, preferencialmente de não mais que 30 hora, mais preferencialmente de não mais que 20 ou 10 horas.
[0041] A determinação da quantidade de amônia/amônio é preferencialmente realizada em uma amostra do meio de reação por espectroscopia UV como segue: Amônia/amônio é reagida na presença de uma glutamato desidrogenase, 2- oxoglutarato e NADH, passando a L-glutamato, NAD+ e água. Uma vez que a quantidade de NADH oxidada é estequiométrica em relação à quantidade de amônia/amônio conforme presente na amostra, a quantidade de amônia/amônio pode ser determinada comparando-se a quantidade de NADH antes e depois da reação. A quantidade de NADH pode ser determinada por absorbância de luz em 334, 340 ou 365 nm. Um kit adequado e comercialmente disponível para determinar a quantidade de amônia/amônio é o kit de teste de amônio r- Biopharm (Roche Diagnostics, Suíça).
[0042] A determinação da quantidade de fosfato é, preferencialmente, realizada em uma amostra do meio de reação por colorimetria como segue: Fosfato é reagido com molibdato de amônio para formar fosfomolibdato de amônio. O fosfomolibdato de amônio é, então, ainda reduzido utilizando-se um agente redutor para produzir um complexo de heteropolimolibdato estável, reduzido e de valência mista, a saber, PO4[Mo(V)O3)4(Mo(VI)O3)8]7-. A taxa de alteração de absorbância do complexo de heteropolimolibdato azul resultante é proporcional à concentração de fosfato conforme originalmente contida na amostra. A determinação colorimétrica da quantidade de fosfato pode ser realizada usando-se um analisador BioProfile Chemistry Analyzer 300 (Nova Biomedical, Waltham, EUA).
[0043] Em uma modalidade preferencial da invenção, a concentração da(s) fonte(s) de nitrogênio está sempre abaixo de 5,6 x 10-3 mol/l (correspondendo, no caso do amônio como fonte de nitrogênio, a 0,1 g/l de amônio) e a concentração da(s) fonte(s) de fosfato está sempre abaixo de 5,4 x 10-3 mol/l (correspondendo a 0,5 g/l de fosfato) pelo menos durante os últimos 50 ou 70 %, preferencialmente pelo menos durante os últimos 80 %, mais preferencialmente pelo menos durante os últimos 90 %, do período da fase de produção de lipídio.
[0044] Na presente invenção, em uma modalidade especial da invenção, a concentração da(s) fonte(s) de nitrogênio está sempre abaixo de 5,6 x 10-3 mol/l e a concentração da(s) fonte(s) de fosfato está sempre abaixo de 5,4 x 10- 3 mol/l durante a fase completa de produção de lipídio.
[0045] Em uma modalidade muito preferencial da invenção, a concentração da(s) fonte(s) de nitrogênio está sempre abaixo de 2,8 x 10-3 mol/l (correspondendo, no caso do amônio como fonte de nitrogênio, a 0,05 g/l de amônio) e a concentração da(s) fonte(s) de fosfato está sempre abaixo de 5,4 x 10-4 mol/l (correspondendo a 0,05 g/l de fosfato) pelo menos durante os últimos 50 ou 70 %, preferencialmente pelo menos durante os últimos 80 %, mais preferencialmente pelo menos durante os últimos 90 %, do período da fase de produção de lipídio.
[0046] Na presente invenção, em uma modalidade especial da invenção, a concentração da(s) fonte(s) de nitrogênio está sempre abaixo de 2,8 x 10-3 mol/l e a concentração da(s) fonte(s) de fosfato está sempre abaixo de 5,4 x 10- 4 mol/l durante a fase completa de produção de lipídio.
[0047] Em uma outra modalidade preferencial da invenção, a concentração da(s) fonte(s) de nitrogênio e da(s) fonte(s) de fosfato está em zero e/ou sempre abaixo do limite de detecção pelo menos durante os últimos 50 ou 70 %, preferencialmente pelo menos durante os últimos 80 %, mais preferencialmente pelo menos durante os últimos 90 %, do período da fase de produção de lipídio.
[0048] Na presente invenção, em uma modalidade especial da invenção, a concentração da(s) fonte(s) de nitrogênio e da(s) fonte(s) de fosfato está sempre em zero e/ou abaixo do limite de detecção desses compostos, em particular pelo uso dos métodos conforme anteriormente mencionado, durante a fase completa de produção de lipídio.
[0049] Em uma modalidade muito preferencial da invenção, nenhuma fonte de nitrogênio e nenhuma fonte de fosfato é adicionada depois que a(s) fonte(s) de nitrogênio e a(s) fonte(s) de fosfato tiverem sido consumidas pelos microrganismos, devendo-se assumir que a concentração da(s) fonte(s) de nitrogênio e da(s) fonte(s) de fosfato é, na verdade, zero ou pelo menos quase zero nessa modalidade muito preferencial durante a fase completa de produção de lipídio ou pelo menos durante os últimos 70, 80 ou 90 % do período da fase de produção de lipídio.
[0050] Um período preferencial da fase de produção de lipídio é de 50 a 150 horas, mais preferencialmente de 70 a 130 horas, em particular de 90 a 110 horas.
