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BR112014007687B1 - Composiçâo farmacêutica de anticorpos para eliminação de antígenos no plasma - Google Patents

Composiçâo farmacêutica de anticorpos para eliminação de antígenos no plasma Download PDF

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BR112014007687B1
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Tomoyuki Igawa
Atsuhiko Maeda
Kenta Haraya
Yuki Iwayanagi
Tatsuhiko Tachibana
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Abstract

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO COM ABSORÇÃO INTRACELULAR AUMENTADA DE UM ANTÍGE- NO LIGADO, COM O NÚMERO DE ANTÍGENOS QUE PODE SER LIGADO POR MOLÉCULA AUMENTADO, COM FARMACOCINÉTICA APERFEIÇOADA, COM DISSOCIAÇÃO INTRACELULAR DE ANTÍGENO EXTRACELULARMENTE LIGADO AUMENTADA, COM LIBERAÇÃO EXTRACELULAR NO ESTADO NÃO LIGADO A ANTÍGENO AUMENTADA, TENDO A FUNÇÃO DE DIMINUIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE ANTÍGENO TOTAL OU DA CONCENTRAÇÃO DE ANTÍGENO LIVRE EM PLASMA, MÉTODOS PARA SUA PRODUÇÃO, BEM COMO COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO AS MESMAS. A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a antígeno contendo um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a receptor FcGama, em que as moléculas têm atividade de ligação a FcRn humano em uma condição de faixa de pH ácido, o domínio de ligação a antígeno muda a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de íon, e o domínio de ligação a receptor FcGama tem atividade de ligação mais alta ao receptor FcGama em uma condição de faixa de pH neutro do que uma região Fc de uma IgG humana nativa em que a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose.(...).

Description

Campo da Técnica
[001] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a an-tígeno com absorção intracelular aumentada de um antígeno ligado, moléculas de ligação a antígeno onde o número de antígenos que pode ser ligado por molécula única é aumentado, moléculas de ligação a antígeno com farmacocinética aperfeiçoada, moléculas de ligação a antígeno com dissociação intracelular aumentada de antígeno extrace- lularmente ligado, moléculas de ligação a antígeno com liberação ex- tracelular aumentada no estado não ligado a antígeno, moléculas de ligação a antígeno tendo a função de diminuição da concentração de antígeno total ou da concentração de antígeno livre em plasma, composições farmacêuticas compreendendo tais moléculas de ligação a antígeno e métodos para sua produção.
Técnica Anterior
[002] Anticorpos estão atraindo a atenção como agentes farmacêuticos uma vez que eles são altamente estáveis em plasma e têm poucos efeitos colaterais. Vários agentes farmacêuticos de anticorpo tipo IgG estão agora disponíveis no mercado e muitos agentes farmacêuticos de anticorpo estão atualmente sob desenvolvimento (Documentos de Não Patente 1 e 2). Entretanto, várias tecnologias aplicáveis a agentes farmacêuticos de anticorpo de segunda geração foram relatadas, incluindo aquelas que aumentam a função efetora, habilidade de ligação a antígeno, farmacocinética e estabilidade, e aquelas que reduzem o risco de imunogenicidade (Documento de Não Patente 3). Em geral, a dose requisitada de um agente farmacêutico de anticorpo é muito alta. Isso por sua vez leva a problemas tais como custo de produção alto bem como dificuldade em produzir formulações sub- cutâneas. Na teoria, a dose de um agente farmacêutico de anticorpo pode ser reduzida através do aperfeiçoamento da farmacocinética de anticorpo ou aperfeiçoamento da afinidade entre anticorpos e antíge- nos.
[003] A literatura relatou métodos para aperfeiçoamento da far-macocinética de anticorpo usando substituição artificial de aminoáci- dos em regiões constantes (Documentos de Não Patente 4 e 5). Similarmente, maturação de afinidade foi relatada como uma tecnologia para aumento da habilidade de ligação a antígeno ou atividade de neutralização de antígeno (Documento de Não Patente 6). Esta tecnologia permite aumento de atividade de ligação a antígeno através da introdução de mutações de aminoácido na CDR de uma região variável ou similar. O aumento de habilidade de ligação a antígeno permite aperfeiçoamento de atividade biológica in vitro ou redução de dosagem e ainda permite aperfeiçoamento de eficácia in vivo (Documento de Não Patente 7).
[004] A capacidade de neutralização de antígeno de uma molécula de anticorpo única depende de sua afinidade. Ao aumentar a afinidade, um antígeno pode ser neutralizado por uma quantidade menor de um anticorpo. Vários métodos podem ser usados para aumentar a afinidade do anticorpo (Documento de Não Patente 6). Ainda, se afinidade puder ser tornada infinita ligando covalentemente um anticorpo a um antígeno, uma molécula de anticorpo única poderia neutralizar uma molécula de antígeno (um anticorpo divalente pode neutralizar duas moléculas de antígeno). No entanto, a neutralização estequiométrica de um anticorpo contra um antígeno (um anticorpo divalente contra dois antígenos) é o limite de métodos preexistentes, e então é impossível neutralizar completamente um antígeno com uma quantidade de anticorpo menor do que a quantidade de antígeno. Em outras palavras, o efeito de aumento de afinidade tem um limite (Documento de Não Patente 9). Para prolongar o efeito de neutralização de um anticorpo de neutralização por um certo período, o anticorpo deve ser administrado em uma dose maior do que a quantidade de antígeno produzida no corpo durante o mesmo período. Com apenas o aperfeiçoamento de farmacocinética de anticorpo ou tecnologia de maturação de afinidade descrita acima, há então uma limitação na redução da dose de anticorpo requerida. Desta maneira, a fim de sustentar o efeito de neutralização de antígeno de um anticorpo por um período alvo com uma quantidade de anticorpo menor do que a quantidade de antí- geno, um anticorpo único deve neutralizar antígenos múltiplos. Um an-ticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente do pH foi recentemente relatado como um novo método para atingir o objetivo acima (Documento de Patente 1). Anticorpos de ligação a antígeno dependentes do pH, que se ligam fortemente a um antígeno sob condições neutras em plasma e dissociam do antígeno sob condições ácidas no endossoma, podem dissociar do antígeno no endossomo. Quando um anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH se dissocia do antígeno ele é reciclado para o plasma através de FcRn, ele pode se ligar a outro antígeno novamente. Desta maneira, um único anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH pode se ligar a vários antígenos repetidamente.
[005] Ainda, retenção no plasma de um antígeno é muito curta comparado com anticorpos reciclados via ligação de FcRn. Quando um anticorpo com tal retenção no plasma longa se liga ao antígeno, o tempo de retenção no plasma do complexo antígeno-anticorpo é prolongado para o mesmo tempo de retenção que aquele do anticorpo. Desta maneira, retenção no plasma do antígeno é prolongada por ligação ao anticorpo, e então a concentração de antígeno no plasma é aumentada.
[006] Desta maneira, anticorpos de ligação a antígeno dependen- te do pH têm efeitos que poderiam não ser obtidos por anticorpos normais, uma vez que eles podem promover eliminação de antígenos a partir do plasma comparado com anticorpos normais, através de ligação de um anticorpo único a uma pluralidade de antígenos. No entanto, métodos de engenharia de anticorpo para aperfeiçoamento dos efeitos de anticorpos de ligação a antígeno dependente do pH que podem se ligar repetidamente a antígenos e que promovem eliminação de antígenos do plasma não foram relatados até agora.
[007] Anticorpos IgG têm longa retentividade em plasma devido à sua ligação a FcRn. Ligação entre IgG e FcRn é observada apenas sob condições ácidas (pH 6,0) e a ligação é dificilmente observada sob condições neutras (pH 7,4). Anticorpos IgG são absorvidos em células não especificamente, mas quando da ligação a FcRn no endossomo sob uma condição intraendossômica ácida, eles retornam para a superfície da célula, e dissociam de FcRn sob condições neutras em plasma. Quando mutações são introduzidas em uma região Fc de IgG de maneira que ligação a FcRn em uma condição de faixa de pH ácido é perdida, reciclagem do anticorpo a partir do endossomo para plasma não acontece e retentividade no plasma dos anticorpos é significante- mente prejudicada. Um método para aperfeiçoamento de ligação a FcRn em uma condição de faixa de pH ácido foi relatado como um método para aperfeiçoamento da retentividade no plasma de um anticorpo IgG. Aperfeiçoamento de ligação a FcRn em uma condição de faixa de pH ácido através da introdução de substituições de aminoácido em uma região Fc de anticorpo IgG leva à eficiência aumentada de reciclagem de anticorpo a partir do endossomo para o plasma e, como resultado, retentividade no plasma é aperfeiçoada.
[008] Muitos estudos foram realizados até agora sobre citotoxidez celular dependente de anticorpo (daqui em diante mencionada como ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)) e citotoxidez de- pendente de complemento (daqui em diante mencionada como CDC (Complement-Dependent Cytotoxicity)), que são funções efetoras de anticorpos classe IgG. Foi relatado que na classe IgG humana, anticorpos da subclasse IgG1 têm as mais altas atividade de ADCC e atividade de CDC (Documento Não Patente 13). Ainda, fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) (Antibody-Dependent Cell-Mediated Phagocytosis), que é fagocitose de células alvo mediada por anticorpos classe IgG, é também sugerida ser uma das funções efetoras do anticorpo (Documentos de Não Patente 14 e 15). Uma vez que anticorpos subclasse IgG1 podem exercer essas funções efetoras contra tumores, anticorpos subclasse IgG1 são usados para a maioria dos agentes farmacêuticos de anticorpo contra antígenos de câncer.
[009] A fim de que os anticorpos IgG façam a mediação de atividades de ADCC e ADCP, a região Fc dos anticorpos IgG deve se ligar a receptores de anticorpo (daqui em diante chamados FCY ou FCYR) que estão presentes na superfície das células efetoras tais como células assassinas, células assassinas naturais e macrófagos ativados. Em humanos, as isoformas FcYRIa, FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa e FcYRIIIb foram relatadas como membros da família de proteína receptor FCYR e seus respectivos alótipos foram também relatados (Documento de Não Patente 16).
[010] Aumento de funções efetoras citotóxicas tais como ADC e ADCP tem chamado atenção como um meio promissor para aumento dos efeitos antitumor de anticorpos anticâncer. Importância de funções efetoras mediadas por receptor Fcy tendo como alvo efeitos antitumor de anticorpos foi relatada usando modelos de camundongo (Documentos de Não Patente 17 e 18). Ainda, foi observado que efeitos clínicos em humanos se relacionavam com o alótipo polimórfico de alta afinidade (V158) e o alótipo polimórfico de baixa afinidade (F158) de FcyRIIIa (Documento de Não Patente 19). Esses relatórios sugerem que anticorpos com uma região Fc otimizada para ligação a receptor FcY específico faz a mediação mais forte de funções efetoras, e desta maneira exercem efeitos antitumor mais eficazes. O equilibro entre afinidade de anticorpos contra os receptores de ativação incluindo FcYRIa, FcYRIIa, FcYRIIIa e FcYRIIIb e os receptores inibidores incluindo FcYRIIb é um fator importante na otimização de funções efetoras de anticorpo. Aumento da afinidade com receptores de ativação pode fornecer a anticorpos uma propriedade de mediar funções efetoras mais fortes (Documento de Não Patente 20) e desta maneira foi relatado em vários relatórios até agora como uma técnica de engenharia de anticorpo para aperfeiçoamento ou aumento da atividade antitumor dos agentes farmacêuticos de anticorpo contra antígenos de câncer.
[011] Com relação à ligação entre a região Fc e receptor FCY, vários resíduos de aminoácido na região de dobra de anticorpo e no domínio CH2, e uma cadeia de açúcar adicionada a Asn na posição 297 (numeração EU) ligada ao domínio CH2 foram mostrados como sendo importantes (Documentos de Não patente 13, 21 e 22). Focando neste sítio de ligação, até agora foram realizados estudos em mutantes da região Fc tendo várias propriedades de ligação a FCY, e mutantes da região Fc com afinidade maior com receptor FCY de ativação foram obtidos (Documentos de Patente 2 e 3). Por exemplo, Lazar e outros obtiveram sucesso no aumento da ligação de IgG1 humana a FcyRIIIa humano (V158) em aproximadamente 370 vezes através da substituição de Ser na posição 239, Ala na posição 330 e Ile na posição 332 (numeração EU) de IgG1 humana com Asn, Leu e Glu, respectivamente (Documento de Não Patente 19 e Documento de Patente 2). A razão de ligação a FcyRIIIa e FcyRIIb (razão A/I) para este mutante foi aproximadamente 9 vezes aquela do tipo selvagem. Ainda, Shinkawa e outros obtiveram sucesso no aumento da ligação a FcyRIIIa até aproximadamente 100 vezes através da remoção de fucose da cadeia de açúcar adicionada a Asn na posição 297 (numeração EU) (Documento de Não Patente 24). Esses métodos podem melhorar muito a atividade de ADCC de IgG1 humana comparado com aquela de IgG1 humana de ocorrência natural.
[012] Desta maneira, uma vez que a atividade de ligação a receptor FCY desempenha um papel importante em atividade citotóxica em anticorpos se direcionado a antígenos do tipo membrana, um isotipo de IgG1 humana com atividade de ligação a FCYR alta é usado quando atividade citotóxica é necessária. Aperfeiçoamento de atividade citotó- xica através do aumento da atividade de ligação a receptor FCY é também uma técnica amplamente usada. Por outro lado, o papel desempenhado pela atividade de ligação a receptor Fcy em anticorpos se direcionando a antígenos solúveis não é conhecido, e foi pensado que não há nenhuma diferença entre IgG1 humana com atividade de ligação a receptor Fcy alta e IgG2 humana e IgG4 humana com atividade de ligação a FcyR baixa. Desta maneira, até agora, aumento da atividade de ligação a receptor Fcy não foi tentada para anticorpos se direcionando a antígenos solúveis, e seus efeitos não foram relatados.
Documentos da técnica anterior Documentos de Patente
[013] Documento de Patente 1 WO 2009/125825
[014] Documento de Patente 2 WO 2000/042072
[015] Documento de Patente 3 WO 2006/019447
[016] Documentos de Não Patente
[017] Documento de Não Patente 1 Janice, M. Reichert, Clark, J. Rosensweig, Laura, B. Faden & Matthew, C. Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic. Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078
[018] Documento de Não Patente 2 Pavlou, A.K,, Belsey, M.J.,The therapeutic antibodies market to 2008., Eur, J, Pharm, Biopharm. (2005); 59(3), 389-396
[019] Documento de Não Patente 3 Kim, S.J., Park, Y., Hong, H.J., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol. Cells. (2005) 20(1), 17-29.
[020] Documento de Não Patente 4 Hinton, P.R., Xiong, J.M., Johlfs, M.G., Tang, M.T., Keller, S., Tsurushita, N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J. Immunol. (2006) 176(1), 346-356
[021] Documento de Não Patente 5 Ghetie, V., Popov, S., Bor- vak, J., Radu, C., Matesoi, D., Medesan, C., Ober, R.J., Ward, E.S., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random muta-genesis., Nat. Biotechnol. (1997) 15(7) 637-640
[022] Documento de Não Patente 6 Rajpal, A., Beyaz, N., Haber, L., Cappuccilli, G., Yee, H., Bhatt, R.R., Takeuchi, T., Lerner, R.A., Crea, R. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2005) 102 (24), 8466-8471
[023] Documento de Não Patente 7 Wu, H., Pfarr, D.S., Johnson, S., Brewah, Y.A., Woods, R.M., Patel, N.K., White, W.I., Young, J.F., Kiener, P.A. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J. Mol. Biol. (2007) 368: 652-665
[024] Documento de Não Patente 8 Hanson, C.V., Nishiyama, Y., Paul S. Catalytic antibodies and their applications. Curr Opin Bio- technol. (2005) 16(6), 631-636
[025] Documento de Não Patente 9 Rathanaswami, P., Roalstad, S., Roskos, L., Su, Q.J., Lackie, S., Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Commun. (2005) 334 (4), 10041013
[026] Documento de Não Patente 10 Dall’Acqua, W.F.; Woods, R.M., Ward, E.S., Palaszynski, S.R., Patel, N.K., Brewah, Y.A., Wu, H., Kiener, P.A., Langermann, S. Increasing the affinity of a human IgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences, J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180
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[028] Documento de Não Patente 12 Datta-Mannan, A., Witcher, D.R., Tang Y, Watkins, J., Wroblewski, V.J. Monoclonal antibody clearance. Impact of modulating the interaction of IgG with the neonatal Fc receptor. J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717
[029] Documento de Não Patente 13 Clark, M., Antibody Engine ering IgG Effector Mechanisms, Chemical Immunology (1997) 65, 88110
[030] Documento de Não Patente 14 Horton, H.M., Bernett, M.J., Pong, E., Peipp, M., Karki, S., Chu, S.Y., Richards, J.O., Vostiar, I., Joyce, P.F., Repp, R., Desjarlais, J.R., Zhukovsky, E.A., Potent In vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19 monoclonal antibody against lymphoma and leukemia, Cancer Res. (2008) 68, 8049-8057
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[034] Documento de Não Patente 18 Clynes, R.A., Towers, T.L., Presta, L.G., Ravetech, J.V., Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytotoxicity against tumor targets. Nat. Med. (2000) 6, 443-446
[035] Documento de Não Patente 19 Cartron, G., Dacheux, L., Salles, G., Solal-Celigny, P., Bardos, P., Colombat, P., Watier, H. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood (2002) 99, 754-758
[036] Documento de Não Patente 20 Nimmerjahn, F., Ravetch, J.V., Divergent immunoglobulin g subclasse activity through selective Fc receptor binding. Science (2005) 310, 1510-1512
[037] Documento de Não Patente 21 Greenwood, J., Clark, M., Waldmann, H.. Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions. Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104
[038] Documento de Não Patente 22 Morgan, A., Jones, N.D., Nesbitt, A.M., Chaplin, L., Bodmer, M.W., Emtage J.S. The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, Fc gamma RI and Fc gamma RIII binding. Immunology (1995) 86, 319-324
[039] Documento de Não Patente 23 Lazar, G.A., Dang, W., Kar-ki, S., Vafa, O., Peng, J.S., Hyun, L., Chan, C., Chung, H.S., Eivazi, A., Yoder, S.C., Vielmetter, J., Carmichael, D.F., Hayes, R.J., Dahiyat, B.I. Engineered antidoby Fc variants with enhanced effector function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 4005-4010
[040] Documento de Não Patente 24 Shinkawa, T., Nakamura, K., Yamane, N., Shoji-Hosaka, E., Kanda, Y., Sakurada, M., Uchida, K., Anazawa, H., Satoh, M., Yamasaki, M., Hanai, N., Shitara, K. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N- acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity, J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473
Sumário da Invenção Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção
[041] A presente invenção foi obtida em vista das circunstâncias acima. Um objetivo da presente invenção é prover moléculas de ligação a antígeno com absorção intracelular aumentada de um antígeno ligado, moléculas de ligação a antígeno onde o número de antígenos que pode ser ligado por molécula única é aumentado, moléculas de ligação a antígeno com farmacocinética aperfeiçoada, moléculas de ligação a antígeno com dissociação intracelular aumentada de antíge- no extracelularmente ligado, moléculas de ligação a antígeno com liberação extracelular aumentada no estado não ligado de antígeno, moléculas de ligação a antígeno tendo a função de diminuição da concentração de antígeno total ou da concentração de antígeno livre em plasma, composições farmacêuticas compreendendo tais moléculas de ligação a antígeno e métodos para sua produção.
Meios para Resolver os Problemas
[042] Como um resultado de condução de pesquisa dedicada para atingir os objetivos mencionados acima, os presentes inventores criaram uma molécula de ligação a antígeno contendo um domínio de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn humano em uma condição de faixa de pH ácido e onde a atividade de ligação a antíge- no de uma molécula de ligação a antígeno muda dependendo da concentração de íon, e um domínio de ligação a receptor FCY tendo uma atividade de ligação maior ao receptor FCY em uma condição de faixa de pH neutro do que o domínio de ligação ao receptor FCY de uma região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada à posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose. Ainda, os presente inventores desenvolveram um método para aumento da absorção intracelular de antígenos ligados, um método para aumento do número de antígenos que podem se ligar a uma molécula de ligação a antígeno única, um método para aperfeiçoamento da farmacocinética de uma molécula de ligação a antígeno, um método para promoção de dissociação intracelular de um antígeno, que é extracelularmente ligado à molécula de ligação a antígeno, de uma molécula de ligação a antígeno, um método para promoção de liberação extracelular da molécula de ligação a antígeno não ligada a um antígeno e um método para diminuição da concentração de antígeno total ou concentração de antígeno livre em plasma, onde os métodos compreendem contato da molécula de ligação a antígeno com uma célula expressando receptor FCY in vivo ou in vitro. Ainda, os inventores desenvolveram métodos para produção de moléculas de ligação a antígeno tendo as propriedades mencionadas acima e também constataram a utilidade de composições farmacêuticas contendo, como um ingrediente ativo, tal molécula de ligação a antígeno ou uma molécula de ligação a antígeno produzida através do método de produção da presente invenção, e desta maneira terminaram a presente invenção.
[043] Isto é, mais especificamente, a presente invenção provê 1 a 46 abaixo:
[044] Uma composição farmacêutica que compreende uma molé cula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação de receptor Fcy, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano em uma condição de faixa de pH ácido, e onde o domínio de ligação a antígeno tem atividade de ligação a antígeno que muda dependendo de uma condição de concentração de íon, e o domínio de ligação de receptor Fcy tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy em uma condição de faixa de pH neutro do que uma região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[045] A composição farmacêutica de 1, onde o antígeno é um an- tígeno solúvel.
[046] A composição farmacêutica de 1 ou 2, onde a concentração de íon é concentração de íon de cálcio.
[047] A composição farmacêutica de 3, onde o domínio de liga ção a antígeno é um domínio de ligação a antígeno onde atividade de ligação ao antígeno sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta é maior do que aquela sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa.
[048] A composição farmacêutica de 1 ou 2, onde a condição de concentração de íon é uma condição de pH.
[049] A composição farmacêutica de 5, onde o domínio de liga ção a antígeno é um domínio de ligação a antígeno onde a atividade de ligação ao antígeno em uma condição de faixa de pH neutro é maior do que aquela em uma condição de faixa de pH ácido.
[050] A composição farmacêutica de qualquer um de 1 a 6, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de neutralização contra o antígeno.
[051] A composição farmacêutica de qualquer um de 1 a 7, onde o domínio de ligação ao receptor FCY compreende uma região Fc de anticorpo.
[052] A composição farmacêutica de 8, onde a região Fc é uma região Fc onde pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU são diferentes de aminoácidos em sítios correspondentes em uma região Fc nativa.
[053] A composição farmacêutica de 9, onde a região Fc é uma região Fc que compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
[054] ou Lys ou Tyr na posição de aminoácido 221;
[055] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá-cido 222;
[056] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Lys na posição de aminoá- cido 223;
[057] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá- cido 224;
[058] qualquer um de Glu, Lys e Trp na posição de aminoácido 225;
[059] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá- cido 227;
[060] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá- cido 228;
[061] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Tyr na posição de aminoá-cido 230;
[062] qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami-noácido 231;
[063] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá-cido 232;
[064] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 233;
[065] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 234;
[066] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 235;
[067] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 236;
[068] qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 237;
[069] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 238;
[070] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 239;
[071] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 240;
[072] qualquer um de Asp, Glu, Leu, Arg, Trp e Tyr na posição de aminoácido 241;
[073] qualquer um de Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp e Tyr na posi ção de aminoácido 243;
[074] His na posição de aminoácido 244;
[075] Ala na posição de aminoácido 245;
[076] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 246;
[077] qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 247;
[078] qualquer um de Glu, His, Gln e Tyr na posição de aminoá- cido 249;
[079] ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 250;
[080] Phe na posição de aminoácido 251;
[081] qualquer um de Phe, Met e Tyr na posição de aminoácido 254;
[082] qualquer um de Glu, Leu e Tyr na posição de aminoácido 255;
[083] qualquer um de Ala, Met e Pro na posição de aminoácido 256;
[084] qualquer um de Asp, Glu, His, Ser e Tyr na posição de ami-noácido 258;
[085] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá-cido 260;
[086] qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile e Thr na posição de ami-noácido 262;
[087] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci-do 263;
[088] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 264;
[089] qualquer um de Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp e Tyr na posição de aminoá- cido 265;
[090] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 266;
[091] qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 267;
[092] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 268;
[093] qualquer um e Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 269;
[094] qualquer um de Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 270;
[095] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 271;
[096] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 272;
[097] ou Phe ou Ile na posição de aminoácido 273;
[098] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 274;
[099] ou Leu ou Trp na posição de aminoácido 275;
[0100] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 276;
[0101] qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 278;
[0102] Ala na posição de aminoácido 279;
[0103] qualquer um de Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 280;
[0104] qualquer um de Asp, Lys, Pro e Tyr na posição de aminoá-cido 281;
[0105] qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami-noácido 282;
[0106] qualquer um de Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg e Tyr na posição de aminoácido 283;
[0107] qualquer um de Asp, Glu, Leu, Asn, Thr e Tyr na posição de aminoácido 284;
[0108] qualquer um de Asp, Glu, Lys, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 285;
[0109] qualquer um de Glu, Gly, Pro e Tyr na posição de aminoá-cido 286;
[0110] qualquer um de Asn, Asp, Glu e Tyr na posição de aminoá- cido 288;
[0111] qualquer um de Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 290;
[0112] qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln e Thr na posição de aminoácido 291;
[0113] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Pro, Thr e Tyr na posição de aminoácido 292;
[0114] qualquer um de Phe, Gly, His, Ile Leu, Met, Asn, Pro, Arg,Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 293;
[0115] qualquer um de Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro,Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 294;
[0116] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 295;
[0117] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr e Val na posição de aminoácido 296;
[0118] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 297;
[0119] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 298;
[0120] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 299;
[0121] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 300;
[0122] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 301;
[0123] Ile na posição de aminoácido 302;
[0124] qualquer um de Asp, Gly e Tyr na posição de aminoácido 303;
[0125] qualquer um de Asp, His, Leu, Asn e Thr na posição de aminoácido 304;
[0126] qualquer um de Glu, Ile, Thr e Tyr na posição de aminoáci-do 305;
[0127] qualquer um de Ala, Asp, Asn, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 311;
[0128] Phe na posição de aminoácido 313;
[0129] Leu na posição de aminoácido 315;
[0130] ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 317;
[0131] qualquer um de His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 318;
[0132] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser,Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 320;
[0133] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Thr e Tyr na posição de aminoácido 322;
[0134] Ile na posição de aminoácido 323;
[0135] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 324;
[0136] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 325;
[0137] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro,Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 326;
[0138] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 327;
[0139] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 328;
[0140] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 329;
[0141] qualquer um de Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 330;
[0142] qualquer um de Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 331;
[0143] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 332;
[0144] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 333;
[0145] qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro e Thr na posi ção de aminoácido 334;
[0146] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro,Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 335;
[0147] qualquer um de Glu, Lys e Tyr na posição de aminoácido 336;
[0148] qualquer um de Glu, His e Asn na posição de aminoácido 337;
[0149] qualquer um de Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser e Thr na posição de aminoácido 339;
[0150] ou Ala ou Val na posição de aminoácido 376;
[0151] ou Gly ou Lys na posição de aminoácido 377;
[0152] Asp na posição de aminoácido 378;
[0153] Asn na posição de aminoácido 379;
[0154] qualquer um de Ala, Asn e Ser na posição de aminoácido 380;
[0155] ou Ala ou Ile na posição de aminoácido 382;
[0156] Glu na posição de aminoácido 385;
[0157] Thr na posição de aminoácido 392;
[0158] Leu na posição de aminoácido 396;
[0159] Lys na posição de aminoácido 421;
[0160] Asn na posição de aminoácido 427;
[0161] ou Phe ou Leu na posição de aminoácido 428;
[0162] Met na posição de aminoácido 429;
[0163] Trp na posição de aminoácido 434;
[0164] Ile na posição de aminoácido 436; e
[0165] qualquer um de Gly, His, Ile, Leu e Tyr na posição de ami-noácido 440;
[0166] no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU.
[0167] A composição farmacêutica de qualquer um de 1 a 10, onde a região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose, é uma região Fc de qualquer uma de IgG1 humana nativa, IgG2 humana nativa, IgG3 humana nativa e IgG4 humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[0168] A composição farmacêutica de qualquer um de 1 a 11, onde o receptor FCY humano é FcYRIa, FcyRIIa(R), FcyRIIa(H), FcyRIIb, FcYRIIIa(V) ou FcyRIIIa(F).
[0169] A composição farmacêutica de qualquer um de 1 a 11, onde o receptor Fcy humano é FcyRIIb.
[0170] A composição farmacêutica de qualquer um de 8 a 13, onde a região Fc é uma região Fc que compreende pelo menos um ou mais de
[0171] Asp na posição de aminoácido 238, e
[0172] Glu na posição de aminoácido 328
[0173] no sítio de região Fc de acordo com a numeração EU.
[0174] Um método compreendendo a etapa de contato de uma molécula de ligação a antígeno com uma célula expressando receptor Fcy in vivo ou ex vivo, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano em uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon e um domínio de ligação a receptor FCY que tem atividade de ligação maior com o receptor FCY em uma condição de faixa de pH neutro comparado com uma região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose, o qual é um método de qualquer um de:
[0175] um método para aumento do número de antígenos que pode se ligar a uma molécula de ligação a antígeno única;
[0176] um método para eliminação de antígenos do plasma;
[0177] um método para aperfeiçoamento da farmacocinética da molécula de ligação a antígeno;
[0178] um método para promoção de dissociação intracelular de um antígeno de uma molécula de ligação a antígeno, onde o antígeno foi extracelularmente ligado à molécula de ligação a antígeno;
[0179] um método para promoção de liberação extracelular de uma molécula de ligação a antígeno não ligada a um antígeno; e
[0180] um método para diminuição da concentração de antigen total ou concentração de antígeno livre em plasma.
[0181] O método de 15, onde o antígeno é um antígeno solúvel.
[0182] O método de 15 ou 16, onde a concentração de íon é concentração de íon de cálcio.
[0183] O método de 17, onde o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno onde atividade de ligação ao antí- geno sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta é maior do que aquela sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa.
[0184] O método de 15 ou 16, onde a condição de concentração de íon é uma condição de pH.
[0185] O método de 19, onde o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno onde a atividade de ligação ao antí- geno em uma condição de faixa de pH neutro é maior do que aquela em uma condição de faixa de pH ácido.
[0186] O método de qualquer um de 15 a 20, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de neutralização contra o antígeno.
[0187] O método de qualquer um de 15 a 21, onde o domínio de ligação a receptor FCY compreende uma região Fc de anticorpo.
[0188] O método de 22, onde a região Fc é uma região Fc onde pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo nos aminoácidos nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 247, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 261, 263, 264, 265, 266, 267, 68, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU são diferentes dos aminoácidos nos sítios correspondentes na região Fc nativa.
[0189] O método de 23, onde a região Fc é uma região Fc que compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
[0190] ou Lys ou Tyr na posição de aminoácido 221;
[0191] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá-cido 222;
[0192] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Lys na posição de aminoá-cido 223;
[0193] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá-cido 224;
[0194] qualquer um de Glu, Lys e Trp na posição de aminoácido 225;
[0195] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá-cido 227;
[0196] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá- cido 228;
[0197] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Tyr na posição de aminoá-cido 230;
[0198] qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami-noácido 231;
[0199] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá-cido 232;
[0200] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 233;
[0201] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 234;
[0202] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 235;
[0203] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 236;
[0204] qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 237;
[0205] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 238;
[0206] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 239;
[0207] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 240;
[0208] qualquer um de Asp, Glu, Leu, Arg, Trp e Tyr na posição de aminoácido 241;
[0209] qualquer um de Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp e Tyr na posição de aminoácido 243;
[0210] His na posição de aminoácido 244;
[0211] Ala na posição de aminoácido 245;
[0212] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá-cido 246;
[0213] qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 247;
[0214] qualquer um de Glu, His, Gln e Tyr na posição de aminoá-cido 249;
[0215] ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 250;
[0216] Phe na posição de aminoácido 251;
[0217] qualquer um de Phe, Met e Tyr na posição de aminoácido 254;
[0218] qualquer um de Glu, Leu e Tyr na posição de aminoácido 255;
[0219] qualquer um de Ala, Met e Pro na posição de aminoácido 256;
[0220] qualquer um de Asp, Glu, His, Ser e Tyr na posição de ami-noácido 258;
[0221] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá-cido 260;
[0222] qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile e Thr na posição de ami-noácido 262;
[0223] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci-do 263;
[0224] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 264;
[0225] qualquer um de Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp e Tyr na posição de aminoá- cido 265;
[0226] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci-do 266;
[0227] qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 267;
[0228] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro,Gln, Arg, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 268;
[0229] qualquer um e Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro,Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 269;
[0230] qualquer um de Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln,Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 270;
[0231] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu,Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 271;
[0232] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro,Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 272;
[0233] ou Phe ou Ile na posição de aminoácido 273;
[0234] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn,Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 274;
[0235] ou Leu ou Trp na posição de aminoácido 275;
[0236] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro,Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 276;
[0237] qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 278;
[0238] Ala na posição de aminoácido 279;
[0239] qualquer um de Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 280;
[0240] qualquer um de Asp, Lys, Pro e Tyr na posição de aminoá-cido 281;
[0241] qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami-noácido 282;
[0242] qualquer um de Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg e Tyr na posição de aminoácido 283;
[0243] qualquer um de Asp, Glu, Leu, Asn, Thr e Tyr na posição de aminoácido 284;
[0244] qualquer um de Asp, Glu, Lys, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 285;
[0245] qualquer um de Glu, Gly, Pro e Tyr na posição de aminoá-cido 286;
[0246] qualquer um de Asn, Asp, Glu e Tyr na posição de aminoá-cido 288;
[0247] qualquer um de Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 290;
[0248] qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln e Thr na posição de aminoácido 291;
[0249] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Pro, Thr e Tyr na posição de aminoácido 292;
[0250] qualquer um de Phe, Gly, His, Ile Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 293;
[0251] qualquer um de Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 294;
[0252] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 295;
[0253] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr e Val na posição de aminoácido 296;
[0254] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 297;
[0255] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 298;
[0256] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 299;
[0257] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 300;
[0258] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 301;
[0259] Ile na posição de aminoácido 302;
[0260] qualquer um de Asp, Gly e Tyr na posição de aminoácido 303;
[0261] qualquer um de Asp, His, Leu, Asn e Thr na posição de aminoácido 304;
[0262] qualquer um de Glu, Ile, Thr e Tyr na posição de aminoáci-do 305;
[0263] qualquer um de Ala, Asp, Asn, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 311;
[0264] Phe na posição de aminoácido 313;
[0265] Leu na posição de aminoácido 315;
[0266] ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 317;
[0267] qualquer um de His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 318;
[0268] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser,Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 320;
[0269] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr,Val, Thr e Tyr na posição de aminoácido 322;
[0270] Ile na posição de aminoácido 323;
[0271] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg,Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 324;
[0272] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu,Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 325;
[0273] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro,Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 326;
[0274] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu,Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 327;
[0275] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 328;
[0276] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 329;
[0277] qualquer um de Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 330;
[0278] qualquer um de Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr,Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 331;
[0279] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 332;
[0280] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met,Pro, Ser, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 333;
[0281] qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro e Thr na posição de aminoácido 334;
[0282] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro,Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 335;
[0283] qualquer um de Glu, Lys e Tyr na posição de aminoácido 336;
[0284] qualquer um de Glu, His e Asn na posição de aminoácido 337;
[0285] qualquer um de Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg,Ser e Thr na posição de aminoácido 339;
[0286] ou Ala ou Val na posição de aminoácido 376;
[0287] ou Gly ou Lys na posição de aminoácido 377;
[0288] Asp na posição de aminoácido 378;
[0289] Asn na posição de aminoácido 379;
[0290] qualquer um de Ala, Asn e Ser na posição de aminoácido 380;
[0291] ou Ala ou Ile na posição de aminoácido 382;
[0292] Glu na posição de aminoácido 385;
[0293] Thr na posição de aminoácido 392;
[0294] Leu na posição de aminoácido 396;
[0295] Lys na posição de aminoácido 421;
[0296] Asn na posição de aminoácido 427;
[0297] ou Phe ou Leu na posição de aminoácido 428;
[0298] Met na posição de aminoácido 429;
[0299] Trp na posição de aminoácido 434;
[0300] Ile na posição de aminoácido 436; e
[0301] qualquer um de Gly, His, Ile, Leu e Tyr na posição de aminoácido 440;
[0302] no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU.
[0303] O método de qualquer um de 15 a 24, onde a região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose, é uma região Fc de qualquer uma de IgG1 humana nativa, IgG2 humana nativa, IgG3 humana nativa e IgG4 humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[0304] O método de qualquer um de 15 a 25, onde o receptor Fcγ humano é FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) ou FcγRIIIa(F).
[0305] O método de qualquer um de 15 a 25, onde o receptor FCY humano é FcYRIIb.
[0306] O método de qualquer um de 22 a 27, onde a região Fc é uma região Fc que compreende pelo menos um ou mais de
[0307] Asp na posição de aminoácido 238, e
[0308] Glu na posição de aminoácido 328
[0309] no sítio de região Fc de acordo com a numeração EU.
[0310] Um método compreendendo a etapa de aumento da atividade de ligação a receptor Fcy em uma condição de faixa de pH neutro do domínio de ligação a receptor Fcy em uma molécula de ligação a antígeno comparado com aquela de uma região Fc de IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano em uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a receptor Fcy e um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno muda dependendo a condição de concentração de íon, o qual é um método de qualquer um de:
[0311] um método para alteração de uma molécula de ligação a antígeno, onde a absorção intracelular do antígeno ao qual ela se liga é aumentada;
[0312] um método para aumento do número de antígenos que podem se ligar a uma única molécula de molécula de ligação a antíge- no;
[0313] um método para aumento da habilidade de uma molécula de ligação a antígeno em eliminar antígenos do plasma;
[0314] um método para aperfeiçoamento da farmacocinética de molécula de ligação a antígeno; um método para promoção de dissociação intracelular de um antígeno a partir de uma molécula de ligação a antígeno, onde o antígeno foi extracelularmente ligado à molécula de ligação a antígeno;
[0315] um método para promoção de liberação extracelular de uma molécula de ligação a antígeno não ligada a um antígeno, onde a molécula de ligação a antígeno tinha sido absorvida em uma célula em uma forma ligada a antígeno; e
[0316] um método para alteração de uma molécula de ligação a antígeno, o qual pode diminuir uma concentração de antígeno total ou concentração de antígeno livre em plasma.
[0317] O método de 29, onde o antígeno é um antígeno solúvel.
[0318] O método de 29 ou 30, onde a concentração de íon é uma concentração de íon de cálcio.
[0319] O método de 31, onde o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno onde atividade de ligação ao antí- geno sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta é maior do que aquela sob condições de concentração de íon de cálcio baixa.
[0320] O método de 29 ou 30, onde a condição de concentração de íon é uma condição de pH.
[0321] O método de 33, onde o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno onde a atividade de ligação ao antí- geno em uma condição de faixa de pH neutro é maior do que aquela em uma condição de faixa de pH ácido.
[0322] O método de qualquer um de 29 a 34, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de neutralização contra o antígeno.
[0323] O método de qualquer um de 29 a 35, onde o domínio de ligação a receptor FCY compreende uma região Fc de anticorpo.
[0324] O método de 36, em que a região Fc é uma região Fc em que pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo con-sistindo nos aminoácidos nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU são diferentes de aminoácidos em sítios correspondentes em uma região Fc nativa.
[0325] O método de 33, onde a região Fc é uma região Fc com preendendo pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
[0326] ou Lys ou Tyr na posição de aminoácido 221;
[0327] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá- cido 222;
[0328] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Lys na posição de aminoá- cido 223;
[0329] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá- cido 224;
[0330] qualquer um de Glu, Lys e Trp na posição de aminoácido 225;
[0331] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá- cido 227;
[0332] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá- cido 228;
[0333] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Tyr na posição de aminoá- cido 230;
[0334] qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami-noácido 231;
[0335] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá-cido 232;
[0336] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 233;
[0337] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 234;
[0338] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 235;
[0339] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 236;
[0340] qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 237;
[0341] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 238;
[0342] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 239;
[0343] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 240;
[0344] qualquer um de Asp, Glu, Leu, Arg, Trp e Tyr na posição de aminoácido 241;
[0345] qualquer um de Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp e Tyr na posição de aminoácido 243;
[0346] His na posição de aminoácido 244;
[0347] Ala na posição de aminoácido 245;
[0348] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 246;
[0349] qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 247;
[0350] qualquer um de Glu, His, Gln e Tyr na posição de aminoá-cido 249;
[0351] ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 250;
[0352] Phe na posição de aminoácido 251;
[0353] qualquer um de Phe, Met e Tyr na posição de aminoácido 254;
[0354] qualquer um de Glu, Leu e Tyr na posição de aminoácido 255;
[0355] qualquer um de Ala, Met e Pro na posição de aminoácido 256;
[0356] qualquer um de Asp, Glu, His, Ser e Tyr na posição de ami-noácido 258;
[0357] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 260;
[0358] qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile e Thr na posição de ami-noácido 262;
[0359] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci-do 263;
[0360] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 264;
[0361] qualquer um de Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp e Tyr na posição de aminoá- cido 265;
[0362] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci-do 266;
[0363] qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 267;
[0364] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro,Gln, Arg, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 268;
[0365] qualquer um e Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro,Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 269;
[0366] qualquer um de Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln,Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 270;
[0367] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu,Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 271;
[0368] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro,Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 272;
[0369] ou Phe ou Ile na posição de aminoácido 273;
[0370] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn,Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 274;
[0371] ou Leu ou Trp na posição de aminoácido 275;
[0372] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro,Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 276;
[0373] qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 278;
[0374] Ala na posição de aminoácido 279;
[0375] qualquer um de Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 280;
[0376] qualquer um de Asp, Lys, Pro e Tyr na posição de aminoá-cido 281;
[0377] qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami-noácido 282;
[0378] qualquer um de Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg e Tyr na posição de aminoácido 283;
[0379] qualquer um de Asp, Glu, Leu, Asn, Thr e Tyr na posição de aminoácido 284;
[0380] qualquer um de Asp, Glu, Lys, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 285;
[0381] qualquer um de Glu, Gly, Pro e Tyr na posição de aminoá-cido 286;
[0382] qualquer um de Asn, Asp, Glu e Tyr na posição de aminoá-cido 288;
[0383] qualquer um de Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 290;
[0384] qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln e Thr na posição de aminoácido 291;
[0385] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Pro, Thr e Tyr na posição de aminoácido 292;
[0386] qualquer um de Phe, Gly, His, Ile Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 293;
[0387] qualquer um de Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 294;
[0388] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 295;
[0389] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr e Val na posição de aminoácido 296;
[0390] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 297;
[0391] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 298;
[0392] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 299;
[0393] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 300;
[0394] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 301;
[0395] Ile na posição de aminoácido 302;
[0396] qualquer um de Asp, Gly e Tyr na posição de aminoácido 303;
[0397] qualquer um de Asp, His, Leu, Asn e Thr na posição de aminoácido 304;
[0398] qualquer um de Glu, Ile, Thr e Tyr na posição de aminoáci-do 305;
[0399] qualquer um de Ala, Asp, Asn, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 311;
[0400] Phe na posição de aminoácido 313;
[0401] Leu na posição de aminoácido 315;
[0402] ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 317;
[0403] qualquer um de His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 318;
[0404] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 320;
[0405] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Thr e Tyr na posição de aminoácido 322;
[0406] Ile na posição de aminoácido 323;
[0407] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 324;
[0408] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 325;
[0409] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 326;
[0410] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 327;
[0411] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 328;
[0412] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 329;
[0413] qualquer um de Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 330;
[0414] qualquer um de Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 331;
[0415] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 332;
[0416] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 333;
[0417] qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro e Thr na posi ção de aminoácido 334;
[0418] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 335;
[0419] qualquer um de Glu, Lys e Tyr na posição de aminoácido 336;
[0420] qualquer um de Glu, His e Asn na posição de aminoácido 337;
[0421] qualquer um de Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser e Thr na posição de aminoácido 339;
[0422] ou Ala ou Val na posição de aminoácido 376;
[0423] ou Gly ou Lys na posição de aminoácido 377;
[0424] Asp na posição de aminoácido 378;
[0425] Asn na posição de aminoácido 379;
[0426] qualquer um de Ala, Asn e Ser na posição de aminoácido 380;
[0427] ou Ala ou Ile na posição de aminoácido 382;
[0428] Glu na posição de aminoácido 385;
[0429] Thr na posição de aminoácido 392;
[0430] Leu na posição de aminoácido 396;
[0431] Lys na posição de aminoácido 421;
[0432] Asn na posição de aminoácido 427;
[0433] ou Phe ou Leu na posição de aminoácido 428;
[0434] Met na posição de aminoácido 429;
[0435] Trp na posição de aminoácido 434;
[0436] Ile na posição de aminoácido 436; e
[0437] qualquer um de Gly, His, Ile, Leu e Tyr na posição de ami-noácido 440;
[0438] no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU.
[0439] O método de qualquer um de 29 a 38, onde a região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose é uma região Fc de qualquer uma de IgG1 humana nativa, IgG2 humana nativa, IgG3 humana nativa e IgG4 humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[0440] O método de qualquer um de 29 a 39, onde o receptor FCY humano é FcYRIa, FcyRIia(R), FcyRIia(H), FcYRIIb, FcyRIIIa(V) ou FcyRIIIa(F).
[0441] O método de qualquer um de 29 a 39, onde o receptor FCY humano é FcYRIIb.
[0442] O método de qualquer um de 36 a 41, onde a região Fc é uma região Fc que compreende pelo menos um ou mais de
[0443] Asp na posição de aminoácido 238, e
[0444] Glu na posição de aminoácido 328
[0445] no sítio de região Fc de acordo com a numeração EU.
[0446] Um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:
[0447] determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta;
[0448] determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa;
[0449] seleção do domínio de ligação a antígeno para o qual a atividade de ligação a antígeno determinada em (a) é maior do que a atividade de ligação a antígeno determinada em (b);
[0450] ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de li gação a antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a receptor FCY tendo atividade de ligação a FcRn humano em uma condição de faixa de pH ácido e onde a atividade de ligação ao receptor Fcy em uma condição de faixa de pH neutro é maior do que aquela de uma região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose;
[0451] cultura das células introduzidas com um vetor onde o poli-nucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e
[0452] coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir da cultura de célula de (e).
[0453] Um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:
[0454] determinação da atividade de ligação a antígeno de um anticorpo sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta;
[0455] determinação da atividade de ligação a antígeno de um anticorpo sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa;
[0456] seleção do anticorpo para o qual a atividade de ligação a antígeno determinada em (a) é maior do que a atividade de ligação a antígeno determinada em (b);
[0457] ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno do anticorpo selecionado em (c) a um polinucleotí- deo codificando um domínio de ligação a receptor Fcy tendo atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido, e onde a atividade de ligação ao receptor FCY em uma condição de faixa de pH neutro é maior do que aquela de uma região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose;
[0458] cultura das células introduzidas com um vetor onde o poli-nucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e
[0459] coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir da cultura de célula de (e).
[0460] Um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:
[0461] determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno em uma condição de faixa de pH neutro;
[0462] determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno em uma condição de faixa de pH ácido;
[0463] seleção do domínio de ligação a antígeno para o qual a ati vidade de ligação a antígeno determinada em (a) é maior do que a atividade de ligação a antígeno determinada em (b);
[0464] ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a receptor Fcy tendo atividade de ligação a FcRn humano em uma condição de faixa de pH ácido e onde a atividade de ligação ao receptor Fcy em uma condição de faixa de pH neutro é maior do que aquela de uma região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose;
[0465] cultura das células introduzidas com um vetor onde o poli-nucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e
[0466] coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir da cultu-ra de célula de (e).
[0467] Um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:
[0468] determinação da atividade de ligação a antígeno de um anticorpo em uma condição de faixa de pH neutro;
[0469] determinação da atividade de ligação a antígeno de um anticorpo em uma condição de faixa de pH ácido;
[0470] seleção do anticorpo para o qual a atividade de ligação a antígeno determinada em (a) é maior do que a atividade de ligação a antígeno determinada em (b);
[0471] ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno do anticorpo selecionado em (c) a um polinucleotí- deo codificando um domínio de ligação a receptor FCY tendo atividade de ligação a FcRn humano em uma condição de faixa de pH ácido, onde a atividade de ligação ao receptor Fcy em uma condição de faixa de pH neutro é maior do que aquela de uma região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose;
[0472] cultura de células introduzidas com um vetor onde o polinu- cleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e
[0473] coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir da cultura de célula de (e).
[0474] O método de produção de qualquer um de 43 a 46, onde o antígeno é um antígeno solúvel.
[0475] O método de produção de qualquer um de 43 a 47, onde o domínio de ligação a receptor Fcy compreende uma região Fc de anticorpo.
[0476] O método de produção de 48, onde a região Fc é uma regi ão Fc onde pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do gru-po consistindo em aminoácidos nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU são diferentes de aminoácidos em sítios correspondentes em uma região Fc nativa.
[0477] O método de produção de 49, onde a região Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
[0478] ou Lys ou Tyr na posição de aminoácido 221;
[0479] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá-cido 222;
[0480] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Lys na posição de aminoá-cido 223;
[0481] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá-cido 224;
[0482] qualquer um de Glu, Lys e Trp na posição de aminoácido 225;
[0483] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá-cido 227;
[0484] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá-cido 228;
[0485] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Tyr na posição de aminoá-cido 230;
[0486] qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami-noácido 231;
[0487] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá-cido 232;
[0488] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 233;
[0489] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 234;
[0490] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 235;
[0491] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 236;
[0492] qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 237;
[0493] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 238;
[0494] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 239;
[0495] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 240;
[0496] qualquer um de Asp, Glu, Leu, Arg, Trp e Tyr na posição de aminoácido 241;
[0497] qualquer um de Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp e Tyr na posi ção de aminoácido 243;
[0498] His na posição de aminoácido 244;
[0499] Ala na posição de aminoácido 245;
[0500] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá-cido 246;
[0501] qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 247;
[0502] qualquer um de Glu, His, Gln e Tyr na posição de aminoá-cido 249;
[0503] ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 250;
[0504] Phe na posição de aminoácido 251;
[0505] qualquer um de Phe, Met e Tyr na posição de aminoácido 254;
[0506] qualquer um de Glu, Leu e Tyr na posição de aminoácido 255;
[0507] qualquer um de Ala, Met e Pro na posição de aminoácido 256;
[0508] qualquer um de Asp, Glu, His, Ser e Tyr na posição de ami-noácido 258;
[0509] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá-cido 260;
[0510] qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile e Thr na posição de ami-noácido 262;
[0511] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci-do 263;
[0512] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 264;
[0513] qualquer um de Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met,Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp e Tyr na posição de aminoá- cido 265;
[0514] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci-do 266;
[0515] qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 267;
[0516] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro,Gln, Arg, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 268;
[0517] qualquer um e Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro,Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 269;
[0518] qualquer um de Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln,Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 270;
[0519] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu,Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 271;
[0520] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro,Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 272;
[0521] ou Phe ou Ile na posição de aminoácido 273;
[0522] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn,Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 274;
[0523] ou Leu ou Trp na posição de aminoácido 275;
[0524] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro,Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 276;
[0525] qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 278;
[0526] Ala na posição de aminoácido 279;
[0527] qualquer um de Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 280;
[0528] qualquer um de Asp, Lys, Pro e Tyr na posição de aminoá-cido 281;
[0529] qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami-noácido 282;
[0530] qualquer um de Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg e Tyr na posição de aminoácido 283;
[0531] qualquer um de Asp, Glu, Leu, Asn, Thr e Tyr na posição de aminoácido 284;
[0532] qualquer um de Asp, Glu, Lys, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 285;
[0533] qualquer um de Glu, Gly, Pro e Tyr na posição de aminoá- cido 286;
[0534] qualquer um de Asn, Asp, Glu e Tyr na posição de aminoá-cido 288;
[0535] qualquer um de Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 290;
[0536] qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln e Thr na posição de aminoácido 291;
[0537] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Pro, Thr e Tyr na posição de aminoácido 292;
[0538] qualquer um de Phe, Gly, His, Ile Leu, Met, Asn, Pro, Arg,Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 293;
[0539] qualquer um de Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 294;
[0540] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 295;
[0541] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr e Val na posição de aminoácido 296;
[0542] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 297;
[0543] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 298;
[0544] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 299;
[0545] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 300;
[0546] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 301;
[0547] Ile na posição de aminoácido 302;
[0548] qualquer um de Asp, Gly e Tyr na posição de aminoácido 303;
[0549] qualquer um de Asp, His, Leu, Asn e Thr na posição de aminoácido 304;
[0550] qualquer um de Glu, Ile, Thr e Tyr na posição de aminoáci-do 305;
[0551] qualquer um de Ala, Asp, Asn, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 311;
[0552] Phe na posição de aminoácido 313;
[0553] Leu na posição de aminoácido 315;
[0554] ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 317;
[0555] qualquer um de His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 318;
[0556] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 320;
[0557] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Thr e Tyr na posição de aminoácido 322;
[0558] Ile na posição de aminoácido 323;
[0559] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg,Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 324;
[0560] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 325;
[0561] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 326;
[0562] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 327;
[0563] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 328;
[0564] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 329;
[0565] qualquer um de Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 330;
[0566] qualquer um de Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 331;
[0567] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 332;
[0568] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 333;
[0569] qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro e Thr na posi ção de aminoácido 334;
[0570] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 335;
[0571] qualquer um de Glu, Lys e Tyr na posição de aminoácido 336;
[0572] qualquer um de Glu, His e Asn na posição de aminoácido 337;
[0573] qualquer um de Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg,Ser e Thr na posição de aminoácido 339;
[0574] ou Ala ou Val na posição de aminoácido 376;
[0575] ou Gly ou Lys na posição de aminoácido 377;
[0576] Asp na posição de aminoácido 378;
[0577] Asn na posição de aminoácido 379;
[0578] qualquer um de Ala, Asn e Ser na posição de aminoácido 380;
[0579] ou Ala ou Ile na posição de aminoácido 382;
[0580] Glu na posição de aminoácido 385;
[0581] Thr na posição de aminoácido 392;
[0582] Leu na posição de aminoácido 396;
[0583] Lys na posição de aminoácido 421;
[0584] Asn na posição de aminoácido 427;
[0585] ou Phe ou Leu na posição de aminoácido 428;
[0586] Met na posição de aminoácido 429;
[0587] Trp na posição de aminoácido 434;
[0588] Ile na posição de aminoácido 436; e
[0589] qualquer um de Gly, His, Ile, Leu e Tyr na posição de ami-noácido 440;
[0590] no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU.
[0591] O método de produção de qualquer um de 43 a 50, onde a região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose é uma região Fc de qualquer uma de IgG1 humana nativa, IgG2 humana nativa, IgG3 humana nativa e IgG4 humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[0592] O método de produção de qualquer um de 43 a 51, onde o receptor FCY humano é FcYRIa, FcyRIIa(R), FcyRIIa(H), FcyRIIb, FcYRIIIa(V) ou FcyRIIIa(F).
[0593] O método de produção de qualquer um de 43 a 51, onde o receptor Fcy humano é FcyRIIb.
[0594] O método de produção de qualquer um de 48 a 53, onde a região Fc é uma região Fc que compreende pelo menos um ou mais de
[0595] Asp na posição de aminoácido 238, e
[0596] Glu na posição de aminoácido 328
[0597] no sítio de região Fc de acordo com a numeração EU.
Breve Descrição dos Desenhos
[0598] A Fig. 1 mostra um mecanismo de ação não limitante para a eliminação de antígeno solúvel do plasma através da administração de um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente da concentração de íon e cuja ligação a receptor FCY é aumentada em um pH neutro comparado a anticorpos de neutralização existentes.
[0599] A Fig. 2 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humanos administrados com Fv4-IgG1 que se liga a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH ou H54/L28-IgG1.
[0600] A Fig. 3 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1 que se liga a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH, Fv4-IgG1-F760 que é uma variante de Fv4-IgG que não tem ligação a FcyR de camundongo, Fv4-IgG1-F1022 que é uma variante de Fv4-IgG1 com ligação a FcyR de camundongo aumentada ou Fv4-IgG1-Fuc que é um anticorpo Fv4-IgG1 com teor de fucose baixo.
[0601] A Fig. 4 mostra um curso de tempo de concentração de re ceptor de IL-6 humano no plasma de camundonogos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1 ou moléculas de ligação a antígeno compreendendo como a cadeia pesada Fv4-IgG1-F1022 ou Fv4-IgG1-F1093 que é uma variante de Fv4-IgG1-F1022 com ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido.
[0602] A Fig. 5 mostra um curso de tempo de concentração das moléculas de ligação a antígeno administradas no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1 ou moléculas de ligação a antígeno compreendendo como a cadeia pesada Fv-IgG1-F1022 ou Fv4-IgG1-F1093 que é uma variante de Fv4-IgG1-F1022 com ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido.
[0603] A Fig. 6 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087 que é uma variante de Fv4-IgG1 com ligação a FCYR de camundongo aumentada (em particular, ligação a FcYRIIb de camundongo e ligação a FcyRIII de camundongo aumentada) e Fv4-IgG1-F1182 que é um variante de Fv4-IgG1 com ligação a FcyR de camundongo aumentada (em particular, ligação a FcyRI de camundongo aumentada e ligação a FcyRIV de camundongo).
[0604] A Fig. 7 mostra um curso de tempo de concentração das moléculas de ligação a antígeno administradas no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087 e Fv4-IgG1-F1180 e Fv4-IgG1-F1412 que são variantes de Fv4-F1087 com ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido.
[0605] A Fig. 8 mostra um curso de tempo de concentração das moléculas de ligação a antígeno administradas no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1182 e Fv4-IgG1-F1181 que é uma variante de Fv4-IgG1- F1182 com ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido.
[0606] A Fig. 9 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087 e Fv4-IgG1- F1180 e Fv4-IgG1-F1412 que são variantes de Fv4-IgG1-F1087 com ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido.
[0607] A Fig. 10 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1182 e Fv4-IgG1-F1181 que é uma variante de Fv4-IgG1-F1182 com ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido.
[0608] A Fig. 11 mostra os resulados de mudança em concentra ção no plasma de Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1782 ou Fv4-IgG1-F1087 em um camundongo transgênicos com FcRn humano quando Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1782 ou Fv4-IgG1-F1087 é administrado ao camundongo.
[0609] A Fig. 12 mostra os resultados de mudança em concentração no plasma de um receptor de IL-6 humano solúvel em um camundongo transgênico com FcRn humano quando Fv4-IgG1, Fv4-IgG1- F1782 ou Fv4-IgG1-F1087 é administrado ao camundongo.
[0610] A Fig. 13 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos normais administrados com Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcYRIIb de camundongo aumentada e ligação a FCYRIII de camundongo e Fv4-mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcYRIIb de camundongo adicionalmente aumentada e ligação a FCYRIII de camundongo.
[0611] A Fig. 14 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos deficientes em FcyRIII administrados com Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 que é uma variante de Fv-4mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo e Fv4-mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo adicionalmente aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo.
[0612] A Fig. 15 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc administrados com Fv4-mIgG1, F4-mIgG1- mF44 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo e Fv4- mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcyRIIb de camundongo adicionalmente aumentada e ligação a FcyRIII de camundongo.
[0613] A Fig. 16 mostra um curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos deficientes em FcYRIIb administrados com Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcYRIIb de camundongo aumentada e ligação a FcYRIII de camundongo e Fv4-mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com ligação a FcYRIIb de camundongo adicionalmente aumentada e ligação a FcYRIII de camundongo.
[0614] A Fig. 17 mostra um resultado de avaliação da habilidade de agregação de plaqueta do imunocomplexo omalizumabe-G1d- v3/IgE pelo ensaio de agregação de plaqueta usando plaquetas derivadas de doacores com alótipo FcYRIIa (R/H).
[0615] A Fig. 18 mostra um resultado de avaliação da habilidade de agregação de plaqueta do imunocomplexo omalizumabe-G1d- v3/IgE através do ensaio de agregação de plaqueta usando plaquetas derivadas de doadores com alótipo FcYRIIa (H/H).
[0616] A Fig. 19 mostra um resultado de avaliação da expressão de CD62p sobre a superfície de membrana de plaquetas lavadas. A área preenchida de preto no gráfico indica um resultado de estimulação de ADP após reação com PBS. A área que não é preenchida no gráfico indica um resultado de estimulação de ADP após reação com o imunocomplexo.
[0617] A Fig. 20 mostra um resultado de avaliação da expressão de integrina ativa sobre a superfície da membrana de plaquetas lavadas. A área preenchida de preto no gráfico indica um resultado de estimulação de ADP após reação com PBS. A área que não está preenchida no gráfico indica um resultado de estimulação de ADP após reação com o imunocomplexo.
[0618] A Fig. 21 mostra os resultados de avaliação de atividade de gregacao de plaqueta induzida pelo imunocomplexo omalizumabe- BP230/IgE e o imunocomplexo omalizumabe-GF1d/IgE em um ensaio de agregação de plaqueta usando plaquetas derivadas de um doador com um polimorfismo de FcYRIIa (R/H).
[0619] A Fig. 22 mostra os resultados de avaliação de expressão de CD62p sobre a superfície da membrana de plaquetas lavadas. O gráfico sombreado de cinza indica o resultado quando estimulação pela adição de ADP foi realizada após reação com PBS, a linha sólida e a linha pontilhada indicam os resultados quando estimulação por ADP foi realizada após reação com o imunocomplexo omalizumabe-G1d- v3/IgE e o imunocomplexo omalizumabe-BP230/IgE, respectivamente.
[0620] A Fig. 23 mostra os resultados de avaliação de ativação de expressão de integrina sobre a superfície da membrana de plaquetas lavadas. O gráfico sombreado de cinza indica o resultado quando estimulação através da adição de ADP foi realizada após reação com PBS, a linha sólida e a linha pontilhada indicam os resultados quando estimulação por ADP foi realizada após reação com o imunocomplexo omalizumabe-G1d-v3/IgE e o imunocomplexo omalizumabe- BP230/IgE, respectivamente.
[0621] A Fig. 24 mostra um gráfico onde o eixo horizontal mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcYRIIb de cada variante de PD e o eixo vertical mostra o valor relativo de atividade de ligação a tipo R de FcYRIIa de cada variante de PD. O valor para a quantidade de ligação de cada variante de PD a cada FcYR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação a IL6R-F652/IL6R-L, que é um anticorpo controle antes da introdução da alteração (IL6R-F652, definido pela SEQ ID NO: 142, é uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma Fc alterada com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp) em cada FcYR; e então o valor obtido foi multiplicado por 100 e usado como o valor de atividade de ligação relativo para cada variante de PD a cada FcYR. O gráfio F652 na figura mostra o valor para IL6R- F652/IL6R-L.
[0622] A Fig. 25 mostra um gráfico onde o eixo vertical mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcYRIIb de variantes produzidas pela introdução de cada alteração em GpH7-B3 (SEQ ID NO: 159)/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 160) que não tem a alteração de P238D e o eixo horizontal mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcYRIIb de variantes produzidas através da introdução de cada alteração em IL6R-F652 (SEQ ID NO: 142)/IL6R-L que tem a alteração de P238D. O valor para a quantidade de ligação a FcYRIIb de cada variante foi dividido pelo valor da quantidade de ligação a FcYRIIb do anticorpo pré-alterado; e então o valor obtido foi multiplicado por 100 e usado como o valor de atividade de ligação relativa. Aqui, a região A contém alterações que exibem o efeito de aumento de ligação a FcYRIIb aumentada em ambos os casos onde uma alteração é introduzida em GpH7-B3/GpL16-k0 que não tem P238D e onde uma alteração é introduzida em IL6R-F652/IL6R-L que tem P238D. A região B contém alterações que exibem o efeito de aumento da ligação a FcYRIIb quando introduzida em GpH7-B3/GpL16-k0 que não tem P238D, mas não exibe o efeito de aumento de ligação a FcYRIIb quando introduzida em IL6R-F652/IL6R-L que tem P238D.
[0623] A Fig. 26 mostra uma estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcYRIIb.
[0624] A Fig. 27 mostra uma imagem de superposição da estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcYRIIb e a estrutura modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular de FcYRIIb, com relação à região extracelular de FcYRIIb e o domínio A de CH2 de Fc através do ajuste de quadrados mínimos com base na distância de par de átomo de Cα.
[0625] A Fig. 28 mostra comparação da estrutura detalhada em torno de P238D após superposição da estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcYRIIb e da estrutura modelo do complexo de Fc(WT)/região extracelular de FcYRIIb com relação a apenas o domínio A de CH2 de Fc ou apenas o domínio B de CH2 de Fc através do ajuste de quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα.
[0626] A Fig. 29 mostra que uma ligação hidrogênio pode ser en contrada entre a cadeia principal de Gly na posição 237 (indicado pela numeração EU) no domínio A de CH2 de Fc e posição Tyr 160 em FcYRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região ex- tracelular de FcYRIIb.
[0627] A Fig. 30 mostra que uma interação eletrostática pode ser encontrada entre Asp na posição 270 (indicado pela numeração EU) no domínio B de CH2 de Fc e Arg na posição 131 em FcYRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcYRIIb.
[0628] A Fig. 31 mostra um gráfico onde o eixo horizontal mostra o valor relativo de atividade de ligação a FcYRIIb de cada variante 2B e o eixo vertical mostra o valor relativo de atividade de ligação a tipo R de FcYRIIa de cada variante 2B. O valor para a quantidade de ligação de cada variante 2B a cada FcYR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação de um anticorpo controle antes da alteração (Fc alterado com substituição de Pro na posição 238 (indicado por numeraco EU) com Asp) a cada FcYR; e então o valor obtido foi multiplicado por 100 e usado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante 2B com relação a cada FcYR.
[0629] A Fig. 32 mostra Glu na posição 233 (indicada pela numeração EU) na Cadeia A de Fc e os resíduos circundantes na região extracelular de FcYRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcYRIIb.
[0630] A Fig. 33 mostra Ala na posição 330 (indicado pela nume ração EU) na Cadeia A de Fc e os resíduos circundantes na região extracelular de FcYRIIb na estrutura de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcYRIIb.
[0631] A Fig. 34 mostra as estruturas de Pro na posição 271 (numeração EU) da Cadeia B de Fc após superposição das estruturas de cristal do complexo de Fc(P238D)/região extracelular de FcYRIIb e o complexo de Fc(WT)/região extracelular de FcYR através do ajuste dos quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα com relação à cadeia B de Fc.
[0632] A Fig. 35 mostra uma imagem do complexo de Fc(P208)/ região extracelular de FcYRIIb determinado através de análise de estrutura de cristal de raios X. Para cada um dos domínios CH2 e CH3 na porção Fc, aqueles no lado esquerdo são referidos como domínio A e aqueles no lado direito são referidos como domínio B.
[0633] A Fig. 36 mostra comparação após superposição das estruturas do complexo de Fc(P208)/região extracelular de FcYR e do complexo de Fc(WT)/região extracelular de FcYRIIa (código PDB: 3RY6) determinadas através de análise de estrutura de cristal de raios X com relação ao domínio A de CH2 da porção Fc através do ajuste dos quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα. No diagrama, a estrutura desenhada com linha grossa mostra o complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb, enquanto a estrutura desenhada com linha fina indica a estrutura de complexo de Fc (WT)/região extracelular de FcYRIIa. Apenas o domínio A de CH2 da porção Fc é desenhado para o complexo de Fc (WT)/região extracelu- lar de FcYRIIa.
[0634] A Fig. 37 mostra na estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb uma estrutura detalhada em torno de Asp na posição 237 (numeração EU) no domínio CH2 A da porção Fc, que forma uma ligação hidrogênio com Tyr na posição 160 em FcYRIIb na porção de cadeia principal.
[0635] A Fig. 38 mostra na estrutura de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb a estrutura de resíduos de aminoácido em torno de Asp na posição 237 (numeração EU) no domínio A de CH2 da porção Fc, que forma uma ligação hidrogênio com Tyr na posição 160 em FcYRIIb na porção de cadeia principal.
[0636] A Fig. 39 mostra comparação em torno da alça nas posições 266 a 271 (numeração EU) após superposição das estruturas de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb mostrado no Exemplo 10 e o complexo da Fc (P208)/região extracelular FcYRIIb com relação ao domínio B de CH2 da porção através do ajuste de quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα. Quando comparado com Fc (P238D), Fc (P208) tem a alternação de H269D na posição 268 (numeração EU) e a alteração P271G na posição 271 (numeração EU) na alça.
[0637] A Fig. 40 é um diagrama mostrando a estrutura em torno de Ser239 no domínio B de CH2 da porção Fc na estrutura de raios X do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb junto, junto com a densidade de eletron determinada por análise de estrutura de cristal de raios X com coeficiente 2Fo-Fc.
[0638] A Fig. 41 mostra comparação após superposição das estruturas tridimensionais do complexo de Fc (P208)/região extracelular FcYRIIaR e complexo de Fc (P208)/região extracelular FcYRIIb determinado através de análise de estrutura de cristal de raios X através de ajuste de quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα.
[0639] A Fig. 42 mostra comparação em torno de Asp na posição 237 (numeração EU) no domínio A de CH2 da porção Fc entre as estruturas de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extrace- lular FcYRIIaR e o complexo de Fc (P208) região extracelular FcYRIIb, junto com a densidade de elétron determinada através de análise de estrutura de cristal de raios X com coeficiente 2Fo-Fc.
[0640] A Fig. 43 mostra comparação em torno de Asp na posição 237 (numeração EU) no domínio A de CH2 da porção Fc entre as estruturas de cristal de raios X do complexo de Fc (P208)/região extrace- lular FcYRIIaR e o complexo de Fc (P208)/região extracelular FcYRIIb, junto com a densidade de elétron determinada através de análise de estrutura de cristal de raios X com coeficiente 2Fo-Fc.
[0641] A Fig. 44 mostra comparação entre as sequências de região constante de G1d e G4d. No diagrama, os aminoácidos circundados com estrutura grossa indicam posições com resíduos de aminoá- cido ácidos diferentes entre G1d e G4d.
[0642] A Fig. 45 mostra a mudança em concentração de anticorpo no plasma de GA2-IgG1 e GA2-F1087 em camundongos normais.
[0643] A Fig. 46 mostra a mudança em concentração de hIgA no plasma em camundongos normais administrados com GA2-IgG1 e GA2-F1087.
[0644] A Fig. 47 mostra a mudança em concentração de anticorpo no plasma de 278-IgG1 e 278-F1087 em camundongos C57BL/6J.
[0645] A Fig. 48 mostra a mudança em concentração de hIgE (Asp6) no plasma em camundongos C57BL/6J administrados com 278-IgG1 e 278-F1087.
[0646] A Fig. 49 mostra a estrutura da CDR3 de cadeia pesada do fragmento de anticorpo Fab 6RL#9 determinada através de análise de estrutura de cristal de raios X. (i) mostra a estrutura de cristal da CDR3 de cadeia pesada obtida sob uma condição de cristalização na presença de íon de cálcio. (ii) mostra a estrutura de cristal da CDR3 de cadeia pesada obtida sob uma condição de cristalização na ausência de íon de cálcio.
[0647] A Fig. 50 mostra um curso de tempo da concentração no plasma de cada anticorpo em camundongos normais administrados com anticorpo H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 ou 6RL#9-IgG1.
[0648] A Fig. 51 mostra um curso de tempo de concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel (hsIL-6R) em camundongos normais administrados com anticorpo H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 ou 6RL#9-IgG1.
[0649] A Fig. 52 mostra os cromatogramas de troca de íon para um anticorpo tendo sequência Vk5-2 humana e um anticorpo tendo sequência h Vk5-2_L65 que tem uma sequência de glicosilação alterada na sequência Vk5-2 humana. A linha sólida indica um cromato- grama para um anticorpo tendo sequência Vk5-2 humana (cadeia pesada: CIM_H (SEQ ID NO: 67); cadeia leve: hVK5-2 (SEQ ID NO: 4); linha interrompida indica um cromatograma para um anticorpo tendo sequência hVk5-2_L65 (cadeia pesada: CIM_H (SEQ ID NO: 67); cadeia leve: hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 70)).
[0650] A Fig. 53A mostra cromatogramas de troca de íon para um anticorpo tendo sequência LfVk1_Ca (cadeia pesada: GC_H (SEQ ID NO: 51); cadeia leve: LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83)) e um anticorpo tendo uma sequência onde Asp (D) na sequência LfVk1_Ca é substituída com Ala (A) após armazenamento a 5° C (linha sólida) ou 50° C (linha pontilhada). Após armazenamento a 5° C, o pico mais alto no croma- tograma para cada anticorpo é definido como um pico principal e o eixo y de cada cromatograma de troca de íon foi normalizado para o pico principal. O gráfico mostra um cromatograma para um anticorpo tendo LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 8) como a cadeia leve.
[0651] A Fig. 53B mostra um cromatograma para um anticorpo tendo LfVk1_Ca1 (SEQ ID NO: 85) como a cadeia leve.
[0652] A Fig. 53C mostra um cromatograma para um anticorpo tendo LfVk1-Ca2 (SEQ ID NO: 86) como a cadeia leve.
[0653] A Fig. 53D mostra um cromatograma para um anticorpo tendo LfVk1_Ca3 (SEQ ID NO: 87) como a cadeia leve.
[0654] A Fig. 54A mostra cromatograma de troca de íon para um anticorpo tendo sequência LfVk1_Ca (cadeia pesada: GC_H (SEQ ID NO: 51); cadeia leve: LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83)) e um anticorpo tendo sequência FfVk1_Ca6 (cadeia pesada: GC_H (SEQ ID NO: 51); cadeia leve: LfVk1_Ca6 (SEQ ID NO: 88)) onde Asp (D) na posição 30 (numeração Kabat) na sequencai LfVk1_Ca é substituído com Ser (S) após armazenamento a 5° C (linha sólida) ou 50° C (linha pontilhada). Após armazenamento a 5° C, o pico mais alto no cromatograma para cada anticorpo é definido como um pico principal, e o eixo y de cada cromatograma de troca de íon foi normalizado para o pico principal. O gráfico mostra um cromatograma para um anticorpo tendo LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83) como a cadeia leve.
[0655] A Fig. 54B mostra um cromatograma para um anticorpo tendo LfVk1_Ca6 (SEQ ID NO: 88) como a cadeia leve.
[0656] A Fig. 55 mostra a relação entre a distribuição de aminoáci- do projetada (indicada com "Projeto") e a distribuição de aminoácido para informação de seuqencia em 290 clones isolados de E. coli introduzidos com uma biblioteca de gene de anticorpos que se ligam a an- tígenos de uma maneira dependente de Ca (indicado com "Biblioteca"). O eixo horizontal indica a posição do aminoácido (numeração de Kabat). O eixo vertical indica porcentagem em distribuição de aminoá- cido.
[0657] A Fig. 56 mostra sensorgramas para anticorpo anti-IL-6R (tocilizumabe), anticorpo 6RC1IgG_010, anticorpo 6RC1IgG_0,12 e anticorpo 6RC1IgG_019 sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta (1,2 mM). O eixo horizontal mostra tempo e o eixo vertical mostra valor RU.
[0658] A Fig. 57 mostra sensorgramas para anticorpo anti-IL-6R (tocilizumabe), anticorpo 6RC1IgG_010, anticorpo 6RC1IgG_0,12 e anticorpo 6RC1IgG_019 sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa (3 μM). O eixo horizontal mostra tempo e o eixo vertical mostra valor RU.
[0659] A Fig. 58 mostra a relação entre distribuição de aminoácido projetada (indicada como "Projeto") e distribuição de aminoácido para informação de sequência em 132 clones isolados de E. coli introduzida com uma biblioteca de gene de anticorpos que se ligam a antígeno de uma maneira dependente do pH (indicado como "Biblioteca"). O eixo horizontal mostra posição de aminoácido (numeração Kabat). O eixo vertical indica porcentagem em distribuição de aminoácido.
[0660] A Fig. 59 mostra sensorgramas para anticorpo anti-IL-6R (tocilizumabe), anticorpo 6RpH#01, anticorpo 6Rp#02 e anticorpo 6RpH#03 em pH 7,4. O eixo horizontal mostra tempo e o eixo vertical mostra valor RU.
[0661] A Fig. 60 mostra sensorgramas para anticorpo anti-IL-6R (tocilizumabe), anticorpo 6RpH#01, anticorpo 6RpH#02 e anticorpo 6RpH#03 em pH 6,0. O eixo horizontal mostra tempo e o eixo vertical mostra valor RU.
[0662] A Fig. 61A mostra um gráfico de respostas de ECL a Fc na tivo e Fc alterado a partir de soros isolados de 15 a 30 pacientes com reumatismo independentes. Gráficos de respostas de ECL a Fc nativo (Fig. 61A), Fv4-YTE (Fig. 61B), Fv4-F1166 (=YTE + Q438R/S440E) (Fig. 61C), Fv4-F1167 (=YTE + S424N) (Fig. 61D), Fv4-LS (Fig. 61E), Fv4-F1170 (=LS + Q438R/S440E) (Fig. 61F). Fv4-F1171 (=LS +S424N) (Fig. 61G), Fv4-N434H (Fig. 61n), Fv4-F1172 (= N434H + Q438R/S440E) (Fig. 61I), Fv4-F1173 (= N434H + S424N) (Fig. 61J) são mostrados, respectivamente.
[0663] A Fig. 61B é uma continuação da Fig. 61A.
[0664] A Fig. 61C é uma continuação da Fig. 61B.
[0665] A Fig. 61D é uma continuação da Fig. 61C.
[0666] A Fig. 61E é uma continuação da Fig. 61D.
[0667] A Fig. 61F é uma continuação da Fig. 61E.
[0668] A Fig. 61G é uma continuação da Fig. 61F.
[0669] A Fig. 61H é uma continuação da Fig. 61G.
[0670] A Fig. 61I é uma continuação da Fig. 61H.
[0671] A Fig. 61J é uma continuação da Fig. 61I.
[0672] A Fig. 62A mostra um gráfico de respostas de ECL a Fc alterado de soros isolados de 30 pacientes com reumatismo independentes. Gráficos de respostas de ECL para Fv4-LS (Fig. 62A), Fv4- F1380 (Fig. 62B), Fv4-F1384 (Fig. 62C), Fv4-F1385 (Fig. 62D), Fv4- F1386 (Fig. 62E), Fv4-F1388 (Fig. 62F) e Fv4-F1389 (Fig. 62G) são mostrados, respectivamente.
[0673] A Fig. 62B é uma continuação da Fig. 62A.
[0674] A Fig. 62C é uma continuação da Fig. 62B.
[0675] A Fig. 62D é uma continuação da Fig. 62C.
[0676] A Fig. 62E é uma continuação da Fig. 62D.
[0677] A Fig. 62F é uma continuação da Fig. 62E.
[0678] A Fig. 62G é uma continuação da Fig. 62F.
Modo para Realizar a Invenção
[0679] As definições e descrição detalhada abaixo são provides para auxiliar na compreensão da presente invenção ilustrada.
Aminoácidos
[0680] Aqui, aminoácidos são descritos em códigos de uma ou três letras ou ambos, por exemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I ou Val/V.
Alterações de aminoácidos
[0681] Para alterações de aminoácido na sequência de aminoáci-do de uma molécula de ligação a antígeno, métodos conhecidos tais como métodos de mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados. Adições, deleções e/ou substituições de um aminoácido são adicionadas apropriadamente por esses métodos conhecidos. Substituição de resíduos de aminoácido substituindo um resíduo de aminoácido com outro resíduo de aminoácido para o propósito de alteração de aspectos tais como os que seguem:
[0682] estrutura principal de um polipeptídeo em uma região de estrutura helical ou uma região de estrutura de folha;
[0683] carga ou hidrofobicidade em um sítio alvo; ou
[0684] comprimento de uma cadeia lateral.
[0685] Resíduos de aminoácido são classificados nos grupos que seguem com base nas propriedades de cadeias laterais incluídas em suas estruturas:
[0686] hidrofobicidade: norleucina, Met, Ala, Val, Leu e Ile;
[0687] hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn e Gln;
[0688] ácido: Asp e Glu;
[0689] básico: His, Lys e Arg;
[0690] resíduos que afetam a orientação da cadeia: Gly e Pro; e
[0691] aromático: Trp, Tyr e Phe.
[0692] Substituição entre resíduos de aminoácido dentre cada um desses grupos é referida como substituição conservativa. Por outro lado, substituição entre resíduos de aminoácido de grupos de aminoá- cido diferentes é referida como substituição não conservativa. Substituições na presente invenção podem ser substituições conservativas ou substituições não conservativas ou uma combinação de substituições conservativas e não conservativas. Ainda, uma pluralidade de métodos conhecidos pode ser empregada como métodos de alteração de aminoácido para substituição de aminoácidos não nativos (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; e Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de tradução livre de célula (Clover Direct (Protein Express)) contendo um tRNA que tem o aminoácido não nativo ligado a um tRNA supressor âmbar complementar do códon UAG (códon âmbar), que é um dos có- dons de parada, é adequadamente usado.
[0693] Ainda, uma expressão que usa códigos de aminoácido de uma letra do aminoácido antes da alteração e do aminoácido após a alteração antes e após um número indicando uma posição específica, respectivamente, pode ser usada apropriadamente como uma expressão para uma alteração de aminoácido. Por exemplo, a alteração P238D, que é usada quando substituindo um aminoácido da região Fc incluída em uma região constante de anticorpo, expressa substituição de Pro na posição 238 (de acordo com a numeração EU) com Asp. Isto é, o número mostra a posição do aminoácido de acordo com a numeração EU, o códido de aminoácido de uma letra escrito antes do número mostra o aminoácido antes da substituição e o código de ami- noácido de uma letra escrito após o número mostra o aminoácido após substituição.
E/ou
[0694] Conforme aqui usado, o termo "e/ou" significa uma combinação dos termos antes e após a expressão "e/ou" e inclui cada combinação onde "e" e "ou" são adequadamente combinados. Especificamente, por exemplo, "os aminoácidos nas posições 326, 328 e/ou 428 são substituídos" inclui uma variação de alterações dos aminoácidos que seguem:
[0695] aminoácido(s) na (a) posição 326, (b) posição 328, (c) posição 428, (d) posição 326 e 328, (e) posições 326 e 428, (f) posições 328 e 428 e (g) posições 326, 328 e 428.
Antígenos
[0696] Conforme aqui usado, a estrutura de um "antígeno" não é particularmente limitada a uma estrutura específica contanto que ela inclua um epítopo que é ligado por um domínio de ligação a antígeno. Em outro significado, um antígeno pode ser uma matéria inorgânica ou uma matéria orgânica, e é preferivelmente um antígeno solúvel que está presente no fluido corporal de um organismo e que está em uma modalidade que pode ser ligado por uma molécula de ligação a antí- geno da presente invenção. As moléculas que seguem são exemplos dos antígenos:
[0697] 17-1A, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, Ace-2, activina, activina A, acti- vina AB, activina B, activina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activi- na RIB ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adressina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1- antitripsina, alfa-V/beta-1 antagonista, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-Id, ASPARTIC, peptídeo natriurético atrial, av/b3 integrina, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, fator de estimulação de linfócito B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF- R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2, BMP-2a, BMP-3 Osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), MBP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-1A (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bom- besina, fator neutrófico derivado de osso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator de complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, cAMP, antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno associado a câncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina Botulínica, toxina Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno associado a tumor citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, fator regulador de complementaridade (Fator de aceleração de declínio), des (1-3)- IGF-1 (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinase, eNOS, Eot, eotaxina, EpCAM, efrina B2/EphB4, ERCC, E-selectina, ET-1, fator IIa, fator VII, fator VIIIc, fator IX, proteína de ativação de fibroblasto (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormônio de estimulação de folículo, factalcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (mios- tatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR- alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, glucagon, Glut4, glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormônio de liberação de hormônio do crescimento, hapteno (NP-cap ou NIP-cap), HB- EGF, HCC, glicoproteína envelope HCMV gBm, glicoproteína envelope HCMV gH, HCMV UL, fator de crescimento hematopoiético (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB do vírus herpes simplex (HSV), glico- proteína gD do HSV, HGFA, antígeno associado a melanoma de peso molecular alto (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 alça V3, HLA, HLA-DR, HM 1,24, HMGF PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV), hormônio do crescimento humano (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-I, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor IgA, IgE, IGF, proteína de ligação a IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (INF)-alfa, INF-beta, INF-gama, inibina, iNOS, cadeia A da insulina, cadeia B da insulina, fator 1 de crescimento do tipo insulina, alfa2 inte- grina, alfa3 integrina, alfa4 integrina, alfa4 integrina/beta1, alfa4 inte- grina/beta7, alfa5 integrina (alfa V), alfa5 integrina/beta1, alfa5 integri- na/beta 3, integrina alfa6, integrina beta1, integrina beta2, interferon gama, IP-10, I-TAC, JE, calicreíona 2, calicreína 5, calicreína 6, cali- creína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, ca- licreína L2, calicreína L3, calicreína L4, KC, KDR, fator de crescimento de queratinócito (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 latente bp1, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno Lewis- Y, antígeno associado a Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipo- proteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, superfície pulmonar, hormônio luteinizante, receptor da linfotoxina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEASES, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, , MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP- 15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Mucl), MUC18, substância inibidora Mulleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C aderina, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4 ou -6, neurturina, fator de crescimento de nervo (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PA- DPr, hormônio paratireoide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P- caderina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatase alcalina placentária (PLAP), PIGF, PLP, PP14, pró-insulina, pré-relaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadeia A da relaxina, cadeia B da relaxina, renina, vírus sincicial respiratório (RSV) F, RSV Fgp, Ret, Fator reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINA, albumina do soro, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STE- AP, STEAP-II, TACE, TACI, MARCADOR-72 (glicoproteína-72 associada a tumor), TARC, TCA-3, receptor de célula T (por exemplo, receptor de célula T alfa/beta), TdT, TECK, TEMI, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatase alcalina tipo PLAP do testículo, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específico, TGF-betaRI (ALK-5), TGF- betaRII, TGF-betaRIIb, TGF-betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF- beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, trombina, Ck-1 do timo, hormônio de estimulação da tireoide, Tie, TIMP, TIQ, fator de tecido, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TAC1), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, P55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, P75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR3 TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 P50), TNFRSF6 (Faz Apo-1, APTI, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligante TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK ligante ODF, ligante OPG), TNFSF12 (TWEAK ligan- te Apo-3, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT ligante HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante GITR ligante AITR, TL6), TNFSF1A (Conectina TNF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 ligante gp34, TXGP1), TNFSFS5 (ligante CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante Fas ligante Apo-1, ligante APT1), TNFSF7 (ligante CD27 CD70), TNFSF8 (ligante CD30 CD153), TNFSF9 (ligan- te 4-1BB ligante CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno associado a tumor CA125, antígeno associado a tumor expressando carboidratos associados a Lewis-Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urocinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE- Caderina, VE-Caderina-2, VEGFR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno de vírus, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integri- na, fator von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT76A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL- 17R, IL-20/IL-20R, LDL oxidado, PSCK9, pré-calicreína, RON, TMEM16F, SOD1, Cromogranina A, Cromogranina B, tau, VAP1, qui- ninógeno de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, fator B, fator D, fator H, properdina, escle- rostina, fibrinogênio, fibrina, protrombina, trombina, fator de tecido, fator V, fator Va, fator VII, fator VIIa, fator VIII, fator VIIIa, fator IX, fator IXa, fator X, fator Xa, fator XI, fator XIa, fator XII, fator XIIa, fator XIII, fator XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminogênio, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Sindecam-1, Sinde- cam-2, Sindecam-3, Sindecam-4, LPA e S1P, receptor de acetilcolina, AdipoR1, AdipoR2, ADP ribosil ciclase-1, alfa-4/beta-7 integrina, alfa- 5/beta-1 integrina, alfa-v/beta-6 integrina, alfa-v/beta-1 integrina, ligan- te de angiopoietina-2, Angptl1, Antrax, Caderina, Anidrase carbônica- IX, CD105, CD155, CD158a, CD37, CD49b, CD51, CD70, CD72, Claudina 18, toxina Clostridium defficile, CS1, ligante da proteína tipo Delta 4, DHICA oxidase, ligante de Dickkopf-1, Dipeptidil peptidase IV, EPOR, proteínas F de RSV, Fator Ia, FasL, receptor de Folato alfa, receptor de Glucagon, receptor de peptídeo 1 tipo Glucagon, Glutama- to carboxipeptidase II, GMCSFR, glicoproteína E2 do vírus da Hepatite C, Hepcidina, receptor de IL-17, receptor de IL-22, receptor de IL-23, receptor de IL-3, tirosina cinase Kit, Alfa-2-Glicoproteína Rica em Leu- cina 1 (LRG1), receptor de lisosfingolipídeo, Glicoproteína de membrana OX2, Mesotelina, MET, MICA, MUC-16, glicoproteína associada à Mielina, Neuropilina-1, Neuropilina-2, receptor Nogo, PLXNA1, PLX- NA2, PLXNA3, PLXNA4A, PLXNA4B, PLXNB1, PLXNB2, PLXNB3, PLXNC1, PLXND1, ligante de morte de célula programada 1, Proprote- ína convertase PC9, ligante da glicoproteína P-selectina 1, RAGE, Re- ticulon 4, RF, RON-8, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SE- MA3E, SEMA3F, SEMA3G, SEMA4A, SEMA4B, SEMA4C, SEMA4D, SEMA4F, SEMA4G, SEMA5A, SEMA5B, SEMA6A, SEMA6B, SE- MA6C, SEMA6D, SEMA7A, toxina tipo Shiga II, receptor de Esfingosi- na-1-fosfato 1, ST2, ácido lipoteicoico Staphylococcal, Tenascina, TG2, receptor da Linfoproteína estromal tímica, receptor da superfamí- lia TNF 12A, Glicoproteína de transmembrana NMB, TREM-1, TREM- 2, Glicoproteína de trofoblasto, receptor TSH, TTR, Tubulina e ULBP2; e receptores para hormônio e fatores de crescimento, moléculas que existem em sua forma solúvel e não são ancoradas a células no fluido corporal de organismos. Por exemplo, dentre os receptores, antígenos solúveis presentes no fluido corporal de um organismo devido a algum mecanismo incluindo digestão mediada por protease de receptores ou similar expressos sobre uma superfície celular são também exemplos adequados dos antígenos solúveis da presente invenção. Exemplos de tais moléculas podem incluir a molécula de IL-6R solúvel (J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968) e CD20, bem como CD52 (Br. J. Haemathol. (2003) 123(5), 850-857), descritos aqui. Ainda, não apenas as moléculas inerentemente expressas em um organismo vivo, mas também an- tígenos solúveis existentes no fluido corporal de um organismo, que são moléculas infecciosas tais como príons ou antígenos apresentados por organismos infecciosos tais como vírus ou apresentados em tais organismos são também exemplos dos antígenos solúveis da presente invenção. Exemplos adequados do fluido corporal incluem sangue, plasma, soro, urina, linfa, saliva e fluido da lágrima.
Epítopo
[0698] "Epítopo" significa um determinante antigênico em um antí- geno e se refere a um sítio antigênico ao qual o domínio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação a antígeno aqui apresentada se liga. Desta forma, por exemplo, o epítopo pode ser definido de acordo com sua estrutura. Alternativamente, o epítopo pode ser definido de acordo com a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação a antígeno que reconhece o epítopo. Quando o antígeno é um peptídeo ou polipeptídeo, o epítopo pode ser especificado pelos resíduos de aminoácido que formam o epítopo. Alternativamente, quando o epítopo é uma cadeia de açúcar, o epítopo pode ser especificado por sua estrutura de cadeia de açúcar específica.
[0699] Um epítopo linear é um epítopo que contém um epítopo cu ja sequência de aminoácidos primária é reconhecida. Tal epítopo linear contém, tipicamente, pelo menos três e o mais comumente pelo menos cinco, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 10 ou 6 a 20 amino- ácidos na sua sequência específica.
[0700] Ao contrário do epítopo linear, o "epítopo conformacional" é um epítopo no qual a sequência de aminoácidos primária contendo o epítopo não é o único determinante do epítopo reconhecido (por exemplo, a sequência de aminoácidos primária de um epítopo confor- macional não é necessariamente reconhecida por um anticorpo que define o epítopo). Os epítopos conformacionais podem conter um número maior de aminoácidos em comparação aos epítopos lineares. Um anticorpo que reconhece um epítopo conformacional reconhece a estrutura tridimensional de um peptídeo ou proteína. Por exemplo, quando uma molécula de proteína se dobra e forma uma estrutura tridimensional, as cadeias principais do aminoácido e/ou polipeptídeo que formam um epítopo conformacional ficam alinhados e o epítopo é tornado passível de reconhecimento pelo anticorpo. Os métodos para determinar as conformações do epítopo incluem, por exemplo, crista-lografia de raios X, ressonância magnética nuclear bidimensional, marcação spin de sítio-específica, e ressonância paramagnética de elétrons, mas não são limitados a estes. Vide, por exemplo Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.).
Atividade de ligação
[0701] Exemplos de um método para avaliar a ligação do epitope por uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R são descritos a seguir. De acordo com os exemplos abaixo, os métodos para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno para um antígeno diferente de IL-6R, também podem ser conduzidos apropriadamente.
[0702] Por exemplo, pode-se confirmar se uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo linear na molécula de IL-6R, por exemplo, como mencionado abaixo. Um peptídeo linear que compreende uma sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular de IL-6R é sintetizado para o propósito acima. O peptídeo pode ser sintetizado quimicamente, ou pode ser obtido por técnicas de engenharia genética usando uma região que codifica a sequência de ami- noácidos que corresponde ao domínio extracelular em um cDNA de IL- 6R. Então, uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R é avaliada para sua atividade de ligação a um peptídeo linear que compreende a sequência de ami- noácidos que forma o domínio extracelular. Por exemplo, um peptídeo linear imobilizado pode ser usado como um antígeno por ELISA para avaliar a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno ao peptídeo. Alternativamente, a atividade de ligação a um peptídeo linear pode ser avaliada com base no nível com que o peptídeo linear inibe a ligação da molécula de ligação a antígeno a células que expressam IL- 6R. Estes testes podem demonstram a atividade de ligação da molé-cula de ligação a antígeno ao peptídeo linear.
[0703] Pode-se avaliar se uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo conformacional da seguinte forma. Células que expressam IL-6R são preparadas para o propósito acima. Pode-se determinar se uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo conformacional quando ela se liga fortemente às células que expressam IL-6R mediante contato, mas não se liga substancialmente a um peptídeo linear imobilizado que compreende uma sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular de IL-6R. Na presente invenção, "não se liga substancialmente" significa que a atividade de ligação é 80% ou menos, geralmente, 50% ou menos, de preferência 30% ou menos, e particularmente, de preferência, 15% ou menos em comparação à atividade de ligação às células que expressam IL-6R humano.
[0704] Métodos para avaliar a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R a células que expressam IL-6R incluem, por exemplo, os métodos descritos em Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359420). Especificamente, a avaliação pode ser feita com base no princípio do ELISA ou classificação celular ativada por fluorescência (FACS) usando células que expressam IL-6R como antígeno.
