BR102013022567B1

BR102013022567B1 - Uso de 6-hidroxi-2-piridonas e seus derivados na preparação de uma composição farmacêutica que atue pela inibição da enzima uridina fosforilase humana

Info

Publication number: BR102013022567B1
Application number: BR102013022567-3A
Authority: BR
Inventors: Luiz Augusto Basso; Pablo Machado; Daiana Renck; Diógenes Santiago Santos
Original assignee: Uniao Brasileira De Educacão E Assistência
Priority date: 2013-09-03
Filing date: 2013-09-03
Publication date: 2021-09-21
Also published as: WO2015031968A1; EP3042657A4; US20160193197A1; BR102013022567A2; US9700547B2; EP3042657A1

Abstract

uso de 6-hidroxi-2-piridonas e seus derivados na preparação de uma composição farmacêutica que atue pela inibição da enzima uridina fosforilase humana a presente invenção descreve o uso de pelo menos um composto de fórmula i ou ii ou seus sais farmaceuticamente acetáveis na preparação de uma composição farmacêutica que atue pela inibição da enzima uridina fosforilase. especificamente, a presente invenção compreende o uso dos referidos compostos na preparação de uma composição farmacêutica que atue pela inibição da enzima uridina fosforilase humana em combinação ou não com pelo menos um antineoplásico, em que a inibição atua no aumento da efetividade dos antineoplásicos e na diminuição dos efeitos colaterais provocados pela administração de antineoplásicos. fórmula i fórmula ii fórmula i fórmula ii

Description

Campo da Invenção

A presente invenção descreve o uso de compostos químicos na preparação de uma composição farmacêutica que atue pela inibição da enzima uridina fosforilase. Mais especificamente, a presente invenção compreende o uso dos compostos de fórmula I ou II, sozinhos ou em combinação com pelo menos um antineoplásico, na preparação de uma composição farmacêutica que atue pela inibição da enzima uridina fosforilase, em que a inibição atua, por exemplo, no aumento da efetividade dos antineoplásicos e na diminuição dos efeitos colaterais provocados pela administração de antineoplásicos. A presente invenção situa-se nos campos da química, farmácia e medicina.

Antecedentes da Invenção

A enzima uridina fosforilase humana (EC 2.4.2.3) é um dos alvos promissores para o estudo e desenvolvimento de novos compostos químicos com capacidade de elevar os níveis endógenos de uridina (Urd) pela inibição da reação química catalisada por esta proteína. Uma classe de compostos que atuam como seus inibidores é a dos derivados de 6-hidroxi-2-piridonas, os quais têm sido testados em relação a diversas patologias, incluindo doenças neurodegenerativas, cardíacas e neoplasias. Entretanto, permanecem os desafios técnicos para a obtenção de estruturas desta classe de compostos, em especial compostos que apresentem uma elevada inibição enzimática específica e, ao mesmo tempo, que atuem de modo combinado com outros fármacos, em especial os fármacos para tratamento do câncer, os quais são conhecidos por seus inúmeros efeitos colaterais indesejáveis, como a perda de peso e reações tóxicas inflamatórias, como a mucosite.

Dentre os compostos conhecidos para tratamento oncológico, inclui-se o 5-fluorouracil, cujos principais efeitos adversos gerados são: alopecia, perda de peso, diarreia e mucosite, esta última tanto intestinal quanto bucal. Devido a estes efeitos colaterais, os pacientes interrompem seus tratamentos por conta das dores severas e da impossibilidade de alimentação por causa das úlceras bucais. É neste contexto que a busca por novos regimes de quimioterapias combinadas com outros agentes terapêuticos tornam-se importantes.

A busca na literatura apontou alguns documentos relevantes que serão descritos a seguir.

O documento de STOPPER et al (“Combination of the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil with an inhibitor of its catabolism results in increased micronucleus induction”. Biochem Biophys Res Commun. 1994 Set 15;203(2):1124-30) revela que a concentração necessária de 5-fluorouracil pode ser reduzida à metade para alcançar o efeito genotóxico do quimioterápico na presença de 2,6-dihidroxipiridina. Também é revelado que a aplicação combinada de 5-fluorouracil e um inibidor, 2,6-diidroxipiridina, por exemplo, reduz os efeitos colaterais do antineoplásico pela redução da dose efetiva do quimioterápico. A presente invenção difere deste documento pelo fato de revelar o uso de compostos derivados de 6-hidroxi-2-piridonas distintos daquele revelado em STOPPER et al. e cujo mecanismo de ação também é diferente, por ter como alvo a enzima uridina fosforilase humana (hUP, EC 2.4.2.3). A presente invenção também diferente deste documento por possibilitar a diminuição da quantidade de 5-fluorouracil que é convertido a 5-fluorouridina e 5-fluoro-uridinamonofosfato.

