BR112019024544A2

BR112019024544A2 - Proteínas enxertadas com anticorpo-citocina e métodos de uso para distúrbios relacionados à imunidade

Info

Publication number: BR112019024544A2
Application number: BR112019024544-8A
Authority: BR
Inventors: DIAZ-DE-DURANA Yaiza; Yaiza Diaz-De-Durana; Didonato Michael; Michael DIDONATO; Filippi Christophe; Christophe Filippi; Meeusen Shelly; Shelly MEEUSEN; Spraggon Glen; Glen Spraggon
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2017-05-24
Filing date: 2018-05-22
Publication date: 2020-06-23
Also published as: EP3630812A1; MY200872A; UY37738A; JOP20190271A1; AU2018274215A1; US11122825B2; US20200113974A1; KR102381237B1; AU2022200528A1; US20220346415A1; WO2018215935A1; EA201992776A1; CN110650973B; PE20200302A1; PH12019502617A1; KR20200008614A; ZA201907481B; IL270772A; CR20190535A; ECSP19083343A

Abstract

a presente revelação refere-se a proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que se ligam a um receptor de interleucina de alta afinidade e estimulam sinalização intracelular através do mesmo. as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina são úteis na intensificação de respostas celulares anti-inflamatórias e na redução de efeitos pró-inflamatórios no tratamento, melhoria e prevenção de distúrbios relacionados à imunidade, tais como diabetes tipo 1.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PROTE- ÍNAS ENXERTADAS COM ANTICORPO-CITOCINA E MÉTODOS DE USO PARA DISTÚRBIOS RELACIONADOS À IMUNIDADE”.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisó- rio nº U.S. 62/510.514, depositado em 24 de maio de 2017, cujo con- teúdo está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO

[002] A presente revelação refere-se a proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que se ligam ao receptor de alta afinidade com inter- leucina-2 (IL2) e métodos para tratar distúrbios autoimunes e relacio- nados à imunidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[003] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente no formato de ASCII e é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 30 de março 2018, é nomeada PAT056491- WO-PCT_SL.txt e tem tamanho de 115.255 bytes.

ANTECEDENTES

[004] A IL2 foi clonada primeiramente em 1983 (Taniguchi et al., Nature 1983, 302:305 a 310, Devos et al., Nucleic Acid Res. 1983, 11(13):4.307 a 4.323, Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1983, 115:1.040 a 1.047). A proteína IL2 tem um comprimento de 153 aminoácidos com um peptídeo sinal de aminoácidos 1 a 20 e se eno- vela em uma estrutura de 4 alfa-hélices anfifáticas antiparalelas (Smith K.A., Science 1988, 240:1.169 a 1.176).

[005] A IL2 medeia seu efeito biológico sinalizando-se através de um receptor de alta afinidade ou de baixa afinidade (Kreig et al., PNAS 2010, 107(26)11.906 a 11.911). O receptor de alta afinidade é triméri-

co, que consiste em IL2-Rα (CD25), IL2-Rβ (CD122) e IL2-Rγ (CD132). O receptor de baixa afinidade é dimérico, que consiste ape- nas nas cadeias de IL2-Rβ(CD122) e IL2-Rγ(CD132). O receptor de baixa afinidade se liga a IL2, mas com 10 a 100 vezes menos afinida- de que o trimérico, receptor de alta afinidade, indicando que IL2-Rα (CD25) é importante para o aumento na afinidade, mas não é um componente de sinalização (Kreig et al., supra). A expressão dos re- ceptores de IL2 também é distinta. O receptor de IL2 de alta afinidade é expresso em células T ativadas e células T reguladoras CD4+/Foxp3+ (Treg). Em contrapartida, o receptor de IL2 de baixa afi- nidade é encontrado em células de memória T CD8+, células de con- venção T (Tcon) e células exterminadoras naturais (NK).

[006] A IL2 recombinante (rhIL2) foi inicialmente aprovada para uso clínico em 1992 (Coventry et al., Cancer Mgt Res. 2012 4:215 a 221). Proleukin® (aldesleucina) é uma IL2 modificada, que é aglicosi- lada, carece de uma alanina N-terminal e tem uma serina substituída por cisteína no aminoácido 125 (C125S). Proleukin® foi inicialmente indicada como uma terapia para melanoma maligno e carcinoma de célula renal, mas foi usada para outros tipos de câncer, tais como co- lorretal, mama, pulmão e mesotelioma (Coventry et al., supra). Um es- tudo que abrangeu 259 pacientes com carcinoma de célula renal de 1986 a 2006 constatou que 23 pacientes têm uma resposta completa e 30 tiveram uma resposta parcial (Klapper et al., Cancer 2008 113(2):293 a 301). Isso representou uma taxa de resposta objetiva ge- ral de 20%, com regressão tumoral completa em 7% dos pacientes com câncer de células renais (Klapper et al., supra).

[007] No entanto, o tratamento contra câncer com IL2 não ocor- reu sem efeitos adversos. O estudo com 259 pacientes observou va- zamento capilar/vascular, vasodilatação e oligúria. Também houve in- fecções de grau 3 e grau 4, tanto de cateteres como infecção geral,

atribuídas à disfunção de neutrófilos (Klapper et al., supra). A literatura de Proleukin® observa que Proleukin® tem sido associada à exacer- bação de doenças autoimunes e distúrbios relacionados à imunidade, tais como doença de Crohn, escleroderma, tireoidite, artrite inflamató- ria, diabetes mellitus, miastenia gravis oculo-bulbar, glomerulonefrite por IgA crescêntrica, colecistite, vasculite cerebral, síndrome de Ste- vens-Johnson e penfigoide bolhoso.

[008] A constatação de que células Treg expressavam constituti- vamente o receptor de IL2 de alta afinidade e eram dependentes de IL2 para sobrevivência e função levou ao trabalho focado na IL2 como uma forma de simular células Treg (D'Cruz et al., Nat. imuno. 2005, 6:1.152 a 1.159). Demonstrou-se que baixa dose de IL2 é um trata- mento seguro e eficaz para pacientes com diabetes tipo I (Hartemann et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2013, 1:295 a 305), vasculite indu- zida pelo vírus da hepatite C (Saadoun et al., N. Eng. J. Med. 2011, 365:2.067 a 2.077) e doença crônica do enxerto versus hospedeiro (Koreth et al., N. Eng. J. Med. 2011 365:2.055 a 2.066). No entanto, a IL2 tem uma meia-vida muito curta no corpo, exigindo múltiplas admi- nistrações. Isso ilustra a necessidade de terapêuticos de IL2 com sele- tividade para estimular Tregs por meio do receptor de alta afinidade com atividade reduzida no receptor inferior de IL2 e farmacocinética melhorada.

DESCRIÇÃO

[009] A presente revelação fornece proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que têm uma molécula de IL2 enxertada nas se- quências de CDR de um anticorpo que tem perfis terapêuticos prefe- renciais sobre moléculas conhecidas e usadas na clínica. Em particu- lar, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina fornecidas aumen- tam ou mantêm atividade de Tregs sem aumentar a atividade de célu- las T CD8+, Tcons ou células NK. Adicionalmente, as composições fornecidas transportam meia-vida aprimorada, estabilidade e capaci- dade de produção sobre formulação de IL2 humana recombinante, tal como Proleukin®. As propriedades preferenciais dessas composições resultam em composições terapêuticas preferenciais em relação àque- las usadas clinicamente ou descritas na literatura. Por exemplo, algu- mas modalidades reveladas no presente documento fornecem proteí- nas enxertadas com anticorpo-citocina que se ligam, de preferência, ao receptor de alta afinidade com IL2 e promovem sinalização através do mesmo, versus o receptor de baixa afinidade com IL2. Algumas modalidades reveladas no presente documento fornecem proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que ativam, de preferência, células Tregs versus células T CD8+, Tcons ou células NK.

[0010] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende Regi- ões Determinantes da Complementaridade (CDR) HCDR1, HCDR2, HCDR3; e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3; e (c) uma molécula de interleucina 2 (IL2) enxertada em uma CDR da VH ou da VL.

[0011] A proteína enxertada com anticorpo-citocina que compre- ende uma molécula de IL2 enxertada em uma CDR de cadeia pesada.

[0012] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a mo- lécula de IL2 é enxertada em uma região selecionada a partir de regi- ão determinante da complementaridade 1 (HCDR1), da região deter- minante da complementaridade 2 (HCDR2) ou da região determinante da complementaridade 3 (HCDR3).

[0013] A proteína enxertada com anticorpo-citocina que compre- ende uma molécula de IL2 enxertada em uma HCDR1.

[0014] A proteína enxertada com anticorpo-citocina que compre- ende uma molécula de IL2 enxertada em uma CDR de cadeia leve.

[0015] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a mo- lécula de IL2 é enxertada em uma região selecionada a partir de regi- ão determinante da complementaridade 1 (LCDR1), região determi- nante da complementaridade 2 (LCDR2) e região determinante da complementaridade 3 (LCDR3).

[0016] A proteína enxertada com anticorpo-citocina que compre- ende uma molécula de IL2 que contém uma mutação que reduz a afi- nidade da molécula de IL2 ao receptor de IL2 de baixa afinidade.

[0017] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a pro- teína enxertada com anticorpo-citocina estimula a proliferação de célu- las Treg mais que a IL2 nativa ou Proleukin®.

[0018] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a pro- teína enxertada com anticorpo-citocina estimula proliferação de efetora T CD8 menos que a IL2 nativa ou Proleukin®.

[0019] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a pro- teína enxertada com anticorpo-citocina tem uma meia-vida mais longa que a IL2 nativa ou Proleukin®.

[0020] A proteína enxertada com anticorpo-citocina em que a mo- lécula de IL2 consiste em SEQ ID NO:4.

[0021] A proteína enxertada com anticorpo-citocina em que a mo- lécula de IL2 consiste em SEQ ID NO:6.

[0022] A proteína enxertada com anticorpo-citocina que compre- ende uma cadeia pesada de anticorpo de classe de IgG.

[0023] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a ca- deia pesada de anticorpo de classe de IgG é selecionada a partir de IgG1, IgG2 ou IgG4.

[0024] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a es- pecificidade de ligação das CDRs de anticorpo é reduzida pela molé-

cula de IL2 enxertada.

[0025] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a es- pecificidade de ligação das CDRs de anticorpo está retida na presença da molécula de IL2 enxertada.

[0026] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a es- pecificidade de ligação das CDRs de anticorpo é distinta da especifici- dade de ligação da molécula de IL2.

[0027] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a es- pecificidade de ligação do domínio variável de anticorpo é para um an- tígeno não humano.

[0028] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que o an- tígeno não humano é um vírus.

[0029] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que o ví- rus é um vírus sincicial respiratório (RSV).

[0030] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que o RSV é selecionado a partir do subgrupo A de RSV e do subgrupo B de RSV.

[0031] A proteína enxertada com anticorpo-citocina em que a por- ção de arcabouço do anticorpo da proteína enxertada com anticorpo- citocina é humanizada ou humana.

[0032] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO: 17, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:18, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:19 e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:30, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:31 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:32; (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO:43, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:44, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:45; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:56, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:57 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:58; (iii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) a uma HCDR1 da SEQ ID NO:69, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:70, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:71; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:82, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:83 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:84; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO:95, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:96, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:97; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:108, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:109 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:110.

[0033] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende SEQ ID NO:20 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende SEQ ID NO: 33; (ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende SEQ ID NO: 46 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende SEQ ID NO: 59; (iii) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende SEQ ID NO:72 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende SEQ ID NO:85; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende SEQ ID NO:98 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende SEQ ID NO:111.

[0034] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que o an- ticorpo compreende a região Fc modificada correspondente à função efetora reduzida.

[0035] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a re-

gião Fc modificada compreende uma mutação selecionada a partir de um ou mais dentre D265A, P329A, P329G, N297A, L234A e L235A.

[0036] A proteína enxertada com anticorpo-citocina, em que a re- gião Fc modificada compreende uma combinação de mutações seleci- onadas a partir de um ou mais dentre D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A e P329G/L234A/L235A.

[0037] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que compreendem uma HCDR1 da SEQ ID NO: 17, uma HCDR2 da SEQ ID NO:18, uma HCDR3 da SEQ ID NO:19, uma LCDR1 da SEQ ID NO:30, uma LCDR2 da SEQ ID NO:31, uma LCDR3 da SEQ ID NO:32, uma região Fc modificada que contém a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com anticorpo-citocina tem ativação maior de células Treg em comparação à Proleukin®.

[0038] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO:43, a HCDR2 da SEQ ID NO:44, uma HCDR3 da SEQ ID NO:45, uma LCDR1 da SEQ ID NO:56, uma LCDR2 da SEQ ID NO:57, uma LCDR3 da SEQ ID NO:58, uma região Fc modificada que contém a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com anticorpo-citocina tem maior ativação de células Treg em comparação à Proleukin®.

[0039] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO:69, a HCDR2 da SEQ ID NO:70, uma HCDR3 da SEQ ID NO:71, uma LCDR1 da SEQ ID NO:82, uma LCDR2 da SEQ ID NO:83, uma LCDR3 da SEQ ID NO:84, uma região Fc modificada que contém a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com anticorpo-citocina tem maior ativação de células Treg em comparação à Proleukin®.

[0040] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO:95, a HCDR2 da SEQ ID NO:96, uma HCDR3 da SEQ ID NO:97, uma LCDR1 da SEQ ID NO:108, uma LCDR2 da SEQ ID NO:109, uma LCDR3 da SEQ ID NO:110, uma região Fc modificada que contém a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com anticorpo-citocina tem maior ativação de células Treg em compa- ração à Proleukin®.

[0041] As modalidades da presente revelação fornecem ácidos nucleicos isolados que codificam uma proteína enxertada com anticor- po-citocina que compreendem: (i) uma cadeia pesada da SEQ ID NO:23 e uma cadeia leve da SEQ ID NO:36; (ii) uma cadeia pesada da SEQ ID NO:49 e uma cadeia leve da SEQ ID NO:62; (iii) uma cadeia pesada da SEQ ID NO:75 e uma cadeia leve da SEQ ID NO:88; ou (iv) uma cadeia pesada da SEQ ID NO:101 e uma cadeia leve da SEQ ID NO:114.

[0042] As modalidades da presente revelação fornecem células hospedeira recombinantes adequadas para a produção de uma proteí- na enxertada com anticorpo-citocina que compreende os ácidos nu- cleicos revelados no presente documento que codificam os polipeptí- deos de cadeia pesada e leve da proteína e opcionalmente um sinal de secreção.

[0043] A célula hospedeira recombinante que é uma linhagem ce- lular de mamífero.

[0044] As modalidades da presente revelação fornecem composi- ções farmacêuticas que compreendem a proteína enxertada com anti- corpo-citocina e um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitá-

veis.

[0045] As modalidades da presente revelação fornecem métodos para tratar um distúrbio relacionado à imunidade em um indivíduo com necessidade do mesmo que compreendem administrar ao indivíduo a quantidade terapeuticamente eficaz das proteínas enxertadas com an- ticorpo-citocina ou composições farmacêuticas reveladas no presente documento.

[0046] O método em que o dito distúrbio relacionado à imunidade é selecionado a partir do grupo que consiste em: diabetes tipo 1, lúpus eritematoso sistêmico, vitiligo, doença crônica do enxerto versus hos- pedeiro (cGvHD), doença aguda profilática do enxerto versus hospe- deiro (pGvHD), vasculite induzida por HIV, alopecia areata, esclerose sistêmica, morfeia e síndrome antifosfolipídica primária.

[0047] O método em que a proteína enxertada com anticorpo- citocina ou composição farmacêutica é administrada em combinação com outro agente terapêutico.

[0048] O método em que o agente terapêutico é outra proteína en- xertada com anticorpo-citocina.

[0049] As modalidades da presente revelação fornecem métodos para expandir células Treg em um paciente com necessidade do mesmo que compreendem administrar uma proteína enxertada com anticorpo-citocina ou composição farmacêutica ao paciente.

[0050] O método em que as células Treg são expandidas e as cé- lulas efetoras T CD8 não são expandidas.

[0051] O método em que as células Treg são expandidas e células NK não são expandidas.

[0052] O método em que a proteína enxertada com anticorpo- citocina ou composição farmacêutica é administrada em combinação com outro agente terapêutico.

[0053] O método em que o agente terapêutico é outra proteína en-

xertada com anticorpo-citocina.

[0054] As modalidades da presente revelação fornecem proteínas enxertadas com anticorpo-citocina para uso como um agente terapêu- tico.

[0055] O uso em que a proteína enxertada com anticorpo-citocina compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreen- de (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO: 17, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:18, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:19 e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:30, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:31 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:32; e (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO:43, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:44, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:45; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:56, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:57 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:58, no tratamento de distúrbios relacionados à imunidade.

[0056] O uso em que o distúrbio relacionado à imunidade é seleci- onado a partir do grupo que consiste em diabetes tipo 1, lúpus erite- matoso sistêmico, vitiligo, doença crônica do enxerto versus hospedei- ro (cGvHD), doença aguda profilática do enxerto versus hospedeiro (pGvHD), vasculite induzida por HIV, alopecia areata, esclerose sistê- mica, morfeia e síndrome antifosfolipídica primária.

[0057] O uso em que a proteína enxertada com anticorpo-citocina é administrada em combinação com outro agente terapêutico.

[0058] As modalidades da presente revelação fornecem usos de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina revelada no presente documento para a fabricação de um medicamento para o tratamento de distúrbio relacionado à imunidade em um indivíduo com necessida- de do mesmo.

[0059] O uso em que o distúrbio relacionado à imunidade é seleci-

onado a partir do grupo que consiste em: diabetes tipo 1, lúpus erite- matoso sistêmico, vitiligo, doença crônica do enxerto versus hospedei- ro (cGvHD), doença aguda profilática do enxerto versus hospedeiro (pGvHD), vasculite induzida por HIV, alopecia areata, esclerose sistê- mica, morfeia e síndrome antifosfolipídica primária.

[0060] Em determinadas modalidades, a proteína enxertada com anticorpo-citocina compreende uma região Fc de anticorpo de classe de IgG. Em modalidades particulares, uma imunoglobulina é selecio- nada a partir de região Fc de subclasse IgG1, IgG2 ou IgG4. O anti- corpo, o fragmento de anticorpo ou a molécula de ligação a antígeno opcionalmente contém pelo menos uma modificação que modula (isto é, aumenta ou diminui) a ligação do anticorpo ou fragmento de anti- corpo a um receptor Fc. A cadeia pesada de imunoglobulina pode compreender opcionalmente uma modificação que confere função efe- tora modificada. Em modalidades particulares, a cadeia pesada de imunoglobulina pode compreender uma mutação que confere a função efetora reduzida selecionada a partir de qualquer um dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A.

[0061] A proteína enxertada com anticorpo-citocina também com- preende variações na porção de IL2 da molécula. As variações podem ser mudanças de único aminoácido, deleções de único aminoácido, mudanças de múltiplos aminoácidos e deleções de múltiplos aminoá- cidos. Essas mudanças na porção de citocina IL2 da molécula pode diminuir a afinidade da proteína enxertada com citocina para o recep- tor de IL2 de baixa afinidade.

[0062] Além disso, a revelação fornece polinucleotídeos que codi- ficam pelo menos uma proteína de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina, conforme descrito no presente documento. Em outro aspecto relacionado, a revelação fornece adicionalmente células hospedeiras adequadas para a produ- ção de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina, conforme des- crito no presente documento. Em modalidades particulares, as células hospedeiras compreendem ácidos nucleicos que codificam um poli- peptídeo de cadeia leve e/ou cadeia pesada da proteína enxertada com anticorpo-citocina. Em ainda outro aspecto, são fornecidos méto- dos para produzir proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que compreendem cultivar as células hospedeiras fornecidas, conforme descrito no presente documento, sob condições adequadas para ex- pressão, formação e secreção da proteína enxertada com anticorpo- citocina e que recuperam a proteína enxertada com anticorpo-citocina da cultura. Em um aspecto adicional, a revelação fornecer adicional- mente kits que compreendem uma proteína enxertada com anticorpo- citocina, conforme descrito no presente documento.

[0063] Em outro aspecto relacionado, a revelação fornece adicio- nalmente composições que compreende uma proteína enxertada com anticorpo-citocina, conforme descrito no presente documento e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a revelação fornece composições farmacêuticas que compreendem uma proteína enxertada com anticorpo-citocina para administrar a um indi- víduo.

[0064] Em um outro aspecto, a revelação fornece métodos para tratar um distúrbio relacionado à imunidade em um indivíduo com ne- cessidade do mesmo que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina, conforme descrito no presente documento. Em um aspecto adicional, a revelação fornece uma proteína enxertada com anticorpo-citocina para uso no tratamento ou profilaxia de um distúrbio relacionado à imunidade em um indivíduo.

[0065] Em algumas modalidades, o paciente tem um distúrbio re-

lacionado à imunidade, por exemplo, diabetes tipo 1, lúpus eritematoso sistêmico, vitiligo, doença crônica do enxerto versus hospedeiro (cGvHD), doença aguda profilática do enxerto versus hospedeiro (pGvHD), vasculite induzida por HIV, alopecia areata, esclerose sistê- mica, morfeia e síndrome antifosfolipídica primária. Para algumas indi- cações, a proteína enxertada com anticorpo-citocina é coadministrada com um esteroide (por exemplo, metilprednisolona, hidrocortisona, prednisona, prednisolona, budesonida, dexametasona).

DEFINIÇÕES

[0066] Um “anticorpo” se refere a uma molécula da família da imu- noglobulina que compreende uma unidade estrutural tetramérica. Ca- da tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de poli- peptídeo, sendo que cada par tem uma cadeia "leve” (cerca de 25 kD) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50 a 70 kD), conectada através de uma ligação de dissulfeto. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante κ, λ, α, γ, δ, ε e μ, assim como os inúmeros genes de região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas ou como κ ou λ. As cadeias pesadas são clas- sificadas como γ, μ, α, δ ou ε que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE respectivamente. Os anticor- pos podem ser qualquer isótipo/classe (por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE) ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2).

[0067] Ambas as cadeias leve e pesada são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos “constante” e “variável” são usados estrutural e funcionalmente. A extremidade N de cada ca- deia defina uma região ou domínio variável (V) de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primeiramente responsáveis por reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia variável pe- sada (VH) se refere a essas regiões de cadeias leves e pesadas res-

pectivamente. O pareamento de uma VH e VL entre si forma um sítio de ligação a antígeno único. Além das regiões V, tanto cadeias leves quanto cadeias pesadas contêm uma região ou domínio constante (C). Uma forma secretada de uma região C de imunoglobulina é formada por três domínios C, CH1, CH2, CH3, opcionalmente CH4 (Cμ) e uma região de articulação. Uma forma ligada a membrana de uma região C de imunoglobulina também tem domínios membranares e intracelula- res. Cada cadeia leve tem uma VL na extremidade N seguida por um domínio constante (C) em sua outra extremidade. Os domínios cons- tantes da cadeia leve (CL) e a cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) con- ferem importantes propriedades biológicas, tais como secreção, mobi- lidade transplacental, ligação de receptor Fc, ligação de complemento e semelhantes. Convencionalmente, a numeração dos domínios de região constantes aumenta à medida que se tornam mais distais do sítio de ligação ao antígeno ou extremidade amino do anticorpo. O terminal N é uma região variável e no terminal C é uma região cons- tante; os domínios CH3 e CL realmente compreendem os domínios carbóxi-terminais da cadeia pesada e leve, respectivamente. A VL é alinhada à VH, e a CL é alinhada ao primeiro domínio constante da cadeia pesada. Conforme usado no presente documento, um anticor- po" abrange estruturas convencionais de anticorpo e variações de an- ticorpos. Desse modo, dentro do escopo desse conceito estão proteí- nas enxertadas com anticorpo-citocina, anticorpos de comprimento total, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos hu- manos e fragmentos de anticorpo dos mesmos.

[0068] Anticorpos existem como cadeias intactas de imunoglobuli- na ou como um número de fragmentos de anticorpo bem caracteriza- dos produzidos por digestão com várias peptidases. O termo "fragmen- to de anticorpo," conforme usado no presente documento, se refere a uma ou mais porções de um anticorpo que retém seis CDRs. Desse modo, por exemplo, a pepsina ingere um anticorpo abaixo das liga- ções de dissulfeto na região de articulação para produzir F(ab)'2, um dímero de Fab' que, por sua vez é uma cadeia leve unida a V H-CH1 por uma ligação de bissulfeto. O F(ab)'2 pode ser reduzido em condições brandas para romper a ligação de dissulfeto na região de articulação, desse modo convertendo o dímero F(ab)'2 em um monômero Fab'. O monômero Fab’ é essencialmente um Fab com uma poção da região de articulação (Paul et al., Fundamental imunology 3ª Edição (1993)). Embora vários fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos de digestão de um anticorpo intacto, uma pessoa de habilidade comum na técnica observará que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo ou quimicamente ou com o uso de metodologia recombinante de DNA. Conforme usado no presente documento, um "fragmento de an- ticorpo" se refere a uma ou mais porções de um anticorpo, ou produzi- dos pela modificação de anticorpos inteiros ou aqueles sintetizados de novo com o uso de metodologias de DNA recombinante que retém es- pecificidade de ligação e atividade funcional. Os exemplos de fragmen- tos de anticorpo incluem fragmentos de Fv, anticorpos de cadeia úni- cos (ScFv), Fab, Fab', Fd (domínios Vh e CH1), dAb (Vh e uma CDR isolada); e versões multiméricas desses fragmentos (por exemplo, F(ab')2,) com a mesma especificidade de ligação. As proteínas enxer- tadas com anticorpo-citocina também podem compreender fragmentos de anticorpo necessários para obter a especificidade e atividade de ligação desejadas.

[0069] Um domínio “Fab”, conforme usado no contexto compreen- de um domínio de cadeia pesada variável, um domínio CH1 de região constante, um domínio de cadeia leve variável e um domínio CL de região constante de cadeia leve. A interação dos domínios é estabili- zada por uma ligação de dissulfeto entre os domínios CH1 e CL. Em algumas modalidades, os domínios de cadeia pesada do Fab estão na ordem, da extremidade N a extremidade C, VH-CH e os domínios de cadeia leve de um Fab estão na ordem, da extremidade N para extre- midade C, VL-CL. Em algumas modalidades, os domínios de cadeia pesada do Fab estão na ordem, da extremidade N para extremidade C, CH-VH e os domínios de cadeia leve do Fab estão na ordem CL- VL. Embora o fragmento Fab tenha sido identificado historicamente por digestão de papaína de uma imunoglobulina intacta, um “Fab” é produzido tipicamente de maneira recombinante por qualquer método. Cada fragmento Fab é monovalente com relação à ligação ao antíge- no, isto é, tem um sítio de ligação a antígeno único.

[0070] Os “domínios determinantes da complementaridade” ou “regiões determinantes da complementaridade” (“CDRs”) se referem de maneira intercambiável às regiões hipervariáveis de V L e VH. As CDRs são o sítio-alvo de ligação a proteína das cadeias de anticorpo que abrigam especificidade para tal proteína-alvo. Há três CDRs (CDR1-3, numeradas sequencialmente a partir da extremidade N) em cada VL ou VH humana, que constitui cerca de 15 a 20% dos domínios variáveis. As CDRs são estruturalmente complementares ao epítopo da proteína-alvo e são então diretamente responsáveis pela especifici- dade da ligação. As extensões restantes da VL ou da VH, as então chamadas regiões estruturantes (FR), exibem menos variação na se- quência de aminoácidos (Kuby, imunology, 4ª Edição, Capítulo 4. W.H. Freeman & Co., Nova Iorque, 2000).

[0071] As posições de CDRs e regiões estruturantes podem ser determinadas como uso de várias definições bem conhecidas na téc- nica, por exemplo, Kabat, Chothia e AbM (consultar, por exemplo, Ka- bat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição , U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publica- tion No. 91-3242, Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205 a 206 (2001); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 a 917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877 a 883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799 a 817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927 a 748 (1997)). De- finições de locais de combinação de antígenos são também descritas nas seguintes obras: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219 a 221 (2000); e Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207 a 209 (2001); (imunoGenTics (IMGT) numbering) Lefranc, M.-P., The imunologist, 7, 132 a 136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55 a 77 (2003); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732 a 745 (1996); e Mar- tin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 86:9.268 a 9.272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121 a 153 (1991); e Rees et al., In Stern- berg M.J.E. (edição), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141 a 172 (1996).