[0705] No formato ELISA, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao an- tígeno de IL-6R às células que expressam IL-6R pode ser avaliada quantitativamente por comparar os níveis de sinal gerado por reação enzimática. Especificamente, uma molécula de ligação a antígeno de teste é adicionada a uma placa de ELISA sobre a qual as células que expressam IL-6R são imobilizadas. Então, a molécula de ligação a an- tígeno de teste ligada às células é detectada usando um anticorpo marcado com enzima que reconhece a molécula de ligação a antígeno de teste. Alternativamente, quando FACS é usado, uma série de diluições de uma molécula de ligação a antígeno de teste é preparada, e o título de ligação do anticorpo para células que expressam IL-6R pode ser determinado para comparar a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno de teste às células que expressam IL-6R.
[0706] A ligação de uma molécula de ligação a antígeno de teste a um antígeno expresso sobre a superfície de células suspensas em tampão ou similares pode ser detectada usando um citômetro de fluxo. Os citômetros de fluxo conhecido incluem, por exemplo, os seguintes dispositivos:
[0707] FACSCanto® II
[0708] FACSAria®
[0709] FACSArray®
[0710] FACSVantage® SE
[0711] FACSCalibur® (todos são nomes comerciais da BD Biosciences)
[0712] EPICS ALTRA HyPerSort
[0713] Cytomics FC 500
[0714] EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
[0715] Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos são nomes comerciais da Beckman Coulter).
[0716] Os métodos preferenciais para avaliar a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R a um antígeno incluem, por exemplo, o seguinte método. Primeiro, células que expressam IL-6R são reagidas com uma molécula de ligação a antígeno de teste, e, então, elas são coradas com um anticorpo secundário marcado com FITC que reconhece a molécula de ligação a antígeno. A molécula de ligação a antígeno de teste é diluída apropriadamente um tampão adequado para preparar a molécula em uma concentração desejada. Por exemplo, a molécula pode ser usada em uma concentração dentro da faixa de 10 μg/ml a 10 ng/ml. Então, a intensidade de fluorescência e a contagem de células são determinadas usando FACSCalibur (BD). A intensidade de fluorescência é obtida por análise usando programa CELL QUEST (BD), isto é, o valor geométrico médio reflete a quantidade de anticorpo ligado às células. Ou seja, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno de teste, que é representada pela quantidade da molécula de ligação a antígeno de teste ligada, pode ser determinada mediante a medição do valor geométrico médio.
[0717] Pode-se avaliar se uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R compartilha um epítopo comum com outra molécula de ligação a antígeno com base na competição entre as duas moléculas pelo mesmo epítopo. A competição entre as moléculas de ligação ao antígeno pode ser detectada por um ensaio de bloqueio cruzado ou similares. Por exemplo, o ensaio ELISA competitivo é um ensaio de bloqueio cruzado de preferência.
[0718] Especificamente, no ensaio de bloqueio cruzado, a proteína IL-6R imobilizada aos poços de uma placa de microtitulação é pré- incubada na presença ou ausência de uma molécula de ligação a antí- geno competidora candidata e, então, uma molécula de ligação a antí- geno de teste é adicionada a isso. A quantidade da molécula de ligação a antígeno de teste ligada à proteína IL-6R nos poços está correlacionada indiretamente com a capacidade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno competidora candidata que compete pela ligação ao mesmo epítopo. Ou seja, quanto maior a afinidade da molécula de ligação a antígeno competidora pelo mesmo epítopo, menor será a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno de teste aos poços revestidos com a proteína IL-6R.
[0719] A quantidade da molécula de ligação a antígeno de teste ligada aos poços através da proteína IL-6R pode ser facilmente determinada através de marcação da molécula de ligação a antígeno antecipadamente. Por exemplo, uma molécula de ligação a antígeno marcada com biotina é medida usando um conjugado de avidi- na/peroxidase e um substrato adequado. Em particular, o ensaio de bloqueio cruzado que usa marcadores de enzima como peroxidase é chamado "ensaio ELISA competitivo". A molécula de ligação a antíge- no também pode ser marcada com outras substâncias de marcação que permitem a detecção ou medição. Especificamente, radiomarca- dores, marcadores fluorescentes, e similares, são conhecidos.
[0720] Quando a molécula de ligação a antígeno competidora candidata pode bloquear a ligação por uma molécula de ligação a an- tígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R em pelo menos 20%, de preferência ao menos 20 a 50%, e mais preferível pelo menos 50% em comparação à atividade de ligação em um experimento de controle conduzido na ausência da molécula de ligação a antígeno competidora, é determinado que a molécula de ligação a antígeno de teste se liga substancialmente ao mesmo epítopo ligado pela molécula de ligação a antígeno competidora, ou compete pela ligação ao mesmo epítopo.
[0721] Quando a estrutura de um epítopo ligado por uma molécula de ligação a antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao an- tígeno de IL-6R já tiver sido identificada, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao antígeno de teste e controle compartilham um epíto- po comum através da comparação das atividades de ligação das duas moléculas de ligação ao antígeno a um peptídeo preparado pela introdução de mutações de aminoácido no peptídeo que forma o epítopo.
[0722] Para medir as atividades de ligação acima, por exemplo, as atividades de ligação das moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle a um peptídeo linear no qual uma mutação é introduzida são comparadas no formato ELISA acima. Além dos métodos ELISA, a atividade de ligação ao peptídeo mutante ligado a uma coluna pode ser determinada por fazer as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle fluírem na coluna, e, então, quantificar a molécula de ligação a antígeno eluída na solução de eluição. Os métodos para ad- sorver um peptídeo mutante a uma coluna, por exemplo, sob a forma de um peptídeo de fusão de GST, são conhecidos.
[0723] Alternativamente, quando o epítopo identificado é um epí-topo conformacional, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle compartilham um epítopo comum por meio do seguinte método. Primeiro, células que expressam IL-6R e células que expressam IL-6R com uma mutação introduzida no epíto- po são preparadas. As moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle são adicionadas a uma suspensão de células preparada por suspender estas células em um tampão adequado, como PBS. A seguir, as suspensões de células são lavadas apropriadamente com um tampão, e um anticorpo marcado com FITC que reconhece as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle é adicionado a elas. A intensidade de fluorescência e o número de células marcadas com o anticorpo marcado são determinados usando FACSCalibur (BD). As moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle são diluídas apropriadamente usando um tampão adequado, e são usadas nas concentrações desejadas. Por exemplo, elas podem ser usadas a uma concentração dentro da faixa de 10 μg/ml a 10 ng/ml. A intensidade de fluorescência é determinada por análise usando programa CELL QUEST (BD), isto é, o valor geométrico médio reflete a quantidade de anticorpo marcado ligado às células. Ou seja, as atividades de ligação das moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle, que são representadas pela quantidade de anticorpo marcado ligado, podem ser determinadas mediante a medição do valor geométrico médio.
[0724] No método acima, pode-se avaliar se uma molécula de li gação a antígeno que "não se liga substancialmente às células que expressam IL-6R mutante", por exemplo, por meio do seguinte método. Primeiro, as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle ligadas às células que expressam IL-6R mutante são marcadas com um anticorpo marcado. Então, a intensidade de fluorescência das células é determinada. Quando FACSCalibur é usado para a detecção da fluorescência por citometria de fluxo, a intensidade de fluorescência determinada pode ser analisada usando o programa CELL QUEST. A partir dos valores médios geométricos na presença e na ausência da molécula de ligação a antígeno, o valor de comparação ^média-Geo) pode ser calculado de acordo com a seguinte fórmula para determinar a proporção de aumento na intensidade de fluorescência como resultado da ligação pela molécula de ligação a antígeno.
[0725] Δmédia-Geo= média-Geo (na presença da molécula de ligação a antígeno)/média-Geo (na ausência da molécula de ligação a antiígeno)
[0726] O valor de comparação da média geométrica (valor da Δmédia-Geo para a molécula de IL-6R mutante) determinado pela análise acima, que reflete a quantidade de uma molécula de ligação a antígeno de teste ligada às células que expressam IL-6R mutante, é comparado com o valor de comparação da Δmédia-Geo que reflete a quantidade da molécula de ligação a antígeno de teste ligada às células que expressam IL-6R. Nesse caso, as concentrações da molécula de ligação a antígeno de teste usadas para determinar os valores de comparação da Δmédia-Geo para células que expressam IL-6R e células que expressam IL-6R mutante são particularmente ajustadas, de preferência, para serem iguais ou substancialmente iguais. Uma molé- cula de ligação a antígeno que foi confirmada como reconhecendo um epítopo em IL-6R é usada como uma molécula de ligação a antígeno de controle.
[0727] Se o valor de comparação da Δmédia-Geo de uma molécula de ligação a antígeno de teste para células que expressam o IL-6R mutante for menor que o valor de comparação da Δmédia-Geo da molécula de ligação a antígeno de teste para células que expressam IL- 6R em pelo menos 80%, de preferência 50%, mais preferível, 30%, e particularmente, de preferência, 15% então, a molécula de ligação a antígeno de teste "não se liga substancialmente às células que expressam IL-6R mutante". A fórmula para determinar o valor da média- Geo (média geométrica) está descrita no guia do usuário do programa CELL QUEST (BD biosciences). Quando a comparação mostra que os valores de comparação são substancialmente equivalentes, pode-se determinar que o epítopo para as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle é o mesmo.
Domínio de ligação ao antígeno
[0728] Na presente invenção, um "domínio de ligação ao antígeno" pode ter qualquer estrutura contanto que ele se ligue a um antígeno de interesse. Tais domínios incluem, de preferência, por exemplo:
[0729] regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anti corpo;
[0730] um módulo de cerca de 35 aminoácidos chamado domínio A que está contido na proteína de membrana celular in vivo Avímero (WO 2004/044011, WO 2005/040229);
[0731] Adnectina contendo o domínio 10Fn3 que se liga à porção de proteína da fibronectina, uma glicoproteína expressa sobre a membrana celular (WO 2002/032925);
[0732] Um aficorpo que é composto por um feixe de três helices com 58 aminoácidos com base na estrutura do domínio de ligação à IgG da proteína A (WO 1995/001937);
[0733] Proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins) que são uma região exposta na superfície molecular das repetições de anquirina (AR) que têm uma estrutura na qual uma subunidade que consiste em uma volta compreendendo 33 resíduos de aminoácido, duas hélices antiparalelas, e um laço é repetidamente empilhada (WO 2002/020565);
[0734] Anticalinas e similares, que são domínios que consistem em quatro alças que suportam um lado de uma estrutura de cilindro composta por oito fitas antiparalelas dispostas circularmente que são altamente conservadas entre as moléculas de lipocalina como lipocali- na associada à gelatinase de neutrófilo (NGAL) (WO 2003/029462); e
[0735] A região côncava formada pela estrutura de folha paralela dentro da estrutura com formato de ferradura constituída por repetições empilhadas do módulo de repetições ricas em leucina (LRR) do receptor de linfócito variável (VLR) que não tem a estrutura da imuno- globulina e é usada no sistema de imunidade adquirida em vertebrados sem mandíbulas como o peixe lampery e congro (WO 2008/016854). Os domínios de ligação ao antígeno preferenciais da presente invenção incluem, por exemplo, aqueles tendo regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo. Os exemplos preferenciais de domínios de ligação ao antígeno incluem "Fv de cadeia única (scFv)", "anticorpo de cadeia única", "Fv", "Fv 2 de cadeia única (scFv2)", "Fab", e "F(ab’)2".
[0736] Os domínios de ligação ao antígeno das moléculas de liga ção ao antígeno da presente invenção podem se ligar a um epítopo idêntico. Tal epítopo pode estar apresentar, por exemplo, em uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, o epítopo pode estar presente na proteína que compreende os aminoácidos nas posições 20 a 365 na sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, cada um dos domínios de ligação ao antígeno das moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção pode se ligar a um epítopo diferente. Na presente invenção, o epítopo diferente pode estar presente, por exemplo, em uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Alternativamente, o epítopo pode estar presente na proteína que compreende os aminoácidos nas posições 20 a 365 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
Especificidade
[0737] "Específico" significa que uma das moléculas que se liga especificamente não mostra qualquer ligação significativa a moléculas que não uma única ou inúmeras moléculas parceiras de ligação. Além disso, "específico" também é usado quando um domínio de ligação ao antígeno é específico para um epítopo particular dentre múltiplos epí- topos em um antígeno. Quando um epítopo ligado por um domínio de ligação ao antígeno está contido em múltiplos antígenos diferentes, as moléculas de ligação ao antígeno contendo o domínio de ligação ao antígeno podem se ligar a vários antígenos que possuem o epítopo.
Anticorpos
[0738] Na presente invenção, "anticorpo" se refere a uma imuno-globulina natural ou uma imunoglobulina produzida por síntese parcial ou completa. Os anticorpos podem ser isolados de fontes naturais como plasma e soro de ocorrência natural, ou sobrenadantes de cultura de hibridomas produtores de anticorpo. Alternativamente, os anticorpos podem ser sintetizados parcial ou completamente usando técnicas como recombinação genética. Os anticorpos preferenciais incluem, por exemplo, anticorpos de um isotipo ou subclasse de imunoglobulina que pertence a isso. As imunoglobulinas humanas conhecidas incluem anticorpos das nove classes a seguir (isotipos): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, e IgM. Destes isotipos, os anticorpos da presente invenção incluem IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Regiões constantes de IgG incluem mutantes naturalmente formados a partir delas. Várias sequências de alótipo devido a polimorfismo genético são descritas em "Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No. 91-3242, para as regiões constantes de anticorpos de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana e qualquer delas pode ser usada na presente invenção. Em particular para a sequência de IgG1 humana, a sequência de aminoácido de posições 356 a 358 (numeração EU) pode ser ou DEL ou EEM.
[0739] Métodos para produzir um anticorpo com a atividade de ligação desejada são conhecidos pelos versados na técnica. Abaixo está um exemplo que descreve um método para produzir um anticorpo que se liga ao IL-6R (anticorpo anti-IL-6R). Anticorpos que se ligam a antígeno diferente de IL-6R também podem ser produzidos de acordo com o exemplo descrito a seguir.
[0740] Os anticorpos anti-IL-6R podem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais usando métodos conhecidos. Os anticorpos anti-IL-6R produzidos são, de preferência, anticorpos monoclo- nais derivados de mamíferos. Tais anticorpos monoclonais derivados de mamífero incluem anticorpos produzidos por hibridomas ou células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que transporta um gene do anticorpo por técnicas de engenharia genética. "Anticorpos humanizados" ou "anticorpos quiméricos" estão incluídos nos anticorpos monoclonais da presente invenção.
[0741] Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal podem ser produzidos usando técnicas conhecidas, por exemplo, conforme descrito abaixo. Especificamente, mamíferos são imunizados por métodos de imunização convencionais usando uma proteína IL-6R como um antígeno de sensibilização. As células imunes resultantes são fundidas com células parentais conhecidas por métodos de fusão celular convencionais. Então, os hibridomas que produzem um anticorpo anti- IL-6R podem ser selecionados por avaliação das células produtoras de anticorpo monoclonal usando métodos de avaliação convencionais.
[0742] Especificamente, os anticorpos monoclonais são preparados conforme mencionado abaixo. Primeiro, o gene de IL-6R cuja sequência de nucleotídeos é revelada na SEQ ID NO: 2 pode ser expresso para produzir uma proteína IL-6R mostrada na SEQ ID NO: 1, que será usada como um antígeno de sensibilização para a preparação do anticorpo. Ou seja, uma sequência gênica que codifica IL-6R é inserida em um vetor de expressão de conhecido, e as células hospedeiras adequadas são transformadas com este vetor. A proteína IL-6R humana desejada é purificada a partir das células hospedeiras ou seus sobrenadantes de cultura por métodos conhecidos. De modo a obter IL-6R solúvel a partir dos sobrenadantes de cultura, por exemplo, uma proteína que consiste nos aminoácidos nas posições 1 a 357 na sequência de polipeptídeos de IL-6R da SEQ ID NO: 15, tal como descrito em Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), é expressa como um IL-6R solúvel, ao invés da proteína IL-6R da SEQ ID NO: 1. A proteína IL-6R natural purificada também pode ser usada como um antígeno de sensibilização.
[0743] A proteína IL-6R purificada pode ser usada como um antí-geno de sensibilização para imunização de mamíferos. Um peptídeo de IL-6R parcial pode, também, ser usada como um antígeno de sensibilização. Nesse caso, um peptídeo parcial pode ser preparado por síntese química com base na sequência de aminoácidos do IL-6R humano, ou por inserir um gene IL-6R parcial em um vetor de expressão para expressão. Alternativamente, um peptídeo parcial pode ser produzido por degradar uma proteína IL-6R com uma protease. O comprimento e a região do peptídeo de IL-6R parcial não se limitam a modalidades específicas. Uma região preferencial pode ser selecionada arbitrariamente a partir da sequência de aminoácidos nas posições de aminoácido 20 a 357 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. O número de aminoácidos que formam um peptídeo a ser usado como um antígeno de sensibilização é, de preferência, pelo menos cinco ou mais, seis ou mais, ou sete ou mais. Mais especificamente, um peptí- deo com 8 a 50 resíduos, mais preferível, 10 a 30 resíduos pode ser usado como um antígeno de sensibilização.
[0744] Para o antígeno de sensibilização, alternativamente, é possível usar uma proteína de fusão preparada por fundir um polipeptídeo ou peptídeo parcial desejado da proteína IL-6R com um polipeptídeo diferente. Por exemplo, fragmentos Fc do anticorpo e marcadores de peptídeo são usados, de preferência, para produzir proteínas de fusão a serem usadas como antígenos de sensibilização. Os vetores para expressão de tais proteínas de fusão podem ser construídos por fundir na estrutura genes que codificam dois ou mais fragmentos do polipep- tídeo desejado e inserir o gene de fusão em um vetor de expressão, conforme descrito acima. Métodos para produzir proteínas de fusão são descritos em Molecular Cloning 2a ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Os métodos para preparar IL-6R para ser usada como um antígeno de sensibilização, e métodos de imunização usando IL-6R são descritos especificamente nos WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693, e similares.
[0745] Não há limitação específica aos mamíferos a serem imunizados com o antígeno de sensibilização. Entretanto, é preferencial selecionar os mamíferos por considerar sua compatibilidade com as células progenitoras a serem usadas para a fusão celular. Em geral, roedores como camundongos, ratos, e hamsters, coelhos, e macacos são preferencialmente usados.
[0746] Os animais acima são imunizados com um antígeno de sensibilização através de métodos conhecidos. Em geral, os métodos de imunização realizados incluem, por exemplo, a injeção intraperitoneal ou subcutânea de um antígeno de sensibilização nos mamíferos. Especificamente, um antígeno de sensibilização é diluído apropriadamente com PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina fisiológica, ou similares. Se for desejado, um adjuvante convencional como adjuvante completo de Freund é misturado com o antígeno, e a mistura é emulsionada. A seguir, o antígeno de sensibilização é administrado a um mamífero várias vezes em intervalos de 4 a 21 dias. Veículos adequados podem ser usados na imunização com o antí- geno de sensibilização. Em particular, quando um peptídeo parcial de baixo peso molecular é usado como o antígeno de sensibilização, é algumas vezes desejável acoplar o peptídeo do antígeno de sensibilização a uma proteína carreadora como albumina ou hemocianina da lapa californiana para a imunização.
[0747] Alternativamente, hibridomas que produzem um anticorpo desejado podem ser preparados usando imunização com DNA, como mencionado abaixo. A imunização com DNA é um método de imunização que confere estimulação imunológica mediante expressão de um antígeno de sensibilização em um animal imunizado como um resultado da administração de um vetor de DNA construído para permitir a expressão de um gene que codifica a proteína do antígeno no animal. Em comparação aos métodos de imunização convencionais nos quais um antígeno proteico é administrado aos animais a serem imunizados, espera-se que a imunização com DNA seja superior em que:
[0748] - estimulação imunológica pode ser fornecida enquanto se mantém a estrutura de uma proteína membrânica como IL-6R; e
[0749] - não há necessidade de purificar o antígeno para imunização.
[0750] De modo a preparar um anticorpo monoclonal da presente invenção usando imunização com DNA, primeiro, um DNA que expressa uma proteína IL-6R é administrado a um animal a ser imunizado. O DNA que codifica IL-6R pode ser sintetizado por métodos conhecidos como PCR. O DNA obtido é inserido em um vetor de expressão adequado, e, então, ele é administrado a um animal a ser imunizado. De preferência, os vetores de expressão usados incluem, por exemplo, vetores de expressão disponíveis comercialmente como pcDNA3.1. Os vetores podem ser administrados a um organismo usando métodos convencionais. Por exemplo, a imunização com DNA é feita pelo uso de uma arma de genes para introduzir as partículas de ouro revestidas com vetor de expressão em células no corpo de um animal a ser imunizado. Os anticorpos que reconheceram IL-6R também podem ser produzidos pelos métodos descritos no WO 2003/104453.
[0751] Após imunizar um mamífero, conforme descrito acima, o aumento no título de um anticorpo de ligação a IL-6R é confirmado no soro. A seguir, as células imunes são coletadas do mamífero, e, então, submetidas à fusão celular. Em particular, esplenócitos são usados, de preferência, como células imunes.
[0752] Uma célula de mieloma de mamífero é usada como uma célula a ser fundida com as células imunes acima mencionadas. As células de mieloma compreendem, de preferência, um marcador de seleção adequado para avaliação. Um marcador de seleção confere características às células para sua sobrevivência (ou morte) sob uma condição de cultura específica. Deficiência em hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (deste ponto em diante no presente documento, abreviada como deficiência de HGPRT) e deficiência em timidina qui- nase (deste ponto em diante no presente documento, abreviada como deficiência de TK) são conhecidos como marcadores de seleção. Células com deficiência de HGPRT ou TK têm sensibilidade à hipoxantina- aminopterina-timidina (deste ponto em diante no presente documento, abreviada como sensibilidade à HAT). As células sensíveis à HAT não sintetizam o DNA em um meio de seleção com HAT e são então mortas. Entretanto, quando as células são fundidas com células normais, elas podem continuar a síntese de DNA usando a via de salvamento das células normais e, portanto, elas podem crescer mesmo no meio de seleção de HAT.
[0753] As células deficientes em HGPRT e deficientes em TK podem ser selecionadas em um meio contendo 6-tioguanina, 8- azaguanina (deste ponto em diante no presente documento abreviada como 8AG), ou 5’-bromodeoxiuridina, respectivamente. As células normais são mortas porque elas incorporam estes análogos de pirimi- dina no seu DNA. Entretanto, células que são deficientes nestas enzimas podem sobreviver no meio de seleção, uma vez que elas não podem incorporar estes análogos de pirimidina. Além disso, um marcador de seleção chamado de resistência à G418 fornecido pelo gene de resistência à neomicina confere resistência aos antibióticos de 2- desoxiestreptamina (análogos de gentamicina). Diversos tipos de células de mieloma que são adequadas para fusão celular são conhecidos.
[0754] Por exemplo, células de mieloma que incluem as seguintescélulas podem ser preferencialmente usadas:
[0755] P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548 1550);
[0756] P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immuno logy (1978)81, 1-7);
[0757] NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519);
[0758] MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415);
[0759] SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270);
[0760] FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21);
[0761] S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323);
[0762] R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.
[0763] Fusões celulares entre os imunócitos e células de myeloma são essencialmente executadas usando métodos conhecidos, por exemplo, um método de Kohler e Milstein e outros (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
[0764] Mais especificamente, a fusão celular pode ser executada, por exemplo, em um meio de cultura convencional na presença de um agente promotor de fusão celular. Os agentes promotores de fusão incluem, por exemplo, polietileno glicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ). Se necessário, uma substância auxiliar como sulfóxido de dimetila também é adicionada para aprimorar a eficiência da fusão.
[0765] A razão entre as células imunes e as células de myeloma pode ser determinada como desejado, de preferência, por exemplo, uma célula de mieloma para cada um a dez imunócitos. Os meios de cultura a serem usados para as fusões celulares incluem, por exemplo, meios que são adequados para o cultivo de linhagens celulares de mi- eloma, como meio RPMI1640 e meio MEM, e outro meio de cultura convencional usado para este tipo de cultura celular. Além disso, suplemento de soro como soro fetal de bovino (FSB) pode ser adicionado, de preferência, ao meio de cultura.
[0766] Para a fusão celular, quantidades predeterminadas das células imunes acima e células de mieloma são bem misturadas no meio de cultura acima. A seguir, uma solução de PEG (por exemplo, o peso molecular médio é cerca de 1.000 a 6.000) preaquecida para cerca de 37°C é adicionada a isto a uma concentração de geralmente 30% a 60% (p/v). Isto é suavemente misturado para produzir as células de fusão desejadas (hibridomas). A seguir, um meio de cultura adequado acima mencionado é adicionado gradualmente às células, e ele é centrifugado repetidamente para remover o sobrenadante. Desta forma, agentes de fusão celular e similares que são desfavoráveis para o crescimento do hibridoma podem ser removidos.
[0767] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados por cultura usando um meio seletivo convencional, por exemplo, meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Células diferentes dos hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas por cultura contínua no meio HAT acima por um período de tempo suficiente. Tipicamente, o período é vários dias a várias semanas. A seguir, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos convencionais de diluição limitante.
[0768] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados usando um meio de seleção com base no marcador de seleção possuído pelo mieloma usado para a fusão celular. Por exemplo, células deficientes em HGPRT ou TK podem ser selecionadas por cultura usando o meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopteri- na, e timidina). Especificamente, quando as células de mieloma sensíveis a HAT são usadas para a fusão celular, as células fundidas de forma bem-sucedida com as células normais podem proliferar seletivamente no meio HAT. Células diferentes dos hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas por cultura contínua no meio HAT acima por um período de tempo suficiente. Especificamente, os hibridomas desejados podem ser selecionados por cultura geralmente por vários dias até várias semanas. A seguir, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos convencionais de diluição limitante.
[0769] Os anticorpos desejados podem ser, de preferência, selecionados e clonados isoladamente por métodos de avaliação com base na reação antígeno/anticorpo conhecida. Por exemplo, um anticorpo monoclonal ligação a IL-6R pode se ligar a IL-6R expressa sobre a superfície celular. Tal anticorpo monoclonal pode ser selecionado por seleção de célula ativada por fluorescência (FACS). O FACS é um sistema que avalia a ligação de um anticorpo a uma superfície celular pela análise das células colocadas em contato com um anticorpo fluorescente usando um feixe de laser, e medindo a fluorescência emitida pelas células individuais.
[0770] Para avaliar hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal da presente invenção por FACS, células que expressam IL-6R são primeiro preparadas. As células preferencialmente usadas para a seleção são células de mamífero nas quais a IL-6R é expressa de forma forçada. Como controle, a atividade de um anticorpo de se ligar a IL-6R da superfície celular pode ser detectada seletivamente usando células de mamífero não transformadas como células hospedeiras. Especificamente, hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal anti-IL-6R podem ser isolados pela seleção de hibridomas que produzem um anticorpo que se liga às células forçadas a expressar IL-6R, mas não às células hospedeiras.
[0771] Alternativamente, a atividade de um anticorpo de se ligar às células que expressam IL-6R imobilizadas pode ser avaliada com base no princípio do ELISA. Por exemplo, células que expressam IL-6R são imobilizadas aos poços de uma placa de ELISA. Os sobrenadantes de cultura dos hibridomas são colocados em contato com as células imobilizadas nos poços, e os anticorpos que se ligam às células imobilizadas são detectados. Quando os anticorpos monoclonais são derivados de camundongo, anticorpos ligados às células podem ser detectados usando um anticorpo de imunoglobulina anticamundongo. Os hibrido- mas que produzem um anticorpo desejado que possui a capacidade de ligação ao antígeno são selecionados pela avaliação acima, e eles podem ser clonados por um método de diluição limitante ou similares.
[0772] Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal assimpreparados podem ser subcultivados em um meio de cultura conven- cional, e armazenados em nitrogênio líquido durante um longo período.
[0773] Os hibridomas acima são cultivados por um método convencional, e os anticorpos monoclonais desejados podem ser preparados a partir dos sobrenadantes de cultura. Alternativamente, os hibri- domas são administrados e cultivados em mamíferos compatíveis, e os anticorpos monoclonais são preparados a partir da ascite. O método anterior é adequado para preparar anticorpos com alta pureza.
[0774] Anticorpos codificados por genes de anticorpo que são clo- nados a partir de células que produzem anticorpos como os hibrido- mas acima também podem ser preferencialmente usados. Um gene de anticorpo clonado é inserido em um vetor adequado, e ele é introduzido em um hospedeiro para expressar o anticorpo codificado pelo gene. Os métodos para isolar genes de anticorpo, inserir os genes em vetores, e transformar células hospedeiras já foram estabelecidos, por exemplo, por Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767775). Métodos para produzir anticorpos recombinantes também são conhecidos, conforme descrito abaixo.
[0775] Por exemplo, um cDNA que codifica a região variável (região V) de um anticorpo anti-IL-6R é preparado a partir de células de hibridoma que expressam o anticorpo anti-IL-6R. Para este propósito, o RNA total é primeiro extraído dos hibridomas. Os métodos usados para a extração de mRNAs das células incluem, por exemplo:
[0776] - o método de ultracentrifugação de guanidina (Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299), e
[0777] - o método de AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156159)
[0778] Os mRNAs extraídos podem ser purificados usando o kit de purificação de mRNA (GE Healthcare Bioscience) ou similares. Alter-nativamente, kits para extrair mRNA total diretamente das células, co- mo o kit de purificação de mRNA QuickPrep (GE Healthcare Bioscience) também são comercialmente disponíveis. Os mRNAs podem ser preparados a partir de hibridomas que usam tais kits. Os cDNAs que codificam a região V do anticorpo podem ser sintetizados a partir dos mRNAs preparados usando uma transcriptase reversa. Os cDNAs podem ser sintetizados usando o kit de síntese de cDNA primeira fita de transcriptase reversa AMV (Seikagaku Co.) ou similares. Além disso, o kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech) e o método 5’- RACE baseado em PCR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) podem ser apropriadamente usados para sintetizar e amplificar cDNAs. Em tal processo de síntese de cDNA, os sítios de enzima de restrição adequados descritos a seguir podem ser introduzidos em ambas as extremidades de um cDNA.
[0779] O fragmento de cDNA de interesse é purificado a partir do produto de PCR resultante, e, então, ele é ligado a um DNA vetor. O vetor recombinante é então construído, e introduzido em E. coli ou similares. Após seleção de colônia, o vetor recombinante desejado pode ser preparado a partir da E. coli formadora de colônia. A seguir, testa- se se o vetor recombinante tem a sequência de nucleotídeos de cDNA de interesse por um método conhecido como o método de terminação de cadeia com nucleotídeo didesóxi.
[0780] O método 5’-RACE que usa iniciadores para amplificar o gene da região variável é usado convenientemente para isolar o gene que codifica a região variável. Primeiro, uma biblioteca de cDNA 5’- RACE é construída por síntese de cDNA usando RNAs extraídos de células de hibridoma como um molde. Um kit disponível para comercialização como o kit de amplificação de cDNA SMART RACE é usado apropriadamente para sintetizar a biblioteca de cDNA 5’-RACE.
[0781] O gene do anticorpo é amplificado por PCR usando a biblio- teca de cDNA 5’-RACE preparada como um molde. Iniciadores para amplificar o gene de anticorpo de camundongo podem ser projetados com base em sequências do gene do anticorpo conhecidas. As sequências de nucleotídeos dos iniciadores variam dependendo da subclasse de imunoglobulina. Portanto, é preferencial que a subclasse seja determinada com antecedência usando um kit disponível para co-mercialização como o kit para isotipagem de anticorpo monoclonal de camundongo Iso Strip (Roche Diagnostics).
[0782] Especificamente, por exemplo, iniciadores que permitem a amplificação de genes que codificam as cadeias pesadas y1, Y2a, Y2b, e Y3 e as cadeias leves K e Y são usados para isolar genes que codificam IgG de camundongo. Em geral, um iniciador que anela a um sítio da região constante próximo da região variável é usado como um iniciador do lado 3’ para amplificar um gene da região variável de IgG. Entretanto, um iniciador ligado a um kit de construção da biblioteca de cDNA 5’ RACE é usado como um iniciador do lado 5’.
[0783] Os produtos de PCR assim amplificados são usados para reformar as imunoglobulinas compostas de uma combinação de cadeias pesadas e leves. Um anticorpo desejado pode ser selecionado usando a atividade de ligação de IL-6R de uma imunoglobulina reformada como um indicador. Por exemplo, quando o objetivo é isolar um anticorpo contra IL-6R, é mais preferencial que a ligação do anticorpo a IL-6R seja específica. Um anticorpo ligação a IL-6R pode ser selecionado, por exemplo, por uma das seguintes etapas:
[0784] colocar uma célula que expressa IL-6R em contato com um anticorpo que compreende a região V codificada por um cDNA isolado de um hibridoma;
[0785] detectar a ligação do anticorpo à célula que expressa IL-6R; e
[0786] selecionar um anticorpo que se liga à célula que expressa IL-6R.
[0787] Métodos para detectar a ligação de um anticorpo a células que expressam IL-6R são conhecidos. Especificamente, a ligação de um anticorpo a células que expressam IL-6R pode ser detectada pelas técnicas descritas acima como FACS. As amostras imobilizadas de células que expressam IL-6R são usadas apropriadamente para avaliar a atividade de ligação de um anticorpo.
[0788] Os métodos de avaliação de anticorpos preferenciais que usam a atividade de ligação como um indicador incluem, também, métodos de separação usando vetores de fago. Os métodos de avaliação usando vetores de fago são vantajosos quando os genes de anticorpo são isolados a partir de bibliotecas das subclasses de cadeia pesada e cadeia leve de uma população de células que expressa um anticorpo policlonal. Os genes que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve podem ser ligados por uma sequência ligante adequada para formar um Fv de cadeia única (scFv). Os fagos que apresentam scFv na sua superfície podem ser produzidos por inserir um gene que codifica scFv em um vetor de fago. Os fagos são colocados em contato com um antígeno de interesse. Então, um codificação de DNA scFv que tem a atividade de ligação de interesse pode ser isolado por coletar os fagos ligados ao antígeno. Este processo pode ser repetido conforme necessário para enriquecer o scFv que tem a atividade de ligação de interesse.
[0789] Após o isolamento do cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-IL-6R de interesse, o cDNA é digerido com enzimas de restrição que reconhecem os sítios de restrição introduzidos em ambas as extremidades do cDNA. As enzimas de restrição preferenciais reconhecem e clivam uma sequência de nucleotídeos que ocorre na sequência de nucleotídeos do gene do anticorpo em uma baixa frequência. Além disso, um sítio de restrição para uma enzima que pro- duz uma extremidade adesiva é introduzido, de preferência, em um vetor para inserir um fragmento digerido de cópia única na orientação correta. O cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-IL-6R é digerido conforme descrito acima, e ele é inserido em um vetor de expressão adequado para construir um vetor de expressão do anticorpo. Nesse caso, se um gene que codifica a região constante do anticorpo (região C) e um gene que codifica a região V acima forem fundidos na estrutura na estrutura, um anticorpo quimérico é obtido. Na presente invenção, "anticorpo quimérico" significa que a origem da região constante é diferente daquela da região variável. Desta forma, em adição aos anticorpos heteroquiméricos de camundongo/seres humanos, an-ticorpos aloquiméricos humano/humano estão incluídos nos anticorpos quiméricos da presente invenção. Um vetor de expressão de anticorpo quimérico pode ser construído por inserir o gene da região V acima em um vetor de expressão que já tem a região constante. Especificamente, por exemplo, uma sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição que corta o gene da região V acima pode ser apropriadamente colocada no lado 5’ de um vetor de expressão que transporta um DNA que codifica uma região constante (região C) desejada do anticorpo . Um vetor de expressão de anticorpo quimérico é construído por fundir na estrutura os dois genes digeridos com a mesma combinação de enzimas de restrição.
[0790] Para produzir um anticorpo monoclonal anti-IL-6R, os genes do anticorpo são inseridos em um vetor de expressão para que os genes sejam expressos sob o controle de uma região reguladora da expressão. A região reguladora da expressão para expressão do anticorpo inclui, por exemplo, intensificadores e promotores. Além disso, uma sequência de sinal adequada pode ser ligada à terminação amino para que o anticorpo expresso seja secretado para o lado de fora das células. Nos exemplos descritos abaixo, um peptídeo que tem a se- quência de aminoácidos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 113) pode ser usado como uma sequência de sinal. Entretanto, outras sequências de sinal adequadas podem ser ligadas. O polipeptídeo expresso é clivado na terminação carboxila da sequência acima, e o po- lipeptídeo resultante é secretado para o lado de fora das células como um polipeptídeo maduro. Então, as células hospedeiras adequadas são transformadas com o vetor de expressão, e células recombinantes que expressam o DNA que codifica o anticorpo anti-IL-6R são obtidas.
[0791] Os DNAs que codificam a cadeia pesada do anticorpo (cadeia H) e a cadeia leve (cadeia L) são inseridos separadamente em diferentes vetores de expressão para expressar o gene do anticorpo. Uma molécula de anticorpo que tem as cadeias H e L pode ser expressa por co-transfectar a mesma célula hospedeira com vetores nos quais os genes da cadeia H e da cadeia L são inseridos, respectivamente. Alternativamente, as células hospedeiras podem ser transformadas com um único vetor de expressão no qual os DNAs que codificam as cadeias H e L são inseridos (consulte WO 1994/011523).
[0792] Há várias combinações de célula hospedeira/vetor de expressão conhecidas para a preparação de anticorpos por introduzir genes de anticorpos isolados em hospedeiros adequados. Todos estes sistemas de expressão são aplicáveis ao isolamento dos domínios de ligação ao antígeno da presente invenção. As células eucarióticas adequadas usadas como células hospedeiras incluem células animais, células vegetais, e células fúngicas. Especificamente, as células animais incluem, por exemplo, as seguintes células.
[0793] células de mamífero: CHO, COS, mieloma, rim de hamster jovem (BHK), HeLa, Vero, rim embriônico humano (HEK) 293, FreeS- tyle®293 ou similares;
[0794] células de anfíbio: oócitos de Xenopus, ou similares; e
[0795] células de inseto: sf9, sf21, Tn5 ou similares.
[0796] Além disso, como uma célula vegetal, um sistema de expressão gênica de anticorpo que usa células derivadas do gênero Ni- cotiana, como Nicotiana tabacum, é conhecido. Células cultivadas do calo podem ser usadas apropriadamente para transformar células vegetais.
[0797] Além disso, as seguintes células podem ser usadas como células fúngicas:
[0798] leveduras: o gênero Saccharomyces, como Saccharomyces serevisiae, e o gênero Pichia, como Pichia pastoris; e
[0799] fungos filamentosos: o gênero Aspergillus, como Asper gillus niger.
[0800] Além disso, os sistemas de expressão de genes de anticor po que utilizam células procarióticas também são conhecidos. Por exemplo, quando se usa células bacterianas, células de E. coli, células de Bacillus subtilis, e similares, podem ser adequadamente utilizadas na presente invenção. Vetores de expressão transportando os genes de anticorpo de interesse são introduzidos nestas células por transfec- ção. As células transfectadas são cultivadas in vitro, e o anticorpo desejado pode ser preparado a partir da cultura de células transformadas.
[0801] Além das células hospedeiras descritas acima, animais transgênicos também podem ser usados para produzir um anticorpo recombinante. Ou seja, o anticorpo pode ser obtido a partir de um animal no qual o gene que codifica o anticorpo de interesse é introduzido. Por exemplo, o gene de anticorpo pode ser construído como um gene de fusão por inserção na estrutura em um gene que codifica uma proteína produzida especificamente no leite. β-caseina de cabra ou similares pode ser usada, por exemplo, como a proteína secretada no leite. Os fragmentos de DNA contendo o gene fundido inserido com o gene do anticorpo são injetados em um embrião de cabra, e, então, este embrião é introduzido em uma cabra fêmea. Os anticorpos desejados podem ser obtidos como uma proteína fundida com a proteína do leite a partir do leite produzido pela cabra transgênica nascida da cabra receptora do embrião (ou sua progênie). Além disso, para aumentar o volume de leite contendo o anticorpo desejado produzido pela cabra transgênica, hormônios podem ser administrados à cabra transgênica, como necessário (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).
[0802] Quando uma molécula de ligação a antígeno descrita aqui é administrada a um ser humano, um domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo geneticamente recombinante que foi modificado artificialmente para reduzir a antigenicidade heteróloga contra um ser humano e similares, pode ser usada apropriadamente como o domínio de ligação ao antígeno da molécula. Tais anticorpos geneticamente recombinantes incluem, por exemplo, anticorpos humanizados. Estes anticorpos modificados são produzidos apropriadamente por métodos conhecidos.
[0803] Uma região variável do anticorpo usada para produzir o domínio de ligação ao antígeno de molécula de ligação a antígeno descrita aqui é formada geralmente por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que são separadas por quatro regiões estruturais (FRs). A CDR é uma região que determina substancialmente a especificidade de ligação de um anticorpo. As sequências de amino- ácidos das CDRs são altamente diversas. Por outro lado, as sequências de aminoácidos formadoras de FR têm frequentemente alta identidade mesmo entre anticorpos com diferentes especificidades de ligação. Portanto, geralmente, a especificidade de ligação de um determinado anticorpo pode ser introduzida em outro anticorpo por enxertia de CDR.
[0804] Um anticorpo humanizado também é chamado de anticorpo humano reformado. Especificamente, os anticorpos humanizados preparados por enxertia da CDR de um anticorpo animal não humano, como um anticorpo de camundongo a um anticorpo humano e similares, são conhecidos. Técnicas de engenharia genética comuns para se obter anticorpos humanizados também são conhecidas. Especificamente, por exemplo, PCR por extensão de sobreposição é conhecida como um método para enxertar uma CDR de anticorpo de camundongo em uma FR humana. Na PCR por extensão de sobreposição, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma CDR de anticorpo de camundongo a ser enxertada é adicionada a iniciadores para sintetizar uma FR de anticorpo humano. Os iniciadores são preparados para cada uma das quatro FRs. Geralmente se considera que quando se enxerta uma CDR de camundongo em uma FR humana, selecionar uma FR humana que tem alta identidade a uma FR de camundongo é vantajoso para manter a função da CDR. Ou seja, é geralmente preferencial usar uma FR humana que compreende uma sequência de amino- ácidos que tem alta identidade à sequência de aminoácidos da FR adjacente à CDR de camundongo a ser enxertada.
[0805] As sequências de nucleotídeos a serem ligadas são projetadas de modo a estarem conectadas umas às outras na estrutura. As FRs humanas são sintetizadas individualmente usando os respectivos iniciadores. Como resultado, são obtidos produtos nos quais o DNA que codifica a CDR de camundongo é ligado aos DNAs que codificam a FR individual. Sequências de nucleotídeos que codificam a CDR de camundongo de cada produto são projetadas para que elas se sobreponham umas com as outras. A seguir, uma reação de síntese de fita complementar é conduzida para anelar a CDR sobreposta dos produtos sintetizados usando um gene de anticorpo humano como molde. As FRs humanas são ligadas através das sequências de CDR de camundongo por esta reação.
[0806] O gene da região V de extensão completa, no qual três CDRs e quatro FRs são essencialmente ligadas, é amplificado usando iniciadores que anelam com a sua extremidade 5’ ou 3’, que são adicionados com sequências de reconhecimento de enzimas de restrição adequadas. Um vetor de expressão para um anticorpo humanizado pode ser produzido por inserir o DNA obtido conforme descrito acima e um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano em um vetor de expressão para que eles se liguem na estrutura. Após o vetor re- combinante ser transfectado para um hospedeiro para estabelecer as células recombinantes, as células recombinantes são cultivadas, e o DNA que codifica o anticorpo humanizado é expresso para produzir o anticorpo humanizado na cultura celular (vide publicação de Patente europeia N° EP 239400 e Publicação de Patente internacional No. WO 1996/002576).
[0807] Ao medir qualitativamente ou quantitativamente e avaliar a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo humanizado produzido conforme descrito acima, pode-se selecionar adequadamente FRs de anticorpo humano que permitem que as CDRs formem um sítio de ligação ao antígeno favorável quando ligados através das CDRs. Os resíduos de aminoácido nas FRs podem ser substituídos como necessário, para que as CDRs de um anticorpo humano reformado formem um sítio de ligação ao antígeno adequado. Por exemplo, mutações na sequência de aminoácidos podem ser introduzidas nas FRs por aplicar o método de PCR usado para enxertar uma CDR de camundongo em uma FR humana. Mais especificamente, mutações parciais na sequência de nucleotídeos podem ser introduzidas em iniciadores que anelam à FR. Mutações na sequência de nucleotídeos são introduzidas nas FRs sintetizadas pelo uso de tais iniciadores. As sequências de FR mutantes que possuem as características desejadas podem ser selecionadas mediante a medição e avaliação da atividade do anticor- po mutante com aminoácido substituído para se ligar ao antígeno pelo método acima mencionado (Cancer Res. (1993) 53: 851-856).
[0808] Alternativamente, os anticorpos humanos desejados podem ser obtidos pela imunização de animais transgênicos que possuem todo o repertório de genes de anticorpos humanos (consulte WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) por imunização com DNA.
[0809] Além disso, técnicas para preparar anticorpos humanos por separação usando bibliotecas de anticorpos humanos também são co-nhecidas. Por exemplo, a região V de um anticorpo humano é expressa como um anticorpo de cadeia única (scFv) na superfície do fago pelo método de apresentação em fago. Os fagos que expressam um scFv que se liga ao antígeno podem ser selecionados. A sequência de DNA que codifica a região V do anticorpo humano que se liga ao antí- geno pode ser determinada através da análise dos genes dos fagos selecionados. A sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno é determinada. Um vetor de expressão é preparado por fundir a sequência da região V na estrutura com a sequência da região C de um anticorpo humano desejado, e inserir isto em um vetor de expressão adequado. O vetor de expressão é introduzido em células adequadas para expressão, como aquelas descritas acima. O anticorpo humano pode ser produzido por expressão do gene que codifica o anticorpo humano nas células. Estes métodos já são conhecidos (consulte WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).
[0810] Em adição às técnicas descritas acima, técnicas de clonagem de células B (identificação de cada sequência codificante do anticorpo, clonagem e seu isolamento; uso na construção do vetor de expressão de modo a preparar cada anticorpo (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, em particular); e similares) tal como descrito em Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) ou no WO 2008/081008 podem ser apropriadamente usadas para isolar os genes de anticorpo.
Sistema de numeração EU e sistema de numeração Kabat
[0811] De acordo com os métodos usados na presente invenção,as posições de aminoácido atribuídas à CDR e à FR do anticorpo são especificadas de acordo com a numeração de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991)). Na presente invenção, quando uma molécula de ligação a antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, os aminoácidos da região variável são indicados de acordo com o sistema de numeração de Kabat, enquanto os aminoá- cidos da região constante são indicados de acordo com o sistema de numeração EU com base nas posições de aminoácido de Kabat.
Condições de concentração de íon Condições de concentração de íon de metal
[0812] Em uma modalidade da presente invenção, a concentração de íon se refere a uma concentração de íon de metal. "Íons de metal" se refere a íons de elementos do grupo I exceto hidrogênio tais como metais alcalinos e elementos do grupo cobre, elementos do grupo II tais como metais alcalinoterrosos e elementos do grupo zinco, elementos do grupo III exceto boro, elementos do grupo IV exceto carbono e silício, elementos do grupo VIII tal como grupo ferro e elementos do grupo platina, elementos pertencentes ao subgrupo A de grupos V, VI e VII, e elementos de metal tais como antimônio, bismuto e polônio. Átomos de metal têm a propriedade de liberação de elétrons de valência para se tornarem cátions. Isso é referido como tendência à ioniza-ção. Metais com tendência à ionização forte são considerados ser quimicamente atraentes.
[0813] Na presente invenção, íons de metal preferidos incluem, por exemplo, íon de cálcio. Íon de cálcio está envolvido em modulação de muitos fenômenos biológicos, incluindo contração de músculos tais como músculos esqueletal, liso e cardíaco; ativação de movimento, fagocitose e similar de leucócitos; ativação de mudança de formato, secreção e similar de plaquetas; ativação de linfócitos; ativação de mastócitos incluindo secreção de histamina; respostas celulares mediadas por receptor α de catecolamina ou receptor de acetilcolina; exoci- tose; liberação de substâncias transmissoras dos terminais de neurônio; e fluxo axoplásmico em neurônios. Receptores de íon de cálcio intracelulares conhecidos incluem troponina C, calmodulina, parvalbu- mina e cadeia leve da miosina, que têm vários sítios de ligação de íon de cálcio e são acreditados ser derivados de uma origem comum em termos de evolução molecular. Há também muitos motivos de ligação de cálcio conhecidos. Tais motivos bem conhecidos incluem, por exemplo, domínios de caderina, EF-hand de calmodulina, domínio C2 de Proteína cinase C, domínio Gla de Fator IX de proteína de coagulação sanguínea, lectinas tipo C de receptor aciaroglicoproteína e receptor de ligação à manose. Um domínio de receptores LDL, anexina, domínio tipo 3 de trombospondina e domínios tipo EGF.
[0814] Na presente invenção, quando o íon de metal é íon de cálcio, as condições de concentração de íon de cálcio incluem concentrações de íon de cálcio baixas e concentrações de íons de cálcio altas. "A atividade de ligação varia dependendo das concentrações de íons de cálcio" significa que a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno varia devido à diferença nas condições entre concentrações de íon de cálcio baixa e alta. Por exemplo, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser maior em uma concentração de íon de cálcio alta do que em uma concentração de íon de cálcio baixa. Alternativamente, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser maior em uma concentração de íon de cálcio baixa do que uma concentra-ção de íon de cálcio alta.
[0815] Aqui, a concentração de íon de cálcio alta não é particularmente limitada a um valor específico; no entanto, a concentração pode ser preferivelmente selecionada entre 100 μM e 10 mM. Em outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 200 μM e 5 mM. Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser selecionada entre 400 μM e 3 mM. Em ainda outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 200 μM e 2 mM. Ainda, a concentração pode ser selecionada entre 400 μM e 1 mM. Em particular, uma concentração selecionada entre 500 μM e 2,5 mM, que é próxima da concentração de íon de cálcio no plasma (sangue) in vivo, é preferida.
[0816] Aqui, a concentração de íon de cálcio baixa não é particularmente limitada a um valor específico; no entanto, a concentração pode ser preferivelmente selecionada entre 0,1 μM e 30 μM. Em outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 0,2 μM e 20 μM. Em ainda outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 0,5 μM e 10 μM. Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser selecionada entre 1 μM e 5 μM. Ainda, a concentração pode ser selecionada entre 2 μM e 4 μM. Em particular, uma concentração selecionada entre 1 μM e 5 μM, que é próxima da concentração de cálcio ionizado em endossomos iniciais in vivo, é preferida.
[0817] Aqui, "a atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta" significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mais fraca em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 0,1 μM e 30 μM do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 100 μM e 10 mM. Preferivelmente, ela significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mais fraca em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 0,5 μM e 10 μM do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 200 μM e 5 mM. Ela significa particularmente preferivelmente que a atividade de ligação a antígeno na concentração de íon de cálcio no endossomo inicial in vivo é mais fraca do que aquela na concentração de íon de cálcio no plasma in vivo; e especificamente, ela significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mais fraca em concentração de íon de cálcio selecionada entre 1 μM e 5 μM do que em uma concentração de íon de cálcio selecionada entre 500 μM e 2,5 mM.
[0818] Se a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é mudada dependendo de concentrações de íon de metal pode ser determinada, por exemplo, através do uso de métodos de medição conhecidos tais como aqueles descritos na seção "Atividade de Ligação" acima. Por exemplo, a fim de confirmar que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno se torna maior em uma concentração de íon de cálcio alta do que em uma concentração de íon de cálcio baixa, a atividade de ligação a an- tígeno da molécula de ligação a antígeno em concentrações de íon de cálcio baixas e altas é comparada.
[0819] Na presente invenção, a expressão "a atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta" pode também ser expressa como "a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é maior em uma concentração de íon de cálcio alta do que em uma concentração de íon de cálcio baixa". Na presente invenção, "a atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta" é algumas vezes escrita como "a habilidade de ligação a antígeno é mais fraca em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta". Também, "a ativida- de de ligação a antígeno em uma concentração de íon de cálcio baixa é reduzida para ser menor do que aquela em uma concentração de íon de cálcio alta" pode ser escrita como "a habilidade de ligação a antí- geno em uma concentração de íon de cálcio baixa é tornada mais fraca do que em uma concentração de íon de cálcio alta".
[0820] Quando determinando a atividade de ligação a antígeno, as condições outras que não concentração de íon de cálcio podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica e não são particularmente limitadas. Por exemplo, a atividade pode ser determinada a 37°C em tampão HEPES. Por exemplo, Biacore (GE Healthcare) ou similar pode ser usado para a determinação. Quando o an- tígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser avaliada fluindo o antí- geno como um analito sobre um chip no qual a molécula de ligação a antígeno é imobilizada. Quando o antígeno é um antígeno de membrana, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno para o antígeno de membrana pode ser avaliada fluindo a molécula de ligação a antígeno como um analito sobre um chip no qual o antígeno é imobilizado.
[0821] Contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção em uma concentração de ion de cálcio baixa seja mais fraca do que aquela em uma concentração de ion de cálcio alta, a razão da atividade de ligação a antí- geno entre aquela em uma concentração de ion de cálcio baixa e em uma concentração de ion de cálcio alta não é particularmente limitada; e o valor de KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 2 mM), que é a razão da constante de dissociação (KD) para um antígeno em uma concentração de ion de cálcio baixa para a KD em uma concentração de ion de cálcio alta, é preferivelmente 2 ou mais; mais preferivelmente o valor de KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 2 mM) é 10 ou mais; e ainda mais preferivelmente o valor KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 2 mM) é 40 ou mais. O limite superior de valor de KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 2 mM) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor tal como 400, 1000 ou 10000, contanto que a molécula possa ser produzida pelas técnicas daqueles versados no campo. Alternativamente, o valor de KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 1,2 mM) é especificado. Isto é, o valor de KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 1,2 mM) é 2 ou mais; mais preferivelmente o valor de KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 1,2 mM) é 10 ou mais; e ainda mais preferivelmente o valor de KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 1,2 mM) é 40 ou mais. O limite superior de valor KD (Ca 3 μM)/KD (Ca 1,2 mM) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor tal como 400, 1000 ou 10000, contanto que a molécula possa ser produzida através das técnicas daqueles versados no campo.
[0822] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a KD (constant de dissociação) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antígeno. Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, KD aparente (constante de dissociação aparente) pode ser usada para representar a atividade. KD (constante de dissociação) e KD aparente (constante de dissociação aparente) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou citometria de fluxo.
[0823] Alternativamente, por exemplo, a constante de taxa de dissociação (kd) pode ser também preferivelmente usada como um índice para representar a razão da atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção entre concentrações de cálcio baixa e alta. Quando a constante de taxa de dissociação (kd) é usada ao invés da constante de dissociação (KD) como um índice para representar a razão de atividade de ligação, a razão da constante da taxa de dissociação (kd) entre concentrações de cálcio baixa e alta, isto é, o valor de kd (concentração de cálcio baixa)/kd (concentração de cálcio alta), é preferivelmente 2 ou mais, mais prefe-rivelmente 5 ou mais, mais preferivelmente ainda 10 ou mais, e ainda mais preferivelmente 30 ou mais. O limite superior do valor de Kd (concentração de cálcio baixa)/kd (concentração de cálcio alta) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 50, 100 ou 200 contanto que a molécula possa ser produzida através de técnicas conhecidas daqueles versados na técnica.
[0824] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a kd (constant da taxa de dissociação) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antígeno. Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, a kd aparente (constante da taxa de dissociação aparente) pode ser usada para representar a atividade de ligação a antí- geno. A kd (constante da taxa de dissociação) e a kd aparente (constante da taxa de dissociação aparente) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE healthcare) ou citometria de fluxo. Na presente invenção, quando a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é determinada em concentrações de íon de cálcio diferentes, é preferível usar as mesmas condições exceto para concentrações de cálcio.
[0825] Por exemplo, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpo incluindo as etapas de:
[0826] determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de cálcio baixa;
[0827] determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de cálcio alta; e
[0828] seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de cálcio baixa do que em uma concentração de cálcio alta.
[0829] Além disso, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpo, ou uma biblioteca dos mesmos, incluindo as etapas de:
[0830] contato de um antígeno com um domínio de ligação a antí-geno ou anticorpo ou uma biblioteca do mesmo em uma concentração de cálcio alta;
[0831] incubação em uma concentração de cálcio baixa de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que se ligou ao antígeno na etapa (a); e
[0832] isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo dissociado na etapa (b).
[0833] Ainda, o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa que aquela em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através de avaliação de domínios ou anticorpos de ligação a antígeno, ou uma biblioteca dos mesmos, incluindo as etapas de:
[0834] contato de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos em uma concentração de cálcio baixa;
[0835] seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que não se liga ao antígeno na etapa (a);
[0836] permitir que o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo selecionado na etapa (c) se ligue ao antígeno em uma concentração de cálcio alta; e
[0837] isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou anti corpo que se ligou ao antígeno na etapa (c).
[0838] Ainda, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de:
[0839] contato em uma concentração de cálcio alta de uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos com uma coluna na qual um antígeno é imobilizado;
[0840] eluição de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que se ligou à coluna na etapa (a) da coluna em uma concentração de cálcio baixa; e
[0841] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo eluído na etapa (b).
[0842] Ainda, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que aquela em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de:
[0843] permitir em uma concentração de cálcio baixa que uma biblioteca de domínio de ligação a antígeno ou anticorpos passe por uma coluna na qual um antígeno é imobilizado;
[0844] coleta de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que foi eluído sem ligação à coluna na etapa (a);
[0845] permitir que o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo coletado na etapa (b) se ligue ao antígeno em uma concentração de cálcio alta; e
[0846] isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou anti corpo que se ligou ao antígeno na etapa (c).
[0847] Além disso, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de:
[0848] contato de um anticorpo com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de cálcio alta;
[0849] obtenção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que se ligou ao antígeno na etapa (a);
[0850] incubação em uma concentração de cálcio baixa do domí nio de ligação a antígeno ou anticorpo obtido na etapa (b); e
[0851] isolamento de um domínio de ligação a antígeno ou anti corpo cuja atividade de ligação a antígeno na etapa (c) é mais fraca do que o critério para a seleção da etapa (b).
[0852] As etapas descritas acima podem ser repetidas duas ou mais vezes. Desta maneira, a presente invenção provê domínios de ligação a antígeno ou anticorpos cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de íon de cálcio baixa do que em uma concentração de íon de cálcio alta, os quais são obtidos através de métodos de avaliação que compreendem ainda a etapa de repetição duas ou mais vezes das etapas (a) a (c) ou (a) a (d) nos métodos de avaliação descritos acima. O número de ciclos das etapas (a) a (c) ou (a) a (d) não é particularmente limitado, mas geralmente é 10 ou menos.
[0853] Nos métodos de avaliação da presente invenção, a ativida de de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anti- corpo em uma concentração de cálcio baixa não é particularmente limitada, contanto que ela seja uma atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizado entre 0,1 μM e 30 μM, mas preferivelmente seja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizada entre 0,5 μM e 10 μM. Mais preferivelmente, ela é uma atividade de ligação a antígeno na concentração de cálcio ionizado no endossomo inicial in vivo, especificamente entre 1 μM e 5 μM. No entanto, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de cálcio alta não é particularmente limitada, contanto que ela seja uma atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizada entre 100 μM e 10 mM, mas preferivelmente seja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio ionizada entre 200 μM e 5 mM. Mais preferivelmente, ela é uma atividade de ligação a antígeno na concentração de cálcio ionizada em plasma in vivo, especificamente entre 0,5 mM e 2,5 mM.
[0854] A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo pode ser medida através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Condições que não a concentração de cálcio ionizado podem ser determinadas por aqueles versados na técnica. A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo pode ser avaliada como uma constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD aparente), constante de taxa de dissociação (kd), constante de dissociação aparente (kd) aparente e similar. Essas podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou FACS.
[0855] Na presente invenção, a etapa de seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é maior em uma concentração de cálcio alta do que em uma concen- tração de cálcio baixa é sinônimo da etapa de seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno é menor em uma concentração de cálcio baixa do que em uma concentração de cálcio alta.
[0856] Embora a atividade de ligação a antígeno seja maior em uma concentração de cálcio alta do que em uma concentração de cálcio baixa, a diferença na atividade de ligação a antígeno entre concentrações de cálcio alta e baixa não á particularmente limitada; no entanto, a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de cálcio alta é preferivelmente duas vezes ou mais, mais preferivelmente 10 vezes ou mais e ainda mais preferivelmente 40 vezes ou mais do que em uma concentração de cálcio baixa.
[0857] Os domínios de ligação a antígeno ou anticorpos da presente invenção a serem avaliados através dos métodos de avaliação descritos acima podem ser quaisquer domínios de ligação a antígeno e anticorpos. Por exemplo, é possível avaliar os domínios de ligação a antígeno e anticorpos descritos acima. Por exemplo, domínios de ligação a antígeno ou anticorpos tendo sequências naturais ou sequências de aminoácido substituídas podem ser avaliados.
Bibliotecas
[0858] Em uma modalidade, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo da presente invenção pode ser obtido de uma biblioteca que é principalmente composta de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de ligação a antígeno têm pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon. As concentrações de íon incluem preferivelmente, por exemplo, concentração de íon de metal e concentração de íon de hidrogênio.
[0859] Aqui, uma "biblioteca" se refere a uma pluralidade de molé- culas de ligação a antígeno ou uma pluralidade de polipeptídeos de fusão contendo moléculas de ligação a antígeno ou ácidos nucleicos ou polinucleotídeos codificando suas sequências. As sequências de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno ou uma pluralidade de polipeptídeos de fusão contendo moléculas de ligação a antíge- no em uma biblioteca não são idênticas, mas são diferentes uma das outras.
[0860] Aqui, a expressão "sequências são diferentes umas das outras" na expressão "uma pluralidade de moléculas de ligação a antí- geno cujas sequências são diferentes umas das outras" significa que as sequências de moléculas de ligação a antígeno em uma biblioteca são diferentes umas das outras. Especificamente, em uma biblioteca, o número de sequências diferentes umas das outras reflete o número de clones independentes com sequências diferentes e pode também ser referido como "tamanho da biblioteca". O tamanho da biblioteca de uma biblioteca de exibição de fago convencional varia de 106 a 1012. O tamanho da biblioteca pode ser aumentado até 1014 através do uso de técnicas conhecidas tal como exibição de ribossomo. No entanto, o número real de partículas de fago usadas em seleção por "separação" de uma biblioteca de fago é em geral 10-10000 vezes maior do que o tamanho da biblioteca. Essa multiplicidade em excesso é também referida como "o número de equivalentes de biblioteca" e significa que há 10 a 10.000 clones individuais que têm mesma sequência de aminoá- cido. Desta maneira, na presente invenção, a expressão "sequências são diferentes umas das outras" significa que as sequências de moléculas de ligação a antígeno independentes em uma biblioteca, excluindo equivalentes de biblioteca, são diferentes umas das outras. Mais especificamente, o acima significa que há 106 a 1014 moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras, preferivelmente 107 a 102 moléculas, mais preferivelmente 108 a 1011 moléculas e particularmente preferivelmente 108 a 1012 moléculas cujas sequências são diferentes umas das outras.
[0861] Aqui, a expressão "uma pluralidade de" na expressão "uma biblioteca composta principalmente de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno" geralmente se refere a, no caso de, por exemplo, moléculas de ligação a antígeno, polipeptídeos de fusão, moléculas de polinucleotídeo, vetores ou vírus da presente invenção, um grupo de dois ou mais tipos da substância. Por exemplo, quando duas ou mais substâncias são diferentes umas das outras em uma característica particular, isso significa que há dois ou mais tipos da substância. Tais exemplos podem incluir, por exemplo, aminoácidos mutantes observados em posições de aminoácido específicas em uma sequência de aminoácido. Por exemplo, quando há duas ou mais moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são substancialmente iguais ou preferivelmente iguais exceto pelos resíduos flexíveis ou exceto pelos aminoácidos mutantes particulares em posições hipervariáveis expostas na superfície, há uma pluralidade de mo-léculas de ligação a antígeno da presente invenção. Em outro exemplo, quando há duas ou mais moléculas de polinucleotídeo cujas sequências são substancialmente iguais ou preferivelmente iguais exceto pelos nucleotídeos codificando resíduos flexíveis ou nucleotídeos codificando aminoácidos mutantes de posições hipervariáveis expostos sobre a superfície, há uma pluralidade de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção.
[0862] Ainda, aqui, a expressão "composta principalmente de" na expressão "uma biblioteca composta principalmente de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno" reflete o número de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das concentrações de íon, dentre clones independentes com sequências diferentes em uma biblioteca. Especificamente, é pre- ferível que haja pelo menos 104 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação em uma biblioteca. Mais preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca contendo pelo menos 105 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Mais preferivelmente ainda, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca contendo pelo menos 106 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Particularmente preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca contendo pelo menos 107 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Ainda mais preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca contendo pelo menos 108 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Al-ternativamente, isso pode ser também preferivelmente expresso como a razão do número de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo das concentrações de íon com relação ao número de clones independentes tendo sequências diferentes em uma biblioteca. Especificamente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca em que moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação são responsáveis por 0,1% a 80%, preferivelmente 50% a 60%, mais preferivelmente 1% a 40%, ainda mais preferivelmente 2% a 20% e particularmente preferivelmente 4% a 10% de clones independentes com sequências diferentes na biblioteca. No caso de polipeptídeos de fusão, moléculas de polinucleotídeo ou vetores, expressões similares podem ser possíveis usando o número de moléculas ou a razão do número total de moléculas. No caso de vírus, expressão similar pode também ser possível usando o número de vírions ou a razão para número total de vírions.
[0863] Aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antigen de domínios de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon.
[0864] Domínios ou anticorpos de ligação a antígeno da presente invenção a serem avaliados através dos métodos de avaliação descritos acima podem ser preparados de qualquer maneira. Por exemplo, quando o íon de metal é íon de cálcio, é possível usar anticorpos preexistentes, bibliotecas preexistentes (biblioteca de fago, etc.), anticorpos ou bibliotecas preparados a partir de hibridomas obtidos através da imunização de animais ou a partir de células D de animais imunizados, anticorpos ou bibliotecas obtidos através da introdução de amino- ácidos capazes de quelação de cálcio (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não naturais nos anticorpos ou bibliotecas descritos acima (aminoácidos quelatáveis com cálcio (tais como ácido aspártico e ácido glutâmico), bibliotecas com teor alto de aminoácidos não naturais, bibliotecas preparadas através da introdução de aminoácidos quelatáveis com cálcio (tais como ácido aspártico e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não naturais em posições particulares ou similar.
[0865] Exemplos dos aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon conforme descrito acima podem ser quaisquer tipos de aminoácidos contanto que os aminoácidos formem um motivo de ligação de cálcio. Motivos de ligação de cálcio são bem conhecidos daqueles versados na técnica e foram descritos em detalhes (por exemplo, Springer e outros (Cell (2000) 102, 275-277); Kawasaki e Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305-490); Moncrief e outros (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562); Chauvaux e outros (Biochem. J. (1990) 265, 261-265); Bairoch e Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419); Schaefer e outros (Genomics (1995) 25, 638-643); Economou e outros (EMBO J. (1990) 9, 349-354); Wurzburg e outros (Structure (2006) 14, 6, 1049-1058)). Especificamente, quaisquer motivos de ligação de cálcio conhecidos, incluindo lecitinas tipo C tais como ASGPR, CD23, MBR e DC-SIGN, podem ser incluídos em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Exemplos preferidos de tais motivos de ligação de cálcio preferidos também incluem, em adição àqueles descritos acima, por exemplo, o motivo de ligação de cálcio no domínio de ligação de antígeno de SEQ ID NO: 462.
[0866] Ainda, como aminoácidos que alteram a atividade de liga ção a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio, por exemplo, aminoácidos tendo atividade de quelação de metal podem ser também preferivelmente usados. Exemplos de tais aminoácidos de quelação de metal incluem, por exemplo, serina (Ser(S)), treonina (Thr(R)), asparagina (Asn(N)), glu- tamina (Gln(Q)), ácido aspártico (Asp(D)) e ácido glutâmico (Glu(E)).
[0867] As posições nos domínios de ligação a antígeno nos quais os aminoácidos descritos acima estão contidos não são particularmente limitadas a posições particulares e podem ser quaisquer posições dentro da região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve que forma um domínio de ligação a antígeno, contanto que elas alterem a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio. Especificamente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de ligação a antígeno de cadeia pesada contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio. Em outra modalidade não limitante, os domínios de liga-ção a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios CDR3 de cadeia pesada contêm os aminoácidos mencionados acima. Em ainda outra modalidade não limitante, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios CDR3 de cadeia pesada contêm os aminoácidos mencionados acima nas posições 95, 96, 100a e/ou 101 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[0868] Entretanto, em uma modalidade não limitante da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de ligação a antígeno de cadeia leve contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo de concentrações de íon de cálcio. Em outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR1 de cadeia leve contêm os aminoácidos mencionados acima. Em ainda outra modalidade, os domínios de ligação a antígeno da presente in-venção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR1 de cadeia leve contêm os aminoácidos mencionados acima nas posições 30, 31 e/ou 32 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[0869] Em outra modalidade não limitante, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR2 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima. Em ainda outra modalidade, a presente invenção provê bibliotecas compostas principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR2 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima na posição 50 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[0870] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CDR3 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima. Em uma modalidade alternativa, domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujos domínios de CD3 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoáci- do mencionados acima na posição 92 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[0871] Ainda, em uma modalidade diferente da presente invenção,os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e em que duas ou três CDRs selecionadas de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve descritas acima contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima. Além disso, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca composta principalmente de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras e cujas cadeias leves contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima em qualquer uma ou mais de posições 30, 31, 32, 50 e/ou 92 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[0872] Em uma modalidade particularmente preferida, as sequências de estrutura principal da região variável de cadeia leve e/ou cadeia pesada de uma molécula de ligação a antígeno contêm preferivelmente sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana. Desta maneira, em uma modalidade da presente invenção, quando as sequências de estrutura principal são sequências completamente humanas, é esperado que quando tal molécula de ligação a antígeno da presente invenção for administrada a seres humanos (por exemplo, para tratar doenças), ela induza pouca ou nenhum resposta imunogênica. No sentido acima, a expressão "contendo uma sequência de linhagem germinativa" na presente invenção significa que uma parte das sequências de estrutura principal da presente invenção é idêntica a uma parte de quaisquer sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana. Por exemplo, quando a sequência FR2 de cadeia pesada de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção é uma combinação de sequências de FR2 de cadeia pesada de sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana diferentes, tal molécula é também uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção "contendo uma sequência de linhagem germina- tiva".
[0873] Exemplos preferidos das estruturas principais incluem, por exemplo, sequências de região de estrutura principal integralmente humanas atualmente conhecidas, que estão incluídas no website da V- Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) o outros. Essas sequências de região de estrutura principal podem ser apropriadamente usadas como uma sequência de linhagem germinativa contida em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção. As sequências de linhagem germinativa podem ser categorizadas de acordo com sua similaridade (Tomlinson e outros, (J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798); Williams e Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461); Cox e outros (Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). Sequências de linhagem germinativa apropriadas podem ser selecionadas de Vk, que é agrupada em sete subgrupos: VÀ, que é agrupada em dez subgrupos; e VH, que é agrupada em sete subgrupos.
[0874] Sequências de VH integralmente humanas preferivelmente incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, sequências VH de:
[0875] subgrupo VH1 (por exemplo, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58 e VH1-69);
[0876] subgrupo VH2 (por exemplo, VH2-5, VH2-26 e VH2-70);
[0877] subgrupo VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 e VH3-74);
[0878] subgrupo VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-39, VH4-59 e VH4-61);
[0879] subgrupo VH5 (VH5-51);
[0880] subgrupo VH6 (VH6-1); e
[0881] subgrupo VH7 (VH7-4 e VH7-81).
[0882] Essas são também descritas em documentos conhecidos (Matsuda e outros, (J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975) e similar e então, pessoas versadas na técnica podem apropriadamente projetar moléculas de ligação a antígeno da presente invenção com base na informação dessas sequências. É também preferível usar outras estruturas principais ou sub-regiões de estrutura principal integralmente humanas.
[0883] Sequências VK integralmente humanas incluem preferivel mente, mas não estão limitadas a, por exemplo:
[0884] A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 e O18 agrupados em subgrupo Vk1;
[0885] A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1 E O11 agrupa das em subgrupo Vk2;
[0886] A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20 e L25 agrupadas em sub grupo Vk3;
[0887] B3 agrupada em subgrupo Vk4;
[0888] B2 (aqui também referida como Vk5-2) agrupada em sub grupo Vk5; e
[0889] A10, A14 e A26 agrupadas em subgrupo VK6
[0890] (Kawasaki e outros (Eur. J. Immunol. (2001) 31, 10171028); Schable e Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 10011022); Bresing-Kuppers e outros (Gene (1997) 191, 173-181).
[0891] Sequências de VL integralmente humanas preferivelmente incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo:
[0892] V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20 e V1-22 agrupados em subgrupo VL1;
[0893] V2-1, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 e V2 19 agrupadas no subgrupo VL1;
[0894] V3-2, V3-3 e V3-4 agrupadas em subgrupo VL3;
[0895] V4-1, V4-2, V4-3, V4-4 e V4-6 agrupados no subgrupo VL4; e
[0896] V5-1, V5-2, V5-4 e V5-6 agrupadas no subgrupo VL5 (Ka wasaki e outros (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).
[0897] Normalmente, essas sequências de estrutura principal são diferentes umas das outras em um ou mais resíduos de aminoácido. Essas sequências de estrutura principal podem ser usadas em combi- nação com "pelo menos um resíduo de aminoácido" que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon" da presente invenção. Outros exemplos das estruturas principais integralmente humanas usadas em combinação com "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon" da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (por exemplo, Kabat e outros (1991) supra; Wu e outros (J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).
[0898] Sem desejar ser limitado a nenhuma teoria particular, uma razão para a expectativa que o uso de sequências de linhagem germi- nativa precluda respostas imunes adversas na maioria dos indivíduos é acreditada ser como segue. Como um resultado do processo de maturação por afinidade durante respostas imunes normais, mutação somática ocorre frequentemente nas regiões variáveis de imunoglobuli- na. Tais mutações ocorrem principalmente em torno das CDRs cujas sequências são hipervariáveis, mas também afetam resíduos de regiões de estrutura principal. Tais mutações de estrutura principal não existem nos genes da linhagem germinativa, mas elas são menos prováveis de ser imunogênicas em pacientes. Isso é devido ao fato que a população humana normal é exposta à maioria das sequências de estrutura principal expressas a partir dos genes de linhagem germinativa e, como resultado de imunotolerância, essas estruturas principais de linhagem germinativa são esperadas ter imunogenicidade baixa ou nenhuma em pacientes. Para maximizar a possibilidade de imunotole- rância, genes de codificação de região variável podem ser selecionados de um grupo de genes de linhagem germinativa funcional de ocorrência comum.
[0899] Métodos conhecidos tais como mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados para produzir moléculas de ligação a antígeno da presente invenção em que as sequências de estrutura principal descritas acima contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio.
[0900] Por exemplo, uma biblioteca que contém uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser construída combinando regiões variáveis de cadeia pesada preparada como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com uma região variável de cadeia leve selecionada como uma sequência de estrutura principal originalmente contendo pelo menos um resíduo de aminoáci- do que altera a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon de cálcio. Como um exemplo não limitante, quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, tais bibliotecas preferidas incluem, por exemplo, aquelas construídas através da combinação da sequência de região variável de cadeia leve pertencente à família Vk5-2 representada pela sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 62 (Vk5-2) e a região variável de cadeia pesada produzida como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada.
[0901] Alternativamente, uma sequência de região variável de cadeia leve selecionada como uma região de estrutura principal contendo originalmente pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno conforme acima mencionado pode ser projetada para conter vários resíduos de aminoácido que não os resíduos de aminoácido acima. Aqui, tais resíduos são referidos como resíduos flexíveis. O número e a posição de resíduos flexíveis não são particularmente limitados, contanto que a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo de concentrações de íon. Especificamente, as sequências de CDR e/ou sequências de FR da cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Por exemplo, quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 462 (Vk5-2) incluem os resíduos de aminoácido listados na Tabela 1 ou 2.Tabela 1
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Tabela 2
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[0902] Aqui, resíduos flexíveis se referem a variações de resíduo de aminoácido presentes em posições hipervariáveis nas quais vários aminoácidos diferentes estão presentes nas regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada quando as sequências de aminoácido de anticorpos conhecidos e/ou nativos ou domínios de ligação a antígeno são comparadas. Posições hipervariáveis estão em geral localizadas na CDR. Em uma modalidade, os dados providos por Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda, Md.) (1987 e 1991) são úteis para determinar posições hi- pervariáveis em anticorpos conhecidos ou nativos. Ainda, banco de dados na internet (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf. org.uk/abs/index.html) provê as sequências coletadas de muitas cadeias leves e cadeias pesadas humanas e suas localizações. A informação sobre as sequências e localizações é útil para determinar posições hipervariáveis na presente invenção. De acordo com a presente invenção, quando uma certa posição de aminoácido tem preferivelmente cerca de 20 a cerca de 20 variações de resíduo de aminoácido possíveis, preferivelmente cerca de 3 a cerca de 19, preferivelmente cerca de 4 a cerca de 18, preferivelmente 5 a 17, preferivelmente 6 a 16, preferivelmente 7 a 15, preferivelmente 8 a 14, preferivelmente 9 a 13 e preferivelmente 10 a 12 variações de resíduo de aminoácido possíveis, a posição é hipervariável. Em algumas modalidades, uma certa posição de aminoácido pode ter preferivelmente pelo menos cerca de 2, preferivelmente pelo menos cerca de 4, preferivelmente pelo menos cerca de 6, preferivelmente pelo menos cerca de 8, preferivelmente cerca de 10 e preferivelmente cerca de 12 variações de resíduo de aminoácido.
[0903] Alternativamente, uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser construída combinando regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com regiões variáveis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon conforme mencionado acima é introduzido. Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem, por exemplo, bibliotecas em que regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável alea- torizada são combinadas com sequências de região variável de cadeia leve em que um resíduo(s) particular em uma sequência de linhagem germinativa tal como SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) ou SEQ ID NO: 8 (Vk4) foi substituído com pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo de concentrações de íon de cálcio. Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoá- cido incluem resíduos de aminoácido em CDR1 de cadeia leve. Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido em CDR2 de cadeia leve. Ainda, outros exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido também incluem resíduos de aminoácido na CDR3 de cadeia leve.
[0904] Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos em CDR1 de cadeia leve incluem aqueles nas posições 30, 31 e/ou 32 na CDR1 de região variável de cadeia leve conforme indicado por numeração Kabat. Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve incluem um resíduo de aminoácido na posição 50 na CDR2 de região variável de cadeia leve conforme indicado por numeração Kabat. Além disso, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos na CDR3 de cadeia leve incluem um resíduo de aminoácido na posição 92 na CDR3 de região variável de cadeia leve conforme indicado por numeração Kabat. Os resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio e/ou contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno varie dependendo das concentrações de íon de cálcio. Entretanto, como troponina C, calmodulina, parvalbumina e cadeia leve da miosina, que têm vários sítios de ligação de íon de cálcio e são acreditados ser derivadas de uma origem comum em termos de evolução molecular, são conhecidas, a CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve pode ser projetada para ter seus motivos de ligação. Por exemplo, é possível usar domínios de caderina,EF hand de calmodulina, domínio C2 de Proteína Cinase C, domínio Gla de Fator IX de proteína de coagulação de sangue, lectinas tipo C de receptor de aciaroglicoproteína e receptor de ligação de manose, domínios A de receptores de LDL, anexina, domínio tipo 3 da trom- bospodina e domínios tipo EGF de uma maneira apropriada para os propósitos acima.
[0905] Quando regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada e regiões variáveis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo das concentrações de íon foi introduzido são combinadas conforme descrito acima, as sequências das regiões variáveis de cadeia leve podem ser projetadas para conter resíduos flexíveis da mesma maneira que descrito acima. O número e a posição de tais resíduos flexíveis não são particularmente limitados às modalidades particulares contanto que a atividade de ligação a an- tígeno de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo das concentrações de íon. Especificamente, as sequências de CDR e/ou sequências FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia leve incluem os resíduos de aminoácido listados nas Ta-belas 1 e 2.
[0906] As regiões variáveis de cadeia pesada preferidas a serem combinadas incluem, por exemplo, bibliotecas de região variável alea- torizadas. Métodos conhecidos são combinados conforme apropriado para produzir uma biblioteca de região variável aleatorizada. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo derivados de linfócitos de animais imunizados com um antígeno específico, pacientes com infecções, pessoas com um título de anticorpo elevado no sangue como um resultado de vacinação, pacientes com câncer ou pacientes com doença autoimune, pode ser preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.
[0907] Em outra modalidade não limitante da presente invenção,uma biblioteca sintética produzida substituindo as sequências de CDR de genes V em DNA genômico ou genes V remodelados funcionais com um conjunto de oligonucleotídeos sintéticos contendo sequências codificando conjuntos de códon de um comprimento apropriado pode ser também preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada. Neste caso, uma vez que diversidade de sequência é observada na sequência de CDR3 de cadeia pesada, é também possível substituir a sequência de CDR3 apenas. Um critério de concessão de origem à diversidade em aminoácidos na região variável de uma molécula de ligação a antígeno é que esta diversidade é dada a resíduos de aminoácido em posições de superfície exposta na molécula de ligação a antígeno. A posição de superfície exposta se refere a uma posição que é considerada ser capaz de ser exposta na superfície e/ou contatada com um antígeno, com base em estrutura, conjunto de estruturas e/ou estrutura modelada de uma molécula de ligação a antígeno. Em geral, tais posições são CDRs. Preferivelmente, posições de superfície exposta são determinadas usando coordenada de um modelo tridimensional de uma molécula de ligação a antígeno usando um programa de computador tal como o programa InsightII (Accelrys). Posições de superfície exposta podem ser determinadas usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Determinação de posições de superfície exposta pode ser realizada usando software adequado para modelagem de proteína e informação estrutural tridimensional obtida de um anticorpo. O software que pode ser usado para esses propósitos preferivelmente inclui SYBYL Biopolymer Module software (Tripos Associates). Em geral ou preferivelmente, quando um algoritmo requer um parâmetro de tamanho de registro de usuário, o "tamanho" de uma sonda que é usada no cálculo é ajustado em cerca de 1,4 Angstrons ou menor em raio. Ainda, métodos para determinação de regiões e áreas de superfície exposta usando software para computadores pessoais são descritos por Pacios (Compu. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).
[0908] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca pura, que é construída a partir de genes de anticorpo derivados de linfócitos de pessoas saudáveis e cujo repertório consiste em sequências puras, que são sequências de anticorpo sem nenhuma predisposição, pode ser também particularmente preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada (Gejima e outros (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso e outros (Scand, J. Immunol. (2000) 51, 337-344). Aqui, uma sequência de aminoácido compreendendo uma sequência nativa se refere a uma sequência de aminoácido obtida de tal biblioteca pura.
[0909] Em uma modalidade da presente invenção, um domínio de ligação a antígeno da presente invenção pode ser obtido a partir de uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras, preparadas através da combinação de regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com uma região variável de cadeia pesada selecionada como uma sequência de estrutura principal que contém originalmente "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno de- pendendo de concentrações de íon". Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem preferivelmente aquelas construídas através de combinação de regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) ou SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1). Alternativamente, tal biblioteca pode ser construída através de seleção de regiões variáveis de cadeia leve apropriadas a partir daquelas tendo sequências de linhagem ger- minativa, ao invés de regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada. Tais bibliotecas preferidas incluem, por exemplo, aquelas em que a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) ou SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1) é combinada com regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linhagem germi- nativa.
[0910] Alternativamente, a sequência de uma região variável de cadeia pesada selecionada como uma sequência de estrutura principal que contém originalmente "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno" conforme mencionado acima pode ser projetada para conter resíduos flexíveis. O número e a posição dos resíduos flexíveis não são particularmente limitados contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo das concentrações de íon. Especificamente, as sequências de CDR e/ou FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Quando a concentração de íon é concentração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) incluem todos os resí- duos de aminoácido de CDR1 e CDR2 de cadeia pesada e os resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada exceto aqueles nas posições 95, 96 e/ou 100a. Alternativamente, exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1) incluem todos os resíduos de aminoácido de CDR1 e CDR2 de cadeia pesada e os resíduos de aminoácido de CDR3 de cadeia pesada exceto aqueles nas posições de aminoácido 95 e/ou 101.
[0911] Alternativamente, uma biblioteca contendo uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser construída combinando regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linhagem germinativa com regiões variáveis de cadeia pesada em que "pelo menos um resíduo de aminoácido responsável pela mudança dependente da concentração de íons na atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno" foi introduzido como acima mencionado. Quando a concentração de íon é con-centração de íon de cálcio, exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem preferivelmente aquelas em que regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequências de linhagem germinativa são combinadas com a sequência de uma região variável de cadeia pesada em que um resíduo(s) particular foi substituído com pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo de concentrações de íon de cálcio. Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada. Exemplos não limitantes adicionais de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada. Ainda, exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoáci- do incluem também resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada. Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido de CDR3 de cadeia pesada incluem os aminoácidos de posições 95, 96, 100a e/ou 101 na CDR3 de região variável de cadeia pesada conforme indicado pela numeração Kabat. Ainda, esses resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio e/ou a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno varie dependendo das concentrações de cálcio.
[0912] Quando regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada ou regiões variáveis de cadeia leve tendo sequência de linhagem germinativa são combinadas com uma região variável de cadeia pesada na qual pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependente de concentrações de íon conforme mencionado acima foi introduzido, a sequência da região variável de cadeia pesada pode ser também projetada para conter resíduos flexíveis da mesma maneira que descrito acima. O número e a posição de resíduos flexíveis não são particularmente limitados, contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie de-pendendo das concentrações de íon. Especificamente, as sequências de CDR de cadeia pesada e/ou FR podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Ainda, bibliotecas de região variável aleatorizada podem ser preferivelmente usadas como sequências de aminoácido de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da região variável de cadeia pesada ao invés dos resíduos de aminoácido que alteram a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno. Quando sequências de linhagem germinativa são usadas como regiões variáveis de cadeia leve, exemplos não limitantes de tais sequências incluem aqueles de SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) e SEQ ID NO: 8 (Vk4).
[0913] Qualquer um dos aminoácidos descritos acima que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependente de concentração de íons de cálcio pode ser preferivelmente usado, contanto que eles formem um motivo de ligação de cálcio. Especificamente, tais aminoácidos incluem aminoácidos doadores de elétron. Exemplos preferidos de tais aminoácidos doadores de elétron incluem serina, treonina, asparagina, ácido glutâmico, ácido aspártico e ácido glutâmico.
Condição de concentrações de íon de hidrogênio
[0914] Em uma modalidade da presente invenção, a condição de concentrações de íon se refere à condição de concentrações de íon de hidrogênio ou condição de pH. Na presente invenção, a concentração de próton, isto é, o núcleo de átomos de hidrogênio, é tratada como sinônimo com índice de hidrogênio (pH). Quando a atividade de íon de hidrogênio em uma solução aquosa é representada como aH+, pH é definido como -log10aH+. Quando a resistência iônica da solução aquosa é baixa (por exemplo, menor do que 10-3), aH+ é quase igual à resistência do íon de hidrogênio. Por exemplo, o produto iônico de água a 25°C e 1 atmosfera é Kw=aH+aOH=10-14 e então em água pura, aH+=aOH=10-7. Neste caso, pH=7 é neutro; uma solução aquosa cujo pH é menor do que 7 é ácida ou cujo pH é maior do que 7 é alcalina.
[0915] Na presente invenção, quando a condição de pH é usada como a condição de concentração de íon, condições de pH incluem concentrações de íon de hidrogênio altas ou pHs baixos, isto é, uma faixa de pH ácido, e concentrações de íon de hidrogênio baixas ou pHs altos, isto é, uma faixa de pH neutro. "A atividade de ligação varia dependendo da condição de pH" significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno varia devido à diferença em condições de uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo (uma faixa de pH ácido) e uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto (uma faixa de pH neutro). Isso inclui, por exemplo, o caso em que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é maior em uma faixa de pH neutro do que em uma faixa de pH ácido e o caso em que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é maior em uma faixa de pH ácido do que em uma faixa de pH neutro.
[0916] No presente relatório, a faixa de pH neutro não é limitada a um valor específico e é preferivelmente selecionada entre pH 6,7 e pH 10,0. Em outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH 6,7 e pH 9,5. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH7,0 e pH9,0. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH7,0 e pH8,0. Em particular, o pH preferido inclui pH 7,4, que é próximo do pH do plasma (sangue) in vivo.
[0917] No presente relatório, uma faixa de pH ácido não é limitada a um valor específico e é preferivelmente selecionada entre pH4,0 e pH6,5. Em outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH4,5 e pH6,5. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH5,0 e pH6,5. Em ainda outra modalidade, o pH pode ser selecionado entre pH5,5 e pH6,5. Em particular, o pH preferido inclui pH 5,8, que está próximo da concentração de cálcio ionizado no endossomo inicial in vivo.
[0918] Na presente invenção, "a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo (uma faixa de pH ácido) é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto (uma faixa de pH neutro)" significa que a atividade de ligação a antí- geno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH 4,0 e pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH 6,7 e pH 10,0; preferivelmente significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH 4,5 e pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH 6,7 e pH 9,5; mais preferivelmente, significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH 5,0 e pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH 7,0 e pH 9,0; mais preferível ainda significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em um pH selecionado entre pH 5,5 e pH 6,5 é mais fraca do que aquela em um pH selecionado entre pH 7,0 e pH 8,0; particularmente preferivelmente significa que a atividade de ligação a antígeno no pH no endossomo inicial in vivo é mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno no pH de plasma in vivo; e especificamente significa que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em pH 5,8 é mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno em pH 7,4.
[0919] Se a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno mudou pela condição do pH pode ser determinada, por exemplo, através do uso de métodos de medição conhecidos tais como aqueles descritos na seção "Atividade de Ligação" acima. Especificamente, a atividade de ligação é medida sob condições de pH diferentes usando os métodos de medição descritos acima. Por exemplo, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antí- geno é comparada sob as condições de faixa de pH ácido e faixa de pH neutro para confirmar que a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno muda para ser maior sob a condição de faixa de pH neutro do que aquela sob a condição de faixa de pH ácido.
[0920] Ainda, na presente invenção, a expressão "a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, pode ser também expressa como "a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é maior do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido". Na presente invenção, "a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro" pode ser descrita como "a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é mais fraca do que a habilidade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro". Alternativamente, a atividade de ligação a antíge- no em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é reduzida para ser menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro" pode ser descrita como "a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é reduzida para ser mais fraca do que a habilidade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro.
[0921] As condições que não concentração de íon de hidrogênio ou pH para medição da atividade de ligação a antígeno podem ser adequadamente selecionadas por aqueles versados na técnica e não são particularmente limitadas. As medições podem ser realizadas, por exemplo, a 37°C usando tampão HEPES. As medições podem ser realizadas, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare). Quando o an- tígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno pode ser determinada através da avaliação da atividade de ligação para o antígeno solúvel ao despejar o antígeno como um analito em um chip imobilizado com a molécula de ligação a antígeno. Quando o antígeno é um antígeno de membrana, a atividade de ligação ao antígeno de membrana pode ser avaliada despejando a molécula de ligação a antígeno como um analito em um chip imobilizado com o antígeno.
[0922] Contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma mo lécula de ligação a antígeno da presente invenção em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH baixo, seja mais fraca do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, a razão da atividade de ligação a antígeno entre aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, e em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutro, não é particularmente limitada, e o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4), que é a razão da constante de dissociação (KD) para um antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido para a KD em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é preferivelmente 2 ou mais; mais preferivelmente, o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) é 10 ou mais; e mais preferivelmente ainda o valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) é 40 ou mais. O limite superior de valor de KD (pH5,8)/KD (pH7,4) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor tal como 400, 1000 ou 10000, contanto que a molécula possa ser produzida através das técnicas daqueles versados na técnica.
[0923] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a constante de dissociação (KD) pode ser usada como o valor para atividade de ligação a antígeno. Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, a constante de dissociação aparente (kd) pode ser usada. A constante de dissociação (KD) e constante de dissociação aparente (KD) podem ser medidas através de métodos conhecidos dos versados na técnica e Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard, citometria de fluxo e similar podem ser usados.
[0924] Alternativamente, por exemplo, a constante de taxa de dissociação (kd) pode ser adequadamente usada como um índice para indicação da razão da atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção entre aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta e pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido e uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutro. Quando a kd (constante de taxa de dissociação) é usada como um índice para indicação da razão da atividade de ligação ao invés de KD (constante de dissociação), o valor de kd (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma faixa de pH neutro), que é a razão de kd (constante de taxa de dissociação) para o antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido para kd (constante de taxa de dissociação) em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, mais preferivelmente e ainda 10 ou mais, e sobretudo preferivelmente 30 ou mais. O valor do limite superior (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma faixa de pH neutro) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 50, 100 ou 200, contanto que a molécula possa ser produzida através das técnicas daqueles versados na técnica.
[0925] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a constante de taxa de dissociação (kd) pode ser usada como o valor para atividade de ligação a antígeno e quando o antígeno é um antígeno de membrana, a constante de taxa de dissociação aparente (kd) pode ser usada. A constante de taxa de dissociação (kd) e a constante de taxa de dissociação aparente (kd) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica e Biacore (GE healthcare), citometria de fluxo e similar podem ser usados. Na presente invenção, quando a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno é medida em concentrações de íon de hidrogênio diferentes, isto é, pHs, condições outras que não a concentração de íon de hidrogênio, isto é, pH, são preferivelmente iguais.
[0926] Por exemplo, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é uma modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos compreendendo as etapas (a) a (c) que seguem:
[0927] obtenção da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma faixa de pH ácido;
[0928] obtenção da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma faixa de pH neutro; e
[0929] seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno na faixa de pH ácido é menor do que aquela na faixa de pH neutro.
[0930] Alternativamente, um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio bai- xa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é uma modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpo, ou sua biblioteca, compreendendo as etapas (a) a (c) que seguem:
[0931] contato de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo, ou sua biblioteca, em uma faixa de pH neutro com um antígeno;
[0932] colocação em uma faixa de pH ácido do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo ligado ao antígeno na etapa (a); e
[0933] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo dissociado na etapa (b).
[0934] Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja ativi dade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos, ou uma biblioteca dos mesmos, compreendendo as etapas (a) a (d) que seguem:
[0935] contato em uma faixa de pH ácido de um antígeno com uma biblioteca de domínio de ligação a antígeno ou anticorpos;
[0936] seleção do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo que não se liga ao antígeno na etapa (a);
[0937] permitir que o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo selecionado na etapa (b) se ligue com o antígeno em uma faixa de pH neutro; e
[0938] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo ligado ao antígeno na etapa (c).
[0939] Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja ativi dade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas (a) a (c) que seguem:
[0940] contato em uma faixa de pH neutro de uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos com uma coluna imobilizada com um antígeno;
[0941] eluição em uma faixa de pH ácido a partir da coluna do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo ligado à coluna na etapa (a); e
[0942] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo eluído na etapa (b).
