BR112014030843A2

BR112014030843A2 - anticorpo anti-teofilina, formulação farmacêutica e uso do anticorpo

Info

Publication number: BR112014030843A2
Application number: BR112014030843A
Authority: BR
Inventors: Hoffmann Eike; Georges Guy; Brinkmann Ulrich
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2012-07-04
Filing date: 2013-07-04
Publication date: 2019-10-15
Also published as: PL2869837T3; JP2018138561A; CN104394886A; ES2600154T3; CN107082810B; DK2869837T3; JP6549278B2; EP3138578B1; JP6324376B2; CA2872184A1; MX2014014381A; KR20150023938A; HUE029435T2; SI2869837T1; WO2014006118A1; JP2015527983A; US9925272B2; CN104394886B; RU2630664C2; US20150238628A1

Abstract

anticorpo anti-teofilina, formulação farmacêutica e uso do anticorpo a invenção fornece anticorpos anti-teofilina e métodos de uso dos mesmos.

Description

“ANTICORPO ANTI-TEOFILINA, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO ANTICORPO” Campo Da Invenção [0001] A presente invenção refere-se aos anticorpos anti-teofilina e métodos de uso dos mesmos.

Antecedentes Da Invenção [0002] Anticorpos de ligação ao hapteno podem ser aplicados como módulos de captura para aplicações terapêuticas e diagnosticas. Por exemplo, entidades ligadas ao hapteno, tais como fluoróforos, reagentes quelantes, peptídeos, ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos, nanopartículas, e muitos outros agentes, podem reagir com os anticorpos de ligação ao hapteno e anticorpos derivados. Isto permite a detecção eficiente de tais ‘cargas’, bem como a captura, o acúmulo nos locais desejados, a ligação cruzada (reticulação) e outros efeitos mediados por anticorpos. Uma vez que as características e composição de haptenos podem influenciar a composição e “comportamento” de entidades ligadas ao hapteno (incluindo o tamanho, solubilidade, atividade, propriedades biofísicas, PK, efeitos biológicos, dentre outros), é altamente desejável desenvolver uma variedade de diferentes entidades de ligação ao hapteno. Deste modo, é possível combinar um hapteno selecionado com uma determinada carga útil para gerar conjugados de hapteno otimizados. Subsequentemente, entidades de ligação ao hapteno ótimas podem ser combinadas com os referidos conjugados para gerar ótimos complexos anticorpo-hapteno-carga. É adicionalmente desejável possuir entidades de ligação ao hapteno, tais como derivados de anticorpos que são humanizados. Isso permite aplicações com risco de interferência significativamente reduzido, tal como imunogenicidade em aplicações terapêuticas.

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2/76 [0003] No documento WO 2010/119704 são divulgados anticorpos que se ligam especificamente a beta oligômeros e o uso dos mesmos. Um novo ensaio competitivo para teofilina e reagente para a utilização no mesmo são divulgados na Patente US 4.855.226. No documento WO 2010/045388 é divulgado o uso de proteínas de ligação à MMP-9 e MMP-12 para o tratamento e prevenção da esclerose sistêmica. Ensaios eletroquimioluminescentes baseados em partículas são divulgados na US 6.881.536.

Descrição Resumida Da Invenção [0004] A invenção fornece anticorpos anti-teofilina e métodos de uso dos mesmos.

[0005] Um aspecto tal como divulgado na presente invenção é um anticorpo anti-teofilina humanizado, em que o anticorpo compreende (a) HVRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, (b) HVRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e (c) HVRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

[0006] Em um exemplo de realização, o anticorpo possui uma constante de dissociação (afinidade) de 10'¹² mol/L ou menos para a teofilina humana.

[0007] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende adicionalmente: (a) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 09, (b) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10, e e (c) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11.

[0008] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende adicionalmente: (a) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, (b) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14, e (c) uma HVR-L3 que compreende a

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3/76 sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15.

[0009] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende na posição 71 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com a numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido arginina.

[0010] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende na posição 46 do domínio variável da cadeia leve, numerado de acordo com a numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido leucina.

[0011] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende na posição 71 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com o sistema de numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido arginina; e na posição 46 do domínio variável da cadeia leve, numerado de acordo com o sistema de numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido leucina.

[0012] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende (a) uma sequência VH possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (b) uma sequência VL possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; ou (c) uma sequência VH como em (a) e uma sequência de VL como em (b), em que o resíduo de aminoácido na posição 71 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com Kabat, é arginina, e o resíduo de aminoácido na posição 46 do domínio variável da cadeia leve, numerado de acordo com Kabat, é leucina.

[0013] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 12.

[0014] Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende

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4/76 uma sequência VL de SEQ ID NO: 16.

[0015] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é um anticorpo que compreende uma sequência VH de SEQ ID NO: 12 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 16.

[0016] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo lgG1 de comprimento total ou um anticorpo lgG4 de comprimento total.

[0017] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[0018] Em um exemplo de realização, o anticorpo é um fragmento de anticorpo que se liga à teofilina.

[0019] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é uma formulação farmacêutica compreendendo o anticorpo, conforme divulgado na presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0020] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é o anticorpo, tal como divulgado na presente invenção, para a utilização como um medicamento.

[0021] Um aspecto conforme divulgado na presente invenção é o uso do anticorpo, tal como divulgado no presente, na fabricação de um medicamento.

Breve Descrição Das Figuras [0022] Figura 1: A expressão de anticorpos quiméricos e humanizados que se ligam à teofilina: SDS PAGE redudor exibe a composição e homogeneidade dos anticorpos quimérico (pista do meio) e humanizados (pista da direita) após a purificação com proteína A e SEC. O marcador de peso molecular foi aplicado na pista da esquerda. Cadeias H (banda superior a 50k) e cadeias L (banda inferior a 25k) são detectáveis como bandas exclusivas sem presença de quantidades visíveis de contaminações de

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5/76 proteínas adicionais.

[0023] Figura 2: Ensaio de ELISA para teofilina demonstrando a ligação específica e eficaz do anticorpo à teofilina imobilizada.

[0024] Figura 3: Perfis de ligação dos anticorpos de ligação à teofilina em experimentos SPR.

[0025] Figura 4: a) Composição, estrutura e peso molecular da Teofilina-Cis-Cy5; b) cromatografia de exclusão por tamanho demonstra a pureza e homogeneidade dos anticorpos variantes de ligação à teofilina purificados; pico # 2 indica o produto purificado, a falta do pico # 1 indica que tais preparações são livres de agregados; c) a formação de complexos covalentes entre os anticorpos de ligação à teofilina e teofilina-Cis-Cy5 conforme demonstrado por SDS-PAGE não redutor (pistas da esquerda) e redutor (pista da direita); Cy5 aparece acoplado à cadeia H, apenas sob condições não redutoras nas amostras que continham Teofilina-Cis-Cy5 e anticorpo cys-mutado, estes conjugados covalentes desintegram-se sob condições não redutoras (pistas da direita); Pista 1: marcador de peso molecular; 2-4 não redutor - 2: anticorpo anti-teofilina (sem mutação cys) + Teofilina-Cis-Cy5 (complexo); 3: anticorpo anti-teofilina-cys_55 + Teofilina-Cis-Cy5 (conjugado); 4: anticorpo anti-teofilina-cys_54 + Teofilina-Cis-Cy5 (conjugado); 5-7 redutor- 5: anticorpo anti-teofilina (sem mutação cys) + Teofilina-Cis-Cy5 (complexo); 6: anticorpo anti-teofilina-cys_55 + Teofilina-Cis-Cy5 (conjugado); 7: anticorpo anti-teofilina-cys_54 + Teofilina-Cis-Cy5 (conjugado).

[0026] Figura 5: A afinidade de ligação do anticorpo à teofilina foi avaliada por experimentos de ressonância plasmônica de superfície (BIAcore). Os fragmentos Fab do anticorpo foram capturados no chip por anti-huFab, seguido pela exposição a mono-teofilina contendo carga (Teo-peptídeo). Complexos 1:1 definidos (Fab:teofilina-carga) foram formados. Além de rápida

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6/76 ligação (on-rate), não observamos velocidades de dissociação (off-rates) detectáveis, ou seja, não há liberação relevante do antígeno ligado.

Descrição Detalhada Da Invenção

I. Definições [0027] Uma “região estrutural aceptora humana” (acceptor human framework) para os propósitos da presente invenção é uma região estrutural ou arcabouço (framework) que compreende a sequência de aminoácidos de uma região estrutural do domínio variável de cadeia leve (V_L) ou uma região estrutural do domínio variável de cadeia pesada (V_H) derivada de uma região estrutural de imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano, tal como definido abaixo. Uma região estrutural ou arcabouço (framework) aceptora humana “derivada de” uma região estrutural de uma imunoglobulina humana ou região estrutural de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácido destas ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em alguns exemplos de realização, o número de alterações de aminoácidos é de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em alguns exemplos de realização, a região de arcabouço humana aceptora V_L é idêntica em sua sequência com a sequência da região de arcabouço da imunoglobulina humana V_L ou sequência da região estrutural de consenso humano.

[0028] “Afinidade” refere-se, em geral, à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A “afinidade de ligação” a menos que indicado de outro modo, refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par ligante (por exemplo, anticorpo e antígeno). A

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7/76 afinidade da molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida através de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Exemplos de realização específicos ilustrativos e exemplares para mensurar a afinidade de ligação são descritos a seguir.

[0029] Um anticorpo “maturado por afinidade” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs), em comparação com um anticorpo parental que não possui tais alterações, e estas modificações resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo ao antígeno.

[0030] As expressões “anticorpo anti-teofilina” e “um anticorpo que se liga à teofilina” referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar à teofilina com afinidade suficiente para que o anticorpo se torne útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico direcionado contra teofilina. Em uma realização, a extensão de ligação de um anticorpo anti-teofilina a uma proteína não relacionada, não teofilina, é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo para a teofilina mensurada, por exemplo, por um teste de radioimunoensaio (RIA). Em determinados exemplos de realização, um anticorpo que se liga à teofilina tem uma constante de dissociação (Kd) < 1 μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10'⁸ M ou menos, por exemplo, de 10'⁸ a 10’¹³, por exemplo, de 10'⁹ a 10'¹³ M).

[0031] O termo “anticorpo” na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange diferentes estruturas de anticorpo, incluindo, mas não se limitando, a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica

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8/76 desejada.

[0032] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula que não é um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a Fv, Fab, Fab’, Fab’SH, F(abj₂, diacorpos (diabodies), anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFV); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[0033] Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo” como um anticorpo de referência refere-se a um anticorpo que bloqueia em 50% ou mais a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição, e inversamente, os anticorpos de referência bloqueiam a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais. Um ensaio de competição exemplar é fornecido na presente invenção.

[0034] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma determinada fonte ou espécie, enquanto que o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[0035] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante presente em sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGi, lgG₂, lgG₃, lgG₄, IgAi e lgA₂. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de oc, δ, ε, γ, e μ, respectivamente.

