BR112013025221A2 - retenção de moléculas de ligação a antígeno em plasma sanguíneo e método para modificação de imunogenicidade - Google Patents
retenção de moléculas de ligação a antígeno em plasma sanguíneo e método para modificação de imunogenicidade Download PDFInfo
- Publication number
- BR112013025221A2 BR112013025221A2 BR112013025221-9A BR112013025221A BR112013025221A2 BR 112013025221 A2 BR112013025221 A2 BR 112013025221A2 BR 112013025221 A BR112013025221 A BR 112013025221A BR 112013025221 A2 BR112013025221 A2 BR 112013025221A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- amino acid
- antigen
- ala
- binding
- region
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/04—Antipruritics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/303—Liver or Pancreas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Oncology (AREA)
Abstract
RETENÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO EM PLASMA SANGUÍNEO E MÉTODO PARA MODIFICAÇÃO DE IMUNOGENICIDADE
A presente invenção refere-se à modificação de uma região Fc de uma molécula de ligação a antígeno para uma região Fc que não forma em uma faixa de pH neutro um complexo heterotetrâmero contendo duas moléculas de FcRn e um receptor Fcy ativo aperfeiçoado pela farmacocinética da molécula de ligação a antígeno e reduzido da resposta imune à molécula de ligação a antígeno. Ainda, a presente invenção refere-se a métodos revelados para a fabricação de moléculas de ligação a antígeno tendo as propriedades descritas acima e demonstradas com sucesso que as composições farmacêuticas, que contêém como um ingrediente ativo tal molécula de ligação a antígeno ou molécula de ligação a antígeno fabricada de acordo com o método de fabricação da presente invenção têm excelentes características sobre as moléculas de ligação a antígeno convencionais em que quando administradas, elas exibem farmacocinética aperfeiçoada e resposta imune in vivo reduzida.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO
PARA ALTERAÇÃO DE RETENÇÃO NO PLASMA E IMUNOGENICIDADE DE MOLÉCULA DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO". Campo da Técnica 5 A presente invenção refere-se a métodos para aperfeiçoamento da farmacocinética de uma molécula de ligação a antígeno em animais ad- ministrados com a molécula e métodos para redução de resposta imune a uma molécula de ligação a antígeno através da modificação da região Fc da molécula de ligação a antígeno que tem um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de íon e uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro. A presente invenção refere-se também a moléculas de ligação a antígeno que exibem farmacocinética aperfeiçoada ou resposta imune redu- zida em animais administrados com as moléculas. Ainda, a presente inven- ção refere-se a métodos para produção das moléculas de ligação a antígeno e a composições farmacêuticas compreendendo como um ingrediente ativo tal molécula de ligação a antígeno. Técnica Anterior Os anticorpos têm chamado a atenção como agentes farmacêu- ticos uma vez que são altamente estáveis no plasma e possuem poucos e- feitos colaterais. Atualmente, um número de agentes farmacêuticos de anti- corpos do tipo IgG está disponível no mercado e muitos agentes farmacêuti- cos de anticorpos estão atualmente em desenvolvimento (Documentos de Não Patente 1 e 2). Enquanto isso, várias tecnologias aplicáveis a agentes farmacêuticos de anticorpos de segunda geração foram relatadas, incluindo aquelas que melhoram a função efetora, a capacidade de ligação ao antíge- no, a farmacocinética e a estabilidade e aquelas que reduzem o risco de i- munogenicidade (Documento de Não Patente 3). Em geral, a dose necessá- ria de um agente farmacêutico de anticorpo é muito alta. Isto, por sua vez, levou a problemas, tal como o alto custo de produção, bem como a dificul- dade de produzir formulações subcutâneas. Em teoria, a dose de um agente farmacêutico de anticorpo pode ser reduzida através do aprimoramento da farmacocinética do anticorpo ou do aprimoramento da afinidade entre anti- corpos e antígenos.
A literatura relatou métodos para aprimorar a farmacocinética do anticorpo utilizando a substituição artificial de aminoácidos em regiões cons- 5 tantes (documentos Não Patente 4 e 5). Similarmente, a maturação da afini- dade foi relatada como uma tecnologia para o aprimoramento da capacidade de ligação ao antígeno ou da atividade de neutralização dos antígenos (Do- cumento de Não Patente 6). Esta tecnologia possibilita o aprimoramento da atividade de ligação ao antígeno através da introdução de mutações de ami- noácidos dentro da região de CDR de uma região variável ou tal.
O aprimo- ramento da capacidade de ligação ao antígeno possibilita o aprimoramento da atividade biológica in vitro ou a redução de dosagem e possibilita ainda o aprimoramento da eficácia in vivo (Documento de Não Patente 7). A capacidade de neutralização de antígeno de uma única molé- cula de anticorpo depende de sua afinidade.
Através do aumento da afinida- de, um antígeno pode ser neutralizado por quantidade menor de um anticor- po.
Vários métodos podem ser utilizados para aprimorar a afinidade do anti- corpo (Documento de Não Patente 6). Além disso, se a afinidade puder se tornada infinita através da ligação de forma covalente do anticorpo ao antí- geno, uma única molécula de anticorpo poderia neutralizar uma molécula de antígeno (um anticorpo divalente pode neutralizar duas moléculas de antíge- no). Entretanto, a neutralização estequiométrica de um anticorpo contra um antígeno (um anticorpo divalente contra dois antígenos) é o limite de méto- dos preexistentes, e assim é impossível neutralizar completamente o antíge- no com a quantidade de anticorpo menor que a quantidade de antígeno.
Em outras palavras, o efeito de aumento de afinidade possui um limite (Docu- mento de Não Patente 9). Para prolongar o efeito de neutralização de um anticorpo neutralizante durante certo período, o anticorpo tem que ser admi- nistrado em uma dose maior que a quantidade de antígeno produzida no corpo durante o mesmo período.
Com o aprimoramento de farmacocinética do anticorpo ou da tecnologia de maturação da afinidade descrito acima, há então uma limitação na redução da dose de anticorpo requerida.
Desta ma-
neira, a fim de sustentar o efeito de neutralização de antígeno do anticorpo por um período alvo com quantidade menor do anticorpo do que a quantida- de de antígeno, um anticorpo único deve neutralizar antígenos múltiplos.
Um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente do pH foi 5 recentemente relatado como um novo método para atingir o objetivo anterior (Documento de Patente 1). Os anticorpos de ligação a antígeno dependente do pH, que se ligam fortemente a um antígeno sob as condições neutras no plasma e se dissociam do antígeno sob condições ácidas no endossomo, podem se dissociar do antígeno no endossomo.
Quando um anticorpo de ligação ao antígeno dependente do pH que se dissocia do antígeno é reci- clado para o plasma por FcRn, este pode se ligar a um outro antígeno no- vamente.
Assim, um único anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH pode se ligar a inúmeros antígenos repetidamente.
Além disso, a retenção no plasma de um antígeno é muito curta quando comparada com os anticorpos reciclados via ligação a FcRn.
Quan- do um anticorpo com tal retenção longa no plasma se liga ao antígeno, o tempo de retenção no plasma do complexo antígeno-anticorpo é prolongado até o mesmo que aquele do anticorpo.
Assim, a retenção no plasma do antí- geno é prolongada através da ligação ao anticorpo e, assim, a concentração de antígenos no plasma é aumentada.
Anticorpo IgG tem tempo de retenção no plasma mais longo co- mo um resultado de ligação a FcRn.
A ligação entre IgG e FcRn é apenas observada sob uma condição ácida (pH 6,0). Em contraste, a ligação é qua- se não detectável sob uma condição neutra (pH 7,4). Anticorpo IgG é absor- vido em células de uma maneira não específica.
O anticorpo retorna para a superfície celular através de ligação a FcRn endossomal sob condição ácido endossomal, e então é dissociada de FcRn sob a condição neutra do plas- ma.
Quando a ligação de FcRn sob a condição ácida é perdida pela introdu- ção de mutações na região Fc IgG, ausência de reciclagem de anticorpo pa- ra o plasma a partir do endossomo notadamente prejudica o tempo de reten- ção de anticorpo no plasma.
Um método relatado para aperfeiçoamento da retenção no plasma de anticorpo IgG é aprimorar a ligação a FcRn sob con-
dições ácidas.
Mutações de aminoácido são introduzidas na região Fc de anticorpo IgG para melhorar a ligação a FcRn sob condições ácidas.
Isso aumenta a eficiência de reciclagem para o plasma a partir do endossomo, resultando em melhora da retenção no plasma.
Uma necessidade importante 5 na substituição de aminoácido é não aumentar a ligação a FcRn sob condi- ções neutras.
Se um anticorpo IgG se ligar a FcRn sob condições neutras, o anticorpo que retorna para a superfície celular através de ligação a FcRn sob a condição ácida endossomal não é dissociado de FcRn sob a condição neutra no plasma.
Neste caso, a retenção no plasma é perdida porque o an- ticorpo IgG não é reciclado para o plasma.
Por exemplo, um anticorpo IgG modificado pela introdução de substituições de aminoácido de maneira que o anticorpo resultante é capaz de se ligar a FcRn de camundongo sob uma condição neutra (pH 7,4) foi relatado exibir retenção no plasma muito pobre quando administrado a camundongos (Documento de Não Patente 10). Ain- da, um anticorpo IgG1 foi modificado através da introdução de substituições de aminoácido de maneira que o anticorpo resultante exibe ligação a FcRn humano aperfeiçoada sob uma condição ácida (pH 6,0) e ao mesmo tempo se torna capaz de se ligar a FcRn humano sob uma condição neutra (pH 7,4) (Documentos Não Patente 10, 11 e 12). O anticorpo resultante foi relatado não mostrar nem melhora nem alteração na retenção no plasma quando administrado a macacos cinomólogos.
Desta maneira, a tecnologia de enge- nharia de anticorpo para aperfeiçoamento de funções de anticorpo focou apenas no aperfeiçoamento de retenção no plasma de anticorpo através do aumento de ligação a FcRn humano sob condições ácidas sem aprimorá-la sob uma condição neutra (pH 7,4). Até agora, não há nenhum relato descre- vendo a vantagem de aperfeiçoamento da ligação a FcRn humano sob uma condição neutra (pH 7,4) através da introdução de substituições de aminoá- cido na região Fc de um anticorpo IgG.
Mesmo se a afinidade com antígeno do anticorpo for melhorada, eliminação de antígeno do plasma não pode ser aumentada.
Os anticorpos de ligação a antígeno dependente do pH descri- tos acima foram relatados ser mais eficazes como um método para aumento da eliminação de antígeno do plasma comparado com anticorpos típicos
(Documento de Patente 1). Assim, um único anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH se liga a inúmeros antígenos e é capaz de facilitar a eliminação dos antí- genos do plasma quando comparado com anticorpos típicos.
Consequente- 5 mente, os anticorpos com ligação a antígeno dependente do pH possuem efeitos não conseguidos por anticorpos típicos.
Entretanto, até agora, não há nenhum relato sobre métodos de engenharia de anticorpo para aperfeiçoa- mento adicional da habilidade de anticorpos de ligação a antígeno depen- dente do pH em se ligarem repetidamente a antígenos e o efeito de aumento de eliminação do antígeno do plasma.
Entretanto, a imunogenicidade de agentes farmacêuticos de an- ticorpo é muito importante do ponto de vista de retenção no plasma, na efi- cácia e na segurança quando eles são administrados a seres humanos.
Foi relatado que se anticorpos forem produzidos contra agentes farmacêuticos de anticorpo administrados no corpo humano, eles causam efeitos indesejáveis tais como aceleração de eliminação dos agentes farma- cêuticos de anticorpo do plasma, redução de eficácia e elicitação de reação de hipersensibilidade e afetando a segurança (Documento de Não Patente 13). Primeiro de tudo, quando levando em consideração a imunoge- nicidade de agentes farmacêuticos de anticorpo, as funções in vivo de anti- corpos naturais devem ser compreendidas.
Primeiro, a maioria dos agentes farmacêuticos de anticorpo são anticorpos que pertencem à classe IgG, e a presença de receptores Fcγ (daqui em diante também referidos como FcγR) como receptores Fc que funcionam através de ligação à região Fc de anti- corpos IgG é conhecida.
FcγRs são expressos na membrana celular de célu- las dendríticas, células NK, macrófagos, neutrófilos, adipócitos e outros; e eles são conhecidos transduzir sinais intracelulares de ativação ou inibidores para células imunes quando da ligação de uma região Fc de IgG.
Para a fa- mília de proteína FcγR humana, as isoformas FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa e FcγRIIIb são conhecidas e seus alótipos foram também relatados (Documento de Não Patente 14). Dois alótipos foram relatados para FcγRIIa humano: Arg (hFcγRIIa(R) e His (hFcγRIIa(H)) na posição 131. Ainda, dois alótipos foram relatados para FcγRIIIa: Val (hFcγRIIIa(V) e Phe (hFcγRIII- a(F)) na posição 158. Entretanto, para a família de proteína FcγR de camun- dongo, FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII e FcγRIV foram relatadas (Documento de 5 Não Patente 15). FcγRs seres humanos incluem receptores de ativação FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa e FcγRIII e receptor inibidor FcγRIIb.
Da mesma maneira, FcγRs de camundongo incluem receptores de ativação FcγRI, FcγRIII e FcγRIV e receptor inibidor FcγRIIb.
Quando FcγR de ativação é reticulado com um complexo imune, ele fosforila motivos de ativação do imunorreceptor baseados em tirosina (ITAMs) (Immunoreceptor Tyrosine-Based Activating Motifs) contidos no do- mínio intracelular ou cadeia γ comum de FcR (uma contraparte de intera- ção), ativa um transdutor de sinal SYK e dispara resposta imune inflamatória através do início de uma cascata de sinal de ativação (Documento Não Pa- tente 15). Foi demonstrado que para a ligação entre a região Fc e FcγR, certos resíduos de aminoácido na região de dobra de anticorpo e domínio CH2 e a cadeia açúcar ligada ao domínio CH2 em Asn de posição 297 no sistema de numeração EU são importantes (Documentos de Não Patente 15 a 17). Com um foco em anticorpos introduzidos com mutações nos sítios descritos acima, mutantes com propriedades de ligação a FcγR variáveis foram investigados e mutantes de região Fc que têm afinidade maior com FcγR de ativação foram obtidos (Documentos de Patente 2 a 5). Entretanto, FcγRIIb, que é um FcγR inibidor, é o único FcγR ex- presso em células B (Documento de Não Patente 8). Interação da região Fc de anticorpo com FcγRIIb foi relatada suprimir a resposta imune primária de células B (Documento de Não Patente 19). Ainda, é relatado que quando FcγRIIb em células B e um receptor de célula B (BCR) (B Cell Receptor) são reticulados através de um complexo imune em sangue, ativação de célula B é suprimida, e produção de anticorpo por células B é suprimida (Documento de Não Patente 20). Nesta transdução de sinal imunossupressora mediada por BCR e FcγRIIb, o motivo de inibição baseado em tirosina imunorrecepto- ra (ITIM) (Immunoreceptor Tyrosine-Base Inhibitory Motif) contido no domí- nio intracelular de FcγRIIb é necessário (Documentos de Não Patente 21 e 22). Esta ação imunossupressora é causada por fosforilação de ITIM.
Como 5 um resultado de fosforilação, inositol polifosfato 5-fosfatase contendo SH2 (SHIP) (SH2-Containing Inositol Polyphosphate 5-Phosphatase) é recrutada, transdução de outras cascatas de sinal de FcγR de ativação é inibida e res- posta imune inflamatória é suprimida (Documento de Não Patente 23). Devido a esta propriedade, FcγRIIb é promissor como um meio para reduzir diretamente a imunogenicidade de agentes farmacêuticos de anticorpo.
Exendina-4 (Ex4) é uma proteína estranha para camundongos, mas anticorpos não são produzidos mesmo quando uma molécula fundida com IgG (Ex4/Fc) é administrada a camundongos.
Entretanto, anticorpos são produzidos contra Ex4 quando da administração da molécula (Ex4/Fc mut) que é obtida através da modificação de Ex4/Fc para não se ligar a FcγRIIb em células B (Documento de Não Patente 24). Este resultado suge- re que Ex4/Fc se liga a FcγRIIb em células B e inibe a produção de anticor- pos de camundongo contra Ex4 em células B.
Ainda, FcγRIIb é também expresso em células dendríticas, ma- crófagos, neutrófilos ativos, mastócitos e basófilos.
FcγRIIb inibe as funções de FcγR de ativação tal como fagocitose e liberação de citocinas inflamató- rias nessas células, e suprime respostas inflamatórias imunes (Documento de Não Patente 25). A importância de funções imunossupressoras de FcγRIIb foi elu- cidada até agora através de estudos usando camundongos com FcγRIIb ina- tivado.
Há relatos que em camundongos com FcγRIIb inativado, imunidade humoral não é apropriadamente regulada (Documento de Não Patente 26), sensibilidade com relação à artrite induzida por colágeno (CIA) (Collagen- induced Arthritis) é aumentada (Documento Não Patente 27), sintomas tipo lúpus são apresentados e sintomas tipo síndrome de Goodpasture são apre- sentados (Documento Não Patente 28). Ainda, inadequação reguladora de FcγRIIb foi relatada a estar relacionada com doenças humanas autoimunes.
Por exemplo, a relação en- tre polimorfismo genético na região de transmembrana e região de promotor de FcγRIIb e a frequência de desenvolvimento de lúpus eritematoso sistêmi- co (SLE) (Systemic Lupus Erythematosus) (Documentos Não Patente 29, 30, 5 31, 32 e 33) e diminuição de expressão de FcγRIIb sobre a superfície de células B em pacientes SLE (Documentos Não Patente 34 e 35) foi relatada.
A partir de modelos de camundongo e constatações clínicas do tipo, FcγRIIb é considerado desempenhar o papel de controle de doenças autoimunes e doenças inflamatórias principalmente através de envolvimento com células B, e é uma molécula alvo promissora para controle de doenças autoimunes e doenças inflamatórias.
IgG, principalmente usado como um agente farmacêutico de an- ticorpo comercialmente disponível, é conhecido se ligar não apenas a FcγRI- Ib, mas também fortemente a FcγR de ativação (Documento de Não Patente 36). Pode ser possível desenvolver agentes farmacêuticos de anticorpo ten- do propriedades imunossupressoras maiores comparado com aquelas de IgG1 através da utilização de uma região Fc com ligação a FcγRIIb maior, ou seletividade de ligação a FcγRIIb melhorada comparado com FcγR de ativa- ção.
Por exemplo, foi sugerido que o uso de um anticorpo tendo uma região variável que se liga a BCR e uma Fc com ligação a FcγRIIb maior pode inibir ativação de célula B (Documento de Não Patente 37). No entanto, FcγRIIb compartilha 93% de identidade de sequên- cia na região extracelular com aquela de FcγRIIb que é um dos FcγRs de ativação, e eles são muito similares estruturalmente.
Há alótipos de FcγRIIb, tipo H e tipo R, em que o aminoácido na posição 131 é His (tipo H) ou Arg (tipo R) e ainda cada um deles reage diferentemente com os anticorpos (Do- cumento de Não Patente 38). Desta maneira, para produzir uma região Fc que se ligue especificamente a FcγRIIb, o problema mais difícil pode ser conferir à região Fc do anticorpo a propriedade de atividade de ligação a FcγRIIb seletivamente aperfeiçoada, o que envolve diminuição ou não au- mento da atividade de ligação com relação a cada alótipo de FcγRIIb, en- quanto aumentando a atividade de ligação com relação a FcγRIIb.
Há um caso relatado sobre aumento da especificidade de liga- ção a FcγRIIb através da introdução de mutações de aminoácido na região Fc (Documento Não Patente 39). De acordo com este documento, mutantes foram construídos de maneira que quando comparados com IgG1, eles re- 5 têm sua ligação a FcγRIIb mais do que FcγRIIa que tem duas formas poli- mórficas.
No entanto, em comparação com IgG1 natural, todos os mutantes relatados ter especificidade aperfeiçoada com FcγRIIb neste documento fo- ram verificados ter ligação a FcγRIIb prejudicada.
Desta maneira, é conside- rado difícil para os mutantes induzir uma reação imunossupressora mediada por FcγRIIb mais fortemente do que IgG1. Há também um relato sobre aumento da ligação a FcγRIIb (Do- cumento de Não Patente 37). Neste documento, a ligação a FcγRIIb foi au- mentada através da introdução de mutações tais como S267E/L328F, G236D/S267E e S239D/S267E na região Fc do anticorpo.
Dentre eles, um anticorpo introduzido com a mutação S267E/L328F se ligou mais fortemente a FcγRIIb.
Este mutante foi mostrado reter a ligação a FcγRIa e FcγRIIb tipo H em níveis comparáveis àqueles de IgG 1 natural.
Mesmo se ligação a FcγRIIb foi aumentada com relação a IgG1, apenas o aumento de ligação a FcγRIIa, mas não o aumento de ligação à FcγRIIb, é esperado ter um efeito sobre células tais como plaquetas que expressam FcγRIIa, mas não FcγRIIb (Documento de Não Patente 25). Por exemplo, foi relatado que plaquetas são ativadas através de um mecanismo dependente de FcγRIIa em lúpus eritematoso sistêmico e ativação de plaqueta está relacionada com a severi- dade (Documento Não Patente 40). De acordo com outro relato, a mutação descrita acima aumentou a ligação a FcγRIIa tipo R várias centenas de ve- zes para o mesmo grau que a ligação a FcγRIIb, e ela não melhorou a espe- cificidade de ligação para FcγRIIb quando comparado com FcγRIIa tipo R (Documento de Patente 17). Ainda, em tipos de célula que expressam am- bos o FcγRIIa e o FcγRIIb tais como células dendríticas e macrófagos, a se- letividade de ligação para FcγRIIb com relação a FcγRIIa é essencial para a transdução de sinais inibidores; no entanto; tal seletividade não poderia ser obtida para tipo R.
FcγRIIa tipo H e tipo R são encontrados quase na mesma taxa dentre Caucasianos e Afro-americanos (Documentos de Não Patente 41 e 42). Desta maneira, há certas restrições quanto ao uso de anticorpos com ligação maior a FcγRIIa tipo R para tratar doenças autoimunes.
Mesmo se a 5 ligação a FcγRIIb fosse aumentada comparado com FcγRs de ativação, o fato que a ligação a qualquer forma polimórfica de FcγRIIa é aumentada não pode ser negligenciado do ponto de vista de seu uso como um agente tera- pêutico para doenças autoimunes.
Quando agentes farmacêuticos de anticorpo se direcionando a FcγRIIb são produzidos para tratar doenças autoimunes, é importante que a atividade de ligação mediada por Fc a quaisquer formas polimórficas de FcγRIIa não seja aumentada ou seja preferivelmente reduzida, e que a ativi- dade de ligação a FcγRIIb seja aumentada comparado com IgG natural.
No entanto, não há quaisquer relatos de mutantes tendo as propriedades descri- tas acima, e então há uma demanda para desenvolver tais mutantes.
Documentos da técnica anterior da presente invenção são mos- trados abaixo: Documentos da técnica anterior Documentos de Patente Documento de Patente 1 WO 2009/125825 Documento de Patente 2 WO 2000/042072 Documento de Patente 3 WO 2006/019447 Documento de Patente 4 WO 2004/099249 Documento de Patente 5 WO 2004/029207 Documentos de Não Patente Documento de Não Patente 1 Janice, M.
Reichert, Clark, J.
Rosensweig, Laura, B.
Faden & Matthew, C.
Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic.
Nat.
Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078 Documento de Não Patente 2 Pavlou, A.K,, Belsey, M.J., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur, J, Pharm, Biopharm. (2005); 59(3), 389-396 Documento de Não Patente 3 Kim, S.J., Park, Y., Hong, H.J.,
Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol. Cells. (2005) 20(1), 17-29. Documento de Não Patente 4 Hinton, P.R., Xiong, J.M., Johlfs, M.G., Tang, M.T., Keller, S., Tsurushita, N., An engineered human IgG1 anti- 5 body with longer serum half-life., J. Immunol. (2006) 176(1), 346-356 Documento de Não Patente 5 Ghetie, V., Popov, S., Borvak, J., Radu, C., Matesoi, D., Medesan, C., Ober, R.J., Ward, E.S., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat. Biotechnol. (1997) 15(7) 637-640 Documento de Não Patente 6 Rajpal, A., Beyaz, N., Haber, L., Cappuccilli, G., Yee, H., Bhatt, R.R., Takeuchi, T., Lerner, R.A., Crea, R. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using com- binatorial libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2005) 102 (24), 8466-8471 Documento de Não Patente 7 Wu, H., Pfarr, D.S., Johnson, S., Brewah, Y.A., Woods, R.M., Patel, N.K., White, W.I., Young, J.F., Kiener, P.A. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Preven- tion of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respira- tory Tract. J. Mol. Biol. (2007) 368: 652-665 Documento de Não Patente 8 Hanson, C.V., Nishiyama, Y., Paul S. Catalytic antibodies and their applications. Curr Opin Biotechnol. (2005) 16(6), 631-636 Documento de Não Patente 9 Rathanaswami, P., Roalstad, S., Roskos, L., Su, Q.J., Lackie, S., Babcook J. Demonstration of an in vivo gen- erated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-
8. Biochem Biophys Res Commun. (2005) 334 (4), 1004-1013 Documento de Não Patente 10 Dall’Acqua, W.F.; Woods, R.M., Ward, E.S., Palaszynski, S.R., Patel, N.K., Brewah, Y.A., Wu, H., Kiener, P.A., Langermann, S. Increasing the affinity of a human IgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences, J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180 Documento de Não Patente 11 Yeung, Y.A., Leabman, M.K., Marvin, J.S., Qiu, J., Adams, C.W., Lien, S., Starovasnik, M.A., Lowman, H.B., Engineering in human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: im-
pact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates.
Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671 Documento de Não Patente 12 Datta-Mannan, A., Witcher, D.R., Tang Y, Watkins, J., Wroblewski, V.J.
Monoclonal antibody clearance.
Impact 5 of modulating the interaction of IgG with the neonatal Fc receptor.
Biol.
Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717 Documento de Não Patente 13 Niebecker, R., Kloft C., Safety of therapeutic monoclonal antibodies.
Curr.
Drug Saf. (2010) 5 (4), 275-286 Documento de Não Patente 14 Jefferis, R., Lund, J.
Interaction sites on human IgG-Fc for FcgammaR: current models.
Immunol.
Lett. (2002) 82, 57-65 Documento de Não Patente 15 Nimmerjahn, F., Ravetch, J.V.
Fcgamma receptors as regulators of imune responses.
Nat.
Rev.
Immunol. (2008) 8 (1), 34-47 Documento de Não Patente 16 M Clark.
Antibody Engineering IgG Effector Mechanisms.
Chemical Immunology (1997) 65, 88-110 Documento de Não Patente 17 Greenwood, J., Clark, M., Waldmann, H., Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions, Eur.
Immunol. (1993) 23, 1098-1104 Documento de Não Patente 18 Amigorena S., Bonnerot C., Cho- quet D., Fridman W.H., Teillaud J.L., Fc gamma RII expression in resting and activated B lymphocytes.
Eur.
Immunol. (1989) 19, 1379-1385 Documento de Não Patente 19 Nicholas, R., Sinclair S.C., Regu- lation of the imune response.
Reduction in ability of specific antibody to inhibit long-lasting IgG immunological priming after removal of the Fc frag- ment.
Exp.
Med. (1969) 129, 1183-1201 Documento de Não Patente 20 Heyman, B., Feedback regulation by IgG antibodies.
Immunol.
Lett. (2003) 88, 157-161 Documento de Não Patente 21 S.
Amigorena, C.
Bonnerot., Drake J.R., D.
Choquet, W.
Hunziker, J.G.
Guillet, P.
Webster, C.
Sautes, I.
Mellman e W.H.
Fridman, Cytoplasmic domain heterogeneity and functions of IgG Fc receptors in B lymphocytes.
Science (1992) 256, 1808-1812
Documento de Não Patente 22 Muta T., Kurosaki T., Misulovin Z., Sanchez M., Nussenzweig M. e Ravetech J.V., A 13-amino acid motif in the cytoplasmic domain of FcγRIIB modulates B-cell receptor signaling. Na- ture (1994) 368, 70-73 5 Documento de Não Patente 23 Ravetch J.V., Lanier L.L. Immune inhibitory receptors, Science (2000) 290, 84-89 Documento de Não Patente 24 Liang Y., Qiu H., Glinka Y., Laza- rus A.H., Ni H., Prud’homme G.J., Wang Q. Immunitty against a therapeutic xenoprotein/Fc construct delivered by gene transfer is reduced through bind- ing to the inhibitory receptor FcγRIIb. J. Gene Med. (2011) doi:
10.1002/jgm.1598 Documento de Não Patente 25 Smith K.G., Clatworthy M.R., FcgammaRIIB in autoimmunity and infection: evolutionary and therapeutic implications. Nat. Rev. Immunol. (2010) 10, 328-343 Documento de Não Patente 26 Wernersson S.,. Karlsson M.C., Dahlström J., Mattsson R., Verbeek J.S., Heyman B. IgG-mediated en- hancement of antibody responses is low in Fc receptor gamma chain- deficient mice and increased in Fc gamma RII-deficient mice. J. Immunol. (1999) 163, 618-622 Documento de Não Patente 27 Joachim L. Schultze, Sabine Mi- chalak, Joel Lowne, Adam Wong. Maria H. Gilleece, John G. Gribben e Lee M. Nadler, Human Non-Germinal Center B Cell Interleukin (IL)-12 Production Is Primarily Regulated by T Cell Signals CD40 Ligand, Interferon γ and IL-10: Role of B Cells in the Maintenance of T Cell Responses, J. Exp. Med. (1999) 189, 187-194 Documento de Não Patente 28 Nakamura, A., Yuasa, T., Ujike, A., Ono, M., Nukiwa, T., Ravetch, J.V., Takai, T. Fcγ receptor IIB-deficient mice develop Goodpasture’s syndrome upon immunization with type IV col- lagen: A novel murine model for autoimune glomerular basement membrane disease, J. Exp. Med. (2000) 191, 899-906 Documento de Não Patente 29 Blank, M.C., Stefanescu, R.N., Masuda, E., Marti, F., King, P.D., Redecha, P.B., Wurzburger, R.J., Peter-
son, M.G., Tanaka, S., Pricop, L.
Decreased transcription of the human FCGR2B gene mediated by the -343 G/C promoter polymorphism and asso- ciation with systemic lupus erythematosus.
Human Genet. (2005) 117, 220- 227 5 Documento de Não Patente 30 Olferiev, M., Masuda, E., Tanaka, S., Blank, M.C., Pricop, L.
The Role of Activating Protein 1 in the Transcrip- tional Regulation of the Human FCGR2B Promoter Mediated by the -343 G- >C Polymorphism Associated with Systemic Lupus Erythematosus, J.
Biol.
Chem. (2007) 282, 1738-1746 Documento de Não Patente 31 Lv, J., Yang, Y., Zhou, X., Yu, L., Li, R., Hou, P., Zhang, H., FCGR3B copy number variation is not associated with lupus nephritis in a Chinese population.
Arthritis Rheum. (2006) 54, 3908-3917 Documento de Não Patente 32 Floto, R.A., Clatworthy, M.R., Heilbronn, K.R., Rosner, D.R., MacAry, P.A., Rankin, A., Lehner, P.J., Ou- wehand, W.H., Allen, J.M., Watkins, N.A., Smith, K.G.
Loss of function of a lupus-associated FcgammaRIIb polymorphism through exclusion from lipid rafts.
Nat.
Med. (2005) 11, 1056-1058 Documento de Não Patente 33 Li, D.H., Tung, J.W., Tarner, I.H., Snow, A.L., Yukinari, T., Ngernmaneepothong, R., Martinez, O.M., Parnes, J.R.
CD72 Down-Modulates BCR-Induced Signal Transduction and Dimin- ishes Survival in Primary Mature B Lymphocytes.
Immunol. (2006) 176, 53231-5328 Document de Não Patente 34 Mackay, M., Stanevsky, A., Wang, T., Aranow, C., Li, M., Koenig, S., Ravetch, J.V., Diamond, B.
Selective dys- regulation of the FcgammaIIB receptor on memory B cells in SLE.
Exp.
Med. (2006) 203, 2157-2164 Documento de Não Patente 35 Su., K., Yang, H., Li, X., Gibson, A.W., Cafardi, J.M., Zhou, T., Edberg, J.C., Kimberly, R.P.
Expression profile of FcgammaRIIb on leukocytes and its dysregulation in systemic lupus ery- thematosus, J.
Immunol. (2007) 178, 3272-3280 Documento de Não Patente 36 Bruhns, P., Iannascoli, B., Eng-
land, P., Mancardi, D.A., Fernandez, N., Jorieux, S., Daëron, M.
Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses.
Blood (2009) 113, 3716 Documento de Não Patente 37 Chu, S.Y., Vostiar, I., Karki, S., 5 Moore, G.L., Lazar, G.A., Pong, E., Joyce, P.F., Szymkowski, D.E., Desjar- lais, J.R.
Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered anti- bodies.
Mol.
Immunol. (2008) 45, 3926-3933 Documento de Não Patente 38 Warmerdam, P.A., van de Winkel, J.G., Gosselin, E.J., Capel, P.J., Molecular basis for a polymorphism of human Fc gamma receptor II (CD32). J.
Exp.
Med. (1990) 172, 19-25 Documento de Não Patente 39 Armour, K.L., van de Winkel, J.G., Williamson, L.M., Clark, M.R.
Differential binding to human Fcgam- maRIIa and FcgammaRIIb receptors by human IgG Wildtype and mutant an- tibodies.
Mol.
Immunol. (2003) 40, 585-593 Documento de Não Patente 40 Science Translational Medicine (2010) Vol. 2, Issue 47, p. 47ra63 Documento de Não Patente 41 Salmon, J.E., Millard, S., Schach- ter, L.A., Arnett, F.C., Ginzler, E.M., Gourley, M.F., Ramsey-Goldman, R., Peterson, M.G., Kimberly, R.P., Fc gamma RIIA alleles are heriTabela risk factors for lupus nephritis in African Americans, J.
Clin.
Invest. (1996) 97, 1348-1354 Documento de Não Patente 42 Manger, K., Repp, R., Spriewald, B.M., Rascu, A., Geiger, A., Wassmuth, R., Westerdaal, N.A., Wentz, B., Manager, B., Kalden, J.R., van de Winkel, J.G., Fcgamma receptor IIa poly- morphism in Caucasian patients with systemic lupus erythematosus: associa- tion with clinical symptoms.
Arthritis Rheum. (1998) 41, 1181-1189 Documento de Não Patente 43 Qiao, S.W., Kobayashi, K., Jo- hansen, F.E., Sollid, L.M., Andersen, J.T., Milford, E., Roopenian, D.C., Len- cer, W.I., Blumberg, R.S.
Dependence of antibody-mediated presentation of antigen on FcRn.
Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (2008) 105 (27) 9337-9342 Documento de Não Patente 44 Mi, W., Wanjie, S., Lo, S.T., Gan,
Z., Pickl-Herk, B., Ober, R.J., Wards, E.S.
Targeting the neonatal fc receptor for antigen delivery using engineered fc fragments.
Immunol. (2008) 181 (11), 7550-7561 Sumário da Invenção 5 Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção Em adição ao envolvimento de FcγR de ativação descrito acima, o chamado mecanismo de apresentação de antígeno é muito importante como um fator para a indução de resposta imune a agentes farmacêuticos de anticorpo administrados.
Apresentação de antígeno se refere a um me- canismo imunológico em que após internalização e degradação intracelular de antígenos estranhos tais como bactérias, e antígenos endógenos, células apresentando antígeno tais como macrófagos e células dendríticas apresen- tam porções dos antígenos em superfície celular.
Os antígenos apresenta- dos são reconhecidos por células T e outras, e ativam ambas imunidades celular e humoral.
O curso de apresentação de antígeno por células dendríticas envolve internalização de um antígeno como um complexo imune (um com- plexo formado entre um anticorpo multivalente e um antígeno) em células, degradação no lisossoma e apresentação dos peptídeos resultantes deriva- dos do antígeno por moléculas do MHC classe II.
FcRn desempenha um papel importante neste curso; e foi relatado que quando usando células den- dríticas deficientes em FcRN ou complexos imunes que são capazes de li- gação a FcRn, apresentação de antígeno e ativação de célula T resultante não ocorrem (Documento de Não Patente 43). Quando animais normais são administrados com uma proteína antígeno como uma substância estranha, eles frequentemente produzem anticorpos contra a proteína antígeno administrada.
Por exemplo, quando camundongos são administrados com um receptor IL-6 humano solúvel co- mo uma proteína estranha, eles produzem anticorpos de camundongo contra o receptor IL-6 humano solúvel.
Por outro lado, mesmo quando os camun- dongos são administrados com um anticorpo IgG1 humano como uma prote- ína estranha, eles dificilmente produzem anticorpos de camundongo contra o anticorpo IgG1 humano.
Esta diferença sugere que a taxa de eliminação da proteína estranha administrada do plasma poderia ser uma influência.
Conforme descrito no Exemplo de Referência 4, um anticorpo IgG1 humano tem a habilidade em se ligar a FcRn humano sob condições 5 ácidas e, então, da mesma maneira que os anticorpos de camundongo, um anticorpo IgG1 humano é reciclado através de FcRn de camundongo quando incorporado aos endossomos.
Por esta razão, quando um anticorpo IgG1 humano é administrado a camundongos normais, eliminação do anticorpo do plasma é muito lenta.
Entretanto, um receptor IL-6 humano solúvel não é reciclado via FcRn de camundongo e é então eliminado rapidamente após administração.
Por outro lado, conforme descrito no Exemplo de Referência 4, a produção de anticorpos de camundongo contra um anticorpo para IL-6R humano solúvel é observada em camundongos normais administrados com um receptor IL6 humano solúvel, enquanto a produção de anticorpos de ca- mundongo contra um anticorpo IgG1 humano não é encontrada em camun- dongos normais administrados com um anticorpo IgG1 humano.
Em outras palavras, um receptor IL-6 humano solúvel que é eliminado rapidamente é mais imunogênico em camundongos do que um anticorpo IgG1 humano que é eliminado lentamente.
Parte do curso para eliminação dessas proteínas estranhas (re- ceptor IL-6 humano solúvel e anticorpo IgG1 humano) do plasma é suposta ser absorção por células apresentando antígeno.
As proteínas estranhas incorporadas a células apresentando antígeno se associam a moléculas MHC classe II após processamento intracelular e são transportadas para a membrana celular.
Então, a apresentação de um antígeno a células T espe- cíficas de antígeno (por exemplo, células T que são especificamente respon- sivas a um receptor IL-6 humano solúvel ou anticorpo IgG1 humano) induz ativação de células T específicas de antígeno.
Neste contexto, é presumi- velmente difícil para uma proteína estranha que é eliminada lentamente do plasma ser processada em células apresentando antígeno, e como um resul- tado apresentação de antígeno a células T específicas de antígeno é impro- vável de ocorrer.
A ligação a FcRn sob condições neutras é conhecida por afetar de modo adverso retenção de anticorpo no plasma.
Uma vez um anticorpo IgG ligado a FcRn sob condições neutras, mesmo se ele for retornado para a superfície celular sob condições ácidas endossomais como um resultado de 5 ligação a FcRN, o anticorpo IgG não pode ser reciclado para plasma sem dissociação de FcRn sob a condição neutra no plasma; e isso prejudica de modo adverso retenção no plasma.
Por exemplo, de acordo com um relató- rio (Documento de Não Patente 10), quando um anticorpo que se torna ca- paz de ligação a FcRn de camundongo sob uma condição neutra (pH 7,4) como um resultado de substituições de aminoácido introduzidas em IgG1 foi administrado a camundongos, a retenção do anticorpo em plasma piorou.
Entretanto, foi relatado que quando um anticorpo que foi confirmado se ligar a FcRn humano sob uma condição neutra (pH 7,4) foi administrado a maca- cos cinomólogos, a retenção de anticorpo no plasma não foi prolongada, mas ao contrário permaneceu inalterada (Documentos de Não Patente 10 a 12). Quanto o tempo de retenção de uma molécula de ligação a antígeno em plasma é encurtado devido a aumento de sua ligação a FcRn sob uma con- dição neutra (pH 7,4), imunogenicidade pode aumentar devido à eliminação acelerada da molécula de ligação a antígeno.
Ainda, FcRn foi relatado ser expresso em células apresentando antígeno e envolvido em apresentação de antígeno.
De acordo com um rela- tório publicado na avaliação de imunogenicidade de uma proteína resultante da fusão de proteína básica da mielina (MBP) (Myelin Basic Protein), embora não uma molécula de ligação a antígeno, à região Fc de IgG1 de camun- dongo (daqui em diante abreviada como MBP-Fc), as células T que são res- ponsivas de uma maneira específica de MBP-Fc são ativadas e proliferadas quando culturadas na presença de MBP-Fc.
Neste aspecto, é conhecido que ativação de célula T é intensificada in vitro através da adição à região Fc de MBP-Fc de uma modificação que aumenta a ligação de FcRn para aumentar incorporação a células apresentando antígeno via FcRn expresso nas célu- las apresentando antígeno.
Foi relatado que sem importar a eliminação ace- lerada do plasma como um resultado de adição de uma modificação que aumenta a ligação a FcRn, ativação de célula T in vivo foi relatada ser bas- tante prejudicada (Documento de Não Patente 44). Desta maneira, imuno- genicidade não é necessariamente aumentada quando a eliminação é acele- rada pelo aumento da ligação a FcRn. 5 Conforme acima descrito, não houve pesquisa suficiente para compreender como aumento da ligação a FcRn de uma molécula de ligação a antígeno que tem um domínio de ligação de FcRn sob uma condição neu- tra (pH 7,4) influencia a retenção no plasma e imunogenicidade da molécula de ligação a antígeno.
Desta maneira, não há nenhum método relatado para aperfeiçoamento da retenção no plasma e imunogenicidade de moléculas de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição neu- tra (pH 7,4). Foi revelado que eliminação de antígeno do plasma pode ser acelerada através do uso de uma molécula de ligação a antígeno que com- preende o domínio de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antí- geno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentra- ção de íon e uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro.
No entanto, estudos suficientes não foram conduzidos para compreender como aumento da atividade de ligação a FcRn de uma região Fc em uma faixa de pH neutro influencia a retenção de moléculas de ligação a antígeno noplasma e imunogenicidade.
Durante os estudos os pre- sentes inventores encontraram um problema que como um resultado de au- mento da atividade de ligação a FcRn da região Fc em uma faixa de pH neu- tro, o tempo de retenção da molécula de ligação a antígeno em plasma é reduzido (a farmacocinética é piorada) e a imunogenicidade da molécula de ligação a antígeno é elevada (a resposta imune à molécula de ligação a an- tígeno é agravada). A presente invenção foi alcançada com êxito em vista das cir- cunstâncias descritas acima.
Um objetivo da presente invenção é prover mé- todos para aperfeiçoamento da farmacocinética em animais administrados com uma molécula de ligação a antígeno através da modificação da região Fc da molécula de ligação a antígeno que compreende o domínio de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de íon e uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro.
Outro objetivo da presente invenção é prover métodos para redução do número de respos- 5 ta imune a uma molécula de ligação a antígeno através da modificação da região Fc da molécula de ligação a antígeno, que compreende o domínio de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de íon e uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro.
Ainda outro objetivo da presente invenção é prover moléculas de ligação a antíge- no que exibam farmacocinética aperfeiçoada ou resposta imune in vivo pre- judicada quando administrada a animais.
Ainda outro objetivo da presente invenção é prover métodos para produção de tais moléculas de ligação a antígeno, bem como composições farmacêuticas compreendendo como um ingrediente ativo as moléculas de ligação a antígeno.
Meios para Resolver os Problemas Os presentes inventores conduziram estudos aplicados para a- tingir os objetivos descritos acima.
Como um resultado, os presentes inven- tores revelaram que uma molécula de ligação a antígeno que compreende o domínio de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de íon e uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro formaram um complexo hetero consistindo em quatro moléculas: mo- lécula de ligação a antígeno/duas moléculas de FcRn/receptor Fcγ de ativa- ção (Fig. 48). Os presentes inventores também demonstraram que a forma- ção de tetrâmero afetou de modo adverso a farmacocinética e a resposta imune.
Os presentes inventores demonstraram que a farmacocinética de uma molécula de ligação a antígeno foi aperfeiçoada através da modificação da região Fc de tal molécula de ligação a antígeno para uma região Fc que em uma faixa de pH neutro não forma um complexo de tetrâmero hetero compreendendo duas moléculas de FcRn e um receptor Fcγ de ativação.
Os presente inventores também demonstraram que a resposta imune em ani-
mais administrados com uma molécula de ligação a antígeno poderia ser alterada através da modificação da região Fc de tal molécula de ligação a antígeno para uma região Fc que em uma faixa de pH neutro não forma um complexo tetrâmero compreendendo duas moléculas de FcRn e um receptor 5 Fcγ de ativação. Os presentes inventores também demonstraram que res- posta imune à molécula de ligação a antígeno foi reduzida através da modifi- cação em uma região Fc que em uma faixa de pH neutro não forma um complexo tetrâmero hetero compreendendo duas moléculas de FcRn e um receptor Fcγ de ativação. Ainda, os presentes inventores desenvolveram moléculas de ligação a antígeno e métodos para produção das mesmas, e ainda constataram que quando administradas, as composições farmacêuti- cas compreendendo um ingrediente ativo tal como uma molécula de ligação a antígeno ou uma molécula de ligação a antígeno produzida através de um método de produção da presente invenção tinham propriedades superiores tal como farmacocinética aperfeiçoada e redução de resposta imune no or- ganismo vivo administrado comparado com moléculas de ligação a antíge- nos convencionais; e então terminaram a presente invenção. Mais especificamente, a presente invenção provê o que segue.
[1] Um método de (a) ou (b) abaixo, em que o método compre- ende modificação da região Fc de uma molécula de ligação a antígeno com- preendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de íon e uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro em uma região Fc que não formam um complexo hetero compreendendo duas moléculas de FcRn e uma molécula de receptor Fcγ de ativação em uma faixa de pH neu- tro: (a) um método para aperfeiçoamento da farmacocinética de uma molécula de ligação a antígeno: e (b) um método para redução de imunogenicidade de uma molé- cula de ligação a antígeno,
[2] O Método de [1], em que a modificação em uma região Fc que não forma o dito complexo hetero compreende modificação da região Fc em uma região Fc cuja atividade de ligação a um receptor Fcγ de ativação é menor do que a atividade de ligação de uma região Fc de IgG humano nati- vo ao receptor Fcγ de ativação. 5 [3] O método de [1] ou [2], em que o receptor Fcγ de ativação é FcγRIa humano, FcγRIIa(R) humano, FcγRIIa(H) humano, FcγRIIIa(V) hu- mano ou FcγRIIIa(F) humano.
[4] O método de qualquer um dentre [1] a [3], o qual compreende substituição de um aminoácido da dita região Fc em qualquer um ou mais aminoácidos de posições 235, 237, 238, 239, 270, 298, 325 e 329 conforme indicado por numeração EU.
[5] O método de [4], o qual compreende substituição de um ami- noácido da dita região Fc conforme indicado pela numeração EU em qual- quer um ou mais de: o aminoácido de posição 234 com qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr e Trp; o aminoácido de posição 235 com qualquer um dentre Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val e Arg; o aminoácido de posição 236 com qualquer um dentre Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro e Tyr; o aminoácido de posição 237 com qualquer um dentre Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr e Arg; o aminoácido de posição 238 com qualquer um dentre Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp e Arg; o aminoácido de posição 239 com qualquer um dentre Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr e Arg; o aminoácido de posição 265 com qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val; o aminoácido de posição 266 com qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp e Tyr; o aminoácido de posição 267 com qualquer um dentre Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp e Tyr;
o aminoácido de posição 269 com qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val; o aminoácido de posição 270 com qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val; 5 o aminoácido de posição 271 com qualquer um dentre Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp e Tyr; o aminoácido de posição 295 com qualquer um dentre Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp e Tyr; o aminoácido de posição 296 com qualquer um dentre Arg, Gly, Lys e Pro; o aminoácido de posição 297 com Ala; o aminoácido de posição 298 com qualquer um dentre Arg, Gly, Lys, Pro, Trp e Tyr; o aminoácido de posição 300 com qualquer um dentre Arg, Lys e Pro; o aminoácido de posição 324 com Lys ou Pro; o aminoácido de posição 325 com qualquer um dentre Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr e Val; o aminoácido de posição 327 com qualquer um dentre Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val; o aminoácido de posição 328 com qualquer um dentre Arg, Asn, Gly, His, Lys e Pro; o aminoácido de posição 329 com qualquer um dentre Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, ILe, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val e Arg; o aminoácido de posição 330 com Pro ou Ser; o aminoácido de posição 331 com qualquer um dentre Arg, Gly e Lys; ou o aminoácido de posição 332 com qualquer um dentre Arg, Lys e Pro.
[6] O método de [1], em que a modificação para uma região Fc que não forma o dito complexo hetero compreende modificação da região Fc para uma região Fc que tem uma atividade de ligação maior para um recep-
tor Fcγ inibidor do que para um receptor Fcγ de ativação.
[7] O método de [6], em que o receptor Fcγ inibidor é FcγRIIb humano.
[8] Método de [6] ou [7], em que o receptor Fcγ de ativação é 5 FcγRIa humano, FcγRIIa(R) humano, FcγRIIa(H) humano, FcγRIIIa(V) hu- mano ou FcγRIIIa(F) humano.
[9] O método de qualquer um dentre [6] a [8], o qual compreende substituição do aminoácido de posição 238 ou 328 indicada por numeração EU.
[10] O método de [9], o qual compreende substituição de Asp pa- ra o aminoácido de posição 238 ou Glu para o aminoácido de posição 328 indicada por numeração EU.
[11] O método de [9] ou [10], o qual compreende substituição de qualquer um ou mais aminoácidos de: o aminoácido de posição 233 com Asp; o aminoácido de posição 234 com Trp ou Tyr; o aminoácido de posição 237 com qualquer um dentre Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp e Tyr; o aminoácido de posição 239 com Asp; o aminoácido de posição 267 com qualquer um dentre Ala, Gln e Val; o aminoácido de posição 268 com qualquer um dentre Asn, Asp e Glu; o aminoácido de posição 271 com Gly; o aminoácido de posição 326 com qualquer um dentre Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser e Thr; o aminoácido de posição 330 com qualquer um e Arg, Lys e Met; o aminoácido de posição 323 com qualquer um dentre Ile, Leu e Met; e o aminoácido de posição 296 com Asp; em que os aminoácidos são indicados por numeração EU;
[12] O método de qualquer um dentre [1] a [11], em que a região
Fc compreende um ou mais aminoácidos que são diferentes de aminoácidos da região Fc nativa em qualquer uma de posições de aminoácido 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 5 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 da dita região Fc conforme indicado por numeração EU.
[13] O método de [12], em que os aminoácidos da dita região Fc indicados por numeração EU são uma combinação de um ou mais de: Met na posição de aminoácido 237; Ile na posição de aminoácido 248; qualquer um dentre Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 250; qualquer um dentre Phe, Trp e Tyr na posição de aminoácido 252; Thr na posição de aminoácido 254; Glu na posição de aminoácido 255; qualquer um dentre Asp, Asn, Glu e Gln na posição de aminoá- cido 256; qualquer um dentre Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr e Val na posição de aminoácido 257; His na posição de aminoácido 258; Ala na posição de aminoácido 265; Ala ou Glu na posição de aminoácido 286; His na posição de aminoácido 289; Ala na posição de aminoácido 297; Gly na posição de aminoácido 298; Ala na posição de aminoácido 303; Ala na posição de aminoácido 305; qualquer um dentre Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 307; qualquer um dentre Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln e Thr na po- sição de aminoácido 308;
qualquer um dentre Ala, Asp, Glu, Pro e Arg na posição de ami- noácido 309; qualquer um dentre Ala, His e Ile na posição de aminoácido 311; Ala ou His na posição de aminoácido 312; 5 Lys ou Arg na posição de aminoácido 314; qualquer um dentre Ala, Asp ou His na posição de aminoácido 315; Ala na posição de aminoácido 317; Val na posição de aminoácido 332; Leu na posição de aminoácido 334; His na posição de aminoácido 360; Ala na posição de aminoácido 376; Ala na posição de aminoácido 380; Ala na posição de aminoácido 382; Ala na posição de aminoácido 384; Asp ou His na posição de aminoácido 385; Pro na posição de aminoácido 386; Glu na posição de aminoácido 387; Ala ou Ser na posição de aminoácido 389; Ala na posição de aminoácido 424; qualquer um dentre Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 428; Lys na posição de aminoácido 433; qualquer um dentre Ala, Phe, His, Ser, Trp e Tyr na posição de aminoácido 434; e qualquer um dentre His, Ile, Leu, Phe, Thr e Val na posição de aminoácido 436.
[14] O método de qualquer um dentre [1] a [13], em que o dito domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja ati- vidade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de íon de cálcio.
[15] O método de [14], em que o dito domínio de ligação a antí-
geno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antíge- no varia de uma maneira que a atividade de ligação a antígeno em uma con- centração de íon de cálcio baixa é menor do que a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de cálcio alta. 5 [16] O método de qualquer um dentre [1] a [13], em que o dito domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja ati- vidade de ligação a antígeno varia dependendo do pH.
[17] O método de [16], em que o dito domínio de ligação a antí- geno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antíge- no varia de uma maneira que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH neutro.
[18] O método de qualquer um dentre [1] a [17], em que o domí- nio de ligação a antígeno é uma região variável de anticorpo.
[19] O método de qualquer um dentre [1] a [18], em que a molé- cula de ligação a antígeno é um anticorpo.
[20] O método de [1], em que a modificação para uma região Fc que não forma o dito complexo hetero compreende modificação para uma região de Fc em que um dos dois polipeptídeos constituindo a região Fc tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro e o outro não tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro.
[21] O método de [20], o qual compreende substituição de um aminoácido em qualquer uma ou mais de posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 conforme indicado por numeração EU na sequên- cia de aminoácido de qualquer um dos dois polipeptídeos constituindo a re- gião Fc.
[22] O método de [21], o qual compreende substituição de um aminoácido da dita região Fc em qualquer um ou mais de: o aminoácido de posição 237 com Met; o aminoácido de posição 248 com Ile;
o aminoácido de posição 250 com Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr; o aminoácido de posição 252 com Phe, Trp ou Tyr; o aminoácido de posição 254 com Thr; 5 o aminoácido de posição 255 com Glu; o aminoácido de posição 256 com Asp, Asn, Glu ou Gln; o aminoácido de posição 257 com Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val; o aminoácido de posição 258 com His; o aminoácido de posição 265 com Ala; o aminoácido de posição 286 com Ala ou Glu; o aminoácido de posição 289 com His; o aminoácido de posição 297 com Ala; o aminoácido de posição 298 com Gly; o aminoácido de posição 303 com Ala; o aminoácido de posição 305 com Ala; o aminoácido de posição 307 com Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr; o aminoácido de posição 308 com Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr; o aminoácido de posição 309 com Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg; o aminoácido de posição 311 com Ala, His ou Ile; o aminoácido de posição 312 com Ala ou His; o aminoácido de posição 314 com Lys ou Arg; o aminoácido de posição 315 com Ala, Asp ou His; o aminoácido de posição 317 com Ala; o aminoácido de posição 322 com Val; o aminoácido de posição 334 com Leu; o aminoácido de posição 360 com His; o aminoácido de posição 376 com Ala; o aminoácido de posição 380 com Ala; o aminoácido de posição 382 com Ala;
o aminoácido de posição 384 com Ala; o aminoácido de posição 385 com Asp ou His; o aminoácido de posição 386 com Pro; o aminoácido de posição 387 com Glu; 5 o aminoácido de posição 389 com Ala ou Ser; o aminoácido de posição 424 com Ala; o aminoácido de posição 428 com Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; o aminoácido de posição 433 com Lys; o aminoácido de posição 434 com Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr; e o aminoácido de posição 436 com His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val; em que os aminoácidos são indicados pela numeração EU;
[23] O método de qualquer um dentre [20] a [22], em que o do- mínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja ativi- dade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de cálcio.
[24] O método de [23], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de uma maneira que a atividade de ligação a antígeno em uma concentra- ção de cálcio baixa é menor do que a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio alta.
[25] O método de qualquer um dentre [20] a [22], em que o do- mínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja ativi- dade de ligação a antígeno varia dependendo do pH.
[26] O método de [25], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de uma maneira que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH neutro.
[27] O método de qualquer um dentre [20] a [26], em que o do- mínio de ligação a antígeno é uma região variável de anticorpo.
[28] O método de qualquer um dentre [20] a [27], em que a mo-
lécula de ligação a antígeno é um anticorpo.
[29] Uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de- pendendo da concentração de íon e uma região Fc que tem atividade de 5 ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro, em que a região Fc compreende um ou mais aminoácidos selecionados de: Ala na posição de aminoácido 234; Ala, Lys ou Arg na posição de aminoácido 235; Arg na posição de aminoácido 236; Arg na posição de aminoácido 238; Lys na posição de aminoácido 239; Phe na posição de aminoácido 270; Ala na posição de aminoácido 297; Gly na posição de aminoácido 298; Gly na posição de aminoácido 325; Arg na posição de aminoácido 328; e Lys ou Arg na posição de aminoácido 329; em que os aminoáci- dos são indicados por numeração EU;
[30] A molécula de ligação a antígeno de [29], a qual compreen- de um ou mais aminoácidos selecionados de; Lys ou Arg na posição de aminoácido 237; Lyz na posição de aminoácido 238; Arg na posição de aminoácido 239; e Lyz ou Arg na posição de aminoácido 239; em que os aminoáci- dos são indicados por numeração EU.
[31] Uma molécula de ligação a antígeno compreendendo o do- mínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de- pendendo da concentração de íon e uma região Fc em que um dos dois po- lipeptídeos constituindo a região Fc tem uma atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro e o outro não tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro.
[32] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um dentre
[29] a [31], em que a região Fc compreende um ou mais aminoácidos que são diferentes de aminoácidos de uma região Fc nativa em qualquer uma de posições de aminoácido 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 5 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 466 indi- cado por numeração EU na sequência de aminoácido de qualquer um dos dois polipeptídeos constituindo a região Fc.
[33] A molécula de ligação a antígeno de [32], a qual compreen- de uma combinação de um ou mais aminoácidos da dita região Fc de: Met na posição de aminoácido 237; Ile na posição de aminoácido 248; Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr na posição de ami- noácido 250; Phe, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 252; Thr na posição de aminoácido 254; Glu na posição de aminoácido 255; Asp, Asn, Glu ou Gln na posição de aminoácido 256; Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val na posição de ami- noácido 257; His na posição de aminoácido 258; Ala na posição de aminoácido 265; Ala ou Glu na posição de aminoácido 286; His na posição de aminoácido 289; Ala na posição de aminoácido 297; Ala na posição de aminoácido 303; Ala na posição de aminoácido 305; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr na posição de aminoáci- do 308; Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg na posição de aminoácido 309; Ala, His ou Ile na posição de aminoácido 311;
Ala ou His na posição de aminoácido 312; Lys ou Arg na posição de aminoácido 314; Ala, Asp ou His na posição de aminoácido 315; Ala na posição de aminoácido 317; 5 Val na posição de aminoácido 332; Leu na posição de aminoácido 334; His na posição de aminoácido 360; Ala na posição de aminoácido 376; Ala na posição de aminoácido 380; Ala na posição de aminoácido 382; Ala na posição de aminoácido 384; Asp ou His na posição de aminoácido 385; Pro na posição de aminoácido 386; Glu na posição de aminoácido 387; Ala ou Ser na posição de aminoácido 389; Ala na posição de aminoácido 424; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 428; Lys na posição de aminoácido 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 434; e His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val na posição de aminoácido 436; em que os aminoácidos são indicados pela numeração EU.
[34] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um dentre
[29] a [33], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da con- centração de íon de cálcio.
[35] A molécula de ligação a antígeno de [34], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de uma maneira que a atividade de ligação a antí- geno em uma concentração de cálcio baixa é menor do que a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio alta.
[36] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um dentre
[29] a [33], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo do pH.
[37] A molécula de ligação a antígeno de [36], em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de 5 ligação a antígeno varia de uma maneira que a atividade de ligação a antí- geno em uma faixa de pH ácido é menor do que a atividade de ligação a an- tígeno em uma faixa de pH neutro.
[38] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um d e [29] a
[37], em que o domínio de ligação a antígeno é uma região variável de anti- corpo.
[39] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um dentre
[29] a [38], em que a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo.
[40] Um polinucleotídeo codificando a molécula de ligação a an- tígeno de qualquer um dentre [29] a [39].
[41] Um vetor que está operavelmente ligado ao polinucleotídeo de [40].
[42] Uma célula introduzida com o vetor de [41].
[43] Um método para produção da molécula de ligação a antíge- no de qualquer um dentre [29] a [39], o qual compreende a etapa de coleta da molécula de ligação a antígeno de uma cultura da célula de [42].
[44] Uma composição farmacêutica que compreende como um ingrediente ativo a molécula de ligação a antígeno de qualquer um dentre
[29] a [39] ou uma molécula de ligação a antígeno obtida através do método de produção de [43]. Ainda, a presente invenção refere-se a kits para uso nos méto- dos da presente invenção, os quais compreendem uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção ou uma molécula de ligação a antígeno produzida através de um método de produção da presente invenção. A pre- sente invenção refere-se também a agentes para aperfeiçoamento da far- macocinética de uma molécula de ligação a antígeno e agentes para diminu- ição da imunogenicidade de uma molécula de ligação a antígeno, os quais compreendem como um ingrediente ativo uma molécula de ligação a antíge-
no da presente invenção ou uma molécula de ligação a antígeno produzida através de um método de produção da presente invenção.
A presente inven- ção refere-se também a métodos para tratamento de doenças imu- nes/inflamatórias, os quais compreendem a etapa de administrar a um indi- 5 víduo uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção ou uma molécula de ligação a antígeno produzida através de um método de produ- ção da presente invenção.
Ainda, a presente invenção refere-se ao uso de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção ou moléculas de liga- ção a antígeno produzidas através de um método de produção da presente invenção na produção de agentes para aperfeiçoamento de farmacocinética de moléculas de ligação a antígeno e agentes para diminuição da imunoge- nicidade de moléculas de ligação a antígeno.
A presente invenção refere-se também a moléculas de ligação a antígeno da presente invenção ou a molé- culas de ligação a antígeno produzidas através de um método de produção da presente invenção para uso nos métodos da presente invenção.
Efeitos da Invenção A presente invenção provê métodos para aperfeiçoamento da farmacocinética de moléculas de ligação a antígeno e métodos para diminui- ção da imunogenicidade de moléculas de ligação a antígeno.
A presente invenção permite terapia com anticorpo sem causar efeitos in vivo desfavo- ráveis comparado com anticorpos gerais.
Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 é um diagrama mostrando efeitos sobre um antígeno so- lúvel de um anticorpo de neutralização existente e um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente do pH e exibe ligação a FcRn au- mentada sob uma condição neutra.
A Fig. 2 é um gráfico mostrando uma concentração no plasma após administração intravenosa ou subcutânea de Fv4-IgG1 ou Fv4-IgG1-F1 a camundongos normais.
A Fig. 3 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se liga a FcγRIa humano.
A Fig. 4 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a
FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se liga a FcγRIIa(R) humano.
A Fig. 5 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se liga a FcγRIIa(H). A Fig. 6 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a 5 FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se liga a FcγRIIb humano.
A Fig. 7 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a FcRn, Fv4-IgG1-F157 se liga a FcγRIIIa(F) humano.
A Fig. 8 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se liga a FcγRI de camundongo.
A Fig. 9 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se liga a FcγRIIb humano.
A Fig. 10 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se liga a FcγRIII de camundongo.
A Fig. 11 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a FcRn humano, Fv4-IgG1-F157 se liga a FcγRIV de camundongo.
A Fig. 12 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a FcRn de camundongo, Fv4-IgG1-F20 se liga a FcγRI de camundongo, Fcγ- RIIb de camundongo, FcγRIII de camundongo e FcγRIV.
A Fig. 13 é um gráfico demonstrando que em um estado ligado a FcRn de camundongo, mPM1-mIgG1-mF3 se liga a FcγRIIb de camundongo e FcγRIII de camundongo.
A Fig. 14 é um gráfico mostrando um curso de tempo de concen- tração no plasma de Fv4-IgG1-F21, Fv4-IgG1-F140, Fv4-IgG1-F157 e Fv4- IgG1-F424 em camundongos transgênicos FcRn humano.
A Fig. 15 é um gráfico mostrando um curso de tempo de concen- tração no plasma de Fv4-IgG1 e Fv4-IgG1-F760 em camundongos transgê- nicos FcRn humano.
A Fig. 16 é um gráfico mostrando um curso de tempo de concen- tração no plasma de Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4- IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 e Fv4-IgG1-F1009 em camundongos transgêni- cos FcRn humano.
A Fig. 17 é um gráfico mostrando um curso de tempo de concen-
tração no plasma de mPM1-mlgG1-mF14, mPM1-mlgG1-mF38, mPM1- mIgG1-mF39 e mPM1-mlgG1-mF40 em camundongos normais.
A Fig. 18 é um diagrama mostrando o resultado de avaliação de imunogenicidade usando Fv4-IgG1-F21 e Fv4-IgG1-F140. 5 A Fig. 19 é um diagrama mostrando o resultado de avaliação de imunogenicidade usando hA33-IgG1-F21 e hA33-IgG11-F140. A Fig. 20 é um diagrama mostrando o resultado de avaliação de imunogenicidade usando hA33-IgG1-F698 e hA33-IgG1-F699. A Fig. 21 é um diagrama mostrando o resultado de avaliação de imunogenicidade usando hA33-IgG1-F698 e hA33-IgG1-F763. A Fig. 22 é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de camun- dongo produzido contra Fv4-IgG1-F11, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após adminis- tração a camundongos transgênicos FcRn humano.
A Fig. 23 é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de camun- dongo produzido contra Fv4-IgG1-F821, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após adminis- tração a camundongos transgênicos FcRn humano.
A Fig. 24 é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de camun- dongo produzido contra Fv4-IgG1-F890, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após adminis- tração a camundongos transgênicos FcRn humano.
B é uma ampliação de A.
A Fig. 25 é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de camun- dongo produzido contra Fv4-IgG1-F939, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após adminis- tração a camundongos transgênicos FcRn humano.
A Fig. 26 é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de camun- dongo produzido contra Fv4-IgG1-F947, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após adminis- tração a camundongos transgênicos FcRn humano.
A Fig. 27 é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de camun- dongo produzido contra Fv4-IgG1-F1009, 3, 7, 14, 21 e 28 dias após admi- nistração a camundongo transgênico FcRn humano.
A Fig. 28 é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de camun- dongo produzido contra mPM1-IgG1-mF14, 14, 21 e 28 dias após adminis- tração a camundongos normais.
A Fig. 29 é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de camun- dongo produzido contra mPM1-IgG1-mF39, 14, 21 e 28 dias após adminis- tração a camundongos normais.
A Fig. 30 é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de camun- 5 dongo produzido contra mPM1-IgG1-mF38, 14, 21 e 28 dias após adminis- tração a camundongos normais.
A Fig. 31 é um gráfico mostrando títulos de anticorpo de camun- dongo produzido contra mPM1-IgG1-mF40, 14, 21 e 28 dias após adminis- tração a camundongos normais.
A Fig. 32 é um gráfico mostrando as concentrações de anticorpo no plasma para Fv4-IgG1-F947 e Fv4-IgG1-FA6a/FB4a 15 minutos, sete horas, um, três, quatro e sete dias após administração a camundongos transgênicos FcRn humano.
A Fig. 33 é um diagrama mostrando variância na ligação de cada mutante B3 a FcγRIIb e FcγRIa.
A Fig. 34 é um diagrama mostrando variância na ligação de cada mutante B3 a FcγRIIb e FcγRIIa(H). A Fig. 35 é um diagrama mostrando variância na ligação de cada mutante B3 a FcγRIIb e FcγRIIa(R). A Fig. 36 é um diagrama mostrando variância na ligação de cada mutante B3 a a FcγRIIb e FcγRIIIa.
A Fig. 37 é um gráfico mostrando a cinética no plasma de um re- ceptor IL-6 humano solúvel em camundongos normais e o título de anticorpo de anticorpo de camundongo contra o receptor IL-6 solúvel humano em plasma de camundongo.
A Fig. 38 é um gráfico mostrando a cinética no plasma de um re- ceptor IL-6 humano solúvel em camundongos normais administrados com anticorpo CD4 anticamundongo e o título de anticorpo de anticorpo de ca- mundongo contra o receptor IL-6 humano solúvel em plasma de camundon- go.
A Fig. 39 é um gráfico mostrando a cinética no plasma de um anticorpo anti-receptor IL-6 em camundongos normais.
A Fig. 40 é um gráfico mostrando um curso de tempo de concen- tração de receptor de IL-6 humano solúvel após coadministração de receptor de IL-6 humano solúvel e um anticorpo oara receptor anti-IL-6 a camundon- gos transgênicos FcRn humano. 5 A Fig. 41 é um diagrama mostrando a estrutura da CDR3 cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo 6RL#9 determinada através de crista- lografia de raio X.
A Fig. 42 é um gráfico mostrando uma curso de tempo de con- centração de anticorpo no plasma para H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 e FH4- IgG1 em camundongos normais.
A Fig. 43 é um gráfico mostrando um curso de tempo de concen- tração de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma em camundongos normais administrados com H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 ou FH4-IgG1. A Fig. 44 é um gráfico mostrando um curso de tempo das con- centrações de anticorpo no plasma de H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W e FH4-N434N em camundongos normais.
A Fig. 45 é um gráfico mostrando um curso de tempo de concen- tração de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma em camundongos normais administrados com H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W ou FH4- N434W.
A Fig. 46 é um cromatograma de troca de íon para um anticorpo compreendendo uma sequência Vk5-2 humana e um anticorpo compreen- dendo uma sequência Vk5-2_L65 h que tem uma sequência de glicosilação modificada da sequência Vk5-2 humana.
A linha sólida representa um cro- matograma para o anticorpo compreendendo a sequência Vk5-2 humana (cadeia pesada: CIM_H, SEQ ID NO: 108; e cadeia leve: hVk5-2, SEQ ID NO: 4). A linha interrompida representa um cromatograma para o anticorpo compreendendo a sequência hVk5-2_L65 (cadeia pesada: CIM_H (SEQ ID NO: 108); e cadeia leve: hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 107)). A Fig. 47 é um diagrama mostrando um alinhamento das se- quências de região constante de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, que são numera- das de acordo com o sistema de numeração EU.
A Fig. 48 é um diagrama esquemático mostrando a formação de um complexo de tetrâmero consistindo em uma molécula de uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro, duas molé- culas de FcRn e uma molécula de FcγR. 5 A Fig. 49 é um diagrama esquemático mostrando a interação de duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγRn com uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro e uma atividade de ligação menor a FcγR de ativação do que aquela de uma região Fc nati- va.
A Fig. 50 é um diagrama esquemático mostrando a interação de duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR com uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro e atividade de ligação seletiva a FcγR inibidor.
A Fig. 51 é um diagrama esquemático mostrando a interação de duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR com uma região Fc em que apenas um dos dois polipeptídeos de domínio de ligação FcRn tem ati- vidade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro e o outro não tem ati- vidade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro.
A Fig. 52 é um gráfico mostrando a relação de uma distribuição de aminoácido projetada (indicada como Design) para a distribuição de ami- noácido (indicada como Library) para a informação de sequência em 290 clones isolados de E. coli introduzidos com uma biblioteca de gene de anti- corpos que se liga a antígenos de uma maneira dependente de Ca.
O eixo horizontal indica posições de aminoácido no sistema de numeração Kabat.
O eixo vertical indica % de distribuição de aminoácido.
A Fig. 53 é um gráfico mostrando a relação de uma distribuição de aminoácido projetada (indicada como Design) para a distribuição de ami- noácido (indicada como Library) para a informação de sequência em 132 clones isolados de E. coli introduzidos com uma biblioteca de gene de anti- corpos que se liga a antígenos de uma maneira dependente do pH.
O eixo horizontal indica posições de aminoácido no sistema de numeração Kabat.
O eixo vertical indica % de distribuição de aminoácido.
A Fig. 54 é um gráfico mostrando um curso de tempo de concen- tração no plasma de Fv4-IgG1-F947 e Fv4-IgG1-F1326 em camundongos transgênicos FcRn humano administrados com Fv4-IgG1-F947 ou Fv4-IgG1- F1326. 5 A Fig. 55 mostra um gráfico em que o eixo horizontal mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcγRIIb de cada variante PD e o eixo vertical mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcγRIIa tipo R de cada variante PD.
O valor para a quantidade de ligação de cada variante PD a cada FcγR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação de IL6R- F652, que é um anticorpo controle antes da introdução da alteração (Fc alte- rado com substituição de Pro na posição 238 (indicado por numeração EU) com As), a cada FcγR; e então o valor obtido foi multiplicado por 100 e usa- do como o valor de atividade de ligação relativo para cada variante PD a ca- da FcγR.
O gráfico F652 na Fig. mostra o valor para IL6R-F652. A Fig. 56 mostra um gráfico em que o eixo vertical mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcγRIIb de variantes produzidas através da introdução de cada alteração em GpH7-B3 que não tem a alteração P238D, e o eixo horizontal mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcγRIIb de variantes produzidas através da introdução de cada alteração em IL6R- F652 que tem a alteração P238D.
O valor para a quantidade de ligação a FcγRIIb de cada variante foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação a FcγRIIb do anticorpo pré-alterado; e então o valor obtido foi multiplicado por 100 e usado como o valor de atividade de ligação relativa.
Aqui, a região A contém alterações que exibem o efeito de aumento da ligação a FcγRIIb em ambos os casos em que uma alteração é introduzida em GpH7-B3 que não tem P238D e em que uma alteração é introduzida em IL6R-F652 que tem P238D.
A região B contém alterações que exibem o efeito de aumento de ligação a FcγRIIb quando introduzidas em GpH7-B3 que não tem P238D, mas não exibem o efeito de aumento de ligação a FcγRIIb quando introduzi- das em IL6R-F652 que tem P238D.
A Fig. 57 mostra uma estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcγRIIb.
A Fig. 58 mostra uma imagem de superposição da estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcγRIIb e a estrutu- ra modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular de FRcγRIIb, com re- lação à região extracelular FcγRIIb e o domínio A CH2 Fc pelos ajustes de 5 quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo Cα.
A Fig. 59 mostra comparação da estrutura detalhada ao redor de P238D após superposição da estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcγRIIb e da estrutura modelo do comple- xo de Fc(WT)/região extracelular de FcγRIIB com relação ao único domínio A CH2 Fc ou ao único domínio B CH2Fc pelos ajuste dos quadrados míni- mos com base nas distâncias de par de átomo Cα.
A Fig. 60 mostra que uma ligação hidrogênio pode ser encontra- da entre a cadeia principal de Gly na posição 237 (indicado pela numeração EU) no domínio A CH2Fc e Tyr na posição 160 em FcγRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/ região extracelular de FcγRIIb.
A Fig. 61 mostra que uma interação eletrostática pode ser en- contrada entre Asp na posição 270 (indicado por numeração EU) em domí- nio B CH2Fc e Arg na posição 131 em FcγRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/ região extracelular de FcγRIIb.
A Fig. 62 mostra um gráfico em que o eixo horizontal mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcγRIIb de cada variante 2B e o eixo vertical mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcγRIIa tipo R de cada variante 2B.
O valor para a quantidade de ligação de cada variante 2B a cada FcγR foi dividido pelo valor da quantidade de ligação de um anticorpo controle antes da alteração (Fc alterado com substituição de Pro na posição 238 (indicado por numeração EU) com Asp) a cada FcγR; e então o valor obtido foi multiplicado por 100 e usado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante 2B com relação a cada FcγR.
A Fig. 63 mostra Glu na posição 233 (indicado por numeração EU) na Cadeia A Fc e os resíduos circundantes na região extracelular de FcγRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelu- lar FcγRIIb.
A Fig. 64 mostra Ala na posição 330 (indicado por numeração EU) na Cadeia A Fc e os resíduos circundantes na região extracelular de FcγRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelu- lar FcγRIIb. 5 A Fig. 65 mostra as estruturas de Pro na posição 271 (numera- ção EU) de Cadeia B Fc após superposição das estruturas de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcγRIIb pelo ajuste dos qua- drados mínimos nas distâncias de par de átomo Cα com relação à Cadeia B Fc.
Modo de Realizar a Invenção As definições e descrição detalhada abaixo são providas para ajudar na compreensão da presente invenção ilustrada aqui.
Aminoácidos Aqui, aminoácidos são descritos em códigos de uma ou três le- tras ou ambos, por exemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I ou Val/V.
Antígenos Aqui, "antígenos" não são particularmente limitados em sua es- trutura, contanto que eles compreendam epítopos aos quais domínios de ligação a antígeno se liguem.
Outros antígenos incluem, por exemplo, as moléculas abaixo: 17-1A, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de ade- nosina A1, A33, ACE, Ace-2, activina, activina A, activina AB, activina B, ac- tivina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activina RIB ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, A- DAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adressina, aFGF, AL- CAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, alfa-V/beta-1 antagonista, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti- Id, ASPARTIC, peptídeo natriurético atrial, av/b3 integrina, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, fator de estimulação de linfócito B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-
ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2, BMP-2a, BMP-3 Osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), MBP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-1A (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK- 2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bombesina, fator neutrófico 5 derivado de osso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator de complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, cAMP, antígeno carci- noembriônico (CEA), antígeno associado a câncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, ca- tepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, C- CL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (pro- teína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina Botulínica, toxina Clostridium per- fringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG- 2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CX- CL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno associado a tumor citoquerati- na, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, fator regulador de complementaridade (Fa- tor de aceleração de declínio), des (1-3)-IGF-1 (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxi- na, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA- A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endo- telina, encefalinase, eNOS, Eot, eotaxina, EpCAM, efrina B2/EphB4, ERCC, E-selectina, ET-1, fator IIa, fator VII, fator VIIIc, fator IX, proteína de ativação de fibroblasto (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2,
FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormônio de estimulação de folículo, factalcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP- 5 2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, glucagon, Glut4, glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormônio de liberação de hormônio do crescimento, hapteno (NP-cap ou NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína envelope HCMV gBm, glicoprote- ína envelope HCMV gH, HCMV UL, fator de crescimento hematopoiético (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB do vírus herpes simplex (HSV), glicoproteína gD do HSV, HGFA, antígeno associado a melanoma de peso molecular alto (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 alça V3, HLA, HLA-DR, HM 1,24, HMGF PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV), hormônio do crescimento humano (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-I, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor IgA, IgE, IGF, proteína de ligação a IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL- 18R, IL-23, interferon (INF)-alfa, INF-beta, INF-gama, inibina, iNOS, cadeia A da insulina, cadeia B da insulina, fator 1 de crescimento do tipo insulina, al- fa2 integrina, alfa3 integrina, alfa4 integrina, alfa4 integrina/beta1, alfa4 inte- grina/beta7, alfa5 integrina (alfa V), alfa5 integrina/beta1, alfa5 integrina/beta 3, integrina alfa6, integrina beta1, integrina beta2, interferon gama, IP-10, I- TAC, JE, calicreíona 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, calicreína L3, cali- creína L4, KC, KDR, fator de crescimento de queratinócito (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 latente bp1, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno Lewis-Y, antígeno associado a Lewis-Y, LFA-1, LFA- 3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, superfície pulmonar, hormônio luteinizante, receptor da linfo- toxina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2,
MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEASES, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, , MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina 5 (Mucl), MUC18, substância inibidora Mulleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C aderina, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4 ou -6, neurturina, fator de crescimento de nervo (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormônio paratireoide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-caderina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatase alcalina placentá- ria (PLAP), PIGF, PLP, PP14, pró-insulina, pré-relaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadeia A da re- laxina, cadeia B da relaxina, renina, vírus sincicial respiratório (RSV) F, RSV Fgp, Ret, Fator reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINA, albumina do soro, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, MARCADOR-72 (glicoproteína-72 associada a tumor), TARC, TCA-3, recep- tor de célula T (por exemplo, receptor de célula T alfa/beta), TdT, TECK, TEMI, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatase alcalina tipo PLAP do testículo, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específico, TGF-betaRI (ALK- 5), TGF-betaRII, TGF-betaRIIb, TGF-betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF- beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, trombina, Ck-1 do timo, hormônio de estimu- lação da tireoide, Tie, TIMP, TIQ, fator de tecido, TMEFF2, Tmpo, TM- PRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KIL- LER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TN- FRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TAC1), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA),
TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, P55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, P75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR3 TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 P50), TNFRSF6 5 (Faz Apo-1, APTI, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TN- FRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TN- FRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK ligante ODF, ligante OPG), TNFSF12 (TWEAK ligante Apo-3, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT li- gante HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante GITR ligante AITR, TL6), TNFSF1A (Conectina TNF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 ligante gp34, TXGP1), TNFSFS5 (ligante CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante Fas ligante Apo-1, ligante APT1), TNFSF7 (ligante CD27 CD70), TNFSF8 (ligante CD30 CD153), TNFSF9 (ligante 4-1BB ligante CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno associado a tumor CA125, antígeno associado a tumor expressando carboidratos as- sociados a Lewis-Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urocinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Caderina, VE-Caderina-2, VEGFR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno de vírus, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrina, fator von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT76A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL- 20R, LDL oxidado, PSCK9, pré-calicreína, RON, TMEM16F, SOD1, Cromo- granina A, Cromogranina B, tau, VAP1, quininógeno de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2, C2a, C2b, C3, C3a,
C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, fator B, fator D, fator H, properdina, esclerostina, fibrinogênio, fibrina, protrombina, trombina, fator de tecido, fator V, fator Va, fator VII, fator VIIa, fator VIII, fator VIIIa, fator IX, fa- tor IXa, fator X, fator Xa, fator XI, fator XIa, fator XII, fator XIIa, fator XIII, fator 5 XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminogê- nio, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Sindecam-1, Sindecam-2, Sindecam-3, Sindecam-4, LPA e S1P; e receptores para hormônio e fatores de cresci- mento. "Epítopo" significa um determinante antigênico em um antígeno e se refere a um sítio antigênico ao qual o domínio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno aqui apresentada se liga.
Desta forma, por exemplo, o epítopo pode ser definido de acordo com sua estrutura.
Al- ternativamente, o epítopo pode ser definido de acordo com a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno que reconhece o epítopo.
Quando o antígeno é um peptídeo ou polipeptídeo, o epítopo po- de ser especificado pelos resíduos de aminoácido que formam o epítopo.
Alternativamente, quando o epítopo é uma cadeia de açúcar, o epítopo pode ser especificado por sua estrutura de cadeia de açúcar específica.
Um epítopo linear é um epítopo que contém um epítopo cuja se- quência de aminoácidos primária é reconhecida.
Tal epítopo linear contém, tipicamente, pelo menos três e o mais comumente pelo menos cinco, por exemplo, cerca de 8 a 10 ou 6 a 20 aminoácidos na sua sequência específi- ca.
Ao contrário do epítopo linear, o "epítopo conformacional" é um epítopo no qual a sequência de aminoácidos primária contendo o epítopo não é o única determinante do epítopo reconhecido (por exemplo, a sequên- cia de aminoácidos primária de um epítopo conformacional não é necessari- amente reconhecida por um anticorpo que define o epítopo). Os epítopos conformacionais podem conter um número maior de aminoácidos em com- paração aos epítopos lineares.
Um anticorpo que reconhece um epítopo conformacional reconhece a estrutura tridimensional de um peptídeo ou pro- teína.
Por exemplo, quando uma molécula de proteína se dobra e forma uma estrutura tridimensional, as cadeias principais do aminoácido e/ou polipeptí- deo que formam um epítopo conformacional ficam alinhados e o epítopo é tornado passível de reconhecimento pelo anticorpo.
Os métodos para de- terminar as conformações do epítopo incluem, por exemplo, cristalografia de 5 raios X, ressonância magnética nuclear bidimensional, marcação spin de sítio-específica, e ressonância paramagnética de elétrons, mas não são limi- tados a estes.
Vide, por exemplo Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.). Atividade de ligação Exemplos de um método para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de liga- ção ao antígeno de IL-6R são descritos a seguir.
De acordo com os exem- plos abaixo, os métodos para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno para um antígeno diferente de IL-6R, também podem ser conduzidos apro- priadamente.
Por exemplo, pode-se confirmar se uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R re- conhece um epítopo linear na molécula de IL-6R, por exemplo, como men- cionado abaixo.
Um peptídeo linear que compreende uma sequência de a- minoácidos que forma o domínio extracelular de IL-6R é sintetizado para o propósito acima.
O peptídeo pode ser sintetizado quimicamente, ou pode ser obtido por técnicas de engenharia genética usando uma região que codifica a sequência de aminoácidos que corresponde ao domínio extracelular em um cDNA de IL-6R.
Então, uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R é avaliada para sua atividade de ligação a um peptídeo linear que compreende a sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular.
Por exemplo, um peptídeo linear imobilizado pode ser usado como um antígeno por ELISA para avaliar a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno ao peptídeo.
Al- ternativamente, a atividade de ligação a um peptídeo linear pode ser avalia- da com base no nível com que o peptídeo linear inibe a ligação da molécula de ligação ao antígeno a células que expressam IL-6R.
Estes testes podem demonstram a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno ao peptídeo linear.
Pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno de tes- 5 te contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epí- topo conformacional da seguinte forma.
Células que expressam IL-6R são preparadas para o propósito acima.
Pode-se determinar se uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo conformacional quando ela se liga fortemente às células que expressam IL-6R mediante contato, mas não se liga substan- cialmente a um peptídeo linear imobilizado que compreende uma sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular de IL-6R.
Na presente in- venção, "não se liga substancialmente" significa que a atividade de ligação é 80% ou menos, geralmente, 50% ou menos, de preferência 30% ou menos, e particularmente, de preferência, 15% ou menos em comparação à ativida- de de ligação às células que expressam IL-6R humano.
Os métodos para avaliar a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R a células que expressam IL-6R incluem, por exemplo, os métodos descritos em Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Especificamente, a avaliação pode ser feita com base no princípio do ELISA ou classificação celular ativa- da por fluorescência (FACS) usando células que expressam IL-6R como an- tígeno.
No formato ELISA, a atividade de ligação de uma molécula de li- gação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R às células que expressam IL-6R pode ser avaliada quantitativamente por comparar os níveis de sinal gerado por reação enzimática.
Especifica- mente, um complexo polipeptídico de teste é adicionado a uma placa de E- LISA sobre a qual as células que expressam IL-6R são imobilizadas.
Então, a molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células é detectada usando um anticorpo marcado com enzima que reconhece a molécula de ligação ao antígeno de teste.
Alternativamente, quando FACS é usado, uma série de diluições de uma molécula de ligação ao antígeno de teste é prepa- rada, e o título de ligação do anticorpo para células que expressam IL-6R pode ser determinado para comparar a atividade de ligação da molécula de 5 ligação ao antígeno de teste às células que expressam IL-6R.
A ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste a um antígeno expresso sobre a superfície de células suspensas em tampão ou similares, pode ser detectada usando um citômetro de fluxo.
Os citômetros de fluxo conhecido incluem, por exemplo, os seguintes dispositivos: FACSCantoTM II FACSAriaTM FACSArrayTM FACSVantageTM SE FACSCaliburTM (todos são nomes comerciais da BD Bioscien- ces) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos são nomes comer- ciais da Beckman Coulter). Os métodos preferenciais para avaliar a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de liga- ção ao antígeno de IL-6R a um antígeno incluem, por exemplo, o seguinte método.
Primeiro, células que expressam IL-6R são reagidas com uma mo- lécula de ligação ao antígeno de teste, e, então, elas são coradas com um anticorpo secundário marcado com FITC que reconhece a molécula de liga- ção ao antígeno.
A molécula de ligação ao antígeno de teste é diluída apro- priadamente um tampão adequado para preparar a molécula em uma con- centração desejada.
Por exemplo, a molécula pode ser usada em uma con- centração dentro da faixa de 10 µg/ml a 10 ng/ml.
Então, a intensidade de fluorescência e a contagem de células são determinadas usando FACSCali- bur (BD). A intensidade de fluorescência é obtida por análise usando pro-
grama CELL QUEST (BD), isto é, o valor geométrico médio reflete a quanti- dade de anticorpo ligado às células.
Ou seja, a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste, que é representada pela quanti- dade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada, pode ser determi- 5 nada mediante a medição do valor geométrico médio.
Pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno de tes- te contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R compartilha um epítopo comum com outra molécula de ligação ao antígeno com base na competição entre as duas moléculas pelo mesmo epítopo.
A competição en- tre as moléculas de ligação ao antígeno pode ser detectada por um ensaio de bloqueio cruzado ou similares.
Por exemplo, o ensaio ELISA competitivo é um ensaio de bloqueio cruzado de preferência.
Especificamente, no ensaio de bloqueio cruzado, a proteína IL- 6R imobilizada aos poços de uma placa de microtitulação é pré-incubada na presença ou ausência de uma molécula de ligação ao antígeno competidora candidata e, então, uma molécula de ligação ao antígeno de teste é adicio- nada a isso.
A quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste liga- da à proteína IL-6R nos poços está correlacionada indiretamente com a ca- pacidade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno competidora candidata que compete pela ligação ao mesmo epítopo.
Ou seja, quanto maior a afinidade da molécula de ligação ao antígeno competidora pelo mesmo epítopo, menor será a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno de teste aos poços revestidos com a proteína IL-6R.
A quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada aos poços através da proteína IL-6R pode ser facilmente determinada atra- vés de marcação da molécula de ligação ao antígeno antecipadamente.
Por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno marcada com biotina é me- dida usando um conjugado de avidina/peroxidase e um substrato adequado.
Em particular, o ensaio de bloqueio cruzado que usa marcadores de enzima como peroxidase é chamado "ensaio ELISA competitivo". A molécula de li- gação ao antígeno também pode ser marcada com outras substâncias de marcação que permitem a detecção ou medição.
Especificamente, radio-
marcadores, marcadores fluorescentes, e similares, são conhecidos.
Quando a molécula de ligação ao antígeno competidora candi- data pode bloquear a ligação por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R em pelo menos 5 20%, de preferência ao menos 20 a 50%, e mais preferível pelo menos 50% em comparação à atividade de ligação em um experimento de controle con- duzido na ausência da molécula de ligação ao antígeno competidora, é de- terminado que a molécula de ligação ao antígeno de teste se liga substanci- almente ao mesmo epítopo ligado pela molécula de ligação ao antígeno competidora, ou compete pela ligação ao mesmo epítopo.
Quando a estrutura de um epítopo ligado por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R já tiver sido identificada, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao antígeno de teste e controle compartilham um epítopo comum através da comparação das atividades de ligação das duas moléculas de ligação ao antígeno a um peptídeo preparado pela introdução de mutações de aminoá- cido no peptídeo que forma o epítopo.
Para medir as atividades de ligação acima, por exemplo, as ati- vidades de ligação das moléculas de ligação ao antígeno de teste e de con- trole a um peptídeo linear no qual uma mutação é introduzida são compara- das no formato ELISA acima.