[0943] Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas (a) a (d) que seguem:
[0944] permitir, em uma faixa de pH ácido, que uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos passe por uma coluna imobilizada com um antígeno;
[0945] coleta do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo eluído sem ligação com a coluna na etapa (a);
[0946] permitir que o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo coletado na etapa (b) se ligue com o antígeno em uma faixa de pH neutro; e
[0947] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo ligado ao antígeno na etapa (c).
[0948] Um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja ativi- dade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade provida pela presente invenção, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas (a) a (d) que seguem:
[0949] contato de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos em uma faixa de pH neutro;
[0950] obtenção do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo ligado ao antígeno na etapa (a);
[0951] colocação em uma faixa de pH ácido do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo obtido na etapa (b); e
[0952] isolamento do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno na etapa (c) é mais fraca do que o padrão selecionado na etapa (b).
[0953] As etapas descritas acima podem ser repetidas duas ou mais vezes. Desta maneira, a presente invenção provê domínios de ligação a antígeno e anticorpos cuja atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela em uma faixa de pH neutro, que são obtidos através de um método de avaliação que compreende ainda as etapas de repetição, duas ou mais vezes, das etapas (a) a (c) ou (a) a (d) nos métodos de avaliação descritos acima. O número de vezes que as etapas (a) a (c) ou (a) a (d) são repetidas não é particularmente limitado; no entanto, o número é 10 ou menos em geral.
[0954] Nos métodos de avaliação da presente invenção, a ativida de de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, não é particularmente limitada, contanto que ela seja a atividade de ligação a antígeno em um pH entre 4,0 e 6,5 e inclua a atividade de ligação a antígeno em um pH entre 4,5 e 6,6 como o pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela em um pH entre 5,0 e 6,5 e aquela em um pH entre 5,5 e 6,5 como outro pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela no pH no endossomo inicial in vivo como o pH mais preferido, e especificamente aquela em pH 5,8. Entretanto, a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, não é particularmente limitada, contanto que ela seja a atividade de ligação a antígeno em pH entre 6,7 e 10, e inclui a atividade de ligação a antígeno em um pH entre 6,7 e 9,5 como o pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela em um pH entre 7,0 e 9,5 e aquela em um pH entre 7,0 e 8,0 como outro pH preferido. A atividade de ligação a antígeno também inclui aquela no pH de plasma in vivo como o pH mais preferido e, especificamente, aquela em pH 7,4.
[0955] A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo pode ser medida através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Aqueles versados na técnica podem determinar adequadamente condições que não concentração de cálcio ionizado. A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo pode ser avaliada com base na constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD), constante de taxa de dissociação (kd), constante de taxa de dissociação aparente (kd) e similar. Essas podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou FACS.
[0956] Aqui, a etapa de seleção de um domínio de ligação a antí-geno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é maior do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é sinônimo da etapa com seleção de um domínio de ligação a antígeno ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, é menor do que aquela em concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro.
[0957] Contanto que a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, seja maior do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, a diferença entre a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, uma faixa de pH neutro, e aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, uma faixa de pH ácido, não é particularmente limitada; no entanto, a atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é preferivelmente duas vezes ou mais, mais preferivelmente 10 vezes ou mais e ainda mais preferivelmente 40 vezes ou mais do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido.
[0958] O domínio de ligação a antígeno ou anticorpo da presente invenção avaliado através dos métodos de avaliação descritos acima pode ser qualquer domínio de ligação a antígeno ou anticorpo, e o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo mencionado acima pode ser avaliado. Por exemplo, domínio de ligação a antígeno ou anticorpo tendo a sequência nativa pode ser avaliado, e domínio de ligação a antígeno ou anticorpo em que suas sequências de aminoácido foram substituídas pode ser avaliado.
[0959] O domínio de ligação a antígeno ou anticorpo da presente invenção a ser avaliado através dos métodos de avaliação descritos acima pode ser preparado de qualquer maneira. Por exemplo, anticorpos convencionais, bibliotecas convencionais (biblioteca de fago, etc), anticorpos ou bibliotecas preparados através de células B de animais imunizados ou de hibridomas obtidos através de animais de imunização, anticorpos ou bibliotecas (bibliotecas com teor de aminoácidos alto com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, bibliotecas introduzidas com aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não natural em posições específicas, etc) obtidos através da introdução de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não natural nos anticorpos ou bibliotecas descritos acima podem ser usados.
[0960] Métodos para obtenção de um domínio de ligação a antíge-no ou anticorpo cuja atividade de ligação a antígeno em uma concentração de íon de hidrogênio baixa ou pH alto, isto é, em uma faixa de pH neutro, é maior do que aquela em uma concentração de íon de hidrogênio alta ou pH baixo, isto é, em uma faixa de pH ácido, a partir de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos preparados a partir de hibridomas obtidos através de imunização de animais ou de células B de animais imunizados incluem preferivelmente, por exemplo, a molécula de ligação a antígeno ou anticorpo em que pelo menos um dos aminoácidos do domínio de ligação a antígeno ou anticorpo é substituído com um aminoácido com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou uma mutação de aminoácido não natural, ou o domínio de ligação a antígeno ou anticorpo inserido com um aminoácido com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácido não natural, tais como aqueles descritos no WO 2009/125825.
[0961] Os sítios de introdução de mutações de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina ou ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais não são particularmente limitados, e podem ser qualquer posição contanto que a atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido se torne mais fraca do que aquela em uma faixa de pH neutro (o valor de KD (em uma faixa de pH ácido)/KD (em uma faixa de pH neutro) ou kd (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma faixa de pH neutro) é aumentado) comparado com antes da substituição ou inserção. Por exemplo, quando a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, a região variável de anticorpo e CDRs são adequadas. Aqueles versados na técnica podem determinar apropriadamente o número de aminoácidos a serem substituídos ou o número de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais a serem inseridos. É possível substituir um único aminoácido tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâ- mico) ou um aminoácido não natural único; é possível inserir um ami- noácido único tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácido não natural único; é possível substituir dois ou mais aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou dois ou mais aminoácidos não naturais; e é possível inserir dois ou mais aminoáci- dos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou dois ou mais aminoácidos não naturais. Alternativamente, outros aminoácidos podem ser deletados, adicionados, inseridos e/ou substituídos concomitantemente, com a exceção da substituição em aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais ou a inserção de aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,08,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não na- turais. Substituição ou inserção de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais pode ser realizada aleatoriamente através de métodos tal como varredura com histidina, em que a alanina de varredura de alanina conhecida daqueles versados na técnica é substituída com histidina. Moléculas de ligação a antígeno exibindo um valor de KD maior (em uma faixa de pH ácido)/KD (em uma faixa de pH neutro) ou kd (em uma faixa de pH ácido)/kd (em uma faixa de pH neutro) comparado com antes da mutação podem ser selecionadas de domínios de ligação a antígeno ou anticorpos introduzidos com inserções aleatórias ou mutações de substituição de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâ- mico) ou aminoácidos não naturais.
[0962] Exemplos preferidos de moléculas de ligação a antigen contendo a mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais conforme acima descrito e cuja atividade de ligação a antíge- no em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela em uma faixa de pH neutro incluem moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno na faixa de pH neutro após a mutação em aminoá- cidos com um pKa de cadeia lateral de 4,-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais é comparável àquela antes da mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais. Aqui, "uma molécula de ligação a antígeno após a mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais tendo uma atividade de ligação a antígeno comparável com aquela antes da mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais" significa que, quando tomando a atividade de ligação a antí- geno de uma molécula de ligação a antígeno antes da mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais como 100%, a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antí- geno após a mutação com aminoácidos tendo um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoáci- dos não naturais é pelo menos 10% ou mais, preferivelmente 50% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais e ainda mais preferivelmente 90% ou mais. A atividade de ligação a antígeno após a mutação de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais em pH 7,4 pode ser maior do que aquela antes da mutação de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais em pH 7,4. Se a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno for diminuída devido à inserção de ou substituição em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, a atividade de ligação a antígeno pode ser feita para ser comparável com aquela antes da inserção de ou substituição em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, através da introdução de uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos da molécula de ligação a antíge- no. A presente invenção também inclui moléculas de ligação a antíge- no cuja atividade de ligação foi ajustada para ser comparável através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoá- cidos após substituição ou inserção de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais.
[0963] Entretanto, quando uma molécula de ligação a antígeno é uma substância contendo uma região constante de anticorpo, modalidades preferidas de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela em uma faixa de pH neutro incluem métodos em que as regiões constantes de anticorpo contidas nas moléculas de ligação a antígeno foram modificadas. Exemplos específicos de regiões constantes de anticorpo modificadas incluem preferivelmente as regiões constantes de SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14.
[0964] Aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antigen de domínio de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de hidrogênio
[0965] Os domínios de ligação a antígeno ou anticorpos da presente invenção a serem avaliados através dos métodos de avaliação descritos acima podem ser preparados de qualquer maneira. Por exemplo, quando condição de concentração de íon é condição de concentração de íon hidrogênio ou condição de pH, anticorpos convencionais, bibliotecas convencionais (biblioteca de fago, etc), anticorpos ou bibliotecas preparados a partir de células B de animais imunizados ou de hibridomas obtidos através de imunização de animais, anticorpos ou bibliotecas (bibliotecas com teor de aminoácidos alto com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, bibliotecas introduzidas com mutações de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais em posições específicas, etc.) obtidos através da introdução de mutações de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais nos anticorpos ou bibliotecas descritos acima podem ser usados.
[0966] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca contendo moléculas de ligação a antígeno múltiplas da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser também construída combinando regiões variáveis de cadeia pesada, produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada, com regiões variáveis de cadeia leve introduzidas com "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio".
[0967] Tais resíduos de aminoácido incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR1 de cadeia leve. Os resíduos de aminoácido também incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve. Os resíduos de aminoácido também incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido contidos na CDR3 de cadeia leve.
[0968] Os resíduos de aminoácido descritos acima contidos na CDR1 de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido de posições 24, 27, 28, 31, 32 e/ou 34 de acordo com numeração Kabat na CDR1 de região variável de cadeia leve. Entretanto, os resíduos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido de posições 50,5 1, 52, 53, 54, 55 e/ou 56 de acordo com numeração Kabat na CDR2 de região variável de cadeia leve. Ainda, os resíduos de aminoácido na CDR3 de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, resíduos de aminoácido nas posições 89, 90, 91, 92, 93, 94 e/ou 95A de acordo com numeração Kabat na CDR3 de região variável de cadeia leve. Além disso, os resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou podem estar contidos em combinação de dois ou mais aminoácidos contanto que eles permitam a mudança na atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da concentração de íon de hidrogênio.
[0969] Mesmo quando a região variável de cadeia pesada produzida como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada é combinada com a região variável de cadeia leve descrita acima introduzida com "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio", é possível projetar de maneira que os resíduos flexíveis estejam contidos na sequência da região variável de cadeia leve da mesma maneira que descrito acima. O número e a posição dos resíduos flexíveis não são particularmente limitados a uma modalidade específica, contanto que a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção mude dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio. Especificamente, as sequências de CDR e/ou FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Por exemplo, resíduos flexíveis a serem introduzidos nas sequências das regiões variáveis de cadeia leve incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, os resíduos de amino- ácido listados nas Tabelas 3 e 4. Entretanto, sequências de aminoáci- do de regiões variáveis de cadeia leve que não os resíduos flexíveis e resíduos de aminoácido que mudam a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio adequadamente incluem, mas não estão limitadas a, sequências de linhagem germinativa tais como Vk1 (SEQ ID NO: 5), Vk2 (SEQ ID NO: 6), Vk3 (SEQ ID NO: 7) e Vk4 (SEQ ID NO: 8).Tabela 3 e 4 (Posição indica numeração Kabat)
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Tabela 4
Figure img0004
[0972] Posição indica numeração Kabat
[0973] Qualquer resíduo de aminoácido pode ser adequadamente usado como os resíduos de aminoácido descritos acima que mudam a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da condição da concentração de íon de hidrogênio. Es-pecificamente, tais resíduos de aminoácido incluem aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0-8,0. Tais aminoácidos de liberação de elétron incluem preferivelmente, por exemplo, aminoácidos de ocorrência natural tais como histidina e ácido glutâmico, bem como amino- ácidos não naturais tais como análogos de histidina (US20090035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3,5-Br2-Tyr (pKa 7,21) e 3,5-12-Tyr (pKa 7,38) (Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 37612768). Resíduos de aminoácido particularmente preferidos incluem, por exemplo, aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 6,0-7,0. Tais resíduos de aminoácido de liberação de elétron incluem preferivelmente, por exemplo, histidina.
[0974] Métodos conhecidos tais como mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de Extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados para modificar os aminoácidos de domínios de ligação a an- tígeno. Ainda, vários métodos conhecidos podem ser também usados como um método de modificação de aminoácido para substituição de aminoácidos com aqueles que não aminoácidos naturais (Annu. Rev. Biophyys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de tradução livre de célula (Clover Direct (Protein Express)) contendo tRNas em que tRNA supressor âmbar, que é complementar a códon UAG (códon âmbar) que é um códon de parada, é ligado com um aminoáci- do não natural pode ser adequadamente usado.
[0975] A região variável de cadeia pesada preferida que é usada em combinação inclui, por exemplo, bibliotecas de região variável aleatorizadas. Métodos conhecidos são apropriadamente combinados como um método para produção de uma biblioteca de região variável aleatorizada. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo derivados de animais imunizados com antígenos específicos, pacientes com infecção ou pessoas com um título de anticorpo elevado em sangue como um resultado de vacinação, pacientes com câncer ou linfóci- tos de doenças autoimunes pode ser adequadamente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.
[0976] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, da mesma maneira que descrito acima, uma biblioteca sintética em que as sequências de CDR de genes V de DNA genômico ou genes V reconstruídos funcionais são substituídas com um conjunto de oligo- nucleotídeos sintéticos contendo as sequências codificando conjuntos de códon de um comprimento apropriado pode ser também adequadamente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada. Neste caso, a sequência de CDR3 sozinha pode ser substituída porque variedade na sequência de gene de CDR3 de cadeia pesada é observada. A base para dar origem a variações de aminoácido na região variável de uma molécula de ligação a antígeno é gerar variações de resíduos de aminoácido de posições expostas à superfície da molécula de ligação a antígeno. A posição exposta à superfície se refere a uma posição em que um aminoácido é exposto na superfície e/ou contatado com um antígeno com base na conformação, conjunto es-trutural e/ou estrutura modelada de uma molécula de ligação a antíge- no e, em geral, tais posições são as CDRs. As posições expostas à superfície são preferivelmente determinadas usando as coordenadas derivadas de um modelo tridimensional da molécula de ligação a antí- geno usando programas de computador tal como o programa InsightII (Accelrys). As posições expostas à superfície podem ser determinadas usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). As posições expostas à superfície podem ser determinadas com base na informação na estrutura tridimensional de anticorpos usando software adequado para modelagem de proteína. Software que é adequadamente usado para este propósito inclui o software de módulo de biopolímero SYBYL (Tripos Associates). Quando o algoritmo requer o parâmetro de tamanho de registro do usuário, o "tamanho" de sonda para uso em computação é geralmente ou prefe-rivelmente ajustado em cerca de 1,4 Angstrom ou menos de raio. Ain- da, um método para determinação de região e área expostas à superfície usando software de computador pessoal é descrito por Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; e J. Mol. Model. (1995) 1, 4653).
[0977] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca pura construída a partir de genes de anticorpo derivados de linfócitos de pessoas saudáveis e consistindo em sequências puras, que são repertório imparciais de sequências de anticorpo, pode ser também particularmente adequadamente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada (Gejima e outros (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); e Cardoso e outros (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)).
Atividade de neutralização
[0978] Uma modalidade não limitante da presente invenção prove uma molécula de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido incluindo um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a receptor FCY e tendo atividade de neutralização contra um antígeno, onde o domínio de ligação a antíge- no tem atividade de ligação a antígeno que muda dependendo da condição de concentração de íon e o domínio de ligação a receptor Fcy tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy em uma condição de faixa de pH neutro do que uma região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose; e uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação a antígeno. Em geral, atividade de neutralização se refere à atividade de inibição da atividade biológica de um ligante, tais como vírus e toxinas, tendo atividade biológica sobre células. Desta maneira, substâncias tendo atividade de neutralização se refere a substâncias que se ligam ao ligante ou ao receptor ao qual o ligante se liga, e inibem a ligação entre o ligante e o receptor. Receptores bloqueados de ligação com o ligante pela atividade de neutralização não serão capazes de exibir atividade biológica através deste receptor. Quando a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, tal anticorpo tendo atividade de neutralização é geralmente chamado um anticorpo de neutralização. Atividade de neutralização de uma substância de teste pode ser medida comparando a atividade biológica na presença de um ligante entre quando a substância de teste está presente e ausente.
[0979] Por exemplo, os principais ligantes possíveis para o receptor de IL-6 incluem preferivelmente IL-6 conforme mostrado na SEQ ID NO: 15. O receptor de IL-6, que é uma proteína de membrana tipo I com seu terminal amino formando o domínio extracelular, forma um heterotetrâmero com um receptor gp130 que foi induzido dimerizar por IL-6 (Heinrich e outros (Biochem. J. (1998) 334, 297-314)). Formação do heterotetrâmero ativa Jak que está associada com o receptor gp130. Jak sofre autofosforilação e fosforila o receptor. O sítio de fos- forilação do receptor e Jak servem como um sítio de ligação para moléculas carregando SH2 pertencentes à família Stat tal como Stat3; MAP cinase; PI3/Akt; e outras proteínas e adaptadores carregando SH2. Em seguida, Stat ligada ao receptor gp130 é fosforilada por Jak. A Stat fosforilada dimeriza e se move para o núcleo, e regula a trans-crição de genes alvo. Jak ou Stat pode também estar envolvida em cascatas de sinal via receptores de outras classes. Cascatas de sinal de IL-6 desreguladas são observadas em condições de inflamação e patológicas de doenças autoimunes e cânceres tais como câncer de próstata e mieloma múltiplo. Stat3 que pode agir como um oncogene é constitutivamente ativada em muitos cânceres. Em câncer de próstata e mieloma múltiplo, há uma interferência (crosstalk) entre a cascata de sinalização via o receptor de IL-6 e a cascata de sinalização via os membros da família de receptor de fator de crescimento epitelial (EGFR) (Epithelial Growth Factor Receptor) (Ishikawa e outros (J. Clin. Exp. Hematopathol. (2006) 46(2), 55-66)).
[0980] Tais cascatas de sinalização intracelular são diferentes pa ra cada tipo de célula; desta maneira, moléculas alvo apropriadas podem ser determinadas para cada célula alvo de interesse e não são limitadas aos fatores mencionados acima. Atividade de neutralização pode ser avaliada através da medição da ativação de sinalização in vivo. Ainda, a ativação de sinalização in vivo pode ser detectada usando como um índice a ação de indução da transcrição de um gene alvo que existe a jusante da cascata de sinalização in vivo. Mudança na atividade de transcrição do gene alvo pode ser detectada pelo princípio de ensaios relatados. Especificamente, um gene repórter tal como proteína verde fluorescente (GFP) (Green Fluorescent Protein) ou luciferase é posto a jusante de uma região promotora ou um fator de transcrição do gene-alvo, sua atividade de repórter é medida, e desta maneira mudança na atividade de transcrição pode ser medida como a atividade repórter. Estojos comercialmente disponíveis para medição da ativação de sinalização in vivo podem ser usados apropriadamente (por exemplo, Mercury Pathway Profiling Luciferase System (Clon- tech)).
[0981] Ainda, para métodos de medição da atividade de recepto-res/ligantes de neutralização da família de receptor EGF e similar, que normalmente agem sobre cascatas de sinalização que funcionam com relação à promoção de proliferação celular, a atividade de neutralização de anticorpos de neutralização pode ser avaliada através da medição da atividade de proliferação de células alvo. Por exemplo, quando células são promovidas para proliferar por fatores de crescimento da família EGF tal como HB-EGF, o efeito inibidor sobre a proliferação de tais células com base na atividade de neutralização de um anticorpo anti-HB-EGF pode ser adequadamente avaliado ou medido através dos métodos que seguem: Para avaliação ou medição da atividade inibidora de proliferação celular in vitro, um método de medição da incorporação de timidina marcada com [3H] adicionada ao meio por células viáveis como um índice de habilidade de replicação de DNA é usado. Como métodos mais convenientes, um método de exclusão de corante, onde a habilidade de uma célula em excluir um corante tal como azul tripano da célula é medida sob o microscópio, e o método MTT, são usados. O último método faz uso da habilidade de células viáveis em converter MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil te- trazólio), que é um sal de tetrazólio, em um produto azul de formaza- no. Mais especificamente, um anticorpo de teste é adicionado bem como um ligante à solução de cultura de uma célula de teste, e após um certo período de tempo, a solução de MTT é adicionada à solução de cultura e esta é deixada descansar um pouco para incorporação de MTT à célula. Como resultado, MTT, que é um composto amarelo, é convertido em um composto azul pela ação de succinato desidroge- nase na mitocôndria da célula. Após dissolução deste produto azul para coloração, sua absorbância é medida e usada como um índice para o número de células viáveis. Em adição a MTT, reagentes tais como MTS, XTT, WST-1 e WST-8 estão também comercialmente disponíveis (Nacalai Tesque e similar) e podem ser adequadamente usados. Para medição da atividade, um anticorpo de ligação que é do mesmo isotipo que o anticorpo anti-HB-EGF, mas não tem a atividade inibidora de proliferação celular, pode ser usado como um anticorpo controle da mesma maneira que o anticorpo anti-HB-EGF, e a atividade pode ser determinada quando o anticorpo anti-HB-EGF mostra atividade inibido- ra de proliferação de célula mais forte do que o anticorpo controle.
[0982] Células que podem ser preferivelmente usadas para avaliação da atividade incluem, por exemplo, células promovidas para proliferar por HB-EGF, tal como linhagem de célula de câncer ovariano RMG-1, e células Ba/F3 de camundongo que foram transformadas por um vetor para expressão de um gene codificando hEGFR/mG-CSFR, que é uma proteína de fusão onde o domínio extracelular de EGFR humano é fundido em estrutura com o domínio intracelular de receptor de GCSF de camundongo. Desta maneira, aqueles versados na técnica podem selecionar apropriadamente células a serem usadas para avaliar a atividade e usá-las para medir a atividade de proliferação celular conforme mencionado acima.
[0983] Uma vez que a molécula de ligação a antígeno provida pela presente invenção pode eliminar antígenos do plasma, a molécula de ligação a antígeno em si não tem necessariamente que ter atividade de neutralizacoa. No entanto, é mais favorável bloquear a função do antígeno presente em plasma através do exercício da atividade de neutralização contra o antígeno até que o antígeno seja absorvido com a molécula de ligação a antígeno em células expressando receptor FCY por endocitose mediada por receptor FCY.
[0984] Ainda, uma vez que a molécula de ligação a antígeno provida pela presente invenção pode promover dissociação intracelular de um antígeno, que foi extracelularmente ligado à molécula de ligação a antígeno, de uma molécula de ligação a antígeno, o antígeno que se dissocia da molécula de ligação a antígeno dentro da célula é degradado no lisossoma. Desta maneira, a molécula de ligação a antígeno em si não tem necessariamente que ter atividade de neutralização. No entanto, é mais favorável bloquear a função do antígeno presente em plasma através do exercício da atividade de neutralização contra o an- tígeno até que o antígeno seja absorvido com a molécula de ligação a antígeno em células expressando receptor Fcy por endocitose mediada por receptor Fcy.
[0985] Ainda, uma vez que a molécula de ligação a antígeno provida pela presente invenção pode diminuir a concentração de antígeno total ou concentração de antígeno livre em plasma, a molécula de ligação a antígeno em si não tem necessariamente que ter atividade de neutralização. No entanto, é mais favorável bloquear a função do antí- geno presente em plasma através do exercício da atividade de neutralização contra o antígeno até que o antígeno seja absorvido com a molécula de ligação a antígeno em células expressando receptor FCY por endocitose mediada por receptor FCY.
Receptor FCY
[0986] Receptor Fcy se refere a um receptor capaz de se ligar à região Fc de anticorpos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 monoclonais e inclui todos os membros pertencentes à família de proteínas substancialmente codificadas por um gene de receptor Fcy. Em humanos, a família inclui FcyRI (CD64) incluindo isoformas FcyRIa, FcyRIb e FcyRIc; FcyRII (CD32) incluindo as isoformas FcyRIIa (incluindo alótipos H131 e R131), FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2) e FcyRIIc; e FcyRIII (CD16) incluindo a isoforma FcyRIIIa (incluindo alótipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo alótipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2); bem como todos FcyRs humanos não identificados, isoformas de FcyR e seus alótipos. No entanto, receptor Fcy não é limitado a esses exemplos. Sem ser limitado a eles, FcyR inclui aqueles derivados de humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. FcyR pode ser derivado de qualquer organismo. FcyR de camundongo inclui, sem ser limitado a, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) e FcyRIII-2 (FcyRIV, CD16-2), bem como FcyRs de camundongo não identificados, isoformas de FcyR e seus alótipos. Tais receptores Fcy preferidos incluem, por exemplo, FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32), FcyRIIb (CD32), FcyRIIIa (CD16) e/ou FcyRIIIb (CD16). A sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcyRI são mostradas nas SEQ ID NOs:16 (NM_000566.3) e 17 (NP_000557.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcyRIIa humano (aló-tipo H131) são mostradas nas SEQ ID NOs: 18 (BC020823.1) e 19 (AAH20823.1) (alótipo R131 é uma sequência onde aminoácido na posição 166 de SEQ ID NO: 19 é substituído com Arg), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FCYIIB são mostradas nas SEQ ID NOs: 20 (BC146678.1) e 21 (AAI46679.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcYRIIIa são mostradas nas SEQ ID NOs: 22 (BC033678.1) e 23 (AAH33678.1), respectivamente; e a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcYRIIIb são mostradas nas SEQ ID NOs: 24 (BC128562.1) e 25 (AAI28563.1), respectivamente (número de acesso RefSeq é mostrado em cada parênteses). Se um receptor FCY tem atividade de ligação à região Fc de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 monoclonal pode ser avaliada através de avaliação ALPHA (Ensaio Homogêneo de Proximidade Lu- minescente Amplificado) (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), método BIACORE baseado em ressonância de plas-mon de superfície (SPR) (Surface Plasmon Resonance) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010), em adição aos formatos FACS e ELISA descritos acima.
[0987] Entretanto, "ligante de Fc" ou "ligante efetor" se refere a uma molécula e preferivelmente um peptídeo que se liga a uma região Fc de anticorpo, formando um complexo ligante Fc/Fc. A molécula pode ser derivada de qualquer organismo. A ligação de um ligante de Fc a Fc preferivelmente induz uma ou mais funções efetoras. Tais ligan- tes incluem, mas não estão limitados a, receptores Fc, FcyR, FcαR, FcεR, FcRn, C1q e C3, lectina de ligação à manana, receptor de ma- nose, Proteína A Staphylococcus, Proteína G Staphylococcus e FcyRs viral. Os ligantes de Fc também incluem homólogos do receptor de Fc (FcRH) (Davis e outros (2002) Immunological Reviews 190, 123-136) ou FCRL (Annu. Rev. Immunol. 2007; 25: 525-60), que são uma famí lia de receptores de Fc homólogos a FCYR. Os ligantes de Fc também incluem moléculas não identificadas que se ligam a Fc.
[0988] Em FCYRI (CD64) incluindo FcYRIa, FcYRIb e FCYRIC, e FcyRIII (CD16) incluindo isoformas FcYRIIIa (incluindo alótipos V158 e F158) e FcYRIIIb (incluindo alótipos FcYRIIIb-NA1 e FcYRIIIb-NA2), cadeia α que se liga à porção Fc de IgG está associada com cadeia Y comum tendo ITAM responsável por transdução de sinal de ativação intracelular. Entretanto, o domínio citoplásmico de FcyRII (CD32) incluindo isoformas FcyRIIa (incluindo alótipos H131 e R131) e FcyRIIc contém ITAM. Esses receptores são expressos em muitas células imunes tais como macrófagos, mastócitos e células apresentando an- tígeno. O sinal de ativação transduzido quando da ligação desses receptores à porção Fc de IgG resulta em aumento da atividade fagocíti- ca e produção de citocina inflamatória de macrófagos, desgranulação de mastócito e a função aumentada de células apresentando antígeno. Receptores Fcy tendo a habilidade em transduzir o sinal de ativação conforme descrito acima podem ser também referidos como receptores Fcy de ativação.
[0989] Entretanto, o domínio intracitoplásmico de FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2) contém ITIM responsável pela transdução de sinais inibidores. A reticulação entre FcyRIIb e receptor de célula B (BCR) em células B suprime o sinal de ativação a partir de BCR, o que resulta em supressão de produção de anticorpo via BCR. A reticulação de FcyRIII e FcyRIIb em macrófagos suprime a atividade fagocítica e produção de citocina inflamatória. Receptores Fc tendo a habilidade em transduzir o sinal inibidor conforme acima descrito também são referidos como receptores Fcy inibidores.
Atividade de ligação ao receptor FCY
[0990] A atividade de ligação de um domínio de ligação a FcyR, que está incluído em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção, a qualquer um dos receptores FCY humanos, FCYRI, FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa e/ou FcYRIIIb, pode ser confirmada através de formato FACS ou ELISA acima descrito, bem como ALPHA Screen (Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificado), um método BIACORE usando o fenômeno de ressonância de plasmon de superfície (SPR) ou similar (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010). O domínio extracelular de um receptor Fcy humano pode ser usado como o antígeno solúvel nesses ensaios.
[0991] Avaliação ALPHA é realizada através da tecnologia ALPHA com base no princípio descrito abaixo usando dois tipos de contas: contas doadoras e aceitadoras. Um sinal luminescente é detectado apenas quando moléculas ligadas às contas doadoras interagem biologicamente com moléculas ligadas às contas aceitadoras e quando as duas contas estão localizadas em proximidade grande. Excitado por um feixe de laser, o fotossensibilizador em uma conta doadora converte oxigênio em torno da conta em oxigênio singleto excisado. Quando o oxigênio singleto difunde em torno das contas doadoras e atinge as contas aceitadores localizadas em proximidade grande, uma reação quimioluminescente dentro das contas aceitadoras é induzida. Esta reação resulta por fim em emissão de luz. Se moléculas ligadas às contas doadoras não interagem com moléculas ligadas a contas aceitadoras, o oxigênio singleto produzido por contas doadoras não atinge as contas aceitadoras e reação quimioluminescente não ocorre.
[0992] Por exemplo, uma molécula de ligação a antígeno marcada com biotina compreendendo região Fc é imobilizada para as contas doadoras e receptor Fcy marcado com glutationa S-transferase (GST) é imobilizado para as contas aceitadoras. Na ausência de uma molécula de ligação a antígeno compreendendo uma variante de região Fc competitiva, receptor Fcy interage com uma molécula de ligação a an- tígeno compreendendo uma região Fc nativa, induzindo um sinal de 520 a 620 nm como um resultado. Uma molécula de ligação a antíge- no não marcada tendo uma variante de região Fc não marcada compete com a molécula de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc do tipo selvagem para interação com o receptor FCY. A afinidade de ligação relativa pode ser determinada através da quantificação da redução de fluorescência como um resultado de competição. Métodos para biotinilação das moléculas de ligação a antígeno tais como anticorpos usando Sulfo-NHS-biotina ou similar são conhecidos. Métodos apropriados para adição de marcador GST a um receptor Fcy incluem métodos que envolvem fusão de polipeptídeos codificando Fcy e GST em estrutura, expressão do gene fundido usando células introduzidas com um vetor ao qual o gene é operavelmente ligado, e então purificação usando uma coluna de glutationa. O sinal induzido pode ser preferivelmente analisado, por exemplo, ajustando a um modelo de competição de um sítio com base em uma análise de regressão não linear usando software tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego).
[0993] Uma das substâncias para observação de sua interação é imobilizada como um ligante sobre a camada fina de ouro de um sensor chip. Quando luz é posta sobre a superfície traseira do sensor chip de maneira que reflexão total ocorre na interface entre a camada fina de ouro e vidro, a intensidade de luz refletida é parcialmente reduzida em um certo sítio (sinal SPR). A outra substância para observação de sua interação é injetada como um analito sobre a superfície do sensor chip. A massa de molécula de ligante imobilizado aumenta quando o analito se liga ao ligante. Isso altera o índice de refração de solvente na superfície do sensor chip. A mudança em índice de refração causa uma mudança posicional de sinal SPR (por outro lado, a dissociação muda o sinal de volta para a posição original). No sistema Bioacore, a quantidade de mudança descrita acima (isto é, a mudança de massa na superfície do sensor chip) é posta em gráfico no eixo vertical, e então a mudança de massa com o tempo é mostrada como dados medidos (sensorgrama). Parâmetros cinéticos (constante de taxa de associação (ka) e constante de taxa de dissociação (kd)) são determinados a partir da curva de sensorgrama, e afinidade (KD) é determinada a partir da razão entre essas duas constantes. Ensaio de inibição é preferivelmente usado nos métodos BIACORE. Exemplos de tal ensaio de inibição são descritos em Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010.
Domínio de ligação a receptor FCY
[0994] Um domínio de ligação a receptor FCY tendo atividade de ligação a receptor Fcy maior do que uma região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose pode ser produzido através da alteração do aminoácido da região Fc de IgG humana nativa. Ainda, qualquer estrutura do domínio de ligação a antígeno descrito anteriormente, que é caracterizado por ser ligado a um receptor Fcy, pode ser usado para o domínio de ligação ao receptor Fcy. Em tal caso, o domínio de ligação a Fcy pode ser produzido sem a necessidade de introdução de alterações de aminoácido ou afinidade com o receptor Fcy pode ser aumentada através da introdução de alterações adicionais. Exemplos de tal domínio de ligação a receptor Fcy incluem um anticorpo de fragmento Fab que se liga a FcyRIIa, que é descrito em Protein Eng. Des. Sel. Mar de 2009;22(3):175-88, Protein Eng. Des. Sel. Jan 2008;21(1):1-10 e J. Immunol. 1 Jul 2002;169(1):137-44, um anticorpo de domínio único derivado de camelo e um anticorpo Fv de cadeia simples e um peptídeo cíclico de ligação a FcyRI descrito em FASEB J. Fev 2009;23(2):575-85. Se ou não atividade de ligação a FcyR do domínio de ligação a receptor Fcy é maior do que aquela da região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose pode ser determinada apropriadamente usando o método descrito na seção mencionada acima sobre atividade de ligação.
[0995] Na presente invenção, uma região Fc de IgG humana é um exemplo adequado de um domínio de ligação a receptor FCY de material de partida. Na presente invenção, "alteração do aminoácido" da região Fc inclui alteração da sequecia de aminoácido da região Fc do material de partida para uma sequência de aminoácido diferente. Contanto que a variante modificada da região Fc de material de partida possa se ligar a um receptor Fcy humano em uma faixa de pH neutro, qualquer região Fc pode ser usada como a região Fc de material de partida. Ainda, uma região Fc produzida através da alteração adicional de uma região Fc já alterada usada como uma região Fc inicial pode também ser preferivelmente usada como a região Fc da presente invenção. A "região Fc inicial" pode se referir ao próprio polipeptídeo, uma composição compreendendo a região Fc de partida ou uma sequência de aminoácido codificando a região Fc de partida. Regiões Fc de partida podem compreender uma região Fc conhecida produzida via recombinação descrita rapidamente na seção "Anticorpos". A origem das regiões Fc de partida não é limitada, e elas podem ser obtidas a partir de humanos ou quaisquer organismos não humanos. Tais organismos incluem preferivelmente camundongos, ratos, porquinhos- da-índia, hamsters, gerbilos, gatos, coelhos, cachorros, cabras, ovelha, bovinos, cavalos, camelos e organismos selecionados de primatas não humanos. Em outra modalidade, domínios de ligação a receptor Fcy de partida podem ser também obtidos a partir de macacos cino- mólogos, marmotas, macacos rhesus, chimpanzés ou humanos. Regiões Fc iniciais podem ser obtidas preferivelmente a partir de IgG1 humana; no entanto, elas não estão limitadas a nenhuma classe de IgG particular. Isso significa que uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana pode ser usada apropriadamente como uma região Fc inicial, e aqui também significa que uma região Fc de uma classe ou subclasse IgG arbitrária derivada de quaisquer organismos descritos acima pode ser preferivelmente usada como uma região Fc inicial. Exemplos de variantes de IgG de ocorrência natural ou formas modificadas são descritos nos documentos publicados (Curr. Opin. Bio- technol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; WO 2009/086320; WO 2008/092117; WO 2007/041635; e WO 2006/105338); no entanto, elas não são limitadas aos exemplos.
[0996] Exemplos de alterações incluem aquelas com uma ou mais mutações, por exemplo, mutações através da substituição de aminoá- cidos por resíduos de aminoácido diferentes de regiões Fc iniciais, através da inserção de um ou mais resíduos de aminoácido em regiões Fc iniciais ou através da deleção de um ou mais aminoácidos da região Fc inicial. Preferivelmente, as sequências de aminoácido de regiões Fc alteradas compreendem pelo menos uma parte da sequência de aminoácido de uma região Fc não nativa. Tais variantes têm necessariamente identidade ou similaridade de sequência de menos do que 100% com sua região Fc inicial. Em uma modalidade preferida, as variantes têm identidade ou similaridade de sequência de aminoácido de cerca de 75% a menos do que 100%, mais preferivelmente cerca de 80% a menos do que 100%, ainda mais preferivelmente cerca de 85% a menos do que 100%, sobretudo preferivelmente 90% a menos do que 100% e ainda sobretudo preferivelmente cerca de 95% a menos do que 100% da sequência de aminoácido de sua região Fc inicial. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, pelo menos um aminoácido é diferente entre uma região Fc modificada da presente invenção e sua região Fc inicial. A diferença de aminoácido entre uma região Fc modificada da presente invenção e sua região Fc inicial pode ser também preferivelmente especificada com base nas diferenças de aminoácido nas posições de aminoácido particulares descritas acima de acordo com o sistema de numeração EU.
[0997] Métodos conhecidos tais como mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de Extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados para modificar os aminoácidos de regiões Fc. Ainda, vários métodos conhecidos podem ser também usados como um método de modificação de aminoácido para substituição de aminoácidos por aqueles que não aminoácidos naturais (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100(11), 6353-6357). Por exemplo, um sistema de tradução livre de célula (Clover Direct (Protein Express)) contendo tRNas onde tRNA supressor âmbar, que é complementar a códon UAG (códon âmbar) que é um códon de parada, é ligado com um aminoácido não natural pode ser adequadamente usado.
[0998] Uma região Fc tendo atividade de ligação ao receptor FCY em uma faixa de pH neutro que está contida nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção pode ser obtida através de qualquer método, mas especificamente, uma região Fc tendo atividade de ligação a receptor Fcy na faixa de pH neutro pode ser obtida através da alteração dos aminoácidos de imunoglobulina IgG humana usada como uma região Fc inicial. Regiões Fc da imunoglobulina IgG preferidas a serem alteradas incluem, por exemplo, as regiões Fc de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 e suas variantes). Regiões Fc de IgG incluem mutantes naturalmente formados a partir delas. Várias sequências de alótipo devido a polimorfismo genético são descritas em "Sequences of proteins of immunological interest", Publicação NIH No. 91-3242, para as regiões Fc de anticorpos IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana, e qualquer uma delas pode ser usada na presente invenção. Em particular para a sequência de IgG1 humana, a sequência de aminoácido nas posições 356 a 358 (numeração EU) pode ser ou DEL ou EEM.
[0999] Aminoácidos em quaisquer posições podem ser alterados para outros aminoácidos contanto que a região Fc tenha atividade de ligação a receptor FCY em uma faixa de pH neutro ou sua atividade de ligação a receptor FCY em uma faixa neutra possa ser aumentada. Quando uma molécula de ligação a antígeno contém a região Fc de IgG1 humana, é preferido incluir alterações que resultem em aumento de ligação a receptor Fcy em uma faixa de pH neutro comparado com a atividade de ligação da região Fc inicial de IgG1 humana. Alterações de aminoácido para aumento atividade de ligação a receptor Fcy em uma faixa de pH neutro foram relatadas, por exemplo, no WO 2007/024249, WO 2007/021841, WO 2006/031370, WO 2000/042072, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO 2006/105338, WO 2007/041635, WO 2008/092117, WO 2005/070963, WO 2006/020114, WO 2006/116260 e WO 2006/023403.
[01000] Exemplos de tais aminoácidos que podem ser alterados incluem pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo naqueles nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 de acordo com numeração EU. Alteração desses aminoácidos aumenta a ligação ao receptor Fcy de uma região Fc de imunoglobulina IgG em uma faixa de pH neutro.
[01001] Alterações particularmente preferidas para uso na presente invenção incluem as alterações que seguem:
[01002] o aminoácido na posição 221 ou para Lys ou Tyr;
[01003] o aminoácido na posição 222 para qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr;
[01004] o aminoácido na posição 223 para qualquer um de Phe, Trp, Glu e Lys;
[01005] o aminoácido na posição 224 para qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr;
[01006] o aminoácido na posição 225 para qualquer um de Glu, Lys e Trp;
[01007] o aminoácido na posição 227 para qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr;
[01008] o aminoácido na posição 228 para qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr;
[01009] o aminoácido na posição 230 para qualquer um de Ala, Glu, Gly e Tyr;
[01010] o aminoácido na posição 231 para qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr;
[01011] o aminoácido na posição 232 para qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr;
[01012] o aminoácido na posição 233 para qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01013] o aminoácido na posição 234 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01014] o aminoácido na posição 235 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01015] o aminoácido na posição 236 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01016] o aminoácido na posição 237 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01017] o aminoácido na posição 238 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01018] o aminoácido na posição 239 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01019] o aminoácido na posição 240 para qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr;
[01020] o aminoácido na posição 241 para qualquer um de Asp, Glu, Leu, Arg, Tpr e Tyr;
[01021] o aminoácido na posição 243 para qualquer um de Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Tpr e Tyr;
[01022] o aminoácido na posição 244 para His;
[01023] o aminoácido na posição 245 para Ala;
[01024] o aminoácido na posição 246 para qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr;
[01025] o aminoácido na posição 247 para qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val e Tyr;
[01026] o aminoácido na posição 249 para qualquer um de Glu, His, Gln e Tyr;
[01027] o aminoácido na posição 250 para ou Glu ou Gln;
[01028] o aminoácido na posição 251 para Phe;
[01029] o aminoácido na posição 254 para qualquer um de Phe, Met ou Tyr;
[01030] o aminoácido na posição 255 para qualquer um de Glu, Leu e Tyr;
[01031] o aminoácido na posição 256 para qualquer um de Ala, Met e Pro;
[01032] o aminoácido na posição 258 para qualquer um de Asp, Glu, His, Ser e Tyr;
[01033] o aminoácido na posição 260 para qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr;
[01034] o aminoácido na posição 262 para qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile e Thr;
[01035] o aminoácido na posição 263 para qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr;
[01036] o aminoácido na posição 264 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr;
[01037] o aminoácido na posição 265 para qualquer um de Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp e Tyr;
[01038] o aminoácido na posição 266 para qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr;
[01039] o aminoácido na posição 267 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01040] o aminoácido na posição 268 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Trp;
[01041] o aminoácido na posição 269 para qualquer um de Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01042] o aminoácido na posição 270 para qualquer um de Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr;
[01043] o aminoácido na posição 271 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01044] o aminoácido na posição 272 para qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, val, Trp e Tyr;
[01045] o aminoácido na posição 273 ou para Phe ou Ile;
[01046] o aminoácido na posição 274 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01047] o aminoácido na posição 275 ou para Leu ou Trp;
[01048] o aminoácido na posição 276 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01049] o aminoácido na posição 278 para qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp;
[01050] o aminoácido na posição 279 para Ala;
[01051] o aminoácido na posição 280 para qualquer um de Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp e Tyr;
[01052] o aminoácido na posição 281 para qualquer um de Asp, Lys, Pro e Tyr;
[01053] o aminoácido na posição 282 para qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr;
[01054] o aminoácido na posição 283 para qualquer um de Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg e Tyr;
[01055] o aminoácido na posição 284 para qualquer um de Asp, Glu, Leu, Asn, Thr e Tyr;
[01056] o aminoácido na posição 285 para qualquer um de Asp, Glu, Lys, Gln, Trp e Tyr;
[01057] o aminoácido na posição 286 para qualquer um de Glu, Gly, Pro e Tyr;
[01058] o aminoácido na posição 288 para qualquer um de Asn, Asp, Glu e Tyr;
[01059] o aminoácido na posição 290 para qualquer um de Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp e Tyr;
[01060] o aminoácido na posição 291 para qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln e Thr;
[01061] o aminoácido na posição 292 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Pro, Thr e Tyr;
[01062] o aminoácido na posição 293 para qualquer um de Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01063] o aminoácido na posição 294 para qualquer um de Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01064] o aminoácido na posição 295 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01065] o aminoácido na posição 296 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr e Val;
[01066] o aminoácido na posição 297 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01067] o aminoácido na posição 298 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01068] o aminoácido na posição 299 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr;
[01069] o aminoácido na posição 300 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp;
[01070] o aminoácido na posição 301 para qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr;
[01071] o aminoácido na posição 302 para Ile;
[01072] o aminoácido na posição 303 para qualquer um de Asp, Gly e Tyr;
[01073] o aminoácido na posição 304 para qualquer um de Asp, His, Leu, Asn e Thr;
[01074] o aminoácido na posição 305 para qualquer um de Glu, Ile, Thr e Tyr;
[01075] o aminoácido na posição 311 para qualquer um de Ala, Asp, Asn, Thr, Val e Tyr;
[01076] o aminoácido na posição 313 para Phe;
[01077] o aminoácido na posição 315 para Leu;
[01078] o aminoácido na posição 317 ou para Glu ou Gln;
[01079] o aminoácido na posição 318 para qualquer um de His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Tyr;
[01080] o aminoácido na posição 320 para qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01081] o aminoácido na posição 322 para qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01082] o aminoácido na posição 323 para Ile;
[01083] o aminoácido na posição 324 para qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01084] o aminoácido na posição 325 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Ph, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01085] o aminoácido na posição 326 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01086] o aminoácido na posição 327 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Tpr e Tyr;
[01087] o aminoácido na posição 328 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01088] o aminoácido na posição 329 para qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01089] o aminoácido na posição 330 para qualquer um de Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Tpr e Tyr;
[01090] o aminoácido na posição 331 para qualquer um de Asp, Phe, His, Ile, leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01091] o aminoácido na posição 332 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr;
[01092] o aminoácido na posição 333 para qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val e Tyr;
[01093] o aminoácido na posição 334 para qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro e Thr;
[01094] o aminoácido na posição 335 para qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr;
[01095] o aminoácido na posição 336 para qualquer um de Glu, Lys e Tyr;
[01096] o aminoácido na posição 337 para qualquer um de Glu, His e Asn;
[01097] o aminoácido na posição 339 para qualquer um de Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser e Thr;
[01098] o aminoácido na posição 376 para qualquer um de Ala ou Val;
[01099] o aminoácido na posição 377 ou para Gly ou Lys;
[01100] o aminoácido na posição 378 para Asp;
[01101] o aminoácido na posição 379 para Asn;
[01102] o aminoácido na posição 380 para qualquer um de Ala, Asn e Ser;
[01103] o aminoácido na posição 382 ou para Ala ou Ile;
[01104] o aminoácido na posição 385 para Glu;
[01105] o aminoácido na posição 392 para Thr;
[01106] o aminoácido na posição 396 para Leu;
[01107] o aminoácido na posição 421 para Lys;
[01108] o aminoácido na posição 427 para Asn;
[01109] o aminoácido na posição 428 ou para Phe ou Leu;
[01110] o aminoácido na posição 429 para Met;
[01111] o aminoácido na posição 434 para Trp;
[01112] o aminoácido na posição 436 para Ile; e
[01113] o aminoácido na posição 440 para qualquer um de Gly, His, Ile, Leu e Tyr,
[01114] de acordo com a numeração EU na região Fc.
[01115] O número de aminoácidos que são alterados não é particularmente limitado. Um aminoácido em uma posição apenas pode ser alterado ou aminoácidos em duas ou mais posições podem ser alterados. Exemplos de combinações de alterações de aminoácido em duas ou mais posições incluem as combinações mostradas na Tabela 5 (Tabelas 5-1 a 5-3). Tabela 5-1
Figure img0005
Tabela 5-2
Figure img0006
Tabela 5-3
Figure img0007
[01120] Para as condições de pH para medir a atividade de ligação do domínio de ligação ao receptor FCY contido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção e o receptor FCY, condições em uma faixa de pH ácido ou em uma faixa de pH neutro podem ser usadas adequadamente. A faixa de pH neutro, como condição para medir a atividade de ligação do domínio de ligação ao receptor Fcy contido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção e o receptor Fcy, geralmente indica pH 6,7 a pH 10,0. De preferência, é uma faixa indicada com valores de pH arbitrários entre pH 7,0 e pH 8,0; e preferencialmente, é selecionado de pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8, pH 7,9 e pH 8,0; e particularmente preferencialmente, é pH 7,4, que é próximo do pH do plasma (sangue) in vivo. Aqui, a faixa de pH ácido, como condição para ter uma atividade de ligação do domínio de ligação ao receptor Fcy contido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção e o receptor Fcy, geralmente indica pH 4,0 a pH 6,5. De preferência, indica pH 5,5 a pH 6,5, e particularmente preferencialmente, indica pH 5,8 a pH 6,0, que é próximo do pH no endossoma inicial in vivo. No que diz respeito à temperatura utilizada como condição de medição, a afinidade de ligação entre o domínio de ligação ao receptor Fcy e o receptor Fcy humano pode ser avaliada a qualquer temperatura entre 10°C e 50°C. De preferência, é utilizada uma temperatura entre 15°C e 40°C para determinar a afinidade de ligação entre o domínio de ligação ao receptor Fcy humano e o receptor Fcy. Mais preferencialmente, qualquer tem-peratura entre 20°C e 35°C, tal como qualquer entre 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C ou 35°C, podem ser usados de forma semelhante para determinar a afinidade de ligação entre o domínio de ligação ao receptor Fcy e o receptor Fcy. Uma temperatura de 25°C é um exemplo não limitativo em uma modalidade da presente invenção.
[01121] Aqui, “a atividade de ligação do domínio de ligação ao receptor FCY em relação ao receptor FCY é maior do que a atividade de ligação da região Fc nativa em relação à ativação do receptor FCY” significa que a atividade de ligação do domínio de ligação ao receptor Fcy em relação a qualquer um dos Fcy humanos receptores de FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa e/ou FcyRIIIb é maior do que a atividade de ligação do domínio de ligação ao receptor Fcy nativo em relação a esses receptores Fcy humanos.
[01122] Por exemplo, refere-se à atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno incluindo um domínio de ligação ao receptor Fcy sendo 105% ou mais, preferencialmente 110% ou mais, 115% ou mais, 120% ou mais, 125% ou mais, particularmente preferencialmente 130% ou mais, 135% ou mais, 140% ou mais, 145% ou mais, 150% ou mais, 155% ou mais, 160% ou mais, 165% ou mais, 170% ou mais, 175% ou mais , 180% ou mais, 185% ou mais, 190% ou mais, 195% ou mais, duas vezes ou mais, 2,5 vezes ou mais, três vezes ou mais, 3,5 vezes ou mais, quatro vezes ou mais, 4,5 vezes ou mais, cinco vezes ou mais, 7,5 vezes ou mais, dez vezes ou mais, 20 vezes ou mais, 30 vezes ou mais, 40 vezes ou mais, 50 vezes ou mais, 60 vezes ou mais, 70 vezes ou mais, 80 vezes ou mais mais, 90 vezes ou mais, ou 100 vezes ou mais em comparação com a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno incluindo uma região Fc de uma IgG humana nativa que é usada como controle, com base no método de análise acima mencionado. Para o domínio de ligação ao receptor Fcy nativo, o domínio de ligação ao receptor Fcy do material de partida pode ser usado e o domínio de ligação ao receptor Fcy de um anticorpo nativo pertencente à mesma subclasse também pode ser usado.
[01123] Na presente invenção, em particular, uma região Fc de uma IgG humana nativa, na qual a cadeia de açúcar ligada a um aminoáci- do na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, é adequadamente utilizada como a região Fc de uma IgG humana nativa para ser utilizada como controle. Se a cadeia de açúcar ligada a um aminoácido na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose pode ser determinada usando a técnica descrita no Documento Não Patente 24. Por exemplo, um método como o seguinte permite determinar se a cadeia de açúcar ligada à região Fc de IgG humana nativa é uma cadeia de açúcar contendo fucose. Por reação da N-glicosidase F (Roche diagnostics) com uma IgG humana nativa a ser testada, uma cadeia de açúcar é dissociada da IgG humana nativa a ser testada (Weitzhandler et al. (J. Pharma. Sciences (1994) 83, 12, 1670-1675)). Em seguida, um material enriquecido concentrado de uma solução de reação da qual as proteínas foram removidas por reação com etanol (Schenk et al. (J. Clin. Investigation (2001) 108 (11) 1687-1695)) é marcada por fluorescência por 2- aminopiridina (Bigge et al. (Anal. Biochem. (1995) 230 (2) 229-238)). A cadeia de açúcar modificada com 2-AB marcada com fluorescência produzida pela remoção do reagente por extração em fase sólida usando um cartucho de celulose, é analisada por cromatografia de fase normal. A observação do pico do cromatograma detectado permite determinar se a cadeia de açúcar ligada à região Fc de IgG humana nativa é uma cadeia de açúcar contendo fucose. Exemplos não limitativos de tal região Fc de uma IgG humana nativa, em que a cadeia de açúcar ligada a um aminoácido na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, incluem regiões Fc incluídas em anticorpos obtidos por expressão em Células CHO, tais como CHO-K1 (American Type Culture Collection, ATCC No. CRL-61) ou DXB11 (American Type Culture Collection, ATCC No. CRL-11397), genes que codificam anticorpos contendo uma região Fc de IgG humana nativa. Utilizando as atividades de ligação ao receptor FCY das regiões Fc incluídas em tais anticorpos como controles, as atividades de ligação ao receptor FCY das regiões Fc da presente invenção foram comparadas. Isso permite determinar se o domínio de ligação ao receptor FCY da presente invenção tem maior atividade de ligação ao receptor Fcy do que a região Fc de uma IgG humana nativa na qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia contendo açúcar fucose. Além disso, a quantidade de fucose ligada à cadeia de açúcar incluída nas regiões Fc comparadas pode ser comparada determinando a quantidade de fucose na cadeia de açúcar ligada às regiões Fc incluídas nestes anticorpos e a quantidade de fucose na cadeia de açúcar ligada a as regiões Fc da presente invenção usando métodos como os mencionados acima.
[01124] Como molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc da mesma subclasse de anticorpo nativo que é usada como controle, as moléculas de ligação ao antígeno possuindo uma região Fc de um anticorpo monoclonal IgG podem ser usadas adequadamente. As estruturas de tais regiões Fc são mostradas na SEQ ID NO: 11 (A é adicionado ao terminal N do RefSeq No. de Acesso AAC82527.1), SEQ ID NO: 12 (A é adicionado ao terminal N do RefSeq No. de Acesso AAB59393.1), SEQ ID NO: 13 (RefSeq No. de acesso CAA27268.1) e SEQ ID NO: 14 (A é adicionado ao terminal N do RefSeq No. de acesso AAB59394.1). Além disso, quando uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc de um isotipo de anticorpo particular é usada como substância de teste, o efeito da atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc de teste em direção ao receptor Fcy é testado usando como um controle de uma molécula de ligação a antígeno com uma região Fc de um anticorpo IgG monoclonal desse isotipo específico. Desta forma, as moléculas de ligação ao antígeno contendo uma região Fc cuja atividade de ligação ao receptor Fcy demonstrou ser alta são adequadamente selecionadas.
[01125] Exemplos de domínios de ligação ao receptor FCY adequados para uso na presente invenção incluem domínios de ligação ao receptor Fcy com a propriedade de ter maior atividade de ligação a certos receptores Fcy do que a outros receptores Fcy (domínios de ligação ao receptor Fcy com atividade de ligação ao receptor Fcy). Quando um anticorpo é usado como a molécula de ligação a antígeno (quando uma região Fc é usada como o domínio de ligação ao receptor Fcy), uma vez que uma única molécula de anticorpo só pode se ligar a um único receptor Fcy, uma única molécula de ligação a antí- geno que é ligada a um receptor Fcy inibitório não pode se ligar a outro FcyR ativador, e uma única molécula de ligação a antígeno que está ligada a um receptor Fcy ativador não pode se ligar a outro receptor Fcy ativador nem a um receptor Fcy inibitório.
[01126] Conforme descrito acima, exemplos adequados do receptor Fcy de ativação são FcyRI (CD64) incluindo FcyRIa, FcyRIb e FcyRIc, e FcyRIII (CD16) incluindo isoformas FcyRIIIa (incluindo os alotipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo os alotipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb- NA2). FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2) é um exemplo adequado do receptor Fcy inibidor.
Domínio de ligação a FCYR com atividade de ligação seletiva a um re-ceptor FCY
[01127] Se um domínio de ligação a FcyR da presente invenção tem ou não atividade de ligação seletiva pode ser confirmado comparando as atividades de ligação aos respectivos receptores Fcy, determinado pelo método descrito na seção acima mencionada sobre atividade de ligação a receptores Fcy. Um domínio de ligação a FcyR com maior atividade de ligação a receptores Fcy inibitórios do que a receptores Fcy ativadores pode ser usado como o domínio de ligação a FcyR seletivo incluído na molécula de ligação a antígeno fornecida pela presente invenção. Em uma modalidade não limitativa, um domínio de ligação a FCYR com maior atividade de ligação a FcYRIIb (incluindo FcYRIIb-1 e FcYRIIb-2) do que a um receptor FCY ativador selecionado do grupo que consiste em FcYRI(CD64) incluindo FcYRIa, FcYRIb, FcYRIc, FcYRIII(CD16) incluindo as isoformas FcYRIIIa (incluindo os alotipos V158 e F158) e FcYRIIIb (incluindo os alotipos FcYRIIIb-NA1 e FcYRIIIb-NA2), e FcYRII(CD32) incluindo as isoformas FcYRIIa e FcYRIIc (incluindo os alotipos H131 e R131) podem ser usados como um domínio de ligação a FcYR seletivo incluído em uma molécula de ligação a antígeno fornecida pela presente invenção. Além disso, em uma modalidade não limitativa da presente invenção, um domínio de ligação a FcYR com maior atividade de ligação a FcYRIIb-1 e/ou FcYRIIb-2 do que a FcYRIa, FcYRIb e FcYRIc, FcYRIIIa incluindo o alo- tipo V158, FcYRIIIa incluindo o alotipo F158, FcYRIIIb incluindo o aloti- po FcYRIIIb-NA1, FcYRIIIb incluindo o alotipo FcYRIIIb-NA2, FcYRIIa incluindo o alotipo H131, FcYRIIa incluindo o alotipo R131 e/ou FcYRIIc pode ser usado como um domínio de ligação a FcYR seletivo incluído em uma molécula de ligação a antígeno fornecida pela presente invenção. Pode ser determinado se um domínio de ligação a FcYR a ser testado tem atividade de ligação seletiva aos receptores FcY comparando o valor (razão) obtido pela divisão dos valores KD do domínio de ligação a FcYR para FcYRIa, FcYRIb, FcYRIc, FcYRIIIa incluindo o alo- tipo V158, FcYRIIIa incluindo o alotipo F158, FcYRIIIb incluindo o aloti- po FcYRIIIb-NA1, FcYRIIIb incluindo o alotipo FcYRIIIb-NA2, FcYRIIa incluindo o alotipo H131, FcYRIIa incluindo o alotipo R131 e/ou FcYRIIc pelos valores de KD para FcYRIIb-1 e/ou FcYRIIb-2, em que os valores de KD são determinados pelo método descrito na seção acima mencionada sobre a atividade de ligação aos receptores FcY, ou mais espe-cificamente, comparando os índices de seletividade FcYR mostrados na Equação 1.[Equação 1] Índice de seletividade de FCYR = valor KD para ativar FCYR / valor KD para FCYR inibitório
[01128] Na Equação 1 mencionada acima, “ativar FCYR” refere-se a FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo o alotipo V158, FcyRIIIa incluindo o alotipo F158, FcyRIIIb incluindo o alotipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo o alotipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo o alotipo H131, FcyRIIa incluindo o alotipo R131 e/ou FcyRIIc e FcyR inibitório referem-se a FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2. Embora o FcyR ativador e o FcyR inibitório usados para as medições do valor KD possam ser sele-cionados a partir de qualquer combinação, em uma modalidade não limitativa, um valor (razão) obtido dividindo o valor KD para FcyRIIa incluindo o alotipo H131 pelo valor KD para FcyRIIb- 1 e/ou FcyRIIb-2 podem ser usados.
[01129] Por exemplo, os índices de seletividade FcyR têm valores de 1,2 ou superior, 1,3 ou superior, 1,4 ou superior, 1,5 ou superior, 1,6 ou superior, 1,7 ou superior, 1,8 ou superior, 1,9 ou superior, 2 ou superior, 3 ou superior , 5 ou superior, 6 ou superior, 7 ou superior, 8 ou superior, 9 ou superior, 10 ou superior, 15 ou superior, 20 ou superior, 25 ou superior, 30 ou superior, 35 ou superior, 40 ou superior, 45 ou superior, 50 ou superior, 55 ou superior, 60 ou superior, 65 ou superior, 70 ou superior, 75 ou superior, 80 ou superior, 85 ou superior, 90 ou superior, 95 ou superior, 100 ou superior, 110 ou superior , 120 ou superior, 130 ou superior, 140 ou superior, 150 ou superior, 160 ou superior, 170 ou superior, 180 ou superior, 190 ou superior, 200 ou superior, 210 ou superior, 220 ou superior, 230 ou superior, 240 ou superior, 250 ou superior, 260 ou superior, 270 ou superior, 280 ou superior, 290 ou superior, 300 ou superior, 310 ou superior, 320 ou superior, 330 ou superior, 340 ou superior, 350 ou superior, 360 ou superior , 370 ou mais , 380 ou superior, 390 ou superior, 400 ou supe-rior, 410 ou superior, 420 ou superior, 430 ou superior, 440 ou superi- or, 450 ou superior, 460 ou superior, 470 ou superior, 480 ou superior, 490 ou superior, 500 ou superior, 520 ou superior, 540 ou superior, 560 ou superior, 580 ou superior, 600 ou superior, 620 ou superior, 640 ou superior, 660 ou superior, 680 ou superior, 700 ou superior, 720 ou superior, 740 ou superior , 760 ou superior, 780 ou superior, 800 ou superior, 820 ou superior, 840 ou superior, 860 ou superior, 880 ou superior, 900 ou superior, 920 ou superior, 940 ou superior, 960 ou superior, 980 ou superior, 1000 ou superior, 1500 ou superior, 2000 ou superior, 2500 ou superior, 3000 ou superior, 3500 ou superior, 4000 ou superior, 4500 ou superior, 5000 ou superior, 5500 ou superior, 6000 ou superior, 6500 ou superior, 7000 ou superior , 7.500 ou superior, 8.000 ou superior, 8.500 ou superior, 9.000 ou superior, 9.500 ou superior, 10.000 ou superior, ou 100.000 ou superior.
[01130] Uma modalidade não limitativa do domínio de ligação a FCYR seletivo em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção inclui, por exemplo, regiões Fc produzidas pela modificação do domínio de ligação a FcyR incluído em uma região Fc (uma região Fc da classe IgG refere-se à região de cisteína na posição 226 (numeração EU) para o terminal C, ou de prolina na posição 230 (numeração EU) para o terminal C, mas não está limitado a ele) constituindo uma porção de uma região constante apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17). Um exemplo de um método para produzir as regiões Fc modificadas inclui o método descrito na seção acima mencionada sobre alterações de aminoácidos. Exemplos de tais regiões Fc alteradas incluem uma região Fc na qual o aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp ou uma região Fc na qual o aminoácido na posição 328 (numeração EU) é Glu em uma IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4). Uma região Fc na qual o aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp ou uma região Fc na qual o aminoácido na po sição 328 (numeração EU) é Glu em uma IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) e moléculas de ligação a antígeno contendo tal região Fc mostram maior atividade de ligação a FcYRIIb-1 e/ou FcYRIIb-2 do que a FcYRIa, FcYRIb, FCYRIC, FcYRIIIa incluindo o alotipo V158, FcYRIIIa incluindo o alotipo F158, FcYRIIIb incluindo o alotipo FcYRIIIb- NA1, FcYRIIIb incluindo o alotipo FcYRIIIb-NA2, FcYRIIa incluindo o alotipo H131, FcYRIIa incluindo o alotipo R131 e/ou FCYRIIC.
[01131] Regiões constantes contendo um domínio de ligação a FcYR seletivo que estão incluídas nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção e moléculas de ligação a antígeno contendo tal região constante também podem ser regiões Fc e moléculas de ligação a antígeno contendo tal região Fc que mantém ou mostra atividade de ligação reduzida para ativar FcYR (FcYRIa, FcYRIb, FcYRIc, FcYRIIIa incluindo o alotipo V158, FcYRIIIa incluindo o alotipo F158, FcYRIIIb incluindo o alotipo FcYRIIIb-NA1, FcYRIIIb incluindo o alotipo FcYRIIIb-NA2, FcYRIIa incluindo o alotipo H131, FcYRIIa incluindo o alotipo R131 e/ ou FcYRIIc) quando comparado a uma região Fc (uma região Fc da classe IgG refere-se à região da cisteína na posição 226 (numeração EU) ao terminal C, ou da prolina na posição 230 (numeração EU) ao terminal C, mas não está limitado a isso) constituindo uma porção de IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) (doravante referida assim como uma região Fc de tipo selvagem) e uma molécula de ligação a antígeno contendo essa região Fc de tipo selvagem.
[01132] Em comparação com uma região Fc de tipo selvagem e uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc de tipo selvagem, o grau da redução acima mencionada na atividade de ligação para ativar FcYR de uma região Fc contendo um domínio seletivo de ligação a FcYR incluído em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção, e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc é, por exemplo, 99% ou menos, 98% ou menos, 97% ou menos, 96% ou menos, 95% ou menos, 94% ou menos, 93% ou menos, 92% ou menos, 91% ou menos, 90% ou menos, 88% ou menos, 86% ou menos, 84% ou menos, 82% ou menos, 80% ou menos, 78% ou menos, 76% ou menos, 74% ou menos, 72% ou menos, 70% ou menos, 68% ou menos, 66% ou menos, 64% ou menos, 62% ou menos, 60% ou menos, 58% ou menos, 56% ou menos, 54% ou menos, 52% ou menos, 50% ou menos, 45% ou menos, 40% ou menos, 35% ou menos, 30% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, 4% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos, 1% ou menos, 0,5% ou menos, 0,4% ou menos, 0,3% ou menos, 0,2% ou menos, 0,1% ou menos, 0,05% ou menos, 0,01% ou menos, ou 0,005% ou menos.
[01133] As regiões Fc contendo um domínio de ligação a FCYR seletivo e regiões constantes contendo tal região Fc, e moléculas de ligação a antígeno contendo tal região constante, que estão incluídas nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, também podem ser regiões Fc e moléculas de ligação ao antígeno contendo tal região Fc que mostra atividade de ligação aumentada ao FcyR inibitório (FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2) quando comparado a uma região Fc (uma região Fc da classe IgG refere-se à região da cisteína na posição 226 (numeração EU) para o terminal C, ou da prolina na posição 230 (numeração EU) para o terminal C, mas não está limitado a ele) constituindo uma porção de uma região constante apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) (doravante referida como uma região Fc de tipo selvagem) e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal tipo região Fc.
[01134] Em comparação com uma região Fc de tipo selvagem e uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc de tipo selvagem, o grau do aumento mencionado acima na atividade de ligação a FCYR inibitório de uma região Fc contendo um domínio de ligação a FCYR seletivo incluído em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc é, por exemplo, 101% ou superior, 102% ou superior, 103% ou superior, 104% ou superior, 105% ou superior, 106% ou superior, 107% ou superior, 108% ou superior, 109% ou superior, 110% ou superior, 112% ou superior, 114% ou superior, 116% ou superior, 118% ou superior, 120% ou superior, 122% ou superior, 124% ou superior, 126% ou superior, 128% ou superior, 130% ou superior, 132% ou superior, 134% ou superior, 136% ou superior, 138% ou superior, 140% ou superior, 142% ou superior, 144% ou superior, 146% ou superior, 148% ou superior, 150% ou superior, 155% ou superior, 160% ou superior, 165% ou superior, 170% ou superior, 175% ou superior, 180% ou maior, 18 5% ou mais, 190% ou mais, 195% ou mais, 2 vezes ou mais, 3 vezes ou mais, 4 vezes ou mais, 5 vezes ou mais, 6 vezes ou mais, 7 vezes ou mais , 8 vezes ou mais, 9 vezes ou mais, 10 vezes ou mais, 20 vezes ou mais, 30 vezes ou mais, 40 vezes ou mais, 50 vezes ou mais, 60 vezes ou mais, 70 vezes ou mais, 80 vezes ou mais, 90 vezes ou mais, 100 vezes ou mais, 200 vezes ou mais, 300 vezes ou mais, 400 vezes ou mais, 500 vezes ou mais, 600 vezes ou superior, 700 vezes ou superior, 800 vezes ou superior, 900 vezes ou superior, 1000 vezes ou superior, 10000 vezes ou superior, ou 100000 vezes ou superior.
[01135] Além disso, a região Fc contendo um domínio de ligação a FcyR seletivo incluído em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção e a molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc pode ser uma região Fc e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc que mantém ou mostra atividade de ligação reduzida para ativar FcyR (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo o alo- tipo V158, FcYRIIIa incluindo o alotipo F158, FcYRIIIb incluindo o aloti- po FcYRIIIb-NA1, FcYRIIIb incluindo o alotipo FcYRIIIb-NA2, FcYRIIa incluindo o alotipo H131, FcYRIIa incluindo o alotipo R131, e/ou FcYRIIc) quando comparado a uma região Fc (uma região Fc da classe IgG refere-se, por exemplo, à região de cisteína na posição 226 (numeração EU) até o terminal C ou de prolina na posição 230 (numeração EU) ao terminal C, mas não está limitado a ele) constituindo uma porção de uma região constante apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16), ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) (doravante referida como uma região Fc de tipo selvagem) e uma molécula de ligação a antígeno contendo essa região Fc de tipo selvagem; e mostra atividade de ligação aumentada a FcYR inibitório (FcYRIIb-1 e/ou FcYRIIb-2) quando comparado a uma região Fc (uma região Fc da classe IgG refere-se, por exemplo, à região de cisteína na posição 226 (numeração EU) ao terminal C ou da prolina na posição 230 (numeração EU) ao terminal C, mas não está limitado a ele) constituindo uma porção de uma região constante apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) (doravante referida como uma região Fc de tipo selvagem) e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc de tipo selvagem.
[01136] Além disso, a região Fc contendo um domínio de ligação a FcYR seletivo incluído em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção e a molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc pode ser uma região Fc e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc com maior grau de aumento da atividade de ligação a um receptor FcY inibitório (FcYRIIb-1 e/ou FcYRIIb-2) do que a um receptor FcY ativador (FcYRIa, FcYRIb, FcYRIc, FcYRIIIa incluindo o alotipo V158, FcYRIIIa incluindo o alotipo F158, FcYRIIIb incluindo o alotipo FcYRIIIb-NA1, FcYRIIIb incluindo o alotipo FcYRIIIb-NA2, FcYRIIa incluindo o alotipo H131, FcYRIIa incluindo o alotipo R131), quando comparado a uma região Fc (uma região Fc da classe IgG re-fere-se, por exemplo, à região de cisteína na posição 226 (numeração EU) para o terminal C ou da prolina na posição 230 (numeração EU) para o terminal C, mas não está limitado a ele) constituindo uma porção de uma região constante apresentada como IgG1 humana (SEQ ID N O: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 17) (doravante referida como uma região Fc de tipo selvagem) e uma molécula de ligação a antígeno contendo tal região Fc de tipo selvagem.
[01137] Na presente invenção, pelo menos outra alteração na região Fc pode ser adicionada à região Fc na qual o aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e a região Fc na qual o aminoácido na posição 328 (numeração EU) é Glu, pelas modalidades e tais descritas na seção supracitada sobre alterações de aminoácidos. Além dessas alterações, alterações adicionais também podem ser adicionadas. As alterações adicionais podem ser selecionadas dentre quaisquer substituições, deleções e modificações de um aminoácido e suas combinações. Por exemplo, podem ser adicionadas alterações que aumentam a atividade de ligação a FcYRIIb enquanto mantêm ou reduzem a atividade de ligação a FcYRIIa (tipo H) e FcYRIIa (tipo R). A adição de tais alterações melhora a seletividade de ligação a FcYRIIb sobre FcYRIIa.
[01138] Entre estas, as alterações que melhoram a seletividade de ligação a FcYRIIb sobre FcYRIIa (tipo R) são favoráveis, e alterações que melhoram a seletividade de ligação a FcYRIIb sobre FcYRIIa (tipo H) são mais favoráveis. Exemplos de substituições de aminoácidos preferidas para tais alterações incluem: uma alteração por substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; uma alteração substi-tuindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; uma alteração substituindo Pro na posição 238 (numeração EU) por Phe; uma altera- ção substituindo Asn na posição 325 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Ser na posição 267 (numeração EU) por Ile; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Trp; uma alteração substituindo Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; uma alteração substituindo Ser na posição 267 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Gly na posição 236 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Ala na posição 327 (numeração EU) por Asn; uma alteração substituindo Asn na posição 325 (numeração EU) por Ser; uma alteração substituindo Leu na posição 235 (numeração EU) por Tyr; uma alteração substituindo Val na posição 266 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Tyr; uma alteração substituindo Leu na posição 235 (numeração EU) por Trp; uma alteração substituindo Leu na posição 235 (numeração EU) por Phe; uma alteração substituindo Ser na posição 239 (numeração EU) por Gly; uma alteração por substituição de Ala na posição 327 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Ala na posição 327 (numeração EU) por Gly; uma alteração substituindo Pro na posição 238 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Ser na posição 239 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Thr; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Ser; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Pro na posição 331 (numeração EU) por Trp; uma alteração substituindo Pro na posição 331 (numeração EU) por Tyr; uma alteração substituindo Pro na posição 331 (numeração EU) por Phe; uma alteração substituindo Ala na posição 327 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Phe; uma alteração substituindo Pro na posição 271 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Ser na posição 267 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Ala; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Ile; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Gln; uma alteração substituindo Leu na posição 328 (numeração EU) por Val; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Trp; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Arg; uma alteração substituindo His na posição 268 (numeração EU) por Gly; uma alteração substituindo His na posição 268 (numeração EU) por Asn; uma alteração substituindo Ser na posição 324 (numeração EU) por Val; uma alteração substituindo Val na posição 266 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; uma alteração substituindo Ile na posição 332 (numeração EU) por Phe; uma alteração substituindo Ser na posição 324 (numeração EU) por Ile; uma alteração substituindo Glu na posição 333 (numeração EU) por Pro; uma alteração substituindo Tyr na posição 300 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Ser na posição 337 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Tyr na posição 300 (numeração EU) por Gln; uma alteração substituindo Thr na posição 335 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Ser na posição 239 (numeração EU) por Asn; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Ile; uma alteração substituindo Ser na posição 239 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Phe; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Val; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Tyr; uma alteração substituindo Ser na posição 267 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Pro; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por His; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Ala; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Trp; uma alteração substituindo His na posição 268 (numeração EU) por Gln; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Val na posição 266 (numeração EU) por Ile; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Tyr na posição 300 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Val; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Thr; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Ser; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por His; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Phe; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Gln; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Pro; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Tyr; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Ile; uma alteração substituindo Gln na posição 295 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Lys na posição 334 (numeração EU) por Asn; uma alteração substituindo His na posição 268 (numeração EU) por Ala; uma alteração substituindo Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; uma alteração substituindo Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; uma alteração substituindo Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; uma alteração por substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; uma alteração substituindo Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; uma alteração substituindo Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; uma alteração substituindo Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo His na posição 268 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo His na posição 268 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; uma alteração substituindo Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; uma alteração substituindo Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Val na posição 323 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e uma alteração substituindo Ala na posição 330 (numeração EU) por Met.
[01139] As substituições de aminoácidos favoráveis entre estas al-terações são, por exemplo, uma alteração por substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Trp; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Phe; uma alteração substituindo Ser na posição 267 (numeração EU) por Val; uma alteração substituindo Ser na posição 267 (numeração EU) por Gln; uma alteração substituindo His na posição 268 (numeração EU) por Asn; uma altera- ção substituindo Pro na posição 271 (numeração EU) por Gly; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Gln; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Ser na posição 239 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Ser na posição 267 (numeração EU) por Ala; uma alteração substituindo Leu na posição 234 (numeração EU) por Trp; uma alteração substituindo Leu na posição 234 (numeração EU) por Tyr; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Ala; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Asp; uma alteração por substituição de Gly na posição 237 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Gly na posição 237 (numeração EU) por Tyr; uma alteração substituindo Ala na posição 330 (numeração EU) por Lys; uma alteração substituindo Ala na posição 330 (numeração EU) por Arg; uma alteração substituindo Glu na posição 233 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo His na posição 268 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo His na posição 268 (numeração EU) por Glu; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Ser; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Thr; uma alteração substituindo Val na posição 323 (numeração EU) por Ile; uma alteração substituindo Val na posição 323 (numeração EU) por Leu; uma alteração substituindo Val na posição 323 (numeração EU) por Met; uma alteração substituindo Tyr na posição 296 (numeração EU) por Asp; uma alteração substituindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Ala; uma alteração substi- tuindo Lys na posição 326 (numeração EU) por Asn; e uma alteração substituindo Ala na posição 330 (numeração EU) por Met.
[01140] A alteração acima mencionada pode ser em uma posição, ou alterações em duas ou mais posições podem ser combinadas. Exemplos favoráveis de tais alterações são aqueles descritos nas Tabelas 14 a 15, Tabelas 17 a 24 e Tabelas 26 a 28.
[01141] Região Fc produzida alterando o domínio de ligação a FCYR incluído na região Fc apresentada como IgG1 humana (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 16) ou IgG4 (SEQ ID NO: 14). NO: 17) pode ser dado como um exemplo de outra modalidade não limitativa do domínio seletivo de ligação a FcyR incluído nas moléculas de ligação ao antígeno da presente invenção. Um método para produzir as regiões Fc modificadas é, por exemplo, o método descrito na seção acima mencionada sobre alterações de aminoácidos. Exemplos de tais regiões Fc alteradas incluem uma região Fc na qual o aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e o aminoácido na posição 271 (numeração EU) é Gly em uma IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4). Uma região Fc na qual o aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e o aminoá- cido na posição 271 (numeração EU) é Gly em uma IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), e moléculas de ligação ao antígeno contendo tal região Fc mostra maior atividade de ligação a FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2 do que a FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo o aloti- po V158, FcyRIIIa incluindo o alotipo F158, FcyRIIIb incluindo o alotipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo o alotipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo o alotipo H131, FcyRIIa incluindo o alotipo R131 e/ou FcyRIIc.
[01142] Na presente invenção, pelo menos outra alteração na região Fc pode ser adicionada à região Fc na qual o aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e o aminoácido na posição 271 (numeração EU) é Gly, pelas modalidades e tal descrito na seção acima mencionada sobre alterações de aminoácidos. Além dessas alterações, alterações adicionais também podem ser adicionadas. As alterações adicionais podem ser selecionadas dentre quaisquer substituições, deleções e modificações de um aminoácido e suas combinações. Por exemplo, alterações que mantêm ou reduzem a atividade de ligação para ativar os receptores FCY (FcYRIa, FcYRIb, FCYRIC, FcYRIIIa incluindo o alotipo V158, FcYRIIIa incluindo o alotipo F158, FcyRIIIb incluindo o alotipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo o alotipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo o alotipo H131, FcyRIIa incluindo o alotipo R131) pode ser adicionado. Alterações que aumentam a atividade de ligação aos receptores inibitórios de Fcy (FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2) enquanto mantêm ou reduzem a atividade de ligação a FcyRIIa (tipo H) e FcyRIIa (tipo R) podem ser adicionadas. Além disso, alterações em que o grau de aumento da atividade de ligação aos receptores Fcy inibitórios (FcyRIIb-1 e/ou FcyRIIb-2) é maior do que o grau de aumento da atividade de ligação aos receptores Fcy ativado- res (FcyRIa, FcyRIb, FcyRIc, FcyRIIIa incluindo alotipo V158, FcyRIIIa incluindo o alotipo F158, FcyRIIIb incluindo o alotipo FcyRIIIb-NA1, FcyRIIIb incluindo o alotipo FcyRIIIb-NA2, FcyRIIa incluindo o alotipo H131, FcyRIIa incluindo o alotipo R131) também podem ser adicionados. A adição de tais alterações melhora a seletividade de ligação a FcyRIIb sobre FcyRIIa.
[01143] Um exemplo de uma modalidade não limitativa da região Fc alterada compreendendo um domínio de ligação a FcyR seletivo inclui uma região Fc alterada na qual qualquer uma ou mais das posições 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333 e 396 (numeração EU) são substituídos na região Fc na qual o aminoácido na posição 238 (numeração EU) é Asp e o aminoá- cido na posição 271 (numeração EU numeração) é Gly em uma IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4).
[01144] Além disso, um exemplo de uma modalidade não limitativa da região Fc alterada compreendendo um domínio de ligação a FCYR seletivo é uma região Fc alterada compreendendo qualquer um ou mais de
[01145] Asp na posição de aminoácido 233,
[01146] Tyr na posição de aminoácido 234,
[01147] Asp na posição de aminoácido 237,
[01148] Ile na posição de aminoácido 264,
[01149] Glu na posição de aminoácido 265,
[01150] qualquer um de Phe, Met e Leu na posição de aminoácido 266,
[01151] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Gln na posição de aminoá- cido 267,
[01152] Asp ou Glu na posição de aminoácido 268,
[01153] Asp na posição de aminoácido 269,
[01154] qualquer um de Asp, Phe, Ile, Met, Asn e Gln na posição de aminoácido 272,
[01155] Asp na posição de aminoácido 296,
[01156] Ala ou Asp na posição de aminoácido 326,
[01157] Gly na posição de aminoácido 327,
[01158] Lys ou Arg na posição de aminoácido 330,
[01159] Ser na posição de aminoácido 331,
[01160] Thr na posição de aminoácido 332,
[01161] qualquer um de Thr, Lys e Arg na posição de aminoácido 333,
[01162] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg e Tyr na posição de aminoácido 396,
[01163] mostradas pela numeração EU, na região Fc onde aminoá- cido na posição 238 é Asp e aminoácido na posição 271 (numeração EU) é Gly em uma IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4).
[01164] Exemplos de uma modalidade não limitante de região Fc que compreende ainda pelo menos outra alteração na região Fc e compreende ainda alterações adicionais mencionadas acima incluem regiões Fc mostradas nas Tabelas 6-1 a 6-7.Tabela 6-1
Figure img0008
[01165] (Tabela 6-2 é uma tabela de continuação da Tabela 6-1.) Tabela 6-2
Figure img0009
(Tabela 6-3 é uma tabela de continuação da Tabela 6-2.
Legenda
[01166] AMINOÁCIDO ALTERADO (NUMERAÇÃO EU)
[01167] Tabela 6-1
[01168] REGIÇÃO Fc ALTERADATabela 6-3
Figure img0010
[01169] (A Tabela 6-4 é uma tabela de continuação da Tabela 6-3.) Tabela 6-4
Figure img0011
[01171] (A Tabela 6-5 é uma tabela de continuação da Tabela 6-4.) Tabela 6-5
Figure img0012
[01173] (a Tabela 6-6 é uma tabela de continuação da Tabela 6-5.) Tabela 6-6
Figure img0013
[01175] (A Tabela 6-7 é uma tabela de continuação da Tabela 6-6.) Tabela 6-7
Figure img0014
[01176] Quatro tipos de FCYRS, FCYRI, FcyRIIb, FcyRIII e FCYRIV, foram identificados em camundongos. Em humanos também, como FcYRs correspondentes, FcYRI, FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa, FcYRIIIa e FcYRIIIb foram identificados. FcYRIIb que é considerado ser o único tipo inibidor dentre esses FcYRs é conservado em ambos humanos e camundongos. Os outros FcYRs, exceto FcYRIIIb, transmitem sinais de ativação via o motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM) (Immunoreceptor Tyrosyne-Based Activatin Motif), enquanto FcYRIIb transmite sinais inibidores via o motivo inibidor baseado em tirosina imunorreceptora (ITIM) (Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhi-bitory Motif) presente dentro das células (Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47).
[01177] FcYRIIb1 e FcYRIIb2 foram relatados como variantes unidas de FcYRIIb. Em ambos humanos e camundongos, FcYRIIb1 tem um domínio intracelular mais longo do que FcYRIIb2. FcYRIIb1 foi confirmado ser expresso em células B, e FcYRIIb2 foi confirmado ser expresso em macrófagos, mastócitos, células dendríticas, basófilos, neu- trófilos e eosinófilos (J. Clin. Immunol. (2005) 25(1), 1-18).
[01178] Até agora, em seres humanos, disfunção e expressão diminuída de FcYRIIb foram relatadas estar relacionadas com início de doenças autoimunes. Por exemplo, foi relatado que em alguns pacientes SLE, ligação de ativadores transcripcionais é atenuada devido a poli- morfismo em uma região de promotor de expressão de FcYRIIb, que resulta na expressão de FcYRIIb diminuída (Human. Genet. (2005) 117, 220-227; J. Immunol. (2004) 172, 7192-7199; e J. Immunol. (2004) 172, 7186-7191). Ainda, dentre os pacientes SLE, dois tipos de alótipos foram relatados, onde o aminoácido na posição 233 é Ile ou Thr em FcYRIIb. Esta posição existe na região de transmembrana de FcYRIIb e é relatado que FcYRIIb é menos provável de existir no número grande de lipídeo quando o aminoácido na posição 233 é Thr comparado com quando este aminoácido é Ile, e como resultado, função de transdução de sinal de FcYRIIb diminui (Nat. Med. (2005) 11, 1056-1058; Hum. Mol. Genet., (2005) 14, 2881-2892). Em camundongos também, camundongos inativados produzidos através de rompimento do gene de FcYRIIb em camundongos C57BL/6 foram relatados apresentar sintomas tipo SLE tal como produção de autoanticorpo e glomerulonefrite (Immunity 13 (2000) 277-285; J. Exp. Med. (2002) 195, 1167-1174). Ainda, até agora, nível de expressão reduzido de FcYRIIb e similar foram relatados em camundongos considerados ser modelos com início natural de SLE (Immunogenetics (2000) 51, 429435; Int. Immunol. (1999) 11, 1685-1691; Curr. Biol. (2000) 10, 227230; J. Immunol. (2002) 169, 4340-4346). A partir desse relatos, FcYRIIb é considerado regular imunidade humoral em camundongos bem como em humanos.
[01179] Quando um anticorpo carregando uma Fc da presente invenção elimina antígenos via FcYRIIb, a função de endocitose de FcYRIIb é considerada estar realizando a contribuição mais importante dentre as funções de FcYRIIb. Conforme acima descrito, FcYRIIb1 e FcYRIIb2 existem como variantes unidas de FcYRIIb, mas é relatado que a última está principalmente envolvida na endocitose de um imu- nocomplexo de um anticorpo e antígeno (J. Immunol. (1994), 152 574588; Science (1992) 256, 1808-1812; Cell (1989) 58, 317-327). Até agora, FcYRIIb2 de camundongo foi relatado ser incorporado a uma vesícula revestida com clatrina e sofre endocitose (Cell (1989) 58, 317-327). Ainda, foi relatado que um motivo dileucina é necessário para endocitose mediada por FcYRIIb2 e o motivo dileucina é conservado em ambos humanos e camundongos (EMBO J. (1994) 13 (13), 29632969). A partir desses, FcYRIIb2 pode ter uma habilidade de endocito- se em humanos como em camundongos.
[01180] Por outro lado, diferente de FcYRIIb2, foi relatado que FcYRIIbl não causa endocitose. FcYRIIbl tem uma sequência inserida em seu domínio intracelular que não é encontrado em FcYRIIb2. É considerado que esta sequência inibe a absorção de FcYRIIbl em uma vesícula revestida com clatrina e como um resultado endocitose é inibida (J. Cell. Biol. (1992) 116, 875-888; J. Cell Biol. (1989) 109, 32913302). Em humanos também, FcYRIIb1 tem uma sequência de inserção em um sítio similar àquele de FcYRIIb2 como em camundongos; desta maneira, diferença na capacidade de endocitose entre FcYRIIb1 e FcYRIIb2 é presumida ser causada por um mecanismo similar. Ainda, em ambos humanos e camundongos, aproximadamente 40% de imunocomplexos na superfície celular são relatados ser absorvidos na célula em 20 minutos (Mol. Immunol. (2011) 49, 329-337; Science (1992) 256, 1808-1812). Desta maneira, em humanos também,FcYRIIb2 é presumido absorver imunocomplexos em células em taxas similares àquelas em camundongos.
[01181] Uma vez que FcYRIIb é o único que tem ITIM dentro da célula em ambos humanos e camundongos dentre a família FcYR e a distribuição de células de expressão é a mesma, é presumível que sua função em controle imune seja similar. Ainda, considerando o fato que imunocomplexos são absorvidos em células em taxas similares em humanos e camundongos, efeitos de eliminação de antígeno de anti-corpos mediados por FcYRIIb em humanos pode ser previsível usando camundongos. Moléculas de ligação a antígeno mF44 e mF46 têm propriedades de ligação a antígenos solúveis de uma maneira depen-dente do pH e têm afinidade aumentada com FcYRIIb e FCYRIII de ca-mundongo comparado com mIgG1 que é uma molécula de ligação a antígeno tendo a propriedade de ligação a um antígeno solúvel de uma maneira dependente do pH. Na verdade, é mostrado no Exemplo 5 que eliminação de antígeno aumentou quando mF44 e mF46 foram administrados a camundongos normais comparado com quando mIgG1 foi administrado.
[01182] Ainda, no Exemplo 6 descrito por último, um experimento similar foi realizado usando camundongos deficientes em cadeia Y de receptor de Fc. Foi relatado que FcYRIIs outros que não FcYRIIb são expressos apenas na co-presença de cadeia gama em camundongos. Desta maneira, apenas FcYRIIb é expresso nos camundongos deficientes em cadeia Y de receptor de Fc. Administração de mF44 ou mF46, que são moléculas de ligação a antígeno tendo a propriedade de ligação a antígenos solúveis de uma maneira dependente do pH, a camundongos deficientes em cadeia Y de receptor de Fc permite avaliação de efeitos de aceleração de eliminação de antígeno quando sítio de ligação a FcYRIIb é seletivamente aumentado. A partir dos resultados do Exemplo 6, quando mF44 ou mF46 (que são moléculas de ligação a antígeno tendo a propriedade de ligação a antígenos solúveis de uma maneira deponente do pH) foi administrado a camundongos deficientes em cadeia Y de receptor de Fc, eliminação de antígeno foi mostrada aumentar comparado com quando mIgG1 (que é uma molécula de ligação a antígeno tendo a propriedade de ligação a antígenos solúveis de uma maneira dependente do pH) foi administrado aos camundongos. Ainda, os resultados do Exemplo 6 mostram que quando administrado a camundongos deficientes em cadeia Y de receptor de Fc, mF44 ou mF46 causa graus similares de eliminação de antígeno como quando administrado a camundongos normais.
[01183] No Exemplo 6, um experimento similar foi realizado usando camundongos deficientes em FCYRIII. Uma vez que mIgGI, mF44 e mF46 se ligam apenas a FcYRIIb e FCYRIII dentre os FCYRS, adminis-tração dos anticorpos a camundongos deficientes em FCYRIII permite avaliação de efeitos de aceleração de eliminação de antígeno quando ligação a FcYRIIb é seletivamente aumentada. Os resultados do Exemplo 6 indicam que quando mF44 ou mF46 foi administrado a camundongos deficientes em FcYRIII, eliminação de antígeno foi aumentada comparado com quando mIgG1 foi administrado ao camundongo para eliminação de antígeno. Ainda, os resultados do Exemplo 6 mostraram que quando administrados a camundongos deficientes em FcYRIII, mF44 e mF46 causam graus similares de eliminação de antí- geno como quando administrados a camundongos deficientes em cadeia Y de receptor de Fc e quando administrados a camundongos normais.
[01184] Esses resultados revelaram que eliminação de antígeno pode ser acelerada através do aumento da ligação seletiva a FcYRIIb sozinho sem aumento da ligação a FcYRs ativos.
[01185] Em adição aos documentos relatados discutidos até agora, com base nos resultados de avaliação mencionados acima usando camundongos, é considerado que absorção de imunocomplexos em células via FcYRIIb acontece in vivo em humanos como em camun-dongos e, como resultado, anticorpos que têm Fc com ligação seleti-vamente aumentada a FcYRIIb podem acelerar a eliminação de seus antígenos. Ainda, conforme discutido acima, uma vez que absorção de imunocomplexos em células via FcYRIIb é considerada acontecer em taxas similares em camundongos e humanos, efeitos de aceleração de eliminação de antígeno comparáveis àqueles de anticorpos tendo Fc com afinidade aumentada com FcYRIIb de camundongo podem ser obtidos in vivo em humanos usando Fc onde afinidade com FcYRIIb humano é aumentada para um grau similar.
[01186] Conforme descrito no WO2009/125825, Fv4-IgG1 é um anticorpo que resulta da conferência a um anticorpo anti-receptor de IL6 H54/L28-IgG1 humanizado a atividade de se ligar ao antígeno de uma maneira dependente do pH, isto é, alterando a região variável para conferir a propriedade de se ligar a um antígeno em pH 7,4 e se dissociar do antígeno em pH 5,8. O WO2009/125825 mostrou que a eliminação de receptor de IL-6 humano solúvel é bastante acelerada em camundongos co-administrados com Fv4 IgG1 e receptor de IL-6 humano solúvel como o antígeno como comparado com camundongos co-administrados com H54/L28-IgG1 e o antígeno. Aqui, H54-IgG1 de cadeia pesada e L28-CK de cadeia leve incluídos em H54/L28-IgG1 são mostrados na SEQ ID NO: 36 e na SEQ ID NO: 37, respectivamente; e VH3-IgG1 de cadeia pesada e VL3-CK de cadeia leve incluídos em Fv4-IgG1 são mostrados na SEQ ID NO: 38 e na SEQ ID NO: 39, respectivamente.
[01187] Receptor de IL-6 humano solúvel ligado a um anticorpo H54/L28-IgG1, que se liga a receptor de IL-6 humano solúvel, é reciclado para o plasma junto com o anticorpo via FcRn. Entretanto, anticorpo Fv4-IgG1 que se liga a receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente do pH se dissocia de receptor de IL-6 humano solúvel que foi ligado ao anticorpo sob uma condição ácida no endos- somo. Uma vez que o receptor de IL-6 humano solúvel dissociado é degradado no lisossomo, eliminação do receptor de IL-6 humano solúvel pode ser bastante acelerada, e o anticorpo Fv4-IgG1 que se liga ao receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente do pH é reciclado para o plasma após ligação a FcRn no endossomo. Uma vez que o anticorpo reciclado pode se ligar a um receptor de IL-6 humano solúvel novamente, ligação ao antígeno (receptor de IL-6 humano so- lúvel) e reciclagem para o plasma vis FcRn são repetidas. Como resul-tado, uma molécula de anticorpo única pode se ligar repetidamente ao receptor de IL-6 humano solúvel múltiplas vezes (WO2009/125825).
