BR112013032771B1 - dipeptídio quimicamente e metabolicamente estável possuindo potente atividade bloqueadora de canais de sódio - Google Patents

Abstract

DIPEPTÍDIO QUIMICAMENTE E METABOLICAMENTE ESTÁVEL POSSUINDO POTENTE ATIVIDADE BLOQUEADORA DE CANAIS DE SÓDIO. A invenção refere-se a um bloqueador de canais de sódio muito estável, seletivo e seguro em relação aos rins representado pela fórmula: (I) A invenção também inclui uma variedade de composições, combinações e métodos de tratamento usando este bloqueador de canais de sódio inventivo.

Description

DIPEPTÍDIO QUIMICAMENTE E METABOLICAMENTE ESTÁVEL POSSUINDO POTENTE ATIVIDADE BLOQUEADORA DE CANAIS DE SÓDIO Antecedentes da Invenção

O presente pedido reivindica prioridade para o pedido US Série N° 61/501,524, depositado em 27 de junho de 2011, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao bloqueador de canais de sódio epiteliais 3,5-diamino-6-cloro-N-(N-(4-(4-((S)-3-(dimetilamino)-4-((S)-1-(dimetilamino)-6-guanidino-1-oxo-hexan-2-ilamino)-4-oxobutil)fenil)butil)carbamimidoil)pirazina-2-carboxamida (I). A presente invenção também inclui uma variedade de métodos de tratamento usando este bloqueador de canais de sódio inventivo. A presente invenção também se refere a novos compostos para o tratamento de olho ressecado, particularmente incluindo 3,5-diamino-6-cloro-N-(N-(4-(4-((S)-3-(dimetilamino)-4-((S)-1 -(dimetilamino)-6-guanidino-1 -oxo-hexan-2-ilamino)-4-oxobutil)fenil)butil)carbamimidoil)pirazina-2-carboxamida (I) e suas formas de sal farmaceuticamente aceitáveis, úteis como bloqueadores de canais de sódio, composições contendo os mesmos, métodos terapêuticos e usos para os mesmos e processos para preparação dos mesmos.

Descrição da Técnica Anterior

As superfícies mucosas na interface entre o ambiente e o corpo desenvolveram inúmeras “defesas inatas”, isto é, mecanismos de proteção. Uma forma principal de tal defesa inata é limpar essas superfícies com um líquido. Tipicamente, a quantidade da camada de líquido sobre uma superfície mucosa reflete o equilíbrio entre a secreção de líquido epitelial, com frequência refletindo a secreção de ânions (C1- e/ou HCO3-) acoplada com água (e um contraíon catiônico), e a absorção de líquido epitelial, com frequência refletindo a absorção de Na+, acoplada com água e um contra-ânion (C1- e/ou HCO3-). Muitas doenças das superfícies mucosas são causadas por muito pouco líquido protetor sobre essas superfícies mucosas criado por um desequilíbrio entre secreção (pouca demais) e absorção (relativamente demasiada). Os processos de transporte de sal defeituosos que caracterizam essas disfunções mucosas residem na camada epitelial da superfície mucosa.

Uma abordagem para repor a camada de líquido protetor sobre as superfícies mucosas é "reequilibrar" o sistema bloqueando o canal de Na+ e a absorção de líquido. A proteína epitelial que medeia a etapa limitadora da taxa de absorção de Na+ e líquido é o canal de Na+ epitelial (ENaC). O ENaC fica situado sobre a superfície apical do epitélio, isto é, interface superfície mucosa-ambiente. Por conseguinte, para inibir a absorção de Na+ e líquido mediada pelo ENaC, um bloqueador de ENaC da classe amiloride (que bloqueia a partir do domínio extracelular do ENaC) deve ser distribuído para a superfície mucosa e, mais importante, ser mantido neste sítio, para ter utilidade terapêutica. A presente invenção descreve doenças caracterizadas por muito pouco líquido sobre as superfícies mucosas e bloqueadores de canais de sódio "tópicos" desenhados para exibir a potência aumentada, a absorção reduzida na mucosa, e a dissociação lenta ("desligamento" ou desprendimento) do ENaC requeridas para terapia dessas doenças.

As doenças pulmonares obstrutivas crônicas caracterizam-se por desidratação das superfícies das vias aéreas e pela retenção de secreções de muco nos pulmões. Exemplos de tais doenças incluem fibrose cística, bronquite crônica, e discinesia ciliar primária ou secundária. Tais doenças afetam aproximadamente 15 milhões de pacientes nos Estados Unidos, são a sexta principal causa de morte. Outras doenças das vias aéreas ou pulmonares caracterizadas pelo acúmulo de secreções de muco retidas incluem sinusite (uma inflamação dos seios paranasais associada à infecção respiratória superior) e pneumonia.

Bronquite crônica (CB), incluindo a forma genética letal mais comum de bronquite crônica, fibrose cística (CF), são doenças que refletem a falha do corpo em depurar muco normalmente dos pulmões, o que essencialmente produz uma infecção crônica das vias aéreas. No pulmão normal, a defesa primária contra infecção crônica das vias intrapulmonares (bronquite crônica) é mediada pela depuração contínua de muco das superfícies das vias aéreas brônquicas. Esta função na saúde remove efetivamente do pulmão as toxinas e os patógenos potencialmente nocivos. Dados recentes indicam que o problema inicial, isto é, o “defeito básico”, tanto em CB quanto CF é a falha em depurar muco das superfícies das vias aéreas. A falha em depurar muco reflete um desequilíbrio entre a quantidade de líquido e mucina sobre as superfícies das vias aéreas. Este "líquido nas superfícies das vias aéreas" (ASL) é principalmente composto de sal e água em proporções similares à do plasma (isto é, isotônico). As macromoléculas de mucina se organizam em uma "camada de muco" bem definida que normalmente prende as bactérias inaladas e é transportada para fora do pulmão via as ações dos cílios que tocam em uma solução aquosa de baixa viscosidade denominada "líquido periciliar" (PCL). No estado de doença, existe um desequilíbrio nas quantidades de muco como ASL nas superfícies das vias aéreas. Isto resulte em uma redução relativa no ASL que leva à concentração de muco, redução na atividade lubrificante do PCL, e uma falha em depurar muco via a atividade ciliar para a boca. A redução na depuração mecânica de muco do pulmão leva à colonização bacteriana crônica de muco aderente às superfícies das vias aéreas. É a retenção crônica de bactérias, a falta de substâncias antimicrobianas locais para eliminar as bactérias aprisionadas no muco em uma base crônica, e as consequentes respostas inflamatórias crônicas do corpo a esse tipo de infecção superficial que levam a síndromes de CB e CF.

A atual população acometida nos Estados Unidos é de 12.000.000 pacientes com a forma adquirida (principalmente por causa da exposição à fumaça de cigarro) de bronquite crônica e aproximadamente 30.000 pacientes com a forma genética fibrose cística. Números aproximadamente iguais de ambas as populações estão presentes na Europa. Na Ásia, há poucos casos de CF mas a incidência de CB é grande e, como no resto do mundo, está crescendo.

Há atualmente uma grande necessidade médica ainda não satisfeita de produtos que tratem especificamente CB e CF no nível do defeito básico que causa que estas doenças. As terapias atuais para bronquite crônica e fibrose cística concentram-se no tratamento dos sintomas e/ou nos efeitos tardios dessas doenças. Por conseguinte, para bronquite crônica, β-agonistas, esteroides inalados, agentes anticolinérgicos, e inibidores de teo-filinas e fosfodiesterase orais estão todos em fase de desenvolvimento. No entanto, nenhuma dessas drogas trata efetivamente o problema fundamental da falha em depurar muco do pulmão. Similarmente, na fibrose cística, o mesmo espectro de agentes farmacológicos é usado. Estas estratégias foram complementadas por estratégicas mais recentes desenhadas para depurar o pulmão CF do DNA ("Pulmozyme"; Genentech) que fora depositado no pulmão por neutrófilos que tentaram inutilmente eliminar as bactérias que cresceram em massas de muco aderentes e através do uso de antibióticos inalados ("TOBI") desenhados para aumentar os mecanismos de extermínio do próprio pulmão para se livrar das placas de muco aderentes com bactérias. Um princípio geral do corpo é que se a lesão inicial não for tratada, neste caso retenção/obstrução de muco, as infecções bacterianas ficam crônicas e cada vez mais refratárias à terapia antimicrobiana. Portanto, uma importante necessidade terapêutica ainda não satisfeita para as doenças pulmonares CB e CF é um meio eficaz de reidratação do muco das vias aéreas (isto é, restaurar/expandir o volume do ASL) e promover sua depuração, com bactérias, do pulmão.

R.C. Boucher, no documento US 6.264.975, descreve o uso de bloqueadores de canais de sódio to itpo pirazinoilguanidina para hidratar superfícies mucosas. Esses compostos, exemplificados pelos diuréticos bastante conhecidos amiloride, benzamil, e fenamil, são eficazes. No entanto, esses compostos sofrem da significativa desvantagem de que eles são (1) relativamente impotentes, o que é importante porque a massa de fárma-co que pode ser inalada pelo pulmão é limitada; (2) rapidamente absorvidos, o que limita a meia-vida da fármaco sobre a superfície mucosa; e (3) são livremente dissociáveis do ENaC. A soma dessas desvantagens incorporadas nesses diuréticos bastante conhecidos produz compostos com potência insuficiente e/ou meia-vida efetiva sobre superfícies mucosas para terem benefício terapêutico para hidratar superfícies mucosas.

R. C. Boucher, na Patente US N° 6.926.911, sugere o uso de bloqueadores de canais de sódio relativamente impotentes tais como amilo-ride, com osmólitos para o tratamento de doenças das vias aéreas. Esta combinação não oferece qualquer vantagem prática sobre qualquer dos tratamentos isolado e não é clinicamente útil, vide Donaldson et al., N Eng J Med., 2006; 353:241-250. Foi descoberto que o amiloride bloqueia a permeabilidade das vias áreas à água e anula o benefício potencial de uso concomitante de solução salina hipertônica e amiloride.

A Patente US N° 5.817.028 concedida a Anderson descreve um método para provocar o estreitamento das passagens aéreas (para avaliar a suscetibilidade à asma) e/ou induzir escarro em indivíduos via a inalação de manitol. Foi sugerido que a mesma técnica pode ser usada para induzir escarro e promover a depuração mucociliar. As substâncias sugeridas incluem cloreto de sódio, cloreto de potássio, manitol e dextrose.

Nitidamente, o que é necessário são drogas que sejam mais eficazes em restaurar a depuração de muco dos pulmões de pacientes com CB/CF. O valor dessas novas terapias será refletido nas melhoras na qualidade e na duração de vida das populações com CF e com CB.

Outras superfícies mucosas tanto no corpo quanto sobre ele exibem diferenças sutis na fisiologia normal dos líquidos superficiais protetores em suas superfícies mas a patofisiologia da doença reflete um tema comum, isto é, muito pouco líquido superficial protetor. Por exemplo, na xerostomia (boca seca) a cavidade oral fica exaurida de líquido devido a uma falha das glândulas parótidas sublinguais e submandibulares em secretar líquido apesar da contínua absorção de líquido mediada pelo transporte de Na+ (ENaC) a partir da cavidade oral.

Similarmente, a ceratoconjuntivite seca (olho ressecado) é causada pela falha das glândulas lacrimais em secretar líquido na face de absorção contínua de líquido dependente de Na+ nas superfícies conjuntivais. A ceratoconjuntivite seca (KCS) ou doença crônica do olho ressecado (DED) é uma das doenças oftalmológicas diagnosticadas com mais frequência, resultando em irritação dolorosa, inflamação na superfície ocular, e visão prejudicada. A KCS/DED resulta de fluido lacrimal aquoso inadequado nos olhos. O olho ressecado é uma das doenças oftalmológicas diagnosticadas com mais frequência afetando mais de 5 milhões de pessoas só nos Estados Unidos. O olho ressecado é uma doença multifatorial, que resulta de uma etiologia comum de filme lacrimal insuficiente causando lesões na superfície ocular e sintomas de desconforto ocular. As poucas terapias atualmente disponíveis, que incluem agentes imunossupressores e reposição lacrimal de venda controlada, não são suficientemente eficaz para muitos usuários ou só proporcionam alívio passageiro dos sintomas do olho ressecado. Portanto, o desenvolvimento de novos agentes para tratar olho ressecado trariam um tremendo benefício para o meio terapêutico. O volume de filme lacrimal sobre a superfície ocular representa um equilíbrio entre a produção de fluido lacrimal versus a perda de fluido via drenagem, evaporação, ou absorção epitelial. Similar a outros tecidos epiteliais, o epitélio da conjuntiva e da córnea são capazes de regular o estado de hidratação da superfície mucosa através do transporte de sal ativo e água. O canal de sódio epitelial (ENaC) é um regulador essencial da absorção de sódio (e água) em números tecidos, inclusive o olho. Acredita-se que a inibição de ENaC no olho preserve as secreções lacrimais mantenha a hidratação da superfície ocular.

Na rinossinusite, existe um desequilíbrio, como na CB, entre a secreção de mucina e a depleção relativa de ASL. Finalmente, no trato gastrointestinal, a falha em secretar C1- (e líquido) no intestino delgado proximal, combinada com a absorção aumentada de Na+ (e líquido) no íleo terminal leva à síndrome de obstrução intestinal distal (DIOS). Em pacientes mais velhos a absorção excessiva de Na+ (e volume) no cólon descendente produz constipação e diverticulite.