Além dos métodos ELISA, a atividade de liga- ção ao peptídeo mutante ligado a uma coluna pode ser determinada por fa- zer as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle fluírem na coluna, e, então, quantificar a molécula de ligação ao antígeno eluída na so- lução de eluição.
Os métodos para adsorver um peptídeo mutante a uma coluna, por exemplo, sob a forma de um peptídeo de fusão de GST, são co- nhecidos.
Alternativamente, quando o epítopo identificado é um epítopo conformacional, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle compartilham um epítopo comum por meio do seguinte método.
Primeiro, células que expressam IL-6R e células que expressam IL- 6R com uma mutação introduzida no epítopo são preparadas.
As moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle são adicionadas a uma sus- pensão de células preparada por suspender estas células em um tampão adequado, como PBS.
A seguir, as suspensões de células são lavadas a- propriadamente com um tampão, e um anticorpo marcado com FITC que 5 reconhece as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle é adi- cionado a elas.
A intensidade de fluorescência e o número de células mar- cadas com o anticorpo marcado são determinados usando FACSCalibur (BD). As moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle são diluí- das apropriadamente usando um tampão adequado, e são usadas nas con- centrações desejadas.
Por exemplo, elas podem ser usadas a uma concen- tração dentro da faixa de 10 µg/ml a 10 ng/ml.
A intensidade de fluorescên- cia é determinada por análise usando programa CELL QUEST (BD), isto é, o valor geométrico médio reflete a quantidade de anticorpo marcado ligado às células.
Ou seja, as atividades de ligação das moléculas de ligação ao antí- geno de teste e de controle, que são representadas pela quantidade de anti- corpo marcado ligado, podem ser determinadas mediante a medição do va- lor geométrico médio.
No método acima, pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno que "não se liga substancialmente às células que expressam IL- 6R mutante", por exemplo, por meio do seguinte método.
Primeiro, as molé- culas de ligação ao antígeno de teste e de controle ligadas às células que expressam IL-6R mutante são marcadas com um anticorpo marcado.
Então, a intensidade de fluorescência das células é determinada.
Quando FACSCa- libur é usado para a detecção da fluorescência por citometria de fluxo, a in- tensidade de fluorescência determinada pode ser analisada usando o pro- grama CELL QUEST.
A partir dos valores médios geométricos na presença e na ausência do complexo de polipeptídeo, o valor de comparação (∆mé- dia-Geo) pode ser calculado de acordo com a seguinte fórmula para deter- minar a proporção de aumento na intensidade de fluorescência como resul- tado da ligação pela molécula de ligação ao antígeno. ∆média-Geo= média-Geo (na presença do complexo de polipep- tídeo)/média-Geo (na ausência do complexo de polipeptídeo)
O valor de comparação da média geométrica (valor da ∆média- Geo para a molécula de IL-6R mutante) determinado pela análise acima, que reflete a quantidade de uma molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células que expressam IL-6R mutante, é comparado com o valor de com- 5 paração da ∆média-Geo que reflete a quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células que expressam IL-6R.
Nesse caso, as concentrações da molécula de ligação ao antígeno de teste usadas para de- terminar os valores de comparação da ∆média-Geo para células que ex- pressam IL-6R e células que expressam IL-6R mutante são particularmente ajustadas, de preferência, para serem iguais ou substancialmente iguais.
Uma molécula de ligação ao antígeno que foi confirmada como reconhecen- do um epítopo em IL-6R é usada como uma molécula de ligação ao antígeno de controle.
Se o valor de comparação da ∆média-Geo de uma molécula de ligação ao antígeno de teste para células que expressam o IL-6R mutante for menor que o valor de comparação da ∆média-Geo da molécula de ligação ao antígeno de teste para células que expressam IL-6R em pelo menos 80%, de preferência 50%, mais preferível, 30%, e particularmente, de prefe- rência, 15% então, a molécula de ligação ao antígeno de teste "não se liga substancialmente às células que expressam IL-6R mutante". A fórmula para determinar o valor da média-Geo (média geométrica) está descrita no guia do usuário do programa CELL QUEST (BD biosciences). Quando a compa- ração mostra que os valores de comparação são substancialmente equiva- lentes, pode-se determinar que o epítopo para as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle é o mesmo.
Domínio de ligação ao antígeno Na presente invenção, um "domínio de ligação ao antígeno" po- de ter qualquer estrutura contanto que ele se ligue a um antígeno de interes- se.
Tais domínios incluem, de preferência, por exemplo: regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo; um módulo de cerca de 35 aminoácidos chamado domínio A que está contido na proteína de membrana celular in vivo Avímero (WO
2004/044011, WO 2005/040229); Adnectina contendo o domínio 10Fn3 que se liga à porção de proteína da fibronectina, uma glicoproteína expressa sobre a membrana ce- lular (WO 2002/032925); 5 Um aficorpo que é composto por um feixe de três hélices com 58 aminoácidos com base na estrutura do domínio de ligação à IgG da proteína A (WO 1995/001937); Proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins) que são uma região exposta na superfície molecular das repetições de anquirina (AR) que têm uma estrutura na qual uma subunidade que consiste em uma volta compreendendo 33 resíduos de aminoácido, duas hélices antiparalelas, e um laço é repetidamente empilhada (WO 2002/020565); Anticalinas e similares, que são domínios que consistem em quatro laços que suportam um lado de uma estrutura de cilindro composta por oito fitas antiparalelas dispostas circularmente que são altamente con- servadas entre as moléculas de lipocalina como lipocalina associada à gela- tinase de neutrófilo (NGAL) (WO 2003/029462); e A região côncava formada pela estrutura de folha paralela dentro da estrutura com formato de ferradura constituída por repetições empilhadas do módulo de repetições ricas em leucina (LRR) do receptor de linfócito vari- ável (VLR) que não tem a estrutura da imunoglobulina e é usada no sistema de imunidade adquirida em vertebrados sem mandíbulas como o peixe lam- pery e congro (WO 2008/016854). Os domínios de ligação ao antígeno pre- ferenciais da presente invenção incluem, por exemplo, aqueles tendo regi- ões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo.
Os exemplos preferenciais de domínios de ligação ao antígeno incluem "Fv de cadeia úni- ca (scFv)", "anticorpo de cadeia única", "Fv", "Fv 2 de cadeia única (scFv2)", "Fab", e "F(ab’)2". Os domínios de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção podem se ligar a um epítopo idêntico.
Tal epítopo pode estar apresentar, por exemplo, em uma proteína que compre- ende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, o epítopo pode estar presente na proteína que compreende os aminoácidos nas posições 20 a 365 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Al- ternativamente, cada um dos domínios de ligação ao antígeno das molécu- las de ligação ao antígeno da presente invenção pode se ligar a um epítopo 5 diferente.
Na presente invenção, o epítopo diferente pode estar presente, por exemplo, em uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, o epítopo pode estar presente na proteína que compreende os aminoácidos nas posições 20 a 365 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Especificidade "Específico" significa que uma das moléculas que se liga especi- ficamente não mostra qualquer ligação significativa a moléculas que não uma única ou inúmeras moléculas parceiras de ligação.
Além disso, "especí- fico" também é usado quando um domínio de ligação ao antígeno é específi- co para um epítopo particular dentre múltiplos epítopos em um antígeno.
Quando um epítopo ligado por um domínio de ligação ao antígeno está con- tido em múltiplos antígenos diferentes, as moléculas de ligação ao antígeno contendo o domínio de ligação ao antígeno podem se ligar a vários antíge- nos que possuem o epítopo.
Anticorpo Na presente invenção, "anticorpo" se refere a uma imunoglobuli- na natural ou uma imunoglobulina produzida por síntese parcial ou completa.
Os anticorpos podem ser isolados de fontes naturais como plasma e soro de ocorrência natural, ou sobrenadantes de cultura de hibridomas produtores de anticorpo.
Alternativamente, os anticorpos podem ser sintetizados parcial ou completamente usando técnicas como recombinação genética.
Os anticor- pos preferenciais incluem, por exemplo, anticorpos de um isotipo ou sub- classe de imunoglobulina que pertence a isso.
As imunoglobulinas humanas conhecidas incluem anticorpos das nove classes a seguir (isotipos): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, e IgM.
Destes isotipos, os anticorpos da presente invenção incluem IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Os métodos para produzir um anticorpo com a atividade de liga-
ção desejada são conhecidos pelos versados na técnica.
Abaixo está um exemplo que descreve um método para produzir um anticorpo que se liga ao IL-6R (anticorpo anti-IL-6R). Anticorpos que se ligam a antígeno diferente de IL-6R também podem ser produzidos de acordo com o exemplo descrito a 5 seguir.
Os anticorpos anti-IL-6R podem ser obtidos como anticorpos po- liclonais ou monoclonais usando métodos conhecidos.
Os anticorpos anti-IL- 6R produzidos são, de preferência, anticorpos monoclonais derivados de mamíferos.
Tais anticorpos monoclonais derivados de mamífero incluem an- ticorpos produzidos por hibridomas ou células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que transporta um gene do anticorpo por técni- cas de engenharia genética. "Anticorpos humanizados" ou "anticorpos qui- méricos" estão incluídos nos anticorpos monoclonais da presente invenção.
Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal podem ser produzidos usando técnicas conhecidas, por exemplo, conforme descrito abaixo.
Especificamente, mamíferos são imunizados por métodos de imuni- zação convencionais usando uma proteína IL-6R como um antígeno de sen- sibilização.
As células imunes resultantes são fundidas com células paren- tais conhecidas por métodos de fusão celular convencionais.
Então, os hibri- domas que produzem um anticorpo anti-IL-6R podem ser selecionados por triagem das células produtoras de anticorpo monoclonal usando métodos de triagem convencionais.
Especificamente, os anticorpos monoclonais são preparados conforme mencionado abaixo.
Primeiro, o gene de IL-6R cuja sequência de nucleotídeos é revelada na SEQ ID NO: 2 pode ser expresso para produzir uma proteína IL-6R mostrada na SEQ ID NO: 1, que será usada como um antígeno de sensibilização para a preparação do anticorpo.
Ou seja, uma sequência gênica que codifica IL-6R é inserida em um vetor de expressão de conhecido, e as células hospedeiras adequadas são transformadas com este vetor.
A proteína IL-6R humana desejada é purificada a partir das células hospedeiras ou seus sobrenadantes de cultura por métodos conhecidos.
De modo a obter IL-6R solúvel a partir dos sobrenadantes de cultura, por exem-
plo, uma proteína que consiste nos aminoácidos nas posições 1 a 357 na sequência de polipeptídeos de IL-6R da SEQ ID NO: 15, tal como descrito em Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), é expressa co- mo um IL-6R solúvel, ao invés da proteína IL-6R da SEQ ID NO: 1. A proteí- 5 na IL-6R natural purificada também pode ser usada como um antígeno de sensibilização. A proteína IL-6R purificada pode ser usada como um antígeno de sensibilização para imunização de mamíferos. Um peptídeo de IL-6R par- cial pode, também, ser usada como um antígeno de sensibilização. Nesse caso, um peptídeo parcial pode ser preparado por síntese química com base na sequência de aminoácidos do IL-6R humano, ou por inserir um gene IL- 6R parcial em um vetor de expressão para expressão. Alternativamente, um peptídeo parcial pode ser produzido por degradar uma proteína IL-6R com uma protease. O comprimento e a região do peptídeo de IL-6R parcial não se limitam a modalidades específicas. Uma região preferencial pode ser se- lecionada arbitrariamente a partir da sequência de aminoácidos nas posi- ções de aminoácido 20 a 357 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
15. O número de aminoácidos que formam um peptídeo a ser usado como um antígeno de sensibilização é, de preferência, pelo menos cinco ou mais, seis ou mais, ou sete ou mais. Mais especificamente, um peptídeo com 8 a 50 resíduos, mais preferível, 10 a 30 resíduos pode ser usado como um an- tígeno de sensibilização. Para o antígeno de sensibilização, alternativamente, é possível usar uma proteína de fusão preparada por fundir um polipeptídeo ou peptí- deo parcial desejado da proteína IL-6R com um polipeptídeo diferente. Por exemplo, fragmentos Fc do anticorpo e marcadores de peptídeo são usados, de preferência, para produzir proteínas de fusão a serem usadas como antí- genos de sensibilização. Os vetores para expressão de tais proteínas de fusão podem ser construídos por fundir na estrutura genes que codificam dois ou mais fragmentos do polipeptídeo desejado e inserir o gene de fusão em um vetor de expressão, conforme descrito acima. Métodos para produzir proteínas de fusão são descritos em Molecular Cloning 2ª ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2ª ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab.
Press). Os métodos para preparar IL-6R para ser usada como um antígeno de sensibilização, e métodos de imunização usando IL-6R são descritos es- pecificamente nos WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693, e 5 similares.
Não há limitação específica aos mamíferos a serem imunizados com o antígeno de sensibilização.
Entretanto, é preferencial selecionar os mamíferos por considerar sua compatibilidade com as células progenitoras a serem usadas para a fusão celular.
Em geral, roedores como camundongos, ratos, e hamsters, coelhos, e macacos são preferencialmente usados.
Os animais acima são imunizados com um antígeno de sensibili- zação através de métodos conhecidos.
Em geral, os métodos de imunização realizados incluem, por exemplo, a injeção intraperitoneal ou subcutânea de um antígeno de sensibilização nos mamíferos.
Especificamente, um antíge- no de sensibilização é diluído apropriadamente com PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina fisiológica, ou similares.
Se for dese- jado, um adjuvante convencional como adjuvante completo de Freund é mis- turado com o antígeno, e a mistura é emulsionada.
A seguir, o antígeno de sensibilização é administrado a um mamífero várias vezes em intervalos de 4 a 21 dias.
Veículos adequados podem ser usados na imunização com o antígeno de sensibilização.
Em particular, quando um peptídeo parcial de baixo peso molecular é usado como o antígeno de sensibilização, é algumas vezes desejável acoplar o peptídeo do antígeno de sensibilização a uma pro- teína carreadora como albumina ou hemocianina da lapa californiana para a imunização.
Alternativamente, hibridomas que produzem um anticorpo dese- jado podem ser preparados usando imunização com DNA, como menciona- do abaixo.
A imunização com DNA é um método de imunização que confere estimulação imunológica mediante expressão de um antígeno de sensibiliza- ção em um animal imunizado como um resultado da administração de um vetor de DNA construído para permitir a expressão de um gene que codifica a proteína do antígeno no animal.
Em comparação aos métodos de imuniza-
ção convencionais nos quais um antígeno proteico é administrado aos ani- mais a serem imunizados, espera-se que a imunização com DNA seja supe- rior em que: - estimulação imunológica pode ser fornecida enquanto se man- 5 tém a estrutura de uma proteína membrânica como IL-6R; e - não há necessidade de purificar o antígeno para imunização.
De modo a preparar um anticorpo monoclonal da presente in- venção usando imunização com DNA, primeiro, um DNA que expressa uma proteína IL-6R é administrado a um animal a ser imunizado.
O DNA que co- difica IL-6R pode ser sintetizado por métodos conhecidos como PCR.
O DNA obtido é inserido em um vetor de expressão adequado, e, então, ele é administrado a um animal a ser imunizado.
De preferência, os vetores de expressão usados incluem, por exemplo, vetores de expressão disponíveis comercialmente como pcDNA3.1. Os vetores podem ser administrados a um organismo usando métodos convencionais.
Por exemplo, a imunização com DNA é feita pelo uso de uma arma de genes para introduzir as partículas de ouro revestidas com vetor de expressão em células no corpo de um animal a ser imunizado.
Os anticorpos que reconheceram IL-6R também podem ser produzidos pelos métodos descritos no WO 2003/104453. Após imunizar um mamífero, conforme descrito acima, o aumen- to no título de um anticorpo de ligação a IL-6R é confirmado no soro.
A se- guir, as células imunes são coletadas do mamífero, e, então, submetidas à fusão celular.
Em particular, esplenócitos são usados, de preferência, como células imunes.
Uma célula de mieloma de mamífero é usada como uma célula a ser fundida com as células imunes acima mencionadas.
As células de mie- loma compreendem, de preferência, um marcador de seleção adequado pa- ra triagem.
Um marcador de seleção confere características às células para sua sobrevivência (ou morte) sob uma condição de cultura específica.
Defi- ciência em hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (deste ponto em dian- te no presente documento, abreviada como deficiência de HGPRT) e defici- ência em timidina quinase (deste ponto em diante no presente documen-
to,abreviada como deficiência de TK) são conhecidos como marcadores de seleção.
Células com deficiência de HGPRT ou TK têm sensibilidade à hipo- xantina-aminopterina-timidina (deste ponto em diante no presente documen- to, abreviada como sensibilidade à HAT). As células sensíveis à HAT não 5 sintetizam o DNA em um meio de seleção com HAT e são então mortas.
En- tretanto, quando as células são fundidas com células normais, elas podem continuar a síntese de DNA usando a via de salvamento das células normais e, portanto, elas podem crescer mesmo no meio de seleção de HAT.
As células deficientes em HGPRT e deficientes em TK podem ser selecionadas em um meio contendo 6-tioguanina, 8-azaguanina (deste ponto em diante no presente documento abreviada como 8AG), ou 5’- bromodeoxiuridina, respectivamente.
As células normais são mortas porque elas incorporam estes análogos de pirimidina no seu DNA.
Entretanto, célu- las que são deficientes nestas enzimas podem sobreviver no meio de sele- ção, uma vez que elas não podem incorporar estes análogos de pirimidina.
Além disso, um marcador de seleção chamado de resistência à G418 forne- cido pelo gene de resistência à neomicina confere resistência aos antibióti- cos de 2-desoxiestreptamina (análogos de gentamicina). Diversos tipos de células de mieloma que são adequadas para fusão celular são conhecidos.
Por exemplo, células de mieloma que incluem as seguintes célu- las podem ser preferencialmente usadas: P3(P3x63Ag8.653) (J.
Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550); P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7); NS-1 (C.
Eur.
Immunol. (1976)6 (7), 511-519); MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415); SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270); FO (J.
Immunol.
Methods (1980) 35 (1-2), 1-21); S194/5.XX0.BU.1 (J.
Exp.
Med. (1978) 148 (1), 313-323); R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.
Fusões celulares entre os imunócitos e células de mieloma são essencialmente executadas usando métodos conhecidos, por exemplo, um método de Kohler e Milstein e outros (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46). Mais especificamente, a fusão celular pode ser executada, por exemplo, em um meio de cultura convencional na presença de um agente promotor de fusão celular.
Os agentes promotores de fusão incluem, por e- 5 xemplo, polietileno glicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ). Se necessário, uma substância auxiliar como sulfóxido de dimetila também é adicionada para aprimorar a eficiência da fusão.
A razão entre as células imunes e as células de mieloma pode ser determinada como desejado, de preferência, por exemplo, uma célula de mieloma para cada um a dez imunócitos.
Os meios de cultura a serem usa- dos para as fusões celulares incluem, por exemplo, meios que são adequa- dos para o cultivo de linhagens celulares de mieloma, como meio RPMI1640 e meio MEM, e outro meio de cultura convencional usado para este tipo de cultura celular.
Além disso, suplemento de soro como soro fetal de bovino (FSB) pode ser adicionado, de preferência, ao meio de cultura.
Para a fusão celular, quantidades predeterminadas das células imunes acima e células de mieloma são bem misturadas no meio de cultura acima.
A seguir, uma solução de PEG (por exemplo, o peso molecular médio é cerca de 1.000 a 6.000) pré-aquecida para cerca de 37°C é adicionada a isto a uma concentração de geralmente 30% a 60% (p/v). Isto é suavemente misturado para produzir as células de fusão desejadas (hibridomas). A se- guir, um meio de cultura adequado acima mencionado é adicionado gradu- almente às células, e ele é centrifugado repetidamente para remover o so- brenadante.
Desta forma, agentes de fusão celular e similares que são des- favoráveis para o crescimento do hibridoma podem ser removidos.
Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados por cultu- ra usando um meio seletivo convencional, por exemplo, meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Células diferentes dos hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas por cul- tura contínua no meio HAT acima por um período de tempo suficiente.
Tipi- camente, o período é vários dias a várias semanas.
A seguir, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos convencionais de diluição limitante.
Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados usando um meio de seleção com base no marcador de seleção possuído pelo mie- loma usado para a fusão celular.
Por exemplo, células deficientes em HG- 5 PRT ou TK podem ser selecionadas por cultura usando o meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Especifica- mente, quando as células de mieloma sensíveis a HAT são usadas para a fusão celular, as células fundidas de forma bem-sucedida com as células normais podem proliferar seletivamente no meio HAT.
Células diferentes dos hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas por cultura contínua no meio HAT acima por um período de tempo suficiente.
Especifi- camente, os hibridomas desejados podem ser selecionados por cultura ge- ralmente por vários dias até várias semanas.
A seguir, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos convencionais de diluição limitante.
Os anticorpos desejados podem ser, de preferência, seleciona- dos e clonados isoladamente por métodos de triagem com base na reação antígeno/anticorpo conhecida.
Por exemplo, um anticorpo monoclonal liga- ção a IL-6R pode se ligar a IL-6R expressa sobre a superfície celular.
Tal anticorpo monoclonal pode ser selecionado por seleção de célula ativada por fluorescência (FACS). O FACS é um sistema que avalia a ligação de um an- ticorpo a uma superfície celular pela análise das células colocadas em con- tato com um anticorpo fluorescente usando um feixe de laser, e medindo a fluorescência emitida pelas células individuais.
Para selecionar hibridomas que produzem um anticorpo mono- clonal da presente invenção por FACS, células que expressam IL-6R são primeiro preparadas.
As células preferencialmente usadas para a seleção são células de mamífero nas quais a IL-6R é expressa de forma forçada.
Como controle, a atividade de um anticorpo de se ligar a IL-6R da superfície celular pode ser detectada seletivamente usando células de mamífero não transformadas como células hospedeiras.
Especificamente, hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal anti-IL-6R podem ser isolados pela se-
leção de hibridomas que produzem um anticorpo que se liga às células for- çadas a expressar IL-6R, mas não às células hospedeiras.
Alternativamente, a atividade de um anticorpo de se ligar às cé- lulas que expressam IL-6R imobilizadas pode ser avaliada com base no 5 princípio do ELISA.
Por exemplo, células que expressam IL-6R são imobili- zadas aos poços de uma placa de ELISA.
Os sobrenadantes de cultura dos hibridomas são colocados em contato com as células imobilizadas nos po- ços, e os anticorpos que se ligam às células imobilizadas são detectados.
Quando os anticorpos monoclonais são derivados de camundongo, anticor- pos ligados às células podem ser detectados usando um anticorpo de imu- noglobulina anticamundongo.
Os hibridomas que produzem um anticorpo desejado que possui a capacidade de ligação ao antígeno são selecionados pela triagem acima, e eles podem ser clonados por um método de diluição limitante ou similares.
Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal assim prepa- rados podem ser subcultivados em um meio de cultura convencional, e ar- mazenados em nitrogênio líquido durante um longo período.
Os hibridomas acima são cultivados por um método convencio- nal, e os anticorpos monoclonais desejados podem ser preparados a partir dos sobrenadantes de cultura.
Alternativamente, os hibridomas são adminis- trados e cultivados em mamíferos compatíveis, e os anticorpos monoclonais são preparados a partir da ascite.
O método anterior é adequado para prepa- rar anticorpos com alta pureza.
Anticorpos codificados por genes de anticorpo que são clonados a partir de células que produzem anticorpos como os hibridomas acima tam- bém podem ser preferencialmente usados.
Um gene de anticorpo clonado é inserido em um vetor adequado, e ele é introduzido em um hospedeiro para expressar o anticorpo codificado pelo gene.
Os métodos para isolar genes de anticorpo, inserir os genes em vetores, e transformar células hospedeiras já foram estabelecidos, por exemplo, por Vandamme et al. (Eur.
Biochem. (1990) 192(3), 767-775). Métodos para produzir anticorpos recombinantes também são conhecidos, conforme descrito abaixo.
Por exemplo, um cDNA que codifica a região variável (região V) de um anticorpo anti-IL-6R é preparado a partir de células de hibridoma que expressam o anticorpo anti-IL-6R.
Para este propósito, o RNA total é primei- ro extraído dos hibridomas.
Os métodos usados para a extração de mRNAs 5 das células incluem, por exemplo: - o método de ultracentrifugação de guanidina (Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299), e - o método de AGPC (Anal.
Biochem. (1987) 162(1), 156-159) Os mRNAs extraídos podem ser purificados usando o kit de puri- ficação de mRNA (GE Healthcare Bioscience) ou similares.
Alternativamen- te, kits para extrair mRNA total diretamente das células, como o kit de purifi- cação de mRNA QuickPrep (GE Healthcare Bioscience) também são comer- cialmente disponíveis.
Os mRNAs podem ser preparados a partir de hibri- domas que usam tais kits.
Os cDNAs que codificam a região V do anticorpo podem ser sintetizados a partir dos mRNAs preparados usando uma trans- criptase reversa.
Os cDNAs podem ser sintetizados usando o kit de síntese de cDNA primeira fita de transcriptase reversa AMV (Seikagaku Co.) ou simi- lares.
Além disso, o kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech) e o método 5’-RACE baseado em PCR (Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) podem ser apropriadamente usados para sintetizar e amplificar cDNAs.
Em tal processo de síntese de cDNA, os sítios de enzima de restrição adequados descritos a seguir podem ser introduzidos em ambas as extremidades de um cDNA.
O fragmento de cDNA de interesse é purificado a partir do pro- duto de PCR resultante, e, então, ele é ligado a um DNA vetor.
O vetor re- combinante é então construído, e introduzido em E. coli ou similares.
Após seleção de colônia, o vetor recombinante desejado pode ser preparado a partir da E. coli formadora de colônia.
A seguir, testa-se se o vetor recombi- nante tem a sequência de nucleotídeos de cDNA de interesse por um méto- do conhecido como o método de terminação de cadeia com nucleotídeo di- desóxi.
O método 5’-RACE que usa iniciadores para amplificar o gene da região variável é usado convenientemente para isolar o gene que codifica a região variável.
Primeiro, uma biblioteca de cDNA 5’-RACE é construída por síntese de cDNA usando RNAs extraídos de células de hibridoma como um molde.
Um kit disponível para comercialização como o kit de amplifica- 5 ção de cDNA SMART RACE é usado apropriadamente para sintetizar a bi- blioteca de cDNA 5’-RACE.
O gene do anticorpo é amplificado por PCR usando a biblioteca de cDNA 5’-RACE preparada como um molde.
Iniciadores para amplificar o gene de anticorpo de camundongo podem ser projetados com base em se- quências do gene do anticorpo conhecidas.
As sequências de nucleotídeos dos iniciadores variam dependendo da subclasse de imunoglobulina.
Portan- to, é preferencial que a subclasse seja determinada com antecedência u- sando um kit disponível para comercialização como o kit para isotipagem de anticorpo monoclonal de camundongo Iso Strip (Roche Diagnostics). Especificamente, por exemplo, iniciadores que permitem a am- plificação de genes que codificam as cadeias pesadas γ1, γ2a, γ2b, e γ3 e as cadeias leves κ e γ são usados para isolar genes que codificam IgG de camundongo.
Em geral, um iniciador que anela a um sítio da região constan- te próximo da região variável é usado como um iniciador do lado 3’ para am- plificar um gene da região variável de IgG.
Entretanto, um iniciador ligado a um kit de construção da biblioteca de cDNA 5’ RACE é usado como um ini- ciador do lado 5’. Os produtos de PCR assim amplificados são usados para refor- mar as imunoglobulinas compostas de uma combinação de cadeias pesadas e leves.
Um anticorpo desejado pode ser selecionado usando a atividade de ligação de IL-6R de uma imunoglobulina reformada como um indicador.
Por exemplo, quando o objetivo é isolar um anticorpo contra IL-6R, é mais prefe- rencial que a ligação do anticorpo a IL-6R seja específica.
Um anticorpo liga- ção a IL-6R pode ser selecionado, por exemplo, por uma das seguintes eta- pas: (1) colocar uma célula que expressa IL-6R em contato com um anticorpo que compreende a região V codificada por um cDNA isolado de um hibridoma; (2) detectar a ligação do anticorpo à célula que expressa IL-6R; e (3) selecionar um anticorpo que se liga à célula que expressa 5 IL-6R.
Métodos para detectar a ligação de um anticorpo a células que expressam IL-6R são conhecidos.
Especificamente, a ligação de um anticor- po a células que expressam IL-6R pode ser detectada pelas técnicas descri- tas acima como FACS.
As amostras imobilizadas de células que expressam IL-6R são usadas apropriadamente para avaliar a atividade de ligação de um anticorpo.
Os métodos de triagem de anticorpos preferenciais que usam a atividade de ligação como um indicador incluem, também, métodos de sepa- ração usando vetores de fago.
Os métodos de triagem usando vetores de fago são vantajosos quando os genes de anticorpo são isolados a partir de bibliotecas das subclasses de cadeia pesada e cadeia leve de uma popula- ção de células que expressa um anticorpo policlonal.
Os genes que codifi- cam as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve podem ser ligados por uma sequência ligante adequada para formar um Fv de cadeia única (scFv). Os fagos que apresentam scFv na sua superfície podem ser produzi- dos por inserir um gene que codifica scFv em um vetor de fago.
Os fagos são colocados em contato com um antígeno de interesse.
Então, um codifi- cação de DNA scFv que tem a atividade de ligação de interesse pode ser isolado por coletar os fagos ligados ao antígeno.
Este processo pode ser repetido conforme necessário para enriquecer o scFv que tem a atividade de ligação de interesse.
Após o isolamento do cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-IL-6R de interesse, o cDNA é digerido com enzimas de restrição que reconhecem os sítios de restrição introduzidos em ambas as extremidades do cDNA.
As enzimas de restrição preferenciais reconhecem e clivam uma sequência de nucleotídeos que ocorre na sequência de nucleotídeos do ge- ne do anticorpo em uma baixa frequência.
Além disso, um sítio de restrição para uma enzima que produz uma extremidade adesiva é introduzido, de preferência, em um vetor para inserir um fragmento digerido de cópia única na orientação correta.
O cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-IL- 6R é digerido conforme descrito acima, e ele é inserido em um vetor de ex- 5 pressão adequado para construir um vetor de expressão do anticorpo.
Nes- se caso, se um gene que codifica a região constante do anticorpo (região C) e um gene que codifica a região V acima forem fundidos na estrutura na es- trutura, um anticorpo quimérico é obtido.
Na presente invenção, "anticorpo quimérico" significa que a origem da região constante é diferente daquela da região variável.
Desta forma, em adição aos anticorpos heteroquiméricos de camundongo/seres humanos, anticorpos aloquiméricos humano/humano estão incluídos nos anticorpos quiméricos da presente invenção.
Um vetor de expressão de anticorpo quimérico pode ser construído por inserir o gene da região V acima em um vetor de expressão que já tem a região constante.
Especificamente, por exemplo, uma sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição que corta o gene da região V acima pode ser apropria- damente colocada no lado 5’ de um vetor de expressão que transporta um DNA que codifica uma região constante (região C) desejada do anticorpo . Um vetor de expressão de anticorpo quimérico é construído por fundir na estrutura os dois genes digeridos com a mesma combinação de enzimas de restrição.
Para produzir um anticorpo monoclonal anti-IL-6R, os genes do anticorpo são inseridos em um vetor de expressão para que os genes sejam expressos sob o controle de uma região reguladora da expressão.
A região reguladora da expressão para expressão do anticorpo inclui, por exemplo, intensificadores e promotores.
Além disso, uma sequência de sinal adequa- da pode ser ligada à terminação amino para que o anticorpo expresso seja secretado para o lado de fora das células.
Nos exemplos descritos abaixo, um peptídeo que tem a sequência de aminoácidos MGWSCIILFLVATATG- VHS (SEQ ID NO: 113) pode ser usado como uma sequência de sinal.
En- tretanto, outras sequências de sinal adequadas podem ser ligadas.
O poli- peptídeo expresso é clivado na terminação carboxila da sequência acima, e o polipeptídeo resultante é secretado para o lado de fora das células como um polipeptídeo maduro.
Então, as células hospedeiras adequadas são transformadas com o vetor de expressão, e células recombinantes que ex- pressam o DNA que codifica o anticorpo anti-IL-6R são obtidas. 5 Os DNAs que codificam a cadeia pesada do anticorpo (cadeia H) e a cadeia leve (cadeia L) são inseridos separadamente em diferentes veto- res de expressão para expressar o gene do anticorpo.
Uma molécula de an- ticorpo que tem as cadeias H e L pode ser expressa por co-transfectar a mesma célula hospedeira com vetores nos quais os genes da cadeia H e da cadeia L são inseridos, respectivamente.
Alternativamente, as células hos- pedeiras podem ser transformadas com um único vetor de expressão no qual os DNAs que codificam as cadeias H e L são inseridos (consulte WO 1994/011523). Há várias combinações de célula hospedeira/vetor de expressão conhecidas para a preparação de anticorpos por introduzir genes de anticor- pos isolados em hospedeiros adequados.
Todos estes sistemas de expres- são são aplicáveis ao isolamento dos domínios de ligação ao antígeno da presente invenção.
As células eucarióticas adequadas usadas como células hospedeiras incluem células animais, células vegetais, e células fúngicas.
Especificamente, as células animais incluem, por exemplo, as seguintes cé- lulas. (1) células de mamífero: CHO, COS, mieloma, rim de hamster jovem (BHK), HeLa, Vero, rim embriônico humano (HEK) 293 ou similares; (2) células de anfíbio: oócitos de Xenopus, ou similares; e (3) células de inseto: sf9, sf21, Tn5, ou similares.
Além disso, como uma célula vegetal, um sistema de expressão gênica de anticorpo que usa células derivadas do gênero Nicotiana, como Nicotiana tabacum, é conhecido.
Células cultivadas do calo podem ser usa- das apropriadamente para transformar células vegetais.
Além disso, as seguintes células podem ser usadas como célu- las fúngicas: leveduras: o gênero Saccharomyces, como Saccharomyces se-
revisiae, e o gênero Pichia, como Pichia pastoris; e fungos filamentosos: o gênero Aspergillus, como Aspergillus ni- ger.
Além disso, os sistemas de expressão de genes de anticorpo 5 que utilizam células procarióticas também são conhecidos.
Por exemplo, quando se usa células bacterianas, células de E. coli, células de Bacillus subtilis, e similares, podem ser adequadamente utilizadas na presente in- venção.
Vetores de expressão transportando os genes de anticorpo de inte- resse são introduzidos nestas células por transfecção.
As células transfecta- das são cultivadas in vitro, e o anticorpo desejado pode ser preparado a par- tir da cultura de células transformadas.
Além das células hospedeiras descritas acima, animais transgê- nicos também podem ser usados para produzir um anticorpo recombinante.
Ou seja, o anticorpo pode ser obtido a partir de um animal no qual o gene que codifica o anticorpo de interesse é introduzido.
Por exemplo, o gene de anticorpo pode ser construído como um gene de fusão por inserção na estru- tura em um gene que codifica uma proteína produzida especificamente no leite. β-caseína de cabra ou similares pode ser usada, por exemplo, como a proteína secretada no leite.
Os fragmentos de DNA contendo o gene fundido inserido com o gene do anticorpo são injetados em um embrião de cabra, e, então, este embrião é introduzido em uma cabra fêmea.
Os anticorpos dese- jados podem ser obtidos como uma proteína fundida com a proteína do leite a partir do leite produzido pela cabra transgênica nascida da cabra receptora do embrião (ou sua progênie). Além disso, para aumentar o volume de leite contendo o anticorpo desejado produzido pela cabra transgênica, hormônios podem ser administrados à cabra transgênica, como necessário (Ebert, K.
M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702). Quando um complexo de polipeptídeo aqui descrito é adminis- trado a um ser humano, um domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo geneticamente recombinante que foi modificado artificialmente pa- ra reduzir a antigenicidade heteróloga contra um ser humano e similares, pode ser usada apropriadamente como o domínio de ligação ao antígeno do complexo.
Tais anticorpos geneticamente recombinantes incluem, por e- xemplo, anticorpos humanizados.
Estes anticorpos modificados são produzi- dos apropriadamente por métodos conhecidos.
Uma região variável do anticorpo usada para produzir o domínio 5 de ligação ao antígeno de um complexo de polipeptídeo aqui descrito é for- mada geralmente por três regiões determinantes de complementaridade (C- DRs) que são separadas por quatro regiões estruturais (FRs). A CDR é uma região que determina substancialmente a especificidade de ligação de um anticorpo.
As sequências de aminoácidos das CDRs são altamente diversas.
Por outro lado, as sequências de aminoácidos formadoras de FR têm fre- quentemente alta identidade mesmo entre anticorpos com diferentes especi- ficidades de ligação.
Portanto, geralmente, a especificidade de ligação de um determinado anticorpo pode ser introduzida em outro anticorpo por en- xertia de CDR.
Um anticorpo humanizado também é chamado de anticorpo hu- mano reformado.
Especificamente, os anticorpos humanizados preparados por enxertia da CDR de um anticorpo animal não humano, como um anticor- po de camundongo a um anticorpo humano e similares, são conhecidos.
Técnicas de engenharia genética comuns para se obter anticorpos humani- zados também são conhecidas.
Especificamente, por exemplo, PCR por ex- tensão de sobreposição é conhecida como um método para enxertar uma CDR de anticorpo de camundongo em uma FR humana.
Na PCR por exten- são de sobreposição, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma CDR de anticorpo de camundongo a ser enxertada é adicionada a iniciadores pa- ra sintetizar uma FR de anticorpo humano.
Os iniciadores são preparados para cada uma das quatro FRs.
Geralmente se considera que quando se enxerta uma CDR de camundongo em uma FR humana, selecionar uma FR humana que tem alta identidade a uma FR de camundongo é vantajoso para manter a função da CDR.
Ou seja, é geralmente preferencial usar uma FR humana que compreende uma sequência de aminoácidos que tem alta iden- tidade à sequência de aminoácidos da FR adjacente à CDR de camundongo a ser enxertada.
As sequências de nucleotídeos a serem ligadas são projetadas de modo a estarem conectadas umas às outras na estrutura.
As FRs huma- nas são sintetizadas individualmente usando os respectivos iniciadores.
Co- mo resultado, são obtidos produtos nos quais o DNA que codifica a CDR de 5 camundongo é ligado aos DNAs que codificam a FR individual.
Sequências de nucleotídeos que codificam a CDR de camundongo de cada produto são projetadas para que elas se sobreponham umas com as outras.
A seguir, uma reação de síntese de fita complementar é conduzida para anelar as re- giões CDR sobrepostas dos produtos sintetizados usando um gene de anti- corpo humano como molde.
As FRs humanas são ligadas através das se- quências de CDR de camundongo por esta reação.
O gene da região V de extensão completa, no qual três CDRs e quatro FRs são essencialmente ligadas, é amplificado usando iniciadores que anelam com a sua extremidade 5’ ou 3’, que são adicionados com se- quências de reconhecimento de enzimas de restrição adequadas.
Um vetor de expressão para um anticorpo humanizado pode ser produzido por inserir o DNA obtido conforme descrito acima e um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano em um vetor de expressão para que eles se liguem na estrutura.
Após o vetor recombinante ser transfectado para um hospedeiro para estabelecer as células recombinantes, as células recombinantes são cultivadas, e o DNA que codifica o anticorpo humanizado é expresso para produzir o anticorpo humanizado na cultura celular (vide publicação de Pa- tente europeia N° EP 239400 e Publicação de Patente internacional No.
WO 1996/002576). Por medir qualitativamente ou quantitativamente e avaliar a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo humanizado produzido conforme descrito acima, pode-se selecionar adequadamente FRs de anticorpo humano que permitem que as CDRs formem um sítio de ligação ao antígeno favorável quando ligados através das CDRs.
Os resíduos de aminoácido nas FRs po- dem ser substituídos como necessário, para que as CDRs de um anticorpo humano reformado formem um sítio de ligação ao antígeno adequado.
Por exemplo, mutações na sequência de aminoácidos podem ser introduzidas nas FRs por aplicar o método de PCR usado para enxertar uma CDR de camundongo em uma FR humana.
Mais especificamente, mutações parciais na sequência de nucleotídeos podem ser introduzidas em iniciadores que anelam à FR.
Mutações na sequência de nucleotídeos são introduzidas nas 5 FRs sintetizadas pelo uso de tais iniciadores.
As sequências de FR mutantes que possuem as características desejadas podem ser selecionadas median- te a medição e avaliação da atividade do anticorpo mutante com aminoácido substituído para se ligar ao antígeno pelo método acima mencionado (Can- cer Res. (1993) 53: 851-856). Alternativamente, os anticorpos humanos desejados podem ser obtidos pela imunização de animais transgênicos que possuem todo o reper- tório de genes de anticorpos humanos (consulte WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) por imunização com DNA.
Além disso, técnicas para preparar anticorpos humanos por se- paração usando bibliotecas de anticorpos humanos também são conhecidas.
Por exemplo, a região V de um anticorpo humano é expressa como um anti- corpo de cadeia única (scFv) na superfície do fago pelo método de apresen- tação em fago.
Os fagos que expressam um scFv que se liga ao antígeno podem ser selecionados.
A sequência de DNA que codifica a região V do anticorpo humano que se liga ao antígeno pode ser determinada através da análise dos genes dos fagos selecionados.
A sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno é determinada.
Um vetor de expressão é preparado por fundir a sequência da região V na estrutura com a sequência da região C de um anticorpo humano desejado, e inserir isto em um vetor de expressão adequado.
O vetor de expressão é introduzido em células adequadas para expressão, como aquelas descritas acima.
O anticorpo humano pode ser produzido por expressão do gene que codifica o anticorpo humano nas célu- las.
Estes métodos já são conhecidos (consulte WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388). Em adição às técnicas descritas acima, técnicas de clonagem de células B (identificação de cada sequência codificante do anticorpo, clona- gem e seu isolamento; uso na construção do vetor de expressão de modo a preparar cada anticorpo (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, em particular); e simila- res) tal como descrito em Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) 5 ou no WO 2008/081008 podem ser apropriadamente usadas para isolar os genes de anticorpo.
Sistema de numeração EU e sistema de numeração de Kabat De acordo com os métodos usados na presente invenção, as posições de aminoácido atribuídas à CDR e à FR do anticorpo são especifi- cadas de acordo com a numeração de Kabat (Sequences of Proteins of Im- munological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991)). Na presente invenção, quando uma molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, os aminoácidos da re- gião variável são indicados de acordo com o sistema de numeração de Ka- bat, enquanto os aminoácidos da região constante são indicados de acordo com o sistema de numeração EU com base nas posições de aminoácido de Kabat.
Condições de concentração de íon Condições de concentração de íon de metal Em uma modalidade da presente invenção, a concentração de íon se refere a uma concentração de íon de metal. "Íons de metal" se refere a íons de elementos do grupo I exceto hidrogênio tais como metais alcalinos e elementos do grupo cobre, elementos do grupo II tais como metais alcali- noterrosos e elementos do grupo zinco, elementos do grupo III exceto boro, elementos do grupo IV exceto carbono e silício, elementos do grupo VIII tal como grupo ferro e elementos do grupo platina, elementos pertencentes ao subgrupo A de grupos V, VI e VII, e elementos de metal tais como antimônio, bismuto e polônio.
Átomos de metal têm a propriedade de liberação de elé- trons de valência para se tornarem cátions.
Isso é referido como tendência à ionização.
Metais com tendência à ionização forte são considerados ser quimicamente atraentes.
Na presente invenção, íons de metal preferidos incluem, por e-
xemplo, íon de cálcio.
Íon de cálcio está envolvido em modulação de muitos fenômenos biológicos, incluindo contração de músculos tais como músculos esqueletal, liso e cardíaco; ativação de movimento, fagocitose e similar de leucócitos; ativação de mudança de formato, secreção e similar de plaque- 5 tas; ativação de linfócitos; ativação de mastócitos incluindo secreção de his- tamina; respostas celulares mediadas por receptor α de catecolamina ou receptor de acetilcolina; exocitose; liberação de substâncias transmissoras dos terminais de neurônio; e fluxo axoplásmico em neurônios.
Receptores de íon de cálcio intracelulares conhecidos incluem troponina C, calmodulina, parvalbumina e cadeia leve da miosina, que têm vários sítios de ligação de íon de cálcio e são acreditados ser derivados de uma origem comum em termos de evolução molecular.
Há também muitos motivos de ligação de cálcio conhecidos.
Tais motivos bem conhecidos incluem, por exemplo, do- mínios de caderina, EF-hand de calmodulina, domínio C2 de Proteína cinase C, domínio Gla de Fator IX de proteína de coagulação sanguínea, lectinas tipo C de receptor aciaroglicoproteína e receptor de ligação à manose.
Um domínio de receptores LDL, anexina, domínio tipo 3 de trombospondina e domínios tipo EGF.
Na presente invenção, quando o íon de metal é íon de cálcio, as condições de concentração de íon de cálcio incluem concentrações de íon de cálcio baixas e concentrações de íons de cálcio altas. "A atividade de li- gação varia dependendo das concentrações de íons de cálcio" significa que a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno varia devido à diferença nas condições entre concentrações de íon de cálcio baixa e alta.
Por exemplo, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser maior em uma concentração de íon de cálcio alta do que em uma concentração de íon de cálcio baixa.
Alternativamente, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser maior em uma concentração de íon de cálcio baixa do que uma concen- tração de íon de cálcio alta.
Aqui, a concentração de íon de cálcio alta não é particularmente limitada a um valor específico; no entanto, a concentração pode ser preferi-
velmente selecionada entre 100 µM e 10 mM.
Em outra modalidade, a con- centração pode ser selecionada entre 200 µM e 5 mM.
Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser selecionada entre 400 µM e 3 mM.
Em ainda outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 200 µM 5 e 2 mM.
Ainda, a concentração pode ser selecionada entre 400 µM e 1 mM.
Em particular, uma concentração selecionada entre 500 µM e 2,5 mM, que é próxima da concentração de íon de cálcio no plasma (sangue) in vivo, é pre- ferida.
Aqui, a concentração de íon de cálcio baixa não é particularmen- te limitada a um valor específico; no entanto, a concentração pode ser prefe- rivelmente selecionada entre 0,1 µM e 30 µM.
Em outra modalidade, a con- centração pode ser selecionada entre 0,2 µM e 20 µM.
Em ainda outra mo- dalidade, a concentração pode ser selecionada entre 0,5 µM e 10 µM.
Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser selecionada entre 1 µM e 5 µM.
Ainda, a concentração pode ser selecionada entre 2 µM e 4 µM.
Em particular, uma concentração selecionada entre 1 µM e 5 µM, que é pró- xima da concentração de cálcio ionizado em endossomos iniciais in vivo, é preferida.
Aqui, "a atividade de ligação a antígeno é menor em uma con- centração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta" significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mais fraca em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 0,1 µM e 30 µM do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 100 µM e 10 mM.
Preferivelmente, ela significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mais fraca em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 0,5 µM e 10 µM do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 200 µM e 5 mM.
Ela significa particularmente preferivelmente que a ativida- de de ligação a antígeno na concentração de íon de cálcio no endossomo inicial in vivo é mais fraca do que aquela na concentração de íon de cálcio no plasma in vivo; e especificamente, ela significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mais fraca em concen-
tração de íon de cálcio selecionada entre 1 µM e 5 µM do que em uma con- centração de íon de cálcio selecionada entre 500 µM e 2,5 mM.
Se a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mudada dependendo de concentrações de íon de metal pode 5 ser determinada, por exemplo, através do uso de métodos de medição co- nhecidos tais como aqueles descritos na seção "Atividade de Ligação" aci- ma.
Por exemplo, a fim de confirmar que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno se torna maior em uma concentra- ção de íon de cálcio alta do que em uma concentração de íon de cálcio bai- xa, a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno em concentrações de íon de cálcio baixas e altas é comparada.
Na presente invenção, a expressão "a atividade de ligação a an- tígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta" pode também ser expressa como "a ati- vidade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é maior em uma concentração de íon de cálcio alta do que em uma concentração de íon de cálcio baixa". Na presente invenção, "a atividade de ligação a antíge- no é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta" é algumas vezes escrita como "a habili- dade de ligação a antígeno é mais fraca em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta". Também, "a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de cálcio baixa é reduzida para ser menor do que aquela em uma concentração de íon de cálcio alta" pode ser escrita como "a habilidade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de cálcio baixa é tornada mais fraca do que em uma concentração de íon de cálcio alta". Quando determinando a atividade de ligação a antígeno, as condições outras que não concentração de íon de cálcio podem ser apropri- adamente selecionadas por aqueles versados na técnica e não são particu- larmente limitadas.
Por exemplo, a atividade pode ser determinada a 37°C em tampão HEPES.
Por exemplo, Biacore (GE Healthcare) ou similar pode ser usado para a determinação.
Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser avaliada fluindo o antígeno como um analito sobre um chip no qual a mo- lécula de ligação a antígeno é imobilizada.
Quando o antígeno é um antíge- no de membrana, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antí- 5 geno para o antígeno de membrana pode ser avaliada fluindo a molécula de ligação a antígeno como um analito sobre um chip no qual o antígeno é imo- bilizado.
Uma vez que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção é mais fraca em uma concentra- ção de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, a razão da atividade de ligação a antígeno entre concentrações de íon de cálcio baixa e alta não é particularmente limitada.
No entanto, a razão da KD (constante de dissociação) da molécula de ligação a antígeno para um antígeno em uma concentração de íon de cálcio baixa com relação à KD em uma concentração de íon de cálcio alta, isto é, o valor de KD (3 µM de Ca)/KD (2 mM de Ca), é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 10 ou mais e ainda mais preferivelmente 40 ou mais.
O limite superior do valor KD (3 µM de Ca)/KD (2 mM de Ca) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor tal como 400, 1000 ou 10000 contanto que a molécula possa ser produzida através de técnicas conhecidas daqueles versados na técnica.
Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a KD (constante de dissociação) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antí- geno.
Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, KD apa- rente (constante de dissociação aparente) pode ser usada para representar a atividade.
KD (constante de dissociação) e KD aparente (constante de dis- sociação aparente) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE healthca- re), gráfico Scatchard ou citometria de fluxo.
Alternativamente, por exemplo, a constante de taxa de dissocia- ção (kd) pode ser também preferivelmente usada como um índice para re- presentar a razão da atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção entre concentrações de cálcio baixa e alta.
Quando a constante de taxa de dissociação (kd) é usada ao invés da constante de dissociação (KD) como um índice para representar a razão de atividade de ligação, a razão da constante da taxa de dissociação (kd) entre 5 concentrações de cálcio baixa e alta, isto é, o valor de kd (concentração de cálcio baixa)/kd (concentração de cálcio alta), é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, mais preferivelmente ainda 10 ou mais, e ainda mais preferivelmente 30 ou mais.
O limite superior do valor de Kd (concentração de cálcio baixa)/kd (concentração de cálcio alta) não é parti- cularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 50, 100 ou 200 con- tanto que a molécula possa ser produzida através de técnicas conhecidas daqueles versados na técnica.
Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a kd (constante da taxa de dissociação) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antígeno.
Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, a kd aparente (constante da taxa de dissociação aparente) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antígeno.
A kd (constante da taxa de dissociação) e a kd aparente (constante da taxa de dissociação aparente) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE healthcare) ou citometria de fluxo.
Na presente invenção, quando a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é determinada em concentrações de íon de cálcio diferentes, é preferível usar as mesmas condições exceto para concentrações de cálcio.
Por exemplo, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cu- ja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpo incluindo as etapas de: (a) determinação da atividade de ligação a antígeno de um do- mínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de cálcio baixa;
(b) determinação da atividade de ligação a antígeno de um do- mínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de cálcio alta; e (c) seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo 5 cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de cál- cio baixa do que em uma concentração de cálcio alta.
Além disso, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpo, ou uma biblioteca dos mes- mos, incluindo as etapas de: (a) contato de um antígeno com um domínio de ligação a antí- geno ou anticorpo ou uma biblioteca do mesmo em uma concentração de cálcio alta; (b) incubação em uma concentração de cálcio baixa de um do- mínio de ligação a antígeno ou anticorpo que se ligou ao antígeno na etapa (a); e (c) isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo dissociado na etapa (b). Ainda, o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja ativi- dade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa que aquela em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através de avaliação de domínios ou anticorpos de ligação a antígeno, ou uma biblioteca dos mes- mos, incluindo as etapas de: (a) contato de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos em uma concentração de cálcio baixa; (b) seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que não se liga ao antígeno na etapa (a); (c) permitir que o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo se- lecionado na etapa (c) se ligue ao antígeno em uma concentração de cálcio alta; e (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que se ligou ao antígeno na etapa (c). Ainda, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja ativi- 5 dade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modali- dade da presente invenção, pode ser obtido através de um método de avali- ação compreendendo as etapas de: (a) contato em uma concentração de cálcio alta de uma bibliote- ca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos com uma coluna na qual um antígeno é imobilizado; (b) eluição de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que se ligou à coluna na etapa (a) da coluna em uma concentração de cálcio baixa; e (c) isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo e- luído na etapa (b). Ainda, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja ativi- dade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que aquela em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de: (a) permitir em uma concentração de cálcio baixa que uma bibli- oteca de domínio de ligação a antígeno ou anticorpos passe por uma coluna na qual um antígeno é imobilizado; (b) coleta de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que foi eluído sem ligação à coluna na etapa (a); (c) permitir que o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo co- letado na etapa (b) se ligue ao antígeno em uma concentração de cálcio alta; e (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que se ligou ao antígeno na etapa (c). Além disso, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de: 5 (a) contato de um anticorpo com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de cálcio alta; (b) obtenção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que se ligou ao antígeno na etapa (a); (c) incubação em uma concentração de cálcio baixa do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo obtido na etapa (b); e (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno na etapa (c) é mais fraca do que o crité- rio para a seleção da etapa (b). As etapas descritas acima podem ser repetidas duas ou mais vezes.
Desta maneira, a presente invenção provê domínios de ligação a an- tígeno ou anticorpos cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, os quais são obtidos através de métodos de avaliação que com- preendem ainda a etapa de repetição duas ou mais vezes das etapas (a) a (c) ou (a) a (d) nos métodos de avaliação descritos acima.
O número de ci- clos das etapas (a) a (c) ou (a) a (d) não é particularmente limitado, mas ge- ralmente é 10 ou menos.
Nos métodos de avaliação da presente invenção, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de cálcio baixa não é particularmente limitada, contanto que ela seja uma atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizado entre 0,1 µM e 30 µM, mas preferivelmente seja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizada entre 0,5 µM e 10 µM.
Mais preferivelmente, ela é uma atividade de ligação a antígeno na concentração de cálcio ionizado no endossomo inicial in vivo, especificamen- te entre 1 µM e 5 µM.
No entanto, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de cálcio alta não é particularmente limitada, contanto que ela seja uma atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizada entre 100 µM e 10 mM, mas preferivelmente seja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizada entre 200 µM e 5 mM.
Mais preferivelmente, 5 ela é uma atividade de ligação a antígeno na concentração de cálcio ioniza- da em plasma in vivo, especificamente entre 0,5 mM e 2,5 mM.
A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo pode ser medida através de métodos conhecidos da- queles versados na técnica.
Condições que não a concentração de cálcio ionizado podem ser determinadas por aqueles versados na técnica.
A ativi- dade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticor- po pode ser avaliada como uma constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD aparente), constante de taxa de dissociação (kd), constante de dissociação aparente (kd) aparente e similar.
Essas po- dem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou FACS.
Na presente invenção, a etapa de seleção de um domínio de li- gação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é maior em uma concentração de cálcio alta do que em uma concentração de cálcio baixa é sinônimo da etapa de seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concen- tração de cálcio baixa do que em uma concentração de cálcio alta.
Embora a atividade de ligação a antígeno seja maior em uma concentração de cálcio alta do que em uma concentração de cálcio baixa, a diferença na atividade de ligação a antígeno entre concentrações de cálcio alta e baixa não á particularmente limitada; no entanto, a atividade de liga- ção a antígeno em uma concentração de cálcio alta é preferivelmente duas vezes ou mais, mais preferivelmente 10 vezes ou mais e ainda mais preferi- velmente 40 vezes ou mais do que em uma concentração de cálcio baixa.
Os domínios de ligação a antígeno ou anticorpos da presente in- venção a serem avaliados através dos métodos de avaliação descritos aci-
ma podem ser quaisquer domínios de ligação a antígeno e anticorpos.
Por exemplo, é possível avaliar os domínios de ligação a antígeno e anticorpos descritos acima.
Por exemplo, domínios de ligação a antígeno ou anticorpos tendo sequências naturais ou sequências de aminoácido substituídas podem 5 ser avaliados.
Bibliotecas Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígeno ou anti- corpo da presente invenção pode ser obtido de uma biblioteca que é princi- palmente composta de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de liga- ção a antígeno têm pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a ativi- dade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependen- do das concentrações de íon.
As concentrações de íon incluem preferivel- mente, por exemplo, concentração de íon de metal e concentração de íon de hidrogênio.
Aqui, uma "biblioteca" se refere a uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno ou uma pluralidade de polipeptídeos de fusão conten- do moléculas de ligação a antígeno ou ácidos nucleicos ou polinucleotídeos codificando suas sequências.
As sequências de uma pluralidade de molécu- las de ligação a antígeno ou uma pluralidade de polipeptídeos de fusão con- tendo moléculas de ligação a antígeno em uma biblioteca não são idênticas, mas são diferentes uma das outras.
Aqui, a expressão "sequências são diferentes umas das outras" na expressão "uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras" significa que as sequências de moléculas de ligação a antígeno em uma biblioteca são diferentes umas das outras.
Especificamente, em uma biblioteca, o número de sequências dife- rentes umas das outras reflete o número de clones independentes com se- quências diferentes e pode também ser referido como "tamanho da bibliote- ca". O tamanho da biblioteca de uma biblioteca de exibição de fago conven- cional varia de 106 a 1012. O tamanho da biblioteca pode ser aumentado até 1014 através do uso de técnicas conhecidas tal como exibição de ribossomo.
No entanto, o número real de partículas de fago usadas em seleção por "se- paração" de uma biblioteca de fago é em geral 10-10000 vezes maior do que o tamanho da biblioteca.
Essa multiplicidade em excesso é também referida como "o número de equivalentes de biblioteca" e significa que há 10 a 5 10.000 clones individuais que têm mesma sequência de aminoácido.
Desta maneira, na presente invenção, a expressão "sequências são diferentes u- mas das outras" significa que as sequências de moléculas de ligação a antí- geno independentes em uma biblioteca, excluindo equivalentes de bibliote- ca, são diferentes umas das outras.
Mais especificamente, o acima significa que há 106 a 1014 moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras, preferivelmente 107 a 102 moléculas, mais prefe- rivelmente 108 a 1011 moléculas e particularmente preferivelmente 108 a 1010 moléculas cujas sequências são diferentes umas das outras.
Aqui, a expressão "uma pluralidade de" na expressão "uma bi- blioteca composta principalmente de uma pluralidade de moléculas de liga- ção a antígeno" geralmente se refere a, no caso de, por exemplo, moléculas de ligação a antígeno, polipeptídeos de fusão, moléculas de polinucleotídeo, vetores ou vírus da presente invenção, um grupo de dois ou mais tipos da substância.
Por exemplo, quando duas ou mais substâncias são diferentes umas das outras em uma característica particular, isso significa que há dois ou mais tipos da substância.
Tais exemplos podem incluir, por exemplo, a- minoácidos mutantes observados em posições de aminoácido específicas em uma sequência de aminoácido.
Por exemplo, quando há duas ou mais moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são substancialmente iguais ou preferivelmente iguais exceto pelos resíduos fle- xíveis ou exceto pelos aminoácidos mutantes particulares em posições hi- pervariáveis expostas na superfície, há uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção.
Em outro exemplo, quando há du- as ou mais moléculas de polinucleotídeo cujas sequências são substancial- mente iguais ou preferivelmente iguais exceto pelos nucleotídeos codifican- do resíduos flexíveis ou nucleotídeos codificando aminoácidos mutantes de posições hipervariáveis expostos sobre a superfície, há uma pluralidade de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção.
Ainda, aqui, a expressão "composta principalmente de" na ex- pressão "uma biblioteca composta principalmente de uma pluralidade de mo- léculas de ligação a antígeno" reflete o número de moléculas de ligação a 5 antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das concen- trações de íon, dentre clones independentes com sequências diferentes em uma biblioteca.
Especificamente, é preferível que haja pelo menos 104 molé- culas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação em uma biblioteca.
Mais preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente inven- ção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca contendo pelo menos 105 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação.
Mais preferi- velmente ainda, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca contendo pelo menos 106 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação.
Particularmente preferivel- mente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca contendo pelo menos 107 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação.
Ainda mais preferivelmen- te, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obti- dos de uma biblioteca contendo pelo menos 108 moléculas de ligação a antí- geno tendo tal atividade de ligação.
Alternativamente, isso pode ser também preferivelmente expresso como a razão do número de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das con- centrações de íon com relação ao número de clones independentes tendo sequências diferentes em uma biblioteca.
Especificamente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma bibliote- ca em que moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação são responsáveis por 0,1% a 80%, preferivelmente 50% a 60%, mais prefe- rivelmente 1% a 40%, ainda mais preferivelmente 2% a 20% e particular- mente preferivelmente 4% a 10% de clones independentes com sequências diferentes na biblioteca.
No caso de polipeptídeos de fusão, moléculas de polinucleotídeo ou vetores, expressões similares podem ser possíveis usan- do o número de moléculas ou a razão do número total de moléculas.
No ca-
so de vírus, expressão similar pode também ser possível usando o número de vírions ou a razão para número total de vírions.
Aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de domínios de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon. 5 Domínios de ligação a antígeno ou anticorpos da presente in- venção a serem avaliados através dos métodos de avaliação descritos aci- ma podem ser preparados de qualquer maneira.
Por exemplo, quando o íon de metal é íon de cálcio, é possível usar anticorpos preexistentes, bibliotecas preexistentes (biblioteca de fago, etc), anticorpos ou bibliotecas preparados a partir de hibridomas obtidos através da imunização de animais ou a partir de células D de animais imunizados, anticorpos ou bibliotecas obtidos atra- vés da introdução de aminoácidos capazes de quelação de cálcio (por e- xemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não naturais nos anticorpos ou bibliotecas descritos acima (aminoácidos quelatá- veis com cálcio (tais como ácido aspártico e ácido glutâmico), bibliotecas com teor alto de aminoácidos não naturais, bibliotecas preparadas através da introdução de aminoácidos quelatáveis com cálcio (tais como ácido as- pártico e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não naturais em posi- ções particulares ou similar.
Exemplos dos aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentra- ções de íon conforme descrito acima podem ser quaisquer tipos de aminoá- cidos contanto que os aminoácidos formem um motivo de ligação de cálcio.
Motivos de ligação de cálcio são bem conhecidos daqueles versados na téc- nica e foram descritos em detalhes (por exemplo, Springer e outros (Cell (2000) 102, 275-277); Kawasaki e Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305- 490); Moncrief e outros (J.
Mol.
Evol. (1990) 30, 522-562); Chauvaux e ou- tros (Biochem.
J. (1990) 265, 261-265); Bairoch e Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419); Schaefer e outros (Ge- nomics (1995) 25, 638-643); Economou e outros (EMBO J. (1990) 9, 349- 354); Wurzburg e outros (Structure (2006) 14, 6, 1049-1058)). Especifica- mente, quaisquer motivos de ligação de cálcio conhecidos, incluindo lecitinas tipo C tais como ASGPR, CD23, MBR e DC-SIGN, podem ser incluídos em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção.
Exemplos preferidos de tais motivos de ligação de cálcio preferidos também incluem, em adição àqueles descritos acima, por exemplo, o motivo de ligação de cálcio no do- 5 mínio de ligação de antígeno de SEQ ID NO: 4. Ainda, como aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentra- ções de íon de cálcio, por exemplo, aminoácidos tendo atividade de quela- ção de metal podem ser também preferivelmente usados.
Exemplos de tais aminoácidos de quelação de metal incluem, por exemplo, serina (Ser(S)), treonina (Thr(R)), asparagina (Asn(N)), glutamina (Gln(Q)), ácido aspártico (Asp(D)) e ácido glutâmico (Glu(E)). As posições nos domínios de ligação a antígeno nos quais os aminoácidos descritos acima estão contidos não são particularmente limita- das a posições particulares e podem ser quaisquer posições dentro da regi- ão variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve que forma um domínio de ligação a antígeno, contanto que elas alterem a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio.
Especificamente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequên- cias são diferentes umas das outras e cujos domínios de ligação a antígeno de cadeia pesada contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentra- ções de íon de cálcio.
Em outra modalidade, os domínios de ligação a antí- geno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios CDR3 de cadeia pesada con- têm os aminoácidos mencionados acima.
Em ainda outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios CDR3 de cadeia pesada contêm os aminoácidos mencionados acima nas posições 95, 96, 100a e/ou 101 conforme indicado de acordo com o sistema de numera- ção Kabat.
Entretanto, em uma modalidade da presente invenção, os domí- 5 nios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antí- geno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de ligação a antígeno de cadeia leve contêm aminoácidos que alteram a ativi- dade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo de concentrações de íon de cálcio.
Em outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR1 de cadeia leve contêm os aminoácidos mencionados acima.
Em ainda outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR1 de cadeia leve contêm os aminoácidos menciona- dos acima nas posições 30, 31 e/ou 32 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
Em outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da pre- sente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmen- te de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR2 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção provê bibliotecas compostas principalmente de moléculas de liga- ção a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR2 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido men- cionados acima na posição 50 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma bi-
blioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR3 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima.
Em uma modalidade alternativa, domínios de ligação a antígeno da presente 5 invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CD3 de cadeia leve contêm os resíduos de ami- noácido mencionados acima na posição 92 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
Ainda, em uma modalidade diferente da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e em que duas ou três CDRs selecionadas de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve descritas acima contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima.
Além disso, os do- mínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujas cadeias leves con- têm os resíduos de aminoácido mencionados acima em qualquer uma ou mais de posições 30, 31, 32, 50 e/ou 92 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
Em uma modalidade particularmente preferida, as sequências de estrutura principal da região variável de cadeia leve e/ou cadeia pesada de uma molécula de ligação a antígeno contêm preferivelmente sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana.
Desta maneira, em uma modalidade da presente invenção, quando as sequências de estrutura prin- cipal são sequências completamente humanas, é esperado que quando tal molécula de ligação a antígeno da presente invenção for administrada a se- res humanos (por exemplo, para tratar doenças), ela induza pouca ou ne- nhum resposta imunogênica.
No sentido acima, a expressão "contendo uma sequência de linhagem germinativa" na presente invenção significa que uma parte das sequências de estrutura principal da presente invenção é idêntica a uma parte de quaisquer sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana.
Por exemplo, quando a sequência FR2 de cadeia pe- sada de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção é uma combinação de sequências de FR2 de cadeia pesada de sequências de es- 5 trutura principal de linhagem germinativa humana diferentes, tal molécula é também uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção "conten- do uma sequência de linhagem germinativa". Exemplos preferidos das estruturas principais incluem, por e- xemplo, sequências de região de estrutura principal integralmente humanas atualmente conhecidas, que estão incluídas no website da V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) o outros.
Essas sequências de região de estrutura principal podem ser apropriadamente usadas como uma sequência de linhagem germinativa contida em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção.
As sequências de linhagem germinativa podem ser cate- gorizadas de acordo com sua similaridade (Tomlinson e outros, (J.
Mol.
Biol. (1992) 227, 776-798); Williams e Winter (Eur.
Immunol. (1993) 23, 1456- 1461); Cox e outros (Nat.
Genetics (1994) 7, 162-168)). Sequências de li- nhagem germinativa apropriadas podem ser selecionadas de Vk, que é a- grupada em sete subgrupos: Vλ, que é agrupada em dez subgrupos; e VH, que é agrupada em sete subgrupos.
Sequências de VH integralmente humanas preferivelmente in- cluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, sequências VH de: subgrupo VH1 (por exemplo, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58 e VH1-69); subgrupo VH2 (por exemplo, VH2-5, VH2-26 e VH2-70); subgrupo VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3- 16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 e VH3-74); subgrupo VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-39, VH4-59 e VH4-61); subgrupo VH5 (VH5-51); subgrupo VH6 (VH6-1); e subgrupo VH7 (VH7-4 e VH7-81). Essas são também descritas em documentos conhecidos (Mat- suda e outros, (J.
Exp.
Med. (1998) 188, 1973-1975) e similar e então, pes- soas versadas na técnica podem apropriadamente projetar moléculas de 5 ligação a antígeno da presente invenção com base na informação dessas sequências.
É também preferível usar outras estruturas principais ou sub- regiões de estrutura principal integralmente humanas.
Sequências Vk integralmente humanas incluem preferivelmente, mas não estão limitadas a, por exemplo: A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 e O18 agrupados em subgrupo Vk1; A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1 E O11 agrupadas em subgrupo Vk2; A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20 e L25 agrupadas em subgrupo Vk3; B3 agrupada em subgrupo Vk4; B2 (aqui também referida como Vk5-2) agrupada em subgrupo Vk5; e A10, A14 e A26 agrupadas em subgrupo Vk6 (Kawasaki e outros (Eur.
Immunol. (2001) 31, 1017-1028); Schable e Zachau (Biol.
Chem.
Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022); Bre- sing-Kuppers e outros (Gene (1997) 191, 173-181). Sequências de VL integralmente humanas preferivelmente inclu- em, mas não estão limitadas a, por exemplo: V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20 e V1-22 agrupados em subgrupo VL1; V2-1, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 e V2-19 agrupadas no subgrupo VL1; V3-2, V3-3 e V3-4 agrupadas em subgrupo VL3; V4-1, V4-2, V4-3, V4-4 e V4-6 agrupados no subgrupo VL4; e V5-1, V5-2, V5-4 e V5-6 agrupadas no subgrupo VL5 (Kawasaki e outros (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).
Normalmente, essas sequências de estrutura principal são dife- rentes umas das outras em um ou mais resíduos de aminoácido.
Essas se- quências de estrutura principal podem ser usadas em combinação com "pelo menos um resíduo de aminoácido" que altera a atividade de ligação a antí- 5 geno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das concentra- ções de íon" da presente invenção.
Outros exemplos das estruturas princi- pais integralmente humanas usadas em combinação com "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon" da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (por exemplo, Kabat e outros (1991) supra; Wu e outros (J.
Exp.
Med. (1970) 132, 211-250)). Sem desejar ser limitado a nenhuma teoria particular, uma razão para a expectativa que o uso de sequências de linhagem germinativa pre- cluda respostas imunes adversas na maioria dos indivíduos é acreditada ser como segue.
Como um resultado do processo de maturação por afinidade durante respostas imunes normais, mutação somática ocorre frequentemen- te nas regiões variáveis de imunoglobulina.
Tais mutações ocorrem princi- palmente em torno das CDRs cujas sequências são hipervariáveis, mas também afetam resíduos de regiões de estrutura principal.
Tais mutações de estrutura principal não existem nos genes da linhagem germinativa, e tam- bém elas são menos prováveis de ser imunogênicas em pacientes.
Por outro lado, a população humana normal é exposta à maioria das sequências de estrutura principal expressas a partir dos genes de linhagem germinativa.
Como um resultado de imunotolerância, essas estruturas principais de linha- gem germinativa são esperadas ter imunogenicidade baixa ou nenhuma em pacientes.
Para maximizar a possibilidade de imunotolerância, genes de co- dificação de região variável podem ser selecionados de um grupo de genes de linhagem germinativa funcional de ocorrência comum.
Métodos comuns tais como mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados para produzir moléculas de ligação a antígeno da presente invenção em que as sequências de estrutura principal descritas acima contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antíge- no dependendo das concentrações de íon de cálcio. 5 Por exemplo, uma biblioteca que contém uma pluralidade de mo- léculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser construída combinando regiões variá- veis de cadeia pesada preparada como uma biblioteca de sequência de re- gião variável aleatorizada com uma região variável de cadeia leve selecio- nada como uma sequência de estrutura principal originalmente contendo pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio.
Como um exemplo não limitante, quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, tais bibliotecas preferidas incluem, por exemplo, aquelas construídas através da combinação da sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 4 (Vk5-2) e a região variável de cadeia pesada produzida como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada.
Alternativamente, uma sequência de região variável de cadeia leve selecionada como uma região de estrutura principal contendo original- mente pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de liga- ção a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno conforme acima mencionado pode ser projetada para conter vários resíduos de aminoácido que não os resíduos de aminoácido acima.
Aqui, tais resíduos são referidos como resíduos flexíveis.
O número e a posição de resíduos flexíveis não são particularmente limitados, contanto que a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo de concentrações de íon.
Especificamente, as sequências de CDR e/ou se- quências de FR da cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis.
Por exemplo, quando a concentração de íon é con- centração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia leve de SEQ
ID NO: 4 (Vk5-2) incluem os resíduos de aminoácido listados na Tabela 1 ou
2. Tabela 1
Tabela 2
Aqui, resíduos flexíveis se referem a variações de resíduo de aminoácido presentes em posições hipervariáveis nas quais vários aminoá- 5 cidos diferentes estão presentes nas regiões variáveis de cadeia leve e ca- deia pesada quando as sequências de aminoácido de anticorpos conhecidos e/ou nativos ou domínios de ligação a antígeno são comparadas.
Posições hipervariáveis estão em geral localizadas nas regiões de CDR.
Em uma mo- dalidade, os dados providos por Kabat, Sequences of Proteins of Immunolo- gical Interest (National Institute of Health Bethesda, Md.) (1987 e 1991) são úteis para determinar posições hipervariáveis em anticorpos conhecidos ou nativos.
Ainda, banco de dados na internet (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) provê as sequências coletadas de muitas cadeias leves e cadeias pesadas humanas e suas localizações.
A informação sobre as sequências e localizações é útil para determinar posi- ções hipervariáveis na presente invenção.
De acordo com a presente inven- ção, quando uma certa posição de aminoácido tem preferivelmente cerca de 5 20 a cerca de 20 variações de resíduo de aminoácido possíveis, preferivel- mente cerca de 3 a cerca de 19, preferivelmente cerca de 4 a cerca de 18, preferivelmente 5 a 17, preferivelmente 6 a 16, preferivelmente 7 a 15, prefe- rivelmente 8 a 14, preferivelmente 9 a 13 e preferivelmente 10 a 12 varia- ções de resíduo de aminoácido possíveis, a posição é hipervariável.
Em al- gumas modalidades, uma certa posição de aminoácido pode ter preferivel- mente pelo menos cerca de 2, preferivelmente pelo menos cerca de 4, prefe- rivelmente pelo menos cerca de 6, preferivelmente pelo menos cerca de 8, preferivelmente cerca de 10 e preferivelmente cerca de 12 variações de re- síduo de aminoácido.
Alternativamente, uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser construída combinando regiões variá- veis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de re- gião variável aleatorizada com regiões variáveis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentra- ções de íon conforme mencionado acima é introduzido.
Quando a concen- tração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem, por exemplo, bibliotecas em que regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada são combinadas com sequências de região variável de cadeia leve em que um resíduo(s) particular em uma sequência de linhagem germinativa tal como SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) ou SEQ ID NO: 8 (Vk4) foi substituído com pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo de concentrações de íon de cálcio.
E- xemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido em CDR1 de cadeia leve.
Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido em CDR2 de ca- deia leve.
Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido também incluem resíduos de aminoácido na CDR3 de cadeia leve. 5 Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido conti- dos em CDR1 de cadeia leve incluem aqueles nas posições 30, 31 e/ou 32 na CDR1 de região variável de cadeia leve conforme indicado por numera- ção EU.
Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido con- tidos na CDR2 de cadeia leve incluem um resíduo de aminoácido na posição 50 na CDR2 de região variável de cadeia leve conforme indicado por nume- ração Kabat.
Além disso, exemplos não limitantes de tais resíduos de ami- noácido contidos na CDR3 de cadeia leve incluem um resíduo de aminoáci- do na posição 92 na CDR3 de região variável de cadeia leve conforme indi- cado por numeração Kabat.
Os resíduos de aminoácido podem estar conti- dos sozinhos ou em combinação contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio e/ou contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno varie dependendo das concentrações de íon de cálcio.
Entretanto, como troponina C, calmodulina, parvalbumina e cadeia leve da miosina, que têm vários sítios de ligação de íon de cálcio e são a- creditados ser derivadas de uma origem comum em termos de evolução mo- lecular, são conhecidas, a CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve pode ser projetada para ter seus motivos de ligação.
Por exemplo, é possível usar domínios de caderina, EF hand de calmodulina, domínio C2 de Proteína Ci- nase C, domínio Gla de Fator IX de proteína de coagulação de sangue, lec- tinas tipo C de receptor de aciaroglicoproteína e receptor de ligação de ma- nose, domínios A de receptores de LDL, anexina, domínio tipo 3 da trom- bospodina e domínios tipo EGF de uma maneira apropriada para os propósi- tos acima.
Quando regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada e regiões variá- veis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antí-
geno dependendo das concentrações de íon foi introduzido são combinadas conforme descrito acima, as sequências das regiões variáveis de cadeia leve podem ser projetadas para conter resíduos flexíveis da mesma maneira que descrito acima.
O número e a posição de tais resíduos flexíveis não são par- 5 ticularmente limitados às modalidades particulares contanto que a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno da presente in- venção varie dependendo das concentrações de íon.
Especificamente, as sequências de CDR e/ou sequências FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis.
Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexí- veis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia leve incluem os resíduos de aminoácido listados nas Tabelas 1 e 2. As regiões variáveis de cadeia pesada preferidas a serem com- binadas incluem, por exemplo, bibliotecas de região variável aleatorizadas.
Métodos conhecidos são combinados conforme apropriado para produzir uma biblioteca de região variável aleatorizada.
Em uma modalidade não limi- tante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo derivados de linfócitos de animais imunizados com um antígeno específico, pacientes com infecções, pessoas com um título de an- ticorpo elevado no sangue como um resultado de vacinação, pacientes com câncer ou pacientes com doença autoimune, pode ser preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.
Em outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca sintética produzida substituindo as sequências de CDR de genes V em DNA genômico ou genes V remodelados funcionais com um conjunto de oligonucleotídeos sintéticos contendo sequências codificando conjuntos de códon de um comprimento apropriado pode ser também preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.
Neste caso, uma vez que diversidade de sequência é observada na sequência de CDR3 de cadeia pesada, é também possível substituir a sequência de CDR3 apenas.
Um critério de concessão de origem à diversidade em aminoácidos na região variável de uma molécula de ligação a antígeno é que esta diversidade é dada a resíduos de aminoácido em posições de superfície exposta na molé- cula de ligação a antígeno.
A posição de superfície exposta se refere a uma posição que é considerada ser capaz de ser exposta na superfície e/ou con- tatada com um antígeno, com base em estrutura, conjunto de estruturas e/ou 5 estrutura modelada de uma molécula de ligação a antígeno.
Em geral, tais posições são CDRs.
Preferivelmente, posições de superfície exposta são determinadas usando coordenada de um modelo tridimensional de uma mo- lécula de ligação a antígeno usando um programa de computador tal como o programa InsightII (Accelrys). Posições de superfície exposta podem ser de- terminadas usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (J.
Mol.
Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J.
Appl.
Cryst. (1983) 16, 548-558)). Determinação de posições de superfície exposta pode ser realizada usando software adequado para modelagem de proteína e infor- mação estrutural tridimensional obtida de um anticorpo.
O software que pode ser usado para esses propósitos preferivelmente inclui SYBYL Biopolymer Module software (Tripos Associates). Em geral ou preferivelmente, quando um algoritmo requer um parâmetro de tamanho de registro de usuário, o "tamanho" de uma sonda que é usada no cálculo é ajustado em cerca de 1,4 Angstroms ou menor em raio.
Ainda, métodos para determinação de regiões e áreas de superfície exposta usando software para computadores pessoais são descritos por Pacios (Compu.
Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J.
Mol.
Mo- del. (1995) 1, 46-53). Em outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca pura, que é construída a partir de genes de anticorpo derivados de linfócitos de pessoas saudáveis e cujo repertório consiste em sequências puras, que são sequências de anticorpo sem nenhuma predisposição, pode ser também particularmente preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada (Gejima e outros (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso e outros (Scand, J.
Immunol. (2000) 51, 337-344). Aqui, uma sequência de aminoácido compreendendo uma sequência nativa se refere a uma sequência de aminoácido obtida de tal biblioteca pura.
Em uma modalidade da presente invenção, um domínio de liga-
ção a antígeno da presente invenção pode ser obtido a partir de uma biblio- teca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da pre- sente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras, prepara- das através da combinação de regiões variáveis de cadeia leve construídas 5 como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com uma região variável de cadeia pesada selecionada como uma sequência de es- trutura principal que contém originalmente "pelo menos um resíduo de ami- noácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo de concentrações de íon". Quando a con- centração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem preferivelmente aquelas construídas através de combinação de regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma bi- blioteca de sequência de região variável aleatorizada com a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) ou SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1). Alternativamente, tal biblioteca pode ser constru- ída através de seleção de regiões variáveis de cadeia leve apropriadas a partir daquelas tendo sequências de linhagem germinativa, ao invés de regi- ões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada.
Tais bibliotecas preferidas incluem, por e- xemplo, aquelas em que a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) ou SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1) é combinada com regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linha- gem germinativa.
Alternativamente, a sequência de uma região variável de cadeia pesada selecionada como uma sequência de estrutura principal que contém originalmente "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno" conforme mencionado acima pode ser projetada para conter resíduos flexíveis.
O nú- mero e a posição dos resíduos flexíveis não são particularmente limitados contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo das concentrações de íon.
Especificamente, as sequências de CDR e/ou FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis.
Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitan- tes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variá- vel de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) incluem todos os resí- 5 duos de aminoácido de CDR1 e CDR2 de cadeia pesada e os resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada exceto aqueles nas posições 95, 96 e/ou 100a.
Alternativamente, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1) incluem todos os resíduos de aminoácido de CDR1 e CDR2 de cadeia pesada e os resíduos de aminoácido de CDR3 de cadeia pesada exceto aqueles nas posições de aminoácido 95 e/ou 101. Alternativamente, uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser construída combinando regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatoriza- da ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linhagem germi- nativa com regiões variáveis de cadeia pesada em que "pelo menos um re- síduo de aminoácido responsável pela mudança dependente da concentra- ção de íons na atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno" foi introduzido como acima mencionado.
Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bi- bliotecas incluem preferivelmente aquelas em que regiões variáveis de ca- deia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linha- gem germinativa são combinadas com a sequência de uma região variável de cadeia pesada em que um resíduo(s) particular foi substituído com pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antíge- no de uma molécula de ligação a antígeno dependendo de concentrações de íon de cálcio.
Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido inclu- em resíduos de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada.
Exemplos não limi- tantes adicionais de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de ami- noácido da CDR2 de cadeia pesada.
Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem também resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada.
Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido de CDR3 de cadeia pesada incluem os aminoácidos de posições 95, 96, 100a e/ou 101 na CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme indi- 5 cado pela numeração Kabat.
Ainda, esses resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio e/ou a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno varie dependendo das concentrações de cál- cio.
Quando regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequência de linhagem germinativa são combinadas com uma região variável de cadeia pesada na qual pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependente de concentrações de íon conforme men- cionado acima foi introduzido, a sequência da região variável de cadeia pe- sada pode ser também projetada para conter resíduos flexíveis da mesma maneira que descrito acima.
O número e a posição de resíduos flexíveis não são particularmente limitados, contanto que a atividade de ligação a antíge- no de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie de- pendendo das concentrações de íon.
Especificamente, as sequências de CDR de cadeia pesada e/ou FR podem conter um ou mais resíduos flexí- veis.
Ainda, bibliotecas de região variável aleatorizada podem ser preferi- velmente usadas como sequências de aminoácido de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da região variável de cadeia pesada ao invés dos resíduos de amino- ácido que alteram a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de li- gação a antígeno.
Quando sequências de linhagem germinativa são usadas como regiões variáveis de cadeia leve, exemplos não limitantes de tais se- quências incluem aqueles de SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) e SEQ ID NO: 8 (Vk4). Qualquer um dos aminoácidos descritos acima que altera a ati- vidade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno depen-
dente de concentração de íons de cálcio pode ser preferivelmente usado, contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio.
Especificamente, tais aminoácidos incluem aminoácidos doadores de elétron.
Exemplos prefe- ridos de tais aminoácidos doadores de elétron incluem serina, treonina, as- 5 paragina, ácido glutâmico, ácido aspártico e ácido glutâmico.
Condição de concentrações de íon de hidrogênio Em uma modalidade da presente invenção, a condição de con- centrações de íon se refere à condição de concentrações de íon de hidrogê- nio ou condição de pH.
Na presente invenção, a concentração de próton, isto é, o núcleo de átomos de hidrogênio, é tratada como sinônimo com índice de hidrogênio (pH). Quando a atividade de íon de hidrogênio em uma solução aquosa é representada como aH+, pH é definido como –log10aH+. Quando a resistência iônica da solução aquosa é baixa (por exemplo, menor do que 10-3), aH+ é quase igual à resistência do íon de hidrogênio.
Por exemplo, o produto iônico de água a 25°C e 1 atmosfera é Kw=aH +aOH=10-14 e então em água pura, aH+=aOH=10-7. Neste caso, pH=7 é neutro; uma solução aquosa cujo pH é menor do que 7 é ácida ou cujo pH é maior do que 7 é alcalina.
Na presente invenção, quando a condição de pH é usada como a condição de concentração de íon, condições de pH incluem concentrações de íon de hidrogênio altas ou pHs baixos, isto é, uma faixa de pH ácido, e concentrações de íon de hidrogênio baixas ou pHs altos, isto é, uma faixa de pH neutro. "A atividade de ligação varia dependendo da condição de pH" significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno varia devido à diferença em condições de uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo (uma faixa de pH ácido) e uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto (uma faixa de pH neutro). Isso inclui, por exemplo, o caso em que a atividade de ligação a antígeno de uma molé- cula de ligação a antígeno é maior em uma faixa de pH neutro do que em uma faixa de pH ácido e o caso em que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é maior em uma faixa de pH ácido do que em uma faixa de pH neutro.
No presente relatório, a faixa de pH neutro não é limitada a um valor específico e é preferivelmente selecionada entre pH 6,7 e pH 10,0. Em outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH 6,7 e pH 9,5. Em ain- da outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH7,0 e pH9,0. Em 5 ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH7,0 e pH8,0. Em particular, o pH preferido inclui pH 7,4, que é próximo do pH do plasma (sangue) in vivo.
No presente relatório, uma faixa de pH ácido não é limitada a um valor específico e é preferivelmente selecionada entre pH 4,0 e pH 6,5. Em outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH 4,5 e pH 6,5. Em ain- da outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH 5,0 e pH 6,5. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH 5,5 e pH 6,5. Em particular, o pH preferido inclui pH 5,8, que está próximo do pH no en- dossomo inicial in vivo.
Na presente invenção, "a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo (uma faixa de pH ácido) é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto (uma faixa de pH neu- tro)" significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de li- gação a antígeno em um pH selecionado entre pH 4,0 e pH6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH6,7 e pH10,0; preferivelmente significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH 4,5 e pH6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH6,7 e pH9,5; mais preferivelmente, significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH5,0 e pH6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH7,0 e pH9,0; mais preferível ainda significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH5,5 e pH6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH7,0 e pH8,0; particularmente preferi- velmente significa que a atividade de ligação a antígeno no pH no endosso- mo inicial in vivo é mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno no pH de plasma in vivo; e especificamente significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em pH 5,8 é mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno em pH 7,4. Se a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação 5 a antígeno mudou pela condição do pH pode ser determinada, por exemplo, através do uso de métodos de medição conhecidos tais como aqueles des- critos na seção "Atividade de Ligação" acima.
Especificamente, a atividade de ligação é medida sob condições de pH diferentes usando os métodos de medição descritos acima.
Por exemplo, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é comparada sob as condições de faixa de pH ácido e faixa de pH neutro para confirmar que a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno muda para ser maior sob a con- dição de faixa de pH neutro do que aquela sob a condição de faixa de pH ácido.
Ainda, na presente invenção, a expressão "a atividade de liga- ção a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, pode ser também expressa como "a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é maior do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido". Na presente invenção, "a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro" pode ser descrita como "a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é mais fraca do que a habilidade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro". Al- ternativamente, a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é redu-
zida para ser menor do que aquela em uma concentração de íon de hidro- gênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro" pode ser descrita como "a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é reduzida 5 para ser mais fraca do que a habilidade de ligação a antígeno em uma con- centração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro.
As condições que não concentração de íon de hidrogênio ou pH para medição da atividade de ligação a antígeno podem ser adequadamente selecionadas por aqueles versados na técnica e não são particularmente limitadas.
As medições podem ser realizadas, por exemplo, a 37°C usando tampão HEPES.
As medições podem ser realizadas, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare). Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a ativi- dade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser determinada através da avaliação da atividade de ligação para o antígeno solúvel ao despejar o antígeno como um analito em um chip imobilizado com a molécula de ligação a antígeno.
Quando o antígeno é um antígeno de membrana, a atividade de ligação ao antígeno de membrana pode ser avali- ada despejando a molécula de ligação a antígeno como um analito em um chip imobilizado com o antígeno.
Embora a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH baixo, seja mais fra- ca do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, a razão da atividade de ligação a antígeno entre aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, e em uma concentração de íon de hi- drogênio baixa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutro, não é particular- mente limitada, e o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4), que é a razão da cons- tante de dissociação (KD) para um antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido para a KD em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é preferivelmente 2 ou mais; mais preferivelmente, o va- lor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) é 10 ou mais; e mais preferivelmente ainda o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) é 40 ou mais.
O limite superior de valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer 5 valor tal como 400, 1000 ou 10000, contanto que a molécula possa ser pro- duzida através das técnicas daqueles versados na técnica.
Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a constante de disso- ciação (KD) pode ser usada como o valor para atividade de ligação a antíge- no.
Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, a constante de dissociação aparente (kd) pode ser usada.
A constante de dissociação (KD) e constante de dissociação aparente (KD) podem ser medidas através de métodos conhecidos dos versados na técnica e Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard, citometria de fluxo e similar podem ser usados.
Alternativamente, por exemplo, a constante de taxa de dissocia- ção (kd) pode ser adequadamente usada como um índice para indicação da razão da atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antí- geno da presente invenção entre aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta e pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido e uma concentra- ção de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutro.
Quando a kd (constante de taxa de dissociação ) é usada como um índice para indicação da razão da atividade de ligação ao invés de KD (constante de dissociação), o valor de kd (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma faixa de pH neutro), que é a razão de kd (constante de taxa de dissociação) para o antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido para kd (constante de taxa de dissociação) em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, mais preferivelmente e ainda 10 ou mais, e sobretudo preferivelmente 30 ou mais.
O valor do limite superior (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma fai- xa de pH neutro) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 50, 100 ou 200, contanto que a molécula possa ser produzida através das técnicas daqueles versados na técnica.
Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a constante de taxa de dissociação (kd) pode ser usada como o valor para atividade de ligação a antígeno e quando o antígeno é um antígeno de membrana, a constante de taxa de dissociação aparente (kd) pode ser usada.