[01188] Por outro lado, conforme revelado na presente invenção, foi constatado que concentração no plasma do antígeno solúvel pode ser reduzida bastante através da administração de uma molécula de ligação a antígeno com atividade de ligação a FCYR aumentada do domínio de ligação a receptor FCY incluído na molécula de ligação a antíge- no que compreende um domínio de ligação a antígeno onde atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon tal como pH, um domínio de ligação a FcRn tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e um domínio de ligação a receptor Fcy.
[01189] Embora não sendo limitado a uma teoria particular, a diminuição inesperada em concentração de antígeno solúvel emplasma observada através da administração de uma molécula de ligação a an- tígeno com ligação aumentada a FcyRs, que compreende um domínio de ligação a antígeno onde atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon tal como pH e um domínio de ligação a FcRn tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido pode ser explicada como segue.
[01190] Conforme acima descrito, uma molécula de ligação a antí- geno tal como Fv4-IgG1 compreenendo um domínio de ligação a antí- geno onde atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon pode ser capaz de se ligar repetidamente ao antígeno múltiplas vezes, mas o efeito de dissociação do antíge- no solúvel no endossomo para acelerar a eliminação de antígeno a partir do plasma pode ser dependente da taxa de absorção do complexo do antígeno e molécula de ligação a antígeno para o endosso- mo. As moléculas de ligação a antígeno com atividades de ligação aumentadas a vários FCYRS, que compreendem um domínio de ligação a antígeno onde atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição da concentração de íon, são ativamente absorvidas em células através de ligação a vários FcyRs expressos na membrana celular, e podem circular no plasma novamente através de reciclagem via ligação entre FcRn e o domínio de ligação a FcRn na molécula tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido. Mais especificamente, uma vez que as moléculas de ligação a antígeno mencionadas acima que formaram complexos com antígenos solúveis em plasma são absorvidas ativamente em células via FcyRs expressos na membrana celular, o efeito de aceleração de eliminação de antígenos solúveis emplasma pode ser mais pronunciado do que aquele de moléculas de ligação a antígeno cujas atividades para vários FcyRs não são aumentadas.
[01191] Atividades de ligação a FcyR de anticorpos que se ligam a antígenos de membrana têm um papel importante em atividade citotó- xica dos anticorpos. Desta maneira, quando atividade citotóxica é ne-cessária para um anticorpo ser usado como um agente farmacêutico, um isotipo de IgG1 humano que tem atividade de ligação a FcyR alta é usado, e a técnica de aumento das atividades de ligação a FcyR do anticorpo para aumentar a atividade citotóxica do anticorpo é amplamente utilizada. Por outro lado, o papel de atividades de ligação a FcyR de anticorpos que se ligam a antígenos solúveis e são usados como agentes farmacêuticos não eram conhecidos, e diferenças em efeitos fisiológicos sobre organismos administrados com IgG1 humano com atividades de ligação a FcyR altas e IgG2 humano e IgG4 humano com atividades de ligação a FcyR baixa, devido às suas diferenças em atividades de ligação a FcyR, não tinham até agora sido completamente examinadas. Conforme descrito mais tarde nos Exemplo, foi realmente confirmado que no plasma de indivíduos administrados com anticorpos cujas atividades de ligação a FCYR foram perdidas, mudanças em concentração de antígeno solúvel não foram afetadas. Por outro lado, na presente invenção, a concentração de antígenos solúveis no plasma foi verificada ser bastante reduzida em indivíduos administrados com moléculas de ligação a antígeno com atividades de ligação a FcyR aumentada e compreendendo um domínio de ligação a antíge- no cuja atividade de ligação a antígenos solúveis muda dependendo da condição de concentração de íon. Mais especificamente, ao combinar um domínio de ligação a FcRn tendo uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e um domínio de ligação a antígeno cuja ligação a antígeno solúveis muda dependendo da condição de concentração de íon, que são domínios incluídos em moléculas de ligação a antígeno se direcionando a antígenos solúveis, uma vantagem de aumento da ligação a FcyR foi verificada pela primeira vez.
Molécula de ligação a antígeno
[01192] Na presente invenção, "uma molécula de ligação a antíge- no" é usado no sentido mais amplo para se referir a uma molécula tendo atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido e contendo um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a receptor Fc. Especificamente, as moléculas de ligação a antígeno incluem vários tipos de moléculas contanto que elas exibam a atividade de ligação a antígeno. Moléculas em que um domínio de ligação a antígeno é ligado a uma região Fc incluem, por exemplo, anticorpos. Anticorpos podem incluir anticorpos monoclonais únicos (incluindo an-ticorpos agonísticos ou anticorpos antagonísticos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e similar. Alterna-tivamente, quando usados como fragmentos de anticorpo, eles preferi-velmente incluem domínios de ligação de antígeno e fragmentos de ligação a antígeno (por exemplo, Fab, F(ab’)2, scFv e Fv). Moléculas de base em que estruturas tridimensionais, tais como a estrutura de proteína em barril α/β estável já conhecida, são usadas como uma base e apenas algumas porções das estruturas são transformadas em bibliotecas para construir domínios de ligação a antígeno que são também incluídos em moléculas de ligação a antígeno da presente in-venção.
[01193] Uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção pode conter pelo menos algumas porções de uma região Fc que faz a mediação da ligação de FcRn e receptor FCY. Em uma modalidade não limitante, a molécula de ligação a antígeno inclui, por exemplo, anti-corpos e proteínas de fusão Fc. Uma proteína de fusão se refere a um polipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo tendo uma primeira sequência de aminoácido que é ligada a um polipeptídeo tendo uma segunda sequência de aminoácido que se ligaria naturalmente na natureza. Por exemplo, uma proteína de fusão pode compreender a sequência de aminoácido de pelo menos uma porção de uma região Fc (por exemplo, uma porção de uma região Fc responsável pela ligação a FcRn ou uma porção de uma região Fc responsável pela ligação ao receptor Fcy) e um polipeptídeo não imunoglobulina contendo, por exemplo, a sequência de aminoácido do domínio de ligação a ligante de um receptor ou um domínio de ligação a receptor de um ligante. As sequências de aminoácido podem estar presentes em proteínas sepa-radas que são transportadas juntas para uma proteína de fusão ou ge-ralmente podem estar presentes em uma proteína única; no entanto, elas estão incluídas em uma nova disposição em um polipeptídeo de fusão. Proteínas de fusão podem ser produzidas, por exemplo, através de síntese química ou através de técnicas de recombinação genética para expressar um polinucleotídeo codificando regiões de peptídeo em uma disposição desejada.
[01194] Os respectivos domínios da presente invenção podem ser ligados via ligantes ou diretamente via ligação de polipeptídeo.
[01195] Os ligantes compreendem ligantes de peptídeo arbitrários que podem ser introduzidos através de engenharia genética e ligantes revelados em, por exemplo, Protein Engineering (1996) 9(3), 299-305. No entanto, ligantes de peptídeo são preferidos na presente invenção. O comprimento dos ligantes de peptídeo não é particularmente limitado e pode ser adequadamente selecionado por aqueles versados na técnica de acordo com o propósito. O comprimento é preferivelmente de cinco aminoácidos ou mais (sem limitação particular, o limite superior é geralmente 30 aminoácidos ou menos, preferivelmente 20 ami- noácidos ou menos) e particularmente preferivelmente 15 aminoáci- dos.
[01196] Por exemplo, tais ligantes de peptídeo incluem preferivelmente:
[01197] Ser
[01198] Gly.Ser
[01199] Gly.Gly.Ser
[01200] Ser.Gly.Gly
[01201] Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO: 26)
[01202] Ser.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO: 27)
[01203] Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO: 28)
[01204] Ser. Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO: 29)
[01205] Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO: 30)
[01206] Ser.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO: 31)
[01207] Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO: 32)
[01208] Ser. Gly.Gly.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO: 33)
[01209] (Gly.Gly.Gly.Gly.Ser (SEQ ID NO: 29))n
[01210] (Ser.Gly.Gly.Gly.Gly (SEQ ID NO: 29))n
[01211] em que n é um inteiro de 1 ou mais. O comprimento ou sequências de ligantes de peptídeo podem ser selecionados consequen- temente por aqueles versados na técnica dependendo do propósito.
[01212] Ligantes sintéticos (agentes de reticulação químicos) são rotineiramente usados para reticular peptídeos, e, por exemplo:
[01213] N-hidróxi succinimida (NHS),
[01214] dissuccinimidil suberato (DSS),
[01215] bis(sulfossuccinimidil) suberato (BS3),
[01216] ditiobis(succinimidil propionato) (DPS),
[01217] ditiobis(sulfossuccinimidil propionato) (DTSSP),
[01218] etileno glicol bis(succinimidil succinato) (EGS),
[01219] etileno glicol bis(sulfossuccinimidil succinato) (sulf-EGS),
[01220] succinimidil tartrato (DST), dissulfossuccinimidil tartrate (sulfo-DST),
[01221] bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES)
[01222] e bis[2-(sulfossuccinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo- BSOCOES). Esses agentes de reticulação estão comercialmente dis-poníveis.
[01223] Quando ligantes múltiplos para ligação dos respectivos domínios são usados, eles podem ser todos do mesmo tipo ou podem ser de tipos diferentes.
[01224] Em adição aos ligantes exemplificados acima, ligantes com marcadores de peptídeo tais como marcador His, marcador HA, mar-cador myc e marcador FLAG podem ser também adequadamente usados. Ainda, ligação hidrogênio, ligação dissulfeto, ligação covalente, interação iônica e propriedades de ligação uns com os outros como um resultado de combinação dos mesmos podem ser adequadamente usadas. Por exemplo, a afinidade entre CH1 e CL de anticorpo pode ser usada, e regiões Fc se originando dos anticorpos biespecíficos descritos acima podem ser também usadas para associação de região Fc hetero. Além disso, ligações dissulfeto formadas entre domínios podem ser também adequadamente usadas.
[01225] A fim de ligar respectivos domínios via ligação de peptídeo, polinucleotídeos codificando os domínios são unidos em estrutura. Mé-todos conhecidos para ligação de polinucleotídeos em estrutura incluem técnicas tal como ligação de fragmentos de restrição, PCR de fusão e PCR de sobreposição. Tais métodos podem ser apropriadamente usados sozinhos ou em combinação para construir moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Na presença invenção, os termos "ligado" e "fundido" ou "ligação" e "fusão" são usados interco- mutavelmente. Esses termos significam que dois ou mais elementos ou componentes tais como polipeptídeos são unidos para formar uma estrutura única através de qualquer meio incluindo os dispositivos de ligação químicos descritos acima e técnicas de recombinação genética. Fusão em estrutura significa, quando dois ou mais elementos ou componentes são polipeptídeos, ligação de duas ou mais unidades de estruturas de leitura para formar uma estrutura de leitura mais longa contínua enquanto mantendo as estruturas de leitura corretas dos po- lipeptídeos. Quando duas moléculas de Fab são usadas como um do-mínio de ligação a antígeno, um anticorpo, que é uma molécula de li-gação a antígeno da presente invenção em que o domínio de ligação a antígeno é ligado em estrutura a uma região Fc via ligação de peptí- deo sem ligante, pode ser usado como uma molécula de ligação a an- tígeno preferida da presente invenção.
[01226] FcRn
[01227] Diferente do receptor FCY pertencente à superfamília de imunoglobulina, FcRn, FcRn humano em particular, é estruturalmente similar a polipeptídeos de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) (Major Histocompatibility Complex) Classe I, exibindo 22% a 29% de identidade de sequência com moléculas do MHC Classe I (Ghetie e outros, Immunol. Today (1997) 18 (2): 592-598). FcRn é expresso como um heterodímero consistindo em cadeia β solúvel ou leve (β2 microglobulina) complexada com cadeia α de transmembrana ou pesada. Tal como MHC, a cadeia α de FcRn compreende três domínios extracelulares (α1, α2 e α3) e seu domínio citoplásmico curto ancora a proteína na superfície celular. Os domínios α1 e α2 interagem com o domínio de ligação a FcRN da região Fc de anticorpo (Ragha- van e outros, Immunity (1994) 1: 303-315).
[01228] FcRn é expresso em placenta materna e saco vitelino de mamíferos, e está envolvido em transferência de IgG de mãe-para- feto. Ainda, em intestino delgado neonatal de roedores, em que FcRn é expresso, FcRn está envolvido em transferência de IgG materno através do epitélio de borda em escova a partir de colostro ou leite ingerido. FcRn é expresso em uma variedade de outros tecidos e sistemas de célula endotelial de várias espécies. FcRn é também expresso em endotélio humano adulto, vasos sanguíneos musculares e capilares sinusoidais hepáticos. FcRn é acreditado desempenhar um papel na manutenção de concentração de IgG no plasma através da mediação da reciclagem de IgG para soro quando da ligação a IgG. Tipicamente, ligação de FcRn a moléculas de IgG é estritamente dependente do pH. A ligação ótima é observada em uma faixa de pH ácido abaixo de 7,0.
[01229] FcRn humano cujo precursor é um polipeptídeo tendo a se-quência de sinal de SEQ ID NO: 34 (o polipeptídeo com a sequência de sinal é mostrado na SEQ ID NO: 35) forma um complexo com β2- microglobulina humana in vivo. Conforme mostrado nos Exemplos de Referência descritos abaixo, FcRn humano solúvel complexado com β2-microglobulina é produzido através do uso de técnicas de expressão recombinantes convencionais. Domínio de ligação a FcRn da presente invenção pode ser avaliado quanto à sua atividade de ligação a tal FcRn humano solúvel complexado com β2-microglobulina. Aqui, a menos que de outra maneira especificado, FcRn humano se refere a uma forma capaz de se ligar a um domínio de ligação a FcRn da presente invenção. Exemplos incluem um complexo entre FcRn humano e β2-microglobulina humana.
[01230] As moléculas de ligação a antígeno da presente invenção têm um domínio de ligação a FcRn. O domínio de ligação a FcRn não é particularmente limitado contanto que as moléculas de ligação a an- tígeno tenham uma atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH ácido, e ele pode ser um domínio que tem atividade de ligação direta ou indireta a FcRn. Exemplos preferidos de tal domínio incluem a região Fc de imunoglobulina IgG, albumina, domínio 3 de albumina, anticorpo anti-FcRn e peptídeo anti-FcRn, molécula de base anti-FcRn e similar que têm uma atividade de se ligar diretamente a FcRn, ou moléculas que se ligam a IgG ou albuma, e similar que têm uma atividade de se ligar indiretamente a FcRn. Na presente invenção, um domínio que tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH ácido e em uma faixa de pH neutro é preferido. Se o domínio já tem atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH ácido, ele pode ser preferivelmente usado como é. Se o domínio não tiver atividade de ligação a FcRn ou uma fraca em uma faixa de pH ácido, aminoácidos na molécula de ligação a antígeno podem ser alterados para conferir atividade de ligação a FcRn. Alternativamente, aminoácidos podem ser alterados em um domínio já tendo atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH ácido para aumentar a atividade de ligação a FcRn. Para alteração de aminoácido do domínio de ligação a FcRn, a alteração de interesse pode ser identificada comparando as atividades de ligação a FcRn em uma faixa de pH ácido antes e após a alteração do aminoácido.
[01231] O domínio de ligação a FcRn humano preferido é uma região que se liga diretamente a FcRn. Tais domínios de ligação a FcRn preferidos incluem, por exemplo, regiões Fc de anticorpo. Entretanto, regiões capazes de ligação a um polipeptídeo tal como albumina ou IgG, que tem atividade de ligação a FcRn, podem indiretamente se ligar a FcRn via albmina, IgG ou similar. Desta maneira, para a região de ligação a FcRn da presente invenção, uma região que se liga a um polipeptídeo tendo atividade de ligação a FcRn pode ser preferivelmente usada. Uma região Fc contém uma sequência de aminoácido derivada da região constante de uma cadeia pesada de anticorpo. Uma região Fc é uma porção da região constante de cadeia pesada de anticorpo começando do terminal N da região de dobra no sítio de clivagem de papaína, que está no aminoácido aproximadamente na posição 261 de acordo com numeração EU, e incluindo os domínios de dobra, CH2 e CH3.A atividade de ligação de um domínio de ligação a FcRn para FcRn, em particular FcRn humano, ou uma molécula de ligação a antígeno compreendendo o domínio
[01232] A atividade de ligação de um domínio de ligação a FcRn da presente invenção para FcRn, FcRn humano em particular, pode ser medida através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, conforme descrito na seção "Atividade de Ligação" acima. Aqueles versados na técnica podem determinar apropriadamente as condições outras que não pH. A atividade de ligação a antígeno e a atividade de ligação a FcRn humano de uma molécula de ligação a antígeno podem ser avaliadas com base na constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD), taxa de dissociação (kd), taxa de dissociação aparente (kd) e similar. Essas podem ser medidas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou citometria de fluxo pode ser usado.
[01233] Quando a atividade de ligação a FcRn de um domínio de ligação a FcRn é medida, condições que não o pH não são particularmente limitadas, e podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica. As medições podem ser realizadas, por exemplo, a 37°C usando tampão MES, conforme descrito no WO 2009/125825). Alternativamente, a atividade de ligação a FcRn de um domínio de ligação a FcRn pode ser medida através de métodos co-nhecidos daqueles versados na técnica e pode ser medida usando, por exemplo, Biacore (GE Healthcare) ou similar. A atividade de ligação de um domínio de ligação a FcRn para FcRn pode ser avaliada despejando, como um analito, FcRn, um domínio de ligação a FcRn ou uma molécula de ligação a antígeno presente invenção contendo o domínio de ligação a FcRn em um chip imobilizado com um domínio de ligação a FcRn, uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção contendo o domínio de ligação a FcRn, ou FcRn.
[01234] A faixa de pH ácido apresentada como a condição para ter atividade de ligação entre FcRn e um domínio de ligação a FcRn em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção geralmente se refere a pH 4,0 até pH 6,5. Preferivelmente ela se refere a pH 5,5 até pH 6,5 e particularmente preferivelmente ela se refere a pH 5,8 até pH 6,0 que está próximo do pH em um endossomo inicial in vivo. A faixa de pH neutro apresentada como a condição para ter atividade de ligação entre FcRn e uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção ou um domínio de ligação a FcRn incluído em tal molécula se refere geralmente a pH 6,7 até pH 10.0. A faixa de pH neutro é preferivelmente uma faixa indicada por qualquer valor de pH de a partir de pH 7,0 até pH 8,0 e é preferivelmente selecionado de pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 e 8,0 e é particularmente preferivelmente pH 7,4 que está próximo do pH no plasma (em sangue) in vivo. Avaliar a afinidade de ligação entre FcRn humano e um domínio de ligação a FcRn humano ou uma molécula de ligação a antígeno contendo este domínio em pH 7,4 é difícil devido à afinidade de ligação baixa, pH 7,0 pode ser usado ao invés de pH 7,4. Como temperatura a ser usada em condições de ensaio, afinidade de ligação entre um domínio de ligação a FcRn e FcRn pode ser avaliada em qualquer temperatura de a partir de 10° C a 50° C. Preferivelmente, uma temperatura de a partir de 15° C a 40° C é usada para determinar a afinidade de ligação entre um domínio de ligação a FcRn e FcRn humano. Mais preferivelmente, qualquer temperatura de a partir de 20° C a 35° C tal como qualquer uma de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 e 35° C é também igualmente usada para determinar a afinidade de ligação entre um domínio de ligação a FcRn e FcRn. Uma temperatura de 25° C é um exemplo não limitante de uma modalidade da presente invenção.
[01235] De acordo com Yeung e outros (J. Immunol. (2009) 182, 7663-7671), a atividade de ligação a FcRn humano de IgG1 humana nativa em uma faixa de pH ácido (pH 6,0) é KD 1,7 μM, mas a atividade pode ser dificilmente detectada em uma faixa de pH neutro. Desta maneira, em uma modalidade preferida, uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção tendo atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido, que inclui moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido é KD 20 μM ou mais forte e atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH neutro é equivalente àquela de um IgG humano nativo pode ser usada. Em uma modalidade mais preferida, uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção incluindo moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcRn humanao sob uma condição de faixa de pH ácido é KD 2,0 μM ou mais forte pode ser usada. Em uma modalidade ainda mais preferida, moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido é KD 0,5 μM ou mais forte podem ser usadas. Os valores de KD mencionados acima são determinados através do método descrito no The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671 (através de imobili-zação de uma molécula de ligação a antígeno sobre um chip e carre-gando de um FcRn humano como o analito).
[01236] Na presente invenção, uma região Fc que tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido é preferida. Se o domínio for uma região Fc já tendo uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, ele pode ser usado como é. Se o domínio não tiver ou tiver uma atividade de ligação a FcRn fraca sob uma condição de faixa de pH ácido, aminoácidos na molécula de ligação a antígeno podem ser alterados para obter uma região Fc tendo a atividade de ligação a FcRn desejada. Uma região Fc tendo a atividade de ligação a FcRn desejada ou atividade de ligação a FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido pode ser também preferivelmente obtida através de alteração dos aminoácidos na região Fc. Alteração de aminoácido de uma região Fc que confere tal atividade de ligação desejada pode ser identificada comparando a atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido antes e após a alteração do aminoácido. Aqueles versados na técnica podem fazer alterações de aminoácido apropriadas usando um método bem conhecido similar ao método mencionado acima usado para alterar a atividade de ligação ao receptor FCY.
[01237] Uma região Fc tendo uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, que está incluída em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção, pode ser obtida através de qualquer método; mas especificamente, um domínio de ligação a FcRn tendo atividade de ligação a FcRn ou tendo atividade de ligação a FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido pode ser obtido através de alteração de aminoácidos de uma imunoglobulina IgG humana usada como a região Fc de partida. Regiões Fc preferidas de imunoglobulinas IgG para a alteração incluem regiões Fc de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e suas variantes). Para alterações de outros aminoácidos, aminoácidos em qualquer posição podem ser al-terados contanto que a região Fc tenha atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido ou a atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido possa ser aumentada. Quando uma molécula de ligação a antígeno inclui uma região Fc de uma IgG1 humana como a região Fc, ela inclui preferivelmente uma alteração que tem o efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação à região Fc de partida de IgG1 humana. Exemplos preferidos de tais aminoácidos que podem ser alterados incluem aminoácidos nas posições 238, 252, 253, 254, 255, 256, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 e/ou 447 (numeração EU) conforme descrito no WO2000/042072. Similarmente, exemplos preferidos de aminoácidos que podem ser alterados também incluem ami- noácidos nas posições 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 e/ou 436 (numeração EU) conforme descrito no WO2002/060919. Ainda, tais aminoácidos que podem ser alterados também incluem aminoácidos nas posições 250, 314 e 428 (numeração EU) conforme descrito no WO2004/092219. Tais aminoá- cidos que podem ser adicionalmente alterados incluem aminoácidos nas posições 251, 252, 307, 378, 428, 430, 434 e/ou 436 (numeração EU) conforme descrito no WO2010/045193. Essas alterações de ami- noácido aumentam a ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido de uma região Fc de uma imunoglobulina IgG.
[01238] Na presente invenção, uma região Fc que tem uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido é preferida. Se o domínio for uma região Fc já tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, ele pode ser usado co mo é. Se o domínio não tiver atividade de ligação a FcRn ou tiver uma fraca sob uma condição de faixa de pH ácido, aminoácidos na molécula de ligação a antígeno podem ser alteradas para obter uma região Fc tendo a atividade de ligação a FcRn desejada. Uma região Fc tendo a atividade de ligação a FcRn desejada ou atividade de ligação a FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido pode ser preferi-velmente obtida através da alteração dos aminoácidos na região Fc. Alteração de aminoácido de uma região Fc que confere tal atividade de ligação desejada pode ser identificada através da comparação da atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido antes e após a alteração do aminoácido. Aqueles versados na técnica pode fazer alterações de aminoácido apropriadas usando um método bem conhecido similar ao método mencionado acima usado para alterar a atividade de ligação a receptor FCY.
[01239] Uma região Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, que está incluída em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção pode ser obtida através de qualquer método; mas especificamente, um domínio de ligação a FcRn tendo atividade de ligação ou tendo atividade de ligação aumentada a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido pode ser obtido através da alteração dos aminoácidos de uma imunoglobulina IgG humana usada como a região Fc de partida. Exemplos preferidos de regiões Fc de imunoglobulinas IgG para a alteração incluem regiões Fc de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e suas variantes). Para alterações para outros aminoácidos, aminoácidos em qualquer posição podem ser alterados contanto que a região Fc tenha atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido ou a atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa ácida possa ser aumentada. Quando uma molécula de ligação a antígeno compreende uma região Fc de uma IgG1 humana como a região Fc, ela inclui preferivel- mente uma alteração que tem efeitos de aumento da ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação de região Fc de partida de IgG1 humana. Exemplos de tais aminoácidos que podem ser alterados incluem aminoácidos nas posições 252, 254, 256, 309, 311, 315, 433 e/ou 434, bem como aminoá- cidos que podem ser combinados com os mesmos, que são aminoáci- dos nas posições 253, 310, 435 e/ou 426 (numeração EU) conforme descrito no WO1997/034631. Aminoácidos preferidos são aminoácidos nas posições 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 32, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 e/ou 447 (numeração EU) como descrito no WO2000/042072. Similarmente, exemplos preferidos de tais aminoácidos que podem ser alterados também incluem aminoácidos nas posições 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 e/ou 436 (numeração EU) conforme descrito no WO2002/060919. Ainda, tais aminoácidos que podem ser alterados incluem aminoácidos nas posições 250, 314 e 428 (numeração EU) conforme descrito no WO2004/092219. Ainda, exemplos preferidos de tais aminoácidos que podem ser alterados incluem aminoácidos nas posições 238, 244, 245, 249, 252, 256, 257, 258, 260, 262, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 307, 311, 312, 316, 317, 318, 332, 339, 341, 343, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 423, 427, 430, 431, 434, 436, 438, 440 e/ou 442 conforme descrito no WO2006/020114. Outros exemplos preferidos de tais aminoácidos que podem ser alterados também incluem aminoácidos nas posições 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 e/ou 436 (numeração EU) conforme descrito no WO2010/045193. Essas alterações de aminoácido aumentam a ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido de uma região Fc de uma imunoglobulina IgG.
[01240] Em uma modalidade não limitante de alterações que produ- zem o efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana quando uma região Fc de IgG1 humana é incluída como uma região Fc, exemplos incluem pelo menos uma ou mais alterações de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em:
[01241] ou Arg ou Leu na posição de aminoácido 251;
[01242] qualquer um de Phe, Ser, Thr e Tyr na posição de aminoá- cido 252;
[01243] ou Ser ou Thr na posição de aminoácido 254;
[01244] qualquer um de Arg, Gly, Ile e Leu na posição de aminoáci- do 255;
[01245] qualquer um de Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu e Thr na posição de aminoácido 256;
[01246] ou Ile ou Thr na posição de aminoácido 308;
[01247] Pro na posição de aminoácido 309;
[01248] qualquer um de Gly, Leu e Ser na posição de aminoácido 311;
[01249] ou Ala ou Asp na posição de aminoácido 312;
[01250] ou Ala ou Leu na posição de aminoácido 314;
[01251] qualquer um de Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser e Thr na posição de aminoácido 385;
[01252] qualquer um de Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser e Thr na posição de aminoácido 386;
[01253] qualquer um de Ala, Arg, His, Pro, Ser e Thr na posição de aminoácido 387;
[01254] qualquer um de Asn, Pro e Ser na posição de aminoácido 389;
[01255] qualquer um de Leu, Met, Phe, Ser e Thr na posição de aminoácido 428;
[01256] qualquer um de Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro e Ser na posição de aminoácido 433;
[01257] qualquer um de His, Phe e Tyr na posição de aminoácido 434; e
[01258] qualquer um de Arg, Asn, His, Lys, Met e Thr na posição de aminoácido 436
[01259] de acordo com a numeração EU. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado, e o aminoácido pode ser alterado em apenas uma posição ou em duas ou mais posições.
[01260] Quando uma região Fc de IgG1 humana é incluída como a região Fc, uma modalidade não limitante de alterações que produzem efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana pode ser uma alteração(ões) compreendendo Ile na posição de aminoácido 308, Pro na posição de aminoácido 309 e/ou Glu na posição de aminoácido 311 de acordo com a numeração EU. Em outra modalidade não limitante das alterações, as alterações podem ser Thr na posição de aminoácido 308, Pro na posição de aminoácido 309, Leu na posição de aminoácido 311, Ala na posição de aminoáci- do 312 e/ou Ala na posição de aminoácido 314. Em ainda outra modalidade não limitante das alterações, as alterações podem ser Ile ou Thr na posição de aminoácido 308; Pro na posição de aminoácido 309; Glu, Leu ou Ser na posição de aminoácido 311; Ala na posição de aminoácido 312; e/ou Ala ou Leu na posição de aminoácido 314. Em uma modalidade não limitante diferente das alterações, as alterações podem ser Thr na posição de aminoácido 308, Pro na posição de ami- noácido 309, Ser na posição de aminoácido 311, Asp na posição de aminoácido 312 e/ou Leu na posição de aminoácido 314.
[01261] Quando uma região Fc de IgG1 humana está incluída como a região Fc, uma modalidade não limitante de alterações que produzem efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação a região Fc de partida de IgG1 humana pode ser uma alteração(ões) compreendendo Leu na posição de aminoácido 251, Tyr na posição de aminoácido 252, Ser ou Thr na posição de aminoácido 254, Arg na posição de aminoácido 255 e/ou Glu na posição de aminoácido 256 de acordo com a numeração EU.
[01262] Quando uma região Fc de IgG1 humana está incluída como a região Fc, uma modalidade não limitante de alterações que produzem efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana pode ser uma alteração(ões) compreendendo qualquer um de Leu, Met, Phe, Ser e Thr na posição de aminoácido 428; qualquer um de Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro e Ser na posição de aminoácido 433; qualquer um de His, Phe e Tyr na posição de amino- ácido 434; e/ou qualquer um de Arg, Asn, His, Lys, Met e Thr na posição de aminoácido 436 indicada pela numeração EU. Em outra modalidade não limitante da alteração(ões), a alteração(ões) pode incluir His ou Met na posição de aminoácido 428 e/ou His ou Met na posição de aminoácido 434.
[01263] Quando uma região Fc de IgG1 humana está incluída como a região Fc, uma modalidade não limitante de alterações que produz efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana pode ser uma alteração(ões) compreendendo Arg na posição de aminoácido 385, Thr na posição de aminoácido 386, Arg na posição de aminoácido 387 e/ou Pro na posição de aminoácido 389 de acordo com a numeração EU. Em outra modalidade não limitante das alterações, a alteração(ões) pode ser Asn na posição de aminoá- cido 385, Pro na posição de aminoácido 386 e/ou Ser na posição de aminoácido 389.
[01264] Ainda, quando uma região Fc de IgG1 humana está incluída como a região Fc, uma modalidade não limitante de alterações que produz efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana, alterações incluem aquelas de pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
[01265] ou Gln ou Glu na posição de aminoácido 250; e
[01266] ou Leu ou Phe na posição de aminoácido 428
[01267] de acordo com a numeração EU. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado, e o aminoácido pode ser alterado em uma posição sozinho ou em duas ou mais posições.
[01268] Quando uma região Fc de IgG1 humana está incluída como a região Fc, uma modalidade não limitante de alterações que produz efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana pode ser uma alteração(ões) compreendendo Gln na posição de aminoácido 250 e/ou Leu ou Phe na posição de amino- ácido 428 de acordo com a numeração EU. Em outra modalidade não limitante das alterações, as alterações podem ser aquelas compreendendo Glu na posição de aminoácido 250 e/ou Leu ou Phe na posição de aminoácido 428.
[01269] Quando uma região Fc de IgG1 humana é incluída como a região Fc, uma modalidade não limitante de alterações que produz efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana, exemplos incluem alterações de pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
[01270] ou Asp ou Glu na posição de aminoácido 251;
[01271] Tyr na posição de aminoácido 252;
[01272] Gln na posição de aminoácido 307;
[01273] Pro na posição de aminoácido 308;
[01274] Val na posição de aminoácido 378;
[01275] Ala na posição de aminoácido 380;
[01276] Leu na posição de aminoácido 428;
[01277] ou Ala ou Lys na posição de aminoácido 430;
[01278] qualquer um de Ala, His, Ser e Tyr na posição de aminoáci- do 434; e
[01279] Ile na posição de aminoácido 436
[01280] de acordo com a numeração EU. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado, e o aminoácido pode ser alterado em apenas duas posições ou em três ou mais posições.
[01281] Quando uma região Fc de IgG1 humana é incluída como a região Fc, uma modalidade não limitante de alterações que produz efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação de região Fc de partida de IgG1 humana pode ser alteração(ões) compreendendo Gln na posição de aminoácido 307 e ou Ala ou Ser na posição de aminoácido 434 de acordo com a numeração EU. Em outra modalidade não limi- tante das alterações, as alterações podem incluir Pro na posição de aminoácido 308 e Ala na posição de aminoácido 434. Em ainda outra modalidade não limitante das alterações, as alterações podem incluir Tyr na posição de aminoácido 252 e Ala na posição de aminoácido 434. Em uma modalidade não limitante diferente das alterações, as alterações podem incluir Val na posição de aminoácido 378 e Ala na posição de aminoácido 434. Em outra modalidade não limitante das alterações, as alterações podem incluir Leu na posição de aminoácido 428 e Ala na posição de aminoácido 434. Em ainda outra modaidade não limitante das alterações, as alterações podem incluir Ala na posição de aminoácido 434 e Ile na posição de aminoácido 436. Ainda, em outra modalidade não limitante das alterações, as alterações podem incluir Pro na posição de aminoácido 308 e Tyr na posição de aminoá- cido 434. Ainda, em outra modalidade não limitante diferente das alte-rações, as alterações podem incluir Gln na posição de aminoácido 307 e Ile na posição de aminoácido 436.
[01282] Quando uma região Fc de IgG1 humana é incluída como a região Fc, uma modalidade não limitante de alterações que produz efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana pode ser uma alteração(ões) compreendendo Gln na posição de aminoácido 307, Alan na posição de aminoácido 380 e Ser na posição de aminoácido 434 de acordo com a numeração EU. Em outra modalidade não limitante das alterações, as alterações podem incluir Gln na posição de aminoácido 307, Ala na posição de ami- noácido 380 e Ala na posição de aminoácido 434. Em ainda outra mo- dalidaide não limitante das alterações, as alterações podem incluir Tyr na posição de aminoácido 252, Pro na posição de aminoácido 308 e Tyr na posição de aminoácido 434. Em uma modalidade não limitante diferente das alterações, as alterações podem incluir Asp na posição de aminoácido 251, Gln na posição de aminoácido 307 e His na posição de aminoácido 434.
[01283] Quando a região Fc de IgG1 humana é incluída como a região Fc, em uma modalidade não limitante de alterações que produz efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana, exemplos incluem alterações de pelo menos dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
[01284] Leu na posição de aminoácido 238;
[01285] Leu na posição de aminoácido 244;
[01286] Arg na posição de aminoácido 245;
[01287] Pro na posição de aminoácido 249;
[01288] Tyr na posição de aminoácido 252;
[01289] Pro na posição de aminoácido 256;
[01290] qualquer um de Ala, Ile, Met, Asn, Ser e Val na posição de aminoácido 257;
[01291] Asp na posição de aminoácido 258;
[01292] Ser na posição de aminoácido 260;
[01293] Leu na posição de aminoácido 262;
[01294] Lys na posição de aminoácido 270;
[01295] ou Leu ou Arg na posição de aminoácido 272;
[01296] qualquer um de Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 279;
[01297] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 283;
[01298] Asn na posição de aminoácido 285;
[01299] Phe na posição de aminoácido 286;
[01300] ou Asn ou Pro na posição de aminoácido 288;
[01301] Val na posição de aminoácido 293;
[01302] qualquer um de Ala, Glu e Met na posição de aminoácido 307;
[01303] qualquer um de Ala, Ile, Lys, Leu, Met, Val e Trp na posição de aminoácido 311;
[01304] Pro na posição de aminoácido 312;
[01305] Lys na posição de aminoácido 316;
[01306] Pro na posição de aminoácido 317;
[01307] ou Asn ou Thr na posição de aminoácido 318;
[01308] qualquer um de Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser e Trp na posição de aminoácido 332;
[01309] qualquer um de Asn, Thr e Trp na posição de aminoácido 339;
[01310] Pro na posição de aminoácido 341;
[01311] qualquer um de Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr e Tyr na posição de aminoácido 343;
[01312] Arg na posição de aminoácido 375;
[01313] qualquer um de Gly, Ile, Met, Pro, Thr e Val na posição de aminoácido 376;
[01314] Lys na posição de aminoácido 377;
[01315] ou Asp ou Asn na posição de aminoácido 378;
[01316] qualquer um de Asn, Ser e Thr na posição de aminoácido 380;
[01317] qualquer um de Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 382;
[01318] Asn na posição de aminoácido 423;
[01319] Asn na posição de aminoácido 472;
[01320] qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 430;
[01321] ou His ou Asn na posição de aminoácido 431;
[01322] qualquer um de Phe, Gly, His, Trp e Tyr na posição de ami- noácido 434;
[01323] qualquer um de Ile, Leu e Thr na posição de aminoácido 436;
[01324] qualquer um de Lys, Leu, Thr e Trp na posição de aminoá- cido 438;
[01325] Lys na posição de aminoácido 440; e
[01326] Lys na posição de aminoácido 442;
[01327] de acordo com a numeração EU. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado e o aminoácido pode ser alterado apenas em duas posições ou em três ou mais posições.
[01328] Quando uma região Fc de IgG1 humana é incluída como a região Fc, uma modalidade não limitante de alterações que produz efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humano pode ser alterações compreendendo Ile na posição de aminoácido 257 e Ile na posição de aminoácido 311 de acordo com a numeração EU. Em outra modalidade não limitante das alterações, as alterações podem incluir Ile na posição de aminoácido 257 e His na posição de aminoácido 434. Em ainda outra modalidade não limitante das alterações, as alterações podem incluir Val na posição de aminoácido 376 e His na posição de aminoácido 434.
[01329] Ainda, conforme descrito mais tarde, para o domínio de ligação a FcRn incluído em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção, uma região Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro pode também ser preferivelmente usada. Tal região Fc pode ser obtida através de qualquer método de acordo com o método mencionado acima para obtenção de regiões Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, mas, especificamente, um domínio de ligação a FcRn tendo atividade de ligação ou tendo atividade de ligação aumentada a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro pode ser obtido através de alteração de aminoácidos de uma imunoglobulina IgG humana usada como a região Fc de partida. Regiões Fc preferidas de imunoglobuli- nas IgG para a alteração incluem regiões Fc de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e suas variantes). Para alterações para outros ami- noácidos, aminoácido em qualquer posição pode ser alterado contanto que a região Fc tenha atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro ou a atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido pode ser aumentada. Quando uma molécula de ligação a antígeno inclui uma região F de uma IgG1 humana como a região Fc, ela compreende preferivelmente uma alteração que tem efeitos de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana. Exemplos preferidos de tais regiões Fc alteradas incluem domínios de ligação a FcRn humano onde pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos nas posições 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309,311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385,386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 no sítio da região Fc de partida de acordo com numeração EU são diferentes dos aminoácidos cor-respondentes na região Fc nativa.
[01330] Exemplos preferidos de tais regiões Fc alteradas incluem regiões Fc compreendendo pelo menos um ou mais aminoácidos sele-cionados do grupo consistindo em:
[01331] Met na posição de aminoácido 237;
[01332] Ala na posição de aminoácido 238;
[01333] Lys na posição de aminoácido 239;
[01334] Ile na posição de aminoácido 248;
[01335] qualquer um de Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 250;
[01336] qualquer um de Phe, Trp e Tyr na posição de aminoácido 252;
[01337] Thr na posição de aminoácido 254;
[01338] Glu na posição de aminoácido 255;
[01339] Qualquer um de Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido 256;
[01340] Qualquer um de Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr e Val na posição de aminoácido 257;
[01341] His na posição de aminoácido 258;
[01342] Ala na posição de aminoácido 265;
[01343] Phe na posição de aminoácido 270;
[01344] ou Ala ou Glu na posição de aminoácido 286;
[01345] His na posição de aminoácido 289;
[01346] Ala na posição de aminoácido 297;
[01347] Gly na posição de aminoácido 298;
[01348] Ala na posição de aminoácido 303;
[01349] Ala na posição de aminoácido 305;
[01350] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 307;
[01351] qualquer um de Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln e Thr na posição de aminoácido 308;
[01352] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Pro e Arg na posição de aminoácido 309;
[01353] qualquer um de Ala, His e Ile na posição de aminoácido 311;
[01354] ou Ala ou His na posição de aminoácido 312;
[01355] ou Lys ou Arg na posição de aminoácido 314;
[01356] ou Ala ou His na posição de aminoácido 315;
[01357] Ala na posição de aminoácido 317;
[01358] Gly na posição de aminoácido 325;
[01359] Val na posição de aminoácido 332;
[01360] Leu na posição de aminoácido 334;
[01361] His na posição de aminoácido 360;
[01362] Ala na posição de aminoácido 376;
[01363] Ala na posição de aminoácido 380;
[01364] Ala na posição de aminoácido 382;
[01365] Ala na posição de aminoácido 384;
[01366] ou Asp ou His na posição de aminoácido 385;
[01367] Pro na posição de aminoácido 386;
[01368] Glu na posição de aminoácido 387;
[01369] ou Ala ou Ser na posição de aminoácido 389;
[01370] Ala na posição de aminoácido 424;
[01371] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 428;
[01372] Lys na posição de aminoácido 433;
[01373] qualquer um de Ala, Phe, His, Ser, Trp e Tyr na posição de aminoácido 434; e
[01374] His na posição de aminoácido 436;
[01375] na região Fc de acordo com a numeração EU.
[01376] Por exemplo, ao usar essas alterações de aminoácido sozinhas ou alterações múltiplas em combinação, ligação de uma região Fc de IgG a FcRn em uma faixa de pH ácido e/ou faixa de pH neutro pode ser aumentada; no entanto, as alterações de aminoácido a serem introduzidas não são particularmente limitadas, contando que o efeito de aperfeiçoamento de retenção no plasma seja conferido, qualquer alteração de aminoácido pode ser introduzida.
[01377] Composições Farmacêuticas
[01378] Quando um anticorpo de neutralização convencional contra um antígeno solúvel é administrado, a retenção no plasma do antígeno é esperada ser prolongada pela ligação ao anticorpo. Em geral, anticorpos têm uma meia-vida longa (uma semana a três semanas) enquanto a meia-vida de antígeno é geralmente curta (um dia ou menos). Entretanto, antígenos ligados a anticorpo têm uma meia-vida signifi- cantemente mais longa em plasma comparado com quando os antíge- nos estão presentes sozinhos. Por esta razão, administração de anticorpo de neutralização existente resulta em uma concentração de an- tígeno aumentada em plasma. Tais casos foram relatados com vários anticorpos de neutralização que se direcionam a antígenos solúveis incluindo, por exemplo, IL-6 (J. Immunotoxicol. (2005) 3, 131-139), beta amiloide (mAbs (2010) 2 (5), 1-13), MCP-1 (ARTHRITIS & RHEUMATISM (2006) 54, 2387-2392), hepcidina (AAPS J. (2010) 4, 646657) e receptor de sIL-6 (Blood (2008) 112 (1), 3959-64). Administra- ção de anticorpos de neutralização existentes foi relatada aumentar a concentração de antígeno no plasma total para cerca de 10 a 1.000 vezes (o nível de aumento varia dependendo do antígeno) a linha de base. Aqui, a concentração de antígeno no plasma total se refere a uma concentração como uma quantidade total de antígeno em plasma, isto é, a soma de concentrações de antígenos ligados a anticorpo e não ligados a anticorpo. Um aumento na concentração de antígeno no plasma total é indesejável para tais agentes farmacêuticos de anticorpo que se direcionam a um antígeno solúvel. A razão é que a concentração de anticorpo tem que ser maior do que pelo menos a concentração de antígeno no plasma total para neutralizar o antígeno solúvel. Especificamente, "a concentração de antígeno no plasma total é au-mentada para 10 a 1.000 vezes" significa que, a fim de neutralizar o antígeno, a concentração de anticorpo no plasma (isto é, dose de anti-corpo) tem que ser 10 a 1.000 vezes maior comparado com quando aumento na concentração de antígeno no plasma total não ocorre. Por outro lado, se a concentração de antígeno no plasma total puder ser reduzida para 10 a 1.000 vezes comparado com o anticorpo de neutra-lização existente, a dose de anticorpo pode ser também reduzida para um grau similar. Desta maneira, anticorpos capazes de diminuir a con-centração de antígeno no plasma total através da eliminação do antí- geno solúvel do plasma são altamente úteis comparado com anticorpos de neutralização existentes.
[01379] Embora a presente invenção não seja restrita a uma teoria particular, a razão para aumento no número de antígenos que pode se ligar a uma molécula de ligação a antígeno única e a razão para dissi-pação aumentada de concentração de antígeno no plasma quando uma molécula de ligação a antígeno é administrada a um organismo vivo que leva a aumento de absorção da molécula de ligação a antíge- no na células in vivo, onde a molécula de ligação a antígeno compre- ende um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a an- tígeno muda dependendo da condição de concentração de íon de maneira que a atividade de ligação a antígeno é menor sob uma condição de faixa de pH ácido do que sob uma condição de faixa de pH neutro e um domínio de ligação a FcRn tal como uma região constante de anticorpo tendo atividade de ligação a receptor FCY humano sob uma condição de faixa de pH neutro pode ser explicada como segue.
[01380] Por exemplo, quando um anticorpo que se liga a um antí- geno de membrana é administrado in vivo, após ligação a um antíge- no, o anticorpo é, em um estado ligado ao antígeno, incorporado ao endossomo via internalização intracelular. Então, o anticorpo é transfe-rido para o lisossomo enquanto permanecendo ligado ao antígeno e é degradado junto com antígeno neste local. A eliminação mediada por internalização a partir do plasma é referida como eliminação dependente de antígeno e foi relatada para muitas moléculas de anticorpo (Drug Discovery Today (2006) 11(1-2), 81-88). Quando uma molécula de anticorpo IgG única se liga a antígenos de uma maneira divalente, a molécula de anticorpo única é internalizada enquanto permanecendo ligada aos dois antígenos, e é degradada no lisossomo. No caso de anticorpos típicos, desta maneira, uma molécula de anticorpo IgG única não pode se ligar a três moléculas de antígeno ou mais. Por exemplo, uma molécula de anticorpo IgG única tendo uma atividade de neu-tralização não pode neutralizar trse moléculas de antígeno ou mais.
[01381] A retenção no plasma de molécula de IgG é relativamente longa (a eliminação é lenta) uma vez que FcRn, que é conhecido como um receptor selvagem para molécula de IgG, funciona. Moléculas de IgG incorporadas aos endossomos por pinocitose se ligam sob condição ácido endossoma a FcRn expresso em endossomos. Moléculas de IgG que não podem se ligar a FcRn humano são transferidas para lisossomos e degradadas neste local. Entretanto, moléculas de IgG ligadas a FcRn são transferidas para a superfície celular. As moléculas de IgG são dissociadas de FcRn sob a condição neutra em plasma, e então elas são recicladas de volta para o plasma.
[01382] Alternativamente, quando as moléculas de ligação a antí- geno são anticorpos que se ligam a um antígeno solúvel, os anticorpos admdinistrados in vivo se ligam a antígenos, e então os anticorpos são incorporados a células enquanto permanecendo ligados aos antíge- nos. A maioria dos anticorpos incorporados a células se ligam a FcRn no endossomo e então são transferidos para a superfície celular. Os anticorpos são dissociados de FcRn sob a condição neutra em plasma e liberados para o exterior das células. No entanto, anticorpos tendo domínios de ligação a antígeno típicos cuja atividade de ligação a an- tígeno não varia dependendo da condição de concentração de íon tal como pH são liberados para o exterior das células enquanto permane-cendo ligados aos antígenos, e então não podem se ligar a um antíge- no novamente. Desta maneira, tal como anticorpos que se ligam a an- tígenos de membrana, molécula de anticorpo IgG típica única cuja ati-vidade de ligação a antígeno não varia dependendo da condição de concentração de íon tal como pH não pode se ligar a três molecuals de antígeno ou mais.
[01383] Anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente do pH, que se ligam fortemente a antígenos sob a condição de faixa de pH neutro em plasma e são dissociados de antígenos sob a condição de faixa de pH ácido endossoma (anticorpos que se ligam a antígenos sob a condição de faixa de pH neutro e são dissociados sob uma condição de faixa de pH ácido) e anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente da concentração de íon de cálcio, que se ligam fortemente a antígenos sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta em plasma e são dissociados de antí- genos sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa no endossomo (anticorpos que se ligam a antígenos sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta e são dissociados sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa) podem ser dissociados de antígeno no endossomo. Anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente do pH ou de uma maneira dependente da concentração de íon de cálcio, quando reciclado para o plasma através de FcRn após dissociação de antígenos, podem novamente se ligar a um antígeno. Desta maneira, tal molécula de ligação a antígeno pode se ligar repetidamente a várias moléculas de antígeno. Entretanto, antígenos ligados a moléculas de ligação a antígeno são dissociados do anticorpo no endossomo e degradados no lisossoma sem reciclagem para o plasma. Através da administração de tais moléculas de ligação a antígeno in vivo, absorção de antígeno em células é acelerada, e é possível diminuir concentração de antígeno no plasma.
[01384] Absorção de antígenos ligados por moléculas de ligação a antígeno em células é ainda mais aumentada ao conferir ou aumentar a atividade de ligação a receptor FCY sob a condição de faixa de pH neutro (pH 7,4) a anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente do pH, que se ligam fortemente a antígenos sob a condição de faixa de pH neutro em plasma e são dissociados de antígenos sob a condição de faixa de pH ácido endossoma (anticorpos que se ligam a antígenos sob a condição de faixa de pH neutro e são dissociados sob uma condição de faixa de pH ácido) e anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente da concentração de íon de cálcio, que se ligam fortemente a antígenos sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta em plasma e são dissociados de antígenos sob uma condicaod e concentração de íon de cálcio baixa no endossomo (anticorpos que se ligam a antígenos sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta e são dissociados sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa). Especificamente, através da administração de tais moléculas de ligação a antígeno in vivo, a eliminação de antígeno é acelerada, e é possível reduzir a con-centração de antígeno no plasma. Anticorpos típicos que não têm a habilidade em se ligar a antígenos de uma maneira dependendo do pH ou de uma maneira dependente da concentração de íon de cálcio e complexos de antígeno-anticorpo de tais anticorpos são incorporados a células através de endocitose não específica, e transportados para a superfície celular através de ligação a FcRn sob a condição ácida en- dossoma. Eles são dissociados de FcRn sob a condição neutra na su-perfície celular e reciclados para o plasma. Desta maneira, quando um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira totalmente de-pendente do pH (que se liga sob a condição de faixa de pH neutro e é dissociado sob uma condição de faixa de pH ácido) ou de uma maneira totalmente dependente da concentração de íon de cálcio (que se liga sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta e é dissociado sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa) se liga a um antígeno em plasma e é dissociado do antígeno no endos- somo, a taxa de eliminação de antígeno é considerada ser igual à taxa de absorção em células do anticorpo ou complexo de antíge- no/anticorpo por endocitose não específica. Quando a dependência do pH ou concentração de íon de cálcio de ligação de antígeno/anticorpo é insuficiente, antígenos que não são dissociados de anticorpos no endossomo são, junto com os anticorpos, reciclados para o plasma. Por outro lado, quando a dependência do pH é suficientemente forte, a etapa de limitação de dose de eliminação de antígeno é a absorção celular por endocitose não específica. Entretanto, FcRn transporta anticorpos do endossomo para a superfície celular e uma fração de FcRn é esperada também ser distribuída na superfície celular.
[01385] Os presentes inventores consideraram que imunoglobulinas IgG tendo atividade de ligação ou tendo atividade de ligação aumenta-da a receptores FCY sob uma condição de faixa de pH neutro podem se ligar a receptores FCY presentes na superfície celular e que as imu- noglobulinas IgG são absorvidas nas células de uma maneira dependente do receptor Fcy através de ligação a receptores Fcy presentes na superfície celular. A taxa de absorção em células via receptores Fcy é mais rápida do que a taxa de absorção em células através de endocitose não específica. Desta maneira, é pensado que a taxa de eliminação de antígeno por moléculas de ligação a antígeno possa ser acelerada mais através do aumento da habilidade em se ligar a receptores Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro. Isto é, moléculas de ligação a antígeno tendo a habilidade em se ligar a receptores Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro absorvem antígenos em células mais rapidamente do que imunoglobulinas IgG comuns (humanas nativas), e após ligação a FcRn no endossomo e dissociação dos antí- genos, elas são recicladas novamente para o plasma, e elas se ligam novamente a antígenos e são absorvidas em células via receptores Fcy. Uma vez que a rotatividade deste ciclo pode ser aumentada aumentando a habilidade em se ligar a receptores Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro, a taxa de eliminação de antígeno a partir do plasma é acelerada. Ainda, ao produzir moléculas de ligação a antíge- no que têm atividade de ligação a antígeno menor sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com atividade de ligação a antigen sob uma condição de faixa de pH neutro, a taxa de eliminação de antí- geno a partir do plasma pode ser acelerada mais. Ao aumentar o número de ciclos resultantes da aceleração da taxa de rotatividade deste ciclo, o número de moléculas de antígeno que pode ser ligado por uma molécula de ligação a antígeno única pode ser aumentado. Moléculas de ligação a antígeno da presente invenção compreendem um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a receptor Fcy, e uma vez que o domínio de ligação a receptor Fcy não afeta a ligação a an- tígeno, e com base no mecanismo mencionado acima, é considerado que sem importar o tipo de antígenos, absorção de antígeno em células por moléculas de ligação a antígeno pode ser aumentada e a taxa de eliminação de antígeno pode ser acelerada através da redução de atividade de ligação (habilidade de ligação) da molécula de ligação a antígeno a antígenos sob uma condição de concentração de íon tal como faixa de pH ácido ou condição de concentração de íon de cálcio baixa comparado com a atividade de ligação (habilidade de ligação) a antígenos sob uma condição de concentração de íon tal como faixa de pH neutro ou condição de concentração de íon de cálcio alta e/ou au-mento de atividade de ligação a receptores FCY em pH em plasma. Desta maneira, as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção podem exibir efeitos melhores do que os anticorpos terapêuticos convencionais em termos de redução de efeitos colaterais causados por antígenos, aumento em dose de anticorpo e aperfeiçoamento de cinética in vivo de anticorpos.
[01386] A Fig. 1 mostra uma modalidade do mecanismo para eliminação de antígenos solúveis a partir do plasma através da administração de anticorpos de ligação a antígeno dependente da concentração de íon com ligação aumentada a receptores Fcy em pH neutro comparado com anticorpos de neutralização convencionais. Abaixo, anticorpos de ligação a antígeno dependente da concentração de íon de hidrogênio (isto é, pH) serão descritos como um exemplo dos anticorpos de ligação a antígeno dependendo da concentração de íon, mas os mecanismos não são limitados à concentração de íon de hidrogênio. Anticorpos de neutralização existentes que não têm habilidade de ligação a antígeno dependente do pH podem ser gradualmente absorvidos principalmente por interações não específicas com células após ligação a antígenos solúveis em plasma. Os complexos de anticorpos de neutralização e antígenos solúveis, que são absorvidos em células, se deslocam para endossomos ácidos e são reciclados para o plasma através de FcRn. Por outro lado, um anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH com ligação aumentada a receptores FCY sob uma condição neutra se liga a um antígeno solúvel em plasma e, então, ele pode ser rapidamente absorvido em células expressando receptor Fcy na superfície celular via interação com um receptor Fcy além de interação não específica. Aqui, os antígenos solúveis ligados a anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH se dissociam do anticorpo devido à habilidade de ligação dependente do pH nos endossomos ácidos. Antígenos solúveis que dissociaram do anticorpo então se deslocam para lisossomos e eles são degradados através de proteólise. Entretanto, anticorpos que liberaram os antígenos solúveis se ligam a FcRn no endossomo ácido e são então reciclados para a membrana celular por FcRn, e são liberados novamente no plasma. Desta maneira, os anticorpos que são reciclados podem se ligar novamente a outros antígenos solúveis. Tais anticorpos de ligação a antígeno dependente do pH cuja ligação a receptores Fcy sob uma condição neutra podem deslocar uma grande quantidade de antígenos solúveis para lisossomos para reduzir a concentração de antígeno total em plasma através da repetição de um ciclo de: absorção em células via receptores Fcy; dissociação e degradação de antígenos solúveis; e reciclagem de anticorpo.
[01387] Especificamente, a presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas compreendendo moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, moléculas de ligação a antígeno pro-duzidas através de métodos de alteração da presente invenção ou mo-léculas de ligação a antígeno produzidas através dos métodos de pro-dução da presente invenção. Moléculas de ligação a antígeno da pre-sente invenção ou moléculas de ligação a antígeno produzidas através dos métodos de produção da presente invenção são úteis como com posições farmacêuticas uma vez que elas, quando administradas, têm o efeito forte de redução da concentração de antígeno no plasma comparado com moléculas de ligação a antígeno típicas, e exibem a resposta imune in vivo, farmacocinética e outros aperfeiçoada em ani-mais administrados com as moléculas. As composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender carreadores farmaceutica- mente aceitáveis.
[01388] Na presente invenção, as composições farmacêuticas ge-ralmente se referem a agentes para tratamento ou prevenção ou teste e diagnóstico de doenças.
[01389] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, elas podem ser usadas parenteralmente, na forma de injeções de soluções ou suspensões estéreis incluindo água e outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, tais composições podem ser formuladas misturando na forma de dose unitária requerida na prática de fabricação de remédio geralmente aprovada, combinando apropriadamente com carreadores ou meios farma- cologicamente aceitáveis, especificamente com água estéril, solução salina fisiológica, óleo vegetal, emulsificante, suspensão, tensoativo, estabilizador, agentes flavorizante, excipiente, veículo, conservante, ligante ou similar. Em tais formulações, a quantidade de ingrediente é ajustada para obter uma quantidade apropriada em uma faixa predeterminada.
[01390] Composições estéreis para injeção podem ser formuladas usando veículos tal como água destilada para injeção, de acordo com prática de formulação padrão.
[01391] Soluções aquosas para injeção incluem, por exemplo, solução salina fisiológica e soluções isotônicas contendo dextrose ou outros adjuvantes (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e clore- to de sódio). É também possível usar em combinação solubilizadores apropriados, por exemplo, álcoois (etanol e similar), poliálcoois (propi- leno glicol, polietileno glicol e similar), tensoativos não iônicos (polis- sorbato 80®, HCO-50 e similar).
[01392] Óleos incluem óleo de sésamo e óleos de soja. Benzoato de benzila e/ou álcool de benzila pode ser usado em combinação como solubilizadores. É também possível combinar tampões (por exemplo, tampão de fosfato e tampão de acetato de sódio), agentes suavi- zantes (por exemplo, cloridrato de procaína), estabilizadores (por exemplo, álcool benzílico e fenol) e/ou antioxidantes. Ampolas apropriadas são cheias com as injeções preparadas.
[01393] As composições farmacêuticas da presente invenção são preferivelmente administradas parenteralmente. Por exemplo, as com-posições na forma de dosagem para injeções, administração transnasal, administração transpulmonar ou administração transdermal são administradas. Por exemplo, elas podem ser administradas sistemica- mente ou localmente através de injeção intravenosa, injeção intramus-cular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea ou similar.
[01394] Métodos de administração podem ser apropriadamente se-lecionados em consideração da idade e sintomas do paciente. A dose de uma composição farmacêutica contendo uma molécula de ligação a antígeno pode ser, por exemplo, de a partir de 0,0001 a 1.000 mg/kg para cada administração. Alternativamente, a dose pode ser, por exemplo, de a partir de 0,001 a 100.000 mg por paciente. No entanto, a presente invenção não é limitada pelos valores numéricos descritos acima. As doses e os métodos de administração variam dependendo do peso, idade e sintomas e similar do paciente. Aqueles versados na técnica podem determinar doses e métodos de administração apropriados em consideração dos fatores descritos acima.
[01395] Aminoácidos contidos nas sequências de aminoácido da presente invenção podem ser pós-traducionalmente modificados (por exemplo, a modificação de uma glutamina N-terminal em um ácido pi- roglutâmico através de piroglutamilação é bem conhecida daqueles versados na técnica). Naturalmente, tais aminoácidos pós- traducionalmente modificados são incluídos nas sequências de amino- ácido na presente invenção.
Métodos que usam moléculas de ligação a antígeno da presente in-venção
[01396] A presente invenção também provê um método compreendendo contato de uma molécula de ligação a antígeno com uma célula expressando receptor FCY in vivo ou ex vivo, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a receptor Fcy, onde atividade de ligação a an- tígeno do domínio de ligação a antígeno muda dependendo da condição da concentração de íon e o domínio de ligação ao receptor Fc tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro maior do que um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, onde o método é qualquer um dos que seguem:
[01397] um método para aumento do número de antígenos aos quais uma molécula de ligação a antígeno única pode se ligar;
[01398] um método de eliminação de antígenos do plasma;
[01399] um método de aperfeiçoamento da farmacocinética da molécula de ligação a antígeno;
[01400] um método de promoção de dissociação intracelular de um antígeno a partir da molécula de ligação a antígeno, onde o antígeno foi extracelularmente ligado à molécula de ligação a antígeno;
[01401] um método de promoção de liberação extracelular de uma molécula de ligação a antígeno em uma forma não ligada a antígeno; e
[01402] um método de diminuição da concentração de antígeno livre ou da concentração de antígeno total em plasma.
[01403] Ainda, a presente invenção provê um método compreendendo aumento da atividade de ligação ao receptor FCY sob uma condição de faixa de pH neutro do domínio de ligação a receptor FCY em uma molécula de ligação a antígeno comparado com aquela de um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a receptor Fcy e um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon, onde o método é qualquer rum dos que seguem:
[01404] um método de alteração de uma molécula de ligação a an- tígeno onde absorção intracelular do antígeno a ser ligado é aumentada;
[01405] um método de aumento do número de antígenos aos quais uma molécula de ligação a antígeno única pode se ligar;
[01406] um método de aumento da habilidade da molécula de ligação a antígeno em eliminar antígenos do plasma;
[01407] um método de aperfeiçoamento da farmacocinética de uma molécula de ligação a antígeno;
[01408] um método de promoção de dissociação intracelular de um antígeno a partir de uma molécula de ligação a antígeno, onde o antí- geno foi extracelularmente ligado à molécula de ligação a antígeno;
[01409] um método de promoção de liberação extracelular de uma molécula de ligação a antígeno em uma forma não ligada a antígeno, onde a molécula de ligação a antígeno tinha sigo absorvida em uma célula em uma forma ligada a antígeno; e
[01410] um método de alteração de uma molécula de ligação a an- tígeno, o qual pode diminuir concentração de antígeno total ou concen-tração de antígeno livre em plasma.
[01411] Exemplos de métodos de contato de uma molécula de ligação a antígeno com uma célula de expressão de receptor FCY in vivo ou ex vivo incluem (1) o chamado método ex vivo onde plasma contendo as moléculas de ligação a antígeno e antígenos que se ligam às moléculas de ligação a antígeno é temporariamente tirado do organismo vivo; contatado com células expressando receptores Fcy; e após um certo período de tempo, o plasma contendo as moléculas de ligação a antígeno extracelularmente recicladas (ou também referidas como resecretadas ou recirculada) sem antígenos ligados é então posto de volta no organismo vivo e (2) o método de administração das moléculas de ligação a antígeno a um organismo vivo. No método de (1), pode ser também utilizado um método de: temporariamente retirar de um organismo vivo plasma contendo os antígenos aos quais as moléculas de ligação a antígeno se ligam; contato com células expressando os receptores Fcy e moléculas de ligação a antígeno; e após um certo período de tempo, retorno do plasma para o organismo vivo.
[01412] Na presente invenção, células expressando receptor Fcy não são limitadas às células particulares e quaisquer tipos de células podem ser usados contanto que elas sejam células que expressem o receptor(es) Fcy desejados. Para identificar células que expressam o receptor(es) Fcy desejados, bancos de dados publicamente conhecidos tais como Human Protein Atlas (http://www.proteinatlas.org/) podem ser usados. Ainda, se os receptores são expressos em células usadas para contato de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção pode ser confirmado através de um método que confirma expressão de um gene codificando o receptor(es) Fcy desejado, ou atra vés de um método imunológico que usa anticorpos que se ligam ao receptor(es) FCY desejado. Esses métodos também estão publicamente disponíveis. Uma vez que contato de células expressando receptor Fcy com moléculas de ligação a antígeno e antígenos que se ligam às moléculas de ligação a antígeno é realizada in vivo também, contato de células expressando receptor Fcy com moléculas de ligação a antí- geno na presente invenção incluem administração das moléculas de ligação a antígeno a organismos vivos. A duração de contato é, por exemplo, uma duração adequada dentre um minuto a várias semanas, 30 minutos a uma semana, uma hora a três dias e duas horas a um dia. Mais especificamente, a duração necessária para absorção das moléculas de ligação a antígeno ou antígenos ligados às moléculas de ligação a antígeno em células através de endocitose mediada pelo receptor Fcy é apropriadamente empregada pela duração do contato. Por exemplo, várias células imunes podem ser usadas para as células expressando receptor Fcy.
[01413] Um método de aumento da atividade de ligação do domínio de ligação a receptor Fcy a um receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro do que não aquele de um domínio de ligação a receptor Fcy ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose é descrito na seção descrita posteriormente sobre métodos para produção de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção.
Método de alteração de uma molécula de ligação a antígeno com ab-sorção intracelular aumentada de antígenos que se ligam à molécula de ligação a antígeno
[01414] A presente invenção provê métodos de alteração de uma molécula de ligação a antígeno com absorção intracelular aumentada de antígenos que se ligam à molécula de ligação a antígeno, onde o método compreende aumento, sob uma condição de faixa de pH neu- tro, de atividade de ligação a receptor FCY do domínio de ligação a re-ceptor FCY em uma molécula de ligação a antígeno comparado com aquela de um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a receptor Fcy e um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon.
[01415] Na presente invenção, "absorção intracelular de antígenos" por uma molécula de ligação a antígeno significa que os antígenos são absorvidos em células através de endocitose mediada por receptor Fcy e internalização. Na presente invenção, "aumenta absorção em células" significa que a taxa de absorção nas células de moléculas de ligação a antígeno ligadas a antígeno em plasma é aumentada e/ou a quantidade de antígenos que foram absorvidos que são reciclados em plasma é reduzida, e é apenas necessário que a taxa de absorção em células seja aumentada comparado com a molécula de ligação a antí- geno antes da redução de atividade de ligação a antígeno (habilidade de ligação) da molécula de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de íon talcomo faixa de pH ácido ou concentração de íon de cálcio baixa comparado com atividade de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de íon tal como faixa de pH neutro ou concentração de íon de cálcio alta em adição ao aumento da atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno a um receptor Fcy em uma faixa de pH neutro, e é preferido que a taxa seja aumentada comparado com IgG humana nativa à qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose e é particularmente preferido que a taxa seja aumentada comparado com qualquer uma das IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humanas na- tivas. Desta maneira, na presente invenção, se absorção intracelular de antígenos por moléculas de ligação a antígeno é aumentada pode ser determinado através da observação de se a taxa de absorção de antígenos em células aumentou. A taxa de absorção de antígenos a células pode ser calculada, por exemplo, através da adição da molécula de ligação a antígeno e antígeno a um meio de cultura contendo células expressando receptor FCY e medição da diminuição em concentração de antígeno no meio de cultura com o tempo ou medicao da quantidade de antígenos absorvidos nas células expressando receptor Fcy com o tempo. Usando o método de aumento da taxa através do qual antígenos são absorvidos em células pela molécula de ligação a antígeno da presente invenção, por exemplo, a taxa de eliminação de antígeno do plasma pode ser aumentada através da administração da molécula de ligação a antígeno. Desta maneira, se absorção de antí- geno em células por molécula de ligação a antígeno é aumentada pode ser também confirmado, por exemplo, através da avaliação de se a taxa de eliminação de antígeno em plasma é acelerada ou se a administração de molécula de ligação a antígeno reduz a concentração de antígeno total em plasma.
[01416] Na presente invenção "concentração de antígeno total no plasma" significa a soma das concentrações de antígenos ligados às moléculas de ligação a antígeno e antígenos não ligados ou "concentrações de antígeno livre em plasma" que é a concentração de antíge- nos não ligados a moléculas de ligação a antígeno. Vários métodos para medição de "concentração de antígeno total em plasma" ou "concentrações de antígeno livre em plasma" são bem conhecidos na técnica conforme descrito abaixo.
[01417] Na presente invenção, "IgG humano nativo" significa IgG humana não modificada e não é limitado a uma classe particular de IgG. Ainda, em "IgG humana nativa", é desejável que a cadeia de açú- car ligada na posição 297 (numeração EU) seja uma cadeia de açúcar contendo fucose. Isso significa contanto que IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 possa se ligar a FcRn humano em uma faixa de pH ácido, ela pode ser usada como uma "IgG humana nativa". Preferivelmente, "IgG humana nativa" pode ser IgG1 humana.
Método de aumento do número de antígenos que podem ser ligados por uma única molécula de ligação a antígeno
[01418] A presente invenção provê um método de aumento do número de antígenos aos quais uma molécula de ligação a antígeno única pode se ligar, onde o método compreende contato de uma molécula de ligação a antígeno com uma célula expressando receptor FCY in vivo ou ex vivo, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligado a receptor Fcy, onde uma atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon e o domínio de ligação de receptor Fcy tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro comparado com um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[01419] Ainda, a presente invenção provê um método de aumento do numero de antígenos aos quais uma molécula de ligação a antíge- no única pode se ligar, onde o método compreende aumento da atividade de ligação ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro do domínio de ligação a receptor Fcy em uma molécula de ligação a antígeno comparado com aquela de um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humana sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a receptor FCY e um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon.
[01420] A expressão "número de antígenos aos quais uma molécula de ligação a antígeno única pode se ligar" na presente invenção significa o número de antígenos aos quais uma molécula de ligação a antí- geno pode se ligar até que a molécula seja degradada e eliminada. A expressão "aumento do número de antígenos aos quais uma molécula de ligação a antígeno única pode se ligar" na presente invenção se refere ao aumento do número de vezes que uma molécula de antígeno ligada à molécula de ligação a antígeno se dissocia e a molécula de ligação a antígeno se liga novamente a uma molécula de ligação a an- tígeno. Moléculas de ligação a antígeno que se ligam à molécula de ligação a antígeno podem ser a mesma molécula de ligação a antíge- no ou moléculas diferentes existentes no sistema de reação onde ambas as moléculas estão presentes. Em outras palavras, ela se refere ao número total de vezes que a molécula de ligação a antígeno se liga a um antígeno no sistema de reação. Em outra expressão, quando um ciclo é suposto ser absorção intracelular de uma molécula de ligação a antígeno ligada a um antígeno, dissociação do antígeno em um en- dossomo, e então retorno da molécula de ligação a antígeno para o exterior da célula, a expressão se refere a aumento no número de vezes que este ciclo pode ser repetido até que a molécula de ligação a antígeno seja degradada e eliminada. Após ligação a um receptor Fcy, moléculas de ligação a antígeno da presente invenção tendo atividade de ligação a receptor Fcy em uma faixa de pH neutro são absorvidas em uma célula expressando este receptor Fcy através de endocitose. A molécula de ligação a antígeno da presente invenção que se dissocia do receptor Fcy sob uma condição de concentração de íon tal co mo uma faixa de pH ácido ou concentração de íon de cálcio baixa é reciclada para o exterior da célula novamente através de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido. A molécula de ligação a antígeno da presente invenção que é reciclada para o exterior da célula após dissociação do antígeno a partir da molécula de ligação a antí- geno sob uma condição de concentração de íon tal como uma faixa de pH ácido ou concentração de íon de cálcio baixa pode se ligar novamente a um antígeno. Desta maneira, se o número de ciclos aumentou pode ser avaliado através da determinação de se a "absorção intracelular é aumentada" mencionada acima ou se a última descrita "farma- cocinética é aperfeiçoada".
Método de eliminação de antígenos do plasma ou método de aumento da habilidade da molécula de ligação a antígeno em eliminar antígenos do plasma
[01421] A presente invenção provê um método de eliminação de antígenos do plasma, o qual compreende contato de uma molécula de ligação a antígeno com uma célula expressando receptor FCY in vivo ou ex vivo, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a Fcy, onde uma atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antí- geno muda dependendo da condição de concentração de íon e o domínio de ligação a receptor Fcy tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro comparado com um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[01422] Ainda, a presente invenção provê um método de aumento da habilidade da molécula de ligação a antígeno em eliminar antígenos no plasma, onde o método compreende aumento da atividade de liga- ção a receptor FCY sob uma condição de faixa de pH neutro do domínio de ligação a receptor FCY em uma molécula de ligação a antígeno comparado com aquela de um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a receptor Fcy e um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon.
[01423] Na presente invenção, a expressão "método de aumento da habilidade em eliminar antígenos do plasma" tem o mesmo significado que "método de aumento da habilidade de uma molécula de ligação a antígeno de eliminar antígenos do plasma".
[01424] Na presente invenção "habilidade de eliminar antígenos do plasma" se refere à habilidade de eliminar do plasma os antígenos presentes em plasma quando moléculas de ligação a antígeno são administradas in vivo ou moléculas de ligação a antígeno são secreta- das in vivo. Desta maneira, na presente invenção, tudo o que a frase "uma habilidade de uma molécula de ligação a antígeno de eliminar antígenos do plasma aumenta" tem que significar é que quando uma molécula de ligação a antígeno é administrada, a taxa de eliminação de antígeno do plasma é acelerada comparado com antes da redução da atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de íon tal como faixa de pH ácido ou concentração de íon de cálcio baixa comparado com a atividade de ligação a antígeno sob uma faixa de pH neutro ou concentração de íon de cálcio alta em adição a aumento da atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno a um receptor Fcy em uma faixa de pH neutro. Se a habilidade de moléculas de ligação a antígeno em eliminar antí- genos do plasma aumenta pode ser determinada, por exemplo, atra vés da administração de antígenos solúveis e moléculas de ligação a antígeno a um organismo vivo e medição da concentração no plasma dos antígenos solúveis após a administração. Quando a concentração de antígenos solúveis em plasma é diminuída após administração de antígenos solúveis e moléculas de ligação a antígeno através do au-mento da atividade de ligação das moléculas de ligação a antígeno a receptores FCY sob uma condição de faixa de pH neutro, ou através da redução da atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de íon tal como faixa de pH ácido ou concentração de íon de cálcio baixa comparado com a atividade de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de íon tal como uma faixa de pH neutro ou concentração de íon de cálcio alta em adição a aumento da atividade de ligação a receptor Fcy, pode ser determinado que a habilidade de moléculas de ligação a antígeno em eliminar antígenos do plasma é aumentada. Antígenos solúveis podem ser antígenos aos quais moléculas de ligação a antígeno são realmente ligadas (antígenos na forma de um complexo de antíge- no/molécula de ligação a antígeno), ou antígenos aos quais moléculas de ligação a antígeno não são ligadas, e suas concentrações podem ser determinadas como "concentração de molécula de ligação a antí- geno-antígenos ligados em plasma" e "concentração de molécula de ligação a antígeno-antígenos não ligados em plasma", respectivamente (o último tem o mesmo significado que "concentrações de antígeno livre em plasma"). Uma vez que "concentração de antígeno total em plasma" significa a soma das concentrações de molécula de ligação a antígeno-antígenos ligados e molécula de ligação a antígeno- antígenos não ligados, ou "concentração de antígenos livres em plasma" que é a concentração de molécula de ligação a antígeno- antígenos não ligados, concentração de antígeno solúvel pode ser determinada como "concentração de antígeno total em plasma". Vários métodos de medição de "concentração de antígeno total em plasma" ou "concentração de antígeno livre em plasma" são bem conhecidos na técnica conforme descrito abaixo.
Método para aperfeiçoamento da farmacocinética de moléculas de li-gação a antígeno
[01425] A presente invenção provê um método de aperfeiçoamento de farmacocinética de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende contato de uma molécula de ligação a antígeno com uma célula expressando receptor FCY in vivo ou ex vivo, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a receptor Fcy, onde uma atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon, e o domínio de ligação a receptor Fcy tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro comparado com um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[01426] Ainda, a presente invenção provê um método de aperfeiçoamento da farmacocinética de uma molécula de ligação a antígeno, onde o método compreende aumento da atividade de ligação a receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro do domínio de ligação a receptor Fcy em uma molécula de ligação a antígeno comparado com aquela de um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, onde a molécula de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido compreende um domínio de ligação a receptor Fcy e um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon.
[01427] Aqui, "aumento da farmacocinética", "melhora da farmaco- cinética" e "farmacocinética superior" podem ser rapresentadas como "aumento da retenção no plasma (sangue)", "melhora da retenção no plasma (sangue)", "retenção no plasma (sangue) superior" e "retenção no plasma (sangue) prolongada". As expressões são sinônimas.
[01428] Aqui, "melhora da farmacocinética" significa não apenas prolongamento do período até a eliminação do plasma (por exemplo, até a molécula de ligação a antígeno ser degradada intracelularmente ou similar e não poder retornar para o plasma) após administração da molécula de ligação a antígeno a seres humanos, ou animais não seres humanos tais como camundongos, ratos, macacos, coelhos e cachorros, mas também prolongamento da retenção no plasma da molécula de ligação a antígeno em uma forma que permita ligação a antí- geno (por exemplo, em uma forma livre de antígeno da molécula de ligação a antígeno) durante o período de administração até eliminação devido à degradação. IgG nativa pode se ligar a FcRn de animais não seres humanos. Por exemplo, camundongo pode ser preferivelmente usado para ser administrado a fim de confirmar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da invenção uma vez que IgG humana nativa pode se ligar a FcRn de camundongo muito mais forte do que FcRn humano (Int. Immunol. (2001) 13(12): 1551-1559). Como outro exemplo, camundongo em que seus genes FcRn nativos são deficientes e um transgene para gene FcRn humano é carregado para ser expresso (Methods Mol. Biol. 2010; 602: 93-104) pode ser também preferivelmente usado como um sujeito a ser administrado a fim de confirmar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da invenção descrita a seguir. Especificamente, "aperfeiçoamento da farmacociné- tica" também inclui prolongamento do período até eliminação devido à degradação da molécula de ligação a antígeno não ligada a antígenos (a forma livre de antígeno de molécula de ligação a antígeno). A molé- cula de ligação a antígeno no plasma não pode se ligar a um novo an- tígeno se a molécula de ligação a antígeno já estiver ligada a um antí- geno. Assim, quanto mais longo for o período em que a molécula de ligação a antígeno não está ligada a um antígeno, mais longo é o período que esta pode se ligar a um novo antígeno (maior a chance de ligação a outro antígeno). Isto possibilita a redução do período de tempo que um antígeno fica livre da molécula de ligação a antígeno in vivo e o prolongamento do período que um antígeno fica ligado à molécula de ligação a antígeno. A concentração plasmática da forma livre de antígeno de molécula de ligação a antígeno pode ser aumentada e o período que o antígeno fica ligado à molécula de ligação a antígeno pode ser prolongado através da aceleração da eliminação dos antíge- nos do plasma através da administração da molécula de ligação a an- tígeno. Especificamente, "aperfeiçoamento da farmacocinética de molécula de ligação a antígeno" inclui o aperfeiçoamento de um parâmetro farmacocinético da forma livre da molécula de ligação a antígeno (qualquer prolongamento da meia-vida em plasma, prolongamento de tempo de retenção médio em plasma e diminuição de eliminação do plasma), prolongamento do período que o antígeno é ligado à molécula de ligação a antígeno após administração da molécula de ligação a antígeno e se os parâmetros farmacocinéticos são aceleração aperfei-çoada de eliminação de antígeno mediadada por molécula de ligação a antígeno do plasma. O aperfeiçoamento de farmacocinética de molécula de ligação a antígeno pode ser avaliado através da determinação de qualquer um dos parâmetros, meia-vida em plasma, tempo de retenção médio no plasma e eliminação do plasma para a molécula de ligação a antígeno ou forma livre de antígeno da mesma ("Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nan- zando). Por exemplo, a concentração plasmática da molécula de ligação a antígeno ou da sua forma livre de antígeno é determinada após a administração da molécula de ligação a antígeno a camundongos, ratos, macacos, coelhos, cachorros ou seres seres humanos. Então, cada parâmetro é determinado. Quando a meia-vida no plasma ou o tempo médio de retenção no plasma é prolongado, a farmacocinética da molécula de ligação a antígeno pode ser julgada ser aperfeiçoada. Os parâmetros podem ser determinados através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Os parâmetros podem ser apropri-adamente avaliados, por exemplo, através de análise não comparti- mental utilizando o programa de análise farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acordo com o manual de instruções em anexo. A con-centração plasmática de molécula de ligação a antígeno livre de antí- geno pode ser determinada através de métodos conhecidos pelos ver-sados na técnica, por exemplo, utilizando o método de ensaio medido em um método conhecido (Clin Pharmacol. 2008 Abr; 48(4): 406-417.
[01429] Aqui, "aperfeiçoamento da farmacocinética" também inclui prolongamento do período que um antígeno é ligado a uma molécula de ligação a antígeno após administração da molécula de ligação a antígeno. Se o período que um antígeno é ligado à molécula de ligação a antígeno após administração da molécula de ligação a antígeno é prolongado pode ser avaliado através da determinação da concentração no plasma do antígeno livre. O prolongamento pode ser julgado com base na concentração no plasma determinada do antígeno livre ou no período de tempo requerido para um aumento na razão de concentração de antígeno livre para a concentração de antígeno total.
[01430] A concentração no plasma do antígeno livre não ligado à molécula de ligação a antígeno ou a razão de concentração de antíge- no livre para a concentração total pode ser determinada através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, o método medido em em Pharm. Res. 2006 Jan; 23(1): 95-103 pode ser usado. Alternativamente, quando um antígeno mostra uma função par ticular in vivo, pode-se avaliar se o antígeno está ligado a uma molécula de ligação a antígeno que netraliza a função do antígeno (molécula antagonista) pode ser determinada ao testar se a função do antígeno é neutralizada. Pode-se avaliar se a função do antígeno é neutralizada ao testar um marcador in vivo que reflete a função do antígeno. Pode- se avaliar se o antígeno está ligado a uma molécula de ligação a antí- geno que ativa a função do antígeno (molécula agonista) ao testar um marcador in vivo que reflete a função do antígeno.
[01431] Determinação da concentração no plasma de antígeno livre e a razão da quantidade de antígeno livre no plasma para a quantidade de antígeno total em plasma, ensaio de marcador in vivo, e tais medições não são particularmente limitadas; entretanto, os ensaios são executados, de preferência, após um determinado período de tempo ter passado após a administração da molécula de ligação a an- tígeno. Na presente invenção, o período após a administração da molécula de ligação a antígeno não é particularmente limitado; os versados na técnica podem determinar o período adequado dependendo das propriedades e similar da molécula de ligação a antígeno administrada. Tais períodos incluem, por exemplo, um dia após a administração da molécula de ligação a antígeno, três dias após a administração da molécula de ligação a antígeno, sete dias após a administração da molécula de ligação a antígeno, 14 dias após a administração da molécula de ligação a antígeno, e 28 dias após a administração da molécula de ligação a antígeno. Aqui, "concentração de antígeno no plasma" se refere a ou "concentração de antígeno total no plasma" que é a soma de antígeno ligado à molécula de ligação a antígeno e concentração de antígeno não ligado ou "concentração de antígeno livre em plasma" que é a concentração de antígeno não ligado à molécula de ligação a antígeno.
[01432] A concentração de antígeno total no plasma pode ser dimi- nuída através da administração de molécula de ligação a antígeno da presente invenção em 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes ou ainda maior comparado com a administração de uma molécula de ligação a antígeno de referência compreendendo a região Fc de IgG onde uma cadeia de açúcar ligada na posição 267 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar tendo fucose como domínio de ligação ao receptor FCY ou comparado com quando a molécula de domínio de ligação a antígeno da presente invenção compreendendo o domínio de ligação a antígeno não é ad-ministrada.
[01433] A razão de antígeno /molécula de ligação a antígeno molar pode ser calculada conforme mostrado abaixo;
[01434] valor A: Concentração de antígeno molar em cada ponto de tempo
[01435] valor B: Concentração de molécula de ligação a antígeno molar em cada ponto de tempo
[01436] valor C: Concentração de antígeno molar com concentração de molécula de ligação a antígeno molar (razão de antíge- no/molécula de ligação a antígeno molar) em cada ponto de tempo
[01437] C=A/B
[01438] O valor C menor indica eficiência maior de eliminação de antígeno por molécula de ligação a antígeno enquanto valor de C maior indica eficiencia menor de eliminação de antígeno por molécula de ligação a antígeno.
[01439] Razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar pode ser calculada conforme acima descrito.
[01440] A razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar pode ser diminuída através da administração de molécula de ligação a antígeno da presente invenção em 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes ou ainda mais comparado com a administração de uma molécula de ligação a antígeno de referência compreendendo a região Fc de IgG humana do tipo selvagem como um domínio de ligação a receptor FCY humano.
[01441] Na presente invenção, uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 é preferivelmente usada como a IgG humana nativa que é usada como uma IgG humana nativa de referência a ser comparada com as moléculas de ligação a antígeno quanto à sua atividade de ligação a receptor Fcy ou atividade in vivo. Preferivelmente, uma molécula de ligação a antígeno de referência compreendendo o mesmo domínio de ligação a antígeno que a molécula de ligação a antígeno de interesse e uma região Fc de IgG nativa como o domínio de ligação a receptor Fcy pode ser apropriadamente usada. Mais preferivelmente, uma IgG1 nativa é usada como uma IgG humana nativa de referência a ser comparada com as moléculas de ligação a antígeno quanto à sua atividade de ligação a receptor Fcy ou atividade in vivo. Ainda, na presente invenção, como uma molécula de ligação a antígeno a ser comparada com as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno não muda dependendo da concentração de ion, uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a FcRn cuja atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido não foi aumentada, uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a receptor Fcy que não tem atividade de ligação seletiva ao receptores Fcy ou similar pode ser também apropriadamente usada dependendo do propósito.
[01442] Redução de concentração de antígeno total no plasma ou razão de antígeno/anticorpo molar pode ser avaliada conforme descrito nos Exemplos 6, 8 e 13. Mais especificamente, usando a linhagem de camundongo transgênico FcRn humano 32 ou linhagem 276 (Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. 2010; 602: 93-104), elas podem ser avaliadas através ou do modelo de coadministração de an- tígeno-anticorpo ou modelo de infusão de antígeno de estado uniforme quando a molécula de ligação a antígeno não reage cruzado com o antígeno contraparte de camundongo. Quando uma molécula de ligação a antígeno reage cruzada com contraparte de camundongo, elas podem ser avaliadas simplesmente administrando molécula de ligação a antígeno na linhagem de camundongo transgênico FcRn humano 32 ou linhagem 276 (Jackson Laboratories). Em modelo de coadministra- ção mistura de molécula de ligação a antígeno e antígeno é administrada ao camundongo. Em modelo de infusão de antígeno de estado uniforme, bomba de infusão contendo solução de antígeno é implantada no camundongo para obter concentração de antígeno no plasma constante e então molécula de ligação a antígeno é administrada ao camundongo. Molécula de ligação a antígeno de teste é administrada na mesma dosagem. Concentração de antígeno total no plasma, concentração de antígeno livre no plasma e concentração de molécula de ligação a antígeno no plasma são medidas em ponto de tempo apropriado usando método conhecido dos versados na técnica.
[01443] Para avaliação dos efeitos de um domínio de ligação a receptor FCY tendo atividade de ligação seletiva a receptores FCY, quando uma molécula de ligação a antígeno não reage cruzado com um antígeno contraparte de camundongo, concentração de antígeno total em plasma ou diminuição em razão em mol de antígeno/anticorpo pode ser avaliada ou através do modelo de injeção simultânea de antí- geno-anticorpo ou o modelo de injeção de antígeno de estado uniforme usando os camundongos C57BL/6J convencionalmente usados (Charles River, Japão). Quando uma molécula de ligação a antígeno reage cruzado com a contraparte do camundongo, a molécula de ligação a antígeno pode simplesmente ser injetada em camundongos C57BL/6J convencionalmente usados (Charles River, Japão) para rea-lizar a avaliação.
[01444] A concentração de antígeno total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar podem ser medidas em 2, 4, 7, 14, 28, 56 ou 84 dias após administração para avaliar o efeito a longo prazo da presente invenção. Em outras palavras, uma concentração de antígeno no plasma a longo prazo é determinada através da medição da concentração de antígeno total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar em 2, 4, 7, 14, 28, 56 ou 84 dias após administração de uma molécula de ligação a antígeno a fim de avaliar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da presente invenção. Se a redução da concentração de antígeno no plasma ou razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar for obtida através da molécula de ligação a antígeno descrita na presente invenção pode ser determinado através da avaliação da redução em qualquer um ou mais os pontos de tempo descritos acima.
[01445] Concentração de antígeno Total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno molar podem ser medidas em 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12 ou 24 horas após administração para avaliar o efeito a curto prazo da presente invenção. Em outras palavras, uma concentração de antígeno no plasma baixa é determinada através da medição de concentração de antígeno total ou livre no plasma e razão de antígeno/molécula de ligação a antígeno em 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12 ou 24 horas após administração de uma molécula de ligação a antígeno a fim de avaliar a propriedade da molécula de ligação a antígeno da presente invenção.
[01446] A via de administração de uma molécula de ligação a antí- geno da presente invenção pode ser selecionada de injeções intradermal, intravenosa, intravítrea, subcutânea, intraperitoneal, parenteral e intramuscular.
[01447] Na presente invenção, o aperfeiçoamento da farmacocinéti- ca em humano é preferida. Quando a retenção no plasma em humano é difícil de determinar, ela pode ser prevista com base na retenção no plasma de camundongos (por exemplo, camundongos normais, ca-mundongos transgênicos expressando antígeno humano, camundongos transgênicos expressando FcRn humano) ou macacos (por exemplo, macacos cinomólogos).
Método de promoção de dissociação intracelular de um antígeno a partir de uma molécula de ligação a antígeno, onde o antígeno foi ex- tracelularmente ligado à molécula de ligação a antígeno
[01448] A presente invenção provê um método de promoção de dissociação intracelular de um antígeno a partir de uma molécula de ligação a antígeno, onde o antígeno foi extracelularmente ligado à mo-lécula de ligação a antígeno, onde o método compreende contato da molécula de ligação a antígeno com uma célula expressando receptor FCY in vivo ou ex vivo, onde a molécula de ligação a antígeno tem ati-vidade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a receptor Fcy, onde uma atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de ion, e o domínio de ligação a receptor Fcy tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro comparado com um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[01449] A presente invenção provê um método de promoção de dissociação intracelular de um antígeno a partir de uma molécula de ligação a antígeno, onde o antígeno foi extracelularmente ligado à mo-lécula de ligação a antígeno, onde o método compreende aumento da atividade de ligação ao receptor FCY sob uma condição de faixa de pH neutro do domínio de ligação a receptor FCY em uma molécula de ligação a antígeno comparado com aquela de um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a receptor Fcy e um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de ion.
[01450] Na presente invenção, o local onde um antígeno se dissocia de uma molécula de ligação a antígeno pode ser qualquer um contanto que ele seja em uma célula, mas preferivelmente ele esteja em um endossomo inicial. Na presente invenção, "dissociação intracelular de um antígeno a partir de uma molécula de ligação a antígeno, onde o antígeno foi extracelularmente ligado à molécula de ligação a antí- geno" não tem que significar que todos os antígenos absorvidos em células após serem ligados a moléculas de ligação a antígeno são intracelularmente dissociados das moléculas de ligação a antígeno, e a dissociação intracelular de antígenos a partir de moléculas de ligação a antígeno precisa apenas ser maior em razão quando comparado com antes da diminuição da atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de ion tal como uma faixa de pH ácido ou concentração de ion de cálcio baixa do que sob uma condição de concentração de íon tal como faixa de pH neutro ou concentração de íon de cálcio alta e aumento da atividade de ligação a receptor Fcy em uma faixa de pH neutro. Ainda, o método de promoção de dissociação intracelular de um antígeno a partir de uma molécula de ligação a antígeno pode ser referido como um método que aumenta a absorção intracelular de moléculas de ligação a an- tígeno ligadas a antígeno e confere às moléculas de ligação a antíge- no a propriedade de facilidade de promoção de dissociação intracelular de antígenos a partir das moléculas de ligação a antígeno.
Método de promoção de liberação extracelular de uma molécula de ligação a antígeno em uma forma não ligada a antígeno
[01451] A presente invenção provê um método de promoção de liberação extracelular de uma molécula de ligação a antígeno em uma forma não ligada a antígeno, onde o método compreende contato de uma molécula de ligação a antígeno com uma célula expressando receptor FCY in vivo ou ex vivo, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a receptor Fcy, onde uma atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon e o domínio de ligação a receptor Fcy tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro comparado com um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[01452] Ainda, a presente invenção provê um método de promoção de liberação extracelular de uma molécula de ligação a antígeno em uma forma não ligada a antígeno, onde a molécula de ligação a antí- geno foi absorvida em uma célula em uma forma ligada a antígeno, onde o método compreende aumento da atividade de ligação a receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro do domínio de ligação a receptor Fcy na molécula de ligação a antígeno comparado com aquela de um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a receptor FCY e um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon.
[01453] Na presente invenção, a frase "liberação extracelular de uma molécula de ligação a antígeno em uma forma não ligada a antí- geno, onde a molécula de ligação a antígeno foi absorvida em uma célula em uma forma ligada a antígeno" não tem que significar que todas as moléculas de ligação a antígeno que foram absorvidas em uma célula em uma forma ligada a antígeno são extracelularmente liberadas em uma forma não ligada a antígeno, e a razão de moléculas de ligação a antígeno extracelularmente liberadas em uma forma não ligada a antígeno apenas precisa ser maior quando comparado com antes da diminuição da atividade de ligação a antígeno das moléculas de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de ion tal como uma faixa de pH ácido ou concentração de íon de cálcio baixa do que sob uma condição de concentração de íon tal como uma faixa de pH neutro ou concentração de ion de cálcio alta e aumento da atividade de ligação a receptor Fcy em uma faixa de pH neutro. As moléculas de ligação a antígeno extracelularmente liberadas preferivelmente mantêm atividade de ligação a antígeno. Ainda, o método de promoção de liberação extracelular de uma molécula de ligação a antíge- no em uma forma não ligada a antígeno, onde a molécula de ligação a antígeno foi absorvida em uma célula em uma forma ligada a antígeno pode ser referida como um método que aumenta a absorção de moléculas de ligação a antígeno ligadas a antígeno em células e confere às moléculas de ligação a antígeno a propriedade de facilidade de promoção de liberação extracelular de uma molécula de ligação a antíge- no em uma forma não ligada a antígeno.
