BR112015011011A2 - cromatografia por troca de íon com gradiente de ph mediada por força iônica - Google Patents

Abstract

resumo patente de invenção: "cromatografia por troca de íon com gradiente de ph mediada por força iônica". a presente invenção refere-se a métodos para analisar composições de polipeptídeos tais como anticorpos pela cromatografia de troca de íon com gradiente de ph mediada pela força iônica. em alguns aspectos, os métodos usam uma combinação de gradientes de ph e gradientes de força iônica para separar o polipeptídeo de variantes de carga do polipeptídeo. em alguns aspectos, os métodos usam uma força iônica estável para otimizar a janela de separação pelo gradiente de ph para separar o polipeptídeo das variantes de carga. tais métodos são úteis para analisar o polipeptídeo, por exemplo, anticorpos, com um pi maior do que 9 ou um pi menor do que 7. em alguns aspectos, a invenção fornece um método para múltiplos produtos para analisar os polipeptídeos de pi's variáveis. 1/1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA ANALISAR UMA COMPOSIÇÃO ATRAVÉS DA CROMATOGRAFIA POR TROCA DE ÍON COM GRADIENTE DE pH MEDIADA POR FORÇA ÍÔNICA.

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se a métodos para analisar preparações de polipeptídeos que usam a cromatografia por troca íônica com gradiente de pH mediada por força íônica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Proteínas como os anticorpos monoclonais (mAbs) possuem a maioria dos aminoácidos carregados e polares na superfície em um ambiente aquoso (Barlow, DJ and Thornton, JM (1986) Biopolymers 25:1717). Devido à interação molecular com os componentes da solução, os resíduos da superfície podem sofrer múltiplas modificações químicas e enzimáticas, que levam a uma mistura heterogênea de variantes de proteína com diferenças discretas sobre suas superfícies eletrostáticas (Dick, LW etal., (2009) J. Chromatogr. B 877:3841; Liu, HW etal., (2008) Rapid Commun. Mass Spectrom. 22:4081; Miller, AK, et al., (2011) J. Pharm. Sei. 100:2543; Wang, WR etal., (2011) Mol. Immunol. 48:860). A cromatografia por troca de ion (CEC) é considerada ser o padrão ouro para configurar a heterogeneidade de carga de terapêuticos de proteína de acordo com uma revisão recente de Vlasak, J and lonescu, R (2008 Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468. O método de separação sensível à carga é tipicamente requerido pelas agências reguladoras para assegurar a consistência da produção durante a fabricação e para monitorar o nível de degradação de terapêuticos de proteína (Miller, AK, et al., (2011) J. Pharm. Sei. 100:2543; He, XPZ (2009) Electrophoresis 30:714; Sosic, Z etal., (2008) Electrophoresis 29:4368; Kim, J etal.,(2010) J. Chromatogr. B 878:1973: Teshima, G etal., (2010) J. Chromatogr. A 1218:2091).

[003] Os métodos de cromatografia analítica por troca de íon

Petição 870160066704, de 11/11/2016, pág. 4/15

2/133 (IEC) que usam um gradiente de pH têm surgido como técnicas alternativas à IEC com gradiente de sal convencional para a caracterização da heterogeneidade da carga de proteínas terapêuticas (Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846; Tsonev, LI and Hirsh, AG (2008) J. Chromatogr. A 1200:166; Nordborg, A et al., (2009) J. Sep. Sei. 32:2668; Rozhkova, A (2009) J. Chromatogr. A 1216:5989; Rea, JC et al. (2010) J. Pharm. Biomed. Anal. 54:317). Nessa técnica, as proteínas que são tipicamente carregadas em uma fase estacionária de troca de íon são eluídas pelo aumento do pH da fase móvel. Foi demonstrado recentemente que um método de IEC com gradiente de pH (pH-IEC) com uma janela de pH relativamente ampla de 6,0 a 9,5 não apenas forneceu uma resolução melhor do que a IEC com gradiente de sal tradicional, mas também ofereceu uma capacidade de múltiplos produtos através da análise de 12 anticorpos monoclonais (mAbs) com pl entre 7,3 a 9,0 (Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846). Esse método de pH-IEC também é altamente tolerante a uma matriz de amostra com forças iônicas variadas (0 a 250 mM NaCI) e valores de pH (5,0 a 8,5) (Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846). Adicionalmente, o método de pH-IEC relatado não é evidentemente impactado pelo comprimento e química da coluna e a separação rápida com uma coluna mais curta pode ser obtida para aperfeiçoar o rendimento da análise da variante de proteína. De acordo com um recente relato de validação (Rea, JC et al. (2010) J. Pharm. Biomed. Anal. 54:317), o método de pH-IEC desenvolvido tem mostrado excelente precisão em diferentes condições cromatográficas e boa linearidade em diferentes cargas de coluna. Portanto, o método de pH-IEC relatado é adequado para o teste de rotina na indústria de biotecnologia.

[004] Apesar de várias vantagens, o método de pH-IEC relatado foi pretendido primariamente para mAbs com valores de pl na faixa

3/133 estudada de 7,3 a 9,0. O fato de que o perfil de eluição de um mAb pode variar com diferentes composições e concentrações de tampão e os valore de pH nos quais os mAbs eluem, indicam que a IEC com gradiente de pH envolve um mecanismo de eluição com força iônica e gradiente de pH combinados (Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846). Isso também é consistente com o relato de Anderson e colaboradores sobre a cromatografia por troca de ânion com gradiente de pH (pH-AIEC) (Anderson, DJ and Shan, L (2001) Clin. Chem. 47:128; Shan, L and Anderson, DJ (2001) J. Chromatogr. A 909:191; Shan, L and Anderson, DJ (2002) Anal. Chem. 74:5641). Com um número crescente de mAbs em fase de desenvolvimento na indústria biotecnológica, especialmente mais mAbs com pl baixa que mostram meia-vida potencialmente mais longa com base em estudos em animais (Igawa, T. (2010) Protein Eng. Des. Sei. 23:385), há uma necessidade de expandir a aplicabilidade de métodos de pH-IEC para uma faixa mais ampla de mAbs terapêuticos.

[005] Todas as referências aqui citadas, incluindo pedidos de patente e publicações estão incorporadas pela referência em sua totalidade.

BREVE SUMÁRIO [006] A invenção fornece um método para analisar uma composição que compreende o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, o método compreendendo a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, em que o tampão de carregamento está em um primeiro pH e compreende uma primeira força iônica; b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição está alterada em um gradiente de força iônica,

4/133 em que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica; c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes. Em algumas modalidades da invenção, os polipeptídeos com pl que variam entre 6,0 a

9,5 podem ser analisados usando os mesmos métodos.

[007] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo ou uma imunoadesina ou um fragmento desses. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento. Em modalidades adicionais, o anticorpo é um anticorpo humano. Em outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de anticorpo.

[008] Em algumas modalidades das modalidades acima, o contaminante é uma variante do polipeptídeo. Em modalidades adicionais, o contaminante é um produto de degradação do polipeptídeo.

[009] Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl maior do que cerca de 9,0. Em modalidades adicionais, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de cátion. Em modalidades adicionais, o material de cromatografia por troca de cátion é um material de cromatografia sulfonado ou um material de cromatografia carboxilado.

[0010] Em modalidades adicionais de qualquer uma das modalidades acima, o gradiente de pH é um gradiente linear. Em outras modalidades de qualquer uma das modalidades acima, o gradiente de pH é um gradiente em etapas. Em modalidades adicionais, o gradiente de pH compreende um aumento de cerca de pH 5 a cerca de pH 11. Em algumas modalidades das modalidades acima, o gradiente de pH é gerado usando um ou mais tampões. Em modalidades adicionais, o um ou mais tampões são de piperazina, imidazol, tris, fosfato ou CAPS.

5/133 [0011] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, o gradiente de força iônica é um gradiente linear. Em outras modalidades, o gradiente de força iônica é um gradiente em etapas. Em algumas modalidades, o gradiente de força iônica compreende um aumento na concentração de sal de cerca de 0 mM a cerca de 200 mM. Em modalidades adicionais, o gradiente de força iônica é um gradiente de NaCI, um gradiente de KCI ou um gradiente de Na₂SO₄.

[0012] Em algumas modalidades das modalidades acima, o polipeptídeo tem um pl menor do que cerca de 7,0. Em modalidades adicionais, o material de cromatografia é um material para cromatografia por troca de ânion. Em modalidades adicionais, o material para cromatografia por troca de ânion é um material para cromatografia de amina quaternária ou um material para cromatografia de amina terciária. Em algumas modalidades, o gradiente de pH é um gradiente linear. Em outras modalidades, o gradiente de pH é um gradiente em etapas. Em algumas modalidades, o gradiente de pH compreende uma diminuição de cerca de pH 8 a cerca de pH 5. Em algumas modalidades, o gradiente de pH é gerado usando um ou mais tampões. Em modalidades adicionais, o um ou mais tampões são de piperazina, imidazol ou Tris. Em algumas modalidades, o gradiente de força iônica é um gradiente linear. Em outras modalidades, o gradiente de força iônica é um gradiente em etapas. Em algumas modalidades, o gradiente de força iônica compreende um aumento na concentração de sal de cerca de 0 mM a cerca de 200 mM. Em algumas modalidades adicionais, o gradiente de força iônica é um gradiente de NaCI, um gradiente de KCI ou um gradiente de Na₂SO₄.

[0013] Em alguns aspectos, a invenção fornece um método para analisar uma composição que compreende o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, o método compreendendo a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca

6/133 de ion usando um tampão de carregamento, em que o tampão de carregamento está em um pH inicial e compreende uma força iônica inicial; b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e em que a força iônica do tampão de eluição é essencialmente a mesma força iônica do tampão de carregamento, em que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pelo gradiente de pH em cerca da força iônica inicial; c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes. Em algumas modalidades da invenção, polipeptídeos com pl que variam entre 6,0 a 9,5 podem ser analisados usando essencialmente os mesmos métodos.

[0014] Em algumas modalidades do aspecto acima, o polipeptídeo é um anticorpo ou uma imunoadesina ou um fragmento desses. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento. Em modalidades adicionais, o anticorpo é um anticorpo humano. Em outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de anticorpo.

[0015] Em algumas modalidades do aspecto acima, o contaminante é uma variante do polipeptídeo. Em modalidades adicionais, o contaminante é um produto de degradação do polipeptídeo.

[0016] Em algumas modalidades do aspecto acima, o polipeptídeo tem um pl maior do que cerca de 9,0. Em modalidades adicionais, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de cátion. Em modalidades adicionais, o material de cromatografia por troca de cátion é um material de cromatografia sulfonado ou um material de cromatografia carboxilado.

[0017] Em modalidades adicionais do aspecto acima, o gradiente de pH é um gradiente linear. Em outras modalidades, o gradiente de

7/133 pH é um gradiente em etapas. Em algumas modalidades, o gradiente de pH compreende um aumento de cerca de pH 5 a cerca de pH 11. Em algumas modalidades, o gradiente de pH é gerado usando um ou mais tampões. Em modalidades adicionais, o um ou mais tampões são de piperazina, imidazol, tris, fosfato ou CAPS.

[0018] Em algumas modalidades das modalidades acima, a força iônica do tampão de eluição está de cerca de 0 mM a cerca de 100 mM. Em modalidades adicionais, o tampão de eluição compreende cerca de 0 mM de NaCI a cerca de 100 mM de NaCI, cerca de 0 mM de KCI a cerca de 100 mM de KCI ou cerca de 0 mM de Na₂SO₄ a cerca de 100 mM de Na₂SO₄.

[0019] Em algumas modalidades das modalidades acima, o polipeptídeo tem um pl menor do que cerca de 7,0. Em modalidades adicionais, o material de cromatografia é um material para cromatografia por troca de ânion. Em modalidades adicionais, o material para cromatografia por troca de ânion é um material para cromatografia de amina quaternária ou um material para cromatografia de amina terciária. Em algumas modalidades das modalidades acima, o gradiente de pH é um gradiente linear. Em outras modalidades, o gradiente de pH é um gradiente em etapas. Em algumas modalidades das modalidades acima, o gradiente de pH compreende uma diminuição de cerca de pH 8 a cerca de pH 5. Em algumas modalidades, o gradiente de pH é gerado usando um ou mais tampões. Em modalidades adicionais, o um ou mais tampões são de piperazina, imidazol ou Tris. Em algumas modalidades, a força iônica do tampão de eluição de cerca de 0 mM a cerca de 100 mM. Em modalidades adicionais, o tampão de eluição compreende cerca de 10 mM de NaCI a cerca de 100 mM de NaCI.

[0020] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a análise é por cromatografia líquida de alto desempenho.

[0021] Em alguns aspectos, a invenção fornece um método para a

8/133 determinação da pureza de um polipeptídeo em uma composição, que compreende analisar a composição de acordo com qualquer um dos métodos das modalidades acima e determinar a proporção de polipeptídeo para os contaminantes na composição.

[0022] Em alguns aspectos, a invenção fornece um método para determinar a estabilidade de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo, o método compreendendo a) incubar a composição que compreende o polipeptídeo de 0^QC a 40^QC por uma a seis semanas, b) analisar a composição da etapa a) por qualquer um dos métodos das modalidades 1 a 63 e c) determinar a proporção de variantes para o polipeptídeo na composição, em que um aumento na proporção de variantes para o polipeptídeo na composição comparada com uma composição que não foi incubada indica a degradação do polipeptídeo na composição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0023] A Figura 1 mostra os perfis de heterogeneidade de carga de três anticorpos monoclonais com pis diferentes (mAb1, mAb2 e mAb3) obtidos com um método de cromatografia por troca de ion (IEC) com gradiente de pH.

[0024] A Figura 2 mostra os perfis de força iôníca e de pH na saída da coluna (painel A) e a coluna de pressão retrógrada no gradiente de pH (painel B) antes da otimização e os perfis de força iôníca e de pH na saída da coluna (painel C) e a coluna de pressão retrógrada no gradiente de pH (painel D) depois da otimização. Os perfis de pH e perfis de condutividade de modelo e experimentais são mostrados nos painéis A e C.

[0025] A Figura 3 mostra os cromatogramas de pH IEC mediada pela força iôníca de mAb1 (painel A) e mAb2 (painel B) obtidos com quatro concentrações diferentes de tampão. A largura total à meia altura (FWHM) do pico principal nos cromatogramas está representada em

9/133 gráfico contra a concentração de tampão (painel C) e a concentração de sal (painel D).

[0026] A Figura 4 mostra os perfis de heterogeneidade de carga obtidos com IEC com gradiente de pH mediada por força iônica de dezesseis anticorpos monoclonais com pl variando entre 6,2 a 9,4. O inserto mostra um gráfico de valores nominais do pH representados em gráfico contra o pH da eluição.

[0027] A Figura 5 mostra os cromatogramas obtidos com IEC com gradiente de pH mediada por força iônica de mAb1 nativo (0 wk) e mAb1 estressado termicamente (3 wk e 6 wk a 40^QC).

[0028] A Figura 6 mostra cromatogramas de mAb1 com 10, 20, 50, 100 e 200 pg de carga de coluna obtidos com a IEC com gradiente de pH mediada por força iônica.

[0029] A Figura 7 mostra o tamponamento através de grupos funcionais de uma solução tampão de piperazina, imidazol e Tris (PIT) em um gradiente de pH semi-linear entre pH 6 a pH 9,5.

[0030] A Figura 8 mostra cromatogramas de mAbs com pl que variam entre pl 6,2 a pl 9,4 usando IEC mediada por força iônica. A coluna era Propac WCX-10, 4 x 250 mm.

[0031] A Figura 9 mostra que perfis similares são observados entre pH-IEC original e pH-IEC mediada por força iônica quando uma coluna de 4 x 250 mm é usada.

[0032] A Figura 10 mostra um modelo de gradiente de pH linear entre pH 6 a pH 11 usando fosfato para manter a condutividade conforme o pH aumenta.

[0033] A Figura 11 são gráficos que mostram que os perfis de pH observado (Painel A) e da condutividade (Painel C) são consistentes com as predições do modelo (Painéis B e D).

[0034] A Figura 12 mostra que corridas mais curtas são possíveis usando tampões de TPP. O cromatograma superior mostra os resulta

10/133 dos com uma coluna de 4 x 50 mm Propac WCX-10HT com um gradiente de 16 minutos e o cromatograma inferior mostra os resultados com uma coluna de 4 x 250 mm com um gradiente de 58 minutos.

[0035] A Figura 13 é um gráfico que demonstra o estado da carga de moléculas diferentes em pH diferentes usando uma ferramenta de modelagem que calcula a carga de anticorpos monoclonais com pl diferentes. A carga de um anticorpo monoclonal é neutra quando ela cruza o eixo de X. A janela de separação de pH-IEC adequada corresponde à faixa de pH onde a curva é relativamente plana.

[0036] A Figura 14 é um gráfico que mostra que em pl alta, as moléculas têm menos tempo para a resolução conforme o pH aumenta.

[0037] A Figura 15 mostra os resultados de um estudo para determinar a concentração ótima de sal para o melhor efeito de blindagem de carga de um anticorpo com um pl > 9,0. Concentrações de sal de 0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM e 50 mM foram testadas.

[0038] A Figura 16 mostra os resultados de um estudo para determinar as concentrações ótimas de sal para o melhor efeito de blindagem de carga de um anticorpo com um pl que varia entre 8,9 a 9,1.

[0039] A Figura 17 mostra os resultados de um estudo para determinar as concentrações ótimas de sal para o melhor efeito de blindagem de carga de um anticorpo com um pl que varia entre 7,6 a 8,7.

[0040] A Figura 18 é um gráfico que mostra que a adição de sal para proteger cargas adicionais move o estado da carga em uma janela de separação adequada.

[0041] A Figura 19 é um gráfico que mostra que o uso de um gradiente de pH superficial pode aperfeiçoar a resolução do pico usando um Mab com pl de 7,6. Os gradientes testados foram os seguintes: PIT (Tris 2,4 mM, imidazol 1,5 mM, piperazina 11,6 mM, pH 6-11); PIT mediado por sal (Tris 4 mM, imidazol 4 mM, piperazina 4 mM, pH 6-11, gradiente de NaCI de 0-16 mM); TPP mediado por sal (Tris 5 mM, pi

11/133 perazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 6-11, gradiente de NaCI de 0-30 mM); pH-IEC, TPP híbrido (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 6-9, 0 mM NaCI); TIC (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, CAPS 5 mM, pH 6-9, NaCI 10 mM). As corridas foram de 20 a 22 minutos.

[0042] A Figura 20 é um gráfico que mostra um gradiente de pH superficial pode aperfeiçoar a resolução do pico que usa um Mab com um pl de 8,6 a 9,3. Os gradientes testados foram os seguintes: PIT (Tris 2,4 mM, imidazol 1,5 mM, piperazina 11,6 mM, pH 6-11); PIT mediado por sal (Tris 4 mM, imidazol 4 mM, piperazina 4 mM, pH 5-11, NaCI 16 mM); TPP mediado por sal (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 6-11, gradiente de NaCI de 20 mM); TPP (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 6-9, gradiente de NaCI 20 mM); TIC (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, CAPS 5 mM, pH 7-10, NaCI 30 mM). As corridas foram de 20 a 22 minutos.

[0043] A Figura 21 é um gráfico que mostra um gradiente de pH superficial pode aperfeiçoar a resolução do pico que usa um Mab com um pl de 9,0. Os gradientes testados foram os seguintes: PIT (Tris 2,4 mM, imidazol 1,5 mM, piperazina 11,6 mM, pH 6-11); PIT mediado por sal (Tris 4 mM, imidazol 4 mM, piperazina 4 mM, pH 5-11, NaCI 16 mM); TPP mediado por sal (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 6-11, gradiente de NaCI de 20 mM); TPP (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 6-11, gradiente de NaCI 30 mM); TPP (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, fosfato 5 mM, pH 7-10, gradiente de NaCI 20 mM); TIC (Tris 5 mM, piperazina 5 mM, CAPS 5 mM, pH 7-10, NaCI 30 mM). As corridas foram de 20 a 22 minutos.

[0044] A Figura 22 é um gráfico que mostra que os tempos de corrida de quinze minutos são possíveis. O Mab tem um pl de 8,8. São mostrados dois cromatogramas, um com um gradiente de pH entre 6 e 10 em NaCI 20 mM em 22 minutos e um com um gradiente de pH entre 7 a 10 em NaCI 20 mM em 15 minutos.

12/133 [0045] A Figura 23 é um gráfico que mostra que os tempos de corrida de quinze minutos são possíveis. O Mab tem um pl de 9,0. São mostrados dois cromatogramas, um com um gradiente de pH entre 6 e 10 em NaCI 20 mM em 22 minutos e um com um gradiente de pH entre 7 a 10 em NaCI 20 mM em 15 minutos.

[0046] A Figura 24 é um gráfico que mostra cromatogramas superpostos da análise em duplicata de três anticorpos monoclonais na condição alvo.

[0047] A Figura 25 é um gráfico que mostra cromatogramas superpostos de Mab3 em diferentes condições cromatográficas. Os picos principais estão alinhados.

[0048] A Figura 26 é um gráfico de distribuição que mostra o efeito da concentração de sal sobre o desempenho cromatográfico. Os círculos representam o percentual do pico principal, os diamantes representam o percentual de variantes ácidas, x representa o percentual de variante básica, triângulos representam a resolução 1 e * representa a resolução 2.

[0049] A Figura 27 mostra os gráficos de distribuição que mostram os efeitos de outros parâmetros sobre o desempenho da cromatografia. No alto à esquerda é mostrado o efeito da concentração de tampão (mM). No alto a direita é mostrado o efeito do pH de partida. Embaixo à esquerda é mostrado o efeito da temperatura da coluna em ^QC. Embaixo à direita é mostrado o efeito da taxa de fluxo (ml/min).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0050] A invenção fornece métodos para analisar uma composição que compreende um polipeptídeo e um ou mais contaminantes, por exemplo, variantes de polipeptídeo, que compreende ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força iônica inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminan

13/133 tes do material de cromatografia de troca de ion usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição é alterado por um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição é alterada por um gradiente de força iônica tal que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material cromatográfico como entidades separadas distintas. Os métodos da invenção podem ser usados para analisar polipeptídeos com pontos isoelétricos que não estão na faixa neutra do pH. Em algumas modalidades, os métodos podem ser usados para separar efetivamente os polipeptídeos com pl maior do que 9 dos contaminantes. Em outras modalidades, os métodos podem ser usados para a separação efetiva de polipeptídeos com um pl menor do que 7 dos contaminantes. Em algumas modalidades, o método separa efetivamente um ou mais contaminantes do polipeptídeo, em que o polipeptídeo tem um pl que varia de cerca de 7,0 a cerca de 12. Em algumas modalidades, o método pode ser usado para separar efetivamente um ou mais contaminantes do polipeptídeo, em que o polipeptídeo tem um pl que varia de cerca de 7,0 a cerca de 12. Exemplos de polipeptídeos incluem, mas não são limitados a anticorpos e fragmentos de anticorpo. Exemplos de contaminantes incluem, mas não são limitados a variantes de anticorpo tais como variantes de carga de anticorpo.

[0051] Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para analisar uma composição que compreende um polipeptídeo e um ou mais contaminantes, por exemplo, variantes de polipeptídeo, que compreende ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força iônica inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes da coluna de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição é alterado por um gradiente de pH e a força iônica permanece essencialmente a mesma, tal

14/133 que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material de cromatografia como entidades distintas separadas. Os métodos da invenção podem ser usados para analisar polipeptídeos com pontos isoelétricos que não estão na faixa de pH neutro. Em algumas modalidades, os métodos podem ser usados para separar efetivamente os polipeptídeos com um pl maior do que 9 dos contaminantes. Em outras modalidades, os métodos podem ser usados para separar efetivamente os polipeptídeos com um pl maior do que 7 dos contaminantes. Exemplos de polipeptídeos incluem, mas não são limitados a anticorpos e fragmentos de anticorpo. Exemplos de contaminantes incluem, mas não são limitados a variantes de anticorpo tais como variantes de carga de anticorpo.

[0052] Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para analisar uma composição que compreende um polipeptídeo e um ou mais contaminantes, por exemplo, variantes de polipeptídeo, que compreende ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força iônica inicial, tal que o estado da carga do polipeptídeo na solução esteja dentro de uma janela de separação por troca de íon em gradiente de pH ótimo. O polipeptídeo e um ou mais contaminantes são então eluídos do material cromatográfico como entidades distintas separadas.

[0053] Em algumas modalidades da invenção, os contaminantes são variantes de carga de polipeptídeo que incluem variantes ácidas, isto é, variantes com um tempo de retenção menor do que aquele do pico principal no modo de troca de cátion. Exemplos de variantes ácidas incluem, mas não são limitadas a polipeptídeos onde um ou mais resíduos de glutamina e/ou asparagina tenham sido deamidados. Em algumas modalidades da invenção, os contaminantes são variantes de carga de polipeptídeo que incluem variantes básicas, isto é, variantes

15/133 com um tempo de retenção maior do que aquele do pico principal no modo de troca de cátion. Exemplos incluem, mas não são limitados a variantes onde um resíduo de ácido aspártico tenha sofrido modificação para uma porção de succinimida.