A literatura publicada inclui inúmeros pedidos de patente e patentes concedidas a Parion Sciences Inc., voltadas para análogos de pirazi-noilguanidina como bloqueadores de canais de sódio. Exemplos de tais publicações incluem as Publicações PCT N°s WO2003/070182, WO2003/070184, WO2004/073629, WO2005/025496, WO2005/016879, WO2005/018644, WO2006/022935, WO2006/023573, WO2006/023617, WO2007/018640, WO2007/146869, WO2008/031028, WO2008/031048, e nas Patentes US N°s 6858614, 6858615, 6903105, 7064129, 7186833, 7189719, 7192958, 7192959, 7192960, 7241766, 7247636, 7247637, 7317013, 7332496, 7368447, 7368450, 7368451, 7375102, 7388013, 7399766, 7410968, 7807834, 7842697, e 7868010.

Permanece a necessidade de novos compostos bloqueadores de canais de sódio com potência e eficácia melhoradas em tecidos mucosos. Também permanece a necessidade de novos compostos bloqueadores de canais de sódio que proporcionam um efeito terapêutico, mas minimizam ou eliminam o aparecimento ou a progressão em hipercalemia nos receptores.

Sumário da Invenção

Constitui um objetivo da presente invenção oferecer um composto que seja estável em formulações líquidas adequadas para administração tópica.

Constitui um objetivo da presente invenção oferecer um composto que seja mais potente in vivo e/ou absorvido menos rapidamente das superfícies mucosas, e/ou que seja reversível em comparação com compostos conhecidos tais como amiloride, benzamil e fenamil.

Constitui um outro objetivo da presente invenção oferecer compostos que sejam (1) absorvidos menos rapidamente das superfícies mucosas, especialmente das superfícies das vias aéreas, em comparação com compostos conhecidos e; (2) quando absorvidos das superfícies mucosas depois de administração às superfícies mucosas, sejam largamente não absorvidos pelos rins evitando assim efeitos coletais renais tais como hiperca-lemia.

Constitui um outro objetivo da presente invenção oferecer métodos de tratamento que tiram vantagem das propriedades farmacológicas dos compostos descritos acima.

Em particular, constitui um objetivo da presente invenção oferecer métodos de tratamento que dependem da reidratação de superfícies mucosas.

Em particular, constitui um objetivo da presente invenção oferecer métodos de tratamento de olho ressecado e doenças oftalmológicas relacionadas.

Os objetivos da presente invenção podem atingidos com uma pirazinoilguanidina representada pelo composto de fórmula (I):

A presente invenção também oferece composições farmacêuticas que compreendem o composto descrito neste relatório.
A presente invenção também oferece um método para promover a hidratação de superfícies mucosas, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a uma superfície mucosa de um indivíduo.
A presente invenção também oferece um método para restaurar a defesa da mucosa, compreendendo:
administrar por via tópica uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a uma superfície mucosa de um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para bloquear o ENaC, compreendendo:
contactar canais de sódio com uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório.
A presente invenção também oferece um método para promover a depuração de muco em superfícies mucosas, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a uma superfície mucosa de um indivíduo.
A presente invenção também oferece um método para o tratamento de bronquite crônica, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de fibrose cística, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de rinossinusite, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de desidratação nasal, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório às passagens nasais de um indivíduo com necessidade do mesmo.
Em uma modalidade específica, the desidratação nasal provocada por administração de oxigênio seco ao indivíduo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de sinusite, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de pneumonia, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de pneumonia induzida por ventilador, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo por meio de um ventilador.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de asma, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de discinesia ciliar primária, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de otite média, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para indução de escarro para fins de diagnóstico, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de doença pulmonar obstrutiva crônica, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de enfisema, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de olho ressecado, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório ao olho do indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para promover a hidratação do olho, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório ao olho do indivíduo.
A presente invenção também oferece um método para promover a hidratação da córnea, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório ao olho do indivíduo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento da doença de Sjogren, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de secura vaginal, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório ao trato vaginal de um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de pele ressecada, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório à pele de um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de boca seca (xerostomia), compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório à boca do indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento da síndrome de obstrução intestinal distal, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de esofagite, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de bronquiectasia, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de constipação, compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo. Em uma modalidade deste método, o composto é administrado seja por via oral ou via um supositório ou enema.
A presente invenção também oferece um método para tratamento de diverticulite crônica compreendendo:
administrar uma quantidade eficaz do composto I descrito neste relatório a um indivíduo com necessidade do mesmo.

Constitui um outro aspecto da presente invenção oferecer tratamentos usando o bloqueador de canais de sódio quando administrado com um melhorador osmótico. Portanto, tal bloqueador de canais de sódio de fórmula I quando usado em conjunto com osmólitos vai proporcionar uma meia-vida farmacodinâmica prolongada sobre as superfícies mucosas em comparação com qualquer um dos compostos usados isoladamente.

Constitui um outro objetivo da presente invenção oferecer tratamentos usando em conjunto o bloqueador de canais de sódio de fórmula (I) e osmólitos que são absorvidos menos rapidamente das superfícies mucosas, especialmente das superfícies das vias aéreas.

Constitui um outro objetivo da invenção oferecer composições que contêm um bloqueador de canais de sódio de fórmula (I) e osmólitos.

Os objetivos da invenção podem ser atingidos com um método de tratamento de uma doença melhorada por depuração mucociliar e hidratação da mucosa aumentadas compreendendo administrar uma quantidade eficaz do composto de fórmula (I) já definido neste relatório e um osmólito a um indivíduo com necessidade de depuração mucociliar e hidratação da mucosa aumentadas.

Os objetivos da invenção também podem ser atingidos com um método de indução de escarro para fins de diagnóstico, compreendendo administrar uma quantidade eficaz do composto de fórmula (I) já definido neste relatório e um osmólito a um indivíduo com necessidade do mesmo.

Os objetivos da invenção também podem ser atingidos com um método de tratamento de antraz, compreendendo administrar uma quantidade eficaz do composto de fórmula (I) já definido neste relatório e um osmóli-to a um indivíduo com necessidade do mesmo.

Os objetivos da invenção também podem ser atingidos com um método de tratamento profilático, profilático após exposição, preventivo ou terapêutico contra doenças ou condições causadas por patógenos, particularmente patógenos que podem ser usados em bioterrorismo, compreendendo administrar uma quantidade eficaz do composto de fórmula (I) a um indivíduo com necessidade do mesmo.

Os objetivos da invenção também podem ser atingidos com uma composição, compreendendo composto de fórmula (I) já definido neste relatório e um composto osmoticamente ativo.

Descrição das Figuras

Figura 1: Curva de dose resposta da inibição de ENaC com P1046 (I) e amiloride. A potência do P-1046 em comparação com a do amilo-ride foi gerado em estudos na câmara Ussing usando culturas primárias de células epiteliais brônquicas caninas. O P-1046 é 100 vezes mais potente que o amiloride segundo indicado pelo desvio para a esquerda na curva de dose resposta.
Figura 2: Os efeitos da concentração de P-1046 (fórmula I, 15) sobre a produção de lágrimas em ratos ExLac. Os valores brutos da produção de lágrimas PRT estão mostrados no painel da esquerda e os corrigidos para a linha basal estão mostrados no painel da direita. Em todas as concentrações, o P-1046 aumenta a produção de lágrimas em ratos ExLac 15 minutos até os valores ou ligeiramente abaixo dos valores de produção de lágrimas observados para ratos normais. Os efeitos ainda são observados 2 horas após a aplicação, à exceção do grupo que recebeu uma dose de 0,1 mM. n=4 para todos os grupos.
Figura 3: A depuração de P-1046 (fórmula I, 15) da superfície ocular. A concentração de P-1046 foi determinada usando os procedimentos descritos acima determinando a massa de P-1046 extraída de cada filamento e determinada a concentração com base no volume de fluido torcido sobre o filamento. Para todas as concentrações testadas, o P-1046 exibe uma depuração bifásica aparente, com o que a maior parte da fármaco é depurada da superfície ocular em 30 minutos após a aplicação, seguida por uma fase de depuração lenta de 30 a 120 minutos após a aplicação. Observe que a concentração de P-1046 durante a fase de depuração lenta para concentração =1 mM está bem acima do IC50 para P-1046 (5,3 nM), proporcionando assim um aumento de longa duração no volume de lágrima.
Figura 4: Figura 4. Os efeitos de P-1046 10 mM (fórmula I, 15) sobre a produção de lágrimas em ratos ExLac. Os valores brutos da produção de lágrimas PRT estão mostrados no painel da esquerda e os corrigidos para a linha basal estão mostrados no painel da direita. Uma única dose de 10 mM de P-1046 produz um volume de lágrima aumentado em relação aos controles com veículo. Embora os dados brutos da produção de lágrimas não sejam significativos além de 60 minutos (refletindo os valores basais mais altos para animais de controle em relação aos animais tratados com P1046), os dados corrigidos para a linha basal são estatisticamente significativos em todos os pontos do tempo após a aplicação (p < 0,03) n=3 para ambos os grupos.
Figura 5: Análise por HPLC de amostras de P-1046 (fórmula I, 15) quanto à solubilidade/estabilidade no dia 1 e no 10. Nenhuma degradação do P-1046 foi observada depois de 10 dias a 50°C em tampão citrato pH 4,2 com 2,8% de NaCl. O P-1046 foi completamente solúvel neste tampão à concentração mais alta testada de 8,8 mg/mL.
Figura 6: Sumário da tolerabilidade ocular do P-1046. (A) Os escores Draize cumulativos para cada grupo de dose e cada intervalo de aplicação (os dados são a soma de todos os escores Draize para o olho direito). Os dois regimes de aplicação para P-1046 mostram apenas ligeiros aumentos nos escores Draize que não são maiores que aqueles observados para os animais tratados com veículo. A título de comparação, um composto identificado como irritante no mesmo estudo está mostrado em amarelo. (B) O índice de piscar médio para cada grupo de dose em cada intervalo de aplicação. Os dois regimes de aplicação para P-1046 mostram apenas ligeiros aumentos em alguns pontos, da maneira similar aos animais tratados com veículo. Estes dados sugerem que o P-1046 a 10 e 30 mM não provoca ardência ao ser instilado.
Figura 7: Níveis plasmáticos de P-1046 depois de aplicação ao olho. (A) Os níveis plasmáticos de animais individuais durante e depois de 8 doses de P-1046 10 mM (50 ul/dose). (B) Os níveis plasmáticos de animais individuais durante e depois de 4 doses de P-1046 30 mM (50 ul/dose).

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção baseia-se na descoberta de que o composto de fórmula (I) é mais potente e/ou absorvido menos rapidamente das superfícies mucosas, especialmente das superfícies das vias aéreas, em comparação com bloqueadores de canais de sódio conhecidos tais como ami-lorde, benzamil, e fenamil. Portanto, o composto de fórmula (I) têm uma meia-vida mais longa nas superfícies mucosas quando comparado com esses compostos.

A presente invenção também se baseia na descoberta de que certos compostos abrangidos pela fórmula (I) são (1) absorvidos menos rapidamente das superfícies mucosas, especialmente das superfícies oculares, quando comparados com compostos conhecidos e (2) quando absorvidos das superfícies mucosas depois de administração às superfícies mucosas, são excretados principalmente por vias não renais para minimizar as chances de hipercalemia.

A presente invenção também se baseia na descoberta de que certos compostos abrangidos pela fórmula (I) proporcionam métodos de tratamento que tiram vantagem das propriedades farmacológicas dos compostos descritos acima.

Em particular, a presente invenção também se baseia na descoberta de que certos compostos abrangidos pela fórmula (I) reidratam as superfícies mucosas.

Em particular, a presente invenção também se baseia na descoberta de que certos compostos abrangidos pela fórmula (I) são úteis no tratamento de olho ressecado e doenças oftalmológicas relacionadas.

O composto I descrito neste relatório pode ser preparado e usado como a base livre. Alternativamente, o composto pode ser preparado e usado como um sal farmaceuticamente aceitável. Sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que conservam ou melhoram a atividade biológica desejada do composto parental e não conferem efeitos toxicológicos indeseja-dos. Exemplos de tais sais são (a) sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, entre outros; (b) sais formados com ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucônico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tânico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácido naftalenossulfôni-co, ácido metanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido naftalenodis-sulfônico, ácido poligalacturônico, ácido malônico, ácido sulfossalicílico, ácido glicólico, 2-hidroxi-3-naftoato, pamoato, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido ftálico, ácido mandélico, ácido láctico, entre outros; e (c) sais formados a partir de ânions elementais, por exemplo, cloro, bromo, e iodo.

Deve ser observado que todos os enantiômeros, diastereômeros e misturas racêmicas, tautômeros, polimorfos, pseudopolimorfos e sais farmaceuticamente aceitáveis do composto dentro do escopo da fórmula (I) estão abrangidos pela presente invenção. Todas as misturas de tais enanti-ômeros e diastereômeros estão dentro do escopo da presente invenção.

Um composto de fórmula I e seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem existir como diferentes polimorfos ou pseudopolimorfos. Conforme usado neste relatório, polimorfismo cristalino significa a capacidade de um composto cristalino existir em diferentes estruturas cristalinas. O polimorfismo cristalino pode resultar de diferenças no arranjo do cristal ("crystal packing”) (polimorfismo de arranjo ["packing polymorphism") ou a diferenças no arranjo entre diferentes confômeros da mesma molécula (polimorfismo conformacional). Conforme usado neste relatório, pseudopolimorfismo cristalino significa a capacidade de um hidrato ou solvato de um composto para existir em diferentes estruturas cristalinas. Os pseudopolimorfos da presente invenção podem existir devido a diferenças no arranjo do cristal (pseudopolimorfismo de arranjo) ou devido a diferenças no arranjo entre diferentes confômeros da mesma molécula (pseudopolimorfismo conforma-cional). A presente invenção compreende todos os polimorfos e pseudopo-limorfos dos compostos de fórmula I e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Um composto de fórmula I e seus sais farmaceuticamente aceitáveis também podem existir como um sólido amorfo. Conforme usado neste relatório, um sólido amorfo é um sólido no qual não existe qualquer ordem de longo alcance das posições dos átomos no sólido. Esta definição também se aplica quando o tamanho do cristal é de dois nanômetros ou menos. Aditivos, incluindo solventes, podem ser usados para criar as formas amorfas da presente invenção. A presente invenção compreende todas as formas amorfas dos compostos de fórmula I-III e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

O composto de fórmula I pode existir em diferentes formas tau-toméricas. O especialista na técnica vai reconhecer que guanidinas podem existir em formas tautoméricas. A título de exemplo e não a título limitativo, os compostos de fórmula I podem existir em várias formas tautoméricas como mostrado abaixo:

Todas as formas tautoméricas possíveis das guanidinas e acil guanidinas de todas as modalidades da fórmula I estão dentro do escopo da presente invenção.

