BR112020023222A2 - método de isolamento de lipídios a partir de uma biomassa contendo lipídios lisados por inversão por emulsão - Google Patents

Abstract

“método de isolamento de lipídios a partir de uma biomassa contendo lipídios lisados por inversão por emulsão”. a presente invenção se refere a um método para separar os lipídios de uma biomassa contendo lipídios pela desemulsificação sob condições brandas, a um óleo e a uma biomassa deslipidada como obtido por tal método.

Description

“MÉTODO DE ISOLAMENTO DE LIPÍDIOS A PARTIR DE UMA BIOMASSA CONTENDO LIPÍDIOS LISADOS POR INVERSÃO POR EMULSÃO”

[0001] A presente invenção se refere a um método para separar os lipídios de uma biomassa contendo lipídios pela desemulsificação sob condições brandas.

[0002] Os lipídios contendo PUFAs (ácidos graxos poli- insaturados) são de grande interesse na indústria de ração, alimentos e na indústria farmacêutica. Devido à sobrepesca, há uma grande necessidade de fontes alternativas de lipídios contendo PUFAs além de óleo de peixe. Constatou-se que, além de certas cepas de levedura e alga, em particular, células de microalga, como aquelas da ordem Thraustochytriales, são uma fonte muito boa de lipídios contendo PUFAs.

[0003] Porém, em relação a organismos microbianos e, em particular, células da ordem Thraustochytriales, as quais produzem os lipídios contendo PUFAs, o isolamento do óleo das células se mostrou um problema particular. A maneira mais eficaz de isolar o óleo consistia no uso de solventes orgânicos como hexano. Porém, o uso de solventes orgânicos resulta em condições operacionais perigosas, exige o uso de equipamento à prova de explosão dispendioso e exige a implementação de um processo de recuperação de solvente dispendioso para evitar a poluição do ambiente.

[0004] Em uma tentativa de evitar o uso de solventes orgânicos, como uma alternativa eficaz de isolar o óleo, encontrou-se a relargagem do óleo com grandes quantidades de cloreto de sódio. Porém, o uso de grandes quantidades de cloreto de sódio resulta em um subproduto de biomassa deslipidada que, devido ao alto teor de sal, não pode ser utilizado como um ingrediente de ração, para que o processo não seja muito sustentável. Além disso, a alta concentração de sal resulta em corrosão rápida do equipamento de aço usado.

[0005] Desse modo, era um objetivo da presente invenção fornecer um método eficaz para isolar um lipídio, em particular, um lipídio contendo PUFAs, de células contendo lipídios, em particular, da ordem Thraustochytriales, e evitar simultaneamente não apenas a necessidade de solventes orgânicos, porém também evitar a necessidade de grandes quantidades de sais e, de preferência, também evitar o uso de grandes quantidades de base e/ou um alto pH para realizar o isolamento eficaz do óleo das células.

[0006] Também era um objetivo da presente invenção fornecer um método para isolar um lipídio, em particular, um lipídio contendo PUFAs, de células contendo lipídios, em particular, da ordem Thraustochytriales, e fornecer simultaneamente uma biomassa deslipidada que pode ser utilizada de uma maneira comercial, preferencialmente no campo agrícola.

[0007] Revelou-se que uma separação eficaz do lipídio da fase aquosa que contêm debris celulares pode ser surpreendentemente realizada, se a biomassa, em particular, após a lise, for concentrada, até a razão de volume entre o óleo e a água na suspensão exceder o valor de 1. Ao concentrar a suspensão a um teor de óleo muito alto, ocorre uma quebra espontânea da emulsão como contido na suspensão. Essa quebra espontânea da emulsão também é chamada de “desemulsificação” ou “inversão por emulsão” no contexto desse pedido.

[0008] A grande vantagem desse processo consiste no fato de que pode ser executado sem a adição de solventes, sem a adição de sais como cloreto de sódio para a salga do óleo, bem como sem a adição de cáusticos, em particular, sem a adição de produtos cáusticos a altas temperaturas, de modo que um método ecológico, sustentável, bem como brando para isolar os lipídios das células seja fornecido.

[0009] Desse modo, uma primeira matéria da presente invenção é um método de isolamento de um lipídio de uma biomassa contendo lipídio, que compreende as seguintes etapas: a) Fornecer uma suspensão de uma biomassa que compreende células que contêm um lipídio; b) Lisar opcionalmente as células da biomassa; c) Concentrar a suspensão, até a razão de volume entre óleo e água na suspensão exceder o valor de 1; d) Separar a fase leve contendo óleo da água, sais, debris celulares e fase aquosa contendo óleo residual.

[0010] De preferência, a suspensão é concentrada, até a razão de volume entre óleo e água na suspensão alcançar um valor entre 1 e 2, com mais preferência, entre 1 e 1,5, em particular, entre 1 e 1,2.

[0011] Em uma modalidade preferencial da invenção, a suspensão é concentrada a um teor de matéria seca total (TDM) de mais de 60 % em peso, de preferência, a um teor de TDM entre 60 e 98 % em peso ou entre 61 e 98 % em peso, com mais preferência, a um teor de TDM entre 60 e 80 % em peso ou entre 62 a 80 % em peso ou entre 62 e 85 % em peso ou entre 65 e 90 % em peso ou entre 65 e 80 % em peso, em particular, a um teor de TDM entre 60 e 75 % em peso ou entre 62 e 75 % em peso.

[0012] De acordo com a invenção, a concentração da suspensão é, de preferência, executada pela evaporação de água a uma temperatura não maior que 100 ºC, de preferência, a uma temperatura de 70 °C a 100 °C, com mais preferência, 80 °C a 90 °C.

[0013] A concentração da suspensão é preferencialmente realizada em um evaporador de circulação forçada (por exemplo, disponível junto à GEA, Alemanha) para permitir uma remoção rápida da água.

[0014] De acordo com a invenção, após fornecer a suspensão de acordo com a etapa (a), de preferência, uma etapa de lise é executada. A etapa de lise pode ser omitida, se - por exemplo, devido às condições de fermentação como aplicado - as células ou uma grande parte das mesmas já forem/for lisada ou facilmente quebrável em uma das seguintes etapas do procedimento sem qualquer etapa de lise explícita.

[0015] A lise das células da biomassa pode ser realizada por métodos como os conhecidos por aqueles versados na técnica, em particular enzimática, mecânica, física ou quimicamente, ou aplicando-se combinações dos mesmos.

[0016] Dependendo do tempo de exposição e/ou do grau de força aplicada, uma composição compreendendo apenas células lisadas ou uma composição compreendendo uma mistura de debris celulares e células intactas pode ser obtida. O termo "biomassa contendo lipídios lisados" se refere, desse modo, a uma suspensão que contém água, debris celulares e óleo como liberados pelas células da biomassa, porém, além disso, também pode compreender outros componentes, em particular, sais, células intactas, outros conteúdos das células lisadas, bem como componentes de um meio de fermentação, em particular, nutrientes. Em uma modalidade preferencial da invenção, apenas pequenas quantidades de células intactas, em particular, menos de 20 %, preferencialmente menos de 10 %, mais preferencialmente menos de 5 % (em relação ao número total de células intactas como presentes antes de lisar as células da biomassa) estão presentes na biomassa lisada após a etapa de lisar as células.

[0017] A lise das células pode ser realizada, por exemplo, com o uso de uma prensa celular francesa, sonicador, homogeneizador, microfluidificador, moinho de bolas, moinho de barras, moinho de seixos, moinho de esferas, rolo de moagem de alta pressão, impactador de eixo vertical, misturador industrial, misturador de alto cisalhamento, misturador de pás e/ou homogeneizador polytron.

[0018] Em uma modalidade preferencial da invenção, a lise das células compreende um tratamento enzimático das células aplicando-se uma enzima degradadora de parede celular.

[0019] De acordo com a invenção, a enzima de degradação de parede celular é, de preferência, selecionada a partir de proteases, celulases (por exemplo, Cellustar CL (Dyadic), Fibrezyme G2000 (Dyadic), Celluclast (Novozymes), Fungamyl (Novozymes), Viscozyme L (Novozymes)), hemicelulases, quitinases, pectinases (por exemplo, Pectinex (Novozymes)), sucrases, maltases, lactases, alfa-glucosidases, beta- glucosidases, amilases (por exemplo, Alphastar Plus (Dyadic); Termamyl (Novozymes)), lisozimas, neuraminidases, galactosidases, alfa-manosidases, glucuronidases, hialuronidases, pululanases, glucocerebrosidases, galactosilceramidases, acetilgalactosaminidases, fucosidases, hexosaminidases, iduronidases, maltases-

glucoamilases, xilanases (por exemplo, Xylanase Plus (Dyadic), Pentopan (Novozymes)), beta-glucanases (por exemplo, Vinoflow Max (Novozymes), Brewzyme LP (Dyadic)), mananases e combinações dos mesmos. A protease pode ser selecionada a partir de serina proteases, treonina proteases, cisteína proteases, aspartato proteases, metaloproteases, ácido glutâmico proteases, alcalases (subtilisinas), e combinações dos mesmos. A quitinase pode ser uma quitotriosidase. A pectinase pode ser selecionada a partir de pectoliases, pectozimas, poligalacturonases e combinações dos mesmos.