[0051] Os microrganismos que produzem um lipídio contendo PUFAs são descritos extensivamente na técnica anterior. Preferencialmente, são microrganismos eucarióticos. As células usadas podem ser, nesse contexto em particular, células que naturalmente já produzem PUFAs; no entanto, também podem ser células que, como resultado de métodos de engenharia genética adequados ou devido à mutagênese aleatória, mostram uma produção melhorada de PUFAs ou foram tornadas capazes de produzir PUFAs. A produção dos PUFAs pode ser autotrófica, mixotrófica ou heterotrófica. Preferencialmente, os microrganismos são capazes de produzir os PUFAs devido a um sistema semelhante a policetídeo sintase. O sistema semelhante a policetídeo sintase pode ser endógeno ou, devido à engenharia genética, exógeno.
[0052] A biomassa compreende preferencialmente células que produzem PUFAs heterotroficamente. As células de acordo com a invenção são preferivelmente selecionadas a partir de algas, fungos, particularmente leveduras, bactérias ou protistas. As células adequadas de leveduras produtoras de óleo são, em particular, cepas de Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces. As células são mais preferivelmente algas microbianas, microalgas ou fungos.
[0053] As células adequadas de algas produtoras de óleo e microrganismos similares a algas são, em particular, microrganismos selecionados a partir do filo Stramenopiles
(também denominado Heterokonta). Os microrganismos do filo Stramenopiles podem ser em particular selecionados a partir dos seguintes grupos de microrganismos: Hamatores, Proteromonads, Opalines, Developayella, Diplophrys, Labrinthulids, Thraustochytrids, Biosecids, Oomycetes, Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, Diatoms, Xanthophytes, Phaeophytes (algas marrons), Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (incluindo Rhizochromulinales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales, e Chromulinales. Outros grupos preferenciais de microalgas incluem os membros das algas verdes e dinoflagelados, incluindo os membros do gênero Crypthecodinium.
[0054] A biomassa de acordo com a invenção compreende preferencialmente células, e preferencialmente consiste essencialmente em tais células, do táxon Labirintulomicetos (Labyrinthulea, fungos net slime, mofos-em-rede), em particular, aqueles da família Thraustochytriaceae. A família Thraustochytriaceae (também denominada Thraustochytrids) inclui os gêneros Althomia, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Botryochytrium, Elnia, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium, e Ulkenia. A biomassa particularmente compreende preferencialmente células dos gêneros Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Schizochytrium, ou Thraustochytrium, principalmente do gênero Schizochytrium.
[0055] De acordo com a invenção, o ácido graxo poli- insaturado (PUFA) é, preferencialmente, um ácido graxo altamente insaturado (HUFA), em particular um ácido graxo de cadeia longa altamente insaturado (lcHUFA).
[0056] As células presentes na biomassa são preferencialmente distinguidas pelo fato de que contêm pelo menos 20 % em peso, preferencialmente pelo menos 30 % em peso, em particular, pelo menos 35 % em peso, mais preferencialmente pelo menos 40 % em peso, de PUFAs, em cada caso com base na matéria seca celular.
[0057] De acordo com a presente invenção, o termo “lipídio” inclui fosfolipídios; ácidos graxos livres; ésteres de ácidos graxos; triacilgliceróis; diacilgliceróis; monoacilgliceróis; esteróis e ésteres de esterol; carotenoides; xantofilas (por exemplo, oxicarotenoides); hidrocarbonetos; compostos derivados de isoprenoides e outros lipídios conhecidos dos versados na técnica. – Os termos "lipídio" e "óleo" são usados alternadamente de acordo com a invenção.
[0058] Em uma modalidade preferencial da invenção, a maioria dos lipídios está presente na forma de triacilgliceróis, com, de preferência, pelo menos 50 % em peso, em particular, pelo menos 75 % em peso e, em uma modalidade especialmente preferencial, pelo menos 90 % em peso dos lipídios presentes na célula que está presente na forma de triglicerídeos.
[0059] De acordo com a invenção, ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs) são compreendidos de modo a se referir a ácidos graxos que têm pelo menos duas, particularmente pelo menos três, ligações duplas C-C. De acordo com a invenção, os ácidos graxos altamente insaturados (HUFAs) são preferenciais entre os PUFAs. De acordo com a invenção, os HUFAs são compreendidos de modo a se referir a ácidos graxos que têm pelo menos quatro ligações duplas C-C.
[0060] Os PUFAs podem estar presentes na célula em forma livre ou em forma ligada. Exemplos da presença em forma ligada são fosfolipídios e ésteres dos PUFAs, em particular, monoacil-, diacil- e triacilgliceróis. Em uma modalidade preferencial, a maioria dos PUFAs está presente na forma de triacilgliceróis, com, de preferência, pelo menos 50 % em peso, em particular, pelo menos 75 % em peso e, em uma modalidade especialmente preferencial, pelo menos 90 % em peso dos PUFAs presentes na célula que está presente na forma de triacilgliceróis.
[0061] Preferencialmente, os lipídios conforme contidos nas células compreendem PUFAs em uma quantidade maior que 15 % em peso, preferencialmente maior que 20, 25 ou 30 % em peso, mais preferencialmente maior que 35 ou 40 % em peso, mais preferencialmente ainda maior que 45 ou 50 % em peso, e com a máxima preferência maior que 55 % em peso.
[0062] Os PUFAs preferenciais são ácidos graxos ômega-3 e ácidos graxos ômega-6, sendo que os ácidos graxos ômega-3 são especialmente preferenciais. Os ácidos graxos ômega-3 preferenciais aqui são o ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5ω-3), particularmente o ácido (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)- eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoico e o ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6ω-3), particularmente o ácido (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoico.