[0054] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para analisar uma composição que compreende um polipeptídeo e um ou mais contaminantes, em que essencialmente os mesmos métodos podem ser usados para analisar polipeptídeos com pl diferentes. Por exemplo, o método pode ser usado para analisar polipeptídeos com pl que variam entre 6,0 a 9,5. Em algumas modalidades, os polipeptídeos são anticorpos ou seus fragmentos. Em algumas modalidades, os contaminantes são variantes de anticorpo ou variantes de fragmentos de anticorpo. Em algumas modalidades, os contaminantes são variantes de carga de anticorpo ou variantes de carga de fragmentos de anticorpo. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para analisar composições de anticorpos ou de fragmentos de anticorpo quanto a presença de variantes de carga (por exemplo, variantes ácidas e/ou variantes básicas) em que o método pode ser usado para analisar composições diferentes que compreendem um anticorpo em que o anticorpo tem um pl que varia entre 6,0 a 9,5.

/. Definições [0055] A expressão polipeptídeo ou proteína são usadas alternativamente para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados e ele pode ser interrompido por não aminoácidos. As expressões também abrangem um polímero de aminoácidos que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como a conjugação com um componente de marcação.

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Também estão incluídos dentro da definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica. As expressões polipeptídeo e proteína como usadas aqui abrangem especificamente anticorpos.

[0056] A expressão variante de carga de polipeptídeo como usada aqui, se refere a um polipeptídeo que tenha sido modificado a partir de seu estado nativo tal que a carga do polipeptídeo esteja alterada. Em alguns exemplos, as variantes de carga são mais ácidas do que o polipeptídeo parental; isto é, possuem um pl menor do que do polipeptídeo parental. Em outros exemplos, as variantes de carga são mais básicas do que o polipeptídeo parental; isto é, possuem um pl maior do que do polipeptídeo parental. Tais modificações podem ser manipuladas ou o resultado de processos naturais tais como a oxidação, deamidação, processamento de resíduos de lisina C terminais, formação de piroglutamato N terminal e glicação. Em alguns exemplos, uma variante de carga do polipeptídeo é uma glicoproteína onde o glicano acoplado à proteína é modificado tal que a carga da glicoproteína está alterada comparada com a glicoproteína parental, por exemplo, pela adição de ácido siálico ou seus derivados. Uma variante de carga de anticorpo como usada aqui é um anticorpo ou seu fragmento em que o anticorpo ou seu fragmento estejam alterados.

[0057] Polipeptídeo purificado (por exemplo, anticorpo ou imunoadesina) significa que o polipeptídeo tem pureza aumentada, tal que ele existe em uma forma que é mais pura do que a existente em seu ambiente natural e/ou quando inicialmente sintetizado e/ou amplificado sob condições de laboratório. Pureza é uma expressão relativa e não significa necessariamente pureza absoluta.

[0058] A expressão antagonista é usada no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que bloqueia, inibe ou neutralize parcialmente

17/133 ou completamente uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo. De uma maneira similar, a expressão agonista é usada em seu sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que mimetize uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo. Moléculas agonistas ou antagonistas adequadas incluem especificamente anticorpos ou fragmentos de anticorpos agonistas ou antagonistas, fragmentos ou variantes de sequência de aminoácido de polipeptídeos nativos, etc. Métodos para a identificação de agonistas ou antagonistas de um polipeptídeo podem compreender contatar um polipeptídeo com um candidato a molécula de agonista ou de antagonista e medir uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas com o polipeptídeo.

[0059] Um polipeptídeo que se liga a um antígeno de interesse, por exemplo, um antígeno alvo de um polipeptídeo associado a um tumor, é aquele que se liga com afinidade suficiente tal que o polipeptídeo é útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico para atingir uma célula ou tecido que expressam o antígeno e que não interage significativamente com outros polipeptídeos. Em tais modalidades, a extensão da ligação do polipeptídeo a um polipeptídeo não alvo será menor do que cerca de 10% da ligação do polipeptídeo ao seu polipeptídeo alvo em particular como determinada pela análise de classificação celular ativada pela fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA).

[0060] Com relação à ligação de um polipeptídeo à uma molécula alvo, a expressão ligação específica ou se liga especificamente ou é específico para um polipeptídeo particular ou um epítopo sobre um polipeptídeo alvo particular significa uma ligação que é diferente de forma mensurável de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, pela determinação da ligação de uma molécula comparada com a ligação de uma molécula de controle,

18/133 que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada pela competição com uma molécula de controle que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Nesse caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado para uma sonda é competitivamente inibida pelo excesso de alvo não marcado.

[0061] A expressão anticorpo é usada aqui no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos e fragmentos de anticorpo desde que eles exibam a atividade biológica desejada. A expressão imunoglobulina (Ig) é usada alternativamente com anticorpo.

[0062] Anticorpos são moléculas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente que possuem estruturas variáveis, todas baseadas no enovelamento da imunoglobulina. Por exemplo, anticorpos IgG possuem duas cadeias pesadas e duas cadeias leves que são ligadas por dissulfeto para formar um anticorpo funcional. Cada cadeia pesada e leve por si só compreende uma região constante (C) e uma variável (V). As regiões V determinam a especificidade de ligação ao antígeno do anticorpo, enquanto que as regiões C forcem suporte estrutural e funcionam em interações específicas não antigênicas com efetores imunes. A especificidade de ligação ao antígeno de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo é a habilidade de um anticorpo de se ligar especificamente a um antígeno particular.

[0063] A especificidade de ligação ao antígeno de um anticorpo é determinada pelas características estruturais da região V. a variabilidade não é uniformemente distribuída através da extensão de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Ao invés disso, as regiões V consistem em fitas relativamente invariáveis chamadas de regiões estrutu

19/133 rais (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separados pelas regiões mais curtas de variabilidade extrema chamadas de regiões hipervariáveis que tem 9 a 12 aminoácidos de extensão cada uma. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem cada um quatro FRs, que adotam amplamente uma configuração de folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam alças que se conectam e, em alguns casos, formam parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (veja, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

[0064] Cada região V compreende tipicamente três regiões determinantes de complementaridade (CDRs, cada uma das quais contém uma alça hipervariável) e quatro regiões estruturais. Um sítio de ligação do anticorpo, a unidade estrutural mínima necessária para se ligar com afinidade substancial a um antígeno particular desejado, incluirá tipicamente as três CDRs e pelo menos três, preferivelmente quatro regiões estruturais intercaladas para manter e apresentar as CDRs na conformação apropriada. Anticorpos com quatro cadeias clássicos possuem sítios de ligação ao antígeno que são definidos pelos domínios de V_H e V_L em cooperação. Certos anticorpos, tais como anticorpos de camelo e de tubarão, carecem de cadeias leves e dependem dos sítios de ligação formados apenas pelas cadeias pesadas. Imunoglobulinas manipuladas de domínio único podem ser preparadas nas quais os sítios de ligação são formados pelas cadeias pesadas ou ca20/133 deias leves apenas, na ausência de cooperação entre V_He V_L.

[0065] A expressão variável se refere ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem intensamente na sequência entre anticorpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular por seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída através dos domínios variáveis dos anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos chamados de regiões hipervariáveis em ambos os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de regiões estruturais (FRs). Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem cada um quatro FRs, que adotam amplamente uma configuração de folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam alças que se conectam e, em alguns casos, formam parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (veja, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

[0066] A expressão região hipervariável quando usada aqui se refere aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável pode compreender resíduos de aminoácidos de uma região determinante de complementaridade ou CDR (por exemplo, em torno de cerca dos resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) na V_L, e em torno de cerca de 31-35B (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) na V_H (Kabat et al., Sequences

21/133 of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma alça hipervariável (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) na V_L, e 26-32 (H1), 52A-55 (H2) e 96-101 (H3) na V_H (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

[0067] Resíduos estruturais ou FR são aqueles resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável como aqui definidos.

[0068] Fragmentos de anticorpo compreendem uma porção de um anticorpo intacto, que compreende preferivelmente a região de ligação ao antígeno desse, Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')₂, e Fv; diacorpos; diacorpos em tandem (taDb), anticorpos lineares (por exemplo, Patente U.S. No. 5.641.870, Exemplo 2; Zapata et a!., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); anticorpos com um braço, anticorpos com domínio variável simples, minibodies, moléculas de anticorpo de cadeia simples; anticorpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticorpo (por exemplo, incluindo, mas não limitados a Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv, ou (di,tri)-scFv) em tandem; e Bi-specific T-cell engagers (BiTEs).

[0069] A digestão pela papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados de fragmentos Fab, cada um com um sítio de ligação ao antígeno único e um fragmento Fc residual, cujo nome reflete sua habilidade para cristalizar prontamente. O tratamento pela pepsina fornece um fragmento F(ab')₂ que tem dois sítios de ligação ao antígeno e ainda é capaz de interligar com o antígeno.

[0070] Fv é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio de reconhecimento do antígeno e um de ligação ao antígeno completos. Essa região consiste em um dímero de um domínio variável de

22/133 cadeia pesada e um de cadeia leve em associação íntima, covalente. É nessa configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno sobre a superfície do dímero de V_H-V_L. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem a especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo. Entretanto, até um domínio variável único (ou metade de um Fv que compreenda apenas três regiões hipervariáveis específicas para o antígeno) tem a habilidade de reconhecer e de se ligar ao antígeno, embora com menor afinidade do que o sítio de ligação completo.

[0071] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na terminação carbóxi do domínio CH1 da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região da dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação para Fab' no qual o resíduo de cisteína dos domínios constantes carregam pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')₂ originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem dobradiças de cisteína entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são conhecidos.

[0072] As cadeias leves dos anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser designadas para um de dois tipos claramente distintos, chamados de kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[0073] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos podem ser designados em classes diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias dessas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3,

23/133 lgG4, IgA, e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamados de α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As estruturas da subunidade e as configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[0074] Fragmentos de anticorpo Fv de cadeia simples ou scFv compreendem os domínios V_H e V_L do anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um ligante peptídico entre os domínios V_H e V_L o que possibilita que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv, veja Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[0075] A expressão diacorpos se refere a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (V_H) conectado a um domínio variável de cadeia leve (V_L) na mesma cadeia de polipeptídeo (V_H - V_L). Pelo uso de um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

[0076] A expressão anticorpo multiespecífico é usada no sentido mais amplo e abrange especificamente um anticorpo que tem especificidade poliepitópica. Tais anticorpos multiespecíficos incluem, mas não são limitados a um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada (V_H) e um domínio variável de cadeia leve (V_L), onde a unidade V_H V_L tem especificidade poliepitópica, anticorpos que

24/133 têm dois ou mais domínios V_H e V_L, com cada unidade V_H V_L se ligando a um epítopo diferente, anticorpos que possuem dois ou mais domínios variáveis únicos com cada domínio variável único se ligando a um epítopo diferente, anticorpos de extensão completa, fragmentos de anticorpo tais como Fab. Fv. dsFv, scFv, diacorpos, diacorpos biespecíficos, triacorpos, anticorpos tri-funcionais, fragmentos de anticorpo que tenham sido ligados covalentemente ou não covalentemente. Especificidade poliepitópica se refere à habilidade de se ligar especificamente a dois ou mais epítopos diferentes sobre os mesmos ou sobre alvos diferentes. Monoespecífico se refere à habilidade de se ligar apenas sobre um epítopo. De acordo com uma modalidade, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo IgG que se liga a cada epítopo com uma afinidade de 5 μΜ a 0,001 pM, 3 μΜ a 0,001 pM, 1 μΜ a 0,001 pM, 0,5 μΜ a 0,001 pM, ou 0,1 μΜ a 0,001 pM.

[0077] A expressão anticorpos de domínio único (sdAbs) ou anticorpos de domínio variável único SVD) geralmente se refere a anticorpos nos quais um único domínio variável (VH ou VL) pode conferir a ligação ao antígeno. Em outras palavras, o domínio variável único não precisa interagir com outro domínio variável a fim de reconhecer o antígeno alvo. Exemplos de anticorpo de domínio único incluem aqueles derivados de camelídeos (lhamas e camelos) e de peixes cartilaginosos (por exemplo, tubarão-lixa) e aqueles derivados de métodos recombinantes entre anticorpos de humanos e de camundongo (Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870).

[0078] A expressão anticorpo monoclonal como usada aqui se refere a um anticorpo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, isto é, os anticorpos individuais que compre

25/133 endem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis variantes que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes estando presentes geralmente em quantidades pequenas. Em contraste com as preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal está direcionado contra um único determinante sobre o antígeno. Em adição a sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos já que eles não estão contaminados por outras imunoglobulinas. O modificador monoclonal indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser considerado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com os métodos fornecidos aqui podem ser feitos pelo método do hibridoma descrito primeiro por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser feitos pelos métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 4.816.567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de fago usando as técnicas descritas em Clackson et a!., Nature 352:624-628 (1991) e Marks et a!., J. Mol. Biol. 222:581597 (1991), por exemplo.

[0079] Os anticorpos monoclonais incluem especificamente anticorpos quiméricos (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de ou outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a ativida

26/133 de biológica desejada (Patente U.S. No. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse incluem anticorpos primatizados que compreendem sequências que se ligam ao antígeno do domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macacos do Velho Mundo, tais como babuíno, macaco rhesus ou cynomolgus) e sequências da região constante humana (Patente U.S. No. 5.693.780).

[0080] Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, de murino) são anticorpos quiméricos que contém uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Na grande maioria, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos pelos resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou um primata não humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, os resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá todo de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem aquelas de uma imunoglobulina não humana e todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana, exceto pelas substituições de FR como observado acima. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, veja Jones et al.,

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Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

[0081] Para os propósitos desse, um anticorpo intacto é aquele que compreende os domínios variáveis pesado e leve assim como uma região Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes da sequência nativa (por exemplo, domínios constantes da sequência nativa humana) ou a sequência de aminoácidos variante desses. Preferivelmente, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efetoras.

[0082] Anticorpos nativos são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas com cerca de 150.000 daltons, compostos por duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada pela ligação de dissulfeto covalente, enquanto que o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes de dissulfeto intra-cadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (V_H) seguido por vários domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (V_L) e um domínio constante na outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável de cadeia pesada. Resíduos de aminoácidos particulares são considerados formar uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada.

[0083] Um anticorpo nu é um anticorpo (como definido aqui) que não está conjugado a uma molécula heteróloga, tal como uma porção citotóxica ou radiomarcador.

[0084] Em algumas modalidades, as funções efetoras do anticorpo se referem aquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc

28/133 (uma sequência nativa da região Fc ou uma variante da sequência de aminoácidos da região Fc) de um anticorpo e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras do anticorpo incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente de anticorpo; ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular.

[0085] A citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo e ADCC se referem a uma reação mediada por célula na qual as células citotóxicas não específicas que expressam os receptores Fc (FCrs) (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) que reconhecem o anticorpo ligado sobre uma célula alvo e, subsequentemente, causam a lise da célula alvo. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto que os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro tal como aquele descrito na Patente U.S. No. 5.500.362 ou 5.821.337 pode ser realizado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele descrito em Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 95:652-656 (1998).

[0086] Células efetoras humanas são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Em algumas modalidades, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam a função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam

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ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células Natural Killer (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas.

[0087] Citotoxicidade dependente do complemento ou CDC se refere a habilidade de uma molécula para lisar um alvo na presença do complemento. A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo, polipeptídeo) (por exemplo, um anticorpo)) complexada com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado.

[0088] As expressões receptor Fc ou FcR são usadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, o FcR é um FcR da sequência humana nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui os receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas com splice alternativo desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (receptor de ativação) e FcyRIIB (um receptor de inibição), que possuem sequências de aminoácidos similares que diferem primariamente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação baseado em imunoreceptor de tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado em imunoreceptor de tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático (veja Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs são revistos em Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:2534 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, estão

30/133 abrangidos pela expressão FcR. A expressão também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

[0089] Contaminantes se referem a materiais que são diferentes do produto de polipeptídeo desejado. Em algumas modalidades da invenção, os contaminantes incluem variantes de carga do polipeptídeo. Em algumas modalidades da invenção, os contaminantes incluem variantes de carga de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades da invenção, os contaminantes incluem, sem limitação: materiais da célula hospedeira, tal como CHOP; Proteína A lixiviada; ácido nucleico; uma variante, fragmento, agregado ou derivado do polipeptídeo desejado; outro polipeptídeo; endotoxina; contaminante viral; componente do meio de cultura celular, etc. Em alguns exemplos, o contaminante pode ser uma proteína da célula hospedeira (HCP) de, por exemplo, mas não limitado a uma célula bacteriana tal como uma célula de E. coll, uma célula de inseto, uma célula procariótica, uma célula eucariótica, uma célula de levedura, uma célula de mamífero, uma célula de ave, uma célula de fungo.

[0090] Como usada aqui, a expressão imunoadesina designa moléculas semelhantes a anticorpo que combinam a especificidade de ligação de um polipeptídeo heterólogo com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é diferente do sítio de reconhecimento e de ligação de um anticorpo (isto é, é heterólogo) e uma sequência do domínio constante de imunoglobulina. A parte de adesina de uma molécula de imunoadesina tipicamente é uma sequência de aminoácidos contígua que compreende pelo menos o sítio de ligação de um receptor ou um ligante. A sequência do domínio

31/133 constante da imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos lgG-1, lgG-2, lgG-3, ou lgG-4, IgA (incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM.

[0091] Como usado aqui, essencialmente o mesmo indica que um valor ou parâmetro não foi alterado por um efeito significativo. Por exemplo, uma força iônica de uma fase móvel de cromatografia na saída da coluna é essencialmente a mesma que a força iônica inicial da fase móvel, se a força iônica não se alterou significativamente. Por exemplo, a força iônica na saída da coluna que é 10%, 5% ou 1% da força iônica inicial é essencialmente a mesma como a força iônica inicial.

[0092] A referência a cerca de um valor ou parâmetro inclui (e descreve) variações que são direcionadas para aquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição que se refere a cerca de X inclui a descrição de X.

[0093] Como usado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular um/uma ou e o/a incluem referencias no plural a menos que o contexto dite claramente de outra maneira. É compreendido que aspectos e variações da invenção descrita aqui incluem consistindo e/ou consistindo essencialmente em aspectos e variações.

II. Métodos de Cromatografia [0094] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para analisar composições que compreendem um polipeptídeo e um ou mais contaminantes, por exemplo, variantes de carga de polipeptídeo, compreendendo ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, com um pH inicial e uma força iônica inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e a força iônica do

32/133 tampão de eluição está alterada em um gradiente de força iônica, tal que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes eluem do material de cromatografia como entidades separadas distintas.

[0095] Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para analisar composições que compreendem um polipeptídeo e um ou mais contaminantes, por exemplo, variantes de polipeptídeo, que compreendem ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, com um pH inicial e uma força iônica inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição está alterada em um gradiente de força iônica, tal que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material de cromatografia como entidades separadas distintas.

[0096] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos aqui, o material de cromatografia é um material de troca de cátion. Em algumas modalidades, o material de troca de cátion é uma fase sólida que é negativamente carregada e tem cátions livres para troca com cátions em uma solução aquosa passada sobre ou através a fase sólida. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o material de troca de cátion pode ser uma membrana, um monólito ou resina. Em algumas modalidades, o material de troca de cátion pode ser uma resina. O material de troca de cátion pode compreender um grupo funcional de ácido carboxílico ou um grupo funcional de ácido sulfônico tal como, mas não limitado a sulfonate, carboxílico, ácido carboximetil sulfônico, sulfoisobutila, sulfoetila, carboxila, sulfopropila, sulfonila, sulfoxietila ou ortofosfato. Em algumas modalidades acima, o material de cromatografia de troca de cátion é uma coluna de cromatografia de troca de cátion. Em algumas modali

33/133 dades, um material de cromatografia de troca de cátion é usado para um polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento com um pl maior do que cerca de 9. Por exemplo, o anticorpo ou seu fragmento pode ter um pl de 9-10,9-11, 10-11,9-12, 10-12, ou 11-12.

[0097] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o material de cromatografia é um material de troca de ânion. Em algumas modalidades, o material de troca de ânion é uma fase sólida que é positivamente carregada e tem ânions livres para troca com ânions em uma solução aquosa passada sobre ou através a fase sólida. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o material de troca de ânions pode ser uma membrana, um monólito ou resina. Em algumas modalidades, o material de troca de ânions pode ser uma resina. O material de troca de ânions pode compreender uma amina primária, uma amina secundária, uma amina terciária ou um grupo funcional de íon de amônia quaternária, um grupo de poliamina funcional ou um grupo funcional de dietilaminoetila. Em algumas modalidades acima, o material de cromatografia de troca de ânion é uma coluna de cromatografia de troca de ânion. Em algumas modalidades, um material de cromatografia de troca de ânions é usado para um polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento com um pl menor do que cerca de 7. Por exemplo, o anticorpo ou seu fragmento pode ter um pl de 6-7, 5-7, 5-6, 4-7, 4-6, ou 4-5.

[0098] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o material de troca de íon pode utilizar um material de cromatografia convencional ou um material de cromatografia por convecção. Os materiais cromatográficos convencionais incluem, por exemplo, materiais de perfusão (por exemplo, uma resina de poli(estireno-divinilbenzeno) e materiais de difusão (por exemplo, resina de agarose reticulada). Em algumas modalidades, a resina de poli(estireno-divinilbenzeno) pode ser uma resina Poros. Em algumas

34/133 modalidades, a resina de agarose reticulada pode ser uma resina de sulfopropil-Sepharose Fast Flow (SPSFF). O material de cromatografia por convecção pode ser uma membrana (por exemplo, polietersulfona) ou um material monolítico (por exemplo, um polímero reticulado). A membrana de polietersulfona pode ser Mustang. O material monolítico de polímero reticulado pode ser poli(metacrilato de glicidila-codimetacrilato de etileno).

[0099] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, o material de cromatografia é uma coluna de cromatografia; por exemplo, uma coluna de cromatografia de troca de cátion ou uma coluna de cromatografia de troca de ânion. Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia é usada para cromatografia líquida. Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia é usada para cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia é uma coluna de cromatografia HPLC; por exemplo, uma coluna de HPLC por troca de cátion ou uma coluna de HPLC por troca de ânion.

[00100] Exemplos de materiais para troca de cátion são conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a Mustang S, Sartobind S, SO3 Monolith, S Ceramic HyperD, Poros XS, Poros HS50, Poros HS20, SPSFF, SP-Sepharose XL (SPXL), CM Sepharose Fast Flow, Capto S, Fractogel Se HiCap, Fractogel SO3, ou Fractogel COO. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, o material de troca de cátion é Poros HS50. Em algumas modalidades a resina Poros HS pode ser de partículas de Poros HS 50 μ ou Poros HS 20 μ. Exemplos de colunas de cromatografia por troca de cátion para uso nos métodos da invenção incluem, mas não são limitadas a ProPac WCX-10 e ProPac WCX-10HT.

[00101] Exemplos de materiais de troca de ânion são conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a Poros HQ 50, Poros Pl

35/133

50, Poros D, Mustang Q, Q Sepharose FF, e DEAE Sepharose. Exemplos de colunas de cromatografia por troca de ânion para uso nos métodos da invenção incluem, mas não são limitadas a Dionex ProPac 10 SAX e Tosoh GSKgel Q STAT 7 μΜ WAX.

[00102] Um procedimento de HPLC exemplificador que pode ser usado para os métodos da invenção é como a seguir; entretanto, os métodos da invenção não são interpretados como estando ligados por esses procedimentos. As amostras são adicionadas a um autoamostrador e são refrigeradas (5 ± 3^QC). As colunas são colocadas no compartimento da coluna e uma característica de controle de temperatura pode ser empregada para manter a temperatura do compartimento dentro de uma faixa estreita (± 1^QC) a partir do ponto de ajuste durante a análise. O efluente da coluna é monitorado a 280 nm.

[00103] As amostras são diluídas com fase móvel até a concentração do polipeptídeo alvo de aproximadamente 1 a 2 mg/mL. Em algumas modalidades, o polipeptídeo pode ser digerido com carboxipeptidase B (CpB), adicionada em uma proporção de 1:100 (p/p) e incubada a 37^QC por 20 min. As amostras podem ser armazenadas a 5^QC até a análise.

[00104] O instrumento pode incluir uma bomba de gradiente quaternário de baixa pressão, um auto-amostrador de separação rápida com capacidade de controle de temperatura, um compartimento de coluna com temperatura controlada e um detector de UV de arranjo de diodo. Na saída do detector, um PCM-3000 pH e um monitor de condutividade podem ser conectados para coletar o pH e os dados da condutividade em tempo real. O controle do instrumento, aquisição de dados e análise de dados podem ser realizados, por exemplo, pelo uso do programa Thermo Scientific Dionex Chromeleon, versão 6.8.