[0036] O termo “agente citotóxico”, da forma como é utilizado no presente, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função celular e/ou

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9/76 causa a destruição ou morte celular. Os agentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, isotopes radioativos (por exemplo, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², P²¹² e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos (por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides da vinca (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorubicina ou outros agentes intercalantes); agentes inibidores do crescimento; enzimas e fragmentos destes como, por exemplo, enzimas nucleotídeas, antibióticos e toxinas como, por exemplo, pequenas moléculas de toxina ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas, e os diversos agentes antitumorais ou anticâncer divulgados abaixo.

[0037] “Funções efetoras” referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com a classe do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: a ligação de C1q e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B), e ativação de células B.

[0038] Uma “quantidade eficaz” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático ou terapêutico desejado.

[0039] O termo “região Fc” é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina contendo pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões de Fc de sequências nativas e regiões Fc variantes. Em um exemplo de realização, uma região Fc de cadeia pesada da IgG humana estende-se desde da Cis226, ou

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10/76 desde a Pro230, até a extremidade carboxi-terminal da cadeia pesada. Entretanto, a lisina C-terminal (Lis447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra maneira, a numeração dos resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado o índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991), Publicação NIH 91-3242.

[0040] “Região de arcabouço” ou “região estrutural” ou “FR” (de framework) referem-se aos resíduos de domínios variáveis que não sejam resíduos da região hipervariável (HVR) A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Assim, as sequências HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência na VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.

[0041] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto”, “anticorpo inteiro” ou “anticorpo completo” são utilizados na presente invenção de forma alternada para se referirem a um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura do anticorpo nativo ou possuindo as cadeias pesadas que contem uma região Fc conforme definido no presente.

[0042] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem de célula hospedeira” e “cultura de células hospedeiras” são utilizados de maneira alternada e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e progênie dela derivada sem levar em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica quanto a

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11/76 conteúdo de ácido nucleico em relação à célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológica, conforme triado ou selecionado na célula transformada inicial, é abrangida pela presente invenção.

[0043] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde ao de um anticorpo produzido por um ser humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificantes de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado, que compreende resíduos não humanos de ligação ao antígeno.

[0044] Uma “região de arcabouço (ou estrutural) de consenso humano” é uma região de arcabouço que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências da região de arcabouço V_H ou V_L da imunoglobulina humana. De modo geral, a seleção das sequências V_H ou V_Lda imunoglobulina humana ocorre a partir de um subgrupo de sequências de domínios variáveis. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Edição, Bethesda MD (1991), NIH Publication 913242, vols.1-3. Em um exemplo de realização, para o V_L, o subgrupo é subgrupo kappa I como em Kabat et al. supra. Em um exemplo de realização, para o V_L, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat etal. supra.

[0045] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos a partir de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos a partir de FRs humanas. Em alguns exemplos de realização, o anticorpo humanizado compreenderá de substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios

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12/76 variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivado de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização.

[0046] O termo “região hipervariável” ou “HVR” conforme utilizado no presente refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que é hipervariável na sequência e/ou forma alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”). Geralmente, os anticorpos nativos de quatro cadeias compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). As HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ou das “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), sendo esta última de maior variabilidade de sequência e/ou estando envolvida no reconhecimento do antígeno. Alças hipervariáveis exemplares ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3). (Chothia, C. e Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917); As CDRs exemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 de L1,50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1,50-65 de H2 e 95-102 de H3. (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 913242). Com exceção da CDR1 no VH, as CDRs compreendem geralmente os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis. As CDRs também compreendem “resíduos determinantes da especificidade”, ou “SDRs”,

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13/76 que são os resíduos que fazem contato com o antígeno. As SDRs estão contidas dentro de regiões das CDRs denominadas de CDRs-abreviadas, ou “a-CDRs”. As a-CDRs exemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDRH1, a-CDR-H2 e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 e 95-102 de H3. (Vide Almagro, J.C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). Salvo quando indicado de outra forma, os resíduos HVR e outros resíduos do domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados na presente invenção de acordo com Kabat et at., Supra.

[0047] Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado com uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo, mas não se limitando a um agente citotóxico.

[0048] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cachorros e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em determinados exemplos de realização, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.

[0049] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi identificado e separado a partir de um componente de seu ambiente natural. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo é purificado a mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por métodos eletroforéticos (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou por cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca iônica ou HPLC de fase inversa). Para uma revisão de métodos para a avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman, S. et at., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87.

[0050] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de

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14/76 ácido nucleico que foi separada a partir de um componente de seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que normalmente expressam a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomalmente ou está em uma localização cromossômica que é diferente de sua localização cromossômica natural.

[0051] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo antiteofilina” refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos (ou fragmentos dos mesmos), incluindo tais moléculas de ácido nucleico em um único vetor ou em vetores separados, e a(s) dita(s) molécula(s) de ácido nucleico estão presentes em pelo menos um ou mais local(ais) de uma célula hospedeira.

[0052] O termo “anticorpo monoclonal” conforme utilizado no presente refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao(s) mesmo(s) epítopo(s), exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que podem surgir durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estão presentes em pequenas quantidades. Ao contrário das preparações com anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre um antígeno. Portanto, o adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma necessidade de se produzir o anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos

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15/76 monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando aos métodos de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo a totalidade ou parte dos loci de imunoglobulinas humanas, e tais métodos e outros métodos exemplares para produzir anticorpos monoclonais sendo descritos no presente.

[0053] Um “anticorpo nu” refere-se a um anticorpo não conjugado a uma molécula heteróloga (tal como uma fração citotóxica) ou um radiomarcador. O anticorpo nu pode estar presente em uma formulação farmacêutica.

[0054] “Anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulinas de ocorrência natural com diferentes estruturas. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por dissulfeto. A partir da extremidade Npara a C-terminal, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também denominada de domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Do mesmo modo, a partir da extremidade N- para a C-terminal, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também denominada de domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante (CL). A “cadeia leve” de um anticorpo pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[0055] O termo “bula” da forma como é utilizado no presente refere-se a instruções habitualmente incluídas nos recipientes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização,

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16/76 posologia, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos.

[0056] “O “percentual (%) de identidade da sequência de aminoácidos” com relação a uma sequencia polipeptídica é definido no presente como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos (gaps), se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de sequências. O alinhamento para propósitos da determinação do percentual de identidade de sequências de aminoácidos pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento da técnica, por exemplo, o uso de softwares de computador publicamente disponíveis, tais como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos hábeis no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão sendo comparadas. Para os propósitos da presente invenção, no entanto, os valores da % de identidade da sequência de aminoácido são gerados usando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 é de autoria da Genentech, Inc. e o código fonte foi apresentado com a documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington, DC, 20559, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível pela Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O

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17/76 programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

[0057] Em situações onde o ALIGN-2 é empregado para a comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma determinado sequência de aminoácido A que contenha uma certa % de identidade de sequência de aminoácidos com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B ) é calculado da seguinte forma:

100 vezes a fração X/Y em que, X é a quantidade de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondentes idênticos pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento A e B do programa e em que Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Será compreendido que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, o percentual de identidade de sequências de aminoácidos de A para B não é igual ao percentual de identidade de sequências de aminoácidos de B para A. A menos que especificamente indicado em contrário, todos os valores percentuais de identidade de sequências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos, tal como descrito no parágrafo anterior, pelo uso do programa ALIGN-2.

[0058] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo contida nela seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação deveria ser administrada.

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18/76 [0059] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica que não seja um ingrediente ativo e que não seja tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

[0060] O termo “teofilina” curto “TEO”, indica uma 1,3-dimetil-7Hpurina-2,6-diona. A teofilina também é conhecida como dimetilxantina.

[0061] Conforme utilizado no presente, o termo “tratamento” (e variações gramaticais deste como “tratar” ou “tratando”) refere-se a intervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo que está sendo tratado, e pode ser realizado para profilaxia ou durante o desenvolvimento da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progressão da doença, melhora ou alívio do estado doentio, e remissão ou prognóstico melhorado. Em alguns exemplos de realização, os anticorpos da presente invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença, ou para retardar a progressão de uma doença.

[0062] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro arcabouços (frameworks - FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6~ ed., W.H. Freeman & Co., (2007) página 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir

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19/76 especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados utilizando um domínio VH ou VL a partir de um anticorpo que se liga ao antígeno para pesquisar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano, S. etal., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. etal., Nature 352 (1991) 624-628).

[0063] O termo “vetor”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual ele foi ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico auto-replicante, bem como o vetor incorporado ao genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido. Determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos no presente como “vetores de expressão”.

[0064] O termo “hapteno” denota uma molécula pequena que pode provocar uma resposta imune apenas quando ligada a um grande portador, tal como uma proteína. Haptenos exemplares são anilina, ácidos o-, m- e p-aminobenzóico, quinona, hidralazina, halotano, fluoresceína, biotina, digoxigenina, teofilina e dinitrofenol. Em um exemplo de realização, o hapteno é biotina ou digoxigenina ou teofilina ou carborano.

[0065] O termo “um hapteno que é conjugado com” ou “composto haptenilado” indica um hapteno que está covalentemente ligado a uma porção adicional, tal como um polipeptídeo ou marcador. Derivados de hapteno ativado são frequentemente utilizados como materiais de partida para a formação de tais conjugados. Em um exemplo de realização o hapteno é digoxigenina e ele está conjugado (em um exemplo de realização através de seu grupo 3-hidroxi) à porção por meio de um ligante. Em um exemplo de realização, o ligante

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20/76 compreende; a) um ou mais (em um exemplo de realização os grupos 3-6) metileno-carboxi-metila (-CH₂-C(O)-), e/ou b) de 1 a 10 (em um exemplo de realização de 1 a 5) resíduos de aminoácidos (em um exemplo de realização, selecionados a partir de glicina, serina, glutamate, β-alanina, ácido γaminobutírico, ácido ε-aminocapróico ou Usina), e/ou c) um ou mais (em um exemplo de realização, um ou dois) compostos possuindo a fórmula estrutural NH₂-[(CH₂)_nO]xCH₂-CH₂-COOH em que n é 2 ou 3 e x é 1 a 10, em um exemplo de realização 1 a 7. Os últimos elementos resultam (pelo menos parcialmente) em (parte) de um ligante da fórmula -ΝΗ-[(ΟΗ₂)_ηΟ]_χΟΗ₂-ΟΗ₂C(O)-. Um exemplo de tal composto é, por exemplo, o ácido 12-amino-4,7,10trioxadodecanóico (resulta em um ligante TEG (trietilenoglicol)). Em um exemplo de realização, o ligante compreende ainda um grupo maleimida. O ligante tem um efeito de estabilização e solubilização uma vez que ele contém cargas ou/e pode formar pontes de hidrogênio. Além disso, pode facilitar estericamente a ligação do anticorpo anti-hapteno ao polipeptídeo conjugado ao hapteno. Em um exemplo de realização, o ligante está localizado em uma cadeia lateral de um aminoácido do polipeptídeo (por exemplo, conjugado com uma cadeia lateral da Usina ou cisteína por meio de um grupo -amino ou -tiol). Em um exemplo de realização, o ligante está localizado na extremidade aminoterminal ou na extremidade carboxi-terminal do polipeptídeo. O posicionamento do ligante no polipeptídeo é tipicamente escolhido em uma região em que a atividade biológica do polipeptídeo não seja afetada. Por esse motivo, a posição de fixação do ligante depende da natureza do polipeptídeo e os elementos estruturais relevantes, que são responsáveis pela atividade biológica. A atividade biológica do polipeptídeo com o hapteno anexado pode ser testada em um ensaio in vitro.