O documento US5155113 revela que a terapia combinada de 5- fluorouracil (ou algum composto capaz de produzir 5-fluorouracil in vivo) com um derivado de piridina, conforme definido em US5155113, seria capaz de potencializar a atividade anticâncer do 5-fluorouracil. A presente invenção difere deste documento pelo fato de propor o uso de compostos da classe 6-hidroxi-2- piridonas distintos a fim de serem utilizados em uma terapia combinada com fármacos antitumorais, como o 5-fluorouracil. Além disso, o mecanismo de ação dos compostos utilizados na presente invenção (inibição da uridina fosforilase) também é distinto daqueles revelados em US5155113.

O documento US4613604 revela uma composição farmacêutica que contém inibidores da enzima uridina fosforilase, caracterizados por aumentar efetividade antitumoral de nucleotídeos de pirimidina, como o 5-fluorouracil e que não interferem com o crescimento de células normais do paciente. A presente invenção difere deste documento pelo fato de apresentar compostos inibidores da uridina fosforilase humana com estrutura distinta daquelas descritas no pedido de patente US4613604. Enquanto o documento US4613604 revela compostos derivados de pirimidinas, a presente invenção revela derivados de piridinas. Além disso, o documento US4613604 não revela nem sugere uma solução para os efeitos colaterais provocados por antineoplásicos.

O documento US5567689 revela métodos e composições farmacêuticas para o aumento dos níveis de uridina no plasma e intracelular, com os compostos dilazep, hexobendina, L-uridina; L-2'-3'-dideoxiuridina, e D-2',3'-dideoxiuridina. A presente invenção difere deste documento pelo fato de apresentar o uso de compostos distintos e, também, o documento US5567689 não revela ou sugere a combinação destes compostos com antineoplásicos.

Dessa forma, há a necessidade da busca por compostos que apresentem elevada capacidade de inibir a enzima uridina fosforilase, inibição esta que pode prevenir ou reduzir a quantidade de efeitos colaterais causados pelos antineoplásicos, ou, ainda, serem utilizados na terapêutica de diversas doenças nas quais o aumento endógeno da uridina pode ser uma alternativa terapêutica para os tratamentos atuais.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um composto de fórmula I ou II,

ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis em que, para a fórmula I, R1, R2 e R3 são independentemente escolhidos dentre: R1 = H, NO2, CN, CO2H, NH2, halogênios, alquila, arila ou heteroarila; R2 = H, NO2, CN, CO2H, NH2, halogênios, alquila, arila, heteroarila, álcoois ou ésteres; R3 = H, NO2, CN, CO2H, NH2, halogênios, alquila, arila, heteroarila, amino álcoois, amino alquilas, álcoois ou ésteres; e, em que para a fórmula II: R1 = H e R2 = -CH2NHCH2CH2OH na preparação de uma composição farmacêutica que atue pela inibição da enzima uridina fosforilase humana.

Em uma realização preferencial do uso da presente invenção, a composição farmacêutica compreende o composto de fórmula I ou II isoladamente ou em combinação com pelo menos um antineoplásico.

Em uma realização preferencial do uso da presente invenção, nos compostos da fórmula I, R1, R2 e R3 são independentemente escolhidos dentre: a) quando R1 = CN, R2 = CH3 e n = 1, R3 = -N(CH3)2, -NHCH2CH2OH, H, (1,2-diidroxipropan-3-il)amino, piperidin-1-il, (1,3-diidroxipropan-2-il)amino, - N(CH2CH3)2, -N(CH2CH2CH3)2 ou fenil; b) R1 = CN, R2 = fenil, R3 = H e n = 0; c) R1 = CN, R2 = CH2CH3, R3 = H e n = 0; d) R1 = CN, R2 = H, R3 = He n = 0; e) R1 = CN, R2 = CH3, n = 0 e o contra-íon da fórmula I é K+.

Em uma realização preferencial do uso da presente invenção, o composto de fórmula I é de fórmula X, Y ou Z:

Em uma realização preferencial do uso da presente invenção, o composto de fórmula X está numa faixa de concentração de 300 nM a 600 nM, o composto de fórmula Y está numa faixa de concentração de 58 nM a 78 nM e o composto de fórmula Z está numa faixa de concentração de 83 nM a 105 nM em relação a inibição da atividade catalítica da enzima uridina fosforilase humana.

Em uma outra realização preferencial do uso da presente invenção, a presente invenção refere-se ao uso de compostos de fórmulas I ou II na preparação de uma composição farmacêutica que atue pela inibição da enzima uridina fosforilase humana, em que a inibição atua no aumento da efetividade e na diminuição dos efeitos colaterais provocados pela administração dos antineoplásicos.