Método de diminuição da concentração de antígeno total ou concentração de antígeno livre em plasma ou um método de alteração de uma molécula de ligação a antígeno que pode diminuir a concentração de antígeno total ou concentração de antígeno livre em plasma
[01454] A presente invenção provê um método de diminuição da concentração de antígeno total ou concentração de antígeno livre em plasma, onde o método compreende contato da molécula de ligação a antígeno com uma célula expressando receptor FCY in vivo ou ex vivo, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a receptor Fcy, onde uma atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de ion e o domínio de ligação a receptor Fcy tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro comparado com um domínio de ligação a receptor Fcy ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[01455] Ainda, a presente invenção provê métodos de alteração de uma molécula de ligação a antígeno que pode diminuir a concentração de antígeno total ou a concentração de antígeno livre em plasma, onde o método compreende aumento da atividade de ligação a receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro do domínio de ligação a receptor Fcy na molécula de ligação a antígeno comparado com aquela de um domínio de ligação a receptor Fcy ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, onde a molécula de ligação a antígeno tem atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido e compreende um domínio de ligação a receptor Fcy e um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de ion.
[01456] O método de avaliação da diminuição de concentração de antígeno total ou concentração de antígeno livre em plasma é descrito na seção mencionada acima sobre o método de aperfeiçoamento da farmacocinética de moléculas de ligação a antígeno.
Método ex vivo de eliminação dos antígenos do plasma
[01457] Um exemplo de uma modalidade não limitante do uso de uma molécula de ligação a antígeno para o método de eliminação dos antígenos de plasma, que é provido pela presente invenção, inclui uso da molécula de ligação a antígeno para um chamado método ex vivo de eliminação de antígenos de plasma, o qual compreende contato da molécula de ligação a antígeno da presente invenção com plasma isolado de indivíduos que permite a formação de imunocomplexos, e deixar que os imunocomplexos contatem células expressando receptores FCY e FcRn. A taxa de eliminação de antígenos do plasma pode ser promovida através da substituição/combinação de um método de administração de moléculas de ligação a antígeno in vivo com um chamado método ex vivo onde plasma contendo moléculas de ligação a antígeno e antígenos que se ligam às moléculas de ligação a antígeno é temporariamente retirado do organismo vivo, e então contatado com células expressando receptores Fcy e FcRn, e plasma contendo moléculas de ligação a antígeno extracelularmente recicladas (ou também referidas como ressecretadas ou recirculada) sem antígeno ligado após um certo período de tempo é retornado para o organismo vivo.
[01458] Ainda, um exemplo de uma modalidade não limitante do uso de uma molécula de ligação a antígeno para o método de eliminação do antígeno a partir do plasma, que é provido pela presente invenção, inclui uso da molécula de ligação a antígeno para um então chamado método ex vivo de eliminação dos antígenos do plasma, o qual compreende contato de imunocomplexos presentes em plasma isolado de indivíduos que foram administrados com as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção com células expressando FcRn e re- ceptores FCY.
[01459] Se ou não os antígenos são eliminados de plasma pode ser confirmado, por exemplo, através da avaliação de se ou não a taxa de eliminação de antígenos do plasma mencionada acima é promovida quando, ao invés da molécula de ligação a antígeno da presente in-venção, uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno onde a atividade de ligação a antígeno não muda dependendo da concentração de ion, uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a FcRn cuja atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido não foi aumentada, ou uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a receptor Fcy que não tem atividade de ligação seletiva a receptores Fcy é usada como um controle para comparação.
Método para produção de moléculas de ligação a antígeno
[01460] A presente invenção também provê um método de produção de uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno e um domínio de ligação a receptor Fcy e atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido, onde a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno muda dependendo da condição de concentração de ion e o domínio de ligação a receptor Fcy tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro do que um domínio de ligação a receptor Fcy ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
[01461] Especificamente, a presente invenção provê um método de produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (f) que seguem:
[01462] determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de ion de cálcio alta;
[01463] determinação da atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno sob uma condição de concentração de ion de cálcio baixa;
[01464] seleção de um domínio de ligação a antígeno para o qual a atividade de ligação a antígeno determinada em (a) é maior do que a atividade de ligação a antígeno determinada em (b);
[01465] ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo codificadn um domínio de ligação a receptor FCY tendo uma atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido, o qual tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro do que um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose;
[01466] cultura de células introduzidas com um vetor ao qual o poli- nucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e
[01467] coleta das moléculas de ligação a antígeno a partir da cultura de célula de (e).
[01468] A presente invenção também provê um método de produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (f) que seguem:
[01469] determinação da atividade de ligação a antígeno de um anticorpo sob uma condição de concentração de ion de cálcio alta;
[01470] determinação da atividade de ligação a antígeno do anticorpo sob uma condição de concentração de ion de cálcio baixa;
[01471] seleção de um anticorpo para o qual a atividade de ligação a antígeno determinada em (a) é maior do que a atividade de ligação a antígeno determinada em (b);
[01472] ligação de um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a antígeno do anticorpo selecioando em (c) a um polinucleotí- deo codificando um domínio de ligação a receptor FCY tendo atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido e tendo atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro do que um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose;
[01473] cultura de células introduzidas com um vetor ao qual o poli- nucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e
[01474] coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir da cultura de célula de (e).
[01475] Ainda, a presente invenção provê um método de produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (f) que seguem:
[01476] determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH neutro;
[01477] determinação da atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno sob uma condição de faixa de pH ácido;
[01478] seleção do domínio de ligação a antígeno para o qual a atividade de ligação a antígeno determinada em (a) é maior do que a atividade de ligação a antígeno determinada em (b);
[01479] ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a receptor Fcy tendo uma atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido, o qual tem atividade de ligação maior ao receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro do que um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose;
[01480] cultura de células introduzidas com um vetor ao qual o poli- nucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e
[01481] coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir da cultura de célula de (e).
[01482] Ainda, a presente invenção provê um método de produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (f) que seguem:
[01483] determinação de uma atividade de ligação a antígeno de um anticorpo sob uma condição de faixa de pH neutro;
[01484] determinação de uma atividade de ligação a antígeno do anticorpo sob uma condição de faixa de pH ácido;
[01485] seleção do anticorpo para o qual a atividade de ligação a antígeno determinada em (a) é maior do que a atividade de ligação a antígeno determinada em (b);
[01486] ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno do anticorpo selecionado em (c) a um polinucleotí- deo codificando um domínio de ligação a receptor FCY tendo atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido e tendo atividade de ligação maior a receptor Fcy sob uma condição de faixa de pH neutro do que um domínio de ligação a receptor Fcy nativo ao qual a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose;
[01487] cultura de células introduzidas com um vetor ao qual o poli- nucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e
[01488] coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir da cultura de (e).
[01489] Os termos "célula", "linhagem de célula" e "cultura de célula" são usados sinonimamente aqui, e tais designações podem incluir toda a progênie de uma célula ou linhagem de célula. Desta maneira, por exemplo, os termos "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula primária do indivíduo e culturas derivadas das mesmas sem importar o número de transferências. É também compreendido que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica em teor de DNA devido a mutações deliberadas e inadvertidas. Progênie de mutante que tem substancialmente a mesma função ou atividade biológica conforme avaliado na célula originalmente transformada pode também ser incluída. Onde designações distintas forem pretendidas, tal intenção será clara a partir do contexto da descrição.
[01490] Quando se referindo à expressão de uma sequência de co-dificação, o termo "sequências controle" se refere a sequências de nu- cleotídeo de DNA que são necessárias para a expressão de uma se-quência de codificação operavelmente ligada em um organismo hos-pedeiro particular. As sequências controle que são adequadas para procariontes incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, um sítio de ligação a ribossomo e, possivelmente, outras sequências ainda pobremente compreendidas. Células eu- carióticas são conhecidas utilizar promotores, sinais de poliadenilação e aumentadores para a expressão de uma sequência de codificação.
[01491] Para um ácido nucleico, o termo "operavelmente ligado" significa que o ácido nucleico é posto em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma pré- sequência ou líder secretora é operavelmente ligado a DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma proteína precursora que participa na secreção do polipeptídeo. Um promotor ou aumentador é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência. Um sítio de ligação de ribossomo é opera- velmente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de maneira a facilitar tradução. Em geral, "operavelmente ligado" significa que as sequências de DNA sendo ligadas são contíguas e, no caso de uma líder secretora, contíguas e estando na estrutura de leitura. No entanto, aumentadores não têm que ser contíguos. Ligação é realizada através de ligação em sítios de restrição adequados. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotí- deo sintéticos são usados de acordo com prática convencional. Ainda, ácidos nucleicos ligados podem ser produzidos através da técnica de PCR de extensão de sobreposição mencionada acima.
[01492] "Ligação" se refere ao processo de formação de ligações fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico. Para ligação dos dois fragmentos, as extremidades dos fragmentos devem ser compatí-veis umas com as outras. Em alguns casos, as extremidades serão diretamente compatíveis após digestão com endonuclease. No entanto, pode ser necessário primeiro converter as extremidades coesas geralmente produzidas após digestão com endonuclease em extremi-dades cegas que as tornam compatíveis para ligação. Para cegar as extremidades, o DNA é tratado em um tampão adequado por pelo menos 15 minutos a 15° C com cerca de 10 unidades do fragmento Kle- now de polimerase de DNA I ou polimerase de DNA T4 na presença de quatro trifosfatos de desoxirribonucleotídeo. O DNA é então purificado através de extração de fenol-clorofórmio e precipitação de etanol ou através de purificação de sílica. Os fragmentos de DNA que devem ser ligados são postos em solução em quantidades equimolares. A solução conterá ATP, tampão de ligase e uma ligase tal como uma ligase de DNA T4 e cerca de 10 unidades por 0,5 μg de DNA. Se o DNA tiver que ser ligado a um vetor, o vetor é primeiro linearizado através de digestão com endonucleases de restrição apropriadas. O fragmento linearizado é então tratado com fosfatase alcalina bacteriana ou fosfa- tase intestinal de bezerro para prevenir autoligação do fragmento durante a etapa de ligação.
[01493] Nos métodos de produção da presente invenção, domínios ou anticorpos de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a antí- geno maior sob uma condição de concentração de íon de cálcio alta do que sob uma condição de concentração de íon de cálcio baixa, que foram selecionados através do método descrito na seção mencionada acima sobre "condições de concentração de íon" são isolados. Ainda, domínios ou anticorpos de ligação a antígeno tendo atividade de ligação a antígeno maior em uma condição de faixa de pH neutro do que em uma condição de faixa de pH ácido, que foram selecionados através do método descrito na seção mencionada acima sobre "condições de concentração de ion" são isolados. Por exemplo, quando domínios de ligação a antígeno isolados desta maneira são selecionados de uma biblioteca, conforme descrito mais tarde nos Exemplo, polinucleo- tídeos codificando os domínios de ligação a antígeno são isolados através de amplificação de gene convencional de vírus tais como fa- gos. Alternativamente, quando domínios ou anticorpos de ligação a antígeno isolados desta maneira são aqueles selecionados de culturas de células tais como hibridomas, conforme indicado na seção mencionada acima sobre anticorpos, genes de anticorpo e similar são isolados através de amplificação de gene convencional a partir dessas células.
[01494] Em seguida, um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a antígeno isolado conforme descrito acima é ligado em estrutura a um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a receptor FCY tendo atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido, e tem atividade de ligação maior ao receptor FCY em uma condição de faixa de pH neutro do que um domínio de ligação a receptor Fcy nativo onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose. Exemplo adequado do domínio de ligação a receptor Fcy inclui uma região Fc de anticorpo conforme descrito na seção mencionada acima sobre ligação a recep- tor FCY. Ainda, exemplos do receptor FCY incluem FcYRIa, FcyRIIa(R), FcyRIIa(H), FcyRIIb, FcyRIIIa(V) ou FcyRIIIa(F).
[01495] Exemplos adequados da região Fc de anticorpo incluem regiões Fc tendo pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU, que são diferentes dos ami- noácidos em sítios correspondentes na região Fc nativa. Um exemplo adequado da região Fc nativa é uma região Fc de qualquer um de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
[01496] Em uma modalidade não limitante, um exemplo adequado da região Fc de anticorpo é uma região Fc compreendendo pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:
[01497] ou Lys ou Tyr na posição de aminoácido 221;
[01498] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá- cido 222;
[01499] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Lys na posição de aminoá- cido 223;
[01500] qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá- cido 224;
[01501] qualquer um de Glu, Lys e Trp na posição de aminoácido 225;
[01502] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá- cido 227;
[01503] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá- cido 228;
[01504] qualquer um de Ala, Glu, Gly e Tyr na posição de aminoá- cido 230;
[01505] qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami- noácido 231;
[01506] qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoá- cido 232;
[01507] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 233;
[01508] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 234;
[01509] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 235;
[01510] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 236;
[01511] qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 237;
[01512] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 238;
[01513] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 239;
[01514] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 240;
[01515] qualquer um de Asp, Glu, Leu, Arg, Trp e Tyr na posição de aminoácido 241;
[01516] qualquer um de Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp e Tyr na posição de aminoácido 243;
[01517] His na posição de aminoácido 244;
[01518] Ala na posição de aminoácido 245;
[01519] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 246;
[01520] qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 247;
[01521] qualquer um de Glu, His, Gln e Tyr na posição de aminoá- cido 249;
[01522] ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 250;
[01523] Phe na posição de aminoácido 251;
[01524] qualquer um de Phe, Met e Tyr na posição de aminoácido 254;
[01525] qualquer um de Glu, Leu e Tyr na posição de aminoácido 255;
[01526] qualquer um de Ala, Met e Pro na posição de aminoácido 256;
[01527] qualquer um de Asp, Glu, His, Ser e Tyr na posição de ami- noácido 258;
[01528] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 260;
[01529] qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile e Thr na posição de ami- noácido 262;
[01530] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 263;
[01531] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 264;
[01532] qualquer um de Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp e Tyr na posição de aminoá- cido 265;
[01533] qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 266;
[01534] qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 267;
[01535] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 268;
[01536] qualquer um e Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 269;
[01537] qualquer um de Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 270;
[01538] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 271;
[01539] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 272;
[01540] ou Phe ou Ile na posição de aminoácido 273;
[01541] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 274;
[01542] ou Leu ou Trp na posição de aminoácido 275;
[01543] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 276;
[01544] qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 278;
[01545] Ala na posição de aminoácido 279;
[01546] qualquer um de Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 280;
[01547] qualquer um de Asp, Lys, Pro e Tyr na posição de aminoá- cido 281;
[01548] qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami- noácido 282;
[01549] qualquer um de Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg e Tyr na posição de aminoácido 283;
[01550] qualquer um de Asp, Glu, Leu, Asn, Thr e Tyr na posição de aminoácido 284;
[01551] qualquer um de Asp, Glu, Lys, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 285;
[01552] qualquer um de Glu, Gly, Pro e Tyr na posição de aminoá- cido 286;
[01553] qualquer um de Asn, Asp, Glu e Tyr na posição de aminoá- cido 288;
[01554] qualquer um de Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 290;
[01555] qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln e Thr na posição de aminoácido 291;
[01556] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Pro, Thr e Tyr na posição de aminoácido 292;
[01557] qualquer um de Phe, Gly, His, Ile Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 293;
[01558] qualquer um de Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 294;
[01559] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 295;
[01560] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr e Val na posição de aminoácido 296;
[01561] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 297;
[01562] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 298;
[01563] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 299;
[01564] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 300;
[01565] qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 301;
[01566] Ile na posição de aminoácido 302;
[01567] qualquer um de Asp, Gly e Tyr na posição de aminoácido 303;
[01568] qualquer um de Asp, His, Leu, Asn e Thr na posição de aminoácido 304;
[01569] qualquer um de Glu, Ile, Thr e Tyr na posição de aminoáci- do 305;
[01570] qualquer um de Ala, Asp, Asn, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 311;
[01571] Phe na posição de aminoácido 313;
[01572] Leu na posição de aminoácido 315;
[01573] ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 317;
[01574] qualquer um de His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 318;
[01575] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 320;
[01576] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 322;
[01577] Ile na posição de aminoácido 323;
[01578] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 324;
[01579] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 325;
[01580] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 326;
[01581] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 327;
[01582] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 328;
[01583] qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 329;
[01584] qualquer um de Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 330;
[01585] qualquer um de Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 331;
[01586] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 332;
[01587] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 333;
[01588] qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro e Thr na posição de aminoácido 334;
[01589] qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 335;
[01590] qualquer um de Glu, Lys e Tyr na posição de aminoácido 336;
[01591] qualquer um de Glu, His e Asn na posição de aminoácido 337;
[01592] qualquer um de Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser e Thr na posição de aminoácido 339;
[01593] ou Ala ou Val na posição de aminoácido 376;
[01594] ou Gly ou Lys na posição de aminoácido 377;
[01595] Asp na posição de aminoácido 378;
[01596] Asn na posição de aminoácido 379;
[01597] qualquer um de Ala, Asn e Ser na posição de aminoácido 380;
[01598] ou Ala ou Ile na posição de aminoácido 382;
[01599] Glu na posição de aminoácido 385;
[01600] Thr na posição de aminoácido 392;
[01601] Leu na posição de aminoácido 396;
[01602] Lys na posição de aminoácido 421;
[01603] Asn na posição de aminoácido 427;
[01604] ou Phe ou Leu na posição de aminoácido 428;
[01605] Met na posição de aminoácido 429;
[01606] Trp na posição de aminoácido 434;
[01607] Ile na posição de aminoácido 436; e
[01608] qualquer um de Gly, His, Ile, Leu e Tyr na posição de aminoácido 440;
[01609] no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU.
[01610] Ainda, para regiões Fc da presente invenção, regiões Fc que têm atividade de ligação ou atividade de ligação aumentada a FcRn em uma condição de faixa de pH ácido podem ser adequadamente usadas. Exemplos de tais regiões Fc incluem regiões Fc de imunoglobulinas do tipo IgG tais como regiões Fc de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e suas variantes). Para variantes tendo alterações em outros aminoácidos, regiões Fc com alterações de aminoá- cido em qualquer posição podem ser usadas contanto que haja atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH ácido ou a atividade de ligação a FcRn humano em uma condição de faixa de pH ácido possa ser aumentada, e quando uma molécula de ligação a antígeno inclui uma região Fc de uma IgG1 humana como a região Fc, ela inclui pre- ferivelmente uma alteração que aumenta a ligação a FcRn em uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc do material de partida de IgG1 humana. Exemplos adequados de aminoácidos que podem ser alterados incluem os aminoá- cidos nas posições 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 e/ou 447 (numeração EU) conforme descrito no WO2000/042072. Similarmente, exemplos adequados de aminoácidos que podem ser alterados também incluem os aminoácidos nas posições 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 e/ou 436 (numeração EU) conforme descrito no WO2002/060919. Ainda, exemplos de aminoácidos que podem ser alterados também incluem os aminoáci- dos nas posições 250, 314 e 428 (numeração EU) conforme descrito no WO2004/092219. Outros exemplos adequados de aminoácidos que podem ser alterados também incluem os aminoácidos nas posições 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 e/ou 436 (numeração EU) conforme descrito no WO2010/045193. Regiões Fc produzidas através do aumento de ligação a FcRn em uma faixa de pH ácido de uma região Fc de imunoglobulina através de alterações de aminoácido podem ser usadas nos métodos de produção da presente invenção.
[01611] Ainda, conforme descrito posteriormente, para a região Fc incluída em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção, uma região Fc tendo atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro pode também ser adequadamente usada. Tal região Fc pode ser obtida através de qualquer método de acordo com o método mencionado acima para obtenção de regiões Fc tendo atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH ácido. Especificamente, uma região Fc contendo um domínio de ligação a FcRn tendo atividade de ligação ou tendo atividade de ligação aumentada a FcRn em uma faixa de pH neutro devido à alteração de aminoácidos da região Fc de uma imuno- globulina IgG humana usada como a região Fc de material de partida pode ser obtida. Regiões Fc favoráveis de imunoglobulinas IgG para a alteração incluem regiões Fc de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e suas variantes). Para variantes tendo alterações em outros aminoá- cidos, regiões Fc com alterações de aminoácido em qualquer posição podem ser usadas contanto que haja atividade de ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro ou a atividade de lgiacao a FcRn humano em uma faixa de pH neutro possa ser aumentada. Quando uma molécula de ligação a antígeno inclui uma região Fc de uma IgG1 humana como a região Fc, ela inclui preferivelmente uma alteração que aumenta a ligação a FcRn em uma faixa de pH neutro comparado com a atividade de ligação de região Fc de material de partida de IgG1 humana. Exemplos adequados de tais regiões Fc alteradas incluem regiões Fc humanas tendo pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos nas posições 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 no sítio da região Fc do material de partida de acordo com numeração EU, que são diferentes dos aminoácidos correspondentes na região Fc nativa.
[01612] Exemplos adequados de tais regiões Fc alteradas incluem regiões Fc compreendendo pelo menos um aminoácido selecionado do grupo consistindo em:
[01613] Met na posição de aminoácido 237;
[01614] Ala na posição de aminoácido 238;
[01615] Lys na posição de aminoácido 239;
[01616] Ile na posição de aminoácido 248;
[01617] qualquer um de Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 250;
[01618] qualquer um de Phe, Trp e Tyr na posição de aminoácido 252;
[01619] Thr na posição de aminoácido 254;
[01620] Glu na posição de aminoácido 255;
[01621] qualquer um de Asp, Glu e Gln na posição de aminoácido 256;
[01622] qualquer um de Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr e Val na posição de aminoácido 257;
[01623] His na posição de aminoácido 258;
[01624] Ala na posição de aminoácido 265;
[01625] Phe na posição de aminoácido 270;
[01626] ou Ala ou Glu na posição de aminoácido 286;
[01627] His na posição de aminoácido 289;
[01628] Ala na posição de aminoácido 297;
[01629] Gly na posição de aminoácido 298;
[01630] Ala na posição de aminoácido 303;
[01631] Ala na posição de aminoácido 305;
[01632] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 307;
[01633] qualquer um de Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln e Thr na posição de aminoácido 308;
[01634] qualquer um de Ala, Asp, Glu, Pro e Arg na posição de aminoácido 309;
[01635] qualquer um de Ala, His e Ile na posição de aminoácido 311;
[01636] ou Ala ou His na posição de aminoácido 312;
[01637] ou Lys ou Arg na posição de aminoácido 314;
[01638] ou Ala ou His na posição de aminoácido 315;
[01639] Ala na posição de aminoácido 317;
[01640] Gly na posição de aminoácido 325;
[01641] Val na posição de aminoácido 332;
[01642] Leu na posição de aminoácido 334;
[01643] His na posição de aminoácido 360;
[01644] Ala na posição de aminoácido 376;
[01645] Ala na posição de aminoácido 380;
[01646] Ala na posição de aminoácido 382;
[01647] Ala na posição de aminoácido 384;
[01648] ou Asp ou His na posição de aminoácido 385;
[01649] Pro na posição de aminoácido 386;
[01650] Glu na posição de aminoácido 387;
[01651] ou Ala ou Ser na posição de aminoácido 389;
[01652] Ala na posição de aminoácido 424;
[01653] qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 428;
[01654] Lys na posição de aminoácido 433;
[01655] qualquer um de Ala, Phe, His, Ser, Trp e Tyr na posição de aminoácido 434; e
[01656] His na posição de aminoácido 436;
[01657] na região Fc de acordo com a numeração EU.
[01658] Por exemplo, ao usar essas alterações de aminoácido indi-vidualmente ou usando mais de uma delas em combinação, ligação a FcRn de uma região Fc de IgG em uma faixa de pH ácido e/ou neutro pode ser aumentada, e as alterações de aminoácido que são introduzidas não são particularmente limitadas, e contanto que a retentividade no plasma seja aperfeiçoada, qualquer alteração de aminoácido pode ser introduzida.
[01659] Uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção é isolada da cultura de células transformadas através de um vetor de expressão desejado carregando um polinucleotídeo operavelmente ligado obtido através de ligação, conforme descrito acima, de um poli- nucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno a um polinu- cleotídeo codificando um domínio de ligação a receptor FCY tendo ati-vidade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido e tendo atividade de ligação maior ao receptor Fcy em uma condição de faixa de pH neutro do que um domínio de ligação a receptor Fcy nativo onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúar contendo fucose. Moléculas de ligação a antígeno da presente invenção são produzidas usando um método de acordo com o método para produção de anticorpos descritos na secao mencionada acima sobre anticorpos.
[01660] Todos os documentos da técnica anterior mencionados no relatório são incorporados aqui a título de referência.
[01661] Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com referência aos Exemplos, mas não deve ser considerada como sendo limitada aos mesmos.
Exemplos
[01662] Exemplo 1 Preparação de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR de camundongo sob uma condição de faixa de pH neutro é maior do que a atividade de ligação de região Fc de IgG humana nativa
Anticorpos de ligação a receptor de IL-6 humano dependente do pH
[01663] H54/L28-IgG que compreende H54-IgG1 (SEQ ID NO: 36) e L28CK (SEQ ID NO: 37) descritos no WO2009/125825 é um anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado. Entretanto, Fv4-IgG1 que compreende VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 38) e VL3-CK (SEQ ID NO: 39) é um anticorpo anti-receptor de IL-6 humanizado resultante da conferência, a H54/L28-IgG1, da propriedade de ligação a receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente do pH (que se liga a pH 7,4 e se dissocia em pH 5,8). O teste de camundongo in vivo descrito no WO2009/125825 demonstrou que, no grupo administrado com a mistu- ra de Fv4-IgG1 e receptor de IL-6 humano solúvel como o antígeno, a eliminação de receptor de IL-6 humano solúvel do plasma foi signifi- cantemente acelerada comparado com o grupo administrado com uma mistura de H54/L28-IgG1 e receptor de IL-6 humano solúvel como o antígeno.
[01664] O receptor de IL-6 humano solúvel ligado a H54/L28-IgG1, que é um anticorpo que se liga a um receptor de IL-6 humano solúvel, é, junto com o anticorpo, reciclado para o plasma através de FcRn. Entretanto, Fv4-IgG1, que é um anticorpo que se liga a um receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente do pH, se dissocia de receptor de IL-6 humano solúvel sob a condição ácida no endos- somo. O receptor de IL-6 humano solúvel dissociado é degradado nos lisossomos, desta maneira isso permite aceleração considerável da eliminação de receptor de IL-6 humano solúvel. Ainda, após ligação a FcRn no endossomo, Fv4-IgG1, que é um anticorpo que se liga a um receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente do pH, é reciclado para o plasma. Uma vez que o anticorpo reciclado pode se ligar a receptor de IL-6 humano solúvel novamente, o anticorpo se liga repetidamente ao antígeno (receptor de IL-6 humano solúvel) e é reciclado por FcRn para o plasma. É pensado que, como resultado, uma molécula de anticorpo única pode se ligar repetidamente várias vezes a receptor de IL-6 humano solúvel (WO 2009/125825).
Preparação de anticorpo anti-receptor de IL-6 humano com ligação a FCYR de camundongo aumentada e anticorpo anti-receptor de IL-6 humano sem ligação a FCYR de camundongo
[01665] VH3-IgG1-F1022 (SEQ ID NO: 40), uma molécula de liga ção a antígeno com ligação a FcyR de camundongo aumentada, foi preparada substituindo Lys por Asp na posição 326 (numeração EU) e Leu por Tyr na posição 328 (numeração EU) em VH3-IgG1. Fv4-IgG1- F1022 contendo VH3-IgG1-F1022 como a cadeia pesada e VL3-CK como a cadeia leve foi produzida usando o método descrito no Exemplo de Referência 2.
[01666] Entretanto, VH3-IgG1-F760 (SEQ ID NO: 41), uma molécula de ligação a antígeno sem ligação a FCYR de camundongo, foi preparado substituindo Leu por Arg na posição 235 e Ser por Lys na posição 239 (numeração EU) em VH3-IgG1. Fv4-IgG1-F760 contendo VH3-IgG1-F760 como a cadeia pesada e VL3-CK como a cadeia leve foi produzido usando o método descrito no Exemplo de Referência 2.
Avaliação de atividade de ligação a FCYR de camundongo
[01667] VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F1022 e VH3/L(WT)- IgG1-F760, que contêm VH3-IgG1, VH3-IgG1-F1022 e VH3-IgG1- F760 como a cadeia pesada, e L(WT)-CK (SEQ ID NO: 42) como a cadeia leve, foram produzidos usando o método descrito no Exemplo de Referência 2. Esses anticorpos foram cineticamente analisados quanto à sua ligação a FcyR de camundongo conforme descrito abaixo.
Análise cinética de ligação a FCYR de camundongo
[01668] A ligação de anticorpos a FcyRI, FcyRIIb, FcyRIII e FcyRIV (daqui em diante referidos como FcyRs de camundongo) (preparados através do Exemplo de Referência 26) foi cineticamente analisada usando Biacore T100 e T200 (GE Healthcare). Uma quantidade apro-priada de proteína L (ACTIGEN) foi imobilizada em um Sensor chip CM4 (GE Healthcare) através de um método de acoplamento de amino, e anticorpos de interesse foram capturados nele. Então, soluções diluídas de FcyRs de camundongo e um tampão de atividade como um blank foram injetados, e os FcyRs de camundongo foram deixados interagir com anticorpos capturados no sensor chip. O tampão de atividade usado era ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, Tween20 0,05% (p/v), pH 7,4. Este tampão foi também usado para diluir os FcyRs de camundongo. O sensor chip foi regenerado usando 10 mmol/l de glici- na-HCl, pH 1,5. Todas as medições foram realizadas a 25° C. A cons-tante de taxa de ligação ka (l/Ms) e constante de taxa de dissociação kd (l/s), que são parâmetros cinéticos, foram calculados a partir dos sensorgramas obtidos pela medição. KD (M) de cada anticorpo para FCYR humano foi calculada com base nos valores. Cada parâmetro foi calculado usando Biacore T100 ou T200 Evaluation Software (GE Healthcare).
[01669] O resultado mostrado na Tabela 7 foi obtido através da me- dicao. VH3/L (WT)-IgG1-F1022 foi demonstrado ter atividade de ligação aumentada com mFcYRI, mFcYRIIb e mFcYRIII comparado com VH3/L (WT)-IgG1. Com relação a VH3/L (WT)-IgG1-F760, a ligação as vários FCYRS de camundongo foi não detectável, demonstrando que VH3/L (WT)-IgG1-F760 não tem a atividade de ligação aos vários FCYRS de camundongo.
[01670] Tabela 7
Figure img0015
Preparação de anticorpos com teor de fucose baixo
[01671] Métodos conhecidos para aumento da atividade de ligação a FcyR de anticorpos incluem métodos para fabricação de cadeias de açúcar ligadas a um anticorpo que são cadeias de açúcar com baixo teor de fucose (J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473) em adição a métodos para introdução de uma alteração de aminoácido na região Fc de um anticorpo. Um Fv4-IgG1 com baixo teor de fucose (daqui em diante abreviado como Fv4-IgG1-Fuc) foi produzido através da expressão de Fv4-IgG1 usando células CHO deficientes em gene transportador de fucose (WO2006067913) como células hospedeiro de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 4. Foi relatado que, dos FCYRS (receptores FCY de camundongo), anticorpos com teor de fucose baixo têm atividade de ligação a FCYRIV seletivamente aumentada (Science, 2005, 310 (5753) 1510-1512).
Exemplo 2 Efeito de eliminação de antígenos do plasma por mo-léculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FCYR é maior do que a atividade de ligação a região Fc de IgG humana nativa (2-1) Efeito de H54/L28-IgG1 e Fv4-IgG1 para eliminar antígenos de plasma
[01672] H54/L28-IgG1, que é um anticorpo anti-receptor de IL-6 humano, e Fv4-IgG1 tendo a propriedade de ligação a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH foram produzidos através do método descrito no Exemplo de Referência 1. Testes de infusão in vivo foram realizados usando os H54/L28-IgG1 e Fv4-IgG1 produzidos através do método descrito abaixo.
(2-1-1) Testes de infusão in vivo usando camundongos transgênicos com FcRn humano
[01673] Um modelo animal onde a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel é mantida constante em plasma foi criado através de implante de uma bomba de infusão (MINI-OSMOTIC PUMP MO- DEL2004, alzet) contendo o receptor de IL-6 humano solúvel sob a pele das costas de camundongos transgênicos FcRn humanos (B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). A dinâmica in vivo após administração de um anticorpo anti-receptor de IL-6 humano foi avaliada no modelo animal. Para suprimir a produção de anticorpos de neutralização contra receptor de IL-6 humano solúvel, um anticorpo monoclonal CD4 anticamundongo (preparado através de um método conhecido) foi administrado uma vez a 20 mg/kg na veia caudal. Então, uma bomba de infusão contendo 92,8 μg/ml de receptor de IL-6 humano solúvel foi subcutaneamente implantada nas costas dos camundongos. Três dias após implante da bomba de infusão, um anticorpo anti-receptor de IL-6 humano foi administrado uma vez a 1 mg/kg na veia caudal. O sangue foi coletado de camundongos 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, quatro dias e sete dias após administração do anticorpo antirrecep- tor de IL-6 humano. Imediatamente, o sangue coletado foi centrifugado a 15.000 rpm e 4° C por 15 minutos para preparar plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador ajustado a -20° C ou abaixo até uso.
(2-1-2) Determinação da concentração do receptor de IL-6 humano (hsIL-6R) em plasma através de um método eletroquimioluminescente
[01674] As concentrações de receptor de IL-6 humano em plasma de camundongo foram determinadas através de um método eletroqui- mioluminescente. Amostras de curva padrão de hsIL-6R preparadas em 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 pg/ml e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídas 50 vezes ou mais foram misturadas com Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody (R&D), Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody (R&D), Tocilizumabe, que tinha sido rutenado com SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery). As misturas foram incubadas a 37° C de um dia para o outro. Tocilizuma- be foi preparado em uma concentração final de 333 μg/ml. Então, as misturas de reação foram separadas em alíquotas em uma MA400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). A solução reagida em temperatura ambiente por uma hora foi lavada, e então Read Buffer T (x4) (Meso Scale Discovery) foi separado em alíquotas. Imediatamente em seguida, a medicao foi realizada usando SECTOR PR 400 Reader (Meso Scale Discovery). A concentração de receptor de IL-6 humano foi determinada com base na resposta da curva padrão usando software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices).
[01675] Um curso de tempo da concentração de receptor de IL-6 humano monitorada é mostrado na Fig. 2. Comparado com H54/L28- IgG1, Fv4-IgG1 que se liga a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH poderia reduzir a concentração de receptor de IL-6 humano, mas não poderia reduzi-la abaixo da linha de base sem administração de anticorpo. Isto é, o anticorpo administrado que se liga a um antígeno de uma maneira dependente do pH não poderia reduzir a concentração de antígeno em plasma abaixo no nível antes da administração do anticorpo.
(2-2) O efeito de eliminação de um antígeno de plasma por um anticorpo com atividade de ligação a FCYR aumentada ou reduzida
[01676] Se o curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano é influenciada pelo aumento ou redução da atividade de ligação a FcyR de Fv4-IgG1, que é um anticorpo de ligação a receptor de IL-6 humano dependente do pH, foi avaliado através do método descrito abaixo. Usando Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F760, Fv4-IgG1-F1022 e Fv4-IgG1-Fuc preparado conforme descrito no Exemplo 1, testes de infusão in vivo foram realizados através do método descrito abaixo.
(2-2-1) Testes de infusão in vivo usando camundongos transgênicos com FcRn humano
[01677] Um modelo animal onde a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel é mantida constante em plasma foi criado através de implante de uma bomba de infusão (MINI-OSMOTIC PUMP MO- DEL2004, alzet) contendo receptor de IL-6 humano solúvel sob a pele das costas de camundongos transgênicos com FcRn humano (B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). No modelo animal, anticorpo antireceptor de IL-6 humano foi administrado simultaneamente com San- glopor (CSL Behring) que é uma preparação de imunoglobulina humana, para avaliar a dinâmica in vivo do receptor de IL-6 humano solúvel após administração de anticorpo. Para suprimir a produção de anticorpos de neutralização contra receptor de IL-6 humano solúvel, um anticorpo monoclonal CD4 anticamundongo (preparado através de um método conhecido) foi administrado uma vez a 20 mg/kg na veia caudal. Então, uma bomba de infusão contendo 92,8 μg/ml de receptor de IL-6 humano solúvel foi subcutaneamente implantada nas costas dos camundongos. Três dias após implante da bomba de infusão, um anticorpo anti-receptor de IL-6 humano e Sanglopor foram administrados uma vez a 1 mg/kg e 1000 mg/kg, respectivamente, na veia caudal. O sangue foi coletado dos camundongo 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, quatro dias e sete dias após administração do anticorpo antireceptor de IL-6 humano. O sangue foi coletado dos camundongos 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, três dias e sete dias após administração do anticorpo anti-receptor de IL-6 humano. Imediatamente, o sangue coletado foi centrifugado a 15.000 rpm e 4° C por 15 minutos para preparar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador ajustado a -20° C ou abaixo até uso.
(2-2-2) Determinação da concentração de receptor de IL-6 humano solúvel (hsIL-6R) em plasma através de um método de eletroquimio- luminescência
[01678] As concentrações de hsIL-6R em plasma de camundongo foram determinadas através do mesmo método de eletroquimiolumi- nescência conforme descrito em (2-1-2).
[01679] O resultado é mostrado na Fig. 3. O curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano em plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F760, do qual a ligação a FCYR de camundongo de Fv4-IgG1 é deletada, foi demonstrado ser comparável àquele em camundongos administrados com Fv4-IgG1. A atividade citotóxica para um antígeno de membrana depende da ligação a FcyR, e então a atividade citotóxica é perdida quando eliminado a ligação a FCYR. Por outro lado, mesmo quando administrando um anticorpo, do qual ligação a FCYR de camundongo é deletada, contra receptor de IL- 6 humano que é um antígeno solúvel, não houve nenhum efeito sobre o curso de tempo de concentração de receptor de IL-6 humano no plasma dos camundongos administrados. Desta maneira, seria pensado que a ligação a FcyR de um anticorpo contra o antígeno solúvel não tem nenhuma contribuição para o curso de tempo de concentração de antígeno no plasma de camundongos administrados com o anticorpo.
[01680] Surpreendentemente, no entanto, a concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1022 com ligação a FcyR de camundongo aumentada foi consideravelmente reduzida comparado com a concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1. Como para o grau de redução, a concentração foi confirmada ser diminuída abaixo da concentração de receptor de IL-6 humano de linha de base sem administração de anticorpo. Em particular, a concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1022 foi reduzida para cerca de 1/100 três dias após administração comparado com o caso de administração de Fv4-IgG1. Esta constatação demonstra que, através da administração a camundongos de um anticorpo que se liga a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH e cuja ligação a FcyR foi aumentada, a concentração de receptor de IL-6 humano no plasma dos camundongos pode ser significantemente reduzida, e como para o grau de redução, a concentração de antígeno em plasma pode ser reduzida abaixo do nível antes da administração do anticorpo.
[01681] Ainda, foi também demonstrado que, conforme comparado com camundongos administrados com Fv4-IgG1, a concentração de receptor de IL-6 humano em plasma foi reduzida em camundongos administrados com Fv4-IgG1-Fuc que tem cadeias de açúcar com teor de fucose baixo e com atividade de ligação a FCYRIV de camundongo aumentada. Em particular, a concentração de receptor de IL-6 humano no plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-Fuc foi reduzida para menos de cerca de % sete dias após administração comparado com o caso de administração de Fv4-IgG1. A constatação acima demonstra que, através da administração a camundongos de uma molécula de ligação a antígeno dependente do pH que se liga a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH e cuja ligação a FCYR foi aumentada, a concentração de antígeno solúvel no plasma dos camundongos podem ser reduzida. Neste caso, métodos para aumento da ligação a FcyR não são particularmente limitados à introdução de alterações de aminoácido. Foi demonstrado que tal aumento pode ser obtido, por exemplo, usando uma região Fc de IgG humana à qual uma cadeia de açúcar com teor de fucose baixo é ligada na posição 297 (numeração EU); no entanto, o efeito de Fv4-IgG1-Fuc para reduzir a concentração de antígeno foi menor do que Fv4-F1022. Com base neste resultado, seria pensado que, para vários FcyRs (FcyRI, II, III e IV para camundongo), FcyIV, ao qual a ligação de Fv4-IgG1-Fuc é aumentada, não tem uma grande contribuição para a redução de concentração de antígeno como um FcyR.
[01682] Desta maneira, foi revelado que, através da administração a um indivíduo de um anticorpo que se liga a um antígeno solúvel de uma maneira dependente do pH e cuja ligação a FcyR foi aumentada, a concentração de antígeno solúvel no plasma do indivíduo pode ser notadamente reduzida.
[01683] Sem ser limitado por uma teoria particular, a redução inesperada de concentração de antígeno solúvel em plasma, que foi observada quando administrando uma molécula de ligação a antígeno que compreende um domínio de ligação a antígeno cuja ligação a FCYR foi aumentada e cuja atividade de ligação a antígeno é alterada dependendo da condição de concentração de ion tal como pH e um domínio de ligação a FcRn que tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, pode ser explicada como segue.
[01684] Anticorpos IgG que são não especificamente incorporados a células retornam para a superfície celular através de ligação a FcRn sob a condição ácida no endossomo, e então se dissociam de FcRn sob a condição neutra em plasma. Em tal caso, quando um anticorpo que neutraliza a função de um antígeno solúvel através de ligação ao antígeno é administrado a camundongos onde a concentração do an- tígeno solúvel é mantida constante em plasma, o antígeno solúvel em plasma forma um complexo com o anticorpo administrado. O antígeno solúvel incorporado às células enquanto permanecendo como o complexo é pensado ser reciclado, em um estado ligado ao anticorpo, para o plasma junto com o anticorpo, porque a região Fc do anticorpo se liga a FcRn sob a condição ácida no endossomo.
[01685] Entretanto, quando o anticorpo contra o antígeno solúvel é um anticorpo que se liga ao antígeno de uma maneira dependente do pH (isto é, um anticorpo que dissocia do antígeno solúvel sob a condição ácida no endossomo), o antígeno solúvel que não é especificamente incorporado a células enquanto permanecendo como um complexo com o anticorpo é dissociado do anticorpo no endossomo e degradado no lisossomo; desta maneira, o antígeno solúvel não é reciclado para o plasma. Isto é, é pensado que Fv4-IgG1 incorporado como um complexo com o antígeno solúvel em células pode se dissociar do antígeno solúvel no endossomo e então acelera a eliminação do antígeno solúvel.
[01686] Conforme acima descrito, moléculas de ligação a antígeno tal como Fv4-IgG1, que contêm um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é alterada dependendo da concentra ção de íon, são pensadas ser capazes de ligação a antígenos repeti-damente várias vezes. O efeito para acelerar a eliminação de antíge- nos solúveis do plasma através de dissociação deles no endossomo é pensado ser dependente da taxa de incorporação do complexo antí- geno/molécula de ligação a antígeno no endossomo. Uma molécula de ligação a antígeno que contém um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a vários FCYRS foi aumentada e cuja atividade de ligação a antígeno é alterada dependendo da condição de concentração de ion é ativamente incorporada a células através de ligação a vários FcyRs expressos na membrana celular e pode ser transportada de volta para o plasma através de reciclagem via a ligação entre FcRn e o domínio de ligação a FcRn compreendido na molécula, que tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição faixa de pH ácido. Isto é, é pensado que, uma vez que a molécula de ligação a antígeno acima que forma um complexo com um antígeno solúvel em plasma é ativamente incorporada a células via FcyR expresso na membrana celular, seu efeito de acelerar a eliminação do antígeno solúvel de plasma é mais notadamente mostrada do que moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a vários FcyRs não foi aumentada.
[01687] No organismo vivo, vários FcyRs são expressos na membrana celular de células imunes e desempenham uma variedade de funções. Quaisquer FcyRs podem ser usados para incorporar anticorpos em células. Especificamente, em humanos, a presença de FcyRIIb inibidor e FcyRs de ativação incluindo FcyRI, FcyRIIa e FcyRIIIa é conhecida, e anticorpos podem ser incorporados através de qualquer um deles. Anticorpos podem ser incorporados por todos ou qualquer um dos FcyRs. Alternativamente, anticorpos podem ser incorporados de tal maneira mediada por vários FcyRs de ativação sozinhos ou por FcyRIIb inibidor sozinho.
[01688] Por outro lado, para atingir os propósitos acima, é possível empregar quaisquer métodos para aumento da atividade de ligação a FCYR do domínio de ligação a FCYR de moléculas de ligação a antíge- no. Por exemplo, conforme mostrado no Exemplo 1, mutações de ami- noácido para aumento da atividade de ligação a FcyR podem ser in-troduzidas no domínio de ligação a FcyR de moléculas de ligação a antígeno ou podem ser usados anticorpos do tipo de baixo teor de fu-cose. Entretanto, o efeito para aumentar a atividade de ligação a FcyR, que é o obtido por tais métodos, pode ser um efeito de aumento da ligação a qualquer FcyR. Especificamente, é possível aumentar a ati-vidade de ligação para um, alguns ou todos os FcyRs. Ainda, é possível apenas aumentar a atividade de ligação a vários FcyRs de ativação ou FcyRIIb inibidor.
[01689] A atividade de ligação a FcyR de um anticorpo que se liga a um antígeno de membrana desempenha um papel importante na atividade citotóxica do anticorpo. Desta maneira, quando é necessário que um anticorpo usado como um agente farmacêutico tenha atividade ci- totóxica, um isotipo de IgG1 humano com atividade de ligação a FcyR forte é usado. Ainda, técnicas para aumentar a atividade citotóxica de tais anticorpos através do aumento da atividade de ligação a FcyR dos anticorpos são geralmente usadas na técnica.
[01690] Entretanto, o papel da atividade de ligação a FcyR de anticorpos que se ligam a antígenos solúveis e que são usados como agentes farmacêuticos não é conhecido na técnica. Não houve avaliação suficiente sobre que diferença no efeito do organismo vivo administrado com os anticorpos é causada pela diferença na atividade de ligação a FcyR entre IgG1 humana com atividade de ligação a FcyR alta e IgG2 humana e IgG4 humana com atividade de ligação a FcyR baixa. Na realidade, foi demonstrado no presente Exemplo que não houve nenhuma influência sobre o curso de tempo de concentração de antígeno solúvel no plasma dos indivíduos administrados com um anti- corpo que não tem atividade de ligação a FCYR. Entretanto, na presente invenção, foi revelado que a concentração de antígeno solúvel foi significantemente reduzida no plasma dos indivíduos administrados com uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR foi aumentada e que contém um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno é alterada dependendo da condição de concentração de ion. Especificamente, pode ser dito que os inventores da presente invenção revelaram pela primeira vez o benefício do aumento de ligação a FcyR através da combinação de um domínio de ligação a FcRn que tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido com um domínio de ligação a antígeno cuja ligação a antígeno solúvel é alterada dependendo da condição de concentração de íon, compreendido em uma molécula de ligação a antígeno direcionada a um antígeno solúvel.
[01691] Exemplo 3 Efeito de eliminação de antígenos de plasma por moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR é maior do que aquela de região Fc de IgG humana nativa e cuja atividade de ligação a FcRn humano foi aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido
(3-1) Preparação de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FCYR é maior do que a atividade de ligação de região Fc de IgG humana nativa e cuja atividade de ligação a FcRn humana foi au-mentada sob uma condição de faixa de pH ácido
[01692] Um método relatado para aperfeiçoamento da retenção de anticorpo IgG em plasma é aperfeiçoar a ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido. É pensado que, quando a ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido é aperfeiçoada através da introdução de uma substituição de aminoácido na região Fc de um anticorpo IgG, isso aumenta a eficiência de reciclagem a partir do en- dossomo para o plasma resultando em um aperfeiçoamento da reten- ção no plasma do anticorpo IgG.
[01693] Há muitos relatos sobre alterações de aminoácido para aperfeiçoar a retenção no plasma através do aperfeiçoamento da ativi-dade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido. Tais alterações incluem, por exemplo:
[01694] o método para substituição de Met por Leu na posição 428 e Asn por Ser na posição 424 (numeração EU) em um anticorpo IgG (Nat. Biotechnol. (2010) 28, 157-159); o método para substituição de Asn por Ala na posição 434 (Drug Metab. Dispos. (2010) 38 (4), 600605); o método de substituição de Met por Tyr na posição 252, Ser por Thr na posição 254 e Thr por Glu na posição 256 (J. Biol. Chem. (2006) 281, 23514-23542); o método de substituição de Thr por Gln na posição 250 e Met por Leu na posição 428 (J. Immunol. (2006) 176 (1) 346-356); o método para substituição de Asn por His na posição 434 (Clin. Pharm. & Ther. (2011) 89 (2) 283-290); e WO2010/106180; WO2010/045193; WO2009/086320; WO2009/058492; WO2008/022152; WO2006/050166, WO2006/053301, WO2006/031370; WO2005/123780; WO2005/047327; WO2005/037867; WO2004/035752; e WO2002/060919.
[01695] VH3-IgG1-F1093 (SEQ ID NO: 43) com substituição de Met por Leu na posição 428 e Asn por Ser na posição 434 (numeração EU) com VH3-IgG1-F1022 foi preparado para aperfeiçoar a farmacodinâ- mica de Fv4-IgG1-F1022 que foi demonstrado produzir, quando administrado, o efeito de reduzir significantemente a concentração de antí- geno solúvel em plasma, conforme descrito no Exemplo 2. Fv4-IgG1- F1093 compreendendo VH3-IgG1-F1093 como a cadeia pesada e VL3-CK como a cadeia leve foi construído usando o método descrito no Exemplo de Referência 2.
(3-2) Efeito de eliminação de antígenos de plasma por moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FCYR é maior do que aquela de região Fc de IgG humana nativa e cuja atividade de ligação a FcRn humano foi aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido
[01696] Um teste de infusão in vivo foi realizado para Fv4-IgG1- F1093 através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo (21) usando camundongos transgênicos com FcRn humano onde a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel é mantida constante em plasma. Concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma de camundongos foram determinadas através dos métodos descritos no Exemplo (2-1-2). O resultado é mostrado na Fig. 4.
(3-2-1) Determinação da concentração de anticorpo antirreceptor de IL-6 humano em plasma através do método ELISA
[01697] Concentrações de anticorpo antirreceptor de IL-6 humano em plasma de camundongo foram determinadas através do método ELISA. Primeiro, um anticorpo ideotipo anti-Fv4 MABTECH foi separado em alíquotas em uma Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International). A placa foi deixada ficar a 4° C de um dia para o outro para preparar uma placa imobilizada com o anticorpo ideotipo anti-Fv4. O anticorpo ideotipo foi obtido através de imunização de um coelho com Fv4-M73 (WO2009/125825). Após purificação do soro usando uma resina de troca de íon, o anticorpo foi purificado por afinidade através de uma coluna imobilizada com Fv4-M73, seguido por adsor- ção usando uma coluna imobilizada para humano. Amostras de curva padrão contendo um anticorpo anti-receptor de IL-6 humano (concentração em plasma: 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 e 0,0125 μg/ml) e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluído 100 vezes ou mais foram preparadas. 100 μl de cada uma da curva padrão e amostras de ensaio foram combinados com 200 μl de 20 ng/ml de receptor de IL-6 humano solúvel. As misturas resultantes foram deixadas descansar em temperatura ambiente por uma hora e separadas em alíquotas para cada cavidade da placa imobilizada com o anticorpo ideo- tipo anti-Fv4. A placa foi deixada ficar em temperatura ambiente por mais uma hora. Então, Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D) foi reagido nela em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi reagida nela em temperatura ambiente por uma hora. A reação cro- mogênica da solução de reação foi realizada usando como um substrato TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após terminar a reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorbância a 450 nm da solução de reação de cada cavidade foi medida com uma leitora de microplaca. Concentrações de anticorpo em plasma de camundongo foram determinadas com base na absor- bância da curva padrão usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices).
[01698] O resultado é mostrado na Fig. 5.
(3-3) Aperfeiçoamento de farmacodinâmica através do aumento da atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido
[01699] Conforme mostrado na Fig. 5, no grupo administrado com Fv-IgG1-F1022 resultante do aumento da atividade de ligação a FCYR de Fv4-IgG1 sob uma condição de faixa de pH neutro, a retenção no plasma do anticorpo administrado foi demonstrada ser reduzida comparado com o grupo administrado com Fv4-IgG1. Entretanto, no grupo administrado com Fv4-IgG1-F1093 resultante do aumento da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1022 sob uma condição de faixa de pH ácido, a retenção no plasma do anticorpo administrado foi demonstrada ser significantemente aperfeiçoada comparado com o grupo administrado com Fv4-IgG1-F1022.
[01700] Ainda, conforme mostrado na Fig. 4, o curso de tempo da concentração de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma do grupo de Fv4-IgG1-F1022 era equivalente àquele do grupo administrado com Fv4-IgG1-F1093, até três dias após a administração do anticorpo. No dia três de administração, comparado com o grupo administrado com Fv4-IgG1, a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foi reduzida tanto quanto 100 vezes em ambos os grupos administrados com Fv4-IgG1-F1022 e Fv4-IgG1-F1093. No entanto, no dia sete após administração do anticorpo, a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foi observada ser elevada no grupo administrado com Fv4-IgG1-F1022 comparado com no dia três após administração. Por outro lado, no grupo administrado com Fv4-IgG1- F1093, um aumento na concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel não foi observado, mostrando que o efeito para reduzir a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel foi sustentado neste grupo de administração.
[01701] Especificamente, Fv4-IgG1-F1093, quando administrado, reduziu a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma do indivíduo administrado para cerca de 1/100 comparado com Fv4- IgG1 e, ainda, sustentou esta condição por um período longo. Desta maneira, Fv4-IgG1-F1093 foi demonstrado ser uma molécula de ligação a antígeno altamente excelente. Sem ser limitado por uma teoria particular, o fenômeno observado aqui pode ser explicado como segue. Fv4-IgG1-F1022 onde a atividade de ligação a FCYR de Fv4-IgG1 foi aumentada sob uma condição de faixa de pH neutro é pensado ser incorporado em uma grande quantidade principalmente em células imunes expressando FcyR na membrana celular. O anticorpo incorporado é transferido para o endossomo, e através de ligação a FcRn no endossomo, o anticorpo é reciclado para o plasma. Quando a atividade de ligação a FcRn do anticorpo não é alta o suficiente sob a condição em pH ácido no endossomo, o anticorpo incorporado no endos- somo é pensado ser incapaz de reciclagem suficiente. Especificamente, uma possível razão para a retenção no plasma reduzida de Fv4- IgG1-F1022 com relação a Fv4-IgG1 seria que a atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido é insuficiente para reci-clagem suficiente do anticorpo incorporado ao endossomo para o plasma através de ligação a FcRn, e o anticorpo que não foi reciclado foi degradado no lisossomo.
[01702] Por outro lado, como com Fv4-IgG1-F1022, Fv4-IgG1- F1093 resultante do aumento da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1022 sob uma condição de faixa de pH ácido é pensado ser incorporado em uma grande quantidade principalmente em células imunes expressando FCYR na membrana celular. Um anticorpo incor-porado e transferido para o endossomo é reciclado para o plasma através de ligação a FcRn no endossomo. Uma vez que a atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido é aumentada, Fv4-IgG1-F1093 é pensado ter atividade de ligação a FcRn suficiente no endossomo. Desta maneira, após incorporação em células, a maior parte do Fv4-IgG1-F1093 é reciclado para o plasma. Desta maneira, seria pensado que a retenção no plasma de Fv4-IgG1- F1093 foi aperfeiçoada em indivíduos administrados comparado com Fv4-IgG1-F1022.
[01703] Por outro lado, é conhecido que a retenção no plasma de anticorpos comuns é aperfeiçoada quando sua atividade de ligação a FcRn é aperfeiçoada sob uma condição de faixa de pH ácido. No entanto, é pensado que, quando a retenção do anticorpo no plasma é aperfeiçoada, a retenção no plasma de antígenos ligados a anticorpo é também aperfeiçoada, e isso resulta em um aumento da concentração de antígeno no plasma. Na realidade, conforme descrito no WO2010/088444, Anticorpo 18E introduzido com a alteração YTE no Anticorpo 18, que é um anticorpo IgG1 humano contra IL-6, para aumentar a atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, mostrou retenção de anticorpo aperfeiçoada no plasma de macacos cinomólogo e ao mesmo tempo, a concentração do antígeno para IL-6 foi também elevada no plasma.
[01704] Surpreendentemente, no entanto, quando administrando Fv4-IgG1-F1093 introduzido com uma alteração similar a YTE para aumento da atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido em Fv4-F1022 que se liga ao antígeno de uma maneira dependente do pH e tem atividade de ligação a FCYR aumentada, a retenção no plasma do anticorpo foi significantemente aperfeiçoada nos indivíduos administrados sem aumento da concentração de receptor de IL-6 humano solúvel que é o antígeno. Ao contrário, no dia sete após administração do anticorpo, a concentração do receptor de IL-6 humano solúvel permaneceu baixa nos indivíduos administrados com Fv4-IgG1-F1093 comparado com aqueles administrados com Fv4- F1022.
[01705] Sem ser limitado por nenhuma teoria particular, o fenômeno observado aqui pode ser explicado como segue. Quando administrado a um organismo vivo, um anticorpo sem ligação a antígeno dependente do pH não é especificamente incorporado a células. Antígenos que permanecem para serem ligados ao anticorpo são reciclados para o plasma no mesmo nível que o anticorpo. Entretanto, para um anticorpo com atividade de ligação a FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido, o grau de reciclagem para o plasma em um organismo vivo administrado com o anticorpo é maior do que aquele de um anticorpo sem atividade de ligação a FcRn aumentada, e isso resulta em um nível aumentado de reciclagem de antígenos ligados ao antígeno para o plasma no organismo vivo. Desta maneira, devido à retenção no plasma aperfeiçoada do anticorpo administrado no organismo vivo, a concentração no plasma do antígeno ao qual o anticorpo se liga é pensada também ser aumentada no organismo vivo.
[01706] Entretanto, quando administrado a um organismo vivo, um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente do pH e que tem atividade de ligação a FCYR aumentada é principalmente incorporado a células imunes expressando FCYR na membrana celular, e isso reduz a retenção no plasma. Ainda, após ser incorporado a células enquanto estando ligado ao anticorpo, o antígeno é dissociado do anticorpo no endossomo e então degradado no lisossomo, resultando em uma diminuição da concentração de antígeno no plasma no organismo vivo. Quando a atividade de ligação a FcRn é aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido, a retenção de anticorpo em plasma, mesmo se piorada devido à atividade de ligação a FcyR aumentada, é aperfeiçoada por um aumento na taxa de reciclagem por FcRn. Neste caso, uma vez que o antígeno ligado ao anticorpo que se liga ao antígeno de uma maneira dependente do pH é dissociado do anticorpo no endossomo e diretamente degradado no lisossomo, não é pensado que a concentração de antígeno seja aumentada no plasma. Ainda, a retenção no plasma aperfeiçoada do anticorpo administrado ao organismo vivo é pensada permitir que o efeito de eliminação de antígeno do anticorpo seja sustentado, e a concentração de antígeno seja mantida baixa por um período mais longo.
[01707] As constatações acima demonstram que a retenção no plasma de um anticorpo administrado é aperfeiçoada em um organismo vivo administrado com o anticorpo onde a atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido é aumentada em uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcyR é maior do que aquela de região Fc de IgG humana nativa. Ainda, foi revelado que, neste caso, a retenção de anticorpo em plasma é aperfeiçoada sem deterioração do efeito de eliminação de antígeno.
Exemplo 4 Avaliação adicional do efeito de eliminação de antíge- nos de plasma
[01708] Moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FCYR é maior do que aquela de região Fc de IgG humana nativa e cuja atividade de ligação a FcRn humana foi aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido
(4-1) O efeito de eliminação de antígeno no organismo vivo administrado com o anticorpo cuja atividade de ligação a FCYR é maior do que aquela da região Fc de IgG humana nativa e que tem atividade de ligação a FcRn humano aumentada sob condições de faixa de pH ácido
[01709] Conforme descrito no Exemplo 2, a concentração de antí- geno em plasma foi significantemente reduzida no grupo administrado com Fv4-IgG1-F1022 com ligação a FcyR de camundongo aumentada. Entretanto, conforme mostrado no Exemplo 3, a retenção no plasma reduzida observada no grupo administrado com Fv4-IgG1-F1022 foi notadamente aperfeiçoada através do aumento da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1022 sob uma condição de faixa de pH ácido. Em seguida, o efeito de eliminação de antígenos solúveis de plasma através do aumento da ligação a FcyR de camundongo e o efeito de aperfeiçoamento de retenção no plasma de um anticorpo no organismo vivo administrado com ele através do aumento da atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido foram adicionalmente avaliados conforme descrito abaixo.
(4-2) Preparação de um anticorpo anti-receptor de IL-6 humano com ligação a FCYR de camundongo aumentada
[01710] VH3-IgG1-F1087 (SEQ ID NO: 123) resultante da substitui ção de Lys por Asp na posição 326 (numeração EU) em VH3-IgG1 e VH3-IgG1-F1182 (SEQ ID NO: 124) resultante da substituição de Ser por Asp na posição 239 e Ile por Glu na posição 32 (numeração EU) em VH3-IgG1 foram preparados como moléculas de ligação a antíge- no com ligação a FcyR de camundongo aumentada. Fv4-IgG1-F1087 que contém VH3-IgG1-F1087 como a cadeia pesada e VL3-CK como a cadeia leve e Fv4-IgG1-F1182 que contém VH3-IgG1-F1182 como a cadeia pesada e VL3-CK como a cadeia leve foram produzidos usando o método descrito no Exemplo de Referência 2.
(4-3) Avaliação de atividade de ligação a FCYR de camundongo
[01711] VH3/L (WT)-IgG1-F1087 3 VH3/L (WT)-IgG1-F1182 que contêm VH3-IgG1-F1087 e VH3-IgG1-F1182 como a cadeia pesada, respectivamente, e L (WT)-CK (SEQ ID NO: 42) como a cadeia leve, foram preparados através do método descrito no Exemplo de Referência 2. Esses anticorpos e VH3/L (WT)-IgG1-F1022 foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a FcyR de camundongo através do método descrito no Exemplo de Referência 2. O resultado é mostrado na Tabela 8. Ainda, a razão do aumento na atividade de ligação a FcyR de camundongo de cada variante com relação a IgG1 antes da alteração é mostrada na Tabela 9. Tabela 8
Figure img0016
Tabela 9
Figure img0017
[01712] Conforme mostrado na Tabela 9, foi demonstrado que F1087 e F1022 tinham atividade de ligação aumentada a FcyR de camundongo, FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo compa- rado com IgG1, enquanto sua atividade de ligação a FCYRIV não foi aumentada. Com relação à atividade de ligação de F1087 a FCYRI de camundongo, FcYRIIb de camundongo e FCYRIII de camundongo e FCYRIV de camundongo, o grau do seu aumento foi revelado ser menor do que aquele de F1022. Entretanto, foi mostrado que a atividade de ligação de F1182 a FCYRI de camundongo e FCYRIV de camundongo foi consideravelmente aumentada, enquanto o grau de aumento em sua atividade de ligação a FcyRIIb e FcyRIII foi menor do que aquela de F1022 e F1087. Conforme mencionado acima, esses três tipos de variantes mostraram ligação aumentada a alguns FcyRs de camundongo; no entanto, foi mostrado que o FcyR ao qual a atividade de ligação é seletivamente aumentada e o grau do aumento variam dependendo da variante.
(4-4) O efeito de eliminação de antígenos do plasma em um indivíduo administrado com Fv4-IgG1-F1087 e Fv4-IgG1-F1182
[01713] Através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo 2, testes de infusão in vivo usando camundongos trangenicos com FcRn humano foram realizados para determinar as concentrações de receptor de IL-6 solúvel no plasma do camundongo. O resultado é mostrado na Fig. 6.
[01714] Em ambos os grupos administrados com Fv4-IgG1-F1087 e Fv4-IgG1-F1182 in vivo, que têm atividade de ligação a FcRn de camundongo aumentada comparado com Fv4-IgG1, a concentração no plasma in vivo de receptor de IL-6 humano solúvel reduziu comparado com o grupo administrado com Fv4-IgG1. O efeito para reduzir a concentração no plasma acima de receptor de IL-6 humano solúvel foi especialmente alta no grupo administrado com Fv4-IgG1-F1087 que tem ligação aumentada a FcyRII de camundongo e FcyRIII de camundongo. Entretanto, o efeito da administração de F1182 para reduzir a concentração em plasma de receptor de IL-6 humano solúvel foi pequeno no grupo administrado com F1182 in vivo que tem atividade de ligação consideravelmente aumentada a FCYRI de camundongo e FCYRIV de camundongo (bem como ligação várias vezes aumentada a FCYRII e camundongo e FCYRIII de camundongo). Foi pensado a partir desses resultados que os FCYRS de camundongo que contribuem mais signifi- cantemente por um efeito que diminui eficientemente a concentração de antígeno no plasma de camundongos administrados com um anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH são FcyRII de camundongo e/ou FcyRIII de camundongo. Especificamente, foi pensado que a concentração de antígeno no plasma pode ser mais eficientemente reduzida in vivo através da administração a um organismo vivo de um anticorpo de ligação a antígeno dependente do pH com ligação au-mentada a FcyRII de camundongo e/ou FcyRIII de camundongo.
(4-5) Preparação de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FCYR é maior do que a atividade de ligação de região Fc de IgG humana nativa e que tem atividade de ligação a FcRn humano aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido
[01715] Conforme descrito no Exemplo 3, quando comparado com camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1-F1022, a retenção no plasma de um anticorpo administrado é notadamente aperfeiçoada em camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1-F1093 resultante do aumento da atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido de Fv4-IgG1-F1022 onde a atividade de ligação a FcyR de camundongo foi aumentada. Se este efeito foi também observado em camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com Fv4-IgG1-F1087 e Fv4-IgG1-F1182 e se o mesmo efeito é observado em camundongos administrados com variantes cuja atividade de ligação a FcRn humano foi aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido através da adição de uma alteração distinta da alteração ava- liada no Exemplo 3 foi avaliado como segue.
[01716] VH3-IgG1-F1180 (SEQ ID NO: 125) e VH3-IgG1-F1181 (SEQ ID NO: 126) foram preparados substituindo Met por Leu na posição 428 e Asn por Ser na posição 434 (numeração EU) nas cadeias pesadas VH3-IgG1-F1087 e VH3-IgG1-F1182, a fim de aumentar sua atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1087 e Fv4-IgG1- F1182 sob uma condição de faixa de pH ácido. Ainda, VH3-IgG1- F1412 (SEQ ID NO: 127) foi preparado através da substituição de Asn por Ala na posição 434 (numeração EU) na cadeia pesada VH3-IgG1- F1087, a fim de aumentar a atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1087 sob uma condição de faixa de pH ácido. Fv4-IgG1- F1180, Fv4-IgG1-F1181 e Fv4-IgG1-F1412 que contêm as cadeias pesadas acima e VL3-CK como a cadeia leve foram preparados usando o método descrito no Exemplo de Referência 2.
(4-6) Aperfeiçoamento de farmacodinâmica de anticorpos com atividade de ligação a FcRn humano aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido
[01717] Testes de infusão in vivo foram realizados através da admi-nistração de Fv4-IgG1-F1180, Fv4-IgG1-F1181 e Fv4-IgG1-F1412 a camundongos transgênicos com FcRn humano de acordo com o mesmo método que aquele descrito no Exemplo 2 para determinar as concentrações de receptor de IL-6 solúvel no plasma do camundongo. Os resultados sobre as concentrações de anticorpo no plasma dos grupos de camundongo administrados com Fv4-IgG1-F1087, Fv4- IgG1-F1180, Fv4-IgG1-F1412 e Fv4-IgG1 são mostrados na Fig. 7. Os resultados das concentrações de anticorpo no plasma dos grupos de camundongo administrados com Fv4-IgG1-F1182, Fv4-IgG1-F1181 e Fv4-IgG1 são mostrados na Fig. 8. Entretanto, as concentrações de anticorpo no plasma nos grupos de camundongo foram medidas através do método descrito no Exemplo 3. Os resultados sobre as concen- trações de receptor de IL-6 solúvel no plasma de Fv4-IgG1-F1087, Fv4-IgG1-F1180, Fv4-IgG1-F1412 e Fv4-IgG1 nos grupos de camundongo são mostrados na Fig. 9; e os resultados sobre as concentrações de receptor de IL-6 solúvel no plasma de Fv4-IgG1-F1182, Fv4- IgG1-F1181 e Fv4-IgG1 são mostrados na Fig. 10.
[01718] Foi confirmado que, comparado com o grupo de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1182, a retenção no plasma de anticorpos administrados foi aperfeiçoada no grupo de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1181 resultante do aumento da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1182 em uma faixa de pH ácido. Entretanto, a concentração de receptor de IL-6 solúvel no plasma dos grupos de camundongo administrados com Fv4-IgG1-F1181 era comparável àquela no grupo de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1182. Quando comparado com os grupos de camundongo administrados com Fv4-IgG1, a concentração de receptor de IL-6 solúvel no plasma foi diminuída em ambos os grupos.
[01719] Por outro lado, comparado com o grupo de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1087, a retenção no plasma de anticorpos administrados foi aperfeiçoada em ambos os grupos de camundongos administrados com FV4-IgG1-F1180 e Fv4-IgG1-F1412 resultante do aumento da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4- IgG1-F1087 em uma faixa de pH ácido e, surpreendentemente, a retenção no plasma foi aperfeiçoada até um nível comparável com aquele dos grupos de camundongo administrados com Fv4-IgG1. Ainda, a sustentabilidade do efeito de redução da concentração de receptor de IL-6 humano soluvel em plasma foi aperfeiçoada através do aperfeiçoamento de retenção de anticorpo no plasma nos grupos de camundongos administrados. Especificamente, nos grupos de camundongos administrados, as concentrações de receptor de IL-6 soluvel em plasma 14 dias e 21 dias após administração de Fv4-IgG1-F1180 e Fv4- IgG1-F1412 foram significantemente reduzidas comparado com as concentrações 14 dias e 21 dias após administração de Fv4-IgG1- F1087.
[01720] Em vista do acima, como para os grupos de camundongos administrados com os quatro exemplos de anticorpos, Fv4-IgG1- F1093, Fv4-IgG1-F1181, Fv4-IgG1-F1180 e Fv4-IgG1-F1412, foi demonstrado que a retenção no plasma pode ser aperfeiçoada em um organismo vivo administrado com um anticorpo onde a atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido foi aumentada em uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FCYR é maior do que a atividade de ligação de região Fc de IgG humana nativa. Foi demonstrado que, no organismo vivo administrado com a molécula de ligação a antígeno, a retenção no plasma é aperfeiçoada sem deterioração do efeito de eliminação de antígenos do organismo vivo e, ao contrário, o efeito de eliminação de antígeno pode ser sustentado.
(4-7) Preparação de moléculas de ligação a antígeno com atividade de ligação a FcRn humano aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido e ligação suprimida a um fator reumatoide
[01721] Nos últimos anos, uma molécula de anticorpo resultante de substituição de Asn por His na posição 434 (numeração EU) em um anticorpo anti-CD4 humanizado para aperfeiçoar a retenção no plasma através de aumento de sua atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido foi relatada se ligar ao fator reuma- toide (RF) (Clin. Pharmacol. Ther. (2011) 89 (2), 283-290). Este anticorpo tem uma região Fc de IgG1 humana e uma substituição de Asn por His na posição 434 (numeração EU) no sítio de ligação a FcRn. O fator reumatoide foi demostrado reconhecer e se ligar à porção substituída.
[01722] Conforme descrito no Exemplo (4-6), comparado com o ca- so onde Fv4-IgG1-F1087 foi administrado a camundongos transgêni- cos com FcRn humano, Fv4-IgG1-F1180 resultante do aumento sob condições de faixa de pH ácido da atividade de ligação a FcRn humano de Fv4-IgG1-F1087 com atividade de ligação a FCYR de camundongo aumentada mostrou retenção aperfeiçoada em plasma. Várias alterações foram relatadas aumentar a atividade de ligação a FcRn humano sob condições de faixa de pH ácido. De tais modificações, uma variante com uma substituição de Met por Leu na posição 428 e Ans por Ser na posição 434 (numeração EU) na cadeia pesada foi relatada mostrar ligação aumentada a fatores reumatoides.
[01723] No entanto, uma variante que tem uma substituição de Tyr por Thr na posição 436 (numeração EU) em adição às substituições acima nas posições 428 a 434 (numeração EU) mostra ligação signifi- cantemente reduzida a fatores reumatoides enquanto retendo atividade de ligação a FcRn humano aumentada sob condições de faixa de pH ácido.
[01724] Isto é, moléculas de ligação a antígeno que têm atividade de ligação a FcRn humano aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido, mas não têm a ligação ao fator reumatoide podem ser produzidas através da introdução no sítio da região Fc de uma alteração que reduz a atividade de ligação a fator reumatoide sozinho sem redução da atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido.
[01725] Tais alterações usadas para redução da atividade de ligação a fator reumatoide incluem alterações nas posições 248-257, 305314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439 e 441-444 (numeração EU), preferivelmente aquelas nas posições 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438 e 440 (numeração EU) e, particularmente preferivelmente, uma alteração que substitui Val por Glu ou Ser na posição 422, uma alteração que substitui Ser por Arg na posição 424, uma al- teração que substitui His por Asp na posição 433, uma alteração que substitui Tyr por Thr na posição 436, uma alteração que substitui Gln por Arg ou Lys na posição 438 e uma alteração que substitui Ser por Glu ou Asp na posição 440 (numeração EU). Essas alterações podem ser usadas sozinhas ou em combinação.
[01726] Alternativamente, é possível introduzir sequências de glico- silação tipo N para reduzir a atividade de ligação a fator reumatoide. Especificamente, sequências de glicosilação tipo N conhecidas incluem Asn-Xxx-Ser/Thr (Xxx representa um aminoácido arbitrário que não Pro). Esta sequência pode ser introduzida na região Fc para adicionar uma cadeia açúcar tipo N e a ligação a RF pode ser inibida pelo impedimento estérico da cadeia de açúcar tipo N. Alterações usadas para adição de uma cadeia de açúcar tipo N incluem preferivelmente uma alteração que substitui Lys por Asn na posição 248, uma alteração que substitui Ser por Asn na posição 424, uma alteração que substitui Tyr por Asn na posição 436 e Gln por Thr na posição 438 e uma alteração que substitui Qln por Asn na posição 438, de acordo com a numeração EU, particularmente preferivelmente uma alteração que substitui Ser por Asn na posição 424 (numeração EU).
(4-8) Avaliação do efeito de aperfeiçoamento da farmacodinâmica de moléculas de ligação a antígeno com atividade de ligação a FcRn hu-mano aumentada sob condições de faixa de pH ácido e ligação a fator reumatoide reduzida
[01727] A fim de avaliar o efeito de anticorpos com uma alteração que reduz a atividade de ligação a fator reumatoide mencionada acima, Fv4-IgG1-F1782 com uma substituição de Met por Leu na posição 428, Asn por Ser na posição 434 e Tyr por Thr na posição 436 (numeração EU) na cadeia pesada de Fv4-IgG1-F1087 foi produzido usando o método descrito no Exemplo de Referência 2. Conforme descrito no Exemplo (4-7), Fv4-IgG1-F1782 é um anticorpo cuja atividade de liga- ção a FcRn humano sob condições de pH ácido e atividade de ligação a FCYR de camundongo foram ambas aumentadas, mas sua atividade de ligação a fator reumatoide não foi aumentada comparado com IgG1 humana nativa. Para testar se a retenção no plasma de anticorpo Fv4- IgG1-F1782 foi aperfeiçoada comparado com Fv4-IgG1-F1087, a far- macodinâmica dos anticorpos no plasma de camundongos transgêni- cos com FcRn humano administrados com os anticorpos foi avaliada através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo 2. A concentração de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma foi determinada através do método descrito no Exemplo (2-1-2), enquanto as concentrações de anticorpo no plasma foram determinadas através do método descrito no Exemplo (3-2-1).
[01728] Um curso de tempo de concentração de anticorpo em plasma é mostrado na Fig. 11 e um curso de tempo de concentração em plasma de receptor de IL-6 humano solúvel é mostrado na Fig. 12. Fv4-IgG1-F1782 mostrou retenção do anticorpo no plasma aperfeiçoada comparado com Fv4-IgG1-F1087. Entretanto, a concentração no plasma de receptor de IL-6 humano solúvel foi significantemente reduzida nos grupos administrados com os anticorpos acima comparado com o grupo de administração de Fv4-IgG.
[01729] Sem ser limitado por uma teoria particular, os resultados acima podem ser interpretados como segue. Os resultados descritos nos Exemplos 3 e 4 mostram que a retenção no plasma pode ser prolongado no organismo vivo administrado com um anticorpo resultante do aumento sob condicoes de faixa de pH ácido da atividade de ligação a FcRn humano de uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a FcRn é maior do que a atividade de ligação da região Fc de IgG humana natural. Foi também demonstrado que, no organismo vivo administrado com tal molécula de ligação a antígeno, a retenção no plasma é prolongada sem deterioração do efeito de elimina- ção de antígenos do organismo vivo e então o efeito de eliminação de antígeno pode ser sustentado.
[01730] No entanto, é compreendido que moléculas de ligação a antígeno introduzidas com uma alteração para aumento da atividade de ligação a FcRn humano sob condições de faixa de pH ácido teriam um risco de atividade de ligação a fator reumatoide aumentada. Dessa maneira, a retenção no plasma pode ser aperfeiçoada sem aumento da atividade de ligação a fator reumatoide através da introdução nas moléculas de ligação a antígeno de uma mutação que reduz a atividade de ligação a fator reumatoide enquanto retendo a atividade de ligação a FcRn humano sob condições de faixa de pH ácido.
[01731] Em outras palavras, foi revelado que quando administradas a um organismo vivo, moléculas de ligação a antígeno que têm a propriedade de ligação a antígenos de uma maneira dependente do pH, e têm atividade de ligação a FcRn humano aumentada sob condições de faixa de pH ácido, e cuja atividade de ligação a FCYR é maior do que aquela da região Fc de IgG humana nativa, e que têm atividade de ligação a fator reumatoide reduzida, têm uma excelente propriedade pelo fato que as moléculas de ligação a antígeno mostram retenção no plasma prolongada sem aumento de sua atividade de ligação a fator reumatoide e efetivamente reduzem a concentração de antígeno solúvel no organismo vivo.
Exemplo 5 Efeito de eliminação de antígenos do plasma de um organismo vivo administrado com uma molécula de ligação a an- tígeno cuja atividade de ligação a FCYR é maior do que a atividade de ligação de região Fc de IgG de camundongo nativa (5-1) O efeito de eliminação de antígeno do plasma de um organismo vivo administração com um anticorpo de camundongo com atividade de ligação a FCYR aumentada
[01732] Conforme descrito nos Exemplos 1 a 4, foi demonstrado que a eliminação de receptor de IL-6 humano solúvel de plasma de camundongo é acelerado nos grupos de camundongos transgênicos com FcRn humano administrados com moléculas de ligação a antíge- no resultantes de aumento da atividade de ligação a FCYR de camundongo de moléculas de ligação a antígeno que têm uma região de Fc de anticorpo humano e a propriedade de ligação a receptor de IL-6 de uma maneira dependente do pH. Se este efeito é também obtido em camundongos normais tendo FcRn de camundongo que foram admi-nistrados com moléculas de ligação a antígeno que têm uma região Fc de anticorpo de camundongo e propriedade de ligação a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH foi avaliado em camundongos normais tendo FcRn de camundongo como segue.
(5-2) Preparação de anticorpos de camundongo com atividade de ligação a FCYR aumentada
[01733] Para um anticorpo IgG1 de camundongo tendo a propriedade de ligação a receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente do pH, VH3-mIgG1 de cadeia pesada (SEQ ID NO: 128) e VL3- mk1 de cadeia leve (SEQ ID NO: 129) foram construídos usando o método descrito no Exemplo de Referência 2. Entretanto, para aumentar a atividade de ligação a FcyR de camundongo de VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 (SEQ ID NO: 130) foi produzido substituindo Ala por Asp na posição 327 (numeração EU). Da mesma maneira, VH3- mIgG1-mF46 (SEQ ID NO: 131) foi produzido substituindo Ser por Asp na posição 239 e Ala por Asp na posição 327, de acordo com a numeração EU, em VH3-mIgG1. Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1 e Fv4-mIgG1- mF46, que contém VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 e VH3-mIgG1- mF46, respectivamente, como a cadeia pesada, e VL3-mk1 como a cadeia leve, foram preparados usando o método descrito no Exemplo de Referência 2.
(5-3) Avaliação de atividade de ligação a FCYR de camundongo de an- ticorpos de camundongo com atividade de ligação a FCYR aumentada
[01734] VH3/L (WT)/mIgG1, VH3/L (WT)-mIgG1-mF44 e VH3/L (WT)-mIgG1-mF46, que contêm VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 e VH3-mIgG1-mF46, respectivamente, como a cadeia pesada, e L (WT)- CK (SEQ ID NO: 42) como a cadeia leve, foram preparados através do método descrito no Exemplo de Referência 2. Esses anticorpos foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a FcyR de camundongo através do método descrito no Exemplo de Referência 25. O resultado é mostrado na Tabela 10. Ainda, a razão do aumento na atividade de ligação a FcyR de camundongo de cada variante com relação a mIgG1 antes da alteração é mostrada na Tabela 11.
[01735] Tabela 10
Figure img0018
[01736] T Fabela 11
Figure img0019
[01737] O resultado de avaliação do Exemplo 4 mostrando que VH3/L (WT)-mIgG1 tendo a região Fc de anticorpo IgG1 de camundongo nativo se liga apenas a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo, mas não a FcyRI de camundongo e FcyRIV de camun-dongo, sugere que FcyRs de camundongo importantes para a redução de concentração de antígeno são FcyRII de camundongo e/ou FcyRIII de camundongo. VH3/L (WT)-mIgG-mF44 e VH3/L (WT)-mIgG1-mF46 introduzidos com uma alteração que é pensada aumentar a atividade de ligação a FcyR de VH3/L (WT)-mIgG1 foram demonstrados ter atividade de ligação aumentada a ambos FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo.
(5-4) Avaliação do efeito para reduzir a concentração de receptor de IL-6 solúvel no plasma de camundongos normais
[01738] O efeito para eliminar receptor de IL-6 soluvel do plasma de camundongos normais administrados com o anticorpo antirreceptor de IL-6 humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 ou Fv4-mIgG1-mF46 foi avaliado como segue.
[01739] Um modelo animal onde a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel é mantida em um estado uniforme em plasma foi criado através do implante de uma bomba de infusão (MINO-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet) contendo receptor de IL-6 humano solúvel sob a pele nas costas de camundongos normais (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão). A dinâmica in vivo do receptor de IL- 6 humano solúvel após administração do anticorpo antirreceptor de IL- 6 humano foi avaliada no modelo animal. Para suprimir a produção de anticorpos contra receptor de IL-6 humano solúvel, um anticorpo monoclonal C4 anticamundongo foi administrado uma vez a 20 mg/kg na veia caudal. Então, uma bomba de infusão contendo 92,8 μg/ml de receptor de IL-6 humano solúvel foi subcutaneamente implantada nas costas dos camundongos. Três dias após implante da bomba de infusão, o anticorpo antirreceptor de IL-6 humano foi administrado uma vez a 1 mg/kg na veia da cauda. O sangue foi coletado dos camundongos 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, quatro dias, sete dias, 14 dias (ou 15 dias) e 21 dias (ou 22 dias) após administração do anticorpo antirreceptor de IL-6 humano. Imediatamente em seguida, o sangue coletado foi centrifugado a 15.000 rpm e 4° C por 15 minutos para preparar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador ajustado a -20° C ou abaixo até o uso.
[01740] As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foram determinadas através do método descrito em (2-1-2). O resultado é mostrado na Fig. 13.
[01741] Surpreendentemente, foi demonstrado que, em camundongos administrados com mF44 e mF46 introduzidos com uma alteração para aumentar a atividade de ligação de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa) a FcYRIIb de camundongo e FCYRIII de camundongo, a concentração de receptor de IL-6 no plasma foi notadamente reduzida comparado com camundongos administrados com mIgG1. Em particular, mesmo no dia 21 após administração de mF44, a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo administrado com mF44 foi reduzida em cerca de 6 vezes comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo sem administração de anticorpo e cerca de 10 vezes comparado com o grupo administrado com mIgG1. Por outro lado, no dia sete após administração de mF46, a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo administrado com mF46 foi notadamente reduzida cerca de 30 vezes comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo sem administração de anticorpo e cerca de 50 vezes comparado com o grupo administrado com mIgG1.
[01742] As constatações acima demonstram que a eliminação de receptor de IL-6 soluvel do plasma foi também acelerada em camun-dongos administrados com anticorpos onde a atividade de ligação a FcYR de camundongo de uma molécula de ligação a antígeno tendo as regiões Fc de anticorpo IgG1 de camundongo é aumentada, como com anticorpos onde a atividade de ligação a FcYR de camundongo de uma molécula de ligação a antígeno tendo a região Fc de anticorpo IgG1 humano é aumentada. Sem ser limitado a nenhuma teoria particular, o fenômeno observado conforme acima descrito pode ser explicado como segue.
[01743] Quando administrado a camundongos, anticorpos que se ligam a um antígeno solúvel de uma maneira dependente do pH e têm atividade de ligação a FCYR aumentada são ativamente incorporados principalmente a células expressando FCYR na membrana celular. Os anticorpos incorporados dissociam o antígeno solúvel sob uma condição de pH ácido no endossomo, e então reciclados para o plasma via FcRn. Desta maneira, um fator que obtém o efeito de eliminação do plasma de antígeno solúvel de tal anticorpo é o nível de atividade de ligação a FcyR do anticorpo. Especificamente, como a atividade de ligação a FcyR é maior, a incorporação a células expressando FcyR ocorre mais ativamente, e isso torna a eliminação de antígenos solúveis do plasma mais rápida. Ainda, contanto que a atividade de ligação a FcyR tenha sido aumentada, o efeito pode ser avaliado da mesma maneira sem importar se a região Fc contida em um anticorpo se origina de IgG1 humana ou de camundongo. Especificamente, a avaliação pode ser obtida para uma região Fc de quaisquer espécies animais, tal como qualquer uma de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, IgG4 humana, IgG1 de camundongo, IgG2a de camundongo, IgG2b de camundongo, IgG3 de camundongo, IgG de rato, IgG de macaco e IgG de coelho, contanto que a atividade de ligação ao FcyR da espécie animal a ser administrada tenha sido aumentada.
Exemplo 6 O efeito de eliminação de antígeno por anticorpos com a atividade de ligação aumentou de uma maneira seletiva de FcYRIIb (6-1) O efeito de eliminação de antígeno de anticorpos onde a atividade de ligação a FCYR foi seletivamente aumentada
[01744] Camundongos deficientes em FcyRIII (B6.129P2-FcgrFcy R3tm1Sjv/J mouse, Jackson Laboratories) expressam FcyRI de ca-mundongo, FcyRIIb de camundongo e FcyRIV de camundongo, mas não FcyRIII de camundongo. Entretanto, camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc (Fcer1g mouse, Taconic, Cell (1994) 76, 519529) expressam FcyRIIb sozinho, mas não FcyRI de camundongo, FCYRIII de camundongo e FCYRIV de camundongo.
[01745] Conforme descrito no Exemplo 5, foi demonstrado que mF44 e mF46 com atividade de ligação a FcyR aumentada de IgG1 de camundongo nativa mostram ligação seletivamente aumentada a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo. Foi concebido que, usando a atividade de ligação seletivamente aumentada dos anticorpos, a condição sob a qual um anticorpo com ligação a FcyRIIb de camundongo seletivamente aumentada é administrado pode ser imitada administrando mF44 e mF46 a camundongos deficientes em FcyRIII ou camundongos deficientes em cadeia y de receptor Fc que não expressam FcyRIII de camundongo.
(6-2) Avaliação do efeito de eliminação de antígeno em um organismo vivo administrado com um anticorpo com aumento seletivo de ligação a FcYRIIb de camundongo usando camundongos deficientes em FCYRIII
[01746] O efeito para eliminar receptor de IL-6 soluvel de plasma em camundongos deficientes em FcyRIII administrados com o anticorpo antirreceptor de IL-6 humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 ou Fv4-mIgG1-mF46 foi avaliado através do mesmo método descrito no Exemplo 5. As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma dos camundongos foram determinadas através do método descrito no Exemplo (2-1-2). O resultado é mostrado na Fig. 14.
[01747] Surpreendentemente, foi demonstrado que as concentrações de receptor de IL-6 no plasma em camundongos deficientes em FcyRIII administrados com mF44 e mF46, que imitam a condição sob a qual a atividade de ligação a FcyRIIb de camundongo de mIgG1 (IgG1 nativa) é seletivamente aumentada, foram notadamente reduzidas comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma em camundongos administrados com mIgG1. Em particular, a concentração de receptor de IL-6 no plasma do grupo administrado com mF44 foi reduzida cerca de três vezes comparado com aquela do grupo ad-ministrado com mIgG1 e o acúmulo de concentração de anticorpo devido à administração de anticorpo foi suprimida. Entretanto, no dia três após administração, a concentração de receptor de IL-6 no plasma do grupo administrado com mF46 foi notadamente reduzida cerca de seis vezes comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma do grupo sem administração de anticorpo e cerca de 25 vezes comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma do grupo administrado com mIgG1. Este resultado mostra que, como a atividade de ligação a FcYRIIb de camundongo de um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano que se liga ao antígeno de uma maneira dependente do pH é maior, a concentração do receptor de IL-6 pode ser reduzida mais no plasma de camundongos administrados com o anticorpo.
(6-3) Avaliação do efeito de eliminação de antígeno no plasma de um organismo vivo administrado com um anticorpo com aumento seletivo de ligação a FcYRIIb usando camundongos deficientes em cadeia Y de receptor Fc
[01748] O efeito de eliminar receptor de IL-6 soluvel do plasma de camundongos deficientes em cadeia Y de receptor Fc administrados com o anticorpo antirreceptor de IL-6 humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1- mF44 ou Fv4-mIgG1mF46, foi avaliado através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo 5. As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma dos camundongos foram determinadas através do método descrito no Exemplo (2-1-2). O resultado é mostrado na Fig. 15.
[01749] Como com o caso onde mF44 e mF46 foram administrados a camundongos deficientes em FcYRIII, a concentração de receptor de IL-6 no plasma em camundongos deficientes em cadeia Y de receptor Fc administrados com mF44 e mF46, que imitam a condição resultante do aumento seletivo na atividade de ligação a FcYRIIb de camundongo de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa), foi demonstrada ser notada- mente reduzida comparado com a concentração de receptor de IL-6 no plasma nos camundongos deficientes em cadeia Y de receptor Fc ad-ministrados com mIgG1. Em particular, a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo administrado com mF44 foi reduzida para cerca de três vezes aquela no grupo a administrado com mIgG1, e o acúmulo de concentração de antígeno devido à administração de anticorpo foi suprimido. Entretanto, no dia três após administração, a concentração de receptor de IL-6 no plasma no grupo administrado com mF46 foi notadamente reduzida cerca de cinco vezes comparado coma aquela no grupo sem administração de anticorpo e cerca de 15 vezes comparado com aquela no grupo administrado com mIgG1.
[01750] Os resultados descritos nos Exemplo (6-2) e (6-3) mostram que a concentração de antígeno solúvel no plasma é notadamente reduzida no grupo administrado com um anticorpo que se liga a um antí- geno solúvel de uma maneira dependente do pH e tem atividade de ligação a FcyRIIb de camundongo seletivamente aumentada.
Exemplo 7 O efeito de eliminação de antígeno de anticorpos com aumento seletivo de ligação a FCYRIII (7-1) O efeito de eliminação de antígeno no plasma de um organismo vivo administrado com anticorpos com ligação a FCYRIII seletivamente aumentada
[01751] Camundongos deficientes em FcyRIIb (FcgrFcyR2b (FcyRII) mouse) Taconic) (Nature (1996) 379 (6563), 346-349) expressam FcyR de camundongo, FcyRIII de camundongo e FcyRIV de camundongo, mas não FcyRIIb de camundongo. Conforme descrito no Exemplo 5, foi demonstrado que mF44 e mF46 resultantes de aumento da atividade de ligação a FcyR de IgG1 de camundongo nativa mostra ligação seletivamente aumentada a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo. Foi concebido que, com base no uso da ativi- dade de ligação seletivamente aumentada dos anticorpos, a condição de administração de um anticorpo com ligação seletivamente aumentada a FCYRIII de camundongo pode ser imitada administrando mF44 ou mF46 a camundongos deficientes em FcYRIIb que não expressam FcyRIIb de camundongo.
[01752] Conforme descrito no Exemplo 6, a concentração de antí- geno solúvel foi reduzida no plasma de camundongos deficientes em FcyRIII, que imitam a condição de administração de um anticorpo com atividade de ligação a FcyRIIb de camundongo seletivamente aumentada. Entretanto, se a concentração de antígeno solúvel for reduzida no plasma de camundongos deficientes em FcyRIIb, que imitam a condição de administração de um anticorpo com atividade de ligação a FcyRIII de camundongo seletivamente aumentada, foi avaliada através do método descrito abaixo.
(7-2) Avaliação do efeito de eliminação de antígeno através do aumento seletivo de ligação a FCYRIII de camundongo usando camundongos deficientes em FcYRIIIb
[01753] O efeito de eliminar receptor de IL-6 soluvel do plasma de camundongo deficientes em FcyRIIb administrados com um anticorpo antirreceptor de IL-6 humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 ou Fv4- mIgG1mF46, foi avaliado através do mesmo método descrito no Exemplo 5. As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foram determinadas através do método descrito no Exemplo (2-1-2). O resultado é mostrado na Fig. 16.
[01754] Surpreendentemente, nos grupos administrados com mF44 e mF46, que imitam aumento seletivo da atividade de ligação a FcyRIII de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa), a concentração de receptor de IL-6 no plasma foi reduzida, mas a redução não foi confirmada comparado com aquela mostrada no Exemplo 6.
[01755] Sem ser limitado a nenhuma teoria particular, com base nos resultados descritos nos Exemplos 5, 6 e 7, a discussão que segue é possível. A eliminação de receptor de IL-6 soluvel de plasma foi verifi-cada ser notadamente acelerada em camundongos normais expressando ambos FcYRIIb de camundongo e FCYRII de camundongo que foram administrados com mF44 e mF46 com atividade de ligação seletivamente aumentada de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa) a FcYRIIb de camundongo e FcYRIII de camundongo. Ainda, foi revelado que, quando mF44 e mF46 foram administrados a camundongos que expressam FcYRIIb de camundongo, mas não FcYRIII de camundongo (isto é, camundongos deficientes em FcYRIII e camundongos deficientes em cadeia Y de receptor Fc), a eliminação de receptor de IL-6 solu- vel de plasma foi também acelerada notadamente nos camundongos. Entretanto, quando mF44 e mF46 foram administrados a camundongos que expressam FcYRIII de camundongo, mas não FcYRIIb de ca-mundongo (isto é, camundongos deficientes em FcYRII), a eliminação de receptor de IL-6 soluvel do plasma não foi acelerada nos camundongos até o ponto que eles foram administrados em camundongos deficientes em FcYRIII ou camundongos deficientes em cadeia Y de receptor Fc.