[0066] O termo “formação do complexo covalente” significa que,

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21/76 após a formação de um complexo não covalente, por exemplo, entre um anticorpo anti-teofilina e a teofilina, uma ligação covalente é formada entre os dois parceiros no complexo. A formação da ligação covalente ocorre sem a necessidade de adicionar reagentes adcionais.

II. Composições E Métodos [0067] Em um aspecto, a invenção é baseada em anticorpos que se ligam à teofilina. Estes anticorpos são fornecidos na presente invenção. Os anticorpos da invenção são úteis, por exemplo, como anticorpos monoespecíficos para a ligação de compostos teofilinilados e como anticorpos multiespecíficos como para o diagnóstico ou tratamento de todos os tipos de doenças pelo uso da especificidade de ligação aos compostos teofilinilados como característica de carga universal do anticorpo.

A. Exemplos de Anticorpos Anti-Teofilina [0068] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos isolados que se ligam a teofilina. Em determinados exemplos de realização, os anticorpos anti-teofilina são anticorpos anti-teofilina humanizados. Em determinados exemplos de realização, os anticorpos anti-teofilina conforme divulgado na presente invenção ligam-se aos compostos teofilinilados sem interferir com a atividade biológica do composto que é conjugado com a teofilina e está especificamente ligado pelo anticorpo através do resíduo de teofilina. Consequentemente, estes anticorpos podem ser utilizados para melhorar as propriedades farmacocinéticas de compostos conjugados à teofilina (compostos teofilinados), se o anticorpo é um anticorpo monoespecífico. Além disso, estes anticorpos podem ser utilizados para a administração direcionada de um composto teofilinilado se o anticorpo é um anticorpo bi- ou multiespecífico como uma especificidade de ligação direcionada contra a teofilina e pode ser usado como especificidade de carga

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22/76 universal ao passo que uma segunda especificidade de ligação se liga especificamente, por exemplo, a uma molécula da superfície celular e proporciona a característica/componente de direcionamento do anticorpo bi- ou multiespecífico.

[0069] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiteofilina compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 02; (c) HVR-H3 compreendendo a sequênciade aminoácido de SEQ ID NO: 03; (d) HVR-L1 compreendendo a sequênciade aminoácido de SEQ ID NO: 05; (e) HVR-L2 compreendendo a sequênciade aminoácido de SEQ ID NO: 06; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 07.

[0070] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiteofilina compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 02; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 03. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 03. Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 03 e HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 07. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 03, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 07, e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 02. Em um

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23/76 exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 02; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 03.

[0071] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiteofilina compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 06; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 07. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 06; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 07.

[0072] Em outro aspecto, um anticorpo anti-teofilina da presente invenção compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (I) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 01, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 02, e (ill) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 03; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (I) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 05, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 06, e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 07.

[0073] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiteofilina compreendendo: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de

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24/76 aminoácidos de SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 02; (c) HVR -H3 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 03; (d) HVR-L1 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 05; (e) HVR-L2 compreendendo a sequênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 06; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 07.

[0074] Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-teofilina é humanizado.

[0075] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiteofilina humanizado compreendendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoâcido de SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoâcido de SEQ ID NO: 10; (c) HVR-H3 compreendendoa sequência de aminoâcido de SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 compreendendoa sequência de aminoâcido de SEQ ID NO: 13; (e) HVR-L2 compreendendoa sequência de aminoâcido de SEQ ID NO: 14; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoâcido de SEQ ID NO: 15.

[0076] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiteofilina humanizado compreendendo pelo menos uma, duas ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoâcido de SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoâcido de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoâcido de SEQ ID NO: 11. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. Em

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25/76 um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11, HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15, e HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10. Em um exemplo de realização adicional, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11.

[0077] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiteofilina humanizado compreendendo pelo menos uma, duas ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15.

[0078] Em um aspecto, um anticorpo da presente invenção compreende (a) um domínio VH compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências VH HVR selecionadas a partir de (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 09, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (ill) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; e (b) um domínio VL compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências VL HVR selecionadas a partir de (I) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-L2 compreendendo a

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26/76 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

[0079] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiteofilina humanizado compreendendo: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 compreendendoa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (c) HVR -H3 compreendendoa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (d) HVR-L1 compreendendoa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (e) HVR-L2 compreendendoa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 15.

[0080] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo antiteofilina humanizado compreendendo: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 compreendendoa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 02; (c) HVR -H3 compreendendoa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 03; (d) HVR-L1 compreendendoa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 05; (e) HVR-L2 compreendendoa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 06; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 07, em que o resíduo de aminoácido na posição 60 da HVR-H2 é A e o resíduo de aminoácido na posição 61 da HVR-H2 é Q.

[0081] Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-teofilina humanizado compreende HVRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano. Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-teofilina humanizado compreende HVRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda

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- R na posição 71.

- A posição 71 Kabat corresponde ao resíduo de número 72 da SEQ ID NO: 04, 12, e 20.

[0082] Esta alteração (mutação para trás - backward mutation) foi introduzida para aumentar a afinidade de ligação do anticorpo anti-teofilina humanizado.

[0083] Em outro aspecto, um anticorpo anti-teofilina compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 04. Em determinados exemplos de realização, uma sequência VH possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo anti-teofilina compreendendo tal sequência ainda mantém a capacidade de se ligar à teofilina. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 04. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-teofilina compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 04, incluindo modificações pós-traducionais da referida sequência. Em um exemplo de realização específico, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 01; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 02; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 03.

[0084] Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-teofilina

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28/76 humanizado compreende HVRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano. Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-teofilina humanizado compreende uma VH compreendendo HVR-Hs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende adicionalmente:

- R na posição 71.

[0085] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-teofilina, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) possuindo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 08. Em determinados exemplos de realização, uma sequência VL possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo anti-teofilina compreendendo tal sequência ainda mantém a capacidade de se ligar à teofilina. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 08. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-teofilina compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 08, incluindo modificações pós-traducionais da referida sequência. Em um exemplo de realização específico, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de

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29/76 aminoácidos de SEQ ID NO: 05; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 06; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 07.

[0086] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-teofilina, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima, e uma VL como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e VL de SEQ ID NO: 04 e SEQ ID NO: 08, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais destas sequências.

[0087] Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-teofilina humanizado compreende HVRs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende ainda uma região de arcabouço humana aceptora, por exemplo, um arcabouço (framework) de imunoglobulina humana ou arcabouço de consenso humano. Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-teofilina humanizado compreende uma VL compreendendo HVRLs como em qualquer um dos exemplos de realização anteriores, e compreende adicionalmente:

- L na posição 46.

- A posição 46 Kabat corresponde ao resíduo de número 51 da SEQ ID NO: 08, 16 e 24.

[0088] Esta alteração (mutação para trás - backward mutation) foi introduzida para aumentar a afinidade de ligação do anticorpo anti-teofilina humanizado.

[0089] Em outro aspecto, um anticorpo anti-teofilina humanizado compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ

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ID NO: 12. Em determinados exemplos de realização, uma sequência VH possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo anti-teofilina compreendendo tal sequência ainda mantém a capacidade de se ligar à teofilina. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s) ou deletado(s) na SEQ ID NO: 12. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-teofilina compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 12, incluindo modificações pós-traducionais da referida sequência. Em um exemplo de realização específico, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 09; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11.

[0090] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-teofilina humanizado, em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) possuindo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em determinados exemplos de realização, uma sequência VL possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas o anticorpo anti-teofilina compreendendo tal sequência ainda mantém a capacidade de se ligar à teofilina. Em certos exemplos de realização, um total de 1 a 10 aminoácidos foi(foram) substituído(s), inserido(s)

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31/76 ou deletado(s) na SEQ ID NO: 16. Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções ocorrem fora das regiões HVRs (ou seja, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-teofilina compreende a sequência VL na SEQ ID NO: 16, incluindo modificações pós-traducionais da referida sequência. Em um exemplo de realização específico, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

[0091] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-teofilina humanizado, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima, e uma VL como em qualquer um dos exemplos de realização fornecidos acima. Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende a sequência VH e VL de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 16, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais destas sequências.

[0092] Em um aspecto adicional da invenção, um anticorpo antiteofilina de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima é um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em um exemplo de realização, um anticorpo anti-teofilina é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacorpo (diabody) ou F(abj₂. Em outro exemplo de realização, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total, por exemplo, um anticorpo IgGi ou lgG₄intacto ou anticorpo de outra classe ou isotipo, conforme definido no presente.

[0093] Em outro aspecto, um anticorpo anti-teofilina de acordo com qualquer um dos exemplos de realização acima pode incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, conforme descrito

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32/76 nas seções 1-5 abaixo:

1. Afinidade de Anticorpo [0094] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção tem uma constante de dissociação (Kd) de < 0,001 nM (por exemplo, 10'¹² M ou menos, por exemplo, de 10'¹² M a 10'¹³ M).

[0095] Em um exemplo de realização, a “Kd” é mensurada por um teste de ligação com antígeno radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno descrito pelo seguinte ensaio. A afinidade de ligação da solução dos FABs pelos antígenos é mensurada equilibrando o Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com I¹²⁵ na presença de uma titulação seriada de antígeno não marcado e, em seguida, capturando os antígenos ligados com uma placa revestida com anticorpos anti-Fab (vide, por exemplo, Chen, et al., J. Mol Biol 293 (1999) 865881). Para estabelecer as condições do ensaio, placas de múltiplos poços MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas durante a noite com 5 pg/ml de anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs), em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e, em seguida, é feito o bloqueio com albumina bovina 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em uma placa não adsorvente (Nunc # 269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno[I¹²⁵] são misturados com diluições seriadas de um Fab de interesse (por exemplo, coerente com a avaliação do anticorpo anti-VEGF, Fab-12 em Presta, L.G., et al., Cancer Fies. 57 (1997) 4593-4599). O Fab de interesse é, em seguida, incubado durante a noite, no entanto, a incubação pode continuar por um longo período (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja alcançado. Posteriormente, as misturas são transferidas para a placa de captura para a incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então retirada e a placa lavada oito vezes com 0,1% de

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33/76 polisorbato-20 (Tween-20®) em PBS. Após as placas estarem secas, 150 μΙ/poço de cintilante (MicroScint-20®; Packard) é adicionado, e as placas são contadas em um contador TOPCOUNT gamma (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que resultam em uma ligação menor ou igual a 20% da ligação máxima são escolhidas para a utilização em ensaios de ligação competitivos.