[0020] O pH adequado para utilizar a enzima depende do pH ideal da enzima.

[0021] Em uma modalidade preferencial da invenção, uma enzima com um pH ideal entre 7,0 e 9,0, em particular, cerca de 7,5, é usada, de modo que o pH aplicado nessa etapa seja de 7,0 a 9,0, em particular, de 7,0 a 8,0, de preferência, de 7,3 a 7,7. Uma enzima preferencial que pode ser usada nessa faixa de pH é uma alcalase.

[0022] A enzima é preferencialmente adicionada como uma solução de enzima concentrada, preferencialmente em uma quantidade de 0,01 a 1,5 % em peso, mais preferencialmente em uma quantidade de 0,03 a 1,0 % em peso, principalmente em uma quantidade de 0,05 a 0,5 % em peso, em relação à quantidade de solução de enzima concentrada como adicionada em relação à quantidade total da suspensão após adição da solução de enzima concentrada.

[0023] Em uma modalidade muito preferencial da invenção, a lise das células é realizada como a seguir: i) Aquecer a suspensão de (a) a uma temperatura entre

50 °C e 70 °C, preferencialmente a uma temperatura entre 55 °C e 65 °C, e adicionar uma enzima degradadora de parede celular à caldo de fermentação, e ajustar um valor de pH adequado, se necessário, no qual a enzima está funcionando adequadamente; ii) Manter a temperatura e o pH nas faixas como mostrado em (i) por pelo menos uma hora, preferencialmente por pelo menos duas horas, mais preferencialmente por duas a quatro horas.

[0024] Na etapa (i), a enzima pode ser adicionada antes ou após o aquecimento da suspensão e/ou antes ou após o ajuste do pH. Do mesmo modo, o aquecimento da suspensão pode ser realizado antes ou após o ajuste do pH. – Porém, em uma modalidade preferencial, a enzima é adicionada após o aquecimento da suspensão e após o ajuste do pH, se o ajuste do pH for necessário, de todo. – Em uma modalidade muito preferencial, todas as medidas são realizadas mais ou menos simultaneamente.

[0025] De preferência, nas etapas (i) e (ii) bem como nas etapas de método (b) e (c) da invenção, em geral, a suspensão é continuamente misturada com uso de um misturador e/ou um agitador. Em particular, a agitação de cisalhamento baixo e/ou agitação de fluxo axial são aplicadas, em particular, como revelado no documento WO 2015/095694. Impulsores adequados para agitação incluem, em particular, impulsores de pá reta, impulsores de pá Rushton, impulsores de fluxo axial, impulsores de fluxo radial, impulsores de disco de pá côncava, impulsores de alto desempenho, propulsores, palhetas, turbinas e combinações dos mesmos.

[0026] O método de acordo com a invenção é, de preferência, executado em um pH entre 5 e 9, com mais preferência, em um pH entre 5,5 e 8,5. Além disso, a temperatura durante o processo completo não é, de preferência, maior que 100 °C, em particular, abaixo de 90 °C.

[0027] O método de acordo com a invenção compreende, de preferência, como uma etapa adicional, a coleta do lipídio, de preferência, de um lipídio contendo PUFAs, da composição desemulsificada como obtido na etapa (c) pela separação da fase leve contendo óleo da água, sais, debris celulares e fase pesada contendo óleo residual.

[0028] A coleta do lipídio pode compreender, como uma etapa opcional, a neutralização da suspensão desemulsificada, se a desemulsificação não for executada em pH neutro anteriormente.

[0029] A neutralização da composição desemulsificada é, de preferência, realizada, se necessário ou desejado, pela adição de um ácido, de preferência, ácido sulfúrico ou um produto cáustico, em particular, soda cáustica, para ajustar um valor de pH de 5 a 9, de preferência, 5,5 a 8,5, em particular, 6,0 a 8,0 ou 6,5 a 7,5. Antes de iniciar a separação da fase leve da fase pesada, a composição neutralizada pode ser agitada em pH neutro de vários minutos a diversas horas.

[0030] A separação da fase leve contendo óleo da fase pesada contendo água, sais e debris celulares é, de preferência, realizada por meios mecânicos e, de preferência, a uma temperatura de 60-90 °C, com mais preferência, 70-80 °C e a valor de pH de, de preferência, 6- 9, com mais preferência, 7-8,5. “Meios mecânicos” se referem,

em particular, a métodos de filtração e centrifugação como conhecido por aqueles que são versados na técnica.

[0031] Após a separação da fase leve contendo óleo, o óleo então obtido pode ser adicionalmente finalizado aplicando- se os métodos como conhecido por aqueles que são versados na técnica, em particular, refino, branqueamento, desodorização e/ou winterização.

[0032] Em uma modalidade alternativa da invenção, em vez de separar a fase leve contendo óleo da fase aquosa, a própria suspensão concentrada deve ser usada como um produto, em particular, como um ingrediente de composição alimentícia para alimentar animais.

[0033] Então, um objetivo adicional da presente invenção consiste em uma suspensão que contém debris celulares, óleo e água, em que a quantidade de óleo na suspensão é, pelo menos, 50 % em peso, em particular, 50 a 75 % em peso, em que o óleo é, de preferência, um óleo que contém pelo menos 20 % em peso, de preferência, pelo menos 30, 40 ou 50 % em peso de PUFAs e em que a suspensão é, de preferência, caracterizada por conter menos que 0,5 % em peso, com mais preferência, menos que 0,2 ou 0,1 % em peso de solventes e/ou por conter menos que 1 % em peso, com mais preferência, menos que 0,5 ou 0,1 % em peso de cloretos, em particular, por ser essencialmente livre de solventes e sais de cloreto.

[0034] Uma vantagem particular do método da presente invenção consiste no fato de que pode ser realizada sem o uso de qualquer solvente orgânico, em particular, sem o uso de qualquer solvente orgânico polar ou apolar. Então, em uma modalidade preferencial da invenção, nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de solventes orgânicos, em particular, de solventes orgânicos polares ou apolares, são usadas para isolar o óleo, em particular, o óleo contendo PUFAs, da biomassa. Os solventes orgânicos típicos são hexano e etanol. Em uma modalidade preferencial da invenção, menos de 2 % em peso de solventes orgânicos apolares são usados, mais preferencialmente menos de 1, 0,5 ou 0,1 % em peso. Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, nenhum solvente orgânico apolar é usado, de todo. Em uma modalidade muito preferencial da invenção, menos de 2 % em peso de solventes orgânicos são usados, em geral, de modo particularmente preferencial menos de 1, 0,5 ou 0,1 % em peso. Em uma modalidade particularmente muito preferencial da invenção, nenhum solvente orgânico é usado, de todo, para isolar o óleo contendo PUFAs da biomassa. – Isso significa, em particular, para essa modalidade, que a suspensão como empregada no método de acordo com a invenção, bem como todas as composições como obtidas pelas ditas etapas de método único, contém preferencialmente solventes orgânicos apolares, preferencialmente solventes orgânicos em geral, em uma quantidade de menos de 2 % em peso, mais preferencialmente menos de 1 % em peso, em particular, menos de 0,5 ou 0,3 % em peso, principalmente em uma quantidade de menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0035] Uma vantagem adicional do método da presente invenção é que uma separação muito eficaz do óleo da biomassa remanescente pode ser realizada sem a adição de cloreto de sódio, o qual é normalmente usado para relargagem do óleo a partir da biomassa. Preferencialmente, o método pode ser realizado sem a adição de sais de cloreto, de todo, principalmente sem a adição de quaisquer sais para relargagem do óleo. Porém, pequenas quantidades de sais de cloreto, em particular, cloreto de sódio, podem estar presentes na suspensão devido ao meio de fermentação, como usado para cultivar a biomassa.

[0036] Então, em uma modalidade preferencial da presente invenção, nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de cloreto de sódio são usadas para melhorar o isolamento de óleo. Em uma modalidade preferencial da invenção, menos de 1 % em peso de cloreto de sódio é usado, mais preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso de cloreto de sódio são usados para isolar o óleo da biomassa, principalmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso, em que a % em peso se refere ao peso total da composição após a adição do cloreto de sódio. – Isso significa, em particular, para essa modalidade, que a suspensão como empregada no método de acordo com a invenção, bem como todas as composições como obtidas pelas ditas etapas de método único, contém preferencialmente cloreto de sódio em uma quantidade de menos de 2 % em peso, mais preferencialmente menos de 1 % em peso, em particular, menos de 0,5 ou 0,3 % em peso, principalmente em uma quantidade de menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0037] Em uma modalidade particularmente preferencial da invenção, nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de sais de cloreto são usadas para melhorar o isolamento de óleo, de todo. Nessa modalidade, preferencialmente menos de 1 % em peso de sais de cloreto, mais preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso de sais de cloreto são usados para isolar o óleo da biomassa, principalmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso, em que a % em peso se refere ao peso total da composição após a adição dos sais de cloreto.

