NO341223B1

NO341223B1 - Piscirickettsia salmonis-antigener og anvendelse derav

Info

Publication number: NO341223B1
Application number: NO20062044A
Authority: NO
Inventors: Michel Thiry; Ingrid Dheur
Original assignee: Eurogentec Sa
Priority date: 2003-10-07
Filing date: 2006-05-08
Publication date: 2017-09-18
Also published as: US7754223B2; DE602004028029D1; AU2004279610B2; NO20062044L; CA2541464A1; EP1670818B1; ATE473236T1; AU2004279610A1; EP1670818A2; CA2541464C; WO2005035558A2; DK200600643A; US20070207165A1; WO2005035558A3; DK177141B1

Description

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører isolert<ft>P45-protein som angitt i krav 1 som kan virke som antigen fra Piscirickettsia salmonis. Den foreliggende oppfinnelse angår også nukleinsyrene som koder for disse antigener som angitt i krav 5. Den foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte for å fremstille en vaksine mot salmonid rickettsial septikemi (SRS) som angitt i krav 16 ved anvendelse av antigenene eller nukleinsyrene.

Bakgrunn:

Salmonid rickettsial septikemi (SRS), også kjent som piscirickettsiose, er en dødelig sykdom i salmonider. Selv om det etiologiske middel for SRS ble identifisert sent i 1980-årene som Piscirickettsia salmonis, viste antibiotika seg å være en lite vellykket behandling, på grunn av, i det minste delvis, denne bakteriens intracellulære karakter [Bravo og Campos, FHS/ AFS Newsl. 17:3 (1989); U.K. Patentsøknad 2 356 632]. Som en konsekvens av mangelen på en mulig behandling, dør millioner av oppdrettslaks av SRS hvert år bare i Sør-Chile alene [Smith et al., Dis. Aquat. Organ. 37(3): 165-172 (1999)]. I tillegg viser nylige rapporter en forbindelse mellom P/sc/nc/cetts/a-lignende bakterier og sykdomssyndromer i ikke-salmonid fisk [se, Mauel og Miller, Veterin. Microbiol. 87(4)279-289 (2002)].

Salmonidae-familien (salmonider) innbefatter laks, ørret, "char", og "whitefisk". Salmonider virker både som matkilde og som fisk for sportsfiske. Enn videre har, i land som for eksempel Chile, Norge, Canada, UK, Irland og USA, salmonider blitt et viktig kommersielt produkt på grunn av, i det minste delvis, fiskeoppdretteres evne til å kunstig gyte, inkubere og oppdrette salmonidene i fangenskap.

Ulikt fisk som stammer fra naturen er de som er oppdrettet i fangenskap mottagelig for profylaktiske behandlinger som for eksempel vaksinering. Dog, til dags dato, er det ikke tatt frem noen sikker og effektiv vaksine mot Piscirickettsia salmonis, selv om andre nylig har foreslått potensielle vaksiner, som for eksempel en basert på et spesifikt Piscirickettsia salmonis- antigen, et 17 kDa lipoprotein OspA [U.K.

Patentsøknad 2 356 632; se også WO 01168865 A2].

I tillegg til Piscirickettsia salmonis er andre patogener kjent for å forårsake sykdom

i oppdrettsfisk, inklusive laks. En slik patogen er infeksiøs pankreatisk nekrose virus

(IPN-virus), hvilket er et ikke-envelopert, icosahedralt, bisegmentert dsRNA virus. IPN-viruset inneholder et hovedstrukturprotein, VP2 (52 kDa) og tre ytterligere proteiner, VP1 (90 k Da), VP3 (30 kDa) og VP4 (28 kDa). VP2 er hovedproteinet i det ytre kapsid og er derfor immunologisk viktig ved gjenkjennelse og binding av viruset. VP1 antas å være en polymerase, mens VP3 og VP4 er interne proteiner. VP4 antas å korrespondere med en form av VP3-fragment dannet under viral differensiering [se, WO 02138770 Al, hvilket innholdet av herved er inkorporert ved referanse i sin helhet). Nukleotid- og aminosyresekvenser for VP2 og VP3 er bestemt [se, Havarstein et al., J. Gen. Virol. 71:299-308 (1990); Pryde et al., Archives of Vir. 129:287-293 (1992)].

Derfor er det et behov for å bringe tilveie sikre og effektive vaksiner mot Piscirickettsia salmonis. I tillegg er det et behov for å identifisere nye antigener fra Piscirickettsia salmonis som kan anvendes i slike vaksiner.

Videre er det et behov for å oppnå nukleinsyrer som koder for slike antigener. I tillegg er det et behov for å bringe tilveie fremgangsmåter for å vaksinere fisk for å beskytte de mot Piscirickettsia salmonis og P/sc/r/c/cetts/a-lignende bakterier. Videre er det et behov for å bringe tilveie vaksiner som kan beskytte fisk mot Piscirickettsia salmonis og andre ikke-relaterte patogener, som for eksempel IPN-virus.

SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse bringer tilveie sikre og effektive vaksiner for å beskytte fisk mot infeksjoner av Piscirickettsia salmonis. Enn videre bringer den foreliggende oppfinnelse tilveie vaksiner som kan beskytte vaksinert fisk mot Piscirickettsia salmonis og andre ikke-relaterte patogener, som for eksempel IPN-virus. Fremgangsmåter for å frembringe vaksinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse bringes også tilveie.

Den foreliggende oppfinnelse bringer videre tilveie protein som nevnt over som kan benyttes som spesifikke antigener fra Piscirickettsia salmonis og som kan anvendes i vaksiner. I tillegg bringer den foreliggende oppfinnelse tilveie nukleinsyrer som koder for disse antigener. I tillegg bringer den foreliggende oppfinnelse tilveie rekombinante, bakterieceller som koder for antigenene, som angitt i krav 7.

I et aspekt i henhold til den foreliggende oppfinnelse bringes et antigen fra Piscirickettsia salmonis tilveie som er et isolert ''^S-protein. Den foreliggende oppfinnelse bringer videre tilveie et rekombinant<ft>p45-protein. Fortrinnsvis får mottakeren av vaksinen, når et antigen, eller et antigent fragment derav, plasseres i en vaksine, beskyttelse mot Piscirickettsia salmonis.

Den foreliggende oppfinnelse bringer videre tilveie et ''^S-protein som omfatter en aminosyresekvens som har i det minste 70 % identitet med aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. I en spesiell utførelsesform omfatter<ft>p45-proteinet en aminosyresekvens som har i det minste 85 % identitet med aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. I en annen utførelsesform omfatter<ft>p45-proteinet en aminosyresekvens som har i det minste 95 % identitet med aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. Fortrinnsvis forårsakes forskjeller i aminosyresekvensene av<ft>p45-proteinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse, av variasjoner funnet i ulike stammer av Piscirickettsia salmonis. I en spesiell utførelsesform omfatter<ft>p45-proteinet i henhold til den foreliggende oppfinnelse aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. I en relatert utførelsesform omfatter<ft>p45-proteinet aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4 omfattende en konservativ aminosyresubstitusjon. I en annen utførelsesform består<ft>p45-proteinet i all vesentlighet av aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. I nok en utførelsesform består''^S-proteinet i all vesentlighet av aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4 omfattende en konservativ aminosyresubstitusjon. I nok en utførelsesform omfatter ''^S-proteinet aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. I nok en utførelsesform omfatter ^45-proteinet aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4 omfattende en konservativ aminosyresubstitusjon.

Den foreliggende oppfinnelse bringer også tilveie antigeniske fragmenter av antigenene i henhold til den foreliggende oppfinnelse. I en spesiell utførelsesform er det antigeniske fragment en del av et<ft>p45-protein som omfatter en aminosyresekvens som har i det minste 70 % identitet med aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. I nok en utførelsesform av denne typen er det antigeniske fragment en del av et<ft>p45-protein som har aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. I en relatert utførelsesform er det antigeniske fragment en del av et<ft>p45-protein som har aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4 omfattende en konservativ aminosyresubstitusjon.

Den foreliggende oppfinnelse bringer videre tilveie rekombinante polypeptider som omfatter et antigenisk fragment av antigenene i henhold til den foreliggende oppfinnelse. I en spesiell utførelsesform omfatter det rekombinante polypeptid aminosyresekvensen av et antigenisk fragment av<ft>p45-proteinet som beskrevet ovenfor.

Den foreliggende oppfinnelse bringer også tilveie kimeriske proteiner som omfatter antigenene og korresponderende antigeniske fragmenter i henhold til den foreliggende oppfinnelse. I en slik utførelsesform omfatter et kimerisk protein aminosyresekvensen av et<ft>p45-protein. I en annen utførelsesform omfatter et kimerisk protein aminosyresekvensen av et antigenisk fragment av et<ft>p45-protein. I en spesiell utførelsesform omfatter et kimerisk protein aminosyresekvensen av et<ft>p45-protein i hvilket det naturlige signalpeptid er erstattet med et alternativt signalpeptid.

I tillegg bringes også antistoff mot alle antigenene, og antigenfragmentene derav, som angitt i krav 4 i henhold til den foreliggende oppfinnelse, tilveie av den foreliggende oppfinnelse. I en spesiell utførelsesform av denne typen bringer den foreliggende oppfinnelse tilveie et antistoff mot ''^S-proteinet. I en spesiell utførelsesform av denne typen tas antistoffet frem mot et<ft>p45-protein i henhold til den foreliggende oppfinnelse, eller et antigenisk fragment derav. I en slik utførelsesform er antistoffet et polyklonalt antistoff. I en annen utførelsesform er antistoffet et monoklonalt antistoff. I nok en utførelsesform er antistoffet et kimært antistoff. I en spesiell utførelsesform dannes et antistoff i henhold til den foreliggende oppfinnelse mot et ^45-prate in som omfatter aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. I en relatert utførelsesform dannes antistoffet mot et<ft>p45-protein omfattende aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4 omfattende en konservativ aminosyresubstitusjon. Det er å foretrekke at antistoffet gjenkjenner en spesifikk epitop av<ft>p45-proteinet. Den foreliggende oppfinnelse bringer videre tilveie isolerte og/eller rekombinante nukleinsyrer som koder for hvert av antigenene og/eller polypeptidene i henhold til den foreliggende oppfinnelse som angitt i krav 5. Den foreliggende oppfinnelse bringer således tilveie isolerte og/eller rekombinante nukleinsyrer som koder for aminosyresekvensene i henhold til SEKV.ID.NR.:2, 4,. Enn videre bringer den foreliggende oppfinnelse tilveie isolerte og/eller rekombinante nukleinsyrer som omfatter nukleotidsekvensene i henhold til SEKV.ID.NR.: 1, 3,. I en slik utførelsesform omfatter nukleinsyren to eller flere av disse nukleotidsekvenser.

Den foreliggende oppfinnelse bringer også tilveie nukleinsyrer som koder for hver av de antigeniske fragmenter i henhold til den foreliggende oppfinnelse. I tillegg bringer den foreliggende oppfinnelse videre tilveie nukleinsyrer som koder for hver av de korresponderende kimeriske proteiner. Alle nukleinsyrene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan videre omfatte heterologe nukleotidsekvenser. Den foreliggende oppfinnelse bringer videre tilveie nukleotidprober og primere for nukleinsyrene i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelse bringer videre tilveie en nukleinsyre som hybridiserer med en nukleotidsekvens i henhold til den foreliggende oppfinnelse, for eksempel, et cDNA bestående av nukleotidsekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 1 og/eller SEKV.ID.NR.: 3. I en spesiell utførelsesform omfatter nukleinsyren den fullstendige kodingssekvensen av et protein i henhold til den foreliggende oppfinnelse, for eksempel,<ft>p45-proteinet. Passende hybridiseringsbetingelser bringes tilveie nedenfor.

I en utførelsesform omfatter en nukleinsyre i det minste 12 nukleotider. I en annen utførelsesform omfatter nukleinsyren i det minste 18 nukleotider. I nok en utførelsesform omfatter nukleinsyren i det minste 24 nukleotider. I nok en utførelsesform omfatter nukleinsyren i det minste 36 nukleotider. I nok en utførelsesform omfatter nukleinsyren i det minste 48 nukleotider. I nok en utførelsesform omfatter nukleinsyren i det minste 72 nukleotider.

I en spesiell utførelsesform bringer den foreliggende oppfinnelse tilveie en isolert og/eller rekombinant nukleinsyre som koder for et ^45-protein som omfatter en aminosyresekvens som har i det minste 70 % identitet med aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. I en foretrukket utførelsesform koder nukleinsyren for et Psp45-protein som omfatter aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 og/eller SEKV.ID.NR.: 4. I en mer foretrukket utførelsesform av denne typen omfatter nukleinsyren nukleotidsekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 1 og/eller SEKV.ID.NR.: 3. I nok en utførelsesform koderen nukleinsyre i henhold til den foreliggende oppfinnelse for et kimerisk protein som omfatter aminosyresekvensen av et antigenisk fragment av et<ft>p45-protein.

Den foreliggende oppfinnelse bringer også tilveie vektorer som kan omfatte en eller flere av nukleinsyrene i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis tilknyttes en eller flere av nukleinsyrene i henhold til den foreliggende oppfinnelse, operativt en transkripsjonen kontrollsekvens i en ekspresjonsvektor. Vertsceller som omfatter vektorene (inklusive ekspresjonsvektorer) er også del av den foreliggende oppfinnelse. I en utførelsesform er vertscellen en gram negativ bakterie. I en slik utførelsesform av denne typen er vertscellen en Escherichia coli-celle. I en foretrukket utførelsesform er vertscellen en Yersinia ruckeri- ceWe.

I tillegg bringer den foreliggende oppfinnelse tilveie fremgangsmåter for å produsere et polypeptid omfattet av de ovenfor nevnte vertsceller. En slik fremgangsmåte omfatter å dyrke vertscellen som uttrykker en nukleinsyre som koder for polypeptidet i henhold til den foreliggende oppfinnelse, for eksempel, et antigen, eller et antigenisk fragment derav, for derved å produsere polypeptidet. Fremgangsmåter for å rense og/eller oppnå de resulterende rekombinante proteiner er også inkludert i den foreliggende oppfinnelse, for eksempel, de rensede rekombinante antigener og antigeniske fragmenter.

Den foreliggende oppfinnelse bringer videre tilveie rekombinante bakterieceller. I en slik utførelsesform er den rekombinante bakteriecelle en Yersinia ruckeri celle som har BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044. I en annen utførelsesform er den rekombinante bakteriecelle en Yersinia ruckeri celle som har BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511.