[0096] De acordo com outro exemplo de realização, a Kd é mensurada pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície utilizando o BIAcore®-2000 ou BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C com chips CM5 de antígeno imobilizado ~ 10 Unidades de Resposta (RU). Resumidamente, chips biosensores de dextrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com cloridrato de AZ-etil-ZV-ÍS-dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC) e A/-hidroxisucinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 pg/ml (~ 0,2 μΜ) antes de ser injetado a uma velocidade de fluxo de 5 μΙ/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, etanolamina 1 M é adicionada para bloquear grupos que não reagiram. Para a mediação cinética, diluições seriadas em duplicatas de Fab (0,78 nM e 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de tensoativo polisorbato-20 (Tween-20®) (PBST) a 25 °C em uma velocidade de fluxo de cerca de 25 μΙ/min. A velocidade de associação (k_on) e a velocidade de dissociação (k_Off) são calculadas utilizando um modelo de ligação simples um-para-um de Langmuir (BIAcore Evaluation Software version 3.2) pelo ajuste simultâneo de sensogramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (K_d) é calculada como a relação k_Off/k_On. Vide, por exemplo, Chen, Y., et al., J. Mol Biol 293 (1999) 865-881. Se a medida for superior a 10⁶ M'¹ S'¹ pelo ensaio de ressonância plasmônica

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34/76 descrito acima, então a taxa pode ser determinada por uma técnica de inibição (quenching) de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição das emissões de intensidade de fluorescência (excitação= 295 nm; Emissão = 340 nm, banda de passagem=16 nm) a 25 ^QC de 20 nM de um anticorpo antiantígeno (na forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes do antígeno mensurado em espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com válvula do tipo stop-flow (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic), com agitador de cuveta.

2. Fragmentos De Anticorpos [0097] Em certas realizações, um anticorpo fornecido na presente invenção é um fragmento de anticorpo. Os fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)₂, Fv, scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, vide Hudson, P. J. etal. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, vide Pluckthun, A., em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg & Moore., (Springer-Verlag, Nova lorque), págs. 269-315 (1994); vide também a publicação WO 93/16185; e as Patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Para uma discussão sobre os fragmentos Fab e F(ab’)₂ compreendendo os resíduos do epitope de ligação aos receptores de recuperação (salvage) e possuindo uma meia-vida in vivo aumentada, vide a Patente US 5.869.046.

[0098] Os diacorpos (diabodies) são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, a Patente EP 404.097; o documento WO 1993/01161; Hudson, P. J., etal., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger, P., etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993). Os triacorpos e tetracorpos

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35/76 também estão descritos em Hudson, P. J., etal. Nat. Med. 9:129-134 (2003).

[0099] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em determinadas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA, vide, por exemplo, Patente US 6.248.516 B1).

[00100] Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por diversas técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto bem como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, Escherichia coli ou fagos), conforme descrito na presente invenção.

3. Anticorpos Quiméricos E Humanizados [00101] Em certas realizações, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente US 4.816.567; e em Morrison, S.L., et al,. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho, ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe alterada” no qual a classe ou subclasse foi alterada em relação ao do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem os fragmentos de ligação ao antígeno destes.

[00102] Em determinadas realizações, o anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade aos seres humanos, enquanto retém a

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36/76 especificidade e afinidade do anticorpo parental não humano. De modo geral, um anticorpo humanizado inclui um ou mais domínios variáveis nos quais as HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e as FRS (ou porções das mesmas) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado também irá compreender, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em alguns exemplos de realização, alguns resíduos FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, anticorpo a partir do qual os resíduos da HVR são derivados), por exemplo, para restabelecer ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

[00103] Os anticorpos humanizados e métodos para produzi-los são revistos, por exemplo, em Almagro, J.C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, são adicionalmente descritos, por exemplo, em Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 10029-10033; Patentes US 5.821.337, US 7,527.791, US 6.982.321, e US 7.087.409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (descrevendo o enxerto de SDR (a-CDR)).; Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (descrevendo o “resurfacing)·, Dall'Acqua, W.F., et al, Métodos 36:43-60 (2005) (descrevendo o “shuffling de FR”); e Osbourn, J. etal, Methods 36:61-68 (2005) e Klimka, A., etal., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que descrevem a abordagem de “seleção guiada” para o shuffling de FR).

[0100] Os arcabouços (ou regiões estruturais - framework) humanos que podem ser utilizados para a humanização incluem, mas não estão limitados a: regiões estruturais selecionadas usando o método de “melhor ajuste” (best-fif)(y\de, por exemplo, Sims, M.J. et al. J. Immunol 151:2296 (1993));. regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de

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37/76 anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter, P., etal. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); e Presta, L.G., et al.J. Immunol, 151:2623 (1993)); regiões estruturais maduras humanas (somaticamente mutadas) ou regiões estruturais humanas da linhagem germinativa (vide, por exemplo, Almagro, J.C., e Fransson J., Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)), e regiões estruturais derivadas a partir da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca, M., et al, J. BioLChem. 272:10678-10684 (1997) e Rosok, M.J., et al., J. Biol.Chem. 271 (1996) 22611-22618).

4. Anticorpos Multiespecíficos [0101] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo fornecido na presente invenção é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Em exemplos de realização específicos, uma das especificidades de ligação é para a teofilina e a outra é para qualquer outro antígeno. Em determinados exemplos de realização, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes da teofilina. Os anticorpos biespecíficos podem também ser usados para concentrar agentes citotóxicos nas células que expressam teofilina. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo total ou fragmentos de anticorpo.

[0102] As técnicas para produzir anticorpos multiespecífico incluem, mas não estão limitadas a, coexpressão recombinante de dois pares cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina possuindo diferentes especificidades (vide Milstein, C. e Cuello, A.C. Nature 305 (1983) 537-540), Publicação WO 93/08829, e Traunecker, A. et al, EMBO J. 10 (1991) 3655

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3659), e a engenharia “knob-in-hole” (vide, por exemplo, a Patente US 5.731.168). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos pela manipulação de efeitos de orientação eletrostática para a produção de moléculas heterodiméricas de Fc-anticorpo (WO 2009/089004); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, Patente US 4.676.980, e Brennan, M. et al, Science, 229 (1985) 81-83); utilizando zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny, S.A., et al., J. Immunol, 148 (1992) (5) 1547-1553); e usando a tecnologia de “diacorpo” para a produção de fragmentos de anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Hollinger, P., et al,. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90 (1993) 64446448) e a utilização de dímeros Fv de cadeia única (sFv) (por exemplo, Gruber

M., et al,. J. Immunol., 152 (1994) 5368-5374); e a preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt, A. et al.J. Immunol. 147 (1991) 60-69.

[0103] Os anticorpos manipulados com três ou mais sítios de ligação a antígenos funcionais, incluindo anticorpos “octopus”, também estão incluídos na presente invenção (vide, por exemplo, US 2006/0025576).

[0104] O anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção inclui também um “FAb de dupla atuação” (Dual Acting Fab) ou “DAF” compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga à teofilina, bem como um outro, para um antígeno diferente (vide, por exemplo, a publicação US 2008/0069820).

[0105] O anticorpo ou fragmento na presente invenção também inclui anticorpos multiespecíficos descritos nos documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 e WO 2010/145793.

5. Anticorpos Variantes

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39/76 [0106] Em determinados exemplos, são contempladas sequências de aminoácidos variantes dos anticorpos fornecidos na presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As sequências de aminoácidos variantes de um anticorpo podem ser preparadas pela introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica o anticorpo ou pela síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para se chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.

a) Variantes De Substituição, Inserção e Deleção [0107] Em certos exemplos de realização, são fornecidos variantes de anticorpos possuindo uma ou mais substituições de aminoácidos. Os sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs e FRs. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 1 sob o título de “substituições preferidas”. Alterações mais substanciais são fornecidas na Tabela 1 sob o título de “substituições exemplares”, e conforme descrito abaixo em referência às classes de cadeias laterais de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, uma ligação ao antígeno melhorada/mantida, diminuição da imunogenicidade, ou ADCC ou CDC melhorada.

Tabelai

Resíduo Original	Substituições exemplares	Substituições preferidas
Ala (A)	Vai; Leu; lie	Vai

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Resíduo Original	Substituições exemplares	Substituições preferidas
Arg (R)	Lis; Gin; Asn	Lis
Asn (N)	Gin; His; Asp, Lis; Arg	Gin
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cis (C)	Ser; Ala	Ser
Gin (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gin	Asp
Gli (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gin; Lis; Arg	Arg
lle(l)	Leu; Vai; Met; Ala; Fen; Norleucina	Leu
Leu (L)	Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Fen	lie
Lis (K)	Arg; Gin; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Fen; lie	Leu
Fen (F)	Trp; Leu; Vai; lie; Ala; Tir	Tir
Pro (P)	Ala	Ala
Ser(S)	Tre	Tre
Tre (T)	Vai; Ser	Ser
Trp (W)	Tir; Fen	Tir
Tir (1)	Trp; Fen; Tre; Ser	Fen
Vai (V)	lie; Leu; Met; Fen; Ala; Norleucina	Leu

[0108] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral:

(1) Hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;

(2) hidrofílico neutro: Cis, Ser, Tre, Asn, Gin;

(3) ácido: Asp, Glu (4) básico: His, Lis, Arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gli, Pro;

(6) aromático: Trp, Tir, Fen.

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41/76 [0109] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[0110] Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano e humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para um estudo mais aprofundado terá(ão) modificações (por exemplo, melhorias) em certas propriedades biológicas (por exemplo, aumento da afinidade, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ou terá(ão) certas propriedades biológicas do anticorpo parental substancialmente retidas. Uma variante de substituição exemplar é um anticorpo maturado por afinidade que pode ser facilmente gerado, por exemplo, usando técnicas de maturação de afinidade baseadas na exibição por fagos, tal como aquelas descritas no presente. Resumidamente, um ou mais resíduos da HVR está mutado e os anticorpos variantes são apresentados no fago e rastreados por uma atividade biológica específica (por exemplo, a afinidade de ligação).

[0111] As alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em “hotspots” da HVR, ou seja, os resíduos codificados pelos códons que são submetidos à mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (vide, por exemplo, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), e/ou em SDRs (a-CDRs), com a variante de VH ou VL resultante avaliada pela afinidade de ligação. A maturação por afinidade por meio da construção e reseleção a partir de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom, H.R. et al. em Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. Em alguns exemplos de realização de maturação por afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para a

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42/76 maturação por qualquer um dentre uma variedade de métodos (por exemplo, PCR sujeito a erros, embaralhamento (shuffling) de cadeias, ou mutagênese dirigida de oligonucleotídeos). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então pesquisada para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens dirigidas à HVR, nas quais vários resíduos HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de cada vez) são distribuídos aleatoriamente. Os resíduos HVR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, utilizando a mutagênese de varredura de alanina ou modelação. Particularmente a CDR-H3 e CDR-L3 são alvos frequentes.