A constante de taxa de 5 dissociação (kd) e a constante de taxa de dissociação aparente (kd) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica e Biacore (GE healthcare), citometria de fluxo e similar podem ser usados.
Na presente invenção, quando a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é medida em concentrações de íon de hidrogênio diferentes, isto é, pHs, condições outras que não a concentração de íon de hidrogênio, isto é, pH, são preferivelmente iguais.
Por exemplo, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cu- ja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogê- nio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que a- quela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é uma modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos compreendendo as etapas (a) a (c) que seguem: (a) obtenção da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma faixa de pH ácido; (b) obtenção da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma faixa de pH neutro; e (c) seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno na faixa de pH ácido é menor do que aquela na faixa de pH neutro.
Alternativamente, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidro- gênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é uma modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpo, ou sua biblioteca, compreendendo as etapas (a) a (c)
que seguem: (a) contato de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo, ou sua biblioteca, em uma faixa de pH neutro com um antígeno; (b) colocação em uma faixa de pH ácido do domínio de ligação a 5 antígeno ou anticorpo ligado ao antígeno na etapa (a); e (c) isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo dissociado na etapa (b). Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticor- pos, ou uma biblioteca dos mesmos, compreendendo as etapas (a) a (d) que seguem: (a) contato em uma faixa de pH ácido de um antígeno com uma biblioteca de domínio de ligação a antígeno ou anticorpos; (b) seleção do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que não se liga ao antígeno na etapa (a); (c) permitir que o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo se- lecionado na etapa (b) se ligue com o antígeno em uma faixa de pH neutro; e (d) isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo li- gado ao antígeno na etapa (c). Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as eta- pas (a) a (c) que seguem: (a) contato em uma faixa de pH neutro de uma biblioteca de do-
mínios de ligação a antígeno ou anticorpos com uma coluna imobilizada com um antígeno; (b) eluição em uma faixa de pH ácido a partir da coluna do do- mínio de ligação a antígeno ou anticorpo ligado à coluna na etapa (a); e 5 (c) isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo e- luído na etapa (b). Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em concen- tração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas (a) a (d) que seguem: (a) permitir, em uma faixa de pH ácido, que uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos passe por uma coluna imobili- zada com um antígeno; (b) coleta do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo eluído sem ligação com a coluna na etapa (a); (c) permitir que o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo co- letado na etapa (b) se ligue com o antígeno em uma faixa de pH neutro; e (d) isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo li- gado ao antígeno na etapa (c). Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as eta- pas (a) a (d) que seguem: (a) contato de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos em uma faixa de pH neutro; (b) obtenção do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo liga-
do ao antígeno na etapa (a); (c) colocação em uma faixa de pH ácido do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo obtido na etapa (b); e (d) isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cu- 5 ja atividade de ligação a antígeno na etapa (c) é mais fraca do que o padrão selecionado na etapa (b). As etapas descritas acima podem ser repetidas duas ou mais vezes.
Desta maneira, a presente invenção provê domínios de ligação a an- tígeno e anticorpos cuja atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela em uma faixa de pH neutro, que são obtidos através de um método de avaliação que compreende ainda as etapas de repetição das etapas (a) a (c) ou (a) a (d) nos métodos de avaliação descri- tos acima.
O número de vezes que as etapas (a) a (c) ou (a) a (d) são repe- tidas não é particularmente limitado; no entanto, o número é 10 ou menos em geral.
Nos métodos de avaliação da presente invenção, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, não é particularmente limitada, contanto que ela seja a atividade de ligação a antígeno em um pH entre 4,0 e 6,5 e inclua a ativida- de de ligação a antígeno em um pH entre 4,5 e 6,6 como o pH preferido.
A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela em um pH entre 5,0 e 6,5 e aquela em um pH entre 5,5 e 6,5 como outro pH preferido.
A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela no pH no endossomo inicial in vivo como o pH mais preferido, e especificamente aquela em pH 5,8. Entre- tanto, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, não é particularmente limitada, contanto que ela seja a atividade de ligação a antígeno em pH entre 6,7 e 10, e inclui a atividade de ligação a antígeno em um pH entre 6,7 e 9,5 como o pH pre- ferido.
A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela em um pH entre 7,0 e 9,5 e aquela em um pH entre 7,0 e 8,0 como outro pH preferido.
A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela no pH de plasma in vivo como o pH mais preferido e, especificamente, aquela em pH 7,4. A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo pode ser medida através de métodos conhecidos da- 5 queles versados na técnica.
Aqueles versados na técnica podem determinar adequadamente condições que não concentração de cálcio ionizado.
A ativi- dade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticor- po pode ser avaliada com base na constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD), constante de taxa de dissociação (kd), cons- tante de taxa de dissociação aparente (kd) e similar.
Essas podem ser de- terminadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou FACS.
Aqui, a etapa de seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é maior do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é sinônimo da etapa com seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro.
Contanto que a atividade de ligação a antígeno em uma concen- tração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, seja maior do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, a diferença entre a ativi- dade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio bai- xa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutro, e aquela em uma concentra- ção de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, não é particularmente limitada; no entanto, a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é preferivelmente duas vezes ou mais, mais preferivel- mente 10 vezes ou mais e ainda mais preferivelmente 40 vezes ou mais do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido.
O domínio de ligação a antígeno ou anticorpo da presente in- venção avaliado através dos métodos de avaliação descritos acima pode ser 5 qualquer domínio de ligação a antígeno ou anticorpo, e o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo mencionado acima pode ser avaliado.
Por exemplo, domínio de ligação a antígeno ou anticorpo tendo a sequência nativa pode ser avaliado, e domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em que suas se- quências de aminoácido foram substituídas pode ser avaliado.
O domínio de ligação a antígeno ou anticorpo da presente in- venção a ser avaliado através dos métodos de avaliação descritos acima pode ser preparado de qualquer maneira.
Por exemplo, anticorpos conven- cionais, bibliotecas convencionais (biblioteca de fago, etc), anticorpos ou bibliotecas preparados através de células B de animais imunizados ou de hibridomas obtidos através de animais de imunização, anticorpos ou biblio- tecas (bibliotecas com teor de aminoácidos alto com um pKa de cadeia late- ral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, bibliotecas introduzidas com aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não natural em posições específicas, etc) obtidos através da introdução de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não natu- ral nos anticorpos ou bibliotecas descritos acima podem ser usados.
Métodos para obtenção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é maior do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, a partir de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos preparados a partir de hibridomas obtidos através de imuniza- ção de animais ou de células B de animais imunizados incluem preferivel- mente, por exemplo, a molécula de ligação a antígeno ou anticorpo em que pelo menos um dos aminoácidos do domínio de ligação a antígeno ou anti-
corpo é substituído com um aminoácido com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou uma mutação de ami- noácido não natural, ou o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo inseri- do com um aminoácido com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exem- 5 plo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácido não natural, tais como aque- les descritos no WO 2009/125825. Os sítios de introdução de mutações de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina ou ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais não são particularmente limitados, e podem ser qualquer posição contanto que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido se torne mais fraca do que aquela em uma faixa de pH neutro (o valor de KD (em uma faixa de pH ácido)/KD (em uma faixa de pH neutro) ou kd (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma faixa de pH neutro) é aumentado) comparado com antes da substituição ou inserção.
Por exem- plo, quando a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, a região variá- vel de anticorpo e CDRs são adequadas.
Aqueles versados na técnica po- dem determinar apropriadamente o número de aminoácidos a serem substi- tuídos ou o número de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais a serem inseridos.
É possível substituir um único aminoácido tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou um aminoácido não natural único; é possível inserir um aminoácido único tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmi- co) ou aminoácido não natural único; é possível substituir dois ou mais ami- noácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou dois ou mais aminoácidos não naturais; e é possível in- serir dois ou mais aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou dois ou mais aminoácidos não naturais.
Alternativamente, outros aminoácidos podem ser deletados, adicio- nados, inseridos e/ou substituídos concomitantemente, com a exceção da substituição em aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais ou a in-
serção de aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por e- xemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais.
Substitui- ção ou inserção de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais pode 5 ser realizada aleatoriamente através de métodos tal como varredura com histidina, em que a alanina de varredura de alanina conhecida daqueles ver- sados na técnica é substituída com histidina.
Moléculas de ligação a antíge- no exibindo um valor de KD maior (em uma faixa de pH ácido)/KD (em uma faixa de pH neutro) ou kd (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma faixa de pH neutro) comparado com antes da mutação podem ser selecionadas de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos introduzidos com inserções aleatórias ou mutações de substituição de aminoácidos com um pKa de ca- deia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoá- cidos não naturais.
Exemplos preferidos de moléculas de ligação a antígeno con- tendo a mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais con- forme acima descrito e cuja atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela em uma faixa de pH neutro incluem molé- culas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno na faixa de pH neutro após a mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não natu- rais é comparável àquela antes da mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou ami- noácidos não naturais.
Aqui, "uma molécula de ligação a antígeno após a mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais tendo uma atividade de ligação a antígeno comparável com aquela antes da muta- ção com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exem- plo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais" significa que, quando tomando a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de liga- ção a antígeno antes da mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais como 100%, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno após a mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou ami- 5 noácidos não naturais é pelo menos 10% ou mais, preferivelmente 50% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais e ainda mais preferivelmente 90% ou mais.
A atividade de ligação a antígeno após a mutação de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glu- tâmico) ou aminoácidos não naturais em pH 7,4 pode ser maior do que a- quela antes da mutação de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não natu- rais em pH 7,4. Se a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno for diminuída devido à inserção de ou substituição em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, a atividade de ligação a antígeno pode ser feita para ser comparável com aquela antes da inserção de ou substituição em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, a- través da introdução de uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos da molécula de ligação a antígeno.
A presente in- venção também inclui moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de li- gação foi ajustada para ser comparável através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos após substituição ou in- serção de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exem- plo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais.
Entretanto, quando uma molécula de ligação a antígeno é uma substância contendo uma região constante de anticorpo, modalidades prefe- ridas de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antíge- no em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela em uma faixa de pH neutro incluem métodos em que as regiões constantes de anticorpo contidas nas moléculas de ligação a antígeno foram modificadas.
Exemplos específi- cos de regiões constantes de anticorpo modificadas incluem preferivelmente as regiões constantes de SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14. Aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de domínio de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de hidrogênio 5 Os domínios de ligação a antígeno ou anticorpos da presente in- venção a serem avaliados através dos métodos de avaliação descritos aci- ma podem ser preparados de qualquer maneira.
Por exemplo, quando con- dição de concentração de íon é condição de concentração de íon hidrogênio ou condição de pH, anticorpos convencionais, bibliotecas convencionais (bi- blioteca de fago, etc), anticorpos ou bibliotecas preparados a partir de célu- las B de animais imunizados ou de hibridomas obtidos através de imuniza- ção de animais, anticorpos ou bibliotecas (bibliotecas com teor de aminoáci- dos alto com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, bibliotecas introduzidas com mutações de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por e- xemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais em posi- ções específicas, etc) obtidos através da introdução de mutações de amino- ácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais nos anticorpos ou bibliotecas descritos acima podem ser usados.
Em uma modalidade da presente invenção, uma biblioteca con- tendo moléculas de ligação a antígeno múltiplas da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser também construída combinando regiões variáveis de cadeia pesada, produzidas como uma bi- blioteca de sequência de região variável aleatorizada, com regiões variáveis de cadeia leve introduzidas com "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antí- geno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio". Tais resíduos de aminoácido incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR1 de cadeia leve.
Os resíduos de aminoácido também incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve.
Os re-
síduos de aminoácido também incluem, mas não estão limitados a, por e- xemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR3 de cadeia leve.
Os resíduos de aminoácido descritos acima contidos na CDR1 de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de 5 aminoácido de posições 24, 27, 28, 31, 32 e/ou 34 de acordo com numera- ção Kabat na CDR1 de região variável de cadeia leve.
Entretanto, os resí- duos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve incluem, mas não es- tão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido de posições 50,5 1, 52, 53, 54, 55 e/ou 56 de acordo com numeração Kabat na CDR2 de região variável de cadeia leve.
Ainda, os resíduos de aminoácido na CDR3 de ca- deia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de ami- noácido nas posições 89, 90, 91, 92, 93, 94 e/ou 95A de acordo com nume- ração Kabat na CDR3 de região variável de cadeia leve.
Além disso, os resí- duos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou podem estar contidos em combinação de dois ou mais aminoácidos contanto que eles permitam a mudança na atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da concentração de íon de hidrogênio.
Mesmo quando a região variável de cadeia pesada produzida como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada é combi- nada com a região variável de cadeia leve descrita acima introduzida com "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio", é possível projetar de maneira que os resíduos flexíveis estejam contidos na sequência da região variável de cadeia leve da mesma maneira que descrito acima.
O número e a posição dos resíduos flexíveis não são particularmente limitados a uma modalidade específica, contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção mude dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio.
Especificamente, as sequências de CDR e/ou FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis.
Por exemplo, resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequências das regiões variáveis de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, os resíduos de aminoácido listados nas Tabelas 3 e 4. Entretanto, sequências de aminoácido de regiões variáveis de cadeia leve que não os resíduos flexíveis e resíduos de aminoácido que mudam a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno de- 5 pendendo da condição de concentração de íon de hidrogênio adequadamen- te incluem, mas não estão limitadas a, sequências de linhagem germinativa tais como Vk1 (SEQ ID NO: 5), Vk2 (SEQ ID NO: 6), Vk3 (SEQ ID NO: 7) e Vk4 (SEQ ID NO: 8). Tabela 3 Posição Aminoácido
Tabela 4 Posição Aminoácido
Qualquer resíduo de aminoácido pode ser adequadamente usa- do como os resíduos de aminoácido descritos acima que mudam a atividade 5 de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição da concentração de íon de hidrogênio.
Especificamente, tais resíduos de aminoácido incluem aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0. Tais aminoácidos de liberação de elétron incluem preferivelmen- te, por exemplo, aminoácidos de ocorrência natural tais como histidina e áci- do glutâmico, bem como aminoácidos não naturais tais como análogos de histidina (US2009/0035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3,5-Br2-Tyr (pKa 7,21) e 3,5-12-Tyr (pKa 7,38) (Bioorg.
Med.
Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768). Resíduos de aminoácido particularmente preferidos incluem, por exemplo, aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 6,0-7,0. Tais resíduos de a-
minoácido de liberação de elétron incluem preferivelmente, por exemplo, histidina.
Métodos conhecidos tais como mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de 5 Extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados para modificar os aminoácidos de domínios de ligação a antígeno.
Ainda, vários métodos conhecidos podem ser também usados como um método de modi- ficação de aminoácido para substituição de aminoácidos com aqueles que não aminoácidos naturais (Annu.
Rev.
Biophyys.
Biomol.
Struct. (2006) 35, 225-249; Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por e- xemplo, um sistema de tradução livre de célula (Clover Direct (Protein Ex- press)) contendo tRNas em que tRNA supressor âmbar, que é complemen- tar a códon UAG (códon âmbar) que é um códon de parada, é ligado com um aminoácido não natural pode ser adequadamente usado.
A região variável de cadeia pesada preferida que é usada em combinação inclui, por exemplo, bibliotecas de região variável aleatorizadas.
Métodos conhecidos são apropriadamente combinados como um método para produção de uma biblioteca de região variável aleatorizada.
Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune cons- truída com base em genes de anticorpo derivados de animais imunizados com antígenos específicos, pacientes com infecção ou pessoas com um títu- lo de anticorpo elevado em sangue como um resultado de vacinação, paci- entes com câncer ou linfócitos de doenças autoimunes pode ser adequada- mente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.
Em outra modalidade não limitante da presente invenção, da mesma maneira que descrito acima, uma biblioteca sintética em que as se- quências de CDR de genes V de DNA genômico ou genes V reconstruídos funcionais são substituídas com um conjunto de oligonucleotídeos sintéticos contendo as sequências codificando conjuntos de códon de um comprimento apropriado pode ser também adequadamente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.
Neste caso, a sequência de CDR3 sozinha po- de ser substituída porque variedade na sequência de gene de CDR3 de ca-
deia pesada é observada.
A base para dar origem a variações de aminoáci- do na região variável de uma molécula de ligação a antígeno é gerar varia- ções de resíduos de aminoácido de posições expostas à superfície da molé- cula de ligação a antígeno.
A posição exposta à superfície se refere a uma 5 posição em que um aminoácido é exposto na superfície e/ou contatado com um antígeno com base na conformação, conjunto estrutural e/ou estrutura modelada de uma molécula de ligação a antígeno e, em geral, tais posições são as CDRs.
As posições expostas à superfície são preferivelmente deter- minadas usando as coordenadas derivadas de um modelo tridimensional da molécula de ligação a antígeno usando programas de computador tal como o programa InsightII (Accelrys). As posições expostas à superfície podem ser determinadas usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (J.
Mol.
Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J.
Appl.
Cryst. (1983) 16, 548-558)). As posições expostas à superfície podem ser determi- nadas com base na informação na estrutura tridimensional de anticorpos usando software adequado para modelagem de proteína.
Software que é adequadamente usado para este propósito inclui o software de módulo de biopolímero SYBYL (Tripos Associates). Quando o algoritmo requer o parâ- metro de tamanho de registro do usuário, o "tamanho" de sonda para uso em computação é geralmente ou preferivelmente ajustado em cerca de 1,4 angstrom ou menos de raio.
Ainda, um método para determinação de região e área expostas à superfície usando software PCR é descrito por Pacios (Comput.
Chem. (1994) 18 (4), 377-386; e J.
Mol.
Model. (1995) 1, 46-53). Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca pura construída a partir de genes de anticorpo derivados de linfócitos de pessoas saudáveis e consistindo em sequências puras, que são repertório imparciais de sequências de anticorpo, pode ser também particu- larmente adequadamente usada como uma biblioteca de região variável ale- atorizada (Gejima e outros (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); e Car- doso e outros (Scand.
Immunol. (2000) 51, 337-344)). FcRn Diferente do receptor Fcγ pertencente à superfamília de imuno-
globulina, FcRn humano é estruturalmente similar a polipeptídeos de com- plexo de histocompatibilidade principal (MHC) (Major Histocompatibility Complex) Classe I, exibindo 22% a 29% de identidade de sequência com moléculas MHC Classe I (Ghetie e outros, Immunol.
Today (1997) 18 (2): 5 592-598). FcRn é expresso como um heterodímero consistindo em cadeia β ou leve solúvel (β2 microglobulina) complexada com cadeia α ou pesada de transmembrana.
Tal como MHC, a cadeia α MHC compreende três domínios extracelulares (α1, α2 e α3) e seu domínio citoplásmico curto ancora a prote- ína na superfície celular.
Os domínios α1 e α2 interagem com o domínio de ligação a FcRN da região Fc de anticorpo (Raghavan e outros, Immunity (1994) 1: 303-315). FcRn é expresso em placenta materna e saco vitelino de mamí- feros, e está envolvido em transferência de IgG de mãe-para-feto.
Ainda, em intestino delgado neonatal de roedores, em que FcRn é expresso, FcRn está envolvido em transferência de IgG materno através do epitélio de borda em escova a partir de colostro ou leite ingerido.
FcRn é expresso em uma varie- dade de outros tecidos e sistemas de célula endotelial de várias espécies.
FcRn é também expresso em endotélio humano adulto, vasos de sangue muscular e capilares sinusoidais hepáticos.
FcRn é acreditado desempenhar um papel na manutenção de concentração de IgG no plasma através da mediação da reciclagem de IgG para soro quando da ligação a IgG.
Tipica- mente, ligação de FcRn a moléculas de IgG é estritamente dependente do pH.
A ligação ótima é observada em uma faixa de pH ácido abaixo de 7,0. FcRn humano cujo precursor é um polipeptídeo tendo a sequên- cia de sinal desejada de SEQ ID NO: 15 (o polipeptídeo com a sequência de sinal é mostrada na SEQ ID NO: 16) forma um complexo com β2- microglobulina humana in vivo.
Conforme mostrado nos Exemplos de Refe- rência descritos abaixo, FcRn humano solúvel complexado com β2- microglobulina é produzido através do uso de técnicas de expressão recom- binantes convencionais.
Regiões FcRn da presente invenção podem ser avaliadas quanto à sua atividade de ligação a tal FcRn humano solúvel com- plexado com β2-microglobulina.
Aqui, a menos que de outra maneira especi-
ficado, FcRn humano se refere a uma forma capaz de se ligar a uma região FcRn da presente invenção.
Exemplos incluem um complexo entre FcRn humano e β2-microglobulina humana.
Região Fc 5 Uma região Fc contém a sequência de aminoácido derivada da região constante de cadeia pesada de um anticorpo.
Uma região Fc é uma porção da região constante de cadeia pesada de um anticorpo, partindo da extremidade terminal N da região de dobra, que corresponde ao sítio de cli- vagem de papaína em um aminoácido em torno da posição 216 de acordo com o sistema de numeração EU e contém os domínios de dobra, CH2 e CH3. A atividade de ligação de uma região Fc da presente invenção para FcRn, FcRn humano em particular, pode ser medida através de méto- dos conhecidos daqueles versados na técnica, conforme descrito na seção "Atividade de Ligação" acima.
Aqueles versados na técnica podem determi- nar apropriadamente as condições outras que não pH.
A atividade de ligação a antígeno e a atividade de ligação a FcRn humano de uma molécula de li- gação a antígeno podem ser avaliadas com base na constante de dissocia- ção (KD), constante de dissociação aparente (KD), taxa de dissociação (kd), taxa de dissociação aparente (kd) e similar.
Essas podem ser medidas atra- vés de métodos conhecidos daqueles versados na técnica.
Por exemplo, Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou citometria de fluxo pode ser usado.
Quando a atividade de ligação a FcRn humano de uma região Fc da presente invenção é medida, condições que não o pH não são particu- larmente limitadas, e podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica.
As medições podem ser realizadas, por exemplo, a 37°C usando tampão MES, conforme descrito no WO 200 9125825). Alterna- tivamente, a atividade de ligação a FcRn humano de uma região Fc da pre- sente invenção pode ser medida através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica e pode ser medida usando, por exemplo, Biacore (GE Healthcare) ou similar.
A atividade de ligação de uma região Fc da presente invenção a FcRn humano pode ser avaliada despejando, como um analito, FcRn humano, uma região Fc ou uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção contendo a região Fc em um chip imobilizado com uma região Fc, uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção con- 5 tendo a região Fc ou FcRn humano.
Uma faixa de pH neutro como a condição em que a região Fc contida em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção tem a atividade de ligação a FcRn significa pH 6,7 a pH 10,00 em geral.
Preferi- velmente, a faixa de pH neutro é uma faixa indicada com valores de pH arbi- trários entre pH 7,0 e pH 8,0 e é preferivelmente selecionada de pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 ou 8,0 e é particularmente preferivelmente pH 7,4 que é próximo do pH de plasma (sangue) in vivo.
Quando a atividade de ligação entre o domínio de ligação a FcRn humano e FcRn humano em pH 7,4 é muito baixa para avaliar, pH 7,0 pode ser usado ao invés de pH 7,4. Aqui, uma faixa de pH ácido como a condição em que a região Fc contida em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção tem a ativida- de de ligação a FcRn significa pH 4,0 a pH 6,5, em geral.
Preferivelmente, a faixa de pH ácido significa pH 5,5 a pH 6,5, particularmente preferivelmente pH 5,8 a pH 6,0, que é próximo do pH no endossomo inicial in vivo.
Com relação à temperatura usada como a condição de medição, a afinidade de ligação entre o domínio de ligação a FcRn humano e FcRn humano pode ser avaliada em qualquer temperatura entre 10°C e 50°C.
Preferivelmente, a afinidade de ligação entre o domínio de ligação a FcRn humano e FcRn hu- mano pode ser determinada a 15°C a 40°C.
Mais prefe rivelmente, a afinida- de de ligação entre o domínio FcRn humano e o FcRn humano pode ser de- terminada da mesma maneira em uma temperatura arbitrária entre 20°C e 35°C, tal como qualquer temperatura de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 e 35°C.
Em uma modalidade da presente invenção, a temperatura inclui, mas não está limitada a, por exemplo, 25°C.
De acordo com o "The Journal of Immunology (2009) 182: 7663- 7671", a atividade de ligação a FcRn humano de IgG1 humana nativa é 1,7 µM (KD) em uma faixa de pH ácido (pH 6,0) enquanto a atividade é quase não detectável na faixa de pH neutro.
Desta maneira, em uma modalidade preferida, as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção tendo a atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido e em uma faixa de pH neutro, incluindo atividade de ligação, podem ser reveladas 5 comparando a atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH áci- do e/ou em uma faixa de pH neutro antes e após a modificação de aminoá- cido.
Aqueles versados na técnica podem modificar apropriadamente os a- minoácidos usando métodos conhecidos.
Na presente invenção, "modificação de aminoácidos" ou "modifi- cação de aminoácido" de uma região Fc inclui modificação em uma sequên- cia de aminoácido que é diferente daquela da região Fc de partida.
O domí- nio de partida pode ser qualquer região Fc, contanto que uma variante modi- ficada da região Fc de partida possa se ligar a FcRn humano em uma faixa de pH ácido (isto é, a região Fc de partida não precisa ter necessariamente a atividade de ligação a FcRn humana na faixa de pH neutro). Regiões Fc pre- feridas como a região Fc de partida incluem, por exemplo, a região Fc de anticorpo IgG, isto é, região Fc nativa.
Ainda, uma região Fc alterada modificada de uma região Fc de partida que já foi modificada pode ser também usada preferivelmente como uma região Fc alterada da presente invenção.
A "região Fc de partida" pode se referir ao próprio polipeptídeo, uma composição compreendendo a região Fc de partida ou uma sequência de aminoácido codificando a região Fc de partida.
As regiões Fc de partida podem compreender uma região Fc de an- ticorpo IgG conhecida produzida via recombinação descrita rapidamente na seção "Anticorpos". A origem de regiões Fc de partida não é limitada, e elas podem ser obtidas de organismos seres humanos ou qualquer não humano.
Tais organismos incluem preferivelmente camundongos, ratos, porquinhos- da-índia, hamsters, gerbilos, gatos, coelhos, cachorros, gatos, ovelha, bovi- nos, cavalos, camelos e organismos selecionados de primatas não seres humanos.
Em outra modalidade, as regiões Fc de partida podem ser tam- bém obtidas de macacos cinomólogos, marmotas, macacos rhesus, chim- panzés ou seres humanos.
As regiões Fc de partida podem ser obtidas pre-
ferivelmente de IgG1 humana; no entanto, elas não são limitadas a nenhuma subclasse IgG particular.
Isso significa que uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana pode ser usada apropriadamente como uma região Fc de partida, e aqui também significa que uma região Fc de uma classe IgG 5 arbitrária ou subclasse derivada de qualquer organismo descrito acima pode ser preferivelmente usada como uma região Fc de partida.
Exemplos de va- riantes de IgG de ocorrência natural ou formas modificadas são descritos no documento publicado (Curr.
Opin.
Biotechnol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr.
Opin.
Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng.
Des.
Sel. (2010) 23 (4): 195-202; WO 2009/086320; WO 2008/092117; WO 2007/041635; e WO 2006/105338); no entanto, elas não são limitadas aos exemplos.
Exemplos de alterações incluem aquelas com uma ou mais mu- tações, por exemplo, mutações através da substituição de resíduos de ami- noácido diferentes por aminoácidos de regiões Fc de partida, através da in- serção de um ou mais resíduos de aminoácido em regiões Fc de partida ou através da deleção de um ou mais aminoácidos da região Fc de partida.
Pre- ferivelmente, as sequências de aminoácido de regiões Fc alteradas compre- endem pelo menos uma parte da sequência de aminoácido de uma região Fc na nativa.
Tais variantes têm necessariamente identidade ou similaridade de sequência de menos do que 100% com sua região Fc de partida.
Em uma modalidade preferida, as variantes têm identidade ou similaridade de sequência de cerca de 75% ou menos a menos do que 100% ou menos, mais preferivelmente cerca de 80% ou menos a menos do que 100%, ainda mais preferivelmente cerca de 85% a menos do que 100%, sobretudo prefe- rivelmente 90% a menos do que 100% e ainda sobretudo preferivelmente cerca de 95% a menos do que 100% da sequência de aminoácido de sua região Fc de partida.
Em uma modalidade não limitante da presente inven- ção, pelo menos um aminoácido é diferente entre uma região Fc modificada da presente invenção e sua região Fc de partida.
A diferença de aminoácido entre uma região Fc modificada da presente invenção e sua região Fc de partida pode ser também preferivelmente especificada com base nas dife- renças de aminoácido nas posições de aminoácido particulares descritas acima de acordo com o sistema de numeração EU.
Métodos conhecidos tais como mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de Extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados para 5 modificar os aminoácidos de regiões Fc.
Ainda, vários métodos conhecidos podem ser também usados como um método de modificação de aminoácido para substituição de aminoácidos por aqueles que não aminoácidos naturais (Annu.
Rev.
Biophys.
Biomol.
Struct. (2006) 35, 225-249; Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A. (2003) 100(11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de tradu- ção livre de célula (Clover Direct (Protein Express)) contendo tRNas em que tRNA supressor âmbar, que é complementar a códon UAG (códon âmbar) que é um códon de parada, é ligado com um aminoácido não natural pode ser adequadamente usado.
Regiões Fc tendo atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro, que estão contidas nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, podem ser obtidas através de qualquer método.
Especifi- camente, regiões Fc tendo atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro podem ser obtidas através da modificação de aminoácidos de i- munoglobulina humana tipo IgG como uma região Fc de partida.
As regiões Fc de imunoglobulinas tipo IgG adequadas para modificação incluem, por exemplo, aquelas de IgGs humanas (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e suas formas modificadas). Aminoácidos de quaisquer posições podem ser modificados em outros aminoácidos, contanto que as regiões Fc tenham a atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro ou possam aumentar a ativi- dade de ligação a FcRn humano na faixa neutra.
Quando a molécula de li- gação a antígeno contém a região Fc de IgG1 humana como a região Fc humana, é preferível que a região Fc resultante contenha uma modificação que resulta no efeito de aumento da ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana.
Os aminoácidos que permitem tal modificação incluem, por exemplo, aminoácidos de posições 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241, 243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 3215 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440 e 442 de acor- do com a numeração EU.
Mais especificamente, tais modificações de ami- noácido incluem aquelas listadas na Tabela 5. A modificação desses amino- 5 ácidos aumenta a ligação a FcRn humano da região Fc de imunoglobulina tipo IgG na faixa de pH neutro.
Daquelas descritas acima, modificações que aumentam a liga- ção a FcRn humano na faixa de pH neutro são apropriadamente seleciona- das para uso na presente invenção.
Aminoácidos particularmente preferidos das regiões Fc modificadas incluem, por exemplo, aminoácidos de posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 308, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 de acordo com o sistema de numeração EU.
A atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro da região Fc contida na molécula de ligação a antígeno pode ser au- mentada substituindo pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoá- cidos acima em um aminoácido diferente.
Modificações particularmente preferidas incluem, por exemplo: Met para o aminoácido de posição 237; Ile para a posição de aminoácido 248; Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 250; Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 252; Thr para o aminoácido de posição 254; Glu para o aminoácido de posição 255; Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido de posição 256; Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr e Val para o aminoácido de posição 257; His para o aminoácido de posição 258; Ala para o aminoácido de posição 265; Ala ou Glu para o aminoácido de posição 286; His para o aminoácido de posição 289;
Ala para o aminoácido de posição 297; Ala para o aminoácido de posição 303; Ala para o aminoácido de posição 305; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Il,e Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, 5 Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido de posição 308; Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg para o aminoácido de posição 309; Ala, His ou Ile para o aminoácido de posição 311; Ala ou His para o aminoácido de posição 312; Lys ou Arg para o aminoácido de posição 314; Ala, Asp ou His para o aminoácido de posição 315; Ala para o aminoácido de posição 317; Val para o aminoácido de posição 332; Leu para o aminoácido de posição 334; His para o aminoácido de posição 360; Ala para o aminoácido de posição 376; Ala para o aminoácido de posição 380; Ala para o aminoácido de posição 382; Ala para o aminoácido de posição 384; Asp ou His para o aminoácido de posição 385; Pro para o aminoácido de posição 386; Glu para o aminoácido de posição 387; Ala ou Ser para o aminoácido de posição 389; Ala para o aminoácido de posição 424; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 428; Lys para o aminoácido de posição 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 434; e His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido de posição 436 da região Fc de acordo com a numeração EU.
Entretanto, o número de ami-
noácidos a ser modificado não é particularmente limitado e aminoácido em apenas um sítio pode ser modificado e aminoácidos em dois ou mais sítios podem ser modificados.
Combinações de modificações de aminoácido em dois ou mais sítios incluem, por exemplo, aquelas descritas na Tabela 6. 5 Molécula de ligação a antígeno Na presente invenção, "uma molécula de ligação a antígeno" é usado no sentido mais amplo para se referir a uma molécula contendo um domínio de ligação a antígeno e uma região Fc.
Especificamente, as molécu- las de ligação a antígeno incluem vários tipos de moléculas, contanto que elas exibam a atividade de ligação a antígeno.
Moléculas em que um domí- nio de ligação a antígeno é ligado a uma região Fc incluem, por exemplo, anticorpos.
Anticorpos podem incluir anticorpos monoclonais únicos (incluin- do anticorpos agonísticos ou anticorpos antagonísticos), anticorpos huma- nos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e similares.
Alternati- vamente, quando usados como fragmentos de anticorpo, eles preferivelmen- te incluem domínios de ligação de antígeno e fragmentos de ligação a antí- geno (por exemplo, Fab, F(ab’)2, scFv e Fv). Moléculas de base em que es- truturas tridimensionais, tais como a estrutura de proteína em barril α/β está- vel já conhecida, são usadas como uma base e apenas algumas porções das estruturas são transformadas em bibliotecas para construir domínios de ligação a antígeno que são também incluídos em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção.
Uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção pode conter pelo menos algumas porções de uma região Fc que faz a mediação da ligação de FcRn a receptor Fcγ.
Em uma modalidade não limitante, a mo- lécula de ligação a antígeno inclui, por exemplo, anticorpos e proteínas de fusão Fc.
Uma proteína de fusão se refere a um polipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo tendo uma primeira sequência de aminoá- cido que é ligada a um polipeptídeo tendo uma segunda sequência de ami- noácido que se ligaria naturalmente na natureza.
Por exemplo, uma proteína de fusão pode compreender a sequência de aminoácido de pelo menos uma porção de uma região Fc (por exemplo, uma porção de uma região Fc res-
ponsável pela ligação a FcRn ou uma porção de uma região Fc responsável pela ligação ao receptor Fcγ) e um polipeptídeo não imunoglobulina conten- do, por exemplo, a sequência de aminoácido do domínio de ligação a ligante de um receptor ou um domínio de ligação a receptor de um ligante. As se- 5 quências de aminoácido podem estar presentes em proteínas separadas que são transportadas juntas para uma proteína de fusão, ou geralmente podem estar presentes em uma proteína única; no entanto, elas estão inclu- ídas em uma nova disposição em um polipeptídeo de fusão. Proteínas de fusão podem ser produzidas, por exemplo, através de síntese química ou através de técnicas de recombinação genética para expressar um polinucle- otídeo codificando regiões de peptídeo em uma disposição desejada. Os respectivos domínios da presente invenção podem ser liga- dos via ligantes ou diretamente via ligação de polipeptídeo. Os ligantes compreendem ligantes de peptídeo arbitrários que podem ser introduzidos através de engenharia genética, ligantes sintéticos e ligantes revelados, por exemplo, em Protein Engineering (1996) 9(3), 299-
305. No entanto, ligantes de peptídeo são preferidos na presente invenção. O comprimento dos ligantes de peptídeo não é particularmente limitado e pode ser adequadamente selecionado por aqueles versados na técnica de acordo com o propósito. O comprimento é preferivelmente de cinco aminoá- cidos ou mais (sem limitação particular, o limite superior é geralmente 30 aminoácidos ou menos, preferivelmente 20 aminoácidos ou menos) e parti- cularmente preferivelmente 15 aminoácidos. Por exemplo, tais ligantes de peptídeo incluem preferivelmente: Ser Gly.Ser Gly.Gly.Ser Ser.Gly.Gly Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO: 17) Ser.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO: 18) Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO: 19) Ser. Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO: 20)
Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO: 21) Ser.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO: 22) Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO: 23) Ser.
Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO: 24) 5 (Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO: 19))n (Ser.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO: 20))n em que n é um inteiro de 1 ou mais.
O comprimento ou sequên- cias de ligantes de peptídeo podem ser selecionados consequentemente por aqueles versados na técnica dependendo do propósito.
Ligantes sintéticos (agentes de reticulação químicos) são rotinei- ramente usados para reticular peptídeos, e, por exemplo: N-hidróxi succinimida (NHS), dissuccinimidil suberato (DSS), bis(sulfossuccinimidil) suberato (BS3), ditiobis(succinimidil propionato) (DPS), ditiobis(sulfossuccinimidil propionato) (DTSSP), etileno glicol bis(succinimidil succinato) (EGS), etileno glicol bis(sulfossuccinimidil succinato) (sulf-EGS), succinimidil tartrato (DST), dissulfossuccinimidil tartrato (sulfo- DST), bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES) e bis[2-(sulfossuccinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo- BSOCOES). Esses agentes de reticulação estão comercialmente disponí- veis.
Quando ligantes múltiplos para ligação dos respectivos domínios são usados, eles podem ser todos do mesmo tipo ou podem ser de tipos diferentes.
Em adição aos ligantes exemplificados acima, ligantes com mar- cadores de peptídeo tais como marcador His, marcador HA, marcador myc e marcador FLAG podem ser também adequadamente usados.
Ainda, ligação hidrogênio, ligação dissulfeto, ligação covalente, interação iônica e proprie- dades de ligação uns com os outros como um resultado de combinação dos mesmos podem ser adequadamente usadas.
Por exemplo, a afinidade entre CH1 e CL de anticorpo pode ser usada, e regiões Fc se originando dos anti- corpos biespecíficos descritos acima podem ser também usadas para asso- ciação de região Fc hetero.
Além disso, ligações dissulfeto formadas entre 5 domínios podem ser também adequadamente usadas.
A fim de ligar respectivos domínios via ligação de peptídeo, poli- nucleotídeos codificando os domínios são unidos em estrutura.
Métodos co- nhecidos para ligação de polinucleotídeos em estrutura incluem técnicas tal como ligação de fragmentos de restrição, PCR de fusão e PCR de sobrepo- sição.
Tais métodos podem ser apropriadamente usados sozinhos ou em combinação para construir moléculas de ligação a antígeno da persente in- venção.
Na presença invenção, os termos "ligado" e "fundido" ou "ligação" e "fusão" são usados intercomutavelmente.
Esses termos significam que dois ou mais elementos ou componentes tais como polipeptídeos são unidos para formar uma estrutura única através de qualquer meio incluindo os dispositi- vos de ligação químicos descritos acima e técnicas de recombinação genéti- ca.
Fusão em estrutura significa, quando dois ou mais elementos ou compo- nentes são polipeptídeos, ligação de duas ou mais unidades de estruturas de leitura para formar uma estrutura de leitura mais longa contínua enquanto mantendo as estruturas de leitura corretas dos polipeptídeos.
Quando duas moléculas de Fab são usadas como um domínio de ligação a antígeno, um anticorpo, que é uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção em que o domínio de ligação a antígeno é ligado em estrutura a uma região Fc via ligação de peptídeo sem ligante, pode ser usado como uma molécula de ligação a antígeno preferida da presente invenção.
Receptor Fcγ Receptor Fcγ (também descrito como FcγR) se refere a um re- ceptor capaz de ligação à região Fc de anticorpos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 monoclonais e inclui todos os membros pertencentes à família de proteínas substancialmente codificadas por um gene de receptor Fcγ.
Em humano, a família inclui FcγRI (CD64) incluindo isoformas FcγRIa, FcγRIb e FcγRIc; FcγRII (CD32) incluindo isoformas FcγRIIa (incluindo alótipo H131 e R131),
FcγRIIb (incluindo FcγRIIb-1 e FcγRIIb-2) e FcγRIIc; e FcγRIII (CD16) inclu- indo isoforma FcγRIIIa (incluindo alótipos V158 e F158) e FcγRIIIb (incluindo alótipos FcγRIIIb-NA1 e FcγRIIIb-NA2); bem como todas as isoformas Fcγ- Rs, FcγR humanas não identificadas, e seus alótipos.
No entanto, receptor 5 Fcγ não é limitado a esses exemplos.
Sem ser limitado a esses, FcγRIIb in- clui aqueles derivados de seres humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos.
FcγR pode ser derivado de quaisquer organismos.
FcγR de ca- mundongo inclui, sem ser limitado a, FcγRI (CD64), FcγRI (CD6), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) e FcγRIII-2 (FcγRIV, CD16-2), bem como FcγRs de camundongo não identificados, isoformas de FcγR e seus alótipos.
Tais re- ceptores Fcγ preferidos incluem, por exemplo, FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), FcγRIIb (CD32), FcγRIIIa (CD16) e/ou FcγRIIIb (CD16). A sequên- cia de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcγRI são mostradas nas SEQ ID NOs: 25 (NM_000566.3) e 26 (NP_000557.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcγRIIa (a- lótipo H131) são mostradas nas SEQ ID NOs: 27 (BC020823.1) e 28 (A- AH20823.1) (alótipo R131 é uma sequência em que aminoácido na posição 166 de SEQ ID NO: 28 é substituído com Arg), respectivamente; a sequên- cia de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcγIIB são mostra- das nas SEQ ID NOs: 29 (BC 146678.1) e 30 (AA146679.1), respectivamen- te; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcγRIIIa são mostradas nas SEQ ID NOs: 31 (BC033678.1) e 32 (AAH33678.1), res- pectivamente; e a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoáci- do de FcγRIIIb são mostradas nas SEQ ID NOs: 33 (BC128562.1) e 34 (A- A128563.1), respectivamente (número de acesso RefSeq é mostrado em cada parênteses). Por exemplo, conforme descrito no Exemplo de Referência 27 e tal como FcγRIIIaV quando alótipo V158 é usado, a menos que de outro mo- do especificado, alótipo F158 é usado; no entanto, o alótipo de isoforma Fc- yRIIIa descrita aqui não deve ser interpretado como sendo particularmente limitado.
Se um receptor Fcγ tem atividade de ligação à região Fc de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 monoclonal pode ser avaliada através de avaliação ALPHA (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay – Ensaio Homongêno de Proximidade Luminescente Amplificado), método BIACORE baseado em ressonância de plasmon de superfície (SPR) (Surfa- 5 ce Plasmon Resonance) e outros (Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA (2006) 103(11), 4005-4010), em adição aos formatos FACS e ELISA descritos aci- ma.
Entretanto, "ligante Fc" ou "ligante efetor" se refere a uma molé- cula e preferivelmente um polipeptídeo que se liga a uma região Fc de anti- corpo, formando um complexo de ligante Fc/Fc.
A molécula pode ser deriva- da de quaisquer organismos.
A ligação de um ligante Fc a Fc induz preferi- velmente uma ou mais funções efetoras.
Tais ligantes Fc incluem, mas não estão limitados a, receptores Fc, FcγR, FcαR, FcεR, FcRn, C1q e C3, lectina de ligação à manana, receptor de manose, Proteína A Staphylococcus, Pro- teína G de Staphylococcus e FcγRs virais.
O ligante Fc também inclui homó- logos de receptor Fc (FcRH) (Davis e outros (2002) Immunological Reviews 190, 123-136), que são uma família de receptores Fc homólogos a FcγR.
Os ligantes Fc também incluem moléculas não identificadas que se ligam a Fc.
Em FcγRI (CD64) incluindo FcγRIa, FcγRIb e FcγRIc e FcγRIII (CD16) incluindo as isoformas FcγRIIIa (incluindo alótipos V158 e F158) e FcγRIIIb (incluindo alótipos FcγRIIIb-NA1 e FcγRIIIb-NA2), cadeia α que se liga à porção Fc de IgG está associada com cadeia γ comum tendo ITAM responsável pela transdução de sinal de ativação intracelular.
Entretanto, o domínio citoplásmico de FcγRII (CD32) incluindo as isoformas FcγRIIa (in- cluindo os alótipos F131 e R131) e FcγRIIc contém ITAM.
Esses receptores são expressos em muitas células imunes tais como macrófagos, mastócitos e células apresentando antígeno.
O sinal de ativação transduzido quando da ligação desses receptores à porção Fc de IgG resulta em aumento da ativi- dade fagocítica de macrófagos, produção de citocina inflamatória, desgranu- lação de mastócito e função aumentada de células apresentando antígeno.
Receptores Fcγ tendo a habilidade em transduzir os sinal de ativação con- forme descrito acima são também referidos como receptores Fcγ de ativa-
ção.
Entretanto, o domínio intracitoplásmico de FcγRIIb (incluindo FcγRIIb-1 e FcγRIIb-2) contém ITIM responsável pela transdução de sinais inibidores.
A reticulação entre FcγRIIb e receptor de célula B (BCR) (B Cell 5 Receptor) em células B suprime o sinal de ativação de BCR, que resulta em supressão de produção de anticorpo via BCR.
A reticulação de FcγRIII e FcγRIIb em macrófagos suprime a atividade fagocítica e produção de citoci- na inflamatória.
Receptores Fcγ tendo a habilidade em transduzir o sinal ini- bidor conforme descrito acima são também referidos como receptor Fcγ ini- bidor.
Avaliação ALPHA é realizada através da tecnologia ALPHA com base no princípio descrito abaixo usando dois tipos de contas: contas doado- ras e aceitadoras.
Um sinal luminescente é detectado apenas quando duas moléculas ligadas às contas doadoras interagem biologicamente com molé- culas ligadas às contas receptoras e quando as duas contas estão muito próximas.
Excitado por feixe de laser, o fotossensibilizador em uma conta doadora converte oxigênio em torno da conta em oxigênio singleto excitado.
Quando o oxigênio singleto difunde em torno das contas doadoras e atinge as contas aceitadoras localizadas muito próximas, uma reação quimiolumi- nescente dentro das contas aceitadoras é induzida.
Esta reação por fim re- sulta em emissão de luz.
Se moléculas ligadas às contas doadoras não inte- ragem com moléculas ligadas às contas aceitadoras, o oxigênio singleto produzido pelas contas doadoras não atingem as contas aceitadoras e rea- ção quimioluminescente não ocorre.
Por exemplo, uma molécula de ligação a antígeno marcada com biotina compreendendo região Fc é imobilizada para as contas doadoras e o receptor Fcγ marcado com glutationa S-transferase (GST) são imobilizado para as contas aceitadoras.
Na ausência de uma molécula de ligação a antí- geno compreendendo uma variante de região Fc competitiva, o receptor Fcγ interage com um complexo de polipeptídeo compreendendo uma região Fc do tipo selvagem, induzindo um sinal de 520 a 620 nm como um resultado.
A molécula de ligação a antígeno tendo uma variante de região Fc não marca-
da compete com a molécula de ligação a antígeno compreendendo uma re- gião Fc nativa por interação com o receptor Fcγ.
A afinidade de ligação rela- tiva pode ser determinada através de quantificação da redução de fluores- cência como um resultado de competição.
Métodos para biotinilação das 5 moléculas de ligação a antígeno tais como anticorpos usando Sulfo-NHS- biotina ou similar são conhecidos.
Métodos apropriados para adição de mar- cador GST a um receptor Fcγ incluem métodos que envolvem fusão de poli- peptídeos codificando Fcγ e GST em estrutura, expressão do gene fundido usando células introduzidas com um vetor ao qual o gene é operavelmente ligado e então purificação usando uma coluna de glutationa.
O sinal induzido pode ser preferivelmente analisado, por exemplo, ajustando a um modelo de competição de um sítio com base em análise de regressão não linear usan- do software tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego). Uma das substâncias para observação de sua interação é imobi- lizada como um ligante na camada fina de ouro de um sensor chip.
Quando luz é posta na superfície posterior do sensor chip de maneira que reflexão total ocorre na interface entre a camada fina de ouro e vidro, a intensidade de luz refletida é parcialmente reduzida em um certo sítio (sinal SPR). A ou- tra substância para observação de sua interação é injetada como um analito na superfície do sensor chip.
A massa de molécula ligante imobilizada au- menta quando o analito se liga ao ligante.
Isso altera o índice de refração de solvente na superfície do sensor chip.
A mudança em índice de refração causa uma mudança posicional de sinal de SPR (por outro lado, a dissocia- ção muda o sinal de volta para a posição original). No sistema Biacore, a quantidade de mudança descrita acima (isto é, a mudança de massa na su- perfície sensor chip) é posta em gráfico no eixo vertical e então a mudança de massa com o tempo é mostrada como dados medidos (sensorgrama). Parâmetros cinéticos (constante de taxa de associação (ka) e constante de taxa de dissociação (kd)) são determinadas a partir da curva de sensorgra- ma e a afinidade (KD) é determinada a partir da razão entre essas duas constantes.
Ensaio de inibição é preferivelmente usado nos métodos BIA- CORE.
Exemplos de tal ensaio de inibição são descritos em Proc.
Natl.
cad.
Sci.
USA (2006) 103(11), 4005-4010. Heterocomplexo compreendendo os quatro elementos de: duas moléculas de FcRn e uma molécula de receptor Fcγ de ativação Estudos cristalográficos sobre FcRn e anticorpos IgG demons- 5 traram que um complexo FcRn-IgG é composto de uma molécula de IgG para duas moléculas de FcRn, e as duas moléculas são pensadas se ligar próximo da interface dos domínios CH2 e CH2 localizados em ambos os la- dos da região Fc de IgG (Burmeister e outros (Nature (1994) 372, 336-343)). Entretanto, conforme mostrado no Exemplo 3 abaixo, a região Fc de anticor- po foi demonstrada ser capaz de formar um complexo contendo os quatro elementos de: duas moléculas de FcRn e uma molécula de receptor Fcγ de ativação (Fig. 48). Esta formação de heterocomplexo é um fenômeno que foi revelado como um resultado de análise das propriedades de moléculas de ligação a antígeno contendo uma região Fc tendo uma atividade de ligação a FcRn sob condições de faixa de pH neutro.
Sem ser limitado a um princípio particular, pode ser considerado que moléculas de ligação a antígeno administradas in vivo produzem os efei- tos descritos abaixo na farmacocinética in vivo (retendo no plasma) das mo- léculas de ligação a antígeno e na resposta imune (imunogenicidade) para as moléculas de ligação a antígeno, como um resultado da formação de he- terocomplexos contendo os quatro elementos de: a região Fc contida nas moléculas de ligação a antígeno, duas moléculas de FcRn e uma molécula de receptor Fcγ de ativação.
Conforme acima descrito, em adição aos vários tipos de receptor Fcγ de ativação, FcRn é expresso em células imunes, e a formação por moléculas de ligação a antígeno de tais complexos de quatro partes em células imunes sugere que afinidade com relação a células imu- nes é aumentada, e que domínios citoplásmicos são montados, levando à amplificação do sinal de internalização e promoção de incorporação a célu- las imunes.
O mesmo se aplica também a células apresentando antígeno e a possibilidade da formação de complexos de quatro partes na membrana ce- lular de células apresentando antígeno fazer com que as moléculas de liga- ção a antígeno sejam facilmente incorporadas a células apresentando antí-
geno é sugerida.
Em geral, moléculas de ligação a antígeno incorporadas a células apresentando antígeno são degradadas nos lisossomas das células apresentando antígeno e são apresentadas às células T.
Como resultado, devido ao fato da incorporação de moléculas de ligação a antígeno a células 5 apresentando antígeno ser promovida pela formação dos complexos de qua- tro partes descritos acima na membrana celular das células apresentando antígeno, retenção no plasma das moléculas de ligação a antígeno pode ser piorada.
Similarmente, uma resposta imune pode ser induzida (agravada). Por esta razão, é concebível que, quando uma molécula de liga- ção a antígeno tendo uma habilidade prejudicada em formar tais complexos de quatro partes é administrada ao corpo, retenção no plasma das molécu- las de ligação a antígeno melhoraria e indução de resposta imune no corpo seria suprimida.
As modalidades preferidas de tais moléculas de ligação a antígeno que inibem a formação desses complexos em células imunes, in- cluindo células apresentando antígeno, incluem as três modalidades descri- tas abaixo.
Modalidade 1: Uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob condições de uma fai- xa de pH neutro e cuja atividade de ligação com relação FcγR de ativação é menor do que a atividade de ligação de uma região Fc nativa com relação à atividade de FcγR A molécula de ligação a antígeno da Modalidade 1 forma um complexo de três partes através da ligação a duas moléculas de FcRn; no entanto, ela não forma nenhum complexo contendo FcγR de ativação (Fig. 49). Uma região Fc cuja atividade de ligação com relação a FcRγ de ativa- ção é menor do que a atividade de ligação de uma região Fc nativa com re- lação à atividade de FcγR pode ser preparada através da modificação dos aminoácidos da região Fc nativa conforme acima descrito.
Se a atividade de ligação com relação a FcγR de ativação da região Fc modificada é menor do que a atividade de ligação com relação à FcγR da região Fc nativa pode ser adequadamente testado usando os métodos descritos na seção "Atividade de Ligação" acima.
Exemplos de receptores Fcγ ativação preferidos incluem FcγRI (CD64) que inclui FcγRIa, FcγRIb e FcγRIc; FcγRIIa (incluindo alótipos R131 e H131); e FcγRIII (CD16) que inclui as isoformas FcγRIIIa (incluindo os aló- tipos V158 e F158) e FcγRIIIb (incluindo os alótipos FcγRIIIb-NA1 e FcγRII- 5 Ib-NA2). Para as condições de pH para medir a atividade de ligação da região Fc e o receptor Fcγ contido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção, condições em uma faixa de pH ácido ou em uma faixa de pH neutro podem ser adequadamente usadas.
A faixa de pH neutro, como uma condição para medir a atividade de ligação da região Fc e o receptor Fcγ contido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção, geral- mente indica pH 6,7 a pH 10,0. Preferivelmente, ela é uma faixa indicada com valores de pH arbitrários entre pH 7,0 e pH 8,0; e preferivelmente, ela é selecionada de pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8, pH 7,9 e pH 8,0; e particularmente preferivelmente, ela é pH 7,4, que é próximo do pH do plasma (sangue) in vivo.
Aqui, a faixa de pH ácido, como uma condição para ter uma atividade de ligação da região Fc e o re- ceptor Fcγ contido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção, geralmente indica pH 4,0 a pH 6,5. Preferivelmente, ela indica pH 5,5 a pH 6,5 e particularmente preferivelmente, ela indica pH 5,8 a pH 6,0, que é pró- ximo do pH no endossomo inicial in vivo.
Com relação à temperatura usada como condição de medição, a afinidade de ligação entre a região Fc e o re- ceptor Fcγ humano pode ser avaliada em qualquer temperatura entre 10°C e 50°C.
Preferivelmente uma temperatura entre 15°C e 40°C é usada para determinar a afinidade de ligação entre a região Fc humana e o receptor FcγR.
Mais preferivelmente, qualquer temperatura entre 20°C e 35°C, tal como qualquer uma de a partir de 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34° C ou 35°C, pode ser similarmente usada para determinar a afinidade de ligação entre a região Fc e o receptor Fcγ.
Uma temperatura de 25°C não é um exemplo limitant e em uma modalidade da presente invenção.
Aqui, "a atividade de ligação da variante de região Fc com rela-
ção ao receptor Fcγ de ativação é menor do que a atividade de ligação da região Fc nativa com relação ao receptor Fcγ de ativação" significa que a atividade de ligação da variante de região Fc com relação a qualquer um dos receptores Fcγ seres humanos de FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa e/ou FcγRIIIb é 5 menor do que a atividade de ligação da região Fc nativa com relação a es- ses receptores Fcγ seres humanos.
Por exemplo, significa que, com base no método analítico descrito acima, a atividade de ligação da molécula de liga- ção a antígeno contendo uma variante da região Fc é 95% ou menos, prefe- rivelmente 90% ou menos, 85% ou menos, 75% ou menos, particularmente preferivelmente 70% ou menos, 65% ou menos, 60% ou menos, 55% ou menos, 50% ou menos, 45% ou menos, 40% ou menos, 35% ou menos, 30% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, 9% ou menos, 8% ou menos, 7% ou menos, 6% ou menos, 5% ou menos, 4% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos ou 1% ou menos com- parado com a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc nativa como um controle.
Como região Fc nativa, a região Fc de partida pode ser usada, e regiões Fc de anticorpos do tipo sel- vagem de isotipos diferentes podem ser também usadas.
Entretanto, a atividade de ligação da forma nativa com relação a Fcγ de ativação é preferivelmente uma atividade de ligação com relação ao receptor Fcγ para IgG1 humano.
Para reduzir a atividade de ligação com relação ao receptor Fcγ, sem a realização das modificações descritas acima, o isotipo pode ser também mudado para IgG2 humano, IgG3 humano ou IgG4 humano.
Alternativamente, quando não realizando as modificações descritas acima, a atividade de ligação com relação ao receptor Fcγ pode ser também reduzida através da expressão da molécula de ligação a antíge- no contendo a região Fc tendo uma atividade de ligação com relação ao re- ceptor Fcγ em hospedeiros que não adicionam cadeias de açúcar, tal como Escherichia coli.
Como molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc que é usada como um controle, moléculas de ligação a antígeno tendo uma região Fc de um anticorpo IgG monoclonal podem ser adequadamente usa-
das.
As estruturas de tais regiões Fc são mostradas na SEQ ID NO: 1 (A é adicionado ao terminal N da RefSeq No. de Acesso AAC82527.1), SEQ ID NO: 2 (A é adicionado ao terminal N de da RefSeq.
No. de Acesso A- AB59393.1), SEQ ID NO: 3 (RefSeq No. de Acesso CAA27268.1) e SEQ ID 5 NO: 4 (A é adicionado ao terminal N da RefSeq No. de Acesso A- AB59394.1). Ainda, quando uma molécula de ligação contendo uma região Fc de um isotipo de anticorpo particular é usada como a substância de teste, o efeito da atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno contendo esta região Fc com relação ao receptor Fcγ é testado usando como um con- trole uma molécula de ligação a antígeno tendo uma região Fc de um anti- corpo IgG monoclonal deste isotipo particular.
Desta maneira, moléculas de ligação a antígeno contendo uma região Fc cuja atividade de ligação com relação ao receptor Fcγ foi demonstrada ser alta são adequadamente sele- cionadas.
Em uma modalidade não limitante da presente invenção, exem- plos preferidos de regiões Fc cuja atividade de ligação com relação a FcγR de ativação é menor do que aquela da região Fc nativa com relação a Fcγ de ativação incluem regiões Fc em que um ou mais aminoácidos em qual- quer uma das posições 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325, 328 e 329 conforme indicado pela numeração EU são modificados em ami- noácidos que são diferentes daqueles da região Fc nativa, dentre os amino- ácidos de uma região Fc descrita acima.
As modificações na região Fc não são limitadas ao exemplo acima e, então, elas podem ser, por exemplo, mo- dificações tais como desglicosilação (N297A e N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1- C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1- S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A e IgG4-L236E descrito em Current Opinion in Biotechology (2009) 20 (6), 685-691; modificações tais como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R e N325L/L328R descrito no WO 2008/092117; inserções de aminoácido nas posições 233, 234, 235 e 237 de acordo com a numeração EU; e modificações nas posições descritas no WO 2000/042072.
Em uma modalidade não limitante da presente invenção, exem- plos de uma região Fc favorável incluem regiões Fc tendo uma ou mais das modificações que seguem conforme indicado pela numeração EU em uma região Fc mencionada acima: 5 o aminoácido na posição 234 é qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr ou Trp; o aminoácido na posição 235 é qualquer um dentre Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Arg; o aminoácido na posição 236 é qualquer um dentre Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro ou Tyr; o aminoácido na posição 237 é qualquer um dentre Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr ou Arg; o aminoácido na posição 238 é qualquer um dentre Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp ou Arg; o aminoácido na posição 239 é qualquer um dentre Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr ou Arg; o aminoácido na posição 265 é qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val; o aminoácido na posição 266 é qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 267 é qualquer um dentre Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 269 é qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val; o aminoácido na posição 270 é qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val; o aminoácido na posição 271 é qualquer um dentre Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 295 em qualquer um dentre Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 296 é qualquer um dentre Arg, Gly, Lys ou Pro;
o aminoácido na posição 297 é qualquer um dentre Ala; o aminoácido na posição 298 é qualquer um dentre Arg, Gly, Lys, Pro, Trp ou Tyr; o aminoácido na posição 300 em qualquer um dentre Arg, Lys 5 ou Pro; o aminoácido na posição 324 é qualquer um dentre Lys ou Pro; o aminoácido na posição 325 é qualquer um dentre Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr ou Val; o aminoácido na posição 327 em qualquer um dentre Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val; o aminoácido na posição 328 é qualquer um dentre Arg, Asn, Gly, His, Lys ou Pro; o aminoácido na posição 329 é qualquer um dentre Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val ou Arg; o aminoácido na posição 330 é qualquer um dentre Pro ou Ser; o aminoácido na posição 331 é qualquer um dentre Arg, Gly ou Lys; ou o aminoácido na posição 332 é qualquer um dentre Arg, Lys ou Pro.
Modalidade 2: Uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob condições de uma fai- xa de pH neutro e cuja atividade de ligação com relação a FcγR inibidor é maior do que a atividade de ligação com relação ao receptor Fcγ de ativa- ção.
Através da ligação das duas moléculas de FcRn e uma molécula de Fcγ inibidor, a molécula de ligação a antígeno da Modalidade 2 pode for- mar um complexo compreendendo esses quatro elementos.
No entanto, uma vez que uma molécula de ligação a antígeno simples pode se ligar ape- nas a uma molécula de FcγR, a molécula de ligação a antígeno em um esta- do ligado a um FcγR não pode se ligar a outros FcγRs de ativação (Fig. 50). Ainda, foi relatado que moléculas de ligação a antígeno que são incorpora- das a células em um estado ligado a FcγR inibidor são recicladas na mem-
brana celular e então escapam de degradação intracelular (Immunity (2005) 23, 503-514). Desta maneira, moléculas de ligação a antígeno tendo ativida- de de ligação seletiva com relação a FcγR inibidor são pensadas ser capa- zes de formar heterocomplexos contendo FcγR de ativação e duas molécu- 5 las de FcRn, o que causa a resposta imune.
Exemplos de receptores Fcγ de ativação preferíveis incluem FcγRI (CD64) que inclui FcγRIa, FcγRIb e FcγRIc; FcγRIIa (incluindo alóti- pos R131 e H131); e FcγRIII (CD16) que inclui as isoformas FcγRIIIa (inclu- indo alótipos V158 e F158) e FcγRIIIb (incluindo alótipos FcγRIIIb-NA1 e FcγRIIIb-NA2). Entretanto, exemplos de receptores Fcγ inibidores preferidos incluem FcγRIIb (incluindo FcγRIIb-1 e FcγRIIb-2). Aqui, "a atividade de ligação com relação a FcγR inibidor é maior do que a atividade de ligação com relação ao receptor Fcγ de ativação" sig- nifica que a atividade de ligação da variante de região Fc com relação a FcγRIIb é maior do que a atividade de ligação com relação a qualquer um dos receptores Fcγ seres humanos FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa e/ou FcγRIIIb.
Por exemplo, significa que, com base no método analítico descrito acima, a atividade de ligação com relação a FcγRIIb da molécula de ligação a antíge- no contendo uma variante de região Fc é 105% ou mais, preferivelmente 110% ou mais, 120% ou mais, 130% ou mais, 140% ou mais, particularmen- te preferivelmente 150% ou mais, 160% ou mais, 170% ou mais, 180% ou mais, 190% ou mais, 200% ou mais, 250% ou mais, 300% ou mais, 350% ou mais, 400% ou mais, 450% ou mais 500% ou mais, 750% ou mais, 10 vezes ou mais, 20 vezes ou mais, 30 vezes ou mais, 40 vezes ou mais, 50 vezes ou mais comparado com a atividade de ligação com relação a qualquer um dos receptores Fcγ seres humanos de FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa e/ou FcγRII- Ib.
Sobretudo preferivelmente, a atividade de ligação com relação a FcγRIIb é maior do que cada uma das atividades de ligação com relação a FcγRIa, FcγRIIa (incluindo alótipos R131 e H131) e FcγRIIIa (incluindo alóti- pos V158 e F158). FcγRIa mostra afinidade notadamente alta com relação a IgG1 nativo; desta maneira, a ligação é pensada ser saturada in vivo devido à presença de uma grande quantidade de IgG1 endógeno.
Por esta razão, inibição de formação de complexo pode ser possível mesmo se a atividade de ligação com relação a FcγRIIb for maior do que as atividades de ligação com relação a FcγRIIa e FcγRIIIa e menor do que a atividade de ligação com 5 relação a FcγRIa.
Como molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc que é usada como um controle, moléculas de ligação a antígeno tendo uma região Fc de um anticorpo IgG monoclonal podem ser adequadamente usa- das.
As estruturas de tais regiões Fc são mostradas na SEQ ID NO: 11 (A é adicionado ao terminal N de RefSeq No. de Acesso AAC82527.1), SEQ ID NO: 12 (A é adicionado ao terminal N de RefSeq No. de Acesso A- AB59393.1), SEQ ID NO: 13 (RefSeq No. de Acesso CAA27268.1) e SEQ ID NO: 14 (A é adicionado ao terminal N de RefSeq No. de Acesso A- AB59394.1). Ainda, quando uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc de um isotipo de anticorpo particular é usada como a subs- tância de teste, o efeito da atividade de ligação da molécula de ligação a an- tígeno contendo essa região Fc com relação ao receptor Fcγ é testado u- sando como um controle uma molécula de ligação a antígeno tendo uma região Fc de um anticorpo IgG monoclonal deste isotipo particular.
Desta maneira, moléculas de ligação a antígeno contendo uma região Fc cuja ati- vidade de ligação com relação ao receptor Fcγ foi demonstrada ser alta são adequadamente selecionadas.
Em uma modalidade não limitante da presente invenção, exem- plos preferidos de regiões Fc tendo uma atividade de ligação seletiva com relação a Fcγ inibidor incluem regiões Fc nas quais, dentre os aminoácidos de uma região Fc descrita acima, o aminoácido em 328 ou 329 conforme indicado por numeração EU é modificado em um aminoácido que é diferente daquele da região Fc nativa.
Ainda, como as regiões Fc tendo atividade de ligação seletiva com relação a receptor Fcγ inibidor, as regiões Fc ou modifi- cações descritas na US 2009/0136485 podem ser adequadamente selecio- nadas.
Em outra modalidade não limitante da presente invenção, um exemplo preferido é uma região Fc tendo uma ou mais das modificações que seguem conforme indicado por numeração EU em uma região Fc menciona- da acima; o aminoácido na posição 238 é Asp; ou o aminoácido na posição 328 é Glu. 5 Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, exemplos de uma região Fc favorável incluem regiões Fc tendo uma ou mais das modificações que seguem: uma substituição de Pro na posição 238 de acordo com a nume- ração EU para Asp, o aminoácido nas posições 237 de acordo com numera- ção EU é Trp, o aminoácido na posição 237 de acordo com numeração EU é Phe, o aminoácido na posição 267 de acordo com a numeração EU é Val, o aminoácido na posição 267 de acordo com a numeração EU é Gln, o amino- ácido na posição 268 de acordo com a numeração EU é Asn, o aminoácido na posição 271 de acordo com a numeração EU é Gly, o aminoácido na po- sição 326 de acordo com a numeração EU é Leu, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Gln, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Glu, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Met, o aminoácido na posição 329 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 267 de acordo com a nume- ração EU é Ala, o aminoácido na posição 234 de acordo com a numeração EU é Trp, o aminoácido na posição 234 de acordo com a numeração EU é Tyr, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Ala, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Asp, o ami- noácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Glu, o aminoáci- do na posição 237 de acordo com a numeração EU é Leu, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Met, o aminoácido na posi- ção 237 de acordo com a numeração EU é Tyr, o aminoácido na posição 330 de acordo com a numeração EU é Lys, o aminoácido na posição 330 de acordo com a numeração EU é Arg, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 268 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 268 de acordo com a nume- ração EU é Glu, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração
EU é Asp, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Ser; o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Thr, o aminoácido na posição 323 de acordo com a numeração EU é Ile, o aminoá- cido na posição 323 de acordo com a numeração EU é Leu, o aminoácido na 5 posição 323 de acordo com a numeração EU é Met, o aminoácido na posi- ção 296 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Ala, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Asn e o aminoácido na posição 330 de acor- do com a numeração EU é Met.
Modalidade 3: Uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc, em que um dos polipeptídeos formando a região Fc tem uma atividade de ligação a FcRn sob condições de uma faixa de pH neutro e os outros não têm nenhuma atividade de ligação a FcRN sob condições de uma faixa de pH neutro.
Através da ligação a uma molécula de FcRn e uma molécula de FcγR, a molécula de ligação a antígeno da Modalidade 3 pode formar um complexo de três partes; no entanto, ela não forma nenhum heterocomplexo contendo os quatro elementos de duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR (Fig. 51). Como região Fc em que um dos dois polipeptídeos for- mando a região Fc tem uma atividade de ligação a FcRn sob condições de uma faixa de pH neutro e os outro não tem nenhuma atividade de ligação a FcRn sob condições de uma faixa de pH neutro contida na molécula de liga- ção a antígeno da Modalidade 3, regiões Fc derivadas de anticorpos especí- ficos podem ser adequadamente usadas.
Anticorpos biespecíficos são dois tipos de anticorpos tendo especificidades com relação a antígenos diferen- tes.
Anticorpos biespecíficos de tipo IgG podem ser secretados de hibrido- mas híbridos (quadromas) resultantes da fusão de dois tipos de hibridomas produzindo anticorpos IgG (Milstein e outros, Nature (1983) 305, 537-540). Quando uma molécula de ligação a antígeno da Modalidade 3 descrita acima é produzida usando técnicas recombinantes tais como aque- las descritas na seção acima "Anticorpo", pode ser usado um método em que genes codificando os polipeptídeos que constituem os dois tipos de re-
giões Fc de interesse são introduzidos em células para coexpressá-los.
No entanto, as regiões Fc produzidas serão uma mistura em que o que segue existirá em uma razão molecular de 2:1:1 regiões Fc em que um dos dois polipeptídeos que formam a região Fc tem uma atividade de ligação a FcRn 5 sob condições de uma faixa de pH neutro e o outro polipeptídeo não tem nenhuma atividade de ligação a FcRn sob condições de uma faixa de pH neutro; regiões Fc em que os dois polipeptídeos formando a região Fc am- bos têm uma atividade de ligação a FcRn sob condições de uma faixa de pH neutro; e regiões Fc em que os dois polipeptídeos que formam a região Fc ambos não têm qualquer atividade de ligação a FcRn sob condições de uma faixa de pH neutro.
É difícil purificar moléculas de ligação a antígeno conten- do as combinações desejadas de regiões Fc dos três tipos de IgGs.
Quando produzindo as moléculas de ligação a antígeno da Mo- dalidade 3 usando tais técnicas de recombinação, moléculas de ligação a antígeno contendo uma combinação heteromérica de regiões Fc podem ser preferivelmente secretadas através da adição de substituições de aminoáci- do apropriadas nos domínios CH3 constituindo as regiões Fc.
Especificamente, este método é conduzido através da substitui- ção de um aminoácido no domínio CH3 de uma das cadeias pesadas por um aminoácido tendo uma cadeia lateral maior (saliência (que significa "bojo") e substituição de um aminoácido no domínio CH3 da outra cadeia pesada por uma cadeia lateral menor (orifício (que significa "oco")) de maneira que a saliência é posta no orifício.
Isso promove formação de cadeia H heteroméri- ca e inibe simultaneamente formação de cadeia H homomérica (WO1996027011; Ridgway e outros, Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant e outros, Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681). Ainda, há também técnicas conhecidas para produção de um an- ticorpo específico através da aplicação de métodos para controle de associ- ação de polipeptídeo ou associação de multímeros heteroméricos formados por polipeptídeos à associação entre os dois polipeptídeos que formam uma região Fc.
Especificamente, métodos para controle de associação de poli- peptídeo podem ser empregados para produzir um anticorpo biespecífico
(WO 2006/106905), em que resíduos de aminoácido que formam a interface entre os dois polipeptídeos que formam a região Fc são alterados para inibir a associação entre regiões Fc tendo a mesma sequência e permitir a forma- ção de complexos de polipeptídeo formados por duas regiões Fc de sequên- 5 cias diferentes.
Tais métodos podem ser usados para preparação da molé- cula de ligação a antígeno da modalidade 3 da presente invenção.
Em uma modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos constituindo uma região Fc derivada de um anticorpo biespecí- fico descrito acima podem ser adequadamente usados como a região Fc.
Mais especificamente, dois polipeptídeos constituindo uma região Fc podem ser adequadamente usados, em que, da sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 349 conforme indicado pela nu- meração EU é Cys e o aminoácido na posição 366 é Trp e da sequência de aminoácido do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356 con- forme indicado pela numeração EU é Cys, o aminoácido na posição 366 é Ser, o aminoácido na posição 368 é Ala e o aminoácido na posição 407 é Val.
Em outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos constituindo uma região Fc, em que, da sequência de aminoá- cido de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp e da sequência de aminoácido do outro dos polipep- tídeo o aminoácido na posição 399 de acordo com a numeração EU é Lys, podem ser adequadamente usados como a região Fc.
Na modalidade acima, o aminoácido na posição 409 pode ser Glu ao invés de Asp e o aminoácido na posição 399 pode ser Arg ao invés de Lys.
Além disso, em adição ao a- minoácido Lys na posição 399, Asp pode ser adequadamente adicionado como aminoácido na posição 360 ou Asp pode ser adequadamente adicio- nado como aminoácido na posição 392. Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos constituindo uma região Fc, em que, da sequência de a- minoácido de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU é Glu, e da sequência de aminoácido do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU é Lys, podem ser adequadamente usados como a região Fc.
Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos constituindo uma região Fc, em que, da sequência de a- 5 minoácido de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 439 de acordo com a numeração EU é Glu, e da sequência de aminoácido do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU é Lys, podem ser adequadamente usados como a região Fc.
Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, qualquer uma das modalidades indicadas abaixo, em que o acima foi combi- nado, pode ser adequadamente usada como a região Fc: dois polipeptídeos constituindo uma região Fc, em que, da se- quência de aminoácido de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp e o aminoácido na posição 370 é Glu, e da sequência de aminoácido do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a numeração EU é Lys e o aminoácido na posição 357 é Lys (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 de a- cordo com a numeração EU pode ser Asp ao invés de Glu e o aminoácido Asp na posição 392 de acordo com a numeração EU pode ser usado ao in- vés do aminoácido Glu na posição 370 de acordo com a numeração EU); dois polipeptídeos constituindo uma região Fc, em que, da se- quência de aminoácido de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp e o aminoácido na posição 439 é Glu, e da sequência de aminoácido do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a numeração EU é Lys e o aminoácido na posição 356 é Lys (nesta modalidade, o aminoácido Asp na posição 360 de acordo com a numeração EU, o aminoácido Asp na posição 392 de acordo com numeração EU ou o aminoácido Asp na posição 439 de acordo com a numeração EU pode ser usado ao invés do aminoácido Glu na posição 439 de acordo com a numeração EU); dois polipeptídeos constituindo uma região Fc, em que, da se- quência de aminoácido de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição
370 de acordo com a numeração EU é Glu e o aminoácido na posição 439 é Glu e da sequência de aminoácido do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU é Lys e o aminoácido na posição 356 é Lys; e 5 dois polipeptídeos constituindo uma região Fc, em que, da se- quência de aminoácido de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 370 é Glu e o aminoácido na posição 439 é Glu, e da sequência de aminoácido do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 399 de acordo com a nu- meração EU é Lys, o aminoácido na posição 357 é Lys, e o aminoácido na posição 356 é Lys (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 de a- cordo com numeração EU pode não ser substituído para Glu, e, ainda, quando o aminoácido na posição 370 não é substituído para Glu, o aminoá- cido na posição 439 pode ser Asp ao invés de Glu, ou o aminoácido Asp na posição 392 pode ser usado ao invés do aminoácido Glu na posição 439). Ainda, em outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos constituindo uma região Fc, em que, da sequência de a- minoácido de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU é Lys, e da sequência de aminoácido do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 435 de acordo com a numeração EU é Arg e o aminoácido na posição 439 é Glu, podem ser adequadamente u- sados.
Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc, em que, da sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, o aminoácido na posição 356 de acor- do com a numeração EU é Lys e o aminoácido na posição 357 é Lys, e da sequência de aminoácido do outro dos polipeptídeos, o aminoácido na posi- ção 370 de acordo com a numeração EU é Glu, o aminoácido na posição 435 é Glu e o aminoácido na posição 439 é Glu, podem ser também ade- quadamente usados.
Essas moléculas de ligação a antígeno das Modalidades 1 a 3 são esperadas serem capazes de reduzir imunogenicidade e melhorar re-
tenção no plasma comparado com moléculas de ligação a antígenos capa- zes de formação de complexos de quatro partes.
Diminuição de resposta imune (redução de imunogenicidade) Se a resposta imune contra a molécula de ligação a antígeno da 5 presente invenção foi modificada pode ser avaliado através da medição da reação da resposta em um organismo ao qual uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação a antígeno como um ingrediente ativo foi administrada.
Reações de resposta de um organismo incluem principal- mente duas respostas imunes: imunidade celular (indução de células T cito- tóxicas que reconhecem fragmentos de peptídeo de moléculas de ligação a antígenos ligadas a MHC classe 1) e imunidade humoral (indução de produ- ção de anticorpos que se ligam a moléculas de ligação de antígeno). Com relação a agentes farmacêuticos de proteína em particular, a produção de anticorpos contra as moléculas de ligação a antígeno administradas é referi- da como imunogenicidade.
Há dois tipos de métodos para avaliação da imu- nogenicidade: métodos para avaliação de produção de anticorpo in vivo e métodos para avaliação da reação de células imunes in vitro.
A resposta imune in vivo (imunogenicidade) pode ser avaliada através da medição do título de anticorpo após administração das moléculas de ligação a antígeno a um organismo.
Por exemplo, títulos de anticorpo são medidos após administração de moléculas de ligação a antígeno A e B a camundongos.
Quando o título de anticorpo para a molécula de ligação a antígeno A é maior do que aquele para B, ou quando seguindo a administra- ção a vários camundongos, administração de molécula de ligação a antígeno A proveu uma incidência maior de camundongos com título de anticorpo ele- vado, então A é julgada ter imunogenicidade maior do que B.
Os títulos de anticorpo podem ser medidos usando métodos para medição de moléculas que se ligam especificamente a moléculas administradas usando ELISA, ECL ou SPR que são conhecidos daqueles versados na técnica (J.
Pharm.
Biomed.
Anal. (2011) 55 (5), 878-888). Métodos para avaliação in vitro da resposta imune de um orga- nismo contra as moléculas de ligação a antígeno (imunogenicidade) incluem métodos de reação in vitro de células humanas mononucleares de sangue periférico isoladas de doadores (ou suas células fracionadas) com moléculas de ligação a antígeno e medição do número de célula ou porcentagem de células T auxiliares e similares que reagem ou proliferam ou a quantidade de 5 citocinas produzidas (Clin.
Immunol. (2010) 137 (1), 5-14; Drugs R.D. (2008) 9 (6), 385-396). Por exemplo, quando da avaliação de moléculas de ligação a antígeno A e B através de tais testes de imunogenicidade in vitro, quando a resposta com molécula A de ligação a antígeno foi maior do que aquela com B, ou quando vários doadores foram avaliados e a taxa positiva de rea- ção com molécula A de ligação a antígeno foi maior, então A é julgado ter imunogenicidade maior do que B.
Sem ser limitado a uma teoria particular, uma vez que moléculas de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro podem formar complexos de tetrâmero hetero compreendendo duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR na membrana celular de célu- las apresentando antígeno, a resposta imune é pensada ser prontamente induzida devido à incorporação aumentada em células apresentando antíge- no.
Há sítios de fosforilação nos domínios intracelulares de FcγR e RcRn.
Em geral, fosforilação dos domínios intracelulares de receptores expressos em uma superfície celular ocorre quando da montagem dos receptores e sua fosforilação causa internalização de receptores.
Montagem dos domínios intracelulares de FcγR não ocorre mesmo se IgG1 nativo formar um comple- xo dimérico de FcγR/IgG1 em células apresentando antígeno.
No entanto, no caso de uma molécula de IgG1 tendo uma atividade de ligação com rela- ção a FcRn sob condições de uma faixa de pH neutro formar um complexo contendo os quatro elementos de FcγR/duas moléculas de FcRn/IgG, os três domínios intracelulares do FcγR e FcRn se reuniram, e é possível que como um resultado, internalização do heterocomplexo contendo os quatro elemen- tos de FcγR/duas moléculas de FcRn/IgG seja induzida.
Os heterocomple- xos contendo os quatro elementos de FcγR/duas moléculas de FcRn/IgG são pensados ser formados em células expressando antígeno coexpressan- do FcγR e FcRn, e é possível que a quantidade de moléculas de anticorpo incorporadas a células apresentando antígeno seja então aumentada, resul- tando em imunogenicidade piorada.
É pensado que, através da inibição da formação de complexo mencionada acima em células apresentando antíge- no usando qualquer um dos métodos da Modalidade 1, 2 ou 3, incorporação 5 em células apresentando antígeno pode ser reduzida e, consequentemente, imunogenicidade pode ser aperfeiçoada.
Aperfeiçoamento da farmacocinética Sem ser limitado a um princípio particular, as razões pelas quais o número de antígenos que uma molécula de ligação a antígeno única pode se ligar é aumentado e o motivo pelo qual a dissipação de concentração de antígeno no plasma é acelerada seguindo promoção de incorporação às cé- lulas de um organismo quando da administração ao organismo de, por e- xemplo, uma molécula de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc tendo uma atividade de ligação com relação a FcRn humano sob condições de uma faixa de pH neutro e um domínio de ligação a antígeno cuja ativida- de de ligação a antígeno muda dependendo das condições de concentra- ções de íon de maneira que a atividade de ligação a antígeno sob condições de uma faixa de pH ácido é menor do que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH neutro podem ser explicados, por exemplo, como se- gue.
Por exemplo, quando a molécula de ligação a antígeno é um an- ticorpo que se liga a um antígeno de membrana, o anticorpo administrado ao corpo se liga ao antígeno e então é absorvido via internalização em endos- somos nas células junto com o antígeno enquanto o anticorpo é mantido li- gado ao antígeno.
Então, o anticorpo se desloca para os lisossomas en- quanto o anticorpo é mantido ligado a antígeno e o anticorpo é degradado pelo lisossoma junto com o antígeno.
A eliminação mediada por internaliza- ção a partir do plasma é chamada eliminação dependente de antígeno, e tal eliminação foi relatada com várias moléculas de anticorpo (Drug.
Discov.
Today (2006) 11(1-2): 81-88). Quando uma molécula única de anticorpo IgG se liga a antígenos de uma maneira divalente, a molécula de anticorpo única é internalizada enquanto o anticorpo é mantido ligado às duas moléculas de antígeno e degradado no lisossomo.
Desta maneira, no caso de anticorpos comuns, uma molécula de anticorpo IgG não pode ser ligar a três ou mais moléculas de antígeno.
Por exemplo, uma molécula de anticorpo IgG única tendo uma atividade de neutralização não pode neutralizar três ou mais mo- 5 léculas de antígeno.
A retenção relativamente prolongada (eliminação lenta) de molé- culas de IgG no plasma é devido à função de FcRn humano que é conhecido como um receptor selvagem de moléculas de IgG.
Quando absorvidas em endossomo via pinocitose, moléculas de IgG se ligam a FcRn humano ex- presso nos endossomos sob a condição ácida nos endossomos.
Enquanto moléculas de IgG que não se ligam a FcRn humano se transferem para li- sossomos em que elas são degradadas.
Moléculas de IgG que são ligadas a FcRn humano se deslocam para a superfície celular e retornam novamente no plasma através de dissociação de FcRn humano sob a condição neutra no plasma.
Alternativamente, quando a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo que se liga a um antígeno solúvel, o anticorpo administrado ao corpo se liga ao antígeno e então é absorvido nas células enquanto o anti- corpo é mantido ligado ao antígeno.
A maioria dos anticorpos incorporados às células se liga a FcRn nos endossomas e se desloca para a superfície celular.
Anticorpos dissoci- am de FcRn humano sob a condição neutra no plasma e são liberados para o exterior das células.
No entanto, anticorpos tendo domínios de ligação a antígeno comuns cuja atividade de ligação a antígeno não muda dependen- do das condições de concentração de íon tal como pH são liberados para o exterior das células enquanto permanecendo ligados aos antígenos; desta maneira, eles são incapazes de se ligar novamente a antígenos.
Desta ma- neira, similarmente a anticorpos que se ligam a antígenos de membrana, uma molécula de anticorpo IgG comum única cuja atividade de ligação a an- tígeno não muda dependendo das condições de concentração de íon tal co- mo pH é incapaz de se ligar a três moléculas de antígeno ou mais.
Anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependen-
te do pH, anticorpos que se ligam fortemente a antígenos sob condições de uma faixa de pH neutro no plasma e dissociado dos antígenos sob condi- ções de uma faixa de pH ácido nos endossomos (anticorpos que se ligam a antígenos sob condições de uma faixa de pH neutro e dissociam sob condi- 5 ções de uma faixa de pH ácido) e anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente da concentração de íon de cálcio, anticorpos que se ligam fortemente a antígeno sob condições de uma concentração de íon de cálcio alta no plasma e dissociam dos antígenos sob condições de uma concentração de íon de cálcio baixa nos endossomos (anticorpos que se ligam a antígenos sob condições de uma concentração de íon de cálcio alta e dissociam sob condições de uma concentração de íon de cálcio baixa) po- dem dissociar dos antígenos nos endossomos.
Anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente do pH ou anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente da concentração de íon de cálcio são capazes de se ligar a antígenos novamente após eles dissociarem dos antígenos e são reciclados para o plasma através de FcRn.
Desta maneira, uma molécula de anticorpo única pode se ligar repetidamente a várias molé- culas de antígeno.
Entretanto, os antígenos ligados às moléculas de ligação a antígeno dissociam dos anticorpos nos endossomos e são degradados nos lisossomos sem serem reciclados para o plasma.
Através da administração de tais moléculas de ligação a antígeno a organismos, incorporação de antí- genos a células é promovida e a concentração de antígeno no plasma pode ser reduzida.
Incorporação em células de antígenos contra os quais moléculas de ligação a antígeno se ligam é ainda promovida ao fornecer uma habilida- de em ligar a FcRn humano sob condições de uma faixa de pH neutro (pH 7,4) a anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente do pH, anticorpos que se ligam fortemente a antígenos sob condições de uma faixa de pH neutro no plasma e dissociam dos antígenos sob condições de uma faixa de pH ácido nos endossomos (anticorpos que se ligam a antíge- nos sob condições de uma faixa de pH neutro e dissociam sob condições de uma faixa de pH ácido), e anticorpos que se ligam a antígenos de uma ma-
neira dependente da concentração de íon de cálcio, anticorpos que se ligam fortemente a antígenos sob condições de uma concentração de íon de cálcio alta no plasma e dissociam dos antígenos sob condições de uma concentra- ção de íon de cálcio baixa nos endossomos (anticorpos que se ligam a antí- 5 genos sob condições de uma concentração de íon de cálcio alta e dissociam sob condições de uma concentração de íon de cálcio baixa). Desta maneira, através da administração de tais moléculas de ligação a antígeno a organis- mos, eliminação de antígeno é promovida e a concentração de antígeno no plasma pode ser reduzida.
Anticorpos comuns que não têm a habilidade em se ligar a antígenos de uma maneira dependente do pH ou a habilidade em se ligar a antígenos de uma maneira dependente da concentração de íon de cálcio, bem como seus complexos de antígeno-anticorpo, são incorporados a células através de endocitose não específica, transportados para a super- fície celular seguindo ligação com FcRn sob a condição ácida nos endosso- mas e reciclados no plasma seguindo dissociação do FcRn sob a condição neutra na superfície celular.
Por esta razão, quando um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira suficientemente dependente do pH (que se liga sob condições de uma faixa de pH neutro e dissocia sob condições de uma faixa de pH ácido) ou um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente da concentração de íon de cálcio suficiente (que se liga sob condições de uma concentração de íon de cálcio alta e dissocia sob condições de uma concentração de íon de cálcio baixa) se liga a um antíge- no no plasma e dissocia nos endossomas do antígeno que ele está ligado, a taxa de eliminação de antígeno será equivalente à taxa de incorporação a células através de endocitose não específica do anticorpo ou complexo antí- geno-anticorpo do mesmo.
Quando a dependência do pH ou a dependência da concentração de íon de cálcio da ligação entre os anticorpos e os antíge- nos é insuficiente, os antígenos que não dissociam dos anticorpos nos en- dossomos serão reciclados para o plasma junto com os anticorpos.
No en- tanto, quando a dependência do pH ou dependência da concentração de íon de cálcio é suficiente, a taxa de incorporação em células através de endoci- tose não específica será limitante de taxa para a taxa de eliminação de antí-
geno.
Entretanto, uma vez que FcRn transporta anticorpos dos endossomas para a superfície celular, uma parte do FcRn é pensada também estar pre- sente na superfície celular.
Em geral, imunoglobulina tipo IgG, que é uma modalidade da 5 molécula de ligação a antígeno, não mostra qualquer atividade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro.
Os presentes inventores consideraram que i- munoglobulina tipo IgG tendo uma atividade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro pode se ligar a FcRn na superfície celular e será incorporada a células de uma maneira dependente de FcRn através de ligação a FcRn na superfície celular.
A taxa de incorporação mediada por FcRn a células é mais rápida do que a incorporação a células através de endocitose não es- pecífica.
Desta maneira, os presente inventores consideraram que a taxa de eliminação de antígeno pelas moléculas de ligação a antígeno pode ser ace- lerada mais conferindo uma habilidade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro.
Especificamente, moléculas de ligação a antígeno tendo habilidade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro enviariam antígenos para células mais rapidamente do que as imunoglobulinas do tipo IgG nativas, liberariam os antígenos nos endossomas, seriam recicladas para a superfície celular ou plasma novamente, novamente se ligando a antígenos lá, e seriam incorpo- radas novamente a células via FcRn.
A taxa deste ciclo pode ser acelerada aumentando a habilidade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro; desta maneira, a taxa de eliminação dos antígenos a partir do plasma é acelerada.
Além disso, a taxa de eliminação de antígeno a partir do plasma pode ser acelerada mais através da redução da atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido de uma molécula de ligação a antígeno comparado com a atividade de ligação a antígeno na faixa de pH neutro.
Ainda, o núme- ro de moléculas de ligação a antígeno às quais uma molécula de ligação a antígeno única pode se ligar é pensado aumentar devido ao aumento no número de ciclos que resulta da aceleração da taxa deste ciclo.
As molécu- las de ligação a antígeno da presente invenção compreendem um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a FcRn, e o domínio de liga- ção a FcRn não afeta a ligação a antígeno.
Além disso, à luz do mecanismo descrito acima, elas não dependem do tipo dos antígenos.