[00105] Exemplos não limitantes de preparações de fase móvel são os seguintes. Soluções estoque de tampão individuais de tris e imi

36/133 dazol são preparadas a 1,0 M e uma solução de CAPS é preparada em uma concentração de 0,1 M sem ajuste de pH e armazenadas em temperatura ambiente. Os componentes individuais são diluídos até uma concentração final de 10 mM em aproximadamente 90% do volume alvo usando água deionizada e deixados misturar. Uma vez que a solução tenha atingido o volume final, a mistura é dividida em duas alíquotas iguais.

[00106] Os valores de pH dos tampões são ajustados com ácido clorídrico para 6,0 (Tampão A) e com hidróxido de sódio para 11,0 (Tampão B). O cloreto de sódio é preparado como uma solução 0,1 M com água deionizada (Tampão C). Água MilliQ (18 MOhms) é vertida em um recipiente separado (Tampão D). Todas as fases móveis são então individualmente filtradas através de um filtro de nylon de 0,2 pm antes do uso.

[00107] Um exemplo não limitante de cromatografia de troca de cátion é o seguinte. Amostras de anticorpo monoclonal são diluídas para 1 mg/mL com uma mistura 1:1 de tampões A e D e são mantidas a 5±3^QC no auto-amostrador. Uma coluna Propac WCX-10HT, 4 x 50 mm é colocada no compartimento da coluna com a temperatura ajustada em 40±1^QC. Para cada corrida cromatográfica, 20 μΙ_ de proteína (20 pg) são injetados. A taxa de fluxo da fase móvel é de 1,0 mL/min. As proteínas são detectadas pela absorbância com ultravioleta (UV) a 280 nm.

[00108] Em alguns exemplos, um gradiente híbrido de pH é estabelecido pelo uso de um gradiente quaternário formado sobre a bomba quaternária usando os tampões A, B, C e D. Esse arranjo fornece a flexibilidade para ajustar 1) o pH de partida e final, usando tampões A e B e 2) a quantidade de sal para cada ingrediente, usando os tampões C e D. Por exemplo, um gradiente de pH entre 6 a 10 com uma concentração de sal constante de 10 mM é estabelecido pelo aumento

37/133 do tampão B entre 0 a 40%, enquanto os tampões C e D são mantidos em 10% e 40%, respectivamente. Exemplos de gradientes híbridos são fornecidos na Tabela 2 nos exemplos abaixo.

[00109] Vários tampões podem ser empregados dependendo, por exemplo, do pH desejado do tampão, da condutividade desejada do tampão, as características da proteína de interesse e o método analítico.

[00110] Eluição, como usada aqui, é a remoção do produto, por exemplo, polipeptídeo, e/ou contaminantes do material cromatográfico. O tampão de eluição é usado para eluir o polipeptídeo ou outro produto de interesse de um material cromatográfico. Em algumas modalidades, o tampão de eluição é parte da fase móvel da cromatografia. Em algumas modalidades, a composição que compreende o polipeptídeo e os contaminantes é aplicada ao material de cromatografia como parte da fase móvel. A fase móvel é então alterada para permitir a separação do polipeptídeo dos contaminantes conforme os polipeptídeos e os contaminantes são eluídos do material cromatográfico. Em muitos casos, um tampão de eluição tem características físicas diferentes do tampão de carregamento. Por exemplo, o tampão de eluição pode ter um pH diferente do tampão de carregamento e/ou uma força iônica diferente do tampão de carregamento. Em algumas modalidades, os polipeptídeos e contaminantes são eluídos do material cromatográfico pela alteração do pH e da força iônica do tampão de eluição. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição e a força iônica do tampão de eluição são aumentados durante o decorrer da eluição comparado com o tampão de carregamento. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição é aumentado durante o decorrer da eluição comparado com o tampão de carregamento e a força iônica do tampão de eluição permanece essencialmente a mesma.

[00111] Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo

38/133 com um pl >9 é aplicado a um material de cromatografia por troca de cátion e o polipeptídeo é eluído do material de cromatografia por troca de cátion pelo aumento do pH e da força iônica da fase móvel da cromatografia. Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo com um pl >9 é aplicado a um material de cromatografia por troca de cátion e o polipeptídeo é eluído do material de cromatografia por troca de cátion pelo aumento do pH da fase móvel da cromatografia, enquanto a força iônica da fase móvel é mantida.

[00112] Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo com um pl < 7 é aplicado a um material de cromatografia por troca de ânion e o polipeptídeo é eluído do material de cromatografia por troca de ânion pela diminuição do pH da fase móvel e aumento da força iônica da fase móvel da cromatografia. Em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo com um pl < 7 é aplicado a um material de cromatografia por troca de ânion e o polipeptídeo é eluído do material de cromatografia por troca de ânion pela diminuição do pH da fase móvel, enquanto a força iônica da fase móvel é mantida.

[00113] Em alguns aspectos de qualquer uma das modalidades acima, o pH do tampão de eluição é alterado a partir do tampão de carregamento por um gradiente linear ou por um gradiente em etapas.

[00114] Em algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo é eluído do material de cromatografia pelo aumento do pH do tampão de eluição na fase móvel. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 5 para cerca de pH 11. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 6 para cerca de pH 9. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 6 para cerca de pH 10. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 6 para cerca de pH 11. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 7 para cerca de pH 9. Em algumas

39/133 modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 7 para cerca de pH 10. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 7 para cerca de pH 11. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 8 para cerca de pH 9. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 8 para cerca de pH 10. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 8 para cerca de pH 11. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição aumenta de cerca de pH 9 para cerca de pH 11. Em qualquer uma das modalidades acima, o aumento no pH do tampão de eluição é combinado com um aumento na força iônica do tampão de eluição. Em outras modalidades de qualquer uma das modalidades acima, o pH do tampão de eluição está aumentado, mas a força iônica do tampão de eluição permanece essencialmente a mesma. Em qualquer uma das modalidades acima, o gradiente de pH é estabelecido ao longo de mais do que cerca de 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min, 55 min, ou 60 min. Em qualquer uma das modalidades acima, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de cátion. Em qualquer uma das modalidades acima, o polipeptídeo tem um pl >9. Em qualquer uma das modalidades acima, o polipeptídeo é um anticorpo ou seu fragmento.

[00115] Em algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo é eluído do material de cromatografia pela diminuição do pH do tampão de eluição na fase móvel. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição diminui de cerca de pH 9 para cerca de pH 5. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição diminui de cerca de pH 9 para cerca de pH 6. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição diminui de cerca de pH 9 para cerca de pH 7. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição diminui de cerca de pH 8 para cerca de pH 5. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição di40/133 minui de cerca de pH 8 para cerca de pH 6. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição diminui de cerca de pH 8 para cerca de pH 7. Em algumas modalidades, o pH do tampão de eluição diminui de cerca de pH 7 para cerca de pH 5. Em qualquer uma das modalidades acima, a diminuição no pH do tampão de eluição é combinada com um aumento na força iôníca do tampão de eluição. Em outras modalidades de qualquer uma das modalidades acima, o pH do tampão de eluição está diminuído, mas a força iôníca do tampão de eluição permanece essencialmente a mesma. Em qualquer uma das modalidades acima, o gradiente de pH é estabelecido ao longo de mais do que cerca de 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min, 55 min, ou 60 min. Em qualquer uma das modalidades acima, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de ânion. Em qualquer uma das modalidades acima, o polipeptídeo tem um pl <7. Em qualquer uma das modalidades acima, o polipeptídeo é um anticorpo ou seu fragmento.

[00116] Um tampão de eluição pode ser preparado com um pH específico usando tampões conhecidos na técnica. Exemplos de tampões incluem, mas não são limitados a piperazina, imidazol, Tris, fosfato e ácido A/-ciclo-hexil-3-aminopropanosulfônico (CAPS). Em algumas modalidades, o pH do tampão pode ser ajustado, por exemplo, pela adição de HCI para fazer um tampão mais ácido ou pela adição de NaOH para fazer um tampão mais básico. Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende uma combinação de tampões. Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende uma combinação de piperazina, imidazol e Tris (por exemplo, um tampão PIT). Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende 11,6 mM de piperazina, 1,5 mM de imidazol e 2,5 mm de Tris. Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende 4 mM de piperazina, 4 mM de imidazol e 4 mm de Tris. Em algumas modalidades da inven

41/133 ção, o tampão de eluição que compreende uma combinação de piperazina, imidazol e Tris é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um polipeptídeo. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição que compreende uma combinação de piperazina, imidazol e Tris é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um polipeptídeo com um pl > 9. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição que compreende uma combinação de piperazina, imidazol e Tris é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um anticorpo. Em algumas modalidades, o tampão de eluição que compreende uma combinação de piperazina, imidazol e Tris é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um anticorpo com um pl > 9. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição que compreende uma combinação de piperazina, imidazol e Tris é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de ânion de um polipeptídeo. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição que compreende uma combinação de piperazina, imidazol e Tris é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de ânion de um polipeptídeo com um pl < 7. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição compreende uma combinação de Tris, piperazina e fosfato (por exemplo, um tampão TPP). Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende 5 mM de Tris, 5 mM de piperazina e 5 mM de fosfato. Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende 10 mM de Tris, 10 mM de piperazina e 10 mM de fosfato. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição compreende uma combinação de Tris, piperazina e fosfato é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um polipeptídeo. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição compreende uma combinação de Tris, piperazina e fosfato é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um polipeptídeo com pl > 9. Em algumas modali

42/133 dades da invenção, o tampão de eluição compreende uma combinação de Tris, piperazina e fosfato é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um anticorpo. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição compreende uma combinação de Tris, piperazina e fosfato é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um anticorpo com pl > 9. Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende uma combinação de Tris, imidazol e CAPS (por exemplo, um tampão TIC). Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende 5 mM de Tris, 5 mM de imidazol e 5 mM de CAPS. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição que compreende uma combinação de Tris, imidazol e CAPS é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um polipeptídeo. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição que compreende uma combinação de Tris, imidazol e CAPS é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um polipeptídeo com pl >9. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição que compreende uma combinação de Tris, imidazol e CAPS é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um anticorpo. Em algumas modalidades da invenção, o tampão de eluição que compreende uma combinação de Tris, imidazol e CAPS é usado na fase móvel de uma cromatografia de troca de cátion de um anticorpo com pl > 9.

[00117] Em algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo é eluído do material cromatográfico pelo aumento do pH do tampão de eluição como descrito acima e pelo aumento da força iônica do tampão de eluição, formando dessa maneira um gradiente de pH e um gradiente de força iônica. Em algumas modalidades, a força iônica do tampão de eluição é aumentada pelo aumento da concentração de sal da fase móvel da cromatografia. Em outras modalidades da invenção, o polipeptídeo é eluído do material cromatográfico pelo aumento do pH

43/133 do tampão de eluição, onde a força iônica do tampão de eluição permanece essencialmente a mesma ao longo da eluição pela manutenção da concentração de sal ao longo da eluição. Em algumas modalidades, a concentração de sal é escolhida tal que o estado da carga do polipeptídeo fornece uma janela de separação ótima de troca de íon por gradiente de pH. O estado da carga do polipeptídeo pode ser determinado pelos procedimentos de modelagem conhecidos na técnica. Exemplos de sais incluem, mas não são limitados a NaCI, KCI e Na₂SO₄.

[00118] Em algumas modalidades, o gradiente de força iônica é um gradiente de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de sal é um gradiente entre cerca de 0 mM de sal a cerca de 200 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de sal é qualquer um entre cerca de 0 mM a cerca de 100 mM, 0 mM a cerca de 60 mM, 0 mM a cerca de 50 mM, 0 mM a cerca de 40 mM, 0 mM a cerca de 30 mM, 0 mM a cerca de 20 mM, 0 mM a cerca de 10 mM, 10 mM a cerca de 200 mM, 10 mM a cerca de 100 mM, 10 mM a cerca de 50 mM, 10 mM a cerca de 40 mM, 10 mM a cerca de 30 mM, 10 mM a cerca de 20 mM, 20 mM a cerca de 200 mM, 20 mM a cerca de 100 mM, 20 mM a cerca de 50 mM, 20 mM a cerca de 30 mM, 30 mM a cerca de 200 mM, 30 mM a cerca de 100 mM, e 30 mM a cerca de 50 mM.

[00119] Em algumas modalidades das modalidades acima, o polipeptídeo e/ou um ou mais contaminantes são eluídos do material cromatográfico por uma combinação de gradiente de pH e gradiente de força iônica. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 5 a pH 10,8 e o gradiente de força iônica está entre 0 mM de sal a 16 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 11 e o gradiente de força iônica está entre 0 mM de sal a 60 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 5 a pH 9,5 e o gradiente de força iônica está entre 0 mM de sal a 16

44/133 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 5 a pH 9,5 e o gradiente de força íônica está entre 0 mM de sal a 30 mM de sal. Em qualquer uma das modalidades acima, o sal é NaCI, KCI e Na₂SO₄. Em qualquer uma das modalidades acima, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de cátion. Em qualquer uma das modalidades, o polipeptídeo tem um pl > 9. Em qualquer uma das modalidades acima, o polipeptídeo é um anticorpo com pl > 9.

[00120] Em algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo e/ou um ou mais contaminantes são analisados por cromatografia de troca de íon, onde o polipeptídeo e/ou um ou mais contaminantes são eluídos do material cromatográfico por uma combinação de gradiente de pH e gradiente de força íônica. Em algumas modalidades, o gradiente de pH este entre pH 7 a pH 5 e o gradiente de força íônica está entre 0 mM de sal a 25 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH este entre pH 7 a pH 5 e o gradiente de força íônica está entre 0 mM de sal a 100 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH este entre pH 7 a pH 5 e o gradiente de força íônica está entre 0 mM de sal a 200 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH este entre pH 7 a pH 5 e o gradiente de força íônica está entre 0 mM de sal a 300 mM de sal. Em qualquer uma das modalidades acima, o sal é NaCI, KCI e Na₂SO₄. Em qualquer uma das modalidades acima, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de ânion. Em qualquer uma das modalidades, o polipeptídeo tem um pl < 7. Em qualquer uma das modalidades acima, o polipeptídeo é um anticorpo com pl < 7.

[00121] Em algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo e/ou um ou mais contaminantes são analisados por cromatografia de troca de íon, onde o polipeptídeo e/ou um ou mais contaminantes são eluídos do material cromatográfico por um gradiente de pH onde a força

45/133 iônica da fase móvel permanece essencialmente a mesma ao longo da eluição. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 11 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 10 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 11 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 20 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 11 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 30 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 11 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 40 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 11 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 50 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 10 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 10 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 10 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 20 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 10 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 30 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 10 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 40 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 10 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 50 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 9 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 10 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 9 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 20 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 9 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 30 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 9 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 40 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 6 a pH 9 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 50 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 11 e a

46/133 força iônica da fase móvel é de cerca de 10 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 11 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 20 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 11 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 30 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 11 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 40 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 11 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 50 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 10 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 10 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 10 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 20 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 10 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 30 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 10 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 40 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 10 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 50 mM de sal. Em qualquer uma das modalidades acima, o sal é NaCI, KCI e Na₂SO₄. Em qualquer uma das modalidades acima, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de cátion. Em qualquer uma das modalidades, o polipeptídeo tem um pl > 9. Em qualquer uma das modalidades acima, o polipeptídeo é um anticorpo com pl > 9.

[00122] Em algumas modalidades da invenção, o polipeptídeo e/ou um ou mais contaminantes são analisados por cromatografia de troca de íon, onde o polipeptídeo e/ou um ou mais contaminantes são eluídos do material cromatográfico por uma combinação de gradiente de pH, onde a força iônica da fase móvel permanece essencialmente a mesma ao longo da eluição. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 8 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de

47/133 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 8 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 20 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 8 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 30 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 8 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 40 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 8 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 50 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 8 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 100 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 8 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 200 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 10 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 20 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 30 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 40 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 50 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 100 mM de sal. Em algumas modalidades, o gradiente de pH está entre pH 7 a pH 5 e a força iônica da fase móvel é de cerca de 200 mM de sal. Em qualquer uma das modalidades acima, o sal é NaCI, KCI e Na₂SO₄. Em qualquer uma das modalidades acima, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de ânion. Em qualquer uma das modalidades, o polipeptídeo tem um pl < 7. Em qualquer uma das modalidades acima, o polipeptídeo é um anticorpo com pl < 7.

48/133 [00123] Em algumas modalidades da invenção, a força iônica da fase móvel, por exemplo, o tampão de eluição, é medida pela condutividade da fase móvel. Condutividade se refere à habilidade de uma solução aquosa de conduzir uma corrente elétrica entre dois eletrodos. Em solução, a corrente flui pelo transporte de íon. Portanto, com uma quantidade crescente de íons presentes na solução aquosa, a solução terá uma maior condutividade. A unidade básica de medida da condutividade é o Siemen (ou mho), mho (mS/cm) e pode ser medida usando um medidor da condutividade, tal como os vários modelos Orion de medidores da condutividade. Como a condutividade elétrica é a capacidade de íons em solução de transmitir a corrente elétrica, a condutividade de uma solução pode ser alterada pela mudança da concentração de íons nela. Por exemplo, a concentração de um agente de tamponamento e/ou a concentração de um sal (por exemplo, cloreto de sódio, acetato de sódio ou cloreto de potássio) na solução podem ser alteradas a fim de obter a condutividade desejada. Preferivelmente, a concentração de sal dos vários tampões é modificada para obter a condutividade desejada.

[00124] Em algumas modalidades, a fase móvel da cromatografia tem uma condutividade inicial de mais do que cerca de 0,0 mS/cm, 0,5 mS/cm, 1,0 mS/cm, 1,5 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,5 mS/cm, 3,0 mS/cm,

3.5 mS/cm, 4,0 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17,0 mS/cm, 18,0 mS/cm, 19,0 mS/cm, ou 20,0 mS/cm. Em algumas modalidades, a condutividade da fase móvel é aumentada durante a cromatografia, por exemplo, por um gradiente de força iônica. Em algumas modalidades, a condutividade da fase móvel no final da eluição é mais do que cerca de 1.0 mS/cm,

1.5 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,5 mS/cm, 3,0 mS/cm, 3,5 mS/cm, 4,0

49/133 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17,0 mS/cm, 18,0 mS/cm, 19,0 mS/cm, ou 20,0 mS/cm. Em algumas modalidades, a condutividade da fase móvel é aumentada por um gradiente linear. Em algumas modalidades, a condutividade da fase móvel é aumentada por um gradiente em etapas que compreende uma ou mais etapas.

[00125] Em algumas modalidades, a condutividade inicial da fase móvel e a condutividade final da fase móvel da cromatografia na eluição do polipeptídeo é essencialmente a mesma. Em algumas modalidades, a condutividade da fase móvel permanece essencialmente a mesma em mais do que cerca de 0,0 mS/cm, 0,5 mS/cm, 1,0 mS/cm,

1,5 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,5 mS/cm, 3,0 mS/cm, 3,5 mS/cm, 4,0 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7,5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17,0 mS/cm, 18,0 mS/cm, 19,0 mS/cm, ou 20,0 mS/cm.

[00126] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, a composição que compreende um polipeptídeo e um ou mais contaminantes é carregada no material de cromatografia em uma quantidade de mais do que cerca de 1 pg, 2 pg, 3 pg, 4 pg, 5 pg, 6 pg, 7 pg, 8 pg, 9 pg, 10 pg, 15 pg, 20 pg, 25 pg, ou 50 pg. Em algumas modalidades, a composição é carregada sobre o material cromatográfico em uma concentração de mais do cerca de 0,5 mg/mL, 1,0 mg/mL, 1,5 mg/mL, 2,0 mg/mL, 2,5 mg/mL, e 5,0 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição é diluída antes do carregamento sobre o material cromatográfico; por exemplo, diluída 1:1, 1:2, 1:5, 1:10 ou maior do que 1:10. Em algumas modalidades, a composição é diluída

50/133 na fase móvel da cromatografia. Em algumas modalidades, a composição é diluída em um tampão de carregamento.

[00127] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, a taxa de fluxo é mais do que cerca de 0,5 mL/min, 0,6 mL/min, 0,7 mL/min, 0,8 mL/min, 0,9 mL/min, 1,0 mL/min, 1,1 mL/min,

1,2 mL/min, 1,3 mL/min, 1,4 mL/min, 1,5 mL/min, 1,75 mL/min e 2,0 mL/min.

[00128] Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, o material cromatográfico é uma coluna. Em algumas modalidades, a coluna é uma coluna de HPLC. Em algumas modalidades, a coluna tem qualquer uma das seguintes dimensões: 4 x 50 mm, 4 x 100 mm, 4 x 150 mm, 4 χ 200 mm, 4 χ 250 mm, ou 2 χ 250 mm.

[00129] Em algumas modalidades da invenção, os métodos são robustos; isto é, um ou mais parâmetros da corrida podem ser perturbados sem afetar os resultados analíticos (por exemplo, percentuais relativos do pico principal e picos dos contaminantes). Em algumas modalidades, a concentração de tampão no tampão de carregamento e/ou tampão de eluição varia entre cerca de 10 mM a 50 mM, 10 mM a 40 mM, 10 mM a 30 mM, 10 mM a 20 mM, 20 mM a 50 mM, 20 mM a 40 mM, 20 mM a 30 mM, 30 mM a 50 mM, 30 mM a 40 mM, ou 40 mM a 50 mM. Em algumas modalidades, a concentração de tampão no tampão de carregamento e/ou tampão de eluição varia entre cerca de 10 mM a cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, o primeiro pH varia entre qualquer um de cerca de pH 5,0 a pH 7,0, pH 5,0 a pH 6,5, pH 5,0 a pH 6,0, pH 5,0 a pH 5,5, pH 5,5 a pH 7,0, pH 5,5 a pH 6,5, pH

5,5 a pH 6,0, pH 6,0 a pH 7,0, pH 6,0 a pH 6,5 ou pH 6,5 a pH 7,0. Em algumas modalidades, o primeiro pH varia entre cerca de pH 5,7 a cerca de pH 6,3. Em algumas modalidades, a temperatura do material cromatográfico varia entre cerca de 20 ^QC a 50 ^QC, 25 ^QC a 50 ^QC, 30 ^QC a 50 ^QC, 35 ^QC a 50 ^QC, 40 ^QC a 50 ^QC, 45 ^QC a 50 ^QC, 20 ^QC a 45 ^QC,

51/133 ^QC a 45 ^QC, 30 ^QC a 45 ^QC, 35 ^QC a 45 ^QC, 40 ^QC a 45 ^QC, 20 ^QC a 40 ^QC, 25 ^QC a 40 ^QC, 30 ^QC a 40 ^QC, 35 ^QC a 40 ^QC, 20 ^QC a 35 ^QC, 25 ^QC a 35 ^QC, 30 ^QC a 35 ^QC, 20 ^QC a 30 ^QC, 25 ^QC a 30 ^QC, ou 20 ^QC a 25 ^QC. Em algumas modalidades, a temperatura do material de cromatografia varia entre cerca de 36^QC a cerca de 44^QC. Em algumas modalidades, o carregamento e a eluição são conduzidos em uma taxa de fluxo que varia entre cerca de 0,5 ml/min a 2,0 ml/min, 0,8 ml/min a 2,0 ml/min, 1,0 ml/min a 2,0 ml/min, 1,2 ml/min a 2,0 ml/min, 1,5 ml/min a 2,0 ml/min, 1,8 ml/min a 2,0 ml/min, 0,5 ml/min a 1,8 ml/min, 0,8 ml/min a 1,8 ml/min, 1,0 ml/min a 1,8 ml/min, 1,2 ml/min a 1,8 ml/min, 1,5 ml/min a 1,8 ml/min, 0,5 ml/min a 1,5 ml/min, 0,8 ml/min a 1,5 ml/min, 1,0 ml/min a 1,5 ml/min, 1,2 ml/min a 1,5 ml/min, 0,5 ml/min a 1,2 ml/min, 0,8 ml/min a 1,2 ml/min, 1,0 ml/min a 1,2 ml/min, 0,5 ml/min a 1,0 ml/min, 0,8 ml/min a 1,0 ml/min, ou 0,5 ml/min a 0,8 ml/min. Em algumas modalidades, o carregamento e a eluição são conduzidos em uma taxa de fluxo que varia entre cerca de 0,8 ml/min a cerca de 1,2 ml/min. Em algumas modalidades, o carregamento e a eluição são conduzidos em uma taxa de fluxo que varia entre cerca de 1,5 ml/min a cerca de 2,0 ml/min. Em modalidades adicionais, qualquer combinação de concentração, pH de partida, temperatura do material cromatográfico e/ou taxa de fluxo pode variar de acordo com as modalidades acima.