[0112] Em certos exemplos de realização, as substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade dos anticorpos de se ligarem ao antígeno. Por exemplo, podem ser feitas alterações conservadoras (por exemplo, substituições conservadoras conforme previsto na presente invenção) nas HVRs que não reduzam substancialmente a afinidade de ligação. Tais alterações podem estar fora dos “hotspots” da HVR ou SDRs. Em certos exemplos de realização das sequências VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR está inalterada, ou não possui mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

[0113] Um método útil para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser direcionados para mutagênese é denominado de “mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham, B.C., e Wells, J. A., (1989) Science, 244: 1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvos (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lis e Glu) é identificado e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para

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43/76 determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativamente ou adicionalmente, uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno pode ser analisada. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser selecionados ou eliminados como candidatos a substituição. As variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[0114]As inserções de sequências de aminoácidos incluem: fusões carbóxi- e/ou amino-terminais que variam de comprimento desde um resíduo, até polipeptídeos que possuem cem ou mais resíduos, bem como inserções intrasequenciais de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo com uma enzima (por exemplo, ADEPT) ou um polipeptídeo que aumente a meia vida do anticorpo no soro.

[0115] Uma forma variante preferida é uma variante de cisteína única, em que o resíduo de aminoácido na posição 53 de acordo com o sistema de numeração de Kabat no domínio variável da cadeia pesada é cisteína.

b) Variantes de Glicosilação [0116] Em determinadas realizações, um anticorpo previsto na invenção é alterado para aumentar ou diminuir o grau em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação em um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de

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44/76 modo que um ou mais sítios de glicosilação é criado ou removido.

[0117] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, os carboidratos ligados a estes podem ser alterados. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos geralmente compreendem um oligossacarídeo ramificado, bianternário que geralmente está ligado por uma ligação N a um Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright, A., e Morrison, S. L, TIBTECH 15 (1997) 26-32. Os oligossacarídeos podem incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo bianternário. Em alguns exemplos de realização, as modificações dos oligossacarídeos em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.

[0118] Em um exemplo de realização, são fornecidos variantes de anticorpos possuindo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose anexa (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose no dito anticorpo pode ser de 1 % a 80%, de 1 % a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada pelo cálculo do valor médio de fucose dentro da cadeia de açúcar na Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e com alto teor de manose) tal como mensurado por espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito no documento WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de aspargina localizados na posição 297 na região Fc (numeração EU dos resíduos da região Fc), no entanto, Asn297 também pode estar localizada a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a variações menores na sequência de anticorpos. Essas variantes de fucosilação

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45/76 podem ter a função ADCC melhorada. Vide, por exemplo, as publicações US 2003/0157108; US 2004/0093621. Exemplos de publicações relacionadas com variantes de anticorpos “defucosilados” ou com deficiência de fucose incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki A. et al. J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N., et al. Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Exemplos de linhagens celulares que produzem anticorpos defucosilados incluem células Led 3 CHO deficientes da fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108 e documento WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, tais como células CHO knockout para gene o alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8 (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4) (2006) 680-688; e documento W02003/085107).

[0119] Variantes de anticorpos são fornecidos adicionalmente com oligossacarídeos bi-ramificados, por exemplo, onde um oligossacarídeo bianternário anexado a região Fc do anticorpo é bi-ramificado pela GlcNAc. Tais variantes de anticorpos podem possuir fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada. Exemplos de tais variantes de anticorpos estão descritos, por exemplo, no documento WO 2003/011878; Patentes US 6.602.684 e US 2005/0123546. Também são fornecidos variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Essas variantes de anticorpos podem ter a função CDC melhorada. Tais variantes de anticorpo estão descritos, por exemplo, no documento WO 1997/30087; WO 1998/58964; e WO 1999/22764.

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c) Variantes da Região Fc [0120] Em certos exemplos de realização, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido na presente invenção, gerando assim um variante da região Fc. A região Fc variante humana pode compreender uma sequência da região Fc (por exemplo, sequência da região Fc da lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em um ou mais posições de aminoácidos.

[0121] Em um exemplo de realização, a invenção contempla um anticorpo variante que possuí alguma, mas não todas as funções efetoras, que torna este anticorpo um candidato desejável para aplicações no qual a meia vida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funções efetoras (como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Um ensaio de citotoxicidade in vitro ou in vivo pode ser conduzido para confirmar a redução / depleção dos CDC e/ou atividades ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação com o receptor Fc (FcR) podem ser realizados a fim de garantir que o anticorpo não tenha ligação ao FcyR (e portanto carece da atividade ADCC), mas mantém a capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para a mediação de ADCC, as células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas está resumida na tabela 3, página 464 de Ravetch, J. V., et ai., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse estão descritos na Patente US 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I., et al. Proc. Nat Acad. Sei. USA 83 (1986) 7059-7063) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat Acad. Sci. USA82 (1985) 1499-1502; Patente US 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et a!., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Alternativamente, podem ser

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47/76 utilizados métodos de ensaio não radioativos (vide, por exemplo, ACTI™ ensaio de citotoxicidade não radioativo por citometria de fluxo (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA, e CyTotox 96® ensaio de citotoxicidade não radioativo (Promega, Madison, Wl). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (Natural Killer ou NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como descrito em Clynes, R., et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 95 (1998) 652-656. Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar à C1q e, portanto, carece de atividade CDC. Vide, por exemplo, o ensaio ELISA de ligação C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio CDC (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro, H., et a!., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; e Cragg, M.S. e Glennie M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743). A determinação da ligação de FcRn e a depuração/meia vida in vivo também pode ser realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).

[0122] Os anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com a substituição de um ou mais dos seguintes resíduos da região Fc: 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US 6.737.056). Tais Fc mutantes incluem Fc mutantes com substituições em duas ou mais das seguintes posições de aminoácidos: 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o Fc mutante então denominado de “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 por alanina (Patente US 7.332.581).

[0123] Certos variantes de anticorpos com ligação a FCRs

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48/76 melhorada ou diminuída são descritos, (vide, por exemplo, a Patente US 6.737.056; o documento WO 2004/056312, e Shields, R. L, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

[0124] Em determinadas realizações, um variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram ainda mais a função ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).

[0125] Em alguns exemplos de realização, as alterações são feitas na região Fc, que resultam na alteração da ligação ao C1q (isto é, melhorada ou diminuída) e/ou da Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na Patente US 6.194.551, WO 99/51642, e Idusogie, E. E., et al. J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

[0126] Anticorpos com a meia-vida aumentada e ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) melhorada, que são responsáveis pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593 e Kim, J. K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), são descritos na US 2005/0014934.

[0127] Tais anticorpos compreendem uma região Fc, com uma ou mais substituições neste local que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes de Fc incluem aquelas com substituições de um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, a substituição do resíduo 434 da região Fc (Patente US 7.371.826).

[0128] Vide também Duncan, A.R., e Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5.648.260; US 5.624.821; e WO 94/29351 relativos a outros exemplos de variantes da região FC.

d) Variantes De Anticorpo Modificados Com Cisteínas

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49/76 [0129] Em determinados exemplos de realização, pode ser desejável a criação de anticorpos modificados com cisteína, por exemplo, “thioMAbs”, no qual um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em exemplos de realização específicos, os resíduos substituídos ocorrer em sítios acessíveis do anticorpo. Pela substituição de tais resíduos com cisteína, os grupos tióis reativos são assim posicionados em locais acessíveis do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras moléculas, tais como moléculas de drogas ou moléculas ligante-droga, para cirar um imunoconjugado, conforme descrito na presente invenção. Em determinadas realizações, um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração Kabat ) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada e S400 (numeração EU) da cadeia pesada da região Fc. Os anticorpos modificados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na Patente US 7.521.541.

e) Derivados de Anticorpo [0130] Em determinados exemplos de realização, um anticorpo da fornecido na presente invenção pode ser adicionalmente modificado para conter moléculas adicionais não proteináceas que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As moléculas adequadas para a derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros hidrossolúveis incluem, mas não se limitando a, polietileno-glicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, policloreto pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/maleico anidrido, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli (n-vinil pirrolidona) polietileno-glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co-polímeros de óxido de prolipropileno

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50/76 óxido de etileno, poliálcool polióis (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, e misturas dos mesmos. O propionaldeído polietilenoglicol pode ter vantagens no processo de fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros acoplados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero encontra-se acoplado, os polímeros podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros utilizado para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a ser melhorado, se o anticorpo derivado será utilizado em uma terapia sob condições definidas, etc.

[0131] Em outro exemplo de realização, são fornecidos conjugados de anticorpo e porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecida por exposição à radiação. Em um exemplo de realização, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam, N. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102 (2005) 11600-11605). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não se limita a, comprimento de ondas que não prejudicam células normais, mas que aquece a porção não proteinácea a uma temperatura no qual as células próximas ao conjugado anticorpo-porção não proteinácea são mortas.

B. Métodos e Composições Recombinantes [0132] Os anticorpos podem ser produzidos utilizando métodos e composições recombinantes, por exemplo, conforme descrito na Patente US 4.816.567. Em um exemplo de realização, é fornecido o ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-teofilina descrito na presente invenção. Tal ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos compreendendo VL e/ou a sequência de aminoácidos compreendendo VH do anticorpo (por

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51/76 exemplo, cadeias leve e/ou pesadas do anticorpo). Em um exemplo de realização adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo tal ácido nucleico é(são) fornecido(s). Em um exemplo de realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico. Em tal exemplo de realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo. Em um exemplo de realização, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, célula YO, NSO, SP20). Em um exemplo de realização, é fornecido um método de produzir um anticorpo anti-teofilina, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo, tal como estabelecido acima, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo, e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura das células hospedeiras).

[0133] Para a produção recombinante de um anticorpo antiteofilina, o ácido nucleico codificante de um anticorpo, por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem adicional e/ou para a expressão em uma célula hospedeira. O dito ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada

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52/76 e leve do anticorpo).

[0134] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores codificantes de anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas descritas na presente invenção. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, particularmente quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, as Patentes US 5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523. (Vide também Charlton, K. A., Methods in Molecular Biology, vol. 248 Lo, B.K.C. (Ed)., Humana Press, Totowa, NJ, (2003), págs 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli). Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular de bactérias em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.

[0135] Além dos procariotos, os micróbios eucariotos como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vetores codificantes de anticorpos, incluindo as cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Vide Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; e Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

[0136] Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas cepas de baculovirus que podem ser utilizadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células Spodoptera frugiperda.