"Enantiômeros" refere-se a dois estereoisômeros de um composto que são imagens especulares não-superponíveis um do outro.

As definições e convenções estereoquímicas usadas neste relatório geralmente seguem S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; e Eliel, E. & Wi-len, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Muitos compostos orgânicos existem em formas oticamente ativas, isto é, eles têm capacidade para girar o plano de luz plano-polarizada. Ao descrever um composto oticamente ativo, os prefixos D e L ou R e S são usados para indicar a configuração da molécula em torno de seus centros quirais. Os prefixos d e l, D e L, ou (+) e (-) são empregados para designar o sinal de rotação da luz plano-polarizada pelo composto, com S, (-), ou 1 indicando que o composto é levogiratório ao passo que um composto com o prefixo R, (+), ou d é dextrogiratório. Para uma dada estrutura química, estes estereoisômeros são idênticos exceto que eles são imagens especulares um do outro. Um estereoisômero específico também pode ser mencionado como um enantiômero, e uma mistura de tais isômeros geralmente é chamada de mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enan-tiômeros é chamada de mistura racêmica ou racemato, que pode ocorrer onde não há estereosseleção ou estereoespecificidade em uma reação ou processo químico. Os termos "mistura racêmica" e "racemato" referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, destituídas de atividade ótica.

Um estereoisômero simples, por exemplo, um enantiômero, substancialmente livre de seus estereoisômero pode ser obtido por resolução da mistura racêmica usando-se um método tal como formação de dias-tereômeros usando agentes de resolução oticamente ativos ("Stereochemistry of Carbon Compounds," (1962) de E. L. Eliel, McGraw Hill; Lochmuller, C. H., (1975) J. Chromatogr., 113:(3) 283-302). As misturas racêmicas de compostos quirais da invenção podem ser separadas e isoladas por qualquer método adequado, incluindo: (2) formação de sais diastereoméricos iônicos com compostos quirais e separação por cristalização fracionada ou outros métodos, (2) formação de compostos diastereoméricos com reagentes derivatizantes quirais, separação dos diastereômeros, e conversão nos estereoisômeros puros, e (3) separação dos estereoisômeros substancialmente puros ou enriquecidos diretamente em condições quirais.

O termo "diastereômero" refere-se a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens especulares uma da outra. Diastereômeros possuem propriedades físicas diferentes, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais, e reatividades. As misturas de diastereômeros podem ser separadas por procedimentos analíticos de alta resolução tais como eletroforese e cromatografia.

Sem querermos nos ater a qualquer teoria particular, acreditamos que o composto de fórmula (I) in vivo age como bloqueador de canais de sódio. Ao bloquear os canais de sódio epiteliais presentes nas superfícies mucosas os compostos de fórmula (I) reduzem a absorção de água pelas superfícies mucosas. Este efeito aumenta o volume de líquidos protetores nas superfícies mucosas, reequilibra o sistema, e assim trata a doença.

A presente invenção também oferece métodos de tratamento que tiram vantagem das propriedades dos compostos descritos nesta invenção já discutidos acima. Portanto, indivíduos que podem ser tratados pelos métodos da presente invenção incluem, porém sem limitação, pacientes acometidos por fibrose cística, discinesia ciliar primária, bronquite crônica, bronquiectasia, doença obstrutiva crônica das vias aéreas, pacientes ventilados artificialmente, pacientes com pneumonia aguda etc. A presente invenção pode ser usada para obter uma amostra de escarro de um paciente por administração dos compostos ativos a pelo menos um pulmão do paciente, e em seguida indução ou coleta de uma amostra de escarro daquele paciente. Tipicamente, a invenção será administrada às superfícies mucosas respiratórias via aerossol (pós líquidos ou secos) ou lavagem.

Indivíduos que podem ser tratados pelo método da presente invenção também incluem pacientes que recebem oxigênio suplementar por via nasal (um regime que tende a secar as superfícies das vias aéreas); pacientes acometidos por uma doença ou resposta alérgica (por exemplo, uma resposta alérgica a pólen, poeira, pelo de animal ou partículas, insetos ou partículas de inseto, etc.) que afeta as superfícies das vias aéreas nasais; pacientes acometidos por uma infecção bacteriana, por exemplo, infecções por estafilococos tais como infecções por Staphylococcus aureus, infecções por Hemophilus influenza, infecções por Streptococcus pneumoniae, infecções por Pseudomonas aeuriginosa, etc.) das superfícies das vias aéreas nasais; pacientes acometidos por uma doença inflamatória que afeta as superfícies das vias aéreas nasais; ou pacientes acometidos por sinusite (onde o agente ou agentes ativos são administrados para promover a drenagem de secreções de muco congestionado nos seios por administração de uma quantidade eficaz para promover a drenagem de fluido congestionado nos seios), ou combinados, rinossinusite. A invenção pode ser administrada às superfícies rinossinusais por distribuição tópica, incluindo aerossóis e gotas.

A presente invenção pode ser usada para hidratar superfícies mucosas que não as superfícies mucosas das vias aéreas. Tais outras superfícies mucosas incluem superfícies gastrointestinais, superfícies orais, superfícies genitouretrais, superfícies oculares ou superfícies do olho, do ouvido interno e do ouvido médio. Por exemplo, os compostos ativos da presente invenção podem ser administrados por qualquer meio adequado, incluindo a via local/tópica, oral, ou retal, em uma quantidade eficaz.

A presente invenção refere-se principalmente ao tratamento de indivíduos humanos, mais também pode ser empregada para o tratamento de outros mamíferos, tais como cachorros e gatos, com fins veterinários.

Como discutido acima, os compostos usados para preparar as composições da presente invenção podem estar na forma de uma base livre farmaceuticamente aceitável. Como a base livre do composto geralmente é menos solúvel que o sal em soluções aquosas, composições da base livre são empregadas para proporcionar uma liberação mais sistemática do agente ativo nos pulmões. Um agente ativo presente nos pulmões na forma parti-culada que não fora dissolvida em solução não está disponível para induzir uma resposta fisiológica, mas serve como um depósito de fármaco biodis-ponível que dissolve gradualmente formando uma solução.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica, compreendendo um composto de fórmula (I) em um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, uma solução carreadora aquosa). Em geral, o composto de fórmula (I) é incluído na composição em uma quantidade eficaz para inibir a reabsorção de água pelas superfícies mucosas.

Sem querermos nos ater a qualquer teoria particular, acreditamos que os bloqueadores de canais de sódio da presente invenção bloqueiam os canais de sódio epiteliais presentes nas superfícies mucosas, os bloqueadores de canais de sódio descritos nesta invenção reduzem a absorção de sal e água pelas superfícies mucosas. Este efeito aumenta o volume de líquidos protetores nas superfícies mucosas, reequilibra o sistema, e portanto trata a doença. Este efeito é intensificado quando usado em combinação com osmólitos.

Os compostos de fórmula (I) também podem ser usados em conjunto com osmólitos diminuindo assim a dose do composto necessária para hidratar as superfícies mucosas. Esta importante propriedade significa que o composto terá uma menor tendência a causar efeitos colaterais indesejados bloqueando os canais de sódio localizados em locais não visados no corpo do receptor, por exemplo, nos rins quando usado em combinação com um osmólito.

Osmólitos ativos da presente invenção são moléculas ou compostos que são osmoticamente ativos (isto é, são "osmólitos"). Os compostos "osmoticamente ativos" da presente invenção são membrana-impermeáveis (isto é, essencialmente não absorvíveis) na superfície epiteli-al das vias aéreas ou pulmonar. Os termos "superfície das vias aéreas" e "superfície pulmonar", conforme usados neste relatório, incluem superfícies das vias aéreas pulmonares tais como os brônquios e bronquíolos, superfícies alveolares, e superfícies nasais e sinusais. Os compostos ativos da presente invenção podem ser osmólitos iônicos (isto é, sais), ou podem ser osmólitos não-iônicos (isto é, açúcares, álcoois de açúcar, e osmólitos orgânicos). Pretendemos especificamente que ambas as formas racêmicas dos compostos ativos que são de natureza de racêmica estejam incluídas no grupo de compostos ativos que são úteis na presente invenção. Deve-se observar que todos os racematos, enantiômeros, diastereômeros, tautôme-ros, polimorfos e pseudopolimorfos e misturas racêmicas dos compostos osmoticamente ativos estão abrangidos pela presente invenção.

Osmólitos ativos úteis na presente invenção que são osmólitos iônicos incluem qualquer sal de um ânion farmaceuticamente aceitável e de um cátion farmaceuticamente aceitável. De preferência, ou o ânion ou o cá-tion (ou ambos) são não-absorvíveis (isto é, osmoticamente ativos e não sujeitos a rápido transporte ativo) em relação às superfícies das vias aéreas às quais eles são administrados. Tais compostos incluem, porém sem limitação, ânions e cátions que estão contidos em sais comercializados e aprovados pelo FDA, vide, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. II, pág. 1457 (19th Ed. 1995), aqui incorporado a título de referência, e podem ser usados em qualquer combinação incluindo suas combinações convencionais.

Ânions osmoticamente ativos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados para realizar a presente invenção incluem, porém sem limitação, acetato, benzenossulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartarato, brometo, edetato de cálcio, cansilato (canforassulfonato), carbonato, cloreto, citrato, dicloridrato, edetato, edisilato (1,2-etanodissulfonato), estolato (lauril sulfato), esilato (1,2-etanodissulfonato), fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato (p-glicolamidofenilarsonato), hexilresorcinato, hidrabamina (N,N'-Di(desidroabietil)etilenodiamina), bromidrato, cloridrato, hidroxinaftoato, iodeto, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, metilbrometo, metilnitrato, metilsulfato, mucato, napsi-lato, nitrato, nitrito, pamoato (embonato), pantotenato, fosfato ou difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, tana-to, tartarato, teoclato (8-cloroteofilinato), trietiliodeto, bicarbonato, etc. Â-nions particularmente preferidos incluem cloreto, sulfato, nitrato, gluconato, iodeto, bicarbonato, brometo e fosfato.

Cátions farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados para realizar a presente invenção incluem, porém sem limitação, cátions orgânicos tais como benzatina (N,N'-dibenziletilenodiamina), cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, meglumina (N-metil D-glucamina), procaína, D-lisina, L-lisina, D-arginina, L-arginina, trietilamônio, N-metil D-glicerol, entre outros. Cátions orgânicos particularmente preferidos são cátions orgânicos de 3 carbonos, 4 carbonos, 5 carbonos e 6 carbonos. Cá-tions metálicos úteis na prática da presente invenção incluem, porém sem limitação, alumínio, cálcio, lítio, magnésio, potássio, sódio, zinco, ferro, a-mônio, entre outros. Cátions particularmente preferidos incluem sódio, potássio, colina, lítio, meglumina, D-lisina, amônio, magnésio, e cálcio.

Exemplos específicos de sais osmoticamente ativos que podem ser usados com os bloqueadores de canais de sódio descritos neste relatório para realizar a presente invenção incluem, porém sem limitação, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de colina, iodeto de colina, cloreto de lítio, cloreto de meglumina, cloreto de L-lisina, cloreto de D-lisina, cloreto de amônio, sulfato de potássio, nitrato de potássio, gluconato de potássio, io-deto de potássio, cloreto férrico, cloreto ferroso, brometo de potássio etc. Seja um sal simples ou uma combinação de diferentes sais osmoticamente ativos podem ser usados para realizar a presente invenção. Combinações de diferentes sais são preferidas. Quando diferentes sais são usados, um dentre o ânion e o cátion pode ser o mesmo entre os diferentes sais.

Compostos osmoticamente ativos da presente invenção também incluem osmólitos não-iônicos tais como açúcares, álcoois de açúcar, e os-mólitos orgânicos. Açúcares e álcoois de açúcar úteis na prática da presente invenção incluem, porém sem limitação, açúcares de 3 carbonos (por exemplo, glicerol, di-hidroxiacetona); açúcares de 4 carbonos (por exemplo, as formas D e L de eritrose, treose, e eritrulose); açúcares de 5 carbonos (por exemplo, as formas D e L de ribose, arabinose, xilose, lixose, psicose, frutose, sorbose, e tagatose); e açúcares de 6 carbonos (por exemplo, as formas D e L de altose, alose, glucose, manose, gulose, idose, galactose, e talose, e as formas D e L de alo-heptulose, alo-hepulose, gluco-heptulose, mano-heptulose, gulo-heptulose, ido-heptulose, galacto-heptulose, talo-heptulose). Açúcares adicionais úteis na prática da presente invenção incluem rafinose, oligossacarídeos da série rafinose, e estaquiose. As formas D e L da forma reduzida de cada açúcar/álcool de açúcar útil na presente invenção também são compostos ativos dentro do escopo da invenção. Por exemplo, glucose, quando reduzida, se transforma em sorbitol; no escopo da presente invenção, sorbitol e outras formas reduzidas de açúcar/álcoois de açúcar (por exemplo, manitol, dulcitol, arabitol) são por conseguintes compostos ativos da presente invenção.