Detecção de variantes de carpa [00130] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos de detecção de variantes de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo e uma ou mais variantes na composição do polipeptídeo. O método que compreende ligar o polipeptídeo e uma ou mais variantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força iônica inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do ma

52/133 terial de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado por um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição está alterada em um gradiente de força iônica, tal que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material cromatográfico como entidades distintas separadas. Os eluentes da cromatografia são então analisados quanto ao polipeptídeo parental e a presença de variantes. Variantes do polipeptídeo podem inclui variantes ácidas do polipeptídeo e variantes básicas do polipeptídeo parental. Exemplos de variantes ácidas, isto é, variantes com um pl menor do que o pl do polipeptídeo parental, incluem, mas não são limitadas a polipeptídeos onde um ou mais resíduos de glutamina e/ou asparagina tenham sido deamidados. Exemplos de variantes de polipeptídeos básicos, isto é, variantes com um pl maior do que o pl do polipeptídeo parental incluem, mas não são limitadas a um resíduo de ácido aspártico que tenha sofrido uma modificação para uma porção de succinimida. Em algumas modalidades, os métodos da invenção são usados para detectar variantes de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um ponto isoelétrico que não está na faixa neutra do pH. Em algumas modalidades, os métodos podem ser usados para detectar efetivamente variantes de carga em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl maior do que 9 dos contaminantes. Em algumas modalidades, um material cromatográfico de troca de cátion é usado efetivamente para detectar variantes de carga em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl maior do que 9. Em outras modalidades, os métodos podem ser usados para detectar efetivamente variantes de carga em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl menor do que 7 dos contaminantes. Em algumas modalidades, um material de cromatografia de troca de ânion é usado efetivamente para detectar variantes de carga em uma composição que compreende um

53/133 polipeptídeo com um pl menor do que 7. Exemplos de polipeptídeos incluem, mas não são limitados a anticorpos e fragmentos de anticorpo.

[00131] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para detectar variantes de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo e uma ou mais variantes do polipeptídeo. O método compreende ligar o polipeptídeo e uma ou mais variantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força iônica inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado por um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição permanece essencialmente a mesma como a força iônica inicial, tal que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material cromatográfico como entidades distintas separadas. Os eluentes da cromatografia são então analisados quanto a presença do polipeptídeo parental e a presença de variantes. Variantes do polipeptídeo podem inclui variantes ácidas do polipeptídeo e variantes básicas do polipeptídeo parental. Exemplos de variantes ácidas, isto é, variantes com um pl menor do que o pl do polipeptídeo parental, incluem, mas não são limitadas a polipeptídeos onde um ou mais resíduos de glutamina e/ou asparagina tenham sido deamidados. Exemplos de variantes de polipeptídeos básicos, isto é, variantes com um pl maior do que o pl do polipeptídeo parental incluem, mas não são limitadas a um resíduo de ácido aspártico que tenha sofrido uma modificação para uma porção de succinimida. Em algumas modalidades, os métodos podem ser usados para detectar efetivamente variantes de carga em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl maior do que 9. Em outras modalidades, os métodos podem ser usados para detectar efetivamente variantes de carga em uma composição que

54/133 compreende o polipeptídeo com um pl menor do que 7. Em algumas modalidades, um material de cromatografia de troca de ânion é usado efetivamente para detectar variantes de carga em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl menor do que 7. Exemplos de polipeptídeos incluem, mas não são limitados a anticorpos e fragmentos de anticorpo.

Determinação da pureza de um Dolipeptídeo em uma composição [00132] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos de determinação da pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo. O método compreende ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força iônica inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado por um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição está alterada por um gradiente de força iônica, tal que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material cromatográfico como entidades distintas separadas. A pureza do polipeptídeo pode ser avaliado pela determinação da proporção da quantidade de polipeptídeo que elui do material cromatográfico para a quantidade total de contaminantes, por exemplo, variantes de carga, que eluem do material cromatográfico. Em algumas modalidades, os métodos da invenção são usados para determinar a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um ponto isoelétrico que não está na faixa neutra do pH. Em algumas modalidades, os métodos podem ser usados para determinar efetivamente a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl maior do que 9 dos contaminantes. Em algumas modalidades, um material de cromatografia de troca de cátion é usado efetivamente para

55/133 detectar a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl maior do que 9. Em outras modalidades, os métodos podem ser usados para determinar efetivamente a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl maior do que 9 dos contaminantes. Em algumas modalidades, um material de cromatografia de troca de cátion é usado efetivamente para detectar a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl menor do 7 dos contaminantes. Em algumas modalidades, o material cromatográfico de troca de ânion é usado para determinar efetivamente a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo com um pl menor do que 7. Exemplos de polipeptídeos incluem, mas não são limitados a anticorpos e fragmentos de anticorpo.

[00133] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos de determinação da pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo. O método compreende ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força iônica inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado por um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição permanece essencialmente a mesma como a força iônica inicial, tal que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material cromatográfico como entidades distintas separadas. A pureza do polipeptídeo pode ser avaliada pela determinação da proporção da quantidade de polipeptídeo que elui do material cromatográfico para a quantidade total de contaminantes, por exemplo, variantes de carga, que eluem do material cromatográfico. Em algumas modalidades, os métodos da invenção

56/133 são usados para determinar a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um ponto isoelétrico que não está na faixa neutra do pH. Em algumas modalidades, os métodos podem ser usados para determinar efetivamente a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl maior do que 9 dos contaminantes. Em algumas modalidades, um material de cromatografia de troca de cátion é usado efetivamente para detectar a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl maior do que 9. Em outras modalidades, os métodos podem ser usados para determinar efetivamente a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl menor do que 7 dos contaminantes. Em algumas modalidades, o material cromatográfico de troca de ânion é usado para determinar efetivamente a pureza de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo com um pl menor do que 7. Exemplos de polipeptídeos incluem, mas não são limitados a anticorpos e fragmentos de anticorpo.

Determinação da estabilidade de um Dolipeptídeo em uma composição [00134] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para determinar a estabilidade de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo. Em algumas modalidades, amostras da composição que compreende o polipeptídeo são analisadas ao longo do tempo. Em algumas modalidades, a composição é incubada em vários intervalos de tempo antes da análise. Em algumas modalidades, a composição é incubada em mais do que qualquer uma de cerca de 0^QC, 20^QC, 37^QC ou 40^QC antes da análise. Em algumas modalidades, a composição é incubada por um ou mais do que 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 ano antes da análise. A composição é então analisada pela ligação do polipeptídeo e um ou mais contami

57/133 nantes na composição a um material de cromatografia por troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força iôníca inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado por um gradiente de pH e a força iôníca do tampão de eluição está alterada por um gradiente de força iôníca, tal que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material cromatográfico como entidades distintas separadas. Em outras modalidades, a composição é então analisada pela ligação do polipeptídeo e um ou mais contaminantes na composição a um material de cromatografia por troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força iôníca inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado por um gradiente de pH e a força iôníca do tampão de eluição permanece essencialmente igual a força iôníca inicial, tal que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material cromatográfico como entidades distintas separadas. Para qualquer uma das modalidades acima, a alteração na proporção de polipeptídeo para contaminantes indica a estabilidade do polipeptídeo na composição. Por exemplo, se a proporção de polipeptídeo para contaminantes não se altera ao longo do tempo, o polipeptídeo pode ser considerado estável, enquanto que o acúmulo rápido de contaminantes com uma diminuição concomitante na quantidade de proteína na composição indica que o polipeptídeo na composição é menos estável. Em algumas modalidades, os métodos da invenção são usados para determinar a estabilidade de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um ponto isoelétrico que não está na faixa neutra do pH. Em algumas modalidades, os métodos podem ser usados para determinar efetivamente a estabilidade de um

58/133 polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl maior do que 9 dos contaminantes. Em algumas modalidades, um material de cromatografia de troca de cátion é usado efetivamente para determinar a estabilidade de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl maior do que

9. Em outras modalidades, os métodos podem ser usados para determinar a estabilidade de um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um pl menor do que 7 dos contaminantes. Em algumas modalidades, o material cromatográfico de troca de ânion é usado para determinar a estabilidade de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo com um pl menor do que 7. Exemplos de polipeptídeos incluem, mas não são limitados a anticorpos e fragmentos de anticorpo.

Purificação de polipeptídeos [00135] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para a purificação de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo e uma ou mais variantes do polipeptídeo. O método compreende ligar o polipeptídeo e uma ou mais variantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força iôníca inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado por um gradiente de pH e a força iôníca do tampão de eluição está alterada por um gradiente de força iôníca, tal que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material cromatográfico como entidades distintas separadas. Frações são coletadas durante a fase de eluição da cromatografia e as frações que contêm o polipeptídeo sem nenhum ou com um mínimo de contaminantes são agrupadas para o processamento posterior ou para formulação farmacêutica. Em algumas modalidades, os métodos da invenção são usa

59/133 dos para purificar um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um ponto isoelétrico que não está na faixa neutra do pH. Em algumas modalidades, os métodos da invenção são usados para purificar um polipeptídeo com um pl maior do que 9. Em algumas modalidades, um material de cromatografia de troca de cátion é usado para purificar um polipeptídeo com um pl maior do que 9. Em outras modalidades, os métodos podem ser usados para purificar um polipeptídeo com um pl menor do que 7 dos contaminantes. Em algumas modalidades, o material cromatográfico de troca de ânion é usado para purificar um polipeptídeo com um pl menor do que 7. Exemplos de polipeptídeos incluem, mas não são limitados a anticorpos e fragmentos de anticorpo.

[00136] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para a purificação de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo e uma ou mais variantes do polipeptídeo. O método compreende ligar o polipeptídeo e uma ou mais variantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento com um pH inicial e uma força íônica inicial, eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado por um gradiente de pH e a força íônica do tampão de eluição é essencialmente igual à força íônica inicial, tal que os polipeptídeos e um ou mais contaminantes eluem do material cromatográfico como entidades distintas separadas. Frações são coletadas durante a fase de eluição da cromatografia e as frações que contêm o polipeptídeo, mas não os contaminantes são agrupadas para o processamento posterior ou para formulação farmacêutica. Em algumas modalidades, os métodos da invenção são usados para purificar um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo com um ponto isoelétrico que não está na faixa neutra do pH. Em algumas modalidades,

60/133 os métodos da invenção são usados para purificar um polipeptídeo com um pl maior do que 9. Em algumas modalidades, um material de cromatografia de troca de cátion é usado para purificar um polipeptídeo com um pl maior do que 9. Em outras modalidades, os métodos podem ser usados para purificar um polipeptídeo com um pl menor do que 7 dos contaminantes. Em algumas modalidades, o material cromatográfico de troca de ânion é usado para purificar um polipeptídeo com um pl menor do que 7. Exemplos de polipeptídeos incluem, mas não são limitados a anticorpos e fragmentos de anticorpo.

III. Polipeptídeos [00137] São fornecidos polipeptídeos para uso em qualquer um dos métodos de cromatografia por troca de íon mediada com gradiente de pH mediada por força iônica aqui descritos. Em algumas modalidades da invenção, as composições de polipeptídeo são analisadas pela cromatografia por troca de íon com gradiente de pH mediada por força iônica. Tais métodos são úteis na identificação de variantes de carga do polipeptídeo dentro da composição. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo ou seu fragmento.

[00138] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um polipeptídeo terapêutico. O polipeptídeo terapêutico pode inibir o crescimento de células tumorais, induzir a apoptose e/ou induzir a morte celular. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um antagonista. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um agonista. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma imunoadesina.

[00139] Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um peso molecular maior do que cerca de 5.000 Daltons, 10.000 Daltons, 15.000 Daltons, 25.000 Daltons, 50.000 Daltons, 75.000 Daltons, 100.000 Daltons, 125.000 Daltons ou 150.000 Daltons. O polipeptídeo pode ter um peso molecular entre cerca de 50.000 Daltons a 200.000 Daltons ou

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100.000 Daltons a 200.000 Daltons. Alternativamente, o polipeptídeo para uso nesse pode ter urn peso molecular de cerca de 120.000 Daltons ou cerca 25.000 Daltons.

[00140] pl é o ponto isoelétrico e é o pH no qual uma molécula em particular ou superfície não carrega nenhuma carga elétrica líquida. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o pl do polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo, pode ser maior do que cerca de 9. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl de cerca de 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5 ou 12. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 9 e 12. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 9 e 11. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 9 e 10. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 10 e 12 Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 10 e 11. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 11 e 12.

[00141] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o pl do polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo, pode ser menor do que cerca de 7. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl de cerca de 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 ou 4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 4 e 7. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 4 e 6. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 4 e 5. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 5 e 7. Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem um pl entre cerca de 5 e 6.

[00142] Em modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o um ou mais contaminantes em uma composição que compreende um polipeptídeo e um ou mais contaminantes são variantes de carga do polipeptídeo. Em algumas modalidades, a variante de carga do

62/133 polipeptídeo é um polipeptídeo que foi modificado a partir de seu estado nativo tal que a carga do polipeptídeo está alterada. Em algumas modalidades, as variantes de carga são mais ácidas do que o polipeptídeo parental, isto é, têm um pl menor do que o polipeptídeo parental. Em outras modalidades, as variantes de carga são mais básicas do que o polipeptídeo parental, isto é, têm um pl maior do que o polipeptídeo parental. Em algumas modalidades, as variantes de carga são manipuladas. Em algumas modalidades, a variante de carga do polipeptídeo é o resultado de processos naturais; por exemplo, oxidação, deamidação, processamento C-terminal de resíduos de lisina, formação de piroglutamato N terminal e glicação. Em algumas modalidades, a variante de carga do polipeptídeo é uma glicoproteína, onde o glicano acoplado à proteína é modificado tal que a carga da glicoproteína é alterada comparada com a glicoproteína parental; por exemplo, pela adição de ácido siálico ou seus derivados. Em algumas modalidades, a variante de carga do polipeptídeo é uma variante de carga de um anticorpo.

[00143] Os polipeptídeos a serem analisados usando os métodos aqui descritos são geralmente produzidos usando técnicas recombinantes. Os métodos para a produção de proteínas recombinantes são descritos, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 5,534,615 e 4.816.567, especificamente incorporadas aqui por referência. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é produzida em uma célula CHO (veja, por exemplo, WO 94/11026). Quando são usadas técnicas recombinantes, os polipeptídeos podem ser produzidos intracelularmente, no espaço periplasmático ou secretados diretamente no meio.

[00144] Os polipeptídeos podem ser recuperados do meio de cultura ou a partir dos lisados de célula hospedeira. Células empregadas na expressão dos polipeptídeos podem ser rompidas por vários meios físicos e químicos, tais como ciclos de congelamento

63/133 descongelamento, sonicação, ruptura mecânica ou agentes que lisam as células. Se o polipeptídeo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os resíduos particulados, fragmentos das células hospedeiras ou lisados, são removidos, por exemplo, pela centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolar polipeptídeos que são secretados para o espaço periplasmático de E. coll. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante cerca de 30 min. Os resíduos celulares podem ser removidos por centrifugação. Onde o polipeptídeo é secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente concentrados primeiro usando um filtro de concentração de polipeptídeo disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas precedentes para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para evitar o desenvolvimento de contaminantes adventícios.

[00145] Em algumas modalidades, o polipeptídeo na composição que compreende o polipeptídeo e um ou mais contaminantes pode ser purificado ou parcialmente purificado antes da análise pelos métodos da invenção. Por exemplo, o polipeptídeo dos métodos está em um eluente de uma cromatografia de afinidade, uma cromatografia por troca de cátion, uma cromatografia por troca de ânion, uma cromatografia em modo misto e uma cromatografia de interação hidrofóbica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo está em um eluente de uma cromatografia com Proteína A.

[00146] Exemplos de polipeptídeos que podem ser analisados pelos métodos da invenção incluem, mas não são limitados a imunoglobulinas, imunoadesinas, anticorpos, enzimas, hormônios, proteínas de fusão, proteínas que contém Fc, imunoconjugados, citocinas e interleu64/133 cinas.

[00147] Em algumas modalidades, o polipeptídeo está em uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o polipeptídeo e um veículo farmaceuticamente aceitável incluindo, mas não limitado a um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno e um veículo farmaceuticamente aceitável incluindo, mas não limitado a um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

(A) Anticorpos [00148] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o polipeptídeo para uso em qualquer um dos métodos de análise de polipeptídeos e formulações que compreendem os polipeptídeos pelos métodos aqui descritos é um anticorpo.

[00149] Alvos moleculares para os anticorpos incluem proteínas CD e seus ligantes tais como, mas não limitadas a: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79a (CD79a) e CD79p (CD79b); (ii) membros da família do receptor de ErbB tal como o receptor de EGF, HER2, HER3 ou receptor de HER4; (iii) moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Mad, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e αν/β3 integrina, incluindo suas subunidades alfa ou beta (por exemplo, anticorpos anti-CD11a, anti-CD18 ou anti-CD11b); (iv) fatores do crescimento tais como VEGF; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor de flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C, BR3, c-met, fator tecidual, β7 etc; e (v) antígenos da superfície celular e transmembrana associados ao tumor (TAA), tais como aqueles descritos na Patente U.S. No. 7.521.541.

[00150] Outros anticorpos exemplificadores incluem aqueles seleci

65/133 onados entre, sem limitação, anticorpo anti-receptor de estrogênio, anticorpo anti-receptor de progesterona, anticorpo anti-p53, anticorpo anti-HER-2/neu, anticorpo anti-EGFR, anticorpo anti-catepsina D, anticorpo anti-Bcl-2, anticorpo anti-E-caderina, anticorpo anti-CA125, anticorpo anti-CA15-3, anticorpo anti-CA19-9, anticorpo anti-erbB-2, anticorpo anti-glicoproteína P, anticorpo anti-CEA, anticorpo anti-proteina do retinoblastoma, anticorpo anti-oncoproteína ras, anticorpo antiLewis X, anticorpo anti-Ki-67, anticorpo anti-PCNA, anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD4, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD7, anticorpo anti-CD8, anticorpo anti-CD9/p24, anticorpo anti-CD10, anticorpo antiCD11a, anticorpo anti-CD11c, anticorpo anti-CD13, anticorpo antiCD14, anticorpo anti-CD15, anticorpo anti-CD19, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-CD22, anticorpo anti-CD23, anticorpo anti-CD30, anticorpo anti-CD31, anticorpo anti-CD33, anticorpo anti-CD34, anticorpo anti-CD35, anticorpo anti-CD38, anticorpo anti-CD41, anticorpo antiLCA/CD45, anticorpo anti-CD45RO, anticorpo anti-CD45RA, anticorpo anti-CD39, anticorpo anti-CD100, anticorpo anti-CD95/Fas, anticorpo anti-CD99, anticorpo anti-CD106, anticorpo anti-ubiquitina, anticorpo anti-CD71, anticorpo anti-c-myc, anticorpo anti-citoqueratinas, anticorpo anti-vimentinas, anticorpo anti-proteínas de HPV, anticorpo anticadeias kappa leve, anticorpo anti-cadeias lambda leve, anticorpo antimelanossomas, anticorpo anti-antígeno específico para próstata, anticorpo anti-S-100, anticorpo anti-antígeno tau, anticorpo anti-fibrina, anticorpo anti-queratinas e anticorpo anti-antígeno Tn.

(i) Anticorpos monoclonais [00151] Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo exceto por possíveis variantes que surgem

66/133 durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Portanto, o modificador monoclonal indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos diferentes ou policlonais.

[00152] Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com os métodos fornecidos aqui podem ser feitos pelo método do hibridoma descrito primeiro por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser feitos pelos métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 4.816.567).

[00153] No método do hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado como aqui descrito para dar origem a linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao polipeptídeo usado para a imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

[00154] As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultuta adequado que contém preferivelmente uma ou mais substancias que inibem o crescimento ou a sobrevida de células de mieloma parental, não fundidas. Por exemplo, se as células do mieloma parental carecem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substancias evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.

[00155] Em algumas modalidades, as células de mieloma são aquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção estável em alto nível de anticorpo pelas células que produzem anticorpo selecio

67/133 nadas e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. Entre essas, em algumas modalidades, as linhagens celulares de mieloma são linhagens de mieloma de murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11, disponibilizadas pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponibilizadas pela American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Linhagens celulares de mieloma humano ou de heteromieloma de camundongo-humano também já foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

[00156] O meio de cultura no qual as células do hibridoma são cultivadas é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno. Em algumas modalidades, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células do hibridoma é determinada pela imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como um radio-imunoensaio (RIA) ou ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA).

[00157] A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980).

[00158] Depois que as células do hibridoma são identificadas pela produção de anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados pelos procedimentos de diluição limitante e cultivados por métodos padronizados (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para esse propósito incluem, por exemplo, os meios D-MEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células do hibridoma podem ser cultivadas in vitro como tumores de

68/133 ascite em um animal.

[00159] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro pelos procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina tais como, por exemplo, polipeptídeo A-Sefarose, cromatografia com hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

[00160] O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos de murino). Em algumas modalidades, as células do hibridoma servem como fonte de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem o polipeptídeo de imunoglobulina de outra maneira, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA que codifica o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) e Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

[00161] Em uma modalidade adicional, anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo geradas usando técnicas descritas em McCafferty et al., Nature 348:552554 (1990). Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murino e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fago. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) pelo shuffling de cadeia (Marks

69/133 et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), assim como pela infecção combinatória e recombinação in vivo como estratégia para construir bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Portanto, essas técnicas são alternativas viáveis às técnicas do hibridoma para o anticorpo monoclonal tradicional para isolamento de anticorpos monoclonais.

[00162] O DNA também pode ser modificado, por exemplo, pela substituição da sequência codificadora para os domínios constantes de cadeia pesada e leve humanas no lugar de sequências homólogas de murino (Patente U.S. No. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 81:6851 (1984)) ou pela união covalente à sequência codificadora da imunoglobulina de toda ou parte da sequência codificadora para um polipeptídeo não imunoglobulina.

[00163] Tipicamente, tais polipeptídeos de não imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo ou eles são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação ao antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação ao antígeno que possui especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação ao antígeno que possui especificidade por um antígeno diferente.

[00164] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos aqui descritos, o anticorpo é IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG monoclonal.

(ii) Anticorpos humanizados [00165] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Métodos para humanização de anticorpos não humanos têm sido descritos na técnica. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são geralmente referidos como resíduos im

70/133 portados, que são tipicamente removidos de um domínio variável importado. A humanização pode ser essencialmente realizada de acordo com o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), pela substituição das sequências da região hipervariável pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Patente U.S. No. 4.816.567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos pelos resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor.

[00166] A escolha de domínios variáveis humanos, leve e pesado, a serem usados na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim chamado método best-fit, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a biblioteca inteira de sequências do domínio variável humano conhecidas. A sequência humana que está mais próxima daquela do roedor é então aceita como a região estrutural humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). Outro método usa uma região estrutural particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).

[00167] É importante que os anticorpos sejam humanizados com

71/133 retenção da alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para obter essa meta, em algumas modalidades dos métodos, anticorpos humanizados são preparados pelo processo da análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais que usam modelos tridimensionais da sequência parental ou humanizada. Modelos tridimensionais de imunoglobulina estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles versados na técnica. Programas de computador que estão disponíveis ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências candidatas selecionadas de imunoglobulina. A inspeção dessas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência candidata de imunoglobulina, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antígeno. Desse modo, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir do receptor e sequências importadas tal que a característica desejada do anticorpo, tal como a afinidade aumentada pelo(s) antígeno(s) alvo, seja obtida. Em geral, os resíduos da região hipervariável são diretamente e o mais substancialmente envolvido na influência da ligação ao antígeno.

(iii) Anticorpos humanos [00168] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano. Como uma alternativa à humanização, os anticorpos humanos podem ser gerados. Por exemplo, agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, depois da imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene da região de junção (J_H) da cadeia pesada do anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e da linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência do arranjo de gene

72/133 de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tai camundongo mutante da linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos depois da inoculação do antígeno. Veja, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann etal., Year in Immuno. 7:33 (1993); e Patentes US Nos. 5.591.669; 5.589.369; e 5.545.807.

[00169] Alternativamente, a tecnologia de apresentação em fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de gene de domínio variável (V) de imunoglobulina a partir de doadores não imunizados. De acordo com essa técnica, genes do domínio V de anticorpo são clonados em fase no gene do polipeptídeo maior ou menos de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd e apresentados como fragmentos de anticorpo funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma do fago, seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula B. A apresentação em fago pode ser realizada em uma variedade de formatos; para uma revisão desses veja, por exemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para apresentação em fago. Clackson et al., Nature 352:624628 (1991) isolaram um arranjo diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um arranjo diverso de antígenos (incluindo auto

73/133 antígenos) pode ser isolado essencialmente de acordo com as técnicas descritas por Marks et aí., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Veja também as Patentes U.S Nos. 5.565.332 e 5.573.905.