[01756] A partir das constatações acima, foi pensado que os anticorpos mF44 e mF46 onde a atividade de ligação de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa) a FcYRIIb de camundongo e FcYRIII de camun-dongo é aumentada são incorporados a células expressando FcYR principalmente por FcYRIIb de camundongo, e então o antígeno solúvel no plasma que se liga aos anticorpos é eliminado. Entretanto, a incorporação mediada por FcYRIII de complexos de anticorpo/antígeno em células expressando FcYR é pensada não contribuir significante- mente para a eliminação do antígeno solúvel do plasma.
[01757] Ainda, conforme mostrado no Exemplo 4, a concentração no plasma de receptor de IL-6 foi notadamente reduzida em camun- dongos administrados com Fv4-IgG1-F1087 tendo atividade de ligação aumentada a FcYRIIb de camundongo e FCYRIII de camundongo, em particular. Entretanto, o efeito para eliminar receptor de IL-6 soluvel do plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1182 com ati-vidade de ligação aumentada a FcYRI de camundongo e FcYRVI de camundongo, em particular, foi mentor do que de Fv4-IgG1-F1087.
[01758] Ainda, conforme mostrado no Exemplo 2, em camundongos administrados com Fv4-IgG1-Fuc cuja atividade de ligação a FcYRIV tinha sido consideravelmente aumentada por ter cadeias de açúcar com teor de fucose baixo (Science (2005) 310 (5753) 1510-1512), a concentração no plasma de receptor de IL-6 soluvel foi reduzida com-parado com aquela em camundongos administrados com Fv4-IgG1; no entanto, o efeito de redução foi tão pequeno quanto duas vezes. Desta maneira, incorporação mediada por FcYRIV de camundongo de anti-corpos a células expressando FcYR é pensada não contribuir signifi- cantemente para a eliminação de antígeno solúvel de plasma.
[01759] Em vista do acima, foi demonstrado que, de vários FcYRs de camundongo, FcYRIIb de camundongo e FcYRIII de camundongo, em particular FcYRIIb de camundongo, desempenham um papel principal em incorporação de anticorpo em células expressando FcYR em camundongos. Desta maneira, seria pensado que mutações a serem introduzidas no domínio de ligação a FcYR de camundongo incluem preferivelmente, mas não estão limitados a, mutações que aumentam a ligação a FcYRIIb de camundongo e FcYRIII de camundongo, em particular, a ligação a FcYRIIb de camundongo.
[01760] As constatações acima demonstram que, em camundongos, a atividade de ligação a FcYRIIb de camundongo e FcYRIII de camundongo, em particular, a atividade de ligação a FcYRIIb dos anti-corpos a serem administrados é mais preferivelmente aumentada para acelerar a eliminação de antígenos solúveis do plasma de um orga- nismo vivo através da sua administração a moléculas de ligação a an- tígeno que se ligam a antígenos solúveis de uma maneira dependente do pH e têm atividade de ligação a FCYR aumentada. Especificamente, quando administradas a um organismo vivo, as moléculas de ligação a antígeno que se ligam a antígenos solúveis de uma maneira dependente do pH e têm atividade de ligação aumentada a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo, em particular atividade de ligação a FcyRIIb aumentada, podem acelerar a eliminação de antígenos solúveis de plasma e reduzir efetivamente a concentração no plasma de antígenos solúveis e, então, as moléculas de ligação a antígeno foram reveladas mostrar uma ação muito eficaz.
Exemplo 8 Avaliação da habilidade de agregação de plaqueta de anticorpos contendo uma região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcYRIIb (8-1) Preparação de anticorpos contendo uma região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcYRIIb
[01761] Conforme descrito no Exemplo de Referência 7, antígenos podem ser eficientemente eliminados do plasma dos organismos vivos através da administração de anticorpos com atividade de ligação a FcyRIIb seletivamente aumentada ao organismo vivo. Ainda, a administração de anticorpos contendo uma região Fc com atividade de ligação a FcyRIIb seletivamente aumentada é pensada ser preferida a partir do ponto de vista de segurança e efeitos colaterais no organismo vivo administrado com tais anticorpos.
[01762] No entanto, a ligação a FcyRIIb de camundongo e ligação a FcyRIII de camundongo são ambas aumentadas em mF44 e mF46, e então o aumento de ligação não é seletivo para FcyRIIb de camundongo. Uma vez que a homologia entre FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo é alta, seria difícil encontrar uma alteração que aumente a ligação seletiva a FcyRIIb de camundongo enquanto distinguindo os dois. Além disso, não há nenhum relato anterior de re-giões Fc com ligação a FcYRIIb de camundongo seletivamente aumen-tada. Também, a homologia entre FcYRIIb humano e FcYRIIa humano (os dois alótipos, 131Arg e 131His) é também conhecida ser alta. Além disso, não há nenhum relato de regiões Fc que contenham uma alteração que aumente a ligação seletiva a FcYRIIb humano enquanto distinguindo os dois (Seung e outros (Mol. Immunol. (2008) 45, 39263933); Greenwood e outros (Eur. J. Immunol. (1993) 23 (5), 10981104). Ainda, a ligação a FcYRIIa foi relatada desempenhar um papel importante em atividade de agregação de plaqueta de um anticorpo (Meyer e outros (J. Thromb. Haemost. (2009), 7 (1), 171-181); Robles- Carrilo e outros (J. Immunol. (2010), 185 (3), 1577-1583)). Em vista desses relatos, é possível que o anticorpo com ligação a FcYRIIa aumentada possa aumentar o risco de desenvolvimento de trombose em um organismo vivo administrado com o mesmo. Desta maneira, se anticorpos com ligação a FcYRIIa aumentada têm uma atividade de agregação de plaqueta aumentada foi avaliado como segue.
(8-2) Avaliação da atividade de ligação a FCYR humano de anticorpos contendo uma região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcYRIIb
[01763] Anticorpos contendo uma região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcYRIIb foram analisados quanto à sua afinidade a FcYRIa, tipo R e FcYRIIa, tipo H, FcYR IIb e FcYRIIIa através do procedimento que segue. Uma cadeia H foi cons-truída para ter, como a região variável de cadeia H de anticorpo, a região variável de anticorpo IL6R-H (SEQ ID NO: 132) contra receptor da interleucina humana que é revelada no WO2009/125825, e como a região constante de cadeia H de anticorpo, IL6R-G1d (SEQ ID NO: 133) que tem G1d resultante da remoção de Gly e Lys C-terminais de IgG1 humana. Então, IL6R-G1d-v3 (SEQ ID NO: 138) foi construído alterando a região Fc de IL6R-G1d pela substituição de Ser por Glu na posição 267 (numeração EU) e Leu por Phe na posição 328 (numeração EU), conforme descrito em Seung e outros (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933). IL6R-L (SEQ ID NO: 135) que é a cadeia L de anticorpo antirreceptor de interleucina 6 humana foi usada como uma cadeia L de anticorpo comum, e expressa em combinação com respectivas cadeias H de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1, e os anticorpos resultantes foram purificados. Em seguida anticorpos contendo IL6R-G1d e IL6R-G1d-v3 como a cadeia pesada são referidos como IgG1 e IgG1-v3, respectivamente.
[01764] Então, a interação entre FCYR e os anticorpos acima foi ci- neticamente analisada usando Biacore T100 (GE Healthcare). O ensaio para a interação foi realizado a 25° C usando HBS-EP+ (GE Healthcare) como um tampão de atividade. O chip usado foi um Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) imobilizado com Proteína A por um método de acoplamento de amino. Cada FcyR diluído com o tampão de atividade foi deixado interagir com os anticorpos de interesse capturados no chip para medir a ligação dos anticorpos a cada FcyR. Após medição, glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) foi reagida para o chip para retirar os anticorpos capturados para repetidamente usar o chip regenerado. Um sensorgrama obtido como um resultado da medição foi analisado usando modelo de ligação Langmuir com Biacore Evaluation Software, e constante de taxa de ligação ka (L/mol/s) e constante de taxa de dissociação kd (l/s) foram calculadas, e a constante de dissociação KD (mol/l) foi calculada a partir desses valores. Os valores KD de IgG1 e IgG1-v3 para cada FcyR são mostrados na Tabela 12 (os valores KD de cada anticorpo para cada FcyR), enquanto os valores KD relativos de IgG1-v3, que são obtidos dividindo KD de IgG1 para cada FcyR pela KD de IgG1-v3 para cada FcyR, são mostrados na Tabela 13. Tabela 12
Figure img0020
Tabela 13
Figure img0021
(8-3) Avaliação da habilidade em agregar plaquetas
[01765] Em seguida, se a afinidade de FcYRIIa aumentada/reduzida do anticorpo contendo a região Fc com a substituição de Ser por Glu na posição 267 e Leu por Phe na posição 328 (numeração EU) na região Fc de IgG1 muda a habilidade de agregação de plaqueta foi avaliada usando plaquetas derivadas de doadores com FcYRIIa tipo H e tipo R. O anticorpo compreendendo como a cadeia leve omalizuma- be_VL-CK (SEQ ID NO: 137) e omalizumabe_VH-G1d (SEQ ID NO: 136) que contém a região variável de cadeia pesada de anticorpo hIgG1 (região constante de IgG1 humana) que se liga a IgE e a região constante de cadeia pesada G1d foi construído usando o método descrito no Exemplo de Referência 2. Ainda, omalizumabe_VH-G1d-v3 (SEQ ID NO: 138) foi construído substituindo Ser por Glu na posição 267 e Leu por PHe na posição 328 (numeração EU) em omalizuma- be_VH-G1d. Omalizumabe-G1d-v3, que contém omalizumabe_VH- G1d-v3 como a cadeia pesada e omalizumabe_VL-CK como a cadeia leve, foi preparado usando o método descrito no Exemplo de Referência 2. Este anticorpo foi avaliado quanto à habilidade de agregação de plaqueta.
[01766] Agregação de plaqueta foi ensaiada usando o agregômetro de plaqueta HEMA TRACER 712 (LMS Co.). Primeiro, cerca de 50 ml de sangue integral foram coletados em uma quantidade fixa em tubos de coleta de sangue evacuados de 4,5 ml contendo 0,5 ml de citrato de sódio 3,8% e este foi centrifugado a 200 g por 15 minutos. O so- brenadante resultante foi coletado e usado como plasma rico em plaqueta (PRP). Após PRP ter sido lavado com tampão A (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, NaHCO3 12 mM, NaH2PO4 0,42 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 5 mM, dextrose 5,55 mM, apirase 1,5 U/ml, BSA 0,35%), o tampão foi substituído com tampão B (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, NaHCO3 12 mM, NaH2PO4 0,42 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 5 mM, dextrose 5,55 mM, CaCl2 2 mM, BSA 0,35%). Isso rendeu plaquetas lavadas em uma densidade de cerca de 300.000/μl. 156 μl das plaquetas lavadas foram separadas em alíquotas em cuvetas de ensaio contendo uma barra de agitação no agregômetro de plaqueta. As plaquetas foram agitadas a 1000 rpm com a barra de agitação nas cuvetas mantidas a 37,0o C no agregômetro de plaqueta. 44 μl do complexo imune de omalizumabe-G1d-v3 e IgE em uma razão molar de 1:1, preparado em concentrações finais de μg/ml e 686 μg/ml, respectivamente, foram adicionados às cuvetas. As plaquetas foram reagidas com o complexo imune por cinco minutos. Então, uma concentração que não permite agregação de plaqueta secundária, difosfato de adenosina (ADP, SIGMA) foi adicionada à mistura de reação para testar se a agregação é aumentada.
[01767] O resultado de agregação de plaqueta para cada doador com uma forma polimórfica de FcYRIIa (R/H ou H/H) obtido a partir do ensaio acima é mostrado nas Figs. 17 e 18, respectivamente. A partir do resultado na Fig. 17, agregação de plaqueta é observada quanto o complexo imune é adicionado às plaquetas de um doador com a forma polimórfica de FcYRIIa (R/H). Entretanto, conforme mostrado na Fig. 18, agregação de plaqueta não foi observada quando o complexo imune é adicionado às plaquetas de um doador com a forma polimórfica de FcYRIIa (H/H).
[01768] Em seguida, ativação de plaqueta foi avaliada usando mar-cadores de ativação. Ativação de plaqueta pode ser medida com base na expressão aumentada de um marcador de ativação tal como CD62p (p-selectina) ou integrina ativa na superfície de membrana de plaqueta. 2,3 μl do imunocomplexo foram adicionados a 7,7 μl das plaquetas lavadas preparadas através do método descrito acima. Após cinco minutos de reação em temperatura ambiente, ativação foi induzida adicionando ADP em uma concentração final de 30 μM, e se o complexo imune aumenta a ativação dependente de ADP foi avaliada. Uma amostra adicionada com tampão de fosfato (pH 7,4) (Gibco), ao invés do complexo imune, foi usada como um controle negativo. Tin- gimento foi realizado adicionando, a cada amostra pós-reação, anticorpo anti-CD62 marcado com PE (BECTON DICKINSON), anticorpo anti-CD61 marcado com PerCP e anticorpo PAC-1 marcado com FITC (BD bioscience). Intensidade de fluorescência para cada tingimento foi medida usando um citômetro de fluxo (FACS CantoII, BD bioscience).
[01769] O resultado sobre expressão de CD62p, obtido através do método de ensaio acima, é mostrado na Fig. 19. O resultado sobre a expressão da integrina ativada é mostrado na Fig. 20. As plaquetas lavadas usadas foram obtidas de uma pessoa saudável com a forma polimórfica FcYRIIa R/H. A quantidade de expressão de ambas CD62p e integrina ativa expressas sobre superfície da membrana da plaqueta, que é induzida pela estimulação de ADP, foi aumentada na presença do complexo imune.
[01770] Os resultados acima demonstram que o anticorpo tendo a região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcYRIIb humana, que é a substituição de Ser por Glu na posição 267 e Leu por Phe na posição 328 (numeração EU) na região Fc de IgG1, promove a agregação de plaquetas expressando FcYRIIa com o alótipo FcYRIIa onde o aminoácido na posição 131 é R, comparado com plaquetas expressando FcYRIIa com a forma polimórfica FcYRIIa onde o aminoácido na posição 131 é H. Isto é, foi sugerido que o risco de desenvolvimento de trombose devido à agregação de plaqueta pode ser aumentado quando um anticorpo contendo uma região Fc introduzida com uma alteração existente que aumenta a ligação a FcYRIIb humano existente é administrado a humanos tendo FcYRIIa tipo R em pelo menos um alelo. Foi mostrado que as moléculas de ligação a antígeno contendo uma região Fc da presente invenção que aumenta a ligação a FcYRIIb mais seletivamente não apenas melhora a retenção do antígeno em plasma, mas também possivelmente resolve os problemas acima. Desta maneira, a utilidade das moléculas de ligação a antígeno da presente invenção é óbvia.
(8-4) Comparação da habilidade de agregação de plaqueta entre um anticorpo (BP230) compreendendo Fc com ligação a FcYRIIb seleti-vamente aumentada e um anticorpo compreendendo uma Fc existente com ligação a FcYRIIb seletivamente aumentada. (8-4-1) Preparação de anticorpos com ligação a FcYRIIb seletivamente aumentada
[01771] Conforme descrito no Exemplo (8-3), foi mostrado que anticorpos com ligação a FcYRIIa aumentada têm habilidade de agregação de plaqueta aumentada e habilidade de ativação de plaqueta aumentada e eles podem aumentar o risco de desenvolvimento de trombose quando administrados a humanos. Entretanto, considerando que dos FcYRs, FcYRIIa sozinho é expresso em plaquetas, é pensado que anticorpos com ligação a FcYRIIb seletivamente aumentada não mostram habilidade de agregação ou habilidade de ativação de plaqueta aumentada ou não aumentam o risco de desenvolvimento de trombose quando administrados a humanos. Para confirmar isso, anticorpos com ligação a FcYRIIb seletivamente aumentada foram realmente testados quanto à sua habilidade de agregação de plaqueta e habilidade de ativação de plaqueta.
[01772] Especificamente, omalizumabe_VH-G1d (SEQ ID NO: 136) e omalizumabe_VL-CK (SEQ ID NO: 137), como a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo hIgG1 (região constante de IgG1 humana) que se liga a IgE, respectivamente, foram produzidos através do método descrito no Exemplo de Referência 2. Então, para seletivamente aumentar a atividade de ligação a FcYRIIb humano de omalizuma- be_VH-G1d, omalizumabe_VH-BP230 (SEQ ID NO: 140) foi produzido substituindo Glu por Asp na posição 233, Gly por Asp na posição 237, Pro por Asp na posição 238, His por Asp na posição 268, Pro por Gly na posição 271, Tyr por Asp na posição 296, Ala por Arg na posição 330 e Lys por Glu naposicao 439 (numeração EU). Da mesma maneira, para aumentar a atividade de ligação a R FcYRIIb e FcYRIIa humanos de omalizumabe_VH-G1d, omalizumabe_VH-G1d-v3 (SEQ ID NO: 138) foi produzido substituindo Ser por Glu na posição 267 e Leu por Phe na posição 328 (numeração EU).
[01773] Omalizumabe-BP230 que compreende omalizumabe_VH- BP230 (SEQ ID NO: 140) como a cadeia pesada e omalizumabe_VL- CK (SEQ ID NO: 137) como a cadeia leve e omalizumabe-G1d-v3 que compreende omalizumabe_VH-G1d-v3 (SEQ ID NO: 138) como a cadeia pesada e omalizumabe_VL-CK (SEQ ID NO: 137) como a cadeia leve foram produzidos usando o método descrito no Exemplo de Referência 2. Esses anticorpos foram avaliados quanto à sua habilidade em agregar e ativar plaquetas.
(8-4-2) Avaliação de omalizumabe-BP230 e omalizumabe-G1d-v3 quanto à sua atividade de ligação a FCYR
[01774] Os resultados da análise sobre a afinidade entre cada FcYR humano e a região Fc de omalizumabe-G1d-v3 resultante do aumento da ligação a FcYRIIb humano de omalizumabe, que é um anticorpo conhecido, são mostrados no Exemplo (8-2). A afinidade da região Fc de omalizumabe-BP230 com cada FcYR humano foi também analisada da mesma maneira, e os resultados são mostrados na Tabela 22.
(8-4-3) Avaliação da habilidade em agregar plaquetas
[01775] Então, omalizumabe-BP230 e omalizumabe-G1d-v3 produzidos conforme descrito no Exemplo (8-4-1) foram ensaiados quanto à sua habilidade usando plaquetas de um doador com a forma polimórfi- ca FcYRIIa (R/H). O resultado do ensaio foi usado para avaliar se a habilidade de agregação de plaqueta é alterada dependendo do nível de afinidade com FcYRIIa.
[01776] Ensaio de agregação de plaqueta foi realizado usando o agregômero de plaqueta HEMA TRACER 712 (LMS Co.). Primeiro, cerca de 50 ml de sangue integral foram preparados através da coleta de quantidades fixas de sangue em tubos de coleta de sangue evacuados de 4,5 ml contendo 0,5 ml de citrato de sódio 3,8% e centrifugados a 200 g por 15 minutos. O sobrenadante resultante foi coletado e usado como plasma rico em plaqueta (PRP) (Platelet-Rich Plasm). Após lavagem de PRP com tampão A (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM), NaHCO3 12 mM, NaH2PO4 0,42 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 5 mM, dextrose 5,55 mM, apirase 1,5 U/mL, BSA 0,35%), o tampão foi mudado com tampão B (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, NaHCO3 12 mM, NaH2PO4 0,42 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 5 mM, dextrose 5,5 mM, CaCl2 2 mM, BSA 0,35%). Isso rendeu plaquetas lavadas em uma densidade de cerca de 300.000/μl. 150,2 μl de plaquetas lavadas foram separados em alíquotas para cuvetas de ensaio contendo uma barra de agitação no agregômero de plaqueta. As plaquetas foram agitadas a 1000 rpm com barras de agitação nas cuvetas mantidas a 37,0 oC no agregôme- ro de plaqueta. 23,4 μl de omalizumabe-G1d-v3 ou omalizumabe- BP230 preparado em uma concentração final de 600 μg/ml foram adicionados às cuvetas. Após um minuto de reação, 25,4 μl de IgE, que foi preparado de maneira que a sua razão molar para o anticorpo fosse 1:1, foi adicionado a ele. As misturas foram incubadas por cinco minutos. Então, em uma concentração que não induz agregação de plaque- ta secundaria, difosfato de adenosina (ADP, SIGMA) foi adicionado à mistura de reação para testar se a agregação é aumentada. As plaquetas lavadas usadas foram obtidas de uma pessoa saudável com a forma polimórfica FcYRIIa R/H.
[01777] O resultado obtido através do método de ensaio descrito acima é mostrado na Fig. 21. O resultado mostrado na Fig. 21 revelou que plaquetas foram fortemente agregadas quando adicionando o complexo imune contendo omalizumabe-G1d-v3. Por outro lado, não houve nenhuma diferença em agregação de plaqueta entre quando PBS foi adicionado e quanto o complexo imune contendo omalizuma- be-BP230 foi adicionado.
[01778] Em seguida, a ativação de plaqueta por omalizumabe-G1d- v3 e omalizumabe-BP230 foi avaliada. Ativação de plaqueta pode ser medida com base na expressão aumentada de um marcador de ativação tal como CD62p (p-selectina) e integrina ativa, sobre a superfície de membrana de plaqueta. 1,22 μl de omalizumabe-G1d-v3 ou oma- lizumabe-BP230 preparado em uma concentração final de 600 μg/ml foi adicionado a 7,51 μl de plaquetas lavadas preparadas através do método descrito acima. Após cinco minutos de reação em temperatura ambiente, 1,27 μl de IgE, que foi preparado de maneira que sua razão molar para o anticorpo fosse 1:1, foi adicionado a ele. Então, após cinco minutos de reação em temperatura ambiente, se ativação de plaqueta é induzida foi avaliado. O controle negativo usado foi uma amostra adicionada com tampão de fosfato (pH 7,4, Gibco), ao invés de complexos imunes. Após reação, cada amostra foi fluorescentemente tingida usando anticorpo anti-CD62 marcado com PE (BECTON DICKINSON), anticorpo anti-CD61 marcado com PerCP e anticorpo PAC-1 marcado com FITC (BD Bioscience) e a intensidade de fluorescência foi determinada usando um citômetro de fluxo (FACS CantoII, BD bioscience). As plaquetas lavadas usadas foram obtidas de uma pessoa saudável com a forma polimórfica FcYRIIa R/H.
[01779] Os resultados obtidos através do método de ensaio descrito acima são mostrados nas Figs. 22 e 23. A expressão de ambas CD62p e integrina ativa sobre a superfície de membrana de plaqueta foi aumentada através da adição de complexo imune contendo oma- lizumabe-G1d-v3. Entretanto, a expressão das moléculas na superfície de membrana da plaqueta através da adição do complexo imune com omalizumabe-BP320 era comparável à expressão na superfície de membrana da plaqueta através da adição do tampão de fosfato.
[01780] Os resultados acima demonstram que o anticorpo que compreende a região Fc modificada existente com substituições de Ser por Glu na posição 267 e Leu por Phe na posição 328 (numeração EU) na região Fc de IgG1, e que aumentou ligação a ambos R FcYRIIb e FcYRIIa, promovem a agregação e ativação de plaquetas onde o aminoácido de posição 131 é Arg em pelo menos um dos alelos para o gene de FcYRIIa polimórfico, comparado com o anticorpo que compre-ende uma região Fc com substituições de Glu por Asp na posição 233, Gly por Asp na posição 237, Pro por Asp na posição 238, His por Asp na posição 268, Pro por Gly na posição 271, Tyr por Asp na posição 296, Ala por Arg na posição 330 e Lys por Glu na posição 439 (numeração EU) e que seletivamente aumentou a ligação a FcYRIIb humano. Especificamente, o anticorpo que compreende a variante da região Fc existente com ligação a FcYRIIb humano aumentada foi sugerido ter um problema que ele pode aumentar o risco de desenvolvimento de trombose devido à agregação de plaqueta em humanos com o alelo de R FcYRIIa; por outro lado, a variante da região Fc com ligação a FcYRIIb seletivamente aumentada foi demonstrada superar este problema.
Exemplo 9 Análise compreensiva de ligação a FcYRIIb de variantes introduzidas com uma alteração na porção de dobra em adi- ção à alteração P238D
[01781] Em uma Fc produzida através da substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp em uma IgG1 humana de ocorrência natural, um efeito combinatorial antecipado não poderia ser obtido mesmo com a sua combinação com outra alteração prevista aumentar mais ligação a FcYRIIb da análise de anticorpos de ocorrência natural. Desta maneira, a fim de encontrar variantes que aumentem mais a ligação a FcYRIIb, alterações foram compreensivamente introduzidas na Fc alterada produzida substituindo Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp. IL6R-F11 (SEQ ID NO: 141) foi produzido introduzindo uma alteração de substituição de Met na posição 252 (numeração EU) com Tyr e uma alteração de substituição de Ans na posição 434 (numeração EU) com Tyr em IL6R-G1d (SEQ ID NO: 133) que foi usado como a cadeia H de anticorpo. Ainda, IL6R-F652 (SEQ ID NO: 142) foi preparado introduzindo uma alteração de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) cm Asp em IL6R-F11. Plasmí- deos de expressão contendo uma sequência de cadeia H de anticorpo foram preparados para cada uma das sequências de cadeia H de anticorpo produzidas substituindo a região próximo do resíduo na posição 238 (numeração EU) (posições 234 a 237 e 239) (numeração EU) em L6R-F652 cada um com 18 aminoácidos excluindo os aminoácidos originais e Cisteína. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) foi utilizado como uma cadeia L de anticorpo. Essas variantes foram expressas e purificadas através do método do Exemplo de Referência 2. Essas variantes Fc são chamadas variantes PD. Interações de cada variante PD com FcYRIIa tipo R e FcYRIIb foram compreensivamente avaliadas através do método do Exemplo de Referência 25.
[01782] Uma figura que mostra os resultados de análise de interação com os respectivos FcYRs foi produzida de acordo com o método que segue. O valor obtido dividindo o valor para a quantidade de liga ção de cada variante PD para cada FCYR pelo valor para a quantidade de ligação de FCYR do anticorpo pé-alterado que é usado como o controle (IL6R-F652/IL6R-L), que tem uma alteração de substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp e então multiplicação do resultado por 100, foi mostrado como o valor de atividade de ligação relativo de cada variante PD para cada FcyR. O eixo horizontal mostra valores relativos da atividade de ligação a FcyRIIb de cada variante PD e o eixo vertical mostra valores relativos dos valores de atividade de ligação a tipo R FcyRIIa de cada variante de PD (Fig. 24).
[01783] Como resultado, foi constatado que a ligação a FcyRIIb de onze tipos de alterações foi aumentada comparado com o anticorpo antes da introdução de alterações, e eles têm efeitos de manutenção ou aumento de ligação a tipo R FcyRIIa. As atividades dessas onze variantes para ligação a R FcyRIIb e FcyRIIa são sumarizadas na Tabela 14. Na tabela, os números de ID de sequência se referem àqueles de cadeias H das variantes e alterações se referem à alteração introduzida em IL6R-F11 (SEQ ID NO: 141) Tabela 14
Figure img0022
[01784] A Fig. 25 mostra valores relativos para a atividade de liga ção a FcyRIIb obtida introduzindo adicionalmente as onze alterações acima em uma variante carregando a alteração P238D e valores relativos para a atividade de ligação a FcyRIIb de uma variante obtida atra vés da introdução das alterações em uma Fc que não contém a P238D. Essas onze alterações aumentaram a quantidade de ligação a FcYRIIb comparado com antes da introdução quanto elas foram introduzidas na variante P238D. Ao contrário, o efeito de diminuição da ligação a FcYRIIb foi observado para oito dessas alterações exceto G237F, G237W e S239D, quando elas foram introduzidas na variante que não contém P238D (dados não mostrados).
[01785] Esses resultados mostraram que, com base nos efeitos de introdução de alterações em uma IgG1 de ocorrência natural, é difícil prever os efeitos de combinação e introdução das mesmas alterações na variante contendo a alteração P238D. Em outras palavras, não seria possível descobrir essas oito alterações identificadas desta vez sem esta investigação que introduz as mesmas alterações que são combinadas e introduzidas na variante contendo a alteração P238D.
[01786] Os resultados de medição dos valores KD das variantes indicadas na Tabela 14 para FcYRIa, FcYRIIaR, FcYRIIaH, FcYRIIb e FcYRIIIaV através do método do Exemplo de Referência 25 são suma- rizados na Tabela 15. Na tabela, alteração se refere à alteração intro-duzida em IL6R-F11 (SEQ ID NO: 141). O molde usado para produção de IL6R-F11, IL6R-G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Ainda, KD (IIaR)/KD (IIb) e KD (IIaH)/KD (IIb) na tabela mostram respectivamente o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcYRIIaR pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb e o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcYRIIaH pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb. KD (IIb) do polipeptídeo parental/KD (IIb) da variante se refere a um valor obtido dividindo o valor KD do polipep- tídeo parental para FcYRIIb pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb.
[01787] Ainda, a Tabela 15 mostra valores KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de cada variante / valo- res KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídeo parental. Aqui, polipeptídeo parental se refere à variante que tem IL6R-F11 (SEQ ID NO: 141) como a cadeia H. Foi determinado que devido à ligação fraca de FCYR à IgG, foi impossível analisar com precisão através de análise cinética, e então as células preenchidas de cinza na Tabela 15 mostram valores calculados usando a Equação 2 do Exemplo de Referência 25. Equação 2
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[01788] A Tabela 15 mostra que todas as variantes aperfeiçoaram sua afinidade com FcyRIIb em comparação com IL6R-F11, e a faixa de aperfeiçoamento foi 1,9 vez a 5,0 vezes. A razão de valor KD de cada variante para FcyRIIaR/valor KD de cada variante para FcyRIIb e a razão de valor KD de cada variante para FcyRIIaH/valor KD de cada variante para FcyRIIb representam uma atividade de ligação a FcyRIIb com relação à atividade de ligação a FcyRIIaR e atividade de ligação a FcyRIIaH, respectivamente. Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcyRIIb, e um valor maior indica uma seletividade de ligação maior para FcyRIIb. Para o poli- peptídeo parental IL6R-F11/IL6R-L, a razão de valor KD para FcyRII- aR/valor KD para FcyRIIb e a razão de valor KD para FcyRIIaH/valor KD para FcyRIIb são ambas 0,7, e desta maneira todas as variantes na Tabela 15 mostraram aperfeiçoamento de seletividade de ligação para FcyRIIb em comparação com o polipeptídeo parental. Quando o valor KD para a mais forte das atividades de ligação de FcyRIIaR e FcyRIIaH de uma variante / valor KD para a mais forte das atividades de ligação para FcyRIIaR e FcyRIIaH do polipeptídeo parental é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de ligação a FcyRIIaR e FcyRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou reduzida comparado com a ligação pela mais forte das atividades de li gação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídeo parental. Uma vez que este valor era 0,7 a 0,5 para as variantes obtidas desta vez, pode ser dito que a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH das variantes obtidas desta vez era quase a mesma ou menor em comparação com o polipeptídeo parental. Esses resultados mostraram que comparado com o polipeptídeo parental, as variantes obtidas desta vez mantiveram ou diminuíram as atividades de ligação a FcYRIIa tipo R e tipo H e aumentaram a atividade de ligação a FcYRIIb e então têm seletividade aperfeiçoada para FcYRIIb. Ainda, comparado com IL6R-F11, todas as variantes tinham afinidade menor com FcYRIa e FcYRIIIaV. Tabela 15
Figure img0024
EXEMPLO 10
[01789] Conforme indicado anteriormente no Exemplo 9, mesmo uma alteração que é prevista a partir da análise de anticorpos IgG1 de ocorrência natural melhorar atividade de ligação a FcYRIIb ou seletivi-dade para FcYRIIb sendo introduzida em uma Fc contendo P238, a atividade de ligação a FcYRIIb foi verificada diminuir, e a razão para isso pode ser que a estrutura na interface de interação entre Fc e FcYRIIb é modificada devido à introdução de P238D. Desta maneira, para buscar a razão para este fenômeno, a estrutura tridimensional do complexo formado entre uma Fc de IgG1 contendo a mutação P238D (daqui em diante referida como Fc (P238D)) e a região extracelular de FcYRIIb foi elucidada por análise de estrutura de cristal de raios-X e isso foi comparado com a estrutura tridimensional do complexo formado entre a Fc de uma IgG1 de ocorrência natural (daqui em diante referida como Fc (WT)) e a região extracelular de FcYRIIb, e os modos de ligação foram comparados. Múltiplos relatos foram feitos sobre a estrutura tridimensional de um complexo formato entre uma Fc e uma região extracelular de FcYR; e as estruturas tridimensionais do complexo Fc (WT) / região extracelular de FcYRIIIb (Nature (2000) 400, 267-273; J. Biol. Chem. (2011) 276, 16469-16466, o complexo Fc (WT) / região extracelular de FcYRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108, 12669-126674) e o complexo Fc (WT) / região extracelular de FcYRIIa (J. Immunol. (2011) 187, 3208-3217) foram analisadas. Embora a estrutura tridimensional do complexo Fc (WT) / região extracelular de FcYRIIb não tenha sido analisada, a estrutura tridimensional de um complexo formado com Fc (WT) é conhecida para FcYRIIa e FcYRIIb, e suas regiões extracelulares são 93% compatíveis em sequência de aminoácido e têm homologia muito alta. Desta maneira, a estrutura tridimensional do complexo Fc (WT) / região extracelular de FcYRIIb foi prevista através de modelagem usando a estrutura de cristal do com plexo Fc (WT) / região extracelular de FcYRIIa.
[01790] A estrutura tridimensional do complexo Fc (P238) / região extracelular de FcYRIIb foi determinada através de análise de estrutura de cristal de raios-X em resolução de 2,6 Â. A estrutura obtida como um resultado desta análise é mostrada na Fig. 26. A região extracelu- lar de FcYRIb é ligada entre dois domínios de CH2 de Fc e isso era similar às estruturas tridimensionais de complexos formados entre Fc (WT) e a respectiva região extracelular de FcYRIIIa, FcYRIIIb ou FcYRIIa analisada até agora. Em seguida, para comparação detalhada, a estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D) / região extrace- lular de FcYRIIb e a estrutura modelo do complexo de Fc (WT) / região extracelular FcYRIIb foram superpostas pelo ajuste dos quadrados mí-nimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα com relação à região extracelular de FcYRIIb e o domínio A de CH2 de Fc (Fig. 27). Neste caso, o grau de sobreposição entre os domínios B de CH2 d eFc não foi satisfatório, e diferenças conformacionais foram encontradas nesta porção. Ainda, usando a estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D) / região extracelular de FcYRIIb e a estrutura modelo do complexo de Fc (WT) / região extracelular de FcYRIIb, pares de átomos que têm uma distância de 3,7 Â ou menos entre a região extrace- lular de FcYRIIb e domínio B de CH2 de Fc foram extraídos e comparados a fim de comparar a interação interatômica entre FcYRIIb e domínio B de CH2 de Fc (WT) com a interação interatômica entre FcYRIIb e (P238D) de Fc. Conforme mostrado na Tabela 16, as interações interatômicas entre domínio B de CH2 de Fc e FcYRIIb em Fc (P238D) e Fc (WT) não eram compatíveis. Tabela 16
Figure img0025
[01792] Ainda, as estruturas detalhadas em torno de P238D foram comparadas através de superposição de estrutura de cristal de raios-X do complexo Fc (P238D) / região extracelular FcYRIIb na estrutura modelo do complexo Fc (WT) / região extracelular FcYRIIb usando o método dos quadrados mínimos com base na distância atômica entre de Cα entre os domínios A e B de CH2 de Fc sozinhos. Como a posição do resíduo de aminoácido na posição 238 (numeração EU), isto é, uma posição de mutagênese de Fc (P238D), é alterada de Fc (WT), a estrutura de alça em torno do resíduo de aminoácido na posição 238 seguindo a região de dobra é verificada ser diferente entre Fc (P238D) e Fc (WT) (Fig. 28). Pro na posição 238 (numeração EU) está origi-nalmente localizado dentro de Fc (WT), formando um núcleo hidrofóbi- co com resíduos em torno da posição 238. No entanto, se Pro na posição 238 (numeração EU) é alterado para altamente hidrofílico e Asp carregado, a presença do resíduo Asp alterado no núcleo hidrofóbico é energeticamente desvantajosa em termos de dessolvação. Desta ma-neira, em Fc (P238D), para cancelar esta situação energeticamente desvantajosa, o resíduo de aminoácido na posição 238 (numeração EU) muda sua orientação para facear a lateral do solvente, e isso pode ter causado esta mudança em estrutura da alça próximo do resíduo de aminoácido na posição 238. Ainda, uma vez que esta alça não está distante da região de dobra reticulada por uma ligação S-S, sua mudança estrutural não será limitada a uma mudança local, e afetará o posicionamento relativo do domínio A e do domínio B de FcCH2. Como resultado, as interações interatômicas entre FcYRIIb e domínio B de CH2 de Fc foram mudadas. Desta maneira, efeitos previstos não puderam ser observados quando alterações que melhoram seletividade e atividade de ligação com relação a FcYRIIb em uma IgG de ocorrência natural foram combinadas com uma Fc contendo a alteração P238D.
[01793] Ainda, como um resultado de mudanças estruturais devido à introdução de P238D em domínio A de CH2 de Fc, uma ligação hi-drogênio foi encontrada entre a cadeia principal de Gly na posição 237 (numeração EU), que está adjacente a P238D mutada, e Tyr na posição 160 em FcYRIIb (Fig. 29). O resíduo em FcYRIIa que corresponde a este Tyr 160 é Phe; e quando a ligação é com FcYRIIa, esta ligação hidrogênio não é formada. Considerando que o aminoácido na posição 160 é uma das poucas diferenças entre FcYRIIa e FcYRIIb na interface de interação com Fc, a presença desta ligação hidrogênio que é espe- cífica para FcYRIIb é presumida ter levado a aperfeiçoamento de ativi-dade de ligação a FcYRIIb e diminuição de atividade e ligação a FcYRIIa em Fc (P238D) e aperfeiçoamento de sua seletividade. Ainda, em domínio B de CH2 de Fc, uma interação eletrostática é observada entre Asp na posição 270 (numeração EU) e Arg na posição 131 em FcYRIIb (Fig. 30). Em FcYRIIa tipo H, que é um dos alótipos de FcYRIIa, o resíduo correspondendo a Aar na posição 131 de FcYRIIb é His, e então não pode formar esta interação eletrostática. Isso pode explicar o porquê da atividade de ligação a Fc (P238D) ser diminuída em FcYRIIa tipo H comparado com FcYRIIa tipo R. Observações baseadas em tais resultados de análise de estrutura de cristal de raios-X mostraram que a mudança da estrutura de alça próximo de P238D devido à introdução de P238D e a mudança acompanhante no posicionamento de domínio relativo causa formação de novas interações que não são encontradas na ligação de IgG e FcYR de ocorrência natural e isso poderia levar a um perfil de ligação seletivo de variantes P238D para FcYRIIb.
Expressão e purificação de Fc (P238D)
[01794] Uma Fc contendo a alteração P238D foi preparada como segue. Primeiro, Cys na posição 220 (numeração EU) de hIL6R-IgG1- v1 (SEQ ID NO: 143) foi substituído com Ser. Então, sequência genética de Fc (P238D) de Glu na posição 236 (numeração EU) a seu terminal C foi clonado por PCR. Usando esta sequência genética clona- da, produção de vetores de expressão e expressão e purificação de Fc (P238D) foram realizadas de acordo com o método dos Exemplos de Referência 1 e 2. Cys na posição 220 (numeração EU) forma uma ligação dissulfeto com Cys da cadeia L em IgG1 geral. A cadeia L não é co-expressa quando Fc sozinha é preparada, e, então, o resíduo ciste- ína foi substituído com Ser para evitar formação de ligações dissulfeto desnecessárias.
Expressão e purificação da região extracelular de FcYRIIb
[01795] A região extracelular de FcYRIIb foi preparada de acordo com o método do Exemplo de Referência 25.
Purificação do complexo Fc (P238D) / região extracelular de FcYRIIb
[01796] A 2 mg da amostra de região extracelular de FcYRIIb obtida para uso em cristalização, 0,29 mg de Endo F1 (Protein Science (1996) 5: 2617-2622) expressa e purificada a partir de Escherichia coli como uma proteína de fusão glutationa S-transferase foi adicionado. Isso foi deixado permanecer em temperatura ambiente por três dias em um tampão de Bis-Tris 0,1M em pH 6,5 e o oligossacarídeo N- ligado foi clivado, exceto N-acetilglicosamina diretamente ligada a Asn da região extracelular FcYRIIb. Em seguida, a amostra de região ex- tracelular de FcYRIIb submetida a tratamento de clivagem de carboidrato, que foi concentrada através de ultrafiltragem com 5000 MWCO, foi purificada através de cromatografia de filtragem em gel (Super- dex200 10/300) usando uma coluna equilibrada em HEPES 20 mM em pH 7,5 contendo NaCl 0,05M. Ainda, à fração de região extracelular de FcYRIIb clivada com carboidrato, Fc (P238D) foi adicionada de maneira que a razão molar da região extracelular de FcYRIIb estaria presente em ligeiro excesso. A mistura concentrada através de ultrafiltragem com 10.000 MWCO foi submetida à purificação através de cromatogra- fia de filtragem em gel (Superdex200 10/300) usando uma coluna equilibrada em HEPES 20 mM em pH 7,5 contendo NaCl 0,05M. Desta maneira, uma amostra do complexo Fc (P238D) / região extracelular FcYRIIb foi obtida.
Cristalização do complexo de Fc (P238D) / região extracelular FcYRIIb
[01797] Usando a amostra do complexo de Fc (P238D) / região ex- tracelular FcYRIIb que foi concentrado para aproximadamente 10 mg/mL através de ultrafiltragem com 10.000 MWCO, cristalização do complexo foi realizada através do método de difusão de vapor de gota assentada (sitting drop). Hydra II Plus One (MATRIX) foi usado para cristalização; e para uma solução de reservatório contendo Bis-Tris 100 mM pH 6,5, PEG3350 17%, acetato de amônio 0,2% e D- Galactose 2,7% (p/v), uma gota de cristalização foi produzida misturando em uma razão de solução de reservatório : amostra de cristalização = 0,2 μl : 0,2 μl. A gota de cristalização após vedação foi deixada permanecer a 20° C e então cristais tipo placa fina foram obtidos.
Medição de dados de difração de raios-X de um cristal do complexo de Fc (P238D) / região extracelular FcYRIIb
[01798] Um dos cristais simples obtidos do complexo de Fc (P238D) / região extracelular FcYRIIb foi embebido em uma solução de Bis-Tris 100 mM pH 6,5, PEG3350 20%, acetato de amônio, D- Galactose 2,7% (p/v), etileno glicol 22,5% (v/v). O cristal simples foi pescado da solução usando um pino com alça de náilon fina presa e congelado em nitrogênio líquido. Então, os dados de difração de raio-X do cristal foram medidos em instalação de radiação sincrotron Photon Factory BL-1A em High Energy Accelerator Research Organization. Durante a medição, o cristal foi constantemente posto em uma corrente de nitrogênio a -178° C para manter em um estado congelado, e um total de 225 imagens de difração de raios-X foi coletado usando Quantum 270 CCD detector (ADSC) preso a uma linha de feixe com rotação do cristal 0,8° de cada vez. Determinação de parâmetros celulares, indexação de pontos de difração e processamento de dados de difra- ção a partir das imagens de difração obtidas foram realizados usando o programa Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) e Scala (CCP4 Software Suite); e, finalmente, dados de intensidade de difração do cristal até resolução de 2,46 Â foram obtidos. O cristal pertence ao grupo espacial P21 e tem os parâmetros celulares que seguem: a = 48,85 Â, b = 76,01 Â, c = 115,09 Â, α = 90°, β = 100,70°, Y = 90°.
Análise da estrutura de cristal de raios-X do complexo de Fc (P238D) / região extracelular FcYRIIb
[01799] A estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D) / região extracelular FcYRIIb foi determinada através do método de substituição molecular usando o programa Phaser (CCP5 Software Suite). A partir do tamanho do látice de cristal obtido e do peso molecular do complexo de Fc (P238D) / região extracelular FcYRIIb, o número de complexos em unidade assimétrica foi previsto ser um. A partir das coordenadas estruturais de código PDB: 3SGJ que é a estrutura de cristal do complexo de Fc (WT) / região extracelular FcYRIIb, as porções de re-síduo de aminoácido das posições 239-340 da cadeia A e posições 239-340 da cadeia B foram consideradas como coordenadas separadas e elas foram ajustadas respectivamente como modelos para pesquisa dos domínios CH de Fc. As porções de resíduo de aminoácido das posições 341-444 da cadeia A e das posições 341-443 da cadeia B foram consideradas como um conjunto único de coordenadas das mesmas coordenadas estruturais de código PDB: 3SGJ; e isso foi ajustado como um modelo para pesquisa dos domínios CH3 de Fc. Finalmente, a partir das coordenadas estruturais de código PDB: 2FCB que é uma estrutura de cristal da região extracelular de FcYRIIb, as porções de resíduo de aminoácido das posições 6-178 da cadeia A foram consideradas e ajustadas como um modelo para pesquisa da região extracelular de FcYRIIb. A orientação e a posição de cada modelo de pesquisa no látice de cristal foram determinadas na ordem do domínio CH3 de Fc, região extracelular de FcYRIIb, e domínio CH2 de Fc, com base na função de rotação e função de translação para obter o modelo inicial para a estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D) / região extracelular de FcYRIIb. Quando refinamento de corpo rígido que move os dois domínios CH2 de Fc, os dois domínios CH3 de Fc e a região extracelular de FcYRIIb foi realizado no modelo inicial obtido, o fator de confiabilidade cristalográfica, valor R se tornou 40,4%, e o valor R Livre se tornou 41,9% para dados de intensidade de difração de 25 Â a 3,0 Â neste ponto. Ainda, refinamento estrutural usando o programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) e revisão do modelo para observar os mapas de densidade de elétron cujo coeficiente tem 2Fo- Fc ou Fo-Fc, que são calculados com base no fator Fo estrutural experimentalmente determinado, no fator Fc estrutural calculado e na fase calculada usando o modelo, foi realizado através do programa Coot (Paul Emsley). Refinamento de modelo foi realizado através de repetição dessas etapas. Finalmente, como um resultado de incorporação de moléculas de água no modelo baseado em mapas de densidade de elétron que usam 2Fo-Fc ou Fo-Fc como o coeficiente, e seguindo refinamento, o fator de confiabilidade cristalográfica, valores R e o valor R Livre do modelo contendo 4846 átomos de não hidrogênio se tornaram 23,7% e 27,6% para 24291 dados de intensidade de difração de resolução de 25 Â a 2,6 Â, respectivamente.
Produção de uma estrutura modelo do complexo Fc (WT) / região extracelular de FcYRIIb
[01800] Com base nas coordenadas estruturais de código PDB: 3RY6 que é uma estrutura de cristal do complexo Fc (WT) / região ex- tracelular de FcYRIIa, a função Build Mutants do Discovery Studio 3.1 program (Accelrys) foi usado para introduzir mutações para serem compatíveis com a sequência de aminoácido de FcYRIIb em FcYRIIa nessas coordenadas estruturais. Neste caso, o Nível de Otimização foi ajustado para Alto, o Raio de Corte foi ajustado para 4,5, cinco modelos foram gerados e o um com o melhor score de energia de todos eles foi determinado como a estrutura modelo para o complexo Fc (WT) / FcYRIIb.
Exemplo 11 Análise de ligação a FcYRIIb de variantes Fc cujos sítios de alteração foram determinados com base em estruturas de cristal
[01801] Com base nos resultados de análise de estrutura de cristal de raios-X no complexo formado entre Fc (P238D) e a região extrace- lular de FcYRIIb obtido no Exemplo 10, variantes foram construídas introduzindo compreensivamente alterações em sítios na Fc alterada tendo substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp que foram previstas afetar interação com FcYRIIb (resíduos de posições 233, 240, 241, 263, 265, 266, 267, 268, 271, 273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332 e 334 (numeração EU) e se combinações de alterações que aumentam mais a ligação de FcYRIIb em adição à alteração P238D podem ser obtidas foi examinado.
[01802] IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144) foi produzido introduzindo em IL6R-G1d (SEQ ID NO: 134) a alteração produzida substituindo Lys na posição 439 (numeração EU) com Glu. Em seguida, IL6R-BF648 foi produzido através da introdução em IL6R-B3 da alteração produzida pela substituição de Pro na posição 238 (Numeração EU) com Asp. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) foi utilizado como a cadeia de anticorpo comum. Essas variantes de anticorpo expressas foram purificadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 2. A ligação dessas variantes de anticorpo a cada um dos FcYRs (FcYRIa, FcYRIIa tipo H, FcYRIIa tipo R, FcYRIIb e FcYRIIIa tipo V) foi compreensivamente avaliada através do método do Exemplo de Referência 25.
[01803] Uma figura foi produzida de acordo com o método que segue para mostrar os resultados de análise de interações com os respectivos FcYRs. O valor para a quantidade de ligação de cada variante a cada FcYRIIb foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação do anticorpo controle pré-alterado (IL6R-BF648/IL6R-L, alteração através da substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp) a cada FCYR, e o obtido foi então multiplicado por 100 e mostrado como o valor de atividade de ligação relativo de cada variante a cada FCYR. O eixo horizontal mostra o valor de atividade de ligação relativo de cada variante a FcyRIIb e o eixo vertical mostra o valor de atividade de ligação relativo de cada variante a FcyRIIa tipo R (Fig. 31).
[01804] Conforme mostrado na Fig. 31, os resultados mostram que de todas as alterações, 24 tipos de alterações foram verificados manter ou aumentar ligação a FcyRIIb em comparação com o anticorpo pré-alterado. A ligação dessas variantes a cada um dos FcyRs é mostrada na Tabela 17. Na tabela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). O molde usado para produção de IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L é indicado com um asterisco (*). Tabela 17
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[01806] Os resultados de medição de valores de KD das variantes mostradas na Tabela 17 para FcYRIa, FcYRIIaR, FcYRIIaH, FcYRIIb e FcYRIIIa tipos V através do método do Exemplo de Referência 25 são sumarizados na Tabela 18. Na tabela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). O molde usado para produção de IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Ainda, KD (IIaR)/KD (IIb) e KD (IIaH)/KD (IIb) na tabela respectivamen- te representam o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcYRIIaR pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb e o valor obtido dividindo o valor KF de cada variante para FcYRIIaH pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb. KD (IIb) do polipeptídeo parental / KD (IIb) do polipeptídeo alterado se refere ao valor obtido dividindo o valor KD do polipeptídeo parental para FcYRIIb pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb. Ainda, o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de cada variante / valor KD para a mais forte das atividades de FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídeo parental são mostrados na Tabela 18. Aqui, polipeptídeo parental se refere à variante que tem IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144) como a cadeia H. Foi determinado que devido à ligação fraca de FcYR a IgG1, foi impossível analisar com precisão através de análise cinética, e então as células preenchidas de cinza na Tabela 18 mostram valores calculados usando a Equação 2 do Exemplo de Referência 25.
[01807] Equação 2
[01808]
Figure img0027
Tabela 18
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[01810] A Tabela 18 mostra que em comparação com IL6R-B3, todas as variantes mostraram aperfeiçoamento de afinidade com FcYRIIb, e a faixa de aperfeiçoamento foi 2,1 vezes a 9,7 vezes. A razão de valor KD de cada variante para FcYRIIaR / valor KD de cada variante para FcYRIIb e a razão de valor KD de cada variante para FcYRIIaH / valor KD de cada variante para FcYRIIb representa uma atividade de ligação a FcYRIIb relativa à atividade de ligação a FcYRII- aR e atividade de ligação a FcYRIIaH, respectivamente. Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcYRIIb e um valor maior indica uma seletividade de ligação maior para FcYRIIb. Uma vez que a razão de valor KD para FcYRIIaR / valor KD para FcYRIIb e a razão de valor KD para FcYRIIaH / valor KD para FcYRIIb no polipeptídeo parental IL6R-B3/IL6R-L foram 0,3 e 0,2, respectivamente, todas as variantes na Tabela 18 mostraram aperfeiçoamento de seletividade de ligação a FcYRIIb em comparação com o polipeptídeo parental. Quando o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante / valor KD para a mais fortes das atividade de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídeo parental é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou menor comparado com a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídeo parental. Uma vez que esse valor era 4,6 a 34,0 para as variantes obtidas desta vez, pode ser dito que em comparação com o polipeptídeo parental, as variantes obtidas desta vez tinham ligação reduzida pela mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH. Esses resultados mostraram que comparado com o polipeptídeo parental, as variantes obtidas desta vez mantiveram ou diminuíram atividades de ligação a FcYRIIa tipo R e tipo H, aumentaram a atividade de ligação a FcYRIIb e melhoraram a seletividade para FcYRIIb. Ainda, comparado com IL6R-B3, todas as variantes tiveram afinidade menor com FcYRIa e FcYRIIIaV.
[01811] Com relação às variantes promissoras dentre as variantes de combinação obtidas, os fatores que levam a esses efeitos foram estudados usando a estrutura de cristal. A Fig. 32 mostra a estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D) / região extracelular de FcYRIIb. Nesta figura, a cadeia H posicionada no lado esquerdo é a Cadeia A de Fc e a cadeia H posicionada no lado direito é a Cadeia B de Fc. Aqui, pode ser visto que o sítio na posição 233 (numeração EU) na Cadeia A de Fc está localizada próximo de Lys na posição 113 de FcYRIIb. No entanto, nesta estrutura de cristal, a cadeia lateral E233 está em uma condição de mobilidade consideravelmente alta e sua densidade de elétron não é bem observada. Desta maneira, a alteração produzida pela substituição de Glu na posição 233 (numeração EU) com Asp leva à diminuição no grau de liberdade da cadeia lateral uma vez eu a cadeia lateral se torna um carbono mais curto. Como resultado, a perda de entropia quando formando uma interação com Lys na posição 113 de FcYRIIb pode ser diminuída e, consequentemente, isso é especulado contribuir para aperfeiçoamento de ligação livre de energia.
[01812] Similarmente, a Fig. 33 mostra o ambiente próximo do sítio na posição 330 (numeração EU) na estrutura do complexo de Fc (P238D) / FcYRIIb. Esta figura mostra que o ambiente em torno do sítio na posição 330 (numeração EU) da Cadeia A de Fc de Fc (P238D) é um ambiente hidrofílico composto de Ser na posição 85, Glu na posição 86, Lys na posição 163 e similar de FcYRIIb. Desta maneira, a alteração produzida pela substituição de Ala na posição 330 (numeração EU) com Lys ou Arg é especulada contribuir para o fortalecimento da interação com Ser na posição 85 ou Glu na posição 86 em FcYRIIb.
[01813] A Fig. 34 mostra as estruturas de Pro na posição 271 (nu meração EU) da Cadeia B de Fc após superposição das estruturas de cristal do complexo de Fc (P238D) / região extracelular de FcYRIIb e o complexo de Fc (WT) / FcYRIIIa pelo ajuste de quadrados mínimos com base nas distâncias de par de átomo de Cα com relação à Cadeia B de Fc. Essas duas estruturas são bastante compatíveis, mas têm estruturas tridimensionais diferentes de Pro na posição 271 (numeração EU). Quando a densidade de elétron fraca em torno desta área na estrutura de cristal do complexo de Fc (P238D) / região extracelular de FcYRIIIb é também levada em consideração, é sugerido que há possibilidade que Pro na posição 271 (numeração EU) em Fc (P238D) / FcYRIIb cause um grande estiramento na estrutura, desta maneira perturbando a estrutura da alça na obtenção de uma estrutura ótima. Desta maneira, a alteração produzida substituindo Pro na posição 271 (numeração EU) com Gly dá flexibilidade a esta estrutura de alça, e é especulada contribuir para aumento de ligação através de redução da barreira energética quando permitindo que uma estrutura ótima se forme durante interação com FcYRIIb.
Exemplo 12 Exame do efeito combinatorial de alterações que au-mentam a ligação a FcYRIIb quando combinadas com P238D
[01814] Das alterações obtidas nos Exemplos 9 e 11, aquelas que aumentaram a ligação a FcYRIIb ou mantiveram a ligação a FcYRIIb e mostraram efeitos de supressão da ligação a outros FcYRs foram combinadas umas com as outras, e seu efeito foi examinado.
[01815] Alterações particularmente boas selecionadas das Tabelas 14 e 18 foram introduzidas na cadeia H de anticorpo IL6R-BF648 de uma maneira similar ao método do Exemplo 11. IL6R-L foi utilizado como a cadeia L de anticorpo, os anticorpos expressos foram purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. A ligação a cada um dos FcYRs (FcYRIa, FcYRIIa tipo H, FcYRIIa tipo R, FcYRIIb e FcYRIIIa tipo V) foi compreensivamente avaliada através do método do Exemplo de Referência 25.
[01816] De acordo com o método que segue, atividades de ligação relativas foram calculadas para os resultados de análise de interações com os respectivos FCYRS. O valor para a quantidade de ligação de cada variante a cada FCYR foi dividido pelo valor para a quantidade de ligação do anticorpo controle pré-alterado (IL6R-BF648/IL6R-L com substituição de Pro na posição 238 (numeração EU) com Asp para cada FcyR, e multiplicado por 100; e então o valor foi mostrado como o valor de atividade de ligação relativa de cada variante para cada FcyR (Tabela 19).
[01817] Na tabela, alteração se refere à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). O molde usado para produção de IL6R- B3, IL6R-G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Tabela 19-1
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[01818] A Tabela 19-2 é uma tabela continuação da Tabela 19-1. Tabela 19-2
Figure img0030
[01819] Os resultados de medição dos valores KD das variantes mostradAs na Tabela 19 para FcYRIa, FcYRIIaR, FcYRIIaH, FcYRIIb e FcYRIIIa tipos V através do Método do Exemplo de Referência 25 são sumarizados nas Tabelas 20-1 e 20-2. Na tabela, alteração refere-se à alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). O molde usado para produção de IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, é indicado com um asterisco (*). Ainda, KD (IIaR)/KD (IIb) e KD (IIaH)/KD (IIb) na tabela respectivamente representam o valor obtido dividindo o valor KD da variante para FcYRIIaR pelo valor KD da variante para FcYRIIb e o valor obtido através da divisão do valor KD da variante para FcYRIIaH pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb. KD (IIb) do polipeptídeo parental / KD (IIb) do polipeptídeo alterado se refere ao valor obtido pela divisão do valor KD do polipeptídeo parental para FcYRIIb pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb. Ainda, o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de cada variante / valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídeo parental são mostrados nas Tabelas 20-1 e 20-2. Aqui, polipeptídeo parental se refere à variante que tem IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144) como a cadeia H. Foi determinado que devido à ligação fraca de FcYR à IgG, foi impossível analisar precisamente através de análise cinética, e então os valores de células preenchidas de cinza nas Tabelas 20-1 e 20-2 mostram valores calculados usando a Equação 2 do Exemplo de Referência 25.
[01820] Equação 2
Figure img0031
[01821] As Tabelas 20-1 e 20-2 mostram que em comparação com IL6R-B3, todas as variantes mostraram aperfeiçoamento de afinidade com FcYR e a faixa de aperfeiçoamento foi 3,0 vezes a 99,0 vezes. A razão de valor KD de cada variante para FcYRRIIaR / valor KD de cada variante para FcYRIIb e a razão de valor KD de cada variante para FcYRIIaH / valor KD de cada variante para FcYRIIb representa uma atividade de ligação a FcYRIIb relativa à atividade de ligação a FCYRII- aR e atividade de ligação a FcYRIIaH, respectivamente. Isto é, esses valores mostram o grau de seletividade de ligação de cada variante para FcYRIIb e um valor maior indica uma seletividade de ligação maior para FcYRIIb. Uma vez que a razão de valor KD para FcYRIIaR / valor KD para FcYRIb e a razão de valor KD para FcYRIIaH / valor KD para FcYRIIb do polipeptídeo parental IL6R-B3/IL6R-L foram 0,3 e 0,2, respectivamente, todas as variantes nas Tabelas 20-1 e 20-2 mostram aperfeiçoamento de seletividade de ligação para FcYRIIb em comparação com o polipeptídeo parental. Quando o valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante / valor KD para a mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídeo parental é 1 ou mais, isso significa que a mais forte das atividades de FcYRIIaR e FcYRIIaH de uma variante tem ligação equivalente ou menor comparado com a ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH do polipeptídeo parental. Uma vez que esse valor foi 0,7 a 29,9 para as variantes obtidas desta vez, pode ser dito que ligação pela mais forte das atividades de ligação a FcYRIIaR e FcYRIIaH das variantes obtidas desta vez era quase equivalente ou menor comparado com aquela do polipeptídeo parental. Esses resultados mostraram que comparado com o polipep- tídeo parental, as variantes obtidas desta vez mantiveram ou diminuíram as atividades de ligação a FcYRIIa tipo R e tipo H, aumentaram a atividade de ligação a FcYRIIb e melhoraram a seletividade para FcYRIIb. Ainda, comparado com IL6R-B3, todas as variantes tinham afinidade menor com FcYRIa e FcYRIIIaV. Tabela 20-1
Figure img0032
[01823] A Tabela 20-2 é uma tabela continuação da Tabela 20-1. Tabela 20-2
Figure img0033
Exemplo 13 Preparação de variantes com ligação a FcγRIIb au mentada
[01824] Conforme mostrado no Exemplo 8, quando aumentando a ligação a FcYRIIb, é preferível que a ligação a FcYRIIb seja aumentada enquanto suprimindo ao máximo a ligação a outros FCYRS de ativação. Desta maneira, os presentes inventores adicionalmente produziram variantes com ligação a FcYRIIb aumentada ou seletividade aperfeiçoada para FcYRIIb através da combinação de alterações que aumentam a ligação a FcYRIIb ou melhoram a seletividade para FcYRIIb. Especi-ficamente, as alterações descritas nos Exemplos 9, 11 e 12 que foram verificadas ser eficazes quando combinadas com a alteração P238D foram combinadas umas com as outras, com base na alteração P238D que mostrou o efeito excelente de aumento da ligação a FcYRIIb e me-lhorou a seletividade para FcYRIIb.
[01825] Variantes foram produzidas combinando as regiões Fc de IL6R-G1d (SEQ ID NO: 133) e IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144) com alterações E233D, L234Y, G237D, S267Q, H268D, P271G, Y296D, K326D, K326A, A330R e A330K descritas nos Exemplos 9, 11 e 12 que foram verificadas ser eficazes quando combinadas com a alteração P238D. Usando IL6R-L (SEQ ID NO: 135) como a cadeia L de anticorpo, anticorpos compreendendo as variantes descritas acima na cadeia pesada foram expressos e purificados de acordo com o método descrito nos Exemplos de Referência 1 e 2. As variantes resultantes foram respectivamente avaliadas quanto à ligação a cada um de FcYR (FcYRIa, FcYRIIaH, FcYRIIaR, FcYRIIb ou FcYRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 25.
[01826] O KD de cada variante para cada FcYR é mostrado na Tabela 21. "Alteração" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). IL6R-IL6R-L que é usado como o molde para produzir cada variante é indicado pelo asterisco (*). "KD (IIaR)/KD (IIb)" na tabela mostra o valor obtido dividindo o valor KD de cada variante para FcYRIIaR pela KD de cada variante para FcYRIIb. Quanto maior o valor, maior a seletividade para FcYRIIb. "KD (IIb) de polipeptídeo paren- tal/KD (IIb) de polipeptídeo alterado" mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYRIIb pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb. Entretanto, KD (IIaR) de polipeptídeo parental/KD (IIaR) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYRIIaR pelo valor KD de cada variante para FcYRIIaR. Na Tabela 21, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcYR a IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando:
[01827] Equação 2
Figure img0034
[01828] descrita no Exemplo de Referência 25. Tabela 21
Figure img0035
[01829] Legenda:
[01830] NOME DA VARIANTE
[01831] ALTERAÇÃO
[01832] KD CONTRA FcYRIa (mol/L)
[01833] KD CONTRA FcYRIIaR (mol/L)
[01834] KD CONTRA FcYRIIaH (mol/L)
[01835] KD CONTRA FcYRIIb (mol/L)
[01836] KD CONTRA FcYRIIIav (mol/L)
[01837] KD (IIb) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL / KD (IIb) DE PO- LIPEPTÍDEO ALTERADO
[01838] KD (IIAr) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL / KD (IIAr) DE POLIPEPTÍDEO ALTERADO
[01839] Quando considerando a ligação a cada um de FcYR por IL6R-B3/IL6R-L resultante da introdução da alteração de K439E na cadeia H de IL6R-G1d/IL6R-L contendo a sequência de IgG1 humana nativa como 1, a ligação de IL6R-G1d/IL6R-L a FcYRIa como 1,3 vez; a ligação de IL6R-G1ds/IL6R-L a FcYRIIaR foi 1,1 vez; a ligação de IL6R-G1d/IL6R-G1d/IL6R-L a FcYRIIaH foi 1,1 vez, a ligação de IL6R- G1d/IL6R-L para ligação de FcYRIIb foi 1,2 vez e a ligação de IL6R- G1d/IL6R-L a FcYRIIIaV foi 0,9 vez. Desta maneira, para qualquer dado tipo de FcYR, a ligação de I6R-B3/IL6R-L a FcYR era comparável à ligação de IL6R-G1d/IL6R-L a FcYR. Desta maneira, a comparação da ligação de cada variante a cada FcYR com aquela de IL6R-B3/IL6R-L antes da introdução da alteração é suposta ser equivalente à comparação da ligação de cada variante a cada FcYR com a ligação a cada FcYR por IL6R-G1d/IL6R-L contendo a sequência de IgG1 humana nativa. Por esta razão, nos subsequentes Exemplos abaixo, a atividade de ligação de cada variante a cada FcYR será comparada com aquela para cada FcYR por IL6R-B3/IL6R-L antes da introdução da alteração. A Tabela 21 mostra que todas as variantes têm atividade de ligação a FcYRIIb aumentada comparado com IL6R-B3 antes da intro-dução da alteração. A atividade de ligação de IL6R-BF648/IL6R-L, que era a mais baixa, foi aumentada em 2,6 vezes, enquanto a atividade de ligação de IL6R-BP230/IL6R-L, que é a mais alta, foi aumentada em 147,6 vezes. Com relação ao valor de KD (IIaR)/KD (IIb) que representa a seletividade, o valor para IL6R-BP234/IL6R-L, que era o mais baixo, foi 10,0, enquanto o valor para IL6R-BP23/IL6-L, que era o mais alto, era 32,2. Comparado com 0,3 para IL6R-B3/IL6-L antes da introdução da alteração, esses valores implicam que todas as variantes têm seletividade aperfeiçoada. Todas as variantes mostraram atividade de ligação menor a FcYRIa, FcYRIIaH e FcYRIIIaV do que aquela de IL6R-B3/IL6R-L antes da introdução da alteração.
Exemplo 14 Análise de estrutura de cristal de raios-X dos complexos de região extracelular de FcYRIIb ou região extracelular de FcYRIIaR e região Fc com ligação a FcYRIIb aumentada
[01840] Conforme mostrado no Exemplo 13, a ligação a FcYRIIb de variante IL6R-BP230/IL6R-L, cuja ligação a FcYRIIb foi a mais aumen-tada, foi aumentada para cerca de 150 vezes comparado com IL6R- B3/IL6R-L antes da introdução da alteração, enquanto o aumento de sua ligação a FcYRIIaR foi suprimida para um grau de cerca de 1,9 vez. Desta maneira, IL6R-BP230/IL6R-L é uma variante excelente em ambas ligação e seletividade a FcYRIIb. No entanto, os presentes inventores viram uma possibilidade de criar variantes mais preferidas com ligação a FcYRIIb maior enquanto suprimindo a ligação a FcYRII- aR possível.
[01841] Conforme mostrado na Fig. 30 descrita no Exemplo 10, na região Fc com alteração P238D, Asp na posição 270 (numeração EU) em seu domínio B de CH2 forma uma interação eletrostática estreita com Arg na posição 131 em FcYRIIb. Este resíduo de aminoácido na posição 131 é His em FcYRIIIa e FcYRIIaH, enquanto ele é Arg em FcYRIIaR tal como em FcYRIIb. Desta maneira, não há nenhuma dife-rença entre FcYRIIaR e FcYRIIb em termos da interação do resíduo de aminoácido na posição 131 com Asp na posição 270 (numeração EU) no domínio B de CH2. Isso é suposto ser um fator principal para a se-letividade pobre entre a ligação a FcYRIIb e FcYRIIaR da região Fc.
[01842] Por outro lado, as regiões extracelulares de FcYRIIa e FcYRIIb são 93% idênticas em sequência de aminoácido, e então elas compartilham homologia muito alta. Com base na análise de estrutura de cristal do complexo da região Fc de IgG1 nativa (daqui em diante abreviada como Fs (WT)) e da região extracelular de FcYRIIaR (J. Immunol. (2011) 187, 3208-3217), uma diferença encontrada em torno da interface entre as duas interagindo uma com a outra foi apenas três aminoácidos (Gln127, Leu132, Phe160) entre FcYRIIaR e FcYRIIb. Desta maneira, os presentes inventores previram que era extremamente difícil melhorar a seletividade da região Fc entre a ligação a FcYRIIb e ligação a FcYRIIaR.
[01843] Neste contexto, os presentes inventores conceberam que, a fim de aumentar mais a atividade de ligação a FcYRIIb da região Fc e melhorar a seletividade das regiões Fc para a ligação a FcYRIIb e ligação a FcYRIIaR, era importante esclarecer diferenças sutis entre a interação região Fc-FcYRIIb e a interação região Fc- FcYRIIaR através da análise não apenas da estrutura tridimensional do complexo da região Fc com ligação a FcYRIIb aumentada e a região extracelular de FcYRIIb, mas também a estrutura tridimensional do complexo da região Fc com ligação a FcYRIIb aumentada e a região extracelular de FcYRIIaR. Primeiro, os presentes inventores, analisaram a estrutura de cristal de raios-X do complexo da região extracelular de FcYRIIb ou FcYRIIaR e Fc (P208) resultante da eliminação da alteração K439E da região Fc de IL6R-BP208/IL6R-L criada conforme descrito no Exemplo 12, que foi a variante usada como a base na produção de IL6R- BP230/IL6R-L.
(14-1) Análise de estrutura de cristal de raios x do complexo de Fc (P208) e a região extracelular de FcYRIIb Expressão e purificação de Fc (P208)
[01844] Fc (P208) foi preparada conforme descrito abaixo. Primeiro, IL6R-P208 foi produzido substituindo Glu por Lys na posição 439 (numeração EU) em IL6R-BP208, como é o caso da sequência de IgG1 humana nativa. Então, a sequência de gene de Fc (P208), que foi clo- nada por PCR a partir de Glu na posição 216 (numeração EU) para o terminal C usando como um molde um DNA codificando uma variante com uma substituição de Cys por Ser na posição 220 (numeração EU), foi clonada. Construção, expressão e purificação de vetor de expressão foram obtidas de acordo com o método descrito nos Exemplos de Referência 1 e 2. Entretanto, Cys na posição 220 (numeração EU) em IgG1 comum forma uma ligação dissulfeto com um Cys na cadeia L. Quando preparando a região Fc sozinha, a cadeia L não é expressa em combinação. Desta maneira, Cys na posição 220 foi substituída por Ser para evitar formação de ligação dissulfeto desnecessária.
Expressão e purificação da região extracelular de FcYRIIb
[01845] A região extracelular de FcYRIIb foi preparada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 25.
Purificação do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb
[01846] 0,15 mg do produto purificado de Endo F1 (Protein Science (1996) 5, 2617-2622) expresso em E. coli como uma proteína de fusão com glutationa S-transferase foi adicionado 1,5 mg de uma amostra de cristalização da região extracelular de FcYRIIb. Esta amostra adicionada em tampão de Bis-Tris 0,1 M (pH 6,5) foi deixada descansar em temperatura ambiente por três dias para clivar cadeias de açúcar tipo N exceto N-acetilglicosamina diretamente ligada ao Asn na amostra da região extracelular de FcYRIIb. Então, a amostra da região extracelular de FcYRIIb submetida a tratamento de clivagem de cadeia de açúcar foi concentrada com um filtro de ultrafiltragem 5000MWCO e purificada através de cromatografia com uma coluna de filtragem em gel (Super- dex200 10/300) equilibrada com HEPES 20 mM (pH 7,5)/NaCl 0,1 M. Em seguida, Fc (P208) foi adicionado de tal maneira que a região ex- tracelular de FcYRIIb está presente em uma razão molar ligeiramente excessiva. Após concentração com um filtro de ultrafiltragem 10000MWCO, a fração purificada da região extracelular de FcYRIIb submetida à clivagem de cadeia de açúcar foi purificada através de cromatografia com uma coluna de filtragem em gel (Superdex200 10/300) equilibrada com HEPES 25 mM (pH 7,5)/NaCl 0,1 M. A fração purificada preparada conforme descrito acima foi usada como uma amostra de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb na avaliação subsequente.
Cristalização do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb
[01847] Uma amostra de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb concentrada para cerca de 10 mg/ml com um filtro de ultra- filtragem de 10000MWCO foi cristalizada usando o método de difusão de vapor de gota pendente em combinação com o método de semeadura. Placa VDXm (Hampton Research) foi usada para cristalização. Usando uma solução de reservatório de Bis-Tris 0,1 M (pH 6,5)/19% (p/v) PEG3350/fosfato de potássio dibásico 0,2 M, gotas de cristalização foram preparadas em uma razão de mistura de solução de reservatório : amostra de cristalização = 0,85 μl : 0,85 μl. Cristais do complexo obtido sob a mesma condição foram triturados com Seed Bead (Hampton Research) para preparar uma solução de cristal de semente. As gotas de cristalização foram adicionadas com 0,15 μl de uma solução diluída preparada a partir da solução de semente e deixada descansar a 20° C em cavidades de reservatório vedadas. Isso forneceu cristais tipo placa.
Medições de dados de difração de raios x de um cristal de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb
[01848] Um cristal simples de complexo de Fc (P208)/região extra- celular de FcYRIIb preparado conforme descrito acima foi embebido em uma solução de Bis-Tris 0,1 M (pH 6,5)/24% (p/v) PEG3350/fosfato d e potássio dibásico 0,2M/etileno glicol 20% (v/v). Então, o cristal simples foi pescado da solução usando um pino com uma alça de náilon fino presa e congelado em nitrogênio líquido. Dados de difração de raios x do cristal simples foram coletados com Spring-8 BL32XU. Durante a medição, o cristal foi constantemente posto em uma corrente de nitrogênio a -178° C para manter em um estado congelado. Um total de 300 imagens de difração de raios x do cristal simples foi coletado usando detector CCD MX-225HE (RAYONIX) preso a uma linha de feixe com giro do cristal simplese 0,6° de cada vez. Com base nas imagens de difração obtidas, determinação da constante do látice, indexação de ponto de difração e processamento de dados de difração foram realizados usando programas Xia2 (J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190), XDS Package (Acta Cryst. (2010) D66, 125-132) e Scala (Acta Cryst. (2006) D62, 72-82). Finalmente, os dados de intensidade de difração do cristal simples até resolução de 2,81 Â foram obtidos. O cristal pertence ao grupo espacial C2221 com a constante de látice a = 156.69A, b = 260,17 A, c = 56,85 A, α = 90°, β = 90° e Y = 90°.
Análise de estrutura de cristal de raios x do complexo de Fc (P208)/ região extracelular de FcYRIIb
[01849] A estrutura do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb foi determinada através do método de substituição molecular usando o programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). O número de complexos em uma unidade assimétrica foi estimado ser um a partir do tamanho do látice de cristal obtido e do peso molecular do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb. Os segmen- tos abrangendo os resíduos de aminoácido nas posições 239-340 da cadeia A e nas posições 239-340 da cadeia B, que foram recuperadas como uma coordenada independente a partir da coordenada estrutural de código PDB: 3SGJ para a estrutura de cristal de complexo de Fc (WT)/região extracelular de FcYRIIb, foram usados como um modelo para pesquisa do domínio CH2 da região Fc. Da mesma maneira, os segmentos abrangendo os resíduos de aminoácido nas posições 341444 da cadeia A e nas posições 341-443 da cadeia B, que foram recuperadas como uma coordenada a partir da coordenada estrutura de código PDB: 3GSJ, foram usados como um modelo para pesquisa do domínio CH3 da região Fc. Finalmente, o segmento abrangendo os resíduos de aminoácido nas posições 6-178 da cadeia A, que foram recuperadas da coordenada estrutural de código PDB: 2CFB para a estrutura de cristal da região extracelular de FcYRIIb, foi usado como um modelo para pesquisa Fc (P208). Os presentes inventores tentaram determinar as orientações e posições dos respectivos modelos de pesquisa do domínio CH3 da região Fc, da região extracelular de FcYRIIb e do domínio CH2 da região Fc nos látices de cristal com base na função de rotação e na função de translação, mas falharam em determinar a posição de um dos domínios CH2. Então, com referência à estrutura de cristal do complexo de Fc (WT)/região extracelular de FcYRIIb, a posição do último domínio A de CH2 foi determinada a partir de um mapa de densidade de eletron que foi calculado com base na fase determinada para as três partes restantes. Desta maneira, os presentes inventores obtiveram um modelo inicial para a estrutura de cristal do complexo de Fv (P208)/região extracelular de FcYRIIb). O valor R do fator de confiabilidade cristalográfica do modelo estrutural para os dados de intensidade difratada a 25 a 3,0 Â foi 42,6% e o valor R livre foi 43,7% após refinamento de corpo rígido em que os dois domínios CH2 e dois domínios CH3 da região Fc e a região extracelular de FcYRIIb foram deixados desviar do modelo estrutural inicial obtido. Então, refinamento de modelo estrutural foi obtido através da repetição de refinamento estrutural usando programa REFMAC5 (Acta Cryst. (2011) D67, 355-367) seguido por revisão do modelo estrutural realizada usando programa Coot (Acta Cryst. (2010) D66, 486-501) com referência aos mapas de densidade de elétron em que os coeficientes 2Fo-Fc e Fo-Fc foram calculados usando fator Fo estrutural experimentalmente determinado, região Fc de fator estrutural calculada de acordo com o modelo estrutural e a fase calculada de acordo com o modelo estrutural. Então, refinamento adicional foi realizado com base nos mapas de densidade de elétron com coeficientes de 2Fo-Fc e Fo- Fc através da integração de moléculas de água no modelo estrutural. Com 27259 dados de intensidade difratada em resolução de 25 a 2,81 Â, por fim o valor R de fator de confiabilidade cristalográfica foi 24,5% e valor R livre foi 28,2% para o modelo estrutural compreendendo 4786 átomos de não hidrogênio.
[01850] A estrutura tridimensional do complexo de Fc/região extra- celular de FcYRIIb foi determinada em uma resolução de 2,81 Â através de análise de estrutura. A estrutura obtida através de análise é mostrada na Fig. 35. A região extracelular de FcYRIIb foi revelada ser ligada e intercalada entre os dois domínios CH2 da região Fc, que lembra as estruturas tridimensionais dos complexos de Fc (WT) anteriormente analisados, que é a Fc de IgG nativa, e cada uma das regiões extracelulares de FcYRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108, 12669-126674), FcYRIIb (Nature (2000) 400, 267-273; J. Biol. Chem. (2011) 276,16469-16477 e FcYRIIa (J. Immunol. (2011) 187 (6), 32083217).
[01851] Uma observação atenta do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIb revelou uma mudança em estrutura de alça nas posições 233 a 239 (numeração EU) seguindo a região de dobra no domínio A de CH2 da região Fc devido a uma influência das alterações G237D e P238D introduzidas comparado com o complexo de Fc (WT)/região extracelular de FcYRIIaR (Fig. 36). Isso leva que a cadeia principal de Asp na posição 237 (numeração EU) em Fc (P208) formou uma ligação hidrogênio firme com a cadeia lateral de Tyr na posição 160 em FcYRIIb (Fig. 37). Em ambos FcYRIIaH e FcYRIIaR, o resíduo de aminoácido na posição 160 é Phe, que é incapaz de formar tal ligação hidrogênio. Isso sugere que a ligação hidrogênio descrita acima tem contribuição importante para o aumento da ligação a FcYRIIb e a aquisição da seletividade de ligação para FcYRIIa de Fc (P208), isto é, aperfeiçoamento da atividade de ligação a FcYRIIb e redução da atividade de ligação a FcYRIIa de Fc (P208).
[01852] Por outro lado, a cadeia lateral de Asp na posição 237 (numeração EU) em Fc (P208) não forma nem interação na ligação FcYRIIb particularmente significante nem interação com outros resíduos dentro da região Fc. Ile na posição 332, Glu na posição 333, Lys na posição 334 (numeração EU) na região Fc estão localizados próximos de Asp na posição 237 (numeração EU) (Fig. 38). Quando os resíduos de aminoácido dessas posições são substituídos por resíduos hidrofílicos para formar uma interação com a cadeia lateral de Asp na posição 237 (numeração EU) em Fc (P208) e a estrutura da alça pode ser estabilizada pela interação, isso pode levar à redução da perda de energia entrópica devido à ligação hidrogênio entre a região Fc e Tyr na posição 160 em FcYRIIb e desta maneira a um aumento na energia livre de ligação, isto é, um aumento na atividade de ligação.
[01853] Quando a estrutura de cristal de raios x do complexo de Fc (P238D) com a alteração P238D e região extracelular de FcYRIIb descrito no Exemplo 10 é comparada com a estrutura de cristal de raios x do complexo de Fc (P208) e região extracelular de FcYRIIb, desvios são observados em cinco porções em Fc (P208) comparado com Fc (P238D) e a maioria das mudanças é vista apenas no nível de cadeia lateral. Entretanto, um desvio posicional no nível de cadeia principal devido à alteração Pro-para-Gly na posição 271 (numeração EU) é também observada não domínio B de CH2 da região Fc, e ainda há uma mudança estrutura na alça nas posições 266 a 270 (numeração EU) (Fig. 39). Conforme descrito no Exemplo 11, é sugerido que, quando Asp na posição 270 (numeração EU) em Fc (P238D) forma uma interação eletrostática forte com Arg na posi ção 131 em FcYRIIb, a interação pode induzir estresse estereoquímico em Pro na posição 271 (numeração EU). O experimento descrito aqui sugere que a mudança estrutural observada com a alteração para Gly para o aminoáci- do na posição 271 (numeração EU) é suposto ser um resultado de eliminação da distorção estrutural acumulada em Pro antes da alteração e a eliminação resulta em um aumento na energia livre para a ligação a FcYRIIb, isto é, um aumento na atividade de ligação.
[01854] Ainda, foi demonstrado que, devido à mudança da estrutura da alça nas posições 266 a 271 (numeração EU), Arg na posição 292 (numeração EU) sofreu uma mudança estrutura enquanto estando em dois estágios. Neste caso, a interação eletrostática (Fig. 39) formada entre Arg na posição 292 (numeração EU) e Asn na posição 268 (nu-meração EU) que é um resíduo alterado em Fc (P208) pode contribuir para a estabilização da estrutura da alça. Uma vez que a interação eletrostática formada entre Asp na posição 270 (numeração EU) na alça e Arg na posição 131 em FcYRIIb contribui muito para a atividade de ligação de Fc (P208) a FcYRIIb, a estabilização da estrutura da alça na conformação de ligação era provável reduzir a perda de energia entrópica quando da ligação. Desta maneira, a alteração é esperada resultar em um aumento na energia livre de ligação, isto é, um aumento na atividade de ligação.
[01855] Além disso, a possibilidade de alteração para aumentar a atividade foi investigada com base no resultado de análise estrutural. Ser na posição 239 (numeração EU) foi verificado ser um candidato para o sítio para introduzir alteração. Conforme mostrado na Fig. 40, Ser na posição 239 (numeração EU) no domínio B de CH2 está presente na posição para a qual Lys na posição 117 em FcYRIIb se estende mais naturalmente em estrutura. No entanto, uma vez que a densidade de elétron não foi observada para Lys na posição 117 em FcYRIIb através da análise descrita acima, o Lys não tem nenhuma estrutura definitiva. Nesta situação, Lys 117 é provável ter apenas um efeito limitado sobre a interação com Fc (P208). Quando Ser na posição 239 (numeração EU) no domínio B de CH2 é substituído com Asp ou Glu negativamente carregado, tal alteração é esperada causar uma interação eletrostática com o Lys positivamente carregado na posição 117 em FcYRIIb, desta maneira resultando em atividade de ligação a FcYRIIb aperfeiçoada.
[01856] Por outro lado, uma observação da estrutura de Ser na posição 239 (numeração EU) no domínio A de CH2 revelou que, através da formação de uma ligação hidrogênio com a cadeia principal de Gly na posição 236 (numeração EU), a cadeia lateral deste Ser estabilizou a estrutura da alça nas posições 233 a 239, incluindo Asp na posição 237 (numeração EU) que forma uma ligação hidrogênio com a cadeia lateral de Tyr na posição 160 em FcYRIIb, seguindo a região de dobra (Fig. 37). A estabilização da estrutura da alça na conformação de ligação pode reduzir a perda de energia entrópica quando da ligação, e resulta em um aumento na energia livre de ligação, isto é, um aperfeiçoamento da atividade de ligação. Entretanto, quando Ser na posição 239 (numeração EU) no domínio A de CH2 é substituído com Asp ou Glu, a estrutura da alça pode se tornar instável devido à perda da ligação hidrogênio para a cadeia principal de Gly na posição 236 (numeração EU). Ainda, a alteração pode resultar em repulsão eletrostática para Asp na posição 265 (numeração EU) em proximidade grande, levando à desestabilização adicional da estrutura da alça. A energia para a desestabilização corresponde à perda de energia livre para a ligação a FcYRIIb, que pode resultar em redução na atividade de ligação.
(14-2) Análise de estrutura de cristal de raios x do complexo de Fc (P208) e região extracelular de FcYRIIaR Expressão e purificação da região extracelular de FcYRIIaR
[01857] A região extracelular de FcYRIIaR foi preparada de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2.
[01858] Purificação do complexo de Fc (P208)/região extracelular de tipo FcYRIIaR
[01859] 1,5 mg de amostra purificada da região extracelular de FcYRIIaR foi adicionado com 0,15 mg do produto purificado de Endo F1 (Protein Science (1996) 5, 2617-2622) expresso em E. coli como uma proteína de fusão com S-transferase, 20 μl de 5 U/ml Endo F2 (QA-bio) e 20 μl de 5 U/ml Endo F3 (QA-bio). Após 9 dias de incubação em temperatura ambiente em tampão de acetato de Na 0,1 M (pH 4,5), a amostra foi adicionada mais com 0,07 mg do Endo F1 descrito acima, 7,5 μl do Endo F2 descrito acima e 7,5 μl do Endo F3 descrito acima e foi incubado por três dias para clivar cadeias de açúcar tipo N exceto N-acetilglicosamina diretamente ligada a Asn na amostra da região extracelular de FcYRIIa R. Então, a amostra da região extrace- lular de FcYRIIaR concentrada com um filtro de ultrafiltragem 10000MWCO e submetida a tratamento de clivagem de cadeia de açúcar descrito acima foi purificada através de cromatografia com uma coluna de filtragem em gel (Superdex200 10/300) equilibrada com HEPES 25 mM (pH 7)/NaCl 0,1 M. Em seguida, Fc (P208) foi adicionada de tal maneira que a região extracelular de FcYRIIaR está presente em uma razão molar ligeiramente excessiva. Após concentração com um filtro de ultrafiltragem 10000MWCO, a fração purificada da região extracelular de FcYRIIaR submetida ao tratamento de clivagem de cadeia de açúcar descrito acima foi purificada através de cromatogra- fia com uma coluna de filtragem de gel (Superdex200 10/300) equilibrada com HEPES 25 mM (pH 7)/NaCl 0,1 M. A fração purificada preparada conforme acima descrito foi usada como uma amostra de complexo de Fc (P208)/ região extracelualr de FcYRIIaR na avaliação subsequente.
Cristalização do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FCYRII- aR
[01860] Uma amostra de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIa tipo R concentrada para cerca de 10 mg/ml com filtro de ultrafiltragem 10000MWCO foi cristalizada usando o método de difusão de vapor de gota assentada. Usando uma solução de reservatório de Bis-Tris 0,1 M (pH 7,5)/PEG3350 26% (p/v)/sulfato de amônio 0,2M, gotas de cristalização foram preparadas em uma razão de mistura de solução de reservatório : amostra de cristalização = 0,8 μl : 1,0 μl. As gotas foram firmemente unidas e deixadas permanecer a 20° C. Isso rendeu cristais tipo placa.
Medição de dados de difração de raios x de cristal de complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIaR
[01861] Um cristal simples de complexo de Fc (P208)/região extra- celular de FcYRIIaR preparado conforme acima descrito foi embebido em uma solução de Bis-Tris 0,1 M (PH 7,5)/PEG3350 27,5% (p/v)/sulfato de amônio 0,2 M/glicerol 20% (v/v). Então, o cristal foi pescado da solução usando um pino com alça de náilon de fino presa e congelado em nitrogênio líquido. Dados de difração de raios x do cristal simples foram coletados de Photon Factory BL-17a da instituição de radiação sincrotron na High Energy Accelerator Research Organization. O cristal foi constantemente posto em uma corrente de nitrogê- nio a -178° C para manter em um estado congelado durante a medição. Um total de 225 imagens de difração de raios x do cristal simples foi coletado usando o CCD detector Quantum 315r (ADSC) equipado com a linha de feixe com giro do cristal simples a 0,6° de cada vez. Com base nas imagens de difração obtidas, determinação da constante de látice, indexação de ponto de difração e processamento de dados de difração foram realizados usando programas Xia2 (J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190), XDS Package (Acta Cryst. (2010) D66, 125-132) e Scala (Acta Cryst. (2006) D62, 72-82). Finalmente, dados de intensidade de difração até resolução de 2,87Â foram obtidos. O cristal pertence ao grupo espacial C2221 com a constante de látice a = 154.31A, b = 257,61 A, c = 56,19 A, α = 90°, β = 90° e Y = 90°.
Análise de estrutura de cristal de raios x do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIaR
[01862] A estrutura do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR foi determinada através do método de substituição molecular usando o programa Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). O número de complexos em uma unidade assimétrica foi estimado ser um a partir do tamanho do látice de cristal obtido e do peso molecular do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR. Usando, como um modelo de pesquisa, a estrutura cristalográfica do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIb obtido conforme descrito no Exemplo (14-1), a orientação e a posição do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcyRIIaR nos látices de cristal foram determinadas com base na função de rotação e na função de translação. O valor R do fator de confiabilidade cristalográfica do modelo estrutural para os dados de intensidade difratada a 25 a 3,0 Â foi 38,4% e o valor R livre foi 30,0% após refinamento de corpo rígido em que os dois domínios CH2 e dois domínios CH3 da região Fc e a região extracelular de FcyRIIb foram deixados desviar independentemente do modelo es- trutural inicial obtido. Então, refinamento de modelo estrutural foi obtido através da repetição de refinamento estrutural usando programa REFMAC5 (Acta Cryst. (2011) D67, 355-367) seguido por revisão do modelo estrutural realizada usando programa Coot (Acta Cryst. (2010) D66, 486-501) com referência aos mapas de densidade de elétron em que os coeficientes 2Fo-Fc e Fo-Fc foram calculados usando fator Fo estrutural experimentalmente determinado, Fc de fator estrutural calculada de acordo com o modelo estrutural e as fases calculadas de acordo com o modelo. Então, refinamento adicional foi realizado com base nos mapas de densidade de elétron com coeficientes de Fo-Fc e 2Fo-Fc através da integração de moléculas de água no modelo estrutural. Com 24838 dados de intensidade difratada em resolução de 25 a 2,87 Â, por fim o valor R de fator de confiabilidade cristalográfica foi 26,3% e valor R livre foi 38,0% para o modelo estrutural compreendendo 4758 átomos de não hidrogênio.
[01863] A estrutura tridimensional do complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIaR foi determinada em uma resolução de 2,87Â através de análise de estrutura. Uma comparação da estrutura de cristal entre o complexo de Fc (P208)/região extracelular de FcYRIIaR e o complexo de Fc (P-208)/região extracelular de FcYRIIb descrito no Exemplo (14-1) não detectou quase nenhuma diferença no nível de estrutura geral (Fig. 41), refletindo a identidade de aminoácido muito alta entre os dois receptores FcY.
[01864] No entanto, uma observação precisa das estruturas no nível de densidade de elétron detectou algumas diferenças que podem levar a aperfeiçoamentos da seletividade entre a ligação a FcYRIIb e a ligação a FcYRIIaR da região Fc. O resíduo de aminoácido na posição 160 em FcYRIIaR não é Tyr, mas Phe. Conforme mostrado na Fig. 42, a ligação hidrogênio entre a cadeia principal do resíduo de aminoácido na posição 237 (numeração EU) no domínio A de CH2 da região Fc e Tyr na posição 160 em FcYRIIb, embora formada quando da ligação entre FcYRIIb e a região Fc com alteração P238D, é esperada não ser formada quando da ligação entre FcYRIIb e a região Fc com alteração P238D. A ausência da formação de ligação hidrogênio pode ser um fator principal para aperfeiçoamento da seletividade entre a ligação a FcYRIIb e a ligação a FcYRIIab da região Fc introduzida com alteração P238D. Comparação adicional no nível de densidade de elétron mostrou que, no complexo de Fc/região de FcYRIIb, densidade de elétron era claramente observável para as cadeias laterais de Leu nas posições 235 (numeração EU) e 234 (numeração EU), enquanto a densidade de elétron das cadeias laterais não era clara no complexo de Fc/região de FcYRIIaR. Isso sugere que a posição próximo da alça 237 (numeração EU) flutua devido à interação a FcYRIIaR reduzida em torno desta posição. Entretanto, uma comparação estrutural do domínio B de CH2 da região Fc (Fig. 43) na mesma região revelou que, no complexo da região Fc e FcYRIIb, densidade de elétron era observável até Asp na posição 237 (numeração EU), enquanto, na estrutura do complexo da região Fc e FcYRIIaR, a densidade de eletron era observável até três resíduos antes da Asp na posição 237 (numeração EU), isto é, até em torno de Leu na posição 234 (numeração EU), sugerindo que a ligação a FcYRIIaR forma uma interação em uma região maior comparado com a ligação a FcYRIIb. A constatação descrita acima sugere a possibilidade que, no domínio A de CH2 da região Fc, a região da posição 234 até a 238 (numeração EU) tem uma contribuição grande para a ligação entre a região Fc e FcYRIIb, enquanto o domínio B de CH2 da região Fc da posição 234 até a 238 (numeração EU) tem uma contribuição grande para a ligação entre a região Fc e FcYRIIaR.
Exemplo 15 Variantes Fc para as quais sítios de alteração foram de-terminados com base em estrutura de cristal
[01865] Conforme descrito no Exemplo 14, Asp na posição 268 (numeração EU) foi sugerido interagir eletrostaticamente com Arg na posição 292 (numeração EU) (Fig. 39) como um resultado da mudança estrutural local devido à introdução da alteração P271G no domínio B da variante com ligação a FcYRIIb aumentada (P208). Há uma possibilidade que a estrutura da alça nas posições 266 a 271 (numeração EU) seja estabilizada pela formação da interação, resultando em aumento da ligação a FcYRIIb. Desta maneira, os presentes inventores avaliaram se a ligação a FcYRIIb da variante poderia ser aumentada pela estabilização adicional desta estrutura de alça devido a aumento da interação eletrostática através da substituição de Asp por Glu na posição 268 (numeração EU) na variante. Por outro lado, conforme mostrado na Fig. 38, Tyr na posição 160 (numeração EU) em FcYRIIb interage com a cadeia principal de Asp na posição 237 (numeração EU) no domínio A de P208. Entretanto, a cadeia lateral de Asp na posição 237 (numeração EU) está localizada próximo da posição 332, Glu na posição 333 e Lys na posição 334 (numeração EU) na molécula sem formação de nenhuma interação particularmente significante. Desta maneira, os presentes inventores também avaliaram se a interação com Tyr na posição 160 em FcYRIIb pode ser aumentada através de estabilização da estrutura da alça nas posições 266 a 271 (numeração EU) devido à interação aumentada com a cadeia lateral de Asp na posição 237 (numeração EU) através da substituição de resíduos de aminoácido hidrofílicos nas posições descritas acima.