[0063] Em uma modalidade muito preferencial da presente invenção, células, em particular, uma cepa de
Schizochytrium, é empregada, a qual produz uma quantidade significativa de EPA e DHA, simultaneamente, em que DHA é preferencialmente produzido em uma quantidade de pelo menos 20 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de pelo menos 30 % em peso, em particular, em uma quantidade de 30 a 50 % em peso, e EPA é produzido em uma quantidade de pelo menos 5 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de pelo menos 10 % em peso, em particular, em uma quantidade de 10 a 20 % em peso (em relação à quantidade total de lipídio como contido nas células, respectivamente). As cepas de Schizochytrium que produzem DHA e EPA podem ser obtidas pela mutagênese consecutiva seguida da seleção adequada de cepas mutantes que demostra produção de EPA e DHA superior e uma razão específica entre EPA:DHA sob condições específicas de cultivo. Qualquer agente químico ou não químico (por exemplo, radiação ultravioleta (UV)) com capacidade para incluir alteração genética para a célula microbiana pode ser usado como o mutagênico. Esses agentes podem ser usados em separado ou em combinação entre si, e os agentes químicos podem ser usados puros ou com um solvente. Esses métodos são bem conhecidos dos versados na técnica.
[0064] As espécies preferenciais de microrganismos do gênero Schizochytrium, as quais produzem EPA e DHA simultaneamente, estão depositadas sob Número de Acesso ATCC PTA-9695, PTA-9696, PTA-9697, PTA-9698, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, ou PTA-10211, PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215.
[0065] Os métodos para produzir a biomassa, em particular, uma biomassa que compreende células contendo lipídios, em particular, PUFAs, particularmente da ordem Thraustochytriales, são descritos em detalhes na técnica anterior (consultar, por exemplo, documentos WO91/07498, WO94/08467, WO97/37032, WO97/36996, WO01/54510). Como regra, a produção ocorre por células sendo cultivadas em um fermentador na presença de uma fonte de carbono e de uma fonte de nitrogênio, juntamente a diversas substâncias adicionais, como minerais que permitem o crescimento dos microrganismos e a produção dos PUFAs. Nesse contexto, as densidades de biomassa de mais que 100 gramas por litro e taxas de produção de mais que 0,5 grama de lipídio por litro por hora podem ser alcançadas. O método é realizado, de preferência, no que é conhecido como um método de batelada alimentada, isto é, as fontes de carbono e nutrientes adicionais são alimentadas gradualmente durante a fermentação. Quando a biomassa desejada tiver sido obtida, a produção de lipídio é induzida conforme anteriormente descrito.
[0066] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, as células são cultivadas na fase de crescimento de densidade de biomassa até que alcancem uma densidade de biomassa de pelo menos 80 ou 100 g/l, mais preferencialmente de pelo menos 120 ou 140 g/l, em particular de pelo menos 160 ou 180 g/l, especialmente pelo menos 200 g/l (calculada como teor de matéria seca). Tais processos são, por exemplo, revelados no documento US
7.732.170.
[0067] A determinação da densidade de biomassa pode ser realizada por análise gravimétrica: Para realizar isso, uma amostra do caldo de fermentação com um volume específico é pesada antes e após a secagem por congelamento. O peso restante da amostra seca corresponde à biomassa como contida naquele volume específico do caldo de fermentação.
[0068] De preferência, as células são fermentadas em um meio com baixa salinidade, em particular, de modo a evitar corrosão. Isso pode ser alcançado usando-se sais de sódio livre de cloro como a fonte de sódio em vez de cloreto de sódio, como, por exemplo, sulfato de sódio, carbonato de sódio, carbonato de sódio e hidrogênio ou soda calcinada (uma mistura de carbonato de sódio e óxido de sódio). De preferência, cloreto é usado na fermentação em quantidades de menos que 3 g/l, em particular, menos que 500 mg/l, especialmente de preferência, menos que 100 mg/l.
[0069] A concentração de sódio é (expressa em g/l de Na) preferencialmente de pelo menos cerca de 1 g/l, mais preferencialmente está na faixa de 1 g/l a 50 g/l e mais preferencialmente na faixa de 2 g/l a 25 g/l.
[0070] As fontes de carbono adequadas são ambas as fontes de carbono alcoólica e não alcoólica. Exemplos de fontes de carbono alcoólicas são metanol, etanol, isopropanol e glicerol. Exemplos de fontes de carbono não alcoólicas são frutose, glicose, sacarose, melados, amido, em particular amido de milho, xarope de milho, cana-de- açúcar e açúcar de beterraba. Os ácidos graxos, na forma de ácidos hidróxi graxos, triacilglicerídeos, e di- e monoacilglicerídeos também podem servir como a fonte de carbono. Uma faixa adequada da quantidade de fonte de carbono necessária para um microrganismo em particular durante um processo de fermentação é bem conhecida dos versados na técnica.
[0071] As células são, de preferência, fermentadas a um pH de 3 a 11, em particular, 4 a 10 e, de preferência, a uma temperatura de pelo menos 15 °C, em particular, 20 a 40 °C, mais preferencialmente pelo menos 24 °C, em particular pelo menos 28 °C. Um processo de fermentação típico leva até aproximadamente 200 horas. Uma fase de produção de lipídio típica desse processo de fermentação leva até cerca de 100 horas.