[00170] Anticorpos humanos também podem ser gerados pelas células B ativadas in vitro (veja as Patentes U.S Nos. 5.567.610 e 5.229.275).

(iv) Fragmentos de anticorpo [00171] Em algumas modalidades, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Várias técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos são derivados através da digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto et a!., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser produzidos agora diretamente pelas células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(abj₂ (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(abj₂ podem ser isolados diretamente a partir de culturas de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo ficarão aparentes para o profissional experiente. Em outras modalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Veja WO 93/16185; Patente US No. 5.571.894; e Patente US No. 5.587.458. O fragmento de anticorpo também pode ser um anticorpo linear, por exemplo, como descrito na Patente US 5.641.870. Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

74/133 [00172] Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo aqui descritos são fornecidos. Em algumas modalidades, o fragmento de anticorpo é um fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F (ab')₂, um scFv, um Fv ou um diabody.

(v) Anticorpos biespecíficos [00173] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois tipos diferentes de epítopos. Anticorpos biespecíficos exemplificadores podem se ligar a dois epítopos diferentes. Alternativamente, um braço de ligação do anticorpo biespecífico pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula provocadora sobre um leucócito tal como um receptor da molécula de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3) ou receptores FC para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de modo a focalizar os mecanismos de defesa para a célula. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de extensão completa ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(abj₂).

[00174] Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de extensão completa é baseada na co-expressão de pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Devido a seleção aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é feita geralmente por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante

75/133 complicada e os rendimentos do produto pequenos. Procedimentos similares estão descritos no WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBOJ., 10:3655-3659 (1991).

[00175] De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis do anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antígeno) são fundidos com sequências do domínio constante de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a fusão é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões da dobradiça, CH2 e CH3. Em algumas modalidades, a primeira região constante da cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para a ligação à cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando proporções desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção fornecem rendimentos ótimos. Entretanto, é possível inserir as sequências codificadoras para duas ou todas três cadeias de polipeptídeo em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em proporções iguais resulta em rendimentos altos ou quando as proporções não são de significância particular.

[00176] Em algumas modalidades dessa abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia leve -cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Foi descoberto que essa estrutura assimétrica facilita a separação do

76/133 composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, já que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica fornece uma via se separação fácil. Essa abordagem está descrita no WO 94/04690. Para detalhes adicionais da geração de anticorpos específicos veja, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

[00177] De acordo com outra abordagem descrita na Patente US No. 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar o percentual de heterodímeros que são recuperados da cultura de célula recombinante. Em algumas modalidades, a interface compreende pelo menos uma parte do domínio C_h3 de um domínio constante do anticorpo. Nesse método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou similar às cadeias laterais são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo pela substituição das grandes cadeias laterais de aminoácidos por outras menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.

[00178] Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou heteroconjugados. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina, o outro à biotina. Tais anticorpos têm sido propostos, por exemplo, para direcionar células-alvo do sistema imune para células indesejadas (Patente US No. 4.676.980) e para o tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes de reticula

77/133 ção adequados são bem conhecidos na técnica e estão descritos na Patente US No. 4.676.980, junto com várias técnicas de reticulação.

[00179] Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo também têm sido descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando a ligação química. Brennan etal., Science 229: 81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(abj₂· Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditiois vicinais impedir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-ΤΝΒ é então reconvertido em Fab'-tiol pela redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

[00180] Várias técnicas para fazer e isolar fragmentos de anticorpo biespecífico diretamente da cultura de célula recombinante também já foram descritas. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos têm sido produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos do zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados a porções de Fab' de dois anticorpos diferentes pela fusão de gene. Os homodímeros do anticorpo foram reduzidos na região da dobradiça para formar monômeros e depois reoxidados para formar heterodímeros do anticorpo. Esse método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia do diabody descrita por Hollinger etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para fazer fragmentos de anticorpo biespecíficos. Os fragmentos com

78/133 preendem um domínio variável de cadeia pesada (V_H) conectado a um domínio variável de cadeia leve (V_L) por um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre dois domínios sobre a mesma cadeia. Consequentemente, os domínios V_H e V_L de um fragmento são forçados a parear com os domínios V_H e V_L de outro fragmento, formando dessa maneira dois sítios de ligação ao antígeno. Outra estratégia para fazer fragmentos de anticorpo biespecíficos pelo uso de dímeros de Fv de cadeia única (sFv) também já foram relatados. Veja, Gruber etal., J. Immunol. 152:5368 (1994).

[00181] Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

(v) Anticorpos multivalentes [00182] Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos multivalentes. Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual o anticorpo se liga. Os anticorpos fornecidos aqui podem ser anticorpos multivalentes (que são diferentes da classe de IgM) com três ou mais sítios de ligação ao antígeno (por exemplo anticorpos tetravalentes) que podem ser rapidamente produzidos pela expressão recombinante de um ácido nucleico que codifica as cadeias de polipeptídeo do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação ao antígeno. Um domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região da dobradiça. Nesse cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais sítios de ligação ao antígeno amino-terminais à região Fc. O anticorpo multivalente preferido compreende (ou consiste em) três a cerca de oito, mas preferivelmente quatro sítios de ligação ao antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia de

79/133 polipeptídeo (e preferivelmente duas cadeias de polipeptídeos), em que a cadeia de polipeptídeo compreende dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, as cadeias de polipeptídeo podem compreender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia de polipeptídeos de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo e n é 0 ou 1. Por exemplo, as cadeias de polipeptídeo podem compreender: VH-CH1-ligante flexível-VH-CH1-cadeia da região Fc; ou VH-CH1-VH-CH1-região da cadeia Fc. O anticorpo multivalente preferivelmente compreende pelo menos dois (e preferivelmente quatro) polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve. O anticorpo multivalente pode, por exemplo, compreender cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve contemplados aqui compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, compreende um domínio CL.

[00183] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico. Exemplos de anticorpos multiespecíficos incluem, mas não são limitados a um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada (V_H) e um domínio variável de cadeia leve (V_L), onde a unidade V_HV_L tem especificidade poliepitópica, anticorpos que possuem dois ou mais domínios de V_L e V_H com cada unidade V_HV_L se ligando a um epítopo diferente, anticorpos que possuem dois ou mais domínios variáveis únicos com cada domínio variável único se ligando a um epítopo diferente, anticorpos de extensão completa, fragmentos de anticorpo tais como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacorpos, diacorpos biespecíficos, triacorpos, anticorpos tri-funcionais, fragmentos de anticorpo que tenham sido ligados covalentemente ou não covalentemente. Em algumas modalidades o anticorpo tem especificidade poliepitópica; por exemplo, a habilidade de se ligar especificamente a dois ou mais epí

80/133 topos diferentes sobre o mesmo ou sobre alvos diferentes. Em algumas modalidades, os anticorpos são monoespecíficos; por exemplo, um anticorpo se liga a apenas um epítopo. De acordo com uma modalidade, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo IgG que se liga a cada epítopo com uma afinidade de 5 μΜ a 0,001 pM, 3 μΜ a 0,001 pM, 1 μΜ a 0,001 pM, 0,5 μΜ a 0,001 pM, ou 0,1 μΜ a 0,001 pM.

(vi) Outras modificações do anticorpo [00184] Pode ser desejável modificar o anticorpo fornecido aqui com relação à função efetora, por exemplo, de modo a intensificar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) do anticorpo. Isso pode ser obtido pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácido em uma região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, permitindo dessa maneira a formação de ligação de dissulfeto entre as cadeias. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internaiização aperfeiçoada e/ou morte celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentadas. Veja Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumor intensificada também podem ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais como descrito em Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo que pode ser manipulado tem regiões Fc duplas e pode dessa maneira ter lise mediada pelo complemento e capacidade de ADCC intensificadas. Veja, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219230 (1989).

[00185] Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo, alterações de aminoácidos podem ser feitas no anticorpo como descritas em US 2006/0067930, que está incorporada aqui por referência em sua totali81/133 dade.

(B) Variantes e Modificações de Polipeptídeo [00186] As modificações da sequência de aminoácidos dos polipeptídeos incluindo os anticorpos aqui descritos podem ser usadas nos métodos de purificação de polipeptídeos (por exemplo, anticorpos) aqui descritos.

(i) Variantes de Polipeptídeos [00187] Variante de polipeptídeo significa um polipeptídeo, preferivelmente um polipeptídeo ativo, como definida aqui que possui pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência nativa de extensão completa do polipeptídeo, uma sequência de polipeptídeo que carece do peptídeo de sinal, um domínio extracelular de um polipeptídeo com ou sem o peptídeo de sinal. Tais variantes de polipeptídeo incluem, por exemplo, polipeptídeos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados ou deletados, na terminação N ou C da sequência de aminoácido nativa de extensão completa. Comumente, uma variante de polipeptídeo TAT terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência do polipeptídeo nativo de extensão completa, uma sequência de polipeptídeo que carece do peptídeo de sinal, um domínio extracelular de um polipeptídeo com ou sem o peptídeo de sinal. Opcionalmente, variantes de polipeptídeo não terão mais do que uma substituição conservative de aminoácidos quando comparada com a sequência nativa do polipeptídeo, alternativamente não mais do que cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições conservatives quando comparada com a sequência nativa do polipeptídeo.

[00188] A variante de polipeptídeo pode ser truncada na terminação N ou terminação C ou pode carecer de resíduos internos, por exemplo,

82/133 quando comparada com um polipeptídeo nativo de extensão completa. Certas variantes de polipeptídeo podem carecer de resíduos de aminoácidos que não são essenciais para a atividade biológica desejada. Essas variantes de polipeptídeos com truncamentos, deleções e inserções podem ser preparadas por qualquer número de técnicas convencionais. Variantes de polipeptídeo desejadas podem ser sintetizadas quimicamente. Outra técnica adequada envolve o isolamento e a amplificação de um fragmento de ácido nucleico que codifica a variante desejada do polipeptídeo, pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Os oligonucleotídeos que definem a terminação desejada do fragmento de ácido nucleico são empregados nos iniciadores 5' e 3' na PCR. Preferivelmente, variantes de polipeptídeo compartilham pelo menos uma atividade biológica e/ou imunológica com o polipeptídeo nativo aqui descrito.

[00189] Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carbóxi terminais que variam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos que contêm uma centena ou mais resíduos, assim como inserções intra-sequência de resíduos únicos ou múltiplos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes por inserção da molécula do anticorpo incluem a fusão na terminação N ou C do anticorpo a uma enzima ou polipeptídeo que aumente a meia-vida sérica do anticorpo. [00190] Por exemplo, pode ser desejável aperfeiçoar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do polipeptídeo. Variantes de sequência de aminoácidos do polipeptídeo são preparadas pela introdução de alterações de nucleotídeo apropriadas no ácido nucleico do anticorpo ou pela síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do polipeptídeo. Qualquer

83/133 combinação de deleção, inserção e substituição é feita para se chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoácido também podem alterar os processos pós-traducional do polipeptídeo (por exemplo, anticorpo), tal como a alteração do número de sítios de glicosilação.

[00191] A orientação na determinação de qual aminoácido pode ser inserido, substituído ou deletado sem afetar adversamente a atividade desejada, pode ser encontrada pela comparação da sequência do polinucleotídeo com aquela de moléculas de polipeptídeos homólogos conhecidos e minimizando o número de alterações das sequências de aminoácidos feitas em regiões de alta homologia.

[00192] Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do polipeptídeo (por exemplo, anticorpo) que são locais preferidos para a mutagênese é chamado de mutagênese por rastreamento de alanina, como descrito por Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou um grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como Arg, Asp, His, Lys, e Glu) e substituído por um aminoácido carregado neutro ou negativamente carregado (o mais preferivelmente Alanina ou Polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno. Essas localizações de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinadas pela introdução de variantes adicionais ou outras variantes nos, para os sítios de substituição. Portanto, enquanto que o sítio para a introdução de uma variação de sequência de aminoácidos é predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, a mutagênese por rastreamento de ala ou mutagênese aleatória são rastreadas quanto a atividade desejável.

[00193] Outro tipo de variante é uma variante por substituição de

84/133 aminoácido. Essas variantes possuem pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese por substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações de FR também são contempladas. As substituições conservatives são mostradas na Tabela 1 abaixo, sob o título de substituições preferidas. Se tais substituições resultam em uma alteração na atividade biológica, então mais alterações substanciais, denominadas substituições exemplificadoras na Tabela 1 ou como descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos rastreados.

Tabela 1

Resíduo Original	Substituições Exemplicadoras	Substituições Preferidas
Ala (A)	Vai; Leu; lie	Vai
Arg (R)	Lys; Gin; Asn	Lys
Asn (N)	Gin; His; Asp, Lys; Arg	Gin
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gin (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gin	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gin; Lys; Arg	Arg
lle(l)	Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina	Leu
Leu (L)	Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Phe	lie
Lys (K)	Arg; Gin; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; lie	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Vai; lie; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Vai; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Vai (V)	lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina	Leu
[00194] Modificações substanciais nas propried	ades biológicas do

polipeptídeo são obtidas pela seleção de substituições que diferem

85/133 significativamente em seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura do arcabouço do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio-alvo ou (c) o volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas ptoptiedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)). [00195] (1) não polares: Ala (A), Vai (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) [00196] (2) polares não carregados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q) [00197] (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) [00198] (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H) [00199] Alternativamente, resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos com base em propriedades comuns das cadeias laterais:

[00200] (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;

[00201] (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

[00202] (3) ácidos: Asp, Glu;

[00203] (4) básicos: His, Lys, Arg;

[00204] (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly,

Pro;

[00205] (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[00206] Substituições não conservatives ocasionarão a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[00207] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente por serina, para aperfeiçoar a estabilidade oxidativa da molécula e impedir a reticulação aberrante. Inversamente, ligações de cisteína podem ser adicionadas ao polipeptídeo para aperfeiçoar a es

86/133 tabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

[00208] Um tipo particularmente preferido de variante por substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado). Geralmente, as variantes resultantes selecionadas para desenvolvimento posterior terão propriedades biológicas aperfeiçoadas em relação ao anticorpo parental a partir do qual elas são geradas. Um modo conveniente para a geração de tais variantes por substituição envolve a maturação por afinidade usando a apresentação em fago. Resumidamente, vários sítios de região hipervariável (por exemplo, 6 a 7 sítios) são mutadas para gerar todas as possíveis substituições de amino'[ácidos em cada sítio. As variantes de anticorpo assim geradas são apresentadas em um aspecto monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões do produto de gene III de M13 embalado dentro de cada partícula. As variantes apresentadas em fago são então rastreadas quanto a sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) como aqui descritas. A fim de identificar sítios da região hipervariável candidatos à modificação, a mutagênese por rastreamento de alanina pode ser realizada para identificar os resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação ao antígeno. Alternativamente ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o alvo. Tais resíduos de contato e resíduos da vizinhança são candidatos a substituição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido ao rastreamento como aqui descrito e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento posterior.

87/133 [00209] Outro tipo de variante de aminoácido do polipeptídeo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. O polipeptídeo pode compreender porções de não aminoácidos. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser glicosilado. Tal glicosilação pode ocorrer naturalmente durante a expressão do polipeptídeo na célula hospedeira ou organismo hospedeiro ou pode ser uma modificação deliberada que surge da intervenção humana. Por alterar, é compreendida a deleção de uma ou mais porções de carboidrato encontradas no polipeptídeo e/ou a adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no polipeptídeo.

[00210] A glicosilação do polipeptídeo está tipicamente ligada a N ou ligada a O. Ligada a N se refere ao acoplamento da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido, exceto a prolina, são sequências de reconhecimento para o acoplamento enzimático da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim a presença dessas sequências de tripeptídeo no polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação ligada à O se refere ao acoplamento de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, o mais comumente serina ou treonina, embora a 5-hidroxiprolina ou a 5hidroxilisina também possam ser usadas.

[00211] A adição de sítios de glicosilação ao polipeptídeo é convenientemente obtida pela alteração da sequência de aminoácido tal que ela contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeo acima descritas (para sítios de glicosilação ligados a N). A alteração também pode ser feita pela adição de, ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação ligados a O).

[00212] A remoção de porções de carboidrato presentes no polipep

88/133 tídeo pode ser obtida quimicamente ou enzimaticamente ou pela substituição mutacional de códons que codificam resíduos de aminoácidos que servem como alvos para a glicosilação. A divagem enzimática de porções de carboidrato no polipeptídeo pode ser obtida pelo uso de uma variedade de endo e exo-glicosidases.

[00213] Outras modificações incluem a deamidação de resíduos de glutaminil e asparaginil nos resíduos de glutamil e aspartil correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de seril ou treonil, metilação de grupos a-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina, acetilação de amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxila C terminal.

(ii) Polipeptídeos Quiméricos [00214] O polipeptídeo aqui descrito pode ser modificado de modo a formar moléculas quiméricas que compreendem o polipeptídeo fundido a outro polipeptídeo heterólogo ou sequência de aminoácido. Em algumas modalidades, uma molécula quimérica compreende uma fusão do polipeptídeo com um polipeptídeo marcador que fornece um epítopo ao qual um anticorpo anti-marcador pode se ligar seletivamente. O marcador de epítopo é geralmente colocado na terminação amino ou carboxila do polipeptídeo. A presença de tais formas com epítopo marcado do polipeptídeo pode ser detectada usando um anticorpo contra o polipeptídeo marcador. O fornecimento do marcador de epítopo também possibilita que o polipeptídeo seja facilmente purificado pela purificação de afinidade usando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao marcador de epítopo.

[00215] Em uma modalidade alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão do polipeptídeo com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Uma forma bivalente da molécula quimérica é referida como uma imunoadesina.

[00216] Como usada aqui, a expressão imunoadesina designa

89/133 moléculas semelhantes a anticorpo que combinam a especificidade de ligação de um polipeptídeo heterólogo com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é diferente do sítio de reconhecimento e de ligação ao antígeno de um anticorpo (isto é, é heterólogo) e uma sequência do domínio constante de imunoglobulina. A parte da adesina de uma molécula de imunoadesina tipicamente é uma sequência de aminoácidos contígua que compreende pelo menos o sítio de ligação de um receptor ou ligante. A sequência do domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tais como lgG-1, lgG-2, lgG-3, ou subtipos de lgG-4, IgA (incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM.

[00217] As fusões de Ig incluem preferivelmente a substituição de uma forma solúvel (domínio transmembrana deletado ou inativado) de um polipeptídeo no lugar de pelo menos uma região variável dentro de uma molécula de Ig. Em uma modalidade particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões da dobradiça, CH₂ e CH₃, ou a dobradiça, d-h, CH₂ e CH₃ de uma molécula de IgG 1.

(iii) Conjugados de Polipeptídeo [00218] O polipeptídeo para uso nas formulações de polipeptídeo pode ser conjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, um agente inibitório do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, de planta ou de animal ou seus fragmentos) ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

[00219] Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de tais conjugados podem ser usados. Adicionalmente, toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser usadas incluem a cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes de toxina diftérica, cadeia A

90/133 de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytholaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de nomordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos estão disponíveis para a produção de polipeptídeos radioconjugados. Exemplos incluem ²¹²Bi, ¹³¹1, ¹³¹ In, ⁹⁰Y, e ¹⁸⁶Re. Conjugados de polipeptídeo e agente citotóxico são feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoesteres (tais como adpimidato de dimetila HCL), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(pazidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium derivatives (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6diisocianato de tolieno), e compostos bis-ativos de flúor (tais como 1,5difluor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metidietileno triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 é um agente quelante exemplificador para conjugação do radionuclídeo ao polipeptídeo.

[00220] Conjugados de um polipeptídeo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como a caliqueamicina, maitansinoides, um tricoteno e CC1065 e os derivados dessas toxinas que possuem atividade de toxina também são contemplados aqui.

[00221] Maitansinoides são inibidores mitóticos que atuam pela inibição da polimerização da tubulina. A maitansina foi isolada primeiro do arbusto africano Maytenus serrata. Subsequentemente, foi descoberto que certos micróbios também produzem maitansinoides, tal co

91/133 mo maitansinol e ésteres C-3 de maitansinol. Maitansinol sintético e seus derivados e análogos também são contemplados. Existem vários grupos de ligação conhecidos na técnica para fazer conjugados de polipeptídeo-maitansinoide, incluindo, por exemplo, aqueles descritos na Pat. U.S. No. 5.208.020. Os grupos de ligação incluem grupos de dissulfeto, grupos tio éter, grupos ácidos lábeis, grupos fotolábeis, grupos lábeis de peptidase ou grupos lábeis de esterase como descritos nas patentes identificadas acima, grupos de dissulfeto e tio éter sendo preferidos.

[00222] O ligante pode ser acoplado à molécula de maitansinoide em várias posições, dependendo do tipo de ligante. Por exemplo, uma ligação éster pode ser formada pela reação com um grupo hidroxila usando técnicas de acoplamento convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 que tem um grupo hidroxila, a posição C-14 sendo modificada com hidroximetila, a posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e a posição C-20 tendo um grupo hidroxila. Em uma modalidade preferida, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo de maitansinol.

[00223] Outro conjugado de interesse compreende um polipeptídeo conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de caliqueamicina de antibióticos são capazes de produzir rupturas de DNA de fita dupla em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família de caliqueamicina, veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 5.712.374. Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não são limitados a γ/, α₂, α₃', Nacetil-γι¹, PSAG e θ/ . Outro fármaco anti-tumor ao qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é um antifolato. Ambos, caliqueamicina e QFA possuem sítios intracelulares de ação e não cruzam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a absorção celular desses agentes através da internaiização mediada pelo polipeptídeo (por

92/133 exemplo, anticorpo) intensifica grandemente seus efeitos citotóxicos.

[00224] Outros agentes anti-tumor que podem ser conjugados aos polipeptídeos aqui descritos incluem BCNU, estreptozocina, vincristina e 5-fluoruracil, a família de agentes conhecida coletivamente como complexo LL-E33288, assim como as esperamicinas.

[00225] Em algumas modalidades, o polipeptídeo pode ser um conjugado entre um polipeptídeo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease tal como uma desoxirribonuclease; DNAse).

[00226] Em outra modalidade, o polipeptídeo (por exemplo, anticorpo) pode ser conjugado com um receptor (tal como estreptavidina) para utilização no pré-direcionamento para o tumor em que o receptor de polipeptídeo é administrado ao paciente, seguida pela remoção do conjugado não ligado da circulação usando um agente de remoção e depois a administração de um ligante (por exemplo, avidina) que está conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um radionuclídeo).

[00227] Em algumas modalidades, o polipeptídeo pode ser conjugado a uma enzima que ativa um profármaco que converte o profármaco (por exemplo, um agente quimioterapêutico de peptidil) em um fármaco anticâncer ativo. O componente de enzima do imunoconjugado inclui qualquer enzima capaz de atuar sobre o profármaco de tal maneira a convertê-lo em sua forma mais ativa citotóxica.

[00228] Enzimas que são úteis incluem, mas não são limitadas a fosfatase alcalina útil para a conversão de profármacos que contêm fosfato em fármacos livres; arilsulfatase útil para a conversão de profármacos que contêm sulfato em fármacos livres; citosina deaminase útil para a conversão de 5-fluorcitosina não tóxica no fármaco anticâncer, 5-fluoruracil; proteases, tais como protease de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para a conversão de profármacos que contêm pep

93/133 tídeo em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para a conversão de profármacos que contêm substituintes de D-aminoácido; enzimas que clivam carboidrato tais como β-galactosidase e neuraminidase úteis para a conversão de profármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase útil para a conversão de fármacos derivatizados com β-lactamas em fármacos livres; e penicilina amidases, tais como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis para a conversão de fármacos derivatizados nos nitrogênios da amina com grupos fenoxiacetil ou fenilacetil, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como abzimas, podem ser usados para converter os profármacos em fármacos livres ativos.

(iv) Outros [00229] Outro tipo de modificação covalente do polipeptídeo compreende a ligação do polipeptídeo a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. O polipeptídeo também pode ser capturado em microcápsulas preparadas, por exemplo, pelas técnicas de coacervação ou pela polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato, respectivamente), em sistemas de liberação de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, micro-emulsões, nanopartículas e nano-cápsulas) ou em macro-emulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Ed., (1990).

IV. Obtenção de Polipeptídeos para Uso nas Formulações e Métodos [00230] Os polipeptídeos usados nos métodos de análise aqui descritos podem ser obtidos usando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo métodos recombinantes. As seções a seguir fornecem uma

94/133 orientação com relação a esses métodos.

(A) Polinucleotídeos [00231] Polinucleotídeo ou ácido nucleico, como usados aqui alternativamente, se referem a polímeros de nucleotídeos de qualquer extensão e incluem DNA e RNA.