[01866] Variantes introduzidas com cada uma das alterações H268E, I332T, I332E, I332K, E333K, E333R, E333S, E333T, K334S, K334T e K334E que foram encontradas com base na informação estrutural, foram produzidas usando como um molde IL6R-BP230/IL6R-L preparado como descrito no Exemplo 13, que mostrou excelente seletividade para FcYRIIb. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acima foram expressos e purifi-cados de acordo com o método descrito nos Exemplos de Referência 1 e 2. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FCYR (FcYRIa, FcYRIIaH, FcYRIIaR, FcYRIIb ou FcYRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 25.
[01867] O KD de cada variante para cada FcyR é mostrado na Tabela 22. Na tabela, "alteração" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP3 (SEQ ID NO: 144). IL6R-B3/IL6R-L que é usado como o molde para produzir IL6R-BP230 é indicado por asterisco(*). KD (IIb) de polipeptídeo parental/KD (Iib) de polipeptídeo alterado na tabela mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Entretanto, KD (IiaR) de polipeptídeo parental/KD (IiaR) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRII- aR pelo valor KD de cada variante para FcyRIIaR. KD (IiaR)/KD (Iib) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcyRIIaR pelo KD da variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcyRIIb. Na Tabela 22, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcyR à IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando:
[01868] Equação 2
Figure img0036
[01869] descrita no Exemplo de Referência 25. Tabela 22
Figure img0037
[01871] Legenda:
[01872] NOME DA VARIANTE
[01873] ALTERAÇÃO INTRODUZIDA EM IL6R-BP230
[01874] KD CONTRA FcYRIa (mol/L)
[01875] KD CONTRA FcYRIIaR (mol/L)
[01876] KD CONTRA FcYRIIaH (mol/L)
[01877] KD CONTRA FcYRIIb (mol/L)
[01878] KD CONTRA FcYRIIIav (mol/L)
[01879] KD (IIaR) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL / KD (IIaR) DE POLIPEPTÍDEO ALTERADO
[01880] KD (IIb) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL / KD (IIb) DE PO- LIPEPTÍDEO ALTERADO
[01881] Ambas atividade de ligação a FcYRIIb e seletividade para FcYRIIb de IL6R-BP264/IL6R-L, IL6R-BP465/IL6R-L, IL6R- BP466/IL6R-L e IL6R-BP470, resultantes da introdução das alterações H268E, E333K, E333R e E333T, respectivamente, em IL6R- BP230/IL6R-L foram aumentadas comparado com aquelas de IL6R- BP230/IL6R-L. A seletividade para FcYRIIb de IL6R-BP391/IL6R-L in-troduzido com a alteração I332T foi reduzida enquanto sua atividade de ligação a FcYRIIb foi aumentada comparado com IL6R- BP230/IL6R-L.
Exemplo 6 Introdução exaustiva de alterações em resíduos de aminoácido em torno da posição 271 (numeração EU)
[01882] Na comparação estrutural entre Fc (P208) e FcYRIIb e Fc (P238D)/ FcYRIIb, a diferença mais significante é encontrada na estrutura em torno da posição 271 (numeração EU) no domínio B de CH2 da região Fc (Fig. 39). Conforme descrito no Exemplo 11, é sugerido que, quando, em Fc (P238D), Asp na posição 270 (numeração EU) forma uma interação eletrostática firme com Arg na posição 131 em FcYRIIb, a interação pode induzir estresse estereoquímico em Pro na posição 271 (numeração EU). Na estrutura de Fc (P208)/ FcYRIIb, devido à substituição de Pro por Gly na posição 271 (numeração EU), um desvio posicional ocorreu no nível de cadeia principal de maneira a eliminar a distorção estrutural, resultando em uma mudança estrutural grande em torno da posição 271. Há uma possibilidade que estabilização adicional da estrutura modificada em torno da posição 271 reduza mais a perda de energia entrópica causada pela ligação quando da formação de uma interação eletrostática com Arg na posição 131 em FcYRIIb. Desta maneira, alterações que aumentam a ligação a FcYRIIb ou aumentam a seletividade para FcYRIIb da região Fc foram buscadas através de introdução exaustiva de alterações em resíduos de aminoácido em torno da posição 271 (numeração EU).
[01883] IL6R-BP267 foi construído como um molde em introdução exaustiva de alterações através de introdução de alterações E233D, G237D, P238D, H268E e P271G em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). IL6R-L (SEQ ID NO: 135) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descri-tas acimas foram expressos e purificados de acordo com o método des-crito nos Exemplo de Referência 1 e 2. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcYR (FcYRIa, FcYRIIaH, FcYRIIaR, FcYRIIb ou FcYRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 25. Os aminoácidos nas posições 264, 265, 266, 267, 269 e 272 (numeração EU) em IL6R-BP267 foram substituídos com cada um dos 18 tipos de aminoácidos, exceto Cys e o aminoácido antes da substituição. IL6R-IL (SEQ ID NO: 135) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anti-corpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acima foram expressos e purificados de acordo com o método descrito nos Exemplos de Referência 1 e 2. Os anticorpos, purificados através do método do Exemplo de Referência 25, foram avaliados quanto à sua ligação a cada FCYR (FcYRIa, FcYRIIaH, FcYRIIaR, FcYRIIb ou FcYRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 25. Va-riantes cuja ligação a FcYRIIb foi aumentada ou seletividade de FcYRIIb foi aumentada comparado com ligação a FcYRIIb e seletividade para FcYRIIb de IL6R-BP267/IL6R-L antes da introdução das alterações são mostradas na Tabela 23. Tabela 23
Figure img0038
[01884] Legenda:
[01885] NOME DA VARIANTE
[01886] ALTERAÇÃO INTRODUZIDA EM IL6R-BP267
[01887] KD CONTRA FcYRIa (mol/L)
[01888] KD CONTRA FcYRIIaR (mol/L)
[01889] KD CONTRA FcYRIIaH (mol/L)
[01890] KD CONTRA FcYRIIb (mol/L)
[01891] KD CONTRA FcYRIIIav (mol/L)
[01892] KD (IIaR) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL / KD (IIaR) DE POLIPEPTÍDEO ALTERADO
[01893] KD (IIb) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL / KD (IIb) DE PO- LIPEPTÍDEO ALTERADO
[01894] O valor KD de cada variante para cada FCYR é mostrado na Tabela 23. Na tabela, "alteração" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP3, que foi usado como um molde. IL6R-B3/IL6R-L que é usado como o molde para produzir IL6R-BP267 é indicado pelo aste- risco(*). Na tabela, KD (IIb) do polipeptídeo parental/KD (IIb) do poli- peptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R- B3/IL6R-L para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Entretanto, KD (IIaR) de polipeptídeo parental/KD (IIaR) de polipeptí- deo alterado mostra o valor obtido dividindo a KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcyRIIaR pela KD de cada variante para FcyRIIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) mostra o valor obtido através de divisão do valor KD de cada variante para FcyRIIaR pelo valor KD da variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcyRIIb. Na Tabela 23, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcyR a IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando:
[01895] Equação 2
Figure img0039
[01896] descrita no Exemplo de Referência 25.
[01897] Todas as atividades de ligação de variantes mostradas na Tabela 23 para FcyRIa, FcyRIIaH e FcyRIIIaV eram comparáveis ou reduzidas comparado com aquelas de IL6R-B3/IL6R-L. Entretanto, a atividade de ligação a FcyRIIb de variantes resultantes da adição de alterações S267A, V264I, E269D, S267E, V266F, S267G e V266M, respectivamente, a IL6R-BP267/IL6R-L foi aumentada comparado com aquela de IL6R-BP267/IL6R-L antes da adição da alteração. Entretanto, os valores KD (IIaR)/KD (IIb) de variantes resultantes da adição das alterações S267A, S267G, E272M, E272Q, D265E, E272D, E272N, V266L, E272I e E272F, respectivamente, a IL6R-BP267/IL6R-L foram aumentados comparado com aqueles de IL6R-BP267/IL6R-L antes da adição de alteração. Isso demonstra que as alterações S267A, S267G, E272M, E272Q, D265E, E272D, E272N, V266L, E272I e E272F produzem o efeito de aperfeiçoamento da seletividade para FcYRIIb.
Exemplo 17 Aumento da ligação a FcYRIIb através da introdução de alterações na região CH3
[01898] Uma alteração de substituição de Pro por Leu na posição 396 (numeração EU) foi relatada aumentar a ligação a FcYRIIb (Cancer Res. (2007) 67, 8882-8890). O aminoácido na posição 396 (numeração EU) está presente em uma posição que não está diretamente envolvida na in-teração com FcYR. No entanto, o aminoácido pode ser suposto ter um efeito sobre a interação com FcYR através da mudança da estrutura do anticorpo. Desta maneira, os presentes inventores avaliaram se a ligação a FcYRIIb da região Fc é aumentada ou sua seletividade para FcYRIIb é aumentada através de introdução exaustiva de alterações de aminoácido na posição 396 (numeração EU) na região Fc.
[01899] IL6R-BP423 foi construído como um modelo em introdução exaustiva de alterações através da introdução das alterações E233D, G237D, P238D, S267A, H268E, P271G e A330R em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). Variantes, em que o aminoácido na posição 396 (numeração EU) em IL6R-BP423 foi substituído com cada um de 18 tipos de aminoácidos, exceto cisteína e o aminoácido antes da substituição, foram construídas. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acima foram expressos e purificados de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcYR (FcYRIa, FcYRIIaH, FcYRIIaR, FcYRIIb ou FcYRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 25. A ligação das variantes resultantes a cada FcYR é mostrada na Tabela 24. Tabela 24
Figure img0040
[01900] Legenda
[01901] NOME DA VARIANTE
[01902] ALTERAÇÃO INTRODUZIDA EM IL6R-BP423
[01903] KD CONTRA FcYRIa (mol/L)
[01904] KD CONTRA FcYRIIaR (mol/L)
[01905] KD CONTRA FcYRIIaH (mol/L)
[01906] KD CONTRA FcYRIIb (mol/L)
[01907] KD CONTRA FcYRIIIaV (mol/L)
[01908] KD (IIaR) / KD (IIb)
[01909] KD (IIaR) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL /KD (IIaR) DE POLIPEPTÍDEO ALTERADO
[01910] KD (IIb) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL /KD (IIb) DE PO- LIPEPTÍDEO ALTERADO
[01911] Na tabela, "alteração introduzida em IL6R-BP423" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP423, que foi usado como um modelo. IL6R-B3/IL6R-L que é usado como o modelo para produzir IL6R-BP423 é indicado como um asterisco(*). Na tabela, KD (IIb) de polipeptídeo parental/KD (IIb) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYRIIb pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb. Entretanto, KD (IIaR) de polipeptí- deo parental/KD (IIar) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido através da divisão do valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYR IIaR pelo valor KD de cada variante para FcYR IIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcYRIIaR pela KD da variante para FcYRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcYRIIb. Na Tabela 24, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcYR a IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando:
[01913] Equação 2
Figure img0041
[01914] descrita no Exemplo de Referência 25.
[01915] O resultado mostrado na Tabela 24 demonstra que: a atividade de ligação a FcYRIIb de IL6R-BP456/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396M em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP455/IL6R- L resultante da introdução da alteração P396L em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP464/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396Y em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP450/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396F em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP448/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396D em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R- BP458/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396Q em IL6R- BP423/IL6R-L, IL6R-BP453/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396I em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP449/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396E em IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R- BP454/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396K em IL6R- BP423/IL6R-L, e IL6R-BP459/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396R em IL6R-BP423/IL6R-L foi aumentada comparado com aquela de IL6R-BP423/IL6R-L antes da introdução das alterações. Entretanto, o valor KD (IIaR)/KD (IIb) de IL6R-BP456/IL6R-L resultante da introdução da alteração P396M em IL6R-BP423/IL6R-L foi maior comparado com aquele de IL6R-BP423/IL6R-L antes da introdução da alteração, demonstrando a seletividade aperfeiçoada de FcYRIIb. Como visto na Tabela 24, a atividade de ligação das variantes preparadas para FcYRIa, FcYRIIaH e FcYRIIIaV foi menor do que aquela de IL6R/B3/IL6R-L, que foi o polipeptídeo parental.
Exemplo 18 Preparação de variantes com ligação a FcYRIIb au-mentada usando sequências de subclasse
[01916] O perfil de ligação de FcYR varia dependendo da subclasse de IgG humano. Os presentes inventores avaliaram se a diferença na atividade de ligação a cada FCYR entre IgG1 e IgG4 poderia ser utilizada para aumentar a atividade de ligação a FcYRIIb e/ou melhorar a seletividade. Primeiro, IgG1 e IgG4 foram analisadas quanto à sua ati-vidade de ligação a cada FcyR. IL6R-G4d (SEQ ID NO: 164) contendo G4d foi construído como a cadeia H de anticorpo. G4d é uma região Fc que não tem Gly e Lys C-terminais e contém uma substituição de Ser por Pro na posição 228 (numeração EU) em IgG4 humano. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e IL6R-G1d/IL6R-L ou IL6R- G4d/IL6R-L foram expressos e purificados de acordo com o método descrito nos Exemplos de Referência 1 e 2. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcyR (FcyRIa, FcyRIIaH, FcyRIIaR, FcyRIIb ou FcyRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 25. A ligação das variantes resultantes a cada FcyR é sumarizada na Tabela 25. Tabela 25
Figure img0042
[01917] Foi demonstrado que a ligação a FcyRIIb de IL6R-IL6R-L era 1,5 vez mais forte do que aquela de IL6R-G1d/IL6R-L enquanto a ligação a FcyRIIaR de IL6R-G4d/IL6R-L era 2,2 vezes mais fraca do que aquela de IL6R-G1d/IL6R-L. Entretanto, a atividade de ligação de IL6R-G4d/IL6R-L a FcyRIa, FcyRIIaH e FcyRIIIaV era menor do que aquela de IL6R-G1d/IL6R-L. O resultado descrito acima revelou que IL6R-G4d tinha características preferíveis comparado com IL6R-G1d em termos de ambas atividade e seletividade de ligação a FcyRIIb.
[01918] A Fig. 44 é um alinhamento para comparar as sequências CH1 de G1d e G4d até o terminal C (posições 118 a 445 (numeração EU)). Na Fig. 44, resíduos de aminoácido que são diferentes entre G1d e G4d estão em uma caixa de linha grossa. Os presentes inventores avaliaram se a ligação a FcYRIIb poderia ser aumentada mais e/ou seletividade para FcYRIIb poderia ser aperfeiçoada mais através de seleção, a partir dos aminoácidos diferentes descritos acima, de algumas porções que são previstas estar envolvidas na interação com FcYR, e enxerto de pelo menos um resíduo de aminoácido ou mais da sequência G4d, que confere uma propriedade preferível do ponto de vista de ambas a atividade de ligação a e seletividade para FcYRIIb, a uma variante com ligação a FcYRIIb aumentada.
[01919] Especificamente, os presentes inventores produziram: IL6R-BP473 resultante da introdução da alteração A327G em IL6R- BP230; IL6R-BP472 resultante da introdução da alteração A330S em IL6R-BP230; IL6R-BP471 resultante da introdução da alteração P331S em IL6R-BP230; IL6R-BP474 resultante da introdução das alterações A330S e P331S em IL6R-BP230; L6R-BP475 resultante da introdução das alterações A327G e P330S em IL6R-BP230; IL6R-BP476 resultante da introdução das alterações A327G e P331S em IL6R-BP230; eIL6R-BP477 resultante da introdução das alterações A327G e P331S em IL6R-BP230. Ainda, para construir IL6R-BP478, os aminoácidos de Ala na posição 118 até Thr na posição 225 (numeração EU) em IL6R- BP230 foram substituídos com os aminoácidos da sequência G4d de Ala na posição 118 para Pro na posição 222 (numeração EU). IL6R-L (SEQ ID NO: 135) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acima foram purificados de acordo com o método descrito nos Exemplos de Referência 1 e 2. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a cada FcYR (FcYRIa, FcYRIIaH, FcYRIIaR, FcYRIIb ou FcYRIIIaV) através do método des- crito no Exemplo de Referência 25.
[01920] O valor KD de cada variante para cada FCYR é mostrado na Tabela 26. KD (IIb) de polipeptídeo parental/KD (IIb) de polipeptídeo alterado na tabela mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R- B3/IL6R-L para FcyRIIb pelo valor KD de cada variante para FcyRIIb. Na tabela, "alteração introduzida em IL6R-BP230" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP230. IL6R-B3/IL6R-L usado como o modelo para produzir IL6R-BP230 é indicado por *1. Entretanto, IL6R- BP478, em que o segmento de a partir de Ala na posição 118 até Thr na posição 225 substituiu a sequência G4 de a partir de Ala na posição 118 até Pro na posição 222 (numeração EU) em IL6R-BP230, é indicado por *2. KD (IIaR) de polipeptídeo parental/KD (IIaR) de polipeptí- deo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R- B3/IL6-R para FcyR IIaR pelo valor KD da variante para FcyR IIa. KD (IIaR)/KD (IIb) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcyRIIaR pela KD da variante para FcyRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcyRIIb. Na Tabela 26, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcyR a IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando:
[01921] Equação 2
Figure img0043
[01922] descrita no Exemplo de Referência 25. Tabela 26
Figure img0044
[01924] Legenda
[01925] NOME DA VARIANTE
[01926] ALTERAÇÃO INTRODUZIDA EM IL6R-BP230
[01927] KD CONTRA FcYRIa (mol/L)
[01928] KD CONTRA FcYRIIaR (mol/L)
[01929] KD CONTRA FcYRIIaH (mol/L)
[01930] KD CONTRA FcYRIIb (mol/L)
[01931] KD CONTRA FcYRIIIaV (mol/L)
[01932] KD (IIaR) / KD (IIb)
[01933] KD (IIaR) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL /KD (IIaR) DE POLIPEPTÍDEO ALTERADO
[01934] KD (IIb) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL /KD (IIb) DE PO- LIPEPTÍDEO ALTERADO
[01935] Das variantes mostradas na Tabela 26, IL6R-BP473/IL6R-L introduzida com a alteração A327G mostrou ligação a FcYRIIb aumentada 1,2 vez comparado com aquela de IL6R-BP230/IL6R-L. Entretanto, IL6R-BP478/IL6R-L, em que os aminoácidos de Ala na posição 118 até Thr na posição 225 (numeração EU) em IL6R-BP230 foram substituídos pelos aminoácidos de Ala na posição 118 até Pro na posição 222 (numeração EU) na sequência de aminoácido de G4d, exibiu ligação aumentada a FcYRIIb e FcYRIIaR 1,1 vez comparado com aquela de IL6R-BP230/IL6R-L. Todas as variantes mostraram atividades de ligação menores a FcYRIa, FcYRIIaH e FcYRIIIaV comparado com o polipeptídeo parental IL6R-B3/IL6R-L.
[01936] As variantes com as modificações em outros sítios mostradas na Fig. 44 foram também avaliadas. Especificamente, na cadeia H de anticorpo IL6R-BP230, K274Q foi introduzida para preparar IL6R- BP541; Y296F foi introduzida para preparar IL6R-BP542; H268Q foi introduzida para preparar IL6R-BP543; R355Q foi introduzida para preparar IL6R-BP544; D35E foi introduzida para preparar IL6R-BP545; L358M foi introduzida para preparar IL6R-BP546; K409R foi introduzida para preparar IL6R-BP547; e Q419E foi introduzida para preparar IL6R-BP548. Entretanto, IL6R-L foi usada como a cadeia L de anticorpo comum. Anticorpos que contêm a variante de cadeia pesada acima e o IL6R-L de cadeia leve foram purificados de acordo com os métodos descritos nos Exemplos de Referência 1 e 2. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FCYR (FcYRIa, FcYRIIaH, FcYRIIaR, FcYRIIb ou FcYRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 25.
[01937] O KD de cada variante para cada FcYR é mostrado na Tabela 27. Na Tabela, "KD (IIb) do polipeptídeo parental/KD (IIb) do poli- peptídeo alterado" representa o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/L6R-L para FcYRIIb pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb. Na Tabela, "alteração de IL6R-BP230" se refere a uma modificação introduzida em IL6R-BP230. IL6R/IL6R-L usado como o modelo para produzir IL6R-BP230 é indicado com *1. "KD (IIaR) do polipep- tídeo parental/KD (IIaR) do polipeptídeo alterado" representa o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYRIIaR pelo valor KD da mesma variante para FcYRIIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) representa o valor obtido dividindo KD de cada variante para FcYRIIaR pelo KD da mesma variante para FcYRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcYRIIb. Na Tabela 27, o numeral na célula preenchida com cinza indica que a ligação de FcYR a IgG foi fraca, e foi determinado que a análise não poderia ser corretamente realizada através de análise cinética e então foi calculada usando:
[01938] Equação 2
Figure img0045
[01939] descrita no Exemplo de Referência 25.
[01940] Conforme mostrado na Tabela 27, IL6R-BP541/IL6R-L re sultante da introdução de L274Q em IL6R-BP230/IL6R-L, IL6R- BP544/IL6R-L resultante da introdução de R355Q em IL6R- BP230/IL6R-L, IL6R-BP545/IL6R-L resultante da introdução de D356E em IL6R-BP230/IL6R-L e IL6R-BP546/IL6R-L resultante da introdução de L358M em IL6R-BP230/IL6R-L mostraram ligação a FcYRIIb aumentada comparado com IL6R-BP230/IL6R-L antes da introdução da alteração. Deles, IL6R-BP544/IL6R-L resultante da introdução de R355Q em IL6R-BP230/IL6R-L, IL6R-BP545/IL6R-L resultante da introdução de D356E em IL6R-BP230/IL6R-L e IL6R-BP546/IL6R-L resultante da introdução de L358M em IL6R-BP230/IL6R-L foram mostrados ter um valor de KD(IIaR)/KD(IIb) aumentado e seletividade aperfeiçoada para FcYRIIb, comparado com IL6R-BP230/IL6R-L antes da introdução de alteração.
[01941] Tabela 27
Figure img0046
Legenda
[01942] NOME DA VARIANTE
[01943] ALTERAÇÃO DE IL6R-BP230
[01944] KD CONTRA FcYRIa (mol/L)
[01945] KD CONTRA FcYRIIaR (mol/L)
[01946] KD CONTRA FcYRIIaH (mol/L)
[01947] KD CONTRA FcYRIIb (mol/L)
[01948] KD CONTRA FcYRIIIaV (mol/L)
[01949] KD (IIaR) / KD (IIb)
[01950] KD (IIaR) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL /KD (IIaR) DE POLIPEPTÍDEO ALTERADO
[01951] KD (IIb) DE POLIPEPTÍDEO PARENTAL /KD (IIb) DE PO- LIPEPTÍDEO ALTERADO
Exemplo 19 Avaliação de combinações de alterações que aumentam a ligação a FcYRIIb ou melhoram a seletividade para FcYRIIb
[01952] Combinações adicionais das alterações descritas aqui nas seções até e incluindo Exemplo 18, alterações que foram verificadas ser eficazes no aspecto de aumento da ligação a FcYRIIb ou o aperfei-çoamento da seletividade para FcYRIIb, foram avaliadas. Especifica-mente, as alterações que tinham sido avaliadas como sendo eficazes em aumento da ligação a FcYRIIb e/ou aperfeiçoamento da seletividade para FcYRIIb foram introduzidas em combinação em IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). Ainda, alterações existentes S267E e L328F que aumentam a ligação a FcYRIIb (Seung e outros (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933)) foram introduzidas em IL6R-B3 para produzir IL6R-BP253 como um controle de comparação. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) foi usado como a cadeia L de anticorpo. Anticorpos contendo a cadeia leve de IL6R-L e as variantes de cadeia pesada descritas acima foram expressos e purificados de acordo com o método conforme descrito nos Exemplos de Referência 1 e 2. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cada FcYR (FcYRIa, FcYRIIaH, FcYRIIaR, FcYRIIb ou FcYRIIIaV) através do método descrito no Exemplo de Referência 25.
[01953] A KD de cada variante para cada FcYR é mostrada na Tabela 28. Na tabela, "alteração" se refere a uma alteração introduzida em IL6R-BP3 (SEQ ID NO: 144). IL6R-B3/IL6R-L que é usado como o molde para produzir cada variante é indicado pelo asterisco (*). KD (IIb) de polipeptídeo parental/KD (IIb) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYRIIb pelo valor KD de cada variante para FcYRIIb. Entretanto, KD (IlaR) de polipeptídeo parental/KD (IIaR) de polipeptídeo alterado mostra o valor obtido dividindo o valor KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcYR IIaR pelo valor KD de cada variante para FcYRIIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcYRIIaR pela KD da variante para FcYRIIb. Quanto maior o valor, mais alta a seletividade para FcYRIIb comparado com FcYRIIaR. Entretanto, KD (IIaH)/KD (IIb) mostra o valor obtido dividindo a KD de cada variante para FcYRIIaH pela KD da variante para FcYRIIb. Quanto maior o valor, maior a seletividade para FcYRIIb comparado com FcYRIIaH. Na Tabela 28, o numeral nas células preenchidas de cinza indica que a ligação de FcYR à IgG foi concluída ser muito fraca para analisar corretamente através de análise cinética e então foi calculada usando:
[01954] Equação 2
Figure img0047
[01955] descrita no Exemplo de Referência 25. Tabela 28-1
Figure img0048
[01956] A Tabela 28-2 é uma continuação da Tabela 28-1. Tabela 28-2
Figure img0049
[01957] A Tabela 28-3 é uma continuação da Tabela 28-2. Tabela 28-3
Figure img0050
[01958] Das variantes mostradas na Tabela 28, IL6R-BP253/IL6R-L adicionados com as alterações existentes que aumentam a ligação a FcYRIIb exibiram atividades de ligação a FcYRIIb e FcYRIIaR aume n- tadas 277 vezes e 529 vezes aquelas de IL6R-B3/IL6R-L antes da in-trodução das alterações, respectivamente. Ainda, a atividade de ligação a FcYRIa de IL6R-BP253/IL6R-L foi também maior do que aquela de IL6R-B3/IL6R-L. Entretanto, a ligação a FcYRIIaH e ligação a FcYRIIIaV de IL6R-BP253/IL6R-L foram reduzidas comparado com aquelas de IL6R-B3/IL6R-L. Dentre outras variantes, IL6R- BP436/IL6R-L e IL6R-BP438/IL6R-L mostraram uma ligação a FcYRIa ligeiramente aumentada comparado com aquela de IL6R-B3/IL6R-L antes da introdução das alterações. Todas as outras variantes mostraram uma ligação a FcYRIa reduzida. Ainda, todas as variantes exibiram ligação a FcYRIIaH e ligação a FcYRIIIaV reduzidas comparado com aquelas de IL6R-B3/IL6R-L.
[01959] As variantes produzidas conforme descrito nesta seção foram comparadas com IL6R-BP253/IL6R-L, que é uma variante existente com ligação a FcYRIIb aumentada. O valor de KD(IIaH)/KD(IIb) de IL6R-BP480/IL6R-L, que é o mais baixo, foi 107,7, enquanto o valor de IL6R-BP426/IL6R-L, que era o mais alto, foi 8362. Desta maneira, os valores das duas variantes foram maiores do que 107,1 de IL6R/BP253/IL6R-L. entretanto, o valor KD(IIaR)/KD(IIb) de IL6R- BP479/IL6R-L, que era o mais baixo, foi 16,1, enquanto o valor de IL6R-BP559/IL6R-L, que era o mais alto, foi 58,4. Desta maneira, os valores das duas variantes eram maiores do que 0,2 de IL6R- BP253/IL6R-L. Esses resultados demonstram que a seletividade para FcYRIIb das variantes mostradas na Tabela 28 tinha sido aperfeiçoada comparado com a seletividade das variantes adicionadas com as modificações existentes que aumentam a ligação a FcYRIIb. Em particular, todos de IL6R-BP559/IL6R-L, IL6R-BP487/IL6R-L, IL6R-BP499/ IL6R-L, IL6R-BP498/IL6R-L, IL6R-BP503/IL6R-L, IL6R-BP488/IL6R-L, IL6R-BP490/IL6R-L, IL6R-BP445/IL6R-L, IL6R-BP552/IL6R-L, IL6R- BP507/IL6R-L, IL6R-BP536/IL6R-L, IL6R-BP534/IL6R-L, IL6R- 491/IL6R-L, IL6R-BP553/IL6R-L, IL6R-BP532/IL6R-L, IL6R- BP506/IL6R-L, IL6R-BP511/IL6R-L, IL6R-BP502/IL6R-L, IL6R- BP531/IL6R-L, IL6R-BP510/IL6R-L, IL6R-BP535/IL6R-L, IL6R- BP497/IL6R-L, IL6R-BP533/IL6R-L, IL6R-BP555/IL6R-L, IL6R- BP554/IL6R-L, IL6R-BP436/IL6R-L, IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R- BP440/IL6R-L, IL6R-BP538/IL6R-L, IL6R-BP429/IL6R-L, IL6R- BP438/IL6R-L, IL6R-BP565/IL6R-L, IL6R-BP540/IL6R-L, BP426/IL6R- L, IL6R-BP437/IL6R-L, IL6R-BP439/IL6R-L, IL6R-BP551/IL6R-L, IL6R- BP494/IL6R-L, IL6R-BP537/IL6R-L, IL6R-BP550/IL6R-L, IL6R- BP556/IL6R-L, IL6R-BP539/IL6R-L, IL6R-BP558/IL6R-L, IL6R- BP425/IL6R-L e IL6R-BP495/IL6R-L, sua ligação a FcYRIIb foi maior do que aquela de IL6R-BP253/IL6R-L adicionado com a modificação existente que aumenta a ligação a FcYRIIb. Do acima, o aumento da ligação a FcYRIIb varia de a partir de 321 vezes (mais baixa) a 3100 vezes (mais alta), comparado com a ligação a IL6R-B3/IL6R-L (que é definida ser 1), de IL6R-BP495/IL6R-L a IL6R-BP498/IL6R-L, respecti-vamente. Desta maneira, pode ser dito que essas variantes são supe-riores em ambos o nível e seletividade de aumento da atividade de ligação a FcYRIIb comparado com a técnica anterior.
Exemplo 20 Preparação de anticorpos que se ligam a IgA humana de uma maneira dependente de cálcio (20-1) Preparação de IgA humana (hIgA)
[01960] Os Exemplos 2 a 4 mostram que moléculas que têm ligação a FcYR de camundongo aumentada e que se ligam de uma maneira dependente do pH a receptor de IL-6 humano como um antígeno podem reduzir significantemente a concentração do antígeno em plasma. Então, um teste adicional foi realizado usando anticorpos para IgA humana como um antígeno, a fim de avaliar a presença de um efeito similar de eliminação de antígenos solúveis do plasma em um organismo vivo administrado com anticorpos que têm ligação a FCYR de camundongo aumentada e que se ligam de uma maneira dependente do pH a antígenos outros que não receptor de IL-6 humano. O antíge- no, IgA humana (daqui em diante também referida como hIgA) (sua região variável é de um anticorpo anti-IL6R humano) foi preparado usando a técnica de recombinação que segue. hIgA foi expressa através de cultura de células hospedeiro contendo um vetor recombinante carregando H (WT)-IgA1 (SEQ ID NO: 145) e L (WT) (SEQ ID NO: 42) e purificado através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando cromatografia de troca de ion e cromatografia de filtragem em gel.
(20-2) Expressão e purificação de um anticorpo que se liga a hIgA
[01961] GA2-IgG1 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 146; cadeia leve, SEQ ID NO: 147) é um anticorpo que se liga a hIgA. Uma sequência de DNA codificando GA2-IgG1 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 146; cadeia leve, SEQ ID NO: 147) foi inserida em um plasmídeo de expressão de célula animal através de um método conhecido daqueles versados na técnica. O anticorpo foi expresso e purificado através do método descrito abaixo. Células da linhagem 293-F FreeStyle derivada de célula de rim fetal humano (Invitrogen) foram suspensas em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen). A suspensão celular foi plaquea- da em uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml em 3 ml a cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. Então, o plasmídeo preparado foi introduzido em células através do método de lipofecção. As células foram culturadas em uma incubadora de CO2 (37° C, CO2 8%, 90 rpm) por 4 dias. A partir do sobrenadante de cultura isolado, o anticorpo foi purificado através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Bioscience). A absorbância (comprimento de onda: 280 nm) da solução do anticorpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro. A con-centração de anticorpo foi determinada usando o coeficiente de extinção calculado a partir do valor medido através do método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(20-3) Avaliação do anticorpo isolado quanto à sua habilidade de ligação a hIgA dependente de cálcio
[01962] O anticorpo isolado conforme descrito no Exemplo (20-2) foi avaliado quanto à sua atividade de ligação a hIgA (constante de disso-ciação, KD (M) usando Biacore T200 (GE Healthcare). A atividade de ligação foi medida usando um tampão de atividade, Tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l (pH 7,4 ou pH 5,8) contendo 3 μM ou CaCl2 1,2 mM. Uma quantidade apropriada de Proteína A/G recom- binante (Thermo Scientific) foi imobilizada em um Sensor chip CM5 (GE Healthcare) através de um método de acoplamento de amino, e o anticorpo foi deixado se ligar a ele. Então, uma concentração apropriada de hIgA (descrito em (A1-1)) foi injetada como um analito e deixada interagir com o anticorpo no sensor chip. A medição foi realizada a 37° C. Após a medição, 10 mmol/L de glicina-HCl (pH 1,5) foram injetados para regenerar o sensor chip. A partir do resultado da medição, a constante de dissociação KD (M) foi calculada através da análise do ajuste de curva e análise de equilíbrio usando Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare). O resultado é mostrado na Tabela 29. GA2- IgG1 se ligou fortemente a hIgA em uma concentração de Ca2+ de 1,2 mM e se ligou fracamente a hIgA em uma concentração de Ca2+ de 3 μM. Entretanto, em uma concentração de Ca2+ de 1,2 mM, GA2-IgG1 se ligou fortemente a IgA humano em pH 7,4 e se ligou fracamente a IgA humano em pH 5,8. Em suma, GA2-IgG1 foi demonstrado se ligar a IgA humano de uma maneira dependente do pH e cálcio. Tabela 29
Figure img0051
Exemplo 21 Preparaçã io de variantes de anticorpo que se ligam a hIgA de uma maneira dependente de cálcio
[01963] Em seguida, para acelerar mais a eliminação de antígeno (hIgA) do plasma, GA2-F1087 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 148) foi produzido substituindo Lys por Asp na posição 326 (numeração EU) em GA2-IgG1 para aumento da ligação a FCYR de camundongo de GA2-IgG1 que se liga a hIgA de uma maneira dependente de cálcio. Uma sequência de DNA codificando GA2-F1087 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 148; cadeia leve, SEQ ID NO: 147) foi inserida em um plasmí- deo de expressão animal através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Variantes de anticorpo foram expressas através do método descrito acima usando o plasmídeo. As concentrações das variantes foram medidas após purificação. Anticorpos compreendendo a modificação acima exibiram ligação a FcyR de camundongo signifi- cantemente aumentada, conforme mostrado no Exemplo (4-3).
Exemplo 22 Avaliação do efeito sobre a retenção de antígeno no plasma em camundongos normais administrados com anticorpos de ligação a hIgA dependente de Ca
[01964] hIgA (IgA humano, preparado conforme descrito no Exemplo (20-1) foi administrado sozinho ou em combinação com um anticorpo anti-hIgA a camundongos normais (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão). Após administração, a dinâmica in vivo de anti-corpos hIgA e anti-hIgA foi avaliada. Uma solução de hIgA (80 μg/ml) ou uma solução mista de hIgA e um anticorpo anti-hIgA foi administrada de uma vez em uma dose de 10 mg/kg na veia caudal. Os anticorpos anti-hIgA usados foram GA2-IgG1 e GA2-F1087 descritos acima.
[01965] Em todas as soluções misturadas, a concentração de hIgA foi 80 μg/ml e a concentração de anticorpo anti-hIgA foi 2,69 mg/ml. Neste experimento, os anticorpos anti-hIgA estavam presentes signifi- cantemente em excesso com relação a hIgA, e então a maior parte do hIgA foi pensada se ligar aos anticorpos. No grupo administrado com GA-IgG1, de camundongos, o sangue foi coletado cinco minutos, sete horas, um dia, dois dias, três dias e sete dias após administração. Entretanto, no grupo administrado com GA-F1087, de camundongos, o sangue foi coletado cinco minutos, 30 minutos, uma hora, duas horas, um dia, três dias e sete dias após a administração. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado a 12.000 rpm e 4° C por 15 minutos para isolar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador a -20° C ou abaixo até o uso.
(22-2) Determinação da concentração de anticorpo anti-hIgA no plasma em camundongos normais através do método ELISA
[01966] Concentrações de anticorpo anti-hIgA em plasma de camundongo foram medidas através do método ELISA. Primeiro, para preparar uma placa imobilizada com IgG anti-humano, Fragmento F(ab’)2 (específico de cadeia Y) de IgG Anti-Humano de Anticorpo (SIGMA) foi separado em alíquotas para cada cavidade de uma Nunc- Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge Nunc International) e a placa foi deixada ficar a 4° C de um dia para o outro. Amostras de curva de calibragem de anticorpo anti-hIgA preparado como soluções padrão para a concentração no plasma (0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01563 e 0,007813 μg/ml) e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluído 100 vezes ou mais foram separadas em alíquotas para a placa imobilizada com IgG anti-humano mencionada acima. Após uma hora de incubação da placa a 25° C, Conjugado de Biotina (BIOT) (específica de cadeia Y) de IgG Anti-Humano de Cabra (Southern Biotechnology Associates Inc.) foi separado em alíquotas para cada cavidade da placa. Então, a placa foi incubada a 25° C por uma hora. Em seguida, Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi separado em alíquotas para cada cavidade da placa. Então, a placa foi incubada a 25° C por uma hora. Reação cromogênica foi realizada usando como um substrato TMB One Compnente HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após o término da reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absorbância da solução de reação em cada cavidade foi medida a 450 nm com uma leitora de micropla- ca. Concentrações de anticorpo anti-hIgA em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância da curva padrão usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo das concentrações de anticorpo de GA2-IgG1 e GA2- F1087 no plasma de camundongos normais após administração intravenosa, que foram medidas através do método descrito acima, é mostrado na Fig. 45. Os resultados demonstram que, com relação ao clone GA2-IgG1 que tem atividade de ligação a hIgA forte, dependente do pH, a concentração no plasma do anticorpo não é significantemente reduzida mesmo se a ligação a FcyR for aumentada.
(22-3) Determinação da concentração de hIgA no plasma através do método ELISA
[01967] Concentrações de hIgA em plasma de camundongo foram medidas através do método ELISA. Primeiro, para preparar uma placa imobilizada com IgA anti-humano, Anticorpo IgA Anti-Humano de Cabra (BETHYL) foi separado em alíquotas para cada cavidade de uma Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge Nunc International), e a placa foi deixada ficar a 4° C de um dia para o outro. Amostras de curva de calibragem de anticorpo hIgA foram preparadas como soluções padrão para a concentração no plasma (0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,00625 μg/ml) foram usadas. 100 μl e cada uma das amostras de curva de calibragem e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídos 100 vezes ou mais foram combinados com 200 μl de 500 ng/ml de hsL6R. Isso foi misturado e incubado em temperatura ambiente por uma hora. Então, 100 μl da mistura foram separados em alíquotas para a placa imobilizada com IgA anti-humano. A placa foi deixada permanecer em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, Anticorpo IL-6 R Anti-humano Biotinilado (R&D) foi separado em alíquotas para cada cavidade da placa. Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi separada em alíquotas para cada cavidade da placa. A placa foi incubada em temperatura ambiente por uma hora. Reação cromogênica foi realizada usando como um substrato TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após terminar a reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), a absor- bância da solução de reação em cada cavidade foi medida a 450 nm com uma leitora de microplaca. As concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância da curva padrão usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo da concentração de hIgA no plasma de camundongos normais após administração intravenosa, que foi medida através do método acima, é mostrado na Fig. 46.
[01968] O resultado mostrou que, em camundongos administrados com hIgA em combinação com GA2-IgG1 tendo uma atividade de ligação a hIgA dependente de Ca de 100 vezes ou mais, eliminação de hIgA foi acelerada comparado com a administração de hIgA sozinho. Entretanto, no plasma de camundongos administrados com GA2- F1087 com ligação aumentada a hIgA e FCYR, a concentração de hIgA foi reduzida abaixo da faixa mensurável (0,006 μg/ml ou mais) um dia após administração, e então a eliminação de hIgA foi significantemente acelerada comparado com o plasma de camundongos administrados com GA-IgG1. As constatações descritas nos Exemplos 2 a 7 acima demonstram o efeito de eliminação de antígeno aumentado de anticorpos com ligação a FcyR em camundongos administrados com anticorpo IL6R e anti-IL6R. Da mesma maneira, um efeito similar foi também demonstrado ser obtido em camundongos administrados com o antígeno hIgA e anticorpo anti-hIgA.
Exemplo 23 Preparação de um anticorpo anti-IgE dependente do pH (23-1) Preparação de anticorpo IgE anti-humano
[01969] A fim de preparar um anticorpo IgE anti-humano dependente do pH, IgE humano (cadeia pesada, SEQ ID NO: 149; cadeia leve, SEQ ID NO: 150) (sua região variável é de um anticorpo glipicano 3 anti-humano) foi expresso como um antígeno usando FreeStyle293 (Life Technologies). O IgE humano expresso foi preparado e purificado através de um método cromatográfico geral conhecido daqueles versados na técnica. Um anticorpo que se liga a IgE humano de um maneira dependente do pH foi selecionado de muitos anticorpos isolados. As regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo IgE anti-humano selecionado foram fundidas com uma região constante de cadeia pesada de IgG1 humana e uma região constante de cadeia leve humana, e o gene de anticorpo resultante foi inserido em um vetor. Usando o vetor, um anticorpo IgE anti-humano recombinante foi expresso e purificado. O anticorpo preparado foi chamado clone 278 (daqui em diante referido como 278-IgG1; cadeia pesada, SEQ ID NO: 151, cadeia leve, SEQ ID NO: 152).
(23-2) Avaliação do anticorpo IgE anti-humano quanto à atividade de ligação a IgE humano e atividade de ligação dependente do pH
[01970] Anticorpos capazes de dissociação de antígenos no endos- somo podem ser produzidos de tal maneira que eles se ligam a antí- genos não apenas de uma maneira dependente do pH, mas também de uma maneira dependente de Ca. Desta maneira, 278-IgG1 e o anticorpo IgG1 humano controle Xolair (omalizumabe, Novartis) sem habilidade de ligação a IgE dependente do pH/Ca foram avaliados quanto à habilidade de ligação dependente do pH e habilidade de ligação dependente do pH/Ca a IgE humano (hIgE). Especificamente, 278-IgG1 e Xolair foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a hIgE (constante de dissociação, KD (M)) usando Biacore T200 (GE Healthcare). As medições foram realizadas usando os três tipos de tampões de processo que seguem:
[01971] CaCl2 1,2 mmol, Tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, pH 7,4
[01972] CaCl2 1,2 mmol, Tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, pH 5,8
[01973] CaCl2 3 μmol, Tween20 0,05%, ACES 20 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, pH 5,8
[01974] Uma quantidade apropriada de um peptídeo (daqui em diante referido como "peptídeo GPC3 biotinilado") resultante da adição de biotina ao Lys C-terminal de uma sequência quimicamente sintetizada derivada de proteína glipicano 3 humana (SEQ ID NO: 153) foi carregada em um Sensor chip SA (GE Healthcare) e imobilizada no Sensor Chip AS com base em afinidade com biotina/estreptavidina. Uma concentração apropriada de IgE humano foi injetada e capturada pelo peptídeo GPC3 biotinilado para imobilizar IgE humano no chip. Uma concentração apropriada de 278-IgG1 foi injetada como um anali- to, e deixada interagir com IgE humano no sensor chip. Então, 10 mmol/L de glicina-HCl (pH 1,5) foram injetados para regenerar o sen sor chip. Todo o ensaio para a interação foi realizado a 37° C. Usando Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare), os resultados do ensaio foram analisados através de ajuste de curva para determinar a constante de taxa de ligação ka (1/Ms) e constante de taxa de dissoci-ação kd (1/s). A constante de dissociação KD (M) foi calculada a partir das constantes acima. Então, a ligação dependente do pH foi avaliada através do cálculo da razão de KD de cada anticorpo entre as condições de pH 5,8/Ca 1,2 mM e pH 7,4/Ca 1,2 mM. A ligação dependente do pH/Ca foi avaliada através do cálculo da razão de KD de cada anticorpo entre as condições de pH 5,8/Ca 3 μM e pH 7,4/Ca 1,2 mM. Os resultados são mostrados na Tabela 30. Tabela 30
Figure img0052
Exemplo 24 Preparação de uma variante de anticorpo que se liga a IgE humano de uma maneira dependente do pH
[01975] Em seguida, para acelerar mais a eliminação de antígeno (IgE humano) do plasma, uma sequência de DNA codificando 278- F1087 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 154; cadeia leve, SEQ ID NO: 152) com uma substituição de Lys por Asp na posição 326 (numeração EU) em 278-IgG foi inserida em um plasmídeo de expressão animal através de um método conhecido daqueles versados na técnica a fim de aumentar a ligação a FCY de camundongo de 278-IgG1 que se liga a IgE humano de uma maneira dependente do pH. As variantes de anticorpo foram expressas através do método mencionado acima usando células animais introduzidas com o plasmídeo. As concentrações das variantes de anticorpo foram determinadas após purificação.
Exemplo 25 Avaliação In vivo de 278-IgG1 (25-1) Preparação de IgE humano (hIgE (Asp6)) para avaliação in vivo
[01976] hIgE (Asp6) (sua região variável é de um anticorpo glipica- no 3 anti-humano), que é um IgE humano para avaliação in vivo, com-preendendo a cadeia pesada (SEQ ID NO: 155) e cadeia leve (SEQ ID NO: 150), foi preparado através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo (23-1). hIgE (Asp6) é uma molécula em que aspara- gina foi substituída com ácido aspártico nos seis sítios de N- glicosilação em IgE humano, de maneira que mudanças dependentes do tempo na concentração de IgE humano como um antígeno no plasma não afetam a heterogeneidade de cadeias de açúcar N-ligadas de IgE humano.
(25-2) Avaliação do efeito de aceleração de eliminação de IgE humano do plasma de camundongos normais administrados com clone 278
[01977] Conforme descrito nos Exemplos 2 a 4, e 22, a concentração de antígeno foi demonstrada ser significantemente reduzida no plasma de camundongos administrados com as moléculas que se ligam de uma maneira dependente do pH a receptor de IL-6 humano ou IgA humano como um antígeno, e cuja ligação a FcyR de camundongo foi aumentada. Um teste adicional foi realizado usando anticorpos para IgE humano como um antígeno para avaliar se um efeito similar de eliminação de antígenos solúveis do plasma de um organismo vivo administrado com anticorpos com ligação a FcyR de camundongo au- mentada que se ligam de uma maneira dependente do pH a antígenos outros que não receptor de IL-6 humano e IgA humano, quando a ligação a FCYR de camundongo é aumentada.
[01978] hIgE (Asp6) e anticorpos IgE anti-humanos foram avaliados quanto à sua dinâmica in vivo após administração de hIgE (Asp6) sozinho ou hIgE (Asp6) em combinação com os anticorpos anti-hIgE (278-IgG1 e 278-F1087) a camundongos C57BL/6J (Charles River Japão). hIgE (Asp6) (20 μg/ml) ou uma mistura de hIgE (Asp6) e um anticorpo IgE anti-humano foi administrado uma vez a 10 mL/Kg na veia caudal (conforme descrito na Tabela 31, todos os anticorpos foram preparados na mesma concentração). Neste caso, cada anticorpo estava presente significantemente em excesso com relação a hIgE (Asp6) e então quase todo do hIgE (Asp6) foi pensado se ligar ao anticorpo. No grupo administrado com clone 278 (278-IgG1), dos camundongos, o sangue foi coletado cinco minutos, duas horas, sete horas, um dia, dois dias, quatro dias, cinco dias, sete dias, 14 dias e 21 dias após administração. No grupo administrado com 278-F1087, dos camundongos, o sangue foi coletado cinco minutos, 30 minutos, uma hora, duas horas, um dia, três dias, sete dias, 14 dias e 21 dias após administração. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado a 15.000 rpm e 4° C por 5 minutos para isolar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador a -20° C ou abaixo até o uso. Tabela 31
Figure img0053
(25-3) Determinação da concentração de anticorpo IgE anti-humano no plasma em camundongos normais
[01979] Concentrações de anticorpo anti-hIgE em plasma de ca- mundongo foram medidas através do método ELISA. Amostras de curva padrão foram preparadas em 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,00625 μg/ml para concentrações no plasma. Para assegurar a homogeneidade do complexo imune entre hIgE (Asp6) e anticorpo anti- hlgE, hIgE (Asp6) foi adicionado a 1 μg/ml às amostras de curva padrão e amostras de ensaio de plasma de camundongo. As amostras do grupo de administração de 278-hIgG1 e das amostras de curva padrão correspondentes foram deixadas permanecer em temperatura ambiente por 30 minutos. Entretanto, as amostras do grupo de administração de 278-F1087 e as amostras de curva padrão correspondentes foram agitadas a 37° C de um dia para o outro. Após incubação ou agitação, as amostras de curva padrão e amostras de ensaio de plasma de camundongo foram separadas em alíquotas para uma immunoplate (Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge Nunc International)) imobilizada com Anti-Human Kappa Light Chain Antibody (Bethyl Laboratories), e isso foi deixado permanecer/agitado em temperatura ambiente por duas horas (as amostras do grupo de administração de 278- F1087 e as amostras de curva padrão de 278-F1087) ou deixado permanecer a 4° C de um dia para o outro (as amostras do grupo de administração de 278-hIgG1 e as amostras de curva padrão de 278- hIgG1). Então, Anticorpo Secundário IgG (Fc) Anti-Humano de Coelho, conjugado à Biotina (Pierce Biotechnology) e Streptavidin-Poly HRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foram cada um reagidos em sucessão por uma hora. Reação cromogênica foi realizada usando como um substrato TMB One Componente HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após o término da reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), as concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base no desenvolvimento de cor através de um método para medição da absorbância a 450 nm com uma leitora de microplaca. As concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância da curva padrão usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo de concentrações de anticorpo em plasma após administração intravenosa, que foram determinadas através do método acima, é mostrado na Fig. 47. O resultado demonstra que, em camundongos administrados com as variantes resultantes do aumento da ligação a FCYR de 278-IgG1 com atividade de ligação a IgE humano forte, de-pendente do pH, a concentração de anticorpo no plasma dos camun-dongos não foi significantemente reduzida comparado com aquela de 278-IgG1.
(25-4) Determinação da concentração de hIgE (Asp6) no plasma em camundongos normais
[01980] Concentrações de hIgE (Asp6) em plasma de camundongo foram medidas através do método ELISA. Amostras de curva de calibragem foram preparadas em 192, 96, 48, 24, 12, 6 e 3 ng/ml para concentrações no plasma. Para assegurar a homogeneidade do complexo imune entre anticorpo hIgE (Asp6) e anti-hIgE, no grupo administrado com 278-hIgG1, Xolair (Novartis) foi adicionado a 10 μg/ml às amostras de curva padrão e ensaio de plasma de camundongo e as misturas foram deixadas permanecer em temperatura ambiente por 30 minutos. No grupo administrado com 278-F1087, 278-F1022 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 156; cadeia leve, SEQ ID NO: 152; preparados da mesma maneira que no Exemplo 24) ou 278-F760 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 157; cadeia leve, SEQ ID NO: 152; preparado da mesma maneira que no Exemplo 24) foi adicionado a 20 μg/ml, e as misturas foram agitadas a 37° C por 60 horas. As amostras de ensaio de plasma de camundongo foram separadas em alíquotas para uma immunoplate (MABTECH) imobilizada com IgE anti-humano ou uma immunoplate (Nunc F96 MicroWell Plate (Nalge Nunc International)) imobilizada com IgE anti-humano (clone 107, MABTECH) e disso foi deixado permanecer ou agitar em temperatura ambiente por duas horas ou deixado permanecer a 4° C de um dia para o outro. Então, proteína de núcleo GPC3 humana (SEQ ID NO: 158), anticorpo anti-GPC3 (prepa-ração na casa) biotinilado com NHS-PEG4-Biotin (Thermo Fisher Sci-entific) e Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foram cada um reagidos em sucessão por uma hora. Reação cromogênica foi realizada usando como um substrato TMB One Com-ponente HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após o término da reação com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), as concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base no desenvolvimento de cor através de um método para medição da ab- sorbância a 450 nm com uma leitora de microplaca. Alternativamente, reação cromogênica foi realizada usando como um substrato Super- Signal(r) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Sci-entific), e as concentrações em plasma de camundongo foram deter-minadas através de um método para medição da intensidade de lumi-nescência com uma leitora de microplaca. As concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância ou intensidade de luminescência da curva padrão usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo de concentrações de hIgE (Asp6) em plasma após administração intrave-nosa, que foram determinadas através do método acima, é mostrado na Fig. 48.
[01981] Com relação à eliminação de IgE humano sozinho, o resultado demonstra que, em camundongos administrados com IgE humano em combinação com 278-IgG1 tendo a atividade de ligação forte, dependente do pH, a eliminação de IgE humano foi acelerada comparado com a administração de IgE humano sozinho. Ainda, em camundongos administrados com IgE humano em combinação com 278- F1087 resultante do aumento da ligação a FCY de 278-IgG1, a elimina- ção de IgE humano foi demonstrada ser significantemente acelerada comparado com os camundongos administrados com IgE humano sozinho ou IgE humano em combinação com 278-IgG1. Isto é, foi mostrado que eliminação de antígeno foi acelerada não apenas em camundongos administrados com o anticorpo anti-IL6R mencionado acima e anticorpo anti-IgA com ligação a FCY aumentada, mas também em camundongos administrados com anticorpo anti-IgE com ligação a Fcy aumentada.
Exemplo de Referência 1 Construção de vetores de expressão de anticorpos IgG com aminoácido substituído
[01982] Mutantes foram preparados usando o QuickChange Site-Mutagenesis Kit (Stratagene) através do método descrito no manual de instruções apenso. Fragmentos de plasmídeo contendo os mutan- tes foram inseridos em vetores de expressão de célula animal para construir vetores de expressão de cadeia H e cadeia L. As sequências de nucleotídeo dos vetores de expressão resultantes foram determinadas através dos métodos conhecidos daqueles versados na técnica.
Exemplo de Referência 2 Expressão e purificação de anticorpos IgG
[01983] Os anticorpos foram expressos usando o método que segue. Linhagem de célula HEK293H derivada de célula de câncer de rim embriônico humano (Invitrogen) foi suspensa em DMEM (Invitro- gen) suplementado com Soro Bovino Fetal 10% (Invitrogen). As células foram plaqueados a 10 ml por placa em placas para células aderentes (10 cm de diâmetro; CORNING) em uma densidade celular de 5 a 6 x 105 células/ml e culturadas em uma incubadora de CO2 (37 °C, CO2 5%) por um dia e uma noite inteiros. Então o meio foi removido através de aspiração e 6,9 ml de meio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) foram adicionados. O plasmídeo preparado foi introduzido nas células através do método de lipofecção. Os sobrenadantes de cultura resul- tantes foram coletados, centrifugados (aproximadamente 2000 x g, 5 min, temperatura ambiente) para remover células e esterilizados através de filtragem em um filtro de 0,22 μm MILLEX (marca registrada)- GV (Millipore) para obter os sobrenadantes. Os anticorpos foram purificados a partir dos sobrenadantes de cultura obtidos através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences). Para determinar a concentração do anticorpo purificado, absorbância foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente de absorbância calculado através do método descrito em Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
Exemplo de Referência 3 Preparação de receptor de IL-6 humano solúvel (hsIL-6R)
[01984] Receptor de IL-6 humano recombinante de receptor de IL-6 humano que é o antígeno foi preparado como descrito abaixo. Uma linhagem CHO que expressa constantemente receptor de IL-6 humano solúvel composto de uma sequência de aminoácido consistindo do 1 ao 357° aminoácido a partir do terminal N conforme relatado em J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968 (daqui em diante, hsIL-6R) foi construída usando um método conhecido daqueles versados na técnica. hsIL-6R foi purificado do sobrenadante de cultura de linhagem CHO resultante através das duas etapas de cromatografia de coluna Blue Sepharose 6 FF e cromatografia de coluna de filtragem. A fração que eluiu como o pico principal na etapa final foi usada como o produto purificado final.
Exemplo de Referência 4 Preparação de anticorpos com um teor de fucose baixo
[01985] Anticorpos com um teor de fucose baixo foram expressos através do método que segue. Células de uma linhagem CHO defici- ente em transportador de fucose (Documento de Patente WO2006/067913) suspensas em meio α-MEM (Invitrogen) suplementado com Soro Bovino Fetal 10% (CCB) foram plaqueadas em uma concentração de 2E+6 células/10 ml em uma placa de célula aderente (diâmetro: 10 cm; CORNING). Após cultura em uma incubadora de CO2 (37° C, CO2 5%) por um dia e uma noite, o meio foi removido através de aspiração, e então 7 ml de meio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) foram adicionados a ele. 7 ml de meio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) foram adicionados a células separadamente preparadas e introduzidas com plasmídeo através de um método de lipofecção. Depois de 72 horas, os sobrenadantes de cultura foram coletados através de centrifugação (cerca de 2000 g, 5 minutos, temperatura ambiente) e esterilizados através de filtragem em filtro de 0,22 μm MILLEX®-GV (Millipore). A partir dos sobrenadantes de cultura resultantes, os anticorpos foram purificados através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences). As concentrações de anticorpos purificados foram calculadas usando o coeficiente de extinção calculado através do método descrito em Protein Science (1995) 4, 2411-2423, com base na absorbância a 280 nm medida através de um espectrofotômetro.
Exemplo de Referência 5 Aquisição de anticorpos que se ligam a receptor de IL-6 de uma maneira dependente de Ca a partir de uma biblioteca de anticorpo humano usando tecnologia de exibição de fago (5-1) Preparação de biblioteca de exibição de fago para anticorpos humanos puros
[01986] Uma biblioteca de exibição de fago para anticorpos humanos, consistindo em fagos múltiplos apresentando os domínios Fc de sequências de anticorpo humano mutuamente diferentes, foi construída de acordo com um método conhecido daqueles versados na técni- ca usando um RNA poli A preparado a partir de PBMC humana e RNA poli A humano comercial como um molde.
(5-2) Aquisição de fragmentos de anticorpo que se ligam a antígeno de uma maneira dependente de Ca a partir da biblioteca através de sepa-ração de conta
[01987] A biblioteca de exibição de fago construída para anticorpos humanos puros foi submetida à seleção inicial através de concentração apenas de fragmentos de anticorpo tendo uma habilidade de ligação a antígeno (receptor de IL-6) ou concentração de fragmentos de anticorpo usando a habilidade de ligação a antígeno (receptor de IL-6) dependente da concentração de Ca como um indicador. A concentração de fragmentos de anticorpo usando uma habilidade de ligação a antígeno (receptor de IL-6) dependente da concentração de Ca como um indicador foi conduzida através da eluição dos fagos da biblioteca de fago ligados a receptor de IL-6 na presença de íons de Ca com EDTA que quela os íons de Ca. Receptor de IL-6 biotinilado foi usado como um antígeno.
[01988] Os fagos foram produzidos a partir de Escherichia coli carregando o fagemídeo de exibição de fago construído. Uma solução de biblioteca de fago foi obtida diluindo com TBS uma população de fago precipitada através da adição de NaCl 2,5M/PEG 10% à solução de cultura de E. coli em que os fagos foram produzidos. Subsequentemente, BSA e CaCl2 foram adicionados à solução de biblioteca de fago em uma concentração final de BSA 4% e 1,2 mM de concentração de íon de cálcio. Um método de separação comum usando um antígeno imobilizado em contas magnéticas foi referido como um método de separação (J. Immunol. Methods (2008) 332 (1-2) 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2) 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 21220; Mol. Cell Proteomics (2003) 2(2) 61-9). Contas revestidas com NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads revestidas com NeutrAvidin) ou contas revestidas com estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidi- na) foram usadas como contas magnéticas.
[01989] Especificamente, 250 pmol do antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada para permitir o contato da dita solução de biblioteca de fago com o antígeno por 60 minutos em temperatura ambiente. Contas magnéticas, bloqueadas com BSA, foram adicionadas para se ligarem a complexos de antígeno-fago por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas uma vez com 1 mL de CaCl2 1,2 mM/TBS (TBS contendo CaCl2 1,2 mM). Subsequentemente, uma solução de fago foi recuperada através de um método de eluição geral para concentrar um fragmento de anticorpo tendo uma habilidade de ligação a receptor de IL-6 ou através de eluição a partir de contas suspensas em EDTA 2 mM /TBS (TBS contendo EDTA 2 mM) para concentrar um fragmento de anticorpo usando habilidade de ligação de um receptor de IL-6 de uma maneira dependente da concentração de Ca como um indicador. A solução de fago recuperada foi adicionada a 10 mL da linhagem de E. coli TG1 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600 de 0,40,7). A E. coli foi culturada com agitação suave a 37° C por 1 hora para permitir que os fagos infectassem a E. coli. A E. coli infectada foi inoculada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Subsequentemente, os fagos foram recuperados do meio de cultura da E. coli após inoculação para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[01990] Na segunda e subsequente separação, os fagos foram en-riquecidos usando a habilidade de ligação dependente de Ca como um indicador. Especificamente, 40 pmol do antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada para permitir o contato da biblioteca de fago com o antígeno por 60 minutos em temperatura ambiente. Contas magnéticas, bloqueadas com BSA, foram adicionadas para serem ligadas a complexos de antígeno-fago por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas com 1 mL de CaCl2 1,2 mM/TBST e CaCl2 1,2 mM/TBS. Subsequentemente, as contas, às quais 0,1 mL de EDTA 2 mM/TBS foi adicionado, foram suspensas em temperatura ambiente. Imediatamente depois disso, as contas foram separadas usando suporte magnético para coletar solução de fago. A solução de fago recuperada foi adicionada a 10 mL da linhagem TG1 de E. coli em uma fase de crescimento logarítmico (OD600 de 0,4-0,7). A E. coli foi culturada com agitação suave a 37° C por 1 hora para permitir que os fagos infectassem a E. coli. A E. coli infectada foi inoculada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Subsequentemente, os fagos foram recuperados do meio de cultura da E. coli após inoculação para coletar uma solução de biblioteca de fago. A separação usando a habilidade de ligação dependente de Ca como um indicador foi repetida várias vezes.
(5-3) Exame através de ELISA de fago
[01991] Um sobrenadante de cultura contendo fago foi coletado de acordo com um método de rotina (Methods Mol. Biol (2002) 178, 133145) a partir de uma única colônia de E. coli, obtida conforme acima descrito.
[01992] Um sobrenadante de cultura contendo fagos, ao qual BSA e CaCl2 foram adicionados em uma concentração final de BSA 4% e 1,2 mM de concentração de íon de cálcio, foi submetido a ELISA conforme descrito abaixo. Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μL de PBS contendo o antígeno marcado com biotina. Cada cavidade da dita placa foi lavada com PBST para remover o antígeno, e então as cavidades foram bloqueadas com 250 μL de BSA 4% - TBS por 1 hora ou mais. A dita placa com o sobrenadante de cultura preparado adicionado a cada placa, do qual o BSA 4% - TBS foi removido, foi deixada descansar sem ser perturbada a 37° C por 1 hora, permitindo a ligação de anticorpo apre- sentando fago ao antígeno presente em cada cavidade. A cada cavidade lavada com CaCl2 1,2 mM/TBST, CaCl2 1,2 mM/TBS ou EDTA 1 mM/TBS foi adicionado. A placa foi deixada descansar sem ser perturbada por 30 minutos a 37° C para incubação. Após lavagem com CaCl2 1,2 mM/TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS em uma concentração final de BSA 4% e 1,2 mM de concentração de cálcio ionizado foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi incubada por 1 hora. Depois de lavagem com CaCl2 1,2 mM /TBST, a reação cromogênica da solução em cada cavidade com uma solução única de TMB (ZYMED) adicionada foi parada através da adição de ácido sulfúrico. Subsequentemente, a dita cor foi medida através da medição da absorbância a 450 nm.
[01993] Como um resultado do ELISA de fago acima, a sequência de base de um gene amplificado com primers específicos e um fragmento de anticorpo identificado como tendo uma habilidade de ligação a antígeno dependente de Ca como um molde foi analisada.
(5-4) Expressão e purificação de anticorpo
[01994] Como um resultado do ELISA de fago acima, um clone identificado como tendo uma habilidade de ligação a antígeno dependente de Ca foi introduzido em um plasmídeo de expressão para células animais. Os anticorpos foram expressos conforme descrito abaixo. A linhagem FreeStyle 293-F (Invitrogen) derivada de células de rim fetal humano foi suspensa no FreeStyle 293 Expression Medium (Invi- trogen) seguido por inoculação de 3 mL em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades em uma densidade celular de 1,33 x 106 célu- las/mL. O plasmídeo preparado foi introduzido nas células através de lipofecção. As células foram culturadas por 4 dias em uma incubadora de CO2 (37° C, CO2 8%, 90 rpm). Os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante de cultura obtido acima através de um método conhecido na técnica usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences). Absorbância da solução de anticorpo purificada foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi calculada a partir das medições obtidas usando um coeficiente de extinção calculado através do método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
Exemplo de Referência 6 Exame da habilidade de ligação dependente de Ca dos anticorpos obtidos a receptor de IL-6 humano
[01995] Para examinar se ou não as atividades de ligação de anticorpos 6RL#9-IgG1 [cadeia pesada (SEQ ID NO: 44; uma sequência em que uma região constante derivada de IgG1 foi ligada à SEQ ID NO: 9); cadeia leve (SEQ ID NO: 45] e FH4-IgG1 [cadeia pesada (SEQ ID NO: 46;e cadeia leve SEQ ID NO:47], obtidos no Exemplo de Referência 5, a receptor de IL-6 humano são dependentes de Ca, a análise cinética das reações de antígeno-anticorpo desses anticorpos com receptor de IL-6 humano foi conduzida usando Biacore T100 (GE Healthcare). H54/L28-IgG1 [cadeia pesada: SEQ ID NO: 36; cadeia leve: SEQ ID NO: 37], descrito no WO 2009/125825, foi usado como um anticorpo controle que não tem nenhuma atividade de ligação dependente de Ca a receptor de IL-6 humano. A análise cinética das reações de antígeno-anticorpo foi conduzida em soluções com concentrações de íon de cálcio de 2 mM e 3 μM, ajustadas como condições de concentração de íon de cálcio alta e baixa, respectivamente. O anticorpo de interesse foi capturado em um Sensor chip CM4 (GE Healthcare) no qual uma quantidade apropriada de Protein A (Invitrogen) foi imobilizada através do método de acoplamento de amina. Dois tampões [ACES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05% (p/v) e CaCl2 2 mM (pH 7,4) ou ACES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05% (p/v) e 3 μmol/L de CaCl2 (pH 7,4)] foram usados como tampões de atividade. Esses tampões foram usados para diluição de receptor de IL-6 humano. Todas as medições foram conduzidas a 37° C.
[01996] Na análise cinética de reação de antígeno-anticorpo usando anticorpo H54L28-IgG1, o anticorpo H54L28-IgG1 capturado no sensor chip foi deixado interagir com receptor de IL-6 através da injeção de um diluente de receptor de IL-6 e tampão de atividade (sem expressão) em uma taxa de fluxo de 20 μL/min por 3 minutos. Subsequentemente, após a dissociação de receptor de IL-6 ter sido observada usando tampão de atividade em uma taxa de fluxo de 20 μL/min por 10 minutos, o senso chip foi regenerado através da injeção de glicina 10 mM-HCl (pH 1,5) em uma taxa de fluxo de 30 μL/min por 30 segundos. Parâmetros cinéticos, constante de ligação (ka) (l/Ms) e constante de taxa de dissociação (kd) (l/s), foram calculados a partir dos sen- sorgramas obtidos na medição. Esses valores foram usados para calcular a constante de dissociação (KD) (M) do anticorpo H54L28-IgG1 para receptor de IL-6 humano. Cada parâmetro foi calculado usando o Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare).
[01997] Na análise cinética de reação de antígeno-anticorpo usando anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1, o anticorpo HF4-IgG1 ou 6RL#9- IgG1 capturado no sensor chip foi deixado interagir com receptor de IL-6 através da injeção de um diluente de receptor de IL-6 e tampão de atividade (sem expressão) em uma taxa de fluxo de 5 μL/min por 15 minutos. Subsequentemente, o sensor chip foi regenerado através da injeção de glicina 10 mM-HCl (pH 1,5) em uma taxa de fluxo de 30 μL/min por 30 segundos. Constantes de dissociação (KD) (M) foram calculadas a partir dos sensorgramas obtidos na medição, usando o modelo de afinidade de estado uniforme. Cada parâmetro foi calculado usando o Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare).
[01998] As constantes de dissociação (KD) entre cada anticorpo e receptor de IL-6 na presença de CaCl2 2 mM, determinadas através do método acima, são mostradas na Tabela 32. Tabela 32
Figure img0054
[01999] O valor K D do anticorpo H54/L28-IgG1 sob a condição de concentração de Ca de 3 μM pode ser calculado da mesma maneira que na presença de concentração de Ca de 2 mM. Sob a condição de concentração de Ca de 3 μM, anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1 foram raramente observados estar ligados ao receptor de IL-6, desta maneira o cálculo de valores KD através do método descrito acima é difícil. No entanto, os valores KD desses anticorpos sob a condição de concentração de Ca de 3 μM podem ser estimados usando a Equação 3 (Biacore T100 Software Handbook, BR-1006-48, AE 01/2007) descrita abaixo.
[02000] [Equação 3]
[02001] Req=C x Rmax / (KD+C) +RI
[02002] O significado de cada parâmetro na [Equação 3] mencionada acima é como segue:
[02003] Req (RU): Níveis de ligação em estado uniforme
[02004] Rmax (RU): Capacidade de ligação de analito da superfície
[02005] RI (RU): Contribuição de índice refrativo de massa na amostra
[02006] C (M): Concentração de analito
[02007] KD (M): Constante de dissociação de equilíbrio
[02008] Os resultados aproximados de valores KD de constante de dissociação para os anticorpos e receptor de IL-6 em uma concentração de Ca de 3 μmol/L, estimada usando a [Equação 3] acima, são mostrados na Tabela 33. Na Tabela 33, os valores Req, Rmax, RI e C são estimados com base no resultado do ensaio. Tabela 33
Figure img0055
[02009] Com base nas constatações descritas acima, foi previsto que a KD entre receptor de IL-6 e anticorpo FH4-IgG1 ou anticorpo 6RL#9-IgG1 foi aumentada em cerca de 60 ou 120 vezes (a afinidade foi reduzida em 60 ou 120 vezes ou mais) quando a concentração de CaCl2 no tampão foi diminuída de 2 mM para 3 μM.
[02010] A Tabela 34 sumariza os valores de KD em concentrações de CaCl2 de 2 mM e 3 μM e a dependência de Ca dos valores de KD para os três tipos de anticorpos H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 e 6RL#9- IgG1. Tabela 34
Figure img0056
[02011] Nenhuma diferença na ligação do anticorpo H54/L28-IgG1 ao receptor de IL-6 devido à diferença em concentração de Ca foi observada. Por outro lado, a ligação de anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9- IgG1 ao receptor de IL-6 foi observada ser significantemente atenuada sob a condição da concentração de Ca baixa (Tabela 34).
Exemplo de Referência 7 Exame de ligação de íon de cálcio ao anticorpo obtido
[02012] Subsequentemente, a temperatura intermediária da desnaturação térmica (valor Tm) foi medida através de calorimetria de varre- dura diferencial (DSC) como um indicador para exame de ligação de íon de cálcio ao anticorpo (MicroCal VP-Capillary DSC. MicroCal). A temperatura intermediária de desnaturação térmica (valor Tm) é um indicador de estabilidade. A temperatura intermediária de desnaturação térmica (valor Tm) se torna maior quando uma proteína é estabilizada através de ligação a íon de cálcio, comparado com nenhuma ligação a íon de cálcio (J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). A atividade de ligação de íon de cálcio a anticorpo foi examinada através do exame de mudanças no valor de Tm do anticorpo dependendo das mudanças na concentração de íon de cálcio da solução de anticorpo. O anticorpo purificado foi submetido à diálise (EasySEP, TOMY) usando uma solução externa de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM e CaCl2 2 mM (pH 7,4) ou Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM e CaCl2 3 μM (pH 7,4). Medição de DSC foi conduzida em uma taxa de aquecimento de 240° C/h de 20 a 115° C usando uma solução de anticorpo preparada em cerca de 0,1 mg/mL com o dialisato como uma substância de teste. As temperaturas intermediárias de desnaturação térmica (valores Tm) dos domínios Fab de cada anticorpo, calculadas com base na curva de desnaturação obtida através de DSC, são mostradas na Tabela 35. Tabela 35
Figure img0057
[02013] A partir dos resultados mostrados na Tabela 35, é indicado que os valores Tm do Fab dos anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1, que mostram uma habilidade de ligação dependente de cálcio, variaram com mudanças na concentração de íon de cálcio, enquanto os valores Tm do Fab do anticorpo H54/L28-IgG1 que não mostra nenhuma habilidade de ligação dependente de cálcio não variam com mudanças na concentração de íon de cálcio. A variação nos valores Tm do Fab dos anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9IgG1 demonstra que íons de cálcio se ligaram a esses anticorpos para estabilizar as porções Fab. Os resultados acima mostram que íons de cálcio se ligaram aos anticorpos FH4-IgG1 e 6RL#9-IgG1, enquanto nenhum íon de cálcio se ligou ao anticorpo H54/L28-IgG1.
Exemplo de Referência 8 Identificação de sítio de ligação a íon de cálcio em anticorpo 6RL#9 através de cristalografia de raios x (8-1) Análise de estrutura de cristal de raios x
[02014] Como descrito no Exemplo de Referência 13, as medições da temperatura de desnaturação térmica Tm sugeriram que o anticorpo 6RL#9 se liga ao íon de cálcio. Entretanto, não foi predita qual porção do anticorpo 6RL#9 se liga ao íon de cálcio. Então, pelo uso da técnica da cristalografia com raios x, os resíduos de anticorpo 6RL#9 que interagem com o íon de cálcio foram identificados.
(8-2) Expressão e purificação do anticorpo 6RL#9
[02015] O anticorpo 6RL#9 foi expresso e purificado por análise de estrutura de cristal de raios X. Especificamente, plasmídeos de expressão animal foram construídos para serem capazes de expressar a cadeia pesada ( SEQ ID NO: 44) e cadeia leve (SEQ ID NO: 45) de anticorpo 6RL#9 foram introduzidos transientemente em células de animais. Os plasmídeos construídos foram introduzidos pelo método da lipofecção em células FreeStyle 293-F (Invitrogen) derivadas de célula de rim fetal humano, suspensas em 800 ml do FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) (densidade celular final: 1 x 106 célu- las/mL). As células com plasmídeo introduzido foram culturadas em uma incubadora de CO2 (37°C, 8% de CO2, 90 rpm) por cinco dias. A partir do sobrenadante de cultura obtido como descrito acima, os anticorpos foram purificados através de um método conhecido por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amers- ham Biosciences). A absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro. As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores medidos usando um coeficiente de extinção calculado pelo método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(8-3) Purificação do fragmento Fab de anticorpo 6RL#9
[02016] O anticorpo 6RL#9 foi concentrado para 21 mg/ml usando um ultrafiltro com um ponto de corte de peso molecular de 10.000 MWCO. Uma amostra de 5 mg/mL de anticorpo (2,5 mL) foi preparada pela diluição da solução de anticorpo usando L-cisteína 4 mM / EDTA 5 mM / tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 6,5). 0,125 mg de papaína (Roche Applied Science) foi adicionado à amostra. Depois de agitar, a amostra foi incubada a 35°C por duas horas. Depois da incubação, um comprimido de Protease Inhibitor Cocktail Mini, sem EDTA (Roche Applied Science), foi dissolvido em 10 ml de tampão MES 25 mM (pH 6) e adicionado à amostra. A amostra foi incubada em gelo para parar a reação proteolítica da papaína. Depois, a amostra foi carregada em uma coluna de troca de cátion de 1 ml HiTrap SP HP (GE Healthcare) equilibrada com tampão MES 25 mM (pH 6), a jusante da qual uma coluna HiTrap MabSelect Sure Protein A de 1 ml (GE Healthcare) foi conectada em tandem. Uma fração purificada do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 foi obtida pela realização da eluição com um gradiente de concentração linear de NaCl até 300 mM no tampão descrito acima. Depois, a fração purificada resultante foi concentrada para cerca de 0,8 ml usando um ultrafiltro 5000 MWCO. O concentrado foi carregado em uma coluna de filtração em gel Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada com tampão HEPES 100 mM (pH 8) contendo NaCl 50 mM. O fragmento Fab purificado do anticorpo 6RL#9 para cristalização foi eluído da coluna usando o mesmo tampão. Todos os tratamentos de coluna descritos acima foram realizados em baixa temperatura de 6 a 7,5°C.
(8-4) Cristalização do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca
[02017] Sementes de cristal do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 foram previamente preparadas sob condições gerais. Então, o fragmento Fab purificado de anticorpo 6RL#9 em CaCl2 5 mM foi concentrado para 12 mg/ml com um ultrafiltro 5000 MWCO. Em seguida, a amostra concentrada como descrito acima foi cristalizada pelo método da difusão de vapor em gota pendente usando tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo 20% a 29% de PEG4000 como uma solução de depósito. As sementes de cristal acima mencionadas foram trituradas em tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo 29% de PEG4000 e CaCl2 5 mM e diluídas serialmente para 100 a 10.000 vezes. Então, 0,2 μL das soluções diluídas foi combinado com uma mistura de 0,8 μl da solução de depósito e 0,8 μl da amostra concentrada para preparar gotas de cristalização sobre uma lamínula de vidro. As gotas de cristal foram deixadas descansar a 20°C por dois a três dias para preparar cristais semelhantes a placas finas. Os dados de difração por raios x foram coletados usando os cristais.
(8-5) Cristalização do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca
[02018] O fragmento Fab purificado do anticorpo 6RL#9 foi concentrado para 15 mg/ml usando um ultrafiltro 5000 MWCO. Depois, a amostra concentrada como descrito acima foi cristalizada pelo método da difusão de vapor em gota pendente usando tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo18% a 25% de PEG4000 como uma solução de depósito. Cristais do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 obtido na presença de Ca foram triturados em tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo 25% de PEG4000 e diluídos serialmente para 100 a 10.000 vezes. Depois, 0,2 μL das soluções diluídas foi combinado com uma mistura de 0,8 μl da solução depósito e 0,8 μl da amostra concentrada para preparar gotas de cristalização sobre uma lamínula de vidro. As gotas de cristal foram deixadas descansar a 20°C por dois a três dias para preparar cristais semelhantes a placas finas. Os dados de difra- ção por raios x foram coletados usando os cristais.
(8-6) Medição de dados de difração de raios x de cristal de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca
[02019] Um cristal simples do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 preparado na presença de Ca foi imerso em solução de tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo PEG4000 35% e CaCl2 5 mM. O cristal simples foi pescado da solução externa usando um pino com uma alça de náilon fino presa e congelado em nitrogênio líquido. Os dados de difração de raios X do cristal congelado foram coletados do feixe linear BL-17A da Photon Factory na High Energy Accelerator Research Organization. O cristal congelado foi constantemente posto em uma corrente de nitrogênio a -178° C para manter em um estado congelado durante a medição. Um total de 180 imagens de difração foi coletado usando o detector de CCD Quantum315r (ADSC) acoplado ao feixe linear com rotação do cristal 1° de cada vez. A determinação da constante do látice, indexação do ponto de difração e a análise dos dados de difração foram realizadas usando os programas Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) e Scala (CCP4 Software Suite). Finalmente, os dados de intensidade da difração para resolução de 22 Â foram obtidos. O cristal pertence ao grupo espacial P2i2i2i com constante de látice a = 45,47 Â, b = 79,86 Â, c = 116,25 A, α = 90°, β = 90°, Y = 90°.
(8-7) Medição de dados de difração por raios x do cristal de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca
[02020] Cristais do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 preparados na ausência de Ca foram imersos em solução de tampão HEPES 100 mM (pH 7,5) contendo PEG4000 35%. Pela remoção da solução exte- rior da superfície de um cristal simples com um pino com alça de náilon fina presa o cristal simples foi congelado em nitrogênio líquido. Os dados de difração de raios X do cristal congelado foram coletados da linha de feixe BL-5A da Photon Factory na High Energy Accelerator Research Organization. O cristal congelado foi constantemente posto em uma corrente de nitrogênio a -178° C para manter sem um estado congelado durante a medição. Um total de 180 imagens de difração foi coletado usando o detector de CCD Quantum210r (ADSC) acoplado ao feixe linear com giro do cristal 1° de cada vez. A determinação da constante de látice, indexação do ponto de difração e a análise dos dados de difração foram realizadas usando os programas Xia2 (CCP4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) e Scala (CCP4 Software Suite). Finalmente, os dados de intensidade da difração até a resolução de 2,3 Â foram obtidos. O cristal pertence ao grupo espacial P2i2i2i com constante de látice a = 45,40 Â, b = 79,63 Â, c = 116,07 Â, α = 90°, β = 90°, Y = 90° e, portanto, é estruturalmente idêntico ao cristal preparado na presença de Ca.
(8-8) Análise de estrutura do cristal de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca
[02021] A estrutura cristalina do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na presença de Ca foi determinada por um método de substituição molecular usando o programa Phaser (CCP4 Software Suite). O número de moléculas em uma unidade assimétrica foi estimado ser um a partir do tamanho do látice do cristal e do peso molecular do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9. Com base na homologia de sequência primária, uma porção das posições de aminoácidos 112 a 220 da cadeia A e uma porção das posições de aminoácidos 116 a 218 da cadeia B na coordenada conformacional de PDB código 1ZA6 foram usadas como moléculas modelo para analisar as regiões CL e CH1. Então, uma porção das posições de aminoácidos 1 a 115 da cadeia B na coordenada conformacional de PDB código 1ZA6 foi usada como molécula modelo para analisar a região VH. Finalmente, uma porção das posições de aminoácidos 3 a 147 da cadeia leve na coordenada conformacional de PDB código 2A9M foi usada como molécula modelo para analisar a região VL. Com base nessa ordem, um modelo estrutural inicial para o fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 foi obtido através da determinação das funções de translação e rotação das posições e orientações das moléculas modelo para análise no látice do cristal. O fator de confiabilidade cristalográfica R para os dados de reflexão na resolução de 25 a 0,3 Â foi de 46,9% e R foi livre de 48,6% depois do refinamento do corpo rígido em que os domínios VH, VL, CH1 e CL foram cada um deixados se desviar do modelo estrutural inicial. Então, o refinamento do modelo foi obtido pela repetição do refinamento estrutural usando o programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) seguido pela revisão do modelo realizada usando o programa Coot (Paul Emsley) com referência aos mapas de densidade de elétron Fo-Fc e 2Fo-F em que os coeficientes Fo-Fc e 2Fo-Fc foram calculados usando o Fator Fo estrutural determinado experimentalmente, Fator Fc estrutural calculado com base no modelo e as fases. O refinamento final foi realizado usando o programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) com base nos mapas de densidade de elétron Fo-Fc e 2Fo-F pela adição de uma molécula de água e um íon de Ca no modelo. Com dados de reflexão de 21,020 na resolução de 25 a 2,2 Â, eventualmente o fator R de confiabilidade cristalográfica tornou-se 20,0% e R livre tornou-se 27,9% para o modelo que consiste em 3440 átomos.
(8-9) Medição de dados de difração de raios x do cristal de fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca
[02022] A estrutura cristalina do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 na ausência de Ca foi determinada com base na estrutura do cristal preparado na presença de Ca. Moléculas de água e íon de Ca foram omitidas da coordenada conformacional do cristal do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 preparado na presença de Ca. O fator de confiabilidade cristalográfica R para os dados de reflexão em uma resolução de 25 a 3,0 Â foi de 30,3% e R livre era de 31,7% depois do refinamento do corpo rígido em que os domínios VH, VL, CH1 e CL foram cada um deixados desviar. Depois, o refinamento do modelo foi obtido pela repetição do refinamento estrutural usando o programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) seguido pela revisão do modelo realizada usando o programa Coot (Paul Emsley) com referência aos mapas de densidade de elétron Fo-Fc e 2Fo-F em que os coeficientes Fo-Fc e 2Fo-Fc foram calculados usando o Fator Fo estrutural determinado experimentalmente, Fator Fc estrutural calculado com base no modelo e as fases. O refinamento final foi realizado usando o programa Refmac5 (CCP4 Software Suite) com base nos mapas de densidade de elétron Fo-Fc e 2Fo-F pela adição de uma molécula de água ao modelo. Com 18.357 dados de reflexão em uma resolução de 25 a 2,3 Â, eventualmente o fator R de confiabilidade cristalográfica tornou-se 20,9% e R livre tornou-se 27,7% for para o modelo que consiste em 3351 átomos.
(8-10) Comparação dos dados de difração cristalográfica com raios x dos fragmentos Fab do anticorpo 6RL#9 na presença e na ausência de Ca
[02023] Quando as estruturas cristalográficas dos fragmentos Fab do anticorpo 6RL#9 são comparadas na presença e na ausência de Ca, são vistas alterações significativas na CDR3 da cadeia pesada. A estrutura da CDR3 da cadeia pesada do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 determinada pela análise de estrutura de cristal de raios x é mostrada na Fig. 49. Especificamente, um íon de cálcio residia no centro da região de alça da CDR3 da cadeia pesada do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9 preparado na presença de Ca. O íon de cálcio foi presumido interagir com as posições 95, 96 e 100a (numeração Kabat) da CDR3 da cadeia pesada. Era acreditado que a alça de CDR3 da cadeia pesada que é importante para a ligação ao antígeno foi estabilizada pela ligação ao cálcio na presença de Ca e tornou-se uma estrutura ótima para a ligação a antígeno. Não há nenhum relato que demonstre que o cálcio se ligue à CDR3 da cadeia pesada do anticorpo. Portanto, a estrutura de ligação ao cálcio de CDR3 da cadeia pesada do anticorpo é uma estrutura nova.
[02024] O motivo de ligação de cálcio presente na CDR3 de cadeia pesada, revelado na estrutura do fragmento Fab do anticorpo 6RL#9, pode também se tornar um novo componente no projeto de uma biblioteca de Ca para obtenção de um domínio de ligação a antígeno incluído na molécula de ligação a antígeno da presente invenção que é contra um antígeno dependendo da concentração de ion de cálcio. O motivo de ligação de cálcio que foi introduzido em uma região variável de cadeia leve nos Exemplos de Referência 18 e 19 posteriormente descritos e, por exemplo, uma biblioteca contendo a CDR3 de cadeia pesada do anticorpo 6RL#9 e resíduos flexíveis em outras CDRs incluindo a cadeia pesada são imaginados ser possíveis.
Exemplo de Referência 9 Preparação de anticorpos que se ligam à IL-6 de uma maneira dependente de Ca a partir de uma biblioteca de anticorpo humano usando técnicas de exibição de fago (9-1) Construção de uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos puros
[02025] Uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano contendo múltiplos fagos que exibem várias sequências de domínio Fab de anticorpo humano foi construída através de um método conhecido por aqueles versados na técnica usando, como um modelo, poli RNA preparado a partir de PBMC humana, poli RNA comercialmente disponível e similar.
(9-2) Preparação de fragmentos de anticorpo que se ligam ao antígeno de uma maneira dependente de Ca a partir de uma biblioteca através de separação de conta
[02026] A seleção primária da biblioteca de exibição de fago construída de anticorpos humanos puros foi realizada pelo enriquecimento de fragmentos de anticorpo que possuem atividade de ligação ao antí- geno (IL-6). O antígeno usado foi IL-6 marcado com biotina.
[02027] Os fagos foram produzidos a partir de E. coli que carrega o fagemídeo construído para a exibição de fago. Para precipitar os fagos produzidos por E. coli, NaCl 2,5 M / PEG 10% foi adicionado ao meio de cultura de E. coli. A fração de fago foi diluída com TBS para preparar uma solução de biblioteca de fago. Então, BSA e CaCl2 foram adicionados à solução de biblioteca de fago em concentrações finais de BSA 4% e íon de cálcio 1,2 mM, respectivamente. O método de separação usado foi um método de separação convencional que usa esferas magnéticas imobilizadas com antígeno (J. Immunol. methods. (2008) 332(1-2): 2-9; J. Immunol. methods. (2001) 247(1-2): 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2): 212-20; Mol. Cell Proteomics (2003) 2(2): 61-9). As contas magnéticas usadas eram contas revestidas com NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads revestidas com NeutrAvidin) e contas revestidas com estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidi- na).
[02028] Especificamente, 250 pmol do antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada. Então, a solução foi contatada com o antígeno em temperatura ambiente por 60 minutos. As contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e o complexo antígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com CaCl2 1,2 mM /TBST (TBST contendo CaCl2 1,2 mM), e depois duas vezes com 1 ml de CaCl2 1,2 mM /TBST (TBST contendo CaCl2 1,2 mM). Depois, 0,5 ml de 1 mg/ml de tripsina foi adicionado às contas. Depois de 15 minutos de dispersão em tem-peratura ambiente, as contas foram imediatamente separadas usando um suporte magnético para coletar uma suspensão de fago. A suspensão de fago preparada foi adicionada a 10 ml de E. coli da linhagem TG1 na fase de crescimento logarítmico (OD600 = 0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação cuidadosa a 37°C por uma hora para infectar os fagos. A E. coli infectada foi semeada em uma placa (225 mm x 225 mm). Então, os fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[02029] Na segunda rodada e separação subsequente, os fagos foram enriquecidos usando a atividade de ligação dependente de Ca como um indicador. Especificamente, 40 pmol do antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada. Então, a biblioteca de fago foi colocada em contato com o antí- geno em temperatura ambiente por 60 minutos. As contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e o complexo antígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 ml de CaCl2 1,2 mM /TBST e CaCl2 1,2 mM /TBS. Depois, 0,1 ml de EDTA 2mM/TBS foi adicionado às contas. Depois da dispersão em temperatura ambiente, as contas foram imediatamente separadas usando um suporte magnético para coletar uma suspensão de fago. A proteína pIII (proteína pII derivada de fago auxiliar) foi clivada dos fagos que não exibiam Fab pela adição de 5 μl de tripsina 100 mg/ml à suspensão de fago coletada para eliminar a habilidade dos fagos não apresentando Fab de infectar E. coli. Os fagos coletados do estoque de fago líquido tripnizado foram adicionados a 10 ml de células de E. coli da linhagem TG1 na fase de crescimento logarítmico (OD600 = 0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação cuidadosa a 37°C por uma hora para infectar o fa- go. A E. coli infectada foi semeada em uma placa (225 mm x 225 mm). Então, os fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar um estoque líquido de biblioteca de fago. O separação foi realizado três vezes usando a atividade de ligação dependente de Ca como um indicador.
(9-3) Avaliação através de ELISA de fago
[02030] Sobrenadantes de cultura contendo fagos foram coletados a partir de colônias isoladas de E. coli obtidas pelo método descrito acima de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145). BSA e CaCl2 foram adicionados em concentrações finais de BSA 4% e concentração de íon de cálcio 1,2 mM, respectivamente, aos sobrenadantes de cultura contendo fago.
[02031] Os sobrenadantes foram submetidos ao ELISA pelo seguinte procedimento. Uma placa de microtitulação de 96 cavidades Strep- taWell (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μL de PBS contendo o antígeno marcado com biotina. O antígeno foi removido pela lavagem de cada cavidade da placa com PBST. Depois, as cavidades foram bloqueadas com 250 μl de BSA 4%-TBS por uma hora ou mais. Depois da remoção de BSA 4%-TBS, os sobrenadantes de cultura preparados foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada a 37°C por uma hora de maneira que os fagos exibindo anticorpo foram deixados se ligar ao antígeno em cada cavidade. Depois que cada cavidade foi lavada com CaCl21,2 mM/TBST, CaCl21,2 mM /TBS ou EDTA1 mM /TBS foi adicionado. A placa foi deixada incubar a 37°C por 30 minutos. Depois de lavar com CaCl2 1,2 mM/TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado com HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS contendo BSA e íon de cálcio em concentrações finais de 4% e 1,2 mM de íon de cálcio foi adicionado a cada cavidade e a placa foi incubada por uma hora. Depois de lavar com de CaCl2 1,2 mM/TBST, uma solução simples de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi parada pela adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada pela medição da absorbância a 450 nm.
[02032] A partir dos 96 clones isolados, o anticorpo 6KC4-1#85 tendo atividade de ligação à IL-6 dependente de Ca foi obtido através de ELISA de fago. Usando os fragmentos de anticorpo que foram previstos ter uma atividade de ligação a antígeno dependente de Ca com base no resultado do ELISA de fago descrito acima como modelo, genes foram amplificados com primers específicos e suas sequências foram analisadas. As sequências da região variável de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo 6KC4-1#85 são mostradas nas SEQ ID NOs: 10 e 104, respectivamente. O polinucleotídeo que codifica a região variável da cadeia pesada do anticorpo 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 10) foi ligado a um polinucleotídeo que codifica uma sequência derivada de IgG1 pelo método da PCR. O fragmento de DNA resultante foi inserido em um vetor de expressão de célula animal para construir um vetor de expressão para a cadeia pesada de SEQ ID NO: 49. Um poli- nucleotídeo que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 48) foi ligado a um polinucleotídeo que codifica a região constante da cadeia Kappa natural (SEQ ID NO: 50) por PCR. O fragmento de DNA ligado foi inserido em um vetor de expressão de célula animal. Sequências das variantes construídas foram confirmadas através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Sequências das variantes construídas foram confirmadas através de um método conhecido daqueles versados na técnica.
(9-4) Expressão e purificação de anticorpos
[02033] O clone 6KC4-1#85 que foi previsto ter uma atividade de ligação a antígeno dependente de Ca com base no resultado de ELISA de fago foi inserido em plasmídeos de expressão de célula animal. A expressão do anticorpo foi realizada pelo seguinte método. Células FreeStyle 293-F (Invitrogen) derivadas de rim fetal humano foram sus- pensas no FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) e plaquea- das em uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml (3 ml) em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram introduzidos nas células pelo método da lipofecção. As células são culturadas por quatro dias em uma incubadora com CO2 (37°C, 8% CO2, 90 rpm). Dos sobrenadantes da cultura, os anticorpos foram purificados usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences) através de um método conhecido por aqueles versados na técnica. A absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro. As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente de extinção calculado pelo método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).