Den foreliggende oppfinnelse bringer også tilveie vaksiner som omfatter proteinene, og/eller antigeniske fragmenter, og/eller rekombinante vertsceller, og/eller bakteriner i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

Vaksinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan omfatte hvilke som helst immunogene sammensetninger i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Foretrukne vaksiner beskytter fisk mot SRS, enten alene eller i multivalente vaksiner som også kan beskytte mot andre patogener. I en relatert utførelsesform er en vaksine som er en naken DNA-vaksine som omfatter en rekombinant DNA-vektor som omfatter en nukleinsyre som koder for et antigen, eller et antigenisk fragment derav, i henhold til den foreliggende oppfinnelse

Hvilken som helst fisk kan være mottaker av vaksinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Eksempler på mottakerfisk listes opp nedenfor. I en spesiell utførelsesform er fisken en teleost. I en foretrukket utførelsesform er teleosten en salmonid. I en mer foretrukket utførelsesform er salmoniden en laks. I en slik utførelsesform er laksen en Salmo salar (atlantisk laks). I en annen utførelsesform er laksen en Oncorhynchus kisutch coholaks. I nok en utførelsesform er salmoniden en Oncorhynchus mykiss (regnbueørret).

I en spesiell utførelsesform omfatter og/eller koder en vaksine for et<ft>p45-protein, eller et antigenisk fragment derav. I en annen utførelsesform omfatter og/eller koder vaksinen for et eller flere antigener og/eller proteiner som omfatter en aminosyresekvens i henhold til SEKV.ID.NR.: 2, 4, og/eller fragmenter derav. I nok en utførelsesform omfatter vaksinen et bakterin av en Yersinia ruckeri celle som har BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044. I nok en utførelsesform omfatter vaksinen et bakterin av en Yersinia ruckeri- ce\\ e som har BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511. I nok en utførelsesform omfatter vaksinen et bakterin av en Yersinia ruckeri- ce\\ e som har BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511 sammen med et bakterin av en Yersinia ruckeri- ceWe som har BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044. Fortrinnsvis bringer slike vaksiner tilveie beskyttelse av fisk mot SRS.

I en annen utførelsesform omfatter og/eller koder en vaksine i henhold til den foreliggende oppfinnelse, videre for et eller flere antigener oppnådd fra et infeksiøs pankreatisk nekrose (IPN) -virus. Disse rekombinante proteiner uttrykkes fortrinnsvis av transformert gjær, Pichia pastoris. I en slik utførelsesform er antigenet oppnådd fra IPN-virus VP2-var-proteinet, eller det antigeniske fragment derav. I en annen utførelsesform er antigenet oppnådd fra IPN-virus VP3-proteinet, eller det antigeniske fragment derav. I en spesiell utførelsesform omfatter vaksinen både VP2-var-proteinet, eller det antigeniske fragment derav, og VP3-proteinet, eller det antigeniske fragment derav.

I en utførelsesform er et antigen delen av VP2-var-proteinet oppnådd fra den transformerte Pichia pastoris- ceWen, BCCM aksesjonsnummer IHEM 20069. I en annen utførelsesform av denne typen er et antigen delen av V P2-va r-protein et oppnådd fra den transformerte Pichia pastoris- ceWen, BCCM aksesjonsnummer IHEM 20070. I nok en utførelsesform er et antigen delen av VP3-proteinet oppnådd fra den transformerte Pichia pastoris- ceWen, BCCM aksesjonsnummer IHEM 20071.

I nok en utførelsesform er et antigen delen av VP3-proteinet oppnådd fra den transformerte Pichia pastoris- ceWen, BCCM aksesjonsnummer IHEM 20072. I en spesiell utførelsesform omfatter vaksinen antigener fra transformerte Pichia pastoris- ceWer, BCCM aksesjonsnummer IHEM 20069 og BCCM aksesjonsnummer IHEM 20071. I en annen utførelsesform omfatter vaksinen antigener fra transformerte Pichia pastoris- ceWer,. BCCM aksesjonsnummer IHEM 20070 og BCCM aksesjonsnummer IHEM 20072.

I nok en utførelsesform omfatter en vaksine i henhold til den foreliggende oppfinnelse et eller flere antigener oppnådd fra Aeromonas salmonicida. I en spesiell utførelsesform frembringes Aeromonas salmonicida som omfatter antigenene fra en kultur dyrket under jernbegrensede tilstander. I en annen utførelsesform frembringes Aeromonas salmonicida som omfatter antigenene fra en kultur dyrket under jernsupplementerte betingelser. I en spesiell utførelsesform benyttes to sett av Aeromonas salmonicida- ant\ ger\ er i vaksinen, et sett fra en kultur dyrket under jernbegrensede betingelser, det andre settet fra en kultur dyrket under jernsupplementerte betingelser. I en spesiell utførelsesform omfatter en multivalent vaksine antigener fra Piscirickettsia salmonis, IPN og Aeromonas salmonicida.

Vaksinene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan også beskytte en fisk mot salmonid rickettsiell septikemi (SRS), eller SRS sammen med en eller flere andre patogene sykdom(er) gjennom vaksinasjon av fisken . I en spesiell utførelsesform er den andre sykdommen infeksiøs pankreatisk nekrose. I en annen utførelsesform er den andre sykdommen furunkulose. Vaksinene kan også benyttes for å beskytte fisken mot SRS, infeksiøs pankreatisk nekrose, og furunkulose (forårsaket av Aeromonas salmonicida).

Vaksinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan administreres ved hvilken som helst metode. I en utførelsesform administreres en vaksine i henhold til den foreliggende oppfinnelse ved immersjon. I en annen utførelsesform administreres en vaksine i henhold til den foreliggende oppfinnelse ved injisering. I nok en utførelsesform administreres en vaksine i henhold til den foreliggende oppfinnelse ved oral administrering.

I tillegg bringes også relaterte boostervaksiner tilveie av den foreliggende oppfinnelse. Administrering av en gitt boostervaksine utføres fortrinnsvis gjennom oral administrering.

I et annet aspekt i henhold til den foreliggende oppfinnelse bringes fremgangsmåter tilveie for å uttrykke rekombinante bakterieoverflateantigener som det på annen måte er ekstremt vanskelig å uttrykke. I en slik utførelsesform anvendes en enterisk bakterie som ikke er tilstede i mennesker (for eksempel, en Yersinia ruckeri- ce\\ e) som en rekombinant vektor for å uttrykke et overflateantigen (for eksempel, et ytre membranprotein) fra en intracellulær patogen. Fortrinnsvis anvendes den rekombinante bakterievektor i en vaksine. I en foretrukket utførelsesform av denne typen er den rekombinante bakterie inaktivert (dvs., et bakterin). Tidligere var det verken kjent eller forventet at i fisk kunne det resulterende rekombinante bakterin være mye mer antigenisk enn et korresponderende rekombinant, ikke-enterisk bakterin.

En slik vaksine omfatter en rekombinant, enterisk bakterie som koder for et overflateantigen, eller et antigenisk fragment derav, av den intracellulære patogen. I en foretrukket utførelsesform av denne typen er overflateantigenet et ytre membranprotein. I en spesiell utførelsesform er den enteriske bakterie inaktivert. I en foretrukket utførelsesform er den enteriske bakterie Yersinia ruckeri.

Fortrinnsvis er det ikke-humane dyr en fisk. Mer fortrinnsvis er fisken en teleost. Representative teleoster listes opp nedenfor. I en foretrukket utførelsesform av denne typen erteleosten en salmonid. I en slik utførelsesform er salmoniden en Salmo salar (Atlantisk laks). I en annen utførelsesform er salmoniden en Oncorhynchus kisutch coho laks. I nok en utførelsesform er salmoniden en Oncorhynchus mykiss (regnbueørret).

Som det følger av dette er det et hovedformål av den foreliggende oppfinnelse å bringe tilveie en vaksine som beskytter salmonider mot SRS.

Det er videre et formål av den foreliggende oppfinnelse å bringe tilveie en vaksine som beskytter fisk fra salmonid rickettsiell septikemi (SIRS) og infeksiøs pankreatisk nekrose (IPN).

Det er videre et formål av den foreliggende oppfinnelse å bringe tilveie en effektiv måte å beskytte mot en rekke ulike fiskeinfeksjoner ved å bringe tilveie en multivalent vaksine.

Det er et videre formål av den foreliggende oppfinnelse å bringe tilveie et DNA-konstrukt som koder for<ft>p45-proteinet, eller varianten derav.

Det er videre et formål av den foreliggende oppfinnelse å bringe tilveie et polypeptid som har en aminosyresubstituert SEKV.ID.NR.: 2, eller et antigenisk fragment derav.

Det er videre et formål av den foreliggende oppfinnelse å bringe tilveie et polypeptid som har en aminosyresubstituert SEKV.ID.NR.: 4, eller et antigenisk fragment derav.

Det er et videre formål av den foreliggende oppfinnelse å bringe tilveie en rekombinant underenhetsvaksine mot SRS.

Det er et videre formål av den foreliggende oppfinnelse å bringe tilveie inaktiverte, rekombinante bakterievektorer som koder for spesifikke antigener for anvendelse i vaksiner mot SRS.

Disse aspekter i henhold til den foreliggende oppfinnelse vil bedre forstås med referanse til de følgende tegninger og detaljerte beskrivelse.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 viser mortaliteten forårsaket av SRS som begynte 9 dager etter utfordring i PBS-kontrollgruppen, og 15 dager etter utfordring i den SRS-vaksinerte gruppen (se Eksempel 7 nedenfor). Figur 2 viser mortaliteten forårsaket av SRS som begynte 9 dager etter utfordring i PBS-kontrollgruppen, og 11 dager etter utfordring i den SRS/IPN-vaksinerte gruppen (se Eksempel 8 nedenfor).

DETAUERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse bringer tilveie vaksiner for å beskytte fisk mot SRS. Den foreliggende oppfinnelse bringer videre tilveie vaksiner som beskytter fisk mot SRS og en eller flere andre patogene sykdommer. I tillegg, bringes også boostervaksiner tilveie av den foreliggende oppfinnelse. Vaksinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse (inklusive boostervaksiner) kan administreres til fisk gjennom en rekke metoder, inklusive ved immersjon, ved injisering og/eller gjennom oral administrering.

Den foreliggende oppfinnelse bringer også tilveie spesifikke antigener fra Piscirickettsia salmonis. Selv om disse antigener kan være plassert i en vaksine i hvilken som helst av en rekke former (for eksempel, som et rekombinant protein eller i en DNA-vaksine) er den foretrukne utførelsesform som et uttrykt protein i en inaktivert, rekombinant, gram negativ bakterie.

Antigenet i henhold til den foreliggende oppfinnelse er<ft>p45-proteinet. Den kodende sekvens for ftp45-protein et er i en rekombinant, Chilensk stamme av Yersinia ruckeri som er deponert (BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044). Nukleotidkodingssekvensen av<ft>p45-proteinet i den deponerte rekombinante Yersinia ruckeri er SEKV.ID.NR.: 1 (se Eksempel 1 nedenfor hvor den er fremstilt). Aminosyresekvensen av<ft>p45-proteinet i den deponerte rekombinante Yersinia ruckeri er SEKV.ID.NR.: 2. Et putativt signalpeptid i SEKV.ID.NR.: 2 fremstilles ved understrekin<g>i aminosyresekvensen nedenfor. Som tydelig vist i fremstillingen av aminosyresekvensen er spaltningssetet mellom to alaninrester, henholdsvis ved posisjoner 22 og 23. Dette signalpeptid kan være erstattet av alternative signalpeptider for å øke utskillelse av<ft>p45-proteinet og slike kimeriske proteiner er inkludert i den foreliggende oppfinnelse.

Som angitt heri har full-lengde<ft>p45-proteinet aminosyresekvensen indikert nedenfor, angitt som SEKV.ID.NR.: 2.<ft>p45-proteinet som mangler signalpeptidet (det vil si, som mangler de amino-terminale 22 aminosyrer i henhold til SEKV.ID.NR.: 2) har aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 4. SEKV.ID.NR.: 3 er nukleotidkodingssekvensen av ^45-proteinet som mangler signalpeptidet.

Den foreliggende oppfinnelse bringer også tilveie en andre deponert, rekombinant Yersinia ruckeri- ceWe (BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511). I en spesiell utførelsesform i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter SRS-vaksinen bakteriner av de deponerte, rekombinante Yersinia ruckeri- ceWer (BCCM aksesjonsnummere LMG P-22511, sammen med LMG P-22044).

Disse rekombinante Yersinia ruckeri celler ble alle deponert ved:

Belgian Coordinated Collections of Mikroorganismer (BCCM)Laboratorium voor Microbiologie - Bacteriénverzameling (LMG)

Universiteit Gent

K.L. Ledegarickstraat 35

B-9000 Gent, Belgium

• Stammenavn: Yersinia ruckeri 224/pGEM5ZF+/45kDa/S

o BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044, deponert 11. september,

2003.

• Stammenavn: Yersinia ruckeri 224/pGEM5ZF+/75kDa

o BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511, deponert 27. mai, 2004.

Den foreliggende oppfinnelse bringer også tilveie vaksiner mot SRS og IPN (SIRS/IPN-vaksiner) som videre omfatter et eller flere antigener oppnådd fra et infeksiøs pankreatisk nekrose (IPN) virus. Disse rekombinante proteiner uttrykkes fortrinnsvis av transformert gjær, Pichia pastoris.

I en slik utførelsesform er antigenet oppnådd fra IPN-viruset VP2-var-proteinet, eller et antigenisk fragment derav. I en spesiell utførelsesform er antigenet VP2-var-proteinet oppnådd fra den transformerte Pichia pastoris- ce\\ e, BCCM aksesjonsnummer IHEM 20069 og/eller fra den transformerte Pichia pastoris- ce\\ e, BCCM aksesjonsnummer IHEM 20070. I en annen utførelsesform er antigenet oppnådd fra IPN-virus VP3-proteinet, eller et antigenisk fragment derav. I en spesiell utførelsesform av denne typen er antigenet VP3-proteinet oppnådd fra den transformerte Pichia pastoris- ce\\ e, BCCM aksesjonsnummer IHEM 20071 og/eller fra den transformerte Pichia pastoris- ce\\ e BCCM aksesjonsnummer IHEM 20072. I en utførelsesform i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter SRS/IPN-vaksinen i det minste et VP-var-antigen og et VP3-antigen.

Fire rekombinante Pichia pastoris gjærceller ble deponert ved:

Belgian Coordinated Collections of Mikroorganismer (BCCM)

Institut Scientifique de la Sante Publique - Louis Pasteur (IHEM)

Section mycology

J. Wytsmanstraat 14 Rue J. Wytsman

B-1050 Brussels, Belgium

Alle fire deponeringer ble utført 11. september, 2003.