Os compostos osmoticamente ativos da presente invenção incluem adicionalmente a família de osmólitos não-iônicos denominados "os-mólitos orgânicos". O termo "osmólitos orgânicos" geralmente é usado para indicar moléculas usadas para controlar a osmolalidade intracelular nos rins. Vide, por exemplo, J. S. Handler et al., Comp. Biochem. Physiol, 117, 301306 (1997); M. Burg, Am. J. Physiol. 268, F983-F996 (1995), ambos aqui incorporados a título de referência. Embora o inventor não deseje se ater a qualquer teoria particular da invenção, parece que esses osmólitos orgânicos são úteis para controle o volume extracelular nas superfícies das vias aéreas/pulmonar. Osmólitos orgânicos úteis como compostos ativos na presente invenção incluem, porém sem limitação, três classes importantes de compostos: polióis (álcoois poli-hídricos), metilaminas, e aminoácidos. Os osmólitos orgânicos tipo poliol considerados úteis na prática desta invenção incluem, porém sem limitação, inositol, mio-inositol, e sorbitol. Os osmólitos orgânicos tipo metilamina úteis na prática desta invenção incluem, porém sem limitação, colina, betaína, carnitina (formas L-, D- e DL), fosforil-colina, liso-fosforilcolina, glicerofosforilcolina, creatina, e fosfato de creatina. Os osmólitos orgânicos tipo aminoácido da invenção incluem, porém sem limitação, as formas D- e L- de glicina, alanina, glutamina, glutamato, aspar-tato, prolina e taurina. Osmólitos adicionais úteis na prática da invenção incluem tiulose e sarcosina. Osmólitos orgânicos de mamíferos são preferidos, com osmólitos orgânicos humanos sendo mais preferidos. No entanto, certos osmólitos orgânicos são de origem bacteriana, levedura, e marinha, e esses compostos também são compostos ativos úteis no escopo da presente invenção.

Em certas circunstâncias um precursor de osmólito pode ser administrado ao indivíduo; por conseguinte, esses compostos são úteis na prática da invenção. O termo "precursor de osmólito" conforme usado neste relatório refere-se a um composto que é convertido em um osmólito por uma etapa metabólica, seja catabólica ou anabólica. Os precursores de osmólito desta invenção incluem, porém sem limitação, glucose, polímeros de glucose, glicerol, colina, fosfatidilcolina, liso-fosfatidilcolina e fosfatos inorgânicos, que são precursores de polióis e metilaminas. Precursores de osmólitos do tipo aminoácido dentro do escopo desta invenção incluem proteínas, peptí-dios, e poliaminoácidos, que são hidrolisados para dar aminoácidos osmóli-tos, e precursores metabólicos que podem ser convertidos em aminoácidos osmólitos por uma etapa metabólica tal como transaminação. Por exemplo, um precursor do aminoácido glutamina é poli-L-glutamina, e um precursor de glutamato é ácido poli-L-glutâmico.

Também se enquadram no escopo desta invenção osmólitos quimicamente modificados ou precursores de osmólito. Tais modificações químicas envolvem ligar ao osmólito (ou precursor) um grupo químico adicional que altera ou intensifica o efeito do osmólito ou precursor de osmólito (por exemplo, inibe a degradação da molécula de osmólito). Tais modificações químicas já foram utilizadas com drogas ou pró-drogas e são conhecidas na literatura. (Vide, por exemplo, as Patentes US N°s 4.479.932 e 4.540.564; Shek, E. et al., J. Med. Chem. 19:113-117 (1976); Bodor, N. et al., J. Pharm. Sci. 67:1045-1050 (1978); Bodor, N. et al., J. Med. Chem. 26:313-318 (1983); Bodor, N. et al., J. Pharm. Sci. 75:29-35 (1986), todos aqui incorporados a título de referência.

Em geral, os compostos osmoticamente ativos da presente invenção (tanto iônicos quanto não-iônicos) que não promovem, ou na verdade deterioram ou retardam o crescimento bacteriano são preferidos.

Os compostos de fórmula (I) descritos nesta invenção e os compostos osmoticamente ativos divulgados neste relatório podem ser administrados em qualquer ordem e/ou concomitantemente a superfícies mucosas tais como o olho, o nariz, e superfícies das vias aéreas incluindo as passagens nasais, os seios e os pulmões de um indivíduo por qualquer meio adequado conhecido na literatura, tal como gotas nasais, névoas, aerossóis, canulação nasal noturna contínua etc. Em uma modalidade da invenção, os compostos de fórmula (I) e os compostos osmoticamente ativos da presente invenção são administrados concomitantemente por lavagem transbroncos-cópica. Em uma modalidade preferida da invenção, os compostos de fórmula (I) e os compostos osmoticamente ativos da presente invenção são depositados sobre as superfícies das vias aéreas pulmonares por administração por inalação de partículas respiráveis em aerossol respirável compreendidas dos compostos de fórmula (I) e dos compostos osmoticamente ativos, onde os compostos de fórmula (I) podem preceder ou seguir a distribuição independente de um composto osmoticamente ativo dentro de um tempo suficientemente curto para que seus efeitos seja aditivos. As partículas respiráveis podem ser líquidas ou sólidas. Numerosos inaladores para administração de partículas aerossóis aos pulmões de um indivíduo são conhecidos. Em uma outra modalidade preferida da invenção, os compostos de fórmula (I) e os compostos osmoticamente ativos podem ser dados concomitantemente como já definido neste relatório.

Os compostos de fórmula (I) e os compostos osmoticamente ativos da presente invenção são administrados sequencialmente (em q ordem) ou concomitantemente ao indivíduo com necessidade do mesmo. Conforme usado neste relatório, o termo " concomitantemente" significa suficientemente perto no tempo para produzir um efeito combinado (isto é, concomitantemente pode ser simultaneamente, ou pode ser dois ou mais eventos ocorrendo dentro de um curto período de tempo antes ou depois um do outro). Concomitantemente também abrande a distribuição dos compostos de fórmula (I) e osmólitos como uma mistura ou solução dos dois componentes assim como quando distribuídos a partir de dois nebulizadores diferentes. Um exemplo disso poderia ser a distribuição do composto 1 em um nebuli-zador e de solução salina hipertônica em um segundo nebulizador conectado por uma peça em forma de T. Quando administrados com outros agentes ativos, os compostos ativos da presente invenção podem funcionar como um veículo ou veículo para o outro agente ativo, ou podem simplesmente ser administrados concomitantemente com o outro agente ativo. O composto ativo da presente invenção pode ser usado como um veículo seco ou líquido para administrar outros princípios ativos às superfícies das vias aéreas. Tais outros agentes ativos podem ser administrados para o tratamento da doença ou distúrbio ao qual eles são destinados, de maneira convencional e nas dosagens convencionais, em combinação com os compostos ativos da presente invenção, que podem ser considerados como funcionando como um veículo ou veículo para o outro agente ativo. Tal outro princípio ativo pode ser empregado, particularmente onde a hidratação das superfícies das vias aéreas (isto é, a atividade dos compostos osmoticamente ativos da presente invenção) facilita a atividade do outro princípio ativo (por exemplo, facilitando ou melhorando a absorção do princípio ativo, contribuindo para o mecanismo de ação do outro princípio ativo, ou por quaisquer outros mecanismos). Em uma modalidade preferida da invenção, quando o composto ativo da presente invenção é administrado concomitantemente com um outro agente ativo, o composto ativo da presente invenção tem um efeito aditivo em relação ao outro agente ativo, isto é, o efeito desejado do outro agente ativo é melhorado pela administração concomitante dos compostos ativos da presente invenção.

Os compostos de fórmula (I) da presente invenção também são úteis para o tratamento de infecções transportadas pelo ar. Exemplos de infecções transportadas pelo ar incluem, por exemplo, RSV. Os compostos de fórmula (I) da presente invenção também são úteis para o tratamento de uma infecção por antraz. A presente invenção refere-se ao uso dos compostos de fórmula (I) da presente invenção para o tratamento profilático, profilático após exposição, preventivo ou terapêutico contra doenças ou condições causadas por patógenos. Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se ao uso dos compostos de fórmula (I) para o tratamento profilático, profilático após exposição, preventivo ou terapêutico contra doenças ou condições causadas por patógenos que podem ser usados em bioterroris-mo.

Nos últimos anos, diversos programas de pesquisa e medidas de biodefesa foram implementados para lidar com as preocupações acerca do uso de agentes biológicos em atos de terrorismo. Essas medidas pretendem abordar preocupações relacionadas com bioterrorismo ou com o uso de micro-organismos ou toxinas biológicas para matar pessoas, disseminar o medo, e romper a sociedade. Por exemplo, o National Institute of Allergy and Infectious Diseases ("Instituto Nacional de Doenças Alérgicas e Infecciosas”) (NIAID) desenvolveu um Plano Estratégico para Pesquisa de Biodefensas que esboça planos para atender às necessidades de pesquisa no amplo campo de bioterrorismo e de doenças infecciosas emergentes e ree-mergentes. Segundo o plano, a exposição deliberada da população civil dos Estados Unidos a esporos do Bacillus anthracis revelou uma falha no preparo geral da nação contra o bioterrorismo. Além disso, o relatório detalha que esses ataques revelaram uma necessidade ainda não satisfeita de testes para diagnosticar rapidamente, vacinas e imunoterapias para prevenir, e drogas e biológicos para curar doenças causadas por agentes de bioterro-rismo.

Grande parte do foco dos vários esforços de pesquisa tem se voltado para o estudo da biologia dos patógenos identificados como potencialmente perigosos como agentes de bioterrorismo, o estudo da resposta do hospedeiro contra tais agentes, o desenvolvimento de vacinas contra doenças infecciosas, a avaliação dos terápicos atualmente disponíveis e em fase de investigação contra tais agentes, e o desenvolvimento de diagnósticos para identificar sinais e sintomas dos agentes ameaçadores. Tais esforços são louváveis, mas, dado o grande número de patógenos que foram identificados como potencialmente disponíveis para bioterrorismo, esses esforços ainda não conseguiram oferecer respostas satisfatórios para as ameaças de bioterrorismo possíveis. Adicionalmente, muitos dos patógenos identificados como potencialmente perigosos como agentes de bioterrorismo não oferecem incentivos econômicos adequados para o desenvolvimento de medidas terapêuticas ou preventivas pela indústria. Além disso, mesmo que medidas preventivas tais como vacinas estivessem disponíveis para cada patógeno que podem ser usado em bioterrorismo, o custo para administrar todas essas vacinas a população em geral é proibitivo.

Até que se encontrem disponíveis tratamentos convenientes e eficazes contra toda ameaça de bioterrorismo, há uma grande necessidade de tratamentos preventivos, profiláticos ou terapêuticos que possam prevenir ou reduzir o risco de infecção por agentes patogênicos.

A presente invenção oferece tais métodos de tratamento profilático. Em um aspecto, a invenção oferece um método de tratamento profilático compreendendo administrar uma quantidade profilaticamente eficaz dos compostos de fórmula (I) a um indivíduo com necessidade de tratamento profilático contra uma infecção por um ou mais patógenos transportados pelo ar. Um exemplo particular de um patógeno transportado pelo ar é antraz.

Em um outro aspecto, a invenção oferece um método de tratamento profilático para reduzir o risco de infecção por um patógeno transportado pelo ar que pode causar uma doença em um ser humano, o referido método compreendendo administrar uma quantidade eficaz dos compostos de fórmula (I) aos pulmões do ser humano que pode correr o risco de uma infecção pelo patógeno transportado pelo ar mas que é assintomático para a doença, onde a quantidade eficaz de um bloqueador de canais de sódio e um osmólito é suficiente para reduzir o risco de infecção no ser humano. Um exemplo particular de um patógeno transportado pelo ar é antraz.

Em um outro aspecto, a invenção oferece um método de tratamento profilático após a exposição ou de tratamento terapêutico para o tratamento de uma infecção por um patógeno transportado pelo ar compreendendo administrar uma quantidade eficaz dos compostos de fórmula (I) aos pulmões de um indivíduo com necessidade de tal tratamento contra uma infecção por um patógeno transportado pelo ar. Os patógenos contra os quais é possível proteger pelos métodos de tratamento profilático após a exposição, tratamento de resgate e tratamento terapêutico da invenção incluem todos os patógenos que podem entrar no corpo pela boca, nariz ou vias aéreas nasais, prosseguindo assim até os pulmões. Tipicamente, os patógenos são patógenos transportados pelo ar, seja de ocorrência natural seja por aerossolização. Os patógenos podem ser de ocorrência natural ou podem ser intencionalmente introduzidos no ambiente depois de aerossoli-zação ou outro método de introdução de patógenos no ambiente. Muitos patógenos que não são naturalmente transmitidos pelo ar já foram ou podem ser aerossolizados para uso em bioterrorismo. Os patógenos para os quais o tratamento da invenção pode ser útil incluem, porém sem limitação, patógenos de prioridade das categorias A, B e C estabelecidos pelo NIAID.
Estas categorias geralmente correspondem às listas compilados pelos Centros para o Controle e a Prevenção de Doenças (CDC). Como estabelecido pelos CDC, agentes da categoria A são aqueles que podem ser facilmente disseminados ou transmitidos de pessoa para pessoa, causam grande mortalidade, com potencial para um grande impacto na saúde pública. Agentes da categoria B são os próximos em termos de prioridade e incluem aqueles que são moderadamente fáceis de disseminar e causam morbidez moderada e baixa mortalidade. A categoria C consiste em patógenos emergentes que podem ser construídos para disseminação em massa no futuro por causa de sua biodisponibidade, são produção e disseminação fáceis com potencial para alta morbidez e mortalidade. Exemplos particulares desses pa-tógenos são antraz e peste. Patógenos adicionais contra os quais é proteger ou reduzir o risco de infecção incluem vírus da influenza, rinovírus, ade-novírus e vírus sinciciais respiratórios, entre outros. Um outro patógeno contra o qual é possível proteger é o coronavírus que se acredita ser o causador da síndrome da angústia respiratória aguda severa (SARS).