[0038] Em uma modalidade muito preferencial da invenção, nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de sais são usadas para melhorar o isolamento de óleo, em geral. Nessa modalidade, preferencialmente menos de 1 % em peso de sais, mais preferencialmente menos de 0,5 ou 0,2 % em peso de sais são usados para isolar o óleo da biomassa, principalmente menos de 0,1 ou 0,05 % em peso, em que a % em peso se refere ao peso total da composição após a adição dos sais. – Isso significa, de preferência, em particular, para essa modalidade da invenção, que a suspensão como empregada no método de acordo com a invenção, bem como todas as composições como obtidas pelas ditas etapas de método único, contém preferencialmente sais, em geral em uma quantidade de menos de 2 % em peso, mais preferencialmente menos de 1 % em peso, em particular, menos de 0,5 ou 0,3 % em peso, principalmente em uma quantidade de menos de 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0039] Uma vantagem adicional do método da presente invenção é que uma separação muito eficaz do óleo da biomassa remanescente pode ser realizada sem a adição de bases, como soda cáustica, que são normalmente usadas para interromper a emulsão. De preferência, o método pode ser executado sem a adição de bases, como um todo, de modo que também nenhuma neutralização subsequente da suspensão seja necessária. – Isso não resulta em uma biomassa que contém apenas quantidades relativamente pequenas de sais, em geral, e, por isso, compreende apenas uma pequena quantidade de cinzas. Porém, pequenas quantidades de bases podem ser adicionadas, em particular, para ajustar o pH, por exemplo, se o pH da suspensão for muito baixo após a fermentação, ou para facilitar o processo de desemulsificação. – Isso significa que em uma modalidade preferencial da invenção, nenhuma ou apenas poucas quantidades de bases são usadas nos métodos de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferencial da invenção, menos que 4 % em peso de bases, são usadas, com mais preferência, menos que 2 ou 1 % em peso de bases são usadas nos métodos de acordo com a invenção, principalmente, menos que 0,5 ou 0,2 % em peso, em que a % em peso se refere ao peso total da composição após a adição da base.

[0040] Porém, em uma modalidade alternativa da invenção produtos cáusticos, em particular, soda cáustica, podem ser adicionados, de preferência, em pequenas quantidades, para facilitar a desemulsificação e para aumentar o rendimento final de óleo.

[0041] Visto que a desemulsificação pode ser executada sem o uso de bases, em uma modalidade preferencial da invenção, o pH pode, de preferência, ser mantido durante o procedimento completo abaixo de um valor de pH de 9, em particular, abaixo de 8,5, 8 ou 7,5, que permite o tratamento do lipídio sob condições muito brandas e, substancialmente, reduz o grau de hidrólise dos ésteres de ácido graxo como contido no lipídio. – Então, em uma modalidade preferencial da invenção, o pH é mantido durante o procedimento completo abaixo de 9, em particular, na faixa de 4,5 a 9, de preferência, abaixo de 8,5, 8 ou 7,5, em particular, na faixa de 4,5 a 8,5, 4,5 a 8 ou 4,5 a 7,5.

[0042] Os métodos da presente invenção permitem uma separação muito eficaz do óleo contido na biomassa a partir de debris celulares e outras substâncias como contido no caldo de fermentação. Com o uso dos métodos da presente invenção, preferencialmente mais de 80 % em peso, em particular, mais de 90 % em peso do óleo contido na biomassa podem ser separados da biomassa e isolados.

[0043] Constatou-se que o óleo como obtido aplicando-se o método da presente invenção tem algumas características vantajosas sobre os óleos contendo PUFAs como revelado no estado da técnica até o momento. Em particular, exibe valores de oxidação muito baixos, um teor muito baixo de ácidos graxos livres e um teor muito baixo de triacilgliceróis polimerizados (TAGs). Os ácidos graxos livres e TAGs polimerizados são subprodutos indesejados no isolamento de lipídios contendo TAGs, que, de preferência, são evitados.

[0044] Então, uma matéria adicional da presente invenção é um óleo como obtido ou como obtenível por um método de acordo com a presente invenção.

[0045] Um objetivo adicional da presente invenção consiste, portanto, também em um óleo, em particular, um óleo contendo PUFAs, que compreende ésteres de ácido graxo, em particular, TAGs, em uma quantidade de pelo menos 50 % em peso, de preferência, pelo menos 70 ou 80 % em peso, em particular, em uma quantidade de pelo menos 85 ou 90 % em peso, caracterizado por compreender ácidos graxos livres (FFAs) em uma quantidade de menos que 0,6 % em peso, de preferência, em uma quantidade menor que 0,5 ou 0,4 % em peso, em particular, em uma quantidade não maior que 0,3 ou 0,2 % em peso.

[0046] Um objetivo adicional da presente invenção consiste, portanto, também em um óleo, que compreende TAGs em uma quantidade de pelo menos 50 % em peso, de preferência, pelo menos 70 ou 80 % em peso, em particular em uma quantidade de pelo menos 85 ou 90 % em peso, caracterizado por compreender TAGs polimerizados em uma quantidade de menos que 1,0 % em peso, de preferência, em uma quantidade de menos que 0,8 % em peso, em particular, em uma quantidade de menos que 0,6 % em peso.

[0047] Um objetivo adicional da presente invenção consiste, portanto, também em um óleo contendo PUFAs, que compreende TAGs em uma quantidade de pelo menos 50 % em peso, de preferência, pelo menos 70 ou 80 % em peso, com mais preferência, pelo menos 85 ou 90 % em peso, exibindo as seguintes características: a) um teor de ácidos graxos livres (FFAs) menor que 0,6 % em peso, de preferência, menor que 0,5 ou 0,4 % em peso, em particular menor que 0,3 ou 0,2 % em peso; b) um teor de TAGs polimerizados menor que 1,0 % em peso, de preferência, menor que 0,8 % em peso, em particular, menor que 0,6 % em peso; c) preferencialmente um valor de peróxido menor que 0,5, em particular menor que 0,3, com mais preferência, menor que 0,15; d) preferencialmente um valor de anisidina menor que 15, em particular, menor que 10; e) preferencialmente um teor de umidade e impurezas de menos de 1 % em peso, preferencialmente menos de 0,5 % em peso; f) preferencialmente uma viscosidade de menos de 0,25 Pa·s (250 cps), mais preferencialmente de menos de 0,2 Pa·s (200 cps), em particular, de menos de 0,16 Pa·s (160 cps); g) preferencialmente um ponto fulgor de pelo menos 350 °C, mais preferencialmente de pelo menos 400 °C, em particular, de pelo menos 450 °C; f) preferencialmente um teor de ácidos graxos ômega-3, em particular, de DHA e EPA, de pelo menos 35 % em peso, preferencialmente pelo menos 40 ou 45 % em peso, principalmente pelo menos 50 % em peso; g)

preferencialmente DHA e EPA, cada um em uma quantidade de pelo menos 8 % em peso, preferencialmente pelo menos 10 % em peso, principalmente pelo menos 15 % em peso; j) preferencialmente uma quantidade de solventes orgânicos de menos que 0,5 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 % em peso, em particular, menos que 0,05 % em peso, principalmente menos que 0,01 % em peso; k) preferencialmente uma quantidade de cloretos de menos de 0,1 % em peso, mais preferencialmente menos de 0,05 % em peso, em particular, menos de 0,01 % em peso.

[0048] O valor de anisidina (AV) é determinado de acordo com o Método Oficial da AOCS nº Cd 18-90. O AV é uma medida para produtos de reação secundários dos ácidos graxos, como aldeídos e cetonas, que ocorrem durante a oxidação do óleo.

[0049] O valor de peróxido (PV) é determinado de acordo com o Método Oficial da AOCS nº CD 8-53. O PV é uma medida para produtos de reação primários, como peróxido e hidroperóxidos, que ocorrem durante a oxidação do óleo. – De acordo com a invenção, o PV é medido em meq/kg.

[0050] O teor de ácidos graxos livres é determinado de acordo com o Método Oficial da AOCS nº AOCS Ca 5a-40. O teor de umidade é determinado de acordo com os Métodos Oficiais da AOCS nº AOAC 930.15, 935.29. O teor de impurezas insolúveis é determinado de acordo com o Método Oficial da AOCS nº AOCS 3a-46. A quantidade de DHA e EPA é determinada de acordo com o Método Oficial da AOCS nº AOCS Ce 1b-89. A quantidade de gordura total é determinada de acordo com o Método Oficial da AOCS nº AOCS 996.06. A quantidade de gordura bruta é determinada de acordo com os Métodos Oficiais da AOCS nº AOAC 920.39, 954.02. A quantidade de TAGs polimerizados (pTAGs) é determinada por cromatografia por exclusão de tamanho de alta eficiência (HPSEC) de acordo com o método de DGF C-III 3c (10).