Em uma realização preferencial do uso da presente invenção, o efeito colateral é a mucosite.

Em uma realização preferencial do uso da presente invenção, o 5- fluorouracil está em uma concentração na faixa de 100 mg/m2 de superfície corporal a 600 mg/m2 de superfície corporal.

Em uma realização preferencial do uso da presente invenção, a inibição da enzima uridina fosforilase atua no tratamento do grupo de desordens fisiológicas consistindo de: epilepsias, convulsões, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ansiedade, disfunções do sono, infertilidade, isquemia, hipóxia, disfunções respiratórias, doenças cardiovasculares e síndrome mão-pé (eritrodisestesia palmo-palmar) induzida por quimioterapia.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: mostra a avaliação da citotoxicidade dos compostos c2 e c3 em cultura de células.

Figura 2: A: mostra a análise do efeito dos compostos sobre a sensibilidade celular ao 5-FU, em específico sobre a linhagem celular normal HaCat; *Diferença significativa em relação ao controle (*p < 0,05) e (**p < 0,01). B: mostra a análise do efeito dos compostos sobre a sensibilidade celular ao 5- FU, em específico sobre a linhagem celular tumoral HT-29; *Diferença significativa em relação ao controle (*p < 0,05) e (**p < 0,01). C: mostra a análise do efeito dos compostos sobre a sensibilidade celular ao 5-FU, em específico sobre a linhagem celular tumoral SW-620; *Diferença significativa em relação ao controle (*p < 0,05) e (**p < 0,01).

Figura 3: mostra a análise do peso entre o dia 1 e o dia 6, sendo A) grupo 1, B) grupo 2, C) grupo 3, D) grupo 4 e E) grupo 5; *Diferença significativa em relação ao primeiro dia (*p < 0,05) e (**p < 0,01).

Figura 4: mostra a análise histológica das vilosidades intestinais, sendo A) grupo 1, B) grupo 2, C) grupo 3, D) grupo 4 e E) grupo 5 #Diferença significativa em relação ao grupo 3; *Diferença significativa em relação ao grupo 1 (#p < 0,001) e (**p < 0,0001).

Figura 5: A: mostra a curva padrão da uridina; B: mostra a análise da concentração da uridina plasma, sendo, A) grupo 1, B) grupo 2, C) grupo 3, D) grupo 4 e E) grupo 5; *Diferença significativa em relação ao grupo 1 (*p < 0,05) e (**p < 0,01).

Figura 6: mostra a análise da MPO em diferentes dias de eutanásia. Em branco grupo salina e em cinza grupo tratado com 5-FUra (50mg/kg); *Diferença significativa em relação ao grupo salina (*p < 0,05).

Figura 7: mostra a análise da MPO em modelo de mucosite; *Diferença significativa em relação ao grupo salina (**p < 0,01).

Descrição Detalhada da Invenção

No contexto da presente invenção, o termo “antineoplásicos” deve ser entendido como qualquer fármaco isolado ou em combinação com outros compostos que atue direta ou indiretamente na morte de células cancerígenas.

Uso dos compostos de fórmulas I e/ou II como inibidores da enzima uridina fosforilase.

Compostos da fórmula I e/ou II:

e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis em que, para a fórmula I, R1, R2 e R3 são independentemente escolhidos dentre: R1 = H, NO2, CN, CO2H, NH2, halogênios, alquila, arila ou heteroarila; R2 = H, NO2, CN, CO2H, NH2, halogênios, alquila, arila, heteroarila, álcoois ou ésteres; R3 = H, NO2, CN, CO2H, NH2, halogênios, alquila, arila, heteroarila, amino álcoois, amino alquilas, álcoois ou ésteres; e, em que para a fórmula II: R1 = H e R2 = -CH2NHCH2CH2OH são utilizados na preparação de uma composição farmacêutica para inibição da enzima uridina fosforilase humana.

Uso dos compostos de fórmulas I e/ou II como inibidores da enzima uridina fosforilase em combinação com pelo menos um antineoplásico.

e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis em que, para a fórmula I, R1, R2 e R3 são independentemente escolhidos dentre: R1 = H, NO2, CN, CO2H, NH2, halogênios, alquila, arila ou heteroarila; R2 = H, NO2, CN, CO2H, NH2, halogênios, alquila, arila, heteroarila, álcoois ou ésteres; R3 = H, NO2, CN, CO2H, NH2, halogênios, alquila, arila, heteroarila, amino álcoois, amino alquilas, álcoois ou ésteres; e, em que para a fórmula II: R1 = H e R2 = -CH2NHCH2CH2OH em combinação com pelo menos um antineoplásico.