[0072] Sob Kabat, resíduos de aminoácido de CDR no VH são enumerados 31 a 35 (HCDR1), 50 a 65 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácido de CDR na VL são enumerados 24 a 34 (LCDR1), 50 a 56 (LCDR2) e 89 a 97 (LCDR3). Sob Chothia, aminoá- cidos de CDR na VH são enumerados 26 a 32 (HCDR1), 52 a 56 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácido em V L são enumerados 26 a 32 (LCDR1), 50 a 52 (LCDR2), e 91 a 96 (LCDR3). Por combinação das definições de CDR de Kabat e Chothia, as CDRs consistem nos resíduos de aminoácidos 26 a 35 (HCDR1), 50 a 65 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3) em VH humana e resíduos de aminoácidos 24 a 34 (LCDR1), 50 a 56 (LCDR2) e 89 a 97 (LCDR3) em VL humana.

[0073] Uma "cadeia leve variável de anticorpo" ou uma "cadeia variável pesada de anticorpo" conforme usado no presente documento se refere a um polipeptídeo que compreende a VL ou VH, respectiva- mente. A VL endógena é codificada pelos segmentos de gene V (variá- vel) e J (juncional) e a VH endógena por V, D (diversidade) e J. Cada uma dentre VL ou VH inclui as CDRs assim como as regiões estrutu-

rantes (FR). O termo “região variável” ou “região V” se refere de ma- neira intercambiável a uma cadeia pesada ou leve que compreende FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Uma região V pode ser de ocorrência natural, recombinante ou sintética. Nesse pedido, cadeias leves de anticorpo e/ou cadeias pesadas de anticorpo podem ser de- nominadas coletivamente de cadeias de anticorpo”. Conforme forneci- do e descrito adicionalmente no presente documento, uma “cadeia le- ve variável de anticorpo” ou uma “cadeia variável pesada de anticorpo” e/ou uma “região variável” e/ou uma “cadeia de anticorpo” compreende opcionalmente uma sequência de polipetídeos de citocina incorpora- das e uma CDR.

[0074] A porção C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobu- lina no presente documento, que compreende por exemplo, os domí- nios CH2 e CH3, é o domínio "Fc". Uma “região Fc”, conforme usado no presente documento se refere à região constante de um anticorpo que exclui a primeiro domínio de imunoglobulina de região constante (CH1). Fc se refere aos últimos dois domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD e IgG e os últimos três domínios de imu- noglobulina de região constante de IgE e IgM e a extremidade N de articulação flexível a esses domínios. Para IgA e IgM, o Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, o Fc compreende domínios de imunoglobulina Cγ2 e Cγ3 e a articulação entre Cγ1 e Cγ. Entende-se na técnica que os limites da região Fc podem variar, no entanto, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é normalmente definida como compreendendo resíduos C226 ou P230 para sua extremidade carboxila, com o uso da numeração de acordo com o índice EU conforme em Kabat et al. (1991, NIH Publication 91 a 3242, National Technical Information Ser- vice, Springfield, Va.). A “região Fc" pode se referir a essa região iso- ladamente ou a essa região no contexto de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. A “região Fc" inclui variantes alélicas de ocorrência natu-

ral da região Fc, por exemplo, na região CH2 e CH3, incluindo, por exemplo, modificação que modulam a função efetora. As regiões Fc também incluem variantes que não resultam em alterações na função biológica. Por exemplo, um ou mais aminoácidos são apagados da ex- tremidade N ou da extremidade C da região Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial de função biológica. Por exemplo, em determi- nadas modalidades, uma lisina C terminal é modificada, substituída ou removida. Em modalidades particulares, um ou mais resíduos C- terminal na região Fc são alterados ou removidos. Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos C-terminal no Fc (por exemplo, uma lisina terminal) é apagada. Em determinadas outras modalidades, um ou mais resíduos C-terminal no Fc são substituídos por um amino- ácido alternativo (por exemplo, uma lisina terminal é substituída). Tais variantes são selecionadas de acordo com os regulamentos gerais co- nhecidos na técnica de modo que tenham um efeito mínimo na ativi- dade (consultar, por exemplo, Bowie, et al., Science 247:306 a 1310, 1990). O domínio Fc é a porção da imunoglobulina (Ig) reconhecida por receptores celulares, tais como o FcR, e aos quais a proteína de ativação do complemento, C1 q, se liga. A região de articulação de ar- ticulação, que é codificada na porção 5' no éxon CH2, fornece flexibili- dade dentro do anticorpo para a ligação aos receptores de FcR.

[0075] Um “anticorpo quimérico” é um molécula de anticorpo na qual (a) a região constante, ou uma porção da mesma, é alterada, substituída ou trocada de modo que o sítio de ligação ao antígeno (re- gião variável) seja ligado a uma região constante de uma classe dife- rente ou alterada, função efetora e/ou espécies ou uma molécula intei- ramente diferente que confere nova propriedades ao anticorpo quimé- rico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento e fármaco; ou (b) a região variável, ou uma porção do mesmo, é alte- rado, substituído ou trocado com uma região variável que tem uma es-

pecificidade de antígeno diferente ou alterada.

[0076] Um anticorpo “humanizado” é um anticorpo que retém a reatividade (por exemplo, especificidade de ligação, atividade) de um anticorpo não humano ao mesmo tempo que é menos imunogênico em seres humanos. Isso pode ser obtido, por exemplo, retendo-se re- giões CDR não humanas e substituindo-se partes restantes de um an- ticorpo por equivalentes humanos. Consultar, por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 81:6.851 a 6.855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65 a 92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1.534 a 1.536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489 a 498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169 a 217 (1994).

[0077] Um "anticorpo humano" inclui anticorpos que têm regiões variáveis nas quais tanto a região estruturante quanto a região de CDR são derivadas das sequências de origem humana. Além disso, caso um anticorpo contenha uma região constante, a região constante tam- bém é derivada de tais sequências humanas, por exemplo, sequências de linhagem germinativa humana ou versões que sofreram mutação de sequências de linhagem germinativa humana ou anticorpo que con- tém sequências estruturantes de consenso de análise de sequências estruturantes humanas, por exemplo, conforme descrito em Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57 a 86, 2000). Os anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências huma- nas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo ou uma substi- tuição conservadora para promover estabilidade ou fabricação).

[0078] O termo “sequência de linhagem germinativa humana cor- respondente" se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que codi- ficam uma sequência de aminoácidos de região variável humana ou subsequência que compartilha a identidade de sequência de aminoá- cido determinada mais alta com uma sequência ou subsequência de aminoácido de região variável de referência em comparação a todas as outras sequências de aminoácido de região variável conhecidas codificadas por sequências de região variável de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Uma sequência de linhagem germinati- va humana correspondente também pode se referir à sequência de aminoácidos de região variável humana ou subsequência com uma identidade de sequência de aminoácidos mais alta com uma sequên- cia de aminoácido de região variável de referência ou subsequência em comparação a todas as outras sequencias de aminoácido de regi- ão variável avaliadas. Uma sequência de linhagem germinativa huma- na correspondente pode ser regiões estruturantes apenas, regiões de- terminantes da complementaridade apenas, regiões estruturantes e regiões determinantes da complementaridade, um segmento variável (conforme definido acima) ou outras combinações de sequências ou subsequências que compreendem uma região variável. A identidade de sequência pode ser determinada com o uso dos métodos descritos no presente documento, por exemplo, alinhar duas sequências com o uso do BLAST, ALIGN ou outro algoritmo conhecido na técnica. O áci- do nucleico de linhagem germinativa humana correspondente ou se- quência de aminoácidos podem ter pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com um ácido nucleico de região variável de referência ou sequência de aminoácidos.

[0079] O termo “valência”, conforme usado no presente documen- to, se refere ao número de sítios de ligação alvo potencial em um poli- peptídeo. Cada sítio de ligação alvo se liga especificamente a uma molécula-alvo ou um sítio específico em um molécula-alvo. Quando um polipeptídeo compreende mais de um sítio de ligação alvo, cada sítio de ligação alvo pode se ligar especificamente às mesmas ou mo- léculas diferentes (por exemplo, pode se ligar a diferentes moléculas,

por exemplo, antígenos diferentes ou diferentes epítopos na mesma molécula). Um anticorpo convencional, por exemplo, tem dois sítios de ligação e é bivalente; "trivalente" e "tetravalente" se refere à presença de três sítios de ligação e quatro sítios de ligação, respectivamente, em uma molécula de anticorpo. As proteínas enxertadas com anticor- po-citocina podem ser monovalentes (isto é, se ligam a uma molécula- alvo), bivalente ou multivalente (isto é, se ligam a mais de uma molé- cula-alvo).

[0080] O sintagma “se liga especificamente” ou “especificidade de ligação” quando usado no contexto de descrever a interação entre um alvo (por exemplo, uma proteína) e uma proteína enxertada com anti- corpo-citocina, se refere a uma reação de ligação que determina a presença de um alvo em uma população heteróloga de proteínas e outros produtos biológicos, por exemplo, uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de sangue, de soro e de tecido. Desse modo, sob determinadas condições designadas, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina com uma especificidade de ligação particular se liga a um alvo particular pelo menos duas vezes o segundo plano e não se liga substancialmente em uma quantidade significativa a outros alvos presentes na amostra. Em uma modalidade, sob condições designa- das, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina com uma especi- ficidade de ligação particular se liga a um antígeno particular pelo me- nos dez (10) vezes o segundo plano e não se liga substancialmente em uma quantidade significativamente a outros alvos presentes na amostra. A ligação específica a uma proteína enxertada com anticor- po-citocina sob tais condições pode exigir que uma proteína enxertada com anticorpo-citocina tenha sido selecionada para sua especificidade para uma proteína alvo particular. Conforme usado no presente docu- mento, a ligação específica inclui proteínas enxertadas com anticorpo- citocina que se ligam seletivamente a receptor de alta afinidade com

IL2 humano e não incluem proteínas enxertadas com anticorpo- citocina que reagem de maneira cruzada, por exemplo, outros mem- bros de superfamília de receptor de citocina. Em algumas modalida- des, são selecionadas as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que se ligam seletivamente a receptor de alta afinidade com IL2 hu- mano e reagem de maneira cruzada com IL2R de primata não humano (por exemplo, IL2R de cinomolgo). Em algumas modalidades, as pro- teínas enxertadas com anticorpo são selecionadas que se ligam seleti- vamente ao receptor de alta afinidade com IL2 humano e reagem com um antígeno-alvo adicional. Uma variedade de formatos pode ser usa- da para selecionar proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que são reativos especificamente com uma proteína-alvo de antígeno par- ticular. Por exemplo, imunoensaios ELISA de fase sólida são rotinei- ramente usados para selecionar anticorpos especificamente imunorre- ativos com uma proteína (consultar, por exemplo, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998), para uma descrição de formatos e condições de imunoensaio que podem ser usados para de- terminar a imunorreatividade específica). Tipicamente, uma reação de ligação específica ou seletiva produzirá um sinal pelo menos duas ve- zes em relação ao sinal em segundo plano e mais tipicamente pelo menos que 10 a 100 vezes em relação ao segundo plano.

[0081] O termo "constante de dissociação de equilíbrio (KD, M)" se refere à constante de taxa de dissociação (kd, tempo-1) dividido pela constante de taxa de associação (ka, temp-1, M-1). As constantes de dissociação em equilíbrio podem ser medidas com o uso de qualquer método conhecido na técnica. As proteínas enxertadas com anticorpo- citocina terão geralmente uma constante de dissociação de equilíbrio menor que cerca de 10-7 ou 10-8 M, por exemplo, menor que cerca de 10-9 M ou 10-10 M, em algumas modalidades, menor que cerca de 10-11 M, 10-12 M ou 10-13 M.

[0082] Conforme usado no presente documento, o termo “epítopo” ou “região de ligação” se refere a um domínio na proteína de antígeno que é responsável pela ligação específica entre os CDRs de anticorpo e a proteína de antígeno.

[0083] Conforme usado no presente documento, o termo “região de ligação receptor-citocina” se refere a um domínio a porção de cito- cina enxertada da proteína enxertada com anticorpo-citocina que é responsável pela ligação específica entre a citocina enxertada e seu receptor (por exemplo, o receptor de alta afinidade com IL2). Há pelo menos uma tal região de ligação receptor-citocina presente em cada proteína enxertada com anticorpo-citocina e cada uma dentre as regi- ões de ligação podem ser idênticas ou diferentes entre si.

[0084] O termo “agonista” se refere de maneira intercambiável a um anticorpo com capacidade para ativar um receptor para induzir uma resposta mediada por receptor completa ou parcial. Por exemplo, uma agonista do receptor de alta afinidade com IL2 se liga ao receptor de alta afinidade com IL2 e induz sinalização intracelular mediada por IL2, ativação celular e/ou proliferação de células Treg. A proteína en- xertada com anticorpo-citocina agonista estimula a sinalização através do receptor de alta afinidade com IL2 de maneira semelhante em al- guns sentidos ao ligante de IL2 nativa. A ligação de IL2 ao receptor de alta afinidade com IL2 induz a ativação de Jak1 e Jak2 que resulta em fosforilação de STAT5. Em algumas modalidades, uma proteína enxer- tada com anticorpo-citocina agonista pode ser identificada por sua ca- pacidade para se ligar ao receptor de alta afinidade com IL2 e induzir fosforilação de STAT5 e/ou proliferação de células Treg.

[0085] O termo “IL2” ou “IL-2” ou “interleucina 2” ou “interleucina- 2”, de maneira intercambiável, se refere a um membro de família de citocina helicoidal alfa em que as funções de proteína nativas na regu- lação e manutenção de processos inflamatórios. Uma propriedade de

IL2 é o fato de que as extremidades N e C estão próximas entre si no espaço, o que torna a proteína citocina de IL2 adequada para enxerto de anticorpo. A IL2 que compreende os resíduos 21 a 153 de humano nativo de comprimento completo é utilizada no contexto das proteínas enxertadas com anticorpo-citocina agonistas. A IL2 humana, conforme revelado no presente documento tem sobre seu comprimento comple- to pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com o aminoácido SEQ ID NO:2 e retém a atividade de agonista preferencial das proteí- nas enxertadas com anticorpo-citocina conforme descrito no presente documento e foram publicadas como nº de registro GenBank NP_000577. SEQ ID NO:1 é a sequência de cDNA de IL2 humana. O ácido nucleico de IL2 humana que codificada para a proteína IL2, con- forme revelado no presente documento, tem sobe seu comprimento completo de pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a se- quência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1 e foi publicado sob o nº de registro GenBank: NM_000586.

[0086] O termo “proteína enxertada com anticorpo-citocina” ou “enxerto de anticorpo-citocina” ou “enxertada” significa que pelo menos uma citocina é incorporada diretamente dentro de uma CDR do anti- corpo, interrompendo a sequência da CDR. A citocina pode ser incor- porada dentro de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3. A citocina pode ser incorporada dentro de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ou LCDR3 e incorporada na sequência N- terminal da CDR ou na sequência C-terminal da CDR. A citocina in- corporada dentro de uma CDR pode reduzir a ligação específica da porção de anticorpo à proteína-alvo original ou a proteína enxertada com anticorpo-citocina pode reter sua ligação específica a sua proteí- na-alvo. As citocinas exemplificativas incluem, porém sem limitação;

IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, e TNF-β. É possível, também, enxertar uma citocina em uma CDR específica de um “braço” do anticorpo e enxertar outra citocina diferente em uma CDR do outro “braço” do anticorpo. Por exemplo, enxertar a IL2 na HCDR1 de um "braço” do anticorpo e enxertar IL-7 na LCDR1 do outro "braço" da pro- teína enxertada com anticorpo-citocina pode criar uma proteína enxer- tada com anticorpo-citocina de função dupla.

[0087] O termo “isolado”, quando aplicado a um ácido nucleico ou proteína, denota que o ácido nucleico ou proteína é essencialmente livre de outros componentes celulares com o qual está associado no estado natural. Está, de preferência, em um estado homogêneo. Pode ser uma solução ou seca ou aquosa. A pureza e homogeneidade são determinadas tipicamente com o uso de técnicas químicas analíticas, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida ou cromatografia líqui- da de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é purificada substancialmente. Em parti- cular, um gene isolado é separado dos quadros abertos de leitura que flanqueiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de inte- resse. O termo “purificado” denota que um ácido nucleico ou proteína gera essencialmente uma banda em um gel eletroforético. Particular- mente, isso significa que o ácido nucleico ou a proteína é pelo menos 85% puro, com mais preferência, pelo menos 95% puro e com máxima preferência pelo menos 99% puro.

[0088] O termo “ácido nucleico” ou “polinucleotídeo” se refere a ácidos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e polímeros dos mesmos em forma ou de dupla fita ou de fita única. Sal- vo quando limitado especificamente, o termo abrange ácidos nucleicos que contêm análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes como o ácido nucleico referência e são metabolizados de maneira semelhante para nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo quando indicado de outro modo, uma se- quência de ácidos nucleicos específica também abrange implicitamen- te variantes conservativamente modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códon degenerado), alelos, ortólogos, SNPs e se- quências complementares, assim como a sequência explicitamente indicada. De modo específico, as substituições de códon degenerado podem ser obtidas gerando-se sequências em que a terceira posição de um ou mais (ou todos) códons selecionados é submetida com resí- duos de desoxi-ionisina e/ou de base misturada Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5.081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2.605 a

2.608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91 a 98 (1994)).

[0089] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usa- dos de maneira intercambiável no presente documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímero de aminoácido de ocorrência não natu- ral.

[0090] O termo “aminoácido” se refere a aminoácidos de ocorrên- cia natural e sintéticos, assim como análogos de aminoácido e miméti- cos de aminoácido que funcionam de uma maneira similar aos amino- ácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, assim como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidro- xiprolina, γ-carboxiglutamato e O-fosfosserina. Os análogos de amino- ácido se referem a compostos que têm a mesma estrutura de base química que o aminoácido de ocorrência natural, isto é, um α-carbono que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de meti- onina, metil-sulfônio de metionina. Tais análogos têm grupos R modifi- cados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais peptídicas modi- ficadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácido se refe- rem a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural.

[0091] "Variantes conservativamente modificadas" se aplicam às sequências tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Com re- lação às sequências de ácidos nucleicos específicas, variantes con- servativamente modificadas se referem àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou em que o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, às sequências essencialmente idênticas. Devido à dege- nerescência do código genético, um grande número de ácidos nuclei- cos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o ami- noácido alanina. Desse modo, em cada posição em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são “variações silencio- sas”, que são uma espécie de variações conservativamente modifica- das. Cada sequência de ácidos nucleicos no presente documento que codifica um polipeptídeo também descreve todas as variações silenci- osas possíveis do ácido nucleico. O perito na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é comumente o único códon para metionina, e TGG, que é comumente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula fun- cionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[0092] Quanto às sequências de aminoácidos, o versado na técni- ca reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais a uma sequência de ácidos nucleicos, peptídeos, polipeptídeos ou prote- ínas que alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos na sequência codificada são uma "variante conservativamente modificada" em que a alteração re- sulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimica- mente similar. Tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são adicionais a e não excluem variantes polimórficas, homólogos entre espécies e alelos. Os oito grupos a seguir contêm, cada um, aminoácidos que são substitui- ções conservativas uns dos outros: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (consultar, por exemplo, Creighton, proteínas (1984)).

[0093] A “porcentagem de identidade de sequência” é determinada comparando-se duas sequências idealmente alinhadas em uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (por exemplo, um polipeptídeo), que não compreende adições ou deleções, para ali- nhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada de- terminando-se o número de posições nas quais o resíduo de ácido nu- cleico ou de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para render o número de posições correspondentes, dividindo-se o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência.

[0094] Os termos “idêntico” ou “identidade” percentual, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, re- ferem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas sequências. Duas sequências são "substancialmente idênti- cas" se duas sequências tiverem uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são iguais (isto é, pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência em uma região especificada, ou, quando não especificado, em toda a sequência de uma sequência de referência), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação ou na região designada con- forme medida com o uso de um dos seguintes algoritmos de compara- ção de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. A re- velação fornece polipeptídeos ou polinucleotídeos que são substanci- almente idênticos aos polipeptídeos ou polinucleotídeos, respectiva- mente, exemplificados no presente documento (por exemplo, as regi- ões variáveis exemplificadas em qualquer uma dentre SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:98, ou SEQ ID NO:111. A identidade existe em uma região que tem pelo menos cerca de 15, 25 ou 50 nucleotídeos de comprimento ou, com mais preferência, em uma região que tem 100 a 500 ou 1.000 ou mais nucleotídeos de comprimento, ou ao longo de todo o comprimento da sequência de referência. Com relação às sequências de aminoácidos, a identidade ou identidade substancial pode existir em uma região que tem pelo menos 5, 10, 15 ou 20 ami- noácidos de comprimento, opcionalmente pelo menos cerca de 25, 30, 35, 40, 50, 75 ou 100 aminoácidos de comprimento, opcionalmente pelo menos cerca de 150, 200 ou 250 aminoácidos de comprimento, ou ao longo de todo o comprimento da sequência de referência. Com relação às sequências de aminoácidos mais curtas, por exemplo, se- quências de aminoácidos de 20 ou menos aminoácidos, a identidade substancial existe quando um ou dois resíduos de aminoácido forem conservativamente substituídos, de acordo com as substituições con- servativas definidas no presente documento.

[0095] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequên- cia atua como uma sequência de referência com a qual sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de se- quências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, são designadas coordenadas de subsequências, se ne- cessário, e são designados parâmetros do programa de algoritmo de sequências. Parâmetros predefinidos do programa podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência, então, calcula o percentual de identidades de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa.

[0096] Uma “janela de comparação”, conforme usado no presente documento, inclui referência a um segmento de qualquer uma dentre o número de posições contíguas selecionadas a partir do grupo que consiste em 20 a 600, normalmente cerca de 50 a cerca de 200, mais normalmente, cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo núme- ro de posições contíguas após as duas sequências serem idealmente alinhadas. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e Wunsch

(1970) J. Mol. Biol. 48:443, pelo método de pesquisa por similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85:2444, por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BEST- FIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Ge- netics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por ali- nhamento manual e inspeção visual (consultar, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).

[0097] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para de- terminar o percentual de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3.389 a 3.402 e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410, respectivamente. O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Esse algoritmo envolve identificar primeiramente pares de sequência de elevada pontuação (HSP) identificando palavras pequenas de comprimento W na sequên- cia de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação T de limite de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é de- nominado o limiar de pontuação da palavra de proximidade (Altschul et al., supra). Estas correspondências de palavra de proximidade iniciais atuam como sementes para a iniciação de buscas para se encontrar HSP mais longos contendo as mesmas. Os acessos à palavra se es- tendem em ambas as direções ao longo de cada sequência na medida em que a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As pontuações acumulativas são calculadas com o uso, para sequên- cias de nucleotídeos, dos parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontua- ção de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, é usada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de pa- lavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinha- mento cumulativa cai de uma quantidade X a partir do seu valor máxi- mo alcançado; a pontuação cumulativa fica a zero ou menos devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação nega- tiva; ou é alcançada a extremidade de qualquer uma das sequências. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibili- dade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para se- quências de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de pa- lavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N=-4 e uma compa- ração de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra de 3 e expec- tativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar Heni- koff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:10.915) usa ali- nhamento (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma compa- ração de ambas as fitas.

[0098] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (consultar, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:5.873 a 5.787). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabi- lidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nu- cleotídeos ou aminoácidos poderia ocorrer ao acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nuclei- co de teste com o ácido nucleico de referência for de menos do que cerca de 0,2, mais preferencialmente, de menos do que cerca de 0,01 e com máxima preferência de menos do que cerca de 0,001.

[0099] Uma indicação de que duas sequências de ácidos nuclei- cos ou polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o polipeptí-

deo codificado pelo primeiro ácido nucleico reage imunologicamente de modo cruzado com os anticorpos captados contra o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, conforme descrito abaixo. As- sim, tipicamente, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas pelas substituições conservativas. Outra indicação de que du- as sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas ou seus complementos se hibridizam uns aos outros sob condições estringentes, conforme descrito abaixo. Ainda outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são subs- tancialmente idênticas é que os mesmos iniciadores podem ser usa- dos para amplificar a sequência.

[00100] O termo “ligar”, quando usado no contexto de descrever como as regiões de ligação são conectadas a uma proteína enxertada com anticorpo-citocina, abrange todos os significados possíveis para unir fisicamente as regiões. A multiplicidade de regiões de ligação é frequentemente unida por ligações químicas, tais como uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação peptídica ou uma ligação dissul- feto) ou uma ligação não covalente, que pode ser uma ligação direta (isto é, sem um ligante entre as duas regiões de ligação) ou ligação indireta (isto é, com o auxílio de pelo menos uma molécula ligante en- tre as duas ou mais regiões de ligação).

[00101] Um “distúrbio relacionado à imunidade” ou “doença imuno- lógica” se refere a uma disfunção do sistema imunológico, na qual o próprio sistema imunológico do corpo ataca tecidos saudáveis. A dis- função pode estar em componentes das células imunológicas e inclui sistemas imunológicos tanto hiperativos como hipoativos.

[00102] Os termos “sujeito”, “paciente”, e “indivíduo” se referem in- tercambiavelmente a um mamífero, por exemplo, um ser humano ou um mamífero primata não humano. O mamífero também pode ser um mamífero de laboratório, por exemplo, camundongo, rato, coelho, hamster. Em algumas modalidades, o mamífero pode ser um mamífe- ro agrícola (por exemplo, equino, ovino, bovino, porcino, camelídeo) ou mamífero doméstico (por exemplo, canino, felino).

[00103] Conforme usado no presente documento, os termos “tratar”, “tratando” ou “tratamento” de qualquer doença ou distúrbio se referem, em uma modalidade, ao melhoramento da doença ou distúrbio (isto é, retardar ou interromper ou reduzir o desenvolvimento da doença ou pelo menos um dos sintomas clínicas da mesma). Em outra modalida- de, “tratar”, “que trata” ou “tratamento” se refere a aliviar ou melhorar pelo menos um parâmetro físico, incluindo aqueles que podem não ser discerníveis pelo paciente. Em ainda uma outra modalidade, “tratar”, “tratando” ou “tratamento” se refere à modulação da doença ou distúr- bio fisicamente, (por exemplo, estabilização de um sintoma discerní- vel), fisiologicamente (por exemplo, estabilização de um parâmetro fí- sico) ou ambos. Em ainda uma outra modalidade, “tratar”, “tratando” ou “tratamento” se refere à prevenção ou retardamento do início ou do desenvolvimento ou da progressão de uma doença ou distúrbio.

[00104] O termo “quantidade terapeuticamente aceitável” ou “dose terapeuticamente eficaz” intercambiavelmente se refere a uma quanti- dade suficiente para desencadear o resultado desejado (isto é, uma redução na inflamação, inibição da dor, prevenção de inflamação, ini- bição ou prevenção de resposta inflamatória). Em algumas modalida- des, uma quantidade terapeuticamente aceitável não induz nem pro- voca efeitos secundários indesejáveis. Uma quantidade terapeutica- mente aceitável pode ser determinada primeiro administrando-se uma baixa dose e, então, aumentando de modo incremental essa dose até o efeito desejado ser atingido. Uma “dosagem profilaticamente eficaz” e uma “dosagem terapeuticamente eficaz” de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina IL2 podem, respectivamente, prevenir o início dos sintomas da doença, ou resultar em uma diminuição na gravidade dos mesmos, associados aos distúrbios relacionados à imunidade.

[00105] O termo “coadministrar” se refere à presença simultânea de dois (ou mais) agentes ativos em um indivíduo. Os agentes ativos que são coadministrados podem ser simultânea ou sequencialmente libe- rados.