Desta maneira, através da redução da atividade de ligação a antígeno (habilidade de liga- ção) de uma molécula de ligação a antígeno sob condições de uma faixa de pH ácido ou concentrações de íon tal como concentração de íon de cálcio 5 baixa comparado com a atividade de ligação a antígeno (habilidade de liga- ção) sob condições de uma faixa de pH neutro ou concentrações de íon tal como concentração de íon de cálcio alta e/ou através do aumento da ativi- dade de ligação a FcRn sob o pH do plasma, incorporação a células dos an- tígenos pelas moléculas de ligação a antígeno pode ser promovida e a taxa de eliminação de antígeno pode ser acelerada.
Aqui, "incorporação de antígeno a células" por moléculas de li- gação a antígeno significa que os antígenos são incorporados a células atra- vés de endocitose.
Ainda, aqui, "promover incorporação a células" indica que a taxa de incorporação a células das moléculas de ligação a antígeno que se ligam a antígenos no plasma é promovida e/ou a quantidade de antígenos incorporados que são reciclados para o plasma é reduzida.
Neste caso, a taxa incorporação a células de uma molécula de ligação a antígeno que tem uma atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro ou de uma molécula de ligação a antígeno que tem esta atividade de ligação a FcRn humano e cuja atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela na faixa de pH neutro deve promovida quando compa- rado com uma molécula de ligação a antígeno que não tem uma atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro ou a uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela na faixa de pH neutro.
Em outra modalidade, a taxa de incorporação a células de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção é preferivelmente promovida comparado com aquela de uma IgG humano, e particularmente preferivelmente ela é promovida comparado com aquela de um IgG humano nativo.
Desta maneira, na presente invenção, se ou não incorporação por moléculas de ligação a antígeno de antígenos a células é promovida pode ser determinado com base em se a taxa de incor- poração de antígeno a células é aumentada ou não.
A taxa de incorporação celular de antígenos pode ser medida, por exemplo, através da adição das moléculas de ligação a antígeno e antígenos a um meio de cultura contendo células expressando FcRn humano e medindo a redução com o tempo da concentração do antígeno no meio ou através de medição com o tempo da 5 quantidade de antígenos incorporados a células expressando FcRn humano.
Ao usar os métodos para promoção da incorporação celular de antígenos mediada pelas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, por exemplo, através da administração das moléculas de ligação a antígeno, a taxa de eliminação de antígeno a partir do plasma pode ser promovida.
Des- ta maneira, se ou não incorporação por moléculas de ligação a antígeno de antígenos a células é promovida pode ser também avaliado, por exemplo, através da medição de se ou não a taxa de eliminação dos antígenos pre- sentes no plasma é acelerada ou medição de se a concentração de antígeno total no plasma é reduzida após administração das moléculas de ligação a antígeno ou não.
Aqui, "IgG humana nativa" se refere a um IgG humana não mo- dificada, e não é limitado a uma subclasse de IgG particular.
Isso significa que IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana pode ser usado coma "IgG humana nativa" contanto que ela seja capaz de se ligar a FcRn humano em uma fai- xa de pH ácido.
Preferivelmente, a "IgG humana nativa" pode ser IgG1 hu- mana.
Aqui, a "habilidade em eliminar os antígenos em plasma" se re- fere à habilidade em eliminar os antígenos presentes no plasma do plasma após administração in vivo das moléculas de ligação a antígeno ou secreção in vivo das moléculas de ligação a antígeno.
Desta maneira, aqui, "a habili- dade das moléculas de ligação a antígeno em eliminar os antígenos no plasma é aumentada" significa que, quando as moléculas de ligação a antí- geno são administradas, a atividade de ligação a FcRn humano das molécu- las de ligação a antígeno na faixa de pH neutro é aumentada, ou que, em adição a este aumento da atividade de ligação a FcRn humano, a taxa de eliminação de antígeno do plasma é acelerada comparado com antes redu- zindo a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido compara-
do com aquela na faixa de pH neutro.
Se ou não a habilidade de uma molé- cula de ligação a antígeno em eliminar os antígenos no plasma é aumentada pode ser avaliado, por exemplo, através da administração de antígenos so- lúveis e da molécula de ligação a antígeno in vivo e medição da concentra- 5 ção no plasma dos antígenos solúveis após administração.
Se a concentra- ção dos antígenos solúveis no plasma for diminuída após administração dos antígenos solúveis e das moléculas de ligação a antígeno após aumento da atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro das moléculas de ligação a antígeno ou, em adição ao aumento desta atividade de ligação a FcRn humano, redução da atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido comparado com aquela na faixa de pH neutro, então a habilidade das moléculas de ligação a antígeno em elimintar o antígeno no plasma é julgada ser aumentada.
O antígeno solúvel pode ser um antígeno que é liga- do a uma molécula de ligação a antígeno ou um antígeno que não é ligado a uma molécula de ligação a antígeno, e sua concentração pode ser determi- nada como uma "concentração no plasma do antígeno ligado a moléculas de ligação a antígeno" ou como uma "concentração no plasma do antígeno que não é ligado às moléculas de ligação a antígeno", respectivamente (a última é sinônimo de "concentração de antígeno livre em plasma"). "A concentração de antígeno total no plasma" significa a soma de concentração de molécula de ligação a antígeno ligada a antígeno e não ligada a antígeno ou a "a con- centração de antígeno livre no plasma" que é a concentração de antígeno não ligado à molécula de ligação a antígeno.
Desta maneira, a concentração de antígeno solúvel pode ser determinada como a "concentração de antíge- no total no plasma". Vários métodos para medição da "concentração de antígeno to- tal no plasma" ou "concentração de antígeno livre no plasma" são bem co- nhecidos na técnica conforme descrito a seguir.
Aqui, "aumento da farmaco- cinética", "melhora da farmacocinética" e "farmacocinética superior" podem ser relacionados com "aumento da retenção no plasma (sangue)", "melhora da retenção no plasma (sangue)", "retenção no plasma (sangue) superior" e "retenção no plasma (sangue) prolongada". As expressões são sinônimas.
Aqui, "melhora da farmacocinética" significa não apenas prolon- gamento do período até a eliminação do plasma (por exemplo, até a molécu- la de ligação a antígeno ser degradada intracelularmente ou similar e não poder retornar para o plasma) após administração da molécula de ligação a 5 antígeno a seres humanos, ou animais não seres humanos tais como ca- mundongos, ratos, macacos, coelhos e cachorros, mas também prolonga- mento da retenção no plasma da molécula de ligação a antígeno em uma forma que permita ligação a antígeno (por exemplo, em uma forma livre de antígeno da molécula de ligação a antígeno) durante o período de adminis- tração até eliminação devido à degradação.
IgG humana tendo uma região Fc do tipo selvagem pode se ligar a FcRn de animais não seres humanos.
Por exemplo, camundongo pode ser preferivelmente usado para ser admi- nistrado a fim de confirmar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da invenção uma vez que IgG humana tendo região Fc do tipo selvagem pode se ligar a FcRn de camundongo muito mais forte do que FcRn humano (Int.
Immunol. (2001) 13(12): 1551-1559). Como outro exemplo, camundon- go em que seus genes FcRn nativos são rompidos e um transgene para ge- ne FcRn humano é carregado para ser expresso (Methods Mol.
Biol. 2010; 602: 93-104) pode ser também preferivelmente usado para ser administrado a fim de confirmar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da in- venção descrita a seguir.
Especificamente, "aperfeiçoamento da farmacoci- nética" também inclui prolongamento do período até eliminação devido à degradação da molécula de ligação a antígeno não ligada a antígenos (a forma livre de antígeno de molécula de ligação a antígeno). A molécula de ligação ao antígeno no plasma não pode se ligar a um novo antígeno se a molécula de ligação ao antígeno já estiver ligada a um antígeno.
Assim, quanto mais longo for o período em que a molécula de ligação ao antígeno não está ligada a um antígeno, mais longo é o período que esta pode se ligar a um novo antígeno (maior a chance de ligação a ou- tro antígeno). Isto possibilita a redução do período de tempo que um antíge- no fica livre da molécula de ligação ao antígeno in vivo e o prolongamento do período que um antígeno fica ligado à molécula de ligação ao antígeno.
A concentração plasmática da forma livre de antígeno de molécula de ligação ao antígeno pode ser aumentada e o período que o antígeno fica ligado à molécula de ligação ao antígeno pode ser prolongado através da aceleração da eliminação dos antígenos do plasma através da administração da molé- 5 cula de ligação ao antígeno.
Especificamente, "aperfeiçoamento da farma- cocinética de molécula de ligação a antígeno" inclui o aperfeiçoamento de um parâmetro farmacocinético da forma livre da molécula de ligação a antí- geno (qualquer prolongamento da meia-vida em plasma, prolongamento de tempo de retenção médio em plasma e diminuição de eliminação do plas- ma), prolongamento do período que o antígeno é ligado à molécula de liga- ção a antígeno após administração da molécula de ligação a antígeno e se os parâmetros farmacocinéticos são aceleração aperfeiçoada de eliminação de antígeno mediadada por molécula de ligação a antígeno do plasma.
O aperfeiçoamento de farmacocinética de molécula de ligação a antígeno pode ser avaliado através da determinação de qualquer um dos parâmetros, meia- vida em plasma, tempo de retenção médio no plasma e eliminação do plas- ma para a molécula de ligação a antígeno ou forma livre de antígeno da mesma ("Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nanzando). Por exemplo, a concentração plasmática da molécula de ligação ao antígeno ou da sua forma livre de antígeno é determinada a- pós a administração da molécula de ligação ao antígeno a camundongos, ratos, macacos, coelhos, cachorros ou seres seres humanos.
Então, cada parâmetro é determinado.
Quando a meia-vida no plasma ou o tempo médio de retenção no plasma é prolongado, a farmacocinética da molécula de liga- ção a antígeno pode ser julgada ser aperfeiçoada.
Os parâmetros podem ser determinados através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica.
Os parâmetros podem ser apropriadamente avaliados, por exemplo, através de análise não compartimental utilizando o programa de análise farmacoci- nética WinNonlin (Pharsight) de acordo com o manual de instruções em a- nexo.
A concentração plasmática de molécula de ligação ao antígeno livre de antígeno pode ser determinada através de métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, utilizando o método de ensaio descrito em
Clin Pharmacol. 2008 Abr; 48(4): 406-417. Aqui, "aperfeiçoamento da farmacocinética" também inclui pro- longamento do período que um antígeno é ligado a uma molécula de ligação a antígeno após administração da molécula de ligação a antígeno.
Se o pe- 5 ríodo que um antígeno é ligado à molécula de ligação a antígeno após admi- nistração da molécula de ligação a antígeno é prolongado pode ser avaliado através da determinação da concentração no plasma do antígeno livre.
O prolongamento pode ser julgado com base na concentração no plasma de- terminada do antígeno livre ou no período de tempo requerido para um au- mento na razão de concentração de antígeno livre para a concentração de antígeno total.
A concentração no plasma do antígeno livre não ligado à molé- cula de ligação a antígeno ou a razão de concentração de antígeno livre pa- ra a concentração total pode ser determinada através de métodos conheci- dos daqueles versados na técnica, por exemplo, através do método usado em Pharm.
Res. 2006 Jan; 23(1): 95-103. Alternativamente, quando um an- tígeno mostra uma função particular in vivo, pode-se avaliar se o antígeno está ligado a uma molécula de ligação ao antígeno que netraliza a função do antígeno (molécula antagonista) ao testar se a função do antígeno é neutra- lizada.
Pode-se avaliar se a função do antígeno é neutralizada ao testar um marcador in vivo que reflete a função do antígeno.
Pode-se avaliar se o antí- geno está ligado a uma molécula de ligação ao antígeno que ativa a função do antígeno (molécula agonista) ao testar um marcador in vivo que reflete a função do antígeno.
Determinação da concentração no plasma de antígeno livre e a razão da quantidade de antígeno livre no plasma para a quantidade de antí- geno total em plasma, ensaio de marcador in vivo, e tais medições não são particularmente limitadas; entretanto, os ensaios são executados, de prefe- rência, após um determinado período de tempo ter passado após a adminis- tração da molécula de ligação ao antígeno.
Na presente invenção, o período após a administração da molécula de ligação ao antígeno não é particular- mente limitado; os versados na técnica podem determinar o período ade-
quado dependendo das propriedades e similar da molécula de ligação ao antígeno administrada.
Tais períodos incluem, por exemplo, um dia após a administração da molécula de ligação ao antígeno, três dias após a adminis- tração da molécula de ligação ao antígeno, sete dias após a administração 5 da molécula de ligação ao antígeno, 14 dias após a administração da molé- cula de ligação ao antígeno, e 28 dias após a administração da molécula de ligação ao antígeno.
Aqui, o conceito "concentração de antígeno no plasma" compreende ambos a "concentração de antígeno total no plasma" que é a soma de antígeno ligado à molécula de ligação a antígeno e concentração de antígeno não ligado ou "concentração de antígeno livre em plasma" que é a concentração de antígeno não ligado à molécula de ligação a antígeno.
A concentração de antígeno total no plasma pode ser diminuída através da administração de molécula de ligação a antígeno da presente invenção em 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes ou ainda maior comparado com a admi- nistração de uma molécula de ligação a antígeno de referência compreen- dendo a região Fc de IgG do tipo selvagem como uma molécula de ligação a antígeno de referência ou comparado com quando molécula de domínio de ligação a antígeno da presente invenção não é administrada.
A razão de antígeno /molécula de ligação a antígeno molar pode ser calculada conforme mostrado abaixo; valor A: Concentração de antígeno molar em cada ponto de tempo valor B: Concentração de molécula de ligação a antígeno molar em cada ponto de tempo valor C: Concentração de antígeno molar com concentração de molécula de ligação a antígeno molar (razão de antígeno/molécula de liga- ção a antígeno molar) em cada ponto de tempo C=A/B O valor C menor indica eficiência maior de eliminação de antíge- no por molécula de ligação a antígeno enquanto valor de C maior indica efi- ciencia menor de eliminação de antígeno por molécula de ligação a antíge-
no.
Razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar pode ser calculada conforme acima descrito.
A razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar pode 5 ser diminuída através da administração de molécula de ligação a antígeno da presente invenção em 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes ou ainda mais comparado com a administração de uma molécula de ligação a antígeno de referência compreendendo a região Fc de IgG humana do tipo selvagem como um do- mínio de ligação a FcRn humano.
Uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 é preferi- velmente usada como a IgG humana do tipo selvagem para um propósito de uma IgG humana do tipo selvagem de referência ser comparada com as mo- léculas de ligação a antígeno quanto à sua atividade de ligação a FcRn hu- mano ou atividade de ligação in vivo.
Preferivelmente, uma molécula de liga- ção a antígeno de referência compreendendo o mesmo domínio de ligação a antígeno que uma molécula de ligação a antígeno de interesse e região Fc de IgG humana do tipo selvagem como um domínio de ligação a FcRn hu- mano pode ser apropriadamente usada.
Mais preferivelmente, uma IgG1 humana intacta é usada para um propósito de uma IgG humana do tipo sel- vagem a ser comparada com as moléculas de ligação a antígeno quanto à sua atividade de ligação a FcRn humano ou atividade in vivo.
Redução de concentração de antígeno total no plasma ou razão de antígeno/anticorpo molar pode ser avaliada conforme descrito nos Exem- plos 4, 5 e 12. Mais especificamente, usando a linhagem de camundongo transgênico FcRn humano 32 ou linhagem 276 (Jackson Laboratories, Me- thods Mol.
Biol. 2010; 602: 93-104), elas podem ser avaliadas através ou do modelo de coinjeção de antígeno-anticorpo ou modelo de infusão de antíge- no de estado uniforme quando a molécula de ligação a antígeno não reage cruzado com o antígeno contraparte de camundongo.
Quando uma molécula de ligação a antígeno reage cruzada com contraparte de camundongo, elas podem ser avaliadas simplesmente injetando molécula de ligação a antígeno na linhagem de camundongo transgênico FcRn humano 32 ou linhagem 276
(Jackson Laboratories). Em modelo de coinjeção, mistura de molécula de ligação a antígeno e antígeno é administrada ao camundongo.
Em modelo de infusão de antígeno de estado uniforme, bomba de infusão contendo so- lução de antígeno é implantada no camundongo para obter concentração de 5 antígeno no plasma constante e então molécula de ligação a antígeno é inje- tada no camundongo.
Molécula de ligação a antígeno de teste é administra- da na mesma dosagem.
Concentração de antígeno total no plasma, concen- tração de antígeno livre no plasma e concentração de molécula de ligação a antígeno no plasma são medidas em ponto de tempo apropriado usando método conhecido dos versados na técnica.
A concentração de antígeno total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar podem ser medidas em 2, 4, 7, 14, 28, 56 ou 84 dias após administração para avaliar o efeito a longo pra- zo da presente invenção.
Em outras palavras, uma concentração de antíge- no no plasma a longo prazo é determinada através da medição da concen- tração de antígeno total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar em 2, 4, 7, 14, 28, 56 ou 84 dias após administra- ção de uma molécula de ligação a antígeno a fim de avaliar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da presente invenção.
Se a redução da con- centração de antígeno no plasma ou razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar for obtida através da molécula de ligação a antígeno des- crita na presente invenção pode ser determinado através da avaliação da redução em qualquer um ou mais os pontos de tempo descritos acima.
Ainda mais especificamente, as moléculas de ligação a antígeno com concentração de antígeno Total ou livre baixa no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar podem ser medidas em 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12 ou 24 horas após administração para avaliar o efeito a curto prazo da presente invenção.
Em outras palavras, uma concentração de antígeno no plasma baixa é determinada através da medição de concentra- ção de antígeno total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno em 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12 ou 24 horas após adminis- tração de uma molécula de ligação a antígeno a fim de avaliar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da presente invenção.
A via de administração de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção pode ser selecionada de injeções intradermal, intrave- nosa, intravítrea, subcutânea, intraperitoneal, parenteral e intramuscular. 5 na presente invenção, o aperfeiçoamento da farmacocinética da molécula de ligação a antígeno em humano é preferida.
Quando a retenção no plasma em humano é difícil de determinar, ela pode ser prevista com ba- se na retenção no plasma de camundongos (por exemplo, camundongos normais, camundongos transgênicos expressando antígeno humano, ca- mundongos transgênicos expressando FcRn humano) ou macacos (por e- xemplo, macacos cinomólogos). Aqui, "o aperfeiçoamento da farmacocinética e retenção no plasma prolongada de uma molécula de ligação a antígeno" significa aper- feiçoamento de qualquer parâmetro farmacocinético (qualquer prolongamen- to da meia-vida no plasma, prolongamento de tempo de retenção médio no plasma, redução de eliminação do plasma e biodisponibilidade) após admi- nistração in vivo da molécula de ligação a antígeno ou um aumento na con- centração da molécula de ligação a antígeno no plasma em um momento apropriado após administração.
Ele pode ser determinado através da medi- ção de qualquer parâmetro tal como meia-vida no plasma, tempo de reten- ção médio no plasma, eliminação do plasma e biodisponibilidade da molécu- la de ligação a antígeno (Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understan- ding through practice), (Nanzando)). Por exemplo, quando uma molécula de ligação a antígeno é administrada a camundongos (camundongos normais e camundongos transgênicos FcRn humanos), ratos, macacos, coelhos, ca- chorros, seres humanos e outros, e a concentração da molécula de ligação a antígeno no plasma é determinada e cada um dos parâmetros é calculado, a farmacocinética da molécula de ligação a antígeno pode ser julgada ser a- perfeiçoada quando a meia-vida no plasma ou tempo de retenção médio no plasma é prolongado.
Esses parâmetros podem ser determinados através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica.
Por exemplo, os parâ- metros podem ser apropriadamente avaliados através de análise não com-
partimental usando software de análise farmacocinética WinNonlin (Pharsi- ght) de acordo com o manual de instruções anexo.
Sem desejar ser limitado a nenhuma teoria particular, uma vez que uma molécula de ligação a antígeno que tem uma atividade de ligação a 5 FcRn na faixa de pH neutro pode formar um complexo de tetrâmero compre- endendo duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR na membrana celular de células apresentando antígeno, incorporação a células apresen- tando antígeno é promovida, e então a retenção no plasma é pensada ser reduzida e a farmacocinética piorada.
Há sítios de fosforilação nos domínios citoplásmicos de FcγR e FcRn.
Em geral, fosforilação do domínio citoplásmi- co de um receptor expresso na superfície celular ocorre quando da monta- gem dos receptores e a fosforilação induz internalização do receptor.
Mesmo se IgG1 nativa formar um complexo dimérico FcγR/IgG1 nas células apre- sentando antígeno, montagem dos domínios citoplásmicos de FcγR não o- corre.
No entanto, quando uma molécula de IgG tendo uma atividade de li- gação a FcRn sob condições de uma faixa de pH neutro forma um complexo de tetrâmero heteromérico compreendendo FcγR/duas moléculas de F- cRn/IgG, os três domínios citoplásmicos de FcγR e FcRn se uniriam, e a in- ternalização do complexo de tetrâmero heteromérico compreendendo Fcγ- R/duas moléculas de FcRn/IgG pode ser então induzida.
Formação dos complexos de tetrâmero heteromérico compreendendo FcγR/duas moléculas de FcRn/IgG é pensada ocorrer em células apresentando antígeno coex- pressando FcγR e FcRn e, consequentemente, a quantidade de moléculas de anticorpo incorporadas às células apresentando antígeno pode ser au- mentada, e a farmacocinética pode ser piorada como um resultado.
Desta maneira, através da inibição da formação do complexo descrito acima em células apresentando antígeno usando qualquer um dos métodos das Moda- lidades 1, 2 e 3 revelados na presente invenção, incorporação em células apresentando antígeno pode ser reduzida e, como resultado, a farmacociné- tica pode ser aperfeiçoada para produção de moléculas de ligação a antíge- no cuja atividade varia dependendo das condições de concentração de íon.
Em uma modalidade não limitante da presente invenção, após isolamento de um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a antí- geno cuja atividade de ligação muda dependendo da condição selecionada conforme acima descrito, o polinucleotídeo é inserido em um vetor de ex- pressão apropriado.
Por exemplo, quando o domínio de ligação a antígeno é 5 uma região variável de anticorpo, uma vez um cDNA codificando a região variável sendo obtido, o cDNA é digerido com enzimas de restrição que re- conhecem os sítios de restrição inseridos nas duas extremidades do cDNA.
Preferivelmente, as enzimas de restrição reconhecem e digerem uma se- quência de nucleotídeo que aparece em uma frequência baixa na sequência de nucleotídeo compondo o gene da molécula de ligação a antígeno.
Ainda, as enzimas de restrição que proveem extremidades coesas são preferivel- mente inseridas para inserir uma cópia única de um fragmento digerido no vetor na orientação correspondente.
O cDNA codificando uma região variá- vel de uma molécula de ligação a antígeno digerida conforme descrito acima é inserido em um vetor de expressão apropriado para obter um vetor de ex- pressão para a molécula de ligação a antígeno da presente invenção.
Neste momento, um gene codificando uma região constante de anticorpo (região C) pode ser fundido em estrutura com o gene codificando a região variável.
Para produzir uma molécula de ligação a antígeno de interesse, um polinucleotídeo codificando a molécula de ligação a antígeno é inserido de uma maneira operavelmente ligado a uma sequência reguladora em um vetor de expressão.
Sequências reguladoras incluem, por exemplo, aumen- tadores e promotores.
Ainda, uma sequência de sinal apropriada pode ser ligada ao terminal N de maneira que a molécula de ligação a antígeno ex- pressa é secretada para o exterior das células.
Uma sequência de sinal, por exemplo, um peptídeo tendo a sequência de aminoácido MGWSCIILFLVA- TATGVHS (SEQ ID NO:3) é usada; no entanto, é também possível ligar ou- tras sequências de sinal apropriadas.
O polipeptídeo expresso é clivado no terminal carboxila da sequência descrita acima e o polipeptídeo clivado é secretado como um polipeptídeo maduro para o exterior das células.
Então, células hospedeiras apropriadas são transformadas com seu vetor de ex- pressão de maneira que células recombinantes expressando o polinucleotí-
deo codificando a molécula de ligação a antígeno de interesse podem ser obtidas.
As moléculas de ligação a antígeno da presente invenção podem ser produzidas a partir das células recombinantes seguindo os métodos des- critos acima na seção sobre anticorpos. 5 Em uma modalidade não limitante da presente invenção, após isolamento de um polinucleotídeo codificando a molécula de ligação a antí- geno descrita acima cuja atividade de ligação varia dependendo da condição selecionada, a variante do polinucleotídeo é inserida em um vetor de ex- pressão apropriado.
Tais variantes incluem preferivelmente aquelas prepa- radas via humanização baseada na sequência de polinucleotídeo codifican- do uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção obtida através da avaliação como uma biblioteca de região variável aleatorizada, uma bibli- oteca sintética ou uma biblioteca imune construída se originando de animais não seres humanos.
Os mesmos métodos que acima descrito para produção de anticorpos humanizados descritos acima podem ser usados como um método para produção de variantes de molécula de ligação a antígeno hu- manizada.
Em outra modalidade, tais variantes incluem preferivelmente a- quelas obtidas através da introdução de uma alteração que aumenta a afini- dade para antígeno (maturação de afinidade) de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção em uma sequência de polinucleotídeo isola- da para a molécula obtida através de avaliação usando uma biblioteca sinté- tica ou uma biblioteca pura como uma biblioteca de região variável aleatori- zada.
Tais variantes podem ser obtidas através de vários procedimentos co- nhecidos para maturação por afinidade, incluindo mutagênese por CDR (Yang e outros (J.
Mol.
Biol. (1995) 254, 392-403), embaralhamento de ca- deia (Marks e outros (Bio/Technology (1992) 10, 779-783, uso de linhagens mutantes de E. coli (Low e outros (J.
Mol.
Biol. (1996) 250, 359-368)), emba- ralhamento de DNA (Patten e outros (Curr.
Opin.
Biotechnol. (1997) 8, 724- 733)), exibição de fago (Thompson e outros (J.
Mol.
Biol. 1996) 256, 77-88)) e PCR sexual (Clameri e outros (Nature (1998) 391, 288-291)). Conforme acima descrito, as moléculas de ligação a antígeno que são produzidas através dos métodos de produção da presente invenção incluem moléculas de ligação a antígeno tendo uma região Fc.
Várias varian- tes podem ser usadas como regiões Fc.
Em uma modalidade, variantes da presente invenção incluem preferivelmente polinucleotídeos codificando mo- 5 léculas de ligação a antígeno tendo uma cadeia pesada em que um polinu- cleotídeo codificando uma variante da região Fc conforme acima descrito é ligado em estrutura a um polinucleotídeo codificando a molécula de ligação a antígeno descrita acima cuja atividade de ligação varia dependendo de uma condição selecionada.
Em uma modalidade não limitante da presente invenção, regiões Fc incluem preferivelmente, por exemplo, regiões constantes Fc de anticor- pos tais como IgG1 de SEQ ID NO: 11 (Ala é adicionado ao terminal N de AAC82527.1), IgG2 de SEQ ID NO: 12 (Ala é adicionado ao terminal N de AAB59393.1), IgG3 de SEQ ID NO: 13 (CAA27268.1) e IgG4 de SEQ ID NO: 14 (Ala é adicionado ao terminal N de AAB59394.1). A retenção no plasma de moléculas de IgG é relativamente longa (a eliminação do plasma é lenta) uma vez que FcRn, particularmente FcRn humano, funciona como um recep- tor selvagem para moléculas IgG.
Moléculas IgG incorporadas a endosso- mos através de pinocitose se ligam sob a condição ácida endossomal a F- cRn, particularmente FcRn humano, expresso em endossomos.
Moléculas de IgG que não se ligam a FcRn, particularmente FcRn humano, são transfe- ridos para lisossomos e degradas lá.
Entretanto, moléculas IgG ligadas a FcRn, particularmente FcRn humano, são transferidas para superfície celu- lar, e então retornam para o plasma como um resultado de dissociação de FcRn, particularmente FcRn humano, sob a condição neutra em plasma.
Uma vez que anticorpos compreendendo uma região Fc típica não têm uma atividade de ligação para FcRn, particularmente a FcRn huma- no, sob a condição de faixa de pH neutro no plasma, anticorpos típicos e complexos de anticorpo-antígeno são incorporados a células através de en- docitose não específica e transferidos para superfície celular através de liga- ção a FcRn, particularmente FcRn humano, na condição de faixa de pH áci- do endossomal.
FcRn, particularmente FcRn humano, transporta anticorpos do endossomo para a superfície celular.
Desta maneira, algum de FcRn, par- ticularmente FcRn humano, é pensado também estar presente na superfície celular.
No entanto, os anticorpos são reciclados para o plasma, uma vez que eles dissociam de FcRn, particularmente FcRn humano, na condição de 5 faixa de pH neutro na superfície celular.
Regiões Fc tendo a atividade de ligação a FcRn humano na fai- xa de pH neutro, que são incluídas em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, podem ser obtidas através de qualquer método.
Especifi- camente, regiões Fc tendo atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro podem ser obtidas através da alteração de aminoácidos de imu- noglobulina do tipo IgG humana como uma região Fc de partida.
Regiões Fc preferidas de imunoglobulina tipo IgG humana para alteração incluem, por exemplo, aquelas de IgGs humanas (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e suas varian- tes). Aminoácidos em quaisquer posições podem ser alterados para outros aminoácidos contanto que as regiões resultantes tenham a atividade de liga- ção a FcRn humano na faixa de pH neutro ou atividade de ligação a FcRn humano aumentada na faixa neutra.
Quando uma molécula de ligação a an- tígeno compreende a região Fc de IgG1 humana como região Fc humana, é preferível que a região resultante compreenda uma alteração que resulte no efeito para aumentar a ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro com- parado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana.
Os aminoácidos que permitem tais alterações incluem, por exemplo, amino- ácidos nas posições 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241, 243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 315 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440 e 442 (indicado por numeração EU). Mais especificamente, tais alterações em aminoácido incluem aquelas listadas na Tabela 5. A alteração desses aminoácidos aumenta a ligação a FcRn humano da região Fc de imunoglobulina tipo IgG na faixa de pH neu- tro.
Dentre aquelas descritas acima, alterações apropriadas que au- mentam a ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro são selecionadas para uso na presente invenção.
Aminoácidos particularmente preferidos para tais variantes de região Fc incluem, por exemplo, aminoácidos nas posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 5 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 (indicado por numeração EU). A atividade de ligação a FcRn humano da região Fc incluída em uma molécula de ligação a antígeno pode ser aumentada na faixa de pH neutro através da substituição de pelo menos um aminoácido com um aminoácido diferente.
Alterações particularmente preferidas na região Fc incluem, por exemplo, substituições de: Met para o aminoácido na posição 237; Ile para o aminoácido na posição 248; Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 250; Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 252; Thr para o aminoácido na posição 254; Glu para o aminoácido na posição 255; Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido na posição 256; Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr e Val para o aminoácido na posição 257; His para o aminoácido na posição 258; Ala para o aminoácido na posição 265; Ala ou Glu para o aminoácido na posição 286; His para o aminoácido na posição 289; Ala para o aminoácido na posição 297; Ala para o aminoácido na posição 303; Ala para o aminoácido na posição 305; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido na posição 308;
Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg para o aminoácido na posição 309; Ala, His ou Ile para o aminoácido na posição 311; Ala ou His para o aminoácido na posição 312; Lys ou Arg para o aminoácido na posição 314; 5 Ala, Asp ou His para o aminoácido na posição 315; Ala para o aminoácido na posição 317; Val para o aminoácido na posição 332; Leu para o aminoácido na posição 334; His para o aminoácido na posição 360; Ala para o aminoácido na posição 376; Ala para o aminoácido na posição 380; Ala para o aminoácido na posição 382; Ala para o aminoácido na posição 384; Asp ou His para o aminoácido na posição 385; Pro para o aminoácido na posição 386; Glu para o aminoácido na posição 387; Ala ou Ser para o aminoácido na posição 389; Ala para o aminoácido na posição 424; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 428; Lys para o aminoácido na posição 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 434; e His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido na posição 436 no sistema de numeração EU.
Entretanto, o número de aminoácidos a alte- rado não é particularmente limitado; tais alterações de aminoácido incluem alteração de aminoácido única e alteração de aminoácidos em dois ou mais sítios.
Combinações de alterações de aminoácido em dois ou mais sítios incluem, por exemplo, aquelas descritas na Tabela 6. A presente invenção não é limitada a uma teoria particular, mas provê métodos para produção de moléculas de ligação a antígeno que com- preendem não apenas uma alteração descrita acima, mas também uma alte-
ração da região Fc de maneira a não formar o complexo de tetrâmero hetero da região Fc incluída na molécula de ligação a antígeno, duas moléculas de FcRn e receptor Fcγ de ativação.
Modalidades preferidas de tais moléculas de ligação a antígeno incluem três modalidades descritas abaixo. 5 Modalidade 1: Moléculas de ligação a antígeno que compreen- dem uma região Fc tendo a atividade de ligação a FcRn sob a condição de faixa de pH neutro e cuja atividade de ligação a FcγR de ativação é menor do que aquela da região Fc nativa As moléculas de ligação a antígeno da Modalidade 1 formam complexos de trímero através da ligação a duas moléculas de FcRn; no en- tanto, elas não formam complexo incluindo FcγR de ativação (Fig. 49). As regiões Fc cuja atividade de ligação para FcγR de ativação é menor do que aquela da região Fc nativa podem ser preparadas alterando os aminoácidos da região Fc nativa conforme acima descrito.
Se a atividade de ligação de uma região Fc alterada para FcγR de alteração for menor do que aquela da região Fc nativa pode ser apropriadamente testado usando os métodos des- critos na seção "Atividade de ligação" acima.
Aqui, a atividade de ligação de uma região Fc alterada a recep- tor Fcγ de ativação é menor do que aquela de região Fc nativa significa que a atividade de ligação de uma região Fc alterada a quaisquer receptores Fcγ seres humanos, FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa e/ou FcγRIIIb, é menor do que aquela da região Fc nativa e, por exemplo, significa que, quando comparado com base em um método analítico descrito acima, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno tendo uma variante de região Fc é 95% ou menos, preferivelmente 90% ou menos, 85% ou menos, 80% ou menos, 75% ou menos, particularmente preferivelmente 70% ou menos, 65% ou menos, 60% ou menos, 55% ou menos, 50% ou menos, 45% ou menos, 40% ou menos, 35% ou menos, 30% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, 9% ou menos, 8% ou menos, 7% ou menos, 6% ou menos, 5% ou menos, 4% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos, 1% ou menos comparado com a atividade de ligação de uma molé- cula de ligação a antígeno controle tendo a região Fc nativa.
Tais regiões Fc nativas incluem a região Fc de partida e regiões Fc de anticorpos do tipo selvagem de isotipos diferentes.
Moléculas de ligação a antígeno apropriadas tendo uma região Fc como um controle incluem aquelas tendo uma região Fc de um anticorpo 5 IgG monoclonal.
As estruturas de tais regiões Fc são mostradas nas SEQ ID NOs: 11 (A é adicionado ao terminal N de RefSeq No. de Acesso A- AC82527.1), 12 (A é adicionado ao terminal N de RefSeq No. de Acesso AAB59393.1), 13 (RefSeq No. de Acesso CAA27268.1) e 14 (A é adicionado ao terminal N de RefSeq No. de Acesso AAB59394.1). Entretanto, quando uma molécula de ligação a antígeno que tem a região Fc de um anticorpo de um certo isotipo é usada como uma substância de teste, a atividade de liga- ção a receptor Fcγ da molécula de ligação a antígeno tendo a região Fc po- de ser testada usando como um controle uma molécula de ligação a antíge- no tendo a região Fc de um anticorpo IgG monoclonal do mesmo isotipo.
É adequado selecionar molécula de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc cuja atividade de ligação a receptor Fcγ foi demonstrada ser alta conforme acima descrito.
Em uma modalidade não limitante da presente invenção, regiões Fc preferidas cuja atividade de ligação a FcγR de ativação é menor do que aquela da região Fc nativa incluem, por exemplo, regiões Fc em que qual- quer um ou mais de aminoácidos nas posições 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 e 329 (indicado pela numeração EU) dentre os aminoáci- dos de uma região Fc descrita acima são substituídos com aminoácidos dife- rentes da região Fc nativa.
Tais alterações de regiões Fc não são limitadas às alterações descritas acima e incluem, por exemplo, alterações tais como cadeias desglicosiladas (N297A e N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1- A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1- C226S/C229/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1- S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A e IgG4-L236E descrito em Current Opinion in Biotechnology (2009) 20 (6), 685-691; alterações tais como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R e N325LL328R descritas no WO
2008/092117; inserções de aminoácido nas posições 233, 234, 235 e 237 (indicado pela numeração EU); e alterações nos sítios descritos no WO 2000/042072; Ainda, em uma modalidade não limitante da presente invenção, 5 regiões Fc preferidas incluem aquelas alteradas para terem uma ou mais alterações de: uma substituição de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 234; uma substituição de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Arg para o aminoácido na posição 235; uma substituição de Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 236; uma substituição de Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr ou Arg para o aminoácido na posição 237; uma substituição de Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lyt, Thr, Trp ou Arg para o aminoácido na posição 238; uma substituição de Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr ou Arg para o aminoácido na posição 239; uma substituição de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 265; uma substituição de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 266; uma substituição de Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 267; uma substituição de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 269; uma substituição de Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Tht, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 270; uma substituição de Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 271; uma substituição de Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 295; uma substituição de Arg, Gly, Lys ou Pro para o aminoácido na posição 296; uma substituição de Ala para o aminoácido na posição 297; uma substituição de Arg, Gly, Lys, Pro, Trp ou Tyr para o amino- ácido na posição 298; 5 uma substituição de Arg, Lys ou Pro para o aminoácido na posi- ção 300; uma substituição de Lys ou Pro para o aminoácido na posição 324; uma substituição de Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 325; uma substituição de Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 327; uma substituição de Arg, Asn, Gly, His, Lys ou Pro para o ami- noácido na posição 328; uma substituição de Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val ou Arg para o aminoácido na posição 329; uma substituição de Pro ou Ser para o aminoácido na posição 330; uma substituição de Arg, Gly ou Lys para o aminoácido na posi- ção 331; e uma substituição de Arg, Lys ou Pro para o aminoácido na posi- ção 332 no sistema de numeração EU na região Fc.
Modalidade 2: Moléculas de ligação a antígeno que compreen- dem uma região Fc tendo a atividade de ligação a FcRn sob a condição de faixa de pH neutro e cuja atividade de ligação a FcγRn inibidor é maior do que a atividade de ligação a receptor Fcγ de ativação As moléculas de ligação a antígeno da Modalidade 2 podem formar o complexo tetrâmero através de ligação a duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR inibir.
No entanto, uma vez que uma molécula de ligação a antígeno pode se ligar apenas a uma molécula de FcγR, uma mo- lécula de ligação a antígeno ligada a FcγR inibidor não pode se ligar mais a FcγR de ativação (Fig. 50). Ainda, foi relatado que moléculas de ligação a antígeno incorporadas a células em um estado ligado a FcγR inibidor são recicladas na membrana celular e então escapam de degradação intracelular (Immunity (2005) 23, 503-514). Especificamente, é suposto que moléculas de ligação a antígeno tendo a atividade de ligação seletiva para FcγR inibi- 5 dor não podem formar o complexo heteromérico compreendendo FcγR de ativação, que é responsável pela resposta imune, e duas moléculas de F- cRn.
Aqui, "a atividade de ligação a FcγR inibidor é maior do que a a- tividade de ligação a receptor Fcγ de ativação" significa que a atividade de ligação de uma variante de região Fc a FcγRIIb é maior do que a atividade de ligação a quaisquer receptores Fcγ seres humanos, FcγRI, FcγRIIa, Fcγ- RIIIa e/ou FcγRIIIb.
Por exemplo, quer dizer que, com base em um método analítico descrito acima, a atividade de ligação a FcγRIIb de uma molécula de ligação a antígeno tendo uma variante de região Fc é 105% ou mais, pre- ferivelmente 110% ou mais, 120% ou mais, 130% ou mais, 140% ou mais, particularmente preferivelmente 150% ou mais, 160% ou mais, 170% ou mais, 180% ou mais, 190% ou mais, 200% ou mais, 250% ou mais, 300% ou mais, 350% ou mais, 400% ou mais, 450% ou mais, 500% ou mais, 750% ou mais, 10 vezes ou mais, 20 vezes ou mais, 30 vezes ou mais, 40 vezes ou mais, 50 vezes ou mais a atividade de ligação a quaisquer receptores Fcγ seres humanos, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa e/ou FcγRIIIb.
Como moléculas de ligação a antígeno controle tendo uma regi- ão Fc, aquelas tendo uma região Fc de um anticorpo IgG monoclonal podem ser apropriadamente usadas.
As estruturas de tais regiões Fc são mostradas nas SEQ ID NOs: 11 (A é adicionado ao terminal N de RefSeq No. de Aces- so AAC82527.1), 12 (A é adicionado ao terminal N de RefSeq No. de acesso AAB59393.1), 13 (RefSeq No. de Acesso CAA27268.1) e 14 (A é adicionado ao terminal N de RefSeq No. de Acesso AAB59394.1). Entretanto, quando uma molécula de ligação a antígeno que tem a região Fc de um anticorpo de um certo isotipo é usada como uma substância de teste, a atividade de liga- ção a receptor Fcγ da molécula de ligação a antígeno tendo a região Fc po- de ser testada usando como um controle uma molécula de ligação a antíge-
no tendo a região Fc de um anticorpo IgG monoclonal do mesmo isotipo.
Conforme acima descrito, uma molécula de ligação a antígeno compreen- dendo uma região Fc cuja atividade de ligação a receptor Fcγ foi demonstra- da ser alta é apropriadamente selecionada. 5 Em uma modalidade não limitante da presente invenção, regiões Fc preferidas tendo a atividade de ligação seletiva para FcγR inibidor inclu- em, por exemplo, regiões Fc em que o aminoácido na posição 238 ou 328 (indicada pela numeração EU) dentre os aminoácidos de uma região Fc descrita acima é alterado para um aminoácido diferente da região Fc nativa.
Ainda, como regiões Fc tendo a atividade de ligação seletiva para FcγR ini- bidor, é também possível selecionar apropriadamente regiões Fc ou altera- ções daquelas descritas na US 2009/0136485. Em outra modalidade não limitante da presente invenção, regi- ões Fc preferidas incluem aquelas em que qualquer um ou mais de: aminoá- cido na posição 238 (indicado pela numeração EU) é substituído com Asp e aminoácido na posição 328 (indicado por numeração EU) é substituído com Glu em uma região Fc descrita acima.
Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, regiões Fc preferidas incluem substituição Pro por Asp na posição 238 (indi- cado por numeração EU), e aquelas em que um ou mais de: uma substituição de Trp para o aminoácido na posição 237 (indi- cado por numeração EU), uma substituição de Phe para o aminoácido na posição 237 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Val para o aminoácido na posição 267 (indi- cado por numeração EU), uma substituição de Gln para o aminoácido na posição 267 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Asn para o aminoácido na posição 268 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Gly para o aminoácido na posição 271 (indi- cado por numeração EU),
uma substituição de Leu para o aminoácido na posição 326 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Gln para o aminoácido na posição 326 (in- dicado por numeração EU), 5 uma substituição de Glu para o aminoácido na posição 326 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Met para o aminoácido na posição 326 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Asp para o aminoácido na posição 239 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Ala para o aminoácido na posição 267 (indi- cado por numeração EU), uma substituição de Trp para o aminoácido na posição 234 (indi- cado por numeração EU), uma substituição de Tyr para o aminoácido na posição 234 (indi- cado por numeração EU), uma substituição de Ala para o aminoácido na posição 237 (indi- cado por numeração EU), uma substituição de Asp para o aminoácido na posição 237 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Glu para o aminoácido na posição 237 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Leu para o aminoácido na posição 237 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Met para o aminoácido na posição 237 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Tyr para o aminoácido na posição 237 (indi- cado por numeração EU), uma substituição de Lys para o aminoácido na posição 330 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Arg para o aminoácido na posição 330 (in- dicado por numeração EU),
uma substituição de Asp para o aminoácido na posição 233 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Asp para o aminoácido na posição 268 (in- dicado por numeração EU), 5 uma substituição de Glu para o aminoácido na posição 268 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Asp para o aminoácido na posição 326 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Ser para o aminoácido na posição 326 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Thr para o aminoácido na posição 326 (indi- cado por numeração EU), uma substituição de ile para o aminoácido na posição 323 (indi- cado por numeração EU), uma substituição de Leu para o aminoácido na posição 323 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Met para o aminoácido na posição 323 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Asp para o aminoácido na posição 296 (in- dicado por numeração EU), uma substituição de Ala para o aminoácido na posição 326 (indi- cado por numeração EU), uma substituição de Asn para o aminoácido na posição 326 (in- dicado por numeração EU), e uma substituição de Met para o aminoácido na posição 330 (in- dicado por numeração EU).
Modalidade 3 Moléculas de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc em que um dos dois polipeptídeos constituindo a região Fc tem a atividade de ligação a FcRn sob a condição de faixa de pH neutro e o outro não tem a atividade de ligação a FcRn sob a condição de faixa de pH neutro.
A molécula de ligação a antígeno da Modalidade 3 pode formar complexos trímeros através da ligação a uma molécula de FcRn e uma mo- lécula de FcγR; no entanto, elas não formam o complexo tetrâmero hetero 5 compreendendo duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR (Fig. 51). As regiões Fc derivadas de anticorpos biespecíficos podem ser apropriada- mente usadas como regiões Fc em que um dos dois polipeptídeos constitu- indo a região Fc tem a atividade de ligação a FcRn sob a condição de faixa de pH neutro e o outro não tem a atividade de ligação a FcRn sob a condi- ção de faixa de pH neutro, os quais estão incluídos na molécula de ligação a antígeno da Modalidade 3. Um anticorpo biespecífico se refere a dois tipos de anticorpos que têm especificidade para antígenos diferentes.
Anticorpos biespecíficos do tipo IgG podem ser secretados a partir de hibridomas híbri- dos (quadromas) resultantes da fusão de dois tipos de hibridomas produzin- do anticorpos IgG (Milstein e outros (Nature (1983) 305, 537-540). Quando moléculas de ligação a antígeno da Modalidade 3 acima são produzidas usando técnicas recombinantes tal como descrito na seção "Anticorpo", pode ser usado um método em que os genes codificando poli- peptídeos que constituem os dois tipos de regiões Fc de interesse são intro- duzidos em células para coexpressá-los.
No entanto, a região Fc produzida é uma mistura que contém, em uma razão molecular de 2:1:1, região Fc em que um dos dois polipeptídeos constituindo a região Fc tem a atividade de ligação a FcRn sob a condição de faixa de pH neutro e os outros não têm a atividade de ligação a FcRn sob a condição de faixa de pH neutro, região Fc em que ambos os polipeptídeos constituindo a região Fc têm a atividade de ligação a FcRn sob a condição de faixa de pH neutro, e região Fc em que ambos os polipeptídeos constituindo a região Fc não têm a atividade de liga- ção a Fc sob a condição de faixa de pH neutro.
É difícil purificar moléculas de ligação a antígeno compreendendo uma combinação desejada de regiões Fc dos três tipos de IgGs.
Quando produzindo moléculas de ligação a antígeno da Modali- dade 3 usando técnicas recombinantes tal como acima descrito, as molécu-
las de ligação a antígeno compreendendo a combinação hetero de regiões Fc podem ser preferivelmente secretadas através de alteração do domínio CH3 que constitui uma região Fc usando substituições de aminoácido apro- priadas.
Especificamente, ela é um método de aumento de formação de ca- 5 deia H hetero e inibição da formação de cadeia H homo através de substitui- ção da cadeia lateral de aminoácido em um domínio CH3 de cadeia pesada com uma cadeia lateral volumosa (saliência (significando "projeção")) en- quanto substituindo a cadeia lateral de aminoácido no outro domínio CH3 de cadeia pesada com uma cadeia lateral menor (orifício ("significando "oco")) de maneira que a "saliência" é posta no "orifício" (WO 1996027011, Ridgway e outros (Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant e outros (Nat.
Biotech. (1998) 16, 677-681)). Ainda, técnicas conhecidas para produção de anticorpos biespe- cíficos incluem aquelas em que um dispositivo para regulagem da associa- ção de polipeptídeo ou associação para formar multímeros heteroméricos constituídos pelos polipeptídeos é aplicado para a associação de um par de polipeptídeos que constitui uma região Fc.
Especificamente, para produzir anticorpos biespecíficos, podem ser usados métodos para regulagem da associação de polipeptídeo através da alteração de resíduos de aminoácido que formam interface entre um par de polipeptídeos que constitui uma região Fc de maneira a formar um complexo de dois polipeptídeos com sequências diferentes constituindo a região Fc, enquanto inibindo a associação de poli- peptídeos tendo uma sequência idêntica que constitui a região Fc (WO 2006/106905). Tais métodos podem ser usados para produzir moléculas de ligação a antígeno da presente invenção descritas na Modalidade 3. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, um par de polipeptídeos que constitui uma região Fc descrita acima se originando de um anticorpo biespecífico pode ser apropriadamente usado como uma região Fc.
Mais especificamente, um par de polipeptídeos que constitui uma região Fc, um dos quais tem uma sequência de aminoácido em que o ami- noácido nas posições 349 e 366 (indicado por numeração EU) são Cys e Trp, respectivamente, e o outro tem uma sequência de aminoácido na qual o aminoácido na posição 356 (indicado por numeração EU) é Cys, o aminoá- cido na posição 366 (indicado por numeração EU) é Ser, o aminoácido na posição 368 é Ala e o aminoácido na posição 407 (indicado por numeração EU) é Val, é preferivelmente usado como regiões Fc. 5 Em outra modalidade não limitante da presente invenção, um par de polipeptídeos que constitui uma região Fc, um dos quais tem uma sequência de aminoácido em que o aminoácido na posição 409 (indicado por numeração EU) é Asp, e o outro tem uma sequência de aminoácido em que o aminoácido na posição 399 (indicado por numeração EU) é Lys é pre- ferivelmente usado como regiões Fc.
Na modalidade descrita acima, o ami- noácido na posição 409 pode ser Glu ao invés de Asp, e o aminoácido na posição 399 pode ser Arg ao invés de Lys.
Alternativamente, é preferível que, quando o aminoácido na posição 399 for Lys, adicionalmente o amino- ácido na posição 360 possa ser Asp ou o aminoácido na posição 392 possa ser Asp.
Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, um par de polipeptídeos que constitu uma região Fc, um dos quais tem uma sequência de aminoácido em que o aminoácido na posição 370 (indicado por numeração EU) é Glu, e o outro tem uma sequência de aminoácido em que o aminoácido na posição 357 (indicado por numeração EU) é Lys é pre- ferivelmente usado como regiões Fc.
Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, um par de polipeptídeos que constitui uma região Fc, um dos quais tem uma sequência de aminoácido em que o aminoácido na posição 439 (indicado por numeração EU) é Glu, e o outro tem uma sequência de aminoácido em que o aminoácido na posição 356 (indicado por numeração EU) é Lys, é pre- ferivelmente usado como regiões Fc.
Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, tais regiões Fc preferidas incluem aquelas como uma combinação de qual- quer uma das modalidades acima tais como: um par de polipeptídeos que constitui uma região Fc, um dos quais tem uma sequência de aminoácido em que os aminoácidos nas posi-
ções 409 e 370 (indicado por numeração EU) são Asp e Glu, respectivamen- te, e o outro tem uma sequência de aminoácido em que os aminoácidos nas posições 399 e 357 (indicado por numeração EU) são ambos Lys (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 (indicado por numeração EU) po- 5 de ser Asp ao invés de Glu ou o aminoácido na posição 392 pode ser Asp, ao invés de Glu na posição de aminoácido 370); um par de polipeptídeos que constitui uma região Fc, um dos quais tem uma sequência de aminoácido em que os aminoácidos nas posi- ções 409 e 439 (indicado por numeração EU) são Asp e Glu, respectivamen- te, e o outro tem uma sequência de aminoácido em que os aminoácidos nas posições 399 e 356 (indicado por numeração EU) são ambos Lys (nesta modalidaide, ao invés de Glu na posição de aminoácido 439 (indicado por numeração EU), o aminoácido na posição 360 pode ser Asp, o aminoácido na posição 392 pode ser Asp ou o aminoácido na posição 439 pode ser Asp); um par de polipeptídeos que constitui uma região Fc, um dos quais tem uma sequência de aminoácido em que os aminoácidos nas posi- ções 370 e 439 (indicado por numeração EU) são ambos Glu, e o outro tem uma sequência de aminoácido em que os aminoácidos nas posições 357 e 356 (indicado por numeração EU) são ambos Lys; e um par de polipeptídeos que constituem uma região Fc, um dos quais tem uma sequência de amino- ácido em que os aminoácidos nas posições 409, 307 e 439 (indicado por numeração EU) são Asp, Glu e Glu, respectivamente, e o outro tem uma sequência de aminoácido em que os aminoácidos nas posições 399, 357 e 356 (indicado por numeração EU) são todos Lys (nesta modalidade, o ami- noácido na posição 370 pode não ser substituído com Glu, e ainda, quando o aminoácido na posição 370 não é substituído com Glu, o aminoácido na posição 439 pode ser Asp ao invés de Glu ou ou aminoácido na posição 439 pode ser Asp, ao invés de Glu na posição de aminoácido 392). Em outra modalidade não limitante da presente invenção, um par de polipeptídeos que constitui a região Fc, um dos quais tem uma se- quência de aminoácido em que o aminoácido na posição 356 (indicado por numeração EU) é Lys, e o outro tem uma sequência de aminoácido em que o aminoácido nas posições 435 e 439 (indicado por numeração EU) são Arg e Glu, respectivamente, é preferivelmente usado.
Essas moléculas de ligação a antígeno das Modalidades 1 a 3 5 são esperadas ter imunogenicidade reduzida e retenção no plasma aperfei- çoada comparada com moléculas de ligação a antígeno capazes de forma- ção do complexo tetrâmero.
Métodos conhecidos apropriados tais como mutagênese direcio- nada a sítio (Kunkel e outros (Proc.
Nat.
Acad.
Sci.
USA (1985) 82, 488- 492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser aplicados para alterar os aminoácidos de regiões Fc.
Ainda, vários métodos conhecidos podem ser também usados como um método de alteração de aminoácido para substitu- ição de aminoácidos com aqueles que não aminoácidos naturais (Annu.
Rev.
Biophys.
Biomol.
Struct. (2006) 35, 225-249; Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, é também preferível usar um sistema de tradução livre de célula (Clover Direct (Protein Express)) compreendendo tRNAs em que um aminoácido não natural é ligado a um tRNA supressor âmbar, que é complementar a códon de parada UAG (códon âmbar). Em uma modalidade de variantes da presente invenção, polinu- cleotídeos codificando moléculas de ligação a antígeno que têm uma cadeia pesada em que um polinucleotídeo codificando uma região Fc modificado para ter uma mutação de aminoácido conforme acima descrito é ligado em estrutura a um polinucleotídeo codificando a molécula de ligação a antígeno descrita acima cuja atividade de ligação varia dependendo de uma condição selecionada.
A presente invenção provê métodos para produção de moléculas de ligação a antígeno compreendendo coleta das moléculas de ligação a antígeno de meios de cultura de células introduzidas com vetores em que um polinucleotídeo codificando uma região Fc é operavelmente ligado em estrutura a um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação varia dependendo da condição de concentração de íon.
Ainda, a presente invenção também provê métodos para produção de moléculas de ligação a antígeno compreendendo coleta das moléculas de ligação a antígeno de meios de cultura de células introduzidas com vetores construídos ligando operavelmente um polinucleotídeo codificando um do- mínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação varia dependendo da 5 condição de concentração de íon para um polinucleotídeo codificando uma região Fc que é previamente operavelmente ligado a um vetor.
Composições farmacêuticas Quando um anticorpo de neutralização convencional contra um antígeno solúvel é administrado, a retenção no plasma do antígeno é espe- rada ser prolongada através de ligação ao anticorpo.
Em geral, os anticorpos têm uma meia-vida longa (uma semana a três semanas) enquanto a meia- vida do antígeno é geralmente curta (um dia ou menos). Entretanto, antíge- nos ligados a anticorpo têm uma meia-vida significantemente mais longa no plasma comparado com quando os antígenos estão presentes sozinhos.
Por esta razão, administração de anticorpo de neutralização existente resulta em uma concentração de antígeno no plasma aumentada.
Tais casos foram re- latados com vários anticorpos de neutralização que se direcionam a antíge- nos solúveis incluindo, por exemplo, IL-6 (J.
Immunotoxicol. (2005) 3, 131- 139), beta amiloide (mAbs (2010) 2 (5), 1-13), MCP-1 (ARTHRITIS & RHEUMATISM (2006) 54, 2387-2392), hepcidina (AAPS, J. (2010) 4, 646- 657) e receptor sIL-6 (Blood (2008) 112 (10), 3959-64). Administração de anticorpos de neutralização existentes foi relatada aumentar a concentração de antígeno total no plasma para cerca de 10 a 1.000 vezes (o nível de au- mento varia dependendo do antígeno) a linha de base.
Aqui, a concentração de antígeno total no plasma se refere a uma concentração como uma quan- tidade total de antígeno no plasma, isto é, a soma de concentrações de antí- genos ligados a anticorpo ligado e não ligados a anticorpo.
Um aumento na concentração de antígeno no plasma total é indesejável para tais agentes farmacêuticos de anticorpo que se direcionam a um antígeno solúvel.
A ra- zão é que a concentração de anticorpo tem que ser mais alta do que pelo menos a concentração de antígeno no plasma total para neutralizar o antí- geno solúvel.
Especificamente, "a concentração de antígeno no plasma total é aumentada para 10 a 1.000 vezes" significa que, a fim de neutralizar o an- tígeno, a concentração de anticorpo no plasma (isto é, dose de anticorpo) tem que ser 10 a 1.000 vezes maior comparado com quando aumento na concentração de antígeno no plasma total não ocorre.
Por outro lado, se a 5 concentração de antígeno no plasma total puder ser reduzida em 10 a 1.000 vezes comparado com o anticorpo de neutralização existente, a dose de an- ticorpo pode ser também reduzida para grau similar.
Desta maneira, anticor- pos capazes de diminuição da concentração de atnigeno no plasma total através da eliminação de antígeno solúvel do plasma são altamente úteis comparado com anticorpos de neutralização existentes.
A presente invenção não é limitada a uma teoria particular, mas pode ser explicado, por exemplo, como segue por que razão o número de antígenos aos quais moléculas de ligação a antígeno únicas podem se ligar é aumentado e por que razão a eliminação de antígeno do plasma é acele- rada quando moléculas de ligação a antígeno que têm um domínio de liga- ção a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da condição de concentração de íon de maneira que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que sob a condição de faixa de pH neutro e adicionalmente têm um domínio de ligação a FcRn tal como uma região constante de anticorpo exibindo a atividade de ligação a FcRn humano sob a condição de faixa de pH neutro são administradas in vivo e absorção in vivo em células é aumentada.
Por exemplo, quando um anticorpo que se liga a um antígeno de membrana é administrado in vivo, após ligação a um antígeno, o anticorpo é, em um estado ligado ao antígeno, incorporado ao endossomo via internali- zação intracelular.
Então, o anticorpo é transferido para o lisossoma enquan- to permanecendo ligado ao antígeno e é degradado junto com o antígeno lá.
A eliminação do plasma mediada por internalização é referida como elimina- ção dependente de antígeno e foi relatada para muitas moléculas de anti- corpo (Drug Discov.
Today (2006) 11 (1-2), 81-88). Quando uma molécula de anticorpo IgG única se liga a antígenos de uma maneira divalente, a mo- lécula de anticorpo única é internalizada enquanto permanecendo ligada aos dois antígenos, e é degradada no lisossomo.
No caso de anticorpos típicos, então, uma molécula de anticorpo IgG única não pode se ligar a três molécu- las de antígeno ou mais.
Por exemplo, uma molécula de anticorpo IgG única tendo uma atividade de neutralização não pode neutralizar trse moléculas de 5 antígeno ou mais.
A retenção no plasma de moléculas de IgG é relativamente lon- ga (a eliminação é lenta) uma vez que FcRn humano, que é conhecido como um receptor selvagem para a molécula de IgG, funciona.
Moléculas de IgG incorporados em endossomos através de pinocitose se ligam sob a condição ácido endossomal a FcRn humano expresso em endossomos.
As moléculas de IgG que não podem se ligar a FcRn humano são transferidas para lisos- somos e degradam lá.
Ao mesmo tempo, moléculas de IgG ligadas a FcRn humano são transferidas para superfície celular.
As moléculas de IgG são dissociadas de FcRn humano sob a condição neutra em plasma e recicladas de volta para o plasma.
Alternativamente, quando moléculas de ligação a antígeno são anticorpos que se ligam a um antígeno solúvel, os anticorpos administrados in vivo se ligam a antígeno, e então os anticorpos são incorporados a células enquanto permanecendo ligados aos antígenos.
A maioria dos anticorpos incorporados a células se liga a FcRn no endossomo e então são transferi- dos para a superfície celular.
Os anticorpos são dissociados de FcRn huma- no sob a condição neutra em plasma e liberados para o exterior das células.
No entanto, anticorpos tendo domínios de ligação a antígeno típicos cuja atividade de ligação a antígeno não varia dependendo a condição de con- centração de íon tal como pH são liberados para o exterior de células en- quanto permanecendo ligados aos antígenos e então não podem se ligar a um antígeno novamente.
Desta maneira, tal como os anticorpos que se li- gam a antígenos de membrana, molécula de anticorpo IgG típica única cuja atividade de ligação a antígeno não varia dependendo da condição de con- centração de íon tal como pH não pode se ligar a três moléculas de antígeno ou mais.
Os anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira depen-
dente do pH, que se ligam fortemente a antígenos sob a condição de faixa de pH neutro em plasma e são dissociados de antígenos sob a condição de faixa de pH ácido endossomal (anticorpos que se ligam a antígenos sob a condição de faixa de pH neutro e são dissociados sob uma condição de faixa 5 de pH ácido) e anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira depen- dente da concentração de íon de cálcio, que se ligam fortemente a antígenos sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta no plasma e são dissociados de antígenos sob uma condição de concentração de íon de cál- cio baixa no endossomo (anticorpos que se ligam a antígenos sob uma con- dição de concentração de íon de cálcio alta e são dissociados sob uma con- dição de concentração de íon de cálcio baixa) podem ser dissociados de antígeno no endossomo.
Anticorpos que se ligama a antígenos de uma ma- neira dependente do pH ou de uma maneira dependente da concentração de íon de cálcio, quando reciclados para o plasma através de FcRn após disso- ciação dos antígenos, podem novamente se ligar a um antígeno.
Desta ma- neira, tal molécula de anticorpo única pode se ligar repetidamente a várias moléculas de antígeno.
Ao mesmo tempo, antígenos ligados a moléculas de ligação a antígeno são dissociados de anticorpo no endossomo e degrada- dos no lisossomo sem reciclagem para o plasma.
Através da administração de tais moléculas de ligação a antígeno in vivo, absorção de antígeno em células é acelerada e é possível diminuir a concentração de antígeno no plasma.
Absorção de antígenos ligados por moléculas de ligação a antí- geno em células é promovida mais através de conferência da atividade de ligação a FcRn humano sob a condição da faixa de pH neutro (pH 7,4) a an- ticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente do pH, que se ligam fortemente a antígenos sob a condição de faixa de pH neutro no plasma e são dissociados de antígenos sob a condição de faixa de pH ácido endossomal (anticorpos que se ligam a antígenos sob a condição de faixa de pH neutro e são dissociados sob uma condição de faixa de pH ácido) e anti- corpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente da concentra- ção de íon de cálcio, que se ligam fortemente a antígenos sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta no plasma e são dissociados de antí- genos sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa no endos- somo (anticorpos que se ligam a antígenos sob uma condição de concentra- ção de íon de cálcio alta e são dissociados sob uma condição de concentra- 5 ção de íon de cálcio baixa). Especificamente, através da administração de tais moléculas de ligação a antígeno in vivo, a eliminação de antígeno é ace- lerada, e é possível reduzir a concentração de antígeno no plasma.
Anticor- pos típicos que não têm a habilidade de se ligar a antígenos de uma maneira dependendo do pH ou de uma maneira depdnente da concentração de íon de cálcio; e complexos de antígeno-anticorpo de tais anticorpos são incorpo- rados a células através de endocitose não específica e transportados para superfície celular através de ligação a FcRn sob a condição ácida endosso- mal.
Eles são dissociados de FcRn sob a condição neutra na superfície celu- lar e reciclados para o plasma.
Desta maneira, quando um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira totalmente dependente do pH (que se liga sob a condição de faixa de pH neutro e é dissociado sob uma condição de faixa de pH ácido) ou de uma maneira totalmente dependente da concen- tração de íon de cálcio (que se liga sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta e é dissociado sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa) se liga a um antígeno no plasma e é dissociado do antígeno no endossomo, a taxa de eliminação de antígeno é considerada ser igual à taxa de absorção em células do anticorpo ou complexo antígeno-anticorpo através de endocitose não específica.
Quando a dependência do pH ou con- centração de íon de cálcio de ligação de antígeno-anticorpo é insuficiente, antígenos que não são dissociados de anticorpos no endossomo são, junto com os anticorpos, reciclados para o plasma.
Por outro lado, quando a de- pendência do pH ou concentração de íon de cálcio é suficientemente forte, a etapa de limitação da taxa de eliminação de antígeno é a absorção celular por endocitose não específica.
Ao mesmo tempo, FcRn transporta anticor- pos do endossomo para a superfície celular, e uma fração de FcRn é espe- rada ser também distribuída na superfície celular.
Em geral, imunoglobulina tipo IgG, que é uma modalidade de moléculas de ligação a antígeno, tem atividade de ligação a FcRn baixa na faixa de pH neutro.
Os presentes inventores conceberam que imunoglobuli- na do tipo IgG tendo a atividade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro pode se ligar a FcRn na superfície celular e é incorporado a células de uma 5 maneira dependente de FcRn através da ligação a FcRn na superfície celu- lar.
A taxa de absorção celular mediada por FcRn é mais rápida do que a absorção celular por endocitose não específica.
Desta maneira, os presentes inventores suspeitaram que a taxa de eliminação de antígeno por moléculas de ligação a antígeno pode ser aumentada mais através de conferência da habilidade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro a moléculas de ligação a antígeno.
Especificamente, moléculas de ligação a antígeno que têm a habi- lidade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro liberam antígenos para célu- las mais rapidamente do que a imunoglobulina do tipo IgG nativa; as molécu- las são dissociadas de antígenos no endossomo e novamente recicladas para a superfície celular ou plasma; e novamente se ligam a antígenos lá e são incorporadas a células via FcRn.
A taxa de ciclização pode ser acelera- da através do aumento da habilidade de ligação a FcRn na faixa de pH neu- tro, resultando na aceleração de eliminação de antígeno do plasma.
Além disso, a taxa de eliminação de antígeno do plasma pode ser acelerada mais através de diminuição da atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH ácido do que na faixa de pH neutro.
Ainda, o número de moléculas de antígeno às quais uma molécula de ligação a an- tígeno única pode se ligar é previsto ser aumentado devido a um aumento no número de ciclização como um resultado de aceleração da taxa de cicli- zação.
As moléculas de ligação a antígeno da presente invenção compreen- dem um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a FcRn.
Uma vez que o domínio de ligação a FcRn não afeta a ligação a antígeno, e não depende do tipo de antígeno baseado no mecanismo descrito acima, a absorção de antígeno mediada por molécula de ligação a antígeno nas célu- las pode ser aumentada para acelerar a taxa de eliminação de antígeno a- través da redução da atividade de ligação a antígeno (habilidade de ligação) de uma molécula de ligação a antígeno de maneira a ser menor sob uma condição de concentração de íon tal como uma faixa de pH ácido ou concen- tração de íon de cálcio baixa do que sob uma condição de concentração de íon tal como uma faixa de pH neutro ou concentração de íon de cálcio alta e/ou através do aumento da atividade de ligação a FcRn no pH do plasma. 5 Desta maneira, as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção são esperadas exibir efeitos mais excelentes do que anticorpos terapêuticos convencionais do ponto de vista de redução de efeitos colaterais de antíge- nos, dose de anticorpo aumentada, aperfeiçoamento de dinâmica in vivo de anticorpos, etc.
A Fig. 1 mostra um mecanismo em que antígenos solúveis são eliminados do plasma através da administração de um anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH que tem atividade de ligação a FcRn aumentada em pH neutro comparado com um anticorpo de neutralização convencional.
Depois de ligação ao antígeno solúvel no plasma, o anticorpo de neutraliza- ção existente que não tem a habilidade de ligação a antígeno dependente do pH é lentamente incorporado às células através de interação não específica com as células.
O complexo entre o anticorpo de neutralização e antígeno solúvel incorporado às células é transferido para o endossomo ácido e então reciclado para o plasma através de FcRn.
Concomitantemente, o anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH que tem a atividade de ligação a FcRn aumentada sob a condição neutra é, após ligação ao antígeno solúvel no plasma, rapidamente incorporado às células expressando FcRn em sua membrana celular.
Então, o antígeno solúvel ligado ao anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH é dissociado do anticorpo no endossomo ácido devido à habilidade de ligação dependente do pH.
O antígeno solúvel disso- ciado do anticorpo é transferido para o lisossomo e degradado através de atividade proteolítica.
Concomitantemente, o anticorpo dissociado do antíge- no solúvel é reciclado para a membrana celular e então liberado para o plasma novamente.
O anticorpo livre, reciclado conforme descrito acima, pode novamente se ligar a outros antígenos solúveis.
Ao repetir tal ciclo: ab- sorção mediada por FcRn em células; dissociação e degradação do antíge- no solúvel; e reciclagem de anticorpo, tais anticorpos de ligação a antígeno dependentes do pH conforme acima descrito tendo a atividade de ligação a FcRn aumentada sob a condição neutra podem transferir uma grande quan- tidade de antígeno solúvel para o lisossomo e então diminuir a concentração de antígeno total no plasma. 5 Especificamente, a presente invenção refere-se também a com- posições farmacêuticas compreendendo moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, moléculas de ligação a antígeno produzidas através de alteração dos métodos da presente invenção ou moléculas de ligação a an- tígeno produzidas através dos métodos de produção da presente invenção.
As moléculas de ligação a antígeno da presente invenção ou moléculas de ligação a antígeno produzidas através de métodos de produção da presente invenção são úteis como composições farmacêuticas uma vez que elas, quando administradas, têm o efeito forte de reduzir a concentração de antí- geno no plasma comparado com moléculas de ligação a antígeno típicas, e exibem a resposta imune in vivo, farmacocinética e outros aperfeiçoados em animais administrados com as moléculas.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender carreadores farmaceuticamente a- ceitáveis.
Na presente invenção, as composições farmacêuticas referem- se geralmente a agentes para o tratamento ou para a prevenção ou para o teste e para o diagnóstico de doenças.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas através de métodos conhecidos pelos versados na técnica.
Por exemplo, elas podem ser utilizadas de forma parenteral, na forma de inje- ções de soluções ou suspensões estéreis incluindo água ou outro líquido farmaceuticamente aceitável.
Por exemplo, tais composições podem ser formuladas através da mistura na forma de dose unitária requerida na prática de fabricação de medicamento geralmente aprovada através da combina- ção, de forma apropriada, com veículos ou meios farmacologicamente acei- táveis, especificamente com água esterilizada, solução salina fisiológica, óleo vegetal, emulsificante, suspensão, tensoativo, estabilizante, agente a- romatizante, excipiente, veículo, conservante, aglutinante ou similar.
Em tais formulações, a quantidade de ingrediente ativo é ajustada para a obtenção de uma quantidade apropriada em uma faixa predeterminada.
As composições estéreis para injeção podem ser formuladas uti- lizando veículos tal como água destilada para injeção, de acordo com a prá- 5 tica de formulação padronizada.
As soluções aquosas para injeção incluem, por exemplo, solu- ção salina fisiológica e soluções isotônicas contendo dextrose ou outros ad- juvantes (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio). É também possível utilizar em combinação solubilizantes apropriados, por exemplo, álcoois (etanol e similares), polialcoóis (propileno glicol, polietileno glicol e similares), tensoativos não iônicos (polissorbato 80(TM), HCO-50 e similares). Os óleos incluem óleo de gergelim e óleos de soja.
O benzoato de benzila e/ou o álcool benzílico pode ser utilizado em combinação como solubilizantes.
É também possível combinar tampões (por exemplo, tampão fosfato e tampão acetato de sódio), agentes suavizantes (por exemplo, clori- drato de procaína), estabilizantes (por exemplo, álcool benzílico e fenol) e/ou antioxidantes.
Ampolas apropriadas são cheias com as injeções preparadas.
As composições farmacêuticas da presente invenção são prefe- rencialmente administradas de forma parenteral.
Por exemplo, as composi- ções na forma de dosagem para injeções, administração transnasal, admi- nistração transpulmonar ou administração transdérmica são administradas.
Por exemplo, elas podem ser administradas de forma sistêmica ou local a- través de injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea ou similar.
Os métodos de administração podem ser apropriadamente sele- cionados considerando a idade e os sintomas do paciente.
Uma dose de uma composição farmacêutica contendo uma molécula de ligação ao antí- geno pode ser, por exemplo, de 0,0001 até 1.000 mg/kg para cada adminis- tração.
Alternativamente, a dose pode ser, por exemplo, de 0,001 até 100,000 mg por paciente.
Entretanto, a presente invenção não é limitada pelos valores numéricos descritos anteriormente.
As doses e os métodos de administração variam dependendo do peso, da idade, dos sintomas do paci- ente e similares.
Os versados na técnica podem determinar doses e méto- dos de administração apropriados considerando os fatores descritos anteri- ormente. 5 Além disso, a presente invenção provê kits para uso nos méto- dos da presente invenção que compreendem pelo menos uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção.
Em adição ao acima, carreadores farmaceuticamente aceitáveis, meios, manuais de instrução descrevendo o uso do método e similar podem ser embalados nos kits.
Ainda, a presente invenção refere-se em geral a agentes para aperfeiçoamento da farmacocinética de moléculas de ligação a antígeno ou agentes para redução da imunogenicidade de moléculas de ligação a antí- geno, que compreendem como um ingrediente ativo uma molécula de liga- ção a antígeno da presente invenção ou uma molécula de ligação a antígeno produzida através do método de produção da presente invenção.
A presente invenção refere-se também a métodos para trata- mento de doenças inflamatórias imunes, os quais compreendem a etapa de administrar aos indivíduos (indivíduos de teste) uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção ou uma molécula de ligação a antígeno pro- duzida através do método de produção da presente invenção.
A presente invenção refere-se também ao uso de moléculas de ligação a antígeno da persente invenção ou moléculas de ligação a antígeno produzidas através dos métodos de produção da presente invenção na pro- dução de agentes para aperfeiçoamento da farmacocinética de moléculas de ligação a antígeno ou agentes para redução da imunogenicidade de molécu- las de ligação a antígeno.
Ainda, a presente invenção refere-se a moléculas de ligação a antígeno da presente invenção e moléculas de ligação a antígeno produzi- das através dos métodos de produção da presente invenção para uso nos métodos da presente invenção.
Os aminoácidos contidos nas sequências de aminoácidos da presente invenção podem ser modificados após a tradução (por exemplo, a modificação de uma glutamina N-terminal em um ácido piroglutâmico através da piroglutamilação é bem conhecida pelos versados na técnica). Natural- mente, tais aminoácidos modificados após a tradução são incluídos nas se- quências de aminoácidos na presente invenção. 5 Todos os documentos da técnica anterior citados no relatório descritivo estão aqui incorporadas a título de referência.
EXEMPLOS Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos Exemplos, mas não deve ser interpretada como sendo limita- da aos mesmos. Exemplo 1 Efeito de aumento de ligação a FcRn humano sob condições neutras na retenção no plasma e imunogenicidade de anticorpo humano ligado a receptor IL-6 humano dependente do pH É importante para um domínio de ligação a FcRn, tal como a re- gião Fc de moléculas de ligação a antígeno tais como anticorpos que intera- gem com FcRn (Nat. Rev. Immunol. (2007) 7 (9), 715-25), ter atividade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro a fim de eliminar antígeno solúvel do plasma. Conforme indicado no Exemplo de Referência 5, foi conduzida pes- quisa em um mutante de domínio de ligação a FcRn (domínio de ligação de aminoácido) que tem atividade de ligação a FcRn na região de pH neutro do domínio de ligação FcRn. F1 a F600 que foram desenvolvidos como mutan- tes Fc foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a FcRn na região neutra do pH, e foi confirmado que eliminação de antígeno do plasma é ace- lerada através do aumento da atividade de ligação a FcRn na região de pH neutro. A fim de desenvolver esses mutantes de Fc como agentes farmacêu- ticos, em adição a terem propriedades farmacológicas preferíveis (tal como aceleração de eliminação de antígeno do plasma através do aumento da ligação a FcRn), é também preferível ter estabilidade e pureza de moléculas de ligação a antígeno superiores, retenção no plasma superior de moléculas de ligação a antígeno no corpo e baixa imunogenicidade. Retenção de anticorpo no plasma é conhecida piorar como um resultado de ligação a FcRn sob condições neutras. Se um anticorpo termi-
nar ligado a FcRn sob condições neutras, mesmo se o anticorpo retornar para a superfície celular através de ligação a FcRn sob condições ácidas em endossomos, um anticorpo IgG não é reciclado para o plasma a menos que o anticorpo IgG dissocie de FcRn no plasma sob condições neutras, desta 5 maneira reciprocamente fazendo com que retenção no plasma seja prejudi- cada.
Por exemplo, retenção de anticorpo no plasma foi relatada piorar no caso de administração de anticorpo a camundongos para os quais ligação a FcRn de camundongo foi observada sob condições neutras (pH 7,4) como um resultado de introdução de uma substituição de aminoácido em IgG1 (Documento de Não Patente 10). Por outro lado, no entanto, foi também re- latado que no caso em que um anticorpo foi administrado a macacos cino- mólogos em que ligação a FcRn humano foi observada sob condições neu- tras (pH 7,4), não houve nenhuma melhora em retenção de anticorpo no plasma, e mudanças em retenção no plasma não foram observadas (Docu- mentos de Não Patente 10, 11 e 12). Ainda, FcRn foi relatado ser expresso em células apresentando antígeno e envolvido em apresentação de antígeno.
Em um relatório descre- vendo avaliação da imunogenicidade de uma proteína (daqui em diante refe- rida como MBP-Fc) obtida fundindo a região Fc de IgG1 de camundongo à proteína básica da mielina (MBP) (Myelin Basic Protein), embora não uma molécula de ligação a antígeno, células T que reagem especificamente com MBP-Fc sofrem ativação e proliferação como um resultado de cultura na presença de MBP-Fc.
Ativação de célula T é conhecida ser aumentada in vitro através do aumento de incorporação em células apresentando antígeno mediada por FcRn expresso em células apresentando antígeno através da adição de uma modificação na região Fc de MBP-Fc que causa um aumento na ligação a FcRn.
No entanto, uma vez que retenção no plasma piora como um resultado de adição de uma modificação que causa um aumento de liga- ção a FcRn, ativação de célula T foi relatada diminuir reciprocamente in vivo (Documento de Não Patente 43). Desta maneira, o efeito de aumento de ligação a FcRn sob con- dições neutras sobre a retenção no plasma e imunogenicidade de moléculas de ligação a antígeno não foi adequadamente investigado.
No caso do de- senvolvimento de moléculas de ligação a antígeno como agentes farmacêu- ticos, a retenção no plasma dessas moléculas de ligação a antígeno é prefe- rivelmente a mais longa possível, e imunogenicidade é preferivelmente a 5 mais baixa possível. (1-1) Produção de anticorpos humanos de ligação a receptor da IL-6 humano Desta maneira, a fim de avaliar a retenção no plasma de molé- culas de ligação a antígeno que contêm um domínio de ligação a FcRn ten- do a habilidade em se ligar a FcRn humano sob condições da região de pH neutro e avaliar a imunogenicidade dessas moléculas de ligação a antígeno, anticorpos humanos de ligação a receptor da IL-6 humano tendo atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro foram pro- duzidos na forma de Fv4-IgG1 composto de VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 35) e VL3-CK (SEQ ID NO: 36), Fv4-IgG1-F1 composto de VH3-IgG1-F1 (SEQ ID NO: 37) e VL3-CK, Fv4-IgG1-F157 composto de VH3-IgG1-F157 (SEQ ID NO: 38) e VL-3-CK, Fv4-IgG1-F20 composto de VH3-IgG1-F20 (SEQ ID NO: 39) e VL3-CK e Fv4-IgG1-F21 composto de VH3-IgG1-F2 (SEQ ID NO: 40) e VL3-CK de acordo com os métodos mostrados no Exemplo de Referência 1 e Exemplo de Referência 2. (1-2) Análise cinética de ligação a FcRn de camundongo Anticorpos contendo VH3-IgG1 ou VH3-IgG1-F1 para a cadeia pesada e L(WT)-CK (SEQ ID NO: 41) para a cadeia leve foram produzidos usando o método mostrado no Exemplo de Referência 2 e atividade de liga- ção a FcRn de camundongo foi avaliada da maneira descrita abaixo.
A ligação entre anticorpo e FcRn de anticorpo foi cineticamente analisada usando Biacore T100 (GE Healthcare). Uma quantidade apropria- da de proteína A (ACTIGEN) foi imobilizada em Sensor chip CM4 (GE Heal- thcare) através do método de acoplamento amino, e o chip foi deixado cap- turar um anticorpo de interesse.
Então, soluções de FcRn diluídas e tampão de atividade (como uma solução de referência) foram injetados para permitir que FcRn de camundongo interagisse com o anticorpo capturado no senso chip.
O tampão de atividade usado contém 50 mmol/l de fosfato de sódio, 150 mmol/l de NaCl e 0,05% (p/v) de Tween 20 (pH 7,4). FcRn foi diluído usando cada tampão.
O sensorchip foi regenerado usando 10 mmol/l de gli- cina-HCl (pH 1,5). Os ensaios foram realizados exclusivamente a 25º C.
A 5 constante de taxa de associação ka (l/Ms) e a constante de taxa de dissoci- ação (kd (1/s), ambas são parâmetros cinéticos, foram calculadas com base nos sensorgramas obtidos nos ensaios, e a KD (M) de cada anticorpo para FcRn de camundongo foi determinada a partir desses valores.
Cada parâ- metro foi calculado usando Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthca- re). Como resultado, embora a KD (M) de IgG1 não tenha sido de- tectada, a KD (M) do IgG1-F1 produzido foi 1,06E-06(M). Isso indica que a atividade de ligação a antígeno do IgG1-F1 produzido para FcRn de camun- dongo é aumentada sob condições da região de pH neutro (pH 7,4). (1-3) Estudo de PK in vivo usando camundongos normais Um estudo de PK foi conduzido usando o método mostrado a- baixo usando camundongos normais tendo os anticorpos humanos de liga- ção a receptor de IL-6 humano dependentes do pH produzidos.Fv4-IgG1 e Fv4-IgG1-F1. O anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano foi administrado a 1 mg/kg em uma administração única a uma veia caudal ou por baixo da pele das costas de camundongos normais (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão). Sangue foi coletado em 5 minutos, 7 horas e 1, 2, 4, 7, 14, 21 e 28 dias após administração do anticorpo para receptor da IL-6 anti- humano.
Plasma foi obtido centrifugando imediatamente o sangue coletado por 15 minutos a 4º C e 15.000 rpm.
O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20º C ou menos até o momento da medição. (1-4) Medição da concentração de anticorpo para receptor da IL- 6 anti-humano através de ELISA A concentração de anticorpo para receptor da IL-6 anti-humano em plasma de camundongo foi medida através de ELISA.
Primeiro, Frag- mento de Anticorpo F(ab’)2 (específico de cadeia γ) de IgG anti-humano (SIGMA) foi posto em uma Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge Nunc In-
ternational) seguido por permitir que isso descansasse sem ser perturbado a 4º C para produzir uma placa de fase sólida de IgG anti-humano.
Amostras de curva de calibragem contendo 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,25 e 0,0125 µ- g/mL de anticorpo para receptor para IL-6 anti-humano em concentração no 5 plasma, e amostras de medição no plasma de camundongo diluídas 100 ve- zes ou mais foram preparadas.
Misturas obtidas através da adição de 200 µl de 20 ng/ml de receptor para IL-6 humana solúvel a 100 µl de amostras de curva de calibragem e amostras de medição no plasma foram então deixa- das descansar sem serem perturbadas por 1 hora em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a placa de fase sólida de IgG anti-humano em que as misturas tinham sido postas em cada uma das suas cavidades foi deixada descansar mais sem ser perturbada por 1 hora em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação cromogênica de um líquido de reação obtido em uma hora de reação com um anticorpo para IL-6 R anti-humano biotinila- do (R&D) em temperatura ambiente e uma hora de reação com Streptavidi- na-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) em temperatura am- biente foi realizada usando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como substrato.
Depois da reação ter sido parada atra- vés da adição de ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), absorbância a 450 nm do líquido de reação de cada cavidade foi medida com uma leitora de microplaca.
As concentrações de anticorpo no plasma de camundongo fo- ram calculadas a partir de valores de absorbância da curva de calibragem usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). As concentrações dos anticorpos de ligação a receptor de IL-6 humano dependentes do pH em plasma seguindo administração intravenosa ou subcutânea dos anticorpos humanos de ligação a receptor de IL-6 huma- no dependente do pH a camundongos normais são mostradas na Fig. 2. Com base nos resultados da Fig. 2, em comparação com Fv4-IgG1 intrave- nosamente administrado, a retenção no plasma foi mostrada piorar em ad- ministração intravenosa de Fv4-IgG1-F1, ao qual ligação a FcRn de camun- dongo sob condições neutras foi aumentada.
Por outro lado, enquanto Fv4- IgG1 subcutaneamente administrado demonstrou retenção no plasma com-
parável com aquela quando administrado intravenosamente, no caso de Fv4-IgG1-F1 subcutaneamente administrado, uma súbita diminuição em concentração no plasma que foi pensada ser devido à produção de anticorpo anti-Fv4-IgG1-F1 de camundongo foi observada 7 dias após administração e 5 no dia 14 após administração Fv4-IgG1-F1 não foi detectado no plasma.
Com base neste resultado, retenção no plasma e imunogenicidade foram confirmadas piorar como um resultado de aumento da ligação de moléculas de ligação a antígeno a FcRn sob condições neutras.
Exemplo 2 Produção de anticorpo de camundongo de ligação a receptor de IL-6 humano tendo atividade de ligação a FcRn de camundongo sob condições da região de pH neutro Anticorpo de camundongo tendo atividade de ligação com FcRn de camundongo sob condições da região de pH neutro foi produzido de a- cordo com o método mostrado abaixo. (2-1) Produção de anticorpo de camundongo de ligação a recep- tor de IL-6 humano A sequência de aminoácido de um anticorpo de camundongo tendo a habilidade em se ligar a IL-6R humano, PM-1 de camundongo (Sato, K. e outros, Cancer Res. (1993) 53 (4), 851-856), foi usada para a região variável de anticorpo de camundongo.
Nas descrições que seguem, a região variável de cadeia pesada de PM-1 de camundongo é referida como mPM1H (SEQ ID NO: 42), enquanto a região variável de cadeia leve é referida como mPM1L (SEQ ID NO: 43). Ainda, IgG1 de camundongo de ocorrência natural (SEQ ID NO: 44, daqui em diante referido como mIgG1) foi usado para a região constante de cadeia pesada, enquanto kappa de camundongo de ocorrência natural (SEQ ID NO: 45, daqui em diante referido como mk1) foi usada como a regi- ão constante de cadeia leve.
Um vetor de expressão tendo as sequências de base de cadeia pesada mPM1H-mIgG1 (SEQ ID NO: 46) e mPM1L-mk1 de cadeia leve (SEQ ID NO: 47) foi produzido de acordo com o método do Exemplo de Re- ferência 1. Ainda, mPM1-mIgG1 que é um anticorpo de camundongo de li-
gação a IL-6R humano composto de mPM1H-mIgG1 e mPM1L-mk1 foi pro- duzido de acordo com o método do Exemplo de Referência 2. (2-2) Produção de anticorpo mPM1 tendo a habilidade em se li- gar a FcRn de camundongo sob condições da região de pH neutro 5 O mPM1-mIgG1 produzido é um anticorpo de camundongo que contém uma região Fc de camundongo de ocorrência natural e não tem ati- vidade de ligação a FcRn de camundongo sob condições da região de pH neutro.
Desta maneira, uma modificação de aminoácido foi introduzida na região constante de cadeia pesada de mPM1-mIgG1 a fim de fornecer ativi- dade de ligação a FcRn de camundongo sob condições da região de pH neutro.
Mais especificamente, mPH1H-mIgG1-mF3 (SEQ ID NO: 48) foi produzido através da adição de uma substituição de aminoácido obtida atra- vés da substituição de Thr por Tyr na posição 252 de mPH1H-mIgG1 con- forme indicado pela numeração EU, uma substituição de aminoácido obtida através da substituição de Thr por Glu na posição 256 (numeração EU), uma substituição de aminoácido obtida através da substituição de His por Lys na posição 433 (numeração EU) e uma substituição de aminoácido obtida atra- vés da substituição de Asn por Phe na posição 434 (numeração EU). Similarmente, mPH1H-mIgG1-mF14 (SEQ ID NO: 49) foi produ- zido através da adição de uma substituição de aminoácido obtida substituin- do Thr por Tyr na posição 252 (numeração EU) de mPH1H-mIgG1, uma substituição de aminoácido obtida através da substituição de Thr por Glu na posição 256 (numeração EU) e uma substituição de aminoácido obtida atra- vés de substituição de His por Lys na posição 433 (numeração EU). Além disso, mPM1H-mIgG1-mF38 (SEQ ID NO: 50) foi produzi- do adicionando uma substituição de aminoácido obtida através da substitui- ção de Thr por Tyr na posição 252 (numeração EU) de mPH1H-mIgG1, uma substituição de aminoácido obtida através da substituição de Thr por Glu na posição 256 (numeração 256) e uma substituição de aminoácido obtida atra- vés de substituição de Asn por Trp na posição 434 (numeração EU). Como um anticorpo de IgG1 de camundongo tendo a habilidade em se ligar a FcRn de camundongo sob condições da região de pH neutro, mPM1-mIgG1-mF3 que é composto de mPM1H-mIgG1-mF3 e mPM1L-mk1 foi produzido usando o método do Exemplo de Referência 2. (2-3) Confirmação de atividade de ligação a FcRn de camun- 5 dongo com Biacore Foram produzidos anticorpos que continham mPM1-mIgG1 ou mPM1-mIgG1-mF3 para a cadeia pesada e L(WT)-CK (SEQ ID NO: 41) para a cadeia leve e a atividade de ligação desses anticorpos a FcRn de camun- dongo em pH 7,0 (constante de dissociação KD) foi medida.
Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo.
Tabela 5 Nome do mutante Substituição de aminoácido Não detectado
Exemplo 3 experimento de ligação da ligação de moléculas de ligação a antígeno tendo região Fc a FcRn e FcγR No Exemplo 1, retenção no plasma e imunogenicidade foram confirmadas piorar como um resultado de aumento da ligação de moléculas de ligação a antígeno a FcRn sob condições neutras.