[00232] Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos podem ser obtidos a partir de qualquer fonte que inclui, mas não está limitada a uma biblioteca de cDNA preparadas a partir de um tecido considerado possuir o mRNA do polipeptídeo e expressá-lo em um nível detectável. Consequentemente, polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo podem ser convenientemente obtidos a partir de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido humano. O gene que codifica o polipeptídeo também pode ser obtido de uma biblioteca genômica ou pelos procedimentos sintéticos conhecidos (por exemplo, síntese automatizada de ácido nucleico).

[00233] Por exemplo, o polinucleotídeo pode codificar uma cadeia inteira de uma molécula de imunoglobulina tal como uma cadeia leve ou uma cadeia pesada. Uma cadeia pesada completa inclui não apenas uma região variável de cadeia pesada (V_H), mas também uma região constante de cadeia pesada (C_H) que tipicamente compreenderá três domínios constantes: C_H1, C_H2 e C_H3; e uma região da dobradiça. Em algumas situações a presença de uma região constante é desejável.

[00234] Outros polipeptídeos que podem ser codificados pelo polinucleotídeo incluem fragmentos de anticorpo que se ligam ao antígeno tais como anticorpos de domínio único (dAbs), Fv, scFv, Fab' e F(abj₂ e minibodies. Minibodies são (tipicamente) fragmentos de anticorpo bivalente dos quais o domínio C_H1 e C_K ou C_L foi removido. Como os minibodies são menores do que os anticorpos convencionais, eles devem obter uma penetração tecidual melhor no uso clíni

95/133 co/diagnóstico, mas sendo bivalentes eles devem reter uma afinidade de ligação maior do que fragmentos de anticorpo monovalentes, tais como dAbs. Consequentemente, a menos que o contexto dite de outra maneira, a expressão anticorpo como usada aqui abrange não apenas moléculas de anticorpo completo, mas também fragmentos de ligação ao antígeno do tipo discutido acima. Preferivelmente cada região estrutural presente no polipeptídeo codificado compreenderá pelo menos uma substituição de aminoácido em relação a estrutura aceptora humana correspondente. Portanto, por exemplo, as regiões estruturais podem compreender, no total, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze ou quinze substituições de aminoácidos em relação às regiões estruturais aceptoras.

VI. Modalidades exemplificadoras [00235] 1. Em uma modalidade, a invenção fornece um método para analisar uma composição que compreende um polipeptídeo e um ou mais contaminantes, o método compreendendo a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, em que o tampão de carregamento está em um primeiro pH e compreende uma primeira força iônica; b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição está alterada em um gradiente de força iônica, em que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica; c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes. Em alguns aspectos dessa modalidade, a invenção fornece métodos para analisar polipeptídeos em composições que compreendem o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, em que o método separa um ou mais contaminantes do polipeptídeo, o método compreendendo a) ligar

96/133 o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, em que o tampão de carregamento está em um primeiro pH e compreende uma primeira força iônica; b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição está alterada em um gradiente de força iônica, em que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica; c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, em que o método é usado para analisar polipeptídeos que possuem um pl que varia entre cerca de 7,0 a cerca de 9,5.

[00236] 2. Em uma modalidade adicional da modalidade 1, o polipeptídeo é um anticorpo ou uma imunoadesina ou um fragmento desses.

[00237] 3. Em uma modalidade adicional das modalidades 1 ou 2, o polipeptídeo é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento.

[00238] 4. Em uma modalidade adicional das modalidades 2 ou 3, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[00239] 5. Em uma modalidade adicional das modalidades 2 ou 3, o anticorpo é um anticorpo humanizado.

[00240] 6. Em uma modalidade adicional das modalidades 2 ou 3, o anticorpo é um anticorpo quimérico.

[00241] 7. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 2 a 6, o anticorpo é um fragmento de anticorpo.

[00242] 8. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 7, o contaminante é uma variante do polipeptídeo.

[00243] 9. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 7, o contaminante é um produto de degradação do polipeptídeo. Por exemplo, uma variante de carga.

97/133 [00244] 10. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 9, o polipeptídeo tem um pl maior do que cerca de 9,0.

[00245] 11. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 10, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de cátion.

[00246] 12. Em uma modalidade adicional da modalidade 11, o material de cromatografia por troca de cátion é um material cromatográfico sulfonado ou um material cromatográfico carboxilado.

[00247] 13. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 12, o gradiente de pH é um gradiente linear.

[00248] 14. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 12, o gradiente de pH é um gradiente em etapas.

[00249] 15. Em uma modalidade adicional das modalidades 13 ou

14, o gradiente de pH compreende um aumento entre cerca de pH 5 a cerca de pH 11.

[00250] 16. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 15, o gradiente de pH é gerado usando um ou mais tampões.

[00251] 17. Em uma modalidade adicional da modalidade 15, o um ou mais tampões são selecionados entre piperazina, imidazol, tris, fosfato ou CAPS.

[00252] 18. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 17, o gradiente de força iônica é um gradiente linear.

[00253] 19. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 17, o gradiente de força iônica é um gradiente em etapas.

[00254] 20. Em uma modalidade adicional das modalidades 18 ou

19, o gradiente de força iônica compreende um aumento na concentração de sal entre cerca de 0 mM a cerca de 200 mM.

98/133 [00255] 21. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 18 a 20, o gradiente de força iônica é um gradiente de NaCI, um gradiente de KCI ou um gradiente de Na₂SO₄.

[00256] 22. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 9, o polipeptídeo tem um pl menor do que cerca de 7,0.

[00257] 23. Em uma modalidade adicional da modalidade 22, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de ânion.

[00258] 24. Em uma modalidade adicional da modalidade 23, o material de cromatografia por troca de ânion é um material cromatográfico de amina quaternária ou um material cromatográfico de amina terciária.

[00259] 25. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 22 a 24, o gradiente de pH é um gradiente linear.

[00260] 26. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 22 a 24, o gradiente de pH é um gradiente em etapas.

[00261] 27. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 25 ou 26, o gradiente de pH compreende uma diminuição entre cerca de pH 8 a cerca de pH 5.

[00262] 28. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 22 a 27, o gradiente de pH é gerado usando um ou mais tampões.

[00263] 29. Em uma modalidade adicional da modalidade 28, o um ou mais tampões são selecionados entre piperazina, imidazol ou Tris.

[00264] 30. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 22 a 29, o gradiente de força iônica é um gradiente linear. [00265] 31. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 22 a 29, o gradiente de força iônica é um gradiente em etapas.

99/133 [00266] 32. Em uma modalidade adicional das modalidades 30 ou

31, o gradiente de força iônica compreende um aumento na concentração de sal entre cerca de 0 mM a cerca de 200 mM.

[00267] 33. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 30 a 32, o gradiente de força iônica é um gradiente de NaCI, um gradiente de KCI ou um gradiente de Na₂SO₄.

[00268] 34. Em uma modalidade, a invenção fornece um método para analisar uma composição que compreende um polipeptídeo e um ou mais contaminantes, o método compreendendo a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, em que o tampão de carregamento está em um primeiro pH e compreende uma primeira força iônica; b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e em que a força iônica do tampão de eluição é essencialmente a mesma como a força iônica do tampão de carregamento, em que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica inicial; c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes. Em alguns aspectos dessa modalidade, a invenção fornece um método para analisar polipeptídeos em composições que compreendem o polipeptídeo, o método compreendendo a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, em que o tampão de carregamento está em um primeiro pH e compreende uma primeira força iônica; b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, em que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e em que a força iônica do tampão de eluição é essencialmente a mesma como a força

100/133 iônica do tampão de carregamento, em que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica inicial; c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, em que o método é usado para analisar polipeptídeos que possuem um pl que varia entre cerca de 7,0 a cerca de 9,5.

[00269] 35. Em uma modalidade adicional da modalidade 34, o polipeptídeo é um anticorpo ou uma imunoadesina ou um fragmento desses.

[00270] 36. Em uma modalidade adicional das modalidades 34 ou

35, o polipeptídeo é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento.

[00271] 37. Em uma modalidade adicional das modalidades 35 ou

36, o anticorpo é um anticorpo humano.

[00272] 38. Em uma modalidade adicional das modalidades 35 ou

36, o anticorpo é um anticorpo humanizado.

[00273] 39. Em uma modalidade adicional das modalidades 35 ou

36, o anticorpo é um anticorpo quimérico.

[00274] 40. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 35 a 39, o anticorpo é um fragmento de anticorpo.

[00275] 41. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 34 a 40, o contaminante é uma variante de polipeptídeo.

[00276] 42. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 34 a 40, o contaminante é um produto de degradação do polipeptídeo.

[00277] 43. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 34 a 42, o polipeptídeo tem um pl maior do cerca de 9,0.

[00278] 44. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 34 a 43, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de cátion.

[00279] 45. Em uma modalidade adicional da modalidade 44, o ma

101/133 terial de cromatografia por troca de cátion é urn material cromatográfico sulfonado ou urn material cromatográfico carboxilado.

[00280] 46. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 34 a 45, o gradiente de pH é um gradiente linear.

[00281] 47. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 34 a 45, o gradiente de pH é um gradiente em etapas.

[00282] 48. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 46 ou 47, o gradiente de pH compreende um aumento entre cerca de pH 5 a cerca de pH 11.

[00283] 49. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 34 a 48, o gradiente de pH é gerado usando um ou mais tampões.

[00284] 50. Em uma modalidade adicional da modalidade 49, o um ou mais tampões são selecionados entre piperazina, imidazol, tris, fosfato ou CAPS.

[00285] 51. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 34 a 50, a força iônica do tampão de eluição está entre cerca de 0 mM a cerca de 100 mM.

[00286] 52. Em uma modalidade adicional da modalidade 51, o tampão de eluição compreende cerca de 0 mM de NaCI a cerca de 100 mM de NaCI, cerca de 0 mM de KCI a cerca de 100 mM de KCI ou cerca de 0 mM de Na₂SO₄ a cerca de 100 mM de Na₂SO₄.

[00287] 53. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 34 a 42, o polipeptídeo tem um pl menor do que 7,0.

[00288] 54. Em uma modalidade adicional da modalidade 53, o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de ânion.

[00289] 55. Em uma modalidade adicional da modalidade 54, o material de cromatografia por troca de ânion é um material cromatográfico de amina quaternária ou um material cromatográfico de amina terciá102/133 ria.

[00290] 56. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 53 a 35, o gradiente de pH é um gradiente linear.

[00291] 57. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 53 a 35, o gradiente de pH é um gradiente em etapas.

[00292] 58. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 56 ou 57, o gradiente de pH compreende uma diminuição entre cerca de pH 8 a cerca de pH 5.

[00293] 59. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 53 a 58, o gradiente de pH é gerado usando um ou mais tampões.

[00294] 60. Em uma modalidade adicional da modalidade 59, o um ou mais tampões são selecionados entre piperazina, imidazol ou Tris.

[00295] 61. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 53 a 60, a força iônica do tampão de eluição está entre cerca de 0 mM a cerca de 100 mM.

[00296] 62. Em uma modalidade adicional da modalidade 61, o tampão de eluição compreende cerca de 0 mM de NaCI a cerca de 100 mM de NaCI.

[00297] 63. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 62, a análise é pela cromatografia líquida de alto desempenho.

[00298] 64. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 63, a concentração do tampão no tampão de carregamento e/ou tampão de eluição varia entre 10 mM a cerca de 50 mM. [00299] 65. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 64, o primeiro pH varia entre cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0.

[00300] 66. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 65, a temperatura do material cromatográfico varia

103/133 entre cerca de 20^QC a cerca de 50^QC.

[00301] 67. Em uma modalidade adicional de qualquer uma das modalidades 1 a 66, o carregamento e a eluição são conduzidos em uma taxa de fluxo que varia entre cerca de 0,5 ml/min a cerca de 2,0 ml/min.

[00302] 68. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para determinar a pureza de um polipeptídeo em uma composição, compreendendo analisar a composição de acordo com qualquer um dos métodos das modalidades 1 a 67 e determinar a proporção de polipeptídeo para contaminantes na composição.

[00303] 69. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para determinar a estabilidade de um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo, o método compreendendo a) incubar a composição que compreende o polipeptídeo de 0^QC a 40^QC por uma a seis semanas, b) analisar a composição da etapa a) por qualquer um dos métodos das modalidades 1 a 67 e c) determinar a proporção de variantes para o polipeptídeo na composição, em que um aumento na proporção de variantes para o polipeptídeo na composição comparada com uma composição que não foi incubada indica a degradação do polipeptídeo na composição.

[00304] Todos os aspectos descritos nesse pedido podem ser combinados em qualquer combinação. Cada aspecto descrito nesse pedido pode ser substituído por um aspecto alternativo que serve ao mesmo propósito, equivalente ou similar. Assim, a menos que expressamente estabelecido de outra maneira, cada característica descrita é apenas um exemplo de uma série genérica de aspectos equivalentes ou similares.

[00305] Detalhes adicionais da invenção são ilustrados pelos seguintes Exemplos não limitantes. As descrições de todas as referências no pedido estão expressamente incorporadas aqui pela referên104/133 cia.

EXEMPLOS [00306] Os exemplos abaixo são pretendidos ser meramente exemplificadores da invenção e, portanto, não devem ser considerados limitantes da invenção de modo algum. Os exemplos a seguir e a descrição detalhada são oferecidos como meio de ilustração e não como meio de limitação.

Materiais e Métodos para os Exemplos [00307] Os materiais e métodos a seguir foram usados para os exemplos a menos que notado de outra maneira.

Materiais [00308] Todos os mAbs foram fabricados internamente na Genentech (South San Francisco, CA) usando linhagens celulares estáveis de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Os valores de pl para os mAbs usados foram determinados experimentalmente usando um protocolo iclEF do fabricante do instrumento (Wu, J and Huang, T (2006) Electrophoresis 27:3584) que emprega sete marcadores de pl. As amostras estressadas termicamente foram obtidas pela incubação de mAbs a 40^QC por 3 e 6 semanas, respectivamente. Os mAbs estressados foram armazenados -80 ^QC antes da análise cromatográfica.

[00309] Colunas Propac WCX-10 foram adquiridas de Dionex. Imidazol foi obtido de EMD Biosciences ou de Fluka. Piperazina (anidra) foi adquirida de Tokyo Chemical Industry Co. LTD. Trisma (Tris) foi obtido de Mallinckrodt Baker Inc. ou Sigma (St. Louis, MO), base Trizma e CAPS da Sigma. Cloreto de sódio, hidróxido de sódio (10 N) e ácido clorídrico (12 N) foram obtidos de Mallinckrodt Baker Inc.. Ácido fosfórico (85%) oi obtido de EMD Millipore.

Configuração de HPLC [00310] Experimentos de cromatografia de troca de cátion foram realizados primariamente em um instrumento Waters 2796 BioAlliance

105/133 de cromatografia líquida ou um UltiMate 3000 Quaternary Rapid Separation LC (Thermo Scientific Dionex). O instrumento incluía uma bomba com gradiente quaternário de baixa pressão, um auto-amostrador com capacidade de controle de temperatura, um compartimento térmico de coluna para o controle preciso da temperatura e um detector de UV com arranjo de diodo de comprimento de onda duplo. Na saída da coluna, um sensor de pH em linha (Modelo S450CD de Sensorex) e um sensor de condutividade (Modelo 529 de Amber Sicence, Eugene, OR) foram conectados em sequência. O sensor de pH foi controlado por um medidor de pH modelo Seven Multi de Mettler Toledo; o sensor de condutividade foi controlado por um medidor digital da condutividade modelo 1056 de Amber Science. As leituras de pH e da condutividade dos dois medidores foram coletadas em Chromeleon através de um conversor analógico/digital Dionex UCI 50. O controle do instrumento, aquisição de dados e análise de dados foram realizados com um programa Dionex Chromeleon versão 6.8.

Preparação da Fase Móvel [00311] Soluções estoque individuais de tampão de tris e imidazol foram preparadas em 1,0 M e uma solução de CAPS foi preparada em uma concentração de 0,1 M, sem ajuste do valor de pH e armazenadas em temperatura ambiente. Uma solução estoque de tampão contendo 40 mM de piperazina, 40 mM de imidazol e 40mM de Tris (todas bases livres) foi preparada primeiro sem ajuste do valor de pH e armazenada em temperatura ambiente. Antes dos experimentos cromatográficos, uma série de tampões da fase móvel contendo uma concentração equimolar de piperazina, imidazol e Tris em 1, 2, 4 ou 8 mM foi feita, cada uma pela diluição da solução estoque de tampão em água deionizada. Os valores de pH dos tampões foram então ajustados usando ácido clorídrico para 5,0 (Tampão A) e 10,8 (Tampão B), respectivamente. Uma solução de cloreto de sódio 0,5 M foi preparada

106/133 com água deionizada (Solução de Sal). As fases móveis foram então filtradas individualmente através de um filtro de nylon com 0,2 μΜ antes do uso.

[00312] Os tampões da fase móvel com piperazina 11,6 mM, imidazol 1,5 mm e Tris 2,4 mM foram preparados como relatado na literatura (Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846; Rea, JC et al. (2010) J. Pharm. Biomed. Anal. 54:317). Uma solução estoque concentrada em dez vezes contendo piperazina 116 mM, imidazol 15 mM e Tris 24 mM foi preparada primeiro e armazenada em temperatura ambiente. Antes de cada experimento, duas alíquotas de solução estoque foram diluídas 10 vezes com água deionizada e seus valores de pH foram subsequentemente ajustadas usando ácido clorídrico para 5,0 (Tampão C) e 9,5 (Tampão D). As fases móveis foram então filtradas individualmente através de um filtro de nylon com 0,2 μΜ antes do uso.

Cromatografia por Troca de Cátion [00313] A menos que estabelecido de outra maneira, as condições cromatográficas foram as seguintes. Amostras de mAb (controle e estressada) foram diluídas para 2 mg/mL com água deionizada e foram mantidos a 5±3G no auto-amostrador. Alternativamen te, amostras de mAb foram diluídas para 1 mg/mL com uma mistura 1:1 de tampões A e D e foram mantidas a 5±3^QC no auto-amostrador. A coluna Propac WCX-10HT, 4 x 50 mm foi colocada no compartimento de coluna com a temperatura ajustada para 40±1^QC. Uma coluna com 4x250 mm Dionex Propac WCX foi usada para a separação cromatográfica e colocada no compartimento de coluna com a temperatura ajustada em 40±1G. Para cada corrida cromatográfica, 10 pL de proteína (20 pg) foram injetados.

[00314] O gradiente de pH mediado por sal foi estabelecido usando um gradiente ternário formado em uma bomba quaternária usando o

107/133 tampão A e B e a Solução de Sal (NaCI 0,5 M). Um gradiente linear de 100% A para 96,8% B e 3,2% de solução de sal em 58 minutos foi liberado para estabelecer um gradiente de pH de 5,0 para 10,8 (0,1 unidade/min de pH) e um gradiente mediado por sal de 0 para 16 mM NaCI (0,28 mM/min). O gradiente final (min, %B e C) foi o seguinte: 0, 100% A; 2, 100% A; 60, 96,8% B e 3,2% C; 64, 96,8% B e 3,2% C; 65, 100% A; 75, 100% A. A taxa de fluxo da fase móvel era de 1,0 mL/min. [00315] O gradiente de pH relatado de 5 para 9,5 (Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846) foi estabelecido pelos tampões C e D. Um aumento linear do tampão D de 0 para 100% em 45 minutos foi fornecido para estabelecer um gradiente de pH de 5,0 para

9,5 (0,1 unidade de pH/min). A taxa de fluxo da fase móvel era de 1,0 mL/mim. As proteínas foram detectadas pela absorbância por UV a 280 nm.

[00316] Um gradiente de pH híbrido foi estabelecido pelo uso de um gradiente quaternário formado sobre a bomba quaternária usando os tampões A, B, C e D. Esse arranjo ofereceu uma flexibilidade para ajustar 1) o pH de partida e final, usando os tampões A e B e 2) a quantidade de sal para cada gradiente, usando os tampões C e D. Um exemplo dos métodos usados nesses experimentos, um gradiente de pH entre 6 a 10, com uma concentração constante de sal de 10 mM, foi estabelecido por um aumento de tampão B de 0 a 40%, enquanto os tampões C e D eram mantidos a 10% e 40%, respectivamente. Os gradientes usados estão listados na Tabela 2.

Modelagem de pH-IEC [00317] O pH do gradiente de misturação linear de dois tampões de pH foi avaliado usando a equação de Henderson-Hasselbach (H-H) para cada um dos componentes com base no modelo de solução ideal. O número de prótons disponíveis/dissociáveis foi primeiro determinado para cada tampão de partida e subsequentemente para cada va

108/133 lor de pH entre os dois tampões em uma etapa de 0,1 unidade de pH. Com base no número de prótons necessários, a proporção molar dos dois tampões foi derivada. O percentual de cada tampão para atingir um ponto no gradiente foi obtido. Em cada ponto de pH, a força iônica foi calculada usando os componentes iônicos estimados.

Exemplo 1. Avaliação de um Método de pH-IEC [00318] O desempenho de um método de pH-IEC foi avaliado. Embora o método de pH-IEC relatado mostre a capacidade de analisar o perfil de heterogeneidade de carga de mAbs múltiplos, ele é pretendido primariamente para mAbs com valores de pl entre cerca de 7 a 9. Para mAbs além dessa faixa (pl<7 ou pl>9, também referidos como valores extremos de pl), o método de pH-IEC geralmente rende perfis de heterogeneidade de carga inaceitáveis. Para avaliar o método, um gradiente de pH de 5,0 para 9,5 foi produzido de acordo com o procedimento que foi previamente relatado (Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846; Rea, JC et al. (2010) J. Pharm. Biomed. Anal. 54:317). Os tampões eram compostos por piperazina 11,4 mM, imidazol 1,5 mM e Tris 2.4 mM e o pH ajustado para 5,0 e 9,5, respectivamente. Três mAbs que compartilham uma ampla faixa de pl (6.2,

8.2 e 9.4) foram analisados e os cromatogramas resultantes são mostrados na Figura 1. Desses mAbs, apenas mAb2 (pl 8,2) mostrou um perfil de heterogeneidade de carga aceitável, caracterizado por uma boa separação de variantes de carga. As variantes de carga de mAb1 de baixo pl (pl=6,2) não foram bem separadas; mAb3 com alto pl (pl 9,4) não eluiu durante o gradiente de pH. Embora mAb3 tenha eluído quando o gradiente de pH foi estendido para pH 10,8, a pressão retrógrada da coluna ficou próxima do limite superior de pressão da coluna e os perfis de cromatografia foram inconsistentes entre as diferentes corridas. Esse experimento demonstrou claramente que embora o método pH-IEC relatado tenha funcionado bem para mAbs com valores

109/133 de pl entre 7 e 9, ele não foi capaz de traçar o perfil de heterogeneidade de carga de mAbs com valores estremos de pl.

Tabela 2

Gradientes de Amostras

Para amostras com valores de pl entre 7,2 - 8,3
pH 6-9, NaCI 10 mM; corrida 22 min
Tempo, min	%B	%C	%D	curva
0,0	0,0	10	40	5
0,2	0,0	10	40	5
16,0	30,0	10	40	5
18,0	30,0	10	40	5
18,1	0,0	10	40	5
22,0	0,0	10	40	5

pH 6-9, NaCI 10 mM; corrida 15 min
Tempo, min	%B	%C	%D	curva
0,0	0,0	10	40	5
0,2	0,0	10	40	5
10,0	30,0	10	40	5
12,0	30,0	10	40	5
12,1	0,0	10	40	5
15,0	0,0	10	40	5

[00319] Para amostras com valores de pl entre 8,3 - 9,0

pH 6-10, NaCI 20 mM; corrida 22 min
Tempo, min	%B	%C	%D	curva
0,0	0,0	20	30	5
0,2	0,0	20	30	5
16,0	40,0	20	30	5
18,0	40,0	20	30	5
18,1	0,0	20	30	5
22,0	0,0	20	30	5

110/133

pH 6-10, NaCI 20 mM; corrida 15 min
Tempo, min	%B	%C	%D	curva
0,0	0,0	20	30	5
0,2	0,0	20	30	5
10,0	40,0	20	30	5
12,0	40,0	20	30	5
12,1	0,0	20	30	5
15,0	0,0	20	30	5

[00320] Para amostras com valores de pl entre 9,0 - 9,2

pH 7-10, NaCI 50 mM; corrida 22 min
Tempo, min	%B	%C	%D	curva
0,0	10,0	50	0	5
0,2	10,0	50	0	5
16,0	40,0	50	0	5
18,0	40,0	50	0	5
18,1	10,0	50	0	5
22,0	10,0	50	0	5

pH 7-10, NaCI 50 mM; corrida 15 min
Tempo, min	%B	%C	%D	curva
0,0	10,0	50	0	5
0,2	10,0	50	0	5
10,0	40,0	50	0	5
12,0	40,0	50	0	5
12,1	10,0	50	0	5
15,0	10,0	50	0	5

[00321] Para amostras com valores de pl entre 9,3 - 9,4

pH 9-11, NaCI 10 mM; corrida 22 min
Tempo, min	%B	%C	%D	curva
0,0	30,0	10	40	5
0,2	30,0	10	40	5
16,0	50,0	10	40	5

111/133

pH 9-11, NaCI 10 mM; corrida 22 min
Tempo, min	%B	%C	%D	curva
18,0	50,0	10	40	5
18,1	30,0	10	40	5
22,0	30,0	10	40	5

pH 9-11, NaCI 10 mM; corrida 15 min
Tempo, min	%B	%C	%D	curva
0,0	30,0	10	40	5
0,2	30,0	10	40	5
10,0	50,0	10	40	5
12,0	50,0	10	40	5
12,1	30,0	10	40	5
15,0	30,0	10	40	5

[00322] O pH na saída da coluna aumentou de 5,0 para 9,5, a condutividade do solvente diminui de uma maneira quase linear de 2700 para 800 pS/m (observe que a condutividade de KCI 5 mM é de 720 pS/m, enquanto que a condutividade de água deionizada é de 5,5 pS/m). Os componentes dos três tampões de pH são todos aminas com pK_a em uma ampla faixa: piperazina com pK_a1 = 5,68 e pK_a2 = 9,82, imidazol com pK_a= 6,95 e Tris com pK_a = 8,10 (em temperatura ambiente). Esses compostos são protonados (ou positivamente carregados) quando o pH da solução é menor do que seu pK_a, mas se tornam neutros quando o pH está acima de seu pK_a. Quando o pH do solvente aumenta, os componentes do tampão se tornam gradativamente neutros a partir de protonados e assim a condutividade do tampão diminui. É digno de nota que o perfil do pH era côncavo em pH em torno de 6 por que a piperazina era o componente mais abundante no tampão tal que a curva do pH era relativamente plana em torno de seus dois pK_a de 5,68 e 9,82.