• Stammenavn: Pichia pastoris GS115/pPICZaB/VP2var/MUT+46

o BCCM aksesjonsnummer IHEM 20069

Denne rekombinante cellen koder for VP2-var-antigenet og humant serum antigen (HSA).

• Stammenavn: Pichia pastoris SMD1168/pPICZaB/VP2 367.5

o BCCM aksesjonsnummer IHEM 20070

Denne rekombinante cellen koder for VP2-var-antigenet uten HSA.

• Stammenavn: Pichia pastoris KM71/pPICZaB/VP3/MUTs 30:11

o BCCM aksesjonsnummer IHEM 20071

Denne rekombinante cellen koder for VP3-antigenet med HSA.

• Stammenavn: Pichia pastoris GS115/pPICZaB/VP3 112.15

o BCCM aksesjonsnummer IHEM 20072

Denne rekombinante cellen koder for VP3-antigenet uten HSA,

Som anvendt heri skal de følgende benevnelser ha definisjonene anvist nedenfor: Som anvendt heri betegner benevnelsen "<ft>p45-protein" et Piscirickettsia salmonis-protein som er omtrent 45000 dalton. Det spesifikke full-lengde<ft>p45-proteinet eksemplifisert heri har aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2, og er viderekarakterisert vedEksempel 1 nedenfor. Det korresponderende<ft>p45-protein som mangler sitt 22 aminosyre signalpeptid har aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 4. Full-lengde<ft>p45-proteinet kodes for av nukleinsyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 1. Det rekombinante<ft>p45-protein kodes for av den rekombinante Yersinia ruckeri- celle som har BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044. Cellene ble deponert på datoen 11. september, 2003 ved:

The Belgian Coordinated Collections of Mikroorganismer (BCCM) ved adressen brakt tilveie ovenfor. En generell adresse for BCCM er:

Prime Minister's Services

Federal Office for Scientific, Technical and Cultural Affairs (OSTC)

Rue de la Science 8

B-1000 Brussels Belgium

Som anvendt heri anvendes benevnelsen "polypeptid" omvekslende med benevnelsen "protein" og menes videre å omfatte peptider. Derfor er, som anvendt heri, et polypeptid en polymer av to eller flere aminosyrer sammenføyd med peptidbindinger. Fortrinnsvis er et polypeptid en polymer som omfatter 20 eller flere aminosyrerester sammenføyd ved peptidbindinger, mens et peptid omfatter to til 20 aminosyrerester sammenføyd ved peptidbindinger.

Som anvendt heri er et polypeptid "bestående i all vesentlighet av" eller som "består i all vesentlighet av" en spesifisert aminosyresekvens et polypeptid som (i) bibeholder en viktig egenskap av polypeptidet som omfatter aminosyresekvensen, for eksempel, antigenisitet på i det minste en epitop av ^<4>5-prate i net, og (ii) videre omfatter den identiske aminosyresekvens, foruten at den omfatter pluss eller minus 10 % (eller en lavere prosentandel), og fortrinnsvis pluss eller minus 5 % (eller en lavere prosentandel) av aminosyrerestene. I en spesiell utførelsesform er ytterligere aminosyrerester inkludert som del av polypeptidet del an en tilknyttet Tag, som for eksempel en C-terminal His6-Tag.

Et molekyl er "antigenisk" når det er i stand til å spesifikt vekselvirke med et av immunsystemets antigengjenkjennelsesmolekyler, som for eksempel et immunglobulin (antistoff) eller en T-celle antigenreseptor. Et antigenisk polypeptid (og/eller fragment av polypeptidet) inneholder i det minste 6, og fortrinnsvis i det minste 12 eller flere aminosyrerester. Et antigenisk del av et molekyl kan være den delen som er immunodominant for gjenkjennelse av et antistoff eller en T-celle reseptor, og/eller det kan være en del anvendt for å frembringe et antistoff overfor molekylet ved å konjugere en immunogen del av antigenet til et bærermolekyl for immunisering. Et molekyl som er antigenisk trenger ikke i seg selv være immunogent, det vil si i stand til å frembringe en immunrespons uten en bærer.

Som anvendt heri er benevnelsen "antigenisk fragment" med hensyn til et spesielt protein, et fragment av det proteinet som er antigenisk. For eksempel er et antigenisk fragment av ^45-proteinet et fragment av<ft>p45-proteinet som er antigenisk. Som anvendt heri kan et "antigenisk fragment" av ''^S-proteinet, for eksempel, være hvilket som helst fragment av<ft>p45-proteinet, inklusive større fragmenter som mangler så lite som en enkelt aminosyre fra full-lengde proteinet. I en spesiell utførelsesform inneholder et antigenisk fragment av<ft>p45-proteinet mellom 12 og 200 aminosyrerester. I tillegg kan et antigenisk fragment av et gitt protein oppnås ved en rekombinant kilde, fra et protein isolert fra naturlige kilder, eller gjennom kjemisk syntese. Enn videre kan et antigenisk fragment oppnås etterfølgende proteolytisk nedbrytning av et protein, eller et fragment derav, gjennom rekombinant ekspresjon, eller alternativt kan det frembringes de novo, for eksempel, gjennom peptidsyntese.

Som anvendt heri er en multivalent vaksine en vaksine som omfatter to eller flere ulike antigener. I en spesiell utførelsesform av denne type stimulerer den multivalente vaksine resipientens immunsystem overfor to eller flere ulike patogener. Spesifikke multivalente vaksiner er eksemplifisert nedenfor.

Som anvendt heri menes benevnelsen "kimerisk" protein å innbefatte fusjonsproteiner. "Kimeriske"<ft>p45-proteiner i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter, for eksempel, i det minste en del av et ikke-<ft>p45-polypeptid sammenføyd via en peptidbinding til i det minste en del av et<ft>p45-protein. Kimeriske proteiner kan ha ytterligere strukturelle, regulatoriske og/eller katalytiske egenskaper. Som anvendt heri kan et kimerisk protein omfatte multiple addisjoner til i det minste en del av et gitt protein, for eksempel kan et kimerisk ''^S-protein omfatte både en HiS6-Tag og en alternativ signalsekvens. I en spesiell utførelsesform virker det kimeriske protein som et middel for å påvise og/eller isolere polypeptidet, eller fragmentet derav, etter at en rekombinant nukleinsyre som koder for det gitte protein, eller antigeniske fragment derav, uttrykkes. Ikke-^45-3111 inosyresekvenser er fortrinnsvis, for eksempel, enten amino- eller karboksy-terminale i forhold til<ft>p45-sekvensen.

Som anvendt heri er en aminosyresekvens 100 % "identisk" med en annen aminosyresekvens når aminosyrerestene av begge sekvenser er identiske. Som det følger av dette, er en aminosyresekvens 50 % "identisk" med en annen aminosyresekvens når 50 % av aminosyrerestene av de to aminosyresekvenser er identiske. Sekvenssammenligningen utføres over en kontinuerlig blokk av aminosyrerester omfattet av et gitt protein, for eksempel,<ft>p45-proteinet, eller en del av polypeptidet som sammenlignes. I en spesiell utførelsesform tas valgte delesjoner eller innsettinger, som ellers kunne endret samsvaret mellom de to aminosyresekvenser, med i beregningen.

Som anvendt heri kan prosent identitet av DNA- og proteinsekvens bestemmes ved anvendelse av C, MacVektor 6.0.1, Vektor NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) og Clustal W-algoritmen med samstillingsstandardverdiene, og standardverdier for identitet. Disse kommersielt tilgjengelige programmer kan også anvendes for å bestemme sekvenslikhet ved anvendelse av de samme eller analoge standardverdier. Alternativt kan et avansert Blast-søk med standard filterbetingelser anvendes, for eksempel, ved anvendelse av GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for GCG the Package, Version 7, Madison, Wisconsin) oppsamlingsprogram ved anvendelse av standardverdiene.

Som anvendt heri refererer en "nukleinsyre" til den fosfatester polymeriske form av ribonukleosider (adenosin, quanosin, uridin eller cytidin; "RNA molekyler") eller deoksyribonukleosider (deoksyadenosin, deoksyguanosine, deoksytymidin, eller deoksycytidin; "DNA molekyler"), eller hvilke som helst fosfoesteranaloger derav, som for eksempel fosforothioater og thioestere, i enten enkelttrådet form, eller en dobbelttrådet heliks. Dobbelttrådet DNA-DNA-, DNA-RNA- og RNA-RNA- helikser er mulig. Når man referer til en nukleinsyre som er dobbelttrådet menes både "sense"-tråden og den komplementære "antisense"-tråden å være inkludert. Således kan en nukleinsyre som er hybridiserbar med SEKV.ID.NR.: 1, for eksempel, være enten hybridiserbar med "sense"-tråden i henhold til SEKV.ID.NR.: 1, hvilket er særskilt opplistet i sekvensopplistingen, eller med "antisense"-tråden hvilket med letthet kan bestemmes fra sekvenslisten.

En DNA "kodingssekvens" er en dobbelttrådet DNA-sekvens som er transkribert og translatert til et polypeptid i en celle in vitro eller in vivo når den er plassert under kontroll av passende regulatoriske sekvenser. Grensene for den kodende sekvens bestemmes ved et startkodon ved 5'- (amino) terminus og et translasjonsstoppkodon ved 3'- (karboksyl) terminus. En kodingssekvens kan innbefatte, prokaryote sekvenser, cDNA fra eukaryot mRNA, genomiske DNA-sekvenser fra eukaryot (for eksempel, mammalisk) DNA, og til og med syntetiske DNA-sekvenser. Hvis den kodende sekvens er ment for ekspresjon i en eukaryot celle, vil et polyadenyleringssignal og transkripsjonstermineringssekvens vanligvis være lokalisert 3' for den kodende sekvens.

Transkripsjons- og translasjons-kontrollsekvenser er DNA regulatoriske sekvenser, som for eksempel promotere, forsterkere, terminatorer, og lignende, som legger til rette for ekspresjon av en kodingssekvens i en vertscelle. I eukaryote celler er polyadenyleringssignaler kontrollsekvenser.

En "promotersekvens" er en DNA-regulatorisk region i stand til å binde RNA-polymerase i en celle og initiere transkripsjon av en nedstrøms (3'-retning) kodingssekvens. Med det formål å definere den foreliggende oppfinnelse er promotorsekvens bundet ved sin 3'-terminus ved transkripsjonsinitieringssetet og strekker seg oppstrøms (5'-retning) for å innbefatte det minste antall av baser eller elementer som er nødvendig for å initiere transkripsjon ved nivåer som er detekterbare over bakgrunnsnivåene. Innen promotorsekvensen vil det finnes et transkripsjonsinitieringssete (passende definert for eksempel, ved å kartlegge med nuklease Sl), så vel som proteinbindingsdomener (konsensussekvenser) som er ansvarlige for bindingen av RNA-polymerase.

En kodingssekvens er "under kontroll" av transkripsjons- og

translasjonskontrollsekvenser i en celle når RNA-polymerase transkriberer den kodende sekvens til mRNA, hvilket deretter kan trans-RNA spleises, når og hvor det er passende, og translateres til proteinet kodet for av den kodende sekvens.

En nukleinsyresekvens er "operativt tilknyttet" en ekspresjonskontrollsekvens når ekspresjonskontrollsekvensen kontroller eller regulerer transkripsjonen og translasjon av nukleinsyresekvensen. Benevnelsen operativt tilknyttet innbefatter å ha et passende startsignal.

En "heterolog nukleotidsekvens" som anvendt heri er en nukleotidsekvens som tilsettes ved rekombinante fremgangsmåter til en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelse, eller som koder for et fragment (det vil si et antigenisk fragment) derav, for å danne en nukleinsyre som ikke naturlig dannes i naturen. Slike nukleinsyrer kan kode for kimeriske proteiner. I tillegg behøver ikke, som anvendt heri, en heterolog nukleotidsekvens være en enkelt, sammenhengende nukleotidsekvens, men kan innbefatte multiple, ikke-sammenhengende nukleotidsekvenser som er kombinert med en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelse, eller en del derav. En heterolog nukleotidsekvens kan omfatte ikke-kodende sekvenser inklusive restriksjonsseter, regulatoriske seter, promotere og lignende. I nok en utførelsesform kan det heterologe nukleotid virke som et middel for å påvise en nukleotidsekvens i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Den foreliggende oppfinnelse bringer tilveie heterologe nukleotidsekvenser som når kombinert med nukleotidsekvenser som koder for et polypeptid i henhold til oppfinnelsen, eller et fragment derav, er nødvendige og tilstrekkelige for å kode for alle de kimeriske proteiner i henhold til den foreliggende oppfinnelse. I en spesiell utførelsesform er polypeptidet<ft>p45-proteinet.

Som anvendt heri er en bakterie (eller bakterin) sagt å være "rekombinant" når det med hensikt er manipulert for å omfatte en eller flere nukleinsyrer som ikke naturlig finnes i denne bakterien (eller bakterinet).

Frasen "binding til" med hensyn til en ligands binding til et polypeptid (for eksempel, antistoff-antigenkompleks) er anvendt heri for å innbefatte hvilke som helst eller alle slike spesifikke vekselvirkninger som fører til et protein-ligand bindingskompleks. Dette kan innbefatte prosesser som foreksempel kovalent, ionisk (elektrostatisk og/eller ladet), hydrofob og hydrogenbinding, men innbefatter ikke uspesifikke assosieringer så som preferanse for løsningsmiddel.

Som anvendt heri er et "lite organisk molekyl" en organisk forbindelse [eller organisk forbindelse kompleksert med en uorganisk forbindelse (for eksempel, metall) som har en molekylvekt mindre enn 3 kDa.

Som anvendt heri anvendes benevnelsene "omtrentlig" og "omtrent" for å uttrykke at en verdi er innen tyve prosent av den indikerte verdi, det vil si en aminosyresekvens som omfatter "omtrent" 400 aminosyrerester kan omfatte mellom 320 og 480 aminosyrerester.

Som anvendt heri betegner enheten "°dager" antallet dagers innkubering etterfølgende vaksinasjon av en fisk, multiplisert med middeltemperaturen i °C for innkuberingen.

Nukleinsyrer som koder for polypeptidene i henhold til den foreliggende oppfinnelse

En nukleinsyre, som for eksempel et cDNA, som koder for et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelse, kan anvendes for å frembringe rekombinante, bakterievertsceller som uttrykker et protein, og/eller antigen i henhold til den foreliggende oppfinnelse, for eksempel,<ft>p45-proteinet. Slike rekombinante vertsceller kan være inaktiverte, det vil si omformet til bakteriner, og anvendes i immunogene sammensetninger som for eksempel vaksiner.