[00106] Conforme usado no presente documento, a frase “consistir essencialmente em” se refere aos gêneros ou espécies de agentes farmaceuticamente ativos incluídos em um método ou composição, bem como qualquer carreador inativo ou excipientes para o propósito pretendido dos métodos ou composições. Em algumas modalidades, a frase “consistir essencialmente em” exclui expressamente a inclusão de um ou mais agentes ativos adicionais diferentes de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina IL2. Em algumas modalidades, a fra- se “consistir essencialmente em” exclui expressamente a inclusão de mais agentes ativos adicionais diferentes de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina IL2 e um segundo agente coadministrado.

[00107] Os termos “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências no plu- ral, a menos que o contexto claramente indique de outra forma.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00108] A Figura 1 é uma tabela de construtos enxertados com an- ticorpo-citocina que mostra que IgG.IL2D49A.H1 expande preferenci- almente Tregs em comparação com uma IL2 recombinante (Proleu- kin®).

[00109] A Figura 2 é uma tabela que compara proteínas enxertadas com anticorpo-citocina com IL2 recombinante (Proleukin®). Observa- se que a molécula IgG.IL2D49A.H1 estimula o receptor de IL2 em cé- lulas Treg, mas não em células T efetoras (Teff) ou células NK con- forme medido por fosforilação de STAT5. Essa molécula também tem uma meia-vida mais longa que Proleukin® e provoca maior expansão de células Treg in vivo.

[00110] A Figura 3 é uma tabela de fold changes em um painel de tipos diferentes de células imunomoduladoras quando doses equimola- res de proteínas enxertadas com anticorpo-citocina são comparadas com Proleukin®.

[00111] A Figura 4 mostra dados experimentais na ativação diferen- cial do receptor de baixa afinidade ou de alta afinidade com IL2 por proteína enxertada com anticorpo-citocina em comparação com Pro- leukin® e conforme medido por fosforilação de STAT5. Observa-se que a IgG.IL2D49A.H1 estimula os receptores de IL2 de alta afinidade expressos em células Treg, mas não em células Tcon CD4+ ou CD8+.

[00112] A Figura 5 mostra dados experimentais em que Tregs ex- pandidas com proteínas enxertadas com anticorpo-citocina (por exem- plo, IgG.IL2D49A.H1) são melhores supressores de células T efetoras (Teff) (consultar painel superior). O painel inferior mostra dados expe- rimentais em que células Treg expandidas por proteínas enxertadas com anticorpo-citocina são estáveis por expressão de proteína Foxp3 e por metilação de Foxp3.

[00113] A Figura 6 mostra dados experimentais em que proteínas enxertadas com anticorpo-citocina têm pouco a nenhum efeito em cé- lulas NK que expressam o receptor de baixa afinidade com IL2. Em contrapartida, Proleukin® estimula células NK, conforme medido por ativação de pSTAT5.

[00114] A Figura 7 mostra dados experimentais sobre o perfil far- macocinético (PK), farmacodinâmico (PD) e de toxicidade de uma pro- teína enxertada com anticorpo-citocina em comparação com Proleu- kin® em macacos cinomolgos. Por exemplo, IgG.IL2D49A.H1 tem um perfil de toxicidade de eosinofilia muito mais reduzido que Proleukin®.

[00115] A Figura 8 é um gráfico que representa a meia-vida esten- dida de IgG.IL2D49.H1.

[00116] A Figura 9 mostra dados experimentais sobre moléculas de proteína enxertada com anticorpo-citocina em um modelo de camun- dongo GvHD. Isso mostra que o tratamento com proteínas enxertadas com anticorpo-citocina nesse modelo expande Tregs melhor que Pro- leukin®, enquanto tem pouco a nenhum efeito em células Teff CD4+/CD8+ ou células NK.

[00117] A Figura 10 mostra dados experimentais sobre as perdas de peso corporal associadas ao tratamento com Proleukin® em um modelo de camundongo GvHD, enquanto há pouca a nenhuma perda de peso corporal associada à administração de IgG.IL2D49.H1.

[00118] A Figura 11 mostra dados experimentais sobre a compara- ção de proteínas enxertadas com anticorpo-citocina com Proleukin® em um modelo de camundongo pré-diabético (NOD) e demonstra que IgG.IL2D49A.H1 previne diabetes tipo 1 nesse modelo.

[00119] A Figura 12 mostra dados experimentais sobre a compara- ção da razão entre Treg e células efetoras T CD8 em um modelo de camundongo pré-diabético NOD.

[00120] A Figura 13A mostra dados experimentais sobre a farmaco- cinética de IgG.IL2D49A.H1 no modelo de camundongo NOD a uma dose de 1,3 mg/kg. A Figura 13B mostra dados experimentais sobre a farmacocinética de IgG.IL2D49A.H1 no modelo de camundongo NOD a uma dose de 0,43 mg/kg.

[00121] A Figura 14 é uma tabela de faixas de dose usadas no mo- delo de camundongo pré-diabético NOD e compara quantidades equimolares de Proleukin®.

[00122] A Figura 15A mostra uma série de gráficos que represen- tam a quantidade de ativação de pSTAT5 em PBMCs humanas retira- das de um paciente com vitiligo e tratadas in vitro com IgG.IL2D49.H1 e comparadas com Proleukin®. A Figura 15B mostra uma série de grá- ficos que representam a quantidade de ativação de pSTAT5 em

PBMCs humanas retiradas de um paciente com diabetes tipo 1 e tra- tadas in vitro com IgG.IL2D49.H1 e Proleukin®.

[00123] A Figura 16 mostra um gráfico de dados de ELISA mos- trando que, quando IL2 é enxertada em CDRH1 de um anticorpo anti- RSV, a ligação a RSV é mantida. No entanto, a ligação a RSV é redu- zida quando IL2 é enxertada em CDRL3. Quando IL2 é enxertada em uma cadeia principal de anticorpo diferente (Xolair), não há ligação a RSV.

[00124] A Figura 17 mostra dados experimentais sobre a expansão de Treg em macaco cinomolgo após uma única dose de IgG.IL2D49A.H1.

[00125] A Figura 18 mostra dados experimentais sobre os efeitos do aumento de concentrações de um anticorpo reticulador IgG anti- humano nas atividades seletivas de GFTX3b_IL-2-H1-D49A.

[00126] A Figura 19 mostra dados experimentais sobre a sinaliza- ção seletiva na PBMC de diferentes pacientes autoimunes com GFTX3b_IL-2-H1-D49A.

[00127] A Figura 20 mostra dados experimentais sobre GFTX3b_IL- 2-H1-D49A que tem maior seletividade que proleucina para sinalização em Tregs sobre células T efetoras em PBMC humana. Proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que têm como alvo o receptor de alta afinidade com IL2

[00128] No presente documento são fornecidos construtos de prote- ína que compreende IL2 enxertada na região determinante da com- plementaridade (CDR) de um anticorpo. As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina mostram propriedades adequadas para serem usa- das em pacientes humanos, por exemplo, as mesmas retêm atividade imunoestimuladora semelhantes àquela de IL2 humana recombinante ou nativa. No entanto, os efeitos negativos são diminuídos, por exem- plo, estímulo de células NK. Outras atividades e características tam-

bém são demonstradas pelo relatório descritivo. Desse modo, são for- necidas proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que têm um perfil terapêutico aprimorado em relação a agentes terapêuticos de IL2 e de IL2 modificada anteriormente conhecidos, tais como Proleukin®, e mé- todos de uso das proteínas enxertadas com anticorpo-citocina forneci- das em terapia.

[00129] Consequentemente, a presente revelação fornece proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que são agonistas do receptor de alta afinidade com IL2, com perfis de atividade seletiva. As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina fornecidas que compreendem uma sequência de cadeias pesadas de imunoglobulina e uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina. Cada sequência de cadeias pesadas de imunoglobulina compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH), em que a região constante de cadeia pesada consiste em regiões constantes da CH1, CH2 e CH3. Cada sequência de cadeia leve de imunoglobulina com- preende uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região cons- tante de cadeia leve (CL). Em cada proteína enxertada com anticorpo- citocina, uma molécula de IL2 é incorporada em uma região determi- nante da complementaridade (CDR) da VH ou VL do anticorpo.

[00130] Em algumas modalidades, a proteína enxertada com anti- corpo-citocina compreende uma molécula de IL2 incorporada em uma CDR de cadeia pesada. Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorporada na região determinante da complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1). Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorporada na região determinante da complementaridade de cadeia pesada 2 (HCDR2). Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorporada na região determinante da complementaridade de cadeia pesada 3 (HCDR3).

[00131] Em algumas modalidades, a proteína enxertada com anti-

corpo-citocina compreende uma molécula de IL2 incorporada em uma CDR de cadeia leve. Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorporada na região determinante da complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1). Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorporada na região determinante da complementaridade de cadeia leve 2 (LCDR2). Em determinadas modalidades, a molécula de IL2 é incorporada na região determinante da complementaridade de cadeia leve 3 (LCDR3).

[00132] Em algumas modalidades, o anticorpo citocina enxertado compreende uma sequência de IL2 incorporada em uma CDR, por meio do qual, a sequência de IL2 é inserida na sequência de CDR. A inserção pode estar na região N-terminal da CDR, ou próxima da mesma, na região intermediária da CDR ou na região C-terminal, ou próxima da mesma, da CDR. Em outras modalidades, a proteína en- xertada com anticorpo-citocina compreende uma molécula de IL2 in- corporada em uma CDR, por meio da qual a sequência de IL2 substitui a totalidade ou parte de uma sequência de CDR. Uma substituição po- de ser a região N-terminal da CDR, na região intermediária da CDR ou na região C-terminal, ou próxima da mesma, a CDR. Uma substituição pode ser baixa, de um ou dois aminoácidos de uma sequência da CDR ou de toda a sequência da CDR.

[00133] Em algumas modalidades, uma molécula de IL2 é enxerta- da diretamente em uma CDR sem um ligante de peptídeo, sem ami- noácidos adicionais entre a sequência da CDR e a sequência de IL2.

[00134] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem cadeias pesadas de imunoglobulina de uma cadeia pesada de anticorpo de classe de IgG. Em determina- das modalidades, uma cadeia pesada IgG é qualquer uma dentre uma subclasse de uma IgG1, uma IgG2 ou uma IgG4.

[00135] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem sequências de imunoglobulinas de cadeia pesada e leve selecionadas a partir de uma sequência de imu- noglobulinas utilizada clinicamente conhecida. Em determinadas mo- dalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreen- dem sequências de imunoglobulinas de cadeia pesada e leve que são sequências humanizadas. Em outras determinadas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem sequên- cias de imunoglobulinas de cadeia pesada e leve que são sequências humanas.

[00136] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem sequências de imunoglobulinas de cadeia pesada e leve selecionadas a partir de sequências de imuno- globulinas de linhagem germinativa.

[00137] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem sequências de imunoglobulinas de cadeia pesada e leve que têm especificidade de ligação dos domínios variáveis de imunoglobulina para um alvo distinto da especificidade de ligação da molécula de IL2. Em algumas modalidades, a especificida- de de ligação do domínio de imunoglobulina variável para o alvo da mesma é retida por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100%, na presença da citocina enxertada. Em determinadas modalidades, a especificidade de ligação retida é para um alvo não humano. Em determinadas modalidades, a especifi- cidade de ligação retida para um vírus, por exemplo, RSV. Em outras modalidades, a especificidade de ligação é para um alvo humano que tem utilidade terapêutico em combinação com uma terapia de IL2. Em determinadas modalidades, ter como alvo a especificidade de ligação da imunoglobulina transporta benefício terapêutico adicionalmente ao componente de IL2. Em determinadas modalidades, a especificidade de ligação da imunoglobulina ao seu alvo transporta atividade sinérgi-

ca com IL2.

[00138] Ainda em outras modalidades, a especificidade de ligação da imunoglobulina ao seu alvo é reduzida em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% pelo enxerto da molécula de IL2.

[00139] As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreen- dem uma molécula de IL2 incorporada em uma região determinante da complementaridade (CDR) da VH ou VL da proteína enxertada com anticorpo-citocina. Em algumas modalidades, a sequência de IL2 tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a molécula de IL2 compreende a sequência da SEQ ID NO:4. Em algumas moda- lidades, a molécula de IL2 consiste na sequência da SEQ ID NO:4. As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem uma molé- cula de IL2 incorporada em uma região determinante da complementa- ridade (CDR) da VH ou VL da proteína enxertada com anticorpo- citocina. Em algumas modalidades, a sequência de IL2 tem pelo me- nos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de sequência em relação à sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a molécula de IL2 compreende a sequência da SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a molécula de IL2 consiste na sequência da SEQ ID NO:4.

[00140] As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreen- dem uma molécula de IL2 incorporada em uma região determinante da complementaridade (CDR) da VH ou VL da proteína enxertada com anticorpo-citocina. Em algumas modalidades, a sequência de IL2 tem pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6. Em algumas modalidades, a molécula de IL2 compreende a sequência da SEQ ID NO:6. Em algumas moda- lidades, a molécula de IL2 consiste na sequência da SEQ ID NO:6. As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem uma molé- cula de IL2 incorporada em uma região determinante da complementa- ridade (CDR) da VH ou VL da proteína enxertada com anticorpo- citocina. Em algumas modalidades, a sequência de IL2 tem pelo me- nos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade de sequência em relação à sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:6. Em algumas modalidades, a molécula de IL2 compreende a sequência da SEQ ID NO:6. Em algumas modalidades, a molécula de IL2 consiste na sequência da SEQ ID NO:6.

[00141] Em algumas modalidades, a proteína enxertada anticorpo citocina confere propriedades anti-inflamatórias superiores à IL2 hu- mana, IL2 humana recombinante ou Proleukin®. Em algumas modali- dades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no presente documento conferem atividade aumentada em células Treg ao mesmo tempo que fornecem atividade pró-inflamatória proporcional reduzida em comparação com a IL2 humana, IL2 humana recombinan- te ou Proleukin®. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no presente documento fornecem estímulo preferencial do receptor de IL2 de alta afinidade. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina revela- das no presente documento fornecem ativação preferencial de células Treg em relação às células Teff , células Tcon e/ou células NK. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no presente documento fornecem expansão preferencial de células Treg em relação às células Teff, células Tcon e/ou células NK. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo- citocina reveladas no presente documento fornecem expansão aumen- tada de células Treg sem expansão de células efetoras T CD8 ou célu-

las NK. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anti- corpo-citocina reveladas no presente documento fornecem uma razão de expansão entre células Treg: células NK que é, é cerca de, é maior que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no presente documento fornecem uma razão de expansão entre células Treg: células efetoras T CD8 que é, é cerca de, é maior que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no presente documento fornecem uma razão de expansão entre células Treg: células Tcon CD4 que é, é cerca de, é maior que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

[00142] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no presente documento fornecem potên- cia de sinalização de IL-2R que é reduzida em células Tcon CD4 em comparação a IL2 humana, IL2 humana recombinante ou Proleukin®. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo- citocina reveladas no presente documento fornecem potência de sina- lização de IL-2R que é reduzida em células CD8 Teff em comparação à IL2 humana, IL2 humana recombinante ou Proleukin®. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina revela- das no presente documento fornecem potência de sinalização de IL- 2R que é reduzida em células NK em comparação a IL2 humana, IL2 humana recombinante ou Proleukin®. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no presente documento fornecem ativação específica de células Treg em relação células efetoras T CD4 que é cerca de 1.000 vezes, cerca de 2.000 vezes, cerca de 3.000 vezes, cerca de 4.000 vezes, cerca de 5.000 vezes, cerca de 6.000 vezes, cerca de 7.000 vezes, cerca de 8.000 vezes, cerca de 9.000 vezes, cerca de 10.000 vezes ou mais, maior que IL2 humana, IL2 humana recombinante ou Proleukin®. Em algu-

mas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina re- veladas no presente documento fornecem ativação específica de célu- las Treg em relação células efetoras T CD8 que é cerca de 100 vezes, cerca de 200 vezes, cerca de 300 vezes, cerca de 400 vezes, cerca de 500 vezes, cerca de 600 vezes, cerca de 700 vezes, cerca de 800 ve- zes, cerca de 900 vezes, cerca de 1.000 vezes ou mais, maior que IL2 humana, IL2 humana recombinante ou Proleukin®. Em algumas moda- lidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no presente documento fornecem ativação específica e células Treg em relação a células efetoras T CD8/de memória que é cerca de 100 ve- zes, cerca de 200 vezes, cerca de 300 vezes, cerca de 400 vezes, cerca de 500 vezes, cerca de 600 vezes, cerca de 700 vezes, cerca de 800 vezes, cerca de 900 vezes, cerca de 1.000 vezes ou mais, maior que IL2 humana, IL2 humana recombinante ou Proleukin®.

[00143] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no presente documento fornecem toxici- dade reduzida, tal como expansão de eosinofilia, em comparação a IL2 humana, IL2 humana recombinante ou Proleukin®. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina revela- das no presente documento fornecem meia-vida aumentada, tal como mais de 4 horas, mais que 6 horas, mais que 8 horas, mais que 12 ho- ras, mais de 24 horas, mais de 48 horas, em comparação a IL2 huma- na, IL2 humana recombinante ou Proleukin®. Em algumas modalida- des, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no pre- sente documento fornecem perda de peso corporal reduzida, tal como em pacientes com doença do enxerto x hospedeiro (GvHD), em com- paração a IL2 humana, IL2 humana recombinante ou Proleukin®. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reveladas no presente documento fornecem melhor proteção contra desenvolvimento de diabetes tipo 1 em comparação a IL2 humana, IL2 humana recombinante ou Proleukin®.

[00144] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem uma imunoglobulina IgG modificada que tem um Fc modificado que contém função efetora modificada. Em determinadas modalidades, a região Fc modificada compreende uma mutação selecionada a partir de um ou mais dentre D265A, P329A, P329G, N297A, L234A e L235A. Em modalidades particulares, a ca- deia pesada de imunoglobulina pode compreender uma mutação ou combinação de mutações que conferem função efetora reduzida sele- cionada a partir de qualquer um dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A.

[00145] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem (i) uma região variável de cadeia pe- sada que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em relação a uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:20 e (ii) uma região variável de cadeia leve que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% a uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:33. A imunoglobulina cadeia é uma classe de IgG selecionada a partir de IgG1, IgG2 ou IgG4. Em determinadas modalidades, a imunoglobulina opcionalmente compre- ende uma mutação ou combinação de mutações que confere função efetora reduzida selecionada a partir de qualquer um dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A.

[00146] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem (i) uma região variável de cadeia pe- sada que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos

85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em relação a uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:46 e (ii) uma região variável de cadeia leve que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% a uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:58. A imunoglobulina cadeia é uma classe de IgG selecionada a partir de IgG1, IgG2 ou IgG4. Em determinadas modalidades, a imunoglobulina opcionalmente compre- ende uma mutação ou combinação de mutações que confere função efetora reduzida selecionada a partir de qualquer um dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A.

[00147] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem (i) uma região variável de cadeia pe- sada que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em relação a uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:71 e (ii) uma região variável de cadeia leve que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% a uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:84. A imunoglobulina cadeia é uma classe de IgG selecionada a partir de IgG1, IgG2 ou IgG4. Em determinadas modalidades, a imunoglobulina opcionalmente compre- ende uma mutação ou combinação de mutações que confere função efetora reduzida selecionada a partir de qualquer um dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A.

[00148] Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem (i) uma região variável de cadeia pe- sada que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos

85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em relação a uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO:97 e (ii) uma região variável de cadeia leve que tem identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% a uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO:110. A cadeia de imunoglobuli- na é uma classe de IgG selecionada a partir de IgG1, IgG2 ou IgG4. Em determinadas modalidades, a imunoglobulina opcionalmente com- preende uma mutação ou combinação de mutações que confere fun- ção efetora reduzida selecionada a partir de qualquer um dentre D265A, P329A, P329G, N297A, D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A, e P329G/L234A/L235A. Proteínas Enxertadas Submetidas à Engenharia Genética e Modifica- das com Anticorpo e Citocina

[00149] Em determinados aspectos, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina são geradas enxertando-se uma sequência de IL2 em uma região da CDR de um arcabouço de imunoglobulina. Ambas as cadeias de imunoglobulina de cadeia pesada e leve são produzidas para gerar proteínas enxertadas de anticorpo final. As proteínas enxer- tadas com anticorpo-citocina conferem atividade terapêutica preferen- cial em células Treg, no entanto, as proteínas enxertadas com anticor- po-citocina reduziram atividade pró-inflamatória em comparação a IL2 humana nativa ou recombinante (rhIL2 ou Proleukin®).

[00150] A fim de modificar geneticamente as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina, sequências de IL2 que contêm muteínas espe- cíficas (SEQ ID NO:4 ou SEQ ID NO:6) são inseridas em um ciclo de CDR de uma proteína de arcabouço de cadeia de imunoglobulina. Os construtos enxertados podem ser preparados como uso de uma varie- dade de sequências de imunoglobulinas conhecidas que forma utiliza- da sem ambientes clínicos, sequências de imunoglobulinas conheci-

das que estão em descoberta atual e/ou desenvolvimento clínico, se- quências de anticorpo de linhagem germinativa humana, assim como sequências de cadeias de imunoglobulina de anticorpo inovador. Os construtos são produzidos com o uso de metodologia de biologia mo- lecular padrão que utilizam DNA recombinante que codificam sequên- cias relevantes. As sequências de IL2 em um arcabouço exemplificati- vo, denominadas de GFTX3b, são retratadas na TABELA 2. Os pontos de inserção foram selecionados para serem o ponto intermediário do laço com base em dados de modelo de homologia ou estrutural dispo- nível, no entanto, os pontos de inserção podem ser ajustados para a extremidade N ou C-terminal do laço de CDR.

[00151] Desse modo, a presente revelação fornece proteínas enxer- tadas com anticorpo-citocina que se ligam especificamente ao receptor de IL2 de alta afinidade que compreendem uma proteína IL2 inserida de maneira recombinante em uma proteína ou polipeptídeo de anticor- po heterólogo para gerar proteínas enxertadas com anticorpo-citocina. Em particular, a revelação fornece proteínas enxertadas com anticor- po-citocina que compreendem um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo descrito no presente documento ou qualquer outro polipeptídeo de anticorpo de arcabouço relevante (por exemplo, uma proteína de imunoglobulina de anticorpo completo, um fragmento Fab, fragmento Fc, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, um domínio VH, uma CDR de VH, um domínio VL, uma CDR de VL etc.) e uma proteí- na citocina heteróloga, polipeptídeo, ou peptídeo, por exemplo, IL2. Métodos para fundir ou conjugar proteínas, polipeptídeos ou peptídeos a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, as Patentes nº U.S. 5.336.603.

5.622.929. 5.359.046. 5.349.053. 5.447.851 e 5.112.946; Patentes Eu- ropeias nº E.P. 307.434 e E.P. 367.166; Publicações Internacionais nº WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl.

Acad. Sci. EUA 88: 10.535 a 10.539; Zheng et al., 1995, J. imunol. 154:5.590 a 5.600; e Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:11.337 a 11.341. Adicionalmente, as proteínas enxertadas com an- ticorpo-citocina podem ser geradas através das técnicas de embara- lhamento de gene, embaralhamento de motivo, embaralhamento de éxon e/ou embaralhamento de códon (denominado coletivamente de "embaralhamento de DNA"). O embaralhamento de DNA pode ser em- pregado para preparar proteínas enxertadas com anticorpo-citocina e/ou para alterar as atividades de anticorpos ou fragmentos dos mes- mos (por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos com afini- dades mais altas taxas de dissociação inferiores). Consultar, geral- mente, a patente U.S. nos 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252, e 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724 a 733; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76 a 82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265 a 276; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotech- niques 24(2):308 a 313 (cada uma dessas patentes e publicações está incorporada ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade). Os anticorpos ou fragmentos dos mesmos ou os anticorpos codificados ou fragmentos dos mesmos podem ser alterados sendo submetido a mutagênese aleatória por PCR propícia a erro, inserção de nucleotídeo aleatório ou outros métodos antes da recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a uma proteína de antígeno de interesse pode ser recombinado com um ou mais componentes, motivos, se- ções, partes, domínios, fragmentos etc. de uma ou mais moléculas de citocina heterólogas, por exemplo, IL2, para preparação de proteínas enxertadas com anticorpo-citocina, conforme fornecido no presente documento.

[00152] Um anticorpo Fab contém seis laços de CDR, 3 na cadeia leve (CDRL1, CDRL2, CDRL3) e 3 na cadeia pesada (CDRH1,

CDRH2, CDRH3) que pode servir como sítios de inserção potenciais para uma proteína citocina. As considerações estruturais e funcionais são consideradas a fim de determinar que o laço de CDR (ou laços de CDR) para inserir a citocina. Uma vez que o tamanho e conformação de laço de CDR variam consideravelmente em diferentes anticorpos, a CDR ideal para inserção pode ser determinada de maneira empírica para cada combinação particular de anticorpo/proteína. Adicionalmen- te, visto que uma proteína citocina será inserida em um laço de CDR, isso pode impor limitações adicionais na estrutura da proteína citocina. Por exemplo, o terminal amino e carbóxi da proteína citocina deve permitir a possibilidade de ser limitado relativamente próximo no (~25 Å). Adicionalmente, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina não deve se basear na oligomerização para atividade biológica. Uma análise de estruturas de bancos de dados de proteína disponível indica muitas proteínas citocina, incluindo IL2, são abrangidas nessa catego- ria.

[00153] As CDRs de cadeias de imunoglobulina são determinadas por sistemas de numeração bem conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos presente documento. Por exemplo, as CDRs foram identificadas e definidas (1) com o uso do sistema de numeração des- crito em Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest” 5ª Edição. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração "Kabat"), publicação NIH nº 91 a 3.242; e (2) Chothia, consultar Al-Lazikani et al., (1997) "Standard conformations for the canonical structures of imunoglobulins", J.Mol.Biol. 273:927 a 948. Para sequências de aminoácidos de CDR identificadas com comprimento menor que 20 aminoácidos, uma ou duas substituições de resíduo de aminoácido conservadores podem ser toleradas ao mesmo tempo que ainda retêm a ligação específica desejada e/ou atividade agonista.

[00154] Uma proteína enxertada com anticorpo-citocina pode ser preparada adicionalmente como uso de um anticorpo que tem uma ou mais dentre as sequências de CDRs e/ou VH e/ou VL mostradas no presente documento (por exemplo, TABELA 2) como material inicial para submeter à engenharia genética uma proteína enxertada com an- ticorpo-citocina, que pode ter propriedades alteradas da proteína en- xertada com anticorpo inicial.

Alternativamente, quaisquer sequências de anticorpos conhecidas podem ser utilizadas como um arcabouço para submeter à engenharia genética proteína modificada enxertada com anticorpo-citocina.

Por exemplo, qualquer anticorpo utilizado clini- camente conhecido pode ser utilizado como um arcabouço de materi- ais iniciais para preparação de proteína enxertada com anticorpo.

Os anticorpos conhecidos e sequências de imunoglobulinas correspon- dentes incluem include, por exemplo, palivizumabe, alirocumabe, me- polizumabe, necitumumabe, nivolumabe, dinutuximabe, secuquinuma- be, evolocumabe, blinatumomabe, pembrolizumabe, ramucirumabe, vedolizumabe, siltuximabe, obinutuzumabe, trastuzumabe, raxibacu- mabe, pertuzumabe, belimumabe, ipilimumabe, denosumabe, tocilizu- mabe, ofatumumabe, canaquinumabe, golimumabe, ustequinumabe, certolizumabe, catumaxomabe, eculizumabe, ranibizumabe, panitu- mumabe, natalizumabe, bevacizumabe, cetuximabe, efalizumabe, omalizumabe, tositumomabe, ibritumomabe, tiuxetano, adalimumabe, alentuzumabe, gentuzumabe, infliximabe, basiliximabe, daclizumabe, rituximabe, abciximabe, muromonabe ou modificações dos mesmos.

Os anticorpos e sequências de imunoglobulinas também incluem se- quências de anticorpo de linhagem germinativa.

As sequências estru- turantes podem ser obtidas a partir de bancos de dados de DNA públi- co ou referências publicadas que incluem sequências gênicas de anti- corpo de linhagem germinativa.