[00323] Os perfis de pH e força iônica do gradiente de pH também

112/133 foram calculados com base no modela da solução ideal mostrado nas linhas pontilhadas na Figura 2A. A curva de pH modelada é muito similar ao perfil experimental do pH, exceto que para aquele experimento o perfil foi retardado em 5 minutos devido ao volume de permanência do sistema e volume da coluna. Igualmente, a curva da força iõnica modelada mostrou uma forma similar como o perfil de condutividade observado experimentalmente. A concordância entre a modelagem e os dados experimentais sugere que a mistura de componentes de tampão baseado em amina acompanhou o modelo de solução ideal. O modelo estabelecido pode então ser usado para avaliar os perfis experimentais de pH e força iõnica em outras condições cromatográficas.

[00324] Além disso, a pressão retrógrada da coluna durante pH-IEC aumentou significativamente com o pH da fase móvel (Figura 2B). Isso é atribuído à diminuição da força iõnica, considerando que a composição da fase móvel era constante durante o gradiente de pH. Quando a força iõnica da fase móvel é baixa, o potencial eletrostático sobre a superfície da fase estacionária se torna alto, de acordo com o modelo de camada dupla (Staahlberg, J (1994) Anal. Chem. 66:440; Stahlberg, J (1999) J. Chromatogr. A 855:3). O alto potencial eletrostático pode alterar a conformação da resina (por exemplo, a dilatação da resina para reduzir a densidade da carga da superfície), que provavelmente aumenta a pressão retrógrada da coluna (Manual do Produto Propac WCX-10 e Propac SCX-10, 7th ed., Dionex Incorporation, Sunnyvale, CA, 2007).

[00325] A condutividade experimental e os perfis modelados da força iõnica podem ser usados para explicar os perfis deficientes de heterogeneidade de carga para mAbs com valores extremos de pl. mAbs com pl baixo eluem na região de pH baixo onde os componentes do tampão são protonados e a fase móvel tem uma força iõnica relativamente alta. Como o gradiente de pH da separação por IEC parece en

113/133 volver uma combinação de mecanismos de eluição baseados na força íônica e baseados no pH (Anderson, DJ and Shan, L (2001) Clin. Chem. 47:128; Shan, L and Anderson, DJ (2001) J. Chromatogr. A 909:191; Shan, L and Anderson, DJ (2002) Anal. Chem. 74:5641), a eluição baseada em força íônica alta pode se sobrepor com a eluição baseada no pH, levando a uma resolução pobre dessas variantes de carga de mAb com baixo pl. Por outro lado, mAbs com pl alto eluem tipicamente na região de pH mais alto onde os componentes do tampão se tornam neutros. Devido a baixa força íônica na fase móvel, esses mAbs com pl alto são difíceis de eluir das cromatografias de coluna por troca de cátion. A fim de confirmar que a força íônica afeta significativamente a separação por pH-IEC e aperfeiçoa o método de pHIEC para mAbs com valores extremos de pl, a força íônica do tampão de pH no gradiente de pH do método IEC foi modulada como descrito abaixo.

Exemplo 3· Aperfeiçoamento do Método de IEC com Gradiente de pH pelo Controle da Forca íônica [00326] A força íônica durante o curso de um gradiente de pH foi modulada de duas maneiras. Primeiro, a força íônica na região de pH baixo foi controlada pelo uso de concentrações diferentes de tampões. Uma série de concentrações de tampão foi testada para avaliar seu impacto sobre IEC com gradiente de pH como discutido abaixo. Segundo, a força íônica na região de pH alto foi modulada pela adição de um gradiente de sal ao gradiente de pH. O impacto da concentração de sal também foi investigado. O novo método é então referido como um método de pH-IEC mediado por força íônica.

[00327] Concentração do Tampão: Nesse método, um gradiente equimolar de pH é suado no lugar de um gradiente de pH de proporção mista usado no método relatado (Farnan, D and Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846), com base em duas considerações: Pri

114/133 meiro, um gradiente de pH quase linear pode ser obtido pelo uso de concentrações equimolares de piperazina, imidazol e Tris (Figura 2C). O gradiente linear estabelecido sobre uma ampla faixa de pH não sacrificará a separação para uma dada região de pH (Tsonev, LI and Hirsh, AG (2008) J. Chromatogr. A 1200:166). Segundo, ele fornece a otimização do declive do gradiente.

[00328] Quatro tampões que consistem em concentrações de piperazina, imidazol e tris de 1, 2, 4 e 8 mM foram investigados. Esses tampões são referidos como tampões de 1,2, 4 e 8 mM e cada um foi mediado com um gradiente de pH entre pH 5,0 a 10,8 e um gradiente linear de sal de 0 a 16 mM de NaCI. Os cromatogramas para o mAb 1 (pl=6,2) com os quatro tampões estão apresentados na Figura 3A. A resolução entre as variantes de carga dependeu evidentemente da concentração do tampão. Com o tampão e 1 mM, as variantes de carga estavam insuficientemente separadas. A resolução melhorou com o tampão de 2 mM e atingiu o pico com o tampão de 8 mM. Pelo contrário, a resolução para o mAb2 (pl=8,2) foi menos sensível à concentração do tampão do que o mAb1 (Figura 3B). A boa resolução para o mAb2 (pl-8,2) foi obtida com todos os quatro tampões, mesmo quando o tampão de 4 mM ofereceu uma resolução discretamente melhor do que os outros três tampões. Com base na inspeção visual acima, o tampão de 4 mM pareceu fornecer a melhor resolução para mAb1 e mAb2.

[00329] Para visualizar melhor o efeito da concentração do tampão em pH-IEC, a largura total à meia altura (FWHM) do pico principal de mAbs representada em gráfico como uma função da concentração do tampão é mostrada na Figura 3C. A FWHM do pico principal geralmente se correlaciona com a resolução de pH-IEC caracterizado pelo fato de que a menor FWHM representa a maior resolução. Para ambos mAb1 e mAb2, a FWHM do pico principal com o tampão de 4 mM foi a

115/133 menor entre os quatro tampões, sugerindo que o tampão de 4 mM forneceu o pico com a largura mais estreita, portanto boa resolução. Pelo contrário, para o mAb3 (pl=9,4), a FWHM do pico principal diminuiu discretamente quando a concentração do tampão aumentou de 1 para 8 mM. Portanto, o tampão de 8 mM provavelmente forneceu a melhor resolução para o mAb3.

[00330] O efeito da concentração do tampão sobre pH-IEC de mAbs dependeu do valor do pl de um mAb. Os mAbs com valores de pl baixos (6,2) e pl médios (8,2) mostraram separação ótima com o tampão de 4 mM, enquanto que os mAbs com valor alto de pl (9,4) pareceram preferir concentrações maiores de tampão. Isso é razoável, já que mAbs com pl alto de ligam fortemente à coluna e, portanto, podem requerer uma eluição baseada em mais força iônica do que mAbs com pl baixo e médio para obter a resolução ótima. Como a concentração de tampão e a condutividade evidentemente impactam a resolução de mAbs na IEC com gradiente de pH, essas devem ser otimizadas para cada mAb individual sempre que a alta resolução é desejada. Um método de IEC que pode resolver variantes ácidas e básicas do pico principal para mAbs sobre uma ampla faixa de pl foi desenvolvido. O tampão de 4 mM pareceu alcançar esse requisito e, portanto, foi escolhido para o método de pH-IEC mediado por sal de múltiplos produtos.

[00331] Concentração de sal: Para investigar como a força iônica afeta a separação por pH-IEC, cinco níveis diferentes (0, 8, 16, 32 e 64 mM) de cloreto de sódio foram adicionados ao gradiente de pH (estabelecido pelo tampão de 4 mM) através de um gradiente linear de pH 5,0 a 10,8. mAb1, mAb2 e mAb3 foram analisados em paralelo. A FWHM do pico principal dos mAbs foi representada em gráfico como uma função da concentração de sal como mostrado na Figura 3 D. Para o mAb1, a FWHM do pico principal foi altamente sensível à concentração de sal e ele atingiu o mínimo com NaCI 8 mM. Isso sugere que

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NaCI 8 mM forneceu a melhor resolução para o mAb1. Para o mAb2, a FWHM do pico principal permaneceu essencialmente plana através da faixa completa de concentrações de sal, sugerindo que a concentração de sal não impacta evidentemente a resolução do mAb2. Ao contrário, para o mAb3, a FWHM do pico principal diminuiu com o aumento da concentração de sal de 8 para 32 mM e permaneceu inalterada entre 32 mM e 64 mM de sal. Isso sugere que mAb3 precisou de 32mM de sal para obter a resolução ótima.

[00332] O efeito da força iôníca sobre a IEC com gradiente de pH de mAbs também se correlacionou com o pl dos mAbs. Os mAbs com pl baixo mostraram separação com 8 mM de sal; os mAbs com pl alto mostraram separação com uma maior concentração de sal, enquanto que a resolução de mAbs com pl médio foi independente da concentração de sal. Devido ao impacto evidente sobre a resolução, a concentração de sal pode ser otimizada para cada mAb individual, sempre que for desejada a alta resolução. Entre as cinco concentrações de sal o método de pH-IEC com um gradiente de sal de 16 mM de NaCI forneceu uma resolução aceitável para os mAbs com valores de pl sobre uma ampla faixa entre 6,2 a 9,2 e, assim, ele foi escolhido o método de pH-IEC mediado por sal de múltiplos produtos nesse trabalho.

[00333] O método de pH-IEC mediado por força iôníca otimizado: O método de pH-IEC mediado por sal otimizado empregou 4 mM de piperazina, 4 mM de imidazol e 4 mM de Tris para estabelecer o gradiente de pH e foi mediado por um gradiente linear de sal entre 0 a 16 mM de NaCI. Os perfis de pH e de condutividade do método são mostrados na Figura 2C. Para comparação, o pH e a força iôníca modelados são mostrados como linhas pontilhadas. O pH experimental na saída da coluna aumentou com o tempo de retenção de uma maneira grosseiramente linear, exceto por uma pequena concavidade em pH entre 8,5 a 9,0 e é consistente com o pH modelado exceto por um re

117/133 tardo de tempo de 5 minutos devido ao volume vazio do sistema. Com a mediação do sal, a condutividade experimental da fase móvel mostrou um discreto aumento durante o gradiente de pH (de 1570 para 1800 pS). Igualmente, a força iônica modelada foi essencialmente consistente durante o gradiente de pH. A força iônica do gradiente de pH baseado em amina foi controlada com sucesso pela redução da concentração de tampão e adição de um gradiente linear de sal. Com a força iônica controlada, a pressão retrógrada da coluna foi mantida abaixo de 95 bar na região de pH alto (Figura 2D). Os cromatogramas resultantes de mAb1-3 (não mostrados) foram reprodutíveis, indicando que a coluna de troca de cátion era estável nessa faixa de pressão. Exemplo 4. Perfil de Heteroqeneidade de Carga de 16 mAbs [00334] Para demonstrar adicionalmente a capacidade de múltiplos produtos do novo método de pH-IEC mediado por sal, 16 mAbs com valores de pl entre 6,2 a 9,4 foram analisados e seus cromatogramas são mostrados na Figura 4. Os anticorpos foram eluídos da coluna com um gradiente de pH entre pH 5 a pH 10,8 e um gradiente de sal de 0 mM de NaCI a 16 mM de NaCI. Para ambos mAblcom pl baixo (6,2) e mAb3 com pl alto (9,4), as variantes de carga foram bem separadas para fornecer os perfis de heterogeneidade de carga. Esse é um aperfeiçoamento substancial comparado com o método de pH-IEC relatado (Figura 1). As variantes de carga de todos os 16 mAbs estavam bem separadas indicando que o método de pH-IEC mediado por sal desenvolvido era capaz de fornecer o perfil de heterogeneidade de carga de múltiplos produtos de mAb sem qualquer esforço para o desenvolvimento de um método adicional.

[00335] Em adição à aplicabilidade mais ampla, o gradiente de pH mediado por sal ofereceu melhor resolução do que o método de pHIEC relatado. Para o mAb2 (pl = 8,2), o método de pH-IEC mediado por sal forneceu a melhor resolução na linha de base entre as varian

118/133 tes de carga (Figura 4). Entretanto, a resolução pelo método de pHIEC prévio foi muito menor (Figura 1). Embora o gradiente de pH mediado por sal fosse mais longo (58 minutos) do que o gradiente de pH prévio (45 minutos), os declives do gradiente nos dois métodos foram idênticos (0,1 unidade de pH/min.) A resolução aperfeiçoada pelo método de pH-IEC mediado por sal não foi então o resultado de uma alteração na extensão do gradiente, mas sim do efeito de controle da força iônica.

Exemplo 5· Monitoramento da estabilidade térmica de mAbs [00336] A cromatografia por troca de cátion é comumente usada para avaliar a degradação e a variação de lote para lote de proteínas biofarmacêuticas durante sua fabricação (Vlasak, J and lonescu, R(2008) Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468). Para demonstrar a habilidade de monitorar a degradação de proteína, o método de pH-IEC mediado pela força iônica desenvolvido foi usado para traçar o perfil de heterogeneidade de carga de mAb1 depois do estresse térmico. O mAb1 foi escolhido nesse estudo por que ele tem a retenção mais baixa entre os mAbs e seu perfil de pH-IEC foi o mais suscetível à alterações nos parâmetros cromatográficos. O anticorpo foi eluído da coluna com um gradiente de pH entre OH 5 a pH 10,8 e um gradiente de sal de 0 mM de NaCI a 16 mM de NaCI.

[00337] Os cromatogramas dos materiais de controle de estressados de mAb1 estão normalizados com o pico principal (Figura 5). Depois do estresse térmico, ambas as variantes ácida e básica aumentaram. Um ressalto também apareceu à direita do pico principal para as amostras estressadas. Essas alterações de perfil indicam evidentemente que mAb1 se degradou depois da incubação a 40^QC por 3 e 6 semanas. Igualmente, a degradação de mAb2 e mAb3 sob estresse térmico também foi detectada pelo método de pH-IEC mediado por sal (dados não mostrados).

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Exemplo 6· Teste de robustez de pH-IEC mediada por forca iônica [00338] Devido ao processo complexo de eluição do método de pHIEC mediado por sal, é necessário garantir sua robustez para o teste de amostra de rotina. Como discutido acima, nós sabemos que a composição de tampão de pH e a concentração de sal afetaram a retenção e a resolução de mAbs. O propósito de estudos adicionais foi investigar a variabilidade originada pela coluna, lote do tampão e instrumento quando uma composição de tampão de pH e uma concentração de sal otimizadas são usadas. Três colunas, três lotes de tampão e dois instrumentos foram testados em quatro dias diferentes. O projeto experimental é mostrado na Tabela 3. mAb1 foi escolhido novamente nos estudos devido ao seu perfil de pH-IEC ser o mais suscetível a alterações nos parâmetros cromatográficos.

[00339] Os cromatogramas de mAb1 obtidos com diferentes colunas e lotes de tampão eram comparáveis, mas aqueles obtidos com instrumentos diferentes mostraram um tempo de retenção discretamente diferente. A diferença nos volumes de retardo esperada entre os instrumentos foi responsável pela variação do tempo de retenção, mas não impactou o desempenho do método. A quantificação das variantes de carga de mAb1 está resumida na Tabela 4. Para os 16 cromatogramas obtidos com dois instrumentos, três colunas e três preparações de tampão diferentes, a quantificação das variantes de carga foi consistente, indicando que pH-IEC mediada por sal foi robusta nessas condições cromatográficas.

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Tabela 3· Projeto experimental para o teste de robustez de pH-IEC mediada por sal usando mAb1

	Dia 1	Dia 2	Dia 3	Dia 4
Waters 2796	X	X	X
Dionex U3000				X
Coluna 1	X
Coluna 2		X	X
Coluna 3				X
Tampão 1	X	X
Tampão 2			X
Tampão 3				X

Tabela 4. Resumo dos dados de robustez (n=16) do gradiente de pH mediado por sal obtido para mAb1

	Variantes Ácidas	Pico Principal	Variantes Básicas
Média	12,32	78,99	8,69
Mais alto	13,20	79,92	9,54
Mais baixo	10,54	77,91	8,14
Desvio padrão	0,78	0,56	0,55
% RSD	6,3	0,7	6,4

[00340] IEC com gradiente de pH mediada por sal também foi robusta através de uma ampla faixa de carregamentos de massa de amostra sobre a coluna. Como mostrado na Figura 6, perfis de eluição consistentes foram observados quando 5 a 200 pg de mAb1 foram carregadas sobre a coluna. Embora o pico principal tenha ampliado discretamente quando a carga da coluna estava acima de 50 pg, a quantificação das variantes de carga foi consistente entre todas as cargas de coluna testadas (Tabela 5).

[00341] No decorrer dos estudos de robustez foram obtidos dados suficientes para cobrir a maioria das variáveis experimentadas em um experimento de HPLC típico. O método de pH-IEC mediado por sal fornece cromatogramas comparáveis e resultados consistentes da

121/133 quantificação de variantes de carga para um mAb típico, demonstrando que o método é robusto em todas as condições cromatográficas estudadas aqui.

Tabela 5· A robustez da heteroqeneidade de carga de mAb1 em diferentes cargas de coluna

Carga da Coluna (pg)	Variantes Ácidas	Pico Principal	Variantes Básicas
5	12,66	79,04	8,30
10	13,04	78,84	8,12
50	13,27	78,14	8,59
100	13,58	77,80	8,62
200	13,55	77,86	8,59
Média	13,22	78,34	8,44
Desvio padrão	0,38	0,57	0,22
% RSD	2,9	0,7	2,6
Exemolo 7. Redução do temoo de corrida oara oH-IEC mediada oor

forca iônica [00342] Previamente, os métodos de IEC mediados por pH usavam piperazina, imidazol e tris (PIT) com reagentes de tamponamento (Farnan, D and Moreno), GT 2009 Anal. Chem. 81:884-8857). Para gerar um gradiente de pH, uma curva de pH semi-linear foi gerada de pH 6 a 9,5. O grupo amino funcional de cada um dos agentes de tamponamento mantém uma carga positiva quando o pH da fase móvel é menor do que o pKa do reagente e neutra quando o pH da fase neutra é maior, como mostrado na Figura 7. O gradiente de pH foi gerado usando o Tampão A (pH 5,0) e o Tampão B (pH 9,5) em um gradiente entre pH 5 a pH 9,5 em 35 minutos. A coluna era Propac WCX-10, 4 x 250 mm. Esse gradiente de pH do sistema de reagente de tampão funcionou bem para uma grande faixa de moléculas com valores de pl entre 7 e 8,5. Entretanto, as variantes de carga para moléculas fora dessa faixa de trabalho não foram bem resolvidas. Um trabalho preli

122/133 minar revelou que a concentração e a força iôníca dos reagentes de tamponamento influenciaram na linearidade da curva de pH e dos tempos de retenção da amostra. Como mostrado no Exemplo 2, a força iôníca diminuiu dramaticamente conforme o pH aumentou ao longo do tempo. Ajustes nas concentrações do tampão e a introdução de um gradiente de sal simultâneo forneceu uma força iôníca mais confiável ao longo do gradiente de pH. Com um gradiente de sal simultâneo, a separação pelo gradiente de pH pode resolver agira variantes moleculares com valores de pl de 6,2 a 9,4. Como mostrado na Figura 8 usando um longo gradiente de 58 min, onde o pH aumentou de pH 5 para pH 10,8 em uma inclinação de 0,1 unidade de pH/min e a concentração de sal aumentou de 0 mM de NaCI para 16 mM de NaCI em um tampão PIT (piperazina 4 mM, imidazol 4 mM e Tris 4 mM), anticorpos monoclonais com valores de pl de 6,2 (Mab 1), 8,2 (Mab 2) e 9,4 (Mab3) são resolvidos. O método aperfeiçoado é referido como um gradiente de pH mediado pela força iôníca ou um gradiente de pH mediado por sal.

[00343] Para reduzir o tempo da corrida e aumentar o rendimento, o gradiente de pH mediado por sal em uma coluna curta (4 x 50 mm) foi avaliado. Farnan, D e Moreno, GT (2009) Anal. Chem. 81:8846-8857 indicaram que perfis de eluição similares foram obtidos usando pH-IEC independentemente do tamanho da coluna, desde que fosse o mesmo modo de separação de pH-IEC (WCX ou SCX). Para determinar se colunas mais curtas podiam reduzir os tempos de eluição, a separação de três Mabs com valores diferentes de pl usando ambas as fases móveis de pH-IEC convencional e pH-IEC mediada por sal usando uma coluna WCX-10, 4 x 50 mm foram comparados. Os mAbs eram Mab 1, pl 7,6; Mab 2, pl 8,6-9,3; e Mab 3, pl 9,1. O gradiente de pH era de 6-11 em 0-16 min, mantido em pH 11 por 2 min, seguido de uma re-equilibração por 4 min em pH 6 para um tempo total de corrida

123/133 de 22 minutos. O tampão para pH-IEC original era Tris 2,4 mM, imidazol 1,5 m e piperazina 11,6 mM. O tampão para pH-IEC mediada por força iônica era piperazina 4 mM, imidazol 4 mM e Tris 4 mM com NaCI 16 mM. Como visto na Figura 9, embora perfis de pico similares fossem obtidos para esses três Mabs, a resolução das variantes de carga diminuiu conforme o pl das moléculas aumentou. A fim de obter uma separação adequada para moléculas com ampla faixa de pl em um tempo de corrida menor, uma investigação no mecanismo de separação da variante e um sistema de tampão diferente foi iniciada.

[00344] Para auxiliar no rastreamento do tampão, uma ferramenta de predição do pH e da condutividade pode ser usada. As curvas de pH e da condutividade de tampões comumente usados e sal de NaCI em diferentes combinações, faixa de pH e tempo de gradiente podem ser calculadas e representadas em gráfico com base no pKa do tampão. A visualização das ferramentas de predição permite uma rápida otimização do sistema de tampão que tem as propriedades desejadas, tais como curva linear de pH, força iônica estável ou crescente ao longo do tempo e menor toxicidade do tampão. Usando esse modelo, várias combinações de tampão foram rastreadas. A combinação de tampões Tris, piperazina e fosfato (TPP) foi encontrada formar um gradiente linear de pH durante um gradiente de 16 minutos (Figura 10). Os tampões incluíram piperazina pK1 com pKa de 5,33 (faixa de 5,0-6,0), fosfato pK2 com pKa de 7,20 (faixa de 5,8-8,0), Tris base com pKa de 8,06 (faixa de 7,5-9,0), piperazina pK2 com pKa de 9,73 (faixa de 9,5 a 9,8) e fosfato pK3 com pKa de 12,33. O gráfico na Figura 10 mostra que a molécula de fosfato permanece carregada ao longo da faixa de pH e compensa, em uma certa extensão, a perda de força iônica devida a desprotonação de grupos amino funcionais e, Tris e piperazina conforme o pH aumenta. As condições cromatográficas eram as seguintes:

124/133 [00345] Coluna: Propac WCX-1OHT, 4 χ 50 mm [00346] Gradiente de pH: 5,0 mM Tris, piperazina, fosfato (TPP) [00347] Tampão A = pH 6,0 [00348] Tampão B = pH 11,0 [00349] Gradiente: 6-11 em 16 min [00350] Tampão C = 60 mM NaCI [00351] Tampão D = água MilliQ [00352] As curvas preditas de pH e da condutividade (Figura 11 painel direito) eram consistentes com aquelas obtidas experimentalmente (painel esquerdo). O sistema de tampão continha 5,0 mM Tris, piperazina e fosfato e uma concentração constante de NaCI em 10 mM, 20 mM ou 30 mM (usada no modelo). A taxa de fluxo experimental era de 1 mL/min ou 2 mL/min.