Os compostos da presente invenção também podem ser usados em conjunto com um agonista do receptor de P2Y2 ou um sal farmaceutica-mente aceitável do mesmo (também às vezes chamado de "agente ativo" neste relatório). A composição pode compreender ainda um agonista do receptor de P2Y2 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (também às vezes chamado de "agente ativo" neste relatório). O agonista do receptor de P2Y2 é tipicamente incluído em uma quantidade eficaz para estimular a secreção de cloreto e água pelas superfícies das vias aéreas, particularmente pelas superfícies das vias aéreas nasais. Agonistas do receptor de P2Y2 adequados estão descritos nas colunas 9-10 das Patentes US 6.264.975, US 5.656.256, e US 5.292.498, todas aqui incorporadas a título de referência.

Broncodilatadores também podem ser usados em combinação com os compostos da presente invenção. Esses broncodilatadores incluem, porém sem limitação, agonistas β-adrenérgicos incluindo, porém sem limitação, epinefrina, isoproterenol, fenoterol, albutereol, terbutalina, pirbuterol, bitolterol, metaproterenol, iosetarina, xinafoato de salmeterol, assim como agentes anticolinérgicos incluindo, porém sem limitação, brometo de ipra-trópio, assim como compostos tais como teofilina e aminofilina. Esses compostos podem ser administrados de acordo com técnicas conhecidas, seja antes ou concomitantemente com os compostos ativos descritos nesta invenção.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica, compreendendo um composto ativo já descrito acima em um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, uma solução car-readora aquosa). Em geral, o composto ativo é incluído na composição em uma quantidade eficaz para tratar superfícies mucosas, tais como inibir a reabsorção de água por superfícies mucosas, incluindo superfícies das vias aéreas e outras superfícies.

Os compostos ativos divulgados nesta invenção podem ser administrados às superfícies mucosas por qualquer meio adequado, incluindo a via tópica, oral, retal, vaginal, ocular e dérmica etc. Por exemplo, para o tratamento de constipação, os compostos ativos podem ser administrados por via oral ou retal à superfície mucosa gastrointestinal. O composto ativo pode ser combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável em qualquer forma adequada, tal como solução salina fisiológica estéril ou diluída ou solução tópica, como gotas, comprimido ou similar para administração oral, como um supositório para administração retal ou genitouretral etc. Ex-cipientes podem ser incluídos na formulação para melhorar a solubilidade dos compostos ativos, conforme desejado.

Os compostos ativos divulgados nesta invenção podem ser administrados às superfícies das vias aéreas de um paciente por qualquer meio adequado, incluindo um spray, névoa, ou gotas dos compostos ativos em um veículo farmaceuticamente aceitável tal como soluções salinas fisiológicas ou diluídas ou água destilada. Por exemplo, os compostos ativos podem ser preparados como formulações e administrados da maneira descrita na Patente US N° 5.789.391 concedida a Jacobus, cuja descrição está aqui incorporada em sua integridade a título de referência.

Agentes ativos particulados sólidos ou líquidos preparados para a prática da presente invenção podem, como observado acima, incluir partículas de tamanho respirável ou não-respirável, isto é, para partículas respiráveis, partículas de um tamanho suficientemente pequeno passam pela boca e pela laringe por inalação e penetram nos brônquios e alvéolos dos pulmões, e para partículas não-respiráveis, partículas suficientemente grandes ficam retidas nas passagens das vias aéreas nasais em vez de passar pela laringe e penetrar nos brônquios e alvéolos dos pulmões. Em geral, partículas variando de cerca de 1 a 5 mícrons de tamanho (mais particularmente, inferiores a cerca de 4,7 mícrons de tamanho) são respiráveis. Partículas de tamanho não-respirável são maiores que cerca de 5 mícrons de tamanho, até o tamanho de gotas visíveis. Portanto, para administração nasal, um tamanho de partícula na faixa de 10-500 pm pode ser usado para garantir sua retenção na cavidade nasal.

Na produção de uma formulação de acordo com a invenção, agentes ativos ou os sais ou bases livres fisiologicamente aceitáveis dos mesmos são tipicamente misturados, inter alia, com um veículo aceitável. Naturalmente, o veículo deve ser compatível com todos os outros ingredientes na formulação e não devem prejudicial para o paciente. O veículo deve ser sólido ou líquido, ou ambos, e é de preferência formulado com o composto como uma formulação de dose unitária, por exemplo, uma cápsula, que pode conter 0,5% a 99% em peso do composto ativo. Um ou mais compostos ativos podem ser incorporados nas formulações da invenção, formulações estas que podem ser preparadas por qualquer uma das técnicas de farmácia bastante conhecidas que consiste essencialmente em misturar os componentes.

Composições contendo partículas secas respiráveis ou não-respiráveis de agente ativo micronizado podem ser preparadas por trituração do agente ativo seco com um pilão, passando-se em seguida a composição micronizada por uma peneira de malha 400 para quebrar ou separar aglomerados grandes.

A composição particulada de agente ativo pode conter opcionalmente um dispersante que serve para facilitar a formulação de um aerossol. Um dispersante adequado é lactose, que pode ser misturada com o agente ativo em qualquer proporção desejada (por exemplo, uma proporção em peso de 1 para 1).

Os compostos ativos divulgados nesta invenção podem ser administrados às superfícies das vias aéreas incluindo as passagens nasais, os seios e os pulmões de um indivíduo por um meio adequado conhecido na literatura, tais como gotas nasais, névoas, etc. Em uma modalidade da invenção, os compostos ativos da presente invenção são administrados por lavagem transbroncoscópica. Em uma modalidade preferida da invenção, os compostos ativos da presente invenção são depositados sobre as superfícies das vias aéreas do pulmão por administração de uma suspensão aerossol de partículas respiráveis compreendidas do composto ativo, que o indivíduo inala. As partículas respiráveis podem ser líquidas ou sólidas. Inúmeros inaladores para administração de partículas aerossóis aos pulmões de um indivíduo são conhecidos.

Inaladores tais como aqueles desenvolvidos por Inhale Therapeutic Systems, Palo Alto, Califórnia, EUA, podem ser empregados, incluindo, porém sem limitação, aqueles divulgados nas Patentes US N°s 5.740.794, 5.654.007, 5.458.135, 5.775.320, e 5.785.049, todas elas aqui incorporadas a título de referência. A Requerente pretende especificamente que as descrições de todas as referências patentárias citadas neste relatório estejam aqui incorporadas em sua integridade a título de referência. Inaladores tais como aqueles desenvolvidos por Dura Pharmaceuticals, Inc., San Diego, Califórnia, EUA, também podem ser empregados, incluindo, porém sem limitação, aqueles divulgados nas Patentes US N°s 5.622.166, 5.577.497, 5.645.051, e 5.492.112, todas elas aqui incorporadas a título de referência. Adicionalmente, inaladores tais como aqueles desenvolvidos por Aradigm Corp., Hayward, Califórnia, EUA, podem ser empregados, incluindo, porém sem limitação, aqueles divulgados nas Patentes US N°s 5.826.570, 5.813.397, 5.819.726, e 5.655.516, todas elas aqui incorporadas a título de referência. Esses aparelhos são particularmente adequados como inaladores de partículas secas.

Aerossóis de partículas líquidas compreendendo o composto ativo podem ser produzidos por qualquer meio, tal como por um nebulizador de aerossol acionado por pressão (L C Star) ou um nebulizador ultrassônico (Pari eFlow). Vide, por exemplo, a Patente US N° 4.501.729, que está aqui incorporada a título de referência. Nebulizadores são dispositivos comercialmente disponíveis que transformam soluções ou suspensões do princípio ativo em uma névoa de aerossol terapêutica pela aceleração de gás comprimido, tipicamente ar ou oxigênio, através de um orifício venturi estreito ou por meio de agitação ultrassônica. Formulações adequadas para uso em nebulizadores consistem no princípio ativo em um veículo líquido, o princípio ativo compreendendo até 40% p/p da formulação, mas de preferência menos de 20% p/p. O veículo é tipicamente água (e mais preferivelmente água estéril sem pirogênio) ou uma solução alcoólica aquosa diluída. Veículos do tipo perfluorocarbono também podem ser usados. Aditivos opcionais incluem preservativos se a formulação não for estéril, por exemplo, metil hidroxibenzoato, antioxidantes, agentes flavorizantes, óleos voláteis, agentes tamponantes e tensoativo.

Aerossóis de partículas sólidas compreendendo o composto ativo também podem ser produzidos com qualquer gerador de aerossol de medicamento particulado sólido. Geradores de aerossol para administrar medicamentos particulados sólidos a um indivíduo produzem partículas que são respiráveis, como explicado acima, e geram um volume de aerossol contendo uma dose regulada predeterminada de medicamento a uma taxa adequada para administração ao homem. Um tipo ilustrativo de gerador de aerossol particulado sólido é um insuflador. Formulações adequadas para administração por insuflação incluem pós finamente cominuídos que podem ser distribuídos por meio de um insuflador ou levados para a cavidade nasal por meio de uma fungada. No insuflador, o pó (por exemplo, uma dose regulada do mesmo eficaz para realizar os tratamentos descritos neste relatório) está contido em cápsulas ou cartuchos, feitos tipicamente de gelatina ou plástico, que são ou perfurados ou abertos in situ e o pó é distribuído por ar arrastado através do dispositivo mediante inalação ou por meio de uma bomba operada manualmente. O pó empregado no insuflador consiste apenas no princípio ativo ou na mistura de pó compreendendo o princípio ativo, um diluente de pó adequado, tal como lactose, e um tensoativo opcional. O princípio ativo tipicamente compreende de 0,1 a 100% p/p da formulação. Um segundo tipo de gerador de aerossol ilustrativo compreende um inalador de dose regulada. Inaladores de dose regulada são dispensadores de aerossol pressurizados, tipicamente contendo uma formulação de suspensão ou solução de princípio ativo em um propelente liquefeito. Durante o uso, esses dispositivos descarregam a formulação através de uma válvula adaptada para distribuir um volume regulado, tipicamente de 10 a 150 µl, para produzir uma borrifação de partículas finas contendo o princípio ativo. Pro-pelentes adequados incluem certos compostos do tipo clorofluorocarbono, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroe-tano e misturas dos mesmos. A formulação pode conter adicionalmente um ou mais cossolventes, por exemplo, etanol, tensoativos, tais como ácido ole-ico ou sorbitano trioleato, antioxidantes e agentes flavorizantes adequados.

O aerossol, seja formado a partir de partículas sólidas ou líquidas, pode ser produzido pelo gerador de aerossol a uma taxa de cerca de 10 a 150 litros por minuto, mais preferivelmente de 30 a 150 litros minuto, e ainda molécula parceira cerca de 60 litros por minuto. Aerossóis contendo quantidades maiores de medicamento podem ser administrado mais rápido.

A dosagem dos compostos ativos divulgados neste relatório vai variar dependendo da condição sendo tratada e do estado do indivíduo, mas geralmente varia de cerca de 0,01, 0,03, 0,05, 0,1 a 1, 5, 10 ou 20 mg do agente farmacêutico, depositado sobre as superfícies das vias aéreas. A dose diária pode ser fracionada em uma ou várias administrações de dose unitária. O objetivo é atingir uma concentração dos agentes farmacêuticos nas superfícies das vias aéreas pulmonares entre 10-9 - 104 M.

Em uma outra modalidade, eles são administrados por administração de uma suspensão aerossol de partículas respiráveis ou não-respiráveis (de preferência partículas não-respiráveis) compreendidas de composto ativo, que é inalada pelo indivíduo pelo nariz. As partículas respiráveis ou não-respiráveis podem ser líquidas ou sólidas. A quantidade de agente ativo incluído pode ser uma quantidade suficiente para atingir concentrações dissolvidas de agente ativo nas superfícies das vias aéreas do indivíduo de cerca de 10-9, 10-8, ou 10-7 a cerca de 10-3, 10-2, 10-1 moles/litro, e mais preferivelmente de cerca de 10-9 a cerca de 10-4 moles/litro.

A dosagem de composto ativo vai variar dependendo da condição sendo tratada e do estado do indivíduo, mas geralmente pode ser uma quantidade suficiente para atingir concentrações dissolvidas de agente ativo nas superfícies das vias aéreas nasais do indivíduo de cerca de 10-9, 10-8, 10-7 a cerca de 10-3, 10-2, ou 10-1 moles/litro, e mais preferivelmente de cerca de 10-7 a cerca de 10-4 moles/litro. Dependendo da solubilidade da formulação particular de composto ativo administrada, a dose diária pode ser fracionada em uma ou várias administrações de dose unitária. A dose diária por peso pode variar de cerca de 0,01, 0,03, 0,1, 0,5 ou 1,0 a 10 ou 20 miligramas de partículas de agente ativo para um indivíduo humano, dependendo da idade e da condição do indivíduo. Uma dose unitária atualmente preferida é de cerca de 0,5 miligrama de agente ativo em um regime de 2-10 administrações por dia. A dosagem pode ser apresentada como uma unidade pré-acondicionada por qualquer meio adequado (por exemplo, encapsulada em uma cápsula de gelatina).