Por exemplo, as sequências de DNA de linhagem germinativa para genes humanos de região variável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas no banco de dados de sequência de linhagens germinativas humanas "VBase" assim como em Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health e Human Services, Publicação NIH nº 91 a 3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776 a 798; e Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J imunol. 24:827 a 836. Em ainda outros exemplos, o anticorpo e sequências de imunoglobuli- nas correspondentes de outras entidades conhecidas que podem estar em descoberta precoce e/ou desenvolvimento de fármaco podem ser adaptados de modo semelhante como material inicial para submeter à engenharia genética uma proteína modificada enxertada com anticor- po-citocina.

[00155] Uma variedade ampla de estruturas de anticorpo/imunoglo- bulina ou arcabouços pode ser empregada desde que o polipeptídeo resultante inclua pelo menos uma região de ligação que acomoda a incorporação de uma citocina (por exemplo, IL2). Tais estruturas ou arcabouços incluem os 5 idiotipos principais de imunoglobulinas hu- manas ou fragmentos dos mesmos e incluem imunoglobulinas de ou- tras espécies animais, de preferência, que têm aspectos humanizados e/ou humanos. Os anticorpos, estruturas, arcabouços e fragmentos inovadores continuam a ser descobertos e desenvolvidos pelas pes- soas versadas na técnica.

[00156] Os anticorpos podem ser gerados com o uso de métodos que são conhecidos na técnica. Para preparação de anticorpos mono- clonais, qualquer técnica conhecida na técnica pode ser usada (con- sulta, por exemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495 a 497 (1975); Kozbor et al., imunology Today 4:72 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies e Cancer Therapy, páginas 77 a 96. Alan R. Liss, Inc. 1985). Técnicas para produção de anticorpos de cadeia única (patente U.S. no 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos para uso em proteínas enxertadas com anticorpo-citocina. Além disso, ca- mundongos transgênicos ou outros organismos, tais como outros ma- míferos, podem ser usados para expressar e identificar anticorpos pri- matizados ou humanizados ou humanos. Alternativamente, tecnologia de exibição de fago pode ser usada para identificar anticorpos e frag- mentos Fab heteroméricos que se ligam especificamente a antígenos selecionados para uso em proteínas enxertadas com anticorpo- citocina (consultar, por exemplo, McCafferty et al., supra; Marks et al., Biotechnology, 10:779 a 783, (1992)).

[00157] Métodos para primatizar ou humanizar anticorpos não hu- manos são bem conhecidos na técnica. Em geral, um anticorpo prima- tizado ou humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido intro- duzidos no mesmo provenientes de uma fonte que é não primara ou não humana. Tais resíduos de aminoácido não primatas ou não hu- manos são frequentemente denominados resíduos de importação, que são tipicamente retirados de um domínio variável de importação. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (consultar, por exemplo, Jones et al., Natu- re 321:522 a 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 a 327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1.534 a 1.536 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 a 596 (1992)), substituindo-se CDRs ou sequências de CDRs pelas sequências correspondentes de um anti- corpo humano. Consequentemente, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (patente U.S. no 4.816.567), em que substanci- almente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prá- tica, anticorpos primatizados ou humanizados são tipicamente anticor- pos primatas ou humanos nos quais alguns resíduos de região deter- minante de complementaridade ("CDR") e possivelmente alguns resí- duos estruturantes ("FR") são substituídos por resíduos de sítios aná-

logos em uma espécie originária (por exemplo, anticorpos de roedor) para conferir especificidade de ligação.

[00158] Alternativa ou adicionalmente, um método in vivo para substituir uma região variável de anticorpo não humano por uma regi- ão variável humana em um anticorpo, enquanto mantém as mesmas características ou fornece melhores características de ligação relacio- nadas àquelas do anticorpo não humano, pode ser utilizado para con- verter anticorpos não humanos em anticorpos humanos geneticamente modificados. Consultar, por exemplo, a publicação de patente U.S. no 20050008625 e a publicação de patente U.S. no 2005/0255552. Alter- nativamente, bibliotecas de segmento V humano podem ser geradas por substituição sequencial de cassetes na qual apenas parte do seg- mento V do anticorpo de referência é inicialmente substituída por uma biblioteca de sequências humanas; e “cassetes” humanos identificados que suportam ligação no contexto de sequências de aminoácidos resi- duais do anticorpo de referência são, então, recombinados em uma segunda tela da biblioteca para gerar segmentos V completamente humanos (consultar, publicação de patente U.S. no 2006/0134098).

[00159] Vários anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno pa- ra uso na preparação de proteínas enxertadas com anticorpo-citocina podem ser produzidos por modificação enzimática ou química dos an- ticorpos intactos, ou sintetizados de novo com o uso de metodologias de DNA recombinante (por exemplo, Fv de cadeia única) ou identifica- dos com o uso de bibliotecas de exibição de fagos (consultar, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348:552 a 554, 1990). Por exemplo, minicorpos podem ser gerados com o uso dos métodos descritos na técnica, por exemplo, Vaughan e Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417 a 430, 2001. Anticorpos biespecíficos po- dem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo enxertos de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Consultar, por exemplo,

Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. imunol. 79:315 a 321 (1990); Kos- telny et al., J. imunol. 148, 1.547 a 1.553 (1992). Anticorpos de cadeia única podem ser identificados com o uso de bibliotecas de exibição de fagos ou bibliotecas de exibição de ribossoma, bibliotecas embaralha- das de genes. Tais bibliotecas podem ser construídas a partir de fon- tes imunocompetentes sintéticas, semissintéticas ou nativas. As se- quências de imunoglobulinas selecionadas podem, assim, ser utiliza- das na preparação de construtos de proteína enxertada com anticorpo- citocina conforme fornecido no presente documento.

[00160] Os anticorpos, as moléculas de ligação ao antígeno ou as moléculas enxertadas com anticorpo-citocina da presente revelação incluem adicionalmente anticorpos biespecíficos. Um anticorpo bies- pecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial que tem dois pares de cadeias pesada/leve diferentes e dois sítios de ligação dife- rentes. Outros fragmentos de ligação ao antígeno ou porções de anti- corpo incluem scFv bivalente (diacorpo), anticorpos scFv biespecifícos em que a molécula de anticorpo reconhece dois epítopos diferentes, domínios de ligação única (dAbs) e minicorpos. As sequências de imunoglobulinas selecionadas podem, assim, ser utilizadas na prepa- ração de construtos de proteína enxertada com anticorpo-citocina con- forme fornecido no presente documento.

[00161] Os fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos, por exemplo, um fragmento Fab, scFv, podem ser usados como blocos de construção para construir proteínas enxertadas com anticorpo-citocina e podem, opcionalmente, incluir formatos multivalentes. Em algumas modalidades, tais moléculas multivalentes compreendem uma região constante de um anticorpo (por exemplo, Fc).

[00162] As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina podem ser modificadas geneticamente modificando-se um ou mais resíduos em uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL) de um anti-

corpo, por exemplo, em uma ou mais regiões CDR e tais sequências adaptadas de região de VH e/ou VL utilizadas para enxertar citocina ou para a preparação de enxerto de citocina. Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de ami- noácidos que se situam nas seis regiões determinantes de cadeia pe- sada e leve de complementaridade (CDRs). Por esta razão, as se- quências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre os anticorpos individuais do que as sequências fora das CDRs. As se- quências de CDR são responsáveis pela maior parte das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de um anticorpo específico construindo-se vetores de expressão que incluem sequências de CDR de um anticor- po específico enxertado em sequências estruturantes de um anticorpo diferente com diferentes propriedades (consultar, por exemplo, Riech- mann, L. et al., 1998 Nature 332:323 a 327; Jones, P. et al., 1986 Na- ture 321:522 a 525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., EUA 86:10.029 a 10.033; patente US no 5.225.539 de Winter, e patentes US nos 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al.). Em determinados casos, é benéfico mutar resíduos nas regiões estrutu- rantes para manter ou intensificar a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo (consular, por exemplo, patente U.S. nos 5.530.101;

5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al).

[00163] Em alguns aspectos, a mutação de resíduos de aminoácido nas regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL para, assim, me- lhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecida como “maturação de afinidade”, pode ser benéfica, por exemplo, para otimizar a ligação ao antígeno de um anticorpo em conjunto com o contexto da proteína enxertada com citocina. Mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a mutação (ou mutações) e o efeito na ligação ao anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo conforme descrito no presente documento e fornecido nos Exemplos e/ou ensaios alternati- vos ou adicionais conhecidos na técnica. Modificações conservativas podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições, adi- ções ou deleções de aminoácidos. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região de CDR são alterados.

[00164] Anticorpos ou fragmentos de anticorpo modificados geneti- camente incluem aqueles nos quais modificações foram feitas aos re- síduos estruturantes em VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Em algumas modalidades, tais modifica- ções estruturantes são realizadas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é alterar um ou mais resí- duos estruturantes para a sequência de linhagem germinativa corres- pondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos estruturantes que diferem da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as sequências estruturantes de anticorpo com as sequências de linhagem germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para devolver as sequências de região estrutu- rante à sua configuração de linhagem germinativa, as mutações somá- ticas podem sofrer "mutação reversa" para a sequência de linhagem germinativa, por exemplo, por mutagênese sítio-dirigida. A modificação estruturante adicional envolve mutar um ou mais resíduos na região estruturante, ou até em uma ou mais regiões CDR, para remover epí- topos de célula T para, assim, reduzir a potencial imunogenicidade do anticorpo. Essa abordagem é também denominada "desimunização" e é descrita em maior detalhe na Publicação de Patente US Nº 20030153043 de Carr et al.

[00165] Regiões constantes dos anticorpos ou fragmentos de anti- corpo utilizados para a preparação da proteína enxertada com anticor- po-citocina podem ser de qualquer tipo ou subtipo, conforme adequa- do e podem ser selecionados a partir das espécies do sujeito a ser tra- tado pelos presentes métodos (por exemplo, ser humano, primata não humano ou outro mamífero, por exemplo, mamífero agrícola (por exemplo, equino, ovino, bovino, porcino, camelídeo), mamífero domés- tico (por exemplo, canino, felino) ou roedor (por exemplo, rato, camun- dongo, hamster, coelho). Em algumas modalidades, os anticorpos uti- lizados em proteínas enxertadas com anticorpo-citocina são submeti- dos à engenharia genética para gerar anticorpos humanizados ou Hu- maneered® . Em algumas modalidades, os anticorpos utilizados em proteínas enxertadas com anticorpo-citocina são anticorpos humanos. Em algumas modalidades, o isótipo de região constante de anticorpo é a IgG, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Em determinadas modali- dades, o isotipo de região constante é IgG1. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem uma IgG. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticor- po-citocina compreendem um Fc de IgG1. Em algumas modalidades, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina compreendem um Fc de IgG2.

[00166] Adicional ou alternativamente às modificações feitas dentro da estrutura ou das regiões CDR, os anticorpos ou fragmentos de anti- corpo utilizados na preparação de proteínas enxertadas com anticor- po-citocina podem ser submetidos à engenharia genética para incluir modificações dentro de uma região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionas do anticorpo, tal como, por exemplo, meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação ao receptor Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anti- corpo, fragmento de anticorpo ou proteína enxertada com anticorpo-

citocina pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser fixadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais da proteína enxertada com anticorpo-citocina.

[00167] Em uma modalidade, uma região de articulação de CH1 é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de articulação seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Por exemplo, por meio da abordagem que é adicionalmente descrita na patente U.S. no 5.677.425 de Bodmer et al., em que o número de resíduos de cisteína na região de articulação de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade da proteína enxertada com anticorpo-citocina. Em uma outra modalidade, uma região de articula- ção Fc de um anticorpo é mutada para alterar a meia-vida biológica da proteína enxertada com anticorpo-citocina. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de inter- face de domínio CH2-CH3 do fragmento da articulação Fc de modo que a proteína enxertada com anticorpo-citocina prejudique a ligação da proteína A Staphylococcyl (SpA) em relação à ligação de SpA ao domínio Fc nativo. Essa abordagem é descrita com mais detalhes na patente U.S. no 6.165.745, de Ward et al.

[00168] A presente revelação fornece proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que se ligam especificamente ao receptor de alta afinidade com IL2 que tem uma meia-vida estendida in vivo. Em uma outra modalidade, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é modificada para aumentar sua meia-vida biológica. São possíveis vá- rias abordagens. As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que têm um aumento na meia-vida in vivo também podem ser geradas in- troduzindo-se uma ou mais modificações de aminoácido (isto é, substi- tuições, inserções ou deleções) em um domínio constante de IgG, ou fragmento de ligação FcRn das mesmas (de preferência, um fragmen- to de domínio Fc ou de Fc de articulação). Por exemplo, podem ser introduzidas uma ou mais das seguintes mutações: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente US Nº 6.277.375 de Ward. Ver, por exemplo, Publicação Internacional N° WO 98/23289; Publicação Inter- nacional Nº WO 97/34631; e Patente US Nº 6.277.375. Alternativa- mente, para aumentar a meia-vida biológica, a proteína enxertada com anticorpo-citocina é alterada na região CH1 ou CL para conter um epí- topo de ligação ao receptor de resgate retirado de dias alças de um domínio de CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito na patente U.S. nos 5.869.046 e 6.121.022 de Presta et al. Em ainda ou- tras modalidades, a região Fc é alterada substituindo-se pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras da proteína enxertada com anticorpo- citocina. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituí- dos por um resíduo de aminoácido diferente de modo que a proteína enxertada com anticorpo-citocina tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retêm a capacidade para se ligar ao antígeno do anticorpo parental. O ligante efetor no qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc (FcR) ou o componente C1 de complemento. Essa abordagem é descrita com mais detalhe nas pa- tentes U.S. no 5.624.821 e 5.648.260, ambas de Winter et al.

[00169] Em uma outra modalidade, um ou mais aminoácidos sele- cionados a partir de resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente de modo que a proteína en- xertada com anticorpo-citocina tenha ligação a C1q e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzido ou abolido alteradas. Essa abordagem é descrita com mais detalhes na patente U.S. n o

6.194.551 de Idusogie et al.

[00170] As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina que contêm tais mutações medeiam a citotoxicidade celular dependente de anti- corpo (ADCC) reduzida ou inexistente ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Em algumas modalidades, os resíduos de ami- noácidos L234 e L235 da região constante IgG1 são substituídos por Ala234 e Ala235. Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido N267 da região constante IgG1 é substituído por Ala267.

[00171] Em uma outra modalidade, um ou mais resíduos de amino- ácido são alterados para, assim, alterar a capacidade da proteína en- xertada com anticorpo-citocina de se fixar ao complemento. Essa abordagem é descrita com mais detalhes na publicação PCT no WO 94/29351 de Bodmer et al.

[00172] Em ainda uma outra modalidade, uma região Fc é modifi- cada para aumentar a capacidade do anticorpo para mediar citotoxici- dade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade da proteína enxertada com anticorpo-citocina para um recep- tor Fcγ modificando-se um ou mais aminoácidos. Esta abordagem é descrita adicionalmente na publicação PCT WO 00/42072 de Presta. Além disso, os sítios de ligação em IgG1 humana para FcγRl, FcγRII, FcγRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada foram descritas (consultar Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6.591 a 6.604).

[00173] Em ainda uma outra modalidade, a glicosilação de uma pro- teína enxertada com anticorpo-citocina é modificada. Por exemplo, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina aglicosilada pode ser produzida (isto é, a proteína enxertada com anticorpo-citocina carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo para “antígeno”. Tais modificações de carboidrato podem ser alcançadas, por exemplo, por alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, podem ser efetuadas uma ou mais substituições de ami-

noácidos que resultem na eliminação de um ou mais sítios de glicosi- lação de arcabouço de região variável para assim eliminar a glicosila- ção nesse sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anti- corpo para antígeno. Tal abordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes US Nº 5.714.350 e 6.350.861 de Co et al.

[00174] Adicional ou alternativamente, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina pode ser produzida tendo um tipo alterado de glico- silação, tal como uma proteína enxertada com anticorpo-citocina hipo- fucosilada que tem quantidades reduzidas de resíduos fucosila ou um anticorpo que tem estruturas GlcNac de bissecção aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados foram demonstrados aumentando a capacidade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) dos anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser alcança- das, por exemplo, expressando-se a proteína enxertada com anticor- po-citocina em uma célula hospedeira com maquinário de glicosilação alterado. Células com maquinário de glicosilação alterado foram des- critas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais expressar proteínas enxertadas com anticorpo-citocina recombi- nantes para, assim, produzir uma proteína enxertada com anticorpo- citocina com glicosilação alterada. Por exemplo, o documento no EP

1.176.195 de Hang et al. descreve uma linhagem celular com um gene funcionalmente interrompido FUT8, que codifica uma fucosil transfera- se, de modo que proteínas enxertadas com anticorpo-citocina expres- sas em tal linhagem celular exibem hipofucosilação. A publicação PCT no WO 03/035835 de Presta descreve uma linhagem celular de CHO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida para atacar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), resultando também na hipofucosila- ção de proteínas enxertadas com anticorpo-citocina expressas na cé- lula hospedeira (consultar também Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26.733 a 26.740). A publicação PCT no WO 99/54342 de

Umana et al. descreve linhagens celulares geneticamente modificadas para expressar glicosil transferases modificadoras de glicoproteína (por exemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) de modo que as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina expressas nas linhagens celulares geneticamente modificadas exibam aumento de estruturas GlcNac de bissecção, o que resultaria no aumento de atividade de ADCC dos anticorpos (consultar também Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176 a 180).

[00175] Em algumas modalidades, um ou mais domínios, ou regi- ões, de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina são conecta- das por meio de um ligante, por exemplo, um ligante de peptídeo, tal como aqueles que são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:6.444 a 6.448; Poljak, RJ., et al. (1994) Structure 2:1121 a 1123). Um ligante de peptídeo pode variar no comprimento, por exemplo, um ligante po- de ter 1 a 100 aminoácidos de comprimento, tipicamente um ligante tem de cinco a 50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 aminoácidos de comprimento.

[00176] Em algumas modalidades, IL2 é enxertada na sequência da CDR opcionalmente com uma ou mais sequências de ligante de peptí- deo. Em determinadas modalidades, um ou mais ligantes de peptídeo são independentemente selecionados a partir de uma sequência de (Glyn-Ser)m (SEQ ID NO: 115), uma sequência de (Glyn-Ala)m (SEQ ID NO: 116) ou qualquer combinação de uma sequência de (Glyn- Ser)m/(Glyn-Ala)m (SEQ ID NOS 115 e 116, respectivamente), em que cada n é, independentemente, um número inteiro de 1 a 5, e cada m é, independentemente, um número inteiro de 0 a 10. Os exemplos de li- gantes incluem, porém sem limitação, ligantes à base de glicina ou li-

gantes de gly/ser G/S, tais como (GmS)n, em que n é um número intei- ro positivo igual a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, e m é um número intei- ro igual a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 (SEQ ID NO: 117). Em deter- minadas modalidades, um ou mais ligantes incluem repetições de G4S (SEQ ID NO: 118), por exemplo, o ligante de Gly-Ser (G4S)n em que n é um número inteiro positivo maior ou igual a 1 (SEQ ID NO: 118). Por exemplo, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 e n=6, n=7, n=8, n=9 e n=10. Em algumas modalidades, Ser pode ser substituído por Ala, por exemplo, ligantes G/A, tais como (GmA)n em que n é um número inteiro positivo igual a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, e m é um número inteiro igual a 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 (SEQ ID NO: 119). Em determinadas mo- dalidades, um ou mais ligantes incluem repetições de G 4A (SEQ ID NO: 120), (G4A)n em que n é um número inteiro positivo maior ou igual a 1 (SEQ ID NO: 120). Por exemplo, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 e n=6, n=7, n=8, n=9 e n=10. Em algumas modalidades, o ligante inclui múlti- plas repetições de ligantes. Em outras modalidades, um ligante inclui combinações e múltiplos de G4S (SEQ ID NO: 118) e G4A (SEQ ID NO: 120).

[00177] Outros exemplos de ligantes incluem aqueles baseados em sequências de ligante flexível que ocorrem naturalmente em anticor- pos para minimizar a imunogenicidade surgindo de ligantes e junções. Por exemplo, há uma ligação flexível natural entre o domínio variável e um domínio constante CH1 na estrutura molecular de anticorpo. Essa ligação natural compreende aproximadamente 10 a 12 resíduos de aminoácidos, contribuídos por 4 a 6 resíduos da extremidade C do domínio V e 4 a 6 resíduos da extremidade N do domínio CH1. As pro- teínas enxertadas com anticorpo-citocina podem, por exemplo, empre- gar ligantes que incorporam 5 a 6 resíduos de aminoácido terminais ou 11 a 12 resíduos de aminoácido de CH1 como um ligante. Os resíduos N-terminais do domínio CH1, particularmente os primeiros 5 a 6 resí-

duos de aminoácido, adotam uma conformação de laço sem estrutura secundária forte e portanto podem atuar como um ligante flexível. Os resíduos N-terminais do domínio CH1 são uma extensão natural dos domínios variáveis, na medida em que os mesmos são parte das se- quências de Ig e portanto minimizam a uma grande extensão qualquer imunogenicidade surgindo dos ligantes e junções. Em algumas moda- lidades, uma sequência de ligante inclui uma sequência de peptídeos modificada com base em uma sequência de dobradiça.

[00178] Além disso, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina podem ser fundidas a sequências marcadoras, tais como um peptídeo, para facilitar a purificação de proteínas enxertadas com anticorpo- citocina. Em modalidades preferenciais, uma sequência de aminoáci- dos marcadores é um peptídeo de hexa-histidina (SEQ ID NO: 121), tal como a etiqueta fornecida em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., Chat- sworth, CA), dentre outros, sendo que muitos dos quais estão comer- cialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:821 a 824, por exemplo, a hexa-histidina (SEQ ID NO: 121) fornece a purificação conveniente da proteína en- xertada. Outras etiquetas úteis para purificação incluem, porém sem limitação, a etiqueta hemaglutinina ("HA"), que corresponde a um epí- topo derivado da proteína hamaglutinina da gripe (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), e a etiqueta “flag”.

[00179] Anticorpos também podem ser fixados a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antígeno-alvo. Tais suportes sólidos incluem, porém sem limitação, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno. Ensaios para atividade de proteína enxertada com anticorpo- citocina

[00180] Os ensaios para identificar proteínas enxertadas com anti-

corpo-citocina são conhecidos na técnica e descritos no presente do- cumento. As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina agonistas se ligam ao receptor de alta afinidade de IL2 e promovem, induzem, esti- mulam a sinalização intracelular resultando em efeitos de Treg assim como efeitos imunoestimuladores.

[00181] A ligação das proteínas enxertadas com anticorpo-citocina ao receptor de alta afinidade de IL2 pode ser determinada com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a ligação ao receptor de alta afinidade de IL2 pode ser determinada com o uso de técnicas conhecidas, incluindo, sem limitação, ELISA, Western blots, ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, BIAcore) e cito- metria de fluxo.

[00182] A sinalização intracelular através do receptor de alta afini- dade de IL2 pode ser medida com o uso de qualquer método conheci- do na técnica. Por exemplo, a ativação através IL2 promove a ativação e sinalização de STAT5. Os métodos para medir a ativação de STAT5 são padrão na técnica (por exemplo, situação da fosforilação da prote- ína STAT5, ensaios de gene-repórter, ensaios de sinalização a jusante etc.). A ativação através do receptor de alta afinidade de IL2 tem efei- tos de Treg aumentados. Adicionalmente, a ligação reduzida do recep- tor de baixa afinidade de IL2 reduz a proliferação de células extermi- nadoras naturais (NK) e células efetoras T CD 8. Os métodos para medir a proliferação de células são padrão na técnica (por exemplo, ensaios de incorporação de 3H-timidina, identificação de CFSE). Os métodos para medir a produção de citocina são bem conhecidos na técnica (por exemplo, ensaios ELISA, ensaios ELISpot). Na realização de ensaios in vitro, as células de teste ou sobrenadante de cultura das células de teste que entraram em contato com uma proteína enxertada com anticorpo-citocina agonista podem ser comparadas a células de controle ou sobrenadantes de cultura de células de controle que não entraram em contato com uma proteína enxertada com anticorpo- citocina agonista e/ou aqueles que entraram em contato com IL2 hu- mana recombinante (por exemplo Proleukin®).

[00183] A atividade das proteínas enxertadas com anticorpo- citocina pode também ser medida ex vivo e/ou in vivo. Em alguns as- pectos, métodos para medir a ativação de STAT5 através de vários tipos de célula ex vivo de animais tratados com proteínas enxertadas com anticorpo-citocina em comparação a animais de controle não tra- tados e/ou animais similarmente tratados com Proleukin® podem ser usados para mostrar a atividade diferencial das proteínas enxertadas com anticorpo agonistas através dos tipos de célula. As proteínas en- xertadas com anticorpo-citocina agonistas preferenciais têm a capaci- dade de ativar e expandir células Treg. Por exemplo, a ativação e ex- pansão in vivo de células Treg podem ser medidas com o uso de qual- quer método conhecido na técnica, por exemplo, por citometria de flu- xo. As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina agonistas prefe- renciais podem ser terapeuticamente úteis na prevenção, redução, ini- bição ou eliminação de distúrbios relacionados à imunidade, por exemplo: diabetes Tipo 1, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Vitiligo, doen- ça de enxerto-contra-hospedeiro crônica (cGvHD), doença de enxerto- contra-hospedeiro aguda profilática (pGvHD), vasculite induzida por HIV, Alopecia areata, Morfeia de esclerose múltipla e síndrome antifos- folípide primária. A eficácia das proteínas enxertadas com anticorpo- citocina agonista em diabetes Tipo 1 e SLE pode ser determinada ad- ministrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína enxertada com anticorpo-citocina a um sujeito e comparando o sujeito antes e após a administração da proteína enxertada com anticorpo- citocina. A eficácia das proteínas enxertadas com anticorpo-citocina agonistas na terapia para diabetes Tipo 1 e SLE também pode ser de- terminada administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina a um sujeito de tes- te e comparando o sujeito de teste a um sujeito de controle que não recebeu o anticorpo e/ou comparação a um sujeito similarmente trata- do com Proleukin®. Polinucleotídeos que Codificam Proteínas Enxertadas com Anti- corpo-Citocina

[00184] Em outro aspecto, ácidos nucleicos isolados que codificam proteínas de cadeia pesada e leve das proteínas enxertadas com anti- corpo-citocina são fornecidos. As proteínas enxertadas com anticorpo- citocina podem ser produzidas por quaisquer meios conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, expressão recombinante, sín- tese química e digestão enzimática de tetrâmeros de anticorpo. A ex- pressão recombinante pode ser de quaisquer células hospedeiras co- nhecidas na técnica, por exemplo, células hospedeiras de mamífero, células hospedeiras de bactérias, células hospedeiras de leveduras, células hospedeiras de insetos etc.

[00185] São fornecidos no presente documento polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis exemplificadas em qualquer um dentre SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:99, e SEQ ID NO:112.

[00186] A revelação fornece, assim, polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de cadeia leve e/ou pesada das proteínas enxertadas com anticorpo-citocina descritos no presente documento, por exemplo, polinucleotídeos que codificam regiões variáveis de cadeia leve ou pe- sada ou segmentos que compreendem as regiões determinantes da complementaridade conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica as regiões variá- veis de cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo me- nos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:99. Em al- gumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica as regiões variá- veis de cadeia leve compreende uma sequência que tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com um po- linucleotídeo selecionado dentre o grupo que consiste na SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO:86 e SEQ ID NO: 112.

[00187] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequên- cia de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia leve tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nu- cleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 36.

[00188] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequên- cia de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 49. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia leve tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nu- cleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 62.

[00189] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequên- cia de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia leve tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,

97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nu- cleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 88.

[00190] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequên- cia de ácidos nucleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 101. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica a cadeia leve tem pelo menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de ácidos nu- cleicos com um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 114.

[00191] Os polinucleotídeos podem codificar apenas a sequência de região variável de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina. Os mesmos podem também codificar tanto uma região variável quanto uma região constante da proteína enxertada com anticorpo-citocina. Algumas das sequências de polinucleotídeos codificam um polipeptí- deo que compreende regiões variáveis tanto da cadeia pesada quanto da cadeia leve de uma das proteínas enxertadas com anticorpo- citocina. Alguns outros polinucleotídeos codificam dois segmentos de polipeptídeos que, respectivamente, são substancialmente idênticos às regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de uma das pro- teínas enxertadas com anticorpo.