[0051] Visto que o isolamento do óleo é executado com uso de nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de produtos cáusticos, a fase aquosa obtida como um subproduto compreende, de preferência, apenas uma quantidade relativamente pequena de sais e cinzas.

[0052] Visto que o isolamento do óleo é adicionalmente realizado preferencialmente com o uso de nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de solventes e também com o uso de nenhuma quantidade ou apenas pequenas quantidades de cloreto de sódio, a fase aquosa obtida como um subproduto também é, de modo preferencialmente substancial, livre de solventes orgânicos e cloreto de sódio. Então, a fase aquosa pode ser utilizada de diferentes maneiras, diretamente após a separação da fase oleosa ou após finalização adicional, como concentração e/ou secagem.

[0053] Uma matéria adicional da presente invenção é, portanto, uma suspensão aquosa contendo lipídios, em particular PUFAs, contendo uma biomassa, preferencialmente uma biomassa deslipidada, como obtida ou como obtenível por um método de acordo com a presente invenção. Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um concentrado ou um produto seco como obtido ou obtenível concentrando-se e/ou secando-se essa suspensão aquosa. Ao concentrar a suspensão aquosa, a mesma é preferencialmente seca até que um teor de matéria seca total (TDM) de 20 a 60 % em peso seja alcançado. - A seguir, a expressão "suspensão aquosa de acordo com a invenção" se refere à fase aquosa como obtido após a separação da fase oleosa, bem como a quaisquer suspensões concentradas dessa fase aquosa como obtida concentrando-se essa fase aquosa. A secagem é preferencialmente realizada por evaporação de solvente, como descrito mais adiante.

[0054] Um objetivo adicional da presente invenção consiste, portanto, também em uma suspensão aquosa contendo lipídios, em particular, PUFAs, que contém uma biomassa, em particular, debris celulares de uma biomassa deslipidada, caracterizada por um teor de sais e/ou cinzas de menos que 15 % em peso, de preferência, 4 a 12 % em peso, em particular, 6 a 10 % em peso e, de preferência, caracterizada adicionalmente por um teor de solventes não polares orgânicos de menos que 1 % em peso, de preferência, menos que 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 ou 0,05 % em peso, principalmente menos que 0,01 % em peso e, de preferência, caracterizada adicionalmente por um teor de íons de cloreto de menos que 1 % em peso, de preferência, menos que 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0055] Um objetivo adicional da presente invenção consiste, portanto, em particular, também em uma suspensão aquosa contendo lipídios, em particular, PUFAs, que contém uma biomassa, em particular, debris celulares de uma biomassa deslipidada, caracterizada por um teor de sais e/ou cinzas de menos que 15 % em peso, de preferência, 4 a 12 % em peso, em particular, 6 a 10 % em peso e, de preferência, caracterizada adicionalmente por um teor de solventes orgânicos de menos que 1 % em peso, de preferência, menos que 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que

0,1 ou 0,05 % em peso, principalmente menos que 0,01 % em peso e, de preferência, caracterizada adicionalmente por um teor de íons de cloreto de menos que 1 % em peso, de preferência, menos que 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0056] Uma matéria preferencial da presente invenção consiste, portanto, também em uma suspensão aquosa contendo lipídios, em particular, PUFAs, que contém uma biomassa de Thraustochytrid, em particular, debris celulares de uma biomassa de Thraustochytrid deslipidada, caracterizada por um teor de sais e/ou cinzas de menos que 15 % em peso, de preferência, 4 a 12 % em peso, em particular, 6 a 10 % em peso e, de preferência, caracterizada por um teor de solventes não polares orgânicos de menos que 1 % em peso, de preferência, menos que 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 ou 0,05 % em peso, principalmente menos que 0,01 % em peso e, de preferência, caracterizada adicionalmente por um teor de íons de cloreto de menos que 1 % em peso, de preferência, menos que 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0057] Uma matéria particularmente preferencial da presente invenção consiste, portanto, também em uma suspensão aquosa contendo lipídios, em particular, PUFAs, que contém uma biomassa de Thraustochytrid, em particular, debris celulares de uma biomassa de Thraustochytrid deslipidada, caracterizada por um teor de sais e/ou cinzas de menos que 15 % em peso, de preferência, 4 a 12 % em peso, em particular, 6 a 10 % em peso e, de preferência, caracterizada por um teor de solventes orgânicos de menos que 1 % em peso, de preferência, menos que 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 ou 0,05 % em peso, principalmente menos que 0,01 % em peso e, de preferência, caracterizada adicionalmente por um teor de íons de cloreto de menos que 1 % em peso, de preferência, menos que 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0058] As suspensões aquosas da invenção como descrito anteriormente, que são obtidas como um subproduto nos métodos de acordo com a invenção, de preferência, exibem um teor de matéria seca total (TDM) de 20 a 60 % em peso, em particular de 25 a 55 % em peso, com mais preferência, de 30 a 50 % em peso, visto que tais suspensões concentradas se provaram particularmente adequadas para as aplicações da invenção como descrito abaixo.

[0059] As suspensões aquosas da invenção podem ser usadas como um produto para propósitos diferentes como revelado adicionalmente abaixo. – Alternativamente, as suspensões aquosas também podem ser desenvolvidas adicionalmente para aumentar o rendimento de óleo geral. O trabalho adicional e isolamento de óleo adicional podem ser executados através do uso de produtos cáusticos, em particular, através do uso de soda cáustica.

[0060] “Cloreto” de acordo com a invenção se refere à quantidade de cloro detectável. A quantidade de cloro presente pode ser determinada, por exemplo, por análise elementar de acordo com DIN EN ISO 11885. O cloro está presente na forma de sais que são denominados "cloretos". O teor de cloreto como mencionado de acordo com a invenção – também denominado "íons de cloreto" - apenas se refere à quantidade de cloro detectável, não à quantidade do sal de cloreto completo, o qual compreende, além de íon de cloreto, também um contraíon catiônico.

[0061] O teor de matéria seca total (TDM) é, de preferência, determinado por análise gravimétrica. Para realizar isso, uma amostra da suspensão homogênea com um volume específico é pesada antes e após a secagem por congelamento. O peso restante da amostra seca corresponde à matéria seca total como contido naquele volume específico da suspensão.

[0062] Em uma modalidade particularmente preferencial da presente invenção, a fase aquosa contendo água, sais, óleo residual e debris celulares, a qual é obtida como subproduto na etapa de coleta de óleo, como descrito anteriormente, é convertida em uma biomassa seca secando-se a biomassa a um teor de matéria seca total de mais de 90 % em peso.

[0063] Devido ao método de fabricação, a biomassa compreende um teor muito baixo de sais, de preferência, cinzas, de menos que 30 % em peso, em particular, menos que 25 % em peso, com mais preferência, menos que 20 % em peso.

[0064] Desse modo, uma matéria adicional da presente invenção também consiste em uma biomassa contendo lipídios, de preferência, PUFAs, em particular, um biomassa deslipidada, caracterizada por um teor de sais e/ou cinzas de menos que 30 % em peso, de preferência, 8 a 30 % em peso, com mais preferência, 12 a 25 % em peso, em particular, 15 a 20 % em peso.

[0065] A biomassa, em particular, biomassa deslipidada, de acordo com a invenção é, de preferência, caracterizada por um teor de sais e/ou cinzas de menos que 30 % em peso, de preferência, 8 a 30 % em peso, com mais preferência, 12 a 20 % em peso, em particular, 15 a 20 % em peso e, de preferência, um teor de solventes orgânicos não polares de menos que 2 % em peso, de preferência, menos que 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1, 0,05 ou 0,02 % em peso e, de preferência, caracterizada adicionalmente por um teor de íons de cloreto de menos que 2 % em peso, de preferência, menos que 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0066] Desse modo, uma matéria preferencial da presente invenção também consiste em uma biomassa de Thraustochytrid contendo lipídios, em particular, PUFAs, em particular, uma biomassa de Thraustochytrid deslipidada, caracterizada por um teor de sais e/ou cinzas de menos que 30 % em peso, de preferência, 8 a 30 % em peso, com mais preferência, 12 a 20 % em peso, em particular, 15 a 20 % em peso e, de preferência, um teor de solventes orgânicos não polares de menos que 2 % em peso, de preferência, menos que 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1, 0,05 ou 0,02 % em peso e, de preferência, caracterizada adicionalmente por um teor de íons de cloreto de menos que 2 % em peso, de preferência, menos que 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0067] Desse modo, uma matéria particularmente preferencial da presente invenção também consiste em um biomassa de Thraustochytrid contendo lipídios, em particular, PUFAs, em particular, um biomassa de Thraustochytrid deslipidada, caracterizada por um teor de cinzas, em particular, sais, de menos que 30 % em peso, de preferência, 8 a 30 % em peso, com mais preferência, 12 a 20 % em peso, em particular, 15 a 20 % em peso e, de preferência,

um teor de solventes orgânicos de menos que 2 % em peso, de preferência, menos que 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1, 0,05 ou 0,02 % em peso e, de preferência, caracterizada adicionalmente por um teor de íons de cloreto de menos que 2 % em peso, de preferência, menos que 1, 0,5 ou 0,2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,1 ou 0,05 % em peso.