I tillegg legger det å oppnå og/eller konstruere et DNA som koder for et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelse, inklusive de som koder for<ft>p45-proteinet i henhold til den foreliggende oppfinnelse, eller et antigenisk fragment derav, til rette for produksjon av større kvantiteter av protein, eller fragmenter derav. De større kvantiteter fremstilt av ''^S-proteinet, og/eller antigene fragmenter derav, er nyttige for å lage enkelte vaksiner i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

Som det følger av dette bringer den foreliggende oppfinnelse tilveie spesifikke nukleinsyrekonstrukter som tillater ekspresjon og isolering av større kvantiteter av proteinene, og/eller antigenene, i henhold til den foreliggende oppfinnelse, som for eksempel ^45-protein et. Disse nukleinsyrer kan videre inneholde heterologe nukleotidsekvenser. For å uttrykke et rekombinant protein i henhold til den foreliggende oppfinnelse i en vertscelle kan en ekspresjonsvektor konstrueres hvilket omfatter det korresponderende cDNA. Den foreliggende oppfinnelse bringer derfor tilveie ekspresjonsvektorer inneholdende nukleinsyrer som koder for proteinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse, inklusive varianter derav.

På grunn av degenerasjonen av nukleotidkodingssekvenser kan andre DNA-sekvenser som koder for hovedsakelig den samme aminosyresekvens som en nukleinsyre som koder for et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelse brukes i praktiseringen i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, alleliske gener, homologe gener fra andre arter, og/eller som er endret ved substitusjon av ulike kodoner som koder for den samme aminosyrerest innen sekvensen, og således produsere en stum endring. Vertsceller som omfatter ekspresjonsvektorene i henhold til den foreliggende oppfinnelse bringes også tilveie. En vanlig benyttet vertscelle er en E. coli- ceWe.

Generelle fremgangsmåter for kloning av cDNAer og ekspresjon av deres samsvarende rekombinante proteiner er beskrevet [se Sambrook og Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L. I. (2000)]. Den spesielle fremgangsmåte anvendt heri er beskrevet i eksemplene nedenfor. Fortrinnsvis bekreftes sekvensen av alle nukleinsyrekonstrukter i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

I tillegg kan hvilken som helst teknikk for mutagenese, kjent innen faget, anvendes for å modifisere det native ^45-protein et i henhold til den foreliggende oppfinnelse, inklusive, in vitro setedirigert mutagenese [Hutchinson et al., J. Biol. Chem., 253:6551 (1978); Zoller og Smith, DNA, 3:479-488 (1984); Oliphant et al., Gene, 44:177 (1986); Hutchinson et al., Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A., 83:710

(1986); Wang og Malcolm, Biotechniques 26:680682 (1999) ]. Anvendelse av TAB@-linkere (Pharmacia), osv. og PCR-teknikker kan også benyttes for setedirigert mutagenese [se Higuchi, "Using PCR to Engineer DNA", i PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Kapittel 6, pp. 61-70 (1989)]

Den foreliggende oppfinnelse bringer også tilveie nukleinsyrer som hybridisere til nukleinsyrer som omfatter nukleotidsekvensene i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Et nukleinsyremolekyl er "hybridiserbart" til et annet nukleinsyremolekyl, som for eksempel et cDNA, genomisk DNA, eller RNA, når en enkelttrådet form av nukleinsyremolekylet bindes med det andre nukleinsyremolekyl under passende temperaturbetingelser og ionestyrke i løsningen [se Sambrook og Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L.I. (2000)].

Temperaturbetingelser og ionestyrker bestemmer "stringensen" av hybridiseringen. For innledende screening for homologe nukleinsyrer kan hybridiseringsbetingelser av lav stringens, korresponderende til en Tm lik 55 °C anvendes, for eksempel, 5X saline natriumcitrat (SSC), 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS), 0,25 % melk, og ingen formamid, eller 30 % formamid, 5XSSC, 0,5 % SDS. Hybridiseringsbetingelser av moderat stringens korresponderer med en høyere Tm, for eksempel, 40 % formamid, med 5X eller 6XSSC. Hybridiseringsbetingelser av høy stringens korresponderer med den høyeste Tm, for eksempel, 50 % formamid, 5X eller 6XSSC. Hybridisering fordrer at de to nukleinsyrene inneholder komplementære sekvenser, selv om, avhengig av stringensen av hybridiseringen, feilpasninger mellom baser er mulig. Den passende stringens for hybridisering av nukleinsyrer er avhenging av nukleinsyrenes lengde og graden av komplementaritet, variabler som er velkjent innen faget. Dess større graden av likhet eller homologi mellom to nukleotidsekvenser er, dess større er verdien av Tm for hybrider av nukleinsyrer som har disse sekvenser. Den relative stabilitet

(korresponderende til høyere Tm) av nukleinsyrehybridiseringer synker i følgende rekkefølge: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. For hybrider som er lengre enn 100 nukleotider er ligninger for å beregne Tm-styrke utledet [se Sambrook og Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L.I. (2000)]. For hybridisering med kortere nukleinsyrer, det vil si oligonukleotider, blir posisjonen av feilpasninger Mer viktig, og oligonukleotidets lengde bestemmer dets spesifisitet.

Fortrinnsvis er minstelengde for en hybridiserbar nukleinsyre i det minste omtrent 12 nukleotider; mer fortrinnsvis i det minste omtrent 18 nukleotider; enda mer fortrinnsvis er lengden i det minste omtrent 24 nukleotider; og mest foretrukket i det minste omtrent 36 nukleotider. I en spesifikk utførelsesform refererer benevnelsen "standard hybridiseringsbetingelser" til en Tm lik 55 °C, og benytter betingelser som fremstilt ovenfor. Under mer stringente betingelser er Tm 60 °C, og under enda mer stringente betingelser er Tm 65 °C for henholdsvis både hybridiserings- og vaskebetingelsene.

Polypeptider i henhold til den foreliggende oppfinnelse

Den foreliggende oppfinnelse bringer tilveie isolerte og/eller rekombinante Piscirickettsia salmonis polypeptider, inklusive alle antigenene i henhold til den foreliggende oppfinnelse, ^45-proteinet (pluss eller minus det amino-terminale signalpeptidet), Piscirickettsia salmonis- stamme varianter derav, antigene fragmenter derav, og kimeriske proteiner derav. I tillegg bringes også polypeptider inneholdende endrede sekvenser i hvilket funksjonelt like aminosyrerester er substituert for de i villtype-aminosyresekvensen, hvilket fører til en konservativ aminosyresubstitusjon, tilveie av den foreliggende oppfinnelse.

For eksempel kan en eller flere av aminosyrerestene i sekvensen være substituert med en annen aminosyre med lignende polaritet, hvilket virker som en funksjonell ekvivalent, hvilket fører til en stum endring. Substitutter for en aminosyre innen sekvensen kan velges fra andre medlemmer av samme klasse som aminosyren tilhører.

For eksempel innbefatter de ikke-polare aminosyrer alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. De polare, nøytrale aminosyrer innbefatter glysin, serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin, og glutamin. De positivt ladede (basiske) aminosyrer innbefatter arginin og lysin. De negativt ladede (syre) aminosyrer innbefatter asparginsyre og glutaminsyre.

Spesielt foretrukne konservative aminosyreerstatninger er:

(a) Lys for Arg, eller omvendt, slik at en positiv ladning kan bibeholdes; (b) Glu for Asp, eller omvendt, slik at en negativ ladning kan bibeholdes; (c) Ser for Thr, eller omvendt, slik at en fri -OH kan bibeholdes; (d) Gin for Asn, eller omvendt, slik at en fri NH2 kan bibeholdes; og (e) Ile for Leu eller for Val, eller omvendt, som omtrentlig ekvivalente hydrofobe aminosyrer.

Alle polypeptidene i henhold til den foreliggende oppfinnelse, inklusive antigeniske fragmenter, kan også være del av et kimerisk protein. I en spesifikk utførelsesform uttrykkes et kimerisk polypeptid i en prokaryot celle. Et slikt kimerisk protein kan være et fusjonsprotein anvendt for å isolere et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelse, gjennom anvendelse av en affinitetskolonne som er spesifikk for et protein fusjonert med ''^S-proteinet, for eksempel. Eksempler på slike fusjonsproteiner innbefatter: et glutathion-S-transferase (GST) fusjonsprotein, et maltose-bindende protein (MBP) fusjonsprotein, et FLAG-merket fusjonsprotein, eller et poly-histidin-merket fusjonsprotein. Spesifikke lenkersekvenser som for eksempel en Ser-Gly-lenker kan også være del av et slikt fusjonsprotein.

Faktisk kan ekspresjon av et kimerisk polypeptid, som for eksempel<ft>p45-proteinet, eller fragmentet derav, som et fusjonsprotein, legge til rette for stabil ekspresjon, og/eller tillate rensing basert på fusjonspartnerens egenskaper. Således kan rensing av de rekombinante polypeptider i henhold til den foreliggende oppfinnelse forenkles gjennom anvendelsen av fusjonsproteiner som har affinitetsmerkelapper. For eksempel binder GST glutathion konjugert til et fast bærermateriale, MBP binder en maltosematriks, og poly-histidin kjelaterer til en Ni-kjelateringstøttesmatriks [se Hochuli et al., Biotechnology 6:1321-1325 (1998)].

Fusjonsproteinet kan elueres fra den spesifikke matriks med passende buffere, eller ved behandling med en protease som er spesifikk for et spaltningssete som er genteknologisk satt inn mellom ''^S-proteinet, for eksempel, og dets fusjonspartner. Alternativt kan et<ft>p45-protein kombineres med et markørprotein som for eksempel grønt fluorescerende protein [Waldo et al., Nature Biotech. 17:691-695 (1999); U.S. Patent Nr. 5,625,048 og WO 97126333, hvilket innholdet av herved er inkorporert ved referanse i sin helhet].

Alternativt, eller i tillegg, kan andre kolonnekromatografitrinn (foreksempel, gelfiltrering, ionebytting, affinitetskromatografi osv.) anvendes for å rense de rekombinante polypeptider i henhold til den foreliggende oppfinnelse (se nedenfor). I mange tilfeller benytter slike kolonnekromatografitrinn høyprestasjons væskekromatografi eller analoge fremgangsmåter i stedet for de mer klassiske tyngdekraftsbaserte metoder.

I tillegg kan ftp45-protein et, og antigene fragmenter derav, syntetiseres kjemisk [se for eksempel, Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H.Freeman & Co., New York, N.Y., pp. 382, Grant, ed. (1992)].

Generelle fremgangsmåter for rensing av polypeptider:

Generelt kan innledende trinn for å rense et polypeptid i henhold til den foreliggende oppfinnelse, innbefatte innsalting eller utsalting, i ammoniumsulfatfraksjoneringer; løsningsmiddeleksklusjonsfraksjoneringer, for eksempel, etanolutfelling; detergentekstraksjoner for å frigjøre membranbundne polypeptider, som for eksempel<ft>p45-proteinet, ved anvendelse av detergenter slik som TRITON X- 100, TWEEN-20 osv.; eller høysaltekstraksjoner. Oppløsning av membranproteiner, kan også oppnås ved anvendelse av passende løsningsmidler som for eksempel dimetylsulfoksid og heksametylfosforamid. I tillegg kan høyhastighets ultrasentrifugering brukes enten alene eller i forbindelse med andre ekstra ksjonsteknikker.

Generelt innbefatter gode sekundære isolasjonstrinn eller rensetrinn fastfaseabsorpsjon ved anvendelse av kalsiumfosfatgel, hydroksyapatitt, eller fastfasebinding. Fastfasebinding kan utføres gjennom ionebinding, med enten en anionebytter, som for eksempel dietylaminoetyl (DEAE), eller dietyl [2-hydroksypropyll aminoetyl (QAE) SEPHADEX eller cellulose; eller en kationebytter som for eksempel karboksymetyl (CM) eller sulfopropyl (SP) SEPHADEX eller cellulose. Alternative midler for fastfasebinding innbefatter utnyttelse av hydrofobe vekselvirkninger for eksempel, anvendelse av et fast bærermateriale som for eksempel fenyl-Sepharose og en høysaltbuffer; affinitetsbinding, immunobinding, ved anvendelse av, for eksempel, et ''^S-protein-antistoff bundet til et aktivert bærermateriale. Andre fastfase bærermaterialer innbefatter de som inneholder spesifikke fargestoffer eller lektiner osv.

En videre fastfaseteknikk som ofte anvendes ved slutten av rensingsprosedyren er basert på størrelseseksklusjon, som foreksempel SEPHADEX- og SEPHAROSE-geler. Alternativt kan en trykk- eller sentrifugeringsmembranteknikk, som benytter størrelseseksklusjons membranfiltere benyttes. Ofte anvendes disse fremgangsmåter etter hverandre.

Fastfaseseparasjoner utføres generelt satsvis med lavhastighetssentrifugering, eller ved kolonnekromatografi. Høyprestasjons væske krom atog raf i (HPLC), inklusive slike relaterte teknikker som FPLC, er for tiden de mest vanlige metoder for utførelse av væskekromatografi. Størrelseseksklusjonsteknikker kan også oppnås ved hjelp av lavhastighetssentrifugering. I tillegg kan størrelsespermeasjonsteknikker, som for eksempel gelelektroforeseteknikker benyttes. Disse teknikker utføres generelt i rør, slabber eller ved kapillærelektroforese.

Nesten alle trinn som involverer polypeptidrensing benytter en bufret løsning. Hvis ikke spesifisert på annen måte, anvendes generelt konsentrasjonene 25 - 100 mM av buffersalter. Lavkonsentrasjonsbuffere innebærer generelt konsentrasjonene 5 - 25 mM. Høykonsentrasjonsbuffere innebærer generelt en konsentrasjon av buffringsmiddel mellom konsentrasjonene 0,1 - 2,0 M. Typiske buffere kan anskaffes fra de fleste biokjemiske kataloger og innbefatter de klassiske buffere som for eksempel Tris, pyrofosfat, monofosfat og difosfat og Good-bufferene som for eksempel Mes, Hepes, Mops, Tricine og Ches [Good et al., Biochemistry, 5:467

(1966); Good og Izawa, Met. Enzymol., 2413:53 (1972); og Fergunson og Good, Anal. Biochem., 104:300 (1980)].

Materialer for å utføre alle disse teknikker er tilgjengelig fra en rekke ulike kommersielle kilder som foreksempel Sigma Chemical Company i St. Louis, Missouri.

Antistoff mot polypeptidene i henhold til den foreliggende oppfinnelse

Polypeptidene i henhold til den foreliggende oppfinnelse, og de antigene fragmenter derav, som produsert ved en rekombinant kilde, eller gjennom kjemisk syntese, eller som isolert fra naturlige kilder; og varianter, derivater eller analoger derav, inklusive fusjonsproteiner, kan brukes som et immunogen for å frembringe antistoff. Slike antistoff innbefatter, polyklonale, monoklonale, kimeriske inklusive enkeltkjede, Fab-fragmenter, og et Fab-ekspresjonsbibliotek. Slike antistoff kan anvendes i diagnostiske kit eller som komponenter i vaksiner.