Em uma realização preferencial, os compostos utilizados como inibidores da enzima uridina fosforilase são os compostos da Fórmula I:

a) quando R1 = CN, R2 = CH3 e n = 1, R3 = -N(CH3)2, -NHCH2CH2OH, H, (1,2-diidroxipropan-3-il)amino, piperidin-1-il, (1,3-diidroxipropan-2-il)amino, - N(CH2CH3)2, -N(CH2CH2CH3)2 ou fenil; b) R1 = CN, R2 = fenil, R3 = H e n = 0; c) R1 = CN, R2 = CH2CH3, R3 = H e n = 0; d) R1 = CN, R2 = H, R3 = He n = 0; e) R1 = CN, R2 = CH3, n = 0 e o contra-íon da fórmula I é K+;

Em uma realização mais preferencial, os compostos de fórmula I são de fórmulas X, Y ou Z e são utilizados na preparação de uma composição farmacêutica que atue pela inibição da enzima uridina fosforilase humana, em combinação ou não com um antineoplásico.

Em uma realização preferencial, o composto de fórmula X está numa concentração de 300 nM a 600 nM, o composto de fórmula Y está numa concentração na faixa de 58 nM a 78 nM e o composto de fórmula Z está numa faixa de concentração de 83 nM a 105 nM em relação a inibição da atividade catalítica da enzima uridina fosforilase humana.

Os compostos de fórmulas I e/ou II, especialmente os compostos de fórmulas X, Y ou Z, são utilizados como inibidores da enzima uridina fosforilase, cuja inibição atua no aumento da efetividade dos antineoplásicos e na diminuição dos efeitos colaterais provocados pela administração de antineoplásicos.

Preferencialmente, o antineoplásico utilizado na presente invenção é um análogo pirimidínico. Mais preferencialmente, o antineoplásico é uma fluorpirimidina, como, por exemplo, o 5-fluorouracil e a 5-fluoro-2’-deoxiridina.

Em uma realização preferencial, o antineoplásico é o 5-fluorouracil, o qual está presente em uma concentração na faixa de 100 mg/m2 de superfície corporal a 600 mg/m2 de superfície corporal.

Mais preferencialmente, o 5-fluorouracil está presente em uma faixa de 400 mg/m2 a 600 mg/m2 de superfície corporal.

Os compostos de fórmulas I e/ou II, especialmente os compostos de fórmulas X ou Y, são utilizados como inibidores da enzima uridina fosforilase, cuja inibição atua em variadas desordens fisiológicas, especialmente as do grupo consistindo de: epilepsias, convulsões, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ansiedade, disfunções do sono, infertilidade, isquemia, hipóxia, disfunções respiratórias, doenças cardiovasculares e síndrome mão-pé (eritrodisestesia palmo-palmar) induzida por quimioterapia.

No presente pedido de patente, os compostos indicados pelas fórmulas I e/ou II elevam os níveis de uridina endógena podendo conduzir ao: aumento da atividade de apreensão para os casos de epilepsia; a potencialização da neurotransmissão dopaminérgica do sistema nervoso central para os casos de doença de Parkinson; interferem na modulação do receptor GABAA- benzodiazepínico para os casos de ansiedade, aumento da ativação dos receptores GABAA-benzodiazepínicos e barbitúricos para os casos de disfunções do sono, aumento da motilidade de espermatozoides para os casos de infertilidade, aumento do metabolismo lipídico e glicídico prevenindo a necrose celular para os casos de isquemia e hipóxia e aumentando a atividade do epitélio mucociliar e reidratando as vias aéreas para os casos de disfunções respiratórias; aumento de uridina endógena reduzindo os efeitos tóxicos da quimioterapia que culmina na síndrome mão-pé.

Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

Exemplo 1. Realização Preferencial Seleção in vitro dos inibidores da uridina fosforilase humana 1 (hUP1):

A atividade enzimática da hUP1 é realizada através de ensaio enzimático utilizando um espectrofotômetro UV/Visível onde foi monitorada a diminuição da absorbância da uridina em 280 nm, por 1 min e a 37°C.

Para a determinação de quais inibidores seriam selecionados para a determinação da constante de inibição (Ki), estipulou-se um ponto de corte de 1 μM, onde apenas aqueles compostos que inibissem mais de 60% da atividade inicial da enzima seriam selecionados para este tipo de análise (Tabela 1). De todos os compostos testados, 7 moléculas tiveram a sua inibição acima de 60% com a concentração de 1 μM (Compostos c1, c2, c3, c4, c6, c12 e c13). Todos os ensaios descritos neste estudo foram realizados para estes compostos e para o benzil aciclo uridina (BAU), a fim de se realizar uma comparação direta dos resultados obtidos com o melhor inibidor in vitro da hUP1 descrito (padrão).