[0072] Os processos da presente invenção preferencialmente fornecem uma taxa média de produção de lipídio de pelo menos cerca de 0,3 g/l/h, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 0,4 g/l/h, em particular de pelo menos cerca de 0,5 g/l/h, e com a máxima preferência de pelo menos cerca de 0,6 g/l/h.
[0073] Preferencialmente, os processos da presente invenção fornecem uma taxa média de produção de PUFA de pelo menos cerca de 0,2 g de PUFAs/l/h, em particular de pelo menos cerca de 0,3 g de PUFAs/l/h, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 0,4 g de PUFAs/l/h, e com a máxima preferência de pelo menos cerca de 0,5 g de PUFAs/l/h, em que os PUFAs se referem preferencialmente a uma mistura de DHA e EPA.
[0074] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, os microrganismos são cultivados em um processo de batelada alimentada. Um processo de batelada alimentada é um processo de fermentação em que um ou mais substratos são adicionados em incrementos.
[0075] Os processos da presente invenção para o cultivo de microrganismos incluem uma fase de crescimento de densidade de biomassa. Na fase de crescimento de densidade de biomassa, o objetivo primário do processo de fermentação é aumentar a densidade de biomassa no meio de fermentação para se obter as densidades de biomassa descritas acima. A taxa de fornecimento da fonte de carbono é tipicamente mantida em um nível ou faixa particular que não gera um efeito prejudicial significativo sobre a produtividade de biomassa dos microrganismos, ou a viabilidade dos microrganismos resultante de capacidades insuficientes dos equipamentos de fermentação de retirar calor e transferir gases para e do caldo líquido.
[0076] A fase de crescimento de densidade de biomassa ocorre em uma típica fermentação técnica em diferentes fases, por exemplo, a fermentação pode compreender um estágio pré-semente ou diversos estágios pré-semente, e um estágio de semente que é finalmente transferido para a fermentação em estágio de produção.
[0077] Em uma modalidade preferencial da invenção, todas as fontes de nutrientes limitantes, em particular as fontes de nitrogênio e fosfato limitantes, estão continuamente presentes em grande abundância antes do início da fase de produção de lipídio para permitir o máximo crescimento da biomassa. Isso significa, em particular, que a presença das fontes de nitrogênio e fosfato limitantes ainda é detectável no caldo de fermentação por aplicação para medição dos métodos conforme anteriormente mencionado, quando o estágio de pré-semente ou de semente tiver terminado e o caldo de fermentação resultantes tiver sido adicionalmente transferido para o próximo estágio de fermentação. Entretanto, as concentrações também não devem ser muito altas para evitar efeitos prejudiciais sobre os microrganismos. Preferencialmente, antes do início da fase de produção de lipídio, a concentração da(s) fonte(s) de nitrogênio limitante está sempre bem acima de 5,6 x 10- 3 mol/l (correspondendo a 0,1 g/l de amônio) e a concentração da(s) fonte(s) de fosfato limitante está sempre bem acima de 5,4 x 10-3 mol/l (correspondendo a 0,5 g/l de fosfato).
[0078] Os processos da presente invenção para o cultivo de microrganismos também incluem uma fase de produção de lipídio. Nessa fase, o uso primário do substrato pelos microrganismos não está aumentando a densidade de biomassa, mas sim o uso do substrato para produzir lipídios. Deve ser entendido que os lipídios também são produzidos pelos microrganismos em menores quantidades durante a fase de crescimento de densidade de biomassa; entretanto, como declarado acima, o objetivo primário na fase de crescimento de densidade de biomassa é aumentar a densidade de biomassa.
[0079] O nível de oxigênio dissolvido (OD) no meio de fermentação durante a fase de crescimento de densidade de biomassa é preferencialmente de pelo menos cerca de 8 % de saturação, e preferencialmente entre 10 % e 20 % de saturação; durante a fase de produção, o oxigênio dissolvido no meio de fermentação é normalmente mantido na mesma faixa que na fase de crescimento de densidade de biomassa, porém também pode ser reduzida a cerca de 3 % de saturação ou menos. No início da fermentação, o OD pode estar na ou próximo da saturação e conforme os microrganismos crescem, pode ser permitido oscilar até esses baixos pontos de ajuste de OD. Em uma modalidade em particular da presente invenção, a quantidade de nível de oxigênio dissolvido no meio de fermentação é variada durante o processo de fermentação.
[0080] A quantidade de oxigênio dissolvido presente no meio de fermentação pode ser controlada controlando-se a quantidade de oxigênio no espaço vazio do fermentador aumentando-se ou diminuindo-se a taxa de aeração, controlando-se a velocidade na qual o meio de fermentação é agitado, ou controlando-se a contrapressão no meio, ou por uma combinação desses parâmetros. Por exemplo, uma alta taxa de agitação e/ou uma alta taxa de aeração resulta em uma quantidade relativamente maior de oxigênio dissolvido no meio de fermentação em comparação a uma baixa taxa de agitação e/ou baixa taxa de aeração.
[0081] Após a fermentação ter sido finalizada, as células podem ser pasteurizadas a fim de exterminar as células e desativar as enzimas que podem promover degradação de lipídio. A pasteurização é preferencialmente realizada aquecendo-se a biomassa a uma temperatura de 50 a 121 °C, preferencialmente 50 a 70 °C, por um período de 5 a 80 minutos, em particular, 20 a 60 minutos.