Em uma modalidade da invenção, a composição de agente ativo particulado pode conter tanto uma base livre do agente ativo como um sal farmaceuticamente aceitável para proporcionar tanto a liberação imediata quanto a liberação sistemática do agente ativo para dissolução nas secreções de muco do nariz. Tal composição serve para proporcionar alívio imediato ao paciente, e alívio sistemático ao longo do tempo. Espera-se que o alívio sistemático, diminuindo o número de administrações diárias necessárias, aumente a colaboração do paciente durante os tratamentos com o agente ativo.

Formulações farmacêuticas adequadas para administração às vias aéreas incluem formulações de soluções, emulsões, suspensões e extratos. Vide, em geral, J. Nairn, Solutions, Emulsions, Suspensions and Extracts, in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, chap. 86 (19th ed. 1995), aqui incorporado a título de referência. Formulações farmacêuticas adequadas para administração nasal podem ser preparadas da maneira descrita nas Patentes US N°s 4.389.393 concedida a Schor, 5.707.644 concedida a Illum, 4.294.829 concedida a Suzuki, e 4.835.142 to Suzuki, cujas descrições estão aqui incorporadas em sua integridade a título de referência.

Névoas ou aerossóis de partículas líquidas compreendendo o composto ativo podem ser produzidos por qualquer meio adequado, tal como por simples borrifação nasal com o agente ativo em um veículo aquoso farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução salina estéril ou água estéril. A administração pode ser feita com um nebulizador de aerossol acionado por pressão ou com um nebulizador ultrassônico. Vide, por exemplo, as Patentes US N°s 4.501.729 e 5.656.256, ambas aqui incorporadas a título de referência. Formulações adequadas para uso em um frasco de gotas nasais ou spray ou em nebulizadores consistem no princípio ativo em um veículo líquido, o princípio ativo compreendendo até 40% p/p da formulação, mas de preferência menos de 20% p/p. Tipicamente o veículo é água (e mais preferivelmente água estéril sem pirogênio) ou uma solução alcoólica aquosa diluída, de preferência feita em uma solução de cloreto de sódio a 0,12% a 0,8%. Aditivos opcionais incluem preservativos se a formulação não for estéril, por exemplo, metil hidroxibenzoato, antioxidantes, agentes flavorizantes, óleos voláteis, agentes tamponantes, agentes osmoticamente ativos (por exemplo, manitol, xilitol, eritritol) e tensoativos.

Composições contendo partículas secas respiráveis ou não-respiráveis de agente ativo micronizado podem ser preparadas por trituração do agente ativo seco em um pilão, passando-se em seguida a composição micronizada por uma peneira de malha 400 para quebrar ou separar aglomerados grandes.

A composição particulada pode conter opcionalmente um dis-persante que serve para facilitar a formulação de um aerossol. Um dispersante adequado é lactose, que pode ser misturada com o agente ativo em qualquer proporção desejada (por exemplo, uma proporção em peso de 1 para 1).

O composto de fórmula I pode ser sintetizado de acordo com procedimentos conhecidos na literatura. Um procedimento de síntese representativo está mostrado no esquema abaixo:

Esses procedimentos estão descritos, por exemplo, em E.J. Cragoe, "The Synthesis of Amiloride and Its Analogs" (Chapter 3) in Amilori-de and Its Analogs, pp. 25-36, aqui incorporado a título de referência. Outros métodos para preparar os compostos estão descritos, por exemplo, na patente US 3.313.813, aqui incorporada a título de referência. Vide em particular os métodos A, B, C, e D descritos na patente US 3.313.813. Métodos adicionados para preparar os intermediários usados na preparação dos compostos da presente invenção estão divulgados nas patentes US 7.064.129, US 6.858.615, US 6.903.105, WO 2004/073629, WO 2007/146869, e WO 2007/018640, todas elas expressamente incorporadas a título de referência.

Diversos ensaios podem ser usados para caracterizar os compostos da presente invenção. Ensaios representativos estão discutidos abaixo.

Medição in vitro da atividade bloqueadora de canais de sódio e sua reversibilidade

Um ensaio usado para avaliar o mecanismo de ação e/ou a potência dos compostos da presente invenção envolve a determinação da inibição medicamentosa luminal das correntes de sódio epiteliais das vias aéreas medida em corrente de curto-circuito (ISc) usando monocamadas epite-liais das vias aéreas montadas em câmaras Ussing. Células obtidas das vias aéreas recém-excisadas de homem, cachorro, carneiro ou roedor são semeadas em Insertos Snapwell™ porosos de 0,4 mícron (CoStar), cultivadas em condições de interface ar-líquido (ALI) em meios definidos em termos hormonais, e analisadas quanto à atividade de transporte de sódio (ISC) enquanto banhadas em Krebs Bicarbonato Ringer (KBR) em câmaras Using. Todas as adições de fármaco de teste ao banho luminal com protocolos de adição de dose de meio-log (de 1 x 10-11 M a 3 x 10-5 M), e a alteração cumulativa em ISC (inibição) foram registradas. Todos os fármacos são preparados em dimetil sulfóxido como soluções de estoque a uma concentração de 1 x 10-2 M e armazenadas a -20°C. Oito preparações são tipicamente testadas paralelamente; duas preparações por teste incorporam amiloride e/ou benzamil como controles positivos. Depois que a concentração máxima (5 x 10-5 M) é administrada, o banho luminal é trocado três vezes pela solução KBR sem fármaco, e o ISC resultante medido depois de cada lavagem por aproximadamente 5 minutos de duração. Reversibilidade é definida como a percentagem de retorno para o valor basal para a corrente de sódio depois da terceira lavagem. Todos os grampos de voltagem são coletados via uma interface de computador e analisados off-line.

As relações dose-efeito para todos os compostos são consideradas e analisadas pelo programa Prism 3.0. Os valores de IC50, concentrações eficazes máximas, e reversibilidade são calculados e comparados com amiloride e benzamil como controles positivos. A potência da atividade blo-queadora de canais de sódio de compostos representativos em células re-cém-excisada de vias aéreas caninas está mostrada na Tabela 2.

Ensaios farmacológicos de absorção (1) Ensaio de desaparecimento apical

Células brônquicas (células de cachorro, homem, carneiro ou roedor) são semeadas a uma densidade de 0,25 x 106/cm2 sobre uma membrana porosa Transwell-Col revestida com colágeno com uma área de crescimento de 1,13 cm2 cultivada em uma interface ar-líquido em meio definido em termos hormonais que promove um epitélio polarizado. De 12 a 120 dias depois do desenvolvimento de uma interface ar-líquido (ALI) espera-se que as culturas estejam > 90% ciliadas, e que mucinas vão se acumular sobre as células. Para garantir a integridade das preparações de células epiteliais de vias aéreas primárias, a resistência transepitelial (Rt) e as diferenças de potencial transepitelial (PD), que são indicadores da integridade da natureza polarizada da cultura, são medidas. Sistemas de células humanas são preferidos para estudos de taxas de absorção de superfícies apicais. O ensaio de desaparecimento é conduzido em condições que mimetizam os filmes "finos" in vivo (~25 μl) e é iniciado pela adição de bloqueadores de canais de sódio experimentais ou de controles positivos (amiloride, benzamil, fenamil) à superfície apical a uma concentração inicial de 10 μΜ. Uma série de amostras (5 μl de volume por amostra) é coletada em vários pontos do tempo, incluindo 0, 5, 20, 40, 90 e 240 minutos. As concentrações são determinadas medindo-se a fluorescência intrínseca de cada bloqueador de canais de sódio usando um fluorômetro de microplaca Fluorocount ou HPLC. A análise quantitativa emprega uma curva padrão gerada a partir de materiais tradicionais de referência autênticos de concentração e pureza conhecidas. A análise de dados da taxa de desaparecimento é efetuada usando-se regressão não-linear, decaimento exponencial unifásico (Prism V 3.0).

2. Ensaio de microscopia confocal de absorção do congênere amiloride

Virtualmente todas as moléculas similares ao amiloride fluores-cem na faixa ultravioleta. Esta propriedade dessas moléculas pode ser usada para medir diretamente a atualização celular usando microscopia confocal x-z. Concentrações equimolares de compostos experimentais e controles positivos incluindo amiloride e compostos que demonstram rápida absorção no compartimento celular (benzamil e fenamil) são colocadas sobre a superfície apical de culturas das vias aéreas sobre a platina do microscópio confocal. Imagens x-z consecutivas são obtidas com o tempo e a magnitude de fluorescência acumulando no compartimento celular é quantificada e plota-da como uma alteração na fluorescência versus tempo.

3. Ensaios in vitro do metabolismo dos compostos

As células epiteliais das vias aéreas têm capacidade de metabo-lizar drogas durante o processo de absorção transepitelial. Além disso, embora menos provável, é possível que as drogas possam ser metabolizadas nas superfícies epiteliais das vias aéreas por atividades de ectoenzimas específicas. Talvez mais provavelmente como um evento ectossuperficial, os compostos possam ser metabolizados pelas secreções infectadas que ocupam os lúmens das vias aéreas de pacientes com doença pulmonar, por exemplo, fibrose cística. Por isso, uma série de ensaios é efetuada para caracterizar o metabolismo do composto que resulta da interação dos compostos de teste com o epitélio das vias aéreas humanas e/ou produtos lumi-nais epiteliais das vias aéreas humanas.

Na primeira série de ensaios, a interação dos compostos de teste em KBR como um estimulante "ASL" são aplicados à superfície apical de células epiteliais das vias aéreas humanas crescendo no sistema de insert T-Col. Para a maioria dos compostos, o metabolismo (produção de novas espécies) é testado usando-se cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para resolver espécies químicas e as propriedades de fluorescência endógena desses compostos para estimar as quantidades relativas do composto de teste e dos novos metabólitos. Para um ensaio típico, uma solução de teste (25 μl de KBR, contendo 10 μM de composto de teste) é colocada sobre a superfície luminal epitelial. Amostras sequenciais de 5 a 10 μl são obtidas dos compartimentos luminal e para análise por HPLC de (1) a massa de composto de teste permeando do banho luminal para o serosal e (2) a potencial formação de metabólitos a partir do composto parental. Nos casos em que as propriedades de fluorescência da molécula de teste não são adequadas para tais caracterizações, compostos radiomarcados são usados para estes ensaios. A partir dos dados de HPLC, a taxa de desaparecimento e/ou formação de novos compostos metabólitos na superfície luminal e o aparecimento do composto de teste e/ou um novo metabólico na solução basolateral é quantificada. Os dados referentes à mobilidade cromatográfica de novos potenciais metabólitos com referência ao composto parental também são quantificados.

Para analisar o potencial metabolismo dos compostos de teste pelo escarro de CF, uma mistura "representativa" do escarro de CF expecto-rado obtido de 10 pacientes com CF (sob aprovação do IRB) foi coletada. O escarro foi solubilizado em uma mistura 1:5 de solução KBR com agitação vigorosa, depois do que a mistura foi dividida em uma alíquota de escarro "limpo" e uma alíquota foi submetida à ultracentrifugação para que fosse obtida uma alíquota de "sobrenadante" (limpo = celular; sobrenadante = fase líquida). Os estudos típicos de metabolismo de compostos por escarro de CF envolvem a adição de massas conhecidos do composto de teste ao escarro de CF "limpo" e alíquotas de "sobrenadante" de escarro de CF incubado a 37°C, seguido pela amostragem sequencial de alíquotas de cada tipo de escarro para caracterização da estabilidade/metabolismo do composto por análise por HPLC, como já descrito acima. Como mencionado acima, a análise do desaparecimento do composto, das taxas de formação de novos metabólitos, e das modalidades por HPLC dos novos metabólitos são então efetuadas.

4. Efeitos farmacológicas e mecanismo de ação da fármaco em animais

O efeito dos compostos para melhorar a depuração mucociliar (MCC) pode ser medido usando-se um modelo in vivo model descrito por Sabater et al., Journal of Applied Physiology, 1999, pp. 2191-2196, aqui incorporado a título de referência.

Métodos

Preparação do animal: Ovelhas adultas (com o peso variando de 25 a 35 kg) foram mantidas em uma posição vertical em um arnês de armação especial adaptado para um carrinho de compras modificado. Os animais = cabeças foram imobilizados e anestesia local da passagem nasal foi induzida com 2% de lidocaína. Os animais foram então entubados pelo nariz com um tubo endotraqueal de 7,5 mm de diâmetro interno (ETT). O punho da ETT foi colocado logo abaixo das cordas vocais e sua posição foi verificada com um broncoscópio flexível. Depois da entubação foi deixado que os animais se equilibrassem por aproximadamente 20 minutos antes de se dar início às medições da depuração mucociliar.
Administração de radio-aerossol: Aerossóis de 99mTc-albumina sérica humana (3,1 mg/ml; contendo aproximadamente 20 mCi) foram gerados usando-se um nebulizador Raindrop que produz gotas com um diâmetro aerodinâmico médio de 3,6 μm. O nebulizador foi conectado a um sistema de dosimetria consistindo em uma válvula solenoide e um fonte de ar comprimido (1,378 bar [20 psi]). A saída do nebulizador foi direcionado para um conector T de plástico; uma extremidade do qual foi conectado ao tubo endotra-queal, e a outra foi conectada a um respirador de êmbolo. O sistema foi ativado por um segundo no início do ciclo inspiratório do respirador. O respira-dor foi ajustado em um volume de corrente de 500 mL, uma relação inspira-tória para expiratória de 1:1, e uma taxa de 20 respirações por minuto para maximizar a deposição na via aérea central. As ovelhas inalaram o aerossol radiomarcado por 5 minutos. Uma câmera gama foi usada para medir a depuração de 99mTc-albumina sérica humana das vias aéreas. A câmera foi posicionada acima do dorso do animal com as ovelhas na posição vertical natural apoiadas em um carrinho para que o campo de imagem fosse perpendicular ao cordão espinhal do animal. Marcadores radiomarcados externos foram colocados nas ovelhas para garantir o alinhamento apropriado da câmera gama. Todas as imagens foram armazenadas em um computador integrado com a câmera gama. Uma região de interesse foi traçada sobre a imagem correspondente ao pulmão direito das ovelhas e as contagens foram registradas. As contagens foram corrigidas para o decaimento e expressas como percentagem de radioatividade presente na imagem basal inicial. O pulmão esquerdo foi excluído da análise porque seus contornos estavam superpostos ao estômago e as contagens podem ser engolidas e penetrar no estômago como muco radiomarcado.
Protocolo de Tratamento (Avaliação da atividade em t zero): Uma imagem de deposição basal foi obtida imediatamente após a administração do radioaerossol. No tempo zero, depois da aquisição da imagem basal, controle com veículo (água destilada), controle positivo (amiloride), ou compostos experimentais foram aerossolizados a partir de um volume de 4 ml usando-se um nebulizador Pari LC JetPlus para os animais respirando livremente. O nebulizador foi acionado por ar comprimido com um fluxo de 8 litros por minuto. O tempo de distribuição da solução foi de 10 a 12 minutos. Os animais foram extubados imediatamente após a distribuição da dose total para prevenir falsas elevações nas contagens causadas pela aspiração do radio-traçador em excesso a partir do ETT. Imagens consecutivas do pulmão foram obtidas em intervalos de 15 minutos durante as 2 primeiras horas após a aplicação e de hora em hora nas 6 horas subsequentes depois da aplicação por um período de observação total de 8 horas. Um período de eliminação de pelo menos 7 dias separou as sessões de medicação com diferentes agentes experimentais.