Determinação do Ki para os compostos líderes:

Inicialmente, foi realizado o ensaio de tempo-dependência a fim de avaliar se a inibição do composto sobre a enzima é afetada ao longo do tempo. Verificou-se que nenhum dos compostos testados até o presente momento apresenta inibição dependente de tempo.

Para a determinação do Ki para os inibidores selecionados, realizamos curvas de saturação onde a concentração de um dos substratos é fixada próxima ao Km e a concentração do outro, variada até a saturação em concentrações fixas-variantes de cada um dos inibidores.

Através dos gráficos de duplo-recíproco gerados pela análise, obtivemos padrões de retas que nos permitem sugerir o tipo de inibição (competitiva, não competitiva ou incompetitiva) que o composto tem sobre a enzima, em relação a cada um dos substratos, e a determinação do seu valor de Ki (Tabela 1) utilizando as equações I a III, indicadas abaixo: (I) v = VA/[Ka(1 + I/Kii) + A] (II) v = VA/[Ka(1 + I/Kii) + A(1 + Kis)] (III) v = VA/[A(1 + I/Kis) + Ka]

Dos 7 compostos testados, os dois melhores compostos foram os compostos c2 e c6, com valores de Ki para a uridina de 68 nM e 94 nM, respectivamente.

Quanto ao perfil de inibição, ambos mostraram ter uma inibição competitiva para o substrato uridina e incompetitiva para o substrato Pi, corroborando os dados do mecanismo cinético da enzima, onde o Pi liga-se primeiro à enzima livre para a posterior ligação da uridina no sítio ativo para ocorrer a formação do complexo ternário (Renck et al., 2010). O composto c6 ainda teve uma característica diferenciada dos demais ligantes, proporcionando a diminuição da constante de Michaelis-Menten (Km) do Pi à metade, isso significa que o ligante aumenta em 2 vezes a afinidade do substrato pelo sítio ativo da enzima. Este evento favorece a ligação do inibidor uma vez que seu tipo de inibição é incompetitiva, ele necessita que o Pi esteja ligado previamente ao sítio ativo da enzima para a sua posterior ligação. Em relação ao BAU, sua constante de inibição para a uridina descrita na literatura é de 100 nM e este dado foi confirmado através dos experimentos realizados, permitindo a comparação direta de eficiência dos nossos compostos.

Deste modo, através de uma visão geral dos valores de Ki e perfis de inibição, obtiveram-se compostos com valores próximos e até mesmo com valores menores que o do inibidor mais potente descrito na literatura até o momento, reforçando a importância dos mesmos.

De acordo com a Tabela 1, os compostos destacados em negrito apresentaram inibição acima de 60% com 1 μM e foram selecionados para a determinação dos parâmetros termodinâmicos. Já os compostos em negrito e sublinhado, são os que foram conduzidos para testes in vivo. Tabela 1 - Inibidores da enzima hUP1 in vitro, comerciais e sintetizados.

Determinação dos parâmetros termodinâmicos:

Para a determinação dos parâmetros termodinâmicos (variação da entalpia - ΔH, variação da entropia - ΔS e variação da energia livre de Gibbs - ΔG) foram realizados ensaios de ligação dos compostos à enzima em diferentes condições: enzima livre, enzima complexada com o substrato Pi e a enzima complexada com o produto ribose-1-fosfato (R1P). Para tal análise, foi utilizado microcalorimetria de titulação isotérmica (ITC) onde o equipamento monitora a diferença de calor transferido, entre a célula de referência e a célula de amostra, quando ligações são formadas ou rompidas durante o processo de ligação. A análise dos dados obtidos foi realizada através do modelo One Set of Sites e a determinação do ΔG e da constante de dissociação (KD) foram através das equações (IV) e (V) abaixo, respectivamente: (IV) ΔG = ΔH - TΔS (V) KD = 1/Ka

Através dos valores negativos de ΔG pode-se sugerir que a ligação destes compostos à enzima é espontânea, assim como através dos valores negativos de ΔH, pode-se sugerir que existe uma forte interação através de ligações polares. Os compostos analisados resolvem um dos maiores problemas no desenho de novas moléculas, que é o sistema compensatório ΔH-ΔS, gerando compostos com os mesmos valores de energia livre de Gibbs e, consequentemente, com a mesma afinidade. Em comparação com o BAU, os compostos analisados apresentam valores de entalpia melhor, indicando uma maior estabilidade do complexo através de ligações de hidrogênio e ligações de van der Waals. Entretanto, no que diz respeito aos valores de entropia, os presentes compostos ainda podem melhorar em relação ao BAU, podendo sugerir que ainda seja possível realizar modificações que adicionem ramificações hidrofóbicas a molécula, principalmente pela presença de um bolsão hidrofóbico que compreende o sítio ativo do uracil. Os valores de KD encontrados através de ITC corroboram os valores de Ki encontrados, assim como a melhor condição de ligação dos compostos à enzima (ligação a forma livre ou complexada da enzima) corroboram com o perfil de inibição obtido.