Spesifikke anti-<ft>p45-protein antistoff i henhold til oppfinnelsen kan, for eksempel, være kryssreaktive, det vil si, de kan gjenkjenne<ft>p45-protein eller et nært beslektet protein avledet fra en annen individuell kilde (for eksempel, en P/sc/nc/cetts/a-lignende bakterie). Polyklonale antistoff har større sannsynlighet for kryssreaktivitet. Alternativt kan et antistoff i henhold til oppfinnelsen være spesifikt for en enkelt form av et<ft>p45-protein, for eksempel, som for eksempel et spesifikt fragment av<ft>p45-proteinet som har aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.:2, eller nært beslektede varianter derav.

I et spesielt aspekt i henhold til den foreliggende oppfinnelse bringes sammensetninger og anvendelser av antistoff som er immunoreaktive med<ft>p45-proteinet tilveie. Slike antistoff binder spesifikt<ft>p45-proteinet, hvilket betyr at de binder via antigenbindende seter av antistoffet sammenlignet med ikke-spesifikke bindingsvekselvirkninger. Benevnelsene "antistoff" anvendes heri i deres bredeste mening, og innbefatter, intakte monoklonale og polyklonale antistoff så vel som fragmenter som for eksempel Fv, Fab, og F(ab') fragmenter, enkeltkjedete antistoff som for eksempel scFv, og ulike kjedekombinasjoner. Antistoffene kan fremstilles ved anvendelse av en rekke forskjellige velkjente fremgangsmåter inklusive, immunisering av dyr som har native eller transgene immun repertoarer, fagoppvisning, hybridom og rekombinant cellekultur.

Både polyklonale og monoklonale antistoff kan fremstilles ved konvensjonelle teknikker. [Se, foreksempel, Monoclonal antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York 37

(1980); og Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)].

Ulike fremgangsmåter kjent innen faget kan brukes for produksjon av polyklonale antistoff mot<ft>p45-proteinet, varianter eller derivater eller analoger derav. For produksjon av et antistoff kan ulike vertsdyr immuniseres ved injisering med ^45-proteinet, varianten eller et derivat (for eksempel, eller fusjonsprotein) derav, eller fragment derav, inklusive, kaniner, mus, rotter, sauer, geiter, osv. I en utførelsesform kan<ft>p45-proteinet konjugeres til et immunogent bærermateriale, for eksempel, bovint serum albumin (BSA) eller "keyhole limpet hemocyanin"??

(KLH). Ulike adjuvanter kan brukes til å øke den immunologiske respons, avhengig

av vertsorganismeartene, inklusive, Freunds (komplett og ukomplett), mineralgeler som for eksempel aluminumhydroksid, overflateaktive substanser som for eksempel lysolecitin, pluroniske polyoler, polyanioner, peptider, oljeemulsjoner, "keyhole limpet hemocyanins??", og dinitrofenol.

For fremstilling av monoklonale antistoff rettet mot<ft>p45-proteinet, varianten, eller analogen, eller derivatet derav, kan hvilken som helst teknikk som bringer tilveie for produksjon av antistoffmolekyler av kontinuerlige cellelinjer i kultur brukes. Disse inkluderer, hybridomteknikken opprinnelig utviklet av Kohler og Milstein [Nature, 256:495497 (1975)], så vel som triomateknikken, og human B-celle hybridomteknikken [Kozbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983); Cote et al., Proe. Nati. Acad Sei. U. SA, 80:2026-2030 (1983)].

De monoklonale antistoff i henhold til den foreliggende oppfinnelse innbefatter kimeriske antistoffversjoner av antistoff som opprinnelig produseres i mus eller andre ikke-humane dyr. Teknikker utviklet for produksjon av "kimeriske antistoff" ved å sammenføye genene fra et antistoffmolekyl fra mus spesifikt for et<ft>p45-protein, for eksempel, sammen med gener fra et fiskeantistoff med passende biologisk aktivitet (for eksempel, en laks) kan anvendes. Slike kimeriske antistoff er innen omfanget av denne oppfinnelse [se generelt, Morrison et al_, J Bacteriol, 159:870 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314:452-454 (1985)].

Hybridomcellelinjer som produserer monoklonale antistoff spesifikke for polypeptidene i henhold til den foreliggende oppfinnelse bringes også tilveie av den foreliggende oppfinnelse. Slike hybridomer kan produseres og identifiseres ved konvensjonelle teknikker.

En fremgangsmåte for å produsere en slik hybridomcellelinje omfatter å immunisere et dyr med et polypeptid, høste miltceller fra det immuniserte dyr, fusjonere miltcellene med en myelomcellelinje, og derved frembringe hybridomceller, og identifisere en hybridomcellelinje som produserer et monoklonalt antistoff som binder polypeptidet. De monoklonale antistoff produsert ved hybridomer kan gjenvinnes med konvensjonelle teknikker.

I henhold til oppfinnelsen kan teknikker beskrevet for produksjon av enkeltkjede antistoff [U.S. Patent Nr. 5,476,786, 5,132,405, og 4,946,778,] tilpasses for å produsere for eksempel,<ft>p45-protein - spesifikt enkeltkjede antistoff. En ytterligere utførelsesform i henhold til oppfinnelsen, benytter teknikkene beskrevet for konstruksjon av Fab-ekspresjonsbiblioteker [Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)1 for å tillate hurtig og lett identifikasjon av monoklonale Fab-fragmenter med den ønskede spesifisitet for et ^45-protein, en variant, derivater, eller analoger.

Antistoffragmenter som inneholder idiotypen av antistoffmolekylet, kan frembringes ved kjente teknikker. For eksempel innbefatter slike fragmenter, F(ab')2-fragmentet som kan produseres ved pepsin nedbrytning av antistoffmolekylet; Fab'-fragmentene som kan frembringes ved å redusere disulfidbroene av F(ab')2-fragmentet, og Fab-fragmentene som kan frembringes ved å behandle antistoffmolekylet med papain og et reduserende middel.

I produksjon av antistoff kan screening for det ønskede antistoff oppnås ved slike teknikker som radioimmunoassay, enzym-lenket immunosorbant assay (ELISA), "sandwich" immunoassayer, immunoradiometriske assayer, geldiffusjonspresipiteringsreaksjoner, immunodiffussjonsassayer, in situ immunoassayer (ved anvendelse av kolloidalt gull, enzym- eller radioisotopemarkører, for eksempel), Western blot, utfellingsreaksjoner, agglutineringsassayer (for eksempel, gelagglutineringsassayer, hemaglutineringsassayer), komplementfikseringsassayer,

immunofluorescensassayer, protein A-assayer, og immunoelektroforeseassayer.

I en utførelsesform påvises antistoffbinding ved å påvise en markør, for eksempel, en fluorescerende markør som for eksempel fluorescent isothiocyanat (FITC), på det primære antistoff. I en annen utførelsesform påvises det primære antistoff ved å påvise binding av et sekundært antistoff eller reagens til det primære antistoff. I en videre utførelsesform merkes det sekundære antistoff. Mange metoder er kjent innen faget for å påvise binding i en immunoassay og er innen omfanget av den foreliggende oppfinnelse. For eksempel for å velge antistoff som gjenkjenner en spesifikk epitop av ftp45-protein et, kan man analysere frembrakte hybridomer for et produkt som binder til<ft>p45-proteinfragmentet inneholdende en slik epitop og velge de som ikke kryss-reagerer med modifiserte ''^S-proteiner som ikke inneholder denne epitopen. For utvelgelse av et antistoff spesifikt for et ^45-protein fra en spesiell kilde, kan man velge på basis av positiv binding med ^45-protein uttrykt av eller isolert fra den spesifikke kilde.

SRS- vaksiner

Den foreliggende oppfinnelse bringer tilveie SRS-vaksiner. En spesiell utførelsesform er en ikke-mineralsk oljeinjiserings primevaksine som omfatter et eller flere antigener fra Piscirickettsia salmonis, som brakt for dagen nedenfor. I en foretrukket utførelsesform av denne type omfatter inaktiverte rekombinante bakterier (bakteriner) Piscirickettsia sa/mon/s-antigenene.

Den foreliggende oppfinnelse bringer også tilveie SRS-vaksiner som også er designet for å beskytte mot en eller flere andre fiskepatogener. For eksempel er furunkulose en infeksiøs ulcerativ laksesykdom og ørretsykdom forårsaket av bakterien Aeromonas salmonicida.

Andre fiskepatogener innbefatter:

Vaksinene for disse ulike sykdommene kan fremstilles fra hele celler, bakteriner, drepte og/eller attenuerte virus, proteinekstrakter, rekombinante DNA vaksinevektorer, isolerte antigener, rekombinante antigener og blandinger derav. Under spesielle forhold, som for Photobacterium damsela og Aeromonas salmonicida, fremstilles vaksinene fortrinnsvis fra to separate kulturer dyrket under henholdsvis jern-begrensede betingelser og jern-supplementerte betingelser.

I en spesiell utførelsesform omfatter en vaksine et eller flere antigener fra Piscirickettsia salmonis sammen med et eller flere IPN-proteiner. I nok en utførelsesform omfatter vaksinen et eller flere antigener fra Piscirickettsia salmonis, et eller flere IPN-proteiner, og et eller flere antigener for å kontrollere Aeromonas salmonicida. I en spesiell utførelsesform av denne type er Aeromonas salmonicida-antigener to typer av hele bakterier dyrket på bakterielle vekstmedier og drept ved tilsetning av formalin.

For en SRS-vaksine ble Yersinia ruckeri valgt som den beste kandidat, for å være vert for antigenene i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Et spesielt Chilensk feltisolat, en type 1 Yersinia ruckeri- stamme, ble anvendt i eksemplene nedenfor. Bedre utbytter forventes med Yersinia ruckeri dyrket ved 20-25 °C.

To IPN virale antigener eksemplifiseres nedenfor (se også WO 02138770,). En av disse avledes fra Vp2, hvilket er hoved ytre kapsidprotein og den andre fra Vp3, hvilket er et internt protein av IPN-viruset. Molekylvekten av Vp2-proteinet er 52 kDa mens molekylvekten av Vp3-proteinet er 30 kDa. IPN-proteinene av vaksinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis rensede rekombinante proteiner. I eksemplene nedenfor uttrykkes og utskilles IPN-proteinene av transformert gjær ( Pichia pastoris) og renses deretter fra gjærcellene.

Antigener for en vaksine som også beskytter mot furunkulose, kan oppnås fra hele formalindrepte bakterier Aeromonas salmonicida. Tidlige A. Salmonicida- vaks\ ner inneholder hele A. Salmonicida-baktener dyrket i normalt vekstmedie og deretter inaktivert ved tilsetning av formalin. Disse bakteriner inneholder en blanding av antigener inklusive overflate A-lag, inaktiverte proteaser og lipopolysakkarid. Pa den annen side uttrykkes en gruppe nye antigener når A salmonicida dyrkes i normalt medie i fullstendig fravær av jern. Disse nye antigener benevnes jern-regulerte ytre membranproteiner (IROMP). IROMP er høyst immunogene og de bringer tilveie forsterket beskyttelse i forhold til vaksiner som inneholder inaktivert A. salmonicida dyrket i normalt medie. Fire IROMP-proteiner som har molekylvekter lik henholdsvis 82 kDa, 77 kDa, 72 kDa og 170 kDa, er identifisert.

Den primære og sekundære antistoff respons overfor IROMP-antigener i Atlantisk laks ( Salmo salar) immunisert med A+ ( Jern pluss) og A- ( jern minus) Aeromonas salmonicida bakteriner er rapportert [0'Dowd et al., Fish & Shellfish Immunology 9:125-138 (1999)]. Således inneholder spesielle vaksiner i henhold til den foreliggende oppfinnelse, en stamme av A salmonicida (MT004) dyrket ved jernbegrensede betingelser og en stamme av A salmonicida (MT423) dyrket under jernsupplerte betingelser.

Vibrio anguillarum (serotype 01) og V. anguillarum (serotype 02) er ulike serotyper som ikke er kryss-beskyttende og derfor er fortrinnsvis begge antigener inkludert i vaksinen for bredspektret beskyttelse.

Administrering:

Vaksinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan administreres til fisk ved hvilken som helst av en rekke metoder inklusive ved injisering (for eksempel, intramuskulært, eller intraperitonalt), immersjon, og/eller gjennom et avleveringssystem for oral vaksinering. Vaksinering av fisk ved injisering kan utføres enten med en adjuvant til å øke aktiviteten av antigenene, eller uten en adjuvant. Adjuvanter innbefatter vandige adjuvanter, som for eksempel Alhydrogel eller aluminumhydroksid, og oljeadjuvanter.

Mineraloljeadjuvanter er vanlig benyttet i fiskevaksiner og er inkludert i den foreliggende oppfinnelse. En slik adjuvant er mannidoleat i en mineraloljeløsning. I en spesiell utførelsesform av denne type omfatter vaksinen 70 % mannidoleat i en mineraloljeløsning. En annen mineraloljeadjuvant i henhold til den foreliggende oppfinnelse, omfatter hvitmineralolje, Span 80 [sorbitanmonooleat], og Tween 80 [polyoksyetylensorbitan monooleat]. I en spesiell utførelsesform omfatteren vaksine 80 % av en adjuvant som har den følgende formulering: 944 ml hvit mineralolje: 50,3 ml Span 80: 5,7 ml Tween 80.

Siden mineraloljeadjuvanter generelt forårsaker skade på fisken ved injeksjonssetet (lesjoner som må fjernes før salg), og senker veksthastigheten for en tid, bringer den foreliggende oppfinnelse også tilveie ikke-mineralske oljeadjuvanter. Syntetiske ikke-mineralske olje adjuvanter innbefatter de som er kommersielt tilgjengelig fra Seppic SA. Montanide, foreksempel, Montanide ISA563, Montanide ISA 575, og Montanide ISA 711. Montanide ISA 711, eksemplifisert nedenfor, er i all vesentlighet mannidoleat i en oljeløsning. Spesielle utførelsesformer av en vaksine i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter 50 % av enten Montanide ISA563 eller Montanide ISA 575, eller 70 % Montanide ISA 711.

Alternativt kan vaksiner appliseres ved et langtids immersjonsbad. I en slik utførelsesform forutgås vaksinering via et immersjonsbad av hyperosmotisk behandling [se Huising et al., Vaccine 21:4178-4193 (2003)]. I en annen utførelsesform administreres en vaksine ved å spraye fisken.