Exemplo de Referência 10 Avaliação de anticorpo 6KC4-1#85 quanto à ligação de íon de cálcio
[02034] Anticorpo de ligação a antígeno dependente de cálcio 6KC4-1#85 que foi isolado da biblioteca de anticorpo humano foi avaliado quanto à sua ligação a cálcio. Se o valor Tm medido varia dependendo da condição de concentração de cálcio ionizado foi avaliado através do método descrito no Exemplo de Referência 2.
[02035] Os valores Tm para o domínio Fab de anticorpo 6KC4-1#85 são mostrados na Tabela 36. Conforme mostrado na Tabela 36, o valor Tm do domínio Fab de anticorpo 6KC4-1#85 variou dependendo da concentração de íon de cálcio. Isso demonstra que anticorpo 6KC4- 1/1#85 se liga a cálcio. Tabela 36
Figure img0058
Exemplo de Referência 11 Identificação de sítio de ligação a íon de cálcio em anticorpo 6KC4-1#85
[02036] Conforme demonstrado no Exemplo de Referência 10, o anticorpo 6KC4-1#85 se liga a íon de cálcio. No entanto, 6KC4-1#85 não tem um motivo de ligação a cálcio tal como a sequência hVk5-2 que foi revelada a partir da avaliação ter um motivo de ligação a cálcio. Então, se íon de cálcio se liga a uma ou ambas a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo 6KC4-1#85 foi confirmado através da avaliação da ligação de íon de cálcio de anticorpos alterados resultantes de troca da cadeia pesada e da cadeia leve de 6KC4-1#85 respectivamente com aquelas de um anticorpo antiglipicano 3 (sequência de cadeia pesada GC_H (SEQ ID NO: 51), sequência de cadeia leve GC_L (SEQ ID NO: 52)) que não se liga a íon de cálcio. Os valores Tm de anticorpos alterados medidos de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 7 são mostrados na Tabela 37. O resultado sugere que a cadeia pesada do anticorpo 6KC4-1#85 se liga a cálcio, porque os valores Tm do anticorpo alterado tendo a cadeia pesada do anticorpo 6KC4-1#85 mudaram dependendo da concentração de íon de cálcio. Tabela 37
Figure img0059
[02037] Desta maneira, para identificar adicionalmente resíduos responsáveis pela ligação de íon de cálcio de anticorpo 6KC4-1#85, cadeias pesadas alteradas (6_H1-11 (SEQ ID NO: 53), 6_H1-12 (SEQ ID NO: 54), 6_H1-13 (SEQ ID NO: 55), 6_H1-14 (SEQ ID NO:56), 6_H1-15 (SEQ ID NO: 57)) ou cadeias leves alteradas (6_L1-5 (SEQ ID NO: 58) e 6_L1-6 (SEQ ID NO: 59)) foram construídas substituindo um resíduo Asp (D) na CDR de anticorpo 6KC4-1#85 com um resíduo Ala (A) que não participa na ligação ou quelação de íon de cálcio. Através do método descrito no Exemplo de Referência 9, anticorpos alterados foram purificados a partir dos sobrenadantes de cultura de células animais introduzidas com vetores de expressão carregando os genes de anticorpo alterado. Os anticorpos alterados purificados foram avaliados quanto à sua ligação a cálcio de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 7. O resultado da medição é mostrado na Tabela 38. Conforme mostrado na Tabela 38, substituição do resíduo na posição 95 ou 101 por um resíduo Ala (numeração Kabat) na CDR3 de cadeia pesada de anticorpo 6KC4-1#85 resultou em perda da atividade de ligação a cálcio do anticorpo 6KC4-1#85. Isso sugere que esses resíduos são responsáveis pela ligação a cálcio. O motivo de ligação de cálcio localizado na base da alça de CDR3 na cadeia pesada do anticorpo 6KC4-1#8, que foi encontrado com base na capacidade de ligação de cálcio do anticorpo alterada do anticorpo 6KC4-1#85, pode ser um fator novo para projeto de bibliotecas de Ca que são usadas para obter domínios de ligação a antígeno contra um antígeno dependendo da concentração de ion que devem estar contidos em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção.
[02038] Nos Exemplos de Referência 18 e 19 abaixo, motivos de ligação de cálcio foram introduzidos na região variável de cadeia leve. Entretanto, tais bibliotecas incluem, por exemplo, aquelas contendo a CDR3 de cadeia pesada de anticorpo 6KC4-1#85 e resíduos flexíveis nas CDRs que não a CDR3 de cadeia pesada, mas incluindo as CDRs de cadeia leve. Tabela 38
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Exemplo de Referência 12 Exame de efeitos de anticorpo de ligação dependente de Ca sobre retenção no plasma de antígeno usando camundongos normais (12-1) Teste in vivo usando camundongos normais
[02039] A um camundongo normal (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão), hsIL-6R (receptor de IL-6 humano solúvel preparado no Exemplo de Referência 3) sozinho foi administrado ou hsIL-6R e anticorpo antirreceptor de IL-6 humano foram administrados simultaneamente para examinar a cinética do hsIL-6R e anticorpo antirrecep- tor de IL-6 humano in vivo. Uma dose única (10 mL/kg) da solução de hsIL-6R (5 μg/mL) ou uma mistura de hsIL-6R e anticorpo antirreceptor de IL-6 humano foi administrada na veia caudal. O H54/L28-IgG1, o 6RL#9-IgG1 e o FH4-IgG1 acima foram usados como anticorpos antir- receptor de IL-6 humano.
[02040] A concentração de hsIL-6R em todas as misturas é 5 μg/mL. As concentrações de anticorpo antirreceptor de IL-6 humano variam com os anticorpos: 0,1 mg/mL para H54/L28-IgG1 e 10 mg/mL para 6RL#9-IgG1 e FH4-IgG1. Neste momento, foi pensado que a maioria dos hsIL-6Rs se liga ao anticorpo devido ao anticorpo antirre- ceptor de IL-6 humano contra hsIL-6R existir em uma quantidade suficiente ou excessiva. Amostras de sangue foram coletadas em 15 mi- nutos, 7 horas e 1, 2, 4, 7, 14, 21 e 28 dias após a administração. As amostras de sangue obtidas foram imediatamente centrifugadas por 15 minutos a 4° C e 12.000 rpm para separar plasma. O plasma separado foi armazenado em um congelador ajustado para -20° C ou menos até o momento da medição.
(12-2) Determinação de concentração de anticorpo antirreceptor de IL- 6 humano no plasma em camundongos normais através de ELISA
[02041] A concentração no plasma de anticorpo antirreceptor de IL- 6 humano em um camundongo foi determinada através de ELISA. Primeiro, Fragmento de Anticorpo F(ab’)2 de IgG Anti-Humano (específico de cadeia Y) (SIGMA) foi despejado em uma Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge Nunc International) e foi deixado ficar sem ser perturbado de um dia para o outro a 4° C para preparar uma placa de fase sólida de IgG anti-humano. Amostras de curva de calibragem em uma concentração no plasma de 0,64, 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02 ou 0,01 μg/mL e amostras de medição de plasma de camundongo diluídas 100 vezes ou mais foram cada uma despejadas na placa de fase sólida de IgG anti-humano, seguido por incubação por 1 hora a 25° C. Subsequentemente, a placa foi deixada reagir com um anticorpo anti- IL-6 R humano biotinilado (R & D) por 1 hora a 25° C, seguido por reação com Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) por 0,5 hora a 25° C. A reação cromogênica foi conduzida usando TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um substrato. Depois da reação cromogênica ter sido parada através da adição de ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), absorbân- cia a 450 nm da solução colorida foi medida usando um leitor de mi- croplaca. A concentração no plasma no camundongo foi calculada a partir da absorbância da curva de calibragem usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Mudanças nas concentrações no plasma dos anticorpos H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 e FH4- IgG1, os camundongos normais após administração intravenosa, medidas conforme acima descrito, são mostradas na Fig. 50.
(12-3) Determinação da concentração de hsIL-6R no plasma através de um método de quimioluminescência
[02042] A concentração no plasma de hsIL-6R em um camundongo foi determinada através de um método de quimioluminescência. Uma amostra de curva de calibragem de hsIL-6R preparada em 2.000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5 ou 31,25 pg/mL e uma amostra de medição no plasma de camundongo diluída 50 vezes ou mais foram misturadas com um anticorpo anti-IL-6R humano monoclonal (R & D) rutenado com SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery), um anticorpo anti-IL6 R humano biotinilado (R & D) e tocilizumabe (SEQ ID NO: 60 de cadeia pesada, SEQ ID NO: 61 de cadeia leve), seguido por reação de um dia para o outro a 4° C. Neste momento, o tampão de ensaio continha EDTA 10 mM para reduzir a concentração de Ca livre na amostra e dissociar quase todos os hsIL-6Rs na amostra de 6RL#9- IgG1 ou FH4-IgG1 a ser ligado ao tocilizumabe adicionado. Subsequentemente, o dito líquido de reação foi despejado em uma MA400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Ainda, depois de lavagem de cada cavidade da placa que foi deixada reagir por 1 hora a 25° C, Read Buffer T (x4) (Meso Scale Discovery) foi despejado a cada cavidade. Imediatamente, o líquido de reação foi submetido à medição usando um leitor SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). A concentração de hsIL-6R foi calculada a partir da resposta da curva de calibragem usando o software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Mudanças na concentração no plasma de hsIL-6R no camundongo normal após administração intravenosa, determinado conforme acima descrito, são mostradas na Fig. 51.
[02043] Como resultado, o desaparecimento de hsIL-6R foi muito rápido quando hsIL-6R foi administrado sozinho, enquanto o desapa- recimento de hsIL-6R foi significantemente retardado quando hsIL-6R foi administrado simultaneamente com H54/L28-IgG1, um anticorpo convencional não tendo nenhuma habilidade de ligação dependente de Ca a hsIL-6R. Em contraste, o desaparecimento de hsIL-6R foi sig- nificantemente acelerado quando hsIL-6R foi administrado simultane-amente com 6RL#9-IgG1 ou FH4-IgG1 tendo 100 vezes ou mais habi-lidade de ligação dependente de Ca a hsIL-6R. As concentrações no plasma de hsIL-6R um dia após hsIL-6R ter sido administrado simulta-neamente com 6RL#9-IgG1 e FH4-IgG1 foram reduzidas 39 vezes e 2 vezes, respectivamente, comparado com administração simultânea com H54/L28-IgG1. Desta maneira, os anticorpos de ligação dependentes de cálcio foram confirmados ser capazes de acelerar desaparecimento de antígeno do plasma.
[02044] Exemplo de Referência 13 Exploração de sequências de linhagem germinativa humana que se ligam a íon de cálcio
(13-1) Anticorpo que se liga a antígeno de uma maneira dependente de cálcio
[02045] Anticorpos que se ligam a um antígeno de uma maneira dependente de Ca (anticorpos de ligação a antígeno dependentes de Ca) são aqueles cujas interações com antígeno mudam com concentração de cálcio. Um anticorpo de ligação a antígeno dependente de cálcio é pensado se ligar a um antígeno através de íon de cálcio. Desta maneira, aminoácidos que formam um epítopo no lado do antígeno são aminoácidos negativamente carregados que podem quelatar íons de cálcio ou aminoácidos que podem ser um aceitador ligado a hidrogênio. Essas propriedades de aminoácidos que formam um epítopo permitem direcionamento de um epítopo que não moléculas de ligação, que são geradas através da introdução de histidinas e se ligam a um antígeno de uma maneira dependente do pH. Ainda, o uso de moléculas de ligação a antígeno tendo propriedades de ligação a antíge- no dependentes de cálcio e do pH é pensado permitir a formação de moléculas de ligação a antígeno que podem individualmente se direcionar a vários epítopos tendo propriedades amplas. Dessa maneira, se uma população de moléculas contendo um motivo de ligação de cálcio (biblioteca de Ca) for construída, a partir da qual moléculas de ligação a antígeno são obtidas, anticorpos de ligação a antígeno dependentes de cálcio são pensados ser eficazmente obtidos.
(13-2) Aquisição de sequências de linhagem germinativa humana
[02046] Um exemplo da população de moléculas contendo um motivo de ligação de cálcio é um exemplo em que as ditas moléculas são anticorpos. Em outras palavras, uma biblioteca de anticorpo contendo um motivo de ligação de cálcio pode ser uma biblioteca de Ca.
[02047] Anticorpos de ligação de íon de cálcio contendo sequências de linhagem germinativa humana não foram relatados. Desta maneira, as sequências de linhagem germinativa de anticorpos tendo sequências de linhagem germinativa humana foram clonadas usando um cDNA molde preparado a partir de Human Fetal Spleen Poly RNA (Clontech) para avaliar se anticorpos tendo sequências de linhagem germinativa humana se ligam a íon de cálcio. Fragmentos de DNA clo- nado foram inseridos em vetores de expressão de célula animal. As sequências de nucleotídeo dos vetores de expressão construídos foram determinadas através de um método conhecido daqueles versados na técnica. As SEQ IDs são mostradas na Tabela 39. Através de PCR, polinucleotídeos codificando SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3), SEQ ID NO: 8 (Vk4) e SEQ ID NO: 62 (Vk5) foram ligados a um polinucleotídeo codificando a região constante de cadeia Kappa natural (SEQ ID NO: 50). Os fragmentos de DNA ligados foram inseridos em vetores de expressão de célula animal. Ainda, polinucleotídeos de região variável de cadeia pesada codificando SEQ ID NO: 63 (Vk1), SEQ ID NO: 64 (Vk2), SEQ ID NO: 65 (Vk3) e SEQ ID NO: 66 (Vk4) foram ligados por PCR a um polinucleotídeo codificando uma IgG1 de SEQ ID NO: 163 (tendo uma deleção de dois aminoácidos no terminal C de sequência natural). Os fragmentos de DNA resultantes foram inseridos em vetores de expressão de célula animal. As sequências das variantes construídas foram confirmadas através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Tabela 39
Figure img0062
(13-3) Expressão e purificação de anticorpos
[02048] Os vetores de expressão de célula animal construídos inseridos com os fragmentos de DNA tendo os cinco tipos de sequências de linhagem germinativa humana foram introduzidos em células animais. Expressão de anticorpo foi realizada através do método que segue. Células FreeStyle 293-F derivadas de célula de rim fetal humano (Invitrogen) foram suspensas em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) e plaqueadas em uma densidade celular de 1,33 x 106 cé- lulas/ml (3 ml) em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. Os plasmídeos preparados são introduzidos em células através de um método de lipofecção. As células foram culturadas por quatro dias em uma incubadora de CO2 (37 °C, CO2 8%, 90 rpm). A partir dos sobre- nadantes de cultura preparados conforme descrito acima, anticorpos foram purificados usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences) através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro. As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando um coeficiente de extinção calculado através do método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).
(13-4) Avaliação de anticorpos tendo sequências de linhagem germinativa humana quanto à sua atividade de ligação a íon de cálcio
[02049] Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a íon de cálcio. A temperatura intermediária de desnaturação térmica (valor Tm) foi medida através de calorimetria de varredura diferencial (DSC) como um indicador para exame de ligação de íon de cálcio ao anticorpo (MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). A temperatura intermediária de desnaturação térmica (valor Tm) é um indicador de estabilidade. Ela se torna maior quando uma proteína é estabilizada através de ligação de íon de cálcio, conforme comparado com o caso em que o íon de cálcio é ligado (J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). A atividade de ligação de íon de cálcio a anticorpo foi avaliada através do exame de mudanças no valor Tm do anticorpo dependendo das mudanças na concentração de íon de cálcio na solução de anticorpo. O anticorpo purificado foi submetido à diálise (Easy- SEP, TOMY) usando uma solução externa de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM e CaCl2 2 mM (pH 7,4) ou Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM e CaCl2 3 μM (pH 7,4). A medição de DSC foi conduzida em uma taxa de aquecimento de 240° C/h de a partir de 20 a 115 °C usando como uma substância de teste uma solução de anticorpo preparada em cerca de 0,1 mg/mL com o dialisato. As temperaturas intermediárias de desnaturação térmica (valores Tm) dos domínios Fab de cada anticorpo, calculadas a partir da curva de desnaturação obtida através de DSC, são mostradas na Tabela 40. Tabela 40
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[02050] Os resultados mostraram que os valores Tm dos domínios Fab de anticorpos tendo a sequência hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4 não variaram dependendo da concentração de íon de cálcio nas soluções contendo domínio Fab. Entretanto, o valor Tm para o domínio Fab de anticorpo tendo a sequência hVk5 variou dependendo da concentração de íon de cálcio na solução contendo domínio Fab. Isso demonstra que a sequência hVk5 se liga a íon de cálcio.
(13-5) Avaliação de sequência hVk5-2 quanto à ligação a íon de cálcio
[02051] Em (5-2) do Exemplo de Referência 5, variante 1 de Vk5-2 (SEQ ID NO: 68) e variante 2 de Vk5-2 (SEQ ID NO: 69) foram obtidas em adição a Vk5-2 (SEQ ID NO: 4), todas são classificadas como Vk5- 2. Essas variantes foram avaliadas quando à sua ligação a cálcio. Fra-gmentos de DNA para Vk5-2, variante 1 de Vk5-2, variante 2 de Vk5-2 foram cada um inseridos em vetores de expressão de célula animal. As sequências de nucleotídeo dos vetores de expressão construídos foram determinadas através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Através do método descrito em (12-3) do Exemplo de Referência 12, os vetores de expressão de célula animal inseridos com fragmentos de DNA para Vk5-2, variante 1 de Vk5-2 e variante 2 de Vk5-2 foram introduzidos, em combinação com um vetor de expressão animal carregando uma inserção para expressar CIM_H (SEQ ID NO: 67) como uma cadeia pesada, em celulas animais e anticorpos foram purificados. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à sua atividade de ligação a íon de cálcio. Os anticorpos purificados foram dialisados (EasySEP, TOMY) contra Tris 20 mM/HCl/ NaCl 150 mM (pH 7,5) (na Tabela 41, indicado como concentração de íon de cálcio 0 mM) ou Tris 20 mM/HCl/ NaCl 150 mM/CaCl2 2 mM (PH 7,5). Medições de DSC foram realizadas em uma taxa de aumento de temperatura de 240° C/h de a partir de 20 a 115° C usando soluções de anticorpo preparadas em uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL através da mesma solução que a usada para diálise. Com base nas curvas de desnaturação DSC obtidas, a temperatura intermediária de desnaturação térmica (valor Tm) foi calculada para o domínio de Fab de cada anticorpo. Os valores Tm são mostrados na Tabela 41. Tabela 41
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[02052] O resultado mostrou que o valor Tm para os domínios de Fab de anticorpos tendo a sequência de Vk5-2, variante 1 de Vk5-2 ou variante 2 de Vk5-2 variou dependendo da concentração de ion de cálcio em soluções contendo anticorpos tendo os domínios de Fab. Isso demonstra que os anticorpos tendo a sequência classificada como Vk5-2 se ligam a íon de cálcio.
Exemplo de Referência 14 Avaliação da sequência Vk5 humana (hVk5) (14-1) Sequência hVk5
[02053] A única sequência hVk5 registrada no banco de dados de Kabat é a sequência hVk5-2. Aqui, hVK5 e hVk5-2 são usados sinoni- mamente. O WO 2010/136598 revela que a razão de abundância da sequência hVk5-2 na sequência de linhagem germinativa é 0,4%. Outros relatos foram também feitos em que a razão de abundância da sequência hVk5-2 na sequência de linhagem germinativa é 0-0,06% (J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2009) 106, 48, 20216-20221). Conforme acima descrito, uma vez que a sequência hVk5-2 é uma sequência de frequência de aparecimento baixa na sequência de linhagem germinativa, ela foi pensada ser ineficiente para obter um anticorpo de ligação a cálcio a partir de uma biblioteca de anticorpo consistindo em sequências de linhagem germinativa humana ou células B obtidas através da imunização de um anticorpo expressando anticorpos humanos. Desta maneira, é possível projetar bibliotecas de Ca contendo a sequência hVk5-2 humana. Entretanto, bibliotecas de anticorpo sintético relatadas (WO2010/105256 e WO2010/136598) não continham a sequência hVk5. Ainda, a possibilidade de realização é desconhecida porque nenhum relato foi publicado sobre as propriedades físicas da sequência hVk5-2.
(14-2) Construção, expressão e purificação de uma forma não glicosi- lada da sequência hVk5-2
[02054] A sequência hVk5-2 tem uma sequência para glicosilação tipo N na posição do aminoácido 20 (numeração Kabat). As cadeias de açúcar ligadas a proteínas exibem heterogeneidade. Desta maneira, é desejável perder a glicosilação a partir do ponto de vista de homogeneidade da substância. Neste contexto, variante hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 70) em que o resíduo Asn (N) na posição 20 (numeração de Kabat) é substituído com Thr (T) foi construído. Substituição de aminoácido foi realizada através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando o QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Um DNA codificando a variante hVk5-2_L65 foi inserido em um vetor de expressão animal. O vetor de expressão animal inserido com o DNA construído codificando a variante hVk5_L65, em combinação com um vetor de expressão animal tendo um inserto para expressar CIM_H (SEQ ID NO: 67) como uma cadeia pesada foi intro- duzido em células animais através do método descrito no Exemplo de Referência 5. O anticorpo compreendendo hVk5-2_L65 e CIM_H, que foi expresso em células animais introduzidas com os vetores, foi purificado através do método descrito no Exemplo de Referência 13.
(14-3) Avaliação do anticorpo tendo a sequência hVk5-2 não glicosila- da quanto a propriedades físico-químicas
[02055] O anticorpo isolado tendo a sequência hVk5-2_L65 modificada foi analisado através de cromatografia de troca de íon para testar se ele é menos heterogêneo do que o anticorpo tendo a sequência original hVk5-2 antes da modificação. O procedimento de cromatogra- fia de troca de íon é mostrado na Tabela 42. O resultado da análise mostrou que hVk5-2_L65 modificada no sítio de glicosilação era menos heterogênea do que a sequência hVk5-2 original, conforme mostrado na Fig. 52. Tabela 42
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[02056] Em seguida, se o anticorpo compreendendo a sequência hVk5-2_L65 menos heterogênea se liga a íon de cálcio foi avaliado através do método descrito no Exemplo de Referência 13. O resultado mostrou que o valor Tm para o domínio de Fab do anticorpo tendo hVk5-2_L65 com sítio de glicosilação alterado também variou dependendo da concentração de íon de cálcio nas soluções do anticorpo, conforme mostrado na Tabela 43. Especificamente, foi demonstrado que o domínio de Fab do anticorpo tendo hVk5-2_L65 com sítio de gli- cosilação alterado se liga a íon de cálcio. Tabela 43
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Exemplo d e Referência 15 Avaliação da atividade de igação a íon de cálcio de moléculas de anticorpo tendo sequência de CDR da sequência hVk5-2
(15-1) Construção, expressão e purificação de anticorpos modificados tendo uma sequência de CDR da sequência hVk5-2
[02057] A sequência hVk5-2_L65 é uma sequência com aminoáci- dos alterados em um sítio de glicosilação na estrutura principal da sequência Vk5-2 humana. Conforme descrito no Exemplo de Referência 14, foi demonstrado que íon de cálcio se ligou mesmo após alteração do sítio de glicosilação. Entretanto, a partir do ponto de vista de imu- nogenicidade, é geralmente desejável que a sequência da estrutura principal seja uma sequência de linhagem germinativa. Desta maneira, os presentes inventores avaliaram se uma sequência de estrutura principal de anticorpo poderia ser substituída com a sequência de estrutura principal de uma sequência de linhagem germinativa não glico- silada enquanto mantendo a atividade de ligação de íon de cálcio do anticorpo.
[02058] Polinucleotídeos codificando sequências quimicamente sin-tetizadas que compreendem uma sequência de estrutura principal alterada da sequência hVk5-2, hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4 (CaVk1 (SEQ ID NO: 71), CaVk2 (SEQ ID NO: 72), CaVk3 (SEQ ID NO: 73) ou CaVk4 (SEQ ID NO: 74), respectivamente) foram ligados através de PCR a um polinucleotídeo codificando a região constante (SEQ ID NO: 50) da cadeia Kappa natural. Os fragmentos de DNA ligados foram inseridos em vetores de expressão de célula animal. Sequências das variantes construídas foram confirmadas através de um método co- nhecido daqueles versados na técnica. Cada plasmídeo construído conforme descrito acima foi introduzido em células animais em combi-nação com um plasmídeo inserido com um polinucleotídeo codificando CIM_H (SEQ ID NO: 67) através do método descrito no Exemplo de Referência 13. As moléculas de anticorpo expressas de interesse foram purificadas a partir do meio de cultura das células animais introduzidas com os plasmídeos.
(15-2) Avaliação de anticorpos alterados tendo a sequência de CDR da sequência hVk5-2 quanto à sua atividade de ligação a íon de cálcio
[02059] Se íon de cálcio se liga a anticorpos alterados tendo a sequência de CDR da sequência hVk5-2 e as sequências de estrutura principal de sequências de linhagem germinativa que não hVk5-2 (hVk1, hVk2, hVk3 e hVk4) foi avaliado através do método descrito no Exemplo de Referência 5. O resultado da avaliação é mostrado na Tabela 44. O valor Tm do domínio Fab de cada anticorpo alterado foi revelado variar dependendo da concentração de íon de cálcio nas soluções de anticorpo. Isso demonstra que os anticorpos tendo uma sequência de estrutura principal que não as sequências de estrutura principal da sequência hVk5-2 também se ligam a íon de cálcio. Tabela 44
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[02060] A temperatura de desnaturação térmica (valor Tm), como um indicador de estabilidade térmica, do domínio de Fab de cada anticorpo alterado para ter a sequência de CDR da sequência hVk5-2 e a sequência de estrutura principal de sequência de linhagem germinativa que não a sequência hVk5-2 (hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4) foi demonstrada ser maior do que aquela do domínio de Fab do anticorpo original tendo a sequência hVk5-2. Este resultado mostra que anticorpos tendo a sequência de CDR da sequência hVK5-2 e a sequência de estrutura principal de hVk1, hVk2, hVk3 ou hVk4 não apenas têm atividade de ligação a íon de cálcio, mas também têm excelentes moléculas do ponto de vista de estabilidade térmica.
Exemplo de Referência 16 Identificação do sítio de ligação de íon de cálcio em sequência hVk5-2 de linhagem germinativa humana (16-1) Projeto de sítio de mutação na sequência de CDR da sequência hVk5-2
[02061] Conforme descrito no Exemplo de Referência 15, anticorpos tendo a cadeia leve resultante da introdução da porção de CDR da sequência hVk5-2 na sequência de estrutura principal de uma sequência de linhagem germinativa diferente foram também demonstrados se ligar a íon de cálcio. Esse resultado sugere que em hVk5-2 um sítio de ligação a íon de cálcio está localizado dentro de sua CDR. Aminoáci- dos que se ligam a íon de cálcio, isto é, íon de cálcio quelato, incluem aminoácidos negativamente carregados e aminoácidos que podem ser um aceitador de ligação hidrogênio. Desta maneira, foi testado se anticorpos tendo uma sequência hVk5-2 mutante com uma substituição de um resíduo Asp (D) ou Glu (E) por um resíduo Ala (A) na sequência de CDR da sequência hVk5-2 se liga a íon de cálcio.
(16-2) Construção de sequências hVk5-2 variantes com substituição de Ala e expressão e purificação de anticorpos
[02062] Moléculas de anticorpo foram preparadas para compreender uma cadeia leve com substituição de um resíduo Asp e/ou Glu por resíduo Ala na sequência de CDR da sequência hVk5-2. Conforme descrito no Exemplo de Referência 14, hVk5-2_L65 variante não glico- silada exibiu ligação a íon de cálcio e foi suposta ser equivalente à se-quência hVk5-2 em termos de ligação de íon de cálcio. Neste Exemplo de Referência, substituições de aminoácido foram introduzidas em hVk5-2_L65 como uma sequência modelo. Variantes construídas são mostradas na Tabela 45. Substituições de aminoácido foram realizadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica tal como usando o QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratage- ne), PCR ou o In fusion Advantage PCR Cloning Kit (TAKARA) para construir vetores de expressão para cadeias leves alteradas tendo uma substituição de aminoácido. Tabela 45
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[02063] Sequências de nucleotídeo dos vetores de expressão construídos foram confirmadas através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Os vetores de expressão construídos para as cadeias leves alteradas foram transientemente introduzidos, em combinação com um vetor de expressão para a cadeia pesada CIM_H (SEQ ID NO: 67), em células da linhagem HEK293H derivada de célula de rim fetal humano (Invitrogen) ou FreeStyle293 (Invitrogen) para expressar anticorpos. A partir dos sobrenadantes de cultura obtidos, os anticorpos foram purificados usando o rProtein A SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare) através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Absorbância a 280 nm das soluções de anticorpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro. Concentrações de anticorpo foram calculadas a partir de valores determinados usando um coeficiente de extinção calculado através do método PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).
(16-3) Avaliação da atividade de ligação a íon de cálcio de anticorpos tendo uma substituição de Ala na sequência hVk5-2
[02064] Se os anticorpos purificados obtidos se ligam a íon de cálcio foi testado através do método descrito no Exemplo de Referência 13. O resultado é mostrado na Tabela 46. Alguns anticorpos tendo substituição de um resíduo Asp ou Glu na sequência de CDR da sequência hVk5-2 com um resíduo Ala que não pode estar envolvido em ligação ou quelação de íon de cálcio foram revelados ter um domínio de Fab cuja Tm não variou pela concentração de íon de cálcio nas soluções de anticorpo. Os sítios de substituição nos quais substituição de Ala não alterou a Tm (posições 32 e 92 (numeração de Kabat)) foram demonstrados ser muito importantes para a ligação de anticorpo íon de cálcio. Tabela 46
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Exemplo de Referência 17 Avaliação dos anticorpos tendo sequência hVk1 com motivo de ligação de ion de cálcio (17-1) Construção de uma sequência hVkl com motivo de ligação de íon de cálcio, expressão e purificação de anticorpos
[02065] O resultado descrito no Exemplo de Referência 16 sobre a atividade de ligação de cálcio do substituto Ala demonstra que os resí-duos Asp ou Glu na sequência de CDR da sequência hVk5-2 eram im-portantes para ligação de cálcio. Desta maneira, os presentes inventores avaliaram se um anticorpo pode se ligar a íon de cálcio quando os resíduos nas posições 30, 31, 32, 50 e 92 (numeração Kabat) sozinhos foram introduzidos em uma sequência de região variável de linhagem germinativa diferente. Especificamente, a variante LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83) foi construída através de substituição dos resíduos nas posições 30, 31, 32, 50 e 92 (numeração Kabat) na sequência hVk1 (uma sequência de linhagem germinativa humana) por resíduos nas posições 30, 31, 32, 50 e 92 (numeração Kabat) na sequência hVk5-2. Especificamente, foi testado se anticorpos tendo uma sequência hVk1 introduzida com apenas 5 resíduos da sequência hVk5-2 podem se ligar a cálcio. As variantes foram produzidas através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo de Referência 16. A variante de cadeia leve resultante LfVk1_Ca e LfVk1 tendo a sequência hVk1 de cadeia leve (SEQ ID NO: 84) foram coexpressas com a CIM_H de cadeia pesada (SEQ ID NO: 67). Os anticorpos foram expressos e purificados através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo de Referência 16.
(17-2) Avaliação da atividade de ligação a íon de cálcio de anticorpos tendo uma sequência hVk1 humana com motivo de ligação de íon de cálcio
[02066] Se o anticorpo purificado preparado conforme acima descrito se liga a íon de cálcio foi avaliado através do método descrito no Exemplo de Referência 13. O resultado é mostrado na Tabela 47. O valor Tm do domínio de Fab do anticorpo tendo LfVk1 com uma sequência hVk1 não variou dependendo da concentração de cálcio nas soluções de anticorpo. Entretanto, Tm do anticorpo tendo a sequência LfVk1_Ca foi mudada em 1 °C ou mais quando da mudança na concentração de cálcio nas soluções de anticorpo. Desta maneira, foi mostrado que o anticorpo tendo LfVk1_Ca se liga a cálcio. O resultado descrito acima demonstra que a sequência de CDR inteira de hVk5-2 não é requerida, enquanto os resíduos introduzidos para construção da sequência LfVk1-Ca sozinha são suficientes para ligação de íon de cálcio. Tabela 47
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(17-3) Construção, expressão e purificação de sequência LfVk1Ca resistente à degradação
[02067] Conforme descrito em (17-1) do Exemplo de Referência 17, variante LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 66) foi construída para ter substituição de resíduos nas posições 30, 31, 32, 50 e 92 (numeração Kabat) na sequência hvK1 (uma sequência de linhagem germinativa humana) por resíduos nas posições 30, 31, 32, 50 e 92 (numeração Kabat) na sequência hVk5-2. A variante foi demonstrada se ligar a íon de cálcio. Desta maneira, é possível projetar bibliotecas de Ca contendo sequência KfVk1_Ca. Entretanto, não há nenhum relato sobre as propriedades de sequência LfVk1_Ca, e então sua viabilidade era desconhecida. A sequência LfVk1_Ca tem Asp nas posições 30, 31 e 32 (numeração Kabat). Desta maneira, a sequência Asp-Asp que foi rela- tada ser degradada sob condições ácidas está contida na sequência CDR1 (J. Pharm. Biomed. Anal. (2008) 47(1), 23-30). É desejável evitar a degradação em condições ácidas do ponto de vista da estabilidade em armazenamento. Então, LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 85), LfVk1_Ca2 (SEQ ID NO: 86) e LfVk1_Ca3 (SEQ ID NO: 87) variante foram construídas para ter substituição de resíduos Asp (D) por resíduos Ala (A) que são possivelmente sensíveis à degradação. Substituição de aminoácido foi realizada através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando o QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). DNAs codificando as variantes foram inseridos em vetores de expressão de mamífero. Em combinação com um vetor de expressão animal tendo uma inserção para expressar GC_H (SEQ ID NO: 51) como a cadeia pesada, os vetores de expressão animal construídos carregando inserções de DNA para as variantes foram introduzidos em células animais através do método descrito no Exemplo de Referência 13. Os anticorpos expressos nas celulas animais introduzidas com os vetores foram purificados através do método descrito no Exemplo de Referência 13.
(17-4) Avaliação de estabilidade de anticorpos tendo a sequência LfVklCa resistente à degradação
[02068] Se os anticorpos preparados conforme descrito em (17-3) do Exemplo de Referência 17 eram mais resistentes à degradação em soluções em pH 6,0 do que os anticorpos originais tendo a sequência LfVk1_Ca provida para alteração foi avaliado comparando a heteroge-neidade entre os respectivos anticorpos após aceleração térmica. Cada anticorpo foi dialisado contra uma solução de Histidina 20 mM-HCl, NaCl 150 mM (pH 6,0) sob uma condição de 4° C de um dia para o outro. Anticorpos dialisados foram ajustados para 0,5 mg/ml e armazenados a 5° C ou 50° C por três dias. Cada anticorpo após armazenamento foi submetido à cromatografia de troca de ion usando o mé- todo descrito no Exemplo de Referência 14. Conforme mostrado na Fig. 53, o resultado da análise demonstra que LfVk1_Ca com uma alteração no sítio de degradação era menos heterogêneo e muito mais resistente à degradação a partir da aceleração térmica do que a sequência LfVk1-Ca original. Especificamente, foi demonstrado que degradação ocorreu no resíduo Asp (D) de posição 30 na sequenica LfVk1_Ca, mas ela poderia ser prevenida pela alteração de aminoáci- do.
(17-5) Construção de uma sequência LVklCa de cadeia leve resistente à degradação no resíduo Asp de posição 30 e expressão e purificação de anticorpos
[02069] O resultado descrito em (17-4) do Exemplo de Referência 17 sobre a resistência à degradação da forma substituída de Ala demonstra que sob condições ácidas a sequência LfVk1_Ca foi degradada no resíduo Asp (D) de posição 30 (numeração Kabat) em sua sequência de CDR e a degradação poderia ser prevenida no caso de substituição do resíduo na posição 30 por um aminoácido diferente (em (17-4), substituído com um resíduo Ala (A)) (numeração Kabat). Então, os presentes inventores testaram se mesmo uma sequência com uma substituição de resíduo na posição 30 por Ser (S), um resíduo principal capaz de quelar íon de cálcio, (numeração Kabat) (referida como LfVk1_Ca6; SEQ ID NO: 88) era resistente à degradação enquanto mantendo a atividade de ligação a cálcio. Variantes foram preparadas através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo de Referência 9. As sequências LfVk1_Ca6 e LfVk1_Ca de cadeia leve alteradas foram expressas em combinação com uma GC_H de cadeia pesada (SEQ ID NO: 51). Anticorpos foram expressos e purificados através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo de Referência 16.
(17-6) Avaliação de uma sequência LVk1Ca de cadeia leve resistente à degradação em resíduo Asp na posição 30
[02070] Anticorpos purificados preparados conforme acima descrito foram avaliados quanto à sua estabilidade em armazenamento através do método descrito em (17-4) do Exemplo de Referência 17. O resultado demonstra que anticorpos tendo a sequência LfVk1_Ca6 são mais resistentes à degradação do que aqueles tendo a sequência LfVk1_Ca original, conforme mostrado na Fig. 54.
[02071] Então, se anticorpos tendo a sequência LfVK1_Ca e anticorpos tendo a sequência LfVk1_Ca6 se ligam a íon de cálcio foi testado através do método descrito no Exemplo de Referência 13. O resultado é mostrado na Tabela 48. Os valores Tm dos domínios de Fab de anticorpos tendo sequência LfVk1_Ca e anticorpos tendo a sequência LfVk1_Ca6 resistente à degradação foram mudados em 1° ou mais quando da mudança na concentração de cálcio em soluções de anticorpo. Tabela 48
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Exemplo de Referência 18 Projeto de uma população de moléculas de anticorpo (biblioteca de Ca) com um motivo de ligação de íon de cálcio introduzido na região variável para obter eficazmente anticorpos de ligação que se ligam a antígeno de uma maneira dependente da concentração de Ca
[02072] Motivos de ligação de cálcio preferidos incluem, por exemplo, a sequência hVk5-2 e a sequência de CDR, bem como resíduos nas posições 30, 31, 32, 50 e 92 (numeração Kabat). Outros motivos de ligação de cálcio incluem o motivo EF-hand possuído por proteínas de ligação de cálcio (por exemplo, calmodulina) e lectina tipo C (por exemplo, ASGPR).
[02073] A biblioteca de Ca é composta de regiões variáveis de cadeias pesada e leve. Sequência de anticorpo humano foi usada para a região variável de cadeia pesada e um motivo de ligação a cálcio foi introduzido na região variável de cadeia leve. A sequência hVk1 foi selecionada como uma sequência modelo da região variável de cadeia leve para introdução de um motivo de ligação a cálcio. Um anticorpo contendo a sequência LfVk1_Ca obtida através da introdução da sequência de CDR de hVk5-2 (um dos motivos de ligação de cálcio) na sequência hVk1 foi mostrado se ligar a ions de cálcio, conforme mostrado no Exemplo de Referência 16. Aminoácidos múltiplos foram deixados aparecer na sequência modelo para diversificar moléculas de ligado a antígeno que constituem a biblioteca. Posições expostas na superfície de uma região variável que é provável interagir com o antí- geno foram selecionadas como aquelas em que aminoácidos múltiplos são deixados aparecer. Especificamente, as posições 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 e 96 (numeração Kabat) foram selecionadas como resíduos flexíveis.
[02074] O tipo e a frequência de aparecimento de resíduos de ami- noácido que foram subsequentemente deixados aparecer foram de-terminados. A frequência de aparecimento de aminoácidos nos resíduos flexíveis das sequências hKv1 e hKv3 registradas no banco de dados de Kabat (KABAT, E.A., e outros: ‘Sequences of proteins of immunological interest’, vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION) foi analisada. Com base nos resultados de análise, o tipo de aminoácidos que foram deixados aparecer na biblioteca de Ca foi selecionado daqueles com frequência de aparecimento maior em cada posição. Neste momento, aminoácidos cuja frequência de aparecimento foi determinada ser baixa com base nos resultados de análise foram também selecionados para evitar a tendência de propriedades de aminoácido. A frequência de aparecimento dos aminoácidos selecionados foi determi- nada em referência aos resultados de análise do banco de dados de Kabat.
[02075] Uma biblioteca de Ca contendo um motivo de ligação de cálcio com ênfase na diversidade de sequência de maneira a conter aminoácidos múltiplos em cada resíduo que não o motivo foi projetada como uma biblioteca de Ca em consideração do conjunto de aminoáci- dos e frequência de aparecimento conforme descrito acima. Os projetos detalhados da biblioteca de Ca são mostrados nas Tabelas 1 e 2 (com as posições em cada tabela representando a numeração Kabat). Ainda, com relação à frequência de aparecimento de aminoácidos descritos nas Tabelas 1 e 2, se a posição 92 representa pela numeração Kabat for Asn (N), a posição 94 pode ser Leu (L) ao invés de Ser (S).
Exemplo de Referência 19 Preparação de biblioteca de Ca
[02076] Uma biblioteca de genes de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo foi amplificada através de PCR usando RNA poli A preparado a partir de PBMC humano ou RNA poli A humano comercialmente disponível como molde. Como descrito no Exemplo de Referência 18, para a porção de região variável de cadeia leve de anticorpo, porções de cadeia leve de regiões variáveis de anticorpo que aumentam a frequência de aparecimento de anticorpos que mantêm um motivo de ligação de cálcio e podem se ligar a um antígeno de uma maneira dependente da concentração de cálcio foram projetadas. Ainda, de resíduos flexíveis, para resíduos de aminoácido que não aqueles com um motivo de ligação de cálcio introduzido, uma biblioteca de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo com aminoácidos uniformemente distribuídos de frequência alta de aparecimento em anticorpos humanos naturais foi projetada com referência à informação de frequência de aparecimento de aminoácido em anticorpos humanos naturais (KABAT, E.A. e outros: ‘Sequences of proteins of immunological Interest’, Vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Uma combinação das bibliotecas de gene de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo geradas conforme acima descrito foi inserida em um vetor de fagemídeo para construir uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano que apresenta domínios de Fab consistindo em sequências de anticorpo humano (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 87-100).
[02077] As sequências de porções de gene de anticorpo isoladas de E. coli introduzida com uma biblioteca de gene de anticorpo foram determinadas de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 23 abaixo. A distribuição de aminoácido nas sequências de 290 tipos isolados de clones e uma distribuição de aminoácido projetada são mostradas na Fig. 55.
Exemplo de Referência 20 Exame da atividade de ligação a íon de cálcio de moléculas contidas na biblioteca de Ca (20-1) Atividade de ligação de íon de cálcio de moléculas contidas na biblioteca de Ca
[02078] Conforme descrito no Exemplo de Referência 14, a sequência hVk5-2 que foi demonstrada se ligar a íons de cálcio é uma sequência de frequência de aparecimento baixa na sequência de linhagem germinativa. Desta maneira, foi pensado ser ineficiente obter um anticorpo de ligação a íon de cálcio a partir de uma biblioteca de anticorpo consistindo em sequências de linhagem germinativa humana ou de células B obtidas através de imunização de um camundongo expressando anticorpos humanos. Como resultado, uma biblioteca de Ca foi construída. A presença ou ausência de um clone mostrando uma ligação de cálcio à biblioteca de Ca construída foi examinada.
(20-2) Expressão e purificação de anticorpos
[02079] Clones da biblioteca de Ca foram introduzidos em plasmí- deos de expressão de célula animal. Anticorpos foram expressos usando os métodos descritos abaixo. Celulas de linhagem 293-F Fre- esStyle derivadas de célula de rim fetal humano (Invitrogen) foram suspensas em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) e pla- queadas em uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml (3 ml) para cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram introduzidos nas celulas através de um método de lipofec- ção. As células foram culturadas em uma incubadora de CO2 (37° C, CO2 8%, 90 rpm) por quatro dias. Através de um método conhecido daqueles versados na técnica, anticorpos foram purificados usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences) a partir de sobrenadantes de cultura obtidos conforme descrito acima. A absor- bância de soluções de anticorpos purificados foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. As concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores medidos através do uso do coeficiente de absorção determinado através do método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(20-3) Avaliação de anticorpos preparados quanto à sua ligação a íon de cálcio
[02080] Anticorpos purificados conforme acima descrito foram avaliados quanto à sua ligação a ion de cálcio através do método descrito no Exemplo de Referência 6. O resultado é mostrado na Tabela 49. A Tm dos domínios de Fab de anticorpos múltiplos na biblioteca de Ca mudou dependendo da concentração de ion de cálcio, sugerindo que a biblioteca contém moléculas que se ligam a ion de cálcio. Tabela 49
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Figure img0074
Exemplo de Referência 21 Isolamento de anticorpos que se ligam a receptor de IL-6 de uma maneira dependente de Ca (21-1) Isolamento de fragmentos de anticorpo, que se ligam a antígenos de uma maneira dependente de Ca, a partir de biblioteca através de separação de conta
[02081] A primeira seleção a partir da biblioteca construída de anticorpos que se ligam a receptor de IL-6 de uma maneira dependente de Ca foi realizada através de enriquecimento apenas de fragmentos de anticorpo tendo a habilidade de se ligar ao antígeno (receptor de IL-6).
[02082] Fagos foram produzidos por E. coli contendo os fagemí- deos construídos para exibição de fago. Para precipitar os fagos, NaCl 2,5 M/PEG 10% foi adicionado ao meio de cultura de E. coli de produção de fago. A população de fago precipitado foi diluída com TBS para preparar uma solução de biblioteca de fago. Então, BSA e CaCl2 foram adicionados à solução de biblioteca de fago para ajustar a concentração de BSA final para 4% e a concentração de ion de cálcio final para 1,2 mM. Com relação ao método de separação, os presentes inventores se referiram aos métodos de separação gerais usando antí- genos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20; Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads revestidas com NeutrAvidin) ou contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[02083] Especificamente, 250 pmol de antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada para permitir o contato da solução de biblioteca de fago com o antígeno em temperatura ambiente por 60 minutos. Contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e deixadas se ligar a complexos de antí- geno/fago em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com 1 ml de CaCl2 1,2 mM/TBST (TBST contendo CaCl2 1,2 mM) e então duas vezes com 1 ml de CaCl2 1,2 mM/TBS (TBS contendo CaCl2 1,2 mM). Então, as contas combinadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de tripsina foram suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos e imediatamente seguido por separação de contas usando um suporte magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 ml de linhagem de E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmico (OD600 de 0,4-0,7). A E. coli foi infectada com os fagos através da sua cultura enquanto suavemente agitando a 37° C por uma hora. A E. coli infectada foi pla- queada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli plaqueada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[02084] Na segunda rodada de separação, fagos foram enriquecidos usando a habilidade de ligação a antígeno ou a habilidade de ligação dependente de Ca como um indicador.
[02085] Especificamente, quando o enriquecimento foi realizado usando a habilidade de ligação a antígeno como um indicador, 40 pmol de antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada para permitir o contato da solução de biblioteca de fago com o antígeno em temperatura ambiente por 60 minutos. Contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e deixadas se ligar a complexos de antígeno/fago em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com 1 ml de CaCl2 1,2 ml/TBST e então duas vezes com CaCl2 1,2 mM/TBS. Então, as contas adicionadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de tripsina foram suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos. Então imediatamente, as contas foram separadas usando um apoio magnético para coletar uma solução de fago. Para eliminar a habilidade de fagos exibindo Fab de infectar E. coli, a proteína pIII (proteína pIII derivada de fago auxiliar) de fagos não exibindo nenhum Fab foi clivada através da adição de 5 μl de 100 mg/ml de tripsina à solução de fago coletada. A solução de fago recuperada foi adicionada a 10 mL de linhagem de E. coli ER2738 em fase de crescimento logarítmico (OD600 de 0,4-0,7). A E. coli foi culturada com agitação suave a 37° C por 1 hora para permitir que os fagos infectassem a E. coli. A E. coli infectada foi inoculada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Subsequentemente, os fagos foram recuperados do meio de cultura da E. coli após inoculação para coletar uma solução de biblioteca de fago.
[02086] Quando o enriquecimento foi realizado usando a habilidade de ligação dependente de Ca como um indicador, 40 pmol de antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fa- go preparada para permitir o contato da solução de biblioteca de fago com o antígeno em temperatura ambiente por 60 minutos. Contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e deixadas se ligar a complexos de antígeno/fago em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas com 1 ml de CaCl2 1,2 mM/TBST e com CaCl2 1,2 mM/TBS. Então, as contas adicionadas com 0,1 ml de EDTA 2 mM/TBS (TBS contendo EDTA 2 mM) foram suspensas em temperatura ambiente. Então imediatamente, as contas foram separadas usando um apoio magnético para coletar uma solução de fago. Para eliminar a habilidade de fagos exibindo Fab de infectar E. coli, a proteína pIII (proteína pIII derivada de fago auxiliar) de fagos não exibindo nenhum Fab foi clivada através da adição de 5 μl de 100 mg/ml de tripsina à solução de fago coletada. A solução de fago recuperada foi adicionada a 10 mL da linhagem de E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmico (OD600 de 0,4-0,7). A E. coli foi culturada com agitação suave a 37° C por 1 hora para permitir que os fagos infectas- sem a E. coli. A E. coli infectada foi inoculada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Subsequentemente, os fagos foram recuperados do meio de cultura da E. coli após inoculação para coletar uma solução de biblioteca de fago.
(21-2) Exame através de ELISA de fago
[02087] Um sobrenadante de cultura contendo fago foi coletado de acordo com um método de rotina (Methods Mol. Biol (2002) 178, 133145) a partir de uma única colônia de E. coli, obtida conforme acima descrito.
[02088] Um sobrenadante de cultura contendo fagos, ao qual BSA e CaCl2 foram adicionados, foi submetido a ELISA conforme descrito abaixo. Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μL de PBS contendo o antígeno marcado com biotina. Cada cavidade da dita placa foi lavada com PBST para remover o antígeno, e então as cavidades foram bloqueadas com 250 μL de BSA 4% - TBS por 1 hora ou mais. A dita placa com o sobrenadante de cultura preparado adicionado a cada placa, do qual o BSA 4% - TBS foi removido, foi deixada descansar sem ser perturbada a 37° C por 1 hora, permitindo a ligação de anticorpo apresentando fago ao antígeno presente em cada cavidade. A cada cavidade lavada com CaCl2 1,2 mM/TBST, CaCl2 1,2 mM/TBS ou EDTA 1 mM/TBS foi adicionado. A placa foi deixada descansar sem ser pertur-bada por 30 minutos a 37° C para incubação. Após lavagem com CaCl2 1,2 mM/TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS em uma concentração de 1,2 mM de concentração de cálcio ionizado foi adicionado a cada cavidade, e a placa foi incubada por 1 hora. Depois de lavagem com CaCl2 1,2 mM /TBST, a reação cromogênica da solução em cada cavidade com uma solução única de TMB (ZYMED) adicionada foi parada através da adição de ácido sulfúrico. Subsequentemente, a dita cor foi medida através da medição da absorbância a 450 nm.
[02089] As sequências de base de genes amplificados com primers específicos foram analisadas quanto aos clones submetidos a ELISA de fago.
[02090] O resultado de ELISA de fago e análise de sequência é mostrado na Tabela 50. Tabela 50
Figure img0075
(21-3) Expressão e purificação de anticorpos
[02091] Clones que são determinados ter habilidade de ligação a antígeno dependente de Ca como um resultado de ELISA de fago foram inseridos em plasmídeos de expressão de célula animal. Anticorpos foram expressos através do método que segue. Celulas de FreeStyle 293-F derivada de célula de rim fetal humano (Invitrogen) foram suspensas em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) e pla- queadas em uma densidade celular de 1,33 x 106 celulas/ml (3 ml) em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram introduzidos em celulas através de um método de lipofec- ção. As celulas foram culturadas por quatro dias em uma incubadora de CO2 (37° C, CO2 8%, 90 rpm). A partir dos sobrenadantes de cultura preparados conforme descrito acima, anticorpos foram purificados usando o rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences) através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Ab- sorbância a 280 nm de soluções de anticorpo purificado foi medida usando um espectrofotômetro. Concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores determinados usando o coeficiente de ex- tinção calculado pelo método PACE (Protein Science (1995) 4: 24112423).
(21-4) Avaliação de anticorpos isolados quanto à sua habilidade de ligação dependente de Ca a receptor de IL-6 humano
[02092] Anticorpos 6RCIgG_010 (SEQ ID NO: 111 cadeia pesada; SEQ ID NO: 112 cadeia leve), 6RC1IgG_0,12 (SEQ ID NO: 113 cadeia pesada; SEQ ID NO: 114 cadeia leve) e 6RC1IgG_019 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 115; cadeia leve, SEQ ID NO: 116) isolados conforme descrito acima foram avaliados quanto à dependência de Ca de sua atividade de ligação a receptor de IL-6 humano através da análise da interação entre os anticorpos e receptor de IL-6 humano usando Bia- core T100 (GE Healthcare). Tocilizumabe (cadeia pesada SEQ ID NO: 60; cadeia leve SEQ ID NO: 61) foi usado como um anticorpo controle que não tem atividade de ligação dependente de Ca a receptor de IL-6 humano. A interação foi analisada em soluções em 1,2 mM e 3 μM de concentração de ion de cálcio, correspondendo a condições de concentração de ion de cálcio alta e baixa, respectivamente. Uma quantidade apropriada de Protein A/G (Invitrogen) foi imobilizada em um Sensor chip CM5 (GE Healthcare) através de um método de acoplamento de amino, e anticorpos de interesse foram capturados no chip. Os dois tipos de tampão de processamento usados foram: ACES 20 mM/NaCl 150 mM/Tween20 0,05% (p/v)/CaCl2 1,2 mM (pH 7,4); e ACES 20 mM/NaCl 150 mM/Tween20 0,05% (p/v)/CaCl2 3 μM (pH 7,4). Esses tampões foram usados cada um para diluir receptor de IL-6 humano. Todas as medições foram realizadas a 37° C.
[02093] Na análise de interação da reação antígeno-anticorpo usando anticorpo tocilizumabe como um anticorpo controle e anticorpos 6RCIgG_010, 6RCIgG_012 e 6RCIgG_019, uma solução de receptor de IL-6 diluída e um tampão de processamento como um componente sem expressão (blank) foram injetados em uma taxa de fluxo de 5 μl/min por três minutos para permitir que o receptor de IL-6 inte-ragisse com anticorpos tocilizumabe, 6RCIgG_010, 6RCIgG_012 e 6RCIgG_019 capturados sobre o sensor chip. Então, glicina 10 mM- HCl (pH 1,5) foi injetada em uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 30 segundos para regenerar o sensor chip.
[02094] Sensorgramas na concentração de ion de cálcio alta obtida através da medição usando o método descrito acima são mostrados na Fig. 56.
[02095] Sob a condição de concentração de ion de cálcio baixa, sensorgramas de anticorpos tocilizumabe, 6RCIgG_010, 6RCIgG_012 e 6RCIgG_019 foram também obtidos através do mesmo método. Sensorgramas na concentração de ion de cálcio baixa são mostrados na Fig. 57.
[02096] O resultado descrito acima mostra que a habilidade de ligação ao receptor de IL-6 de anticorpos 6RCIgG_010, 6RCIgG_012 e 6RCIgG_019 foi significantemente reduzida quando a concentração de íon de cálcio no tampão foi mudada de 1,2 mM para 3 μM.
Exemplo de Referência 22 Projeto de biblioteca de anticorpo de ligação dependente do pH (22-1) Método para aquisição de anticorpos de ligação dependente do pH
[02097] O WO 2009/125825 revela um anticorpo de ligação a antí- geno dependente do pH cujas propriedades são mudadas em regiões de pH neutro e pH ácido através da introdução de uma histidina em uma molécula de ligação a antígeno. O anticorpo de ligação dependente do pH revelado é obtido através de alteração para substituir uma parte da sequência de aminoácido da molécula de ligação a antígeno de interesse com uma histidina. Para obter um anticorpo de ligação dependente do pH mais eficientemente sem preliminarmente obter a molécula de ligação a antígeno de interesse a ser modificada, um mé- todo pode ser obtenção de uma molécula de ligação a antígeno que se liga a um antígeno desejado a partir de uma população de moléculas de ligação a antígeno (referida como biblioteca de His) com uma histi- dina introduzida na região variável (mais preferivelmente, uma região potencialmente envolvida em ligação de antígeno). Pode ser possível obter eficientemente uma molécula de ligação a antígeno tendo propri-edades desejadas a partir de uma biblioteca de His, porque histidina aparece com mais frequência em moléculas de ligação a antígeno da biblioteca de His do que aquelas das bibliotecas de anticorpo conven-cionais.
(22-2) Projeto de uma população de moléculas de anticorpo (biblioteca de His) com resíduo histidina introduzido na sua região variável para adquirir eficazmente anticorpos de ligação que se ligam a antígeno de uma maneira dependente do pH
[02098] Primeiro, as posições para introdução de uma histidina foram selecionadas em uma biblioteca de His. O WO 2009/125825 revela geração de anticorpos de ligação a antígeno dependente do pH através da substituição de resíduos de aminoácido nas sequências de anticorpo de receptor de IL-6, anticorpo de IL-6 e anticorpo de receptor de IL-31 com uma histidina. Ainda, um anticorpo de lisozima anti-clara do ovo (FEBS Letter 11483, 309, 85-88) e anticorpo anti-hepcidina (WO 2009/139822) tendo uma habilidade de ligação a antígeno dependente do pH foram gerados através da substituição da sequência de aminoácido da molécula de ligação a antígeno com histidinas. As posições em que histidinas foram introduzidas no anticorpo para receptor de IL-6, anticorpo para IL-6, anticorpo para receptor de IL-31, anticorpo para lisozima da clara do ovo e anticorpo para hepcidina são mostradas na Tabela 51. As posições mostradas na Tabela 51 podem ser listadas como posições candidatas que podem controlar a ligação antígeno-anticorpo. Ainda, além da posição mostrada na Tabela 51, as posições que são prováveis ter contato com antígeno foram também consideradas ser adequadas para introdução de histidinas. Tabela 51
Figure img0076
[02099] Na biblioteca de His consistindo nas regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve, uma sequência de anticorpo humano foi usada para a região variável de cadeia pesada e histidinas foram in-troduzidas na região variável de cadeia leve. As posições listadas acima e posições que podem estar envolvidas em ligação a antígeno, isto é, posições 30, 32, 50, 53, 91, 92 e 93 (numeração Kabat, Kabat, E.A. e outros, 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest, NIH) na cadeia leve foram selecionadas nas posições para introdução de histidinas na biblioteca de His. Ainda, a sequência Vk1 foi selecionada como uma sequência modelo da região variável de cadeia leve para introdução de histidinas. Aminoácidos múltiplos foram deixados aparecer na sequência modelo para diversificar moléculas de ligação a antí- geno que constituem a biblioteca. As posições expostas na superfície de uma região variável que é provável interagir com o antígeno foram selecionadas como aquelas em que aminoácidos múltiplos são deixados aparecer. Especificamente, as posições 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 e 96 da cadeia leve (numeração Kabat, Kabat, E.A. e outros, 1991, Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH) foram selecionadas como resíduos flexíveis.
[02100] O tipo e a frequência de aparecimento de resíduos de ami- noácido que foram subsequentemente deixados aparecer foram de-terminados. A frequência de aparecimento de aminoácidos nos resíduos flexíveis nas sequências hVk1 e hVk3 registradas no banco de dados Kabat (KABAT, E.A. E OUTROS: Sequences of proteins of immunological interest, Vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION) foi analisada. Com base nos resultados da análise, o tipo de aminoácidos deixados aparecer na biblioteca de His foi selecionado daqueles com frequência de aparecimento maior em cada posição. Neste momento, os aminoácidos cuja frequência de aparecimento foi determinada ser baixa com base nos resultados da análise foram também selecionados para evitar a tendência de propriedades de aminoácido. A frequência de aparecimento dos aminoácidos selecionados foi determinada com referência aos resultados da análise do banco de dados Kabat.
[02101] Como bibliotecas de His, a biblioteca de His 1 que é fixada para necessariamente incorporar uma histidina única em cada CDR e biblioteca de His 2 que é mais enfatizada em diversidade de sequência do que a biblioteca de His 1 foram projetadas levando em consideração o conjunto de aminoácidos e frequência de aparecimento conforme descrito acima. Os projetos detalhados das bibliotecas de His 1 e 2 são mostrados nas Tabelas 3 e 4 (com a posição em cada tabela representando a numeração Kabat). Com relação à frequência de aparecimento de aminoácidos descrita nas Tabelas 3 e 4, Ser (S) na posição 94 pode ser excluído se a posição 92 representada pela numeração Kabat for Asn (N).
Exemplo de Referência 23 Preparação de uma biblioteca de exibição de fago para anticorpos humanos (biblioteca de His 1) para obter um anticorpo que se liga a antígeno de uma maneira dependente do pH
[02102] Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo foi amplificada através de PCR usando um RNA poli A preparado a partir de PBMC humana e RNA poli A humano comercial como um modelo. Uma biblioteca de gene de regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo projetada como biblioteca de His 1 conforme descrito no Exemplo de Referência 22 foi amplificada usando PCR. Uma combinação das bibliotecas de gene de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo conforme acima descrito foi inserida em um vetor de fagemídeo para construir uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano que apresenta domínios de Fab consistindo em sequências de anticorpo humano. Para o método de construção, Methods Mol. Biol. (2002) 178, 87-100 foi usado como uma referência. Para a construção da biblioteca, uma região ligante conectando o Fab de fagemídeo à proteína pIII do fago e as sequências de uma biblioteca de exibição de fago com uma sequência de clivagem de tripsina inserida entre os domínios N2 e CT do gene da proteína pIII de fago auxiliar foram usadas. Sequências das porções de gene de anticorpo isoladas de E. coli nas quais a biblioteca de gene de anticorpo foi introduzida foram identificadas, e informação de sequência foi obtida para 132 clones. A distribuição de aminoácido projetada e a distribuição de aminoácido das sequências identificadas são mostradas na Figura 58. Uma biblioteca contendo várias sequências correspondendo à distribuição de aminoácido projetada foi construída.
Exemplo de Referência 24 Isolamento de anticorpos que se ligam a IL6-R de uma maneira dependente do pH (24-1) Isolamento de fragmentos de anticorpo, que se ligam a antígenos de uma maneira dependente do pH, a partir da biblioteca através de separação de conta
[02103] A primeira seleção a partir da biblioteca de His 1 construída foi realizada através de enriquecimento de apenas fragmentos de anticorpo com habilidade de ligação a antígeno (IL-6R).
[02104] Fagos foram produzidos por E. coli contendo os fagemí- deos construídos para exibição de fago. Para precipitar os fagos, NaCl 2,5 M/PEG 10% foi adicionado ao meio de cultura de E. coli de produção de fago. A população de fago precipitado foi diluída com TBS para preparar uma solução de biblioteca de fago. Então, BSA e CaCl2 foram adicionados à solução de biblioteca de fago para ajustar a concentração de BSA final para 4% e a concentração de ion de cálcio final para 1,2 mM. Com relação ao método de separação, os presentes inventores se referiram aos métodos de separação gerais usando antígenos imobilizados em contas magnéticas (J. Immunol. Methods (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20; Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (Sera-Mag SpeedBeads revestidas com NeutrAvidin) ou contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).
[02105] Especificamente, 250 pmol de antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada para permitir o contato da solução de biblioteca de fago com o antígeno em temperatura ambiente por 60 minutos. Contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e deixadas se ligar a complexos de antí- geno/fago em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com 1 ml de CaCl2 1,2 mM/TBST (TBST contendo CaCl2 1,2 mM e Tween20 0,1%) e então duas vezes com 1 ml de CaCl2 1,2 mM/TBS (pH 7,6). Então, as contas adicionadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de tripsina foram suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos e então imediatamente separadas usando um suporte magnético para coletar uma solução de fago. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 ml de linhagem de E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmico (OD600 de 0,4-0,7). A E. coli foi infectada com os fagos através da sua cultura enquanto suavemente agitando a 37° C por uma hora. A E. coli infectada foi plaqueada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli plaqueada para preparar uma solução de biblioteca de fago.
[02106] Para enriquecer os fagos, as segunda e subsequentes rodadas de separação foram realizadas usando a habilidade de ligação a antígeno ou a habilidade de ligação dependente do pH como um indicador. Especificamente, 40 pmol do antígeno marcado com biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada para permitir o contato da solução de biblioteca de fago com o antígeno em temperatura ambiente por 60 minutos. Contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e deixadas se ligar a complexos de antí- geno/fago em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas múltiplas vezes com 1 ml de CaCl2 1,2 mM/TBST e com CaCl2 1,2 mM/TBS. Então, quando os fagos foram enriquecidos usando a habilidade de ligação a antígeno como um indicador, as contas adicionadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de tripsina foram suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos e então imediatamente separadas usando um apoio magnético para coletar uma solução de fago. Alternativamente, quando os fagos foram enriquecidos usando a habilidade de ligação a antígeno dependente do pH como um indicador, as contas adicionadas com 0,1 ml de MES 50 mM/CaCl2 1,2 mM/NaCl 150 mM (pH 5,5) foram suspensas em temperatura ambiente e então imediatamente separadas usando um apoio magnético para coletar uma solução de fago. Para eliminar a habilidade de fagos não exibindo nenhum Fab em infectar E. coli, a proteína pIII (proteína pIII derivada de fago auxiliar) de fagos não exibindo nenhum Fab foi clivada através da adição de 5 μl de 100 mg/ml de tripsina à solução de fago coletada. Os fagos coletados foram adicionados a 10 ml de linhagem de E. coli ER2738 em uma fase de crescimento logarítmica (OD600 de 0,4-0,7). A E. coli foi infectada com os fagos através de sua cultura enquanto agitando suavemente a 37° C por uma hora. A E. coli infectada foi pla- queada em uma placa de 25 mm x 25 mm. Então, os fagos foram cole-tados a partir do meio de cultura da E. coli plaqueada para coletar uma solução de biblioteca de fago. A separação usando a habilidade de ligação a antígeno ou a habilidade de ligação dependente do pH como um indicador foi repetida duas vezes.
(24-2) Avaliação através de ELISA de fago
[02107] Sobrenadantes de cultura contendo fago foram coletados de acordo com um método de rotina (Methods Mol. Biol (2002) 178, 133-145) a partir de colônias simples de E. coli obtida através do método descrito acima.
[02108] Aos sobrenadantes de cultura contendo fago, BSA e CaCl2 foram adicionados em uma concentração final de BSA 4% e em uma concentração de ion de cálcio final de 1,2 mM. Esses sobrenadantes de cultura contendo fago foram submetidos a ELISA através do procedimento que segue. Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μL de PBS contendo o antígeno marcado com biotina. Após lavagem de cada cavidade da placa com PBST (PBS contendo Tween20 0,1%) para remover o antí- geno, as cavidades foram bloqueadas com 250 μl de BSA 4%/TBBS por uma hora ou mais. Após remocao de BSA 4%/TBS, os sobrena- dantes de cultura preparados foram adicionados a cada cavidade. Os anticorpos apresentados nos fagos foram deixados se ligar aos antí- genos em cada cavidade através de incubação da placa a 37° C por uma hora. Seguindo lavagem com CaCl2 1,2 mM/TBST, CaCl2 1,2 mM/TBS (pH 7,6) ou CaCl2 1,2 mM/TBS (pH 5,5) foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada a 37° C por 30 minutos. Após lavagem com CaCl2 1,2 mM/TBST, anticorpo anti-M13 acoplado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS contendo BSA 4% e cálcio ionizado 1,2 mM foi adicionado a cada cavidade. A placa foi in- cubada por uma hora. Depois de lavagem com CaCl2 1,2 mM /TBST, solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi parada através da adição de ácido sulfúrico e então absorbância a 450 nm foi medida para avaliar o desenvolvimento de cor.
[02109] Quando enriquecimento foi realizado usando a habilidade de ligação a antígeno como um indicador, ELISA de fago seguindo duas rodadas de separação mostro que 17 de 96 clones eram ELISA positivo de uma maneira específica de antígeno. Desta maneira, clones foram analisados após três rodadas de separação. Entretanto, quando enriquecimento foi realizado usando a habilidade de ligação a antígeno dependente do pH como um indicador, ELISA de fago seguindo duas rodadas e separação mostrou que 70 de 94 clones eram positivos em ELISA. Desta maneira, os clones foram analisados após duas rodadas de separação.
[02110] As sequências de base de genes amplificados com primers específicos foram analisadas quanto a clones submetidos a ELISA de fago. Os resultados de ELISA de fago e análise de sequência são mostrados na Tabela 52 abaixo. Tabela 52
Figure img0077
[02111] Através do mesmo método, anticorpos com habilidade de ligação a antígeno dependente do pH foram isolados da biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano puro. Quando enriquecimento foi realizado usando a habilidade de ligação a antígeno como um indi-cador, 13 tipos de anticorpos de ligação dependente do pH foram isolados de 88 clones testados. Entretanto, quando enriquecimento foi realizado usando a habilidade de ligação a antígeno dependente do pH como um indicador, 27 tipos de anticorpos de ligação dependente do pH foram isolados de 83 clones testados.
[02112] O resultado descrito acima demonstrou que a variação de clones com habilidade de ligação a antígeno dependente do pH isolados da biblioteca de His 1 foi maior comparado com a biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano nativo.
(24-3) Expressão e purificação de anticorpos
[02113] Clones supostos ter habilidade de ligação dependente do pH para antígenos com base no resultado de ELISA de fago foram introduzidos em plasmídeos de expressão de célula animal. Os anticorpos foram expressos usando o método descrito abaixo. Celulas de linhagem FreeStyle 293-F derivada de rim fetal humano (Invitrogen) foram suspensas em FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) e plaqueadas em uma densidade de célula de 1,33 x 106 celulas/ml (3 ml) para cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. Os plasmídeos preparados foram introduzidos nas celulas através de um método de lipofecção. As celulas foram culturadas em uma incubadora de CO2 (37° C, CO2 8%, 90 rpm) por quatro dias. Através de um método conhecido daqueles versados na técnica, anticorpos foram purificados usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences) de sobrenadantes de cultura obtidos conforme descrito acima. A absor- bância de soluções de anticorpos purificados foi medida a 280 nm usando um espectrômetro. Concentrações de anticorpo foram calculadas a partir dos valores medidos usando o coeficiente de absorção determinado através do método PACE (Protein Science (1995) 4, 24112423).
(24-4) Avaliação de anticorpos isolados quanto à sua habilidade de ligação dependente do pH a receptor de IL-6 humano
[02114] Anticorpos 6RpH#01 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 117; ca deia leve, SEQ ID NO: 118) e 6Rp#02 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 19; cadeia leve, SEQ ID NO: 120) e 6RpH#03 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 121; cadeia leve, SEQ ID NO: 122) isolados conforme descrito em (24-3) foram avaliados quanto à dependência do pH de sua atividade de ligação a receptor de IL-6 humano através da análise da interação entre os anticorpos e receptor de IL-6 humano usando Biacore T100 (GE Healthcare). Tocilizumabe (cadeia pesada, SEQ ID NO: 60; cadeia leve, SEQ ID NO: 61) foi usado como um anticorpo controle que não tem atividade de ligação dependente do pH a receptor de IL-6 humano. A interação para a reação antígeno-anticorpo foi analisada em soluções em pH 7,4 e pH 6,0, correspondendo a condições de pH neutro e pH ácido, respectivamente. Uma quantidade apropriada de Protein A/G (Invitrogen) foi imobilizada em um Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) através de um método de acoplamento de amino, e cerca de 300 RU cada de anticorpos de interesse foram capturados no chip. Os dois tipos de tampões de processamento usados foram: ACES 20 mM/NaCl 150 mM/Tween20 0,05% (p/v)/CaCl2 1,2 mM (pH 7,4); e ACES 20 mM/NaCl 150 mM/Tween20 0,05% (p/v)/CaCl2 1,2 mM (pH 6,0). Esses tampões foram usados cada um para diluir receptor de IL-6 humano. Todas as medições foram realizadas a 37° C.
[02115] Na análise de interação da reação antígeno-anticorpo usando tocilizumabe como um anticorpo controle e anticorpos 6RpH#01, 6RpH#02 e 6RpH#03, uma solução de receptor de IL-6 diluída e um tampão de processamento como um componente sem expressão (blank) foram injetados em uma taxa de fluxo de 5 μl/min por três minutos para permitir que o receptor de IL-6 interagisse com anticorpos tocilizumabe, 6RpH#01, 6RpH#02 e 6RpH#03 capturados so- bre o sensor chip. Então, glicina 10 mM-HCl (pH 1,5) foi injetada em uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 30 segundos para regenerar o sensor chip.
[02116] Sensorgramas em pH 7,4 obtidos através da medição usando o método descrito acima são mostrados na Fig. 59. Sen- sorgramas sob a condição de pH 6,0 obtidos através do mesmo método são mostrados na Fig. 60.
[02117] O resultado descrito acima mostra que a habilidade de ligação ao receptor de IL-6 de anticorpos 6RpH#01, 6RpH#02 e 6RpH#03 foi significantemente reduzida quando o pH do tampão foi mudado de pH 7,4 para pH 6,0.
Exemplo de Referência 25 Método para preparação de FCYR humano e método para análise da interação entre um anticorpo alterado e FcyR humano
[02118] Domínios extracelulares de FCYRS humanos foram preparados através do método que segue. Primeiro, um gene do domínio extracelular de FCYR foi sintetizado através de um método bem conhecido daqueles versados na técnica. Neste momento, a sequência de cada FcyR foi produzida com base na informação registrada em NCBI. Especificamente, FcyR foi produzido com base na sequência de NCBI No. de Acesso NM_000566 (Versão No. NM_000566.3), FcyRIIa foi produzido com base na sequência de NCBI No. de Acesso NM_001136219 (Versão No. NM_001136219.1), FcyRIIb foi produzido com base na sequência de NCBI No. de Acesso NM_004001 (Versão No. NM_004001.3). FcyRIIIa foi produzido com base na sequência de NCBI No. de Acesso NM_001127593 (Versão No. NM_001127593.1) e FcyRIIIb foi produzido com base na sequência de NCBI No. de Acesso NM_000570 (Versão No. NM_000570.3) e um marcador His foi preso ao terminal C. Ainda, a presença de polimorfismo é conhecida para FcyRIIa, FcyRIIIa e FcyRIIIb, e os sítios polimórficos foram produzidos através de referência a Warmerdam e outros (J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25) para FcYRIIa; Wu e outros (J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070) para FcYRIIIa; e Ory e outros (J. Clin. Invest., 1989, 84, 16881691) para FcYRIIIb.
[02119] Vetores de expressão foram construídos através de inserção em vetores de expressão de célula animal dos fragmentos de gene obtidos. Os vetores de expresso construídos foram transientemente introduzidos em celulas FreeStyle293 derivadas de célula de câncer de rim fetal humano (Invitrogen) para expressar as proteínas de interesse. FcYRIIb para uso em análise cristalográfica foi preparado de maneira que a cadeia de açúcar ligada a FcYRIIb é do tipo de alto teor de manose através da expressão da proteína de interesse na presença de Quifunesina em uma concentração final de 10 μg/ml. Os líquidos preparados através de filtragem em um filtro de 0,22 μm dos sobrena- dantes de cultura obtidos do meio de cultura das celulas acima submetidas à introdução transiente foram purificados, a princípio, através das quatro etapas que seguem:
[02120] a primeira etapa: cromatografia de coluna de troca de cá- tion (SP Sepharose FF);
[02121] a segunda etapa: cromatografia de coluna de afinidade com marcador His (HisTrap HP);
[02122] a terceira etapa: cromatografia de coluna de filtragem em gel (Superdex200); e
[02123] a quarta etapa: filtragem estéril.
[02124] Para purificar FcYR, cromatografia de coluna de troca de ânion com Q Sepharose FF foi usada para a primeira etapa. A absor- bância da proteína purificada foi medida a 280 nm usando um espec- trofotômetro. Com base nos valores medidos, as concentrações de proteínas purificadas foram calculadas usando o coeficiente de extinção determinado através de um método tal como PACE (Protein Sci- ence (1995) 4, 2411-2423).
[02125] A interação entre cada variante de anticorpo e o receptor FCYR preparado conforme acima descrito foi analisada usando Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200 (GE Healthcare), Biacore A100 e Biacore 4000. O tampão de processamento usado foi HBS-EP+ (GE Healthcare) e a temperatura de medição foi 25° C. O chip imobilizado usado foi: Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) ou Series S sensor Chip CM4 (GE Healthcare) imobilizado com um peptídeo de antígeno, ProteinA (Thermo Scientific), Protein A/G (Thermo Scientific) ou Protein L (ACTIGEN ou Bio Vision) através de um método de acoplamento de amino. Alternativamente, o chip imobilizado usado foi: Series S Sensor Chip AS (certificado) (GE Healthcare) imobilizado com um peptídeo de antígeno pré-biotinilado através de interação do peptí- deo com o chip.
[02126] Anticorpos de interesse foram capturados nesses sensor chips e o receptor Fcy diluído com o tampão de processamento foi deixado interagir com eles. As quantidades de ligação com os anticorpos foram medidas e comparadas entre os anticorpos. Uma vez que a quantidade de ligação de receptor Fcy depende da quantidade do anticorpo capturado, a comparação foi realizada para valores normalizados obtidos dividindo a quantidade de ligação de receptor FcyR pela quantidade para cada anticorpo capturado. Entretanto, glicina 10 mM- HCl (pH 1,5) foi reagida para retirar o anticorpo capturado do sensor chip, desta maneira, o sensor chip foi regenerado para uso repetido.
[02127] Entretanto, o valor KD de cada anticorpo variante para FcyR foi cineticamente analisado através do método que segue. Primeiro, anticorpos de interesse foram capturados no sensor chip acima, e o receptor Fcy diluído com o tampão de processamento foi deixado interagir com eles. Os resultados de medição dos sensorgramas obtidos foram processados através de ajuste global de acordo com um modelo de ligação Langmuir 1:1 usando Biacore Evaluation Software. A partir dos valores de constante de taxa de ligação ka (l/mol/s) e constante de taxa de dissociação kd (l/s), a constante de dissociação KD (mol/l) foi determinada.
[02128] Quando a interação entre cada um dos anticorpos alterados e FCYR foi fraca e análise correta foi determinada ser impossível através do método de análise cinética mencionado acima, a KD para tais interações foi calculada usando a equação modelo de ligação 1:1 que segue descrita no Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edição AE.
[02129] O comportamento de moléculas de interação de acordo com o modelo de ligação 1:1 em Biacore pode ser descrito pela Equação 4 mostrada abaixo.
[02130] Equação 4
Figure img0078
[02131] Req: um gráfico de níveis de ligação em estado uniforme contra concentração de analito
[02132] C: concentração
[02133] RI: contribuição do índice de refrativo de massa na amostra
[02134] Rmax: capacidade de ligação de analito da superfície
[02135] Quando esta equação é rearrumada, KD pode ser expressa como Equação 2 mostrada abaixo.
[02136] Equação 2
Figure img0079
[02137] KD pode ser calculada designando valores para Rmax, RI e C nesta equação. RI e C são determinados a partir do resultado da medição de um sensorgrama e da condição de medição. Rmax foi calculado de acordo com o método que segue. Para um anticorpo comparado com interação suficientemente forte que é simultaneamente avaliado no período de medição, o valor Rmax obtido por ajuste global de acordo com o modelo de ligação Langmuir 1:1 mencionado acima foi dividido pela quantidade do anticorpo comparado capturado no sensor chip e então esse foi multiplicado pela quantidade capturada de um anticorpo alterado a ser avaliado. O valor resultante foi usado como Rmax.
[02138] Exemplo de Referência 26 Método para preparação de mFcYR
[02139] O domínio extracelular de FCYR de camundongo foi preparado através do método que segue. Primeiro, os genes para os domínios extracelulares de FcyRs foram sintetizados através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Os genes foram construídos com base na informação de sequência para cada FcyR registrado em NCBI. Especificamente, mFcyRI foi produzido com base em na Sequência de Referência NCBI: NP_034316.1; mFcyRII foi produzido com base em Sequência de Referência NCBI:NP_0,34317.1; mFcyRIII foi produzido com base em na Sequência de Referência NCBI: NP_034318.2; e mFcyRIV foi produzido com base em na Sequência de Referência NCBI: NP_653142.2; e um marcador His foi adicionado aos seus terminais C.
[02140] Os sobrenadantes de cultura obtidos a partir de meios de cultura das células acima submetidas à introdução transiente foram filtrados em um filtro de 0,22 μm. Os líquidos preparados foram purificados, a princípio, através das quatro etapas que seguem:
[02141] a primeira etapa: cromatografia de coluna de troca de cá- tion (SP Sepharose FF);
[02142] a segunda etapa: cromatografia de afinidade com marcador His (HisTrap HP);
[02143] a terceira etapa: cromatografia de coluna de filtragem em gel (Superdex200); e
[02144] a quarta etapa: filtragem estéril.
[02145] Entretanto, quando purificando FCYRI, cromatografia de coluna de troca de ânion com Q Sepharose FF foi usada na primeira etapa. A absorbância das proteínas purificadas foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. Com base nos valores medidos, as concentrações de proteínas purificadas foram calculadas usando o coeficiente de extinção determinado através de um método tal como PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
[02146] Vetores de expressão foram construídos através da inserção dos fragmentos de gene obtidos em vetores de expressão de célula animal. Os vetores de expressão construídos foram transientemente introduzidos em células FreeStyle2933 derivadas de célula de câncer de rim fetal humano (Invitrogen) para expressar as proteínas de interesse. Os sobrenadantes de cultura obtidos de meios de cultura das celulas acima submetidas à introdução transiente foram filtrados em um filtro de 0,22 μm. Os líquidos preparados foram purificados, a princípio, através das quatro etapas que seguem:
[02147] a primeira etapa: cromatografia de coluna de troca íon;
[02148] a segunda etapa: cromatografia de afinidade com marcador His (HisTrap HP);
[02149] a terceira etapa: cromatografia de coluna de filtragem em gel (Superdex200); e
[02150] a quarta etapa: filtragem estéril.
[02151] Entretanto, para a cromatografia de coluna de troca de íon na primeira etapa, quando purificando mFcyRI, Q Sepharose HP foi usada; quando purificando mFcyRII e mFcyRIV, SP Sepharose FF foi usada; e quando purificando mFcyRIII, SP Sepharose HP foi usada. Nas terceira e subsequentes etapas, D-PBS(-) foi usado como um solvente, e na purificação de mFcyRIII, o solvente usado foi D-PBS(-) contendo arginina 0,1 M. A absorbância das proteínas purificadas foi medida a 280 nm usando um espectrômetro. Com base nos valores medidos, as concentrações das proteínas purificadas foram calculadas usando o coeficiente de extinção determinado através de um método tal como PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
Exemplo de Referência 27 Alteração para suprimir a ligação a fator reumatoide (27-1) Supressão da ligação a fator reumatoide pelas variantes Fv4- YTE, Fv4-N434H e LS
[02152] Para suprimir a ligação a fator reumatoide pelas variantes Fv4-YTE, Fv4-N434H e LS, em que a retenção no plasma foi aperfeiçoada devido à ligação a FcRn aperfeiçoada em uma faixa de pH ácido, a alteração Q438R/S440E ou S424N foi introduzida nas variantes. Especificamente, as novas variantes de Fc mostradas na Tabela 53 foram preparadas. Primeiro, as variantes foram avaliadas quanto à sua afinidade de ligação com FcRn em pH 6,0. O resultado é mostrado na Tabela 53. Tabela 53
Figure img0080
[02153] Então, as variantes (Fv4-F1166, F1167, F1172, F1173, F1170 e F1171) foram avaliadas quanto à sua ligação a fator reuma- toide. O ensaio de ligação para fator reumatoide foi realizado em pH 7,4 através de um método de eletroquimioluminescência (ECL). Neste ensaio, soros (Protogenex) de 15 ou 30 pacientes reumatoides foram usados. Amostras de soro diluídas 50 vezes foram misturadas com anticorpos de teste marcados com biotina (1 μg/ml) e anticorpos de teste marcados com SULFO-TAG NHS ester (1 μg/ml). As misturas foram incubadas em temperatura ambiente por três horas. Então, as misturas foram separadas em alíquota para cada cavidade de uma placa de 96 cavidades MULTI-ARRAY revestida com estreptavidina (Meso Scale Discovery). Essa foi incubada por duas horas em temperatura ambiente, cada cavidade da placa foi lavada e Read Buffer (x4) foi separado em alíquotas nela. A placa foi posta em um SECTOR imager 2400 Reader (Meso Scale Discovery) para medir a quimiolumi- nescência de cada cavidade.
[02154] O resultado é mostrado na Fig. 61. A ligação ao fator reu- matoide das variantes F1166 (Q438R/S440E) e F1167 (S424N) foi significantemente suprimida comparado com a variante YTE que exibiu atividade de ligação forte com fator reumatoide nos soros de doadores 90216S e 90214S. Com relação às variantes F1173 e F1171 compre-endendo a modificação S424N, sua ligação ao fator reumatoide, que é causada pelas variantes N434H e LS, respectivamente, foi significan- temente suprimida. No entanto, a alteração Q438R/S440E não pôde suprimir completamente a ligação a fator reumatoide causada pelas variantes N434H e LS, e a ligação a fator reumatoide nos soros de um ou dois doadores foi observada.
(27-2) Supressão a ligação a fator reumatoide ela variante LS
[02155] Conforme mostrado na Tabela 54, variantes de Fc foram produzidas através da introdução de uma nova alteração em Fv4-LS. Delas, as variantes (Fv4-F1380, F1384-F1386, F1388 e F1389) que retêm a ligação a FcRn em pH 6,0 foram avaliadas quanto à sua ligação a fator reumatoide de acordo com o método descrito no Exemplo (27-1). O resultado é mostrado na Fig. 62. Essas variantes mostraram ligação significantemente suprimida a fator reumatoide nos soros de doadores. Em particular, a ligação a fator reumatoide de Fv4-F1389 compreendendo Y436T era comparável àquela de IgG1 nativa. Tabela 54
Figure img0081
[02156] Conforme mostrado acima, moléculas de ligação a antígeno podem ser produzidas, as quais não têm nenhuma atividade de ligação a fator reumatoide e cuja atividade de ligação a FcRn humano foi aumentada sob a condição de uma faixa de pH ácido, através da in-trodução na região Fc no sítio de uma modificação que reduz a atividade de ligação a fator reumatoide sozinha sem redução da atividade de ligação a FcRn sob a condição de uma faixa de pH ácido.
[02157] Tais alterações que reduzem a atividade de ligação a fator reumatoide incluem alterações nas posições 284-257, 305-314, 342352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439 e 441-444 (numeração EU). Preferivelmente alterações nas posições 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438 e 440 (numeração EU) são usadas. Particularmente preferivelmente, uma alteração através da substituição de Val por Glu ou Ser na posição 422, uma alteração através da substituição de Ser por Arg na posição 424, uma alteração através da substituição de His por Asp na posição 433, uma alteração através da substituição de Tyr por Thr na posição 436, uma alteração através de substituição de Gln por Arg ou Lys na posição 438 e uma alteração através da substituição de Ser por Glu ou Asp na posição 440 (numeração EU) são usadas. Essas alterações podem ser usadas sozinhas ou sítios múltiplos podem ser usados em combinação.
[02158] Alternativamente, uma sequência de adição de cadeia de açúcar N-ligada pode ser introduzida para reduzir a atividade de ligação a fator reumatoide. Especificamente, como a sequência de adição de cadeia de açúcar N-ligada, Asn-Xxx-Ser/Thr (Xxx representa um aminoácido arbitrário que não Pro) é conhecida, e esta sequência pode ser introduzida na região Fc para adição de cadeia de açúcar N- ligada. O impedimento estérico de cadeia de açúcar N-ligada pode inibir a ligação a RF. Para alterações para adição de cadeia de açúcar N- ligada. Uma alteração através da substituição de Lys por Asn na posição 248, uma alteração através da substituição de Ser por Asn na posição 424, uma alteração através das substituições de Tyr por Asn na posição 436 e Gln por Tyr na posição 438 e uma alteração através de substituição de Qln por Asn na posição 438 (numeração EU) são usadas. Particularmente preferivelmente, uma alteração através de substituição de Ser por Asn na posição 424 (numeração EU) é usada.
Aplicabilidade Industrial
[02159] A presente invenção provê métodos para aumento da absorção de antígenos em celulas através de moléculas de ligação a antígeno, métodos para aumento do número de antígenos aos quais uma molécula de ligação a antígeno única pode se ligar e métodos para redução da con-centração de antígeno em plasma através de administração das mesmas. Ao aumentar a absorção de antígenos em celulas através de moléculas de ligação a antígeno, é possível aumentar a redução da concentração de antígeno em plasma através da administração de moléculas de ligação a antígeno e também aperfeiçoar a farmacodinâmica de moléculas de liga-ção a antígeno e aumentar o número de antígenos aos quais uma molécu-la de ligação a antígeno única pode se ligar. Desta maneira, moléculas de ligação a antígeno podem exibir efeitos in vivo superiores com relação a moléculas de ligação a antígeno comuns.

Claims (8)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo compreendendo uma região variável de an-ticorpo e uma região constante IgG de anticorpo possuindo atividade de ligação a FcRn humano em uma condição de faixa de pH ácido, em que a região variável de anticorpo tem um valor de KD (pH 5,8) / KD (pH 7,4) definido como a razão de KD para o antígeno em pH 5,8 e KD para o antígeno em pH 7,4, de 2 ou superior, em que pelo menos um aminoácido de uma CDR do anticorpo foi substituído por histidina, ou pelo menos uma histidina foi inserida em uma CDR do anticorpo, em que a região constante IgG de anticorpo tem atividade de ligação maior a um receptor FCY em uma condição de faixa de pH neutro do que uma região constante IgG humana nativa em que a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose, e em que a região constante IgG de anticorpo compreende uma região Fc de anticorpo cujo aminoácido na posição 238 de acordo com a numeração EU é alterado de Pro em locais correspondentes em uma região Fc nativa para qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys , Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno é um antígeno solúvel.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo tem atividade de neutralização contra o antígeno.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a região Fc é uma região Fc em que pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU são diferentes de aminoácidos em sítios correspondentes em uma região Fc nativa.
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que a região Fc é uma região Fc que compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: ou Lys ou Tyr na posição de aminoácido 221; qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá- cido 222; qualquer um de Phe, Trp, Glu e Lys na posição de aminoá- cido 223; qualquer um de Phe, Trp, Glu e Tyr na posição de aminoá- cido 224; qualquer um de Glu, Lys e Trp na posição de aminoácido 225; qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoáci- do 227; qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoáci- do 228; qualquer um de Ala, Glu, Gly e Tyr na posição de aminoáci- do 230; qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami- noácido 231; qualquer um de Glu, Gly, Lys e Tyr na posição de aminoáci- do 232; qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 233; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 234; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 235; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 236; qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 237; qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 239; qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 240; qualquer um de Asp, Glu, Leu, Arg, Trp e Tyr na posição de aminoácido 241; qualquer um de Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp e Tyr na posição de aminoácido 243; His na posição de aminoácido 244; Ala na posição de aminoácido 245; qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 246; qualquer um de Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 247; qualquer um de Glu, His, Gln e Tyr na posição de aminoá- cido 249; ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 250; Phe na posição de aminoácido 251; qualquer um de Phe, Met e Tyr na posição de aminoácido 254; qualquer um de Glu, Leu e Tyr na posição de aminoácido 255; qualquer um de Ala, Met e Pro na posição de aminoácido 256; qualquer um de Asp, Glu, His, Ser e Tyr na posição de ami- noácido 258; qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 260; qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile e Thr na posição de ami- noácido 262; qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 263; qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 264; qualquer um de Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp e Tyr na posição de aminoá- cido 265; qualquer um de Ala, Ile, Met e Thr na posição de aminoáci- do 266; qualquer um de Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 267; qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 268; qualquer um de Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 269; qualquer um de Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 270; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 271; qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 272; ou Phe ou Ile na posição de aminoácido 273; qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 274; ou Leu ou Trp na posição de aminoácido 275; qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 276; qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 278; Ala na posição de aminoácido 279; qualquer um de Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 280; qualquer um de Asp, Lys, Pro e Tyr na posição de aminoá- cido 281; qualquer um de Glu, Gly, Lys, Pro e Tyr na posição de ami- noácido 282; qualquer um de Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg e Tyr na posição de aminoácido 283; qualquer um de Asp, Glu, Leu, Asn, Thr e Tyr na posição de aminoácido 284; qualquer um de Asp, Glu, Lys, Gln, Trp e Tyr na posição de aminoácido 285; qualquer um de Glu, Gly, Pro e Tyr na posição de aminoáci- do 286; qualquer um de Asn, Asp, Glu e Tyr na posição de aminoá- cido 288; qualquer um de Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp e Tyr na posição de aminoácido 290; qualquer um de Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln e Thr na posição de aminoácido 291; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Pro, Thr e Tyr na posição de aminoácido 292; qualquer um de Phe, Gly, His, Ile Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 293; qualquer um de Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 294; qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 295; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr e Val na posição de aminoácido 296; qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 297; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 298; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 299; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val e Trp na posição de aminoácido 300; qualquer um de Asp, Glu, His e Tyr na posição de aminoá- cido 301; Ile na posição de aminoácido 302; qualquer um de Asp, Gly e Tyr na posição de aminoácido 303; qualquer um de Asp, His, Leu, Asn e Thr na posição de aminoácido 304; qualquer um de Glu, Ile, Thr e Tyr na posição de aminoáci- do 305; qualquer um de Ala, Asp, Asn, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 311; Phe na posição de aminoácido 313; Leu na posição de aminoácido 315; ou Glu ou Gln na posição de aminoácido 317; qualquer um de His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 318; qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 320; qualquer um de Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Thr e Tyr na posição de aminoácido 322; Ile na posição de aminoácido 323; qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 324; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 325; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 326; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 327; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 328; qualquer um de Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 329; qualquer um de Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 330; qualquer um de Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 331; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 332; qualquer um de Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val e Tyr na posição de aminoácido 333; qualquer um de Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro, e Thr na posição de aminoácido 334; qualquer um de Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp e Tyr na posição de aminoácido 335; qualquer um de Glu, Lys e Tyr na posição de aminoácido 336; qualquer um de Glu, His e Asn na posição de aminoácido 337; qualquer um de Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser e Thr na posição de aminoácido 339; ou Ala ou Val na posição de aminoácido 376; ou Gly ou Lys na posição de aminoácido 377; Asp na posição de aminoácido 378; Asn na posição de aminoácido 379; qualquer um de Ala, Asn e Ser na posição de aminoácido 380; ou Ala ou Ile na posição de aminoácido 382; Glu na posição de aminoácido 385; Thr na posição de aminoácido 392; Leu na posição de aminoácido 396; Lys na posição de aminoácido 421; Asn na posição de aminoácido 427; ou Phe ou Leu na posição de aminoácido 428; Met na posição de aminoácido 429; Trp na posição de aminoácido 434; Ile na posição de aminoácido 436; e qualquer um de Gly, His, Ile, Leu e Tyr na posição de ami- noácido 440; no sítio da região Fc de acordo com a numeração EU.
6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a região Fc de uma IgG humana nativa em que a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose é uma região Fc de qualquer uma de IgG1 humana nativa, IgG2 humana nativa, IgG3 humana nativa e IgG4 humana nativa em que a cadeia de açúcar ligada na posição 297 de acordo com a numeração EU é uma cadeia de açúcar contendo fucose.
7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o receptor FCY é FcYRIa, FcyRIia(R), FcyRIia(H), FcYRIIb, FcyRIIia(V) ou FcyRIIIa(F).
8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o receptor Fcy é FcyRIIb.
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