Uma vez que IgG1 de ocorrência natural não tem atividade de ligação a FcRn humano na região neutra, retenção no plasma e imunogenicidade foram pensadas piorar como um resultado de fornecimento da habilidade em se ligar a FcRn sob condi- ções neutras. (3-1) Domínio de ligação a FcRn e domínio de ligação a FcγR Um domínio de ligação a FcRn e um domínio de ligação a FcγR estão presentes na região Fc de anticorpo.
O domínio de ligação a FcRn está presente em dois locais na região Fc, e duas moléculas de FcRn foram anteriormente relatadas ser capazes de simultaneamente se ligar à região Fc de uma molécula de anticorpo única (Nature (1994) 372 (6504), 379-383). Por outro lado, embora um domínio de ligação a FcγR esteja também pre- sente em dois locais na região Fc, duas moléculas de FcγR são pensadas não serem capazes de se ligar simultaneamente.
Isso é porque a segunda molécula de FcγR é incapaz de se ligar devido a uma mudança estrutural na região Fc que ocorre da ligação da primeira molécula de FcγR para a região Fc (J.
Biol.
Chem. (2001) 276 (19), 16469-16477). Conforme anteriormente descrito, FcγR ativo é expresso nas 5 membranas celulares de várias células imunes tais como células dendríticas, células NK, macrófagos, neutrófilos e adipócitos.
Além disso, em seres hu- manos FcRn foi relatado ser expresso em células imunes tais como células apresentando antígeno, por exemplo, células dendríticas, macrófagos e mo- nócitos (J.
Immunol. (2001) 166 (5), 3266-3276). Uma vez que IgG1 de ocor- rência natural normal é incapaz de se ligar a FcRn na região de pH neutro e é apenas capaz de se ligar a FcγR, IgG1 de ocorrência natural se liga a célu- las apresentando antígeno através da formação de um complexo binário de FcγR/IgG1. Sítios de fosforilação estão presentes nos domínios intracelula- res de FcγR e FcRn.
Tipicamente, fosforilação de domínios intracelulares de receptores expressos em superfícies celulares ocorre através de conjugação do receptor, e receptores são internalizados como um resultado desta fosfo- rilação.
Mesmo se IgG1 de ocorrência natural formar um complexo binário de FcγR/IgG1 em células apresentando antígeno, conjugação do domínio intracelular de FcγR não ocorre.
No entanto, quando hipoteticamente uma molécula de IgG tendo atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro forma um complexo contendo quatro componentes: FcγR/duas moléculas de FcRn/IgG, internalização de um heterocomplexo contendo quatro componentes consistindo em FcγR/duas moléculas de FcRn/IgG po- de ser induzida como um resultado uma vez que conjugação de três domí- nios extracelulares de FcγR e FcRn ocorre.
A formação de um heterocom- plexo contendo quatro componentes consistindo em FcγR/duas moléculas de FcRn/IgG é pensada ocorrer em células apresentando antígeno expres- sando ambos o FcγR e o FcRn, e como um resultado, retenção no plasma de moléculas de anticorpo incorporadas a células apresentando antígeno foi pensada piorar, e a possibilidade de piora de imunogenicidade foi também considerada.
No entanto, não há quaisquer relatórios verificando a maneira que as moléculas de ligação a antígeno contendo um domínio de ligação a FcRn, tal como uma região Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob condi- ções da região de pH neutro, se ligam a células imunes tais como células apresentando antígeno expressando FcγR e FcRn juntos. 5 Se ou não um complexo quaternário de FcγR/duas moléculas de FcRn/IgG pode ser formado pode ser determinado através de se ou não uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro é capaz de simultane- amente se ligar a FcγR e FcRn.
Desta maneira, um experimento de ligação simultânea a FcRn e FcγR e região Fc contida em uma molécula de ligação a antígeno foi conduzido de acordo com o método indicado abaixo. (3-2) Avaliação de ligação simultânea a FcRn e FcγR usando Bi- acore Foi feita uma avaliação de se ou não FcRn humano ou de ca- mundongo e FcγRs seres humanos ou de camundongo simultaneamente se ligam a uma molécula de ligação a antígeno usando o Biacore T100 ou T200 System (GE Healthcare). A molécula de ligação a antígeno sendo testada foi capturada por FcRn humano ou de camundongo imobilizado no CM4 Sensor chip (GE Healthcare) através de acoplamento de amina.
Em seguida, FcγRs seres humanos ou de camundongo diluídos e um tampão de atividade usado como um agente sem expressão foram injetados para permitir que FcγRs seres humanos ou de camundongo interagissem com a molécula de ligação a antígeno ligada a FcRn no sensor chip.
Um tampão consistindo em 50 mmol/L de fosfato de sódio, 150 mmol/L de NaCl e 0,05% (p/v) de Tween 20 (pH 7,4) foi usado para o tampão de atividade, e este tampão foi também usado para diluir FcγRs. 10 mmol/L de Tris-HCl (pH 9,5) foram usados para regenerar o sensor chip.
Todas as medições de ligação foram realizadas a 25º C. (3-3) Experimento de ligação simultânea em IgG humano, FcRn humano, FcγR humano ou FcγR de camundongo Foi feita uma avaliação de se ou não Fv4-IgG1-F157 produzido no Exemplo 1, que é um anticorpo humano que tem a habilidade em se ligar a FcRn humano sob condições da região de pH neutro, se liga a vários tipos de FcγR humano ou vários tipos de FcγR de camundongo enquanto simulta- neamente se ligando a FcRn humano.
O resultado mostrou que Fv4-IgG1-F157 era capaz de se ligar a 5 FcγRIa humano, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb e FcγRIIIa(F) simultanea- mente com ligação a FcRn humano (Figuras 3, 4, 5, 6 e 7). Ainda, Fv4-IgG1- F157 foi mostrado ser capaz de se ligar a FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII e FcγRIV simultaneamente com ligação a FcRn humano (Figuras 8, 9, 10 e 11). Com base no acima, anticorpos humanos tendo atividade de li- gação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro foram mostra- dos ser capazes de se ligar a vários tipos de FcγR humano e vários tipos de FcγR de camundongo tais como FcγRIa humano, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb e FcγRIIIa(F) bem como FcγRIa de camundongo, FcγRIIb, FcγRIII e FcγRIV simultaneamente com ligação a FcRn humano. (3-4) Experimento de ligação simultânea em IgG humano, FcRn de camundongo e FcγR de camundongo Foi feita uma avaliação de se ou não Fv4-IgG1-F20 produzido no Exemplo 1, que é um anticorpo humano tendo atividade de ligação a FcRn de camundongo sob condições da região de pH neutro, se liga a vários tipos de FcγR de camundongo simultaneamente com ligação a FcRn de camun- dongo.
O resultado mostrou que Fv4-IgG1-F20 foi capaz de se ligar a FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII e FcγRIV simultaneamente com ligação a FcRn de camundongo (Fig. 12). (3-5) Experimento de ligação simultânea em IgG de camundon- go, FcRn de camundongo e FcγR de camundongo Foi feita uma avaliação de se ou não mPM1-mIgG1-mF3 produ- zido no Exemplo 2, que é um anticorpo de camundongo tendo atividade de ligação a FcRN de camundongo sob condições da região de pH neutro, se liga a vários tipos de FcγR de camundongo simultaneamente com ligação a FcRn de camundongo.
O resultado mostrou que mPM1-mIgG1-mF3 foi capaz de se li-
gar a FcγRIIb de camundongo e FcγRIII simultaneamente sem ligação a F- cRn de camundongo (Fig. 13). Quando julgando a partir do relatório que um anticorpo IgG1 de camundongo não tem a habilidade em se ligar a FcγRI de camundongo e FcγRIV (J.
Immunol. (2011) 187(4), 1754-1763), o resultado 5 que ligação a FcγRI e FcγRIV não foi confirmada é considerado ser um re- sultado razoável.
Com base nessas constatações, anticorpos humanos e anticor- pos de camundongo tendo atividade de ligação a FcRn de camundongo sob condições da região de pH neutro foram mostrados ser capazes também de se ligar a vários tipos de FcγR de camundongo simultaneamente com liga- ção a FcRn de camundongo.
A constatação acima indica a possibilidade de formação de um heterocomplexo compreendendo uma molécula de Fc, duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR sem qualquer interferência mútua, embora uma região de ligação a FcRn e região de ligação a FcγRII estejam presen- tes na região Fc de IgG humano e de camundongo.
Esta propriedade da região Fc de anticorpo de ser capaz de for- mar tal heterocomplexo não foi anteriormente relatada, e foi determinada aqui pela primeira vez.
Conforme anteriormente descrito, vários tipos de FcγR ativo e FcRn são expressos em células apresentando antígeno, e a formação deste tipo de complexo quaternário em células apresentando antí- geno pelas moléculas de ligação a antígeno é sugerida melhorar a afinidade para moléculas apresentando antígeno enquanto promovendo ainda incorpo- ração em células apresentando antígeno através do aumento dos sinais de internalização através de conjugação do domínio intracelular.
Em geral, mo- léculas de ligação a antígeno incorporadas a células apresentando antígeno são quebradas em lisossomos dentro das células apresentando antígeno e então apresentadas a células T.
A saber, moléculas de ligação a antígeno tendo atividade de li- gação a FcRn na região de pH neutro formam um heterocomplexo contendo quatro componentes incluindo uma molécula de FcγR ativo e duas molécu- las de FcRn, e isso é pensado resultar em um aumento em incorporação em células apresentando antígeno, desta maneira piorando a retenção no plas- ma e piorando mais a imunogenicidade.
Consequentemente, no caso de introdução de uma mutação em uma molécula de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn na 5 região de pH neutro, produção de uma molécula de ligação a antígeno em que a habilidade em formar tal complexo quaternário diminuiu, e adminis- trando esta molécula de ligação a antígeno no corpo, a retenção no plasma desta molécula de ligação a antígeno melhora e indução de uma resposta imune pelo corpo pode ser inibida (a saber, a imunogenicidade pode ser di- minuída). Exemplos de modalidades preferidas de moléculas de ligação a antígeno incorporadas a células sem formação de tal complexo incluem os três tipos mostrados abaixo.
Modalidade 1 Moléculas de ligação a antígeno que têm atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro e cuja atividade de ligação a FcγR ativo é menor do que a atividade de ligação do domínio de ligação a FcγR nativo.
As moléculas de ligação a antígeno da Modalidade 1 formam um complexo contendo três componentes através da ligação a duas moléculas de FcRn, mas não formam um complexo contendo FcγR ativo.
Modalidade 2 Moléculas de ligação a antígeno que têm atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro e têm atividade de ligação seletiva a FcγR inibidor As moléculas de ligação a antígeno da Modalidade 2 são capa- zes de formar um complexo contendo quatro componentes através de liga- ção a duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR inibidor.
No entan- to, uma vez que uma molécula de ligação a antígeno é apenas capaz de se ligar a uma molécula de FcγR, uma molécula de de ligação a antígeno única é incapaz de se ligar a outro FcγR ativo enquanto ligada a FcγR inibidor.
A- lém disso, moléculas de ligação a antígeno que são incorporadas a células enquanto ainda ligadas a FcγR inibidor são relatadas ser recicladas para a membrana celular para evitar serem quebradas dentro das células (Immunity (2005) 23, 503-514). A saber, moléculas de ligação a antígeno tendo ativida-
de de ligação seletiva a FcγR inibidor são pensadas ser incapazes de formar um complexo contendo FcγR ativo que cause uma resposta imune.
Modalidade 3 Moléculas de ligação a antígeno em que apenas um dos dois polipeptídeos compondo o domínio de ligação a FcRn tem ativi- 5 dade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro enquanto o outro não tem atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro Embora as moléculas de ligação a antígeno da Modalidade 3 se- jam capazes de formar um complexo ternário através de ligação a uma mo- lécula de FcRn e uma molécula de FcγR, elas não formam um heterocom- plexo contendo quatro componentes incluindo duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR.
As moléculas de ligação a antígeno das Modalidades 1 a 3 são esperadas ser capazes de melhorar a retenção no plasma e diminuir a imu- nogenicidade em comparação com moléculas de ligação a antígeno que são capazes de formação de complexos contendo quatro componentes incluindo duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR.
Exemplo 4 Avaliação de retenção no plasma de anticorpos humanos que têm atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro e cuja ativi- dade de ligação a FcγR humano e de camundongo é menor do que a ativi- dade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo. (4-1) Produção de anticorpo cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo e que se liga a receptor de IL-6 humano de uma maneira de- pendente do pH As moléculas de ligação a antígeno da Modalidade 1 dentre as três modalidades mostradas no Exemplo 3, a saber moléculas de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro e cuja atividade de ligação a FcγR ativo é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo, foram produzidas da maneira descrita abaixo.
Fv4-IgG1-F21 e Fv4-IgG1-F157 produzidos no Exemplo 1 são anticorpos que têm atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro e se ligam a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH.
Foram produzidas variantes em que ligação a FcγR de 5 camundongo foi diminuída por uma substituição de aminoácido em que Ser substituiu Lys na posição 239 (numeração EU) nas suas sequências de ami- noácido.
Mais especificamente, VH3-IgG1-F140 (SEQ ID NO: 51) foi produ- zido em que Ser substituiu Lys na posição 239 (numeração EU) da sequên- cia de aminoácido de VH3-IgG1-F21. Ainda, VH3-IgG1-F424 (SEQ ID NO: 5) foi produzido, em que Ser substituiu Lys na posição 239 (numeração EU) da sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F157. Fv4-IgG1-F140 e Fv4-IgG1-F424 contendo essas cadeias pesa- das e a cadeia leve de VL3-CK foram produzidos usando o método do E- xemplo de Referência 2. (4-2) Confirmação da atividade de ligação a FcRn humano FcγR de camundongo A atividade de ligação (constante de dissociação KD) a FcRn humano em pH 7,0 e atividade de ligação a FcγR de camundongo em pH 7,4 de anticorpos contendo o VH3-IgG1-F21, VH3-IgG1-F140, VH3-IgG1-F157 ou VH3-IgG1-F424 produzido para a cadeia pesada e L(WT)-CK para a ca- deia leve foram medidas usando o método mostrado abaixo. (4-3) Análise cinética de ligação a FcRn humano Uma análise cinética de ligação entre FcRn humano e os anti- corpos mencionados acima foi realizada usando o Biacore T100 ou T200 (GE Healthcare). Os anticorpos sendo testados foram capturados no CM4 Sensor chip (GE Healthcare) em que uma quantidade adequada de Proteína L (ACTIGEN) foi adequadamente imobilizada por acoplamento de amina.
Em seguida, FcRn humano diluído e um tampão de atividade usado como uma substância sem expressão foram injetados para permitir que o FcRn humano interagisse com o anticorpo capturado no sensor chip.
Um tampão consistin- do em 50 mmol/L de fosfato de sódio, 150 mmol/L de NaCl e 0,05% (p/v) de Tween 20 (pH 7,0 ou pH 7,4) foi usado para o tampão de atividade, e cada tampão foi também usado para diluir o FcRn humano. 10 mmol/L de glicina- HCl (pH 1,5) foram usados para regenerar o sensor chip.
Todas as medições de ligação foram realizadas a 25º C.
A KD (M) de cada anticorpo para FcRn humano foi calculada com base em parâmetros cinéticos, isto é, a constante 5 de taxa de associação ka (1/Ms) e a constante de taxa de dissociação kd (1/s) calculadas a partir de um sensorgrama obtido através da medição.
O Biacore T100 ou T200 Evaluation Software (GE Healthcare) foi usado para calcular cada parâmetro.
Os resultados são mostrados na Tabela 6 abaixo.
Tabela 6 Nome do mutante Substituição de aminoácido
Atividade de ligação a FcγR de camundongo em pH 7,4 foi me- dida usando o método mostrado abaixo. (4-4) Avaliação de atividade de ligação a FcγR de camundongo Atividade de ligação entre os anticorpos de FcγRI, FcγRII, Fcγ- RIII e FcγRIV (R & D Systems, Sino Biological) (daqui em diante referido como FcγR de camundongo) foi avaliada usando o Biacore T100 ou T200 (GE Healthcare). Os anticorpos sendo testados foram capturados pela Prote- ína L (ACTIGEN) que foi imobilizada em quantidades adequadas no CM4 Sensor chip (GE Healthcare) através de acoplamento de amina.
Em seguida, os FcγRs de camundongo diluídos e um tampão de atividade usado como um agente sem expressão foram injetados para permitir interação com o an- ticorpo capturado no sensor chip.
Um tampão consistindo em 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L de NaCl e 0,05% (p/v) de Tween 20 (pH 7,4) foi usado para o tampão de atividade e este tampão foi também usado para diluir os FcγRs de camundongo. 10 mmol/L de glicina-HCl (pH 1,5) foram usados para regenerar o sensor chip.
Todas as medições foram realizadas a 25º C.
Atividade de ligação a FcγRs de camundongo pode ser repre- sentada pela atividade de ligação relativa a FcγRs de camundongo.
Anticor-
po foi capturado pela Proteína L, e a quantidade de mudança em um sen- sorgrama antes e após o anticorpo ter sido capturado foi definida como X1. Em seguida, FcγRs de camundongo foram deixados interagir como anticor- po, e o valor obtido através de subtração da atividade de ligação de FcγRs 5 de camundongo representada como a quantidade de mudança em um sen- sorgrama antes e após permitir que o tampão de atividade interagisse com anticorpo capturado pela Proteína L (∆A2) do valor obtido multiplicando por 1500 o valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcγRs de camundon- gos representada como a quantidade de mudança em um sensorgrama an- tes e após esta interação (∆A1) pela quantidade capturada (X) de cada anti- corpo foi dividido pela quantidade capturada de cada anticorpo (X) seguido por multiplicação por 1500 para obter a atividade de ligação dos FcγRs de camundongo (Y) (Equação 1). Equação 1 A atividade de ligação de FcγRs de camundongo (Y) = (∆A1- ∆A2)/X x 1500 Os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo.
Tabela 7 Quantidade de ligação (BU)
De acordo com os resultados das Tabelas 2 e 3, Fv4-IgG1-F140 e Fv4-IgG1-F424 demonstraram uma diminuição em ligação a FcγR de ca- mundongo sem afetar a atividade de ligação a FcRn humano em compara- ção com Fv4-IgG1-F21 e Fv4-IgG1-F157. (4-5) Estudo de PK In vivo usando camundongos transgênicos FcRn humanos Um estudo de PK em administração dos anticorpos Fv4-IgG1- F140, Fv4-IgG1-F424, Fv4-IgG1-F21 e Fv4-IgG1-F157 a camundongos transgênicos FcRn humanos foi realizado de acordo com os métodos mos- trados abaixo.
Anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano foi administrado a 1 mg/kg em uma administração única a uma veia caudal de camundongos 5 transgênicos FcRn humanos (camundongo linhagem 32 +/+ Tg B6.mFcRn-/- .hFcRn, Jackson Laboratories, Methods Mol.
Biol. (2010)602, 93-104). San- gue foi coletado em 15 minutos, 7 horas e 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 e 28 dias após administração do anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano.
Plasma foi obtido centrifugando imediatamente o sangue coletado por 15 minutos a 4º C e 15.000 rpm.
O plasma separado foi armazenado em um congelador a- justado para -20º C ou menos até o momento da medição. (4-6) Medição de concentração de anticorpo para receptor de IL- 6 anti-humano através de ELISA A concentração de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano em plasma de camundongo foi medida através de ELISA.
Primeiro, Frag- mento de Anticorpo IgG anti-humano (específico de cadeia γ) (SIGMA) foi posto em uma Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge Nunc International) seguido por permitir que ficasse sem ser perturbado de um dia para o outro a 4º C para produzir uma placa de fase sólida de IgG anti-humano.
Amostras de curva de calibragem contendo 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 e 0,0125 µ- g/mL de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano em concentração de anticorpo no plasma e amostras de medição no plasma de camundongo dilu- ídas 100 vezes ou mais foram preparadas.
Misturas obtidas através da adi- ção de 200 µl de 20 ng/mL de receptor de IL-6 humano solúvel a 100 µL das amostras de curva de calibragem e amostras de medição do plasma foram então deixadas descasar sem serem perturbadas por 1 hora em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a placa de fase sólida de IgG anti-humano em que as misturas tinham sido dispersas em cada uma das suas cavidades foi deixada descansar mais sem ser perturbada por 1 hora em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a reação cromogênica de um líquido de rea- ção obtido quando da reação com um anticorpo IL-6 R anti-humano biotinila- do (R & D) por 1 hora em temperatura ambiente e reação adicional com Es-
treptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) por 1 hora em temperatura ambiente foi realizada usando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como substrato.
Depois da reação ter sido parada através da adição de ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), 5 absorbância a 450 nm dos líquidos de reação de cada cavidade foi medida com uma leitora de microplaca.
As concentrações de anticorpo no plasma de camundongo foram calculadas a partir dos valores de absorbância da curva de calibragem usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular De- vice). As concentrações dos anticorpos de ligação a receptor de IL-6 humano dependente do pH em plasma seguindo administração intravenosa dos anticorpos de ligação a receptor de IL-6 humano dependente do pH a camundongos transgênicos FcRn humanos são mostradas na Fig. 14. Com base nos resultados da Fig. 14, Fv4-IgG1-F140 cuja liga- ção a FcγR de camundongo foi menor em comparação com Fv4-IgG1-F21 foi observado demonstrar aperfeiçoamento de retenção no plasma em com- paração com Fv4-IgG1-F21. Similarmente, Fv4-IgG1-F424 cuja ligação a FcγR de camundongo foi menor em comparação com Fv4-IgG1-F157 foi observado demonstrar prolongamento de retenção no plasma em compara- ção com Fv4-IgG1-F157. Com base nisso, um anticorpo que tem atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro e tem um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR é menor do que aquela de um domínio de ligação a FcγR normal foi mostrado ter retenção no plasma maior do que um anticorpo tendo o domínio de ligação a FcγR normal.
Embora a presente invenção não seja limitada a uma teoria es- pecífica, a razão por ter observado tal aperfeiçoamento de retenção no plasma de molécula de ligação a antígeno é pensada ser que uma vez que as moléculas de ligação a antígeno têm atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro, e têm um domínio de FcγR cuja ativi- dade de ligação a FcγR é menor do que aquela do domínio de ligação a FcγR de ocorrência natural, a formação do complexo quaternário descrito no
Exemplo 3 foi inibida.
Em outras palavras, Fv4-IgG1-F21 e Fv4-IgG1-F157, que formam um complexo quaternário na membrana celular de células apre- sentando antígeno, são pensados ser mais facilmente incorporados a células apresentando antígeno.
Por outro lado, in Fv4-IgG1-F140 e Fv4-IgG1-F424, 5 que são classificados como Modalidade 1 indicada no Exemplo 3 e não for- mam um complexo quaternário na membrana celular de células apresentan- do antígeno, incorporação em células apresentando antígeno é pensada ser inibida.
Aqui, incorporação de moléculas de ligação a antígeno a células tais como células endoteliais vasculares que não expressam FcγR ativo é pen- sada incluir principalmente incorporação não específica ou incorporação mediada por FcRn na membrana celular, e não é considerada ser afetada por uma diminuição na atividade de ligação a FcγR.
Em outras palavras, o aperfeiçoamento de retenção no plasma que foi observado conforme anteri- ormente descrito é pensado ser o resultado de inibição seletiva de incorpo- ração a células imunes, incluindo células apresentando antígeno.
Exemplo 5 Avaliação de retenção no plasma de anticorpos hu- manos que têm atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro, mas não têm atividade de ligação a FcγR de camundongo (5-1) Produção de anticorpos humanos que não têm atividade de ligação a FcγR humano e de camundongo e se ligam a receptor de IL-6 hu- mano de uma maneira dependente do pH Os anticorpos foram produzidos da maneira mostrada abaixo a fim de produzir anticorpos humanos que não têm atividade de ligação a FcγR humano e de camundongo e se ligam a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH.
VH3-IgG1-F760 (SEQ ID NO: 53) que não tem atividade de ligação a FcγR humano e de camundongo foi produzido através de uma substituição de aminoácido obtida através da substituição de Leu por Arg na posição 235 (numeração EU) e uma substituição de aminoá- cido obtida através da substituição de Ser por Lys na posição 239 da se- quência de aminoácido de VH3-IgG1. Similarmente, VH3-IgG1-F821 (SEQ ID NO: 57), VH3-IgG1-F939 (SEQ ID NO: 58) e VH3-IgG1-F1009 (SEQ ID NO: 59) que não têm atividade de ligação a FcγR humano e de camundongo foram produzidos através de substituição de um aminoácido obtido através da substituição de Leu por Arg na posição 235 (numeração EU) e uma substituição de aminoácido obtida através da substituição de Ser por Lys na posição 239 das respectivas se- 5 quências de aminoácido de VH3-IgG1-F11 (SEQ ID NO: 54), VH3-IgG1- F890 (SEQ ID NO: 55) e VH3-IgG1-F947 (SEQ ID NO: 56). Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4- IgG1-F760, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 e Fv4-IgG1-F1009 contendo esses anticorpos para as cadeias pesadas e VL3-CK para a cadeia leve fo- ram produzidos usando o método do Exemplo de Referência 2. (5-2) Confirmação da atividade de ligação a FcRn humano e FcγR de camundongo A atividade de ligação (constante de dissociação KD) a FcRn humano em pH 7,0 de anticorpos contendo VH3-IgG1, VH3-IgG1-F11, VH3- IgG1-F890, VH3-IgG1-F947, VH3-IgG1-F760, VH3-IgG1-F821, VH3-IgG1- F939 ou VH3-IgG1-F1009 para a cadeia pesada e L(WT)-CK para a cadeia leve produzida usando o método do Exemplo de Referência 2 foi medida usando o método do Exemplo 4. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 8 abaixo.
Tabela 8 Nome do mutante Substituição de aminoácido Não detectado
Não detectado
A atividade de ligação a FcγR de camundongo em pH 7,4 de an- ticorpos contendo VH3-IgG1, VH3-IgG1-F11, VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1- F947, VH3-IgG1-F760, VH3-IgG1-F821, VH3-IgG1-F939 ou VH3-IgG1- F1009 para a cadeia pesada e L(WT)-CK para a cadeia leve foi medida da mesma maneira que o método do Exemplo 4. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 9 abaixo.
Tabela 9 Nome do Quantidade de ligação (RU) mutante
5 De acordo com os resultados das Tabelas 4 e 5, Fv4-IgG1-F760, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 e Fv4-IgG1-F1009 demonstraram uma dimi- nuição em ligação a FcγR de camundongo sem afetar a atividade de ligação a FcRn humano em comparação com Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1- F890 e Fv4-IgG1-F947. (5-3) Estudo de PK In vivo usando camundongos transgênicos FcRn humano Um estudo de PK em administração dos anticorpos Fv4-IgG1 e Fv4-IgG1-F760 produzidos a camundongos transgênicos FcRn humano foi realizado de acordo com o método mostrado abaixo.
Anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano foi administrado a 1 mg/kg em uma administração única em uma veia caudal de camundongos transgênicos com FcRn humano (camundongo linhagem 32 +/+ Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn, Jackson Laboratories, Methods Mol.
Biol. (2010)602, 93-104). Sangue foi coletado em 15 minutos, 7 horas e 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 e 28 dias após administração do anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano.
Plasma foi obtido centrifugando imediatamente o sangue coletado por 15 minutos a 4º C e 15.000 rpm.
O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20º C ou menos até o momento da medição.
A concentração do anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano no plasma de camundongo foi medida através de ELISA da mesma maneira que o método do Exemplo 4. Os resultados são mostrados na Fig. 15. Fv4- IgG1-F760, que diminuiu a atividade de ligação de Fv4-IgG1 a FcγR de ca- mundongo, demonstrou retenção no plasma quase igual àquela de Fv4- IgG1-F11; no entanto, um efeito de aperfeiçoamento de retenção no plasma 5 através da diminuição da atividade de ligação a FcγR não foi observado. (5-4) Estudo de PK in vivo usando camundongos transgênicos com FcRn humano Um estudo de PK em administração dos anticorpos Fv4-IgG1- F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4-IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 e Fv4- IgG1-F1009 a camundongos transgênicos com FcRn humano foi realizado de acordo com o método mostrado abaixo.
Anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano foi administrado a 1 mg/kg em uma administração única sob a pele das costas de camundongos transgênicos com FcRn humano (camundongo linhagem 32 +/+ Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn, Jackson Laboratories, Methods Mol.
Biol. (2010)602, 93-104). Sangue foi coletado em 15 minutos, 7 horas e 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 e 28 dias após administração do anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano.
Plasma foi obtido centrifugando imediatamente o sangue coletado por 15 minutos a 4º C e 15.000 rpm.
O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20º C ou menos até o momento da medição.
Concentração de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano no plasma de camundongo foi medida através de ELISA da mesma maneira que o método do Exemplo 4. Os resultados são mostrados na Fig. 16. Fv4- IgG1-F821, que diminuiu a atividade de ligação de Fv4-IgG1-F11 a FcγR de camundongo, demonstrou retenção no plasma quase igual àquela de Fv4- IgG1-F11. Por outro lado, Fv4-IgG1-F939, que diminuiu a atividade de liga- ção de Fv4-IgG1-F890 a FcγR de camundongo, foi observado demonstrar retenção no plasma aperfeiçoada em comparação com Fv4-IgG1-F890. Si- milarmente, Fv4-IgG1-F1009, que diminuiu a atividade de ligação de Fv4- IgG1-F947 a FcγR de camundongo, foi observado demonstrar retenção no plasma aperfeiçoada em comparação com Fv4-IgG1-F947. Por outro lado, uma vez que não houve quaisquer diferenças observadas em retenção no plasma para ambos o Fv4-IgG1 e o IgG1-F760, e Fv4-IgG1, que não tem atividade de ligação a FcRn na região de pH neu- tro, é capaz de formar um complexo binário com FcγR em células imunes, mas é incapaz de formar um complexo quaternário, aperfeiçoamento de re- 5 tenção no plasma atribuível a uma diminuição em atividade de ligação a FcγR foi pensado não ter sido observado.
A saber, aperfeiçoamento de re- tenção no plasma pode ser dito ser observado apenas como um resultado de diminuição de atividade de ligação a FcγR de moléculas de ligação a an- tígeno tendo atividade de ligação a FcRn na região de pH neutro, e inibição da formação de um complexo quaternário.
Com base nesta constatação também, a formação de um complexo quaternário é pensada realizar um papel importante na exacerbação de retenção no plasma. (5-5) Produção de anticorpos humanos que não têm atividade de ligação a FcγR humano e de camundongo e se ligam a receptor de IL-6 hu- mano de uma maneira dependente do pH VH3-IgG1-F1326 (SEQ ID NO: 155), em que atividade de liga- ção a FcγR humano e de camundongo é diminuída, foi produzido através de uma substituição de aminoácido obtida através de substituição de Leu por Ala na posição 234 (numeração EU) e uma substituição de aminoácido obti- da substituindo Leu por Ala na posição 235 da sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F947 (SEQ ID NO: 56). Fv4-IgG1-F1326 contendo VH3-IgG1-F1326 para a cadeia pe- sada e VL3-CK para a cadeia leve foi produzido usando o método do Exem- plo de Referência 2. (5-6) Confirmação da atividade de ligação a FcRn humano e FcγR de camundongo A atividade de ligação (constante de dissociação KD) a FcRn humano em pH 7,0 de anticorpo contendo VH3-IgG1-F1326 para a cadeia pesada e L(WT)-CK para a cadeia leve produzido usando o método do E- xemplo de Referência 2 foi medida usando o método do Exemplo 4. Ainda, a atividade de ligação a FcγR de camundongo em pH 7,4 foi medida da mes- ma maneira que o método do Exemplo.
Os resultados da medição são mos-
trados na Tabela 10 abaixo.
Tabela 10 Nome mutante Substituição de aminoácido
De acordo com os resultados da Tabela 10, Fv4-IgG1-F1326 5 demonstrou uma diminuição na ligação a FcγR de camundongo sem afetar a atividade de ligação a FcRn humano em comparação com Fv4-IgG1-F947. (5-7) Estudo de PK in vivo usando camundongos transgênicos com FcRn humano Um estudo de PK em administração do anticorpo Fv4-IgG1- F1326 produzido a camundongos transgênicos com FcRn foi realizado da mesma maneira que o método do Exemplo 5-4. Concentração de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano no plasma de camundongo foi medida através de ELISA da mesma maneira que o método do Exemplo 4. Os resul- tados são mostrados na Fig. 54 junto com os resultados para Fv4-IgG1-F947 obtido no Exemplo 5-4. Fv4-IgG1-F1326, que diminuiu a atividade de ligação de Fv4-IgG1-F947 a FcγR de camundongo, foi observado demonstrar aper- feiçoamento de retenção no plasma em comparação com Fv4-IgG1-F947. Com base no acima, no caso de um anticorpo humano tendo li- gação aumentada a FcRn humano sob condições neutras, foi indicado ser possível aperfeiçoar a retenção no plasma em camundongos transgênicos com FcRn humano através da diminuição da atividade de ligação a FcγR humano e inibição da formação de um complexo quaternário.
Aqui, a fim de demonstrar o efeito de aperfeiçoamento de retenção no plasma através da diminuição da atividade de ligação a FcγR de camundongo, a afinidade (KD) com FcRn humano em pH 7,0 é preferivelmente maior do que 310 nM e mais preferivelmente 110 nM ou menos.
Como resultado, retenção no plasma foi confirmada aperfeiçoar ao fornecer as propriedades da Modalidade 1 a moléculas de ligação a antí- geno da mesma maneira que o Exemplo 4. Aqui, o aperfeiçoamento obser-
vado de retenção no plasma é pensado ter sido devido à inibição seletiva de incorporação a células imunes, incluindo células apresentando antígeno, e como um resultado disso, é esperado ser possível inibir indução de uma resposta imune. 5 Exemplo 6 Avaliação de retenção no plasma de anticorpos de camundongo que têm atividade de ligação a FcRn de camundongo na região de pH neutro, mas não têm atividade de ligação a FcγR de camundongo (6-1) Produção de anticorpos de camundongo que se ligam a re- ceptor de IL-6 humano, mas não têm atividade de ligação a FcγR de camun- dongo Nos Exemplos 4 e 5, moléculas de ligação a antígeno tendo ati- vidade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro, e contendo um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR de camundongo é menor do que a atividade de ligação de um domínio de liga- ção a FcγR nativo, foram indicadas demonstrar retenção no plasma aperfei- çoada em camundongos transgênicos com FcRn humano.
Similarmente, se retenção no plasma em camundongos normais é ou não aperfeiçoada foi verificado para moléculas de ligação a antígeno que têm atividade de ligação a FcRn de camundongo sob condições da região de pH neutro e contêm um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR de camundongo é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR na- tivo. mPM1H-mIgG1-mF40 (SEQ ID NO: 60) foi produzido através de uma substituição de aminoácido obtida substituindo Pro por Lys na posição 235 (numeração EU) e uma substituição de aminoácido obtida substituindo Ser por Lys na posição 239 na sequência de aminoácido de mPM1-mIgG1- mF38 produzido no Exemplo 2, enquanto mPM1H-mIgG1-mF39 (SEQ ID NO: 61) foi produzido através de uma substituição de aminoácido obtida substituindo Pro por Lys na posição 235 (numeração EU) e uma substituição de aminoácido obtida substituindo Ser por Lys na posição 239 da sequência de aminoácido de mPM1H-mIgG1-mF14. (6-2) Confirmação de atividade de ligação a FcRn de camun-
dongo e FcγR de camundongo A atividade de ligação (constante de dissociação KD) a FcRn de camundongo em pH 7,0 foi medida usando o método do Exemplo 2. Os re- sultados são mostrados na Tabela 11 abaixo. 5 Tabela 11 Nome de mutante Substituição de aminoácido
A atividade de ligação a FcγR de camundongo em pH 7,4 foi medida usando o método do Exemplo 4. Os resultados são mostrados na Tabela 12 abaixo.
Tabela 12 Nome do mu- Quantidade de ligação tante
(6-3) Estudo de PK In vivo usando camundongos normais Um estudo de PK em administração dos mPM1-mIgG1-mF14, mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1-mF39 e mPM1-mIgG1-mF40 a camun- dongos normais foi realizado de acordo com o método indicado abaixo.
Anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano foi administrado a 1 mg/kg em uma administração única sob a pele das costas de camundongos normais (camundongo C57BL/6J , Charles River, Japão). Sangue foi coleta- do em 5 minutos, 7 horas e 1, 2, 4, 7 e 14 dias após administração do anti- corpo para receptor de IL-6 anti-humano.
Plasma foi obtido centrifugando imediatamente o sangue coletado por 15 minutos a 4º C e 15.000 rpm.
O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -2º C ou menos até o momento da medição. (6-4) Medição da concentração de anticorpo de camundongo pa- ra receptor IL-6 anti-humano no plasma através de ELISA 5 A concentração de anticorpo de camundongo para receptor de IL-6 anti-humano em plasma de camundongo foi medida através de ELISA.
Primeiro, receptor de IL-6 humano solúvel foi posto em uma Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge Nunc International) seguido por permitir que ficasse sem ser perturbado de um dia para o outro a 4º C para produzir uma placa de fase sólida de receptor de IL-6 humano solúvel.
Amostras de curva de calibragem contendo 1,25, 0,625, 0,313, 0,156, 0,078, 0,039 e 0,020 µg/mL de anticorpo de camundongo para receptor de IL-6 anti-humano em concen- tração de anticorpo no plasma e amostras de medição de plasma de camun- dongo diluídas em 100 vezes ou mais, foram preparadas.
Alíquotas de 100 µL dessas amostras de curva de calibragem e amostras de medição do plasma foram postas em cada cavidade da placa de fase sólida de receptor de IL-6 humano solúvel seguido por pemitir que descansassem sem ser per- turbadas por 2 horas em temperatura ambiente.
Subsequentemente, a rea- ção cromogênica de um líquido de reação obtido através de reação com An- ti-Mouse IgG-Peroxidase Antibody (SIGMA) por 1 hora em temperatura am- biente e reação adicional com Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific De- tection Technologies) por 1 hora em temperatura ambiente foi realizada u- sando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como substrato.
Depois da reação ter parado através da adição de Ácido Sulfúrico 1N (Showa Chemical), absorbância a 450 nm dos líquidos de rea- ção de cada cavidade foi medida com uma leitora de microplaca.
As concen- trações de anticorpo no plasma de camundongo foram calculadas a partir dos valores de absorbância da curva de calibragem usando software de aná- lise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Mudanças na concentração de an- ticorpo em plasma de camundongo normal seguindo administração intrave- nosa conforme medido com este método são mostradas na Fig. 17. Com base nos resultados mostrados na Fig. 17, mPM1-mIgG1-
mF40, que não tem atividade de ligação a FcγR de camundongo, foi obser- vado demonstrar aperfeiçoamento de retenção no plasma em comparação com mPM1-mIgG1-mF38. Ainda, mPM1-mIgG1-mF39, que não tem ativida- de de ligação para FcγR de camundongo, foi observado demonstrar aperfei- 5 çoamento de retenção no plasma em comparação com mPM1-mIgG1-mF14. Com base no acima, um anticorpo tendo atividade de ligação pa- ra FcRn de camundongo sob condições da região de pH neutro e tendo um domínio de ligação a FcγR que não tem atividade de ligação a FcγR de ca- mundongo, foi mostrado ter retenção no plasma maior em camundongos normais do que um anticorpo tendo um domínio de ligação a FcγR normal.
Como resultado, da mesma maneira que nos Exemplos 4 e 5, retenção no plasma foi confirmada ser alta para moléculas de ligação a antí- geno tendo as propriedades de moléculas de ligação a antígeno da Modali- dade 1. Embora a presente invenção não seja limitada a uma teoria específi- ca, o aperfeiçoamento de retenção no plasma observado aqui é pensado ser o resultado de inibição seletiva de incorporação a células imunes, incluindo células apresentando antígeno, e como um resultado do mesmo, é esperado ser possível inibir indução de uma resposta imune.
Exemplo 7 Avaliação in vitro de imunogenicidade de um anticor- po imunizado (anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano) tendo atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro e contendo um domínio de ligação de FcγR cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que atividade de ligação a domínio de ligação a FcγR nativo A fim de avaliar a imunogenicidade em seres humanos de uma molécula de ligação a antígeno da Modalidade 1, a saber uma molécula de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn sob condições da regi- ão de pH neutro e contendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcγR ativo é menor do que a atividade de ligação de um domí- nio de ligação a FcγR nativo.
A resposta de célula T para a molécula de liga- ção a antígeno in vitro foi avaliada de acordo com o método mostrado abai- xo. (7-1) Confirmação de atividade de ligação a FcRn humano
As constantes de associação (KD) de VH3/L(WT)-IgG1, VH3- L(WT)-IgG1-F21 e VH3/L(WT)-IgG1-F140 a FcRn humano sob condições da região de pH neutro (pH 7,0) medidas no Exemplo 4 são mostradas na Ta- bela 13 abaixo. 5 Tabela 13 Nome mutante Substituição de aminoácido Não detectado
(7-2) Avaliação de atividade de ligação a FcγR humano As atividades de ligação a VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1- F21 e VH3/L(WT)-IgG1-F140 a FcγR humano em pH 7,4 foram medidas u- sando o método mostrado abaixo.
A atividade de ligação entre os anticorpos e FcγRIa humano, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb e FcγRIIIa(F) (daqui em diante referidos como FcγRs seres humanos) foi avaliada usando o Biacore T100 ou T200 (GE Healthcare). Os anticorpos sendo testados foram capturados por Protein L (ACTIGEN) que foi imobilizada em quantidades adequadas no CM4 Sen- sor chip (GE Healthcare) através de acoplamento de amina.
Em seguida, os FcγRs seres humanos diluídos e um tampão de atividade foram usado como um agente sem expressão foram injetados para permitir interação com os anticorpos capturados no sensor chip.
Um tampão consistindo em 20 mmol/L de ACES, 150 mmol/L de NaCl e 0,5% (p/v) Tween 20 (pH 7,4) foi usado para o tampão de ativação e este tampão foi também usado para diluir os FcγRs seres humanos. 10 mmol/L de glicina-HCl (pH 1,5) foram usados para regenerar o senso chip.
Todas as medições foram realizadas a 25º C.
A atividade de ligação a FcγRs seres humanos pode ser repre- sentada pela atividade de ligação relativa a FcγRs seres humanos.
Anticorpo foi capturado por Protein L e a quantidade de mudança em um sensorgrama antes e após o anticorpo ter sido capturado foi definida como XI.
Em segui- da, FcγRs seres humanos foram deixados interagir com o anticorpo, e o va- lor obtido subtraindo atividade de ligação de FcγRs seres humanos repre- sentada como a quantidade de mudança em um sensorgrama antes e após permitir que o tampão de atividade interagisse com anticorpo capturado por Protein L (∆A2) do valor obtido multiplicando por 1500 o valor obtido dividin- do a atividade de ligação de FcγRs seres humanos representada como a quantidade de mudança em um sensorgrama antes e após esta interação 5 (∆A1) pela quantidade capturada (X) de cada anticorpo, foi dividida pela quantidade capturada de cada anticorpo (X) seguido por multiplicação por 1500 para obter a atividade de ligação dos FcγRs (Y) seres humanos (Equa- ção 2). Equação 2 Atividade de ligação de FcγRs (Y) humano = (∆A1- ∆A2)/X x 150 Os resultados são mostrados na Tabela 14 abaixo.
Tabela 14 Quantidade de ligação
De acordo com os resultados da Tabela 14, Fv4-IgG1-F140 de- monstrou uma diminuição em ligação a cada FcγR humano sem afetar a ati- vidade de ligação a FcRn humano em comparação com Fv4-IgG1-F21. (7-3) Estudo de imunogenicidade in vivo usando PBMCs seres humanos Um estudo de imunogenicidade in vitro foi realizado conforme mostrado na tabela abaixo usando Fv4-IgG1-F21 e Fv4-IgG1-F140 produzi- dos no Exemplo 1. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) (Periphe- ral Blood Mononuclear Cells) foram isoladas de sangue coletado de voluntá- rios saudáveis.
Depois de separar as PBMCs do sangue por centrifugação com gradiente de densidade Ficoll (GE Healthcare), células T CD8+ foram removidas das PBMCs magneticamente usando Dynabeads CD8 (Invitro- gen) de acordo com o protocolo padrão provido.
Em seguida, células T CD25hi foram removidas magneticamente usando Dynabeads CD25 (Invitro- gen) de acordo com o protocolo padrão provido.
Um ensaio de proliferação foi realizado da maneira descrita a- baixo.
A saber.
PBMCs de cada doador, das quais células T CD8+ e células T CD25hi tinham sido removidas e que tinham sido ressuspensas em meio AIMV (Invitrogen) contendo 3% de soro humano desativado para uma con- 5 centração de 2 x 106/ml, foram adicionadas a uma placa de 24 cavidades de fundo plano a 2 x 106 células por cavidade.
Depois de cultura por 2 horas sob condições de 37º C e CO2 5%, as células às quais cada substância de teste foi adicionada para concentrações finais de 10, 30, 100 e 300 µg/ml foram culturadas por 8 dias.
BrdU (Bromodesoxiuridina) foi adicionada a 150 µL de suspensão celular durante cultura após transferência para uma placa de 96 cavidades de fundo redondo nos dias 6, 7 e 8 de cultura, após o que as células foram culturadas adicionalmente por 24 horas.
As BrdU que ti- nham sido incorporada aos núcleos das células culturadas com BrdU foram tingidas usando o BrdU Flow Kit (BD Bioscience) de acordo com o protocolo padrão provido, enquanto enquanto os antígenos de superfície (CD3, CD4 e CD19) foram tingidos por anticorpos anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD19 (BD Bioscience). Em seguida, a porcentagem de células T CD4+ positivas para BrdU foi detectada com BD FACS Calibur ou BD FACS CantII (BD). A por- centagem de células T CD4+ positivas para BrdU em cada concentração de substância de teste de 30, 100 e 300 µg/mL nos dias 6, 7 e 8 de cultura foi calculada, seguido por cálculo dos seus valores médios.
Os resultados são mostrados na Fig. 18. A Fig. 18 indica as res- postas de proliferação de células T CD4+ a Fv4-IgG1-F21 e Fv4-IgG1-F140 nas PBMCs de cinco doadores seres humanos dos quais células T CD8+ e células T CD25hi tinham sido removidas.
Primeiro, um aumento na resposta de proliferação de células T CD4+ atribuível à adição de substância de teste não foi observado nas PBMCs de doadores A, B e D em comparação com um controle negativo.
Esses doadores são pensados ter inerentemente não sofrido uma resposta imune às substâncias de teste.
Por outro lado, uma resposta proliferativa de células T CD4+ atribuível à adição de substância de teste foi observada na PBMC de doadores C e E em comparação com um controle negativo.
Um dos pontos a serem notados aqui é que a resposta proliferativa de células T CD4+ a Fv4-IgG1-F140 tende a diminuir em com- paração com Fv4-IgG1-F21 para ambos os doadores C e E.
Conforme ante- riormente descrito, Fv4-IgG1-F140 tem uma atividade de ligação menor a FcγR humano do que Fv-IgG1-F21, e tem as propriedades da Modalidade 1. 5 Com base nos resultados acima, foi sugerido que imunogenicidade pode ser suprimida com relação a moléculas de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro e contendo um domí- nio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo.
Exemplo 8 Avaliação in vitro da imunogenicidade de um anticor- po imunizado (Anticorpo Anti-humano A33) tendo atividade de ligação a F- cRn humano na região de pH neutro e contendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a afini- dade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo (8-1) Produção de hA33-IgG1 Uma vez que PBMCs seres humanos têm inerentemente uma resposta imune baixa a Fv4-IgG1-F21 conforme indicado no Exemplo 7, elas foram sugeridas não ser adequadas para avaliação de supressão de respos- ta imune a Fv4-IgG1-F140 contendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcγR é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo.
Desta maneira, um anticorpo para A33 humanizado (hA33-IgG1), que é um anticorpo IgG1 humanizado para o antí- geno A33, foi produzido a fim de aumentar a capacidade de detecção de efeitos de diminuição de imunogenicidade em um sistema de avaliação de imunogenicidade in vitro.
Em hA33-IgG1, o anti-anticorpo tinha sido confirmado ser produ- zido em 33% a 73% de indivíduos em um estudo clínico (Hwang e outros (Methods (2005) 36, 3-10) e Walle e outros (Expert Opin.
Bio.
Ther. (2007) 7(3), 405-418). Uma vez que a imunogenicidade alta de hA33-IgG1 se origi- na na sequência de região variável, para moléculas em que atividade de li- gação a FcRn na região de pH neutro tinha sido aumentada para hA33-IgG1, seria fácil detectar efeitos de diminuição de imunogenicidade que surgem da inibição da formação de um complexo quaternário através da diminuição da atividade de ligação a FcγR.
As sequências de aminoácido de hA33H (SEQ ID NO: 62) usado para a região variável de cadeia pesada do anticorpo A33 humanizado e 5 hA33L (SEQ ID NO: 63) usado para a região variável de cadeia leve foram adquiridas de informação conhecida (British Journal of Cancer (1995) 72, 1364-1372). Ainda, IgG1 humano de ocorrência natural (SEQ ID NO: 11, daqui em diante referido como IgG1) foi usado para a região constante de cadeia pesada e kappa humano de ocorrência natural (SEQ ID NO: 64, da- qui em diante referido como k0) foi usado para a região constante de cadeia leve.
Um vetor de expressão contendo as sequências de base de hA33H-IgG1 de cadeia pesada e hA33L-k0 de cadeia leve foi produzido de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Ainda, um anticorpo A33 humanizado na forma de hA33-IgG1 contendo hA33H-IgG1 de cadeia pesa- da e hA33L-k0 de cadeia leve foi produzido de acordo com o método do E- xemplo de Referência 2. (8-2) Produção de um anticorpo de ligação A33 tendo atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro Uma vez que o hA33-IgG1 produzido é um anticorpo humano tendo uma região Fc humana de ocorrência natural, ele não tem atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro.
Desta manei- ra, uma modificação de aminoácido foi introduzida na região constante de cadeia pesada de hA33-IgG1 a fim de fornecer a habilidade em se ligar a FcRn humano sob condições da região de pH neutro.
Mais especificamente, hA33H-IgG1-F21 (SEQ ID NO: 65) foi produzido substituindo Met por Tyr na posição 252 (numeração EU), substi- tuindo Val por Pro na posição 308 (numeração EU) e substituindo Asn por Tyr na posição 434 (numeração EU) na região constante de cadeia pesada de hA33-IgG na forma de hA33H-IgG1. Usando o método do Exemplo de Referência 2, um anticorpo de ligação A33 tendo atividade de ligação a F- cRn humano sob condições da região de pH neutro foi produzido na forma de hA33-IgG1-F21 contendo hA33H-IgG1-F21 para a cadeia pesada e hA33L-k0 para a cadeia leve. (8-3) Produção de um anticorpo de ligação A33 contendo um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR humano sob 5 condições da região do pH neutro é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo hA33H-IgG1-F140 (SEQ ID NO: 66) foi produzido, em que Ser é substituído por Lys na posição 239 (numeração EU) na sequência de amino- ácido de hA33H-IgG1-F21 a fim de diminuir a atividade de ligação de hA33- IgG1-F21 a FcγR humano. (8-4) Avaliação de imunogenicidade de vários tipos de anticor- pos de ligação A33 através de ensaio de célula T in vitro A imunogenicidade do hA33-IgG1-F21 e do hA33-IgG1-F140 produzido foi avaliada usando o mesmo método que aquele do Exemplo 7. Ainda, os voluntários saudáveis servindo como doadores não eram os mes- mos indivíduos que os voluntários saudáveis dos quais PBMCs usadas no Exemplo 7 foram isoladas.
Em outras palavras, o doador A no Exemplo 7 e o doador A neste estudo eram voluntário saudáveis diferentes.
Os resultados do estudo são mostrados na Fig. 19. Na Fig. 19, é feita uma comparação entre os resultados para hA33-IgG1-F21 que tem ati- vidade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro e hA33-IgG1-F140 que contém um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo.
Uma vez que uma resposta a hA33-IgG1-F21 não foi observa- da em PBMCs isoladas dos doadores C, D e E em comparação com um controle negativo, os doadores C, D e E são pensados ser doadores em quem uma resposta imune a hA33-IgG1-F21 não ocorre.
Uma resposta imu- ne forte a hA33-IgG1-F21 foi observada nas PBCs isoladas dos outros sete doadores (doadores A, B, E, G, H, I e J) em comparação com o controle ne- gativo; e hA33-IgG1-F21 demonstrou um nível alto de imunogenicidade in vitro conforme esperado.
Por outro lado, um efeito foi observado em que a resposta imune de PBMCs isoladas de todos esses sete doadores (doadores
A, B, E, G, H, I e J) a hA33-IgG1-F140 que contém um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo foi diminuído em compa- ração com aquela de hA33-IgG1-F21. Ainda, uma vez que a resposta imune 5 das PMBCs isoladas dos doadores E e J a hA33-IgG1-F140 foi também mais ou menos a mesma que aquela do controle negativo, foi pensado que imunogenicidade pode ser reduzida em moléculas de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn humano na região neutra através da dimi- nuição da atividade de ligação a FcγR humano para um nível menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo e inibição da formação de um complexo quaternário.
Exemplo 9 Avaliação de imunogenicidade in vitro de um anticor- po humanizado (anticorpo para A33 anti-humano) que tem atividade de liga- ção a FcRn humano sob condições da região de pH neutro, mas não tem atividade de ligação a FcγR humano (9-1) Produção de um anticorpo de ligação a A33 tendo atividade de ligação forte a FcRn humano sob condições da região de pH neutro hA33-IgG1-F698 (SEQ ID NO: 67) foi produzido de acordo com o método do Exemplo de Referência 1 substituindo Met por Tyr na posição 252 (numeração EU), substituindo Asn por Glu na posição 286 (numeração EU), substituindo Thr por Gln na posição 307 (numeração EU), substituindo Gln por Ala na posição 311 (numeração EU) e substituindo Asn por Tyr na posição 434 (numeração EU) na sequência de aminoácido de hA33H-IgG1. Um anticorpo de ligação A33 humano tendo atividade de ligação forte a F- cRn humano sob as condições da região de pH neutro foi produzido na for- ma de hA33-IgG1-F698 contendo hA33H-IgG1-F698 para a cadeia pesada e hA33L-k0 para a cadeia leve. (9-2) Produção de um anticorpo de ligação a A33 contendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcγR humano sob condições da região de pH neutro é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo hA33H-IgG1-G699 (SEQ ID NO: 68) foi produzido, em que Ser foi substituído por Lys na posição 239 (numeração EU) de hA33H-F698 e que contém um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de liga- ção a FcγR nativo. 5 A atividade de ligação a FcRn humano em pH 7,0 de VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698 e VH3/L(WT)-IgG1-F699 foi medi- da usando o método do Exemplo 4. Além disso, atividade de ligação a FcγR humano em pH 7,4 de VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG10-F698 e VH3/L(WT)-IgG1-F699 foi medida usando o método do Exemplo 7. Os resul- tados para ambos são mostrados na Tabela 15 abaixo.
Tabela 15 Nome do Quantidade de ligação mutante
Como é mostrado na Tabela 15, VH3/L(WT)-IgG1-F699, em que Ser é substituído por Lys na posição 239 (numeração EU) e que contém um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a cada tipo de FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo, demonstrando atividade de ligação a hFcgRI mesmo que liga- ção a hFcgRIIa(R), hFcgRIIa(H), hFcgRIIb e hFcgRII(F) foi diminuída. (9-3) Avaliação de imunogenicidade de vários tipos de anticor- pos de ligação a A33 através de ensaio de célula T in vitro Imunogenicidade a hA33-IgG1-F698 e a hA33-IgG1-F699 produ- zidos foi avaliada de acordo com o mesmo método que o Exemplo 7. Ainda, os voluntários saudáveis servindo como doadores não eram os mesmos in- divíduos que os voluntários saudáveis dos quais PBMC usada nos Exemplos 7 e 8 foi isolada.
Em outras palavras, doador A nos Exemplos 7 e 8 e doador A neste estudo eram voluntários saudáveis diferentes.
Os resultados do estudo são mostrados na Fig. 20. Na Fig. 20, é feita uma comparação entre os resultados para hA33-IgG1-F698 que tem atividade de ligação forte a FcRn humano sob condições da região de pH neutro e hA33-IgG1-F699 que contém um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio FcγR de ocorrência natural.
Uma vez que uma resposta a hA33-IgG1-F698 não foi observada em PBMCs isoladas de doadores G e I 5 em comparação com um controle negativo, doadores G e I são pensados ser doadores em quem uma resposta imune a hA33-IgG1-F698 não ocorre.
Uma resposta imune forte a hA33-IgG1-F698 foi observada em PBMCs isoladas dos outros sete doadores (doadores A, B, C, D, E, F e H) em comparação com o controle negativo, e um nível alto de imunogenicidade foi demonstra- do in vitro da mesma maneira que o hA33-IgG1-F21 mencionado acima.
Por outro lado, um efeito foi observado em que a resposta imune de PBMCs iso- ladas de cinco doadores (doadores A, B, C, D e F) a hA33-IgG1-F699 que contém um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR hu- mano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo foi diminuída em comparação com aquela para hA33-IgG1- F698. Em particular, uma resposta imune das PBMCs isoladas dos doadores C e F a hA33-IgG1-F699 foi confirmada ser mais ou menos aquela do con- trole negativo.
O fato que o efeito de redução de imunogenicidade foi confir- mado não apenas para hA33-IgG1-F21, mas também para hA33-IgG1-F698 que tem atividade de ligação forte a FcRn humano mostrou que imunogeni- cidade pode ser reduzida em moléculas de ligação a antígeno tendo ativida- de de ligação a FcRn humano na região de pH neutro, ao tornar a atividade de ligação a FcγR humano menor do que a atividade de ligação de um do- mínio de ligação a FcγR nativo, e inibindo a formação de um complexo qua- ternário. (9-4) Produção de um anticorpo de ligação a A-33 não tendo ati- vidade de ligação a FcγR humano sob condições da região de pH neutro Conforme anteriormente descrito para (9-3), hA33-IgG1-F699 demonstrou uma atividade de ligação menor a vários tipos de FcγR humano através de substituição de Ser por Lys na posição 239 (numeração EU) em hA33-IgG1-F698, e ligação a hFcgRI permaneceu embora ligação a hFcgRI- Ia(R), hFcgRIIa(H), hFcgRIIb e hFcgRIIIa(F) tenha diminuído consideravel-
mente.
Desta maneira, a fim de produzir um anticorpo de ligação a A-33 que contém um domínio de ligação a FcγR não tendo atividade de ligação a todos os FcγR seres humanos incluindo hFcgRIa, hA33H-IgGI-F763 (SEQ ID 5 NO: 69) foi produzido em que Leu substituiu Arg na posição 235 (numeração EU) e Ser substituiu Lys na posição 239 (numeração EU) em hA33H-IgG1- F698 (SEQ ID NO: 67). Constantes de associação (KD) para FcRn humano sob condi- ções da região de pH neutro (pH 7,0) foram medidas para VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698 e VH3/L(WT)-IgG1-F763 usando o método do Exem- plo 4. Ainda, a atividade de ligação a FcγR humano foi avaliada para VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F698 e VH3/L(WT)-IgG1-F763 de acordo com o método descrito no Exemplo 7. Esses resultados são também mos- trados na Tabela 16 abaixo.
Tabela 16 Nome do Quantidade de ligação mutante
Conforme mostrado na Tabela 16, IgG1-F763, em que Leu subs- tituiu Arg na posição 235 (numeração EU) e Ser substituiu Lys na posição 239 (numeração EU), foi mostrado demonstrar atividade de ligação menor a todos os FcγRs seres humanos incluindo hFcγRIa. (9-5) Avaliação de imunogenicidade de vários tipos de anticor- pos de ligação A33 através de ensaio de célula T in vitro A imunogenicidade do hA33-IgG1-F698 e do hA33-IgG1-F763 produzidos foi avaliada usando o mesmo método que aquele do Exemplo 7. Ainda, da mesma maneira que anteriormente descrito, os voluntários saudá- veis servindo como doadores não foram os mesmos indivíduos que os volun- tários saudáveis dos quais as PBMCs usadas nos exemplos mencionados acima foram isoladas.
Em outras palavras, o doador A nos exemplos men- cionados acima e o doador A neste estudo foram voluntários saudáveis dife-
rentes.
Os resultados do estudo são mostrados na Fig. 21. Na Fig. 21, é feita uma comparação entre os resultados para hA33-IgG1-F698 que tem atividade de ligação forte a FcRn humano sob condições da região de pH 5 neutro e hA33-IgG1-F763 que contém um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo.
Uma vez que uma resposta a hA33-IgG1-F698 não foi observada em PBMCs isoladas dos doadores B, E, F e K em comparação com um controle negativo, os doadores B, E, F e K são pensados ser doadores em quem uma resposta imune a hA33-IgG1- F698 não ocorre.
Uma resposta imune forte a hA33-IgG1-F698 foi observada nas PBMCs isoladas dos outros sete doadores (doadores A, C, D, G, H, I e J) em comparação com o controle negativo.
Por outro lado, foi observado um efeito em que a resposta imune de PBMCs isoladas de quatro doadores (do- adores A, C, D e H) a hA33-IgG1-F763 que contém um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio FcγR de ocorrência natural foi diminuído em com- paração com aquele de hA33-IgG1-F698. Dentre esses quatro doadores, a resposta imune das PBMCs isoladas de doadores C, D e H em particular a hA33-IgG1-F763 foi mais ou menos a mesma que aquela do controle negati- vo, e dentre os quatro doadores em quem a resposta imune de PBMCs foi diminuída como um resultado de diminuição de ligação a FcγR, foi na reali- dade possível inibir completamente a resposta imune de PBMC em três do- adores.
Também baseado nesta constatação, moléculas de ligação a antí- geno contendo um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR humano é baixa são consideradas ser moléculas extremamente efica- zes tendo imunogenicidade reduzida.
Com base nos resultados dos Exemplos 7, 8 e 9, uma resposta imune a moléculas de ligação a antígeno em que a formação de um comple- xo quaternário foi inibida através da diminuição da ligação a FcγR ativo (Mo- dalidade 1) foi confirmada ser inibida em vários doadores em comparação com moléculas de ligação a antígeno que são capazes de formar um com-
plexo quaternário em células apresentando antígeno.
Os resultados acima mostraram que a formação de um complexo quaternário em células apresen- tando antígeno é importante para a resposta imune de moléculas de ligação a antígeno e que moléculas de ligação a antígeno que não formam o com- 5 plexo quaternário tornam possível reduzir a imunogenicidade em vários doa- dores.
Exemplo 10 Avaliação de imunogenicidade in vivo de um anti- corpo humanizado que tem atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro, mas não tem atividade de ligação a FcγR de camundongo Foi demonstrado através do experimento in vitro nos Exemplos 7, 8 e 9 que imunogenicidade é reduzida em moléculas de ligação a antíge- no tendo atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro e con- tendo um domínio de ligação a FcγR cuja atividade de ligação a FcγR é me- nor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo em comparação com moléculas de ligação a antígeno em que a atividade de ligação a FcγR não foi diminuída.
O estudo que segue foi conduzido para confirmar se ou não este efeito é também demonstrado in vivo. (10-1) Estudo de imunogenicidade in vivo em camundongos transgênicos FcRn humanos Produção de anticorpo para Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F890, Fv4- IgG1-F947, Fv4-IgG1-F821, Fv4-IgG1-F939 e Fv4-IgG1-F1009 foi avaliada usando plasma de camundongo obtido no Exemplo 5 de acordo com o mé- todo indicado abaixo. (10-2) Medição de anticorpo de espécime antiadministrado em plasma através de luminescência eletroquímica Anticorpo contra um anticorpo de espécime administrado pre- sente em plasma de camundongo foi medido através de luminescência ele- troquímica.
Primeiro, o anticorpo administrado foi posto em uma Uncoated Multi-Array Plate (Meso Scale Discovery) seguido por permitir que ficasse sem ser perturbado de um dia para o outro a 4º C para produzir uma placa de fase sólida de anticorpo administrado.
Amostras para medição de plasma de camundongo foram preparadas diluindo 50 vezes seguido por derrama-
mento na placa de fase sólida e reação de um dia para o outro a 4º C.
Sub- sequentemente, IgG Anti-Camundongo (molécula inteira) (Sigma) rutenado com Sulfo-Marcador NHS Ester (Meso Scale Discovery) foi deixado reagir por 1 hora em temperatura ambiente e Read Buffer T (x4) (Meso Scale Dis- 5 covery) foi adicionado, seguido imediatamente por medição com o Sector PR 400 (Meso Scale Discovery). O plasma de cinco animais que não foram ad- ministrados com o anticorpo foi medido como uma amostra controle negativa para cada sistema de medição, e o valor (X), obtido através da adição do produto de multiplicação do desvio padrão (SD) (Standard Deviation) de va- lores medidos usando o plasma daqueles cinco animais por 1,645 à média (MEAN) de valores medidos usando os cinco animais, foi usado como o cri- tério para determinação de uma reação positiva (Equação 3). Aqueles ani- mais que demonstraram uma reação excedendo o critério positivo mesmo uma vez em qualquer um dos dias de coleta de sangue foram julgados ter resposta de produção de anticorpo positiva para a substância de teste.
Equação 3 Critérios positivos para produção de anticorpo (X) = MÉDIA + 1,645 X SD (10-3) Efeito inibidor sobre imunogenicidade in vivo através da diminuição da atividade de ligação a FcγR Os resultados são mostrados nas Figuras 22 a 27. A Fig. 22 mostra os títulos de anticorpo de camundongo produzido em resposta a Fv4- IgG1-F11 em 3, 7, 14, 21 e 28 dias após administração de Fv4-IgG1-F11 a camundongos transgênicos FcRn humano.
Produção de anticorpo de ca- mundongo a Fv4-IgG1-F11 foi mostrada ser positiva em um dos três camun- dongos (No. 3) em cada dia que sangue foi coletado seguindo administração (taxa positiva: 1/3). Por outro lado, a Fig. 23 mostra os títulos de anticorpo de camundongo produzido em resposta a Fv4-IgG1-F821 em 3, 7, 14, 21 e 28 dias após administração de Fv4-IgG1-F821 a camundongos transgênicos FcRn humano.
Produção de anticorpo de camundongo a Fv4-IgG1-F821 foi mostrada ser negativa em todos os três dos camundongos em cada dia que sangue foi coletado seguindo administração (taxa positiva: 0/3).
A Fig. 24A e sua vista ampliada na forma da Fig. 24B mostram títulos de anticorpo de camundongo produzido em resposta a Fv4-IgG1-F890 em 3, 7, 14, 21 e 28 dias após administração de Fv4-IgG1-F890 a camun- dongos transgênicos FcRn humano.
Produção de anticorpo de camundongo 5 para Fv4-IgG1-F890 foi mostrada ser positiva em dois dos três camundon- gos (No. 1 e No. 3) em 21 e 28 dias após administração (taxa positiva: 2/3). Por outro lado, a Fig. 25 mostra títulos de anticorpo de camundongo produ- zido em resposta a Fv4-IgG1-F939 em 3, 7, 14, 21 e 28 dias após adminis- tração de Fv4-IgG1-F939 a camundongos transgênicos FcRn humano.
Pro- dução de anticorpo de camundongo a Fv4-IgG1-F939 foi mostrada ser nega- tiva em todos os três camundongos em cada dia que sangue foi coletado seguindo administração (taxa positiva: 0/3). A Fig. 26 mostra títulos de anticorpo de camundongo produzido em resposta a Fv4-IgG1-F947 em 3, 7, 14, 21 e 28 dias após administração de Fv4-IgG1-F947 a camundongo transgênico FcRn humano.
Produção de anticorpo de camundongo para Fv4-IgG1-F947 foi mostrada ser positiva em dois dos três camundongos (No. 1 e No. 3) em 14 dias após administração (taxa positiva: 2/3). Por outro lado, a Fig. 27 mostra títulos de anticorpo de camundongo produzido em resposta a Fv4-IgG1-F1009 em 3, 7, 14, 21 e 28 dias após administração de Fv4-IgG1-F1009 a camundongos transgênicos FcRn humanos.
Produção de anticorpo de camundongo para Fv4-IgG1- F1009 foi mostrada ser positiva em dois dos três camundongos (No. 4 e No. 5) começando 7 dias após administração (taxa positiva: 2/3). Conforme indicado no Exemplo 5, Fv4-IgG1-821 tinha ligação menor a vários tipos de FcγR de camundongo com relação a Fv4-IgG1-F11, Fv4-IgG1-F939 similarmente tem ligação menor a vários tipos de FcγR de camundongo com relação a Fv4-IgG1-F890, e Fv4-IgG1-F1009 similarmente tem ligação menor a vários tipos de FcγR de camundongo com relação a Fv4-IgG1-F947. Foi indicado que imunogenicidade in vivo pode ser notadamente reduzida através da diminuição da ligação de Fv4-IgG1-F11 e Fv4-IgG1- F890 a vários tipos de FcγR de camundongo.
Por outro lado, o efeito de re-
dução de imunogenicidade in vivo não foi demonstrado como um resultado de diminuição da ligação de Fv4-IgG1-F947 a vários tipos de FcγR de ca- mundongo.
Embora não limitado a uma teoria específica, a razão para ob- 5 servação deste efeito inibidor sobre imunogenicidade pode ser explicada da maneira descrita abaixo.
Como foi descrito no Exemplo 3, a inibição da formação de um complexo quaternário na membrana central de células apresentando antíge- no é pensada ser possível através da diminuição da atividade de ligação a FcγR de moléculas de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro.
Como um resultado de inibição da formação de um complexo quaternário, incorporação de moléculas de liga- ção a antígeno em células apresentando antígeno é pensada ser inibida, e como um resultado disso, indução de imunogenicidade para as moléculas de ligação a antígeno é pensada ser suprimida.
Fv4-IgG1-F11 e Fv4-IgG1-F890 são pensados ter suprimido indução de imunogenicidade desta maneira a- través da diminuição da atividade de ligação a FcγR.
Por outro lado, Fv4-IgG1-F947 não demonstrou o efeito de su- pressão de imunogenicidade como um resultado de diminuição de atividade de ligação a FcγR.
Embora não limitado a uma teoria específica, a razão para isso pode ser discutida da maneira indicada abaixo.
Conforme mostrado na Fig. 16, eliminação de Fv4-IgG1-F947 e Fv4-IgG10F1009 do plasma é extremamente rápida.
Aqui, Fv4-IgG1-F1009 é pensada ter sofrido uma diminuição em atividade de ligação a FcγR de camundongo e a formação de um complexo quaternário em células apresen- tando antígeno é pesada ser inibida.
Consequentemente, Fv4-IgG1-F1009 é pensado ser incorporado a células como um resultado de ligação apenas a FcRn expresso na membrana celular de tais células como células endoteliais vasculares ou células hematopoiéticas.
Aqui, uma vez que FcRn é também expresso nas membranas celulares de algumas células apresentando antí- geno, Fv4-IgG1-F1009 pode ser também incorporado às células apresen- tando antígeno através de ligação apenas a FcRn.
Em outras palavras, entre a eliminação rápida de Fv4-IgG1-F1009 do plasma, uma porção pode ser incorporada a células apresentando antígeno.
Além disso, Fv4-IgG1-F1009 é um anticorpo humano, e é uma proteína completamente estranha para camundongos.
Em outras palavras, 5 os camundongos são pensados ter várias populações de célula T que res- pondem especificamente a Fv4-IgG1-F1009. Mesmo a menor quantidade de Fv4-IgG1-F1009 incorporada às células apresentando antígeno é apresen- tada a células T após processando dentro das células, e uma vez que ca- mundongos têm várias populações de célula T que respondem especifica- mente a Fv4-IgG1-F1009, uma resposta imune a Fv4-IgG1-F1009 é pensada ser facilmente induzida.
Na realidade, quando uma proteína estranha na forma de um receptor de IL-6 solúvel humano é administrada a camundon- gos conforme indicado no Exemplo de Referência 4, o receptor de IL-6 solú- vel humano é eliminado em um período de tempo curto, e uma resposta i- mune ao receptor de IL-6 solúvel humano é induzida.
O fato que imunogeni- cidade foi induzida embora receptor de IL-6 solúvel humano não tenha ativi- dade de ligação a FcγR e FcRn na região de pH neutro é pensado ser devi- do à eliminação rápida de receptor de IL-6 solúvel humano e a quantidade grande sendo incorporada a células apresentando antígeno.
Em outras palavras, no caso quando uma molécula de ligação a antígeno é uma proteína estranha (tal como no caso de administração de uma proteína humana a camundongos), é pensado ser mais difícil suprimir uma resposta imune através da inibição da formação de um complexo qua- ternário em células apresentando antígeno em comparação com o caso da molécula de ligação a antígeno sendo uma proteína homóloga (tal como no caso de administração de uma proteína de murino a camundongo). Na realidade, no caso quando a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, uma vez que o anticorpo administrado a seres humanos é um anticorpo humanizado ou anticorpo humano, uma resposta imune ocorre à proteína homóloga.
Desta maneira, uma avaliação foi realizada no Exem- plo 11 de se inibição da formação de um complexo quaternário leva ou não à redução em imunogenicidade através da administração de um anticorpo de camundongo a camundongos.
Exemplo 11 Avaliação de imunogenicidade in vivo de anticorpos de camundongo que têm atividade de ligação a FcRn de camundongo sob 5 condições da região de pH neutro, mas não têm atividade de ligação a FcγR de camundongo (11-1) Estudo de imunogenicidade in vivo em camundongos normais O estudo que segue foi conduzido para o propósito de verifica- ção do efeito inibidor de imunogenicidade obtido através da inibição da for- mação de um complexo quaternário em células apresentando antígeno no caso quando a molécula de ligação a antígeno é uma proteína homóloga (como no caso de administração de um anticorpo de camundongo a camun- dongos). Produção de anticorpo para mPM1-mIgG1-mF38, mPM1-mIgG1- mF40, mPM1-mIgG1-mF14 e mPM1-mIgG1-mF39 foi avaliada usando plasma de camundongo obtido no Exemplo 6 de acordo com o método indi- cado abaixo. (11-2) Medição de anticorpo de espécime antiadministrado em plasma através de luminescência eletroquímica Anticorpo contra um espécime administrado presente em plasma de camundongo foi medido através de luminescência eletroquímica. Primei- ro, o espécie administrado foi posto em uma placa de 96 cavidades de multi- disposição, seguido por 1 hora de reação em temperatura ambiente. Depois de lavagem da placa, amostras de medição de plasma de camundongo dilu- ídas 50 vezes foram preparadas, e depois de 2 horas de reação em tempe- ratura ambiente e lavagem da placa, o espécime administrado rutenado com Sulfo-Marcador NHS Ester (Meso Scale Discovery) foi posto, seguido por reação de um dia para o outro a 4º C. Depois da placa ter sido lavada no dia seguinte, Read Buffer T (x4) (Meso Scale Discovery) foi posto, seguido ime- diatamente por medição com o Sector PR 2400 Reader (Meso Scale Disco- very). O plasma de cinco animais que não foram administrados com o anti-
corpo foi medido como uma amostra controle negativo para cada sistema de medição, e o valor (X) obtido através da adição do produto de multiplicação do desvio padrão (SD) de valores medidos usando o plasma desses cinco animais por 1,645 à média (MEAN) de valores medidos usando o plasma 5 dos cinco animais foi usado como o critério para determinação de uma rea- ção positiva (Equação 3). Aqueles animais que demonstraram uma reação excedendo critérios positivos mesmo uma vez em qualquer um dos dias de coleta de sangue foram julgados ter resposta de produção de anticorpo posi- tiva à substância de teste.
Equação 3 Critério de avaliação positivo para produção de anticorpo (X) = MÉDIA + 1,645 x SD (11-3) Efeito inibidor sobre imunogenicidade in vivo através da diminuição da atividade de ligação a FcγR Os resultados são mostrados nas Figuras 28 a 31. A Fig. 28 mostra os títulos de anticorpo de camundongo produzido em resposta a mPM1-mIgG1-mF14 em 14, 21 e 28 dias após administração de mPM1- mIgG1-mF14 a camundongos normais.
Produção de anticorpo de camun- dongo para mPM1-mIgG1-mF14 foi mostrada ser positiva em todos os três camundongos em 24 dias após administração (taxa positiva: 3/3). Por outro lado, a Fig. 29 mostra os títulos de anticorpo de camundongo produzido em resposta a mPM1-mIgG1-mF39 em 14, 21 e 28 dias após administração de mPM1-mIgG1-mF39 a camundongos normais.
Produção de anticorpo de camundongo para mPM1-mIgG1-mF39 foi mostrada ser negativa em todos os três camundongos em cada dia que sangue foi coletado seguindo admi- nistração (taxa positiva: 0/3). A Fig. 30 mostra títulos de anticorpo de camundongo produzido em resposta a mPM1-mIgG1-mF38 em 14, 21 e 28 dias após administração de mPM1-mIgG1-mF38 a camundongos normais.
Produção de anticorpo de camundongo a mPM1-mIgG1-mF38 foi mostrada ser positiva em dois dos três camundongos (No. 1 e No. 2) em 28 dias após administração (taxa posi- tiva: 2/3). Por outro lado, a Fig. 31 mostra títulos de anticorpo de camundon-
go produzido em resposta a mPM1-mIgG1-mF40 em 14, 21 e 28 dias após administração de mPM1-mIgG-mF40 a camundongos normais.
A produção de anticorpo de camundongo para mPM1-mIgG1-mF40 foi mostrada ser ne- gativa em todos os três camundongos em cada dia que sangue foi coletado 5 seguindo administração (taxa positiva: 0/3). Como foi mostrado no Exemplo 6, com relação a mPM1-mIgG1- mF38, mPM1-mIgG1-mF40 tem ligação menor a vários tipos de FcγR de camundongo e similarmente com relação a mPM1-mIgG1-mF14, mPM1- mIgG1-mF39 tem ligação menor a vários tipos de FcγR de camundongo.
Esses resultados confirmaram que mesmo se anticorpos de ca- mundongo mPM1-mIgG1-mF38 e mPM1-mIgG1-mF14 que são proteínas homólogas fossem administrados a camundongos normais, produção de anticorpo foi confirmada em resposta ao anticorpo administrado e uma res- posta imune foi confirmada.
Conforme indicado nos Exemplos 1 e 2, isso é pensado ser devido à promoção da incorporação a células apresentando antígeno através da formação de um complexo quaternário em células apre- sentando antígeno através do aumento da atividade de ligação a FcRn na região de pH neutro.
Foi mostrado que é possível reduzir imunogenicidade in vivo a- través da inibição da formação de um complexo quaternário através da dimi- nuição da ligação de tais moléculas de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro a vários tipos de FcγR de camundongo.
Esses resultados indicam que ao diminuir a atividade de ligação a FcγR de uma molécula de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro, a imunogenicidade desta molé- cula de ligação a antígeno pode ser diminuída extremamente eficazmente ambos in vitro e in vivo.
Em outras palavras, a imunogenicidade de uma mo- lécula de ligação a antígeno que tem atividade de ligação a FcRn sob condi- ções da região de pH neutro e cuja atividade de ligação a FcγR ativo é me- nor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR (a saber, uma molécula de ligação a antígeno da Modalidade 1 descrita no Exemplo 3)
foi indicada ser notadamente diminuída em comparação com uma molécula de ligação a antígeno tendo atividade de ligação mais ou menos comparável com aquela do domínio de ligação a FcγR nativo (a saber, a molécula de ligação a antígeno capaz de formar um complexo quaternário conforme des- 5 crito no Exemplo 3). Exemplo 12 Produção e avaliação de anticorpos humanos tendo atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro e cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo (12-1) Produção e avaliação de anticorpos IgG1 seres humanos tendo atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro e cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR Em um aspecto não limitante da presente invenção, embora e- xemplos preferíveis de uma região Fc cuja atividade de ligação a FcγR ativo é menor do que a atividade de ligação a FcγR ativo de uma região Fc de ocorrência natural incluem regiões Fc em que um ou mais aminoácidos em qualquer uma das posições 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325 e 329 (numeração EU) dentre os aminoácidos da região Fc mencionada a- cima são modificados em um aminoácido que difere da região Fc de ocor- rência natural , modificação da região Fc não é limitada àquela descrita aci- ma, mas ao contrário pode ser também ser, por exemplo, desglicosilação (N297A, N297Q) descrita em Current Opinion in Biotechnology (2009) 20(6), 685-691, modificações tal como IgG1-L234A/L235A, IgG1- A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1- C226S/C229S/E233P/L235A, IgG1-L234/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4- L235A/G237A/E318A ou IgG4/L236E, bem como modificações tal como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R ou N325LL328R descrita no WO 2008/092117, inserção de aminoácidos nas posições 233, 234, 235 e 237 (numeração EU) e modificações nos locais descritos no WO 2000/042072.
O Fv4-IgG1-F890 e o Fv4-IgG1-F947 produzidos no Exemplo 5 são anticorpos que têm atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro e se ligam a receptor IL-6 humano de uma maneira dependente do pH.
Várias variantes foram produzidas em que ligação a 5 FcγR humano foi diminuída através da introdução de substituições de ami- noácido nas suas sequências de aminoácido (Tabela 17). Mais especifica- mente, foram produzidas variantes incluindo VH3-IgG1-F938 (SEQ ID NO: 156), em que Leu foi substituído por Lys na posição 235 (numeração EU) e Ser foi substituído por Lys na posição 239 da sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1315 (SEQ ID NO: 157), em que Gly foi substi- tuído por Lys na posição 237 (numeração EU) e Ser foi substituído por Lys na posição 239 da sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1- F1316 (SEQ ID NO: 158), em que Gly foi substituído por Arg na posição 237 (numeração EU) e Ser foi substituído por Lys na posição 239 na sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1317 (SEQ ID NO: 159), em que Ser foi substituído por Lys na posição 239 (numeração EU) e Pro foi substituído por Lys na posição 329 na sequência de aminoácido de VH3- IgG1-F890, VH3-IgG1-F1318 (SEQ ID NO: 160), em que Ser foi substituído por Lys na posição 239 (numeração EU) e Pro foi substituído por Arg na po- sição 329 da sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1324 (SEQ ID NO: 161), em que Leu foi substituído por Ala na posição 234 (nu- meração EU) e Leu foi substituído por Ala na posição 235 da sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1315 (SEQ ID NO: 162), em que Leu foi substituído por Ala na posição 234 (numeração EU), Leu foi substitu- ído por Ala na posição 235 e Asn foi substituído por Ala na posição 297 da sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1333 (SEQ ID NO: 163), em que Leu foi substituído por Arg na posição 235 (numeração EU), Gly foi substituído por Arg na posição 236 e Ser foi substituído por Lys na posição 239 da sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1- F1356 (SEQ ID NO: 164), em que Gly foi substituído por ARg na posição 236 (numeração EU) e Leu foi substituído por Arg na posição 328 da se- quência de aminoácido de VH3-IgG1-F890, VH3-IgG1-F1326 (SEQ ID NO:
155), em que Leu foi substituído por Ala na posição 234 (numeração EU) e Leu foi substituído por Ala na posição 235 da sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F947 e VH3-IgG1-F1327 (SEQ ID NO: 165), em que Leu foi subs- tituído por Ala na posição 234 (numeração EU), Leu foi substituído por Ala 5 na posição 235 e Asn foi substituído por Ala na posição 297 da sequência de aminoácido de VH3-IgG1-F947. Tabela 17 Nome do mutante Substituição de aminoácido
(12-2) Confirmação de atividade de ligação a FcRn humano e FcγR humano A atividade de ligação (constante de dissociação KD) a FcRn humano em pH 7,0 de anticorpos contendo cada uma das sequências de aminoácido produzidas em (12-1) como cadeias pesadas e contendo L(WT)- CK como cadeia leve foi medida usando o método do Exemplo 4. Ainda, a atividade de ligação a FcγR humano em pH 7,4 foi medida usando o método do Exemplo 7. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 18 abai- xo.
Tabela 18 Nome do Quantidade de ligação (RU) mutante
De acordo com os resultados da Tabela 18, na há quaisquer li- mitações particulares com relação às modificações de aminoácido introduzi- 5 das a fim de diminuir a atividade de ligação a vários tipos de FcγR humano em comparação com a atividade de ligação de um domínio de FcγR nativo, e isso pode ser obtido usando várias modificações de aminoácido. (12-3) Produção de um anticorpo de ligação antiglipicano-3 Uma análise compreensiva foi feita da ligação a cada FcγR de variantes de resíduos de aminoácido pensados ser os sítios de ligação para FcγR na região Fc de IgG1 a fim de encontrar modificações em que ligação a FcRn diminui em comparação com IgG1 de ocorrência natural.
A região variável de um anticorpo antiglipicano-3 tendo dinâmica no plasma aperfei- çoada revelada no WO 2009/041062 na forma de anticorpo glipicano-3 con- tendo a CDR de GpH7 (SEQ ID NO: 74) foi usada para a cadeia de anticor- po H.
Similarmente, GpL 16-k0 do anticorpo glipicano-3 que tem dinâmica no plasma aperfeiçoada conforme revelado no WO 2009/041062 (SEQ ID NO: 75) foi usado em comum para a cadeia L de anticorpo.
Ainda, B3, obtido a- través da introdução de uma mutação de K439E em G1d, em que Gly e Lys tinham sido deletados do terminal C de IgG1 (SEQ ID NO: 76), foi usado pa- ra a região constante da cadeia H de anticorpo.
Esta cadeia H é subsequen- temente referida como GpH7-B3 (SEQ ID NO: 77), enquanto a cadeia L é subsequentemente referida como GpL 16-k0 (SEQ ID NO: 75).
(12-4) Análise cinética de ligação a vários tipos de FcγR Primeiro, a fim de verificar a validade de análise compreensiva usando GpH7-B3/GpL 16-k0 como um controle, foi feita uma comparação de habilidade de ligação a cada FcgR entre GpH7-B3/GpL 16-k0 e GpH7- 5 G1d/GpL 16-k0 (Tabela 19). A ligação a cada FcγR humano (FcγRIa, FcγRI- Ia(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb e FcγRIIa(F) de ambos os anticorpos seguindo expressão e purificação de acordo com o método do Exemplo de Referência 2 foi avaliada de acordo com o método indicado abaixo.
A interação entre cada anticorpo modificado e receptor Fcγ pre- parado da maneira descrita acima foi analisada usando o Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200 (GE Healthcare), Biacore A100 ou Biacore 4000. HBS-EP+ (GE Healthcare) foi usado para o tampão de atividade, e as medi- ções foram realizadas a 25º C.
Os chips usados eram chips em que peptí- deos de antígeno, Protein A (Thermo Scientific), Protein A/G (Thermo Scien- tific) ou Protein L (ACTIGEN ou BioVision) foram imobilizados no Series S Sensor chip CM5 (GE Healthcare) ou Series S Sensor chip CM4 (GE Heal- thcare) através de acoplamento de amina, ou chips em que peptídeos de antígeno preliminarmente biotinilados foram deixados interagir e então imobi- lizados no Series S Sensor chip AS (certificado) (GE Healthcare). Os anti- corpos alvo foram capturados nesses sensor chips, receptor Fcγ diluído com o tampão de atividade foi deixado interagir, seguido por medição da quanti- dade de anticorpo ligado.
As quantidades ligadas foram comparadas entre os anticorpos.
No entanto, uma vez que a quantidade de receptor Fcγ ligado depende da quantidade de anticorpo capturado, os valores usados para comparação foram primeiro corrigidos dividindo a quantidade de receptor Fcγ ligado pela quantidade capturada de cada anticorpo.
Através da reação com glicina-HCl 10 mM em pH 1,5, os sensor chips foram regenerados atra- vés de lavagem do anticorpo capturado nos sensor chips e usados repeti- damente.
A resistência de ligação foi analisada de acordo com o método que segue com base nos resultados de análise da interação com cada FcγR.
O valor obtido dividindo o valor da quantidade de GpH7-B3/GpL 16-k0 ligado a FcγR pelo valor da quantidade de GpH7-Gld/GpL 16-k0 ligado a FcγR e multiplicando este valor por 100 foi usado como um indicador de atividade de ligação relativa a cada FcγR.
Com base nos resultados mostrados na Tabela 19, uma vez que ligação a GpH7-B3/GpL 16-k0 a cada FcgR era mais ou 5 menos igual àquela de GpH7-Gld/GpL 16-k0, foi julgado que GpH7-B3/GpL 16-k0 pode ser usado como um controle nos estudos subsequentes.
Tabela 19 Nome da variante
(12-5) Produção e avaliação de mutantes de Fc Em seguida, esses aminoácidos e seus aminoácidos circundan- tes pensados estar envolvidos em ligação a FcγR na sequência de aminoá- cido de GpH7-B3 (da posição 234 até a posição 239, posição 265 até a po- sição 271, posição 295, posição 296, posição 298, posição 300 e posição 324 até a posição 327 (numeração EU) foram respectivamente substituídos com 18 tipos de aminoácidos excluindo aminoácidos originais e Cys.
Esses mutantes de Fc são referidos como variantes B3. Ligação de variantes B3, expressos e purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 2, a cada FcγR (FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb e FcγRIIIa(F) foi compreensivamente avaliado de acordo com o método de (12-4). Resistência de ligação foi avaliada de acordo com o método que segue com base nos resultados de análise de interação com cada FcγR.
O valor da quantidade de anticorpo derivado de cada variante B3 ligada a FcγR foi dividido pelo valor da quantidade de anticorpo comparativo em que muta- ções não foram introduzidas em B3 (anticorpo tendo a sequência de IgG1 humano de ocorrência natural na posição 234 até a posição 239, posição 265 até a posição 271, posição 295, posição 296, posição 298, posição 300 e posição 324 até a posição 337, indicado por numeração EU) ligada a Fcγ- R.
Este valor foi então multiplicado adicionalmente por 100 e o valor resul- tante foi usado como um indicador de atividade de ligação relativa a cada FcγR.
Essas modificações que diminuíram ligação a todos FcgR dentre as variantes analisadas são mostradas na Tabela 21. Os 236 tipos de modi- ficações mostrados na Tabela 20 são modificações que reduziram a ligação a pelo menos um tipo de FcgR em comparação com anticorpo antes da in- trodução de uma modificação (GpH7-B3/GpL16-k0) e são pensadas ser mo- 5 dificações tendo o efeito de reduzir similarmente ligação a pelo menos um tipo de FcgR mesmo quando introduzidas em IgG1 de ocorrência natural.
Consequentemente, não há quaisquer limitações particulares nas modificações de aminoácido introduzidas para diminuir a atividade de ligação a cada tipo de FcγR humano em comparação com a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo, e foi mostrado ser possível obter isso através da introdução das modificações de aminoácido mostradas na Tabela 20 em pelo menos um local.
Ainda, as modificações de aminoáci- do introduzidas aqui podem estar em qualquer local ou uma combinação de locais múltiplos.
Tabela 20
Alteração introdu- zida em GpH-B3
(12-6) Produção e avaliação de um anticorpo IgG2 humano e um anticorpo IgG4 humano que têm atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro e cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do 5 que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo.
Uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neutro e cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo foi pro- duzida da mesma maneira descrita abaixo usando IgG2 humano ou IgG4 humano.
Anticorpo contendo VH3-IgG2 (SEQ ID NO: 166) para a cadeia pesada e L(WT)-CK (SEQ ID NO: 41) para a cadeia leve foi produzido de acordo com o método mostrado no Exemplo de Referência 2 para uso como anticorpo de ligação a receptor de IL-6 humano tendo IgG2 humano para a região constante.
Similarmente, anticorpo contendo VH3-IgG4 (SEQ ID NO: 167) para a cadeia pesada e L(WT)-CK (SEQ ID NO: 41) para a cadeia leve foi produzido de acordo com o método mostrado no Exemplo de Referência 2 para uso como anticorpo de ligação a receptor de IL-6 humano tendo IgG4 humano para a região constante.
Substituições de aminoácido foram introduzidas em cada região constante de VH3-IgG2 e VH3-IgG4 a fim de fornecer atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro.
Mais especificamente, VH3-IgG2-F890 (SEQ ID NO: 168) e VH3-IgG4-F890 (SEQ ID NO: 169) fo- ram produzidos através de uma substituição de aminoácido de VH3-IgG2 e VH3-IgG4 em que Met foi substituído por Tyr na posição 252 (numeração EU), Asn foi substituído por Tyr na posição 434 e Tyr foi substituído por Val na posição 436.
Substituições de aminoácido foram introduzidas em cada região constante de VH3-IgG2-F890 e VH3-IgG4-F890 a fim de diminuir a ligação a FcγR humano.
Além disso, especificamente, VH3-IgG2-F939 (SEQ ID NO: 170) foi produzido através da substituição de um aminoácido de VH3-IgG2- 5 F890 em que Ala foi substituído por Arg na posição 235 (numeração EU) e Ser foi substituído por Lys na posição 239. Ainda, VH3-IgG4-F939 (SEQ ID NO: 17) foi produzido através da substituição de um aminoácido de VHE- IgG4-F890 em que Leu foi substituído por Arg na posição 235 (numeração EU) e Ser foi substituído por Lys na posição 239. Anticorpo contendo o VH3-IgG2-F890, VH3-IgG4-F890, VH3- IgG2-F939 ou VH3-IgG4-F939 produzido como cadeia pesada e L(WT)-CK (SEQ ID NO: 41) como cadeia leve foi produzido de acordo com o método mostrado no Exemplo de Referência 2. (12-7) Avaliação de anticorpo IgG2 humano e um anticorpo IgG4 humano que têm atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neu- tro e cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo Atividade de ligação (constante de dissociação KD) a FcRn hu- mano em pH 7,0 do anticorpo (Tabela 21) produzido em (12-6) foi medida usando o método do Exemplo 4. Ainda, a atividade de ligação a FcγR huma- no em pH 7,4 foi medida usando o método do Exemplo 7. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 22 abaixo.
Tabela 21 Nome do Mu- Substituição de aminoácido tante
Tabela 22 Nome do Quantidade de ligação Mutante
Os resultados da Tabela 22 mostram que é possível obter uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn humano na região de pH neu- 5 tro e cuja atividade de ligação a FcγR humano é menor do que a atividade de ligação de um domínio de ligação a FcγR nativo usando IgG1 humano sem limitação particular e IgG2 humano ou IgG4 pode ser também usado.
Exemplo 13 Produção e avaliação de uma molécula de ligação a antígeno em que apenas um dos polipeptídeos que compõem o domínio de ligação a FcRn tem atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro Uma molécula de ligação a antígeno em que apenas um dos dois polipeptídeos que compõem o domínio de ligação a FcRn tem atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro, enquanto o outro não tem atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro conforme mostrado na Modalidade 3 do Exemplo 3, foi produzido da maneira indicada abaixo. (13-1) Produção de uma molécula de ligação a antígeno em que apenas um dos dois polipeptídeos que compõem o domínio de ligação a F- cRn tem atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro enquanto o outro não tem atividade de ligação a FcRn sob condições da re- gião de pH neutro.
Primeiro, VH3-IgG1-F947 (SEQ ID NO: 70) foi produzido de a- cordo com o método do Exemplo de Referência 1 como a cadeia pesada de um anticorpo para IL-6R anti-humano tendo atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro.
Ainda, VH3-IgG1-F46 (SEQ ID NO: 71) foi produzido através da adição de uma substituição de aminoácido obtida substituindo Ile por Ala na posição 253 (numeração EU) VH3-IgG1 para uso como uma molécula de ligação a antígeno que não tem atividade de ligação a FcRn em ambas a região de pH ácido e região de pH neutro.
O uso de regiões Fc em que uma região Fc de um anticorpo 5 contém substituições em que Asp é substituído por Lys na posição 356 (nu- meração EU) e Glu é substituído por Lys na posição 357 (numeração EU) e a outra região Fc contém substituições em que Lys é substituído por Glu na posição 370 (numeração EU), His é substituído por Arg na posição 435 (nu- meração EU) e Lys é substituído por Glu na posição 439 (numeração EU) é conhecido como um método para obtenção de um heterodímero de um anti- corpo com alta pureza (WO 2006/106905). VH3-IgG1-FA6a (SEQ ID NO: 72) foi produzido em que Asp é substituído por Lys na posição 356 (numeração EU) e Glu é substituído por Lys na posição 357 (numeração EU) de VH3-IgG1-F947 (daqui em diante referido como Cadeia Pesada A). Ainda, VH3-IgG1-FB4a (SEQ ID NO: 73) foi produzido em que Lys é substituído por Glu na posição 370 (numeração EU), His é substituído por Arg na posição 435 (numeração EU) e Lys é subs- tituído por Glu na posição 439 (numeração EU) de VH3-IgG1-F46 (daqui em diante referido como Cadeia Pesada B) (Tabela 23). Tabela 23 Nome do mutante Substituição de aminoácido
Fv4-IgG1-FA6a/FB4a foi produzido com referência ao método do Exemplo de Referência 2 que tem VH3-IgG1-FA6a e VH3-IgG1-FB4a como cadeias pesadas e VL3-CK para a cadeia leve através da adição de quanti- dades iguais de plasmídeos de cadeia pesada na forma de VH3-IgG1-FA6a e VH3-IgG1-FB4a. (13-2) Um estudo de PK de uma molécula de ligação a antígeno em que apenas dois polipeptídeos que compõem o domínio de ligação a FcRn têm atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro enquanto o outro não tem atividade de ligação a FcRn sob condições da re- gião de pH neutro Um estudo de PK foi conduzido de acordo com o método descri- to abaixo na administração de Fv4-IgG1-F947 e Fv4-IgG1-FA6a/FB4a a ca- 5 mundongos transgênicos FcRn humano. Anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano foi administrado a 1 mg/kg em uma administração única sob a pele das costas de camundongos transgênicos FcRn humano (camundongo linhagem 32 +/+ Tg B6.mFcRn-/- .hFcRn, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010)602, 93-104). San- gue foi coletado em 15 minutos, 7 horas e 1, 2, 3, 4 e 7 dias após adminis- tração do anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano. Plasma foi obtido centrifugando imediatamente o sangue coletado por 15 minutos a 4º C e
15.000 rpm. O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20º C ou menos até o momento da medição. A concentração do anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano em plasma de camundongo foi medida através de ELISA da mesma maneira que o método do Exemplo 4. Os resultados são mostrados na Fig. 32. Fv4- IgG1-FA6a/FB4a, que é capaz de se ligar a apenas uma molécula de FcRn humano através de uma região de ligação única, foi mostrado demonstrar uma mudança de concentração no plasma maior em comparação com Fv4- IgG1-F947, que é capaz de se ligar a duas moléculas de FcRn humano atra- vés de duas regiões de ligação. Conforme anteriormente descrito, embora haja duas regiões de ligação a FcRn na região Fc de IgG, foi relatado que moléculas tendo uma Fc da qual uma das duas regiões de ligação a FcRn foi deletada são elimi- nadas do plasma mais rapidamente em comparação com moléculas tendo uma região Fc de ocorrência natural (Scand, J. Immunol., 1994, 40:457-465). Em outras palavras, IgG tendo duas regiões de ligação que se ligam a FcRn sob condições da região de pH ácido são conhecidos demonstrar retenção no plasma aperfeiçoada em comparação com IgG tendo uma região de liga- ção a FcRn única. Essas mostraram que IgG incorporado a células é reci- clado de volta para o plasma através de ligação a FcRn dentro dos endos-
somos, e uma vez que IgG de ocorrência natural é capaz de se ligar a duas moléculas de FcRn por meio de duas regiões de ligação a FcRn, ele se liga a FcRn com uma capacidade de ligação alta e uma quantidade grande de IgG é então pensada ser reciclada.
Por outro lado, IgG tendo apenas uma 5 região de ligação a FcRn única tem uma capacidade de ligação baixa para FcRn dentro dos endossomos, e uma vez que ele não pode ser adequada- mente reciclado, ele é pensado ser eliminado do plasma mais rapidamente.
Consequentemente, em Fv-IgG1-FA6a/FB4a tendo apenas um sítio de ligação a FcRn único sob condições da região de pH neutro confor- me mostrado na Fig. 32, o fenômeno através do qual um aperfeiçoamento em retenção no plasma é observado foi completamente inesperado uma vez que ele é o oposto daquele no caso de IgG de ocorrência natural.
Embora a presente invenção não seja limitada a uma teoria es- pecífica, uma razão possível para a transição observada desses níveis altos de retenção no plasma é um aumento na taxa de absorção de anticorpo sob a pele em administração subcutânea de anticorpo a camundongos.
Em geral, anticorpo que foi administrado subcutaneamente é pensado migrar para o plasma após ser absorvido através do sistema linfáti- co (J.
Pharm.
Sci. (2000)89(3), 297-310). Uma vez que um grande número de células imunes está presente no sistema linfátioc, anticorpo que foi admi- nistrado subcutaneamente é pensado migrar para o plasma após ser expos- to a um número grande de células imunes.
Em geral, imunogenicidade é co- nhecida ser aumentada quando preparações farmacêuticas de anticorpo são administradas subcutaneamente em comparação com sua administração intravenosa, e uma possível causa disso é que anticorpos subcutaneamente administrados são expostos a um número grande de células imunes no sis- tema linfático.
Na realidade, conforme mostrado no Exemplo 1, foi confirma- do que quando subcutaneamente administrado, Fv4-IgG1-F1 foi rapidamen- te eliminado do plasma, e isso sugere produção de anticorpo de camundon- go para Fv4-IgG1-F1. Por outro lado, no caso de administração intravenosa, eliminação rápida de Fv4-IgG1-F1 do plasma não foi confirmada, sugerindo que anticorpo de camundongo para Fv4-IgG1-F1 não foi produzido.
A saber, durante o curso de absorção de um anticorpo subcuta- neamente administrado, quando o anticorpo é incorporado a células imunes presentes no sistema linfático, ele causa uma diminuição em biodisponibili- dade e ao mesmo tempo se torna uma causa de imunogenicidade. 5 No entanto, no caso de administração subcutânea da molécula de ligação a antígeno mostrada como um exemplo de Modalidade 3 no E- xemplo 3 em que apenas um dos dois polipeptídeos que compõem o domí- nio de ligação a FcRn tem atividade de ligação a FcRn sob condições da região de pH neutro enquanto o outro polipeptídeo não tem atividade de li- gação a FcRn sob condições da região de pH neutro, mesmo se exposta a células imunes presentes no sistema linfático durante o curso de absorção, um complexo quaternário não é pensado ser formado na membrana celular de células imunes.
Consequentemente, um aumento em biodisponibilidade ocorre devido à inibição de incorporação em células imunes presentes no sistema linfático, e como um resultado, é considerado possível que um au- mento em concentração no plasma tenha ocorrido.
Métodos para causar um aumento na concentração no plasma ou diminuição em imunogenicidade através do aumento da biodisponibilida- de de um anticorpo subcutaneamente administrado não são limitados a mo- léculas de ligação a antígeno mostradas na Modalidade 3 do Exemplo 3. Ao invés, qualquer molécula de ligação a antígeno pode ser usada contanto que ela seja uma molécula de ligação a antígeno que não forme um complexo quaternário na membrana celular de células imunes.
Isto é, quando adminis- tradas subcutaneamente, quaisquer moléculas de ligação a antígeno das Modalidades 1, 2 e 3 é pensada ser capaz de aperfeiçoar a retenção no plasma e ao mesmo tempo aumentar a biodisponibilidade, e ainda causar uma diminuição em imunogenicidade, em comparação com moléculas de ligação a antígeno capazes de formar um complexo quaternário.
Uma porção de moléculas de ligação a antígeno que permanece no plasma é pensada sempre migrar para o sistema linfático.
Ainda, células imunes estão também presentes no sangue.
Consequentemente, embora adaptação da presente invenção não seja de maneira alguma limitada a uma via de administração específica, um exemplo esperado demonstrar efeitos particularmente facilmente é pensado ser uma via de administração que é mediada pelo sistema linfático durante o curso de absorção de uma molécu- la de ligação a antígeno e um desses exemplos é administração subcutânea. 5 Exemplo 14 Produção de anticorpo tendo atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro e atividade de ligação seletiva a FcγR inibidor Ainda, a molécula de ligação a antígeno da Modalidade 2 mos- trada no Exemplo 3 pode ser produzida usando uma modificação que causa aumento de atividade de ligação seletiva a FcγRIIb inibidor para uma molé- cula de ligação a antígeno tendo ligação aumentada a FcRn sob condições neutras.
Em outras palavras, uma molécula de ligação a antígeno que tem atividade de ligação a FcRn sob condições neutras e na qual uma modifica- ção é introduzida para causar aumento de atividade de ligação seletiva a FcγRIIb inibidor é capaz de formar um complexo quaternário mediado por duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR.
No entanto, uma vez que ligação seletiva a FcγR inibidor é causada pelo efeito desta modificação, ati- vidade de ligação a FcγR ativo é reduzida.
É pensado que um complexo quaternário contendo FcγR inibidor é preferivelmente formado em células apresentando antígeno como um resultado.
Conforme anteriormente descri- to, é pensado que imunogenicidade é causada pela formação de um com- plexo quaternário contendo FcγR ativo e resposta imune pode ser inibida como um resultado de formação de um complexo quaternário contendo FcγR inibidor desta maneira.
Desta maneira, o estudo que segue foi conduzido a fim de en- contrar mutações de aminoácido que causem aumento de atividade de liga- ção seletiva a FcγRIIb inibidor. (14-1) Análise compreensiva de ligação a FcγR de variante de Fc Foi conduzida uma análise compreensiva da atividade de ligação a cada FcγR de uma pluralidade de variantes de anticorpo IgG1 em que foi introduzida uma mutação que reduz ligação mediada por Fc a FcγR ativo,
em particular qualquer um dos polimorfismos do tipo H e do tipo R de FcγRI- Ia, em comparação com IgG1 de ocorrência natural e aumenta ligação a FcγRIIb.
A região variável de um anticorpo antiglipicano-3 tendo dinâmica 5 no plasma aperfeiçoada revelada no WO 2009/041062 na forma de um anti- corpo de glipicano-3 contendo a CDR de GpH7 (SEQ ID NO: 74) foi usada para a cadeia H de anticorpo.
Similarmente, GpL 16-k0 do anticorpo de glipi- cano-3 tendo dinâmica no plasma aperfeiçoada revelado no WO 2009/041062 (SEQ ID NO: 75) foi usada em comum para a cadeia L de anti- corpo em combinação com a cadeia H diferente.
Ainda, B3, obtido através da introdução de uma mutação de K439E em G1d, em que Gly e Lys tinham sido deletados do terminal C de IgG1 (SEQ ID NO: 76), foi usado para a re- gião constante de cadeia H de anticorpo.
Esta cadeia H é subsequentemen- te referida como GpH7-B3 (SEQ ID NO: 77), enquanto a cadeia L é subse- quentemente referida como GpL 16-k0 (SEQ ID NO: 75). Esses aminoácidos e seus aminoácidos circundantes pensados estar envolvidos em ligação a FcγR na sequência de aminoácido de GpH7- B3 (da posição 234 até a posição 239, posição 265 até a posição 271, posi- ção 295, posição 296, posição 298, posição 300 e posição 324 até a posição 337 (numeração EU) foram respectivamente substituídos com 18 tipos de aminoácidos excluindo os aminoácidos anteriores e Cys.
Essas variantes de Fc são referidas como variantes B3. A atividade de ligação de variantes B3 expressas e purificadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 2 a cada FcγR (FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb e FcγRIIIa) foi com- preensivamente avaliada em obediência ao método descrito no Exemplo 9. Diagramas foram preparados para cada FcγR de acordo com o método descrito abaixo.
A saber, o valor da quantidade de anticorpo deriva- do de cada variante B3 ligado a cada FcγR foi dividido pelo valor da quanti- dade de anticorpo controle que não tem quaisquer mutações introduzidas em B3 (anticorpo tendo a sequência de IgG1 humano de ocorrência natural na posição 234 até a posição 239, posição 265 até a posição 271, posição 295, posição 296, posição 298, posição 300 e posição 324 até a posição 337
(numeração EU). Este valor foi então multiplicado mais por 100 e o valor re- sultante foi expresso como o valor de ligação a cada FcγR.
Ligação de cada variante a FcγRIIb foi representada no eixo horizontal e valores de cada FcγR ativo na forma de FcγRIa, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R) e FcγRIIIa foram 5 respectivamente representados no eixo vertical (Figuras 33, 34, 35 e 36). Como resultado, conforme indicado pelas legendas das Figuras 33 a 36, dentre todas as modificações, a mutação A (modificação obtida substituindo Pro por Asp na posição 238 (numeração EU) e a mutação B (modificação obtida substituindo Leu por Glu na posição 328 (numeração EU) demonstraram ligação notadamente aumentada a FcγRIIb em compara- ção com IgG1 de ocorrência natural, e foram verificadas demonstrar um efei- to de supressão notável de ligação a ambos os tipos de FcγRIIa. (14-2) Análise SPR de variantes de ligação seletiva a FcγRIIb Uma análise mais detalhada foi conduzida de ligação a cada FcγR da variante obtida substituindo Pro por Asp na posição 238 (numera- ção EU) encontrada em (14-1) Para a cadeia H de IgG1, a região variável de IL6R-H revelada no WO 2009/125825 (SEQ ID NO: 78) que é a região variável de um anti- corpo contra receptor da interleucina-6 humana é usada como região variá- vel de cadeia H de anticorpo e IL6R-G1d (SEQ ID NO: 79) contendo uma região constante G1d da qual Gly e Lys do terminal C de IgG1 humano ti- nham sido removidos é usada como a região constante de cadeia H de anti- corpo.
IL6R-G1d v1 (SEQ ID NO: 80) foi produzido em que Pro foi substituí- do por Asp na posição 238 (numeração EU) de IL6R-G1d.
Em seguida, IL6R-G1d_v2 (SEQ ID NO: 81) foi produzido em que Leu foi substituído por Glu na posição 328 (numeração EU) de IL6R-G1d.
Por questão de compara- ção, IL6R-G1d_v3 (SEQ ID NO: 82) que é uma variante de IL6R-G1d foi produzido, no qual uma mutação conhecida (Mol.
Immunol. (2008)45, 3926- 3933) foi introduzida substituindo Ser por Glu na posição 267 (numeração EU) e substituindo Leu por Phe na posição 328 (numeração EU). IL6R-L (SEQ ID NO: 83) que é a cadeia L de tocilizumabe foi usado em comum para a cadeia L de anticorpo em combinação com essas cadeias pesadas.
Os anticorpos foram expressos e purificados de acordo com o método do E- xemplo de Referência 2. Os anticorpos contendo como cadeia H de anticor- po IL6R-G1d, IL6R-G1d_v1, IL6R-G1d_v2 e IL6R-G1d_v3 são daqui em di- ante referidos respectivamente como IgG1, IgG1-v1, IgG2-v2 e IgG1-v3. 5 Em seguida, interação entre esses anticorpos e FcγR foi anali- sada cineticamente usando o Biacore T100 (GE Healthcare). A interação foi medida em uma temperatura de 25º C usando HBS-EP+ (GE Healthcare) para o tampão de atividade.
O Series S Sensor chip CM5 (GE Healthcare) foi usado após imobilização de Protein A através de acoplamento de amina.
Ligação de cada FcγR a anticorpo foi medida ao permitir que cada FcγR dilu- ído com tampão de atividade agisse no chip no qual um anticorpo alvo tinha sido capturado.
O anticorpo capturado no chip foi lavado ao permitir que 10 mM de glicina-HCl (pH 1,5) reagissem seguindo a medição.
O chip regerado desta maneira foi usado repetidamente.
A constante de dissociação KD (mol/L) foi calculada a partir da constante de taxa de associação (L/mol) e constante de taxa de dissociação kd (l/s) conforme calculado através de a- juste global dos resultados de medição com um modelo de ligação Langmuir 1:1 usando o Biacore Evaluation Software.
Uma vez que a ligação de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcγRIIa(H) ou FcγRIIIa foi extremamente fraca, a KD não pôde ser calculada através de ajuste global dos resultados de medição com o modelo de ligação Langmuir 1:1 mencionado acima usando o Biacore Evaluation Software.
KD pôde ser calculada para interação de IgG1-v1 e IgG2-v2 com FcγRIIa(H) ou FcγRIIIa usando o modelo de ligação 1:1 que segue descrito no Biacore T100 Softwa- re Handbook BR1006-48, Edição AE.
O comportamento das moléculas de interação no sistema Biaco- re usando o modelo de ligação 1:1 pode ser representado pela Equação 4 abaixo.
Equação 4 Req = C x Rmax (KD+C) + R1 O significado de cada parâmetro na Equação 4 mencionada a- cima é como segue:
Req (RU): Nível de ligação em estado uniforme C (M): Concentração de analito C: Concentração Rmax (RU): Capacidade de ligação à superfície do analito 5 RI (RU): Contribuição do índice de refração da massa em amos- tra KD (M): Constante de dissociação de equilíbrio A KD pode ser expressa na maneira da Equação 5 abaixo atra- vés da transformação da Equação 4. Equação 5 KD = C x Rmax (Req-RI) – C A KD pode ser calculada substituindo os valores de Rmax, RI e C nesta equação.
Sob as condições de medição usadas aqui, os valores substituídos na equação foram RI = 0 e C = 2 µmol/L.
O valor obtido dividin- do o valor de Rmax obtido quando ajuste global dos resultados de análise da interação de IgG1 com cada FcγR usando o modelo de ligação Langmuir 1:1 pela quantidade de IgG1 capturada e multiplicando as quantidades captura- das de IgG1-v1 e IgG1-v2 foi usado para Rmax.
Sob as condições de medição usadas aqui, ligação de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcγRIIa(H) foi cerca de 2,5 RU e 10 RU, respectivamente, e liga- ção de IgG1-v1 e IgG1-v2 a FcγRIIIa foi cerca de 2,5 RU e 5 RU, respecti- vamente.
As quantidades capturadas de anticorpos IgG1-v1 e IgG1-v2 no sensor chip durante análise da interação de IgG1 com FcγRIIa(H) foram 469,2 RU e 444,2 RU, e as quantidades capturadas de anticorpos IgG1-v1 e IgG1-v2 no sensor chip durante análise da interação de IgG1 com FcγRIIIa foram 470,8 RU e 447,1 RU.
Ainda, os valores de Rmax obtidos através de ajuste global dos resultados de análise da interação de IgG1 com FcγRIIa(H) e FcγRIIIa usando o modelo de ligação Langmuir 1:1 foram 69,8 RU e 63,8 RU, respectivamente, e as quatnidades de anticorpo capturado no sensor chip foram 452 RU e 454,5 RU, respectivamente.
Os valores de Rmax de IgG1-v1 e IgG2-v2 para FcγRIIa(H) foram calculados ser 72,5 RU e 68,6 RU, respectivamente, enquanto os valores de Rmax de IgG1-v1 e IgG1-v2 para
FcγRIIIa foram calculados ser 66,0 RU e 62,7 RU, respectivamente, usando esses valores.
Os valores de KD para IgG1-v1 e IgG1-v2 para FcγRIIa(H) e FcγRIIIa foram calculados substituindo esses valores na Equação 5. Equação 5 5 KD = C x Rmax / Req-RI) – C Os valores de KD de IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2 e IgG1-v2 para ca- da FcγR (valores de KD de cada anticorpo para cada FcγR) são mostrados na Tabela 24, enquanto valores de KD relativos de IgG1-v1, IgG2-v2 e IgG1- v3, obtidos dividindo os valores de KD de IgG1 para cada FcγR por valores de KD de IgG1-V1, IgG1-v2 e IgG1-v3 a cada FcγR (valores de KD relativos de cada anticorpo para cada FcγR) são mostrados na Tabela 25. Tabela 24
Na Tabela 24 acima, asteriscos indicam valores de KD que fo- ram calculados usando a Equação 5 quando ligação de FcγR a IgG não foi adequadamente observada.
Equação 5 KD = C x Rmax (Req-RI) – C Tabela 25
Conforme mostrado na Tabela 25, afinidade de IgG1-v1 com FcγRIa diminuiu para 0,047 vez em comparação com IgG1, afinidade com FcγRIIa(R) diminuiu para 0,10 vez, afinidade com FcγRIIa(H) diminuiu para 0,014 vez e afinidade com FcγRIIIa diminuiu para 0,061 vez.
Por outro lado,
afinidade com FcγRIIb melhorou 4,8 vezes.
Ainda, conforme mostrado na Tabela 25, afinidade de IgG1-v2 com FcγRIa diminuiu 0,74 vez em comparação com IgG1, afinidade com FcγRIIa(R) diminuiu para 0,41 vez, afinidade com FcγRIIa(H) diminuiu para 5 0,064 vez e afinidade com FcγRIIIa diminuiu para 0,14 vez.
Por outro lado, afinidade com FcγRIIb melhorou 2,3 vezes.
A saber, com base nesses resultados, IgG1-v1, em que Pro foi substituído por Asp na posição 238 (numeração EU), e IgG1-v2, em que Leu foi substituído por Glu na posição 328 (numeração EU), demonstraram liga- ção menor a todas as formas ativas de FcγR incluindo ambos os polimorfis- mos de FcγRIIa; e ligação a FcγRIIb que é FcγR inibidor foi claramente au- mentada.
Até agora, alterações tendo tais propriedades não foram relatadas, e elas são muito raras conforme mostrado nas Figuras 33 a 36. Alterações produzidas substituindo Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp ou substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) com Glu são muito úteis para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para doenças inflamatórias imunológicas e similar.
Ainda, conforme mostrado na Tabela 25, IgG1-v3 certamente mostra uma ligação com aumento de 408 vezes a FcγRIIb, enquanto a liga- ção a FcγRIIa (H) é diminuída para 0,51 vez e a ligação a FcγRIIa (R) é au- mentada para 522 vezes.
Desta maneira, uma vez que IgG1-v1 e IgG1-v2 suprimem sua ligação a ambos o FcγRIIa (R) e FcγRIIa (H) e aumentam sua ligação a FcγRIIb, eles são considerados ser variantes que se ligam com um FcγRIIb maior seletivamente comparado com IgG1-v3. Especificamente, al- terações produzidas substituindo Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp ou substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) com Glu são muito úteis para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para doenças inflama- tórias imunológicas e similar. (14-3) Efeitos de combinação de modificações de ligação seleti- va a FcγRIIb e outras substituições de aminoácido da região Fc Em (14-2), uma variante obtida substituindo Pro por Asn na po- sição 238 (numeração EU) na sequência de aminoácido de IgG1 humano de ocorrência natural, ou uma variante obtida substituindo Leu por Glu na posi- ção 328 (numeração EU), foi verificada demonstrar ligação mediada por Fc menor a FcγRIa, FcγRIIIa e qualquer um dos polimorfismos de FcγRIIa, bem como ligação aperfeiçoada a FcγRIIb.
Desta maneira, variantes de Fc foram 5 criadas para terem ligação reduzida adicional a qualquer um dentre FcγRI, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R) e FcγRIIIa e ainda ligação aperfeiçoada a FcγRIIb como um resultado de introdução de substituições de aminoácido adicionais na variante obtida substituindo Pro por Asp na posição 238 (numeração EU) ou a variante obtida substituindo Leu por Glu na posição 328 (numeração EU). (14-4) Produção de anticorpos tendo atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro e cuja atividade de ligação a FcγRIIb humano foi seletivamente aumentada Anticorpos foram produzidos de acordo com o método mostrado abaixo a fim de aumentar seletivamente a atividade de ligação a FcγRIIb humano para VH3-IgG1 e VH3-IgG1-F11. VH3-IgG1-F648 (SEQ ID NO: 84) foi produzido introduzindo uma substituição de aminoácido obtida substituin- do Pro por Asp na posição 238 (numeração EU) em VH3-IgG1 de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Similarmente, VH3-IgG1-F652 (SEQ ID NO: 85) foi produzido introduzindo uma substituição de aminoácido obtida substituindo Pro por Asp na posição 238 (numeração EU) em VH3- IgG1-F11 de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. (14-5) Avaliação de anticorpos tendo atividade de ligação com FcRn humano sob condições da região de pH neutro e cuja atividade de li- gação a FcγR humano foi seletivamente aumentada Anticorpos contendo VH3-IgG1, VH3-IgG1-F648, VH3-IgG1-F11 ou VH3-IgG1-F652 para a cadeia pesada e L(WT)-CK para a cadeia leve foram produzidos de acordo com o método do Exemplo de Referência 2. Interação desses anticorpos com FcγRIIa(R) e FcγRIIb foi anali- sada usando o Biacore T100 (GE Healthcare). As medições foram realizadas a 25º C usando um tampão consistindo em ACES 10 mM, NaCl 150 mM e Tween 20 0,05% (pH 7,4) para o tampão de atividade.
O Series S Sensor chip CM4 (GE Healthcare) foi usado após imobilização de Protein L através de acoplamento de amida.
Interação de cada FcγR com anticorpo foi medida ao permitir que cada FcγR diluído com tampão de atividade agisse no chip no qual um anticorpo alvo tinha sido capturado.
O anticorpo capturado no 5 chip foi lavado através de reação com glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) seguindo a medição e o chip regenerado desta maneira foi repetidamente usado.
Os resultados de medição foram analisados usando o Biacore Evaluation Software.
Anticorpo foi capturado por Protein L e a quantidade de mudança em um sensorgrama antes e após o anticorpo ter sido capturado foi definida como X1. Em seguida, FcγRs seres humanos foram deixados interagir com o anticorpo e o valor obtido subtraindo atividade de ligação de FcγRs seres humanos representado como a quantidade de mudança em um sensorgrama antes e após permitir que o tampão de atividade interagisse com anticorpo capturado por Protein L (∆A2) do valor obtido multiplicando por 1500 o valor obtido dividindo a atividade de ligação de FcγRs seres hu- manos representado como a quantidade de mudança em um sensorgrama antes e após esta interação (∆A1) pela quantidade capturada (X) de cada anticorpo foi dividido pela quantidade capturada de cada anticorpo (X) se- guido por multiplicação por 1500 para obter a atividade de ligação dos FcγRs (Y) seres humanos (Equação 1). Equação 1 Atividade de ligação de FcγRs (Y) de camundongo = (∆A1- ∆A2)/X x 1500 Os resultados são mostrados na Tabela 26 abaixo.
O efeito do aumento seletivo de atividade de ligação a FcγRIIb através da introdução de uma mutação obtida substituindo Pro por Asp na posição 238 (numeração EU) foi confirmado ser igualmente observado mesmo no caso de introdução em um anticorpo tendo atividade de ligação a FcRn humano sob condições da região de pH neutro.
Tabela 26 Quantidade de ligação
O IgG1-F652 obtido aqui é um anticorpo que tem atividade de li- gação a FcRn sob condições da região de pH neutro e que causa aumento 5 de atividade de ligação seletiva a FcγRIIb inibidor.
A saber, este anticorpo corresponde a uma molécula de ligação a antígeno da Modalidade 2 mos- trada no Exemplo 3. Em outras palavras, IgG1-F652 é capaz de formar um complexo quaternário mediado por duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcγR; no entanto, uma vez que ele causa aumento de atividade de liga- ção seletiva a FcγR inibidor, atividade de ligação a FcγR ativo diminui.
Como um resultado, um complexo quaternário contendo FcγR inibidor é pensado ser preferivelmente formado em células apresentando antígeno.
Conforme anteriormente descrito, é pensado que imunogenicidade seja causada pela formação de um complexo quaternário contendo FcγR ativo, e a resposta imune é inibida como um resultado de formação de um complexo quaterná- rio contendo FcγR inibidor desta maneira.
Exemplo de Referência 1 Construção de vetores de expressão de anticorpos IgG substituídos com aminoácido Mutantes foram preparados usando o QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) através do método descrito no manual de ins- truções anexo.
Fragmentos de plasmídeo contendo os mutantes foram inse- ridos em vetores de expressão de célula animal para construir vetores de expressão de cadeia H e cadeia L desejados.
As sequências de nucleotídeo dos vetores de expressão resultantes foram determinadas através dos mé- todos conhecidos daqueles versados na técnica.
Exemplo de Referência 2 Expressão e purificação de anticorpos IgG
Os anticorpos foram expressos usando o método que segue.
Li- nhagem de célula HEK293H derivada de célula de câncer de rim embriônico humano (Invitrogen) foi suspensa em DMEM (Invitrogen) suplementado com Soro Bovino Fetal 10% (Invitrogen). As células foram plaqueadas a 10 ml por 5 placa em placas para células aderentes (10 cm de diâmetro; CORNING) em uma densidade celular de 5 a 6 x 105 células/ml e culturadas em uma incu- badora de CO2 (37º C, CO2 5%) por um dia e uma noite.
Então, o meio foi removido através de aspiração e 6,9 ml de meio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) foram adicionados.
O plasmídeo preparado foi introduzido nas células atra- vés do método de lipofecção.
Os sobrenadantes em cultura resultantes fo- ram coletados, centrifugados (aproximadamente 2.000 x g, 5 minutos, tem- peratura ambiente) para remover células e esterilizados através de filtragem em filtro de 0,22 µm MILLEX (marca registrada) – GV (Millipore) para obter os sobrenadantes.
Os anticorpos foram purificados a partir dos sobrenadan- tes de cultura obtidos através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Bioscien- ces). Para determinar a concentração do anticorpo purificado, a absorbância foi medida a 280 nm usando um espectrômetro.
As concentrações de anti- corpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coefi- ciente de absorbância calculado através do método descrito em Protein Sci- ence (1995) 4: 2411-2423. Exemplo de Referência 3 Preparação de receptor de IL-6 huma- no solúvel (hsIL-6R) Receptor de IL-6 humano recombinante de receptor de IL-6 hu- mano que é um antígeno foi preparado da maneira descrita abaixo.
Uma linhagem CHO que expressa constantemente receptor de IL-6 humano solú- vel composto de uma sequência de aminoácido consistindo do 1º ao 357º aminoácido do terminal N conforme relatado em J.
Immunol. (1994) 152, 4958-4968 (daqui em diante referido como hsIL-6R) foi construída usando um método conhecido dentre pessoas de habilidade comum na técnica.
O receptor de IL-6 humano solúvel foi expresso através de cultura desta linha- gem CHO.
Receptor de IL-6 humano solúvel foi purificado do sobrenadante de cultura da linhagem CHO resultante através de duas etapas de cromato- grafia de coluna Blue Sepharose 6 FF e cromatografia de coluna de filtragem em gel.
A fração que eluiu como o pico principal na etapa final foi usada co- mo o produto purificado final. 5 Exemplo de Referência 4 Estudo de PK em receptor de IL-6 hu- mano solúvel e anticorpos humanos em camundongos normais Para examinar a retenção no plasma e a imunogenicidade de receptor de IL-6 humano solúvel e anticorpos humanos em um camundongo normal, o teste que segue foi conduzido. (4-1) Exame de retenção no plasma e imunogenicidade de re- ceptor de IL-6 humano solúvel em camundongos normais Para examinar a retenção no plasma e a imunogenicidade de receptor de IL-6 humano solúvel em um camundongo normal, o teste que segue foi conduzido.
Uma dose única (50 µg/kg) de receptor de IL-6 humano solúvel (preparado no Exemplo de Referência 3) foi administrada na veia caudal de um camundongo normal (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão). Amostras de sangue foram coletadas em 15 minutos, 7 horas e 1, 2, 3, 4, 7, 14, e 21 dias após administração de receptor de IL-6 humano solúvel.
As amostras de sangue foram imediatamente centrifugadas por 15 minutos a 4º C e 15.000 rpm para separar o plasma.
O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20º C ou menos até o momento da medi- ção.
A concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel e o título de anticorpo de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano de camundongo foram determinados conforme descrito abaixo.
A concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel em um camundongo foi determinada através de um método de quimiolumi- nescência.
Uma amostra da curva de calibragem de receptor de IL-6 huma- no solúvel, preparada em 2.000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5 ou 31,25 pg/mL, e uma amostra de medição de plasma de camundongo, diluída 50 vezes ou acima, foram misturadas com um anticorpo anti-IL6R anti-humano monoclo- nal (R&D) rutenado com SULFO-MARCADOR NHS Ester (Meso Scale Dis-
covery), um anticorpo IL-6 R anti-humano biotinilado (R & D), e tocilizumabe, seguido por reação de um dia para o outro a 37º C.
Toxilizumabe foi prepa- rado em uma concentração final de 333 µg/mL.
Subsequentemente, o líqui- do da reação foi despejado em uma MA400 PR Streptavidin Plate (Meso 5 Scale Discovery). Ainda, depois da lavagem o líquido de reação que foi dei- xado reagir por 1 hora em temperatura ambiente, Read Buffer T (x4) (Meso Scale Discovery) foi despejado.
Subsequentemente, o líquido de reação foi imediatamente submetido à medição usando um leitor SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). A concentração de receptor de IL-6 humano solúvel foi calculada a partir da resposta da curva de calibragem usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). O título de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano em plasma de camundongo foi determinado através de um método de eletro- quimioluminescência.
Primeiro, o receptor de IL-6 humano foi despejado em uma MA100 PR Uncoated Plata (Meso Scale Discovery). A placa foi deixada descansar sem ser perturbada de um dia para o outro a 4º C para preparar uma placa de fase sólida de receptor de IL-6 humano.
A placa de fase sólida de receptor de IL-6 humano, com uma amostra de medição de plasma de camundongo diluída 50 vezes aplicada, foi deixada descansar sem ser per- turbada de um dia para o outro a 4º C.
Subsequentemente, a dita placa que foi deixada reagir com o IgG anticamundongo (molécula integral) (Sigma- Aldrich) rutenado com SULFO-MARCADOR NHS Ester (Meso Scale Disco- very) por 1 hora em temperatura ambiente foi lavada.
Read Buffer T (x4) (Meso Scale Discovery) foi despejado na dita placa, imediatamente seguido por medição usando um leitor SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Os resultados são mostrados na Fig. 37. Os resultados demons- tram que receptor de IL-6 humano solúvel no plasma de camundongo desa- pareceu rapidamente.
Dos três camundongos que receberam receptor de IL- 6 humano solúvel, dois camundongos (Nos. 1 e 3) mostraram um título de anticorpo alto de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano de camundon- go solúvel em plasma.
É sugerido que esses dois camundongos desenvolve- ram uma resposta imune a receptor de IL-6 humano solúvel, resultando na produção de anticorpos de camundongo. (4-2) Avaliação de imunogenicidade de receptor de IL-6 humano em modelo de estado uniforme Para examinar o efeito de produção de anticorpo de camundon- 5 go contra receptor de IL-6 humano solúvel na concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel, o teste que segue foi conduzido.
O modelo de estudo que segue foi construído como um modelo para manutenção da concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel no estado uniforme (cerca de 20 ng/mL). Uma bomba de infusão (MODEL2004, alzet MINI-OSMOTIC PUMP), cheia com receptor de IL-6 humano solúvel, foi subcutaneamente implantada nas costas de um camun- dongo normal (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão) para criar um modelo de animal com concentração no plasma de receptor de IL-6 humano mantida no estado uniforme.
O estudo foi conduzido em dois grupos (n = 4 por grupo). Para o grupo de camundongos que imitava tolerância imune, uma dose única (20 mg/kg) de anticorpo CD4 anti-camundongo monoclonal (R & D) foi adminis- trada à veia caudal para inibir a produção de anticorpos de camundongo contra receptor de IL-6 humano solúvel.
Subsequentemente, o anticorpo foi similarmente administrado uma vez em 10 dias (daqui em diante referido como grupo de administração de anticorpo CD4 anti-camundongo). O outro grupo foi usado como um grupo controle, isto é, grupo de não administração de anticorpo CD4 anti-camundongo que não recebeu nenhum anticorpo CD4 anti-camundongo monoclonal.
Subsequentemente, uma bomba de infusão cheia com 92,8 µg/mL de receptor de IL-6 humano solúvel foi subcutanea- mente implantada nas costas de um camundongo.
Depois da implantação de uma bomba de infusão, amostras de sangue foram coletadas com o tempo, imediatamente seguido por centrifugação por 15 minutos a 4º C e 15.000 rpm para obter plasma.
O plasma separado foi armazenado em um congela- dor ajustado para -20º C ou menos até o momento da medição.
A concen- tração de receptor de IL-6 humano solúvel (hsIL-6R) foi determinada da mesma maneira que no Exemplo de Referência 4-1.
Mudanças na concentração no plasma de receptor de IL-6 hu- mano solúvel em um camundongo normal individual, determinadas conforme descrito acima, são mostradas na Fig. 38. Como resultado, no dia 14 após a bomba de infusão ter sido 5 subcutaneamente implantada nas costas de um camundongo, foi observado que as concentrações no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel foram reduzidas em todos os camundongos de grupo de não administração de an- ticorpo CD4 anti-camundongo.
Por outro lado, não foi observado que as concentrações no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel foram reduzi- das em todos os camundongos que receberam anticorpo CD4 anticamun- dongo para inibir a produção de anticorpos de camundongo contra receptor de IL-6 humano solúvel.
Os resultados de (4-1) e (4-2) indicam os três pontos que se- guem: (1) receptor de IL-6 humano solúvel, após administração a um camundongo, desaparece rapidamente do plasma. (2) receptor de IL-6 humano solúvel é uma proteína estranha para camundongos, que é imunogênica quando administrada a um camun- dongo, induzindo a produção de anticorpos de camundongo contra receptor de IL-6 humano solúvel; e (3) se produção de anticorpos de camundongo contra receptor de IL-6 humano solúvel ocorrer, o desaparecimento de receptor de IL-6 hu- mano solúvel é acelerado mais, mesmo em um modelo com a concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel mantida em um certo nível, redução de concentração no plasma ocorre. (4-3) Exame da retenção no plasma e imunogenicidade de anti- corpo humano em um camundongo normal Para examinar a retenção no plasma e imunogenicidade de anti- corpo humano em um camundongo normal, o teste que segue foi conduzido.
Uma dose única (1 mg/kg) de anticorpo para receptor de IL-6 an- ti-humano, Fv4-IgG1, foi administrada à veia caudal de um camundongo normal (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão). Amostras de sangue foram coletadas em 15 minutos, 7 horas e 1, 2, 3, 4, 7, 14 e 21 dias após a administração de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano.
As amostras de sangue obtidas foram imediatamente centrifugadas a 15.000 rpm por 15 minutos a 4º C para separar plasma.
O plasma separado foi armazenado em 5 um congelador ajustado para -20º C ou menos até o momento da medição.
A concentração no plasma de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano em um camundongo foi determinada através de ELISA.
Primei- ro, Fragmento de Anticorpo F(ab’)2 de IgG anti-humano (específico de ca- deia γ) (SIGMA) foi despejado em uma Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nal- ge Nunc International) e foi deixado descansar sem ser perturbado de um dia para o outro a 4º C para preparar uma placa de fase sólida de IgG anti- humano.
Amostras de curva de calibragem contendo anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano em uma concentração no plasma de 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 ou 0,0125 µg/ml e amostras de medição no plasma de camun- dongo diluídas 100 vezes ou mais foram preparadas.
Uma mistura de 100 µL da amostra de curva de calibragem e da amostra de medição no plasma e 200 µL de 20 ng/mL de receptor de IL-6 humano solúvel foi deixada des- cansar sem ser perturbada por 1 hora em temperatura ambiente.
Subse- quentemente, a placa de fase sólida de IgG anti-humano em que a mistura tinha sido despejada em cada uma das suas cavidades foi deixada descan- sar mais sem ser perturbada por 1 hora em temperatura ambiente.
Subse- quentemente, a placa foi deixada reagir com Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R & D) por 1 hora em temperatura ambiente.
A reação cromogêni- ca do líquido de reação obtido através de reação com Streptavidin- PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) por 1 hora em tempera- tura ambiente foi conduzida usando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um substrato.
Depois da reação ter sido parada através da adição de ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), ab- sorbância a 450 nm do líquido de reação em cada cavidade foi medida u- sando uma leitora de microplaca.
A concentração de anticorpo no plasma em um camundongo foi calculada a partir da absorbância da curva de cali- bragem usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices).
Os resultados são mostrados na Fig. 39. A retenção no plasma de anticorpo humano quando uma dose única de anticorpo humano foi ad- ministrada a um camundongo foi significantemente maior do que aquela de receptor de IL-6 humano solúvel quando uma dose única de receptor de IL-6 5 humano solúvel foi administrada (Fig. 37), e a concentração alta no plasma foi demonstrada ser mantida mesmo no dia 21 após a administração.
Isso é provavelmente devido ao fato que anticorpos humanos que são incorporados a células se ligam a FcRn de camundongo dentro do endossomo a ser reci- clado no plasma.
Por outro lado, receptor de IL-6 humano solúvel que é in- corporado a células é pensado desaparecer rapidamente do plasma porque ele não tem nenhum curso para ser reciclado do endossomo.
Ainda, a concentração reduzida no plasma, vista no modelo de estado uniforme de receptor de IL-6 humano solúvel (Fig. 38), não foi obser- vada em nenhum dos três camundongos que receberam anticorpo humano.
Em outras palavras, foi sugerido que diferente de receptor de IL-15 humano, nenhum anticorpo de camundongo foi produzido contra anticorpo humano.
Os resultados de (4-1), (4-2 e (4-3) podem sugerir o que segue.
Primeiro, ambos o receptor de IL-6 solúvel humano e o anticorpo humano são proteínas estranhas em camundongos.
Desta maneira, os camundongos são pensados ter uma população de célula T grande que responde especifi- camente a eles.
Quando o receptor de IL-6 solúvel humano, isto é, uma proteína estranha, foi administrado a um camundongo, ele desapareceu do plasma em um tempo curto e resposta imune para o receptor de IL-6 solúvel huma- no foi confirmada.
Aqui, o desaparecimento rápido de receptor de IL-6 solú- vel humano do plasma sugere que muitos receptores de IL-6 solúveis seres humanos são incorporados a células apresentando antígeno em um tempo curto e submetidos a processamento dentro das células e então ativam célu- las T que respondem especificamente a receptor de IL-6 solúvel humano.
É pensado que reposta imune a receptor de IL-6 solúvel humano (isto é, pro- dução de anticorpo de camundongo contra receptor de IL-6 solúvel humano) ocorre como um resultado.
Por outro lado, quando um anticorpo humano, isto é, uma prote- ína estranha, foi administrado a um camundongo, sua retenção no plasma foi significantemente mais longa do que aquela de receptor de IL-6 solúvel humano e resposta imune ao anticorpo humano não ocorreu.
A retenção no 5 plasma mais longa indica a presença de apenas uma pequena quantidade de anticorpos humanos que são incorporados a células apresentando antí- geno e submetidos a processamento.
Desta maneira, é pensado que mesmo se o camundongo tiver uma população de célula T que especificamente res- ponde ao anticorpo humano, as células T não são ativadas através da apre- sentação de antígeno, e, como um resultado, resposta imune ao anticorpo humano (isto é, produção de anticorpo de camundongo contra o anticorpo humano) não ocorre.
Exemplo de Referência 5 Preparação e avaliação de várias vari- antes de Fc de anticorpo com afinidade de ligação aumentada com FcRn humano em pH neutro (5-1) Preparação e avaliação de atividade de ligação de várias variantes de Fc de anticorpo com afinidade de ligação aumentada com FcRn humano em pH neutro Para aumentar a afinidade de ligação com FcRn humano em uma faixa de pH neutro, várias mutações foram introduzidas em VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 35) para avaliação.
As variantes (IgG1-F1 a IgG1-F1052) con- tendo as cadeias pesada e leve criadas L (WT)-CK (SEQ ID NO: 41) foram expressas e purificadas de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. A ligação de anticorpo para FcRn humano foi analisada de acor- do com o método descrito no Exemplo 4. Em outras palavras, as atividades de ligação de variantes de FcRn humano sob condições neutras (pH 7,0), determinadas usando Biacore, são mostradas nas Tabelas 27-1 a 27-32.
Tabela 27-1 Variante Posição de alteração de aminoácido
Tabela 27-2 é uma continuação da tabela 27-1. Tabela 27-2
Tabela 27-3 é uma continuação da tabela 27-2. Tabela 27-3
Tabela 27-4 é uma continuação da tabela 27-3. Tabela 27-4
Tabela 27-5 é uma continuação da tabela 27-4. Tabela 27-5
Tabela 27-6 é uma continuação da tabela 27-5. Tabela 27-6
Tabela 27-7 é uma continuação da tabela 27-6. Tabela 27-7
Tabela 27-8 é uma continuação da tabela 27-7. Tabela 27-8
Tabela 27-9 é uma continuação da tabela 27-8. Tabela 27-9
Tabela 27-10 é uma continuação da tabela 27-9. Tabela 27-10
Tabela 27-11 é uma continuação da tabela 27-10. Tabela 27-11
Tabela 27-12 é uma continuação da tabela 27-11. Tabela 27-12
Tabela 27-13 é uma continuação da tabela 27-12. Tabela 27-13
Tabela 27-14 é uma continuação da tabela 27-13. Tabela 27-14
Tabela 27-15 é uma continuação da tabela 27-14. Tabela 27-15
Tabela 27-16 é uma continuação da tabela 27-15. Tabela 27-16
Tabela 27-17 é uma continuação da tabela 27-16. Tabela 27-17
Tabela 27-18 é uma continuação da tabela 27-17. Tabela 27-18
Tabela 27-19 é uma continuação da tabela 27-18. Tabela 27-19
Tabela 27-20 é uma continuação da tabela 27-19. Tabela 27-20
Tabela 27-21 é uma continuação da tabela 27-20. Tabela 27-21
Tabela 27-22 é uma continuação da tabela 27-21. Tabela 27-22
Tabela 27-23 é uma continuação da tabela 27-22. Tabela 27-23
Tabela 27-24 é uma continuação da tabela 27-23. Tabela 27-24
Tabela 27-25 é uma continuação da tabela 27-24. Tabela 27-25
Tabela 27-26 é uma continuação da tabela 27-25. Tabela 27-26
Tabela 27-27 é uma continuação da tabela 27-26. Tabela 27-27
Tabela 27-28 é uma continuação da tabela 27-27. Tabela 27-28
Tabela 27-29 é uma continuação da tabela 27-28. Tabela 27-29
Tabela 27-30 é uma continuação da tabela 27-29. Tabela 27-30
Tabela 27-31 é uma continuação da tabela 27-30. Tabela 27-31
Tabela 27-32 é uma continuação da tabela 27-31. Tabela 27-32
(5-2) Teste in vivo de anticorpos de ligação a receptor de IL-6 5 humano dependente do pH com ligação a FcRn humano aumentada sob a condição de pH neutro Os anticorpos de ligação a receptor de IL-6 humano dependente do pH tendo habilidade de ligação a FcRn humano sob uma condição neutra foram produzidos usando as cadeias pesadas preparadas conforme descrito nos Exemplos 5-1 para terem habilidade de ligação a FcRn humano sob uma condição neutra.
Os anticorpos foram avaliados quanto ao seu efeito de eliminação de antígeno in vivo.
Especificamente, os anticorpos listados abai- xo foram expressos e purificados através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica conforme descrito no Exemplo de Referência 2. Fv4-IgG1 compreendendo VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 35) e VL3-CK (SEQ ID NO: 36); Fv4-IgG1-v2 compreendendo VH3-IgG1-2 (SEQ ID NO: 37) e VL3-CK (SEQ ID NO: 36); Fv4-IgG1-F14 compreendendo VH3-IgG1-F14 (SEQ ID NO: 86)
e VL3-CK (SEQ ID NO: 36); Fv4-IgG1-F20 compreendendo VH3-IgG1-F20 (SEQ ID NO: 39) e VL3-CK (SEQ ID NO: 36); Fv4-IgG1-F21 compreendendo VH3-IgG1-F21 (SEQ ID NO: 40) 5 e VL3-CK (SEQ ID NO: 36); Fv4-IgG1-F25 compreendendo VH3-IgG1-F25 (SEQ ID NO: 87) e VL3-CK (SEQ ID NO: 36); Fv4-IgG1-F29 comprendendo VH3-IgG1-F29 (SEQ ID NO: 88) e VL3-CK (SEQ ID NO: 36); Fv4-IgG1-F35 compreendendo VH3-IgG1-F35 (SEQ ID NO: 89) e VL3-CK (SEQ ID NO: 36); Fv4-IgG1-F48 compreendendo VH3-IgG1-F48 (SEQ ID NO: 90) e VL3-CK (SEQ ID NO: 36); Fv4-IgG1-F93 compreendendo VH3-IgG1-F93 (SEQ ID NO: 91) e VL3-CK (SEQ ID NO: 36); e Fv4-IgG1-F94 compreendendo VH3-IgG1-F94 (SEQ ID NO: 92) e VL3-CK (SEQ ID NO: 36). Os anticorpos de ligação a receptor de IL-6 humano dependente do pH preparados foram testados in vivo através do método descrito abaixo usando camundongos transgênicos FcRn humano (camundongo linhagem 276 +/+ Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn, Jackson Laboratories; Methods Mol.
Biol. (2010) 602: 93-104). A um camundongo transgênico FcRn humano (camundongo li- nhagem 276 +/+ Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn, Jackson Laboratories; Methods Mol.
Biol. (2010) 602: 93-104) e camundongo normal (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão), hsIL-6R (receptor de IL-6 humano solúvel preparado no Exemplo de Referência 3) foi administrado sozinho ou receptor de IL-6 humano solúvel e anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano foram administrados simultaneamente para examinar a farmacocinética do receptor de IL-6 humano solúvel e anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano in vi- vo.
Uma dose única (10 mL/kg) de solução de receptor de IL-6 humano solú- vel (5 µg/mL) ou uma mistura de receptor de IL-6 humano solúvel e anticor-
po para receptor de IL-6 anti-humano (5 µg/mL e 0,1 mg/mL, respectivamen- te) foi administrada à veia caudal.
Neste momento, o anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano contra receptor de IL-6 humano solúvel existia em uma quantidade suficiente ou excessiva.
Desta maneira, é pensado que a maioria 5 dos receptores de IL-6 seres humanos solúveis se ligou ao anticorpo.
Amos- tras de sangue foram coletadas em 15 minutos, 7 horas e 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 e 28 dias após a administração.
As amostras de sangue obtidas foram ime- diatamente centrifugadas por 15 minutos a 4º C e 15.000 rpm para separar o plasma.
O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20º C ou menos até o momento da medição. (5-3) Determinação da concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel através de um método de eletroquimioluminescência Uma amostra de curva de calibragem de receptor de IL-6 huma- no solúvel preparada a 2.000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5 ou 31,25 pg/mL e uma amostra de medição do plasma de camundongo diluída 50 vezes ou mais foram misturadas com um anticorpo para IL-6R anti-humano monoclo- nal (R&D) rutenado com SULFO-MARCADOR NHS Ester (Meso Scale Dis- covery), um anticorpo para IL-6R anti-humano biotinilado (R&D), e tocilizu- mabe, seguido por reação de um dia para o outro a 37º C.
Tocilizumabe foi preparado em uma concentração final de 333 µg/mL.
Subsequentemente, o líquido de reação foi despejado em uma MA400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Ainda, após lavagem do líquido de reação que foi deixado reagir por 1 hora em temperatura ambiente, Read Buffer T (x4) (Meso Scale Discovery) foi despejado.
Subsequentemente, o líquido de reação foi imedia- tamente submetido à medição usando um leitor SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). A concentração de receptor de IL-6 humano solúvel foi calculada a partir da resposta da curva de calibragem usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo de concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel após administração intravenosa a camundongos trans- gênicos FcRn humano é mostrado na Fig. 40. O resultado do teste mostrou que a concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel perma-
neceu baixa com o tempo na presença de qualquer um dos anticorpos de ligação a receptor de IL-6 humano dependente do pH com ligação a FcRn humano aumentada sob condição neutra, comparado com na presença de Fv4-IgG1 que não tem quase nenhuma habilidade de ligação a FcRn huma- 5 no sob condição neutra.
Dentre outros, os anticorpos que produziram o efei- to notável incluem, por exemplo, Fv4-IgG1-F14. A concentração de receptor de Iil-6 humano solúvel no plasma simultaneamente administrado com Fv4- IgG1-F14 foi demonstrada ser reduzida em cerca de 54 vezes um dia após a administração comparado com aquela de receptor de IL-6 humano solúvel simultaneamente administrado com Fv4-IgG1. Ainda, a concentração de re- ceptor de IL-6 humano solúvel simultaneamente administrado com Fv4- IgG1-F21 foi demonstrada ser reduzida cerca de 24 vezes sete horas após administração comparado com aquela de receptor de IL-6 humano solúvel simultaneamente administrado com Fv4-IgG1. Ainda, a concentração de re- ceptor de IL-6 humano solúvel no plasma simultaneamente administrado com Fv4-IgG1-F25 sete horas após a administração estava abaixo do limite de detecção (1,56 ng/ml). Desta maneira, Fv4-IgG1-F25 era esperado permi- tir uma redução notável de 200 vezes ou mais na concentração de receptor de IL-6 humano solúvel com relação à concentração de receptor de IL-6 hu- mano solúvel simultaneamente administrado com Fv4-IgG1. As constatações descritas acima demonstram que o aumento da ligação a FcRn humano de anticorpos de ligação a antígeno dependente do pH sob uma condição neutra é altamente eficaz para aumento do efeito de eliminação de antígeno.
Entretanto, o tipo de alteração de aminoácido para aumentar a ligação a FcRn humano sob condição neutra, que é introduzida para aumentar o efeito de eliminação de antígeno, não é particularmente limitado: e tais alterações incluem aquelas mostradas na Tabela 16. O efeito de eliminação de antígeno pode ser previsto ser aumentado in vivo através de qualquer alteração introduzida.
Exemplo de Referência 6 Aquisição de anticorpos que se ligam a receptor de IL-6 de uma maneira dependente de Ca a partir da biblioteca de anticorpo humano usando tecnologia de exibição de fago
(6-1) Preparação de biblioteca de exibição de fago para anticor- pos humanos puros Uma biblioteca de exibição de fago para anticorpos humanos, consistindo em fagos múltiplos apresentando os domínios Fc de sequências 5 de anticorpo humano mutuamente diferentes, foi construída de acordo com um método conhecido daqueles de habilidade na técnica usando um RNA poli A preparado a partir de PBMC humana e RNA poli A humano comercial como um molde. (6-2) Aquisição de fragmentos de anticorpo que se ligam a antí- geno de uma maneira dependente de Ca a partir da biblioteca através de de separação de conta A biblioteca de exibição de fago construída para anticorpos hu- manos puros foi submetida à seleção inicial através de concentração apenas de fragmentos de anticorpo tendo uma habilidade de ligação a antígeno (re- ceptor de IL-6) ou concentração de fragmentos de anticorpo usando a habili- dade de ligação a antígeno (receptor de IL-6) dependente da concentração de Ca como um indicador.
A concentração de fragmentos de anticorpo u- sando uma habilidade de ligação a antígeno (receptor de IL-6) dependente da concentração de Ca como um indicador foi conduzida através da eluição dos fagos da biblioteca de fago ligados a receptor de IL-6 na presença de íons de Ca com EDTA que quela os íons de Ca.
Receptor de IL-6 biotinilado foi usado como um antígeno.
Os fagos foram produzidos a partir de Escherichia coli carregan- do o fagemídeo de exibição de fago construído.
Uma solução de biblioteca de fago foi obtida diluindo com TBS uma população de fago precipitada atra- vés da adição de NaCl 2,5M/PEG 10% à solução de cultura de E. coli em que os fagos foram produzidos.
Subsequentemente, BSA e CaCl2 foram adi- cionados à solução de biblioteca de fago em uma concentração final de BSA 4% e 1,2 mM de concentração de íon de cálcio.
Um método de de separa- ção comum usando um antígeno imobilizado em contas magnéticas foi refe- rido como um método de de separação (J.
Immunol.
Methods (2008) 332 (1- 2) 2-9; J.
Immunol.
Methods. (2001) 247 (1-2) 191-203; Biotechnol.
Prog.
(2002) 18(2) 212-20; Mol.
Cell Proteomics (2003) 2(2) 61-9). Contas revesti- das com NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads revestidas com NeutrAvidin) ou contas revestidas com estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidina) foram usadas como contas magnéticas. 5 Especificamente, 250 pmol do antígeno marcado com biotina fo- ram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada para permitir o contato da dita solução de biblioteca de fago com o antígeno por 60 minutos em temperatura ambiente.
Contas magnéticas, bloqueadas com BSA, foram adicionadas para se ligarem a complexos de antígeno-fago por 15 minutos em temperatura ambiente.
As contas foram lavadas uma vez com 1 mL de CaCl2 1,2 mM/TBS (TBS contendo 1,2 mM de CaCl2). Subsequentemente, uma solução de fago foi recuperada através de um método de eluição geral para concentrar um fragmento de anticorpo tendo uma habilidade de ligação a receptor de IL-6 ou através de eluição a partir de contas suspensas em 2 mM de EDTA/TBS (TBS contendo EDTA 2 mM) para concentrar um frag- mento de anticorpo usando habilidade de ligação de um receptor de IL-6 de uma maneira dependente da concentração de Ca como um indicador.
A so- lução de fago recuperada foi adicionada a 10 mL da linhagem de E. coli TG1 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600 de 0,4-0,7). A E. coli foi cul- turada com agitação suave a 37º C por 1 hora para permitir que os fagos infectassem a E. coli.
A E. coli infectada foi inoculada em uma placa de 225 mm x 225 mm). Subsequentemente, os fagos foram recuperados do meio de cultura da E. coli após inoculação para preparar uma solução de biblioteca de fago.
No segundo e subsequente separação, os fagos foram concen- trados usando a habilidade de ligação dependente de Ca como um indica- dor.
Especificamente, 40 pmol do antígeno marcado com biotina foram adi- cionados à solução de biblioteca de fago preparada para permitir o contato da biblioteca de fago com o antígeno por 60 minutos em temperatura ambi- ente.
Contas magnéticas, bloqueadas com BSA, foram adicionadas para serem ligadas a complexos de antígeno-fago por 15 minutos em temperatura ambiente.
As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 1,2 mM/TBST e Ca-
Cl2 1,2 mM/TBS.
Subsequentemente, as contas, às quais 0,1 mL de EDTA 2 mM/TBS foi adicionado, foram suspensas em temperatura ambiente.
Imedia- tamente depois disso, as contas foram separadas usando suporte magnético para coletar solução de fago.
A solução de fago recuperada foi adicionada a 5 10 mL da linhagem TG1 de E. coli em uma fase de crescimento logarítmico (OD600 de 0,4-0,7). A E. coli foi culturada com agitação suave a 37º C por 1 hora para permitir que os fagos infectassem a E. coli.
A E. coli infectada foi inoculada em uma placa de 225 mm x 225 mm.
Subsequentemente, os fa- gos foram recuperados do meio de cultura da E. coli após inoculação para coletar uma solução de biblioteca de fago.
A separação usando a habilidade de ligação dependente de Ca como um indicador foi repetido várias vezes. (6-3) Exame através de ELISA de fago Um sobrenadante de cultura contendo fago foi coletado de acor- do com um método de rotina (Methods Mol.
Biol (2002) 178, 133-145) a par- tir de uma única colônia de E. coli, obtida conforme acima descrito.
Um sobrenadante de cultura contendo fagos, ao qual BSA e CaCl2 foram adicionados em uma concentração final de BSA 4% e 1,2 mM de concentração de íon de cálcio, foi submetido a ELISA conforme descrito abaixo.
Uma placa de microtitulação de 96 cavidades Strepta (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 µL de PBS contendo o antígeno marcado com biotina.
Cada cavidade da dita placa foi lavada com PBST pa- ra remover o antígeno, e então as cavidades foram bloqueadas com 250 µL de BSA 4% - TBS por 1 hora ou mais.
A dita placa com o sobrenadante de cultura preparado adicionado a cada placa, do qual o BSA 4% - TBS foi re- movido, foi deixada descansar sem ser perturbada a 37º C por 1 hora, per- mitindo a ligação de anticorpo apresentando fago ao antígeno presente em cada cavidade.
A cada cavidade lavada com CaCl2 1,2 mM/TBST, CaCl2 1,2 mM/TBS ou EDTA 1 mM/TBS foi adicionado.
A placa foi deixada descansar sem ser perturbada por 30 minutos a 37º C para incubação.
Após lavagem com CaCl2 1,2 mM/TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amer- sham Pharmacia Biotech) diluído com TBS em uma concentração final de BSA 4% e 1,2 mM de concentração de cálcio ionizado foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi incubada por 1 hora.
Depois de lavagem com 1,2 mM de CaCl2/TBST, a reação cromogênica da solução em cada cavidade com uma solução única de TMB (ZYMED) adicionada foi parada através da adi- ção de ácido sulfúrico.
Subsequentemente, a dita cor foi medida através da 5 medição da absorbância a 450 nm.
Como um resultado do ELISA de fago acima, a sequência de base de um gene amplificado com primers específicos e um fragmento de anticorpo identificado como tendo uma habilidade de ligação a antígeno de- pendente de Ca como um molde foi analisada. (6-4) Expressão e purificação de anticorpo Como um resultado do ELISA de fafoacima, um clone identifica- do como tendo uma habilidade de ligação a antígeno dependente de Ca foi introduzido em um plasmídeo de expressão para células animais.
Os anti- corpos foram expressos conforme descrito abaixo.
A linhagem FreeStyle 293-F (Invitrogen) derivada de células de rim fetal humano foi suspensa no FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) seguido por inoculação de 3 mL em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades em uma densidade ce- lular de 1,33 x 106 células/mL.
O plasmídeo preparado foi introduzido nas células através de lipofecção.
As células foram culturadas por 4 dias em uma incubadora de CO2 (37º C, CO2 8%, 90 rpm). Os anticorpos foram purifica- dos a partir do sobrenadante de cultura obtido acima através de um método conhecido na técnica usando rProtein A Sepharose (marca registrada) Fast Flow (Amersham Biosciences). Absorbância da solução de anticorpo purifi- cada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro.
A concentração de anticorpo foi calculada a partir das medições obtidas usando um coeficiente de extinção calculado através do método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423). Exemplo de Referência 7 Exame da habilidade de ligação de- pendente de Ca dos anticorpos obtidos a receptor de IL-6 humano Para examinar se ou não as atividades de ligação de anticorpos 6RL#9-IgG1 [cadeia pesada (uma sequência de região constante derivada de IgG1 ligada à SEQ ID NO: 9) e cadeia leve (SEQ ID NO: 93)] e FH4-IgG1
[cadeia pesada (SEQ ID NO: 94) e cadeia leve (SEQ ID NO: 95)], obtidos no Exemplo de Referência 6, a receptor de IL-6 humano são dependentes de Ca, a análise cinética das reações de antígeno-anticorpo desses anticorpos com receptor de IL-6 humano foi conduzida usando Biacore T100 (GE Heal- 5 thcare). H54/L28-IgG1 [região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 96) e região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 97)], descrito no WO 2009/125825, foi usado como um anticorpo controle que não tem nenhuma atividade de ligação dependente de Ca a receptor de IL-6 humano.
A análise cinética das reações de antígeno-anticorpo foi conduzida em soluções com 2 mM e 3 µM de concentrações de íon de cálcio, ajustadas como condições de concentração de íon de cálcio alta e baixa, respectivamente.
O anticorpo de interesse foi capturado em um Sensor chip CM4 (GE Healthcare) no qual uma quantidade apropriada de Protein A (Invitrogen) foi imobilizada através do método de acoplamento de amina.
Dois tampões [ACES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05% (p/v) e CaCl2 2 mM (pH 7,4) ou ACES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05% (p/v) e 3 µmol/L de CaCl2 (pH 7,4)] foram usados como tampões de atividade.
Esses tampões foram usados para dilu- ição de receptor de IL-6 humano.
Todas as medições foram conduzidas a 37º C.
Na análise cinética de reação de antígeno-anticorpo usando an- ticorpo H54L28-IgG1, o anticorpo H54L28-IgG1 capturado no sensor chip foi deixado interagir com receptor de IL-6 através da injeção de um diluente de receptor de IL-6 e tampão de atividade (sem expressão) em uma taxa de fluxo de 20 µL/min por 3 minutos.
Subsequentemente, após a dissociação de receptor de IL-6 ter sido observada usando tampão de atividade em uma taxa de fluxo de 20 µL/min por 10 minutos, o senso chip foi regenerado atra- vés da injeção de glicina 10 mM-HCl (pH 1,5) em uma taxa de fluxo de 30 µL/min por 30 segundos.
Parâmetros cinéticos, constante de ligação (ka) (l/Ms) e constante de taxa de dissociação (kd) (l/s), foram calculados a partir dos sensorgramas obtidos na medição.
Esses valores foram usados para calcular a constante de dissociação (KD) (M) do anticorpo H54L28-IgG1 para receptor de IL-6 humano.
Cada parâmetro foi calculado usando o Biacore
T100 Evaluation Software (GE Healthcare). Na análise cinética de reação de antígeno-anticorpo usando an- ticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1, o anticorpo HF4-IgG1 ou 6RL#9-IgG1 cap- turado no sensor chip foi deixado interagir com receptor de IL-6 através da 5 injeção de um diluente de receptor de IL-6 e tampão de atividade (sem ex- pressão) em uma taxa de fluxo de 5 µL/min por 15 minutos.
Subsequente- mente, o sensor chip foi regenerado através da injeção de glicina 10 mM-HCl (pH 1,5) em uma taxa de fluxo de 30 µL/min por 30 segundos.
Constantes de dissociação (KD) (M) foram calculadas a partir dos sensorgramas obtidos na medição, usando o modelo de afinidade de estado uniforme.
Cada parâ- metro foi calculado usando o Biacore T100 Evaluation Software (GE Health- care). As constantes de dissociação (KD) entre cada anticorpo e receptor de IL-6 na presença de CaCl2 2 mM, determinadas através do método acima, são mostradas na Tabela 28. Tabela 28 Anticorpo
O valor KD do anticorpo H54/L28-IgG1 sob a condição de con- centração de Ca de 3 µM pode ser calculado da mesma maneira que na presença de concentração de Ca de 2 mM.
Sob a condição de concentração de Ca de 3 µM, anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1 foram raramente obser- vados estar ligados ao receptor de IL-6, desta maneira o cálculo de valores KD através do método descrito acima é difícil.
No entanto, os valores KD desses anticorpos sob a condição de concentração de Ca de 3 µM podem ser estimados usando a Fórmula 5 (Biacore T100 Software Handbook, BR- 1006-48, AE 01/2007) descrita no Exemplo 13. Os resultados aproximados de valores KD de constante de dis- sociação para os anticorpos e receptor de IL-6 em uma concentração de Ca de 3 µmol/L estimados usando Fórmula 3 descrita no Exemplo 13 são mos- trados na Tabela 29. Na Tabela 29, os valores Req, Rmax, RI e C são estima- dos com base no resultado do ensaio.
Tabela 29 Anticorpo
Com base nas constatações descritas acima, foi previsto que a KD entre receptor de IL-6 e anticorpo FH4-IgG1 ou anticorpo 6RL#9-IgG1 foi 5 aumentada em cerca de 60 ou 120 vezes (a afinidade foi reduzida em 60 ou 120 vezes ou mais) quando a concentração de CaCl2 no tampão foi diminuí- da de 2 mM para 3 µM.
A Tabela 30 sumariza os valores de KD em concen- trações de CaCl2 de 2 mM e 3 µM e a dependência de Ca para os três tipos de anticorpos H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1. Tabela 30 Anticorpo ou mais ou mais ou mais Dependente de Ca Cerca do mesmo Cerca de 60 vezes ou mais Cerca de 120 vezes ou mais
Nenhuma diferença na ligação do anticorpo H54/L28-IgG1 obtido ao receptor de IL-6 devido à diferença em concentração de Ca foi observa- da.
Por outro lado, a ligação de anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1 ao re- ceptor de IL-6 foi observada ser significantemente atenuada sob a condição da concentração de Ca baixa (Tabela 30). Exemplo de Referência 8 Exame de ligação de íon de cálcio ao anticorpo obtido Subsequentemente, a temperatura intermediária da desnatura- ção térmica (valor Tm) foi medida através de calorimetria de varredura dife- rencial (DSC) como um indicador para exame de ligação de íon de cálcio ao anticorpo (MicroCal VP-Capillary DSC.
MicroCal). A temperatura intermediá- ria de desnaturação térmica (valor Tm) é um indicador de estabilidade.
A temperatura intermediária de desnaturação térmica (valor Tm) se torna maior quando uma proteína é estabilizada através de ligação a íon de cálcio, com- parado com nenhuma ligação a íon de cálcio (J.
Biol.
Chem. (2008) 283, 37,
25140-25149). A atividade de ligação de íon de cálcio a anticorpo foi exami- nada através do exame de mudanças no valor de Tm do anticorpo depen- dendo das mudanças na concentração de íon de cálcio da solução de anti- corpo.
O anticorpo purificado foi submetido à diálise (EasySEP, TOMY) u- 5 sando uma solução externa de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM e CaCl2 2 mM (pH 7,4) ou Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM e CaCl2 3 µM.
Medição de DSC foi conduzida em uma taxa de aquecimento de 240º C/h de 20 a 115º C u- sando uma solução de anticorpo preparada em cerca de 0,1 mg/mL com o dialisato em uma substância de teste.
As temperaturas intermediárias de desnaturação térmica (valores Tm) dos domínios Fab de cada anticorpo, calculadas com base na curva de desnaturação obtida através de DSC, são mostradas na Tabela 31. Tabela 31
Anticorpo Concentração de íon de cálcio
A partir do resultado mostrado na Tabela 31, é indicado que os valores Tm do Fab dos anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1, que mostram uma habilidade de ligação dependente de cálcio, variaram com mudanças na concentração de íon de cálcio, enquanto os valores Tm do Fab do anti- corpo H54/L28-IgG1 que não mostra nenhuma habilidade de ligação depen- dente de cálcio não variaram com mudanças na concentração de íon de cál- cio.
A variação nos valores Tm do Fab dos anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9IgG1 demonstra que íons de cálcio se ligaram a esses anticorpos para estabilizar as porções Fab.
Os resultados acima mostram que íons de cálcio se ligaram aos anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1, enquanto nenhum íon de cálcio se ligou ao H54/L28-IgG1. Exemplo de Referência 9 Identificação de sítio de ligação a íon de cálcio em anticorpo 6RL#9 através de cristalografia de raios X
(9-1) Cristalografia de raios X Como descrito no Exemplo de Referência 8, as medidas da tem- peratura de desnaturação térmica Tm sugeriram que o anticorpo 6RL#9 se liga ao íon de cálcio.
Entretanto, não foi predita qual porção do anticorpo 5 6RL#9 se liga ao íon de cálcio.
Então, pelo uso da técnica da cristalografia com raios X, os resíduos de anticorpo 6RL#9 que interagem com o íon de cálcio foram identificados. (9-2) Expressão e purificação do anticorpo 6RL#9 O anticorpo 6RL#9 foi expresso e purificado por cristalografia com raios X.
Especificamente, plasmídeos de expressão em animal que fo- ram construídos para serem capazes de expressar a cadeia pesada (se- quência de região constante derivada de IgG1 foi ligada à SEQ ID NO: 9) e a cadeia leve (SEQ ID NO: 93) do anticorpo 6RL#9 foram introduzidos transito- riamente em células de animais.
Os plasmídeos construídos foram introduzi- dos pelo método da lipofecção em células FreeStyle 293-F (Invitrogen) deri- vadas de célula de rim fetal humano, suspensas em 800 ml do Meio de Ex- pressão FreeStyle 293 (Invitrogen) (densidade celular final: 1 x 106 célu- las/mL). As células com plasmídeo introduzido foram cultivadas em uma in- cubadora com CO2 (37°C, 8% de CO 2, 90 rpm) por cinco dias.
A partir do sobrenadante de cultura obtido como descrito acima, os anticorpos foram purificados por um método conhecido por aqueles versados na técnica u- sando rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences). A absor- bância a 280 nm dos anticorpos purificados foi medida usando um espectro- fotômetro.
As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valo- res medidos usando um coeficiente de extinção calculado pelo método PA- CE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423). (9-3) Purificação do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 O anticorpo 6RL#9 foi concentrado para 21 mg/ml usando um ul- trafiltro com um ponto de corte de peso molecular de 10.000 MWCO.
Uma amostra de 5 mg/mL de anticorpo (2,5 mL) foi preparada pela diluição da solução de anticorpo usando L-cisteína 4 mM / EDTA 5 mM / tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 6,5). 0,125 mg de papaína (Roche Applied Science)
foram adicionados à amostra.
Depois de agitar, a amostra foi incubada a 35ºC por duas horas.
Depois da incubação, um comprimido de Protease I- nhibitor Cocktail Mini, sem EDTA (Roche Applied Science) foi dissolvido em 10 ml de tampão MES 25 mM (pH 6) e adicionados a amostra.
A amostra foi 5 incubada em gelo para parar a reação proteolítica da papaína.
Depois, a amostra foi carregada em uma coluna de troca de cátion de 1 ml HiTrap SP HP (GE Healthcare) equilibrada com tampão MES 25 mM (pH 6), a jusante da qual uma coluna HiTrap MabSelect Sure Protein A de 1 ml (GE Healthca- re) foi conectada em tandem.
Uma fração purificada do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 foi obtida pela realização da eluição com um gradiente de concentração linear de NaCl até 300 mM no tampão descrito acima.
Depois, a fração purificada resultante foi concentrada para cerca de 0,8 ml usando um ultrafiltro 5000 MWCO.
O concentrado foi carregado em uma coluna de filtração em gel Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada com tampão HEPES 100 mM (pH 8) contendo NaCl 50 mM.
O fragmento Fab purificado do anticorpo 6RL#9 para cristalização foi eluído da coluna usando o mesmo tampão.
Todos os tratamentos de coluna descritos acima foram realizados em baixa temperatura de 6 a 7,5°C. (9-4) Cristalização do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na pre- sença de Ca Sementes de cristal do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 foram previamente preparadas sob condições gerais.
Depois, o fragmento Fab pu- rificado do anticorpo 6RL#9 em CaCl2 5 mM foi concentrado para 12 mg/ml com um ultrafiltro 5000 MWCO.
Depois, a amostra concentrada como descri- to acima foi cristalizada pelo método da difusão de vapor em gota pendente usando tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo 20% a 29% de PEG4000 como uma solução depósito.
As sementes de cristal acima mencionadas fo- ram trituradas em tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo 29% de PEG4000 e CaCl2 5 mM e diluídas serialmente para 100 a 10.000 vezes.
Depois, 0,2 µL das soluções diluídas foi combinado com uma mistura de 0,8 µl da solução depósito e 0,8 µl da amostra concentrada para preparar gotas de cristalização sobre uma lamínula de vidro.
As gotas de cristal foram dei-
xadas descansar a 20ºC por dois a três dias para preparar cristais seme- lhantes a placas finas.
Os dados de difração por raios X foram coletados u- sando os cristais. (9-5) Cristalização do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na au- 5 sência de Ca O fragmento Fab purificado do anticorpo 6RL#9 foi concentrado para 15 mg/ml usando um ultrafiltro 5000 MWCO.
Depois, a amostra con- centrada como descrito acima foi cristalizada pelo método da difusão de va- por em gota pendente usando tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) conten- do18% a 25% de PEG4000 como uma solução depósito.
Cristais do frag- mento Fab do anticorpo 6RL#9 obtido na presença de Ca foram triturados em tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo 25% de PEG4000 e diluídos serialmente para 100 a 10.000 vezes.
Depois, 0,2 µL das soluções diluídas foi combinado com uma mistura de 0,8 µl da solução depósito e 0,8 µl da amostra concentrada para preparar gotas de cristalização sobre uma lamínu- la de vidro.
As gotas de cristal foram deixadas descansar a 20ºC por dois a três dias para preparar cristais semelhantes a placas finas.
Os dados de di- fração por raios X foram coletados usando os cristais. (9-6) Medida cristalográfica com raios X do cristal de fragmento de Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca Cristais do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 preparados na presença de Ca foram imersos em solução de tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo PEG4000 35% e CaCl2 5 mM.
Pela remoção da solução exte- rior da superfície de um único cristal com uma microalça de náilon, o cristal isolado foi congelado em nitrogênio líquido.
Os dados de difração de raios X do cristal congelado foram coletados do feixe linear BL-17A da Photon Fac- tory na High Energy Accelerator Research Organization.
O cristal congelado foi mantido no estado congelado durante a medição pela sua colocação constante em um fluxo de gás nitrogênio a -178°C.
U m total de 180 imagens de difração foi coletado usando o detector de CCD Quantum315r (ADSC) acoplado ao feixe linear, enquanto girando o cristal em intervalos de 1º.
A determinação da constante do látice, indexação do ponto de difração e a análise dos dados de difração foram realizadas usando os programas Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) e Scala (CCP4 Software Suite). Finalmente, os dados de intensidade da difração para reso- lução de 22 Angstrons foram obtidos.
O cristal pertence ao grupo espacial 5 P212121 com estrutura constante a = 45,47 Angstrons, b = 79,86 Angstrons, c = 116,25 Angstrons, α = 90°, β = 90°, γ = 90°. (9-7) Medida cristalográfica com raios X do cristal de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca Cristais do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 preparados na ausência de Ca foram imersos em solução de tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo PEG4000 35%. Pela remoção da solução exterior da superfí- cie de um único cristal com uma microalça de náilon, o cristal único foi con- gelado em nitrogênio líquido.
Os dados de difração de raios X do cristal con- gelado foram coletados do feixe linear BL-5A da Photon Factory na High E- nergy Accelerator Research Organization.
O cristal congelado foi mantido no estado congelado durante a medição pela sua colocação constante em um fluxo de gás nitrogênio a -178°C.
Um total de 180 i magens de difração foi coletado usando o detector de CCD Quantum315r (ADSC) acoplado ao feixe linear, enquanto girando o cristal em intervalos de 1º.
A determinação da constante de látice, indexação do ponto de difração e a análise dos dados de difração foram realizadas usando os programas Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) e Scala (CCP4 Software Suite). Finalmen- te, os dados de intensidade da difração até a resolução de 2,3 Angstrons foram obtidos.
O cristal pertence ao grupo espacial P212121 com constante de látice a = 45,40 Angstrons, b = 79,63 Angstrons, c = 116,07 Angstrons, α = 90°, β = 90°, γ = 90° e, portanto, é estruturalmente idêntico ao c ristal pre- parado na presença de Ca. (9-8) Medida cristalográfica com raios X do cristal de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca A estrutura cristalina do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca foi determinada por um método de substituição molecular usando o programa Phaser (CCP4 Software Suite). O número de moléculas em uma unidade assimétrica foi estimado ser um a partir do tamanho do láti- ce do cristal e o peso molecular do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9. Com base na homologia de sequência primária, uma porção das posições de a- minoácidos 112 a 220 da cadeia A e uma porção das posições de aminoáci- 5 dos 116 a 218 da cadeia B na coordenada conformacional de PDB código 1ZA6 foram usadas como moléculas modelo para analisar as regiões CL e CH1. Depois, uma porção das posições de aminoácidos 1 a 115 da cadeia B na coordenada conformacional de PDB código 1ZA6 foi usada como molécu- la modelo para analisar a região VH.
Finalmente, uma porção das posições de aminoácidos 3 a 147 da cadeia leve na coordenada conformacional de PDB código 2A9M foi usada como molécula modelo para analisar a região VL.
Com base nessa ordem, um modelo estrutural inicial para o fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 foi obtido através da determinação das funções de translação e rotação das posições e orientações das moléculas modelo para análise no látice do cristal.
O fator de confiabilidade cristalográfico R para os dados de reflexão na resolução de 25 a 0,3 Angstrons foi de 46,9% e Free R foi de 48,6% depois do refinamento do corpo rígido em que os domínios VH, VL, CH1 e CL foram cada um deixados se desviar do modelo estrutural inici- al.
Depois, o refinamento do modelo foi obtido pela repetição do refinamento estrutural usando o programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) seguido pela revisão do modelo realizada usando o programa Coot (Paul Emsley) com referência aos mapas de densidade de elétron Fo-Fc e 2Fo-F em que os coeficientes Fo-Fc e 2Fo-Fc foram calculados usando o Fator Fo estrutural determinado experimentalmente, Fator Fc estrutural calculado com base no modelo e as fases.
O refinamento final foi realizado usando o programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) com referência aos mapas de densidade de elétron Fo-Fc e 2Fo-F pela adição de uma molécula de água e um íon de Ca no modelo.
Com dados de reflexão de 21,020 na resolução de 25 a 2,2 Angstrons, eventualmente o fator R de confiabilidade cristalográfica tornou- se 20,0% e R livre tornou-se 27,9% para o modelo que consiste em 3440 átomos. (9-9) Medida de dados de difração de raios X do cristal de frag-
mento Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca A estrutura cristalina do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca foi determinada com base na estrutura do cristal preparado na presença de Ca.
Moléculas de água e íon de Ca foram omitidas da coor- 5 denada conformacional do cristal do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 pre- parado na presença de Ca.
O fator de confiabilidade cristalográfica R para os dados de reflexão em uma resolução de 25 a 3,0 Angstrons foi de 30,3% e Free R era de 31,7% depois do refinamento do corpo rígido em que os domínios VH, VL, CH1 e CL foram cada um deixados desviar.
Depois, o refi- namento do modelo foi obtido pela repetição do refinamento estrutural usan- do o programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) seguido pela revisão do mo- delo realizada usando o programa Coot (Paul Emsley) com referência aos mapas de densidade de elétron Fo-Fc e 2Fo-F em que os coeficientes Fo-Fc e 2Fo-Fc foram calculados usando o Fator Fo estrutural determinado expe- rimentalmente, Fator Fc estrutural calculado com base no modelo e as fases.
O refinamento final foi realizado usando o programa Refmac5 (CCP4 Soft- ware Suite) com referência aos mapas de densidade de elétron Fo-Fc e 2Fo- F pela adição de uma molécula de água e um íon de Ca no modelo.
Com dados de reflexão de 18,357 em uma resolução de 25 a 2,3 Angstrons, even- tualmente o fator R de confiabilidade cristalográfica tornou-se 20.9% e R li- vre tornou-se 27,7% for para o modelo que consiste em 3351 átomos. (9-10) Comparação dos dados de difração cristalográfica com raios X dos fragmentos Fab do anticorpo 6RL#9 na presença e na ausência de Ca Quando as estruturas cristalográficas os fragmentos Fab do an- ticorpo 6RL#9 são comparadas na presença e na ausência de Ca, são vistas alterações significativas na CDR3 da cadeia pesada.
A estrutura da CDR3 da cadeia pesada do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 determinada pela cris- talografia por raios X é mostrada na Fig. 41. Especificamente, um íon de cál- cio residia no centro da região de alça da CDR3 da cadeia pesada do frag- mento Fab do anticorpo 6RL#9 preparado na presença de Ca.
O íon de cál- cio foi presumido interagir com as posições 95, 96 e 199 (numeração de Ka-
bat) da CDR3 da cadeia pesada.
Foi considerado que a alça de CDR3 da cadeia pesada que é importante para a ligação ao antígeno foi estabilizada pela ligação ao cálcio na presença de Ca e tornou-se uma estrutura ótima para a ligação a antígeno.
Não há nenhum relato que demonstre que o cál- 5 cio se ligue à CDR3 da cadeia pesada do anticorpo.
Portanto, a estrutura de ligação ao cálcio de CDR3 da cadeia pesada do anticorpo é uma estrutura nova.
O motivo de ligação a cálcio presente na CDR3 da cadeia pesa- da, revelado na estrutura do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9, pode tam- bém se tornar um elemento de projeto novo para a biblioteca de Ca.
Por e- xemplo, uma biblioteca contendo a CDR3 de cadeia pesada do anticorpo 6RL#9 e resíduos flexíveis em outras CDRs incluindo a cadeia leve é pensa- da ser possível.
Exemplo de Referência 10 Preparação de anticorpos que se li- gam à IL-6 de uma maneira dependente de Ca a partir de uma biblioteca de anticorpo humano usando técnicas de exibição de fago (10-1) Construção de uma biblioteca de exibição de fago de anti- corpos humanos puros Uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano con- tendo múltiplos fagos que exibem várias sequências de domínio Fab de anti- corpo humano foi construída através de método conhecido por aqueles ver- sados na técnica usando, como modelo, poli RNA preparado a partir de PBMC humana, poli RNA comercialmente disponível e etc. (10-2) Preparação de fragmentos de anticorpo que se ligam ao antígeno de uma maneira dependente de Ca a partir de uma biblioteca atra- vés de separação de conta A seleção primária da biblioteca de exibição de fago construída de anticorpos humanos puros foi realizada pelo enriquecimento de fragmen- tos de anticorpo que possuem atividade de ligação ao antígeno (IL-6). O an- tígeno usado foi IL-6 marcado com biotina.
Os fagos foram produzidos a partir de E. coli que carrega o fa- gemídeo construído para a exibição de fago.
Para precipitar os fagos produ-
zidos por E. coli, NaCl 2,5 M / PEG 10% foi adicionado ao meio de cultura de E. coli.
A fração de fago foi diluída com TBS para preparar uma solução de biblioteca de fago.
Depois, BSA e CaCl2 foram adicionados à solução de bi- blioteca de fago em concentrações finais de 4% e 1,2 mM de concentração 5 de íon de cálcio, respectivamente.
O método de separação usado foi um método de separação convencional que usa esferas magnéticas imobiliza- das com antígeno (J.
Immunol. methods. (2008) 332(1-2): 2-9; J.
Immunol. methods. (2001) 247(1-2): 191-203; Biotechnol.
Prog. (2002) 18(2): 212-20; Mol.
Cell Proteomics (2003) 2(2): 61-9). As contas magnéticas usadas eram contas revestidas com NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin- coated) e contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Strepta- vidin). Especificamente, 250 pmols do antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada.
Então, a solu- ção foi contatada com o antígeno em temperatura ambiente por 60 minutos.
As contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e o comple- xo antígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos.
As contas foram lavadas três vezes com CaCl2 1,2 mM /TBST (TBST contendo CaCl2 1,2 mM), e depois duas vezes com 1 ml de CaCl2 1,2 mM /TBST (TBST contendo CaCl2 1,2 mM). Depois, 0,5 ml de 1 mg/ml de tripsina foi adicionado às contas.