Den foreliggende oppfinnelse innbefatter også oralt avleverte vaksiner. Generelt fremstilles orale vaksiner ved å enten oversprøyte maten med et antigen (for eksempel, ved spraytørking) eller ved å inkorporere antigenet i maten [se, for eksempel, Vinitnantharat et al., Adv. Vet. Med. 41:539-550 (1999)]. Andre teknikker innbefatter vann-i-olje metoder, bioenkapsulering, mikroenkapsulering, inkorporering i liposomer, inkorporering i hule forpiller priller, og inkorporering i mikropartikkelbærere, for eksempel, polylaktid ko-glykolid bærerpartikler [se, for eksempel, Singh et al., Expert Opin. Biol. Ther. 4(4):483491 (2004)]. Nok en annen metode medfører å uttrykke antigenet i alger.

Boostervaksiner er også del av den foreliggende oppfinnelse. I en spesiell utførelsesform anvendes en oljet emulsjons oral boostervaksine som omfatter et eller flere antigener fra Piscirickettsia salmonis, etter den primære vaksinering. Fortrinnsvis lages oljeemulsjonen av vann:olje i området 6:4 til 4:15. Nivået av frie fettsyrer bør ikke være større enn 5 % (vektprosent) av oljen og fortrinnsvis ikke større enn 3 %. Spesielle oljer innbefatter hel fiskekropp olje og nøytral marin olje. Emulgatoren er fortrinnsvis av matgrad. Lecitin kan anvendes som en slik emulgator, for eksempel, soya lecitin.

Emulgatoren omfatter generelt fra omtrent 0,1 % til omtrent 5 % (vektprosent) av den totale emulsjon. I en spesiell utførelsesform av denne type er emulusjonens oljefasen 47 % v/v raffinert fiskekroppolje pluss 3 % v/v lecitin (Bolec MT) som blandes, steriliseres med gammastråling og deretter blandes ved anvendelse av en homogenisator. Den vandige antigenfase kan fortynnes med fosfatbuffret saline [se, GB 2 255 909, PCT/GB9101828, WO/92106599].

Injiseringsvaksinering utføres vanligvis i en kommersiell skala ved anvendelse av en fast dose, automatisk repeterende sprøyte eller en automatisk injiseringsmaskin. Disse fremgangsmåter er designet for å avlevere en fast dose som vanligvis er 0,1 eller 0,2 ml per fisk. Vaksinen injiseres gjennom kroppsveggen inn i den intraperitonale kavitet. Det er også mulig å immunisere fisk ved å injisere vaksinen inn i den dorsale sinus. Generelt vaksineres fisk ved injisering etterfølgende anestesi.

Immersjonsvaksinering kan utføres som følger: Fortynn 1 liter vaksine med 9 liter rent utklekningsvann. Deretter drener og vei en håv med fisk og dypp fiskene i den fortynnede vaksine i 30 til 60 sekunder mens man forsikrer at fiskene er fullstendig nedsenket i vaksinen. Etter 30 til 60 sekunder; løft nettet, drener og returner fiskene til holdetanken. Gjenta inntil 100kg fisk er dyppet i 10 liter fortynnet vaksine.

Oral vaksinering kan utføres som følger: En beholder med vaksine bringes til romtemperatur (20 °C) og rystes deretter foregående bruk. Vaksinen blandes med fiskeforet slik at vaksinen legger seg på overflaten av fiskeforet og adsorberes. Den totale vaksinedose bør fores i løpet av en 10 dagers periode ved 1/10 dose per fisk per dag.

REKOMBINANTE ENTERISKE BAKTERIEVAKSINER

I vaksiner ifølge den foreliggende oppfinnelse kan det benyttes rekombinante enteriske bakterier som ikke er tilstede i mennesker, for å uttrykke fremmede rekombinante bakterieoverflateantigener. Fram til nå har disse bakterieoverflateantigenene vært ekstremt vanskelig å uttrykke, særskilt i en vektor for anvendelse i en vaksine. Fortrinnsvis vedrører dette aspekt av oppfinnelsen rekombinante enteriske bakterier som koder for et fremmed overflateantigen fra en intracellulær fiskepatogen. Den enteriske bakterien er fortrinnsvis også en som infekterer fisk.

Som eksemplifisert heri kan Yersinia ruckeri, en ikke-human enterisk bakterie, anvendes som en rekombinant vektor. Eksempler på andre passende enteriske bakterier innbefatter Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Moritella viscosus og Photobacterium damsela. Fortrinnsvis er den rekombinante bakterien inaktivert (det vil si et bakterin).

Hvilket som helst overflateantigen fra en intracellulær patogen kan anvendes som det fremmede overflateantigen. IROMPS, diskutert nedenfor, er eksempler på passende overflateantigener. For eksempel kan en nukleinsyre som koder for et overflateantigen fra en enterisk fiskebakterie være satt inn i en annen enterisk fiskebakterie for å frembringe en slik rekombinant enterisk bakterie. I en spesiell utførelsesform anvendes en nukleinsyre som koder for et utskilt protein, som for eksempel en protease i stedet for en nukleinsyre som koder for et overflateantigen i den rekombinante enteriske bakterievektor.

Fremgangsmåter for å fremstille disse rekombinante enteriske bakterier, fremgangsmåter for inaktivering av disse, fremgangsmåter for fremstilling av vaksiner inneholdende disse rekombinante enteriske bakterier, og fremgangsmåter for å administrere vaksinene er de samme som brakt tilveie for de rekombinante Yersinia ruckeri vaksiner eksemplifisert heri. Passende vaksineringsresipienter bringes tilveie i avsnittet som følger nedenfor.

VAKSINERINGSRESIPIENTER

Salmonid rickettsiell septikemi (SRS) ble først observert i salmonider, hvilket er fisk i Salmonidae-familien, av ordenen Salmoniformes og av klassen Osteichthyes. Salmonider er elongerte benfisk med de siste vertebrater snudd opp, og som har en liten adipos finne uten finnestråler mellom den dorsale finne og halen. Mange arter av salmonider lever i havet, men går til ferskvann for å gyte. Salmonidae-familien innbefatter laks, ørret, char, og whitefisk (se Tabell 1 nedenfor, hvilket bringer tilveie en ikke-uttømmende liste av fisk i Salmonidae-familien).

Rapporter av (SRS) og nært beslektet Rickettsiell syndrom som virker på fisk så uensartede som tilapia, white sea bass, regnbueørret, steelhead trout, gruppeer, Chilean sea bass, tiger puffers, red sea bream, blue-eyed plecostomus, striped bass, fluke, atlantisk torsk, smørfisk, ocean pout, spotted hake, summer og Winter flounder, weakfisk, yellowtail flounder, Windowpane flounder ( Scophthalmus aquosus) cultured amberjack, three lined grunt, og blue eyed plecostomus indikerer at vaksinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan brukes til å vaksinere i vesentlighet hvilken som helst fisk. Fortrinnsvis er fisken i Teleosti grupperingen av fisk, det vil si teleoster. Både ordenen Salmoniformes (hvilket innbefatter Salmonidae-familien) og ordenen Perciformes (hvilket innbefatter Centrarchidae-familien) er innbefattet i Te/eostZ-grupperingen.

På siden av Sa/mon/dae-familien og de inkludert ovenfor innbefatter eksempler på potensielle vaksineringsresipienter SerrarTydae-familien, Spar/dae-familien, C/cMdae-familien, Cenfrarc/7/dae-familien, three-Line Grunt ( Parapristipoma thlineatum), og Blue-Eyed Plecostomus plecostomus spp). Den foreliggende oppfinnelse kan bedre forstås med referanse til de følgende ikke-begrensende eksempler, hvilke bringes tilveie som eksemplariske i henhold til oppfinnelsen. De følgende eksempler er presentert for mer fullstendig å kunne illustrere de foretrukne utførelsesformer i henhold til oppfinnelsen.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

IDENTIFISERING AV ANTIGENER I PISCIRICKETTSIA SALMONIS

Oppsummering

Høytiter ant\- Piscirickettsia salmonis (Ps) serum ble oppnådd fra kaniner for screening av ekspresjon av Ps antigener. Høymolekylvekts DNA ble ekstrahert fra Ps-celler for å klones i E. coli. Et cDNA-bibliotek ble konstruert i fag (HBEM-1 2 - PROMEGA) etterfølgende strategien detaljert nedenfor.

CDNA-biblioteket ble overført til plasmidvektorer for å tillate screening av bakteriekolonier ved anvendelse av kanin antiserum. Flere etterfølgende screeninger ble utført på mer enn 30 000 kolonier. To potensielle antigener ble identifisert med Western blot, en av hvilke er<ft>p45-proteinet.

DNA-innsettinger av klonene som produserer<ft>p45-proteinet ble analysert og den fullstendige nukleotidsekvens av klonen ble oppnådd [SEKV.ID.NR.: 1]. Den kodende sekvens av<ft>p45-proteinet ble reprodusert ved PCR og deretter introdusert inn i ekspresjonsvektoren pARHS2. Ekspresjon med høyt utbytte ble oppnådd i E. coli.

For å fremstille en effektiv vaksine ble en chilensk stamme av Yersinia ruckeri valgt som vertsorganisme. pARHS2-ekspresjonsvektoren viste seg å være lite effektiv i Yersinia ruckeri. Nukleinsyrekonstrukter ble deretter overført inn i en pSE380-ekspresjonsvektor ( for eksempel, fra Invitrogen Life Technologies). Produksjon av det rekombinante antigen ble ikke oppnådd i Yersinia ruckeri ved anvendelse av denne vektor. Et alternativt design ble derfor valg som ga en effektiv ekspresjon ''^S-proteinet i Yersinia ruckeri ved anvendelse av den opprinnelige kloningsvektor. Det samme design tillot også ekspresjon av andre Piscirickettsia salmonis antigener i Yersinia ruckeri.

Serum

Piscirickettsia salmonis- ceWer oppnådd fra Puerto Montt, Chile, ble inaktiver med omtrent 70 % etanol og/eller med omtrent 0,5 % formaldehyd. De inaktiverte cellene ble dialysert natten over mot bikarbonatbuffer og deretter frysetørket. Tre kaniner ble immunisert med fire månedlige subkutane injeksjoner av 300 ug av de frysetørkete celler i løpet av fire måneder, med hver kanin mottakende totalt fire injeksjoner. Det resulterende kanin antiserum identifiserte en rekke Ps antigener via Western blot.<ft>p45-proteinet ble identifisert på denne måten. Et rekombinant ''^S-protein ble deretter produsert i E. coli og anvendt for å immunisere mus.

Kanin antiserumet gjenkjente også dette rekombinante Ps-antigen.

Kloner og Sekvensering

Ekspresjonsbibliotek: Et ekspresjonsbibliotek inneholdende Ps-cDNAer ble konstruert ved anvendelse av fag [AGEM-12-PROMEGA]. Basert på antallet av kloner og størrelsen av innsettinger syntes det å være et høykvalitets fagbibliotek. Dog kunne ikke screening av fagbiblioteket direkte identifisere noen positive kloner. Utbyttet av rekombinante antigener kan ha vært for lavt under faginfeksjonen til å tillate påvisning. Fagbibliotekets Ps-nukleinsyrer ble derfor overført til plasmidvektorer. Dog viste screening av det resulterende plasmidbibliotek seg å være vanskelig, på grunn av en høy bakgrunn. Serumadsorpsjon på E. Coli-antigener reduserte bakgrunnen mye og tillot hurtig identifisering av to antigener. ''^S-proteinet var et av de to antigenene identifisert. Påfølgende screeninger av de omtrent 30 000 kloner mislyktes i å identifisere ytterligere antigener.

Sekvensering: Plasmidet som uttrykte<ft>p45-proteinet inneholder 17 000 basepar. Et restriksjonskart av plasmidet ble forberedt og pertinente restriksjonsfragmenter ble underklonet. Etter flere manipuleringsrunder ble en nukleinsyre som omfatter 2096 basepar isolert som fortsatt var i stand til å uttrykke<ft>p45-proteinet. Nukleotidsekvensen av nukleinsyren ble deretter bestemt (SEKV.ID.NR.: 19) og bringes tilveie nedenfor. Den korresponderende aminosyresekvens forutsier et utskilt protein av 438 aminosyrer med et 22-resters signalpeptid (understreket - kursiv i sekvensen nedenfor). Den forutsagte molekylvekt av det modne protein etter utskillelse og spaltning av signalpeptidet er 44021 dalton.

PSORT-algoritmen ble applisert til aminosyresekvensen for å forutsi proteinets lokalisering [Nakai og Kanehisa, PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 11: 95-110 (1991)]. Denne algoritmen ga den høyeste verdi (0,944) for en ytre membranlokalisering og en mindre verdi (0,376) foren periplasmisk lokalisering. Lokalisering i cytoplasma og indre membran ble rutelukket med verdier lik 0,000. Yttermembranproteiner er potensielle mål for nøytraliserende antistoff. Ingen homologi med andre proteiner sekvensert til dags dato kunne finnes.

Ekspresjon

Ekspresjon av Psp45- proteinantiqenet i E . Coli: To konstrukter ble laget for ekspresjon av det rekombinante<ft>p45-proteinet. Ekspresjonssystemet valgt er standard T7-BL21 systemet [kommersielt tilgjengelig fra Gene Therapy System Inc.]. Systemet er basert på en to trinns amplifisering av indusering av produksjon. Det første trinn er syntese av den svært effektive T7-fag RNA polymerase ved indusering med IPTG av en lac-promoter. Denne polymerase binder en spesifikk T7-sekvens og transkriberer RNA aktivt. Det andre trinn er basert på plassering av denne T7-sekvens akkurat oppstrøms for genet av interesse på høykopiplasmidet pARHS.

To konstrukter ble fremstilt. Konstrukt A inneholdt den fullstendige kodingssekvensen for ^45-protein et (som har nukleotidsekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 1). Proteinet uttrykt kan utskilles eller uttrykkes på overflaten av E. Co//'-vertscellen. Konstrukt B koder for et ^45-protein (som har nukleotidsekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 3) som kun mangler den kodende region for signalpeptidet. Uten signalpeptidet kan ikke<ft>p45-proteinet utskilles. Ekspresjon av ''^S-proteinet (som har aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 4) kan forventes å føre til et høyere protein utbytte og en mindre celletoksisitet enn ekspresjon av full-lengde<ft>p45-protein (som har aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2).

Begge konstrukter ble dyrket i en liten skala (100 ml). Ekspresjon av<ft>p45-proteinet ble designet til å fordre IPTG-indusering. Dog ble høye nivåer av indusering av det rekombinante<ft>p45-proteinet funnet i både forkulturen og den ikke-induserte kultur. Denne typen av resultat er ikke uvanlig når kaskade T7-promoteren anvendes. Tilsynelatende blir<ft>p45-proteinet med letthet produsert i E. coli, hvilket, dessverre, er høyst detrimentale for stabiliteten av stammen.