[0082] Do mesmo modo, após a fermentação ter sido finalizada, antioxidantes podem ser adicionados a fim de proteger os PUFAs presentes na biomassa da degradação oxidativa. Os antioxidantes preferenciais nesse contexto são BHT, BHA, TBHA, galato, propil-galato, etoxiquina, betacaroteno, vitamina E e vitamina C. O antioxidante, se usado, é preferencialmente adicionado em uma quantidade de 0,01 a 2 % em peso.
[0083] Quaisquer métodos de isolamento atualmente conhecidos podem ser usados para isolar microrganismos do meio de fermentação, incluindo centrifugação, filtração, ultrafiltração, decantação e evaporação de solvente.
[0084] Em uma modalidade preferencial da invenção, após a fermentação dos microrganismos eucarióticos, ocorre um processo de recuperação de lipídio. A recuperação de lipídio pode, por exemplo, compreender a remoção de água do dito meio de fermentação para fornecer microrganismos secos; e subsequentemente o isolamento dos ditos lipídios a partir dos ditos microrganismos. A etapa de remoção de água pode compreender a secagem do caldo de fermentação tanto diretamente quanto após a concentração do caldo de fermentação em um secador de tambor ou em um granulador de leito fluidizado sem centrifugação prévia.
[0085] O processo de recuperação de lipídio também pode alternativamente compreender o tratamento do caldo de fermentação para a permeabilização, lise ou ruptura das células microbianas e, subsequentemente, a recuperação dos lipídios a partir do caldo de fermentação por separação por gravidade, e preferencialmente a centrifugação, com ou sem o auxílio de um solvente solúvel em água para auxiliar na ruptura da emulsão lipídio/água. Os processos de lise das células no caldo de fermentação são, por exemplo, descritos nos documentos WO 2001/053512, WO 2002/010423, WO 2011/153246, WO 2015/095694 e WO 2015/095696. Os processos preferenciais de recuperação dos lipídios quando as células estiverem permeabilizadas, rompidas ou lisadas no caldo de fermentação (o que permite que a emulsão lipídica seja rompida e que a fração rica em lipídios seja recuperada) incluem o processo de remoção de óleo descrito no documento
WO 96/05278. Nesse processo, um composto solúvel em água, por exemplo, álcool ou acetona, é adicionado à emulsão de óleo/água para romper a emulsão e a mistura resultante é separada por separação por gravidade, por exemplo, centrifugação. Esse processo também pode ser modificado para usar outros agentes (solúvel em água e/ou lipídio) para romper a emulsão.
[0086] Microrganismos, lipídios extraídos destes, a biomassa remanescente após a extração do lipídio ou combinações destes podem ser usados diretamente como um ingrediente alimentício, como um ingrediente em bebidas, molhos, alimentos à base de laticínios (como leite, iogurte, queijo e sorvete) e produtos assados; suplemento nutricional (nas formas de cápsula ou comprimido); alimento ou suplemento alimentar para qualquer animal cuja carne ou produtos são consumidos por humanos; suplemento alimentar, incluindo alimentos para bebês e fórmulas infantis; e produtos farmacêuticos (em aplicação direta ou terapia auxiliar). O termo “animal” significa qualquer organismo que pertence ao reino Animalia e inclui, sem limitação, qualquer animal do qual deriva carne de ave, fruto do mar, carne bovina, carne de porco ou carne de cordeiro. Os frutos do mar são derivados de, sem limitação, peixe, camarão e crustáceos. O termo “produtos” inclui qualquer produto, que não carne, derivado dos ditos animais, incluindo, sem limitação, ovos, leite ou outros produtos. Quando alimentados a tais animais, lipídios poli- insaturados podem ser incorporados na carne, leite, ovos ou outros produtos de tais animais, para aumentar o seu teor desses lipídios.
Exemplos Exemplo 1: Produção de lipídio contendo biomassa de Schizochytrium sp ATCC PTA-9695 por limitação simples de amônia na transição para a fase de produção de lipídio da fermentação principal.
[0087] As culturas foram inoculadas com 10 % (peso/peso) de uma fermentação de semente de ATCC PTA-9695 e as células foram cultivadas por cerca de 192 horas no total em fermentadores de 10 L com uma massa inicial de 7,5 litros e uma massa final de 10 litros. Durante a fermentação, uma solução de dextrose de 85 % (peso/volume) foi alimentada para manter uma concentração de glicose de cerca de 50 g/l no caldo de fermentação. Na fase de formação de biomassa (cerca de 60 horas do tempo de fermentação), a concentração de amônia no caldo foi mantida em uma faixa entre 0,2 e 0,4 g/l. Em determinados intervalos, solução de KH2PO4 foi adicionada para manter a concentração de fosfato entre 0,5 e 2 g/l durante todo o tempo da fermentação. O ponto de viragem do pH foi mantido por titulação com água de amônia dentro do fermentador. Após cerca de 60 horas de fermentação, decidiu-se iniciar a transição para a fase de produção de óleo interrompendo a titulação de água de amônia, levando à completa exaustão na amônia do caldo, e em vez disso mudar para a titulação com NaOH, enquanto a titulação com KH2PO4 foi mantida. Particularmente, o fosfato foi mantido durante a fase de produção de óleo em uma concentração de cerca de 0,5 g/l em um ciclo e em uma concentração de cerca de 1,5 g/l em um outro ciclo. O nível de oxigênio dissolvido (OD) foi mantido a 20 % de saturação ou mais no caldo durante toda a fermentação. O OD foi controlado pela velocidade do agitador.