[0137] Culturas de células vegetais podem também ser utilizadas

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53/76 como hospedeiros. Vide, por exemplo, as Patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIES® para produção de anticorpos em plantas transgênicas).

[0138] Células de vertebrados também podem ser utilizadas como hospedeiros. Por exemplo, a linhagem de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão pode ser útil. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são; linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7); linhagem de rim embriônico humano (293 ou células 293 conforme descrito em Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células rim de hamster neonate (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, J. P., Biol. Reprod 23 (1980) 243-252); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células humanas de carcinoma cervical (HeLa); células de rim de cão (MDCK); células do fígado de rato búfalo (BRL 3A); células pulmonares humanas (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J. P., et al, Annals NY Acad.Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem a célula de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO' - DHFR (Urlaub, G. et al, Proc Acad Nat. Sei USA 77 (1980) 4216-4220) e linhagem de células de mieloma, como NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki, P. e Wu, A. M., Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, Ed., Human Press, Totowa, NJ, 2004), págs 255-268.

C. Ensaios

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54/76 [0139] Os anticorpos anti-teofilina fornecidos na presente invenção podem ser identificados, rastreados, ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos no estado da técnica.

Ensaios de ligação e outros ensaios [0140] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado quanto à sua atividade de ligação ao antígeno, por exemplo, por métodos conhecidos, como o ELISA, Western blot, e etc.

[0141] Em outro aspecto, podem ser utilizados ensaios de competição para identificar um anticorpo que compete com os anticorpos conforme divulgado na presente invenção pela ligação à teofilina.

[0142] Em um ensaio de competição exemplar, a teofilina imobilizada é incubada com uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga à teofilina e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado quanto à sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo para se ligar à teofilina. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, a teofilina imobilizada é incubada com uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após a incubação sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo à teofilina, o excesso de anticorpo não ligado é removido, e a quantidade de marcador associada com a teofilina imobilizada é mensurada. Se a quantidade de marcador associado com a teofilina imobilizada estiver substancialmente reduzida na amostra teste em relação à amostra controle, então isso indica que o segundo anticorpo compete com o primeiro anticorpo pela ligação à teofilina. Vide Harlow, E. e Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988).

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D. IMUNOCONJUGADOS [0143] A invenção também provê imunoconjugados que compreendem um anticorpo anti-teofilina da presente invenção conjugado com um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterápicos ou fármacos, agentes inibidores do crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimaticamente ativas de origem vegetal, bacteriana, fúngica ou animal, ou fragmentos destes), ou isótopos radioativos.

[0144] Em um exemplo de realização, um imunoconjugado é um conjugado Anticorpo-Droga (ADC) no qual o anticorpo conjugado está conjugado com uma ou mais drogas incluindo, mas não se limitando a, um maitansinoide (vide as Patentes US 5.208.020, US 5.416.064, EP 0425235), uma auristatina, como porções de fármaco monometilauristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (vide US 5.635.483, US 5.780.588, US 7.498.298), uma dolastatina, uma caliqueamicina ou derivado as mesmas (vide US 5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001, US 5.877.296, Hinman, L.M. et al., Cancer Fies. 53 (1993) 33363342; e Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); uma antraciclina tal como daunomicina ou doxorubicina (vide Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343; e Patente US 6.630.579), metotrexato, vindesina, taxano, tal como o docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel, um tricoteceno e CC1065.

[0145] Em outro exemplo de realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo tal como descrito na presente invenção conjugado

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56/76 com uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento desta, incluindo, mas não se limitando a, cadeia A da toxina diftérica, fragmentos ativos não ligantes da toxina diftérica, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de rícina, cadeia A da abrina, cadeia A da modeccina, alfa-sarcina, proteínas da Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da Momordica charantia, curcina, cretina, inibidor da Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

[0146] Em outro exemplo de realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito na presente invenção conjugado a um átomo radioativo, para formar um radioconjugado. Uma série de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado for utilizado para diagnóstico, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc^99m ou I¹²³, ou um marcador de spin para formação de imagem através de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagem por ressonância magnética, MRI), tal como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

[0147] Os conjugados de um anticorpo e agentes citotóxicos podem ser feitos pela utilização de uma série de agentes de acoplamento proteicos bifuncionais, tais com propionate de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila) (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais

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57/76 como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6diisocianato de toluene) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, uma imunotoxina ricina, conforme descrito em Vitetta et a!., Science 238 (1987) 1098-1104. O ácido 1isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopenta acético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide o documento WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação de uma droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligante ácido lábil, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábel, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari, R. V., etal., Cancer Fies. 52 (1992) 127-131; patente US 5.208.020).

[0148] Os imunoconjugados ou ADCs da presente invenção contemplam expressamente, mas não se limitam limitados a, conjugados preparados com reagentes de reticulação, incluindo, mas não limitado a; BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4vinilsulfona)benzoato) que são comercialmente disponíveis (por exemplo, pela Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).

E. Métodos e Composições Para Diagnósticos e Detecção [0149] O termo “detecção”, conforme utilizado no presente abrange a detecção quantitativa ou qualitativa.

[0150] Em um exemplo de realização, é fornecido um anticorpo anti-teofilina para uso em um método de diagnóstico ou detecção. Tal método pode ser um método in vitro ou in vivo.

[0151] Em certos exemplos de realização, são fornecidos

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58/76 anticorpos anti-teofilina marcados. Os marcadores incluem, mas não estão limitados a, marcadores ou moléculas que são detectados diretamente (tais como marcadores fluorescentes, cromóforos, eletrodensos, quimioluminescentes e radioativos), bem como moléculas, tais como enzimas ou ligantes, que são detectadas indiretamente, por exemplo, por meio de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores exemplares incluem, mas não se limitam a, radioisotopes P³², S³², C¹⁴, I¹²⁵, H³, e I¹³¹, fluoróforos tais como quelatos terrosos raros ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, a luciferase do vaga-lume e luciferase bacteriana (Patente US 4.737.456), luciferina, 2,3dihidroftalazinadionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacárido-oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas como uricase e xantina-oxidase, acoplados com uma enzima que emprega o peroxide de hidrogênio para oxidar um precursor de corante, tal como a HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, teofilina/avidina, marcadores de spin, mercadores de bacteriófagos, radicais livres estáveis, e similares.

F. Formulações Farmacêuticas [0152] As formulações farmacêuticas de um anticorpo anti-teofilina conforme descrito na presente invenção são preparadas pela mistura do antagonista possuindo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis (Flemington's Pharmaceutical Sciences 16^ãedição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são em geral atóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, mas não estão limitados a: tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos;

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59/76 antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, ácool butílico ou benzilíco; alquil parabenes tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol;

3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, aspargina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (tal como, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como polietileno glicol (PEG). Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem ainda agentes de dispersão intersticial de fármacos, tais como glicoproteínas hialuronidase neutro-ativas solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 humana solúvel, como a rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de utilização, incluindo a rHuPH20, estão descritos nas Publicações de Patente US 2005/0260186 e US 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[0153] Exemplary lyophilized antibody formulations are described in US Patent No. 6,267,958. As formulações aquosas de anticorpos incluem as descritas na Patente US 6.171.586 e no documento WO 2006/044908, sendo que as formulações deste último inclui um tampão histidina-acetato.

[0154] A presente formulação também pode conter mais de um ingrediente ativo de acordo com a necessidade para a indicação específica a

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60/76 ser tratada, sendo preferenoialmente aqueles que possuem atividades complementares que atuem de maneira prejudicial entre si. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar adicionalmente [[lista de fármacos que podem ser combinados com o anticorpo anti-teofilina]]. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[0155] Os ingredientes ativos podem ser retidos (encapsulados) em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de coacervação ou por meio de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Flemington's Pharmaceutical Sciences, 16^ã Edição, Osol, A. Ed. (1980).

[0156] Podem ser fabricadas preparações de liberação controlada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham o anticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas.

[0157] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilização pode ser facilmente obtida, por exemplo, por meio da filtragem através de membranas de filtração estéreis.

G. Composições e Métodos Terapêuticos [0158] Qualquer um dos anticorpos anti-teofilina fornecidos na presente invenção podem ser usados nos métodos terapêuticos.

[0159] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-teofilina para

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61/76 uso como um medicamento. Em certos exemplos de realização, é fornecido um anticorpo anti-teofilina para uso em um método de tratamento.

[0160] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um anticorpo anti-teofilina na manufatura ou preparação de um medicamento.

[0161] Em um aspecto adicional, a invenção provê formulações farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-teofilina fornecidos na presente invenção. Em um exemplo de realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-teofilina fornecidos na presente invenção e um veículo farmaceutlcamente aceitável.

[0162] Os anticorpos da presente invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional.

[0163] Tais terapias combinadas referidas acima abrangem a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma formulação ou em formulações distintas), e a administração separada, nesse caso a administração do anticorpo da invenção, pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente terapêutico adicional e/ou adjuvante Os anticorpos da invenção também podem ser usados em combinação com a radioterapia.

[0164]Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer via apropriada, que inclui a via parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A administração pode ser feita por qualquer via de administração adequada, por exemplo, por injeções, tais como

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62/76 injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem, incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas ao longo do tempo, em vários pontos de tempo, administração em bolus, e infusão pulsada são contempladas pela presente invenção.

[0165] Os anticorpos da invenção podem ser formulados, dosados, e administrados de forma consistente com a boa prática médica. Fatores que devem ser considerados neste contexto incluem o distúrbio específico a ser tratado, a mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O anticorpo não precisa ser, mas opcionalmente é formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar os distúrbios em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme descritas acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente, ou em qualquer dosagem e por qualquer via de administração descrita que é empiricamente/ clinicamente determinada como sendo apropriada.

[0166] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da gravidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, do histórico clínico do paciente e resposta ao

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63/76 anticorpo, e o critério do médico atendente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (tal como 0,5 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo é uma possível dose candidata inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderá variar em cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo estará na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação destas) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais.

[0167]Deve ser compreendido que quaisquer formulações ou métodos terapêuticos descritos acima podem ser realizados utilizando um imunoconjugado da invenção no lugar ou além de um anticorpo antiteofilina.

III. Artigos De Manufatura [0168] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de manufatura que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou

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64/76 diagnóstico dos distúrbios descritos anteriormente. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou associado a ele. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de soluções para administração I.V. e etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição que é por si só, ou em combinação com outra composição, eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola que contém uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da presente invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de escolha. Além disso, o artigo de manufatura pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição ali contida, em que a composição compreende um anticorpo da presente invenção, e (b) um segundo recipiente com uma segunda composição ali contida, em que a segunda composição compreende um agente citotóxico adicional ou outro agente terapêutico. O artigo de manufatura neste exemplo de realização pode compreender ainda uma bula indicando que a composição pode ser usada para tratar uma condição específica. Alternativamente ou adicionalmente, o artigo de manufatura pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

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65/76 [0169] Entende-se que qualquer um dos artigos de manufatura acima pode incluir um imunoconjugado da invenção no lugar ou além do anticorpo anti-teofilina.