Protocolo de Tratamento (Avaliação da atividade em t 4 horas): A seguinte variação do protocolo de tratamento foi usada para avaliar a durabilidade da resposta subsequente a uma única exposição ao controle com veículo (água destilada), compostos de controle positivo (amiloride ou ben-zamil), ou agentes investigacionais. No tempo zero, controle com veículo (água destilada), controle positivo (amiloride), ou compostos investigacio-nais foram aerossolizados a partir de um volume de 4 ml usando-se um nebulizador Pari LC JetPlus para os animais respirando livremente. O nebulizador foi acionado por ar comprimido com um fluxo de 8 litros por minuto. O tempo de distribuição da solução foi de 10 a 12 minutos. Os animais foram mantidos em uma posição vertical em um arnês de armação especial por 4 horas. Ao final do período de 4 horas os animais receberam uma única dose de 99mTc-albumina sérica humana aerossolizada (3,1 mg/ml; contendo aproximadamente 20 mCi) a partir de um nebulizador Raindrop. Os animais foram extubados imediatamente após a distribuição da dose total do radiotra-çador. Uma imagem de deposição basal foi obtida imediatamente após a administração do radioaerossol. Imagens consecutivas do pulmão foram obtidas em intervalos de 15 minutos durante as 2 primeiras horas após a administração do radiotraçador (representando as horas 4 a 6 depois da administração do fármaco) e de hora em hora nas 2 horas subsequentes depois da aplicação por um período de observação total de 4 horas. Um período de eliminação de pelo menos 7 dias separou as sessões de medicação com diferentes agentes experimentais.

Estatística: Os dados foram analisados usando-se SYSTAT para Windows, versão 5. Os dados foram analisados usando-se um ANOVA bilateral repetido (para avaliar os efeitos globais), seguido por um teste t parea-do para identificar diferenças entre pares específicos. Significância era reconhecida quanto P era menor ou igual a 0,05. Os valores da inclinação (calculados a partir dos dados coletados durante os 45 minutos iniciais após a aplicação na avaliação em t zero) para as curvas de MCC média foram calculados usando regressão linear dos mínimos quadrados para avaliar diferenças nas taxas iniciais durante a fase de depuração rápida.

EXEMPLOS

Tendo descrito esta invenção de um modo geral, é possível compreendê-la melhor com referência a certos exemplos específicos que são oferecidos a título ilustrativo apenas e não se destinam a limitá-la de forma alguma, a menos que especificado em contrário. Preparação de blo-queadores de canais de sódio

Materiais e métodos. Todos os reagentes e solventes foram adquiridos na Aldrich Chemical Corp. e usados sem purificação posterior. Os espectros de RMN de próton e de carbono foram obtidos em um espectrô-metro Bruker AC 300 a 300 MHz e 75 MHz, respectivamente. Os espectros de prótons tiveram como referência tetrametilsilano como um padrão interno e os espectros de carbono tiveram como referência CDCl3, CD3OD, acetona-d6 ou DMSO-d6 (adquiridos na Aldrich ou Cambridge Isotope Laboratories, a menos que de outra forma especificado). Os pontos de fusão foram obtidos em um aparelho Mel-Temp II e não foram corrigidos. Os espectros de massa ESI foram obtidos em um espectrômetro de massa Shimadzu LCMS-2010 EV. As análises por HPLC foram obtidas usando-se uma coluna analítica Waters XTerra RP C18 detectadas a 220 nm (a menos que de outra forma especificado) em um sistema de HPLC Shimadzu Prominence. Com uma taxa de fluxo de 1,0 mL por minuto, o seguinte programa de tempo foi utilizado:

As seguintes definições das abreviações aplicam-se a menos que indicado em contrário.

Preparação da fórmula I (15)

Preparação do composto 2;

Cloreto de acetila (27,1 mL, 380,1 mmol) foi adicionado em gotas a MeOH (225 mL) à temperatura ambiente, e o composto 1 (15,0 g, 54,3 mmol) foi adicionado. A solução resultante foi refluxada por uma noite e concentrada, e em seguida cristalizada a partir de hexanos (700 mL) para dar o composto 2 desejado (14,0 g, 89%) como um sólido esbranquiçado: 1H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 7,07 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,71 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 4,02 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 3,68 (s, 3H), 2,75-2,57 (m, 2H), 2,22-2,05 (m, 2H).

Preparação do composto 3;

A uma solução de composto 2 (14,0 g, 48,2 mmol) em Me-OH/H2O (140 mL/70 mL) foram adicionados NaHCO3 (28,5 g, 337,4 mmol) e Boc2O (11,5 g, 53,0 mmol) a 0 °C A mistura resultante foi deixada esquentar até a temperatura ambiente e agitada por uma noite. A mistura reacional foi distribuída entre EtOAc (300 mL) e água (300 mL). A camada aquosa foi separada e extraída com EtOAc (2 × 300 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados sobre Na2SO4 e concentrados para dar o composto 3 (13,5 g, 90%) como um sólido esbranquiçado: H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 6,98 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,67 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 4,03 (t, J = 4,5 Hz, 1H), 3,68 (s, 3H), 2,65-2,40 (m, 2H), 1,92-1,82 (m, 1H), 1,44 (s, 9H).

Preparação do composto 4;

A uma solução de composto 3 (13,5 g, 43,6 mmol) em piridina (150 mL) foi adicionado triflato (7,3 mL, 43,6 mmol) a 0 °C, e a mistura rea-cional foi agitada a 0°C por 3 horas. Depois de concentrada, a mistura rea-cional foi distribuída entre EtOAc (300 mL) e água (300 mL). A camada aquosa foi separada e extraída com EtOAc (2 × 300 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados sobre Na2SO4 e concentrados. O resíduo foi purificado por cromatografia (sílica-gel, 95:5 CHCl3/MeOH) para dar o composto 4 desejado (16,0 g, 83%) como um sólido acastanhado: 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,26-7,23 (m, 2H), 7,20-7,17 (m, 2H), 5,08 (br s, 1H), 4,36 (br s, 1H), 3,71(s, 3H), 2,73-2,67 (m, 2H), 2,212,13 (m, 1H), 1,99-1,87 (m, 1H), 1,45 (s, 9H).

Preparação do composto 6;

A uma solução de composto 4 (16,0 g, 36,2 mmol) em CH3CN anidro (160 mL) foram adicionados TEA (20,9 mL, 144,8 mmol), 10% de (t-Bu)3P em hexanos (1,4 g, 7,2 mmol), benzil but-3-inilcarbamato (5, 8,8 g, 43,4 mmol) e CuI (340 mg, 1,8 mmol)à temperatura ambiente. A mistura resultante foi desgaseificada com argônio por 3 minutos e Pd(PPh3)4 (4,1 g, 3,6 mmol) foi adicionado rapidamente de uma só vez. Depois de desgaseifi-cada com argônio por 5 minutos, a mistura resultante foi aquecida a 60°C por 12 horas. A mistura reacional foi concentrada a vácuo e o resíduo foi purificado por coluna (sílica-gel, 40:60 hexanos/EA) para dar o composto 6 (16,0 g, 70%) como um óleo castanho: 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,36-7,28 (m, 8H), 7,07 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,12 (br s, 4 H), 4,33 (br s, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,46-3,39 (m, 2H), 2,68-2,59 (m, 4H), 2,14-2,20 (m, 1H), 1,96-1,84 (m, 1H), 1,44 (s, 9H).

Preparação do composto 7;

O composto 6 (8,0 g, 16,1 mmol) foi dissolvido em HCl 4 N em dioxano (60 mL) à temperatura ambiente e a solução resultante foi agitada por 1 hora. Depois de concentrada, o resíduo foi cristalizado a partir de MTBE para o sal de ácido clorídrico 7 (6,75 g, 90%) como um sólido branco: 1H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 7,32-7,28 (m, 7H), 7,18 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 5,08 (s, 2H), 4,04 (t, J= 6,3 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,31-3,29 (m, 2H), 2,822,67 (m, 2H), 2,58 (t, J=6,9 Hz, 2H), 2,26-2,08 (m, 2H).

Preparação do composto 8;

A uma solução de composto 7 (6,75 g, 15,6 mmol) em Me-OH/AcOH (70 mL/15 mL) foram adicionados 37% de CH2O em H2O (25,2 mL, 312 mmol) e cianoboroidreto de sódio (7,84 g, 124,8 mmol). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. Depois de concentrada, o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (sílica gel, 10:1 CH2Cl2/MeOH, 10:1:0,1 CHCl3/MeOH/NH4OH) para dar o composto 8 desejado (3,8 g, 63%) como um sólido esbranquiçado: 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,36-7,26 (m, 7H), 7,11 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 5,11 (s, 2H), 3,69 (s, 3H), 3,45-3,39 (m, 2H), 3,10 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 2,65-2,60 (m, 4H), 2,32 (s, 6H), 2,01-1,88 (m, 2H).

Preparação do composto 9;

A uma solução de éster metílico 8 (3,80 g, 8,9 mmol) em THF/MeOH/H2O (30 mL/30 mL/10 mL) foi adicionado NaOH (3,50 g, 89,0 mmol). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. Depois de concentrada, o resíduo foi dissolvido em H2O (50 mL) e HCl aquoso 1 N foi adicionado para ajustar o valor do pH em 5. O precipitado resultante foi removido por filtração e secado para dar o composto 9 desejado (3,25 g, 90%) como um sólido esbranquiçado: 1H RMN (300 MHz, CD3OD) δ 7,32-7,28 (m, 7H), 7,17 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,08 (s, 2H), 3,46-3,42 (m, 1H), 3,45-3,39 (m, 2H), 2,83-2,70 (m, 8H), 2,58 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,152,05 (m, 2H).

Preparação do composto 11;

A uma solução de composto 9 (1,80 g, 4,4 mmol) em DMF anidra (20 mL) foram adicionados HATU (3,3 g, 8,8 mmol) e DIPEA (4,0 mL, 22,0 mmol). A solução resultante foi adicionada à temperatura ambiente por 0,5 hora e a amina 10 (2,1 g, 5,2 mmol) foi adicionada. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite e distribuída entre EtOAc (200 mL) e água (200 mL). A camada aquosa foi separada e extraída com EtOAc (2 × 200 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secados sobre Na2SO4 e concentrados. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna (sílica-gel, 95:5 CHCl3/MeOH) para dar o composto 11 desejado (1,70 g, 49%) como um sólido branco: 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,36-7,28 (m, 7H), 7,10 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 5,10 (s, 3H), 4,97-4,90 (m, 1H), 3,86 (t, J =6,6 Hz, 2H), 3,45-3,35 (m, 2H), 3,12 (s, 3H), 3,09-3,00 (m, 2H), 2,96 (s, 3H), 2,91-2,71 (m, 2H), 2,62 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,30 (s, 6H), 1,97-1,31 (m, 26H).

Preparação do composto 12;

Uma suspensão de composto 11 (1,7 g, 2,1 mmol) e 10% Pd/C (800 mg) em MeOH/AcOH (25 mL/1,0 mL) fi submetida a condições de hi-drogenação (1 atm) por uma noite à temperatura ambiente. A mistura rea-cional foi filtrada através de celite e lavada com MeOH. O filtrado foi concentrado a vácuo e cristalizado a partir de MTBE para dar o sal acético 12 (1,45g, 90%) como um óleo incolor: 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,12 (s, 4H), 4,97-4,90 (m, 2H), 3,90-3,85 (m, 2H), 3,29 (s, 3H), 2,95 (s, 3H), 2,91 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 2,63 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,57-2,50 (m, 8H), 1,95 (s, 6H), 2,02-1,96 (m, 2H), 1,80-1,62 (m, 10H), 1,50 (s, 9H), 1,45 (s, 9H).