''^S-proteinet som mangler signalpeptidet, akkumulerte i bakterienes cytoplasma, i mengder omtrent 10 - 20 % av total protein (estimert fra Coomassie-blå farget SDS-PAGE). Full-lengde proteinet akkumulerte også, og en fraksjon ble vist å være eksportert i kulturmediet. Dette er et sannsynlig resultat siden E. coli ikke er en god utskiller. Enn videre ble stammen dyrket ved 37 °C, en temperatur som ikke nødvendigvis er optimal for et protein som stammer fra en psykro- eller mesofil organisme.

Ekspresjon av Psp45-proteinet i Chilenske stammer av Yersinia ruckeri (Yr):

Det T7-promoter baserte ekspresjonssystemet virker kun i E. Co//'-stammer som omfatter den lysogene fag DE3, som koder for T7-polymerase. Siden Yersinia ruckeri ikke koder for T7-polymerase, ble konstrukter som koder for full-lengde

''^S-proteinet og<ft>p45-proteinet som mangler signalpeptidet, overført inn i en ny vektor som har en promoter avledet fra laktose-operonet. Selv om Yersinia ruckeri er laktose negativ kan lac-promoteren induseres av laktose-analogen IPTG. Yersinia ruckeri stamme 224 serotype 1 ble valgt, hvilket mangler enhver antibiotikaresistens.

To ekspresjonsplasmider ble konstruert som ble avledet fra plasmid pSE380 oppnådd fra Invitrogen (USA). De karakteristiske egenskapene av plasmidet er de følgende: 1. ColEl-replikasjonsorigin for å vedlikeholde plasmidet i forskjellige Gram-negative verter. 2. Ampicillinresistens for utvelgelse av bakteriene som inneholder plasmidet. Dette antibiotikumet er generelt ikke anvendt innen akvakultur. 3. laclq er en superprodusent av lad, aktivatorproteinet av lac-promotere eller promotere som for eksempel Ptrc som anvender lacl-aktivatorbindingssekvensen. I nærvær av laktose eller dets stabile (ikke metaboliserte) analog iso-propyl-thiogalaktosid (IPTG) slår lad PtrC-promoteren på. 4. Ptrc-promoterer en syntetisk promoter som inneholder lacl-aktivatorbindingssekvens. 5. RBS, ribosom bindingssete optimert for E. coli, det er også aktivt i Yersinia ruckeri. 6. ATG er initiatorkodonet av det rekombinante protein, det er plassert ved optimal avstand fra RBS for effektiv translasjon av mRNAet til protein. ATG er inkludert i Ncol-restriksjonssetet. 7. Superlinkeren bringer tilveie et stort panel av restriksjonsseter for lett innsetting av rekombinante gener. 8. Term er en RNA transkripsjonsterminator, den forhindrer

transkripsjonskomplekset i å gå for langt i plasmidet og sette på spill stabiliteten av plasmidet.

En rekombinant nukleinsyre som koder for<ft>p45-proteinet ble fremstilt med PCR for å kunne introdusere et Nco I-sete på initiatorkodonet og et Barn HI-sete etter stoppsignalet. Den rekombinante nukleinsyren ble introdusert mellom Nco I og Barn HI-setet av superlinkeren. En andre rekombinant nukleinsyre som koder for<ft>p45-proteinet ble fremstilt med PCR, et Nco I-sete ble introdusert i den riktige leseramme etter det putative signalpeptidet. På lignende måte ble et Barn HI-sete tilsatt etter stoppsignalet. Den rekombinante nukleinsyre ble introdusert mellom Nco I og Barn HI-setet av superlinkeren. Begge plasmider ble introdusert inn i E. coli for amplifisering, ekstrahert og introdusert ved elektroporering inn i Yersinia ruckeri stamme 224. Ved dyrkning og induksjon kunne intet rekombinant ^45-protein påvises.

En alternativ strategi måtte utformes. Dessverre var lite kjent om Yersinia ruckeri resipientstammen. Siden den naturlige Ps-promoter var aktiv i E. coli, ble det besluttet å se på ekspresjon av opprinnelig plasmid i Yersinia ruckeri.

Yersinia ruckeri stamme 224 ble henholdsvis transformert med opprinnelig plasmid og forkortede plasmider #12 og #18. Som en kontroll ble Yersinia ruckeri stamme 224 også transformert med pSHVG55, et plasmid som uttrykker et Viral Haemorrhagisk Septikemi ( VHS) antigen og er bygd på et replikon som har en bredere område for verter enn Col El. Dette plasmid ble anvendt for å se hvorvidt Col El replikonbasert plasmid var adekvat for Yersinia ruckeri. På lignende måte ble en europeisk stamme av Yersinia ruckeri transformert med de samme plasmider.

Det ble funnet at en dobbel dose av ampicillin, sammenlignet med E. coli, var nødvendig for seleksjon. Col El-baserte promotere var stabile i Yersinia ruckeri. Yr

[#18] (BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044) uttrykte lett påvisbare mengder av ''^S-proteinet.

Denne stamme ble derfor valgt som en kandidatvaksine. Den produserte full-lengde ''^S-proteinet, siden ingen konstrukter som mangler signalpeptidet var tilgjengelig i de originale kloningsvektorer.

Ytterligere sju åpne leserammer ble identifisert i LMG P-22044. En av disse, det vil si et protein som omfatter SEKV.ID.NR.: 6, kodet for av SEKV.ID.NR.: 5, viser homologi med en proteinfamilie som koder for AMP-bindende enzymer. To andre åpne leserammer, det vil si et protein som omfatter SEKV.ID.NR.; 8, kodet for av SEKV.ID.NR.: 7, og et protein som omfatter SEKV.ID.NR.: 10, kodet for av SEKV.ID.NR.: 9, viser ingen homologi til noen proteinfamilie. Nok en annen åpen leseramme, det vil si, et protein som omfatter SEKV.ID.NR.: 12, kodet for av SEKV.ID.NR.: 11, viser homologi med DDE endonukleasefamilien og i særdeleshet integrase kjernedomenet. Nok en annen åpen leseramme, det vil si et protein som omfatter SEKV.ID.NR.: 14, kodet for av SEKV.ID.NR.: 13 viser homologi med transposaser. Nok en annen åpen leseramme, det vil si et protein som omfatter SEKV.ID.NR.: 16, kodet for av SEKV.ID.NR.: 15 viseren viss homologi med HlyD-familien av sekretoriske proteiner. Nok en annen åpen leseramme, det vil si et protein som omfatter SEKV.ID.NR.: 18, kodet for av SEKV.ID.NR.: 17 viser homologi med intergral membran AcrB/AcrD/AcrB-proteinfamilien.

Et alternativt antigen, fra den opprinnelige kloningsvektoren, klone #7, og en Yersinia ruckeri, Yr [#7] (BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511) ble valgt som andre vaksinekandidat.

Vaksineproduksjon: Hver vaksinestamme ble dyrket i en 25 ml konisk flaske med ampicillin inntil midtre vekstlogfase. Kulturen ble deretter gjort i 50 % glyserol, alikvoter ble lagt i 2 ml kryorør for å danne såkultur. For hver vaksine ble tre koniske 2 liters flasker inneholdende 333 ml av Trypton Soya buljong (TSB) pluss ampicillin inokulert med et rør av såkultur og dyrket i 36 timer med rysting ved 25 °C. Etter 36 timer ble kulturene inaktivert med formaldehyd ved 25 °C med omrøring. Prøver for kvalitetskontroll ble tatt før inaktivering siden det er kjent at formaldehyd forårsaker polymerisering av proteinene, og derfor kan ikke SDS-PAGE utføres på inaktiverte vaksiner. Etter 24 timers inaktivering ble formaldehyd nøytralisert med natrium bisulfitt og sterilitetstesten ble utført. Vaksinen ble oppdelt i to en-liters flasker, hver inneholdende 500 ml vaksine. Vaksinen ble frigitt etter fullstendiggjøring Av sterilitetstesten.

Kontroll: som en kontroll ble en formaldehydinaktivert Yersinia ruckeri stamme 224 dyrket. Kontrollkulturen hadde en optisk tetthet ved 600 nm (0D600nm) lik 6,0 ved tidspunktet for høsting, korresponderende til omtrent 6 x IO<9>celler/ml.

BCCM aksesjonsnummer LMG P- 22044: (Yr[#18], som uttrykker<ft>p45-proteinet). BCCM aksesjonsnummeret LMG P-22044-kulturen hadde en OD6oonm lik 5,8 ved høstingstidspunktet, korresponderende til omtrent 5,8 x IO<9>celler/ml. Ekspresjon av<ft>p45-proteinet ble undersøkt i supernatanten og cellene. Det rekombinante ''^S-proteinet ble effektivt utskilt i kulturmediet, og det var også tilstede i en celleassosiert form.

BCCM aksesjonsnummer LMG P- 22511: (Yr[#7]). BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511-kulturen hadde en OD60o nm lik 5,1 ved høstingstidspunktet, korresponderende til omtrent 5,1 x IO<9>celler/ml. Ekspresjon av potensielle antigene proteiner fra denne rekombinante Yersinia ruckeri stamme ble undersøkt i supernatanten og cellene.

EKSEMPEL 2

STORSKALA PRODUKSJON AV YERSINIA RUCKERI

( 45 LITERS KULTUR)

Bakteriestammer: De rekombinante stammer av Yersinia ruckeri uttrykker konstutivt antigener fra Piscirickettsia salmonis. Vektoren er pGEM5ZF+ og promotoren er den naturlige promoter for det respektive antigen fra Piscirickettsia salmonis. • Yersinia ruckeri (Yr[#18] BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044 (uttrykker<ft>p45-proteinet).

• Yersinia ruckeri (Yr[#7]) BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511.

Såkultur: 50-100 ul av stock av bakteriestammene ovenfor ("glyserol" stock) ble anvendt for å inokulere 500 ml avYES-medium (se nedenfor) og 100 mg/l ampicillin i en 2 liter rysteflaske. Kulturene ble inkubert ved: 20 - 25 °C med en omrøring lik 270 rpm i 21 timer (+/- 2 timer) og dyrket for å ha en endelig OD(600nm) mellom 1,5 - 3,0.

Fermentering: En såkultur (se ovenfor) ble anvendt for å inokulere 45 liter YES-medium i en 50-liters sterilisert fermentor for å oppnå en initiell optisk tetthet ved 600nm lik 0,002.

Kulturbetingelser

• pH = 7 (10 % HN03og 4M NaOH)

• Temperatur = 20 °C

• Luftgjennomstrømningshastighet = 45 l/min

• Løst oksygen = 30 % med virkning på omrørerhastigheten

• Omrøring = 150 rpm og mer hvis nødvendig

• Trykk = 3 psig

Slutten av den eksponentielle veksten forekommer etter omtrent 24 timer. Etter 2 timer av enden av den eksponentielle vekstfasen, slås pH-reguleringen av og formaldehyd (37 %) tilsettes til fermentoren ved en konsentrasjon lik 5 ml per liter kultur for å drepe cellene. Kulturen homogeniseres (5 minutter) og høstes i en Nalgene-tank. Deretter ble fermentoren raskt renset og sterilisert (20 min, 121 °C).

Med en gang fermentoren er sterilisert overføres kulturen til fermentoren i hvilket inaktivering finner sted ved forsiktig omrøring (det vil si ved 100 rpm). Temperaturen kontrolleres ved 20 °C, uten lufting og uten pH-regulering. Inaktiveringskinetikken indikerer at inaktiveringen krever i det minste 6 timers inkubering med formaldehyd. Rutinemessig er den fullstendige varighet for inkubering med formaldehyd omtrent 19 timer.

Etter denne inkubering tilsettes en steril 1 M fosfatbuffer pH 7 (3,4 liter per 45 liter kultur) for å forberede inaktivering av formaldehyden (15 minutter). Fermentoren blandes forsiktig (100 rpm) og en oppkonsentrert løsning av metabisulfitt (endelig konsentrasjon 3 g/l kultur) introduseres aseptisk til fermentoren (15 minutter). Den homogeniserte, inaktiverte kultur overføres aseptisk i en steril Nalgene-tank og lagres ved 40 °C.

YES-Medium (sterilisert 20 min. ved 121 °C:

Løsning av 1 M Fosfat, PH 7

( sterilisert ved filtrering gjennom 0, 2 um membran)

Kvalitetskontroll:

• Levedyktige telling (CFU) bestemmelse ved slutten av fermentasjonen

• Western blot ved slutten av fermentasjonen

• Sterilitet av den endelige sammenslåtte løsning (Eur Ph protokoll, 20 ml prøve - 21 dager) • Bestemmelse av den gjenværende konsentrasjon av formaldehyd i den endelige sammenslåtte løsning (<= 500 ppm, Eur Ph protokoll B)

EKSEMPEL 3

PRODUKSJONSMETODE FOR VP2var eller VP3

f50 LITERS SKALA)

Giærstammer: Pichia pastoris GS 115 - pPI CZaB - VP2var.

P/c/7/3-ekspresjonssystemet ble anvendt for å uttrykke IPN-proteinantigenene [Research Corporation Technologies, Tucson, Arizona, se U.S. Patent Nr. 4,808,537, 4,837,148, 4,879,231].

Forkultur: en 2-liter bafflet rystekolbe inneholdende 400 ml YSG+ (se nedenfor) inokuleres med 600 ul av den ovenfor identifiserte gjærstamme. Kulturen inkuberes ved 30 °C med en omrøring lik 270 rpm, under 23 - 25 timer. Den optiske tettheten ved 600nm (OD600nm) er >15 enheter (ved anvendelse av et NOVASPEC 11 spektrofotometer).

Fermentering; Fermentoren Braun D50 forberedes med 50 liter vekstmedie (SAPPEY, se nedenfor). Fermentoren inokuleres med et volum (V) av forkultur bestemt ved ligningen:

Løsningen steriliseres ved filtrering med en 0,22 um membran. PTMl-løsningen må tilsette til fermentoren separat fra komplementløsning 1.

Etter 24 timers vekst realiseres en første indusering av rekombinant proteinekspresjon ved tilsetning av metanol og gjærekstraktløsning. Ved dette tidspunkt er OD60onm større enn omtrent 10 enheter. Etter indusering synker P02raskt. Etter omtrent 1 time øker den sakte til metning. En andre induksjon realiseres etter 48 timer kultivering ved de samme betingelser. OD600nm oppnådd er større enn omtrent 13 enheter. Etter 72 timers vekst kjøles fermentoren til en temperatur som er lavere enn 20 °C. 0D600nm oppnådd er større enn omtrent 13 enheter.