Depois de 15 minutos de disper- são em temperatura ambiente, as contas foram imediatamente separadas usando um suporte magnético para coletar uma suspensão de fago.
A sus- pensão de fago preparada foi adicionada a 10 ml de E. coli da linhagem TG1 na fase de crescimento logarítmico (OD600 = 0,4 a 0,5). A E. coli foi incubada com agitação cuidadosa a 37°C por uma hora para inf ectar os fagos.
A E. coli infectada foi semeada em uma placa (225 mm x 225 mm). Depois os fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
Na segunda rodada e separação subsequente, os fagos foram enriquecidos usando a atividade de ligação dependente de Ca como um in- dicador.
Especificamente, 40 pmol do antígeno marcado com biotina foram adicionados para preparar a solução de biblioteca de fago.
Então, a bibliote- ca de fago foi colocada em contato com o antígeno em temperatura ambien- te por 60 minutos.
As esferas magnéticas bloqueadas com BSA foram adi- cionadas e o complexo antígeno-fago foi deixado se ligar às esferas magné- 5 ticas em temperatura ambiente por 15 minutos.
As esferas foram lavadas com 1 ml de CaCl2 1,2 mM /TBST e CaCl2 1,2 mM /TBS.
Depois, 0,1 ml de EDTA 2mM/TBS foi adicionado às esferas.
Depois da dispersão em tempera- tura ambiente, as esferas foram imediatamente separadas usando um supor- te magnético para coletar uma suspensão de fago.
A proteína pIII (proteína pII derivada de fago auxiliar) foi clivada dos fagos que não exibiam Fab pela adição de 5 µl de tripsina 100 mg/ml à suspensão de fago coletada para eli- minar a habilidade dos fagos não apresentando Fab de infectar E. coli.
Os fagos coletados do estoque de fago líquido tripsinizado foram adicionados a 10 ml de células de E. coli da linhagem TG1 na fase de crescimento logarít- mico (OD600 = 0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação cuidadosa a 37°C por uma hora para infectar o fago.
A E. coli infectada foi semeada em uma placa (225 mm x 225 mm). Depois os fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar um estoque líquido de biblioteca de fago.
A separação foi realizada três vezes usando a atividade de ligação de- pendente de Ca como um indicador. (10-3) Avaliação através de ELISA de fago Sobrenadantes de cultura contendo fago foram coletados a partir de colônias isoladas de E. coli obtidas pelo método descrito acima de acordo com um método convencional (Methods Mol.
Biol. (2002) 178, 133-145). BSA e CaCl2 foram adicionados em concentrações finais de 4% e concen- tração de íon de cálcio 1,2 mM, respectivamente, aos sobrenadantes de cul- tura contendo fago.
Os sobrenadantes foram submetidos ao ELISA pelo seguinte procedimento.
Uma placa de microtitulação de 96 cavidades StreptaWell (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 µL de PBS contendo o antígeno marcado com biotina.
O antígeno foi removido pela lavagem de cada cavidade da placa com PBST.
Depois, as cavidades foram bloqueadas com 250 µl de BSA 4%-TBS por uma hora ou mais.
Depois da remoção de BSA 4%-TBS, os sobrenadantes de cultura preparados foram adicionados a cada cavidade.
A placa foi incubada a 37°C por uma hora tal que os fagos exibindo anticorpo foram deixados se ligar ao antígeno em cada cavidade. 5 Depois que cada cavidade foi lavada com CaCl21,2 mM/TBST, CaCl21,2 mM /TBS ou EDTA1 mM /TBS foi adicionado.
A placa foi deixada incubar a 37°C por 30 minutos.
Depois de lavar com CaCl21,2 mM/TBST, um anticorpo anti- M13 conjugado com HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS contendo BSA e íon de cálcio em concentrações finais de 4% e 1,2 mM de íon de cálcio foi adicionado a cada cavidade e a placa foi incubada por uma hora.
Depois de lavar com de CaCl2 1,2 mM/TBST, uma solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade.
A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi paralisada pela adição de ácido sulfúrico.
De- pois, a cor desenvolvida foi avaliada pela medição da absorbância a 450 nm.
A partir dos 96 clones isolados, o anticorpo 6KC4-1#85 tendo a- tividade de ligação à IL-6 dependente de Ca foi obtido através de ELISA de fago.
Usando os fragmentos de anticorpo que foram previstos ter uma ativi- dade de ligação ao antígeno dependente de Ca com base no resultado do ELISA de fago descrito acima como modelo, genes foram amplificados com primers específicos e suas sequências foram analisadas.
As sequências da região variável de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo 6KC4-1#85 são mostradas nas SEQ ID NOs: 10 e 98, respectivamente.
O polinucleotí- deo que codifica a região variável da cadeia pesada do anticorpo 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 10) foi ligado a um polinucleotídeo que codifica uma sequência derivada de IgG1 pelo método da PCR.
O fragmento de DNA resultante foi inserido em um vetor de expressão em célula animal para construir um vetor de expressão para a cadeia pesada de SEQ ID NO: 99. Um polinucleotídeo que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 98) foi ligado a um polinucleotídeo que codifica a região constante da cadeia Kappa natural (SEQ ID NO: 100) por PCR.
Um fragmento de DNA que codifica a sequência ligada mostrado na SEQ ID NO: 101 foi inserido em um vetor de expressão em célula animal.
Sequências das variantes constru-
ídas foram confirmadas através de um método conhecido daqueles versados na técnica. (10-4) Expressão e purificação de anticorpos O clone 6KC4-1#85 que foi previsto ter uma atividade de ligação 5 ao antígeno dependente de Ca com base no resultado de ELISA de fago foi inserido em plasmídeos de expressão em célula animal.
A expressão do an- ticorpo foi realizada pelo seguinte método.
Células FreeStyle 293-F (Invitro- gen) derivadas de rim fetal humano foram suspensas no FreeStyle 293 Ex- pression Medium (Invitrogen) e plaqueadas em uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml (3 ml) em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades.
Os plasmídeos preparados foram introduzidos nas células pelo método da lipofecção.
As células foram cultivadas por quatro dias em uma incubadora com CO2 (37°C, 8% CO 2, 90 rpm). Dos sobrenadantes da cultura, os anti- corpos foram purificados usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amer- sham Biosciences) pelo método conhecido por aqueles versados na técnica.
A absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purificado foi medida u- sando um espectrofotômetro.
As concentrações de anticorpo foram calcula- das a partir dos valores determinados usando um coeficiente de extinção calculado pelo método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). Exemplo de Referência 11 Avaliação do anticorpo 6KC4-1#85 quanto à ligação de íon de cálcio (11-1) Avaliação de anticorpo 6KC4-1#85 quanto à ligação de íon de cálcio Anticorpo de ligação a antígeno dependente de cálcio 6KC4- 1#85 que foi isolado da biblioteca de anticorpo humano foi avaliado quanto à sua ligação a cálcio.
Se o valor Tm medido varia dependendo da condição de concentração de cálcio ionizado foi avaliado através do método descrito no Exemplo de Referência 46. Os valores Tm para o domínio Fab de anticorpo 6KC4-1#85 são mostrados na Tabela 32. Conforme mostrado na Tabela 32, o valor Tm do domínio Fab de anticorpo 6KC4-1#85 variou dependendo da concentração de íon de cálcio.
Isso demonstra que anticorpo 6KC4-1/1#85 se liga a cálcio.
Tabela 32 Anticorpo Concentração de íon de cálcio
(11-2) Identificação de sítio de ligação a íon de cálcio em anti- corpo 6KC4-1#85 5 Conforme demonstrado em (11-1) do Exemplo de Referência 11, o anticorpo 6KC4-1#85 se liga a íon de cálcio.
No entanto, 6KC4-1#85 não tem um motivo de ligação a cálcio tal como a sequência hVk5-2 que foi reve- lada a partir da avaliação ter um motivo de ligação a cálcio.
Desta maneira, para identificar resíduos responsáveis pela ligação de íon de cálcio a anti- corpo 6KC4-1#85, cadeias pesadas alteradas (6_H1-11 (SEQ ID NO: 102), 6_H1-12 (SEQ ID NO: 103), 6_H1-13 (SEQ ID NO: 104), 6_H1-14 (SEQ ID NO:105), 6_H1-15 (SEQ ID NO: 106)) ou cadeias leves alteradas (6_L1-5 (SEQ ID NO: 107) e 6_L1-6 (SEQ ID NO: 108)) foram construídas substitu- indo um resíduo Asp (D) na CDR de anticorpo 6KC4-1#85 com um resíduo Ala (A) que não participa na ligação ou quelação de íon de cálcio.
Através do método descrito no Exemplo de Referência 6, anticorpos alterados foram purificados a partir dos sobrenadantes de cultura de células animais introdu- zidas com vetores de expressão carregando os genes de anticorpo alterado.
Os anticorpos alterados purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cálcio através do método descrito no Exemplo de Referência 46. O resultado da medição é mostrado na Tabela 33. Conforme mostrado na Tabela 33, substituição do resíduo na posição 95 ou 101 por um resíduo Ala (numera- ção de Kabat) na CDR3 de cadeia pesada de anticorpo 6KC4-1#85 resultou em perda da atividade de ligação a cálcio do anticorpo 6KC4-1#85. Isso su- gere que esses resíduos são responsáveis pela ligação a cálcio.
O motivo de ligação a cálcio presente ao redor da base da alça da CDR3 de cadeia pe- sada do anticorpo 6KC4-1#85, conforme revelado a partir das propriedades de ligação a cálcio do anticorpo 6KC4-1#85, pode também se tornar um no-
vo elemento de projeto para a biblioteca de Ca conforme descrito no Exem- plo de Referência 9. Em outras palavras, além de uma biblioteca com um motivo de ligação de cálcio introduzido na região variável de cadeia leve provida como um exemplo específico no Exemplo de Referência 20 e etc, uma biblioteca contendo o motivo de ligação de cálcio presente na, por e- xemplo, CDR3 de cadeia pesada do anticorpo 6KC4-1#85 e contendo resí- duos flexíveis em outros resíduos de aminoácido é possível.
Tabela 33 Cadeia Cadeia Resíduo alte- Concentração de pesada leve rado íon de cálcio
Tipo de selva- gem Posição 61 da cadeia H (numeração Kabat)
Posição 95 da cadeia H (numeração Kabat)
Posição 100a da cadeia H (numeração Kabat)
Posição 100g da cadeia H (numeração Kabat)
Posição 101 da cadeia H (numeração Kabat)
Posição 50 da cadeia L (numeração Kabat)
Posição 92 da cadeia L (numeração Kabat)
Exemplo de Referência 12 Exame de efeitos de anticorpo de li- gação dependente de Ca sobre retenção no plasma de antígeno usando 5 camundongos normais (12-1) Teste in vivo usando camundongos normais A um camundongo normal (camundongo C57BL/6J, Charles Ri- ver Japão), hsIL-6R (receptor de IL-6 humano solúvel preparado no Exemplo de Referência 3) sozinho foi administrado ou receptor de IL-6 humano solú- vel e anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano foram administrados simul- taneamente para examinar a cinética do receptor de IL-6 humano solúvel e anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano in vivo.
Uma dose única (10 mL/kg) da solução de receptor de IL-6 humano solúvel (5 µg/mL) ou uma mistura de receptor de IL-6 humano solúvel e anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano foi administrada na veia caudal.
O H54/L28-IgG1, o 6RL#9-
IgG1 e o FH4-IgG1 acima foram usados como anticorpos para receptor de IL-6 anti-humano.
A concentração de receptor de IL-6 humano solúvel em todas as misturas é 5 µg/mL.
As concentrações de anticorpo para receptor de IL-6 5 anti-humano variam com os anticorpos: 0,1 mg/mL para H54/L28-IgG1 e 10 mg/mL para 6RL#9-IgG1 e FH4-IgG1. Neste momento, foi pensado que a maioria dos receptores de IL-6 humano solúveis se liga ao anticorpo devido ao anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano contra receptor de IL-6 hu- mano solúvel existir em uma quantidade suficiente ou excessiva.
Amostras de sangue foram coletadas em 15 minutos, 7 horas e 1, 2, 4, 7, 14, 21 e 28 dias após a administração.
As amostras de sangue obtidas foram imediata- mente centrifugadas por 15 minutos a 4º C e 12.000 rpm para separar plas- ma.
O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para - 20º C ou menos até o momento da medição. (12-2) Determinação de concentração de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano no plasma em camundongos normais através de ELISA A concentração no plasma de anticorpo para receptor de IL-6 an- ti-humano em um camundongo foi determinada através de ELISA.
Primeiro, Fragmento de Anticorpo F(ab’)2 de IgG Anti-Humano (específico de cadeia γ) (SIGMA) foi despejado em uma Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge Nunc International) e foi deixado ficar sem ser perturbado de um dia para o outro a 4º C para preparar uma placa de fase sólida de IgG anti-humano.
Amostras de curva de calibragem em uma concentração no plasma de 0,64, 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02 ou 0,01 µg/mL e amostras de medição no plasma diluídas 100 vezes ou mais foram cada uma despejadas à placa de fase só- lida de IgG anti-humano, seguido por incubação por 1 hora a 25º C.
Subse- quentemente, a placa foi deixada reagir com um anticorpo para IL-6 R anti- humano biotinilado (R & D) por 1 hora a 25º C, seguido por reação com S- treptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) por 0,5 hora a 25º C.
A reação cromogênica foi conduzida usando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um substrato.
Depois da reação cromogênica ter sido parada através da adição de ácido sulfúrico
1N (Showa Chemical), absorbância a 450 nm da solução colorida foi medida usando um leitor de microplaca.
A concentração no plasma no camundongo foi calculada a partir da absorbância da curva de calibragem usando o soft- ware de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Mudanças nas con- 5 centrações no plasma dos anticorpos H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 e FH4- IgG1, os camundongos normais após administração intravenosa, medidas conforme acima descrito, são mostradas na Fig. 42. (12-3) Determinação da concentração de receptor de IL-6 huma- no solúvel no plasma através de um método de quimioluminescência A concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel em um camundongo foi determinada através de um método de quimiolumi- nescência.
Uma amostra de curva de calibragem de receptor de IL-6 huma- no solúvel preparada em 2.000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5 ou 31,25 pg/mL e uma amostra de medição no plasma de camundongo diluída 50 vezes ou mais foram misturadas com um anticorpo para IL-6R anti-humano monoclo- nal (R & D) rutenado com SULFO-MARCADOR NHS Ester (Meso Scale Dis- covery), um anticorpo para IL-6 R anti-humano biotinilado (R & D) e tocilizu- mabe (SEQ ID NO: 109 de cadeia pesada, SEQ ID NO: 83 de cadeia leve), seguido por reação de um dia para o outro a 4º C.
Neste momento, o tam- pão de ensaio continha EDTA 10 mM para reduzir a concentração de Ca li- vre na amostra e dissociar quase todos os receptores de IL-6 humano solú- veis na amostra de 6RL#9-IgG1 ou FH4-IgG1 a ser ligado ao tocilizumabe adicionado.
Subsequentemente, o dito líquido de reação foi despejado em uma MA400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Ainda, depois de lavagem de cada cavidade da placa que foi deixada reagir por 1 hora a 25º C, Read Buffer T (x4) (Meso Scale Discovery) foi despejado a cada cavida- de.
Imediatamente, o líquido de reação foi submetido à medição usando um leitor SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). A concentração de receptor para IL-6 humano solúvel foi calculada a partir da resposta da curva de cali- bragem usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Mudanças na concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel no camundongo normal após administração intravenosa, determinado con-
forme acima descrito, são mostradas na Fig. 43. Como resultado, o desaparecimento de receptor de IL-6 humano solúvel foi muito rápido quando receptor de IL-6 humano solúvel foi adminis- trado sozinho, enquanto o desaparecimento de receptor de IL-6 humano so- 5 lúvel foi significantemente retardado quando receptor de IL-6 humano solúvel foi administrado simultaneamente com H54/L28-IgG1, um anticorpo conven- cional não tendo nenhuma habilidade de ligação dependente de Ca a recep- tor de IL-6 humano solúvel.
Em contraste, o desaparecimento de receptor de IL-6 humano solúvel foi significantemente acelerado quando receptor de IL-6 humano solúvel foi administrado simultaneamente com 6RL#9-IgG1 ou FH4- IgG1 tendo 100 vezes ou mais habilidade de ligação dependente de Ca a receptor de IL-6 humano solúvel.
As concentrações no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel um dia após receptor de IL-6 humano solúvel ter si- do administrado simultaneamente com 6RL#9-IgG1 e FH4-IgG1 foram redu- zidas 39 vezes e 2 vezes, respectivamente, comparado com administração simultânea com H54/L28-IgG1. Desta maneira, os anticorpos de ligação de- pendentes de cálcio foram confirmados ser capazes de acelerar desapare- cimento de antígeno do plasma.
Exemplo de Referência 13 Testes para melhorar o efeito de ace- leração de eliminação de antígeno de anticorpo com ligação a antígeno de- pendente de Ca (preparação de anticorpos) (13-1) Com relação à ligação de anticorpo IgG a FcRn Os anticorpos IgG têm tempo de retenção no plasma mais longo como um resultado de ligação a FcRn.
A ligação entre IgG e FcRn é obser- vada apenas sob uma condição ácida (pH 6.0). Em contraste, a ligação é quase não detectável sob uma condição neutral (pH 7,4). Um anticorpo IgG é absorvido em células de uma maneira não específica.
O anticorpo retorna para a superfície celular através de ligação a FcRn endossomal sob a condi- ção ácida endossomal, e então dissocia de FcRn sob a condição neutra no plasma.
Quando a ligação a FcRn sob a condição ácida é perdida através da introdução de mutações na região Fc de IgG, o tempo de retenção de anti- corpo no plasma é notadamente prejudicado porque o anticorpo não recicla mais para o plasma a partir do endossomo.
Um método relatado para aperfeiçoamento de retenção no plasma de um anticorpo IgG é aumentar a ligação a FcRn sob condições ácidas.
Mutações de aminoácido são introduzidas em sua região Fc de um 5 anticorpo IgG para aperfeiçoar sua ligação a FcRn sob condições ácidas.
Isso aumenta a eficiência de reciclagem de anticorpo IgG para o plasma do endossomo, resultando em aperfeiçoamento da retenção no plasma de anti- corpo IgG.
Quando introduzindo substituição de aminoácido, é considerado importante não aumentar a ligação a FcRn sob condições neutras.
Anticor- pos IgG que se ligam a FcRn sob condições neutras podem retornar para a superfície celular através de ligação a FcRn sob a condição ácida do endos- somo, mas anticorpos IgG não dissociam do FcRn no plasma sob condições neutra e não são reciclados para o plasma, e então retenção no plasma de anticorpos IgG foi pensada ser inversamente prejudicada.
Por exemplo, conforme descrito por Dall’ Acqua e outros (J.
Im- munol. (2002) 169 (9), 5171-5180), a retenção no plasma do anticorpo IgG1 que foi deixado se ligar a FcRn de camundongo sob uma condição neutra (pH 7,4) foi exacerbada como um resultado de introdução de uma substitui- ção de aminoácido em um camundongo.
Ainda, conforme descrito por Yeung e outros, (J.
Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671), Datta-Mannan e outros (J.
Biol.
Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717) e Dall’ Acqua e outros (J.
Immu- nol. (2002) 169 (9), 5171-5180), variantes de anticorpo IgG1 cuja ligação a FcRn no plasma sob uma condição ácida (pH 6,0) é aperfeiçoada através da introdução de uma substituição de aminoácido são também observadas se ligar a FcRn humano sob uma condição neutra (pH 7,4). Notadamente, a retenção no plasma do dito anticorpo administrado a um macaco cinomólogo não foi aperfeiçoada, não mostrando nenhuma mudança na retenção no plasma.
Desta maneira, em tecnologia de engenharia de anticorpo para a- perfeiçoamento de funções do anticorpo, forma feitos esforços para aperfei- çoar a retenção no plasma de anticorpo através do aumento de sua ligação a FcRn humano sob condições ácidas sem aumentar sua ligação a FcRn humano sob uma condição neutra (pH 7,4). Em outras palavras, nenhum relato foi publicado sobre as vantagens de anticorpos IgG cuja ligação a F- cRn humano sob uma condição de neutra (pH 7,4) é aumentada através da introdução de substituições de aminoácido na região Fc.
Os anticorpos que se ligam a um antígeno de uma maneira de- 5 pendente de Ca são extremamente úteis porque eles têm um efeito de ace- leração do desaparecimento de antígeno solúvel e a ligação repetida de uma molécula de anticorpo única a antígeno solúvel.
Um método de aumento de ligação a FcRn sob uma condição neutra (pH 7,4) foi examinado como um método para aperfeiçoar mais o efeito de aceleração sobre desaparecimento de antígeno. (13-2) Preparação de anticorpos de ligação a receptor de IL-6 humano dependente de Ca tendo habilidade de ligação a FcRn sob condi- ções neutras Uma mutação de aminoácido foi introduzida nas regiões Fc de FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG tendo uma habilidade de ligação a antígeno depen- dente de cálcio e H54/L28-IgG1 não tendo nenhuma habilidade de ligação a antígeno dependente de cálcio (usado como um controle) para preparar va- riantes tendo uma habilidade de ligação a FcRn sob uma condição de pH neutro (pH 7,4). A mutação de aminoácido foi introduzida através de um mé- todo conhecido na técnica usando PCR.
Especificamente, FH4-N434W (SEQ ID NO: 110 de cadeia pesada, SEQ ID NO: 95 de cadeia leve), 6RL#9- N434W (SEQ ID NO: 111 de cadeia pesada, SEQ ID NO: 93 de cadeia leve) e H54-L28-N434W (SEQ ID NO: 112 de cadeia pesada, SEQ ID NO: 97 de cadeia leve) com Asn (um aminoácido na posição 434 representado por nu- meração EU) substituído por Trp na região constante de cadeia pesada de IgG1 foram preparados.
Um vetor de expressão de célula animal em que um polinucleotídeo codificando uma variante com a substituição de aminoácido foi inserido foi preparado usando o QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) através do método descrito nas instruções acompanhantes.
Expressão e purificação de anticorpo e medição de concentração foram conduzidas de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 6. Exemplo de Referência 14 Exame do efeito de aceleração do desaparecimento de anticorpos de ligação dependente de Ca usando ca- mundongos normais (14-1) Teste in vivo usando camundongos normais A um camundongo normal (camundongo C57BL/6J, Charles Ri- 5 ver Japão), hsIL-6R (receptor de IL-6 humano solúvel preparado no Exemplo de Referência 3) sozinho fio administrado ou receptor de IL-6 humano solú- vel e anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano foram administrados simul- taneamente para examinar a cinética do receptor de IL-6 humano solúvel e anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano in vivo.
Uma dose única (10 mL/kg) de solução de receptor de IL-6 humano solúvel (5 µg/mL) ou uma mistura de receptor de IL-6 humano solúvel e anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano foi administrada à veia caudal.
O H54/L28-N434W, o 6RL#9- N434W e o FH4-N434W foram usados como anticorpos para receptor de IL- 6 anti-seres humanos.
A concentração de receptor de IL-6 humano solúvel em todas as misturas é 5 µg/mL.
As concentrações de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano variam com os anticorpos: preparados a 0,042 mg/mL para H54/L28-N434W, 0,55 mg/mL para 6RL#9-N434W e 1 mg/mL para FH4- N434W.
Neste momento, foi pensado que a maioria dos receptores de IL-6 seres humanos solúveis se ligasse ao anticorpo porque o anticorpo para re- ceptor de IL-6 anti-humano contra receptor de IL-6 humano solúvel existe em uma quantidade suficiente ou excessiva.
Amostras de sangue foram coleta- das em 15 minutos, 7 horas e 1, 2, 4, 7, 14, 21 e 28 dias após a administra- ção.
As amostras de sangue foram imediatamente centrifugadas por 15 mi- nutos a 4º C e 12.000 rpm para separar o plasma.
O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20º C ou menos até o mo- mento da medição. (14-2) Determinação de concentração de anticorpo para receptor de IL-6 anti-humano em camundongos normais através de ELISA A concentração no plasma de anticorpo para receptor de IL-6 an- ti-humano em um camundongo foi determinada através de ELISA conforme descrito no Exemplo de Referência 12. Mudanças nas concentrações no plasma de anticorpos, H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W e FH4-N434W, nos camundongos normais após administração intravenosa medidas conforme descrito acima são mostradas na Fig. 44. (14-3) Determinação de concentração de receptor de IL-6 huma- 5 no solúvel no plasma através de um método de eletroquimioluminescência A concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel em um camundongo foi determinada através de um método de quimiolumi- nescência.
Uma amostra de curva de calibragem de receptor de IL-6 huma- no solúvel preparada em 2.000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5 ou 31,25 pg/mL e uma amostra de medição no plasma de camundongo diluída 50 vezes ou mais foram misturadas com um anticorpo para IL-6R anti-humano monoclo- nal (R & D) rutenado com SULFO-MARCADOR NHS Ester (Meso Scale Dis- covery) e um anticorpo para IL-6 R anti-humano biotinilado (R & D), seguido por reação de um dia para o outro a 4º C.
Neste momento, o tempão de en- saio continha EDTA 10 mM para reduzir a concentração de Ca livre na a- mostra e dissociar quase todos os receptores de IL-6 seres humanos solú- veis na amostra de 6RL#9-N434W ou FH4-N434W para existir em um esta- do livre.
Subsequentemente, o dito líquido de reação foi despejado em uma MA 400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Ainda, após lavagem de cada cavidade da placa que foi deixada reagir por 1 hora a 25º C, Read Buffer T (x4) (Meso Scale Discovery) foi despejado em cada cavidade.
Ime- diatamente, o líquido de reação foi submetido à medição usando um leitor SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). A concentração de receptor de IL- 6 humano solúvel foi calculada a partir da resposta da curva de calibragem usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Mudan- ças na concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel no ca- mundongo normal após administração intravenosa determinada conforme descrito acima são mostradas na Fig. 45. Como resultado, em comparação com a administração de recep- tor de IL-6 humano solúvel sozinho, administração simultânea de receptor de IL-6 humano solúvel com o anticorpo H54/L28-N434W que tem atividade de ligação a FcRn em pH 7,4 e não tem atividade de ligação dependente de Ca a receptor de IL-6 humano solúvel teve um desaparecimento retardado de receptor de IL-6 humano solúvel.
Em contraste, o desaparecimento de re- ceptor de IL-6 humano solúvel foi acelerado quando receptor de IL-6 huma- no solúvel foi administrado simultaneamente com o anticorpo 6RL#9-N434W 5 ou FH4-N434W que tem habilidade de ligação dependente de Ca 100 vezes ou mais a receptor de IL-6 humano solúvel e atividade de ligação a FcRn e pH 7,4, comparado com a administração de receptor de IL-6 humano solúvel sozinho.
As concentrações no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel um dia após receptor de IL-6 humano solúvel ter sido administrado simulta- neamente com o anticorpo 6RL#9-N434W ou FH4-N434W foram reduzidas 3 vezes e 8 vezes, respectivamente, comparado com a administração de re- ceptor de IL-6 humano solúvel sozinho.
Como resultado, foi confirmado que o desaparecimento de antígeno do plasma poderia ser acelerada mais for- necendo atividade de ligação a FcRn em pH 7,4 a um anticorpo que se liga a antígeno de uma maneira dependente de cálcio.
O anticorpo 6RL#9-IgG1 ou FH4-IgG1 tendo atividade de ligação dependente de Ca 100 vezes ou mais a receptor de IL-6 humano solúvel foi confirmado aumentar o desaparecimento de receptor de IL-6 humano solú- vel, comparado com o anticorpo H54/L28-IgG1 não tendo nenhuma atividade de ligação dependente de Ca a receptor de IL-6 humano solúvel.
O anticorpo 6RL#9-N434 ou FH4-N434W que tem atividade de ligação dependente de Ca 100 vezes ou mais a receptor de IL-6 humano solúvel e atividade de liga- ção a FcRn em pH 7,4 foi confirmado acelerar mais fortemente o desapare- cimento de receptor de IL-6 humano solúvel, comparado com a administra- ção de receptor de IL-6 humano solúvel sozinho.
Esses dados sugerem que um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente de Ca dissocia do antígeno no endossomo, similarmente a um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente do pH.
Exemplo de Referência 15 Exploração de sequências de linha- gem germinativa humana que se ligam a íon de cálcio (15-1) Anticorpo que se liga a antígeno de uma maneira depen- dente de cálcio
Os anticorpos que se ligam a um antígeno de uma maneira de- pendente de Ca (anticorpos de ligação a antígeno dependente de Ca) são aqueles cujas interações com antígeno mudam com concentração de cálcio.
Um anticorpo de ligação a antígeno dependente de Ca é pensado se ligar a 5 um antígeno através de íon de cálcio.
Desta maneira, aminoácidos que for- mam um epítopo no lado do antígeno são aminoácidos negativamente car- regados que podem quelar íons de cálcio ou aminoácidos que podem ser um aceitador de ligação hidrogênio.
Essas propriedades de aminoácidos que formam um epítopo permitem direcionamento de um epítopo que não molé- culas de ligação, que são gerados através da introdução de histidinas e liga- ção a um antígeno de uma maneira dependente do pH.
O uso de moléculas de ligação a antígeno tendo propriedades de ligação a antígeno dependen- tes de cálcio e pH é pensado permitir a formação de moléculas de ligação a antígeno que podem individualmente se ligar a vários epítopos tendo propri- edades amplas.
Desta maneira, se uma população de moléculas contendo motivo de ligação de cálcio (biblioteca de Ca) for construída, das quais mo- léculas de ligação a antígeno são obtidas, anticorpos de ligação a antígeno dependentes de Ca são pesados ser eficazmente obtidos. (15-2) Aquisição de sequências de linhagem germinativa huma- na Um exemplo da população de moléculas contendo um motivo de ligação de cálcio é um exemplo em que as ditas moléculas são anticorpos.
Em outras palavras, uma biblioteca de anticorpo contendo um motivo de li- gação de cálcio pode ser uma biblioteca de Ca.
Anticorpos que se ligam ao íon de cálcio contendo sequências da linhagem germinativa humana não foram descritos.
Portanto, as sequên- cias da linhagem germinativa de anticorpos que possuam sequências da linhagem germinativa humana foram clonadas usando como modelo um cD- NA preparado a partir de Human Fetal Spleen Poly RNA (Clontech) para avaliar se os anticorpos que possuem sequências da linhagem germinativa humana se ligam ao íon de cálcio.
Os fragmentos de DNA clonados foram inseridos em vetores de expressão em célula animal.
As sequências de nu-
cleotídeos dos vetores de expressão construídos foram determinadas atra- vés de um método conhecido por aqueles versados na técnica.
As SEQ IDs são mostradas na Tabela 34. Por PCR, os polinucleotídeos que codificam a SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3), SEQ ID NO: 5 8 (Vk4) e SEQ ID NO: 4 (Vk5) foram ligados a um polinucleotídeo que codifi- ca a região constante da cadeia Kappa natural (SEQ ID NO: 100). Os frag- mentos de DNA ligados foram inseridos em vetores de expressão em célula animal.
Adicionalmente, os polinucleotídeos que codificam as SEQ ID NO: 113 (Vk1), SEQ ID NO: 114 (Vk2), SEQ ID NO: 115 (Vk3), SEQ ID NO: 116 (Vk4) e SEQ ID NO: 117 (Vk5) foram ligados por PCR a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo (SEQ ID NO: 22) que possui uma deleção de dois aminoácidos no terminal C de IgG1. Os fragmentos de DNA resultantes foram inseridos em vetores de expressão em célula animal.
As sequências das variantes construídas foram confirmadas por um método conhecido por aqueles versados na técnica.
Tabela 34 Sequência de linha Cadeia pesa (região variável) Região variável de cadeia leve germinativa de cadeia
(15-3) Expressão e purificação de anticorpos Os vetores de expressão em célula animal construídos inseridos com os fragmentos de DNA que possuem cinco tipos de sequências da li- nhagem germinativa humana foram introduzidos em células de animais.
A expressão de anticorpo foi realizada pelo seguinte método.
Células FreeSt- yle 293-F (Invitrogen) derivadas de células de rim fetal humano foram sus- pensas no FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) e plaqueadas em uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml (3 ml) em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades . Os plasmídeos preparados foram introduzidos nas células pelo método da lipofecção.
As células foram cultivadas por qua- tro dias em uma incubadora com CO2 (37°C, 8% CO 2, 90 rpm). Dos sobre- nadantes da cultura preparados conforme acima descrito, os anticorpos fo-
ram purificados usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosci- ences) pelo método conhecido por aqueles versados na técnica.
A absor- bância a 280 nm das soluções de anticorpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro.
As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir 5 dos valores determinados usando um coeficiente de extinção calculado pelo método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (15-4) Avaliação de anticorpos que possuem sequências da li- nhagem germinativa humana quanto à sua atividade de ligação ao íon de cálcio Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ativida- de de ligação de íon de cálcio.
A temperatura intermediária de desnaturação térmica (valor Tm) foi medida através de calorimetria de varredura diferencial (DSC) como um indicador para exame de ligação de íon de cálcio ao anti- corpo (MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). A temperatura intermediária de desnaturação térmica (valor Tm) é um indicador de estabilidade.
Ela se torna maior quando uma proteína é estabilizada através de ligação a íon de cálcio, comparado com o caso em que nenhum íon de cálcio é ligado (J.
Bi- ol.
Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). A atividade de ligação de íon de cálcio a anticorpo foi avaliada através do exame de mudanças no valor Tm do anticorpo dependendo das mudanças na concentração de íon de cálcio na solução de anticorpo.
O anticorpo purificado foi submetido à diálise (E- asySEP, TOMY) usando uma solução externa de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM e CaCl2 2 mM (pH 7,4), ou Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM e CaCl2 3 µM (pH 7,4). Medição por DSC foi realizada em uma taxa de aquecimento de 240º C/h de 20 a 115º C usando como uma substância de teste uma solução de anticorpo preparada em cerca de 0,1 mg/mL com o dialisato.
As tempera- turas intermediárias de desnaturação térmica (valores Tm) do domínio Fab de cada anticorpo, calculadas a partir da curva de desnaturação obtida atra- vés de DSC, são mostradas na Tabela 35.
Tabela 35 Sequência de linha Concentração de íon de cálcio germinativa de ca- deia leve
Os resultados mostraram que os valores Tm dos domínios Fab de anticorpos tendo sequência Vk1, Vk2, Vk3 ou Vk4 não variaram depen- 5 dendo da concentração de íon de cálcio nas soluções contendo domínio Fab.
Entretanto, o valor Tm para o domínio Fab de anticorpo tendo a se- quência Vk5 variou dependendo da concentração de íon de cálcio na solu- ção contendo domínio Fab.
Isso demonstra que a sequência Vk5 se liga a íon de cálcio.
Exemplo de Referência 16 Avaliação da sequência Vk5 (hVk5) humana (16-1) Sequência hVk5 A única sequência hVk5 registrada no banco de dados de Kabat é a sequência hVk5-2. Daqui em diante, hVk5 e hVk5-2 são usadas sinoni- mamente.
O WO 2010/136598 revela que a razão de abundância da se- quência hVk5-2 na sequência de linhagem germinativa é 0,4%. Outros rela- tórios foram também feitos em que a razão de abundância da sequência hVK5-2 na sequência de linhagem germinativa é 0-0,06% (J.
Mol.
Biol. (2000) 296, 57-86; Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (2009) 106, 48, 20216-20221). Con- forme descrito acima, uma vez que a sequência hVk5-2 é uma sequência de frequência de aparecimento baixa na sequência de linhagem germinativa, ela foi pensada ser ineficiente para obter um anticorpo de ligação de cálcio a partir da biblioteca de anticorpo consistindo em sequências da linhagem germinativa humana ou células B obtidas através da imunização de um ca- mundongo expressando anticorpos humanos.
Desta maneira, foi considera- do possível projetar uma biblioteca de Ca contendo uma sequência de hVk5-
2 humana.
No entanto, realização da possibilidade é desconhecida porque nenhum relato foi publicado sobre as propriedades físicas da sequência hVk5-2. (16-2) Construção, expressão e purificação de uma forma não 5 glicosilada da sequência hVk5-2 A sequência hVk5-2 tem uma sequência para N glicosilação na posição de aminoácido 20 (numeração de Kabat). Cadeias de açúcar aco- pladas a proteínas exibem heterogeneidade.
Portanto, é desejável perder a glicosilação do ponto de vista da homogeneidade da substância.
Nesse con- texto, a variante hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 118), na qual o resíduo Asn (N) na posição 20 (numeração de Kabat) é substituído por Thr (T) foi construída.
A substituição de aminoácido foi realizada por um método conhecido por a- queles versados na técnica usando o QuikChange Site-Directed Mutagene- sis Kit (Stratagene). Um DNA que codifica a variante hVk5-2_L65 foi inserido em um vetor de expressão animal.
O vetor de expressão em animal inserido com o DNA construído que codifica a variante hVk5-2_L65, em combinação com um vetor de expressão em célula animal que possui um inserto para expressar CIM_H (SEQ ID NO: 117) como a cadeia pesada, foi introduzido nas células de animal pelo método descrito no Exemplo de Referência 6. O anticorpo compreendendo hVk5-2_L65 e CIM_H, que foi expresso em célu- las de animais introduzidas com vetores, foi purificado pelo método descrito no Exemplo de Referência 6. (16-3) Avaliação do anticorpo que possui a sequência hVk5-2 não glicosilada quanto a propriedades físicas O anticorpo isolado que possui a sequência hVk5-2_L65 modifi- cada foi analisado pela cromatografia de troca de ion para testar se ele é menos heterogêneo do que o anticorpo que possui a sequência hVk5-2 ori- ginal antes da modificação.
O procedimento de cromatografia de troca de íon é mostrado na Tabela 36. O resultado da análise mostrou que hVk5-2_L65 modificada no sítio da glicosilação era menos heterogênea do que a se- quência hVk5-2 original, como mostrada na Fig. 46.
Tabela 36 Condição Coluna Fase móvel
Programa de gradiente Temperatura de coluna Detecção Volume de injeção A seguir, foi avaliado pelo método descrito no Exemplo de Refe- rência 15 se o anticorpo que compreende a sequência hVk5-2_L65 menos 5 heterogênea se liga ao íon de cálcio.
O resultado mostrou que o valor de Tm para o domínio Fab do anticorpo que possui hVk5-2_L65 com o sítio de gli- cosilação alterado também variou dependendo das concentrações do íon de cálcio nas soluções de anticorpo, como mostrado na Tabela 37. Especifica- mente, foi demonstrado que o domínio Fab do anticorpo que possui hVk5- 2_L65 com o sítio de glicosilação alterado se liga a íon de cálcio.
Tabela 37
Cadeia leve Sequência glicolisada Concentração de íon de cálcio
Exemplo de Referência 17 Avaliação da atividade de ligação ao íon de cálcio de moléculas de anticorpo que possuem a sequência de CDR da sequência hVk5-2 (17-1) Construção, expressão e purificação de anticorpos modifi- cados que possuem uma sequência de CDR a partir da sequência hVk5-2 A sequência hVk5-2_L65 é uma sequência com aminoácidos al- terados em um sítio de glicosilação na estrutura da sequência Vk5-2 huma- na.
Como descrito no Exemplo de Referência 16, foi demonstrado que o íon de cálcio se liga mesmo depois da alteração do sítio de glicosilação.
Entre- tanto, do ponto de vista da imunogenicidade, é geralmente desejável que a sequência estrutural seja uma sequência da linhagem germinativa.
Portanto, os presentes inventores avaliaram se uma sequência estrutural de anticorpo poderia ser substituída por uma sequência estrutural de uma sequência da linhagem germinativa não glicosilada, enquanto mantendo a atividade de 5 ligação ao íon de cálcio do anticorpo.
Polinucleotídeos que codificam sequências quimicamente sinte- tizadas que compreendem uma sequência estrutural alterada da sequência hVk5-2 sequência, hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4 (CaVk1 (SEQ ID NO: 119), CaVk2 (SEQ ID NO: 120), CaVk3 (SEQ ID NO: 121) ou CaVk4 (SEQ ID NO: 122), respectivamente) foram ligados por PCR a um polinucleotídeo que co- difica a região constante (SEQ ID NO: 100) da cadeia Kappa natural.
Os fragmentos de DNA ligados foram inseridos em vetores de expressão em célula animal.
Sequências das variantes construídas foram confirmadas por um método conhecido por aqueles versados na técnica.
Cada plasmídeo construído como descrito acima foi introduzido em células de animal em combinação com um plasmídeo inserido com um polinucleotídeo que codifi- ca CIM_H de cadeia pesada (SEQ ID NO: 117) pelo método descrito no E- xemplo de Referência 6. As moléculas de anticorpo de interesse expressas foram purificadas do meio de cultura das células animais com os plasmídeos introduzidos. (17-2) Avaliação dos anticorpos alterados que possuem a se- quência de CDR da sequência de hVk5-2 quanto à sua atividade de ligação ao íon de cálcio Se íon de cálcio se liga a anticorpos alterados que possuem a sequência de CDR da sequência hVk5-2 e as sequências estruturais das sequências da linhagem germinativa diferentes de hVk5-2 (hVk1, hVk2, hVk3, and hVk4) foi avaliado pelo método descrito no Exemplo 6. O resulta- do da avaliação é mostrado na Tabela 38. O valor de Tm do domínio Fab de cada anticorpo alterado foi revelado variar dependendo da concentração de íon de cálcio nas soluções de anticorpo.
Isso demonstra que os anticorpos que possuem a sequência estrutural diferente das sequências estruturais da sequência hVk5-2 também se ligam a íon de cálcio.
Tabela 38 Linha germinativa Concentração de íon de cálcio (sequência de estru- tura de cadeia leve
A temperatura de desnaturação térmica (valor de Tm), como um indicador da estabilidade térmica, do domínio Fab de cada anticorpo alterado 5 para ter a sequência de CDR da sequência hVk5-2 e a sequência estrutural de uma sequência da linhagem germinativa diferente da sequência hVk5-2 (hVk1, hVk2, hVk3, ou hVk4) foi demonstrada ser maior que aquela do do- mínio Fab do anticorpo original que possui a sequência hVk5-2. Esse resul- tado mostra que anticorpos que possuem a sequência de CDR da sequência de hVk5-2 e a sequência estrutural da sequência hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4 não apenas possuem atividade de ligação a íon de cálcio, mas também são moléculas excelentes do ponto de vista da estabilidade térmica.
Exemplo de Referência 18 Identificação do sítio de ligação a íon de cálcio na sequência hVk5-2 da linhagem germinativa humana (18-1) Projeto do sítio de mutação na sequência de CDR da se- quência hVk5-2 Como descrito no Exemplo de Referência 17, os anticorpos que possuem a cadeia leve que resulta da introdução do domínio de CDR da sequência de hVk5-2 na sequência estrutural de uma sequência da linhagem germinativa diferente também foram demonstrados se ligar a íon de cálcio.
Esse resultado sugere que em hVk5-2 um sítio de ligação ao íon de cálcio está localizado dentro de sua CDR.
Aminoácidos que se ligam a íon de cál- cio, isto é, que quelam o íon de cálcio, incluem aminoácidos negativamente carregados e aminoácidos que podem ser aceitadores de ligação de hidro- gênio.
Então, foi testado se os anticorpos que possuem uma sequência de hVk5-2 mutante com uma substituição de um resíduo Asp (D) ou Glu (E) por um resíduo Ala (A) na sequência de CDR da sequência de hVk5-2 se ligam a íon de cálcio. (18-2) Construção de sequências hVk5-2 variantes com substitu- 5 ição de Ala e expressão e purificação de anticorpos As moléculas de anticorpo foram preparadas para compreender uma cadeia leve com uma substituição de um resíduo Asp e/ou Glu por um resíduo Ala na sequência de CDR da sequência de hVk5-2. Como descrito no Exemplo de Referência 16, a variante não glicosilada hVk5-2_L65 exibiu ligação a íon de cálcio e foi presumida ser equivalente à sequência hVk5-2 em termos de ligação a íon de cálcio.
Nesse Exemplo, as substituições de aminoácidos foram introduzidas em hVk5-2_L65 como uma sequência mo- delo.
As variantes construídas são mostradas na Tabela 39. As substituições de aminoácidos foram realizadas pelos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica tal como usando o QuikChange Site-Directed Mutage- nesis Kit (Stratagene), PCR, ou o In fusion Advantage PCR Cloning Kit (TA- KARA) para construir vetores de expressão para cadeia leves alteradas que possuam uma substituição de aminoácido.
Tabela 39 Nome de variante Posição alterada de cadeia leve (numeração Kabat)
Tipo selvagem
As sequências de nucleotídeos dos vetores de expressão cons-
truídos foram confirmadas através de um método conhecido por aqueles versados na técnica.
Os vetores de expressão construídos para as cadeias leves alteradas foram introduzidos transitoriamente, em combinação com um vetor de expressão para a cadeia pesada CIM_H (SEQ ID NO: 117), em cé- 5 lulas da linhagem HEK293H (Invitrogen) ou FreeStyle293 (Invitrogen) deri- vadas de célula de rim fetal humano para expressar os anticorpos.
Dos so- brenadantes de cultura obtidos, anticorpos foram purificados usando rProtein A SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare) por um método conhecido por aqueles versados na técnica.
A absorbância a 280 nm das soluções de anti- corpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro.
As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente de extinção calculado através do método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (18-3) Avaliação da atividade de ligação a íon de cálcio de anti- corpos que possuem uma substituição de Ala na sequência hVk5-2 Se os anticorpos purificados obtidos se ligam a íon de cálcio fo- ram testados através do método descrito no Exemplo de Referência 15. O resultado é mostrado na Tabela 40. Alguns anticorpos tendo substituição de um resíduo Asp ou Glu na sequência de CDR da sequência hVk5-2 com um resíduo Ala que não pode estar envolvido em ligação de íon de cálcio ou quelação foram revelados ter um domínio Fab cuja Tm não variou pela con- centração de íon de cálcio nas soluções de anticorpo.
Os sítios de substitui- ção em que substituição de Ala não alteraram a Tm (posições 32 e 92 (nu- meração de Kabat)) foram demonstrados ser muito importantes para a liga- ção de íon de cálcio-anticorpo.
Tabela 40 Nome da varian- Posição alteração Concentração de íon de cálcio te de cadeia leve (numeração Kabat)
Tipo selvagem
Exemplo de Referência 19 Avaliação da atividade de ligação a íon de cálcio de anticorpos tendo sequência hVk1 com motivo de ligação de 5 íon de cálcio (19-1) Construção de uma sequência hVk1 com motivo de liga- ção de íon de cálcio e expressão e purificação de anticorpos O resultado descrito no Exemplo de Referência 18 sobre a ativi- dade de ligação a íon de Ca do substituto de Ala demonstra que os resíduos Asp ou Glu na sequência de CDR da sequência hVk5-2 eram importantes para a ligação a cálcio.
Então, os presentes inventores avaliaram se um an- ticorpo pode se ligar ao íon de cálcio quando os resíduos nas posições 30, 31, 32, 50 e 92 (numeração de Kabat) sozinhos eram introduzidos em uma sequência da região variável da linhagem germinativa diferente.
Especifica- mente, a variante LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 131) foi construída pela substitui- ção dos resíduos nas posições 30, 31, 32, 50 e 92 (numeração de Kabat) na sequência hVk1 (uma sequência da linhagem germinativa humana) pelos resíduos nas posições 30, 31, 32, 50 e 92 (numeração de Kabat) na sequên- cia hVk5-2. Especificamente, foi testado se os anticorpos que possuem uma sequência hVk1 introduzida com apenas 5 resíduos da sequência hVk5-2 podem se ligar ao cálcio.
As variantes foram produzidas pelo mesmo método como descrito no Exemplo de Referência 17. A variante de cadeia leve resul- tante LfVk1_Ca e LfVk1 que possui a sequência de cadeia leve hVk1 (SEQ
ID NO: 132) foram co-expressas com a CIM_H de cadeia pesada (SEQ ID NO: 117). Os anticorpos foram expressos e purificados pelo mesmo método como descrito no Exemplo de Referência 18. (19-2) Avaliação da atividade de ligação ao íon de cálcio de anti- 5 corpos que possuem uma sequência hVk1 humana com motivo de ligação ao íon de cálcio Se o anticorpo purificado preparado como descrito acima se liga a íon de cálcio foi avaliado pelo método descrito no Exemplo de Referência
15. O resultado é mostrado na Tabela 41. O valor de Tm do domínio Fab do anticorpo que possui LfVk1 com uma sequência hVk1 não variou na depen- dência da concentração de cálcio nas soluções de anticorpo. Entretanto, a Tm do anticorpo que possui a sequência LfVk1_Ca foi alterada em 1°C ou mais depois da alteração na concentração de cálcio nas soluções de anti- corpo. Portanto, foi mostrado que o anticorpo que possui LfVk1_Ca se liga a cálcio. O resultado descrito acima demonstra que a sequência de CDR intei- ra de hVk5-2 não é necessária, já que os resíduos introduzidos para a cons- trução da sequência LfVk1_Ca sozinhos já são suficientes para a ligação a íon de cálcio. Tabela 41 Nome da variante Concentração de íon de cálcio de cadeia leve Exemplo de Referência 20 Projeto de uma população de molé- culas de anticorpo (biblioteca de Ca) com um motivo de ligação de íon de cálcio introduzido na região variável para obter eficazmente anticorpos de ligação que se ligam a antígeno de uma maneira dependente da concentra- ção de Ca Motivos de ligação de cálcio preferidos incluem, por exemplo, a sequência hVk5-2 e a sequência de CDR, bem como resíduos nas posições 30, 31, 32, 50 e 92 (numeração Kabat). Outros motivos de ligação de cálcio incluem o motivo EF-hand possuído por proteínas de ligação a cálcio (por exemplo, calmodulina) e lectina tipo C (por exemplo, ASGPR). A biblioteca de Ca consiste em regiões variáveis de cadeias pe- sada e leve.
Uma sequência de anticorpo humana foi usada para a região variável de cadeia pesada e um motivo de ligação de cálcio foi introduzido 5 na região variável de cadeia leve.
A sequência hVk1 foi selecionada como uma sequência modelo da região variável de cadeia leve para introdução de um motivo de ligação de cálcio.
Um anticorpo contendo uma sequência LfVk1_Ca obtida através da introdução da sequência de CDR de hVK5-2 (um dos motivos de ligação de cálcio) na sequência hVk1 foi mostrado se ligar a íons de cálcio, conforme mostrado no Exemplo de Referência 19. A- minoácidos múltiplos foram deixados aparecer na sequência modelo para diversificar moléculas de ligação a antígeno que constituem a biblioteca.
Po- sições expostas na superfície de uma região variável que é provável interagir com o antígeno foram selecionadas como aquelas em que aminoácidos múl- tiplos são deixados aparecer.
Especificamente, as posições 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 e 96 (numeração Kabat) foram selecionadas como re- síduos flexíveis.
O tipo e a frequência de aparecimento de resíduos de aminoáci- do que foram subsequentemente deixados aparecer foram determinados.
A frequência de aparecimento de aminoácidos nos resíduos flexíveis das se- quências hVk1 e hVk3 registradas no banco de dados Kabat (KABAT, E.A.
E OUTROS: ‘Sequences of proteins of immunological interest’, vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION) foi analisada.
Com base nos resultados da análise, o tipo de aminoácidos que eram deixados aparecer na biblioteca de Ca foi se- lecionado daqueles com frequência de aparecimento maior em cada posi- ção.
Neste momento, os aminoácidos cuja frequência de aparecimento foi determinada ser baixa com base nos resultados da análise foram também selecionados para evitar a tendência de propriedades de aminoácido.
A fre- quência de aparecimento dos aminoácidos selecionados foi determinada em referência aos resultados de análise do banco de dados Kabat.
Uma biblioteca de Ca contendo um motivo de ligação de cálcio com ênfase na diversidade de sequência de maneira a conter aminoácidos múltiplos em cada resíduo que não o motivo foi projetada como uma biblio- teca de Ca em consideração do conjunto de aminoácidos ácidos e frequên- cia de aparecimento conforme descrito acima.
Os projetos detalhados da biblioteca de Ca são mostrados nas Tabelas 1 e 2 (com as posições em ca- 5 da tabela representando a numeração EU). Ainda, se a posição 92 represen- tada pela numeração Kabat for Asn (N) para as frequências de aparecimento de aminoácidos conforme descrito nas Tabelas 1 e 2, a posição 94 pode ser Leu (L) ao invés de Ser (S). Exemplo de Referência 21 Preparação de biblioteca de Ca Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo foi amplificada através de PCR usando um RNA poli A prepara- do a partir de PBMC humana e RNA poli A humano comercial, etc, como um molde.
Conforme descrito no Exemplo de Referência 20, para as regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo, regiões variáveis de cadeia leve que aumentam a frequência de aparecimento de anticorpos que mantêm um mo- tivo de ligação de cálcio e podem se ligar a um antígeno de uma maneira dependente da concentração de cálcio foram projetadas.
Ainda, para resí- duos de aminoácido dentre os resíduos flexíveis que não aqueles com um motivo de ligação de cálcio introduzido, uma biblioteca de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo com aminoácidos uniformemente distribuídos de frequência de aparecimento alta em anticorpos humanos naturais foi proje- tada com referência à informação de frequência de aparecimento de amino- ácido em anticorpos humanos naturais (KABAT, E.A.
E OUTROS: "Sequen- ces of proteins of immunological interest’, Vol. 91, 1991. NIH PUBLICATION). Uma combinação das bibliotecas de gene de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo geradas conforme acima descrito foi inse- rida em um vetor fagemídeo para construir uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano que apresenta domínios Fab consistindo em se- quências de anticorpo humano (Methods Mol.
Biol. (2002) 178, 87-100). Pa- ra construção da biblioteca, uma porção de ligação conectando o Fab do fagemídeo à proteína pIII de fago e as sequências de uma biblioteca de exi- bição de fago com um sequência de clivagem de tripsina inserida entre os domínios N2 e CT do gene de proteína pIII de fago auxiliar foram usadas.
As sequências das porções de gene de anticorpo isoladas de E. coli, nas quais a biblioteca de gene de anticorpo foi introduzida, foram identificadas para obter informação de sequência para 290 clones.
A distribuição de aminoáci- 5 do projetada e a distribuição de aminoácido nas sequências identificadas são mostradas na Fig. 52. Uma biblioteca contendo várias sequências cor- respondendo à distribuição de aminoácido projetada foi construída.
Exemplo de Referência 22 Exame da atividade de ligação a íon de cálcio de moléculas contidas na biblioteca de Ca (22-1) Atividade de ligação a íon de cálcio de moléculas contidas na biblioteca de Ca Conforme descrito no Exemplo de Referência 14, a sequência hVk5-2 que foi demonstrada se ligar a íons de cálcio é uma sequência de frequência de aparecimento baixa na sequência de linhagem germinativa.
Desta maneira, ela foi considerada ser ineficiente para obter um anticorpo de ligação a cálcio a partir da biblioteca de anticorpo consistindo em sequências de linhagem germinativa humana ou de células B obtidas através de imuni- zação de um camundongo expressando anticorpos humanos.
Como resulta- do, uma biblioteca de Ca foi construída no Exemplo de Referência 21. A pre- sença ou a ausência de um clone mostrando ligação de cálcio à biblioteca de Ca construída foi examinada. (22-2) Expressão e purificação de anticorpos Os clones incluídos na biblioteca Ca foram inseridos nos plasmí- deos de expressão de célula animal.
Os anticorpos foram expressos através do método que segue.
Células derivadas de célula de rim fetal humano Fre- eStyle 293-F (Invitrogen) foram suspensas em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) e plaqueadas em uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml (3 ml) em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades.
Os plas- mídeos preparados foram introduzidos nas células através de um método de lipofecção.
As células foram culturadas por quatro dias em uma incubadora de CO2 (37º C, CO2 8%, 90 rpm). A partir dos sobrenadantes de cultura pre- parados conforme descrito acima, anticorpos foram purificados usando o rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences) através de um método conhecido daqueles versados na técnica.
Absorbância a 280 nm de soluções de anticorpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro.
As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores deter- 5 minados usando um coeficiente de extinção calculado através do método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423). (22-3) Avaliação de ligação de íon de cálcio dos anticorpos obti- dos Se ou não o anticorpo purificado obtido conforme acima descrito se liga a íons de cálcio foi determinado através do método descrito no E- xemplo de Referência 6. Os resultados são mostrados na Tabela 42. O valor Tm dos domínios Fab de anticorpos múltiplos contidos na biblioteca de Ca variou com a concentração de íon de cálcio, mostrando a presença de molé- culas de ligação a íon de cálcio.
Tabela 42 Anticorpo Concentração de cál- cio de íon Cadeia Cadeia leve pesada
Exemplo de Referência 23 Projeto de biblioteca de anticorpo de ligação dependente do pH
(23-1) Método para aquisição de anticorpos de ligação depen- dente do pH O WO 2009/125825 revela um anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH cujas propriedades são mudadas em regiões de pH neu- 5 tro e ácido através da introdução de uma histidina em uma molécula de liga- ção a antígeno.
O anticorpo de ligação dependente do pH revelado é obtido através de modificação para substituir uma parte da sequência de aminoáci- do da molécula de ligação a antígeno de interesse com uma histidina.
Para obter um anticorpo de ligação dependente do pH mais eficientemente sem preliminarmente obter a molécula de ligação a antígeno de interesse a ser modificada, um método pode ser obtenção de uma molécula de ligação a antígeno que se liga a um antígeno desejado a partir de uma população de moléculas de ligação a antígeno (referida como biblioteca His) com uma his- tidina introduzida na região variável (mais preferivelmente, uma região po- tencialmente envolvida em ligação de antígeno). Pode ser possível obter eficientemente uma molécula de ligação a antígeno tendo propriedades de- sejadas a partir de uma biblioteca de His, porque histidina aparece com mais frequência em moléculas de ligação a antígeno da biblioteca de His do que aquelas das bibliotecas de anticorpo convencionais. (23-2) Projeto de uma população de moléculas de anticorpo (bi- blioteca de His) com resíduo histidina introduzido na sua região variável para adquirir eficazmente anticorpos de ligação que se ligam a antígeno de uma maneira dependente do pH Primeiro, as posições para introdução de uma histidina foram se- lecionadas em uma biblioteca de His.
O WO 2009/125825 revela geração de anticorpos de ligação a antígeno dependente do pH através da substituição de resíduos de aminoácido nas sequências de receptor de IL-6, anticorpos para IL-6 e receptor de IL-31 com uma histidina.
Ainda, lisozima branca anti- ovo (FEBS Letter 11483, 309, 85-88) e anticorpos anti-hepcidina (WO 2009/139822) tendo uma habilidade de ligação a antígeno dependente do pH foram gerados através da substituição da sequência de aminoácido da molécula de ligação a antígeno com histidinas.
As posições em que histidi-
nas foram introduzidas no anticorpo para receptor de IL-6, anticorpo para IL- 6, anticorpo para receptor de IL-31, anticorpo para lisozima branca do ovo e anticorpo para hepcidina são mostradas na Tabela 43. As posições mostra- das na Tabela 43 podem ser listadas como posições candidatas que podem 5 controlar a ligação antígeno-anticorpo.
Ainda, além da posição mostrada na Tabela 43, as posições que são prováveis ter contato com antígeno foram também consideradas ser adequadas para introdução de histidinas.
Tabela 43 Anticorpo Cadeia Posição Anticorpo de receptor IL-6 Anticorpo IL-6
Anticorpo de recep- tor IL-31 Anticorpo de lisozima enquanto ovo Anticorpo de hepcidina
Na biblioteca de His consistindo nas regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve, uma sequência de anticorpo humano foi usada para a região variável de cadeia pesada e histidinas foram introduzidas na região variável de cadeia leve.
As posições listadas acima e posições que podem estar envolvidas em ligação de antígeno, isto é, posições 30, 32, 50, 53, 91, 92 e 93 (numeração Kabat, Kabat, E.A. e outros, 1991. ‘Sequence of Prote- ins of Immunological Interest’, NIH) na cadeia leve foram selecionadas nas posições para introdução de histidinas na biblioteca de His.
Ainda, a sequên- cia Vk1 foi selecionada como uma sequência modelo da região variável de cadeia leve para introdução de histidinas.
Aminoácidos múltiplos foram dei- xados aparecer na sequência modelo para diversificar moléculas de ligação a antígeno que constituem a biblioteca.
As posições expostas na superfície de uma região variável que é provável interagir com o antígeno foram sele- cionadas como aquelas em que aminoácidos múltiplos são deixados apare- cer.
Especificamente, as posições 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 e 96 da cadeia leve (numeração Kabat, Kabat, E.A. e outros, 1991, ‘Sequence of Proteins of Immunological Interest’. NIH) foram selecionadas como resíduos flexíveis.
O tipo e a frequência da aparência de resíduos de aminoácido que foram subsequentemente deixados aparecer foram determinados.
A fre- quência de aparecimento de aminoácidos nos resíduos flexíveis nas se- 5 quências hVk1 e hVk3 registradas no banco de dados Kabat (KABAT, E.A.
E OUTROS: ‘Sequences of proteins of immunological interest’, Vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION) foi analisada.
Com base nos resultados da análise, o tipo de aminoácidos deixados aparecer na biblioteca de His foi selecionado daqueles com frequência de aparecimento maior em cada posição.
Neste momento, os aminoácidos cuja frequência de aparecimento foi determinada ser baixa com base nos resultados da análise foram também selecionados para evitar a tendência de propriedades de aminoácido.
A frequência de apa- recimento dos aminoácidos selecionados foi determinada com referência aos resultados da análise do banco de dados Kabat.
Como bibliotecas de His, a biblioteca de His 1 que é fixada para necessariamente incorporar uma histidina única em cada CDR e biblioteca de His 2 que é mais enfatizada em diversidade de sequência do que a biblio- teca de His 1 foram projetadas levando em consideração o conjunto de ami- noácidos e frequência de aparecimento conforme descrito acima.
Os proje- tos detalhados das bibliotecas de His 1 e 2 são mostrados nas Tabelas 3 e 4 (com a posição em cada tabela representando a numeração Kabat). Ser (S) na posição 94 pode ser excluído se a posição 92 representada pela numera- ção Kabat for Asn (N) para a frequência de aparecimento de aminoácidos conforme descrito nas Tabelas 3 e 4. Exemplo de Referência 24 Preparação de uma biblioteca de exi- bição de fago para anticorpos humanos (biblioteca de His 1) para obter um anticorpo que se liga a antígeno de uma maneira dependente do pH Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo foi amplificada através de PCR usando um RNA poli A prepara- do a partir de PBMC humana e RNA poli A humano comercial como um mo- delo.
Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia leve de anticor- po projetada como biblioteca de His 1 conforme descrito no Exemplo 1 foi amplificada usando PCR.
Uma combinação das bibliotecas de gene de regi- ões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo conforme acima descrito foi inserida em um vetor de fagemídeo para construir uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano que apresente domínios Fab con- 5 sistindo em sequências de anticorpo humano.
Para o método de construção, Methods Mol.
Biol. (2002) 178, 87-100 foi usado como uma referência.
Para a construção da biblioteca, uma região ligante conectando o Fab de fagemí- deo à proteína pIII do fago e as sequências de uma biblioteca de exibição de fago com uma sequência de clivagem de tripsina inserida entre os domínios N2 e CT do gene da proteína pIII de fago auxiliar foram usadas.
Sequências das porções de gene de anticorpo isoladas de E. coli nas quais a biblioteca de gene de anticorpo foi introduzida foram identificadas, e informação de sequência foi obtida para 132 clones.
A distribuição de aminoácido projetada e a distribuição de aminoácido das sequências identificadas são mostradas na Fig. 53. Uma biblioteca contendo várias sequências correspondendo à distribuição de aminoácido projetada foi construída.
Exemplo de Referência 25 Preparação de uma biblioteca de exi- bição de fago de anticorpo humano (biblioteca de His 2) para obter anticor- pos que se ligam a antígeno de uma maneira dependente do pH Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo foi amplificada através de PCR usando um RNA poli A prepara- do a partir de PBMC humana e RNA poli A comercial como modelo.
Confor- me descrito no Exemplo de Referência 23, das porções de cadeia leve das regiões variáveis de anticorpo, aquelas com frequência de aparecimento maior de resíduos histidina tendo um potencial alto para serem uma região de contato de antígeno, são projetadas para aumentar a frequência de apa- recimento de anticorpos tendo uma habilidade de ligação a antígeno depen- dente do pH.
Ainda, para os resíduos de aminoácido que não aqueles com histidina introduzida dentre os resíduos flexíveis, uma biblioteca de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo com aminoácidos distribuídos unifor- memente de frequência de aparecimento alta identificados usando a infor- mação de frequência de aparecimento de aminoácido em anticorpos huma-
nos naturais é projetada.
Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo projetada conforme acima descrito foi sintetizada.
Uma biblioteca pode ser comercialmente sintetizada em uma base de con- signação.
Uma combinação das bibliotecas de gene de regiões variáveis de 5 cadeia pesada e cadeia leve geradas conforme acima descrito foi inserida em um vetor de fagemídeo para construir uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano que apresenta domínios Fab consistindo em sequên- cias de anticorpo humano através de um método conhecido (Methods Mol.
Biol. (2002) 178, 87-100). Uma porção de gene de anticorpo isolada de E. coli com uma biblioteca de gene de anticorpo introduzida foi sequenciada conforme descrito no Exemplo de Referência 24. Exemplo de Referência 26 Efeitos de combinação de modifica- ção de ligação seletiva a FcγRIIb com outras substituições de aminoácido da região Fc Foi feita uma tentativa de aumentar mais a seletividade para FcγRIIb modificando a variante com Pro na posição 238 (numeração EU) substituída por Asp que tem seletividade aperfeiçoada para FcγRIIb confor- me verificado no Exemplo 14. Primeiro, com relação a IL6R-G1d-v1 (SEQ ID NO: 80) que é ob- tido através da introdução da modificação de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) de IL6R-G1d com Asp, a variante IL6R-G1d-v4 (SEQ ID NO: 172) em que Leu na posição 328 (numeração EU) foi substituído por Glu para aumentar a seletividade para FcγRIIb conforme descrito no Exem- plo 14 foi preparada.
IL6R-G1d-v4 expresso em combinação com IL6R-L (SEQ ID NO: 83), que foi usado como a cadeia L, foi preparado conforme descrito no Exemplo de Referência 2. Um anticorpo tendo uma sequência de aminoácido derivada de IL6R-G1d-v4 como cadeia H de anticorpo obtido aqui é descrito como IgG1-v4. Atividades de ligação a FcγRIIb de IgG1, IgG2-v1, IgG1-v2 e IgG1-v4, examinadas conforme descrito no Exemplo 14, são mostradas na Tabela 44. Modificações na tabela representam aquelas introduzidas em IL6R-G1d.
Tabela 44 Variante para KD relativo para Alteração KD para para cadeia variante
A partir dos resultados da Tabela 44, uma vez que L328E melho- ra a atividade de ligação a FcγRIIb 2,3 vezes comparado com IgG1, sua 5 combinação com P238D que similarmente melhora a atividade de ligação a FcγRIIb em 4,8 vezes comparado com IgG1 foi antecipada aumentar mais o grau de aperfeiçoamento de atividade de ligação a FcγRIIb; no entanto, na realidade, a atividade de ligação a FcγRIIb da variante contendo uma combi- nação dessas alterações foi diminuída para 0,47 comparado com aquela de IgG1. Este resultado é um efeito que não poderia ser previsto a partir das respectivas alterações.
Similarmente, em IL6R-G1d-v1 (SEQ ID NO: 80) produzido in- troduzindo em IL6R-G1d a alteração produzida substituindo Pro na posição 238 (indicado por numeração EU) com Asp, as substituções de Ser na posi- ção 267 (indicada por numeração EU) com Glu e de Leu na posição 328 (in- dicada por numeração EU) com Phe conforme descrito no Exemplo 14 que aperfeiçoam a atividade de ligação a FcγRIIb foram introduzidas, e a varian- te IL6R-G1d-v5 (SEQ ID NO: 173) foi preparada de acordo com o método do Exemplo de Referência 2. O anticorpo obtido tendo a sequência de aminoá- cido derivada de IL6R-G1d-v5 como a cadeia H do anticorpo foi chamado IgG1-v5. As atividades de ligação a FcγRIIb de IgG1, IgG1-v1, IgG1-v3 e IgG1-v5 conforme avaliado de acordo com o método do Exemplo 14, são mostradas na Tabela 45. S267E/L328F que é a modificação com um efeito de aumento sobre FcγRIIb no Exemplo 14 foi introduzida na variante P238D.
Mudanças nas atividades de ligação a FcγRIIb antes e após introdução desta alteração são mostradas na Tabela 45.
Tabela 45
Kd para KD relativo para Variante Alteração Kd para para cada cadeia variante
A partir dos resultados da Tabela 45, uma vez que S267E/L328F 5 aperfeiçoa a atividade de ligação a FcγRIIb em 408 vezes comparado com IgG1, combinação dele com P238D que similarmente aperfeiçoa a atividade de ligação a FcγRIIb em 4,8 vezes comparado com IgG1 foi antecipada au- mentar mais o grau de aperfeiçoamento de atividade de ligação de FcγRIIb; no entanto, na realidade, de uma maneira similar ao primeiro exemplo, a ati- vidade de ligação a FcγRIIb da variante contendo uma combinação dessas alterações foi aperfeiçoada apenas 12 vezes ou mais comparado com aque- la de IgG1. Este resultado é também um efeito que não poderia ter sido pre- visto a partir dos efeitos das respectivas alterações.
Esses resultados mostraram que embora a substituição de Pro na posição 238 (indicada pela numeração EU) com Asp sozinha tenha aper- feiçoado a atividade de ligação a FcγRIIb, o efeito não é exibido quando ele é combinado com outras alterações que aperfeiçoam a atividade de ligação a FcγRIIb.
Uma razão para isso pode ser que a estrutura da interface para a interação entre Fc e FcγR é mudada através da introdução da substituição de Pro na posição 238 (indicada pela numeração EU) com Asp e os efeitos de alteração observados no anticorpo de ocorrência natural não são mais refletidos nos resultados.
Desta maneira, foi considerado ser extremamente difícil criar uma Fc com excelente seletividade para FcγRIIb usando uma Fc compreendendo substituição de Pro na posição 238 (indicado por numera- ção EU) com Asp como um modelo, uma vez que a a informação sobre efei- tos de alterações obtidos com anticorpos de ocorrência natural não pôde ser aplicada.
Exemplo de Referência 27 Análise compreensiva de ligação a FcγRIIb de variantes introduzidas com uma alteração na porção de dobra em adição à alteração de P238D Conforme mostrado no Exemplo de Referência 26, em uma Fc produzido substituindo Pro na posição 238 (indicado por numeração EU) com Asp em um IgG1 humano de ocorrência natural, um efeito combinatorial 5 antecipado não pôde ser obtido mesmo combinando-o com outra alteração prevista aumentar mais a ligação a FcγRIIb a partir da análise de anticorpos de ocorrência natural.
Desta maneira, a fim de encontrar variantes que au- mentem mais a ligação a FcγRIIb, modificações foram compreensivamente introduzidas no Fc alterado produzido substituindo Pro na posição 238 (indi- cado pela numeração EU) com Asp.
IL6R-F11 (SEQ ID NO: 174) foi produzi- do através da introdução de uma alteração de substituição de Met na posi- ção 252 (indicado por numeração EU) com Tyr e uma alteração de substitui- ção de Asn na posição 434 (indicado por numeração EU) com Tyr em IL6R- G1d (SEQ ID NO: 79) que foi usado como a cadeia H de anticorpo.
Ainda, IL6R-F652 (SEQ ID NO: 175) foi preparado através da introdução de uma alteração de substituição de Pro na posição 238 (indicado pela numeração EU) com Asp em IL6R-F11. Plasmídeos de expressão contendo uma se- quência de cadeia H de anticorpo foram preparados para cada uma das se- quências de cadeia H de anticorpo produzidas através de substituição da região próximo do resíduo na posição 238 (indicado pela numeração EU) (posições 234 a 237 e 239 (indicado por numeração EU)) em IL6R-F652 ca- da uma com 18 aminoácidos excluindo os aminoácidos originais e Cys.
IL6R-L (SEQ ID NO: 83) foi utilizado como uma cadeia L de anticorpo co- mum para todos os anticorpos.
Essas variantes foram expressas e purifica- das através do método do Exemplo de Referência 2. Essas variantes de Fc são chamadas variantes de PD.
Interações de cada variante de PD com FcγRIIa tipo R e FcγRIIb foram compreensivamente avaliadas através do método do Exemplo 14. Uma Fig. que mostra os resultados de análise da interação com os respectivos FcγRs foi produzida de acordo com o método que segue.
O valor obtido dividindo o valor para a quantidade de ligação de cada variante de PD para cada FcγR pelo valor da quantidade de ligação a Fcγ do anticor-
po pré-alterado que é usado como o controle (IL6R-F652/IL6R-L, que tem uma alteração de substituição de Pro na posição 238 (indicado por numera- ção EU) com Asp e então multiplicando o resultado por 100, foi mostrado como o valor de atividade de ligação relativo de cada variante de PD a cada 5 FcγR.
O eixo horizontal mostra valores relativos da atividade de ligação a FcγRIIb de cada variante de PD, e o eixo vertical mostra valores relativos dos valores de atividade de ligação a FcγRIIa tipo R de cada variante de PD (Fig. 55). Como resultado, foi constatado que a ligação a FcγRIIb de onze tipos de alterações foi aumentada comparado com o anticorpo antes da in- trodução das alterações, e elas têm o efeito de manter ou aumentar a liga- ção a FcγRIIa tipo R.
As atividades dessas onze variantes em se ligar a FcγRIIb e FcγRIIa R são sumarizadas na Tabela 46. Na tabela, SEQ ID NO: se refere à SEQ ID NO: da cadeia H da variante avaliada e alteração se refe- re à alteração introduzida em IL6R-F11 (SEQ ID NO: 174). Tabela 46 Nome da va- Alteração Atividade de liga- Atividade de liga- ção relativa ção relativa riante
A Fig. 56 mostra valores relativos para a atividade de ligação a FcγRIIb obtida introduzindo adicionalmente as onze alterações acima em uma variante carregando a alteração P238D e valores relativos para a ativi- dade de ligação a FcγRIIb de uma variante obtida através da introdução das alterações em uma Fc que não contém a P238D.
Essas onze alterações aumentaram a quantidade de ligação a FcγRIIb comparado com antes da introdução quando elas foram introduzidas ainda na variante P238D.
Ao con-
trário, o efeito de diminuição de ligação a FcγRIIb foi observado para oito dessas alterações exceto G237F, G237W e S239D, quando elas foram intro- duzidas na variante que não contém P238D (GpH7-B3/GpL 16-k0) usada no Exemplo 14. O Exemplo de Referência 26 e esses resultados mostraram 5 que, com base nos efeitos de introdução de alterações em um IgG1 de ocor- rência natural, é difícil prever o efeito de combinação e introdução das mes- mas alterações na variante contendo a alteração P238D.
Em outras pala- vras, não seria possível constatar essas oito alterações identificadas desta vez sem esta investigação que introduz as mesmas alterações combinadas e introduzidas na variante contendo a alteração P238D.
Os resultados de medição dos valores KD das variantes indica- das na Tabela 46 para FcγRIa, FcγRIIar, FcγRIIaH, FcγRIIb e FcγRIIIaV a- través do método do Exemplo 14 são sumarizados na Tabela 47. Na tabela, SEQ ID NO: se refere à SEQ ID NO: da cadeia H da variante avaliada, e a alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-F11 (SEQ ID NO: 174). O modelo usado para produção de IL6R-F11, IL6R, G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Ainda, KD(IIaR)/KD(IIb) e KD(IIaH)/KD(IIb) na tabela, respectivamente, mostram o valor obtido dividindo o valor KD de cada vari- ante para FcγRIIaR pelo valor KD de cada variante para FcγRIIb, e o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcγRIIaH pelo valor KD de cada variante para FcγRIIb.
KD(IIb) do polipeptídeo parental / KD(IIb) do po- lipeptídeo alterado se refere a um valor obtido dividindo o valor KD do poli- peptídeo parental para FcγRIIb pelo valor KD de cada variante para FcγRIIb.
Ainda, a Tabela 47 mostra valores KD para a mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH de cada variante / valores KD para a mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH do polipeptídeo pa- rental.
Aqui, polipeptídeo parental se refere a uma variante que tem IL6R- F11 (SEQ ID NO: 27) como a cadeia H.
Foi determinado que devido à liga- ção fraca de FcγR a IgG1, era impossível analisar com precisão através de análise cinética e então as células cheias em cinza na Tabela 47 mostram valores calculados usando a Equação 5 do Exemplo 14.
Equação 5 KD = C x Rmax / (Req – RI) – C A Tabela 47 mostra que todas as variantes aperfeiçoaram sua a- finidade com FcγRIIb em comparação com IL6R-F11, e a faixa de aperfeiço- 5 amento foi 1,9 vez a 5,0 vezes.
A razão de valor KD de cada variante para FcγRIIaR / valor KD de cada variante para FcγRIIb e a razão do valor KD de cada variante para FcγRIIaH / valor KD de cada variante para FcγRIIb repre- sentam uma atividade de ligação a FcγRIIb com relação à atividade de liga- ção a FcγRIIaR e atividade de ligação a FcγRIIaH, respectivamente.
Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcγRIIb e um valor maior indica uma seletividade de ligação maior para FcγRIIb.
Para o polipeptídeo parental IL6R-F11/IL6R-L, a razão de valor KD para FcγRIIaR / valor KD para FcγRIIb e a razão de valor KD para FcγRIIaH / valor KD para FcγRIIb são ambas 0,7 e, então, todas as variantes na Tabe- la 47 mostraram aperfeiçoamento de seletividade de ligação para FcγRIIb em comparação com o polipeptídeo parental.
Quando o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH de uma variante / valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH do polipeptídeo parental é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das ati- vidades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH de uma variante tem ligação e- quivalente ou reduzida comparado com a ligação pelas atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH do polipeptídeo parental.
Uma vez que esse valor foi 0,7 a 5,0 para as variantes obtidas desta vez, poderia ser dito que ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH das varian- tes obtidas desta vez foi quase igual ou menor em comparação com o poli- peptídeo parental.
Esses resultados mostraram que comparado com o poli- peptídeo parental, as variantes obtidas desta vez mantiveram ou diminuíram atividades de ligação a FcγRIIa tipo R e tipo H e aperfeiçoaram a seletivida- de para FcγRIIb.
Ainda, comparado com IL6R-F11, todas as variantes tinham afinidade menor com FcγRIa e FcγRIIIaV.
Tabela 47
Exemplo de Referência 28 Análise cristalográfico por raios X de um complexo formado entre uma Fc contendo P238D e uma região extrace- 5 lular de FcγRIIb Conforme indicado antes no Exemplo de Referência 27, mesmo uma alteração que é prevista a partir da análise de anticorpos IgG1 de ocor- rência natural aperfeiçoar a atividade de ligação a FcγRIIb ou seletividade para FcγRIIb sendo introduzida em uma Fc contendo P238D, a atividade de ligação a FcγRIIb foi verificada diminuir, e a razão para isso pode ser que a estrutura na interface de interação entre Fc e FcγRIIb é mudada devido à introdução de P238D.
Desta maneira, para obter a razão para este fenôme- no, a estrutura tridimensional do complexo formado entre uma Fc de IgG1 contendo a mutação P238D (daqui em diante Fc(P238D)) e a região extrace- lular de FcγRIIb foi elucidada através de análise cristalográfica de raios X e esta foi comparada com a estrutura tridimensional do complexo formado en- tre o Fc de um IgG1 de ocorrência natural (daqui em diante, Fc(WT)) e a re- gião extracelular de FcγRIIb e os modos de ligação foram comparados.
Re- latórios múltiplos foram feitos sobre a estrutura tridimensional de um com- plexo formado entre uma Fc e uma região extracelular de FcγR; e as estrutu-
ras tridimensionais do complexo de Fc(WT) / região extracelular de FcγRIIB (Nature, 2000, 400; 267-273; J.
Biol.
Chem. 2011, 276: 16469-16477), o complexo de Fc(WT) / região extracelular de FcγRIIIa (Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA, 2011, 108: 12669-126674) e o complexo de Fc(WT) / região extracelu- 5 lar de FcγRIIa (J.
Immunol. 2011, 187: 3208-3217) foram analisadas.
Embo- ra a estrutura tridimensional do complexo de Fc(WT) / região extracelular de FcγRIIb não tenha sido analisada, a estrutura tridimensional de um complexo formado com Fc(WT) é conhecida para FcγRIIa, e as regiões extracelulares de FcγRIIa e FcγRIIb são 93% compatíveis em sequência de aminoácido e têm homologia muito alta.
Desta maneira, a estrutura tridimensional do com- plexo Fc(WT) / região extracelular de FcγRIIb foi prevista através de mode- lagem usando a estrutura de cristal do complexo de Fc(WT) / região extrace- lular de FcγRIIa.
A estrutura tridimensional do complexo Fc(238D) / região extra- celular de FcγRIIb foi determinada através de análise cristalográfica de raios X em resolução de 2,6 Å.
A estrutura obtida como um resultado esta análise é mostrada na Fig. 57. A região extracelular de FcγRIIb é ligada entre dois dominós CH2 Fc e isso era similar às estruturas tridimensionais de comple- xos formados entre Fc(WT) e a respectiva região extracelular de FcγRIIIa, FcγRIIb ou FcγRIIa analisada até agora.
Em seguida, para comparação detalhada, a estrutura de cristal do complexo Fc(P238D) / região extracelular FcγRIIb e a estrutura modelo do complexo de Fc(238D) / região extracelular de FcγRIIb foram superpostas através do ajuste de quadrados mínimos nas distâncias de par de átomo Cα com relação à região extracelular de FcγRIIb e o domínio A CH2 Fc (Fig. 58). Neste caso, o grau de sobreposição entre domínios B CH Fc não foi satisfa- tório, e diferenças conformacionais foram encontradas nesta porção.
Ainda, usando a estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb e a estrutura modelo do complexo de Fc(WT) / região extracelu- lar de FcγRIIb, pares de átomos que têm uma distância de 3,7 Å ou menos entre a região extracelular de FcγRIIb extraída e domínio B CH2 Fc foram extraídos e comparados a fim de comparar a interação interatômica entre
FcγRIIb e domínio B CH2 Fc (WT) com a interação interatômica entre FcγRI- Ib e Fc(P238D). Conforme mostrado na Tabela 48, as interações interatômi- cas entre domínio B CH2 Fc e FcγRIIb em Fc(P238D) e Fc(WT) não eram compatíveis. 5 Tabela 48 Parceiro de interação Fc(P648D) Parceiro de interação Fc(WT) Átomo de Fcγ RIIb CH2 de domínio B (distância entre CH2 de domínio B (distância átomos Å entre átomos Å)
Ainda, as estruturas detalhadas em torno de P238D foram com- paradas através de superposição da estrutura de cristal de raios X do com- plexo Fc (P238D) / domínio extracelular de FcγRIIb na estrutura modelo do complexo de Fc (WT) / domínio extracelular de FcγRIIb usando o método de quadrados mínimos com base na distância atômica Cα entre os domínios A e B CH2 Fc sozinhos.
Uma vez que a posição do resíduo de aminoácido na posição 238 (numeração EU) isto é, uma posição de mutagênese de Fc (P238D), é alterada de Fc (WT), a estrutura de alça em torno do resíduo de aminoácido na posição 238 seguindo a região de dobra é verificada ser dife- rente entre Fc (P238D) e Fc (WT) (Fig. 59). Pro na posição 238 (numeração 5 EU) está originalmente localizado dentro de Fc (WT), formando um núcleo hidrofílico com resíduos em torno da posição 238. No entanto, se Pro na po- sição 238 (numeração EU) for alterado para altamente hidrofílico e Asp car- regado, a presença do resíduo Asp alterado em um núcleo hidrofílico é ener- geticamente desvantajosa em termos de dessolvação. Desta maneira, em Fc(P238I)), para cancelar esta situação energeticamente desvantajosa, o resíduo de aminoácido na posição 238 (indicada pela numeração EU) muda sua orientação para facear o lado do solvente, e isso pode ter causado esta mudança na estrutura da alça próximo do resíduo de aminoácido na posição
238. Ainda, uma vez que essa alça não está distante da região de dobra reti- culada por uma ligação S-S, sua mudança estrutural não será limitada a uma mudança local, e afetará o posicionamento relativo do domínio A e do domí- nio B de CH2 Fc. Como resultado, as interações interatômicas entre FcγRIIb e domínio B de CH2 Fc foram mudadas. Desta maneira, os efeitos previstos não puderam ser observados quando alterações que aperfeiçoam seletivida- de e atividade de ligação com relação a FcγRIIb em um IgG de ocorrência natural foram combinadas com uma Fc contendo a alteração P238D. Ainda, como um resultado de mudanças estruturais devido à in- trodução de P238D em domínio A de CH2 Fc, uma ligação hidrogênio foi encontrada entre a cadeia principal de Gly na posição 237 (indicada por nu- meração EU), que está adjacente a P238D mutado, e Tyr na posição 160 em FcγRIIb (Fig. 60). O resíduo em FcγRIIb que corresponde a este Tyr 160 é Phe; e quando a ligação é com FcγRIIa, esta ligação hidrogênio não é for- mada. Considerando que o aminoácido na posição 160 é uma das poucas diferenças entre FcγRIIa e FcγRIIb na interface de interação com Fc, a pre- sença desta ligação hidrogênio que é específica para FcγRIIb é presumida ter levado a aperfeiçoamento de atividade de ligação a FcγRIIb e diminuição da atividade de ligação a FcγRIIa em Fc(P238D) e aperfeiçoamento de sua seletividade.
Ainda, no domínio B de CH2 Fc, uma interação eletrostática é observada entre Asp na posição 270 (indicada pela numeração EU) e Arg na posição 131 em FcγRIIb (Fig. 61). Em FcγRIIa tipo H, que é um dos alótipos de FcγRIIa, o resíduo correspondendo a Arg na posição 131 de FcγRIIb é 5 His, e então não pode formar esta interação eletrostática.
Isso pode explicar o motivo pelo qual a atividade de ligação a Fc(P238D) é diminuída em Fcγ- RIIa tipo H comparado com FcγRIIa tipo R.
Observações baseadas em tais resultados de análise cristalográfica de raios X mostraram que a mudança da estrutura da alça junto de P238D devido à introdução de P238D e a mu- dança acompanhante no posicionamento de domínio relativo causa forma- ção de novas interações que não são encontradas na ligação do IgG de o- corrência natural e FcγR, e isso poderia levar a um perfil de ligação seletiva de variantes de P238D para FcγRIIb.
Expressão e Purificação de Fc(P238D) Uma Fc contendo a alteração P238D foi preparada como segue.
Primeiro, Cys na posição 220 (indicada pela numeração EU) de hIL6R-IgG1- v1 (SEQ ID NO: 80) foi substituído com Ser.
Então sequência genética de Fc(P238D) de Glu na posição 236 (indicada por numeração EU) para seu terminal C foi clonada através de PCR.
Usando esta sequência genética clo- nada, produção de vetores de expressão, e expressão e purificação de Fc(238D) foram realizadas de acordo com o método dos Exemplos de Refe- rência 1 e 2. Cys na posição 220 (indicada pela numeração EU) forma uma ligação dissulfeto com Cys da cadeia L em IgG1 geral.
A cadeia L não é co- expressa quando Fc sozinho é preparado e, então, o resíduo Cys foi substi- tuído com Ser para evitar formação de ligações dissulfeto desnecessárias.
Expressão e Purificação da região extracelular de FcγRIIb A região extracelular de FcγRIIb foi preparada de acordo com o método do Exemplo 14. Purificação do complexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb A 2 mg da amostra de região extracelular de FcγRIIb obtida para uso em cristalização, 0,29 mg de Endo F1 (Protein Science 1996, 5: 2617-
2622) expressa e purificada a partir de Escherichia coli como uma proteína de fusão glutationa S-transferase foi adicionado. Isso foi deixado permane- cer em temperatura ambiente por três dias em tampão Bis-Tris 0,1 M em pH 6,5 e o oligossacarídeo N-ligado foi clivado, exceto N-acetilglicosamina dire- 5 tamente ligada a Asn da região extracelular de FcγRIIb. Em seguida, a a- mostra de domínio extracelular de FcγRIIb submetida a tratamento com cli- vagem de carboidrato, que foi concentrada através de ultrafiltragem com 5000 MWCO, foi purificada através de cromatografia de filtragem em gel (Superdex200 10/300) usando uma coluna equilibrada em HEPS 20 mM em pH 7,5 contendo NaCl 0,05 M. Ainda, à fração de região extracelular de FcγRIIb clivada por carboidrato obtida, Fc(P238D) foi adicionada de maneira que a razão molar da região extracelular de FcγRIIb estaria presente em li- geiro excesso. A mistura concentrada através de ultrafiltragem com MWCO
10.000 foi submetida à purificação através de cromatografia de filtragem em gel (Superdex200 10/300) usando uma coluna equilibrada em HEPS 20 mM em pH 7,5 contendo NaCl 0,05 M. Desta maneira, uma amostra do complexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb foi obtida. Cristalização do complexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb Usando a amostra do complexo de complexo de Fc(P238D) / re- gião extracelular de FcγRIIb que foi concentrado para aproximadamente 10 mg/mL através de ultrafiltragem com MWCO 10.000, cristalização do com- plexo foi realizada através do método de difusão de vapor de gota sentada (sitting drop). Hydra II Plus One (MATRIX) foi usado para cristalização; e pa- ra uma solução reservatório contendo Bis-Tris 100 mM pH 6,5, PEG3350 17%, acetato de amônio 0,2 M e D-Galactose 2,7% (p/v), uma gota de crista- lização foi produzida misturando em uma razão de solução de reservatório : amostra de cristalização = 0,2 µL : 0,2 µL. A gota de cristalização após veda- ção foi deixada permanecer a 20º c e então cristais tipo placa finos foram obtidos. Medição de dados de difração de raios X de um cristal de com- plexo de Fc(238D) / região extracelular de FcγRIIb
Um dos cristais simples obtidos do complexo de Fc(238D) / regi- ão extracelular de FcγRIIb foi embebido em uma solução de Bis-Tris 100 mM pH 6,5, PEG3350 20%, acetato de amônio, 2,7% (pv) de D-Galactose, 22,5% (v/v) de etileno glicol.
O cristal simples foi fisgado da solução usando 5 um pino com alça de náilon fino presa, e congelado em nitrogênio líquido.
Os dados de difração de raios X do cristal foram medidos na instalação de radi- ação sincotron Photon Factory BL-1A em High Energy Accelerator Research Organization.
Durante a medição, o cristal foi posto constantemente em uma corrente de nitrogênio a -178º C para manter em um estado congelado e um total de 225 imagens de difração de raios X foi coletado usando detector Quantum 270 CCD (ADSC) ligado a uma feixe girando o cristal a 0,8º de cada vez.
Determinação de todos os parâmetros celulares, índice de pontos de difração e processamento de dados de difração das imagens de difração obtidas foi realizada usando o programa Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) e Scala (CCP4 Software Suite); e finalmente dados de intensidade de difração do cristal até resolução de 2,46 Å foram obtidos.