[0088] O meio inicial do fermentador principal tinha a seguinte composição: Composto Fórmula Faixas Concentração opcionais Sulfato de g/l 8,8 0-25, 2-20 sódio NaSO4 ou 3-10 Cloreto de g/l 0,625 0-25, 0,1-10 sódio NaCl ou 0,5-5 Cloreto de g/l 1 0-5, 0,25-3 potássio KCl ou 0,5-2 Sulfato de g/l 5 0-10, 2-8 ou magnésio MgSO4 * 7H2O 3-6 Sulfato de g/l 0,42 0-10, 0,25-5 amônio (NH4+)2SO4 ou 0,05-3 Cloreto de g/l 0,29 0,1-5, 0,15- cálcio CaCl2 * 2H2O 3 ou 0,2-1 Extrato de g/l 1 0-20, 0,1-10 levedura ou 0,5-5 Fosfato g/l 1,765 0,1-10, 0,5- KH2PO4 monopotássico 5 ou 1-3 Pós-autoclave (Metais) mg/l 46,82 0,1-5000, Ácido cítrico 10-3000 ou C6H8O7 * H2O 40-2500 Sulfato ferroso mg/l 10,3 0,1-100, 1- (II)+ FeSO4 * 7H2O 50 ou 5-25
Composto Fórmula Faixas Concentração opcionais Cloreto de mg/l 3,1 0,1-100, 1- manganês MnCl2 * 4H2O 50 ou 2-25 Sulfato de mg/l 9,3 0,01-100, 1- zinco ZnSO4 * 7H2O 50 ou 2-25 mg/l 0,04 0-1, 0,001- Molibdato de Na2MoO4 * 0,1 ou 0,01- sódio 2H2O 0,1 mg/l 2,07 00,1-100, Sulfato de CuSO4 * 5H2O 0,5-50 ou 1- cobre 25 mg/l 2,07 0,1-100, Sulfato de 0,5-50 ou 1- níquel NiSO4 * 6H2O 25
Pós-autoclave (Vitaminas) Cloridrato de mg/l 0,1-100, 1- C12H18Cl2N4OS 9,75 tiamina 50 ou 5-25 D(+)- mg/l 0,1-100, pantotenato de C18H32Ca14N2O10 3,33 0,1-50 ou 1- cálcio 10 mg/l 0,1-100, Biotina 1 % C10H16N2O3S 0,00358 0,1-50 ou 1- D(+) 10
Pós-autoclave (Carbono)
Composto Fórmula Faixas Concentração opcionais Dextrose C6H12O6 g/l 30 5-150, 10- 100 ou 20-50 Adição alvo de Alimentação de alimentação de nitrogênio nitrogênio Faixas opcionais NH4OH (28-30 % 0-150, 10-100 ou p/p) 23,6 ml/l 15-50
[0089] As condições de cultivo foram as seguintes: Faixas Parâmetro Valor opcionais Observação 18-30; 20-27; Temperatura 22,5 °C 22-25 Oxigênio Dissolvido 10-100; 15- (OD) ≥ 20 % 75; 20-60 Controlado pela 6,5-7,5; 6,7- adição de água de pH 7,0 7,3; 6,8-7 amônia ou NaOH
[0090] Após um tempo de fermentação de 192 h no total, o processo de fermentação foi interrompido aquecendo-se o caldo a 60 °C por 20 minutos, o que interrompeu o metabolismo das células. Subsequentemente, determinou-se a quantidade total de óleo conforme produzido pelas células. - Ocorreu que a interrupção do fornecimento de nitrogênio, enquanto simultaneamente manteve-se o fornecimento de fosfato em concentrações de cerca de 500 mg/l ou cerca de 1500 mg/l, resultou em um teor final de gordura total nas células de 47 e 43 %, respectivamente. Exemplo 2: Produção de lipídio contendo biomassa de Schizochytrium sp ATCC PTA-9695 por limitação simples de PO4 na transição para a fase de produção de lipídio da fermentação principal
[0091] As culturas foram inoculadas com 10 % (peso/peso) de uma fermentação de semente de ATCC PTA-9695 e as células foram cultivadas por cerca de 192 horas no total em fermentadores de 10 L com uma massa inicial de 7,5 litros e uma massa final de 10 litros. Durante a fermentação, uma solução de dextrose de 85 % (peso/volume) foi alimentada para manter uma concentração de glicose de cerca de 50 g/l no caldo de fermentação. Na fase de formação de biomassa (cerca de 60 horas do tempo de fermentação), a concentração de fosfato no caldo foi mantida entre 500 e 2000 mg/l pela adição de solução de KH2PO4 em determinados intervalos. Para iniciar a fase de produção de óleo, permitiu-se que a concentração de PO4 caísse continuamente até ficar completamente exaurida do caldo. A concentração de amônia foi mantida durante toda a fermentação, e em particular durante a fase de produção de óleo, em uma faixa entre 0,2 a 0,4 g/l. O ponto de viragem do pH foi mantido por titulação com água de amônia dentro do fermentador ou por titulação de uma combinação de água de amônia e NaOH. O nível de oxigênio dissolvido (OD) foi mantido a 20 % de saturação ou mais no caldo durante toda a fermentação. O OD foi controlado pela velocidade do agitador.