[0068] Já que a preparação é preferencialmente realizada sem o uso de solventes orgânicos apolares, preferencialmente sem o uso de quaisquer solventes orgânicos, de todo, e sem o uso de cloreto de sódio, preferencialmente sem o uso de sais de cloreto, de todo, a biomassa resultante é preferencialmente livre de quaisquer solventes orgânicos apolares, preferencialmente livre de quaisquer solventes orgânicos, em geral, ainda essencialmente livre de quaisquer íons de cloreto, de todo, em que "essencialmente livre" significa que contém íons de cloreto em uma quantidade de menos de 0,1 % em peso, em particular, em uma quantidade de menos de 0,05 % em peso.

[0069] A biomassa de acordo com a invenção exibe preferencialmente um teor de umidade de não mais que 10 % em peso, preferencialmente não mais que 5 % em peso.

[0070] A biomassa então obtida compreende preferencialmente lipídios (gordura bruta) em uma quantidade de cerca de 3 a 14 % em peso, em particular, cerca de 4 a cerca de 14 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de cerca de 4,5 a cerca de 12 % em peso, mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 5 a cerca de 10 % em peso. Além disso, o lipídio compreende preferencialmente pelo menos um PUFA selecionado a partir de

DHA e EPA, mais preferencialmente uma mistura de DHA e EPA, em que a razão entre DHA e EPA está preferencialmente entre 3:2 a 4:1 e em que a quantidade de DHA é preferencialmente de 30 a 50 % em peso da quantidade total de lipídios contidos e a quantidade de EPA é preferencialmente de 10 a 20 % em peso da quantidade total de lipídios contidos. Consequentemente, também as suspensões aquosas, como descrito anteriormente, são preferencialmente caracterizadas por serem conversíveis por secagem em uma biomassa com tal teor de gordura bruta e/ou teor de EPA e/ou teor de DHA por secagem da suspensão aquosa a um teor de umidade de não mais que 10 % em peso, preferencialmente não ais que 5 % em peso.

[0071] A biomassa ainda compreende preferencialmente proteínas e/ou aminoácidos em uma quantidade de 15 a 25 % em peso, mais preferencialmente em uma quantidade de 17 a 23 % em peso, e exibe preferencialmente um teor de proteína bruta de 25 a 35 % em peso. Visto que a desemulsificação é executada sob condições brandas, a razão de peso entre aminoácidos livres e a soma de proteínas e peptídeos é, de preferência, menos que 9:1, com mais preferência, menos que 5:1, em particular, menos que 1:1. Consequentemente, também as suspensões aquosas, como descrito anteriormente, são preferencialmente caracterizadas por serem conversíveis por secagem em uma biomassa com tal aminoácido e/ou teor de proteína bruta e/ou razão entre aminoácidos livres e proteínas e peptídeos por secagem da suspensão aquosa a um teor de umidade de não mais que 10 % em peso, preferencialmente não mais que 5 % em peso.

[0072] A biomassa ainda exibe preferencialmente um teor de fibra bruta de menos de 5 % em peso, preferencialmente menos de 2 % em peso, mais preferencialmente de cerca de 0 % em peso. Consequentemente, também as suspensões aquosas, como descrito anteriormente, são preferencialmente caracterizadas por serem conversíveis por secagem em uma biomassa com tal teor de fibra bruta por secagem da suspensão aquosa a um teor de umidade de não mais que 10 % em peso, preferencialmente não mais que 5 % em peso.

[0073] A biomassa seca é preferencialmente uma biomassa deslipidada, o que significa uma biomassa cuja maior parte dos lipídios foi removida, preferencialmente por um processo como revelado neste pedido. Já que a separação de óleo da biomassa é muito eficaz, o óleo remanescente na biomassa é preferencialmente menos de 20 % em peso, preferencialmente menos de 15 % em peso, mais preferencialmente menos de 10 % em peso, do óleo como originalmente contido na biomassa. Porém, já que o óleo não pode ser removido completamente por tal processo, uma quantidade substancial de óleo ainda permanece contida também na biomassa deslipidada de acordo com a invenção. Isso significa que o termo "biomassa deslipidada" de acordo com a invenção se refere a uma biomassa lisada, cuja maior parte de óleo foi removida, preferencialmente por um processo ou método como revelado neste pedido, porém que ainda contém uma parte substancial de lipídios, em particular, de lipídios contendo PUFAs, em que a quantidade de lipídios na biomassa seca deslipidada é preferencialmente de 3-14 % em peso, em particular, 4-14 % em peso, preferencialmente de 4,5-12 % em peso, mais preferencialmente de 5-10 % em peso. Desse modo, a "biomassa deslipidada" de acordo com a invenção também pode ser denominada "biomassa parcialmente deslipidada" ou uma

"biomassa substancialmente deslipidada.

[0074] Desse modo, uma matéria adicional da presente invenção é um método para obter uma biomassa que tem um baixo teor de sais, é substancialmente livre de solventes orgânicos apolares, preferencialmente livre de solventes orgânicos, em geral, e que é, ainda, substancialmente livre de cloreto de sódio, preferencialmente livre de sais de cloreto, em geral, que compreende as etapas de método como mencionado anteriormente.

[0075] A conversão da fase pesada contendo água, sais, óleo remanescente e debris celulares, a qual é obtida como subproduto na etapa de coleta de óleo, em uma biomassa seca secando-se a biomassa a um teor de matéria seca total de mais de 90 % em peso pode ser realizada de diferentes maneiras.

[0076] De um modo muito preferencial, a transformação é realizada pela concentração da fase pesada a um teor de matéria seca de 30-50 % em peso, preferencialmente 35-45 % em peso, e granulação por aspersão subsequente da biomassa por meio de granulação de leito fluidizado. Ao fazê-lo, de um modo muito eficaz, uma biomassa com recursos vantajosos pode ser obtida. A granulação por aspersão por meio de granulação de leito fluidizado é revelada em mais detalhes no documento EP13176661.0.

[0077] A concentração da fase pesada a um teor de matéria seca de 30-50 % em peso é preferencialmente realizada por evaporação de solvente, em particular, evaporação a vácuo, e/ou com o uso de um evaporador rotativo, um evaporador de filme fino ou um evaporador de filme descendente. Uma alternativa útil à evaporação de solvente é a osmose reversa.

[0078] Como uma alternativa à granulação por aspersão, outros métodos de secagem, em particular, outros métodos de secagem convectiva, como secagem em túnel ou secagem por aspersão, em particular, secagem com bocal de aspersão, ou métodos de secagem por contato, como secagem em tambor, ou métodos de secagem por radiação, como secagem por infravermelho, da fase pesada concentrada seriam alternativas aplicáveis, em que, com o uso daqueles métodos, normalmente partículas com um diâmetro menor ou mais são obtidas.

[0079] De acordo com a invenção, durante o processo de secagem, um agente antiaglomerante, em particular, sílica, preferencialmente uma sílica hidrofóbica ou hidrofílica, pode ser opcionalmente adicionada à biomassa para impedir aglomeração. Com esse propósito, a suspensão, em particular, o caldo de fermentação que compreende biomassa bem como a sílica são preferencialmente aspergidos na zona de secagem particular. Alternativa ou adicionalmente, a biomassa pode ser misturada com o agente antiaglomerante após o processo de secagem. Em relação ao uso de sílica como agente antiaglomerante, é feita referência em particular ao pedido de patente EP13187631.0.

[0080] A conversão de um pó de granuralidade fina em um produto sem pó com granuralidade grossa pode ser realizada por processos de granulação. Os auxiliares orgânicos ou inorgânicos convencionais ou suportes, como amido, gelatina, derivados de celulose ou substâncias similares, os quais são tipicamente usados em processamento de alimentos ou processamento de rações como agentes ligantes, agentes geleificantes ou espessantes, podem ser opcionalmente usados nesse processo subsequente de granulação. Auxiliares adicionais que são preferencialmente usados de acordo com a invenção são revelados no documento WO 2016/050560, sendo que carboximetilcelulose é um agente ligante particularmente preferencial.

[0081] Após secagem e opcionalmente granulação e/ou peneiramento da biomassa, a biomassa seca é preferencialmente armazenada ou embalada.