IV Exemplos [0170] A seguir são fornecidos exemplos de métodos e composições da presente invenção. Entende-se que diversas outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.

Exemplo 1

Isolamento e Caracterização de cDNAs que Codificam os Domínios VH e VL de um Anticorpo Anti-Teofilina Murino da Classe IgG1 com Cadeia Leve Kappa A Partir de Hibridoma de Camundongo [0171] A informação da proteína e sequência (DNA) dos domínios VH e VL do anticorpo hapteno-teofilina murino foi obtida diretamente a partir de clones de hibridoma.

[0172] As etapas experimentais realizadas posteriormente foram (I) o isolamento de RNA a partir de células de hibridoma produtoras de anticorpos, (ii) conversão deste RNA em cDNA, a transferência em fragmentos de PCR carregando VH e VL, e (ill) a integração destes fragmentos da PCR em vetores plasmidiais para a propagação em E. coli e determinação de seus DNA (e sequências proteicas deduzidas).

Preparação de RNA a partir de células de hibridoma:

[0173] O RNA foi preparado a partir de 5x10⁶ células de hibridoma expressando o anticorpo aplicando o kit RNeasy (Qiagen). Resumidamente, as células sedimentadas foram lavadas uma vez em PBS, sedimentaram e foram subsequentemente resuspensas para a lise em 500 pL de RLT-Puffer (+B-ME). As células foram completamente Usadas por passagem através de um Qiashredder (Qiagen) e, em seguida, submetidas ao procedimento de

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66/76 purificação mediada por matriz (ETOH, colunas RNeasy) conforme descrito no manual do fabricante. Após a última etapa de lavagem, o RNA foi recuperado a partir das colunas em 50 μΙ_ de água livre de RNAse. A concentração de RNA recuperado foi determinada pela quantificação a A260 e A280 de amostras diluídas 1:20. A integridade (qualidade, grau de degradação) das amostras de RNA isolado foi analisada por eletroforese de RNA em gel desnaturante em géis de agarose-formamida (vide manual de Maniatis). Bandas discretas que representam os RNAs ribossomais 18s e 28s intactos foram obtidas e a integralidade (e aprox. relação 2:1 de intensidade) dessas bandas indicou uma boa qualidade das preparações de RNA. Os RNA isolados a partir do hibridoma foram congelados e armazenados a -80 ^QC em alíquotas.

Geração de fragmentos de DNA que codificam VH e VH por RACE PCR, CLONAGEM DESTES FRAGMENTOS DE DNA EM PLASMÍDEOS E DETERMINAÇÃO DE SUAS SEQUÊNCIAS DE DNA E AMINOÁCIDOS.

[0174] O cDNA para as subsequentes reações de PCR (-RACE) foi preparado a partir das preparações de RNA por meio da aplicação de tecnologias como as descritas no pedido de patente internacional PCT/EP2011/074273. Subsequentemente, os fragmentos da PCR codificante da VH e VL foram isolados por extração em gel de agarose e subsequente purificação por meio de técnicas de biologia molecular padrão. Os fragmentos da PCR purificados gerados pela PWO (polimerase) foram inseridos no vetor pCR bluntll topo kit (Invitrogen) seguindo exatamente as instruções do fabricante. As reações de ligação -Topo foram transformadas em células de E. coli competentes TopoW-one-shot. Em seguida, os clones de E. coli que continham os vetores contendo as inserções VL ou VH foram identificados como colônias sobre placas de ágar LB-canamicina. Os plasmídeos foram

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67/76 preparados a partir destas colônias e a presença da inserção pretendida no vetor foi confirmada pela digestão com a enzima de restrição EcoRI. Uma vez que a estrutura principal do vetor contém sítios de reconhecimento da enzima de restrição EcoRI que flanqueiam cada um dos lados da inserção, plasmídeos contendo as inserções foram definidos pela presença de inserções EcoRIlibertáveis de aprox. 800 pb (para VL) ou 600 pb (para VH). A sequência de DNA e a sequência de proteína deduzida da VL e VH foram determinadas pelo sequenciamento de DNA automatizado em múltiplos clones para VH e VL.

[0175] A sequência VL murina do anticorpo anti-teofilina é representada na SEQ ID NO: 08. A sequência VH murina do anticorpo antiteofilina é representada na SEQ ID NO: 04.

Exemplo 2

Humanização dos Domínios VH e VL de Anticorpo Anti-Teofilina Murino [0176] O anticorpo de ligação à teofilina murino foi humanizado da seguinte forma: um anticorpo anti-teofilina humanizado foi gerado com base na combinação da região de arcabouço (framework) de linha germinal humana IGHV4-31-02 e IGKV2-30-01. A VH humanizada baseia-se na linhagem germinal humana IGHV4-31-02 e o elemento J humano na linhagem germinal IGHJ4-01-3. Foi introduzida uma mutação reversa na região do arcabouço (framework) 3 na posição 71 (V71R). A VL humanizada baseia-se na linhagem germinal humana IGHV2-30-01 e o elemento J humano na linhagem germinal IGKJ2-01. Foi introduzida uma mutação reversa na região do arcabouço (framework) 2 na posição 46 (R46L). A sequência de aminoácidos da VH humanizada está representada na SEQ ID NO: 12 e a sequência de aminoácidos da VL humanizada está representada na SEQ ID NO: 16.

Exemplo 3

Composição, Expressão e Purificação de Anticorpos Anti-Teofilina

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Recombinantes [0177] As regiões variáveis do anticorpo anti-teofilina murine e humanizado foram combinadas com regiões constantes de origem humana para formar anticorpos quiméricos ou humanizados mono- ou biespecíficos.

[0178] A geração de anticorpos anti-teofilina humanizados monoespecíficos e anticorpos anti-teofilina humanizados biespecíficos que se ligam especificamente à teofilina, assim como um alvo não teofilina diferente (por exemplo, receptores tirosina-quinases ou IGF-1R) necessita do (i) desenvolvimento e definição das sequências de nucleotídeos e aminoácidos para tais moléculas, (ii) a expressão destas moléculas em células de mamíferos transfectadas cultivadas, e (iii) a purificação dessas moléculas a partir dos sobrenadantes das células transfectadas. Estas etapas foram realizadas conforme descrito anteriormente na PCT/EP2011/074273.

[0179] Em geral, para gerar um anticorpo humanizado da classe IgG que tem a especificidade de ligação (original) do anticorpo anti-teofilina murine, a sequência VH humanizada foi fundida à estrutura na extremidade Nterminal da CH1-dobradiça-CH2-CH3 de uma região Fc humana da subclasse IgGi. Do mesmo modo, a sequência de VL humanizada foi fundida à estrutura na extremidade N-terminal da região constante CLkappa humana.

[0180] Para gerar derivados de anticorpos biespecíficos que contenham a especificidade de ligação à teofilina bem como especificidades para outros alvos, o anticorpo anti-teofilina, um fragmento scFv ou Fab, foi fundido à estrutura na extremidade C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anteriormente descrito. Em muitos casos, a aplicação de scFv anti-hapteno ficou ainda mais estabilizada pela da introdução de uma ligação de bissulfeto VH44-VL100, que foi previamente descrita (por exemplo, Reiter, Y., et at., Nature Biotechnology 14(1996) 1239-1245).

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Plasmídeos de expressão [0181] Os plasmídeos de expressão compreendem cassetes de expressão para a expressão das cadeias pesada e leve que forma montadas separadamente em vetores de expressão de células de mamíferos.

[0182] Deste modo, os segmentos de genes que codificam os elementos individuais foram unidos conforme descrito acima.

[0183] Informações gerais sobre as sequências de nucleotídeos das cadeias leve e pesada humana a partir das quais a utilização preferencial de códon (codon usage) pode ser deduzida são fornecidas em: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242.

[0184] A unidade de transcrição da cadeia leve-κ é composta pelos seguintes elementos:

- o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (hCMV),

- uma sequência de Kozak sintética incluindo a 5'-UT,

- uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina, incluindo o íntron da sequência sinal,

- o cDNA da cadeia leve variável clonado arranjado com um sítio de restrição único Bsm\ na extremidade 5' e um sítio doador e um sítio de restrição único A/otl na extremidade 3',

- a região constante do gene-κ humano genômico, incluindo o facilitador do íntron 2 lg-κ camundongo (Picard, D., e Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82), e

- a sequência sinal de poliadenilação (“poli-A”) da imunoglobulina k humana.

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70/76 [0185] A unidade de transcrição da cadeia pesada-γΙ é composta pelos seguintes elementos:

- uma sequência de Kozak sintética incluindo a 5'-UT,

- uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina modificada, incluindo o íntron da sequência sinal,

- o cDNA da cadeia pesada variável monoespecífica clonado ou o cDNA da fusão scFc-cadeia pesada variável biespecífica clonado e arranjado com um sítio de restrição único Bsm\ na extremidade 5' e um sítio doador e um sítio de restrição único A/otl na extremidade 3',

- a região constante do gene γΙ-pesado humano genômico, incluindo o facilitador μ da Ig de camundongo (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), e

- a sequência sinal de poliadenilação (“poli-A”) da imunoglobulina γΙ humana.

[0186] Ao lado do cassete de expressão da cadeia κ-leve ou cadeia γ1-pesada estes plasmídeos contêm:

- um gene de resistência à higromicina,

- uma origem de replicação, oriP, do vírus Epstein-Barr (EBV),

- uma origem de replicação a partir do vetor pUC18 que permite a replicação deste plasmídeo em E. colr, e

- um gene β-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli.

TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE [0187] A clonagem foi realizada usando técnicas de clonagem convencionais, conforme descrito em Sambrook et a!., 1999 (supra). Todos os

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71/76 reagentes de biologia molecular eram comercialmente disponíveis (se não for indicado de outra forma) e foram usados de acordo com as instruções do fabricante.

[0188] O DNA que contém sequências codificantes, mutações ou outros elementos genéticos foi sintetizado pela Geneart AG, Regensburg.

[0189] As sequências de DNA foram determinadas pelo sequenciamento de dupla fita realizado na SequiServe (SequiServe GmbH, Alemanha).

Análise da sequência de DNA e de proteína e gestão dos dados de sequência [0190] A suíte de programas Vector NTI Advance versão 9.0 foi usada para a criação, mapeamento, análise, anotações e ilustração das sequências.

Expressão de anticorpos anti-teofilina e derivados [0191] Os anticorpos anti-teofilina foram expressos por transfecção transitória de células 293 de rim embrionário humano (HEK293) em suspensão. Para isso, as cadeias leves e pesadas dos anticorpos mono- ou biespecíficos correspondentes foram construídas em vetores de expressão que transportam marcadores de seleção procarióticos e eucarióticos, conforme descrito acima. Estes plasmídeos foram amplificados em E. coli, purificados, e subsequentemente aplicados para transfeções transitórias. As técnicas-padrão para cultura de células foram usadas para a manipulação das células tal como descrito em “Current Protocols in Cell Biology, (2000) Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.