[0092] O meio inicial do fermentador principal tinha a seguinte composição: Composto Fórmula Concentração Faixas g/l 8,8 0-25, 2-20 ou Sulfato de sódio NaSO4 3-10 g/l 0,625 0-25, 0,1-10 Cloreto de sódio NaCl ou 0,5-5 Cloreto de g/l 1 0-5, 0,25-3 potássio KCl ou 0,5-2 Sulfato de MgSO4 * g/l 5 0-10, 2-8 ou magnésio 7H2O 3-6 g/l 0,42 0-10, 0,25-5 Sulfato de amônio (NH4+)2SO4 ou 0,05-3 CaCl2 * g/l 0,29 0,1-5, 0,15-3 Cloreto de cálcio 2H2O ou 0,2-1 Extrato de g/l 1 0-20, 0,1-10 levedura ou 0,5-5 Fosfato g/l 1,765 0,1-10, 0,5-5 KH2PO4 monopotássico ou 1-3
Pós-autoclave (Metais) mg/l 46,82 0,1-5000, 10- Ácido cítrico C6H8O7 * 3000 ou 40- H2O 2500 Sulfato ferroso FeSO4 * mg/l 10,3 0,1-100, 1-50 (II)+ 7H2O ou 5-25 Cloreto de MnCl2 * mg/l 3,1 0,1-100, 1-50 manganês 4H2O ou 2-25
Composto Fórmula Concentração Faixas ZnSO4 * mg/l 9,3 0,01-100, 1- Sulfato de zinco 7H2O 50 ou 2-25 mg/l 0,04 0-1, 0,001- Molibdato de Na2MoO4 * 0,1 ou 0,01- sódio 2H2O 0,1 mg/l 2,07 00,1-100, CuSO4 * Sulfato de cobre 0,5-50 ou 1- 5H2O 25 NiSO4 * mg/l 2,07 0,1-100, 0,5- Sulfato de níquel 6H2O 50 ou 1-25
Pós-autoclave (Vitaminas) Cloridrato de C12H18Cl2N4 mg/l 0,1-100, 1-50 9,75 tiamina OS ou 5-25 D(+)-pantotenato C18H32Ca14N mg/l 0,1-100, 0,1- 3,33 de cálcio 2O10 50 ou 1-10 mg/l 0,0035 0,1-100, 0,1- Biotina 1 % D(+) C10H16N2O3S 8 50 ou 1-10
Pós-autoclave (Carbono) Dextrose C6H12O6 g/l 30 5-150, 10-100 ou 20-50
Adição alvo Alimentação de de Faixa fosfato alimentação de fosfato Solução de KH2PO4 (8,75 % p/p) 40 ml/l 5-150, 15-100 ou 20-75
[0093] As condições de cultivo foram as seguintes: Parâmetro Valor Faixas Observação 18-30; 20-27; Temperatura 22,5 °C 22-25 Oxigênio Dissolvido 10-100; 15- (OD) ≥ 20 % 75; 20-60 Controlado pela 6,5-7,5; 6,7- adição de água de pH 7,0 7,3; 6,8-7 amônia e/ou NaOH
[0094] Após um tempo de fermentação de 192 h no total, o processo de fermentação foi interrompido aquecendo-se o caldo a 60 °C por 20 minutos, o que interrompeu o metabolismo das células. Subsequentemente, determinou-se a quantidade total de óleo conforme produzido pelas células. - Ocorreu que a interrupção do fornecimento de fosfato, enquanto simultaneamente manteve-se o fornecimento de amônia em concentrações entre 0,2 e 0,4 g/l, resultou em um teor final de gordura total nas células de entre 50 e 60 %. Exemplo 3: Produção de lipídio contendo biomassa de Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695 por limitação simultânea de amônia e fosfato na transição para a fase de produção de lipídio da fermentação principal:
[0095] Essa fermentação foi realizada essencialmente sob as mesmas condições conforme descrito no “Exemplo 1” com a solução de KH2PO4 sendo adicionada somente na fase de formação de biomassa da fermentação para manter a concentração de fosfato entre 500 e 2000 mg/l. Após a fase de formação de biomassa, permitiu-se que a concentração de fosfato caísse continuamente sem mais adições de solução de KH2PO4. Ao eliminar a adição da solução de KH2PO4, a cultura passa a sofrer uma limitação simultânea de amônia e fosfato. - Ocorreu que a interrupção tanto do fornecimento de fosfato quanto do fornecimento de amônia proporcionou o melhor rendimento de gordura total final nas células, a saber, uma quantidade de gordura total de cerca de 70 %.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Método caracterizado por ser de produção de lipídios contendo ácidos graxos poli-insaturados provenientes de microrganismos capazes de produzir pelo menos cerca de 10 % em peso de sua biomassa na forma de lipídios, que compreende uma fase de crescimento de densidade de biomassa e uma fase de produção de lipídio, que compreende a) adicionar, durante a fase de crescimento de densidade de biomassa, a um meio de fermentação contendo os ditos microrganismos, uma fonte de carbono e pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes a uma taxa suficiente para aumentar a densidade de biomassa do dito meio de fermentação até pelo menos 50 g/l, e b) interromper ou reduzir significativamente o fornecimento de pelo menos duas das ditas fontes de nutrientes limitantes na fase de produção de lipídio, enquanto o fornecimento de uma fonte de carbono ainda é mantido.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, ao interromper ou reduzir significativamente o fornecimento das pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes, as quantidades das ditas fontes de nutrientes limitantes caem para concentrações em que os microrganismos produtores de lipídios são privados das ditas fontes de nutrientes limitantes.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os microrganismos produtores de lipídios estão privados de ambas as ditas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes durante pelo menos 30 % do tempo da fase de produção de lipídio, preferencialmente durante pelo menos 40, 50 ou 60 % do tempo da fase de produção de lipídio, especialmente durante pelo menos 70, 80 ou 90 % do tempo da fase de produção de lipídio.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a concentração de ambas as ditas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes cai abaixo de 0,01 mol/l, mais preferencialmente abaixo de 0,005 mol/l, especialmente abaixo de 0,003 mol/l, em particular a zero e/ou abaixo do limite de detecção daquelas fontes de nutrientes limitantes, no decorrer da fermentação.