Todos os parâmetros termodinâmicos encontram-se Tabela 2 abaixo. Em destaque, (a) estão as melhores condições de ligação para cada um dos compostos à enzima. Tabela 2 - Parâmetros termodinâmicos dos compostos selecionados.

Teste em cultura de células com os compostos c2 e c3

Para os testes de cultura de células, foram selecionadas duas linhagens tumorais de cólon (HT-29 e SW-620) e uma linhagem normal de queratinócitos (HaCat). As células HaCat foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) enquanto as células HT-29 e SW-620 foram cultivadas em meio RPMI 1640, ambas com 2 mM de L-glutamina, suplementado com 10% de soro bovino fetal, 150 U/ml de penicilina, 150 μg/ml de estreptomicina e mantidas em incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.

Na figura 1, estão demonstrados os resultados de células normais HaCat (A e D), de células tumorais HT-29 (B e E) e de células tumorais SW-620 (C e F). A análise estatística foi realizada através do one-way ANOVA seguido do teste de Bonferroni. As linhas representam o erro padrão enquanto que cada coluna representa a média de três experimentos independentes realizados em quadruplicata.

Para a análise da citotoxicidade dos compostos nas linhagens citadas acimas, os compostos foram adicionados às células, aderidas em placas de 96 poços (7x103 células/poço), nas concentrações de 1-3-10-30-100 μM, por 72 h de incubação. Os resultados foram obtidos através do método colorimétrico com brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-dimetiltetrazólio (MTT), onde a oxidação do MTT em seu produto MTT-formazan é proporcional à atividade mitocondrial e, por conseguinte, à viabilidade celular. Como o desejado, os compostos não foram citotóxicos contra as linhagens tumorais HT-29 e SW-620 nem contra a linhagem normal HaCat (Figura 1).

Avaliação do efeito dos compostos sobre a citotoxicidade do 5-FU

A análise dos possíveis efeitos dos compostos sobre a curva dose- dependente do 5-FU foi realizada com as mesmas linhagens celulares descritas acima, a fim de fazer uma comparação entre linhagens normais e tumorais.

Primeiramente, determinou-se o valor de concentração de 5-FU que inibe 50% do crescimento celular (IC50) sem a presença dos compostos. Para isso, diferentes concentrações de 5-FU foram adicionadas as células (7 x 103 células/poço) em placas de 96 poços: HaCat (0,25 - 20 μM), HT-29 (0,25 - 50 μM) e SW-620 (0,5 - 150 μM). As células foram expostas ao quimioterápico pelo período de 72 h. A mesma curva de dose-resposta foi feita na presença de 30 μM dos compostos c2 e c3, assim como se utilizou o inibidor BAU como controle positivo para inibição da uridina fosforilase.

Para a análise da sensibilidade celular ao 5-FU, foi utilizado o método de MTT (descrito acima) e expresso na forma de IC50 o qual foi calculado a partir de uma curva semilogaritma. A partir dos gráficos, verificamos que os valores de IC50 para a linhagem normal HaCat manteve-se similar, sem diferença significativa entre a curva controle e as curvas com os compostos (Figura 2A). A análise estatística foi realizada através do one-way ANOVA seguido do teste de Bonferroni. As linhas representam o erro padrão enquanto que cada coluna representa a média de três experimentos independentes realizados em quadruplicata.

Na linhagem tumoral menos agressiva HT-29, verificamos que o composto c2 desenvolveu um efeito de proteção à sensibilidade celular contra o 5-FUra, elevando o valor de IC50 para este tipo celular (Figura 2B). A análise estatística foi realizada através do one-way ANOVA seguido do teste de Bonferroni. As linhas representam o erro padrão enquanto que cada coluna representa a média de três experimentos independentes realizados em quadruplicata.

De forma interessante, nas células tumorais mais agressivas (SW-620), os compostos diminuíram significativamente os valores de IC50 do 5-FU (Figura 2C) mostrando que a presença desses compostos torna as células mais sensíveis ao quimioterápico; sugerindo, dessa forma, que o bloqueio da conversão do 5-FU em 5-FUrd realizado pela hUP, permite que mais 5-FU fique disponível para ser convertido em FdUMP e inibir a enzima TS, gerando o seu efeito terapêutico de dano ao DNA. Dessa forma, os compostos da presente invenção atuam adicionalmente no aumento da efetividade dos antineoplásicos. A análise estatística foi realizada através do one-way ANOVA seguido do teste de Bonferroni. As linhas representam o erro padrão enquanto que cada coluna representa a média de três experimentos independentes realizados em quadruplicata.