[0082] A biomassa particulada da invenção bem como as suspensões aquosas da invenção podem ser usadas de modos diferentes. Por exemplo, a mesma pode ser usada a fim de produzir um gênero alimentício ou composição alimentícia. Alternativamente, podem ser usadas diretamente como gênero alimentício ou composição alimentícia.

[0083] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um método para produzir uma composição alimentícia ou gênero alimentício, em que uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção é usada, e é preferencialmente misturada com ingredientes adicionais de composição alimentícia ou gênero alimentício.

[0084] Em uma modalidade preferencial da invenção, a biomassa particulada e/ou a suspensão aquosa é usada para produzir um gênero alimentício ou composição alimentícia, em que a biomassa e/ou a suspensão aquosa é preferencialmente misturada com outros ingredientes de gênero alimentício ou composição alimentícia e é, então, processada para produzir o gênero alimentício ou a composição alimentícia.

[0085] A mistura de biomassa e/ou suspensão aquosa e outros ingredientes de gênero alimentício ou composição alimentícia é processada em uma modalidade preferencial por um processo de extrusão, a fim de obter porções de gênero alimentício ou composição alimentícia prontas para venda. Alternativamente, um método de peletização também pode ser usado.

[0086] Uma extrusora de rosca ou rosca dupla é preferencialmente empregada no processo de extrusão. O processo de extrusão é preferencialmente realizado a uma temperatura de 80 – 220 °C, particularmente 100 – 190 °C, uma pressão de 1000 a 4000 kPa (10 – 40 Bar), e uma velocidade rotacional de haste de 100 – 1000 rpm, particularmente 300 – 700 rpm. O tempo de permanência da mistura introduzida é preferencialmente de 5 – 30 segundos, em particular, 10 – 20 segundos.

[0087] Em um modo do processo de extrusão que é preferencial de acordo com a invenção, o processo compreende uma etapa de compactação e uma etapa de compressão.

[0088] É preferencial misturar intensamente os componentes entre si antes de realizar o processo de extrusão. Isso é realizado, de preferência, em um tambor equipado com aletas. Nessa etapa de mistura, uma modalidade preferencial inclui uma injeção de vapor, em particular, de modo a causar o intumescimento do amido que está, de preferência, presente.

[0089] Antes de serem misturados com a biomassa e/ou suspensão aquosa, os demais ingredientes de ração ou produto alimentício são, de preferência, triturados – se exigido – de modo a garantir que uma mistura homogênea seja obtida na etapa de mistura. A trituração dos demais ingredientes de ração ou produto alimentício pode ser realizada, por exemplo, com o uso de um moinho de martelos.

[0090] Uma matéria adicional da presente invenção é, portanto, um método para alimentar animais, em que uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção são fornecidas para animais, preferencialmente após misturar a biomassa particulada e/ou a suspensão aquosa com outros ingredientes de composição alimentícia, em que os animais são preferencialmente selecionados a partir de aves, suínos, martas, ruminantes, em particular, de bezerros e gado bovino, ovelhas, cabras, animais domésticos ou animais mantidos em aquacultura.

[0091] Alternativamente, a biomassa e/ou suspensão aquosa de acordo com a invenção podem ser usadas em aplicações de solo, em particular, como fertilizante (orgânico), NPC (fonte de nitrogênio/fósforo/potássio), melhorador de solo, melhorador de planta e/ou auxiliar de compostagem, para produzir biogás, para tratamento de água servida ou como combustível alternativo, em particular, para fornos de cimento. Podem ser adicionalmente usadas como parte de um meio de fermentação para produzir microrganismos, em particular, para produzir biomassa contendo PUFAs adicional.

[0092] Uma matéria adicional da presente invenção é, portanto, um método para melhorar o solo, em que uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção são espalhadas sobre e possivelmente misturadas com o solo, em particular, com solo de terreno agrícola ou solo de jardim.

[0093] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um método para fertilização e/ou compostagem do solo, em particular, terreno agrícola ou jardim, em que uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção são espalhadas sobre e possivelmente misturadas com o solo, em particular, com solo de terreno agrícola ou solo de jardim.

[0094] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um método para produzir biogás, em que uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção é submetida à degradação microbiana sob condições anaeróbicas, em particular, com o uso de bactérias metanogênicas.

[0095] Uma matéria adicional da presente invenção também é, portanto, um método para tratamento de água servida, em que a água servida é misturada com uma biomassa particulada e/ou uma suspensão aquosa de acordo com a invenção.

[0096] Uma matéria adicional da presente invenção consiste, portanto, também em um método para produzir microrganismos, em particular, para produzir uma biomassa contendo lipídios, em que os lipídios compreendem, de preferência, PUFAs, em que uma biomassa particulada e/ou suspensão aquosa de acordo com a invenção é usada como parte do meio de fermentação.

[0097] As células contendo lipídios de acordo com a invenção contêm, de preferência, em média pelo menos 10 % em peso de lipídios, com mais preferência, pelo menos 20 ou 30 % em peso de lipídios, em particular, pelo menos 40 ou 50 % em peso de lipídios.

[0098] As células contendo lipídios de acordo com a invenção, de preferência, contêm adicionalmente ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs).

[0099] As células da biomassa contendo lipídios e, em particular, PUFAs, são, de preferência, células microbianas ou células vegetais. Em uma modalidade preferencial da invenção, as células são capazes de produzir os PUFAs devido a um sistema de policetídeo sintase. O sistema de policetídeo sintase pode ser endógeno ou, devido à engenharia genética, exógeno.

[0100] Consequentemente, "biomassa deslipidada" de acordo com a invenção se refere aos resíduos de tais células contendo PUFAs que compreendem biomassa, em particular, como revelado mais adiante, após terem sido submetidos a um processo de isolamento de óleo, em particular, como adicionalmente revelado anteriormente.

[0101] As células vegetais podem ser selecionadas em particular a partir de células das famílias Brassicaceae, Elaeagnaceae e Fabaceae. As células da família Brassicaceae podem ser selecionadas a partir do gênero Brassica, em particular, da colza oleaginosa, colza de nabo e mostarda da Índia; as células da família Elaeagnaceae podem ser selecionadas a partir do gênero Elaeagnus, em particular, da espécie Oleae europaea; as células da família Fabaceae podem ser selecionadas a partir do gênero Glycine, em particular, das espécies Glycine max.

[0102] Os organismos microbianos que contêm um lipídio contendo PUFAs são descritos extensivamente na técnica anterior. As células usadas podem ser, nesse contexto em particular, células que naturalmente já produzem PUFAs (ácidos graxos poli-insaturados); no entanto, também podem ser células que, como resultado de métodos de engenharia genética adequados ou devido a mutagênese aleatória, mostram uma produção melhorada de PUFAs ou foram tornadas capazes de produzir PUFAs, de todo. A produção dos PUFAs pode ser auxotrófica, mixotrófica ou heterotrófica.

[0103] A biomassa compreende preferencialmente células que produzem PUFAs heterotroficamente. As células de acordo com a invenção são preferencialmente selecionadas a partir de algas, fungos, particularmente leveduras, bactérias ou protistas. As células são mais preferencialmente algas microbianas ou fungos.

[0104] As células adequadas de leveduras produtoras de óleo são, em particular, cepas de Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces.

[0105] As células adequadas de algas produtoras de óleo e microrganismos similares a algas são, em particular, microrganismos selecionados a partir do filo Stramenopiles (também denominado Heterokonta). Os microrganismos do filo Stramenopiles podem ser em particular selecionados a partir dos seguintes grupos de microrganismos: Hamatores, Proteromonads, Opalines, Developayella, Diplophrys, Labrinthulids, Thraustochytrids, Biosecids, Oomycetes, Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, Diatoms, Xanthophytes, Phaeophytes (algas marrons), Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (incluindo Rhizochromulinales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales, e Chromulinales. Outros grupos preferenciais de microalgas incluem os membros das algas verdes e dinoflagelados, incluindo os membros do gênero

Crypthecodiurn.

[0106] A biomassa de acordo com a invenção compreende preferencialmente células, e preferencialmente consiste essencialmente em tais células, do táxon Labirintulomicetos (Labyrinthulea, fungos net slime, mofos-em-rede), em particular, aqueles da família Thraustochytriaceae. A família Thraustochytriaceae (Thraustochytrids) inclui os gêneros Althomia, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Botryochytrium, Elnia, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium e Ulkenia. A biomassa particularmente compreende preferencialmente células dos gêneros Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Schizochytrium, ou Thraustochytrium, principalmente do gênero Schizochytrium.

[0107] De acordo com a invenção, o ácido graxo poli- insaturado (PUFA) é preferencialmente um ácido graxo altamente insaturado (HUFA).

[0108] As células presentes na biomassa são preferencialmente distinguidas pelo fato de que contêm pelo menos 20 % em peso, preferencialmente pelo menos 30 % em peso, em particular, pelo menos 35 % em peso, de PUFAs, em cada caso com base na matéria seca celular.