O cristal pertence ao grupo espacial P21, e tem os parâmetros celu- lares que seguem: a = 48,85 Å, b = 76,01 Å, c = 115,09 Å, α = 90º, β = 100,70º, γ = 90º.
Análise cristalográfica de raios X do complexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb A estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D) / região extra- celular de FcγRIIb foi determinada através do método de substituição mole- cular usando o programa Phaser (CCP4 Software Suite). A partir do tamanho do látice de cristal obtido e do peso molecular do complexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb, o número de complexos na unidade assimé- trica foi previsto ser um.
A partir das coordenadas estruturais do código PDB: 3SGJ que é a estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D) / região extra- celular de FcγRIIb, as porções de resíduo de aminoácido das posições 239- 340 da cadeia A e das posições 239-340 da cadeia B foram tomadas como coordenadas separadas, e elas foram ajustadas, respectivamente, como modelos para pesquisa dos domínios de CH2 Fc.
As porções de resíduo de aminoácido das posições 341-444 da cadeia A e das posições 341-443 da cadeia B foram tomadas como coordenadas das mesmas coordenadas es- truturais do código PDB: 3SGJ; e isso foi ajustado como um modelo para pesquisa dos domínios de CH3 Fc.
Finalmente, a partir das coordenadas 5 estruturais de código PDB: 2FCB que é a estrutura de cristal da região ex- tracelular de FcγRIIb, as porções de aminoácido da cadeia A posições 6-178 foram tomadas e ajustadas como um modelo para pesquisa da região extra- celular de FcγRIIb.
A orientação e a posição de cada modelo de pesquisa no látice de cristal foram determinadas na ordem do domínio de CH3 Fc, região extracelular de FcγRIIb e domínio de CH2 Fc, com base na função de rota- ção e função de tradução para obter o modelo inicial para a estrutura de cris- tal do complexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb.
Quando refi- namento de corpo rígido que move os dois domínios de CH2 Fc, os dois domínios de CH3 Fc e a região extracelular de FcγRIIb foi realizado no mo- delo inicial obtido, o fator de confiabilidade cristalográfica, valor R passou para 40,4% e o valor R Livre passou para 41,9% para dados de intensidade de difração de 25 Å a 3,0 Å neste ponto.
Ainda, refinamento estrutural usan- do o programa Refmac5 (CCP4 Software Suit) e revisão do modelo para ob- servar os mapas de densidade de elétron cujo coeficiente tem 2Fo-Fc ou Fo- Fc, que são calculados com base no fator estrutural Fo experimentalmente determinado, o fator estrutural Fc calculado e a fase calculada usando o mo- delo, foi realizada através do programa Coot (Paul Emsley). Refinamento do modelo foi realizado repetindo essas etapas.
Finalmente, como um resultado de incorporação de moléculas de água ao modelo comb ase nos mapas de densidade de elétron que usam 2Fo-Fc ou Fo-Fc como o coeficiente, e o refinamento que segue, o fator de confiabilidade cristalográfica, valores R e o valor R Livre do modelo contendo 4846 átomos de não hidrogênio se tor- nou 23,7% e 27,6% para 24291 dados de intensidade de difração de 25 Å a 2,6 Å de resolução, respectivamente.
Produção de uma estrutura modelo do complexo de Fc(WT) / re- gião extracelular de FcγRIIb Com base nas coordenadas estruturais do código PDB: 3RY6 que é uma estrutura de cristal do complexo de Fc(WT) / região extracelular de FcγRIIb, a função Build Mutants do programa Discovery Studio 3.1 (Ac- celrys) foi usada para introduzir mutações para igualar a sequência de ami- noácido de FcγRIIb em FcγRIIa nessas coordenadas estruturais.
Neste ca- 5 so, o Nível de Otimização foi ajustado para Alto, o Radio de Corte foi ajusta- do para 4,5, cinco modelos foram gerados e aquele com o melhor score de energia dentre eles foi fixado como a estrutura modelo para o complexo de Fc(WT) / região extracelular de FcγRIIb.
Exemplo de Referência 29 Análise de ligação a FcγR de varian- tes de Fc cujos sítios de alteração foram determinados com base nas estru- turas de cristal Com base nos resultados de análise cristalográfica de raios X no complexo formado entre Fc (P239D) e a região extracelular de FcγRIIB obti- do no Exemplo de Referência 28, foram construídas variantes através de introdução compreensivamente de alterações nos sítios na Fc alterada tendo substituições de Pro na posição 238 (Indicado por numeração EU) com Asp que foram previstas afetar a interação com FcγRIIB (resíduos de posições 233, 240, 241, 263, 265, 266, 267, 268, 271, 273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332 e 334 (indicado por numeração EU) e se com- binações de alterações que aumentam mais a ligação a FcγRIIB em adição à alteração P238D podem ser obtidas foi examinado.
IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187) foi produzido através da introdução em IL6R-G1d (SEQ ID NO: 79) produzido no Exemplo 14 da alteração pro- duzida substituindo Lys na posição 439 (indicado pela numeração EU) com Glu.
Em seguida, IL6R-BF648 foi produzido introduzindo em IL6R-B3 a alte- ração produzida substituindo Pro na posição 238 (indicado pela numeração EU) com Asp.
IL6R-L (SEQ ID NO: 83) foi utilizado como a cadeia L de anti- corpo comum.
Essas variantes de anticorpo expressas foram purificadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 2. A ligação dessas varian- tes de anticorpo a cada um dos FcγRs (FcγRIa, FcγRIIa tipo H, FcγRIIa tipo R, FcγRIIb e FcγRIIIa tipo V) foi compreensivamente avaliada através do método do Exemplo 14.
Uma figura foi produzida de acordo com o método que segue pa- ra mostrar os resultados de análise das interações com os respectivos Fcγ- Rs.
O valor para a quantidade de ligação de cada variante a cada FcγR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação do anticorpo controle pré- 5 alterado (IL6R-BF648/IL6R-L, alteração através de substituição de Pro na posição 238 (indicado pela numeração EU) com Asp) para cada FcγR e o obtido foi então multiplicado por 100 e mostrado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante para cada FcγR.
O eixo horizontal mos- tra o valor de atividade de ligação relativo de cada variante para FcγRIIb e o eixo vertical mostra o valor de atividade de ligação relativo de cada variante para FcγRIIa tipo R (Fig. 62). Conforme mostrado na Fig. 62, os resultados mostram que de todas as alterações, 24 tipos de alterações foram verificados manter ou au- mentar a ligação a FcγRIIb em comparação com o anticorpo pré-alterado.
A ligação dessas variantes a cada um dos FcγRs é mostrada na Tabela 49. Na tabela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187). O modelo usado para produção de IL6R-b3, IL6R-G1d/IL6R-L, é indi- cado com um asterisco (*).
Tabela 49
Os resultados de medição dos valores KD das variantes mostra- das na Tabela 49 para FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb e FcγRIIIa tipo V através do método do Exemplo 14 são sumarizados na Tabela 50. Na ta- bela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187). O modelo usado para produção de IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R1, é indi-
cado com um asterisco (*). Ainda, KD(IIaR)/KD(IIb) e KD(IIaH)/KD(IIb) na tabela, respectivamente, representam o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcγRIIaR pelo valor KD de cada variante para FcγRIIb, e o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcγRIIaH pelo valor 5 KD de cada variante para FcγRIIb.
KD(IIb) do polipeptídeo parental / KD(IIb) do polipeptídeo alterado se refere ao valor obtido dividindo os valores KD do polipeptídeo parental para FcγRIIb pelo valor KD de cada variante para Fcγ- RIIb.
Ainda, o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcγRII- aR e FcγRIIaH de cada variante / valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH do polipeptídeo parental são mostrados na Tabela 50. Aqui, polipeptídeo parental se refere à variante que tem IL6R- B3 (SEQ ID NO: 187) como a cadeia H.
Foi determinado que devido à liga- ção fraca de FcγR a IgG, foi impossível analisar com precisão através de análise cinética e então as células preenchidas com cinza na Tabela 50 mos- tram valores calculados usando a Equação 5 do Exemplo 14. Equação 5 KD = C x Rmax / (Req – RI) – C A Tabela 50 mostra que em comparação com IL6R-B33, todas as variantes mostraram aperfeiçoamento de afinidade com FcγRIIb e a faixa de aperfeiçoamento foi 2,1 vezes a 9,7 vezes.
A razão de valor KD de cada variante para FcγRIIaR / valor KD de cada variante para FcγRIIb, e a razão de valor KD de cada variante para FcγRIIaH / valor KD de cada variante para FcγRIIb representa uma atividade de ligação a FcγRIIb com relação à ativi- dade de ligação a FcγRIIaR e atividade de ligação a FcγRIIaH, respectiva- mente.
Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcγRIIb, e um valor maior indica uma seletividade de li- gação maior para FcγRIIb.
Uma vez que a razão de valor KD para FcγRIIaR / valor KD para FcγRIIb e a razão de valor KD para FcγRIIaH / valor KD para FcγRIIb no polipeptídeo parental IL6R-B3/IL6R-L foram 0,3 e 0,2, respecti- vamente, todas as variantes na Tabela 50 mostraram aperfeiçoamento de seletividade de ligação para FcγRIIb em comparação com o polipeptídeo parental.
Quando o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a
FcγRIIaR e FcγRIIaH de uma variante / valor KD para a mais forte das ativi- dades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH do polipeptídeo parental é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou menor comparado 5 com a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRI- IaH do polipeptídeo parental.
Uma vez que esse valor era 4,6 a 34,0 para as variantes obtidas desta vez, pode ser dito que em comparação com o poli- peptídeo parental, as variantes obtidas desta vez tinham ligação reduzida pela mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH.
Esses re- sultados mostraram que comparado com o polipeptídeo parental, as varian- tes obtidas desta vez têm atividades de ligação a FcγRIIa tipo R e tipo H mantidas ou diminuídas, atividade de ligação a FcγRIIb aumentada e seleti- vidade aperfeiçoada para FcγRIIb.
Ainda, comparado com IL6R-B3, todas as variantes tinham afinidade menor com FcγRIa e FcγRIIIaV.
Tabela 50
KD (IIb) do Valor de KD para a mais forte das polipeptídeo atividades de ligação Fcγ RIIaR e Fcγ Nome de de origem/ KD RIIaH da variante/ valor de KD para a variante Alteração (IIb) do poli- mais forte das atividades de ligação peptídeo Fcγ RIIaR e Fcγ RIIaH do polipeptí- alterado deo de origem
392/402
Com relação às variantes promissoras dentre as variantes de combinação obtidas, os fatores que levam aos seus efeitos foram estudados usando a estrutura de cristal.
A Fig. 63 mostra a estrutura de cristal do com- plexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb.
Nesta Fig., a cadeia H 5 posicionada no lado esquerdo é a Cadeia A de Fc e a cadeia H posicionada no lado direito é a Cadeia B de Fc.
Aqui, pode ser visto que o sítio na posi- ção 233 (indicado por numeração EU) na Cadeia A de Fc está localizado próximo de Lys na posição 113 de FcγRIIb.
No entanto, nesta estrutura de cristal, a cadeia lateral em E233 está em uma condição de mobilidade consi- deravelmente alta, e sua densidade de elétron não é bem observada.
Desta maneira, a alteração produzida substituindo Glu na posição 233 (indicado por numeração EU) com Asp leva à diminuição no grau de liberdade da ca- deia lateral uma vez que a cadeia lateral fica um carbono mais curta.
Como resultado, a perda de entropia quando formando uma interação com Lys na posição 113 de FcγRIIb pode ser diminuída e, consequentemente, isso é especulado contribuir para aperfeiçoamento de energia livre de ligação.
Similarmente, a Fig. 64 mostra o ambiente próximo do sítio na posição 330 (indicado por numeração EU) na estrutura do complexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb.
Esta Fig. mostra que o ambiente ao redor do sítio na posição 330 (indicado por numeração EU) de Cadeia A de Fc de Fc (P238D) é um ambiente hidrofílico composto de Ser na posição 85, Glu na posição 86, Lys na posição 163 e similar de FcγRIIb.
Desta ma- neira, a alteração produzida substituindo Ala na posição 330 (indicado por numeração EU) com Lys ou Arg é especulada contribuir para reforço da inte- ração com Ser na posição 85 ou Glu na posição 86 em FcγRIIb.
A Fig. 65 mostra as estruturas de Pro na posição 271 (indicado por numeração EU) de Cadeia B de Fc após superposição das estruturas de cristal do complexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb e o com- plexo de Fc(WT) / região extracelular de FcγRIIIa através do ajuste dos qua- drados mínimos com base nas distâncias de par de átomo Cα com relação à Cadeia B de Fc.
Essas duas estruturas combinam bem, mas têm estruturas tridimensionais diferentes de Pro na posição 271 (indicado por numeração
EU). Quando a densidade de elétron fraca ao redor desta área na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D) / região extracelular de FcγRIIb é tam- bém levada em consideração, é sugerido que há possibilidade que Pro na posição 271 (indicada por numeração EU) em Fc(P238D) / FcγRIIb cause 5 uma deformação grande na estrutura, desta maneira perturbando a estrutura da alça para atingir uma estrutura ótima.
Desta maneira, a alteração produ- zida substituindo Pro na posição 271 (indicado por numeração EU) com Gly dá flexibilidade para a estrutura desta alça, e é especulado contribuir para aumento de ligação através de redução da barreira energética quando per- mitindo que uma estrutura ótima se forme durante interação com FcγRIIb.
Exemplo 30 Exame do efeito combinatorial de alterações que aumentam a ligação a FcγRIIb quando combinadas com P238D Das alterações obtidas nos Exemplos de Referência 27 e 29, aquelas que aumentaram a ligação a FcγRIIb ou mantiveram a ligação a FcγRIIb e mostraram efeitos de supressão de ligação a outros FcγRs foram combinadas umas com as outras e seu efeito foi examinado.
Alterações particularmente boas selecionadas das Tabelas 46 e 49 foram introduzidas na cadeia H do anticorpo IL6R-BF648 de uma maneira similar ao método do Exemplo de Referência 29. IL6R-L foi utilizado como a cadeia L de anticorpo comum, os anticorpos expressos foram purificados de acordo com o método do Exemplo 12. A ligação a cada um dos FcγRs (Fcγ- RIa, FcγRIIa tipo H, FcγRIIa tipo R, FcγRIIb e FcγRIIIa tipo V) foi compreen- sivamente avaliada através do método do Exemplo 14. De acordo com o método que segue, atividades de ligação rela- tiva foram calculadas para os resultados de análise de interações com os respectivos FcγRs.
O valor para a quantidade de ligação de cada variante a cada FcγR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação do anticorpo controle pré-alterado (IL6R-BF648/IL6R-L com substituição de Pro na posi- ção 238 (indicado por numeração EU) com Asp para cada Fcγ e multiplicado por 100; e então o valor foi mostrado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante para cada FcγR (Tabela 51).
Na tabela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R- B3 (SEQ ID NO: 187). O modelo usado para produção de IL6R-B3, IL6R- G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*).
Tabela 51
Nome da Atividade de ligação relativa Alteração variana
396/402
Os resultados de medição dos valores KD das variantes mostra- das na Tabela 51 para FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb e FcγRIIIa tipo V através do método do Exemplo 14 são sumarizados nas Tabelas 51-2 e 52-2. Na tabela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 5 (SEQ ID NO: 187). O modelo usado para produção de IL6R-B3, IL6R- G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Ainda, KD(IIaR)/KD(IIb) e KD(IIaH)/KD(IIb) na tabela, respectivamente, representam o valor obtido di- vidindo o valor KD de cada variante para FcγRIIaR pelo valor KD de cada variante para FcγRIIb e o valor obtido dividindo do valor KD de cada variante para FcγRIIaH pelo valor KD de cada variante para FcγRIIb, KD(IIb) do poli- peptídeo parental / KD(IIb) do polipeptídeo alterado se refere ao valor obtido dividindo o valor KD do polipeptídeo parental para FcγRIIb pelo valor KD de cada variante para FcγRIIb.
Ainda, o valor KD para a mais forte das ativida- des de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH de cada variante / valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH do polipeptídeo parental conforme mostrado nas Tabelas 51-2 e 52-2. Aqui, polipeptídeo pa- rental se refere à variante que tem IL6R-B3 (SEQ ID NO: 187) como a ca- deia H.
Foi determinado que devido à ligação fraca de FcγR a IgG, foi im- possível analisar com precisão através de análise cinética, e então as célu- las preenchidas com cinza nas Tabelas 51-2 e 52-2 mostram valores calcu- lados usando a Equação 5 do Exemplo 14. Equação 5 KD = C x Rmax / (Req – RI) – C As Tabelas 51-2 e 52-2 mostram que em comparação com IL6R- B3, todas as variantes mostraram aperfeiçoamento de afinidade com FcγRI- Ib e a faixa de aperfeiçoamento foi 3,0 vezes a 99,0 vezes.
A razão de valor KD de cada variante para FcγRIIaR / valor KD de cada variante para FcγRIIb e a razão de valor KD de cada variante para FcγRIIaH / valor KD de cada variante para FcγRIIb representa uma atividade de ligação a FcγRIIb relativa à atividade de ligação a FcγRIIaR e atividade de ligação a FcγRIIaH, respec- tivamente.
Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcγRIIb e um valor maior indica uma seletividade de ligação maior para FcγRIIb.
Uma vez que a razão de valor KD para FcγRIIaR / valor KD para FcγRIIb e a razão de valor KD para FcγRIIaH / valor KD para FcγRIIb do polipeptídeo parental IL6R-B3/IL6R-L foram 0,3 e 0,2, respecti- vamente, todas as variantes nas Tabelas 51-2 e 52-2 mostraram aperfeiço- 5 amento de seletividade de ligação para FcγRIIb em comparação com o poli- peptídeo parental.
Quando o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH de uma variante / valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH do polipeptídeo parental é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de ligação a FcγRII- aR e FcγRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou diminuída com- parado com a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH do polipeptídeo parental.
Uma vez que esse valor era 0,7 a 29,9 para as variantes obtidas desta vez, pode ser dito que ligação pela mais for- te das atividades de ligação a FcγRIIaR e FcγRIIaH das variantes obtidas desta vez era quase equivalente ou menor comparado com aquela do poli- peptídeo parental.
Esse resultados mostraram que comparado com o poli- peptídeo parental, as variantes obtidas desta vez mantiveram ou diminuíram as atividades de ligação a FcγRIIa tipo R e tipo H, aumentaram a atividade de ligação a FcγRIIb e aperfeiçoaram a seletividade para FcγRIIb.
Ainda, comparado com IL6R-B3, todas as variantes tinham afinidade menor com FcγRIa e FcγRIIaV.
Tabela 52-1 KD (IIb) do Valor de KD para a mais forte das polipeptídeo atividades de ligação Fcγ RIIaR e Nome da Alt6ração de origem/ Fcγ RIIaH da variante/ valor de KD (IIb) do KD para a mais forte das ativida- variante polipeptídeo des de ligação Fcγ RIIaR e Fcγ alterado RIIaH do polipeptídeo de origem
400/402
A Tabela 52-2 é uma tabela de continuação da Tabela 52-1. Tabela 52-2
Aplicabilidade Industrial A presente invenção provê métodos para aperfeiçoamento da farmacocinética de moléculas de ligação a antígeno e métodos para redução da imunogenicidade de moléculas de ligação a antígeno.
A presente inven- ção permite terapia com anticorpo sem causar efeitos desfavoráveis in vivo comparados com anticorpos convencionais.
Claims (44)
1. Método de (a) ou (b) abaixo, em que o método compreende a modificação da região Fc de uma molécula de ligação a antígeno compreen- dendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antíge- 5 no varia dependendo da concentração de íon e uma região Fc que tem ativi- dade de ligação de FcRn em uma faixa de pH neutro em uma região Fc que não forma um complexo hetero compreendendo duas moléculas de FcRn e uma molécula de ativação do receptor Fcγ ativador em uma faixa de pH neu- tro: (a) um método para aperfeiçoamento da farmacocinética de uma molécula de ligação a antígeno; e (b) um método para redução da imunogenicidade de uma molé- cula de ligação a antígeno.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a modifica- ção em uma região Fc que não forma o dito complexo hetero compreende modificação da região Fc em uma região Fc cuja atividade de ligação a um receptor Fcγ ativador é menor do que a atividade de ligação de uma região Fc de IgG humana nativa ao receptor Fcγ ativador.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o re- ceptor Fcγ ativador é FcγRIa humano, FcγRIIa(R) humano, FcγRIIa(H) hu- mano, FcγRIIIa(V) humano ou FcγRIIIa(F) humano.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o qual compreende substituição de um aminoácido da dita região Fc em qualquer um ou mais aminoácidos de posições 235, 237, 238, 239, 270, 298, 325 e 329 conforme indicado pela numeração EU.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, o qual compreende substituição de um aminoácido da dita região Fc conforme indicado pela numeração EU em qualquer um ou mais de: o aminoácido de posição 234 com qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr e Trp; o aminoácido de posição 235 com qualquer um dentre Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val e Arg;
o aminoácido de posição 236 com qualquer um dentre Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro e Tyr; o aminoácido de posição 237 com qualquer um dentre Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr e Arg; 5 o aminoácido de posição 238 com qualquer um dentre Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp e Arg; o aminoácido de posição 239 com qualquer um dentre Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr e Arg; o aminoácido de posição 265 com qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val; o aminoácido de posição 266 com qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp e Tyr; o aminoácido de posição 267 com qualquer um dentre Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp e Tyr; o aminoácido de posição 269 com qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val; o aminoácido de posição 270 com qualquer um dentre Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val; o aminoácido de posição 271 com qualquer um dentre Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp e Tyr; o aminoácido de posição 295 com qualquer um dentre Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp e Tyr; o aminoácido de posição 296 com qualquer um dentre Arg, Gly, Lys e Pro; o aminoácido de posição 297 com Ala; o aminoácido de posição 298 com qualquer um dentre Arg, Gly, Lys, Pro, Trp e Tyr; o aminoácido de posição 300 com qualquer um dentre Arg, Lys e Pro; o aminoácido de posição 324 com Lys ou Pro; o aminoácido de posição 325 com qualquer um dentre Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr e Val;
o aminoácido de posição 327 com qualquer um dentre Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val; o aminoácido de posição 328 com qualquer um dentre Arg, Asn, Gly, His, Lys e Pro; 5 o aminoácido de posição 329 com qualquer um dentre Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val e Arg; o aminoácido de posição 330 com Pro ou Ser; o aminoácido de posição 331 com qualquer um dentre Arg, Gly e Lys; ou o aminoácido de posição 332 com qualquer um dentre Arg, Lys e Pro.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a modifica- ção em uma região Fc que não forma o dito complexo hetero compreende modificação da região Fc em uma região Fc que tem uma atividade de liga- ção maior com um receptor Fcγ inibidor do que um receptor Fcγ ativador.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o receptor Fcγ inibidor é FcγRIIb humano.
8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o re- ceptor Fcγ ativador é FcγRIa humano, FcγRIIa(R) humano, FcγRIIa(H) hu- mano, FcγRIIIa(V) humano ou FcγRIIIa(F) humano.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, o qual compreende substituição do aminoácido da posição 238 ou 328 indicado pela numeração EU.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, o qual compreende substituição de Asp para o aminoácido de posição 238 ou Glu para o amino- ácido de posição 328 indicado por numeração EU.
11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, o qual com- preende substituição de qualquer um ou mais aminoácidos de: o aminoácido de posição 233 com Asp; o aminoácido de posição 234 com Trp ou Tyr; o aminoácido de posição 237 com qualquer um dentre Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp e Tyr;
o aminoácido de posição 239 com Asp; o aminoácido de posição 267 com qualquer um dentre Ala, Gln e Val; o aminoácido de posição 268 com qualquer um dentre Asn, Asp 5 e Glu; o aminoácido de posição 271 com Gly; o aminoácido de posição 326 com qualquer um dentre Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser e Thr; o aminoácido de posição 330 com qualquer um dentre Arg, Lys e Met; o aminoácido de posição 323 com qualquer um dentre Ile, Leu e Met; e o aminoácido de posição 296 com Asp; em que os aminoácidos são indicados por numeração EU.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a região Fc compreende um ou mais aminoácidos que são dife- rentes dos aminoácidos da região Fc nativa em qualquer uma das posições de aminoácido 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 da dita re- gião Fc conforme indicado pela numeração EU.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que os ami- noácidos da dita região Fc indicados pela numeração EU são uma combina- ção de um ou mais de: Met na posição de aminoácido 237; Ile na posição de aminoácido 248; qualquer um dentre Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 250; qualquer um dentre Phe, Trp e Tyr na posição de aminoácido 252; Thr na posição de aminoácido 254; Glu na posição de aminoácido 255;
Qualquer um dentre Asn, Asp, Glu e Gln na posição de aminoá- cido 256; qualquer um dentre Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr e Val na posição de aminoácido 257; 5 His na posição de aminoácido 258; Ala na posição de aminoácido 265; Ala ou Glu na posição de aminoácido 286; His na posição de aminoácido 289; Ala na posição de aminoácido 297; Gly na posição de aminoácido 298; Ala na posição de aminoácido 303; Ala na posição de aminoácido 305; qualquer um dentre Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 307; qualquer um dentre Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln e Thr na po- sição de aminoácido 308; qualquer um dentre Ala, Asp, Glu, Pro e Arg na posição de ami- noácido 309; qualquer um dentre Ala, His e Ile na posição de aminoácido 311; Ala ou His na posição de aminoácido 312; Lys ou Arg na posição de aminoácido 314; qualquer um dentre Ala, Asp e His na posição de aminoácido 315; Ala na posição de aminoácido 317; Val na posição de aminoácido 332; Leu na posição de aminoácido 334; His na posição de aminoácido 360; Ala na posição de aminoácido 376; Ala na posição de aminoácido 380; Ala na posição de aminoácido 382; Ala na posição de aminoácido 384; Asp ou His na posição de aminoácido 385;
Pro na posição de aminoácido 386; Glu na posição de aminoácido 387; Ala ou Ser na posição de aminoácido 389; Ala na posição de aminoácido 424; 5 qualquer um dentre Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 428; Lys na posição de aminoácido 433; qualquer um dentre Ala, Phe, His, Ser, Trp, e Tyr na posição de aminoácido 434; e qualquer um dentre His, Ile, Leu, Phe, Thr e Val na posição de aminoácido 436.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o dito domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concen- tração de íon de cálcio.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o dito domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja ati- vidade de ligação a antígeno varia de uma maneira que a atividade de liga- ção a antígeno em uma concentração de íon de cálcio baixa é menor do que a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de cálcio al- ta.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o dito domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo do pH.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o dito domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja ati- vidade de ligação a antígeno varia de uma maneira que a atividade de liga- ção a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH neutro.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que o domínio de ligação a antígeno é uma região variável de anti- corpo.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo.
20. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a modifi- cação em uma região Fc que não forma o dito complexo hetero compreende 5 modificação em uma região Fc em que um dos dois polipeptídeos constituin- do a região Fc tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro e o outro não tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, o qual compreen- de substituição de um aminoácido em qualquer uma ou mais das posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 conforme indicado pela numeração EU na sequência de aminoácido de qualquer um dos dois poli- peptídeos constituindo a dita região Fc.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, o qual compreen- de substituição de um aminoácido da dita região Fc em qualquer um ou mais dentre: o aminoácido de posição 237 com Met; o aminoácido de posição 248 com Ile; o aminoácido de posição 250 com Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr; o aminoácido de posição 252 com Phe, Trp ou Tyr; o aminoácido de posição 254 com Thr; o aminoácido de posição 255 com Glu; o aminoácido de posição 256 com Asn, Asp, Gluou Gln; o aminoácido de posição 257 com Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val; o aminoácido de posição 258 com His; o aminoácido de posição 265 com Ala; o aminoácido de posição 286 com Ala ou Glu; o aminoácido de posição 289 com His; o aminoácido de posição 297 com Ala;
o aminoácido de posição 298 com Gly; o aminoácido de posição 303 com Ala; o aminoácido de posição 305 com Ala; o aminoácido de posição 307 com Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, 5 Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr; o aminoácido de posição 308 com Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr; o aminoácido de posição 309 com Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg; o aminoácido de posição 311 com Ala, His ou Ile; o aminoácido de posição 312 com Ala ou His; o aminoácido de posição 314 com Lys ou Arg; o aminoácido de posição 315 com Ala, Asp ou His; o aminoácido de posição 317 com Ala; o aminoácido de posição 332 com Val; o aminoácido de posição 334 com Leu; o aminoácido de posição 360 com His; o aminoácido de posição 376 com Ala; o aminoácido de posição 380 com Ala; o aminoácido de posição 382 com Ala; o aminoácido de posição 384 com Ala; o aminoácido de posição 385 com Asp ou His; o aminoácido de posição 386 com Pro; o aminoácido de posição 387 com Glu; o aminoácido de posição 389 com Ala ou Ser; o aminoácido de posição 424 com Ala; o aminoácido de posição 428 com Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr; o aminoácido de posição 433 com Lys; o aminoácido de posição 434 com Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr; e o aminoácido de posição 436 com His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val; em que os aminoácidos são indicados pela numeração EU.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concen- tração de cálcio. 5
24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de uma maneira que a atividade de ligação a antí- geno em uma concentração de cálcio baixa é menor do que a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio alta.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo do pH.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de uma maneira que a atividade de ligação a antí- geno em uma faixa de pH ácido é menor do que a atividade de ligação a an- tígeno em uma faixa de pH neutro.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, em que o domínio de ligação a antígeno é uma região variável de anti- corpo.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 27, em que a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo.
29. Molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de íon e uma região Fc que tem atividade de ligação a F- cRn em uma faixa de pH neutro, em que a região Fc compreende um ou mais aminoácidos selecionados de: Ala na posição de aminoácido 234; Ala, Lys, ou Arg na posição de aminoácido 235; Arg na posição de aminoácido 236; Arg na posição de aminoácido 238; Lys na posição de aminoácido 239;
Phe na posição de aminoácido 270; Ala na posição de aminoácido 297; Gly na posição de aminoácido 298; Gly na posição de aminoácido 325; 5 Arg na posição de aminoácido 328; e Lys ou Arg na posição de aminoácido 329; em que os aminoáci- dos são indicados pela numeração EU.
30. Molécula de ligação a antígeno de acordo com a reivindica- ção 29, a qual compreende um ou mais aminoácidos selecionados de: Lys ou Arg na posição de aminoácido 237; Lys na posição de aminoácido 238; Arg na posição de aminoácido 239; e Lys ou Arg na posição de aminoácido 329; em que os aminoáci- dos são indicados pela numeração EU.
31. Molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de íon e uma região Fc em que um dos dois polipeptídeos constituindo a região Fc tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro e o outro não tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro.
32. Molécula de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, em que a região Fc compreende um ou mais aminoácidos que são diferentes de aminoácidos de uma região Fc nativa em qualquer uma das posições de aminoácido 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 indicadas pela numeração EU na sequência de aminoácido de qualquer um dos dois polipeptídeos constituindo a região Fc.
33. Molécula de ligação a antígeno de acordo com a reivindica- ção 32, a qual compreende uma combinação de um ou mais aminoácidos da dita região Fc de: Met na posição de aminoácido 237;
Ile na posição de aminoácido 248; Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr na posição de amino- ácido 250; Phe, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 252; 5 Thr na posição de aminoácido 254; Glu na posição de aminoácido 255; Asn, Asp, Glu ou Gln na posição de aminoácido 256; Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val na posição de amino- ácido 257; His na posição de aminoácido 258; Ala na posição de aminoácido 265; Ala ou Glu na posição de aminoácido 286; His na posição de aminoácido 289; Ala na posição de aminoácido 297; Ala na posição de aminoácido 303; Ala na posição de aminoácido 305; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr na posição de aminoáci- do 308; Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg na posição de aminoácido 309; Ala, His ou Ile na posição de aminoácido 311; Ala ou His na posição de aminoácido 312; Lys ou Arg na posição de aminoácido 314; Ala, Asp ou His na posição de aminoácido 315; Ala na posição de aminoácido 317; Val na posição de aminoácido 332; Leu na posição de aminoácido 334; His na posição de aminoácido 360; Ala na posição de aminoácido 376; Ala na posição de aminoácido 380; Ala na posição de aminoácido 382;
Ala na posição de aminoácido 384; Asp ou His na posição de aminoácido 385; Pro na posição de aminoácido 386; Glu na posição de aminoácido 387; 5 Ala ou Ser na posição de aminoácido 389; Ala na posição de aminoácido 424; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 428; Lys na posição de aminoácido 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr na posição de aminoácido 434; e His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val na posição de aminoácido 436; em que os aminoácidos são indicados pela numeração EU.
34. Molécula de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de- pendendo da concentração de íon de cálcio.
35. Molécula de ligação a antígeno de acordo com a reivindica- ção 34, em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de uma maneira que a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio baixa é me- nor do que a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio alta.
36. Molécula de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de- pendendo do pH.
37. Molécula de ligação a antígeno de acordo com a reivindica- ção 36, em que o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia de uma maneira que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH neutro.
38. Molécula de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 37, em que o domínio de ligação a antígeno é uma região variável de anticorpo.
39. Molécula de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 38, em que a molécula de ligação a antígeno é um 5 anticorpo.
40. Polinucleotídeo codificando a molécula de ligação a antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 29 a 39.
41. Vetor que é operavelmente ligado ao polinucleotídeo como definido na reivindicação 40.
42. Célula introduzida com o vetor como definido na reivindica- ção 41.
43. Método para produção da molécula de ligação a antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 29 a 39, o qual compre- ende a etapa de coleta da molécula de ligação a antígeno de uma cultura da célula como definida na reivindicação 42.
44. Composição farmacêutica que compreende como um ingre- diente ativo a molécula de ligação a antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 29 a 39, ou uma molécula de ligação a antígeno ob- tida através do método de produção como definido na reivindicação 43.
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011040923 | 2011-02-25 | ||
PCT/JP2011/001888 WO2011122011A2 (en) | 2010-03-30 | 2011-03-30 | Antibodies with modified affinity to fcrn that promote antigen clearance |
JPPCT/JP2011/00111888 | 2011-03-30 | ||
PCT/JP2011/072550 WO2012132067A1 (ja) | 2011-03-30 | 2011-09-30 | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 |
JPPCT/JP2011/072550 | 2011-09-30 | ||
JP2011219835 | 2011-10-04 | ||
JPPCT/JP2011/054624 | 2012-02-24 | ||
PCT/JP2012/054624 WO2012115241A1 (ja) | 2011-02-25 | 2012-02-24 | FcγRIIb特異的Fc抗体 |
PCT/JP2012/058603 WO2012133782A1 (ja) | 2011-03-30 | 2012-03-30 | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BR112013025221A2 true BR112013025221A2 (pt) | 2020-09-08 |
BR112013025221A8 BR112013025221A8 (pt) | 2020-10-27 |
Family
ID=46721013
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BR112013021526-7A BR112013021526B1 (pt) | 2011-02-25 | 2012-02-24 | Polipeptídio variante, métodos para manter ou diminuir as atividades de ligação a fcgriia (tipo r) e fcgriia (tipo h) e aumentar a atividade de ligação a fcgriib de um polipeptídio e para a supressão da produção de um anticorpo contra um polipeptídio compreendendo a região fc do anticorpo, métodos para a produção do referido polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas e aumentada e para a produção suprimida de um anticorpo, composição farmacêutica e uso de um polipeptídio |
BR112013025221A BR112013025221A8 (pt) | 2011-02-25 | 2012-03-30 | retenção de moléculas de ligação a antígeno em plasma sanguíneo e método para modificação de imunogenicidade |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BR112013021526-7A BR112013021526B1 (pt) | 2011-02-25 | 2012-02-24 | Polipeptídio variante, métodos para manter ou diminuir as atividades de ligação a fcgriia (tipo r) e fcgriia (tipo h) e aumentar a atividade de ligação a fcgriib de um polipeptídio e para a supressão da produção de um anticorpo contra um polipeptídio compreendendo a região fc do anticorpo, métodos para a produção do referido polipeptídio com atividades de ligação mantidas ou diminuídas e aumentada e para a produção suprimida de um anticorpo, composição farmacêutica e uso de um polipeptídio |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20140093496A1 (pt) |
EP (2) | EP3604330A1 (pt) |
JP (6) | JP6032818B2 (pt) |
KR (3) | KR20230005405A (pt) |
CN (2) | CN103492565B (pt) |
AU (2) | AU2012222252B2 (pt) |
BR (2) | BR112013021526B1 (pt) |
CA (1) | CA2827923C (pt) |
MX (1) | MX352889B (pt) |
RU (1) | RU2608504C2 (pt) |
SG (2) | SG192945A1 (pt) |
WO (1) | WO2012115241A1 (pt) |
Families Citing this family (105)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101479381B (zh) | 2006-03-31 | 2015-04-29 | 中外制药株式会社 | 调控抗体血液动力学的方法 |
AU2008304778B9 (en) | 2007-09-26 | 2014-05-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR |
PT2275443E (pt) | 2008-04-11 | 2016-03-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Moléculas de ligação ao antigénio capazes de se ligarem, repetidamente, a duas ou mais moléculas de antigénio |
TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
LT2647707T (lt) | 2010-11-30 | 2018-11-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Citotoksiškumą indukuojantis terapinis agentas |
CN103328632A (zh) | 2010-11-30 | 2013-09-25 | 中外制药株式会社 | 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子 |
EP3604330A1 (en) | 2011-02-25 | 2020-02-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fcgammariib-specific fc antibody |
EP2698431B1 (en) | 2011-03-30 | 2020-09-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity |
JP5997151B2 (ja) | 2011-06-30 | 2016-09-28 | 中外製薬株式会社 | ヘテロ二量化ポリペプチド |
EP2752200B1 (en) * | 2011-09-30 | 2023-11-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule inducing immune response to target antigen |
TW201817745A (zh) | 2011-09-30 | 2018-05-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有促進抗原清除之FcRn結合域的治療性抗原結合分子 |
WO2013047748A1 (ja) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | 中外製薬株式会社 | 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
PE20141478A1 (es) | 2011-10-13 | 2014-10-23 | Bristol Myers Squibb Co | Polipeptidos de anticuerpos que antagonizan cd40l |
KR102168733B1 (ko) | 2011-10-31 | 2020-10-23 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자 |
CN113416256A (zh) | 2011-11-30 | 2021-09-21 | 中外制药株式会社 | 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物 |
KR102475951B1 (ko) * | 2012-02-24 | 2022-12-08 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | FcγRIIB를 매개로 항원의 소실을 촉진하는 항원 결합 분자 |
MX2014014678A (es) * | 2012-05-30 | 2015-02-10 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molecula de union al antigeno especifico para el tejido objetivo. |
WO2013187495A1 (ja) | 2012-06-14 | 2013-12-19 | 中外製薬株式会社 | 改変されたFc領域を含む抗原結合分子 |
CN104736706B (zh) * | 2012-08-24 | 2021-10-19 | 中外制药株式会社 | FcγRIIb特异性Fc区变体 |
US11236168B2 (en) | 2012-08-24 | 2022-02-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Mouse FcγammaRII-specific Fc antibody |
LT2895513T (lt) * | 2012-09-12 | 2018-09-10 | Genzyme Corporation | Fc turintys polipeptidai su pakeistu glikozilinimu ir sumažinta efektoriaus funkcija |
KR102249779B1 (ko) | 2012-12-27 | 2021-05-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 헤테로이량화 폴리펩티드 |
WO2014113510A1 (en) | 2013-01-15 | 2014-07-24 | Xencor, Inc. | Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies |
CA2904528C (en) * | 2013-03-15 | 2021-01-19 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Fc variants |
JP6598680B2 (ja) * | 2013-04-02 | 2019-10-30 | 中外製薬株式会社 | Fc領域改変体 |
CN105143262A (zh) | 2013-04-29 | 2015-12-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 结合人fcrn的修饰的抗体和使用方法 |
BR112015029788B1 (pt) * | 2013-05-31 | 2024-01-02 | Zymeworks Inc | HETERO-MULTÍMERO, USO E MÉTODO PARA PREPARAR DO MESMO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA REDUZIR FUNÇÃO EFETORA DE UM CONSTRUTO IgG FC |
PT3050896T (pt) | 2013-09-27 | 2021-08-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Processo para a produção de heteromultímeros de polipéptidos |
AU2014348552A1 (en) | 2013-11-13 | 2016-06-02 | Zymeworks Inc. | Monovalent antigen binding constructs targeting EGFR and/or HER2 and uses thereof |
WO2015083764A1 (ja) | 2013-12-04 | 2015-06-11 | 中外製薬株式会社 | 化合物の濃度に応じて抗原結合能の変化する抗原結合分子及びそのライブラリ |
EP3094648A1 (en) | 2014-01-15 | 2016-11-23 | F. Hoffmann-La Roche AG | Fc-region variants with improved protein a-binding |
PL3130606T3 (pl) * | 2014-04-07 | 2022-02-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Przeciwciała dwuswoiste aktywujące układ odpornościowy |
WO2015174439A1 (ja) | 2014-05-13 | 2015-11-19 | 中外製薬株式会社 | 免疫抑制機能を有する細胞に対するt細胞リダイレクト抗原結合分子 |
JP6166000B1 (ja) | 2014-06-03 | 2017-07-19 | エックスバイオテク, インコーポレイテッドXbiotech, Inc. | 黄色ブドウ球菌(staphylococcus aureus)感染症を治療および予防するための組成物および方法 |
US20160060360A1 (en) | 2014-07-24 | 2016-03-03 | Xencor, Inc. | Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies |
FR3024453B1 (fr) * | 2014-08-01 | 2018-06-29 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de production de variants ayant un fc presentant une sialylation amelioree |
MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
MX2017006323A (es) | 2014-11-21 | 2017-08-21 | Bristol Myers Squibb Co | Anticuerpos que comprenden regiones constantes pesadas modificadas. |
PT3221363T (pt) | 2014-11-21 | 2020-07-23 | Bristol Myers Squibb Co | Anticorpos contra cd73 e utilizações dos mesmos |
KR20180054923A (ko) | 2014-12-19 | 2018-05-24 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법 |
PL3233921T3 (pl) | 2014-12-19 | 2022-01-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania |
SG11201705063VA (en) | 2014-12-23 | 2017-07-28 | Bristol Myers Squibb Co | Antibodies to tigit |
US10464999B2 (en) | 2015-01-28 | 2019-11-05 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
US9879080B2 (en) | 2015-01-28 | 2018-01-30 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
US10633433B2 (en) | 2015-01-28 | 2020-04-28 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
CN114773469A (zh) | 2015-02-05 | 2022-07-22 | 中外制药株式会社 | 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体,fc区变体,il-8-结合抗体及其应用 |
AU2016219534B2 (en) | 2015-02-09 | 2021-07-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Multi-specific antibodies with affinity for human A33 antigen and dota metal complex and uses thereof |
US10457737B2 (en) | 2015-02-09 | 2019-10-29 | Research Development Foundation | Engineered immunoglobulin Fc polypeptides displaying improved complement activation |
US10202453B2 (en) * | 2015-02-13 | 2019-02-12 | Sorrento Therapeutics, Inc. | Antibody therapeutics that bind CTLA4 |
KR101892883B1 (ko) | 2015-02-27 | 2018-10-05 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | Il-6 관련 질환 치료용 조성물 |
LT3303396T (lt) | 2015-05-29 | 2023-01-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Antikūnai prieš ox40 ir jų panaudojimo būdai |
US20180171017A1 (en) * | 2015-06-05 | 2018-06-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Combined use of immune activators |
WO2017004006A1 (en) | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibodies to cd40 |
US10526408B2 (en) | 2015-08-28 | 2020-01-07 | Research Development Foundation | Engineered antibody FC variants |
KR20230079500A (ko) | 2015-09-18 | 2023-06-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | Il-8에 결합하는 항체 및 그의 사용 |
WO2017086419A1 (ja) | 2015-11-18 | 2017-05-26 | 中外製薬株式会社 | 液性免疫応答の増強方法 |
US11660340B2 (en) | 2015-11-18 | 2023-05-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function |
CA3006462C (en) * | 2015-12-14 | 2023-10-31 | Macrogenics, Inc. | Bispecific molecules having immunoreactivity with pd-1 and ctla-4, and methods of use thereof |
US11359009B2 (en) | 2015-12-25 | 2022-06-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-myostatin antibodies and methods of use |
KR20220033522A (ko) | 2016-03-04 | 2022-03-16 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 항-cd73 항체와의 조합 요법 |
AU2017256786B2 (en) * | 2016-04-29 | 2024-06-13 | Horizon Therapeutics Ireland Dac | Binding molecules specific for FcγGamma RIIA and uses thereof |
EP3470424A4 (en) * | 2016-06-08 | 2020-03-04 | Shanghai Jiaotong University School of Medicine | SEQUENCE OF HEAVY CHAIN CONSTANT ANTIBODY REGION TO INCREASE AGONIST-ANTIBODY ACTIVITY |
KR102306744B1 (ko) | 2016-06-17 | 2021-09-28 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항-마이오스타틴 항체 및 사용 방법 |
WO2018007999A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | Staten Biotechnology B.V. | Anti-apoc3 antibodies and methods of use thereof |
BR112019001989A2 (pt) | 2016-08-02 | 2019-08-20 | Visterra Inc | polipeptídeos projetados e usos dos mesmos |
AU2017305073B2 (en) | 2016-08-05 | 2024-02-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Composition for prevention or treatment of IL-8 related diseases |
SG10201607778XA (en) | 2016-09-16 | 2018-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use |
JP7191833B2 (ja) | 2017-01-30 | 2022-12-19 | 中外製薬株式会社 | 抗スクレロスチン抗体およびその使用 |
WO2018148447A1 (en) * | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Adimab, Llc | Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor |
KR20190118172A (ko) | 2017-02-08 | 2019-10-17 | 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. | 천연 킬러 세포의 활성화를 위한 다중-특이적 결합 단백질 및 암 치료에서의 그의 치료적 용도 |
BR112019017197A2 (pt) | 2017-02-20 | 2020-04-14 | Dragonfly Therapeutics Inc | proteínas que se ligam a her2, nkg2d e cd16 |
TWI788340B (zh) | 2017-04-07 | 2023-01-01 | 美商必治妥美雅史谷比公司 | 抗icos促效劑抗體及其用途 |
AU2018255938A1 (en) | 2017-04-21 | 2019-10-31 | Staten Biotechnology B.V. | Anti-ApoC3 antibodies and methods of use thereof |
WO2018203545A1 (ja) | 2017-05-02 | 2018-11-08 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター | Il-6及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法 |
KR20220167342A (ko) | 2017-05-25 | 2022-12-20 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 |
CA3065171A1 (en) * | 2017-06-05 | 2018-12-13 | Janssen Biotech, Inc. | Engineered multispecific antibodies and other multimeric proteins with asymmetrical ch2-ch3 region mutations |
KR20200074956A (ko) | 2017-10-06 | 2020-06-25 | 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 | 항-트랜스타이레틴 항체 |
WO2019087115A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Staten Biotechnology B.V. | Anti-apoc3 antibodies and methods of use thereof |
US10538583B2 (en) | 2017-10-31 | 2020-01-21 | Staten Biotechnology B.V. | Anti-APOC3 antibodies and compositions thereof |
CN111556895B (zh) | 2017-11-14 | 2024-09-13 | 中外制药株式会社 | 抗-c1s抗体及使用方法 |
PE20211453A1 (es) | 2017-11-29 | 2021-08-05 | Prothena Biosciences Ltd | Formulacion liofilizada de un anticuerpo monoclonal contra transtirretina |
JP7284759B2 (ja) | 2017-12-27 | 2023-05-31 | ブリストル-マイヤーズ スクイブ カンパニー | 抗cd40抗体およびその使用 |
FI3749346T3 (fi) | 2018-02-08 | 2024-09-04 | Dragonfly Therapeutics Inc | Nkg2d-reseptoriin kohdistuvat vasta-aineen vaihtelevan domeenin yhdistelmät |
JP7326764B2 (ja) * | 2018-03-09 | 2023-08-16 | 東ソー株式会社 | 腫瘍マーカーならびに腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して回収および検出する方法 |
CA3093729A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use |
BR112021002037A2 (pt) | 2018-08-10 | 2021-05-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | molécula de ligação de antígeno anti-cd137 e uso da mesma |
JP2022513653A (ja) | 2018-11-28 | 2022-02-09 | ブリストル-マイヤーズ スクイブ カンパニー | 修飾された重鎖定常領域を含む抗体 |
US20220153875A1 (en) | 2019-03-19 | 2022-05-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule containing antigen-binding domain of which binding activity to antigen is changed depending on mta, and library for obtaining said antigen-binding domain |
US20240058466A1 (en) * | 2019-10-04 | 2024-02-22 | TAE Life Sciences | Antibody Compositions Comprising Fc Mutations and Site-Specific Conjugation Properties For Use In Treating Cancer, Immunological Disorders, and Methods Thereof |
WO2021102376A1 (en) * | 2019-11-20 | 2021-05-27 | Abvision, Inc. | Monoclonal antibodies that target human cd47 protein |
BR112022012010A2 (pt) | 2019-12-18 | 2022-08-30 | Hoffmann La Roche | Anticorpos, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, formulação farmacêutica, uso do anticorpo, método de produção de um anticorpo, método de tratamento de um indivíduo que tem câncer e método de tratamento de um indivíduo que tem uma doença inflamatória ou autoimune |
TW202140553A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商威特拉公司 | C5ar1抗體分子及其用途 |
TW202144395A (zh) | 2020-02-12 | 2021-12-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子 |
WO2021231732A1 (en) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibodies to garp |
GB2595299B (en) | 2020-05-21 | 2022-08-03 | Mabsolve Ltd | Modified immunoglobulin FC regions |
EP4172210A4 (en) * | 2020-06-30 | 2024-10-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | SITE-SPECIFIC NOTCH-ACTIVATING MOLECULE AND USES THEREOF |
CN112649417B (zh) * | 2020-12-01 | 2021-10-29 | 西北大学 | 一种检测mmp-14的电化学发光生物传感器及其制备方法 |
WO2022155340A1 (en) | 2021-01-13 | 2022-07-21 | Visterra, Inc. | Humanized complement 5a receptor 1 antibodies and methods of use thereof |
CA3221735A1 (en) | 2021-06-18 | 2022-12-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Bispecific anti-ccl2 antibodies |
CN113834939A (zh) * | 2021-09-18 | 2021-12-24 | 胜亚生物科技(厦门)有限公司 | 一种用于检测川崎病及疗效评估的试剂、试剂盒及应用 |
US20230272072A1 (en) * | 2021-10-21 | 2023-08-31 | Seismic Therapeutic, Inc. | Dual targeted immune regulating compositions |
GB202204016D0 (en) * | 2022-03-22 | 2022-05-04 | Ucl Business Plc | Affinity chromatography ligands for antibody glycovariant separation |
AU2023264772A1 (en) | 2022-05-02 | 2024-10-24 | Novo Nordisk A/S | Novel anti-angptl3 antibodies suitable for high concentration compositions and subcutaneous administration |
WO2023239940A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Research Development Foundation | Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof |
US12030945B2 (en) | 2022-10-25 | 2024-07-09 | Seismic Therapeutic, Inc. | Variant IgG Fc polypeptides and uses thereof |
Family Cites Families (290)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE370449B (pt) | 1970-08-29 | 1974-10-14 | Philips Nv | |
JPS5334319B2 (pt) | 1971-12-28 | 1978-09-20 | ||
JPS5334319U (pt) | 1976-08-28 | 1978-03-25 | ||
US4769320A (en) | 1982-07-27 | 1988-09-06 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Immunoassay means and methods useful in human native prothrombin and human abnormal prothorombin determinations |
US4738927A (en) | 1982-03-31 | 1988-04-19 | Ajinomoto Co. Inc. | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
ES8404858A1 (es) | 1982-04-12 | 1984-05-16 | Hybritech Inc | Un procedimiento para la purificacion de un anticuerpo. |
US4689299A (en) | 1982-09-30 | 1987-08-25 | University Of Rochester | Human monoclonal antibodies against bacterial toxins |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
JPH06104071B2 (ja) | 1986-08-24 | 1994-12-21 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 第▲ix▼因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体 |
US4801687A (en) | 1986-10-27 | 1989-01-31 | Bioprobe International, Inc. | Monoclonal antibody purification process using protein A |
US4851341A (en) * | 1986-12-19 | 1989-07-25 | Immunex Corporation | Immunoaffinity purification system |
US5004697A (en) | 1987-08-17 | 1991-04-02 | Univ. Of Ca | Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier |
JPH01144991A (ja) | 1987-12-02 | 1989-06-07 | Kagaku Oyobi Ketsusei Riyouhou Kenkyusho | 血液凝固第8因子の精製方法 |
US5322678A (en) | 1988-02-17 | 1994-06-21 | Neorx Corporation | Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5202253A (en) | 1988-12-30 | 1993-04-13 | Oklahoma Medical Research Foundation | Monoclonal antibody specific for protein C and antibody purification method |
CA2006684C (en) | 1988-12-30 | 1996-12-17 | Charles T. Esmon | Monoclonal antibody against protein c |
JPH0636741B2 (ja) * | 1989-11-08 | 1994-05-18 | 帝人株式会社 | ヒト・プロテインcの分離方法 |
DE69130561T2 (de) | 1990-02-16 | 1999-06-24 | Boston Biomedical Research Institute, Inc., Boston, Mass. | Hybride Reagenzien mit der Fähigkeit, Moleküle selektiv in Zellen freizusetzen |
ATE185601T1 (de) | 1990-07-10 | 1999-10-15 | Cambridge Antibody Tech | Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
DK0546073T3 (da) | 1990-08-29 | 1998-02-02 | Genpharm Int | Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer |
AU668349B2 (en) | 1991-04-25 | 1996-05-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor |
ATE181571T1 (de) | 1991-09-23 | 1999-07-15 | Medical Res Council | Methoden zur herstellung humanisierter antikörper |
PT1024191E (pt) | 1991-12-02 | 2008-12-22 | Medical Res Council | Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos |
AU3328493A (en) | 1991-12-17 | 1993-07-19 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
GB9203459D0 (en) | 1992-02-19 | 1992-04-08 | Scotgen Ltd | Antibodies with germ-line variable regions |
WO1993019172A1 (en) | 1992-03-24 | 1993-09-30 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
WO1994002602A1 (en) | 1992-07-24 | 1994-02-03 | Cell Genesys, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
CA2161351C (en) | 1993-04-26 | 2010-12-21 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
EP0710288B1 (en) | 1993-06-10 | 2006-04-05 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviral vectors for treatment of hemophilia |
GB9313509D0 (en) | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Medical Res Council | Chemisynthetic libraries |
FR2707189B1 (fr) | 1993-07-09 | 1995-10-13 | Gradient Ass | Procédé de traitement de résidus de combustion et installation de mise en Óoeuvre dudit procédé. |
GB9314271D0 (en) | 1993-07-09 | 1993-08-18 | Inst Of Cancer The Research | Cell growth factor receptors |
IL107742A0 (en) | 1993-11-24 | 1994-02-27 | Yeda Res & Dev | Chemically-modified binding proteins |
EP0731842A1 (en) | 1993-12-03 | 1996-09-18 | Medical Research Council | Recombinant binding proteins and peptides |
US6074642A (en) | 1994-05-02 | 2000-06-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis |
KR100261941B1 (ko) | 1994-07-13 | 2000-07-15 | 나가야마 오사무 | 사람의 인터루킨-8에 대한 재구성 사람항체 |
US6309636B1 (en) | 1995-09-14 | 2001-10-30 | Cancer Research Institute Of Contra Costa | Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides |
EP0783893B1 (en) | 1994-10-07 | 2012-04-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Inhibition of abnormal growth of synovial cells using il-6 antagonist as active ingredient |
CZ298325B6 (cs) | 1994-10-21 | 2007-08-29 | Kishimoto@Tadamitsu | Farmaceutický prípravek pro prevenci nebo lécení plasmocytosy |
US6485943B2 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The University Of Chicago | Method for altering antibody light chain interactions |
ES2304786T3 (es) | 1995-04-27 | 2008-10-16 | Amgen Fremont Inc. | Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados. |
WO1996034096A1 (en) | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5830478A (en) | 1995-06-07 | 1998-11-03 | Boston Biomedical Research Institute | Method for delivering functional domains of diphtheria toxin to a cellular target |
US5783186A (en) | 1995-12-05 | 1998-07-21 | Amgen Inc. | Antibody-induced apoptosis |
CA2249195A1 (en) | 1996-03-18 | 1997-09-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobin-like domains with increased half lives |
ZA976326B (en) | 1996-07-19 | 1998-02-03 | Amgen Inc | Analogs of cationic proteins. |
US5990286A (en) | 1996-12-18 | 1999-11-23 | Techniclone, Inc. | Antibodies with reduced net positive charge |
US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
US7365166B2 (en) | 1997-04-07 | 2008-04-29 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
US6884879B1 (en) | 1997-04-07 | 2005-04-26 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
HU226175B1 (en) | 1997-04-17 | 2008-06-30 | Amgen Inc | Human ob protein suspension, process for producing thereof and use for production of pharmaceutical composition |
NZ503489A (en) | 1997-10-03 | 2002-11-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Natural humanized antibody, method of production and pharmaceutical composition |
JP3998419B2 (ja) | 1998-04-03 | 2007-10-24 | 中外製薬株式会社 | ヒト組織因子(tf)に対するヒト型化抗体およびヒト型化抗体の作製方法 |
GB9809951D0 (en) * | 1998-05-08 | 1998-07-08 | Univ Cambridge Tech | Binding molecules |
WO2000009560A2 (en) | 1998-08-17 | 2000-02-24 | Abgenix, Inc. | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
US6475718B2 (en) | 1998-09-08 | 2002-11-05 | Schering Aktiengesellschaft | Methods and compositions for modulating the interaction between the APJ receptor and the HIV virus |
RU2236222C2 (ru) * | 1998-09-11 | 2004-09-20 | Айлексус Пти Лимитед | Модуляторы fc-рецептора и их применение |
JP2002531466A (ja) | 1998-12-01 | 2002-09-24 | プロテイン デザイン ラブス, インコーポレイテッド | γ−インターフェロンに対するヒト化抗体 |
PL220113B1 (pl) | 1999-01-15 | 2015-08-31 | Genentech Inc | Wariant macierzystego polipeptydu zawierającego region Fc, polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania receptora Fc gamma (FcγR), polipeptyd zawierający wariant regionu Fc o zmienionym powinowactwie wiązania noworodkowego receptora Fc (FcRn), kompozycja, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, komórka gospodarza, sposób otrzymywania wariantu polipeptydu, zastosowanie wariantu polipeptydu i sposób otrzymywania wariantu regionu Fc |
US6737056B1 (en) * | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US7183387B1 (en) | 1999-01-15 | 2007-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US6972125B2 (en) | 1999-02-12 | 2005-12-06 | Genetics Institute, Llc | Humanized immunoglobulin reactive with B7-2 and methods of treatment therewith |
SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
SE9903895D0 (sv) | 1999-10-28 | 1999-10-28 | Active Biotech Ab | Novel compounds |
AU5471501A (en) | 2000-03-22 | 2001-10-03 | Octagene Gmbh | Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines |
FR2807767B1 (fr) | 2000-04-12 | 2005-01-14 | Lab Francais Du Fractionnement | Anticorps monoclonaux anti-d |
HUP0301835A2 (hu) | 2000-05-03 | 2003-09-29 | Mbt Munich Biotechnology Ag | Kationos diagnosztikai, képalkotó és terápiás ágensek, aktivált vaszkuláris helyekkel asszociálódva |
KR20060088905A (ko) | 2000-06-16 | 2006-08-07 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 | 면역특이적으로 BLyS에 결합하는 항체 |
ATE448301T1 (de) | 2000-09-08 | 2009-11-15 | Univ Zuerich | Sammlung von proteinen mit sich wiederholenden sequenzen (repeat proteins), die repetitive sequenzmodule enthalten |
WO2002032925A2 (en) | 2000-10-16 | 2002-04-25 | Phylos, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
EP2357187A1 (en) | 2000-12-12 | 2011-08-17 | MedImmune, LLC | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
US20040001839A1 (en) | 2000-12-29 | 2004-01-01 | Avigdor Levanon | Multimers - isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof |
US20040001822A1 (en) | 2000-12-29 | 2004-01-01 | Avigdor Levanon | Y1-isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof |
US20040002450A1 (en) | 2000-12-29 | 2004-01-01 | Janette Lazarovits | Y17 - isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof |
US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
GEP20074252B (en) | 2001-04-13 | 2007-12-10 | Biogen Idec Inc | Antibodies to vla-1 |
US7667004B2 (en) | 2001-04-17 | 2010-02-23 | Abmaxis, Inc. | Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor |
US20030157561A1 (en) | 2001-11-19 | 2003-08-21 | Kolkman Joost A. | Combinatorial libraries of monomer domains |
US20040236080A1 (en) | 2001-06-22 | 2004-11-25 | Hiroyuki Aburatani | Cell proliferation inhibitors containing anti-glypican 3 antibody |
JP4303105B2 (ja) | 2001-06-28 | 2009-07-29 | ドマンティス リミテッド | 二重特異性リガンドとその利用 |
WO2004058821A2 (en) | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
US20040161741A1 (en) | 2001-06-30 | 2004-08-19 | Elazar Rabani | Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification |
US20030049203A1 (en) | 2001-08-31 | 2003-03-13 | Elmaleh David R. | Targeted nucleic acid constructs and uses related thereto |
ES2624547T3 (es) | 2001-11-14 | 2017-07-14 | Janssen Biotech, Inc. | Anticuerpos anti il 6, composiciones, métodos y usos |
US20050171339A1 (en) | 2001-12-28 | 2005-08-04 | Izumi Sugo | Method of stabilizing protein |
JP2006506943A (ja) | 2002-02-11 | 2006-03-02 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 抗原結合速度の大きい抗体変異体 |
AR038568A1 (es) | 2002-02-20 | 2005-01-19 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-a beta y su uso |
US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
US20080199471A1 (en) | 2002-03-01 | 2008-08-21 | Bernett Matthew J | Optimized cd40 antibodies and methods of using the same |
US20090042291A1 (en) | 2002-03-01 | 2009-02-12 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
AU2003217912A1 (en) | 2002-03-01 | 2003-09-16 | Xencor | Antibody optimization |
US8188231B2 (en) * | 2002-09-27 | 2012-05-29 | Xencor, Inc. | Optimized FC variants |
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US7662925B2 (en) * | 2002-03-01 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants and methods for their generation |
AU2003248652A1 (en) | 2002-06-12 | 2003-12-31 | Genencor International, Inc. | Methods for improving a binding characteristic of a molecule |
US20060141456A1 (en) | 2002-06-12 | 2006-06-29 | Cynthia Edwards | Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target |
ITMI20021527A1 (it) | 2002-07-11 | 2004-01-12 | Consiglio Nazionale Ricerche | Anticorpi anti componente c5 del complemento e loro uso |
US20050260213A1 (en) * | 2004-04-16 | 2005-11-24 | Scott Koenig | Fcgamma-RIIB-specific antibodies and methods of use thereof |
US8193318B2 (en) * | 2002-08-14 | 2012-06-05 | Macrogenics, Inc. | FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof |
JP2005535341A (ja) | 2002-08-15 | 2005-11-24 | エピトミスク インコーポレーティッド | ヒト化ウサギ抗体 |
CN101987871A (zh) | 2002-09-27 | 2011-03-23 | 赞科股份有限公司 | 优化的Fc变体及其产生方法 |
RU2325186C2 (ru) | 2002-09-27 | 2008-05-27 | Ксенкор, Инк. | АНТИТЕЛО, СОДЕРЖАЩЕЕ Fc-ВАРИАНТНУЮ ЧАСТЬ (ВАРИАНТЫ), ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИТЕЛО, И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО |
US7217797B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
AU2003286467B2 (en) | 2002-10-15 | 2009-10-01 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
US7361740B2 (en) | 2002-10-15 | 2008-04-22 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
AU2003285874A1 (en) | 2002-10-16 | 2004-05-04 | Amgen Inc. | HUMAN ANTI-IFN-Gamma NEUTRALIZING ANTIBODIES AS SELECTIVE IFN-Gamma PATHWAY INHIBITORS |
US7960512B2 (en) | 2003-01-09 | 2011-06-14 | Macrogenics, Inc. | Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same |
JP2006517109A (ja) | 2003-02-07 | 2006-07-20 | プロテイン デザイン ラブス インコーポレイテッド | アンフィレグリン抗体ならびに癌および乾癬を処置するためのその使用 |
PT1601697E (pt) | 2003-02-28 | 2007-09-04 | Lonza Biologics Plc | Purificação de anticorpos através de proteína a e cromatografia de troca iónica. |
US8388955B2 (en) | 2003-03-03 | 2013-03-05 | Xencor, Inc. | Fc variants |
US20090010920A1 (en) * | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
GB2401040A (en) | 2003-04-28 | 2004-11-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for treating interleukin-6 related diseases |
RU2337107C2 (ru) | 2003-05-02 | 2008-10-27 | Ксенкор, Инк. | ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ Fc-ВАРИАНТЫ, ИМЕЮЩИЕ ИЗМЕНЕННОЕ СВЯЗЫВАНИЕ С FcγR, И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ |
DK1631313T3 (en) | 2003-06-05 | 2015-06-15 | Genentech Inc | Combination therapy for b cell disorders |
WO2005027966A2 (en) | 2003-09-05 | 2005-03-31 | Genentech, Inc. | Antibodies with altered effector functions |
JP2005101105A (ja) | 2003-09-22 | 2005-04-14 | Canon Inc | 位置決め装置、露光装置、デバイス製造方法 |
US8101720B2 (en) * | 2004-10-21 | 2012-01-24 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions |
AU2003271174A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Double specific antibodies substituting for functional protein |
CA2545539A1 (en) | 2003-10-15 | 2005-04-28 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis of positions 250, 314 and/or 428 of the heavy chain constant region of ig |
AU2004284090A1 (en) | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Avidia, Inc. | LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers |
EP1689777B1 (en) | 2003-11-05 | 2007-04-25 | Ares Trading S.A. | Process for the purification of il-18 binding protein |
EP2385069A3 (en) | 2003-11-12 | 2012-05-30 | Biogen Idec MA Inc. | Neonatal Fc rReceptor (FcRn)- binding polypeptide variants, dimeric Fc binding proteins and methods related thereto |
US20050142133A1 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-30 | Xencor, Inc. | Optimized proteins that target the epidermal growth factor receptor |
CN102344491B (zh) | 2003-12-10 | 2015-03-11 | 梅达雷克斯有限责任公司 | 干扰素α抗体及其用途 |
WO2005077981A2 (en) | 2003-12-22 | 2005-08-25 | Xencor, Inc. | Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES |
EA012872B1 (ru) | 2004-01-09 | 2009-12-30 | Пфайзер Инк. | АНТИТЕЛА ПРОТИВ MAdCAM |
EP1706424B1 (en) | 2004-01-12 | 2009-07-22 | Applied Molecular Evolution, Inc. | Fc region variants |
US20080145367A1 (en) | 2004-02-11 | 2008-06-19 | Warner-Lambert Compay, Llc | Methods of Treating Osteoarthritis with Il-6 Antagonists |
WO2005092925A2 (en) | 2004-03-24 | 2005-10-06 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin variants outside the fc region |
US20050260711A1 (en) | 2004-03-30 | 2005-11-24 | Deepshikha Datta | Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids |
WO2005123780A2 (en) | 2004-04-09 | 2005-12-29 | Protein Design Labs, Inc. | Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
WO2005112564A2 (en) | 2004-04-15 | 2005-12-01 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Germline and sequence variants of humanized antibodies and methods of making and using them |
KR100620554B1 (ko) | 2004-06-05 | 2006-09-06 | 한국생명공학연구원 | Tag-72에 대한 인간화 항체 |
AR049390A1 (es) | 2004-06-09 | 2006-07-26 | Wyeth Corp | Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos |
US7632924B2 (en) | 2004-06-18 | 2009-12-15 | Ambrx, Inc. | Antigen-binding polypeptides and their uses |
CN101163498B (zh) | 2004-06-18 | 2011-10-05 | 诺华疫苗和诊断公司 | 用于诊断汉他病毒感染的方法和试剂 |
JP2008504289A (ja) | 2004-06-25 | 2008-02-14 | メディミューン,インコーポレーテッド | 部位特異的突然変異誘発による哺乳動物細胞における組換え抗体の産生の増加 |
CN103172731A (zh) | 2004-07-15 | 2013-06-26 | 赞科股份有限公司 | 优化的Fc变体 |
MX2007000644A (es) | 2004-07-20 | 2007-03-28 | Symphogen As | Anticuerpo policlonal recombinante anti-rhesus d y metodos de fabricacion. |
PL1776384T3 (pl) | 2004-08-04 | 2013-10-31 | Mentrik Biotech Llc | WARIANTY REGIONÓW Fc |
EP1787998A4 (en) | 2004-08-11 | 2008-08-27 | Mitsubishi Chem Corp | ANTIBODIES AND USE RELATING THERETO |
AU2005277641A1 (en) | 2004-08-16 | 2006-03-02 | Medimmune, Llc | Eph receptor Fc variants with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity |
WO2006031370A2 (en) | 2004-08-19 | 2006-03-23 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
MX2007002883A (es) | 2004-09-13 | 2007-06-15 | Macrogenics Inc | Anticuerpos humanizados contra el virus de nilo occidental y usos terapeuticos y profilacticos del mismo. |
AU2005284006A1 (en) | 2004-09-14 | 2006-03-23 | Health Protection Agency | Vaccine |
US7563443B2 (en) | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
US7964706B2 (en) | 2004-10-22 | 2011-06-21 | Medimmune, Llc | High affinity antibodies against HMGB1 and methods of use thereof |
WO2006050166A2 (en) | 2004-10-29 | 2006-05-11 | Medimmune, Inc. | Methods of preventing and treating rsv infections and related conditions |
US7462697B2 (en) | 2004-11-08 | 2008-12-09 | Epitomics, Inc. | Methods for antibody engineering |
WO2007024249A2 (en) | 2004-11-10 | 2007-03-01 | Macrogenics, Inc. | Engineering fc antibody regions to confer effector function |
US8802820B2 (en) | 2004-11-12 | 2014-08-12 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
US20070135620A1 (en) | 2004-11-12 | 2007-06-14 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
US9200079B2 (en) | 2004-11-12 | 2015-12-01 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
CN101098890B (zh) | 2004-11-12 | 2012-07-18 | 赞科股份有限公司 | 对FcRn的结合被改变的Fc变体 |
US8367805B2 (en) | 2004-11-12 | 2013-02-05 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
US20090061485A1 (en) | 2004-12-22 | 2009-03-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of Producing an Antibody Using a Cell in Which the Function of Fucose Transporter Is Inhibited |
AU2005318700B2 (en) | 2004-12-23 | 2011-04-14 | Novo Nordisk A/S | Antibody binding affinity ligands |
AU2006204791A1 (en) * | 2005-01-12 | 2006-07-20 | Xencor, Inc | Antibodies and Fc fusion proteins with altered immunogenicity |
GB0502358D0 (en) | 2005-02-04 | 2005-03-16 | Novartis Ag | Organic compounds |
AU2006230413B8 (en) | 2005-03-31 | 2011-01-20 | Xencor, Inc | Fc variants with optimized properties |
TWI544076B (zh) | 2005-03-31 | 2016-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | A method of manufacturing a polypeptide that controls assembly |
WO2006109592A1 (ja) | 2005-04-08 | 2006-10-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 血液凝固第viii因子の機能代替抗体 |
CN103342751B (zh) | 2005-04-18 | 2015-12-23 | 安进研发(慕尼黑)股份有限公司 | 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体中和剂 |
CA2606102C (en) | 2005-04-26 | 2014-09-30 | Medimmune, Inc. | Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering |
EP2221316A1 (en) | 2005-05-05 | 2010-08-25 | Duke University | Anti-CD19 antibody therapy for autoimmune disease |
WO2006130834A2 (en) | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | IGGl ANTIBODIES WITH MUTATED FC PORTION FOR INCREASED BINDING TO FCRN RECEPTOR AND USES THEREOF |
FR2888850B1 (fr) | 2005-07-22 | 2013-01-11 | Pf Medicament | Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications |
DK1919503T3 (en) | 2005-08-10 | 2014-12-15 | Macrogenics Inc | Identification and preparation of antibodies with variant fc regions and methods of use thereof |
JP2009504787A (ja) | 2005-08-19 | 2009-02-05 | シーラス コーポレイション | 抗体によって媒介される免疫応答の増強 |
CN103450359B (zh) | 2005-08-19 | 2018-07-24 | 惠氏有限责任公司 | 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途 |
AU2006299429B2 (en) | 2005-10-03 | 2012-02-23 | Xencor, Inc. | Fc variants with optimized Fc receptor binding properties |
KR20080073293A (ko) | 2005-10-14 | 2008-08-08 | 메디뮨 엘엘씨 | 항체 라이브러리의 세포 디스플레이 |
US8679490B2 (en) | 2005-11-07 | 2014-03-25 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences |
WO2007060411A1 (en) | 2005-11-24 | 2007-05-31 | Ucb Pharma S.A. | Anti-tnf alpha antibodies which selectively inhibit tnf alpha signalling through the p55r |
PL2548577T3 (pl) | 2005-12-29 | 2017-08-31 | Janssen Biotech, Inc | Ludzkie przeciwciała anty-il-23 , kompozycje, sposoby i zastosowania |
WO2007114325A1 (ja) | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法 |
CN101479381B (zh) | 2006-03-31 | 2015-04-29 | 中外制药株式会社 | 调控抗体血液动力学的方法 |
TWI392684B (zh) | 2006-04-05 | 2013-04-11 | Abbott Biotech Ltd | 抗體之純化 |
TWI395754B (zh) | 2006-04-24 | 2013-05-11 | Amgen Inc | 人類化之c-kit抗體 |
CA2660592C (en) | 2006-05-26 | 2016-07-12 | Macrogenics, Inc. | Humanized fc.gamma.riib-specific antibodies and methods of use thereof |
PE20080333A1 (es) | 2006-06-08 | 2008-06-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias |
CA2656224C (en) | 2006-06-26 | 2018-01-09 | Macrogenics, Inc. | Combination of fc.gamma.riib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof |
PL2059536T3 (pl) | 2006-08-14 | 2014-07-31 | Xencor Inc | Zoptymalizowane przeciwciała ukierunkowane na CD19 |
EP3424950A1 (en) | 2006-10-06 | 2019-01-09 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Prevention of tissue ischemia, related methods and compositions |
US20100034194A1 (en) | 2006-10-11 | 2010-02-11 | Siemens Communications Inc. | Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks |
US8652466B2 (en) | 2006-12-08 | 2014-02-18 | Macrogenics, Inc. | Methods for the treatment of disease using immunoglobulins having Fc regions with altered affinities for FcγRactivating and FcγRinhibiting |
JP5357778B2 (ja) | 2007-01-23 | 2013-12-04 | ゼンコー・インコーポレイテッド | 最適化cd40抗体および前記を使用する方法 |
WO2008092117A2 (en) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Xencor, Inc. | Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region |
WO2008114011A2 (en) | 2007-03-19 | 2008-09-25 | Medimmune Limited | Fc polypeptide variants obtained by ribosome display methodology |
US20090252729A1 (en) | 2007-05-14 | 2009-10-08 | Farrington Graham K | Single-chain Fc (scFc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto |
EP2708557A1 (en) | 2007-05-30 | 2014-03-19 | Xencor, Inc. | Method and compositions for inhibiting CD32B expressing cells |
EP3543691A1 (en) | 2007-06-29 | 2019-09-25 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Analysis of amino acids in body fluid by liquid chromatography-mass spectrometry |
US8940872B2 (en) | 2007-07-06 | 2015-01-27 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | Antibody binding specifically to TDP-43 aggregate |
JOP20080381B1 (ar) | 2007-08-23 | 2023-03-28 | Amgen Inc | بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9) |
AU2008304778B9 (en) | 2007-09-26 | 2014-05-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR |
TWI578998B (zh) | 2007-09-26 | 2017-04-21 | 中外製藥股份有限公司 | 抗il-6受體的抗體 |
JP5484060B2 (ja) | 2007-09-26 | 2014-05-07 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
EP2617736A1 (en) | 2007-09-28 | 2013-07-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-glypican 3 antibody having improved kinetics in plasma |
KR100888133B1 (ko) * | 2007-10-02 | 2009-03-13 | 에스케이에너지 주식회사 | 4종의 금속성분으로 구성된 다성분계 비스무스몰리브데이트 촉매 제조방법 및 상기촉매를 이용하여1,3-부타디엔을 제조하는 방법 |
US20100249381A1 (en) | 2007-10-22 | 2010-09-30 | David Delvaille | Method for Purifying FC-Fusion Proteins |
WO2009062051A2 (en) | 2007-11-08 | 2009-05-14 | Pikamab, Inc. | Methods and compositions for antibody therapy |
AU2008343855B2 (en) | 2007-12-21 | 2013-08-15 | Amgen Inc. | Anti-amyloid antibodies and uses thereof |
CA2958185C (en) | 2007-12-26 | 2020-08-25 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to fcrn |
US8426141B2 (en) | 2008-01-18 | 2013-04-23 | Stichting Sanquin Bloedvoorziening | Methods for increasing the therapeutic efficacy of immunoglobulin G class 3 (IgG3) antibodies |
EP2245065A1 (en) | 2008-01-23 | 2010-11-03 | Xencor, Inc. | Optimized cd40 antibodies and methods of using the same |
EP2238156B1 (en) | 2008-01-29 | 2014-10-01 | Ablynx N.V. | Methods to stabilize proteins and polypeptides |
PT2275443E (pt) | 2008-04-11 | 2016-03-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Moléculas de ligação ao antigénio capazes de se ligarem, repetidamente, a duas ou mais moléculas de antigénio |
CN108467431A (zh) | 2008-04-25 | 2018-08-31 | 戴埃克斯有限公司 | 针对fcrn的抗体及其用途 |
WO2009139822A1 (en) | 2008-05-01 | 2009-11-19 | Amgen Inc. | Anti-hepcidin antibodies and methods of use |
WO2009155513A2 (en) | 2008-06-20 | 2009-12-23 | Novartis Ag | Immunoglobulins with reduced aggregation |
AU2009279197B2 (en) | 2008-08-05 | 2013-12-12 | Novartis Ag | Compositions and methods for antibodies targeting complement protein C5 |
JP5028372B2 (ja) | 2008-09-26 | 2012-09-19 | 京セラドキュメントソリューションズ株式会社 | 画像処理装置、画像処理方法及び画像処理プログラム |
TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
MX2011004001A (es) | 2008-10-14 | 2011-05-19 | Genentech Inc | Variantes de inmunoglobulinas y sus usos. |
JP5807300B2 (ja) * | 2008-11-18 | 2015-11-10 | 株式会社シノテスト | 試料中のc反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬 |
JO3672B1 (ar) | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
AU2010203353B2 (en) | 2009-01-12 | 2016-06-16 | Cytomx Therapeutics, Inc | Modified antibody compositions, methods of making and using thereof |
CN102369291A (zh) | 2009-01-23 | 2012-03-07 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 效应子功能降低的稳定Fc多肽及使用方法 |
WO2010098863A1 (en) | 2009-02-26 | 2010-09-02 | Lpath, Inc. | Humanized platelet activating factor antibody design using anti-lipid antibody templates |
TWI646193B (zh) | 2009-03-19 | 2019-01-01 | 中外製藥股份有限公司 | 抗體恆定區域改變體 |
SG10201900451SA (en) * | 2009-03-19 | 2019-02-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Pharmaceutical formulation containing improved antibody molecules |
EP2233500A1 (en) | 2009-03-20 | 2010-09-29 | LFB Biotechnologies | Optimized Fc variants |
AU2010201495B2 (en) | 2009-04-16 | 2012-04-12 | Accenture Global Services Limited | Touchpoint customization system |
EP2435079A4 (en) | 2009-05-26 | 2012-11-14 | Univ Johns Hopkins | NEW DESMINPHOSPHORYLATION ORTE FOR DIAGNOSIS AND INFLUENCING DISEASES |
MX2011014008A (es) * | 2009-06-26 | 2012-06-01 | Regeneron Pharma | Anticuerpos biespecificos facilmente aislados con formato de inmunoglobulina original. |
CN102549016B (zh) | 2009-06-30 | 2015-05-06 | 研究发展基金会 | 免疫球蛋白fc多肽 |
JP5208882B2 (ja) | 2009-08-10 | 2013-06-12 | ルネサスエレクトロニクス株式会社 | 表示装置用電源回路 |
NZ599148A (en) | 2009-10-06 | 2014-08-29 | Medimmune Ltd | Rsv-specific binding molecule |
US8568726B2 (en) | 2009-10-06 | 2013-10-29 | Medimmune Limited | RSV specific binding molecule |
US9096877B2 (en) | 2009-10-07 | 2015-08-04 | Macrogenics, Inc. | Fc region-containing polypeptides that exhibit improved effector function due to alterations of the extent of fucosylation, and methods for their use |
WO2011091078A2 (en) | 2010-01-19 | 2011-07-28 | Xencor, Inc. | Antibody fc variants with enhanced complement activity |
CN102971342B (zh) | 2010-01-28 | 2016-08-03 | Ab生物科学公司 | 亲和力降低的新抗体和制备所述抗体的方法 |
SI2536745T1 (sl) | 2010-02-19 | 2016-10-28 | Xencor Inc. | Novi imunoadhezini CTLA4-Ig |
WO2011108714A1 (ja) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
JP2011184418A (ja) | 2010-03-11 | 2011-09-22 | Tokyo Institute Of Technology | 親和性可変抗体 |
PE20130393A1 (es) | 2010-03-11 | 2013-04-07 | Rinat Neuroscience Corp | Anticuerpos con union de antigenos dependiente de ph |
TWI667346B (zh) | 2010-03-30 | 2019-08-01 | 中外製藥股份有限公司 | 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體 |
JP5234045B2 (ja) | 2010-04-13 | 2013-07-10 | Tdk株式会社 | スパッタリングターゲット、及び、光メディアの製造方法 |
CN103201293B (zh) | 2010-09-08 | 2016-04-27 | 哈洛齐梅公司 | 评估和鉴定或发展条件活性治疗蛋白的方法 |
WO2012044831A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-04-05 | Board Of Trustees Of Northern Illinois University | Library-based methods and compositions for introducing molecular switch functionality into protein affinity reagents |
CN103328632A (zh) | 2010-11-30 | 2013-09-25 | 中外制药株式会社 | 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子 |
EP3604330A1 (en) | 2011-02-25 | 2020-02-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fcgammariib-specific fc antibody |
WO2012132067A1 (ja) | 2011-03-30 | 2012-10-04 | 中外製薬株式会社 | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 |
JP5972915B2 (ja) | 2011-03-16 | 2016-08-17 | アムジエン・インコーポレーテツド | Fc変異体 |
EP2698431B1 (en) | 2011-03-30 | 2020-09-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity |
JP2014517846A (ja) | 2011-05-25 | 2014-07-24 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション | 改善された特性を有するFc含有ポリペプチドの製造方法 |
JP5997151B2 (ja) | 2011-06-30 | 2016-09-28 | 中外製薬株式会社 | ヘテロ二量化ポリペプチド |
UA117901C2 (uk) | 2011-07-06 | 2018-10-25 | Ґенмаб Б.В. | Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування |
TW201817745A (zh) | 2011-09-30 | 2018-05-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有促進抗原清除之FcRn結合域的治療性抗原結合分子 |
RU2014117505A (ru) | 2011-09-30 | 2015-11-10 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Антигенсвязывающая молекула для ускорения удаления антигенов |
EP2752200B1 (en) | 2011-09-30 | 2023-11-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule inducing immune response to target antigen |
CN107287660A (zh) | 2011-09-30 | 2017-10-24 | 中外制药株式会社 | 离子浓度依赖性结合分子文库 |
WO2013047748A1 (ja) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | 中外製薬株式会社 | 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
JP6271251B2 (ja) | 2011-10-05 | 2018-01-31 | 中外製薬株式会社 | 糖鎖受容体結合ドメインを含む抗原の血漿中からの消失を促進する抗原結合分子 |
CN113416256A (zh) | 2011-11-30 | 2021-09-21 | 中外制药株式会社 | 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物 |
US20150210763A1 (en) | 2012-02-09 | 2015-07-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | MODIFIED Fc REGION OF ANTIBODY |
KR102475951B1 (ko) | 2012-02-24 | 2022-12-08 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | FcγRIIB를 매개로 항원의 소실을 촉진하는 항원 결합 분자 |
EP2825037B1 (en) | 2012-03-16 | 2019-05-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodents expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences |
MX355732B (es) | 2012-03-16 | 2018-04-27 | Regeneron Pharma | Anticuerpos con cadena ligera modificada con histidina por ingenieria genetica y animales no humanos geneticamente modificados para generarlos. |
EP2825035A1 (en) | 2012-03-16 | 2015-01-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics |
TWI619729B (zh) | 2012-04-02 | 2018-04-01 | 再生元醫藥公司 | 抗-hla-b*27抗體及其用途 |
MX2014014678A (es) | 2012-05-30 | 2015-02-10 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molecula de union al antigeno especifico para el tejido objetivo. |
EP3892638A1 (en) | 2012-05-30 | 2021-10-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens |
WO2013187495A1 (ja) | 2012-06-14 | 2013-12-19 | 中外製薬株式会社 | 改変されたFc領域を含む抗原結合分子 |
KR20150041662A (ko) | 2012-08-13 | 2015-04-16 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | Ph-의존적 결합 특성을 갖는 항-pcsk9 항체 |
US11236168B2 (en) | 2012-08-24 | 2022-02-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Mouse FcγammaRII-specific Fc antibody |
CN104736706B (zh) | 2012-08-24 | 2021-10-19 | 中外制药株式会社 | FcγRIIb特异性Fc区变体 |
KR102249779B1 (ko) | 2012-12-27 | 2021-05-07 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 헤테로이량화 폴리펩티드 |
JO3532B1 (ar) | 2013-03-13 | 2020-07-05 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها |
WO2014144080A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Amgen Inc. | Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 |
ES2657304T3 (es) | 2013-03-15 | 2018-03-02 | Bayer Healthcare Llc | Variantes de anticuerpo anti TFPI con unión diferencial a lo largo del intervalo de pH para mejorar la farmacocinética |
US9321686B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-04-26 | Forta Corporation | Reinforcement fiber coating compositions, methods of making and treating, and uses for improved adhesion to asphalt and portland cement concrete |
WO2014140366A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Affibody Ab | New polypeptides |
AU2014235430A1 (en) | 2013-03-15 | 2015-09-24 | Amgen Inc. | Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9) |
JP6598680B2 (ja) | 2013-04-02 | 2019-10-30 | 中外製薬株式会社 | Fc領域改変体 |
US10111953B2 (en) | 2013-05-30 | 2018-10-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9) |
AU2014323527B2 (en) | 2013-09-18 | 2020-10-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified non-human animals for generating the same |
MA39061A1 (fr) | 2013-11-20 | 2017-10-31 | Regeneron Pharma | Modulateurs d'aplnr et leurs utilisations |
NZ711451A (en) | 2014-03-07 | 2016-05-27 | Alexion Pharma Inc | Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics |
JP7037885B2 (ja) | 2014-06-30 | 2022-03-17 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | pH依存性抗原結合を示す抗TNFa抗体 |
KR20180054923A (ko) | 2014-12-19 | 2018-05-24 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법 |
PL3233921T3 (pl) | 2014-12-19 | 2022-01-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania |
CN114773469A (zh) | 2015-02-05 | 2022-07-22 | 中外制药株式会社 | 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体,fc区变体,il-8-结合抗体及其应用 |
US10233252B2 (en) | 2015-12-21 | 2019-03-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation | pH-dependent antibodies targeting the transferrin receptor and methods of use thereof to deliver a therapeutic agent |
KR20240151866A (ko) | 2017-03-14 | 2024-10-18 | 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. | 산성 pH에서 VISTA에 결합하는 항체 |
UA125757C2 (uk) | 2017-03-16 | 2022-06-01 | Медімм'Юн Лімітед | Антитіло до par2 і його застосування |
-
2012
- 2012-02-24 EP EP19190090.1A patent/EP3604330A1/en active Pending
- 2012-02-24 US US14/001,218 patent/US20140093496A1/en not_active Abandoned
- 2012-02-24 EP EP12749420.1A patent/EP2679681B2/en active Active
- 2012-02-24 MX MX2013009774A patent/MX352889B/es active IP Right Grant
- 2012-02-24 CN CN201280020170.5A patent/CN103492565B/zh active Active
- 2012-02-24 KR KR1020227044264A patent/KR20230005405A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-02-24 SG SG2013064340A patent/SG192945A1/en unknown
- 2012-02-24 CN CN202110063632.2A patent/CN112812184A/zh active Pending
- 2012-02-24 SG SG10201609665PA patent/SG10201609665PA/en unknown
- 2012-02-24 KR KR1020137024252A patent/KR102147548B1/ko active IP Right Grant
- 2012-02-24 KR KR1020207023693A patent/KR20200103845A/ko not_active IP Right Cessation
- 2012-02-24 WO PCT/JP2012/054624 patent/WO2012115241A1/ja active Application Filing
- 2012-02-24 RU RU2013143303A patent/RU2608504C2/ru active
- 2012-02-24 CA CA2827923A patent/CA2827923C/en active Active
- 2012-02-24 JP JP2013501147A patent/JP6032818B2/ja active Active
- 2012-02-24 BR BR112013021526-7A patent/BR112013021526B1/pt active IP Right Grant
- 2012-02-24 AU AU2012222252A patent/AU2012222252B2/en active Active
- 2012-03-30 BR BR112013025221A patent/BR112013025221A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-03-30 JP JP2013507791A patent/JP6074360B2/ja active Active
- 2012-03-30 US US14/007,947 patent/US10618965B2/en active Active
-
2016
- 2016-08-10 JP JP2016157498A patent/JP6348936B2/ja active Active
- 2016-11-25 AU AU2016262766A patent/AU2016262766B2/en active Active
-
2018
- 2018-06-01 JP JP2018105744A patent/JP2018138616A/ja active Pending
-
2019
- 2019-03-11 JP JP2019043293A patent/JP6826620B2/ja active Active
-
2020
- 2020-03-02 US US16/806,027 patent/US11718678B2/en active Active
- 2020-11-30 JP JP2020197907A patent/JP2021027845A/ja active Pending
-
2022
- 2022-06-22 US US17/846,672 patent/US20230174655A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7288466B2 (ja) | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 | |
JP6826620B2 (ja) | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 | |
US20230140797A1 (en) | ANTIGEN-BINDING MOLECULE FOR PROMOTING DISAPPEARANCE OF ANTIGEN VIA Fc GAMMA RIIB | |
JP6261785B2 (ja) | 抗原の消失を促進する抗原結合分子 | |
AU2012233313B2 (en) | Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule | |
EP3517550A1 (en) | Drug containing carrier into cell for forming immune complex | |
JP2023106564A (ja) | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 | |
RU2799423C1 (ru) | Способ изменения удержания в плазме и иммуногенности антигенсвязывающей молекулы | |
RU2772771C1 (ru) | Антигенсвязывающая молекула для ускорения элиминации антигенов |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] |
Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS. |
|
B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] | ||
B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] | ||
B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] | ||
B12B | Appeal against refusal [chapter 12.2 patent gazette] |