[00192] Em determinadas modalidades, os polinucleotídeos ou áci- dos nucleicos compreendem DNA. Em outras modalidades, os polinu- cleotídeos ou ácidos nucleicos compreendem RNA, que pode ser de fita simples ou fita dupla.

[00193] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombi- nante que compreende os ácidos nucleicos que codificam uma ou mais cadeias de proteína de imunoglobulina de uma proteína enxerta- da com anticorpo-citocina, e opcionalmente sinais de secreção são fornecidos. Em determinadas modalidades, uma célula hospedeira re-

combinante compreende um vetor que codifica uma cadeia de proteína de imunoglobulina e sinais de secreção. Em outras certas modalida- des, uma célula hospedeira recombinante compreende um ou mais vetores que codificam duas cadeias de proteína de imunoglobulina da proteína enxertada com anticorpo-citocina e sinais de secreção. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombinante compre- ende um único vetor que codifica duas cadeias de proteína de imuno- globulina da proteína enxertada com anticorpo-citocina e sinais de se- creção. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombinan- te compreende dois vetores, um codificando uma cadeia de proteína de imunoglobulina de cadeia pesada e outro codificando uma cadeia de proteína de imunoglobulina de cadeia leve da proteína enxertada com anticorpo-citocina, com cada um incluindo sinais de secreção. Uma célula hospedeira recombinante pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma linhagem celular eucariótica. Em algumas modalidades, a célula hos- pedeira é uma linhagem celular de mamífero. Em algumas modalida- des, a célula hospedeira é uma célula CHO. Em algumas modalida- des, a linhagem celular hospedeira é uma linhagem celular de CHO para produção de anticorpos.

[00194] São adicionalmente fornecidos métodos para produzir as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina. Em algumas modalida- des, o método compreende as etapas de (i) cultivar uma célula hospe- deira que compreende um ou mais vetores que codificam as cadeias de proteína de imunoglobulina de uma proteína enxertada com anti- corpo-citocina sob condições adequadas para expressão, formação e secreção da proteína enxertada com anticorpo-citocina e (ii) recuperar a proteína enxertada com anticorpo-citocina.

[00195] As sequências de polinucleotídeo podem ser produzidas pela síntese de DNA de fase sólida de novo ou por mutagênese de

PCR de uma sequência existente (por exemplo, sequências conforme descrito no presente documento) que codifica uma cadeia de polipep- tídeo de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina. A síntese química direta de ácidos nucleicos pode ser realizada pelos métodos conhecidos na técnica, tais como o método de fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979; o método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; o método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; e o método de suporte sólido da Patente no U.S. 4.458.066. A introdução de mutações em uma sequência de polinucleotídeos por PCR pode ser realizada con- forme descrito em, por exemplo, PCR Technology: Principles and Ap- plications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nu- cleic Acids Res. 19:967, 1991; e Eckert et al., PCR Methods and Appli- cations 1:17, 1991.

[00196] São também fornecidos vetores de expressão e células hospedeiras para produzir as proteínas enxertadas com anticorpo- citocina descritas acima. Vários vetores de expressão podem ser em- pregados para expressar polinucleotídeos que codificam as cadeias de polipeptídeo de imunoglobulina, ou fragmentos, das proteínas enxerta- das com anticorpo-citocina. Vetores de expressão não virais ou com base viral podem ser usados para produzir as proteínas de imunoglo- bulina em uma célula hospedeira de mamífero. Os sistemas e vetores não virais incluem plasmídeos, vetores epissômicos, tipicamente com um cassete de expressão para expressar uma proteína ou RNA e cromossomos artificiais humanos (consultar, por exemplo, Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para expressão dos polinucleotídeos e polipeptídeos de proteína en- xertada com anticorpo-citocina em células de mamíferos (por exemplo,

seres humanos) incluem pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), vetores MPSV e inúmeros outros vetores conhecidos na técnica para expressar outras proteínas. Os vetores virais úteis incluem vetores com base em retrovírus, adenoví- rus, vírus adenoassociados, herpes vírus, vetores com base em SV40, papilomavírus, vírus Epstein Barr HBP, vetores de vírus da vaccínia e vírus Semliki (SFV). Consultar Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; e Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.

[00197] A escolha do vetor de expressão depende das células hos- pedeiras nas quais se pretende que o vetor seja expresso. Tipicamen- te, os vetores de expressão contêm um promotor e outras sequências reguladoras (por exemplo, intensificadores) que são ligadas de manei- ra funcional aos polinucleotídeos que codificam uma proteína de imu- noglobulina da proteína enxertada com anticorpo-citocina. Em algumas modalidades, um promotor induzível é empregue para impedir a ex- pressão de sequências inseridas, exceto sob condições de indução. Promotores induzíveis incluem, por exemplo, arabinose, lacZ, promo- tor de metalotioneína ou um promotor de choque térmico. As culturas de organismos transformados podem ser expandidas sob condições não indutoras sem enviesar a população a codificar as sequências cu- jos produtos de expressão são mais bem tolerados pelas células hos- pedeiras. Adicionalmente a promotores, outros elementos reguladores podem também ser exigidos ou desejados para expressão eficiente de uma cadeia de imunoglobulina ou fragmento das proteínas enxertadas com anticorpo-citocina. Esses elementos incluem tipicamente um có- don de iniciação de ATG e sítio de ligação a ribossoma adjacente ou outras sequências. Adicionalmente, a eficiência da expressão pode ser intensificada pela inclusão de intensificadores apropriados para o sis- tema de célula em uso (consultar, por exemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; e Bittner et al., Meth. Enzymol.,

153:516, 1987). Por exemplo, o intensificador de SV40 ou intensifica- dor de CMV pode ser usado para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamíferos.

[00198] Os vetores de expressão podem também fornecer uma po- sição de sequência de sinal de secreção para formar uma proteína en- xertada com anticorpo-citocina que foi exportada para fora da célula e para dentro do meio de cultura. Em determinados aspectos, as se- quências de imunoglobulinas inseridas das proteínas enxertadas com anticorpo-citocina são ligadas a uma sequência de sinal antes da in- clusão no vetor. Os vetores a serem usados para receber sequências que codificam domínios variáveis de cadeia leve e pesada de imuno- globulina também codificam, por vezes, regiões constantes ou partes das mesmas. Tais vetores permitem a expressão das regiões variáveis como proteínas enxertadas com as regiões constantes levando, assim, à produção de proteínas enxertadas com anticorpo-citocina intactas ou fragmentos das mesmas. Tipicamente, tais regiões constantes são humanas.

[00199] As células hospedeiras para abrigar e expressar as cadeias de proteína enxertada com anticorpo-citocina podem ser ou procarióti- cas ou eucarióticas. E. coli é um hospedeiro procariótico útil para clo- nar e expressar os polinucleotídeos da presente revelação. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, tais como Bacillus subtilis, e outras enterobactérias, tais como Salmonella, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Nesses hospedeiros pro- carióticos, pode-se também produzir vetores de expressão, que tipi- camente contêm sequências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Além disso, qualquer número de uma variedade de promotores bem conhecidos estará presente, tal como o sistema produtor de lactose, um sistema promotor de triptofano (trp), um sistema promotor de beta-

lactamase ou um sistema promotor de fago lambda. Os promotores tipicamente controlam a expressão, opcionalmente com uma sequên- cia operadora, e têm sequências de sítio de ligação ao ribossoma e semelhantes, para iniciar e concluir a transcrição e tradução. Outros micróbios, tais como levedura, podem também ser empregados para expressar polipeptídeos de proteína enxertada com anticorpo-citocina. Células de inseto em combinação com vetores de baculovírus podem também ser usadas.

[00200] Em algumas modalidades preferenciais, células hospedei- ras de mamífero são usadas para expressar e produzir os polipeptí- deos de proteína enxertada com anticorpo-citocina. Por exemplo, as mesmas podem ser uma linhagem celular de mamífero que abriga um vetor de expressão exógeno. As mesmas incluem qualquer célula hu- mana ou animal mortal normal ou normal ou imortal anormal. Por exemplo, várias linhagens de célula hospedeira adequadas com capa- cidade para secretar imunoglobulinas intactas foram desenvolvidas, incluindo as linhagens celulares CHO, várias linhagens celulares Cos, células HeLa, linhagens celulares de mieloma, células B transforma- das e hibridomas. O uso de cultura celular de tecido de mamífero para expressar polipeptídeos é discutido geralmente em, por exemplo, Win- nacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Os vetores de expressão para células hospedeiras de mamífero podem incluir sequências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor e um intensificador (consultar, por exemplo, Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 a 68, 1986) e sítios de informações de processamento necessários, tais como sítios de ligação a ribosso- ma, sítios de splicing de RNA, sítios de poliadenilação e sequências terminadoras transcricionais. Esses vetores de expressão usualmente contêm promotores derivados de genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos. Promotores adequados podem ser constitutivos, específi-

cos para o tipo celular, específicos para estágio e/ou moduláveis ou reguláveis. Promotores úteis incluem, porém sem limitação, o promotor de metalotioneína, o principal promotor recente de adenovírus consti- tutivo, o promotor de MMTV induzível por dexametasona, o promotor SV40, o promotor MRP polIII, o promotor de MPSV constitutivo, o promotor de CMV induzível por tetraciclina (tal como o promotor ime- diato de CMV precoce humano), o promotor de CMV constitutivo e combinações de promotores intensificadores conhecidos na técnica.

[00201] Métodos para introduzir vetores de expressão que conte- nham as sequências de polinucleotídeos de interesse variam depen- dendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, en- quanto o tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usada para outros hospedeiros celulares (consultar, de modo geral, Sambrook et al., supra). Outros métodos incluem, por exemplo, eletro- poração, tratamento com fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossoma, injeção e microinjeção, métodos balísticos, virossomas, imunolipossomas, conjugados de policátion:ácido nucleico, DNA nu, vírions artificiais, enxerto à proteína estrutural do herpes vírus VP22 (Elliot e O'Hare, Cell 88:223, 1997), absorção de DNA intensificada por agente e transdução ex vivo. Para produção de alto rendimento a lon- go prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável será fre- quentemente desejada. Por exemplo, as linhagens celulares que ex- pressam estavelmente cadeias de proteína enxertada com anticorpo- citocina imunoglobulina podem ser preparadas com o uso de vetores de expressão que contêm origens virais de replicação ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Após a intro- dução do vetor, as células podem ser deixadas proliferar por 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para meios seleti- vos. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à se-

leção e sua presença permite a proliferação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas em meios seletivos. Células resistentes estavelmente transfectadas podem ser proliferadas com o uso de técnicas de cultura de tecidos adequados para o tipo de célula. Composições que Compreendem Proteínas Enxertadas com Anti- corpo e Citocina

[00202] São fornecidas composições farmacêuticas que compreen- dem uma proteína enxertada com anticorpo e citocina formulada junto de um carreador farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, as composições farmacêuticas contêm adicionalmente agentes que são adequados para tratar ou prevenir um determinado distúrbio. Transpor- tadores farmaceuticamente aceitáveis intensificam ou estabilizam a composição ou facilitam a preparação da composição. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotô- nicos e de retardamento de absorção e semelhantes que são fisiologi- camente compatíveis.

[00203] Uma composição farmacêutica pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Rota e/ou modo de administração variam dependendo dos resultados desejados. É prefe- rencial que a administração seja por administração parenteral (por exemplo, selecionada a partir de qualquer via dentre intravenosa, in- tramuscular, intraperitoneal, intratecal, intra-arterial ou subcutânea) ou administrada proximal ao sítio do alvo. Um carreador farmaceutica- mente aceitável é adequado para administração por qualquer uma ou mais dentre administração intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intra-arterial, subcutânea, intranasal, por inalação, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou enxerto). Dependendo da via de administração, o composto ativo, por exemplo, proteína enxer- tada com anticorpo-citocina, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto. Em algumas modalidades, a compo- sição farmacêutica é formulada para administração intravenosa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para administração subcutânea.

[00204] Uma proteína enxertada com anticorpo-citocina, sozinha ou em combinação com outros componentes adequados, pode ser feita em formulações aerossóis (isto é, as mesmas podem ser "nebuliza- das") para serem administradas por meio da inalação. As formulações aerossóis podem ser colocadas em propelentes aceitáveis pressuriza- dos, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e similares.

[00205] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é estéril e fluida. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, por meio do uso de revestimento, tal como lecitina, da manutenção do ta- manho de partícula necessário no caso de dispersão e do uso de ten- soativos. Em muitos casos, é preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol ou sorbitol, e clo- reto de sódio na composição. A absorção a longo prazo das composi- ções injetáveis pode ser provocada incluindo-se na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, monoestearato de alumí- nio ou gelatina. Em determinadas modalidades, as composições po- dem ser preparadas para armazenamento em uma forma liofilizada com o uso de excipientes apropriado (por exemplo, sacarose).

[00206] As composições farmacêuticas podem ser preparadas em conformidade com os métodos bem conhecidos e normalmente prati- cados na técnica. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular que é administrada, assim como pelo método particular usado para administrar a composi- ção. Consequentemente, há uma ampla variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas. Os métodos aplicáveis pa-

ra formular uma proteína enxertada com anticorpo-citocina e determi- nar a dosagem e cronograma apropriados podem ser encontrados, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Edição, University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippincott Wil- liams & Wilkins (2005); e em Martindale: The Complete Drug Referen- ce, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press., e em Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31ª Edição, 1996, Amer Phar- maceutical Assn, and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.

Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1978, sendo que cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de referência.

As composições farmacêuticas são, de preferên- cia, fabricadas sob condições GMP.

Tipicamente, uma dose terapeuti- camente eficaz ou dose eficaz de uma proteína enxertada com anti- corpo-citocina é empregada nas composições farmacêuticas.

Uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é formulada em forma de dosagem farmaceuticamente aceitável por métodos convencionais co- nhecidos por aqueles versados na técnica.

Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Na determinação de uma dose terapêutica ou profilaticamente eficaz, uma dose baixa pode ser administrada e então incrementalmente aumentada até uma resposta desejada ser alcança- da com pouco ou nenhum efeito colateral indesejado.

Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcio- nalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica.

É especialmente vantajoso formular composi- ções parentéricas na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem.

Forma unitária de dosa- gem, conforme usado no presente documento, se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os su-

jeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade prede- terminada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêu- tico desejado em associação com o carreador farmaceuticamente ne- cessária.

[00207] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente divulgação podem ser varia- dos de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja efi- caz para se alcançar a resposta terapêutica desejada para um pacien- te em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxica ao paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma varie- dade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composi- ções particulares empregadas, ou seu éster, sal ou amida, a via de administração, o momento de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, ou- tros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, afec- ção, saúde geral e histórico médico prévio do paciente sendo tratado e fatores similares. Coformulação com Segundo Agente

[00208] Em algumas modalidades, as composições farmacológicas compreendem uma mistura de uma proteína enxertada com anticorpo- citocina e um ou mais agentes farmacológicos adicionais. Os segun- dos agentes exemplificativos para inclusão em misturas com a presen- te proteína enxertada com anticorpo-citocina incluem, sem limitação, agentes anti-inflamatórios, agentes imunomoduladores, aminossalicila- tos e antibióticos. A seleção apropriada pode depender de formulação preferencial, dosagem e/ou método de entrega.

[00209] Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é coformulada (isto é, fornecida como uma mistura ou preparada em uma mistura) com um agente anti-inflamatório. Em modalidades particulares, os agentes anti-inflamatórios corticosteroi- des podem ser usados em combinação com a proteína enxertada com anticorpo-citocina. Os corticosteroides para uso podem ser seleciona- dos a partir de qualquer metilprednisolona, hidrocortisona, prednisona, budenisonida, mesalamina e dexametasona. A seleção apropriada de- penderá da formulação e das preferências de entrega.

[00210] Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é coformulada com um agente imunomodulador. Em modalidades particulares, o imunomodulador selecionado a partir de qualquer um dentre 6-mercaptopurina, azatioprina, ciclosporina A, ta- crolimus e metotrexato. Em modalidades particulares, um imunomodu- lador é selecionado a partir de um agente anti-TNF (por exemplo, infli- ximabe, adalimumabe, certolizumabe, golimumabe), natalizumabe e vedolizumabe.

[00211] Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é coformulada com um agente de aminossalicilato. Em modalidades particulares, um aminossalicilato é selecionado a par- tir de sulfasalazina, mesalamina, balsalazida, olsalazina ou outros de- rivados de ácido 5-aminosalicílico.

[00212] Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é coformulada com um agente antibacteriano. Os agentes antibacterianos incluem, sem limitação sulfonamidas (por exemplo, sulfanilamide, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfisoxazol, sul- facetamida), trimetoprim, quinolonas (por exemplo, ácido nalidíxico, cinoxacina, norfloxacina, ciprofloxacina, ofloxacina, sparfloxacina, fle- roxacina, perloxacina, levofloxacina, garenoxacin e gemifloxacin), me- tenamina, nitrofurantoina, penicilinas (por exemplo, penicilina G, peni- cilina V, meticilina oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, ampici- lina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina e piperacilina), cefalosporinas (por exemplo, cefazolina, cefalexina, cefadroxila, cefoxi-

tina, cefaclor, cefprozila, cefuroxima, cefuroxim acetila, loracarbef, ce- fotetan, ceforanida, cefotaxima, cefpodoxima proxetila, cefibuten, cefdinir, cefditoren pivorxila, ceftizoxima, ceftriaxona, cefoperazona, ceftazidima e cefepina), carbapenems (por exemplo, imipenem, aztre- onam) e aminoglicosídeos (por exemplo, neomicina, canamicina, es- treptomicina, gentamicina, toramicina, netilmicina e amicacina). Artigos de Fabricação/Kits

[00213] Em alguns aspectos, uma proteína enxertada com anticor- po-citocina é fornecida em um artigo de fabricação (isto é, um kit). Uma proteína enxertada com anticorpo-citocina fornecida está geral- mente em um frasco ou um recipiente. Assim, um artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou bula no ou associada ao re- cipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, uma garra- fa, frasco, seringa, bolsa de solução etc. Conforme apropriado, a pro- teína enxertada com anticorpo-citocina pode estar em forma líquida ou seca (por exemplo, liofilizada). O recipiente retém uma composição que, por si só ou combinada com outra composição, é eficaz para pre- parar uma composição para tratar, prevenir e/ou melhorar um distúrbio relacionado à imunidade. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para tratar, prevenir e/ou melhorar um distúrbio relacionado à imunidade. Os artigos de fabricação (kits) que compreendem uma pro- teína enxertada com anticorpo-citocina, conforme descrito no presente documento, contêm opcionalmente um ou mais agentes adicionais. Em algumas modalidades, um artigo de fabricação (kit) contém proteí- na enxertada com anticorpo-citocina e um diluente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com an- ticorpo-citocina é fornecida em um artigo de fabricação (kit) com um ou mais agentes ativos adicionais na mesma formulação (por exemplo, como misturas). Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é fornecida em um artigo de fabricação (kit)

com um segundo ou terceiro agente em formulações separadas (por exemplo, em recipientes separados). Em determinadas modalidades, um artigo de fabricação (kit) contém alíquotas da proteína enxertada com anticorpo-citocina em que a alíquota fornece uma ou mais doses. Em algumas modalidades, alíquotas para múltiplas administrações são fornecidas, em que as doses são uniformes ou variadas. Em modali- dades particulares, os regimes de dosagem variados são crescentes ou decrescentes, conforme apropriado. Em algumas modalidades, as dosagens de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina e um se- gundo agente são independentemente uniformes ou independente- mente variadas. Em determinadas modalidades, um artigo de fabrica- ção (kit) compreende um agente adicional selecionado a partir de qualquer um dentre um agente anti-inflamatório, agente imunomodula- dor, aminossalicilato e antibiótico. A seleção de um ou mais agentes adicionais dependerá da dosagem, entrega e condição da doença a ser tratada. Métodos de Tratamento e Uso das Composições para Tratamento de Distúrbios Relacionados à Imunidade Afecções Submetidas ao Tratamento ou Prevenção

[00214] As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina encontram uso no tratamento, melhora ou profilaxia de distúrbios relacionados à imunidade. Em um aspecto, a revelação fornece métodos para de tra- tamento de distúrbios relacionados à imunidade em um indivíduo com necessidade do mesmo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina, conforme descrito no presente documento. A reve- lação também fornece, em um aspecto, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina para uso como um agente terapêutico. Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é forne- cida para uso como um agente terapêutico no tratamento ou profilaxia de um distúrbio relacionado à imunidade em um indivíduo. Em algu- mas modalidades, o uso de uma proteína enxertada com anticorpo- citocina é fornecido para fabricação de um medicamento para o trata- mento de um distúrbio relacionado à imunidade em um indivíduo com necessidade do mesmo. Em um aspecto adicional, a revelação forne- ce uma composição que compreende tal proteína enxertada com anti- corpo-citocina para uso no tratamento ou melhora do distúrbio relacio- nado à imunidade em um indivíduo com necessidade do mesmo.

[00215] As afecções submetidas ao tratamento incluem distúrbios relacionados à imunidade. Para propósitos terapêuticos, um indivíduo pode ter um distúrbio relacionado à imunidade. Para propósitos pre- ventivos ou profiláticos, um indivíduo pode estar em remissão de um estado ativo do distúrbio relacionado à imunidade ou pode antecipar um início futuro. Em algumas modalidades, o paciente tem um distúr- bio relacionado à imunidade, é suspeito de ter um distúrbio relaciona- do à imunidade ou está em remissão de um distúrbio relacionado à imunidade. Os distúrbios relacionados à imunidade submetidos ao tra- tamento com uma proteína enxertada com anticorpo-citocina obtêm benefício da ativação da sinalização de receptor de IL2 em células Treg. Os distúrbios relacionados à imunidade submetidos a tratamento incluem, sem limitação: diabetes Tipo 1, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Vitiligo, doença de enxerto-contra-hospedeiro crônica (cGvHD), doen- ça de enxerto-contra-hospedeiro aguda profilática (pGvHD), vasculite induzida por HIV, Alopecia areata, Morfeia de esclerose múltipla e sín- drome antifosfolípide primária. Administração de Proteínas Enxertadas com Anticorpo-Citocina

[00216] Um médico ou veterinário pode começar com doses de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina empregada na compo- sição farmacêutica a níveis menores do que este exigido para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até o efeito desejado ser alcançado. Em geral, as doses eficazes das composições variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluin- do a doença ou afecção específica a ser tratada, meios de administra- ção, sítio-alvo, estado fisiológico do paciente, se um paciente é huma- no ou um animal, outras medicações administradas e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento exigem tipica- mente titulação para otimizar a segurança e a eficácia. Para a adminis- tração com uma proteína enxertada com anticorpo-citocina, a dosa- gem está na faixa de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e mais usualmente 0,01 a 5 mg/kg do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as do- sagens podem ser 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg. A dosagem pode ser diá- ria, semanal, quinzenal, mensal ou mais ou menos frequentemente, conforme necessário ou desejado. Um regime de tratamento exempli- ficativo implica a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses.

[00217] A proteína enxertada com anticorpo-citocina pode ser ad- ministrada em doses únicas ou divididas. Uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é usualmente administrada em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre as dosagens únicas podem ser semanais, quinze- nais, mensais ou anuais, conforme necessário ou desejado. Os inter- valos podem também ser irregulares conforme indicado medindo-se os níveis sanguíneos de proteína enxertada com anticorpo-citocina no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de proteína enxertada com anticorpo-citocina plas- mática de 1 a 1.000 µg/ml e em alguns métodos 25 a 300 µg/ml. Alter- nativamente, a proteína enxertada com anticorpo-citocina pode ser administrada como uma formulação com liberação sustentada, em tal caso, uma administração menos frequente é exigida. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia-vida da proteína enxertada com anticorpo-citocina no paciente. Em geral, proteínas enxertadas com anticorpo mostram meia-vida mais longa do que esta da IL2 nati- va ou citocinas recombinantes, tais como Proleukin®. A dosagem e a frequência de administração podem variar dependendo de se o trata- mento é profilático ou terapêutico. Em geral, para aplicações profiláti- cas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes por um longo período de tempo. Em geral, para aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em in- tervalos de tempo relativamente curtos é algumas vezes necessária até a progressão da doença ser reduzida ou eliminada e de preferên- cia até o paciente mostrar melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Posteriormente, a um paciente pode ser administrado um regime profilático. Coadministração com um Segundo Agente

[00218] O termo "terapia de combinação" refere-se à administração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar uma afecção ou dis- túrbio terapêutico descrito na presente revelação. Tal administração engloba a coadministração destes agentes terapêuticos de um modo substancialmente simultâneo, tal como em uma cápsula única tendo uma razão fixa de ingredientes ativos. Alternativamente, tal adminis- tração abrange a coadministração em múltiplos recipientes, ou em re- cipientes separados (por exemplo, cápsulas, pós e líquidos) para cada ingrediente ativo. Os pós e/ou líquidos podem ser reconstituídos ou diluídos em uma dose desejada antes da administração. Além disso, tal administração também abrange o uso de cada tipo de agente tera- pêutico de uma maneira sequencial, aproximadamente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes. Em qualquer caso, o regime de tratamento fornecerá efeitos benéficos da combinação de fármacos no tratamento das afecções ou distúrbios descritos no presente documen- to.

[00219] Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é coadministrada com um ou mais agentes farmaco- lógicos adicionais. Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina e um ou mais agentes adicionais são adminis- trados como uma mistura. Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina e um ou mais agentes adicionais são administrados como formulações separadas. Em determinadas moda- lidades em que são utilizadas formulações separadas, a administração é concomitante. Em determinadas modalidades em que são utilizadas formulações separadas, a administração é sequencial. Em determina- das modalidades em que são utilizadas formulações separadas, a ad- ministração é por meio da mesma via. Em determinadas modalidades em que são utilizadas formulações separadas, a administração é por meio de diferentes vias. Agentes adicionais exemplificativos para co- administração com uma proteína enxertada com anticorpo-citocina in- cluem, sem limitação, agentes anti-inflamatórios, agentes imunomodu- ladores, aminossalicilatos e antibióticos. A seleção apropriada pode depender de formulação preferencial, dosagem e/ou método de entre- ga. As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina também são úteis em terapias de combinação com procedimentos estabelecidos adicio- nais para tratar afecções de distúrbio relacionado à imunidade , por exemplo, cirurgia.

[00220] Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é coadministrada com um agente anti-inflamatório. Em modalidades particulares, os agentes anti-inflamatórios corticoste- roides podem ser usados em combinação com a proteína enxertada com anticorpo-citocina. Os corticosteroides para uso podem ser sele- cionados a partir de qualquer metilprednisolona, hidrocortisona, pred- nisona, budenisonida, mesalamina e dexametasona. A seleção apro- priada dependerá da formulação e das preferências de entrega.

[00221] Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é coadministrada com um agente imunomodulador. Em modalidades particulares, o imunomodulador selecionado a partir de qualquer um dentre 6-mercaptopurina, azatioprina, ciclosporina A, tacrolimus e metotrexato. Em outra modalidade, um imunomodulador é selecionado a partir de um agente anti-TNF (por exemplo, infliximabe, adalimumabe, certolizumabe, golimumabe), natalizumabe e vedolizu- mabe.

[00222] Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é coadministrada com um agente de aminossalicila- to. Em modalidades particulares, um aminossalicilato é selecionado a partir de sulfasalazina, mesalamina, balsalazida, olsalazina ou outros derivados de ácido 5-aminossalicílico.