Teste em roedores do composto c3:

O composto c3 foi testado em in vivo para avaliação de sua proteção quanto à mucosite intestinal causada pelo 5-FU.

O modelo de mucosite foi desenvolvido em Ratos Wistar fêmeas (180 - 200g) e os animais foram divididos em 5 grupos com 4 animais em cada grupo: Grupo 1: Salina + Salina Grupo 2: Composto c3 (150 mg/kg) + salina Grupo 3: Salina + 5-FU (50 mg/kg) Grupo 4: Composto c3 (50 mg/kg) + 5-FU (50 mg/kg) Grupo 5: Composto c3 (150 mg/kg) + 5-FU (50 mg/kg)

O composto teste foi administrado por via oral, 30 minutos antes da administração do quimioterápico 5-FU, que foi administrado por via intraperitoneal. Este tratamento foi seguido por 5 dias com administrações 1 vez ao dia. No 5° dia de tratamento os animais foram eutanasiados utilizando um anestésico inalatório (isoflurano) e foi coletada a porção inicial do intestino (correspondente ao jejuno e íleo) para análise da mieloperoxidase (MPO) e análise histológica do tecido, assim como coleta de sangue para a análise da quantificação da uridina no plasma. Os animais também foram acompanhados quanto à perda de peso e a diarreia.

Quanto à perda de peso, todos os animais que receberam o 5-FU, tanto com ou sem o composto, tiveram uma perda de peso e esta foi significativa (Figura 3). Do mesmo modo, todos os grupos que receberam o quimioterápico desenvolveram diarreia severa. Nestes parâmetros, o composto não foi capaz de evitar esses efeitos adversos. A análise estatística foi realizada através do one-way ANOVA seguido do teste de Bonferroni. As linhas representam o erro padrão enquanto que cada coluna representa a média dos pesos dos 4 animais de cada grupo.

Entretanto, ao se realizar a análise histológica, verificou-se que os grupos que receberam o composto, nas duas doses testadas, tiveram o tamanho das vilosidades intestinais estatisticamente iguais ao grupo salina (sem 5-FU) e diferente do grupo que recebeu 5-FU, enquanto que o grupo que recebeu somente o 5-FU teve suas vilosidades totalmente danificadas (Figura 4). Na figura 4, a análise estatística foi realizada através do one-way ANOVA seguido do teste de Bonferroni. As linhas representam o erro padrão enquanto que cada coluna representa a média de três campos diferentes de cada um dos 4 animais do grupo.

Os dados obtidos e indicados na figura 4 são de extrema importância visto que as vilosidades intestinais são responsáveis pela absorção de água e nutrientes do organismo fazendo também que o epitélio intestinal fique mais integro e assim diminuindo o grau de mucosite.

A determinação da concentração da uridina no plasma dos animais foi realizada por HPLC, utilizando como fase móvel ácido acético 0,1 %.

Primeiramente foi feita uma curva de calibração utilizando uridina comercial como padrão (Sigma) nas concentrações de 0,625 - 1,25 - 2,5 - 5,0 - 10,0 - 20,0 μM em plasma de rato para manter a mesma matriz onde as amostras estão. Após a curva de calibração, foram analisadas as amostras de plasma de cada grupo e foi obtido um resultado positivo. Assim como o esperado, houve o aumento de 4,4 vezes na concentração da uridina no plasma dos animais que receberam o composto por via oral, tanto na dose de 50 mg/kg como na dose de 150 mg/kg (Figuras 5A e 5B). A partir desses dados, é possível sugerir que o efeito de proteção visto no epitélio intestinal dos animais em relação à agressão do quimioterápico foi devido ao efeito de proteção gerado pela uridina. Na figura 5B, a análise estatística foi realizada através do one-way ANOVA seguido do teste de Bonferroni. As linhas representam o erro padrão, enquanto que cada coluna representa a média da concentração em cada um dos 4 animais de cada grupo.

A última análise in vivo foi em relação à MPO. A MPO é uma resposta primária de inflamação, presente em neutrófilos, e para isso analisou-se qual o melhor dia de eutanásia para verificar essa resposta primária. O esquema de tratamento durou 5 dias, onde os animais foram divididos em 2 grupos com 10 animais em cada (Grupo Salina e Grupo 5-FU). O 5-FU (50mg/kg) foi administrado utilizando a via intraperitoneal, assim como a salina. Os animais foram eutanasiados em 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h após a administração (dias 1-5) e a porção inicial do intestino foi coletada. Foi verificado que o melhor dia para a quantificação da MPO seria o dia 2 (48 h após a administração do 5-FU), tal como representado na figura 6, na qual a análise estatística foi realizada através do one-way ANOVA seguido do teste de Bonferroni. As linhas representam o erro padrão enquanto que cada coluna representa a média de dois animais de cada grupo.