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as concentrações das ditas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes caem abaixo de 0,01 mol/l, mais preferencialmente abaixo de 0,005 mol/l, especialmente abaixo de 0,003 mol/l, em particular a zero e/ou abaixo do limite de detecção daquelas fontes de nutrientes limitantes, dentro de 40 horas, preferencialmente dentro de 30 horas, mais preferencialmente dentro de 20 horas, após o início da fase de produção de lipídio.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as concentrações das ditas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes estão abaixo de 0,01 mol/l, mais preferencialmente abaixo de 0,005 mol/l, especialmente abaixo de 0,003 mol/l, em particular zero e/ou abaixo do limite de detecção daquelas fontes de nutrientes limitantes pelo menos durante os 40 % finais completos, mais preferencialmente pelo menos durante os 50 % finais completos, mais preferencialmente pelo menos durante os 60, 70 ou 80 % finais completos, do tempo da fase de produção de lipídio.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as concentrações das ditas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes estão abaixo de 0,01 mol/l, mais preferencialmente abaixo de 0,005 mol/l, especialmente abaixo de 0,003 mol/l, em particular zero e/ou abaixo do limite de detecção daquelas fontes de nutrientes limitantes, pelo menos durante as últimas 20 horas da fermentação, mais preferencialmente pelo menos durante as últimas 40 horas da fermentação, em particular pelo menos durante as últimas 60 horas da fermentação.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as ditas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes são selecionadas a partir do grupo que consiste em fontes de nitrogênio, fontes de fosfato, fontes de vitamina (por exemplo, fontes de vitamina B2, fontes de pantotenato, fontes de tiamina), fontes de metais em traços (por exemplo, fontes de zinco, fontes de cobre, fontes de cobalto, fontes de níquel, fontes de ferro, fontes de manganês, fontes de molibdênio), e fontes de metais em quantidades maiores (por exemplo, fontes de magnésio, fontes de cálcio, fontes de sódio, fontes de potássio), fontes de sílica e misturas destas.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as ditas pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes são uma fonte de nitrogênio e uma fonte de fosfato.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a dita fonte de nitrogênio compreende um sal inorgânico de amônio, em particular hidróxido de amônio, ou amônia ou misturas destes.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a fonte de fosfato compreende ácido fosfórico ou sais inorgânicos de fosfato, em particular di-hidrogenofosfato de potássio, ou misturas destes.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que, na fase de produção de lipídio, a quantidade da(s) fonte(s) de nitrogênio é reduzida abaixo de uma concentração de 5,6 x 10-3 mol/l e a quantidade da(s) fonte(s) de fosfato é reduzida abaixo de uma concentração de 5,4 x 10-3 mol/l dentro de um intervalo de não mais que 40 horas, preferencialmente de não mais que 30 ou 20 horas.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que, na fase de produção de lipídio, a quantidade da(s) fonte(s) de nitrogênio e da(s) fonte(s) de fosfato é reduzida a zero e/ou abaixo do limite de detecção daqueles compostos dentro de um intervalo de não mais que 40 horas, preferencialmente de não mais que 30 horas, mais preferencialmente de não mais que 20 ou 10 horas.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que a concentração da(s) fonte(s) de nitrogênio está sempre abaixo de 5,6 x 10-3 mol/l e a concentração da(s) fonte(s) de fosfato está sempre abaixo de 5,4 x 10-3 mol/l pelo menos durante os últimos 75 %, preferencialmente pelo menos durante os últimos 80 %, mais preferencialmente pelo menos durante os últimos 90 %, do tempo da fase de produção de lipídio.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que, durante a fase de produção de lipídio, o fornecimento das pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes é interrompido.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que, durante a fase de produção de lipídio, o fornecimento de pelo menos uma das, preferencialmente todas as pelo menos duas fontes de nutrientes limitantes, é mantido.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a fase de crescimento de densidade de biomassa é realizada até que seja atingida uma densidade de biomassa de pelo menos 80 g/l, preferencialmente de pelo menos 100 g/l, mais preferencialmente de pelo menos 120 g/l, em particular de pelo menos 150 g/l.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os microrganismos são capazes de produzir pelo menos cerca de 20 % em peso, preferencialmente pelo menos cerca de 30 % em peso, mais preferencialmente pelo menos cerca de 40 % em peso de sua biomassa na forma de lipídios.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 15 % em peso dos lipídios produzidos são lipídios poli-insaturados.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os microrganismos são selecionados entre algas, fungos, protistas, bactérias, microalgas, células de plantas, e misturas destas, em que as microalgas são preferencialmente selecionadas entre o filo Stramenopiles, em particular da família de Thraustochytrids, preferencialmente do gênero Schizochytrium.
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