Preparação do composto 14;

A uma solução de sal de ácido acético 12 (1,45 g, 2,1 mmol) e sal de ácido iodídrico de metil 3,5-diamino-6-cloropirazina-2-carbonilcarbamimidotioato (13, 1,28 g, 3,3 mmol) em EtOH (20 mL) foi adicionado DIPEA (2,17 g, 16,8 mmol) à temperatura ambiente. A mistura rea-cional foi aquecida a 70°C por 2 horas, e em seguida resfriada para a temperatura ambiente e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cro-matografia de coluna (sílica gel, 9:1 CH2Cl2/MeOH, 80:18:2 CH-Cl3/MeOH/NH4OH) para dar o composto 14 desejado (1,15 g, 68%) como um sólido amarelo: 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,09 (s, 4H), 4,87-4,82 (m, 2H), 3,86 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 3,24-3,18 (m, 3H), 3,22 (s, 3H), 2,96-2,91 (m, 4H), 2,64-2,47 (m, 4H), 2,30 (t, 6H), 1,99-1,72 (m, 10 H) , 1,55-1,32 (m, 20 H).

Preparação do composto 15 [Fórmula I] - 3,5-diamino-6-cloro-N-(N-(4-(4-((S)-3-(dimetilamino)-4-((S)-1-(dimetilamino)-6- guanidino-1-oxo-hexan-2-ilamino)-4- oxobutil)fenil)butil)carbamimidoil)pirazina-2-carboxamida;

A uma solução de composto 14 (670 mg, 0,7 mmol) em CH2Cl2 (20 mL) foi adicionado TFA (5,0 mL) e a solução resultante foi agitada à temperatura ambiente por 2 horas. A mistura reacional foi concentrada a vácuo e transformada em um azeótropo com HCl aquoso 1 N 3 vezes para dar o sal de ácido clorídrico de 15 (fórmula I, 600 mg, 99%) como um sólido higroscópico amarelo: 1H RMN (400 MHz, D2O) δ 7,16-7,15 (m, 4H), 3,843,81 (m, 1H), 3,26 (br s, 2H), 3,13-3,11 (m, 5H), 2,91-2,86 (m, 9H), 2,61-2,53 (m, 4H), 2,25-2,11 (m, 2H), 1,74-1,23 (m, 10 H).

Sumário dos dados in vitro para o composto 15:

• • Potência (IC50) em células epiteliais brônquicas caninas: 5,3 ± 3,3 nM (n=5) (Figura 1)
• • Reversão do efeito máxima em células epiteliais brônquicas caninas: 6,8 ± 5,1% (n=3) do efeito foram perdidos com 3 lavagens
• • Taxa de absorção através células epiteliais brônquicas humanas: 0,12 ± 0,05 nM/cm /min (n=3)
• • Metabolismo por células epiteliais brônquicas humanas: Nenhum metabólito detectado apical ou basolateral
• • Estabilidade no plasma humano: Nenhum metabolismo detectado depois de 4 horas
• • Durabilidade da retenção de líquido na superfície das vias aéreas por células epiteliais brônquicas caninas: 94 ± 5% (n=3) de fluido retido 8 horas depois da distribuição da fármaco; 56 ± 6% (n=2) de fluido retido 24 horas depois da distribuição da fármaco
• • Metabolismo em hepatócito de rato: Sem evidência de metabolismo significativo em toda a incubação de 24 horas
• • Ligação a proteínas plasmáticas humanas: 80 ± 5% (n=6) ligados a proteínas plasmáticas

Uma curva de dose-resposta da inibição de ENaC com P-1046 (I) e amiloride está mostrada na Figura 1.

Dados oculares e métodos para o composto 15 (fórmula I, também conhecido como I, também conhecido como P-1046, também conhecido como 1046):
Os efeitos da concentração de P-1046 (fórmula I, 15) sobre a produção de lágrimas em ratos ExLac estão mostrados na Figura 2.
A depuração de P-1046 (fórmula I, 15) da superfície ocular está mostrada na Figura 3.
Os efeitos de 10 mM P-1046 (fórmula I, 15) sobre a produção de lágrimas em ratos ExLac estão mostrados na Figura 4.

Procedimentos para a medição de filamento de vermelho de fenol (PRT) da produção de lágrimas:
Espécie / cepa do animal: Ratos, Sprague Dawley (SD); glândula lacrimal removida cirurgicamente (ExLac).

Número / sexo do animal:3-4 fêmeas/grupo
Formulação do artigo de teste: Todas as soluções de estoque para cada braço de aplicação foram preparadas no máximo 48 horas antes do início do estudo. A concentração de bloqueadores de ENaC em todas as soluções de artigo de teste foi confirmada por espectrofotometria.

Administração do artigo de teste: Tanto os olhos ipsilaterais quanto os olhos contralaterais foram medicados com 5 l da solução de artigo de teste.

Teste do filamento de vermelho de fenol (PRT): A produção de lágrimas foi medida usando-se um filamento de algodão ZoneQuick impregnada com o corante vermelho de fenol. A extremidade dobrada do filamento foi mantida no fundo de saco conjuntival lateral-ventral por 10 segundos. O comprimento da mecha de lágrima no filamento foi determinado medindo-se o comprimento do filamento que muda de cor de amarelo para vermelho. Um estereomicroscópio foi usado para auxiliar uma medição precisa (registrada em milímetros) da mecha / mudança de cor.

Procedimento para P-1046 (composto 15 fórmula I, também conhecido como I, também conhecido como P-1046, também conhecido como 1046): Extração de filamentos de PRT:

Todos os filamentos de PRT foram coletados em tubos eppen-dorf e armazenados a -20°C até o momento de análise da concentração de fármaco. O P-1046 foi extraído dos filamentos e analisado da seguinte maneira:

• 1. 200 µL de ACN a 70% (70% de ACN, 30% de H2O) foram introduzidos em tubos de ensaio que já contêm filamentos.
• 2. Os tubos da etapa 1 foram turbilhonados por 30 segundos e sonicados por 1 minuto para submergir completamente os filamentos.
• 3. As soluções de amostra foram incubadas por 4 horas à temperatura ambiente.
• 4. As amostras foram turbilhonadas mais uma vez por 30 segundos.
• 5. 75 µL de cada solução de amostra (da etapa 4) foram transferidos para uma placa UPLC de 96 poços com mais 75 µL de uma fase móvel A (5mM de formiato de amônio, 0,1% de ácido fórmico em H2O) acrescentados a cada poço com amostra.
• 6. Padrões analíticos (10 mM, 1mM, 100 M, 10 M, 1 M, 100 nM, Buffer) foram preparados de maneira idêntica às soluções de filamento.
• 7. As concentrações de fármaco de todas as amostras foram analisadas por UPLC.

Teste de solubilidade e estabilidade para o composto 15 (fórmula I, também conhecido como I, também conhecido como P-1046, também conhecido como 1046):

Procedimento para avaliação da solubilidade e estabilidade:
1. Preparar um tampão com 2,8% de NaCl e 25 mM de citrato, pH da solução 4,2. A osmolalidade da solução é aproximadamente 940 mOsM.
2. Acrescentar uma quantidade apropriada da solução tampão a um composto de teste até atingir uma concentração aproximada de 10 mg/mL.
3. Turbilhonar a solução por 15 segundos, sonicar por 30 segundos, turbilhonar novamente por 60 segundos e observar visualmente a solução.
4. Calcular a concentração final da solução por meio de um es-pectrofotômetro.

• • Retirar uma porção da solução e diluir a mesma em uma proporção 1:10. Colocar esta solução a 50°C para o estudo de estabilidade acelerada por 10 dias.
• • Obter dados de estabilidade por análise por HPLC.

5. Preparar um tampão com 2,8% de NaCl e 25 mM de citrato, pH da solução 4,2. A osmolaridade da solução é aproximadamente 940 mOsM.
6. Acrescentar uma quantidade apropriada da solução tampão a um composto de teste até atingir uma concentração aproximada de 10 mg/mL.
7. Turbilhonar a solução por 15 segundos, sonicar por 30 segundos, turbilhonar novamente por 60 segundos e observar visualmente a solução.
8. Calcular a concentração final da solução por meio de um es-pectrofotômetro.

• • Retirar uma porção da solução e diluir a mesma em uma proporção 1:10. Colocar esta solução a 50°C para o estudo de estabilidade acelerada por 10 dias.
• • Obter dados de estabilidade por análise por HPLC.

A Figura 5 mostra a análise por HPLC das amostras quanto à solubilidade/estabilidade de P-1046 (fórmula I, 15) no dia 1 e no dia 10.
Resumo da segurança e tolerabilidade para o composto 15 (fórmula I, também conhecido como I, também conhecido como P-1046,
Um estudo de toxidade ocular aguda não-GLP em coelhos brancos neozelandeses com P-1046
também conhecido como 1046):

• OBJETIVO:

A finalidade deste estudo era avaliar a tolerabilidade ocular e a exposição sistêmica do P-1046, um inibidor do canal de sódio epitelial (E-NaC), quando administrado como uma instilação tópica a coelhos brancos neozelandeses.

• MÉTODOS:

O artigo de teste (P-1046) foi apresentado com um pó branco amarelo claro. Os artigos de teste foram então preparados como soluções de dosagem para aplicação tópica ao olho. Vinte e oito coelhos brancos neozelandeses machos experimentalmente naive, com aproximadamente 4 meses de idade no início do estudo e pesando 2,6-3,1 quilos quando da randomização foram distribuídos em grupos de tratamento como mostrado na tabela abaixo:

*Em cada dose, 50 µl de veículo ou solução de artigo de teste foram instilados no olho direito e 50 µl de solução salina foram instilados no olho esquerdo
**As doses foram administradas oito vezes (1 hora entre doses, grupos de dose de 10 mM) ou quatro vezes (2 horas entre cada dose, grupos de dose de 30 mM) durante um único dia

Os animais foram medicados com 50 µl do composto de teste ou do veículo de controle no globo do olho direito e 50 µl de solução salina no globo do olho esquerdo oito vezes (aproximadamente uma hora entre cada dose) nos grupos 1 e 6 e quatro vezes (aproximadamente duas vezes entre cada dose) no grupo 7. A mortalidade e observações clínicas foram registradas diariamente. Os pesos corporais foram registrados quando da ran-domização/seleção e antes do sacrifício no dia 2. Para avaliar o índice de piscar, as piscadas de olho no olho direito só foram contadas durante 3 minutos antes do início do tratamento e depois de todas as doses. Os casos de contração nervosa e patada nos olhos durante o período de observação de piscada do olho de 3 minutos foram registrados como observações clínicas. O consumo de alimentos foi registrado diariamente. Os olhos foram classificados segundo Draize antes do tratamento, depois de cada dose e no dia 2 aproximadamente 24 horas após a aplicação. Sangue para avaliação da toxicocinética foi coletado dos animais nos grupos 2-7 antes da primeira dose, 30 minutos depois da dose intermediária (4a dose nos grupos 3, 5, e 6; 2a dose nos grupos 2, 4, e 7) e 30, 60, 120 e 240 minutos depois da dose final no dia 1. Amostras de sangue para avaliação de parâmetros químicos do soro foram coletadas antes do início do tratamento e 120 e 240 minutos depois da dose final. Amostras de urina foram coletadas durante um período de 4 horas depois da dose final. Todos os animais foram sacrificados após o término dos procedimentos de estudo no dia 2.

• RESULTADOS E CONCLUSÕES:

Os animais em estudo pareciam estar em bom estado de saúde, segundo avaliado por observações clínicas, pesos corporais e consumo de alimentos.

A irritação ocular foi avaliada por medição do índice de piscar, avaliação Draize dos olhos e observações clínicas. A irritação associada a cada tratamento está discutida abaixo.

Veículo

O veículo foi bem tolerado com apenas uma irritação ocular transitória mínima subsequente à aplicação. Os animais no grupo de controle com veículo tiveram vermelhidão conjuntival em ambos os olhos (escore Draize max = 1) e incidências isoladas de contração nervosa e patada nos olhos. A incidência de vermelhidão conjuntival foi ligeiramente mais alta nos olhos tratados com veículo (olho direito), em comparação com os olhos tratados com solução salina (olho esquerdo), o que sugere que a irritação observada pode ter sido resultado tanto dos efeitos do veículo quanto do procedimento de aplicação (Figura 6). Todos os olhos pareceram normais no dia 2.

10 e 30mM P-1046

As formulações de P-1046 foram bem toleradas. Após a aplicação foi observada vermelhidão conjuntival, mas a severidade e incidência deste sinal foram comparáveis às dos controles com veículo. Todos os olhos no grupo de 10 mM pareceram normais no dia 2.

Um resumo da tolerabilidade ocular ao P-1046 está mostrado na Figura 6.

A Figura 7 mostra os níveis plasmáticos de P-1046 depois de aplicação ao olho.

Claims (9)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que é representado pela fórmula (I):

   

   e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um sal de adição de ácido de um ácido inorgânico ou de um ácido orgânico selecionado do grupo que consiste em ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucônico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tânico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácido naftalenossulfônico, ácido metanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido naftalenodissulfônico, ácido poligalacturônico, ácido malônico, ácido sulfossalicílico, ácido glicólico, 2-hidroxi-3-naftoato, pamoato, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido ftálico, ácido mandélico, e ácido láctico.
3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:
   o composto como definido na reivindicação 1; e
   um agonista do receptor de P2Y2.
5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:
   o composto como definido na reivindicação 1; e
   um broncodilatador.
6. Processo para a preparação de sal de adição de ácido clirídrico de um composto representado pela fórmula (I)

   

   caracterizado pelo fato de que compreende:
   tratar o composto representado pela fórmula (14)

   

   com uma quantidade eficaz de ácido trifluoracético seguido por azeotropinar com HCl aquoso.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tratamento é conduzido em CH2Cl2.
8. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o HCl aquoso é 1N HCl aquoso.
9. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, subsequente ao tratamento e antes de azeotropinar, concentrar a mistura da reação resultante sob vácuo.

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