[0109] De acordo com a presente invenção, o termo "lipídio" inclui fosfolipídios; ácidos graxos livres; ésteres de ácidos graxos; triacilglicerídios (TAGs); esteróis e ésteres de esterol; carotenoides; xantofilas (por exemplo, oxicarotenoides); hidrocarbonetos; compostos derivados de isoprenoide e outros lipídios conhecidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica. – Os termos "lipídio" e "óleo" são usados alternadamente de acordo com a invenção.

[0110] Em uma modalidade preferencial, a maioria dos lipídios nesse caso está presente na forma de triglicerídeos, com, de preferência, pelo menos 50 % em peso, em particular, pelo menos 75 % em peso e, em uma modalidade especialmente preferencial, pelo menos 90 % em peso dos lipídios presentes na célula que está presente na forma de triglicerídeos.

[0111] De acordo com a invenção, ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs) são compreendidos de modo a se referir a ácidos graxos que têm pelo menos duas, particularmente pelo menos três, ligações duplas C-C. De acordo com a invenção, os ácidos graxos altamente insaturados (HUFAs) são preferenciais entre os PUFAs. De acordo com a invenção, os HUFAs são compreendidos de modo a se referir a ácidos graxos que têm pelo menos quatro ligações duplas C-C.

[0112] Os PUFAs podem estar presentes na célula em forma livre ou em forma ligada. Exemplos da presença em forma ligada são fosfolipídios e ésteres dos PUFAs, em particular, monoacil-, diacil- e triacilglicerídeos. Em uma modalidade preferencial, a maioria dos PUFAs está presente na forma de triglicerídeos, com, de preferência, pelo menos 50 % em peso, em particular, pelo menos 75 % em peso e, em uma modalidade especialmente preferencial, pelo menos 90 % em peso dos PUFAs presentes na célula que está presente na forma de triglicerídeos.

[0113] Os PUFAs preferenciais são ácidos graxos ômega-3 e ácidos graxos ômega-6, sendo que os ácidos graxos ômega-3 são especialmente preferenciais. Os ácidos graxos ômega-3 preferenciais do presente documento são o ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5ω-3), particularmente o ácido

(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoico, e o ácido docosa-hexaenoico (DHA, 22:6ω-3), particularmente o ácido (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19- hexaenoico.

[0114] Em uma modalidade muito preferencial da presente invenção, células, em particular, uma cepa de Schizochytrium, é empregada, a qual produz uma quantidade significativa de EPA e DHA, simultaneamente, em que DHA é preferencialmente produzido em uma quantidade de pelo menos 20 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de pelo menos 30 % em peso, em particular, em uma quantidade de 30 a 50 % em peso, e EPA é produzido em uma quantidade de pelo menos 5 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de pelo menos 10 % em peso, em particular, em uma quantidade de 10 a 20 % em peso (em relação à quantidade total de lipídio como contido nas células, respectivamente). As cepas de Schizochytrium que produzem DHA e EPA podem ser obtidas pela mutagênese consecutiva seguida da seleção adequada de cepas mutantes que demostra produção de EPA e DHA superior e uma razão específica entre EPA:DHA. Qualquer agente químico ou não químico (por exemplo, radiação ultravioleta (UV)) com capacidade para incluir alteração genética para a célula de levedura pode ser usado como o mutagênico. Esses agentes podem ser usados em separado ou em combinação entre si, e os agentes químicos podem ser usados puros ou com um solvente.

[0115] As espécies preferenciais de microrganismos do gênero Schizochytrium, as quais produzem EPA e DHA simultaneamente em quantidades significativas, como mencionado anteriormente, estão depositadas sob Número de Acesso ATCC PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, ou PTA-10211,

PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215.

[0116] A suspensão de biomassa de acordo com a presente invenção é, de preferência, um caldo de fermentação.

[0117] A suspensão, em particular, o caldo de fermentação, tem, de preferência, uma densidade de biomassa de pelo menos 80 ou 100 g/l, em particular, de 80 ou 100 g/l a 250 g/l, de preferência, pelo menos 120 ou 140 g/l, em particular, 120 g/l ou 140 g/l a 220 g/l, com mais preferência, pelo menos 160 ou 180 g/l, em particular, 160 g/l a 200 g/l (calculado como teor de matéria seca). Então, a suspensão pode ser obtida cultivando-se e desenvolvendo-se células adequadas em um meio de fermentação sob condições em que os PUFAs são produzidos pelo microrganismo.

[0118] Os métodos para produzir a biomassa, em particular, uma biomassa que compreende células contendo lipídios, em particular, PUFAs, particularmente da ordem Thraustochytriales, são descritos em detalhes na técnica anterior (consultar, por exemplo, documentos WO91/07498, WO94/08467, WO97/37032, WO97/36996, WO01/54510). Como regra, a produção ocorre por células sendo cultivadas em um fermentador na presença de uma fonte de carbono e de uma fonte de nitrogênio, juntamente a diversas substâncias adicionais, como minerais que permitem o crescimento dos microrganismos e a produção dos PUFAs. Nesse contexto, as densidades de biomassa de mais que 100 gramas por litro e taxas de produção de mais que 0,5 gramas de lipídio por litro por hora podem ser alcançadas. O processo é realizado, de preferência, no que é conhecido como um processo de batelada alimentada, isto é, as fontes de carbono e nitrogênio são alimentadas gradualmente durante a fermentação. Quando a biomassa desejada é obtida, produção de lipídio pode ser induzida por várias medidas, por exemplo, limitando-se a fonte de nitrogênio, a fonte de carbono ou o teor de oxigênio ou combinações das mesmas.

[0119] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, as células são cultivadas até que alcancem uma densidade de biomassa de pelo menos 80 ou 100 g/l, em particular, de 80 ou 100 g/l a 250 g/l, de preferência, pelo menos 120 ou 140 g/l, em particular, 120 g/l ou 140 g/l a 220 g/l, com mais preferência, pelo menos 160 ou 180 g/l, em particular, 160 g/l a 200 g/l (calculada como teor de matéria seca). Tais processos são, por exemplo, revelados no documento US 7.732.170.

[0120] De preferência, as células são fermentadas em um meio com baixa salinidade, em particular, de modo a evitar corrosão. Isso pode ser alcançado usando-se sais de sódio livre de cloro como a fonte de sódio em vez de cloreto de sódio, como, por exemplo, sulfato de sódio, carbonato de sódio, carbonato de sódio e hidrogênio ou soda calcinada. De preferência, cloreto é usado na fermentação em quantidades de menos que 3 g/l, em particular, menos que 500 mg/l, especialmente de preferência, menos que 100 mg/l.

[0121] As fontes de carbono adequadas são ambas as fontes de carbono alcoólica e não alcoólica. Exemplos de fontes de carbono alcoólicas são metanol, etanol e isopropanol. Exemplos de fontes de carbono não alcoólicas são frutose, glicose, sacarose, melaços, amido e xarope de milho.

[0122] As fontes de nitrogênio adequadas são ambas as fontes de nitrogênio inorgânicas e orgânicas. Exemplos de fontes de nitrogênio inorgânicas são nitratos e sais de amônio, em particular, sulfato de amônio e hidróxido de amônio. Exemplos de fontes de nitrogênio orgânicas são aminoácidos, em particular, glutamato, e ureia.

[0123] Além disso, compostos de fósforo orgânicos e inorgânicos e/ou substâncias estimuladoras de crescimento conhecidas, como, por exemplo, extrato de levedura ou milhocina, também podem ser adicionados de modo a ter um efeito positivo na fermentação.

[0124] As células são, de preferência, fermentadas a um pH de 3 a 11, em particular, 4 a 10 e, de preferência, a uma temperatura de pelo menos 20 °C, em particular, 20 a 40 °C, especialmente de preferência, pelo menos 30 °C. Um processo de fermentação típico leva aproximadamente 100 horas.

[0125] Após a fermentação ter sido finalizada, as células podem ser pasteurizadas a fim de exterminar as células e desativar as enzimas que podem promover degradação de lipídio. A pasteurização é preferencialmente realizada aquecendo-se a biomassa a uma temperatura de 50 a 121 °C, preferencialmente 50 a 70 °C, por um período de 5 a 80 minutos, em particular, 20 a 60 minutos.