[00223] Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é coadministrada com um agente antibacteriano. Os agentes antibacterianos incluem, sem limitação sulfonamidas (por exemplo, sulfanilamida, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfisoxazol, sul- facetamida), trimetoprim, quinolonas (por exemplo, ácido nalidíxico, cinoxacina, norfloxacina, ciprofloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, fle- roxacina, perloxacina, levofloxacina, garenoxacina e gemifloxacina), metenamina, nitrofurantoína, penicilinas (por exemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina e piperaci- lina), cefalosporinas (por exemplo, cefazolina, cefalexina, cefadroxila, cefoxitina, cefaclor, cefprozila, cefuroxima, cefuroxim acetila, loracar- bef, cefotetano, ceforanida, cefotaxima, cefpodoxima proxetila, cefibu- teno, cefdinir, cefditoren pivorxila, ceftizoxima, ceftriaxona, cefopera- zona, ceftazidima e cefepina), carbapenemos (por exemplo, imipenem, aztreonam) e aminoglicosídeos (por exemplo, neomicina, canamicina, estreptomicina, gentamicina, toramicina, netilmicina e amicacina).

[00224] Em algumas modalidades, uma proteína enxertada com anticorpo-citocina é coadministrada com o padrão de cuidados. Por exemplo, no tratamento de diabetes Tipo 1, o padrão de cuidados é a administração de insulina ou terapia de insulina. As proteínas enxerta- das com anticorpo-citocina, conforme revelado no presente documen- to, ainda funcionaram em promover tolerância imunológica uma vez que a insulina restaura primariamente níveis de açúcar normais.

EXEMPLOS Exemplo 1: Criação de proteínas enxertadas com anticorpo- citocina IL2

[00225] As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina foram ge- radas modificando-se uma sequência de IL2 em regiões CDR de vá- rios arcabouços de imunoglobulina, em seguida, cadeias de imunoglo- bulina tanto leve quanto pesada foram usadas para gerar as proteínas de citocina de anticorpo final. As proteínas enxertadas com anticorpo- citocina conferem as propriedades terapêuticas preferenciais de IL2; no entanto, as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina reduziram efeitos indesejados, tais como atividade de célula NK aumentada, em comparação a rhIL2.

[00226] A fim de criar proteínas enxertadas com anticorpo-citocina, sequências de IL2 que contêm muteínas (SEQ ID NO:4 ou 6) foram inseridas em laços de CDR de um arcabouço de cadeia de imunoglo- bulina. As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina foram prepara- das com o uso de uma variedade de sequências de imunoglobulinas conhecidas que foram utilizadas em ambientes clínicos assim como sequências de anticorpo de linhagem germinativa. As sequências de IL2 em um arcabouço exemplificativo, denominadas GFTX3b, são re- tratadas na TABELA 2. Os pontos de inserção foram selecionados como o ponto intermediário do laço com base nos dados de modelo estruturais ou de homologia. As proteínas enxertadas com anticorpo-

citocina foram produzidas com o uso de metodologia de biologia mole- cular padrão que utiliza DNA recombinante que codifica as sequências relevantes.

[00227] A seleção de qual CDR escolhida para enxerto de citocina se baseia nos parâmetros da biologia exigida nos parâmetros de: a biologia exigida, propriedades biofísicas e um perfil de desenvolvimen- to favorável. O software de modelagem foi útil apenas parcialmente em prever qual CDR e qual localização dentro da CDR fornecerá os parâ- metros desejados, portanto, todos os seis possíveis enxertos de citoci- na são feitos e em seguida avaliados em ensaios biológicos. Caso a atividade biológica exigida seja obtida, então as propriedades biofísi- cas, tais como resolução estrutural quanto a como a molécula enxer- tada com anticorpo-citocina interage com receptor de citocina respecti- va são solucionadas.

[00228] Para as moléculas enxertadas com anticorpo-IL2, a estrutu- ra do candidato anticorpo considerado para enxerto de citocina foi ini- cialmente solucionada. A partir dessa estrutura, verificou-se que o pa- ratopo, a porção do anticorpo que interage com epítopo, estava na ex- tremidade N mais distante do "braço" do anticorpo e que uma citocina enxertada nessa localização apresentaria a citocina a seu respectivo receptor. Devido ao fato de que a tecnologia da tecnologia de enxerto, cada proteína enxertada com anticorpo-IL2 é limitada por um laço de CDR de diferentes comprimentos, sequência e ambientes estruturais. Desse modo, IL2 foi enxertada em todas as seis CDRs, corresponden- tes a LCDR-1, LCDR-2, LCDR-3 e HCDR-1, HCDR-2 e HCDR-3. A Figura 1 mostra as versões exemplificativas diferentes dos enxertos de citocina IL2 no anticorpo que foram produzidos que incluem mutações em vários pontos e comutação do ponto de inserção de IL2 ou para a porção N ou C do laço de CDR (nH1, cH1, nH2, cH2). A partir da Ta- bela na Figura 1, fica evidente que as proteínas enxertadas com anti-

corpo-citocina são todas diferentes em suas atividades, incluindo que essa IL2 enxertada na cadeia leve de CDR2 (IgG.IL2.L2) não expres- sou. Observou-se, também, que os enxertos de citocina IL2 no anti- corpo com função Fc alterada (por exemplo, Fc silencioso) teve um melhor perfil.

[00229] HCDR-1 foi escolhida devido ao fato de que teve a melhor combinação de propriedades (biofísica e biológica) e as mutações de ponto de IL2 que foram incluídas intensificaram as propriedades bioló- gicas desejadas. Para a seleção do ponto de inserção, o centro estru- tural do laço de CDR foi escolhido uma vez que forneceu o maior es- paço em qualquer lado (de tamanho linear 3.8Å x o número de resí- duos) e sem ser ligado por qualquer uma teoria, isso forneceu uma molécula estável permitindo-se a IL2 para enovelar mais prontamente independentemente. Uma vez que a estrutura do arcabouço de enxer- to GFTX3b já é conhecido, o centro estrutural de cada CDR também foi conhecido. Isso coincidiu com o centro da sequência laços de CDR, conforme definido com o uso do formato de numeração Chothia. Con- forme mencionado anteriormente, o ponto de inserção dos enxertos de IL-2 comutou para longe do centro e em direção ou à porção de N ou C terminal do laço de CDR. No entanto, a comutação da IL2 dentro do laço de CDR não fez uma diferença significativa na atividade biológica.

[00230] Em resumo, ponto de inserção em cada CDR foi escolhido em uma base estrutural, com a hipótese de que o enxerto na CDR for- nece algum número de impedimento estérico às subunidades individu- ais do receptor IL2. A seleção final de qualquer CDR foi melhor para uma citocina particular se baseou na biologia desejada e propriedades biofísicas. A natureza do receptor de citocina, as interações citoci- na/receptor e o mecanismo de sinalização também exerceu uma fun- ção e isso foi feito comparando-se cada molécula de anticorpo-citocina individual para suas respectivas propriedades.

TABELA 1 SEQ ID NO:1 DNA de IL2 do tipo AGTTCCCTATCACTCTCTTTAAT- selvagem CACTACTCACAGTAACCTCAAC- TCCTGCCACAATGTACAGGATG- CAACTCCTGTCTTGCATTGCAC- TAAGTCTTGCACTTGTCACAAACA- GTGCACCTACTTCAAGTTCTA- CAAAGAAAACACAGCTACAACTG- GAGCATTTACTGCTGGATTTACA- GATGATTTTGAATGGAATTAATAA- TTACAAGAATCCCAAACTCACCAG- GATGCTCACATTTAAGTTTTACA- TGCCCAAGAAGGCCACAGAAC- TGAAACATCTTCAGTGTC- TAGAAGAAGAACTCAAACCTCTG- GAGGAAGTGCTAAATTTAGCT- CAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGA- CCCAGGGACTTAATCAGCAATAT- CAACGTAATAGTTCTGGAAC- TAAAGGGATCTGAAACAACATT- CATGTGTGAATATGCTGATGAGA- CAGCAACCATTGTAGAATTT- CTGAACAGATGGATTACCTTTTGT- CAAAGCATCATCTCAACACTGAC- TTGATAATTAAGTGCTTCCCACT- TAAAACATATCAGGCCTTCTATT- TATTTAAATATTTAAATTTTATA- TTTATTGTTGAATGTATGGTTTGC- TACCTATTGTAACTATTATTCTTA- ATCTTAAAACTATAAATATGGA-

TCTTTTATGATTCTTTTTGTAAG- CCCTAGGGGCTCTAAAATGGTTT- CACTTATTTATCCCAAAATATTTA- TTATTATGTTGAATGTTAAATATA- GTATCTATGTAGATTGGTTAG- TAAAACTATTTAATAAATTTGA- TAAATA- TAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AA SEQ ID NO:2 Proteína IL2 do tipo MYRMQLLSCIALSLALVTNSAP- selvagem TSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN- GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLN- LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- LKGSETTFMCEYADETATIVEFLN-

RWITFCQSIISTLT SEQ ID NO:3 DNA de muteína de GCCCCTACCTCCTCCAGCAC- IL2 CAAGAAAACCCAGCTGCAG- CTCGAACATCTGCTGCTGGCCCTG- CAGATGATCCTGAACGGCATCAA- CAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTA- CATGCCCAAGAAGGCCACCGAG- CTGAAACATCTGCAGTGCCTGGA- AGAGGAACTGAAGCCCCTGGA- AGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGG- CCTCGGGACCTGATCTCCAACAT- CAACGTGATCGTGCTGGAAC-

TGAAGGGCTCCGAGACAACCTT- CATGTGCGAGTACGCCGACGAGA- CAGCCACCATCGTGGAATTT- CTGAACCGGTGGATCACCTTCTG-

CCAGTCCATCATCTCCACCCTGACC SEQ ID NO:4 Proteína de muteí- APTSSSTKKTQLQLEHLLLALQMI- na de IL2, o amino- LNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPK- ácido de muteína KATELKHLQCLEEELKPLEEVLN- está em negrito e LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- sublinhado LKGSETTFMCEYADETATIVEFLN-

RWITFCQSIISTLT SEQ ID NO:5 DNA de muteína de GCCCCTACCTCCTCCAGCAC- IL2 CAAGAAAACCCAGCTGCAG- CTCGAACATCTGCTGCTGGCCCTG- CAGATGATCCTGAACGGCATCAA- CAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTA- CATGCCCAAGAAGGCCACCGAG- CTGAAACATCTGCAGTGCCTGGA- AGAGGAACTGAAGCCCCTGGA- AGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGG- CCTCGGGACCTGATCTCCAACAT- CAACGTGATCGTGCTGGAAC- TGAAGGGCTCCGAGACAACCTT- CATGTGCGAGTACGCCGACGAGA- CAGCCACCATCGTGGAATTT- CTGAACCGGTGGATCACCTT- CTCCCAGTCCATCATCTCCAC-

CCTGACC

SEQ ID NO:6 Proteína de muteí- APTSSSTKKTQLQLEHLLLALQMI- na de IL2, os ami- LNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPK- noácidos de muteí- KATELKHLQCLEEELKPLEEVLN- na estão em negrito LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- e sublinhados LKGSETTFMCEYADETATIVEFLN-

RWITFSQSIISTLT SEQ ID NO:7 DNA de IL2 sem GCCCCTACCTCCTCCAGCAC- sequência de sinal CAAGAAAACCCAGCTGCAG- CTCGAACATCTGCTGCTGGACCTG- CAGATGATCCTGAACGGCATCAA- CAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTA- CATGCCCAAGAAGGCCACCGAG- CTGAAACATCTGCAGTGCCTGGA- AGAGGAACTGAAGCCCCTGGA- AGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGG- CCTCGGGACCTGATCTCCAACAT- CAACGTGATCGTGCTGGAAC- TGAAGGGCTCCGAGACAACCTT- CATGTGCGAGTACGCCGACGAGA- CAGCCACCATCGTGGAATTT- CTGAACCGGTGGATCACCTTCTG-

CCAGTCCATCATCTCCACCCTGACC SEQ ID NO:8 Proteína IL2 sem APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMI- sequência de sinal LNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPK- KATELKHLQCLEEELKPLEEVLN- LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- LKGSETTFMCEYADETATIVEFLN-

RWITFCQSIISTLT

SEQ ID NO:9 DNA de muteína de GCCCCTACCTCCTCCAGCAC- IL2 CAAGAAAACCCAGCTGCAG- CTCGAACATCTGCTGCTGGACCTG- CAGATGATCCTGAACGGCATCAA- CAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTA- CATGCCCAAGAAGGCCACCGAG- CTGAAACATCTGCAGTGCCTGGA- AGAGGAACTGAAGCCCCTGGA- AGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGG- CCTCGGGACCTGATCTCCAACAT- CAACGTGATCGTGCTGGAAC- TGAAGGGCTCCGAGACAACCTT- CATGTGCGAGTACGCCGACGAGA- CAGCCACCATCGTGGAATTT- CTGAACCGGTGGATCACCTT- CTCCCAGTCCATCATCTCCAC-

CCTGACC SEQ ID NO:10 Proteína de muteí- APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMI- na IL2, o aminoáci- LNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPK- do com mutação KATELKHLQCLEEELKPLEEVLN- está em negrito e LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- sublinhado LKGSETTFMCEYADETATIVEFLN-

RWITFSQSIISTLT TABELA 2 IgG.IL2D49A.H1 SEQ ID NO:11 (com- HCDR1 GFSLAPTSSSTKKTQLQLEHLLLALQMILN- binado) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR-

PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFCQSIISTLTSTSGMSVG SEQ ID NO:12 (com- HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS binado) SEQ ID NO: 13 HCDR3 SMITNWYFDV (combinado) SEQ ID NO:14 (Ka- HCDR1 APTSSSTKKTQLQLEHLLLALQMILN- bat) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR- PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFCQSIISTLTSTSGMSVG SEQ ID NO:15 (Ka- HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS bat) SEQ ID NO:16 (Ka- HCDR3 SMITNWYFDV bat) SEQ ID NO:17 HCDR1 GFSLAPTSSSTKKTQLQLEHLLLALQMILN- (Chothia) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR- PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFCQSIISTLTSTSGM SEQ ID NO:18 HCDR2 WWDDK (Chothia) SEQ ID NO:19 HCDR3 SMITNWYFDV (Chothia) SEQ ID NO:20 VH QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLAP- TSSSTKKTQLQLEHLLLALQMILNGINNYKN- PKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK- PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- LKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT- FCQSIISTLTSTSGMSVGWIR-

QPPGKALEWLADIWWDDKKDYNPSLKSRL- TISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTA-

TYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO:21 VH de CAAGTCACACTGCGTGAAAGCGGCCCTG- DNA CCCTGGTCAAGCCCACCCAGACCCTGAC- CCTGACCTGCACCTTCTCCGGCTTCAG- CCTGGCCCCTACCTCCTCCAGCAC- CAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAACATCTG- CTGCTGGCCCTGCAGATGATCCTGAACGG- CATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTG- CAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTG- GAAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTG- GAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTTCATG- TGCGAGTACGCCGACGAGACAGCCACCATCG- TGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCTG- CCAGTCCATCATCTCCACCCTGACCTCCAC- CTCCGGCATGTCCGTGGGCTGGATCCGGCAG- CCTCCTGGCAAGGCCCTGGAGTGGCTGG- CCGACATTTGGTGGGACGACAAGAAGGACTA- CAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGCTGAC- CATCTCCAAGGACACCTCCAAGAACCAAG- TGGTGCTGAAAGTGACCAACATGGACCCCG- CCGACACCGCCACCTACTACTGCGCCCGG- TCCATGATCACCAACTGGTACTTCGACGTG- TGGGGCGCTGGCACCACCGTGACCGTG-

TCCTCT

SEQ ID NO:22 Cadeia QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLAP- Pesada TSSSTKKTQLQLEHLLLALQMILNGINNYKN- PKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK- PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- LKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT- FCQSIISTLTSTSGMSVGWIR- QPPGKALEWLADIWWDDKKDYNPSLKSRL- TISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTA- TYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSSAST- KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN- VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA- PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN- KALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS- REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS-

RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:23 Cadeia CAAGTCACACTGCGTGAAAGCGGCCCTG- Pesada CCCTGGTCAAGCCCACCCAGACCCTGAC- de DNA CCTGACCTGCACCTTCTCCGGCTTCAG- CCTGGCCCCTACCTCCTCCAGCAC- CAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAACATCTG- CTGCTGGCCCTGCAGATGATCCTGAACGG- CATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTG-

CAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTG- GAAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTG- GAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTTCATG- TGCGAGTACGCCGACGAGACAGCCACCATCG- TGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCTG- CCAGTCCATCATCTCCACCCTGACCTCCAC- CTCCGGCATGTCCGTGGGCTGGATCCGGCAG- CCTCCTGGCAAGGCCCTGGAGTGGCTGG- CCGACATTTGGTGGGACGACAAGAAGGACTA- CAACCCCAGCCTGAAGTCCCGGCTGAC- CATCTCCAAGGACACCTCCAAGAACCAAG- TGGTGCTGAAAGTGACCAACATGGACCCCG- CCGACACCGCCACCTACTACTGCGCCCGG- TCCATGATCACCAACTGGTACTTCGACGTG- TGGGGCGCTGGCACCACCGTGACCGTG- TCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTG- TTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTAC- CTCCGGCGGCACAGCTGCTCTGGGCTG- CCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAGCCTG- TGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGAC- CTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTG- CAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCG- TGGTCACAGTGCCTTCAAGCAGCCTGGGCAC- CCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAG- CCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTG- GAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACCCACAC- CTGTCCTCCCTGCCCTGCTCCTGAACTG- CTGGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTT- CCCTCCAAAGCCCAAGGACAC- CCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGAC- CTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGA- TCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGA- CGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAG- CCTCGGGAGGAACAGTACAACTCCACCTAC- CGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC- CAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAG- TGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGGCCG- CCCCTATCGAAAAGACAATCTCCAAGG- CCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTGTA- CACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAAATGAC- CAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGT- CAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTG- GAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAA- CAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGAC- TCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAAC- TGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGG- CAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATG- CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCA-

GAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCCGGCAAG SEQ ID NO:24 (com- LCDR1 KAQLSVGYMH binado) SEQ ID NO:25 (com- LCDR2 DTSKLAS binado) SEQ ID NO:26 (com- LCDR3 FQGSGYPFT binado) SEQ ID NO:27 (Ka- LCDR1 KAQLSVGYMH bat) SEQ ID NO:28 (Ka- LCDR2 DTSKLAS bat)

SEQ ID NO:29 (Ka- LCDR3 FQGSGYPFT bat) SEQ ID NO:30 LCDR1 QLSVGY (Chothia) SEQ ID NO:31 LCDR2 DTS (Chothia) SEQ ID NO:32 LCDR3 GSGYPF (Chothia) SEQ ID NO:33 VL DIQMTQSPSTLSAS- VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSG- TEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTF-

GGGTKLEIK SEQ ID NO:34 VL de GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAC- DNA CCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGAC- CATCACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGC- TACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGG- CAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGACAC- CTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGA- TTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTT- CACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGA- CGACTTCGCCACCTACTACTGTTTTCAAGG- CTCCGGCTACCCCTTCACCTTCGGCGGAGG-

CACCAAGCTGGAAATCAAG SEQ ID NO:35 Cadeia DIQMTQSPSTLSAS- Leve VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSG- TEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTF- GGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG- TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL-

QSGNSQESVTEQDSKDSTYS- LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT

KSFNRGEC SEQ ID NO:36 Cadeia GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAC- Leve de CCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGAC- DNA CATCACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGC- TACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGG- CAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGACAC- CTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGA- TTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTT- CACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGA- CGACTTCGCCACCTACTACTGTTTTCAAGG- CTCCGGCTACCCCTTCACCTTCGGCGGAGG- CACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGG- CCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAG- CGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAG- CGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTAC- CCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG- GACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAG- GAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGAC- TCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGAC- CCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA- TAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCA- GGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTT-

CAACAGGGGCGAGTGC IgG.IL2D49A- C154S.H1 SEQ ID NO:37 (com- HCDR1 GFSLAPTSSSTKKTQLQLEHLLLALQMILN- binado) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR-

PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFSQSIISTLTSTSGMSVG SEQ ID NO:38 (com- HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS binado) SEQ ID NO:39 (com- HCDR3 SMITNWYFDV binado) SEQ ID NO:40 (Ka- HCDR1 APTSSSTKKTQLQLEHLLLALQMILN- bat) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR- PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFSQSIISTLTSTSGMSVG SEQ ID NO:41 (Ka- HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS bat) SEQ ID NO:42 (Ka- HCDR3 SMITNWYFDV bat) SEQ ID NO:43 HCDR1 GFSLAPTSSSTKKTQLQLEHLLLALQMILN- (Chothia) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR- PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFSQSIISTLTSTSGM SEQ ID NO:44 HCDR2 WWDDK (Chothia) SEQ ID NO:45 HCDR3 SMITNWYFDV (Chothia) SEQ ID NO:46 VH QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLAP- TSSSTKKTQLQLEHLLLALQMILNGINNYKN- PKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK- PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- LKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT- FSQSIISTLTSTSGMSVGWIR-

QPPGKALEWLADIWWDDKKDYNPSLKSRL- TISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTA-

TYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO:47 VH de CAAGTCACACTGCGTGAAAGCGGCCCTG- DNA CCCTGGTCAAGCCCACCCAGACCCTGAC- CCTGACCTGCACCTTCTCCGGCTTCAG- CCTGGCCCCTACCTCCTCCAGCAC- CAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAACATCTG- CTGCTGGCCCTGCAGATGATCCTGAACGG- CATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTG- CAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTG- GAAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTG- GAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTTCATG- TGCGAGTACGCCGACGAGACAGCCACCATCG- TGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTT- CTCCCAGTCCATCATCTCCACCCTGAC- CTCCACCTCCGGCATGTCCGTGGGCTGGA- TCCGGCAGCCTCCTGGCAAGGCCCTGGAG- TGGCTGGCCGACATTTGGTGGGACGA- CAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGAC- CAACATGGACCCCGCCGACACCGCCACCTAC- TACTGCGCCCGGTCCATGATCACCAACTGG- TACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCG-

TGACCGTGTCCTCT

SEQ ID NO:48 Cadeia QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLAP- Pesada TSSSTKKTQLQLEHLLLALQMILNGINNYKN- PKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK- PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- LKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT- FSQSIISTLTSTSGMSVGWIR- QPPGKALEWLADIWWDDKKDYNPSLKSRL- TISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTA- TYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSSAST- KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN- VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA- PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN- KALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS- REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS-

RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:49 Cadeia CAAGTCACACTGCGTGAAAGCGGCCCTG- Pesada CCCTGGTCAAGCCCACCCAGACCCTGAC- de DNA CCTGACCTGCACCTTCTCCGGCTTCAG- CCTGGCCCCTACCTCCTCCAGCAC- CAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAACATCTG- CTGCTGGCCCTGCAGATGATCCTGAACGG- CATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTG-

CAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTG- GAAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTG- GAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTTCATG- TGCGAGTACGCCGACGAGACAGCCACCATCG- TGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTT- CTCCCAGTCCATCATCTCCACCCTGAC- CTCCACCTCCGGCATGTCCGTGGGCTGGA- TCCGGCAGCCTCCTGGCAAGGCCCTGGAG- TGGCTGGCCGACATTTGGTGGGACGA- CAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGAC- CAACATGGACCCCGCCGACACCGCCACCTAC- TACTGCGCCCGGTCCATGATCACCAACTGG- TACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCG- TGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGG- CCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAG- CAAGTCTACCTCCGGCGGCACAGCTG- CTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT- CCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAAC- TCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACAC- CTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG- TACTCCCTGTCCTCCGTGGTCACAGTGCCTT- CAAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATCTG- CAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACAC- CAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAG- TCCTGCGACAAGACCCACACCTG- TCCTCCCTGCCCTGCTCCTGAACTGCTGGG- CGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAG- CCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGAC- CCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTG- TCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAA- TTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA- CAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAG- TACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTG- CTGACCGTGCTGCACCAGGACTGG- CTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAAG- TCTCCAACAAGGCCCTGGCCGCCCCTA- TCGAAAAGACAATCTCCAAGGCCAAGGGCCA- GCCTAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTG- CCACCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAAC- CAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGGG- CTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGG- GAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTA- CAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGA- CGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGAC- CGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGG- CAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATG- CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCA-

GAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCCGGCAAG SEQ ID NO:50 (com- LCDR1 KAQLSVGYMH binado) SEQ ID NO:51 (com- LCDR2 DTSKLAS binado) SEQ ID NO: LCDR3 FQGSGYPFT 52(combinado) SEQ ID NO:53 (Ka- LCDR1 KAQLSVGYMH bat) SEQ ID NO:54 (Ka- LCDR2 DTSKLAS bat) SEQ ID NO:55 (Ka- LCDR3 FQGSGYPFT bat) SEQ ID NO:56 LCDR1 QLSVGY (Chothia) SEQ ID NO:57 LCDR2 DTS (Chothia) SEQ ID NO:58 LCDR3 GSGYPF (Chothia) SEQ ID NO:59 VL DIQMTQSPSTLSAS- VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSG- TEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTF-

GGGTKLEIK SEQ ID NO:60 VL de GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAC- DNA CCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGAC- CATCACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGC- TACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGG- CAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGACAC- CTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGA- TTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTT- CACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGA- CGACTTCGCCACCTACTACTGTTTTCAAGG- CTCCGGCTACCCCTTCACCTTCGGCGGAGG-

CACCAAGCTGGAAATCAAG SEQ ID NO:61 Cadeia DIQMTQSPSTLSAS- Leve VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSG- TEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTF- GGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG-

TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTEQDSKDSTYS- LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT

KSFNRGEC SEQ ID NO:62 Cadeia GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAC- Leve de CCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGAC- DNA CATCACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGC- TACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGG- CAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGACAC- CTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGA- TTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTT- CACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGA- CGACTTCGCCACCTACTACTGTTTTCAAGG- CTCCGGCTACCCCTTCACCTTCGGCGGAGG- CACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGG- CCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAG- CGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAG- CGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTAC- CCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTG- GACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAG- GAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGAC- TCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGAC- CCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCA- TAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCA- GGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTT-

CAACAGGGGCGAGTGC IgG.IL2.L3 SEQ ID NO:63 (com- HCDR1 GFSLSTSGMSVG binado) SEQ ID NO:64 (com- HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS binado) SEQ ID NO:65 (com- HCDR3 SMITNWYFDV binado) SEQ ID NO:66 (Ka- HCDR1 TSGMSVG bat) SEQ ID NO:67 (Ka- HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS bat) SEQ ID NO:68 (Ka- HCDR3 SMITNWYFDV bat) SEQ ID NO:69 HCDR1 GFSLSTSGM (Chothia) SEQ ID NO:70 HCDR2 WWDDK (Chothia) SEQ ID NO:71 HCDR3 SMITNWYFDV (Chothia) SEQ ID NO:72 VH QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFS- LSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKK- DYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPA-

DTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO:73 VH de CAAGTCACCCTGCGTGAAAGCGGCCCTG- DNA CCCTGGTCAAGCCCACCCAGACCCTGAC- CCTGACCTGCACCTTCTCCGGCTTCTCCCTG- TCCACCTCCGGCATGTCCGTGGGCTGGA- TCCGGCAGCCTCCTGGCAAGGCCCTGGAG- TGGCTGGCCGACATTTGGTGGGACGA- CAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGAC- CAACATGGACCCCGCCGACACCGCCACCTAC- TACTGCGCCCGGTCCATGATCACCAACTGG-

TACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCG-

TGACCGTGTCCTCT SEQ ID NO:74 Cadeia QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFS- Pesada LSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKK- DYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPA- DTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVS- SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN- VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA- PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN- KALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS- REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS-

RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:75 Cadeia CAAGTCACCCTGCGTGAAAGCGGCCCTG- Pesada CCCTGGTCAAGCCCACCCAGACCCTGAC- de DNA CCTGACCTGCACCTTCTCCGGCTTCTCCCTG- TCCACCTCCGGCATGTCCGTGGGCTGGA- TCCGGCAGCCTCCTGGCAAGGCCCTGGAG- TGGCTGGCCGACATTTGGTGGGACGA- CAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGAC- CAACATGGACCCCGCCGACACCGCCACCTAC- TACTGCGCCCGGTCCATGATCACCAACTGG- TACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCG-

TGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGG- CCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAG- CAAGTCTACCTCCGGCGGCACAGCTG- CTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT- CCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAAC- TCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACAC- CTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG- TACTCCCTGTCCTCCGTGGTCACAGTGCCTT- CAAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATCTG- CAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACAC- CAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAG- TCCTGCGACAAGACCCACACCTG- TCCTCCCTGCCCTGCTCCTGAACTGCTGGG- CGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAG- CCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGAC- CCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTG- TCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAA- TTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA- CAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAG- TACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTG- CTGACCGTGCTGCACCAGGACTGG- CTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAAG- TCTCCAACAAGGCCCTGGCCGCCCCTA- TCGAAAAGACAATCTCCAAGGCCAAGGGCCA- GCCTAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTG- CCACCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAAC- CAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGGG- CTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGG- GAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTA- CAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGA- CGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGAC- CGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGG- CAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATG- CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCA-

GAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCCGGCAAG SEQ ID NO:76 (com- LCDR1 KAQLSVGYMH binado) SEQ ID NO:77 (com- LCDR2 DTSKLAS binado) SEQ ID NO:78 (com- LCDR3 FQGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN- binado) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR- PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFCQSIISTLTYPFT SEQ ID NO:79 (Ka- LCDR1 KAQLSVGYMH bat) SEQ ID NO:80 (Ka- LCDR2 DTSKLAS bat) SEQ ID NO:81 (Ka- LCDR3 FQGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN- bat) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR- PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFCQSIISTLTYPFT SEQ ID NO:82 LCDR1 QLSVGY (Chothia) SEQ ID NO:83 LCDR2 DTS (Chothia) SEQ ID NO:84 LCDR3 GSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN- (Chothia) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR- PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFCQSIISTLTYPF SEQ ID NO:85 VL DIQMTQSPSTLSAS- VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSG- TEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGAP- TSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN- PKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK- PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- LKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-

FCQSIISTLTYPFTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:86 VL de GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAC- DNA CCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGAC- CATCACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGC- TACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGG- CAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGACAC- CTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGA- TTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTT- CACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGA- CGACTTCGCCACCTACTACTGTTTTCAAGG- CTCTGGCGCCCCTACCTCCTCCAGCAC- CAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAACATCTG- CTGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGG- CATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTG- CAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTG- GAAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTG- GAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTTCATG-

TGCGAGTACGCCGACGAGACAGCCACCATCG- TGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCTG- CCAGTCCATCATCTCCACCCTGACCTAC- CCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTG-

GAAATCAAG SEQ ID NO:87 Cadeia DIQMTQSPSTLSAS- Leve VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSG- TEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGAP- TSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN- PKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK- PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- LKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT- FCQSIISTLTYPFTFGGGTKLEIKRTVAAP- SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN- FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK- DSTYS-

LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT

KSFNRGEC SEQ ID NO:88 Cadeia GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAC- Leve de CCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGAC- DNA CATCACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGC- TACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGG- CAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGACAC- CTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGA- TTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTT- CACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGA- CGACTTCGCCACCTACTACTGTTTTCAAGG- CTCTGGCGCCCCTACCTCCTCCAGCAC- CAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAACATCTG-

CTGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGG- CATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTG- CAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTG- GAAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTG- GAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTTCATG- TGCGAGTACGCCGACGAGACAGCCACCATCG- TGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTCTG- CCAGTCCATCATCTCCACCCTGACCTAC- CCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTG- GAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCG- TGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAG- CTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTG- CCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGG- CCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACG- CCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGT- CACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTA- CAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAG- CAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTG- TACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTG- TCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACA-

GGGGCGAGTGC IgG.IL2C217S.L3 SEQ ID NO:89 (com- HCDR1 GFSLSTSGMSVG binado) SEQ ID NO:90 (com- HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS binado)

SEQ ID NO:91 (com- HCDR3 SMITNWYFDV binado) SEQ ID NO:92 (Ka- HCDR1 TSGMSVG bat) SEQ ID NO:93 (Ka- HCDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS bat) SEQ ID NO:94 (Ka- HCDR3 SMITNWYFDV bat) SEQ ID NO:95 HCDR1 GFSLSTSGM (Chothia) SEQ ID NO:96 HCDR2 WWDDK (Chothia) SEQ ID NO:97 HCDR3 SMITNWYFDV (Chothia) SEQ ID NO:98 VH QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFS- LSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKK- DYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPA-

DTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO:99 VH de CAAGTCACCCTGCGTGAAAGCGGCCCTG- DNA CCCTGGTCAAGCCCACCCAGACCCTGAC- CCTGACCTGCACCTTCTCCGGCTTCTCCCTG- TCCACCTCCGGCATGTCCGTGGGCTGGA- TCCGGCAGCCTCCTGGCAAGGCCCTGGAG- TGGCTGGCCGACATTTGGTGGGACGA- CAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGAC- CAACATGGACCCCGCCGACACCGCCACCTAC- TACTGCGCCCGGTCCATGATCACCAACTGG- TACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCG-

TGACCGTGTCCTCT SEQ ID NO:100 Cadeia QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFS- Pesada LSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKK- DYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPA- DTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVS- SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN- VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA- PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN- KALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS- REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS-

RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:101 Cadeia CAAGTCACCCTGCGTGAAAGCGGCCCTG- Pesada CCCTGGTCAAGCCCACCCAGACCCTGAC- de DNA CCTGACCTGCACCTTCTCCGGCTTCTCCCTG- TCCACCTCCGGCATGTCCGTGGGCTGGA- TCCGGCAGCCTCCTGGCAAGGCCCTGGAG- TGGCTGGCCGACATTTGGTGGGACGA- CAAGAAGGACTACAACCCCAGCCTGAAG- TCCCGGCTGACCATCTCCAAGGACAC- CTCCAAGAACCAAGTGGTGCTGAAAGTGAC- CAACATGGACCCCGCCGACACCGCCACCTAC- TACTGCGCCCGGTCCATGATCACCAACTGG- TACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCG- TGACCGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGG-

CCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAG- CAAGTCTACCTCCGGCGGCACAGCTG- CTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT- CCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAAC- TCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACAC- CTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTG- TACTCCCTGTCCTCCGTGGTCACAGTGCCTT- CAAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATCTG- CAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACAC- CAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAG- TCCTGCGACAAGACCCACACCTG- TCCTCCCTGCCCTGCTCCTGAACTGCTGGG- CGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAG- CCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGAC- CCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTG- TCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAA- TTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA- CAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAG- TACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTG- CTGACCGTGCTGCACCAGGACTGG- CTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAAG- TCTCCAACAAGGCCCTGGCCGCCCCTA- TCGAAAAGACAATCTCCAAGGCCAAGGGCCA- GCCTAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTG- CCACCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAAC- CAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAGGG- CTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGG- GAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTA- CAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGA- CGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGAC- CGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGG- CAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATG- CACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCA-

GAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCCGGCAAG SEQ ID NO:102 LCDR1 KAQLSVGYMH (combinado) SEQ ID NO:103 LCDR2 DTSKLAS (combinado) SEQ ID NO:104 LCDR3 FQGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN- (combinado) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR- PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFSQSIISTLTYPFT SEQ ID NO:105 (Ka- LCDR1 KAQLSVGYMH bat) SEQ ID NO:106 (Ka- LCDR2 DTSKLAS bat) SEQ ID NO:107 (Ka- LCDR3 FQGSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN- bat) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR- PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFSQSIISTLTYPFT SEQ ID NO:108 LCDR1 QLSVGY (Chothia) SEQ ID NO:109 LCDR2 DTS (Chothia) SEQ ID NO:110 LCDR3 GSGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN- (Chothia) GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLR- PRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA-

TIVEFLNRWITFSQSIISTLTYPF

SEQ ID NO:111 VL DIQMTQSPSTLSAS- VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSG- TEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGAP- TSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN- PKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK- PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- LKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT-

FSQSIISTLTYPFTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:112 VL de GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAC- DNA CCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGAC- CATCACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGC- TACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGG- CAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGACAC- CTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGA- TTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTT- CACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGA- CGACTTCGCCACCTACTACTGTTTTCAAGG- CTCTGGCGCCCCTACCTCCTCCAGCAC- CAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAACATCTG- CTGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGG- CATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTG- CAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTG- GAAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTG- GAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTTCATG- TGCGAGTACGCCGACGAGACAGCCACCATCG-

TGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTT- CTCCCAGTCCATCATCTCCACCCTGACCTAC- CCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTG-

GAAATCAAG SEQ ID NO:113 Cadeia DIQMTQSPSTLSAS- Leve VGDRVTITCKAQLSVGYMHWYQQK- PGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSG- TEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGAP- TSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKN- PKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK- PLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLE- LKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT- FSQSIISTLTYPFTFGGGTKLEIKRTVAAP- SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN- FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK- DSTYS-

LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT

KSFNRGEC SEQ ID NO:114 Cadeia GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAC- Leve de CCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGAC- DNA CATCACTTGCAAGGCCCAGCTGTCCGTGGGC- TACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGG- CAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGACAC- CTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCAGA- TTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTT- CACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGA- CGACTTCGCCACCTACTACTGTTTTCAAGG- CTCTGGCGCCCCTACCTCCTCCAGCAC- CAAGAAAACCCAGCTGCAGCTCGAACATCTG- CTGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGG-

CATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGAC- CCGGATGCTGACCTTCAAGTTCTACATG- CCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACATCTG- CAGTGCCTGGAAGAGGAACTGAAGCCCCTG- GAAGAAGTGCTGAACCTGGCCCAG- TCCAAGAACTTCCACCTGAGGCCTCGGGAC- CTGATCTCCAACATCAACGTGATCGTGCTG- GAACTGAAGGGCTCCGAGACAACCTTCATG- TGCGAGTACGCCGACGAGACAGCCACCATCG- TGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTT- CTCCCAGTCCATCATCTCCACCCTGACCTAC- CCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTG- GAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCG- TGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAG- CTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTG- CCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGG- CCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACG- CCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGT- CACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTA- CAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAG- CAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTG- TACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTG- TCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACA-

GGGGCGAGTGC Exemplo 2: Proteínas enxertadas com anticorpo-citocina mostram maior atividade em células Treg e meia-vida aumentada

[00231] IgG.IL2D49A.H1 e IgG.IL2.L3 foram selecionadas à medida que obtêm os efeitos biológicos desejados sobre Proleukin® (a Figura 1 resume as mudanças relativas). Esses efeitos incluem; seletividade para IL-2R em Tregs vs. Tcon e células NK, maior expansão de meia- vida de Tregs vs. Tcon e células NK em camundongos.

[00232] Na avaliação para estímulo de receptor de IL-2 de alta afi- nidade, o enxerto tanto com Proleukin® quanto com IgG.IL2D49A.H1 mostrou potência de sinal comparável em células Treg, porém IgG.IL2D49A.H1 mostrou atividade diminuída ou nenhuma atividade tanto em células CD8 Tefetora quanto células NK, diferentemente de Proleukin®. A IL2 enxertada em CDRL3 (IgG.IL2.L3) mostrou menos potência de sinal em Tregs do que a Proleukin®, porém nenhuma ati- vidade nas células NK. As células mononucleares sanguíneas periféri- cas humanas (hPBMC) foram comparadas da HemaCare Corp. e tes- tadas in vitro ou com Proleukin®, IgG.IL2D49A.H1 ou IgG.IL2.L3 para avaliar atividade seletiva no receptor de alta afinidade de IL-2. As célu- las foram deixadas em repouso em meios de teste livre de soro e adi- cionadas a cada poço. Ou a proteína enxertada com anticorpo-citocina ou IL-2 humana nativa foram adicionadas aos poços, e incubadas por 20 minutos a 37 °C. Após 20 minutos as células foram fixadas, marca- das com marcadores de superfície, permeabilizadas e marcadas com anticorpo STAT5 (BD Biosciences) seguindo as instruções do fabrican- te.

[00233] A farmacocinética de IgG.IL2D49A.H1 ou IgG.IL2.L3 em plasma mostrou uma meia-vida estendida em relação a Proleukin® após apenas 1 dose. A expansão celular foi avaliada no baço de ca- mundongos NOD pré-diabéticos 8 dias após um tratamento ou com Proleukin® ou os enxertos. IgG.IL2D49A.H1 obtiveram expansão de Treg superior em relação a células Tefetoras e células NK e foi mais bem tolerado do que a Proleukin® em camundongos pré-diabéticos. O sumário do estímulo STAT5, o PK/PD de IgG.IL2D49A.H1 e IgG.IL2.L3 é mostrado na Figura 2. Isso mostra que as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina podem não apenas ter melhor meia-vida do que a Proleukin®, como também o estímulo das células Treg tidas como al- vo, sem estímulo indesejado de célula Tefetoras e célula NK.

Exemplo 3: Proteína enxertada com anticorpo-citocina mostra me- lhor atividade em células Treg

[00234] O camundongo diabético não obeso (NOD) desenvolve a diabetes Tipo 1 espontaneamente e é usado muitas vezes como um modelo animal para diabetes Tipo 1 humano. Aos camundongos NOD pré-diabéticos foi administrada Proleukin® equimolar (3x por semana) e diferentes proteínas enxertadas com anticorpo-citocina (1x/semana). Oito dias após o primeiro tratamento, baços foram processados para obter uma única suspensão celular e lavados em RPMI (FBS a 10%). As células sanguíneas vermelhas foram lisadas com Tampão de Lise de Células Sanguíneas Vermelhas (Sigma nº R7757) e células conta- das para o número de células e viabilidade. A marcação de FACS foi realizada sob protocolos padrão com o uso do tampão de FACS (1xPBS + 0,5% de BSA + 0,05% de azida de sódio). As células foram marcadas com anticorpos de superfície: CD3-BV605 anticamundongo de rato (BD Pharmingen nº 563004), CD4-Pacific Blue anticamundon- go de rato (BD Pharmingen nº 558107), CD8-PerCp anticamundongo de rato (BD Pharmingen nº 553036), CD44 FITC (Pharmingen nº 553133) e CD25-APC anticamundongo de rato (Ebioscience nº 17- 0251) subsequentemente fixados/permeabilizados e marcados para FoxP3 de acordo com o conjunto de marcação PE de FoxP3 de anti- camundongo/rato (Ebioscience nº 72-5775). As células foram analisa- das no BD LSR Fortessa® ou BD FACS LSR II® e os dados analisa- dos com software FlowJo®. A Figura 3 mostra os valores em vezes e as razões calculadas de cada baço como número absoluto que com- preende IgG.IL2D49A.H1 e IgG.IL2D113A.H1 com Proleukin®. A ex- pansão aumentada de células Treg sem expansão de células efetoras T CD8 ou células NK com IgG.IL2D49A.H1 é mostrada na fileira supe- rior. Isso se opõe à Proleukin® de baixa dose de dose alta, o que leva à expansão de todos os tipos celulares.

Exemplo 4: A potência de sinalização de IL-2R é reduzida em CD4 Tcon e CD8 Teff, porém não em Tregs in vitro

[00235] Tanto Proleukin® quanto IgG.IL2D49A.H1 foram testadas em in vitro quanto a potência de sinal no IL-2R, PBMC tanto de maca- co cinomolgo quanto de ser humano. Tanto IgG.IL2D49A.H1 quanto Proleukin® em concentrações de IL2 equimolares mostraram potência semelhante nas células Treg que expressam IL-2R de alta afinidade, porém apenas IgG.IL2D49A.H1 mostraram potência reduzida em célu- las CD4 convencionais e células efetoras T CD8 que expressam o re- ceptor de IL-2 de baixa afinidade. Esses resultados foram observados tanto em PBMC humano quanto de cinomolgo. Para o ensaio, as célu- las PBMC foram deixadas em repouso nos meios de teste livre de soro e adicionadas a cada poço. Ou IgG.IL2D49A.H1 ou Proleukin® foram adicionadas aos poços e incubados por 20 minutos a 37 °C. Após 20 minutos, as células foram fixadas, marcadas com marcadores de su- perfície, permeabilizadas e marcadas com anticorpo STAT5 (BD Bios- ciences) seguindo as instruções do fabricante. As células foram anali- sadas no BD LSR Fortessa® e os dados analisados com software FlowJo®.

[00236] O resultado, conforme mostrado na Figura 4, foi especifi- camente evidente. Tanto PBMC humana quanto de cinomolgo, ativa- ção de pSTAT5 por IgG.IL2D49A.H1 foi encontrado em Tregs, com muito pouco em efetores de CD8 T Exemplo 5: IgG.IL2D49A.H1 expande as Tregs funcionais e está- veis in vitro

[00237] A seletividade aprimorada para Tregs é acompanhada por um efeito funcional. As Tregs expandidas com IgG.IL2D49A.H1 são equivalentes ou supressores de T efetoras melhores que Tregs ex- pandidas por Proleukin®. Para esse ensaio, a PBMC humana foi puri- ficada do sangue total por centrifugação em reação a gradientes de

Ficoll-Hypaque (GE HealthCare nº de catálogo 17-1440-03). PBMCs foram lisadas por RBC (Amimed nº de cat. 3-13F00-H). As células CD4+ foram enriquecidas como uso do kit de enriquecimento de célula T CD4+ EasySep (StemCell Technologies nº de cat. 19052). A CD4+ enriquecida foi marcada com V500 anti-CD4 (clone RPAT4), PerCP- Cy5.5 anti-CD127 (e APC anti-CD25 e classificada para isolar CD4+CD127-CD25+ T células reguladoras naturais (nTregs) e res- pondedoras CD4+CD127+CD25- T (Tresp). As Tregs classificadas fo- ram colocadas em placa (1x105/100μl/poço) em réplicas em micropla- cas de fundo redondo de 96 poços depositado com microesferas mé- dias e estimuladas a razões entre microesfera e célula de 3:1 na pre- sença de 1 nM ou 0,3 nM Proleukin® ou IgG.IL2D49A.H1 em concen- trações equimolares.

Após incubação de 24 horas a 37 °C, os poços foram repreenchidos com meio a 100 μl que contém a mesma concen- tração de IL2. No dia 3, as culturas foram suspensas, divididas no meio e repreenchidas com meio a 100 μl que contém a mesma con- centração de IL2. No dia 6, as culturas foram processadas como no dia 3. No dia 8, as células foram colhidas, agrupadas em tubos e nas microesferas e as microesferas removidas colocando-se os tubos em um ímã de múltiplas plataformas por 1 a 2 minutos.

Os sobrenadantes que contêm células foram coletados e centrifugados a 200 g por 5 mi- nutos à temperatura ambiente.

Em seguida, as células foram contadas e colocadas novamente a cerca de 5x105/ml em microplacas de fundo achatado de 48 poços preenchidas com meio que contém 1/5 da con- centração de IL2 original.

Após 2 dias de repouso, as células foram colhidas, contadas e analisadas ou usadas no ensaio de supressão.

As células Tregs e respondedoras CD4+CD127+CD25- T (Tresp) re- centemente desgeladas foram rotuladas, conforme descrito nas instru- ções do fabricante com 0,8 µM deCTViolet (Life Technologies nº de cat.

C34557) e 1 µM de CFSE (Life Technologies nº de cat.

C34554),

respectivamente. A fim de avaliar as propriedades supressoras de Tregs expandidas, 3x104 Tresp identificadas como CFSE foram colo- cadas em placa em triplicatas sozinhas ou com Tregs identificadas com CTViolet (razão Tresp:Treg diferente) e estimulada com Dynabe- ads a uma razão entre microesfera e célula 1:8 (volume final 200μl/poço). Após 4 a 5 dias, as células foram coletadas e a prolifera- ção de células respondedoras avaliadas por citometria de fluxo.

[00238] A situação de metilação foi avaliada em Tregs frescas ex- pandidas em comparação com Tresp células. O DNA genômico (gDNA) foi isolado >5,0 x 105 células com o uso do Allprep® DNA/RNA Mini da Qiagen (nº de cat.80204). Em seguida, 200 ng do gDNA foram processados com o uso do kit de modificação de DNA Imprint® da Sigma (nº de cat.MOD50) para converter citosinas não metiladas para uracila (ao passo que as citosinas metiladas permanecem inalteradas). A metilação quantitativa foi, então, avaliada em 8 ng de gDNA conver- tido em bissulfeto com o uso de PCR em tempo real com base em sonda sequência-específica utilizando EpiTect Metilight® PCR+ROX (Qiagen nº de cat.59496), DNA de controle Epitect (Qiagen nº de cat.59695), plasmídeos padrão metilados (Life Technologies, nº de cat.12AAZ7FP) e não metilados (Life Technologies, nº de cat.12AAZ7FP), região desmetilada Treg-específica (TSDR) iniciado- res diretos e reversos metilados e não metilados e sondas (Mi- croSynth). A porcentagem de metilação foi calculada, conforme des- crito em EpiTect Metilight® PCR Handbook.

[00239] A Figura 5 mostra graficamente a desmetilação estável do locus Foxp3 com Tregs expandidas por Proleukin® e IgG.IL2D49A.H1. As Tregs humanas expandidas com IgG.IL2D49A.H1 in vitro são está- veis por desmetilação e expressão de Foxp3, o que leva a células Treg estáveis. Exemplo 6: Potência na sinalização de Il-2R reduzida em NKs hu-

manas in vitro com IgG.Il2d49.H1

[00240] A IgG.IL2D49A.H1 mostrou potência reduzida de sinaliza- ção em células NK em comparação a Proleukin® em concentrações equimolares. As células PBMC foram deixadas em repouso em meios de teste livre de soro e adicionadas a cada poço. Ou IgG.IL2D49A.H1 ou Proleukin® foram adicionadas aos poços e incubados por 20 minu- tos a 37 °C. Após 20 minutos, as células foram fixas com 1,6% de for- maldeído, lacas e marcadas com marcadores de superfície. Após 30 minutos à temperatura ambiente, as amostras foram lavadas e os pé- letes celulares e suspensos novamente foram permeabilizados com - 20 °C de metanol, lavados e marcados com intercaladores STAT5 e DNA. As células passaram em Cytof e os dados foram analisados com software FlowJo®. Os resultados são mostrados na Figura 6, em que IgG.IL2D49A.H1 não teve efeito nas células NK. Em contrapartida, o tratamento de Proleukin® aumentou a atividade de pSTAT5 em células NK, como um efeito colateral do tratamento Proleukin®. Exemplo 7: Avaliação da farmacocinética (PK), farmacodinâmica (PD) e efeitos toxicológicos de IgG.IL2D49A.H1 quando adminis- trados por via subcutânea a macacos cinomolgo fêmea.

[00241] A IgG.IL2D49A.H1 em macacos cinomolgo mostrou farma- cocinética, expansão de Treg superior em relação a células Tefetoras e menos toxicidade do que a Proleukin® de baixa dose. Esse estudo de laboratório não clínico foi conduzido em conformidade com o proto- colo genérico aprovado pela Novartis Animal Care and Use Committee no. TX 4039, com esse protocolo e com Procedimentos Operacionais Padrão da instalação (SOPs).

[00242] Os animais foram dosados por via subcutânea ou com IgG.IL2D49A.H1 ou Proleukin® no primeiro dia do estudo. O sangue foi coletado de todos os animais em cada nível de dose no estudo. O dia 1 na pré-dose, 1 hora, 6 horas e 12 horas pós-dose e em seguida nos dias 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 10 e 12. Todas as amostras de sangue para farmacocinéticas e farmacodinâmicas foram centrifugadas e as amos- tras plasmáticas foram obtidas. As amostras plasmáticas resultantes foram transferidas em um tubo único de polipropileno e congeladas a aproximadamente -70 °C ou abaixo. Todas as amostras foram anali- sadas e concentrações de IgG.IL2D49A.H1 e Proleukin® em plasma medida como uso de imunoensaios. Os parâmetros farmacocinéticos, tais como meia-vida foram calculados, e as células imunofenotipadas por y FACS por farmacodinâmica. O protocolo de ensaio Gyros IL-2/IL- 2 é conforme a seguir. Cada amostra foi executada em duplicata, com cada uma dentre as análises duplicadas exigindo 5 µl da amostra que foi diluída 1:20. O anticorpo de captura é anticorpo biotinilado anti-IL-2 humana de cabra (R&D Systems BAF202) e detectado com Alexa 647 anti-IL-2 humana, Clone MQ1-17H12 (Biolegend 500315) LOQ: 0,08 ng/ml, todos os imunoensaios foram conduzidos com o uso de Gyrolab Bioaffy200® com Gyros CD-200s®.

[00243] A Figura 7 mostra os contrastes entre IgG.IL2D49A.H1 e Proleukin®. A IgG.IL2D49A.H1 tem a meia-vida de 12 horas, ao passo que a Proleukin® tem uma meia-vida de 3 horas. Com a meia-vida es- tendida de IgG.IL2D49A.H1 ocorre a atividade aumentada de Treg e muita toxicidade reduzida de eosinofilia. Exemplo 8: IgG.IL2D49A.H1 mostra uma meia-vida estendida em relação a Proleukin®

[00244] A IgG.IL2D49A.H1 mostrou uma meia-vida de aproxima- damente 12 horas em comparação à meia-vida de Proleukin® de 4 horas após uma única administração. Os animais de CD-1 naïve foram dosados por via intravenosa ou subcutânea e o sangue coletado de todos os animais e pré-dose, 1 hora, 3, 7, 24, 31, 48, 55 e 72 horas pós dose. As amostras sanguíneas foram centrifugadas e as amostras plasmática obtidas. As amostras de plasma resultante foram transferi-

das em um único tubo de polipropileno e congelados a -80 °C. Todas as amostras foram analisadas e as concentrações de IgG.IL2D49A.H1 em plasma foram medidas como uso de imunoensaios. O protocolo de ensaio Gyros IL-2/IL-2 é conforme a seguir. Cada amostra foi executa- da em duplicata, com cada uma dentre as análises duplicadas exigin- do 5 µl da amostra que foi diluída 1:20. O anticorpo captura é um anti- corpo biotinilado anti-IL-2 humana de cabra (R&D Systems BAF202) e detectado com Alexa 647 anti-IL-2 humana, Clone MQ1-17H12 (Biole- gend 500315) LOQ: 0,08 ng/ml, todos os imunoensaios foram condu- zidos com o uso de Gyrolab Bioaffy200® com Gyros CD-200s®. Esse ensaio se expande mediante a determinação da meia-vida do Exemplo

7. Os resultados desse ensaio são mostrados na Figura 8, em que a meia-vida de IgG.IL2D49A.H1 é determinada como 12 a 14 horas, em contrapartida a Proleukin® que tem uma meia-vida de 4 horas. Exemplo 9: Tregs humanas se expandem, porém células efetoras T ou NK não, em camundongos com xeno-GvHD

[00245] A IgG.IL2D49A.H1 expande seletivamente as Tregs em re- lação as células T efetoras ou células NK no modelo xeno-GvHD, ao passo que a Proleukin® não expande Os camundongos nulos gama NOD-scid IL2R (NSG) foram injetados com hPBMCs de doadores saudáveis por meio de injeção intraperitoneal (HemaCare Corp). 24 horas após injeção, os animais foram dosados com ou IgG.IL2D49A.H1 1x/semana ou Proleukin® 5x/semana a cada semana para a direção do estudo. O peso corporal foi monitorado duas vezes por semana para a duração do estudo. Quatro camundongos por gru- po foram colhidos 28 dias após a primeira dose e, baços foram pro- cessados para obter suspensões celulares únicas e lavadas em RPMI (FBS a 10%). As células sanguíneas vermelhas foram lisadas com tampão de lise de células sanguíneas vermelhas e células contadas para número e viabilidade celular. A marcação de FACS foi realizada sob protocolos padrão com o uso do tampão de FACS (1xPBS + 0,5% de BSA + 0,05% de azida de sódio). As células foram marcadas com anticorpos de superfície e subsequentemente fixados/permeabilizados e marcados para FoxP3 de acordo com Conjunto de Marcação Anti- Mouse/Rato FoxP3 PE (Ebioscience nº 72-5775). As células foram analisadas no BD LSR Fortessa® e os dados analisados com software FlowJo®. Os valores e razões em vez se baseiam no número relativo calculado para cada número absoluto do número. A Figura 9 mostra que o IgG.IL2D49A.H1 expande as células Treg muito melhor que Pro- leukin® nesse modelo de camundongo e também reduz a expansão indesejada de Tcons e células NK.