Repetiu-se o primeiro experimento de mucosite, com 3 grupos com 5 animais em cada (Grupo salina+salina, Grupo salina + 5-FU e Grupo Composto c3 + 5-FU). O composto teve seu início de administração 2 dias antes do 5-FU, de 8-8 h, por via oral, na dose de 50 mg/kg; e seguiu nos outros 2 dias juntamente com o quimioterápico. Os animais foram eutanasiados com isoflurano e a porção inicial do intestino foi analisada. Verificou-se que o composto não foi capaz de reverter o processo de inflamação primário (Figura 7), o que corrobora com a perda de peso que os animais tiveram mesmo com a preservação das vilosidades. Na figura 7, a análise estatística foi realizada através do one-way ANOVA seguido do teste de Bonferroni. As linhas representam o erro padrão enquanto que cada coluna representa a média de cinco animais para cada grupo.

Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outros variantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Uso de um composto de fórmula I e/ou II,

ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, sendo, em que, para a fórmula I: a) Quando R1 = CN, R2 = CH3 e n = 1, R3 = -N(CH3)2, -NHCH2CH2OH, H, (1,2-dihydroxypropan-3-yl)amino, piperidin-1-yl, (1,3-dihydroxypropan-2- yl)amino, -N(CH2CH3)2, -N(CH2CH2CH3)2 ou fenil; b) quando R1 = CN, R2 = fenila, R3 = H e n = 0; c) quando R1 = CN, R2 = CH2CH3, R3 = H e n = 0; d) quando R1 = CN, R2 = H, R3 = H e n = 0; e) quando R1 = CN, R2 = CH3, n = 0 e o contra-íon é K+; f) quando R1 = CN, R2 = CH3, R3 = H e n = 0; e, para a fórmula II, quando R1 = H e R2 = -CH2NHCH2CH2OH; caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica para inibição da enzima uridina fosforilase humana na redução de mucosite causada pela administração de antineoplásicos.

2. Uso de um composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela composição farmacêutica para inibição da enzima uridina fosforilase humana compreender o composto de fórmula I e/ou II, isoladamente ou em combinação, com pelo menos um antineoplásico.

3. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por, na fórmula I, R1, R2 e R3 serem independentemente escolhidos dentre: a) quando R1 = CN, R2 = CH3 e n = 1, R3 = -N(CH3)2, -NHCH2CH2OH, H, (1,2-diidroxipropan-3-il)amino, piperidin-1-il, (1,3-diidroxipropan-2- il)amino, -N(CH2CH3)2, -N(CH2CH2CH3)2 ou fenil; b) R1 = CN, R2 = fenil, R3 = H e n = 0; c) R1 = CN, R2 = CH2CH3, R3 = H e n = 0; d) R1 = CN, R2 = H, R3 = He n = 0; e) R1 = CN, R2 = CH3, n = 0 e o contra-íon da fórmula I é K+.

4. Uso de um composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo composto de fórmula I ser de fórmula X, Y ou Z:

5. Uso de um composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo composto de fórmula X estar numa faixa de concentração de 300 nM a 600 nM, o composto de fórmula Y estar numa faixa de concentração de 58 nM a 78 nM e o composto de fórmula Z estar numa faixa de concentração de 83 nM a 105 nM em relação à inibição da enzima uridina fosforilase humana.

6. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica que atue pela inibição da enzima uridina fosforilase humana, em que a inibição atua no aumento da efetividade dos antineoplásicos.

7. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica para inibição da enzima uridina fosforilase humana e para diminuição dos efeitos colaterais provocados pela administração de antineoplásicos.

8. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo efeito colateral ser mucosite.

9. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo antineoplásico ser um análogo pirimidínico.

10. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo antineoplásico ser uma fluorpirimidina.

11. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo antineoplásico ser 5-fluorouracil ou 5-fluoro-2’- deoxiridina.

12. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo 5-fluorouracil estar em uma concentração na faixa de 100 mg/m2 de superfície corporal a 600 mg/m2 de superfície corporal.

13. Uso de um composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de uma composição farmacêutica para inibição da enzima uridina fosforilase humana para tratamento do grupo de desordens fisiológicas consistindo de: epilepsias, convulsões, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ansiedade, disfunções do sono, infertilidade, isquemia, hipóxia, disfunções respiratórias, doenças cardiovasculares, síndrome mão-pé (eritrodisestesia palmo-palmar) induzida por quimioterapia.