[0126] Do mesmo modo, após a fermentação ter sido finalizada, antioxidantes podem ser adicionados a fim de proteger os PUFAs presentes na biomassa da degradação oxidativa. Os antioxidantes preferenciais nesse contexto são BHT, BHA, TBHA, etoxiquina, beta-caroteno, vitamina E, em particular, tocoferol, e vitamina C. O antioxidante, se usado, é preferencialmente adicionado em uma quantidade de 0,001 a 0,1 % em peso, preferencialmente em uma quantidade de 0,002 a 0,05 % em peso, em relação à quantidade total do caldo de fermentação após adição do antioxidante. Exemplos de trabalho Exemplo 1:

[0127] Um caldo celular não lavado contendo células microbianas (Schizochytrium sp.) a uma densidade de biomassa de mais de 100 g/l foi aquecido a 60 °C em um vaso agitado. Após aquecer a suspensão, o pH foi ajustado a 7,5 com o uso de soda cáustica (50 % em peso de solução de NaOH), antes de uma alcalase (Alcalase® 2.4 FG (Novozymes)) ter sido adicionada em forma líquida em uma quantidade de 0,5 % em peso (em peso de caldo). A agitação continuou por 3 horas a 60 °C. Após isso, 1 kg de amostras da mistura de célula lisada foi subsequentemente transferido em um evaporador de rotação e aquecido a uma temperatura de 85 °C. As amostras diferentes foram concentradas no evaporador de rotação, até um teor de matéria seca total entre 42 e 95 % em peso ser alcançado. Após isso, a agitação continuou por cerca de uma hora adicional à temperatura ambiente. Surpreendentemente, a formação de duas fases, uma fase oleosa e uma fase aquosa, pode ser observada em um teor de matéria seca total de mais de 60 % em peso. A fase oleosa pode ser diretamente separada da fase aquosa por centrifugação. A centrifugação foi executada por 5 minutos em 12.000 g, se não indicado de outro modo.

[0128] Nas seguintes tabelas, a influência de diferentes parâmetros no rendimento de óleo é revelada. Tabela 1: Influência de concentração na separação de fase e rendimento de óleo

Matéria Seca Separação de Quantidade de Ácidos Total [% em fase óleo isolado graxos peso] [% em peso] livres [% em peso] 42,0 Não -- -- 45,2 Não -- -- 60 Não -- -- 63 Sim 85,3 0,4 72,6 Sim 85,1 0,5 74,6 Sim 85,3 0,4 79 Sim 80,0 0,4 95 Sim não det. não det.

[0129] Como pode ser visto a partir da tabela 1, uma separação de fase eficaz, isto é, desemulsificação, ocorre em um teor de matéria seca total na suspensão de mais de 60 % em peso, levando a um rendimento de óleo isolado de pelo menos 80 % em peso, em que o óleo contém apenas uma quantidade relativamente pequena de ácidos graxos livres de não mais que 0,5 % em peso.

[0130] Tabela 2: Influência de medida mecânica no rendimento de óleo Matéria Seca Força Quantidade de Ácidos graxos Total [% em centrífuga óleo isolado livres [% em peso] [g] [% em peso] peso] 79,2 4000 80,0 0,4 73,8 4000 79,9 não det. 73,8 12000 88,0 não det.

[0131] Como pode ser visto a partir da tabela 2, o rendimento é aprimorado, quando uma força centrífuga maior é aplicada. A centrifugação foi executada por 5 minutos, respectivamente.

Tabela 3: Influência de valor de pH no rendimento de óleo Matéria valor Quantidade Ácidos Cinza [% TAG Seca de pH de óleo graxos em peso] polimerizado Total isolado [% livres [% em peso] [% em em peso] [% em peso] peso] 75,7 5 80,1 0,3 17 não det. 73,4 7 82,4 0,25 27 não det. 72,3 9 79,8 0,2 30 0,56

[0132] Como pode ser visto a partir da tabela 3, o ajuste do valor de pH antes de executar a desemulsificação não tinha grande influência sobre o rendimento de óleo, mas o uso de um caldo de fermentação lisado na desemulsificação sem a adição de cáusticos resultou em uma suspensão com um teor de cinzas relativamente pequeno de menos que 20 % em peso. Além disso, pode ser aprendido que independente do valor de pH, teores muito baixos de ácidos graxos livres - tão baixos quanto 0,2 % em peso - podem ser realizados pelos métodos de acordo com a invenção. – Além disso, constatou-se que os métodos de acordo com a invenção levam a produtos com uma quantidade muito baixa de TAGs polimerizados.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de isolamento de um lipídio a partir de uma biomassa contendo lipídio caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) Fornecer uma suspensão de uma biomassa que compreende células que contêm um lipídio; b) Lisar opcionalmente as células da biomassa; c) Concentrar a suspensão, até a razão de volume entre óleo e água na suspensão exceder o valor de 1; d) Separar a fase leve contendo óleo da fase aquosa.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a suspensão é concentrada a um teor de matéria seca total (TDM) de mais de 60 % em peso, de preferência, a um teor de TDM entre 60 e 98 % em peso, em particular, a um teor de TDM entre 65 e 90 % em peso, com mais preferência, a um teor de TDM entre 65 e 80 % em peso.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a concentração da suspensão é executada pela evaporação de água a uma temperatura não maior que 100 °C, de preferência, a uma temperatura entre 70 °C e 100 °C, com mais preferência, a uma temperatura entre 80 °C a 90 °C.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a lise das células da biomassa é executada enzimática, mecânica, química e/ou fisicamente.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a suspensão é fornecida como um caldo de fermentação e/ou com uma densidade de biomassa de pelo menos 80 ou 100 g/l, em particular, de 80 ou 100 g/l a 250 g/l, de preferência, pelo menos 120 ou 140 g/l, em particular, 120 ou 140 g/l a 220 g/l, com mais preferência, pelo menos 160 ou 180 g/l, em particular, 160 g/l a 200 g/l.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células da biomassa compreendem em média pelo menos 10 % em peso de lipídios, de preferência, pelo menos 20 ou 30 % em peso de lipídios, com mais preferência, pelo menos 40 ou 50 % em peso de lipídios.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as células que contêm os lipídios contêm um lipídio contendo PUFAs e são selecionadas a partir de algas, fungos, protistas, bactérias, microalgas, células vegetais, e misturas dos mesmos, em que as microalgas são preferencialmente selecionadas a partir do filo Stramanopiles, em particular, da família Thraustochytrids.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo o método caracterizado por ser executado, pelo menos essencialmente, sem a adição de solventes ou produtos cáusticos.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo o método caracterizado por ser executado, pelo menos essencialmente, sem a adição de quaisquer solventes, soda cáustica ou hidróxido de sódio.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o pH é mantido abaixo de 9, em particular, entre 4,5 e 9, de preferência, abaixo de 8,5, em particular, entre 4,5 e 8,5, durante o processo completo.

11. Óleo que compreende ésteres de ácido graxo, em particular, triacilgliceróis (TAGs), em uma quantidade de pelo menos 50 % em peso, de preferência, pelo menos 70 ou 80 % em peso, em particular, em uma quantidade de pelo menos 85 ou 90 % em peso, caracterizado por compreender ácidos graxos livres (FFAs) em uma quantidade de menos que 0,6 % em peso, de preferência, em uma quantidade de menos que 0,5 ou 0,4 % em peso, em particular, em uma quantidade de não mais que 0,3 ou 0,2 % em peso.

12. Óleo, de acordo com a reivindicação 11, que compreende TAGs em uma quantidade de pelo menos 50 % em peso, caracterizado por compreender TAGs polimerizados em uma quantidade de menos que 1,0 % em peso, de preferência, em uma quantidade de menos que 0,8 % em peso, em particular, em uma quantidade de menos que 0,6 % em peso.

13. Biomassa deslipidada caracterizada por compreender menos que 30 % em peso de sais e/ou cinzas, de preferência, 10 a 25 % em peso, em particular, 15 a 20 % em peso, de sais e/ou cinzas e, de preferência, menos que 2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,5 % em peso, em particular, menos que 0,1 % em peso, de um solvente orgânico não polar e, de preferência, menos que 2 % em peso, com mais preferência, menos que 0,5 % em peso, em particular, menos que 0,1 % em peso, de cloreto, em que a biomassa contém, de preferência, células e/ou debris celulares do filo de Stramanopiles, em particular, da família Thraustochytrids, de preferência, do gênero Schizochytrium.

14. Suspensão aquosa que contém uma biomassa deslipidada caracterizada por um teor de sais e/ou cinzas de menos que 15 % em peso, de preferência, 6 a 10 % em peso, e de preferência, um teor de solventes não polares orgânicos de menos que 1 % em peso, de preferência, menos que 0,1 % em peso e, de preferência, um teor de cloreto de menos que 1 % em peso, de preferência, menos que 0,1 % em peso, em que a biomassa contém, de preferência, células e/ou debris celulares do filo de Stramanopiles, em particular, da família de Thraustochytrids, com mais preferência, do gênero Schizochytrium, e em que a suspensão aquosa se caracteriza, de preferência, por um teor de matéria seca total de 20 a 60 % em peso.

15. Método de alimentação de animais, em particular, gado bovino, caracterizado pelo fato de que um óleo conforme definido na reivindicação 11 ou 12, ou biomassa conforme definida na reivindicação 13, ou uma suspensão aquosa conforme definida na reivindicação 14, é fornecido aos animais, de preferência, após a mistura do óleo, biomassa e/ou a suspensão aquosa com ingredientes de composição alimentícia adicionais.