[0192] As células foram cultivadas em meio de expressão adequado, a 37 ^QC / 8% de CO₂. No dia da transfecção as células foram

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72/76 semeadas em meio fresco a uma densidade de 1-2 x 10⁶ células viáveis/mL. Os complexos de DNA com os reagentes de transfecção foram preparados em meio Opti-MEM I (Invitrogen, EUA) contendo 250 pg de DNA plasmidial da cadeia pesada e leve em uma razão molar 1:1 para um volume de transfecção final de 250 pl. Os sobrenadantes das culturas celulares contendo anticorpos monoespecíficos ou biespecíficos foram coletados 7 dias após a transfecção por centrifugação a 14.000 g durante 30 minutos e filtrados através de um filtro estéril (0,22 pm). Os sobrenadantes foram armazenados a -20 ^QC até a purificação.

[0193] Para determinar a concentração de anticorpos e derivados nos sobrenadantes das culturas celulares, foi aplicada a cromatografia HPLC de afinidade. Para isso, o sobrenadante da cultura de células contendo o anticorpo mono- ou biespecífico ou os seus derivados que se ligam à proteínaA foi aplicado a uma coluna Applied Biosystems Poros A/20 em uma solução compreendendo 200 mM de KH₂PO₄, 100 mM de citrato de sódio, em pH 7,4. A eluição do material cromatográfico foi realizada pela aplicação de uma solução compreendendo 200 mM de NaCI, 100 mM de ácido cítrico, em pH 2,5. Um sistema HPLC UltiMate 3000 (Dionex) foi usado. A proteína eluída foi quantificada pela absorbância UV e integração das áreas de pico. O anticorpo lgG1 purificado serviu como um padrão.

Purificação de anticorpos anti-teofilina [0194] Sete dias após a transfecção os sobrenadantes das células HEK 293 foram coletados. Os anticorpos recombinantes contidos nestes sobrenadantes foram purificados em duas fases por cromatografia de afinidade utilizando a cromatografia de afinidade com Proteína A-Sepharose™ (GE Healthcare, Suécia) e cromatografia de exclusão por tamanho Superdex200. Resumidamente, os sobrenadantes das culturas celulares clarificados contendo

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73/76 o anticorpo foram aplicados em uma coluna MabSelectSure ProteinA (5-50 mL) equilibrada com tampão PBS (10 mM de Na₂HPO₄, 1 mM de KH₂PO₄, 137 mM de NaCI e 2,7 mM de KCI, pH 7,4). As proteínas não ligadas foram lavadas com tampão de equilíbrio. Os anticorpos (ou derivados) foram eluídos com 50 mM de tampão citrato, pH 3,2. As frações contendo proteína foram neutralizadas com 0,1 ml de tampão Tris 2 M, pH 9,0. Em seguida, as frações proteicas eluídas foram reunidas, concentradas com um dispositivo tipo filtro para centrifuga Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) e carregadas em uma coluna de filtração em gel Superdex200 HiLoad 26/60 (GE Healthcare, Suécia), equilibrada com histidina 20 mM, NaCI 140 mM, pH 6,0. A concentração de proteína de anticorpos purificados e derivados destes foi mensurada pela determinação da densidade óptica (OD) a 280 nm com a OD a 320 nm como correção de fundo, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace, C.N., et al. Protein Science, 1995, 4, 2411-2423. As frações de anticorpos monoméricos foram reunidas, congeladas e armazenadas a -80 ^QC. Parte das amostras foi fornecida para a subsequente análise de proteínas e caracterização.

[0195] A homogeneidade dos anticorpos foi confirmada por SDSPAGE na presença e na ausência de um agente redutor (5 mM de 1,4ditiotreitol) e coloração com azul brilhante de Coomassie. O sistema “NuPAGE® Pre-Cast gel system” (Invitrogen, EUA) foi usado de acordo com as instruções do fabricante (4-20% de géis de Tris-Glicina).

[0196] Sob condições redutoras, as cadeias polipeptídicas relacionadas com a IgG se mostraram mediante a SDS-PAGE em tamanhos moleculares aparentes análogas aos pesos moleculares calculados. Os níveis de expressão de todas as construções foram analisados pela proteína-A. Os rendimentos médios de proteína foram entre 6 mg e 35 mg de proteína

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74/76 purificada por litro de sobrenadante da cultura de células em tais experimentos de expressão transitória não otimizados.

[0197] A Figura 1 mostra as análises de SDS-PAGE dos produtos da expressão de anticorpos quiméricos e humanizados que se ligam à teofilina. A composição e homogeneidade de anticorpos quiméricos e humanizados após purificação com proteína A e SEC demonstram presença de cadeias H e cadeias -L de anticorpos como bandas únicas, sem a presença de quantidades visíveis de proteínas contaminantes adicionais.

Exemplo 4

Detecção da Ligação Específica do Anticorpo à Teofilina [0198] Para determinar a ligação específica do anticorpo por ELISA, placas de ELISA revestidas com estreptavidina foram carregadas com teofilina biotinilada (500 ng/mL em PBS) e incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. Depois duas lavagens para remover o antígeno não ligado, os anticorpos foram adicionados em concentrações entre 50 e 3000 ng/ml (em PBS) e incubados durante 30 minutos. Depois duas lavagens, o anticorpo ligado foi detectado com um anti-huFc conjugado com Fab-HRP e substrato ABTS (com medição de absorbância a 405 nm). A Figura 2 mostra que o anticorpo quimérico, bem como o anticorpo humanizado se liga especificamente e de maneira dose-dependente à teofilina, que está imobilizada na placa de ELISA. Em contraste, um anticorpo controle que reconhece um antígeno diferente (carboidrato) (LeY) não gera sinais neste tipo de ensaio.

[0199] Para determinar a afinidade de ligação específica do anticorpo à teofilina, foi aplicada a analise por ressonância plasmônica de superfície (SPR). Os perfis de ligação dos anticorpos que se ligam à teofilina são mostrados na Figura 3. As afinidades (KD) calculadas são 20 nM e 17 nM,

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75/76 respectivamente, para a anticorpos murinos (linha superior) e anticorpos humanizados (linha inferior) (vide a tabela a seguir).

Tabela

ka	kd	KD	KD [nM]	tl/2 [min]
l,12E+05	0,00228	2,03E-08	20,3	5,1

l,31E+05	0,002214	l,70E-08	17,0	5,2

Exemplo 5

Geração de Complexos Teofilina-Anticorpo Anti-Teofilina Covalentes [0200] Para avaliar a formação de complexos de anticorpos covalentes que utilizam teofilina e anticorpos de ligação à teofilina como sistema de reconhecimento de hapteno, foi gerado a Teofilina-Cis-Cy5 como carga fluorescente, se aplicando de modo geral as tecnologias de síntese e purificação que foram descritas acima. A composição do derivado de teofilinaCis-Cy5 que foi sintetizada é mostrada na Figura 4. Para demonstrar a formação de uma ligação de bissulfeto covalente, foram gerados anticorpos de ligação à teofilina que continha Cis concebidas na posição 54 ou 55 da região variável da cadeia pesada (anticorpo-Cis anti-teofilina). A pureza destes anticorpos é mostrada exemplarmente para a variante Y54C na Figura 4b. Estes derivados de anticorpos foram complexados com teofilina-Cis-Cy5 e subsequentemente submetidos ao SDS-PAGE sob condições não redutoras e redutoras conforme descrito no Exemplo 3. Sob condições não redutoras, o anticorpo anti-teofilina ligada por bissulfeto complexado à Cy5 foi detectado pela sua cadeia H associada à fluorescência dentro do gel da mesma maneira que foi descrito no Exemplo 3. Isto está representado na Figura 4c, que demonstra que os complexos covalentes entre o anticorpo foram formados como uma consequência da reação de carregamento simples da mesma maneira como os bissulfetos que foram observados quando se utiliza Digoxigenina, Fluoresceina ou biotina como hapteno. Estes complexos se

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76/76 dissociam conforme esperado após a redução, ou seja, a carga é liberada a partir da cadeia H apenas quando a ligação de bissulfeto se torna reduzida (Figura 4c).

Exemplo 6

Anticorpo de Ligação à Teofilina se Liga ao Seu Antígeno com Afinidade Extremamente Elevada [0201] A afinidade de ligação do anticorpo à teofilina foi avaliada por experimentos de ressonância plasmônica de superfície (BIAcore) (Figura 5). Os fragmentos Fab do anticorpo foram capturados no chip por anti-huFab, seguido pela exposição a mono-teofilina contendo carga (Teo-peptídeo). Complexos 1:1 definidos (Fab:teofilina-carga) foram formados. Além de rápida ligação (on-rate), não observamos velocidades de dissociação (off-rates) detectáveis, ou seja, não há liberação relevante do antígeno ligado. Assim, o anticorpo teve uma inesperada alta afinidade de valor inferior a faixa de pM de um dígito, possivelmente menos de 1 pM (Figura 5). Uma vez que as constantes de dissociação não eram observáveis sob estas condições experimentais, os valores exatos de K_D não puderam ser determinados (Fora das Especificações = o anticorpo não tinha velocidade de dissociação (off-rate) detectável). Portanto, é possível que o anticorpo possua uma afinidade tão elevada quanto na faixa do sub-picomolar.

Claims

1. ANTICORPO ANTI-TEOFILINA, caracterizado por compreender (a) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 03; (b) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 07, e (c) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 02.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 01; (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 02, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 03.

3. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 05; (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 06, e (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 07.

4. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser um anticorpo humanizado e compreender na posição 71 do domínio variável da cadeia pesada, numerado de acordo com a numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido arginina.

5. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser um anticorpo humanizado e compreender na posição 46 do domínio variável da cadeia leve, numerado de acordo com a numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido leucina.

6. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender:

(a) uma sequência VH possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 04;

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2/3 (b) uma sequência VL possuindo pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 08; ou (c) uma sequência VH como em (a) e uma sequência VL como em (b), em que o resíduo de aminoácido na posição 71 do domínio variável de cadeia pesada, numerado de acordo com a numeração de Kabat, é arginina; e o resíduo de aminoácido na posição 46 do domínio variável de cadeia leve, numerado de acordo com a numeração de Kabat, é leucina.

7. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 04.

8. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 4 ou 7, caracterizado por compreender uma sequência VL de SEQ ID NO: 08.

9. ANTICORPO, caracterizado por compreender uma sequência VH de SEQ ID NO: 04 e uma sequência VL de SEQ ID NO: 08.

10. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por ser um anticorpo IgGi de comprimento total ou um anticorpo lgG₄ de comprimento total.

11. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal.

12. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por ser um fragmento de anticorpo que se liga à teofilina.

13. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 12, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser para uso como um medicamento.

15. USO DO ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser para a fabricação de um

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3/3 medicamento.