Exemplo 8· Determinação das faixas de forca iônica ótimas [00353] Várias amostras foram analisadas usando um gradiente de 16 min do método com TPP mediado por sal. Um exemplo de métodos com perfis consistentes entre 22 e 58 minutos de colunas Propac WCX-10 4x 50 mm e 4 x250 mm, respectivamente, é mostrado na Figura 12. A eluição com a coluna de 4 x 50 foi com Tris/Piperazina/Fosfato (TPP) mediado por sal, pH 6 a 11 e NaCI 0 a 30 mM durante 16 min. A eluição com a coluna de 4 x 250 foi com Piperazina/lmidazol/Tris (PIT) mediado por sal, pH 5 a 10,8 e NaCI 0 a 16 mM durante 58 min, foi determinado que o método com TPP mediado por sal era suficiente para as moléculas principalmente na faixa de pl de 7 a 8,5, que foi a faixa similar obtida com o método PIT original. Conclui-se que os reagentes do tampão e a força iônica desempenham uma parte na separação, mas outros fatores podem estar envolvidos.

[00354] O estado da carga líquida de MAbs em uma faixa de pH foi modelado. A Figura 13 mostra uma superposição de cargas líquidas

125/133 sobre o pH para mAbs com pl diferentes. No modo de troca de cátion, um mAb carrega uma carga positiva até que o pH diminua para alcançar seu pl (interseção de x) e então é eluído da coluna. Conforme o pH aumenta, o mAb se torna negativamente carregado. O perfil da variante de carga para uma dada molécula de proteína consiste em um pico principal, uma região ácida e uma básica (como mostrado no painel inferior). Geralmente, uma variante de carga tem uma ou poucas cargas fora do pico principal, com o envelope completo de carga da variante mais ácida para a mais básica abrangendo 5 a 7 cargas. A janela de separação com gradiente de pH ótimo pode estar na região plana da curva entre o pH 6,5 a pH 8,5 (Figura 13); por exemplo, para moléculas com valores de pl menores do que cerca de 8,5, a carga líquida imediatamente abaixo de seu pl teórico muda muito pouco e a curva é relativamente plana entre pH 6,5 e 8,5. Em uma corrida com gradiente de pH, há tempo suficiente para variantes de carga serem eluídas da coluna separadamente em diferentes tempos de retenção conforme o pH aumenta ao longo do tempo.

[00355] Inversamente, para moléculas com valores de pl maiores do que 8,5 e menores do que 6,5, a carga líquida se altera dramaticamente em seu pl teórico (Figura 14). Durante ume corrida com uma plataforma de gradiente de pH linear, a carga por inclinação mínima é muito pronunciada nesses pHs para permitir a separação adequada e um pico é observado (inserto).

[00356] Como a melhor separação e a robustez do pico foi atingida na porção relativamente plana da curva da carga vs. pH, a questão é como eluir variantes de proteína nessa região independente do pl. Isso requer a pré-modificação do estado da carga para moléculas com pl maior usando um fator diferente do pH. Esse fator é a força íônica do tampão. Com maior força íônica na fase móvel, mais cargas sobre a superfície da molécula são protegidas da fase estacionária. Portanto, a

126/133 carga líquida aparente diminui para permitir que as variantes sejam eluídas em pH abaixo do pl.

[00357] No trabalho apresentado nos Exemplos 1 a 6, as variantes de carga das moléculas com valores de pl maiores do que 9 (modo de troca de cátion) e menores do que 7 (modo de troca de ânion) foram separadas pela correção das deficiências de força iônica nas fases móveis com PIT combinadas com um gradiente de sal (gradiente de pH mediado por sal). A força de impulsão combinada de gradiente de pH e sal permite que o estado de carga aparente da molécula diminua mais rápido ao longo do tempo quando comparada com o gradiente de pH sozinho. Isso pode ser ilustrado conforme a carga aparente vs. a curva de pH se torna esticada verticalmente, com uma região plana mais estreita entre pH 7-8 e uma inclinação mais rasa em pH maior do que 9. Portanto, para moléculas com pl maiores, a separação ocorre em um pH discretamente abaixo de seus pis. Usando uma coluna mais longa (250 mm) e um tempo de corrida longo (60 min), há tempo suficiente para as variantes de carga eluírem. Entretanto, o método com gradiente de pH mediado por sal falhou em resolver as variantes de carga para moléculas com pl alto em uma coluna mais curta (50 mm) em um tempo de corrida mais curto (20 min).

[00358] Como o tempo de corrida curto é crítico, ao invés de diminuir gradativamente a carga aparente com um gradiente de sal durante 60 min, o estado da carga desejado pode ser alcançado no início da corrida pela introdução precoce do sal e mantido constante durante a corrida.

[00359] A Figura 15 é uma superposição de separações por gradiente de pH de um mAb com pl alto (pl 9,2) na presença de um sal de NaCI em diferentes concentrações. Usando um sistema quaternário, um gradiente de pH de pH6-11 foi criado usando as linhas A e B e as concentrações de sal de NaCI de 0, 10, 20, 30, 40 ou 50 mM foi manti

127/133 do usando as linhas C e D. As condições do gradiente e tempos de corrida eram os seguintes: Instrumento: U3000 2DLC; Fases móveis: 10 mM Tris, piperazina, fosfato, A) pH 6,0, B) pH 11,0; C) 100 mM NaCI, D) água milliQ; Coluna: Propac WCX-10, 4 x 50 mm, 10 pm; Temp, da coluna: 40Ό; Taxa de fluxo: 1 mL/min; Gradiente de pH: 1050% B; sal constante: 0 mM=0% C, 50% D; 10 mM=10% C, 40% D; 20 mM=20% C, 30% D, 30 mM=30% C, 20% D, 40 mM=40% C, 10% D, 50 mM=50% C, 0% D; Cone, da amostra: 1 pg/pL; Volume carregado: 20 pL.

[00360] Em uma concentração menor de sal, muito pouca separação foi observada. Em concentrações de sal subsequentemente maiores, as separações melhoraram enquanto o tempo de eluição diminuía. O tempo de eluição diminuído com o aumento da concentração de sal suporta que cargas extras sobre a superfície da molécula são protegidas da fase estacionária tal que a carga aparente diminui para permitir a separação da variante em um pH abaixo do pl. Nesse caso, uma separação ótima foi obtida com NaCI 40-50 mM, na qual a carga ótima desse mAb presumivelmente residia na porção relativamente plana da curva de carga vs. pH.

[00361] A análise de vários mAbs com diferentes pis foi realizada em concentrações constantes de sal diferentes enquanto o mesmo gradiente de pH é aplicado. Geralmente, a separação ótima foi obtida em uma concentração constante de sal tal que o estado da carga aparente caia na porção plana da curva de carga vs. pH. Por exemplo, mAbs na faixa de pl de 7 a 8,3 não precisaram de sal, aqueles na faixa de pl de 8,3 a 8,8 necessitaram de 20 mM de sal e aqueles na faixa de pl de 8,8 a 9,0 necessitaram de 50 mM de sal (Figuras 16 e 17). Sobre a curva de carga vs. pH, a adição de sal moveu essencialmente o eixo de x para o estado da carga desejado sobre a molécula para permitir a separação ótima na região plana da curva. Esse tipo de separação é

128/133 referido como um gradiente híbrido de pH (Figura 18).

[00362] Separações aperfeiçoadas foram obtidas pela alteração das condições de gradiente. Um gradiente superficial híbrido de pH-IEC (usando fases móveis de TPP) resultou na separação aperfeiçoada do pico comparado com os métodos de pH-IEC original e mediada por sal (Figuras 19 e 20). Uma separação similar foi obtida pelo uso do tampão TIC (Tris, imidazol, CAPS) com 10 mM de NaCI para substituir a piperazina, eliminando uma preocupação perigosa, e fosfato, um tampão biológico versátil que pode induzir adversamente um artefato no ensaio devido a modificação pós-traducional do tampão catalisado (Figura 21).

[00363] O método de pH-IEC híbrido curto foi desafiado a determinar se tempos de análise mais rápidos seriam possíveis. O gradiente de pH foi ajustado para pH 7 a 10 em 10 minutos, com uma espera de 2 minutos em pH 10 e um tempo de equilíbrio de 3 min para um tempo de corrida total de 15 minutos.

[00364] As condições cromatográficas foram as seguintes: Instrumento: U3000 2DLC; Fases móveis: 10 mM Tris, piperazina, fosfato, A) pH 6,0, B) pH 11,0; C) 100 mM NaCI, D) água milliQ; Coluna: Propac WCX-10, 4 x 50 mm, 10 pm; Temp, da coluna: 40Ό; Taxa de fluxo: 1 mL/min; Gradiente de pH: 0 mM=0% C, 50% D; 10 mM=10% C, 40% D; 20 mM=20% C, 30% D, 30 mM=30% C, 20% D, 40 mM=40% C, 10% D, 50 mM=50% C, 0% D; Cone, da amostra: 1 pg/pL; Volume carregado: 20 pL.

[00365] Como mostrado nas Figuras 22 e 23, os perfis foram similares entre as corridas com 15 e 22 min para dois MAbs diferentes com valores de pl de 8,8 a 9,0, respectivamente. Entretanto, como os tempos de corrida se tornaram mais curtos, mais valores de pH de partida/final específicos para o produto e as concentrações de sal foram necessários.

129/133 [00366] Quando um método específico para o produto é desenvolvido, a resolução ótima pode ser obtida pela seleção cuidadosa da inclinação do gradiente de pH e da concentração de sal apropriados com base no pl da molécula. Métodos específicos para o produto seriam benéficos se apenas um produto fosses exclusivamente analisado na sequência. Para laboratórios que analisam uma variedade de mAbs, cada um com um pl diferente, o uso de um sistema quaternário que pode fornecer um gradiente de pH enquanto mantém uma certa concentração de sal é desejável. Um tempo de corrida mais longo de 22 min., por outro lado, pode ser necessário como um método de plataforma usando um sistema binário que libere o gradiente de pH em uma concentração fixa de sal.

Exemplo 9· Robustez da cromatoqrafia por troca de íon com gradiente de pH mediado por forca iônica [00367] Para demonstrar a janela de robustez e as condições de corrida do alvo de uma cromatografia por troca de íon com gradiente de pH mediado por força iônica para análise de múltiplos produtos de anticorpo monoclonal com um pl através de uma ampla faixa usando uma abordagem de design do experimento (DOE). O método é adequadamente robusto se não houver alteração significativa para os valores reportáveis incluindo as áreas de pico relativo dos picos principal (Principal%), variante ácida (AV%) e variante básica (BV%). Em geral, o perfil geral do pico como medido pelas resoluções de pico (Rs1 eRs2). Para testar a robustez, os parâmetros da corrida tais como concentração de sal, concentrações de tampão, pH, temperatura da coluna e taxa de fluxo são intencionalmente perturbados.

Materiais e Métodos [00368] Os três anticorpos a seguir foram testados:

[00369] mAb1, pl = 8,2 [00370] mAb2, pl = 8,5

130/133 [00371] mAb3, pl = 9,0 [00372] Um Módulo Waters 2796 Bioseparations equipado com uma válvula de comutação de 8 portas, 3 vias para a coluna, válvulas seletoras com 6 portas para o solvente para as linhas C e D e urn detector Waters 2487 Dual λ UV foi usado para a cromatografia.

[00373] A coluna da cromatografia era uma coluna Dionex ProPac WCX-10 HT, 4 x 50 mm.

[00374] O sistema de tampão foi o seguinte: quantidade equimolar de imidazol, Tris e CAPS para os tampões A & B. O tampão C era NaCI 100 mM e o tampão D era água.

[00375] Para o Tampão A, o pH foi como especificado na tabela do projeto do experimento (Tabela 6), o pH para o tampão B era 10,0. A força total do tampão e a concentração de sal que foram usados são mostradas na tabela do projeto experimental.

[00376] O gradiente foi o seguinte: 0 a 2 min, no pH de partida; 2 a 16 min do pH de partida para pH 10; 16 a 18 min em pH 10; 18 a 22 min no pH de partida. As concentrações de sal selecionadas permaneceram constantes através do gradiente.

[00377] Temperatura da Coluna e taxa de fluxo foram usadas como indicado na Tabela 6.

[00378] 3 mAbs:

[00379] mAb1, pl =8,2 [00380] mAb2, pl=8,5 [00381] mAb3, pl =9,0 [00382] Módulo Waters 2796 Bioseparations equipado com uma válvula de comutação de 8 portas, 3 vias para a coluna, válvulas seletoras com 6 portas para o solvente para as linhas C e D e um detector Waters 2487 Dual λ UV.

[00383] Coluna Dionex ProPac WCX-10 HT, 4x50mm.

[00384] Sistema de tampão: quantidade equimolar de imidazol, Tris

131/133 e CAPS para os tampões A & Β. O tampão C é NaCI 100 mM e o tampão D é água.

[00385] pH do Tampão A está especificado na tabela do projeto experimental, pH do Tampão B é 10,0. A força total do tampão e a concentração de sal que foram usados são mostradas na tabela do projeto experimental.

[00386] Gradiente: 0 a 2 min, no pH de partida; 2 a 16 min do pH de partida para pH 10; 16 a 18 min em pH 10; 18 a 22 min no pH de partida. As concentrações de sal selecionadas permaneceram constantes através do gradiente.

[00387] Temperatura da coluna e taxa de fluxo: veja a tabela do projeto experimental.

Tabela 6· Projeto Experimental (Parâmetros da Corrida)

Padrão	Sal (mM)	Tampão (mM)	pH Partida	Temp, da Coluna (2C)	Fluxo (ml/min)
+ + + —	25	20	6,3	36	0,8
— + —	15	10	6,3	36	0,8
- +---	15	20	5,7	36	0,8
+ - + - +	25	10	6,3	36	1,2
- + + - +	15	20	6,3	36	1,2
+ — + +	25	10	5,7	44	1,2
----+	15	10	5,7	36	1,2
0	20	15	6,0	40	1
+ + + + +	25	20	6,3	44	1,2
+ + - + -	25	20	5,7	44	0,8
— + + +	15	10	6,3	44	1,2
---+ _	15	10	5,7	44	0,8
- + - + +	15	20	5,7	44	1,2
+ - + + -	25	10	6,3	44	0,8
- + + + -	15	20	6,3	44	0,8
+ + — +	25	20	5,7	36	1,2
+----	25	10	5,7	36	0,8
0	20	15	6,0	40	1

[00388] A robustez do procedimento cromatográfico para a análise de múltiplos produtos de anticorpo monoclonal foi testada pela pertur132/133 bação sistemática dos parâmetros das condições-alvo da corrida de 20 mM de sal, 15 mM de tampão, pH de partida 6,0, temperatura da coluna 40^QC e uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min (designado como 0 na Tabela 6). Três mAbs diferentes, com pl de 8,2, 8,5 e 9,0 foram testados. Os cromatogramas resultantes de cromatografias em duplicata na condição da corrida do alvo são apresentados na Figura 24. Um exemplo de um teste para a robustez da condição da corrida do alvo para Mab3 pela perturbação das condições de corrida de acordo com a Tabela 6 é apresentado na Figura 25. Embora existam algumas diferenças pequenas na resolução, os perfis gerais do pico, especialmente para as três regiões (ácida, principal e básica) estão mantidos e permitem a quantificação.

[00389] Os efeitos dados parâmetros da corrida sobre o desempenho do método podem ser visualizados usando um gráfico de distribuição (Figura 26). Nesse gráfico, os valores reportáveis (Principal%, AV% e BV%) para as análises em diferentes condições foram distribuídos íntimamente em torno daquela condição-alvo (no centro de cada painel, isto é, 20 mM de sal). Os resultados mostram que não há efeito significativo sobre os valores reportáveis devido à concentração de sal. Entretanto, há uma tendência nas resoluções com o aumento da concentração de sal: uma discreta tendência descendente para o Mab1 (pl = 8,2) e Mab2 (pl = 8,5) e uma tendência ascendente para o Mab3 (pl = 9). Foi sugerido que com o aumento no pl das moléculas, a resolução pode ser adicionalmente aperfeiçoada pela concentração crescente de sal, para um método específico para o produto. Como um método de múltiplos produtos, a concentração de sal foi otimizada para mAbs com pl através de uma ampla faixa. Os resultados desses estudos demonstraram que 20 mM é a concentração útil de sal para a análise de anticorpos com um pl que varia entre 7,0 a 9,5.

[00390] Os efeitos dos outros parâmetros da corrida também foram

133/133 representados em gráfico e estão apresentados na Figura 27. Nesses gráficos, os valores reportáveis (Principal%, AV% e BV%) para as análises em diferentes condições também foram centralizados em volta daquelas condições-alvo. Os resultados demonstraram que não houve efeito significativo sobre os valores reportáveis devido às perturbações intencionais das condições de corrida. Portanto, o método para múltiplos produtos é adequadamente robusto na condição da corrida-alvo.

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para analisar uma composição que compreende um polipeptídeo e um ou mais contaminantes, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (I) (a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, sendo que o tampão de carregamento está em um primeiro pH e compreende uma primeira força iônica;

   (b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, sendo que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição está alterada em um gradiente de força iônica, sendo que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica; e (c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes; ou (II) (a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, sendo que o tampão de carregamento está em um pH inicial e compreende uma força iônica inicial;

   (b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, sendo que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e sendo que a força iônica do tampão de eluição é essencialmente a mesma como a força iônica inicial do tampão de carregamento, sendo que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de for

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2. 2/7 ça iônica inicial; e (c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes.

   2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é usado para analisar polipeptídeos apresentando pl variando a partir de cerca de 7,0 a cerca de 9,5.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um:

   (a) anticorpo ou uma imunoadesina ou um fragmento desses, e/ou (b) anticorpo monoclonal ou seu fragmento.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é:

   (a) um anticorpo humano, ou um anticorpo humanizado, ou um anticorpo quimérico; e/ou (b) um fragmento de anticorpo.
5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   1,3 e 4, caracterizado pelo fato de que o contaminante é:

   (a) uma variante de polipeptídeo; ou (b) um produto de degradação do polipeptídeo.
6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo apresenta um pl maior do cerca de 9,0.
7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o material cromatográfico é um material de cromatografia de troca de cátion, preferencialmente sendo que o material de cromatografia por troca de cátion é um material cromatográfico sulfonado ou um material cromatográfico carboxilado.
8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 7, caracterizado pelo fato de que o gradiente de pH:

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   3/7 (a) é um gradiente linear ou um gradiente em etapas, preferencialmente sendo que o gradiente de pH compreende um aumento entre cerca de pH 5 a cerca de pH 11; e/ou (b) o gradiente de pH é gerado usando um ou mais tampões, preferencialmente sendo que o um ou mais tampões são selecionados entre piperazina, imidazol, tris, fosfato ou CAPS.
9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo apresenta um pl menor do que cerca de 7,0.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o material de cromatografia é um material de cromatografia por troca de ânion, preferencialmente sendo que o material de cromatografia por troca de ânion é um material cromatográfico de amina quaternária ou um material cromatográfico de amina terciária.
11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o gradiente de pH:

    (a) é um gradiente linear ou um gradiente em etapas, preferencialmente sendo que o gradiente de pH compreende uma diminuição entre cerca de pH 8 a cerca de pH 5; e/ou (b) é gerado usando um ou mais tampões, preferencialmente, sendo que o um ou mais tampões são selecionados entre piperazina, imidazol ou Tris.
12. 12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 11, caracterizado pelo fato de que o método compreende:

    (a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, sendo que o tampão de carregamento está em um primeiro pH e compreende uma primeira força iônica;

    (b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição,

    Petição 870160066704, de 11/11/2016, pág. 7/15

    4/7 sendo que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição está alterada em um gradiente de força iônica, sendo que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica; e (c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, sendo que o gradiente de força iônica é um gradiente linear ou um gradiente em etapas, preferencialmente sendo que (a) o gradiente de força iônica compreende um aumento na concentração de sal entre cerca de 0 mM a cerca de 200 mM. e/ou (b) um gradiente de NaCI, um gradiente de KCI ou um gradiente de Na₂SO₄.
13. 13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 8, caracterizado pelo fato de que o método compreende:

    (a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, sendo que o tampão de carregamento está em um pH inicial e compreende uma força iônica inicial;

    (b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, sendo que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e sendo que a força iônica do tampão de eluição é essencialmente a mesma como a força iônica inicial do tampão de carregamento, sendo que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica inicial;

    (c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, sendo que a força iônica do tampão de eluição está entre cerca de 0 mM a cerca de 100 mM, preferencialmente sendo que o tampão de eluição compreende cerca de 0 mM de NaCI a cerca de

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    5/7

    100 mM de NaCI, cerca de 0 mM de KCI a cerca de 100 mM de KCI ou cerca de 0 mM de Na₂SO₄ a cerca de 100 mM de Na₂SO₄.
14. 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o método compreende:

    (a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, sendo que o tampão de carregamento está em um pH inicial e compreende uma força iônica inicial;

    (b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, sendo que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e sendo que a força iônica do tampão de eluição é essencialmente a mesma como a força iônica inicial do tampão de carregamento, sendo que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica inicial; e (c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, sendo que a força iônica do tampão de eluição está entre cerca de 0 mM a cerca de 100 mM, preferencialmente sendo que o tampão de eluição compreende cerca de 0 mM de NaCI a cerca de 100 mM de NaCI.
15. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a14, caracterizado pelo fato de que a análise é por cromatografia líquida de alto desempenho.
16. 16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o contaminante:

    (a) é uma variante de polipeptídeo; e/ou (b) um produto de degradação do polipeptídeo; e/ou (c) uma variante de carga do polipeptídeo.
17. 17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica

    Petição 870160066704, de 11/11/2016, pág. 9/15

    6/7 ções 1 a 16, caracterizado pelo fato de que:

    (a) a concentração do tampão no tampão de carregamento e/ou tampão de eluição varia entre cerca de 10 mM a cerca de 50 mM; e/ou (b) o primeiro pH varia entre cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0; e/ou (c) a temperatura do material cromatográfico varia entre cerca de 20^QC a cerca de 50^QC, e/ou (d) o carregamento e a eluição são conduzidos em uma taxa de fluxo que varia entre cerca de 0,5 ml/min a cerca de 2,0 ml/min.
18. 18. Método para determinar a pureza de um polipeptídeo em uma composição, caracterizado pelo fato de que compreende analisar a composição de acordo com qualquer um dos métodos, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, e determinar a proporção de polipeptídeo para contaminantes na composição.
19. 19. Método para determinar a estabilidade de um polipeptídeo em uma composição, caracterizado pelo fato de que compreende (a) incubar a composição que compreende o polipeptídeo a 40^QC por três a seis semanas, (b) analisar a composição da etapa (a) por qualquer um dos métodos, como definidos nas reivindicações 1 a 18, e (c) determinar a proporção de polipeptídeo para contaminantes na composição, sendo que um aumento na proporção de variantes para polipeptídeo na composição comparada com uma composição que não foi incubada indica a degradação do polipeptídeo na composição.
20. 20. Método para analisar um polipeptídeo em uma composição que compreende o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, caracterizado pelo fato de que compreende (a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um

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    7/7 material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, sendo que o tampão de carregamento está em um primeiro pH e compreende uma primeira força iônica;

    (b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, sendo que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e a força iônica do tampão de eluição está alterada em um gradiente de força iônica, sendo que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica; e (c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, sendo que o método é usado para analisar polipeptídeos que possuem um pl que varia entre cerca de 7,0 a cerca de 9,5.
21. 21. Método para analisar um polipeptídeo em uma composição que compreende um polipeptídeo e um ou mais contaminantes, caracterizado pelo fato de que compreende (a) ligar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes a um material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de carregamento, sendo que o tampão de carregamento está em um primeiro pH e compreende uma primeira força iônica;

    (b) eluir o polipeptídeo e um ou mais contaminantes do material de cromatografia de troca de íon usando um tampão de eluição, sendo que o pH do tampão de eluição está alterado em um gradiente de pH e sendo que a força iônica do tampão de eluição é essencialmente a mesma como a força iônica do tampão de carregamento, sendo que o polipeptídeo e um ou mais contaminantes são separados pela combinação do gradiente de pH e do gradiente de força iônica inicial;

    (c) detectar o polipeptídeo e um ou mais contaminantes, sendo que o método é usado para analisar os polipeptídeos que possuem um pl que varia entre cerca de 7,0 a cerca de 9,5.