[00246] Quando os camundongos xeno-GvHD foram tratados com a IgG.IL2D49.H1 e injetados com PBMCs humanas (as células estra- nhas), os mesmos mantiveram um peso corporal normal ao longo do curso do tratamento. Em contrapartida, os camundongos tratados com Proleukin® tiveram graves perdas de peso corporal. O peso corporal foi monitorado duas vezes por semana durante o período do estudo e a porcentagem de peso corporal foi calculada levando-se em conside- ração o peso inicial dos animais no momento de alistamento. Essa me- lhora é associada ao efeito que IgG.IL2D49A.H1 tem em na intensifi- cação de Treg nesse modelo e os dados são mostrados graficamente na Figura 10. Esses dados indicam que IgG.IL2D49A.H1 e outras pro- teínas enxertadas com anticorpo-citocina têm um índice terapêutico maior e uma margem de segurança. Exemplo 10: IgG.IL2D49A.H1 previne o desenvolvimento de diabe- tes tipo 1 em um modelo de camundongos NOD com diabetes

[00247] NOD fêmeas pré-diabéticas foram administradas com Pro- leukin® equimolar (3x/semana) e IgG.IL2D49A.H1 (1x/semana) por injeção intraperitoneal. Durante o período do estudo (4 meses após a primeira dose), os camundongos foram monitorados duas vezes por semana quanto à glicose sanguínea e peso corporal. A Figura 11 mos- tra que camundongos tratados com IgG.IL2D49A.H1 mantiveram um baixo valor de glicose sanguínea. Sendo assim, os camundongos tra- tados com IgG.IL2D49A.H1 não progrediram para diabetes do tipo 1 (T1D) aparente. Em contrapartida, camundongos tratados com Proleu- kin® começaram com baixos valores de glicose sanguínea, mas isso aumentou ao longo do tempo e resultou em sintomas de diabetes tipo

1. Exemplo 11: IgG.IL2D49A.H1 versus baixa dose de Proleukin® em camundongos NOD pré-diabéticos

[00248] IgG.IL2D49A.H1 mostrou expansão de Treg superior, me- lhor tolerabilidade e nenhum evento adverso com uma dose, em com- paração com 3 doses de Proleukin® no modelo de camundongo NOD. NOD fêmeas pré-diabéticas foram administradas com baixa dose equimolar de Proleukin® (3x/semana) e IgG.IL2D49A.H1 (1x/semana) por injeção intraperitoneal. Quatro camundongos por grupo foram aba- tidos 4 dias após a primeira dose e os baços foram processados para obter suspensões de uma única célula e lavados em RPMI (FBS a 10%). As células sanguíneas vermelhas foram lisadas com tampão de lise de células sanguíneas vermelhas e células contadas para número e viabilidade celular. A marcação de FACS foi realizada sob protocolos padrão com o uso do tampão de FACS (1xPBS + 0,5% de BSA + 0,05% de azida de sódio). As células foram marcadas com anticorpos de superfície: CD3-BV605 anticamundongo de rato (BD Pharmingen nº 563004), CD4-Pacific Blue anticamundongo de rato (BD Pharmingen nº 558107), CD8-PerCp anticamundongo de rato (BD Pharmingen nº 553036), CD44 FITC (Pharmingen nº 553133) e CD25-APC antica- mundongo de rato (Ebioscience nº 17-0251) subsequentemente fixa- dos/permeabilizados e marcados para FoxP3 de acordo com o conjun- to de marcação PE de FoxP3 de anti-camundongo/rato (Ebioscience nº 72-5775). As células foram analisadas no BD LSR Fortessa® ou BD FACS LSR II® e os dados analisados com software FlowJo®. Os valo- res e razões em vezes se baseiam no número relativo calculado para cada número absoluto do número. A administração de uma única dose de IgG.IL2D49A.H1 mostrou maior expansão de Tregs que a adminis- tração repetida de Proleukin® no modelo de camundongo NOD con- forme mostrado na Figura 12. Exemplo 12: Farmacocinética de uma dose eficaz de IgG.IL2D49A.H1 no modelo de camundongo NOD

[00249] A farmacocinética de IgG.IL2D49A.H1 em 1,3 mg/kg e 0,43 mg/kg foi ensaiada em plasma até 48 horas após 1 dose. Camundon- gos NOD pré-diabéticos de 10 semanas de idade foram dosados intra- peritonealmente com IgG.IL2D49A.H1 em duas concentrações diferen- tes e sangue foi coletado de todos os animais em 1 hora, 3, 7, 24 e 48 horas após a dose. As amostras sanguíneas foram centrifugadas, e amostras de plasma foram obtidas. As amostras de plasma resultante foram transferidas em um único tubo de polipropileno e congelados a - 80 °C. Cada amostra foi analisada para detectar concentrações de plasma de IgG.IL2D49A.H1 com o uso de três métodos diferentes adaptados à plataforma de Gyros: 1) captura e detecção com base em IL2, 2) captura com base em IL2 e detecção com base em hFc e 3) captura e detecção com base em hFc.

[00250] Cada amostra foi executada em duplicata, com cada uma dentre as análises duplicadas exigindo 5 µl da amostra que foi diluída 1:20. O ensaio de Gyros IL-2/IL-2 usa um anticorpo de captura biotini- lado de IL-2 anti-humana de cabra (R&D Systems BAF202) e detecta, com IL-2 anti-humana Alexa 647, o clone MQ1-17H12 (Biolegend 500315). Para detecção de IL-2/Fc, um anticorpo de captura biotinilado de IL-2 anti-humana de cabra (R&D Systems BAF202) é usado, e para detecção, um anticorpo específico para Fc de IgG anti-humana de ca-

bra Alexa 647 (Jackson ImmunoResearch 109-605-098). Para o en- saio de Fc/Fc humano, uma IgG de captura anti-humana biotinilada de cabra, específica para Fc (Jackson ImmunoResearch nº 109-065-098) foi usada. A etapa de detecção usou uma IgG anti-humana de cabra Alexa 647, específica para Fcγ (Jackson ImmunoResearch nº 109-605- 098). Todos os imunoensaios foram conduzidos com o uso de um Gyrolab Bioaffy200® com Gyros CD-200s. O limite de quantificação (LOQ) nesse modelo de camundongo é de 48 horas conforme mostra- do na Figura 13A. Isso é comparado à Proleukin® e a uma proteína de fusão IL2-Fc na Figura 13B. Esse gráfico mostra que o LOQ é maior para as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina, tais como IgG.IL2D49.H1. Exemplo 13: Faixa de dosagem encontrada em camundongos NOD pré-diabéticos

[00251] IgG.IL2D49A.H1 mostrou expansão de Treg superior tanto em Tcon CD4 como em T efetoras CD8 em comparação com Proleu- kin® nas mesmas concentrações equimolares. Eventos adversos, tais como mortalidade, foram encontrados nos grupos de Proleukin® com doses mais altas, e nenhuma mortalidade foi observada em camun- dongos tratados com qualquer dose de IgG.IL2D49.H1.

[00252] NOD fêmeas pré-diabéticas foram administradas com baixa dose equimolar de IL-2 (3x/semana) e IgG.IL2D49A.H1 (1x/semana) por injeção intraperitoneal. Três camundongos por grupo foram sub- metidos à eutanásia 8 dias após a primeira dose e os baços foram co- letados. Os baços foram processados para obter suspensões de uma única célula e lavados em RPMI (FBS a 10%). O sangue foi coletado, as células sanguíneas vermelhas foram lisadas com tampão de lise de células sanguíneas vermelhas e as células contadas para número e viabilidade celular. A marcação de FACS foi realizada sob protocolos padrão com o uso do tampão de FACS (1xPBS + 0,5% de BSA +

0,05% de azida de sódio). As células foram marcadas com anticorpos de superfície e subsequentemente fixados/permeabilizados e marca- dos para FoxP3 de acordo com Conjunto de Marcação Anti- Mouse/Rato FoxP3 PE (Ebioscience nº 72-5775). As células foram analisadas no BD LSR Fortessa® e os dados analisados com software FlowJo®. As razões se baseiam no número de células relativo calcula- do a partir de cada baço. Esses dados são fornecidos na Figura 14. A tabela fornece um formato de faixa de dose para proteínas enxertadas com anticorpo-citocina. A mesma também demonstra que IgG.IL2D49A.H1 teve um índice terapêutico maior que Proleukin®, vis- to que a dosagem é bem tolerada ao longo de uma grande faixa. Em contrapartida, a administração de Proleukin® em doses mais altas produziu morbidade e mortalidade nos camundongos. A dose mais alta de Proleukin® produziu morbidade e mortalidade suficientes para que o tratamento nessa dose tivesse que ser descontinuado. Exemplo 14: Sinalização de STAT5 em PBMC humana

[00253] A IgG.IL2D49A.H1 foi seletiva para ativação de Treg em relação a Tcon e NK em PBMC humana de doador saudável assim como em PBMC de doadores autoimunes. A potência da sinalização de STAT5 foi reduzida em Tcon, porém não em Tregs após o trata- mento in vitro com IgG.IL2D49.H1. PBMC humana de células de paci- entes saudáveis e autoimunes (Hemacare Corp) foram testados em meios de teste livre de soro e adicionadas a cada poço. A IgG.IL2D49A.H1 foi adicionada aos poços, e incubadas por 20 minutos a 37 °C. Após 20 minutos, as células foram fixadas, marcadas com marcadores de superfície, permeabilizadas e marcadas com anticorpo STAT5 (BD Biosciences) seguindo as instruções do fabricante. As cé- lulas foram analisadas no BD LSR Fortessa® e os dados analisados com software FlowJo®. Os dados na Figura 15A indicam que o trata- mento com IgG.IL2D49A.H1 das PBMCs obtidos dos pacientes huma-

nos com vitiligo que houve pouca ativação de células NK, CD4 Tcon ou efetoras T CD8, ao mesmo tempo que a atividade de Treg é manti- da. Esse resultado também foi observado em PBMCs obtidas de paci- entes de com SLE e doença de Hashimoto (dados não mostrados). A Figura 15B mostra que as PBMCs obtidas dos pacientes humanos com Diabetes do tipo 1 (T1D) e tratadas com IgG.IL2D49A.H1 e Pro- leukin® tiveram atividade de pSTAT5 reduzida em células NK, células efetoras T CD8 ou células CD4 Tcon. À medida que o tratamento IgG.IL2D49A.H1 foi eficaz em PBMCs normais e bem toleradas em PBMCs obtidas de pacientes com T1D, isso indica que as proteínas de anticorpo-citocina seriam úteis no tratamento de T1D até mesmo caso o paciente receba terapia de insulina. Isso indica que IgG.IL2D49A.H1 é bem tolerado em pacientes com esses distúrbios relacionados à imunidade e é eficaz em lidar com esses distúrbios relacionados à imunidade. Exemplo 15: Ligação de proteínas enxertadas com anticorpo- citocina

[00254] As sequências de IL2 que contêm muteínas (SEQ ID NO:4 ou 6) foram inseridas no laço de CDR de um arcabouço de cadeia de imunoglobulina. As proteínas enxertadas com anticorpo-citocina foram preparadas com o uso de uma variedade de sequências de imunoglo- bulinas conhecidas que foram utilizadas em ambientes clínicos assim como sequências de anticorpo de linhagem germinativa. Um dentre os anticorpos usados tem RSV no seu antígeno. A fim de determinar se o enxerto com IL2 nas CDRs desse anticorpo reduziu ou revogou a liga- ção ao RSV, um ensaio ELISA foi executado nas proteínas RSV ou em PBS ou um tampão de carbonato. Conforme mostrado na Figura 16, isso parece ser influenciado por qual CDR foi escolhida para enxerto com IL2. Por exemplo, IgG.IL2D49A.H1 tem ligação de RSV seme- lhante ao anticorpo original não enxertada (não modificada). Em con-

trapartida, o enxerto com IL2 na cadeia leve de CDR3 (CDR-L3) ou em CDR-H3 reduz a ligação. Conforme esperado, a IL2 enxertada em um anticorpo irrelevante (Xolair) não produz ligação. Isso demonstra que as proteínas enxertadas com anticorpo-citocina podem reter a ligação ao alvo original do arcabouço de anticorpo ou essa ligação pode ser reduzida. Exemplo 16: Expansão Treg em primatas não humanos

[00255] A IgG.IL2D49A.H1 foi administrada a macacos cinomolgo em duas doses subcutâneas ascendentes únicas fornecidas com in- tervalo livre de dosagem de 4 semanas alternando entre 2 grupos de dose (3M/grupo). Isso foi seguido por uma fase de múltiplas doses de 2 semanas em dois grupos (3M/grupo) que recebem 6 doses subcutâ- nea (em dias alternados por duas semanas) de tampão ou 5 mg/kg de IgG.IL2D49A.H1. As mudanças em populações de linfócitos avaliadas por citometria de fluxo (imunofenotipagem) da "fase de dose única" (duas doses fornecidas a cada 29 dias) são mostradas na Figura 17. Nas doses 125 e 375 µg/kg, aumentos de 3 a 4 vezes e 5,5 vezes em números absolutos de Treg foram observados sem qualquer efeito aparente em Tcon ou células NK. A expansão máxima de Treg foi ob- servada no dia 4 e os números de Treg retornaram próximo à linha de base no dia 10. A IgG.IL2D49A.H1 estava segura e bem tolerada e não houve mortalidades, sinais ou mudanças clínicas no peso corpo- ral, consumo de alimentos, níveis de citocina ou patologia clínica. Além disso, nenhum efeito cardiovascular (ECG ou pressão sanguínea) foi observado no estudo após dose única até 2,4 mg/kg ou múltiplas do- sagens em dias alternados por duas semanas a 5 mg/kg. Não houve indicação de vazamento vascular ou outras constatações relacionadas a CV. Exemplo 17: Risco de efeitos de anticorpo antifármaco

[00256] A fim de determinar o risco de efeitos do anticorpo antifár-

maco no perfil seletivo de GFTX3b_IL-2-H1-D49A, os ensaios de sina- lização foram conduzidos na presença de um anticorpo de reticulação de Fc em resposta à dose.

[00257] Os PBMCs humanos foram ressuspensos em meio RPMI completo em 3x106 células/ml, colocados em placa em 3x105 célu- las/poço (100 ul) e deixados em repouso por 2 horas. Em uma placa de 96 poços separadas, concentrações superiores de Proleukin, GFTX3b_IL-2-H1-D49A e GFTX3b_IL-2-H1-D49A + excesso molar de IgG anti-humana de F(ab')2 IgG, IgG anti-humana F(ab')2 de cabra somente (Southern Biotech nº de CAT.2042-01, nº de Lote J1715- PI77) e curvas de titulação foram preparadas a concentração final de 2X no meio. Para todas as condições, a concentração superior de IL2 equivalente foi 200 nM. A concentração superior foi preparada e um curva de diluição de 10-pt foi preparada abaixo da concentração supe- rior (com uma diluição 1:2 de intercalação) para Proleukin e GFTX3b_IL-2-H1-D49A. Adicionalmente, as curvas de titulação foram preparadas com concentração superior GFTX3b_IL-2-H1-D49A a 200 nM (IL-2 equivalente) e IgG anti-humana a 0,5x, 1x, 2,5x, 5x e 10x GFTX3b_IL-2-H1-D49A com base em molaridade. Uma curva de dilui- ção 10-pt, 1:10 foi preparada abaixo da concentração superior para cada condição. IgG anti-humana + titulações GFTX3b_IL-2-H1-D49A foram preparadas e incubadas por 20 minutos à temperatura ambiente antes da adição em PBMCs.

[00258] As condições preparadas (ou meios sozinhos) foram adici- onadas a PBMCs por um volume final de 100 ul/poço. PBMCs foram estimuladas por 25 minutos a 37 °C, 5% de CO2. Após a incubação, as células foram fixadas rapidamente, processadas para receberem códi- gos de barra, marcadas para superfície, permeabilizadas e marcadas para pSTAT5 e Foxp3. As células foram lidas no Cytof e os dados ana- lisados com o software FlowJo. As concentrações crescentes de um anticorpo IgG anti-humana de reticulador não interfere com as ativida- des seletivas de GFTX3b_IL-2-H1-D49A (Figura 18). Exemplo 18: Sinalização seletiva em diferentes pacientes autoi- munes

[00259] PBMC humanos de células de pacientes autoimunes (He- macare Corp) foram deixadas em meios de teste livre de soro e adici- onadas a cada poço. Em uma placa separada, as concentrações supe- riores ou de Proleukin ou GFTX3b_IL-2-H1-D49A foram feitas e as curvas de titulação foram preparadas em uma concentração final de 4x no meio. A concentração superior (200 nM de IL-2 equivalente) foi preparada e uma curva de diluição de 4-pt (ou 10 pt para AD) foi pre- parada abaixo da concentração superior ou de GFTX3b_IL-2-H1-D49A ou IL-2 humana nativa (Proleukin). As condições preparadas foram adicionadas aos poços e incubadas por 25 minutos a 37 °C. Após 25 min, as células foram fixadas, marcadas com marcadores de superfí- cie, permeabilizadas e marcadas com anticorpos intracelulares (pSTAT5, Foxp3) para aquisição em Cytof (todos os anticorpos de Flu- idigm) seguindo as instruções de fabricante. Os dados foram analisa- dos com o uso do software FlowJo.

[00260] GFTX3b_IL-2-H1-D49A foi seletivo para Tregs em reação a CD4 Tcon e CD8 Teff em diversas indicações autoimunes testadas inclu- indo diabetes Tipo 1, SLE, vitiligo e dermatite atópica (Figura 19). A potência de sinalização de IL-2R foi reduzida em Tcon e Teff, porém não Tregs in vitro. Exemplo 19 Seletividade para Sinalização em Tregs em Relação a Células T Efetoras em PBMC Humano

[00261] As células PBMC repousaram em meios de RPMI e foram adicionados a cada poço. Ou o enxerto de IL-2 D49A ou IL-2 humana nativa foram adicionadas aos poços e incubadas por 25 minutos a 37°C. Após 25 minutos, as células foram fixadas com 1,6% de formal-

deído, lavada e manchada com marcadores de superfície. Após 30 minutos à temperatura ambiente, as amostras foram lavas e os péletes celulares ressuspensos foram permeabilizados com -20°C metanol, lavados e marcados com intercaladores de STAT5 e DNA. As células foram passadas em um Cytof e os dados foram analisados com o sof- tware FlowJo.

[00262] GFTX3b_IL-2D49A mostram maior especificidade em rela- ção à Proleukin para sinalização em Tregs sobre T efetores em con- centrações equimolares de IL-2 (Figura 20).

[00263] Entende-se que os exemplos e modalidades descritos no presente documento servem a título de ilustração e que várias modifi- cações ou mudanças à luz dos mesmos serão sugeridas para pessoas versadas na técnica e devem estar incluídas dentro do espírito e previ- são do presente pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, números de acesso de sequência, patentes e pedidos de patente citados no presente documento são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade para qualquer fim.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína enxertada com anticorpo-citocina caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende Regiões Determinantes da Complementaridade (CDR) HCDR1, HCDR2, HCDR3; e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreen- de LCDR1, LCDR2, LCDR3; e (c) uma molécula de interleucina 2 (IL2) enxertada em uma CDR da VH ou da VL.

2. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 é enxertada em uma CDR de cadeia pesada.

3. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a CDR de cadeia pesada é selecionada a partir da região determinante da complemen- taridade 1 (HCDR1), da região determinante da complementaridade 2 (HCDR2) e da região determinante da complementaridade 3 (HCDR3).

4. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 é enxertada na HCDR1.

5. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 é enxertada em uma CDR de cadeia leve.

6. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a CDR de cadeia leve é selecionada a partir da região determinante da complementari- dade 1 (LCDR1), região determinante da complementaridade 2 (LCDR2) e da região determinante da complementaridade 3 (LCDR3).

7. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 contém uma mutação que reduz a afinidade da molécula de IL2 a um receptor de IL2 de baixa afinidade.

8. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a proteína enxertada com anticorpo-citocina estimula a prolifera- ção de células Treg mais que a IL2 nativa ou Proleukin®.

9. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a proteína enxertada com anticorpo-citocina estimula a prolifera- ção de célula efetora T CD8 menos que a IL2 nativa ou Proleukin®.

10. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína enxertada com anticorpo-citocina tem uma meia-vida mais longa que a IL2 nativa ou Proleukin®.

11. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 consiste em SEQ ID NO:4.

12. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a molécula de IL2 consiste em SEQ ID NO:6.

13. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma cadeia pesada de anticorpo de classe de IgG.

14. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a cadeia pesa- da de anticorpo de classe de IgG é selecionada a partir da IgG1, IgG2 ou IgG4.

15. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a especificidade de ligação das CDRs ao alvo é reduzida em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% pela molécula de IL2 enxertada.

16. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a especificidade de ligação das CDRs ao alvo é retida em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% na presença da molécula de IL2 enxertada.

17. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a especificidade de ligação das CDRs é distinta da especifici- dade de ligação da molécula de IL2.

18. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a especificidade de ligação das CDRs é a um antígeno não humano.

19. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o antígeno não humano é um vírus.

20. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o vírus é um vírus sincicial respiratório (RSV).

21. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o RSV é sele- cionado a partir do subgrupo A de RSV e do subgrupo B de RSV.

22. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que a porção de arcabouço do anticorpo da proteína enxertada com anticorpo-citocina é humanizada ou humana.

23. Proteína enxertada com anticorpo-citocina caracteriza- da pelo fato de que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO: 17, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:18, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:19 e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:30, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:31 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:32; (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO:43, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:44, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:45; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:56, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:57 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:58; (iii) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO:69, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:70, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:71; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:82, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:83 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:84; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO:95, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:96, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:97; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:108, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:109 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:110.

24. Proteína enxertada com anticorpo-citocina caracteriza- da pelo fato de que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compre- ende SEQ ID NO:20 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende SEQ ID NO: 33; (ii) uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende SEQ ID NO: 46 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende SEQ ID NO: 59;

(iii) uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende SEQ ID NO:72 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende SEQ ID NO:85; ou (iv) uma região variável de cadeia pesada (VH) que com- preende SEQ ID NO:98 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende SEQ ID NO:111.

25. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma região Fc modificada correspondente à função efetora reduzida.

26. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a região Fc modificada compreende uma mutação selecionada a partir de um ou mais dentre D265A, P329A, P329G, N297A, L234A e L235A.

27. Proteína enxertada com anticorpo-citocina, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a região Fc modificada compreende uma combinação de mutações selecionadas a partir de um ou mais dentre D265A/P329A, D265A/N297A, L234/L235A, P329A/L234A/L235A e P329G/L234A/L235A.

28. Proteína enxertada com anticorpo-citocina caracteriza- da pelo fato de que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO: 17, uma HCDR2 da SEQ ID NO:18, uma HCDR3 da SEQ ID NO:19, uma LCDR1 da SEQ ID NO:30, uma LCDR2 da SEQ ID NO:31, uma LCDR3 da SEQ ID NO:32, uma região Fc modificada que contém a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com anticorpo- citocina estimula menos expansão de células NK em comparação à Proleukin®.

29. Proteína enxertada com anticorpo-citocina caracteriza- da pelo fato de que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO:43, uma HCDR2 da SEQ ID NO:44, uma HCDR3 da SEQ ID NO:45, uma

LCDR1 da SEQ ID NO:56, uma LCDR2 da SEQ ID NO:57, uma LCDR3 da SEQ ID NO:58, uma região Fc modificada que contém a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com anticorpo- citocina estimula mais expansão de células NK em comparação à Pro- leukin®.

30. Proteína enxertada com anticorpo-citocina caracteriza- da pelo fato de que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO:69, uma HCDR2 da SEQ ID NO:70, uma HCDR3 da SEQ ID NO:71, uma LCDR1 da SEQ ID NO:82, uma LCDR2 da SEQ ID NO:83, uma LCDR3 da SEQ ID NO:84, uma região Fc modificada que contém a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com anticorpo- citocina estimula mais expansão de células NK em comparação à Pro- leukin®.

31. Proteína enxertada com anticorpo-citocina caracteriza- da pelo fato de que compreende uma HCDR1 da SEQ ID NO:95, uma HCDR2 da SEQ ID NO:96, uma HCDR3 da SEQ ID NO:97, uma LCDR1 da SEQ ID NO:108, uma LCDR2 da SEQ ID NO:109, uma LCDR3 da SEQ ID NO:110, uma região Fc modificada que contém a mutação D265A/P329A, em que a proteína enxertada com anticorpo- citocina estimula menos expansão de células NK em comparação à Proleukin®.

32. Ácido nucleico isolado que codifica uma proteína enxer- tada com anticorpo-citocina caracterizado pelo fato de que compreen- de: (i) uma cadeia pesada da SEQ ID NO:23 e uma cadeia leve da SEQ ID NO:36; (ii) uma cadeia pesada da SEQ ID NO:49 e uma cadeia le- ve da SEQ ID NO:62; (iii) uma cadeia pesada da SEQ ID NO:75 e uma cadeia le- ve da SEQ ID NO:88; ou

(iv) uma cadeia pesada da SEQ ID NO:101 e uma cadeia leve da SEQ ID NO:114.

33. Célula hospedeira recombinante adequada para a pro- dução de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina caracterizada pelo fato de que compreende os ácidos nucleicos, como definido na reivindicação 32, que codificam os polipeptídeos de cadeia pesada e leve da proteína e opcionalmente um sinal de secreção.

34. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a rei- vindicação 33, caracterizada pelo fato de que é uma linhagem celular de mamífero.

35. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular de mamífero é uma linhagem celular de CHO.

36. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína enxertada com anticorpo-citocina, co- mo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, e um carrea- dor farmaceuticamente aceitável.

37. Método para tratar um distúrbio relacionado à imunida- de em um indivíduo com necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade te- rapeuticamente eficaz da proteína enxertada com anticorpo-citocina, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, ou a com- posição farmacêutica, como definida na reivindicação 36.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo fato de que o distúrbio relacionado à imunidade é selecionado a partir do grupo que consiste em: Diabetes Tipo 1, Lúpus eritematoso sistêmico, Vitiligo, Doença do enxerto contra hospedeiro (cGvHD), Do- ença do enxerto contra hospedeiro profilática aguda (pGvHD), vasculi- te induzida por HIV, Alopecia areata, morfeia de esclerose sistêmica e síndrome do antifosfolipídeo primário.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, carac- terizado pelo fato de que a proteína enxertada com anticorpo-citocina ou a composição farmacêutica é administrada em combinação com outro agente terapêutico.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do pelo fato de que o agente terapêutico é outra proteína enxertada com anticorpo-citocina.

41. Método para expandir células Treg em um paciente com necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma proteína enxertada com anticorpo-citocina, como defi- nida em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, ou a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 36 ao paciente.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que as células Treg são expandidas e as células efeto- ras T CD8 não são expandidas.

43. Método, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, carac- terizado pelo fato de que as células Treg são expandidas e as células NK não são expandidas.

44. Uso de uma proteína enxertada com anticorpo-citocina caracterizado pelo fato de que ocorre no tratamento de um distúrbio relacionado à imunidade que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreende: (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO: 17, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:18, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:19 e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:30, (e) uma LCDR2 da SEQ ID NO:31 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:32; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende: (a) uma HCDR1 da SEQ ID NO:43, (b) uma HCDR2 da SEQ ID NO:44, (c) uma HCDR3 da SEQ ID NO:45; e uma região variável de cadeia leve que compreende: (d) uma LCDR1 da SEQ ID NO:56, (e)

uma LCDR2 da SEQ ID NO:57 e (f) uma LCDR3 da SEQ ID NO:58, no tratamento de um distúrbio relacionado à imunidade.

45. Uso, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado à imunidade é selecionado a partir do grupo que consiste em diabetes Tipo 1, Lúpus eritematoso sistêmico, Vitiligo, doença do enxerto contra hospedeiro (cGvHD), do- ença do enxerto contra hospedeiro aguda profilática (pGvHD), vasculi- te induzida por HIV, Alopecia areata, morfeia de esclerose sistêmica e síndrome do antifosfolipídeo primário.

46. Uso, de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracteri- zado pelo fato de que a proteína enxertada com anticorpo-citocina é administrada em combinação com outro agente terapêutico.