Høsting og fylling: Cellene fra fermentoren høstes deretter. Kulturen sentrifugeres (5000g, 4 %, 20 min) for å kunne eliminere pelletene. Supernatanten filtreres aseptisk med en 0,2 um membran (Sartobran P) og 2,5 liter alikvoter plasseres i en gallons flasker. Disse flaskene lagres deretter ved -20 °C.

EKSEMPEL 4

EN INJISERBAR SRS- VAKSINE

Oppsummering

En SRS injiserbar vaksine i henhold til den foreliggende oppfinnelse er en vann-i-olje type vaksine. Den inneholder en suspensjon av to bakteriner som omfatter antigener av Piscirickettsia salmonis, rekombinante stammer av Yersinia ruckeri av BCCM aksesjonsnummer LMGP-22511, sammen med BCCM aksesjonsnummer LMG P22044, i fosfatbuffret saline. Den oljede adjuvant er MONTANIDE ISA711 (oppnådd fra SEPPIC, Paris, Frankrike) og konstituerer 70 % av vaksinens totale volum.

Formuleringen kan også inneholde gjenværende kvantiteter av formaldehyd, avledet fra inaktivering av de rekombinante Yersinia ruckeri kulturene. SRS-vaksinen utformes og anbefales for administrering ved intraperitonal injisering, ved en dose lik 0,1 ml per fisk, for å forhindre salmonid rickettsial septikemi forårsaket av Piscirickettsia salmonis i fisk, mer spesielt salmonider, og enda mer spesielt, i laks.

Presentasjon

Den SRS injiserbare vaksine presenteres i 500 ml høy tetthets polyetylen infusjonsflasker lukket med røde gummikorker og med aluminumforseglinger. Flaskene og korkene er i samsvar med kravene i de relevante monografer av den europeiske farmakopea (Ph. Eur). Beholderne autoklaveres ved 121 °C i 20 minutter. Korkene autoklaveres ved 121 °C i 60 minutter.

Produksjon

Produksjon av antigener av Piscirickettsia salmonis: Rekombinante stammer av Yersinia ruckeri av BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511, så vel som BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044 fremstilles som beskrevet i Eksempler 1 og 2 ovenfor. Stamløsningene av arbeidskultur tines og inokuleres i 500 ml primær Trypton Soya buljong (TSB) såkultur medium pluss ampicillin i 2-liters flasker.

En renhetstest utføres. Såkulturen inkuberes i omtrent 20 timer, med forsiktig omrøring, og inokuleres deretter i 18 liter TSB fermenteringsmedium i en 30 liters fermentor og inkuberes, med omrøring, inntil straks før slutten av den eksponentielle fase, som indikert ved avlesninger av optisk tetthet.

En bestemmelse av levedyktige utføres. Like før slutten av den eksponentielle fase høstes kulturen og inaktiveres med 37 % formalin. Kulturen overføres til en separat steril beholder mens inaktivering foregår.

Prøver tas for kvalitetskontrolltester vedrørende sterilitet, inaktivering, bestemmelse av levedyktige, Western blot, gjenværende formaldehydinnhold og pH.

Lagring

De inaktiverte kulturer slås i sterile 50 liters nalgene flasker og lagres ved 40 °C inntil resultatene fra kvalitetskontrolltestene er tilgjengelig.

Blanding av den endelige vaksine

De sammenslåtte antigener blandes med fosfatbuffret saline og oljekomponenten for å oppnå en sammenslått vaksine med den ønskede cellekonsentrasjon.

Fylling

Etter å ha fullført en påfølgende sterilitetstest overføres vaksinen til 500 ml høytetthets polyetylenflasker med nitril gummi korker og plastikkforseglinger. Prøvene testes for sterilitet.

Materialer

Antigen: Produktet inneholder to bakteriner som indikert ovenfor, inneholdende antigener av Piscirickettsia salmonis, isolert fra atlantisk laks i Chile. Renkulturer av organismene ble mangfoldiggjort og DNA ekstrahert fra disse, ble anvendt for å fremstille en genpool. De passende gener ansvarlige for ekspresjon av antigenene ble satt inn i separate kulturer av Yersinia ruckeri. Siden antigenene uttrykkes i cellemembranen innbefatter produktet inaktiverte kulturer av komplette celler av Y. ruckeri for å kunne bringe tilveie antigenene (se Eksempler 1 og 2 ovenfor, for flere detaljer).

Validerin<g>

Utstyr og Installasjoner: Antigenene produseres i en installasjon som opererer i henhold til internasjonal "Good Manufacturing Principles" (GMP) og "Good Laboratory Practices" (GLP). Den endelige vaksine produseres i overensstemmelse med internasjonal GMP. Fylleprosessen utføres under Klasse lA-betingelser. Miljø-og HEPA-laminære gjennomstrømningsfiltere underlegges regulær validering. Miljøovervåkning av prosessen utføres. Fylleprosedyren i seg selv valideres ved hjelp av kulturassayer.

Fremstillingsprosedvre: SRS-vaksine fremstillingsprosessen involverer konvensjonelle mikrobiologiske kulturer i glassflasker og fermentorer. Den første samsvarer med etablerte prosedyrer som ikke behøver spesifikk validering og den senere er validert etterfølgende installering.

Bovine Spongiform Encephalopati: Det finnes ingen bevis for at fisk kan overføre eller være vertskap for spongiform encephalopathier (TSE). Dog inspekteres kildene av materialer av biologisk opprinnelse anvendt i fremstilling av vaksinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse, med hensyn til potensial overføring av spongiform encephalopathier. Det betrakter at risikoene for at spongiform encephalopathier spres ved anvendelse av vaksinene i henhold til den foreliggende oppfinnelse er minimal, hvis noen i det hele tatt.

Assaver

Flere tester utføres for å sikre at konsistens og kvalitet av vaksinen og dens komponenter opprettholdes. Disse tester er beskrevet nedenfor.

Såkultur: En renhetstest utføres ved å spre kulturen på agargeleplater. Akseptkriterie er en ren kultur.

Kultur ved høsting ( antall levedyktige) : Det finnes ingen satte grenser. Antallet av CFU/ml registreres for blandingsformål.

Inaktiverte Antigener: En sterilitetstest utføres i overensstemmelse med Ph. Eur. Akseptkriterie er at kulturen må være steril. Sterilitetstesten har også virket som inaktiveringstest, med akseptkriteriet ingen vekst. Den gjenværende formaldehydtest beskrevet i Ph. Eur. utføres kun for å bestemme mengden.

PH: pH måles ved anvendelse av et pH-meter. Området er normalt pH 6,5 ± 0,5

Blandet vaksine: En sterilitetstest utføres i overensstemmelse med Ph. Eur., med akseptkriteriet at kulturen må være steril.

Tester på fulle beholdere: En sterilitetstest utføres i overensstemmelse med Ph. Eur. Igjen er akseptkriterie at kulturen må være steril.

Sikkerhet i målarter: En test utføres for å bekrefte at vaksinen er sikker i målartene. Dette er en del av et eksperimentelt program.

Stabilitet: Stabilitetstester utføres på det endelige produkt.

Stabilitetstestprogrammet innbefatter tester på produktet ved tidspunktet for tillaging og etterfølgende lagring i 15 og 27 måneder ved temperaturer mellom 2 °C og 8 °C. Spesiell oppmerksomhet rettes mot produktets utseende og virkeevnen av antigenene som det inneholder.

EKSEMPEL 5

EN INJISERBAR VAKSINE FOR SRS OG IPN

Oppsummering

En injiserbar vaksine i henhold til den foreliggende oppfinnelse er en vann-i-olje type vaksine. Denne vaksine inneholder en suspensjon av to rekombinante proteiner (VP2 og VP3), eller antigene fragmenter derav, fra infeksiøs pankreatisk nekrose virus og bakteriner som omfatter antigener av Piscirickettsia salmonis i rekombinant stammer av Yersinia ruckeri av BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511, sammen med BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044, i fosfatbuffret saline.

Antigeniske fragmenter av hver av de to IPN rekombinante proteiner inkluderes i vaksinen. VP2 (VP2var) rekombinante proteiner uttrykkes av transformert gjær, Pichia pastoris BCCM aksesjonsnummer IHEM 20069 og/eller BCCM aksesjonsnummer IHEM 20070, mens VP3 rekombinante proteiner uttrykkes av BCCM aksesjonsnummer IHEM 20071 og/eller BCCM aksesjonsnummer IHEM 20072. Oljeadjuvanten er MONTANIDE ISA711 og omfatter 70 % av vaksinens totale volum. Formuleringen kan inneholde gjenværende mengder av formaldehyd, hvilket stammer fra inaktivering av kulturene.

Denne spesielle vaksine utformes og anbefales for administrering ved intraperitonal injisering, for å beskytte mot salmonid rickettsiell septikemi, og infeksiøs pankreatisk nekrose i fisk, mer spesielt salmonider, og enda mer spesielt, i laks.

Presentasjon

Den injiserbare vaksine for SRS og IPN presenteres i 500 ml høytetthets polyetylen infusjonsflasker, stengt med røde gummikorker og med aluminumforseglinger. Flaskene og korkene er i samsvar med de relevante monografer av den europeiske farmakopea (Ph. Eur). Beholderne autoklaveres ved 121 °C i 20 minutter. Korkene autoklaveres ved 121 °C i 60 minutter.

Produksjon

Produksjon av Antigener av IPNV

En beholder med arbeidskultur åpnes og inokuleres i 400 ml medium og inkuberes ved omtrent 30 °C i 19 - 24 timer. Kulturen inokuleres i 46 til 47 liter vekstmedium i en fermentor. pH justeres til pH 6,0 med saltsyre eller natriumhydroksid. Kulturen inkuberes ved omtrent 30 °C i 24 timer. Under kontinuerlig fermentering tilsettes metanol og gjærekstrakt for å fremkalle proteinekspresjon, og dette gjentas 24 timer senere. Etterfølgende inkubering over totalt 72 timer, kjøles fermentoren til under 20 °C. Deretter elimineres cellene med sentrifugering og kasseres i overensstemmelse med lokale miljøbeskyttelsesreguleringer. Supernatanten som inneholder det uttrykte protein steriliseres ved filtrering (0,22 um pore membran) og lagres ved -20 °C inntil det behøves for blanding.

Produksjon av antigener av Piscirickettsia salmonis: Rekombinante stammer av Yersinia ruckeri av BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511, og BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044 fremstilles og lagres som beskrevet i Eksempel 4 ovenfor.

En renhetstest utføres. Såkultur inkuberes i omtrent 20 timer, med forsiktig omrøring. Kulturen inokuleres deretter i 18 liter TSB fermenteringsmedie i en 30 liters fermentor og inkuberes deretter, med omrøring, inntil rett før slutten av den eksponentielle fase, som indikert ved avlesinger av optisk tetthet.

En bestemmelse av antall levedyktige utføres. Rett før slutten av den eksponentielle fase høstes kulturen og inaktiveres med 37 % formalin. Kulturen overføres til en separat steril beholder mens inaktivering forekommer.

Prøver tas for kvalitetskontrolltester vedrørende sterilitet, inaktivering, antall levedyktige, Western blot, gjenværende formaldehydinnhold og pH.

Lagring

De inaktiverte kulturer tømmes i sterile 50 liters nalgen flasker og lagres ved 4 °C inntil resultatene fra kvalitetskontrolltestene er tilgjengelig.

Blanding av den endelige vaksine

Bulk antigener blandes med de andre antigen komponenter, fosfatbuffret salineløsning, og oljekomponenten for å oppnå en bulk vaksine av den ønskede cellekonsentrasjon.

Volumene av bulk antigener som er nødvendig (beregnet med hensyn til den individuelle konsentrasjonen av sammenslått antigen, den nødvendige konsentrasjon av disse i sluttproduktet og batch størrelse) fjernes fra lagring. De sammenslåtte antigener overføres til kalde, sterile beholdere og blandes grundig.

Volumet steril saline som er nødvendig beregnes og overføres aseptisk til de blandede sammenslåtte antigener. Antigenene og saline blandes grundig og pH justeres til pH 7,0 - 7,4 med 10 M natriumhydroksid eller 10 M saltsyre (vandig fase).

Vekt av steril oljefase som er nødvendig beregnes og overføres aseptisk til en steril blandingsbeholder. Olje- og vannfaser emulgeres i 5 minutter ved omtrent 3000 rpm. Den emulgerte blanding vedlikeholdes ved ambient temperatur i 24 timer. Blandingen plasseres i de endelige beholdere, med en nominell fyllverdi lik 505 ml. Korkene settes i aseptisk og forseglingene appliseres. Hver beholder merkes, pakkes og lagres ved +2 °C til +8 °C i karantene inntil frigjøring for salg. Batch størrelsen varierer i henhold til produksjonskravene og er normalt innen området 100 liter til 1500 liter.

Validering

Utstyr, Installasjoner og fremstillingsprosedyre: Validering av utstyr, installasjoner og fremstillingsprosedyre er som beskrevet i Eksempel 4 ovenfor.

Materialer

Piscirickettsia salmonis antigen: Produktet inneholder to bakteriner som indikert ovenfor, som inneholder antigener av Piscirickettsia salmonis, isolert fra atlantisk laks i Chile. Renkulturer av organismene ble mangfoldiggjort og DNA ekstrahert fra disse ble anvendt for å fremstille en genpool. De passende gener ansvarlige for ekspresjon av antigenene ble satt inn i separate kulturer av Yersinia ruckeri. Siden antigenene uttrykkes i cellemembranen innbefatter produktet inaktiverte kulturer av komplette celler av Y. ruckeri for å kunne bringe tilveie antigenene (se Eksempler 1, 2 og 4 ovenfor, for flere detaljer).

Vaksinen inneholder også rekombinante proteiner VP2 var og VP3 av IPNV [se WO 02138770 Al] for å beskytte mot IPN-viruset. VP2 var-proteinet anvendt avledes fra en stamme av IPN-virus kjent som Sp.

VP2var er en region av VP2-proteinet tidligere identifisert som et variabelt segment av VP2 som omfatter omtrent 150 aminosyrerester [tidligere identifisert som aminosyrer 183-337 kodet for av nukleotider 678-1140, se, Havarstein et al., J. Gen. Virol. 71:299-308 (1990); Pryde et al., Archives of Vir. 129:287-293 (1992)].

Nukleinsyrer som koder for VP3 og VP2-var er klonet og satt inn i Pichia pastoris gjær. Konstruksjonsmetoden for gjær er slik at de relevante gensekvenser integreres i vertsorganismens genom og det er ikke noe fritt plasmid tilstede.

IPN-viruset fra hvilket klonede gensekvenser er avledet ble opprinnelig isolert fra syke atlantiske laks på en laksefarm på Shetlandsøyene [se WO 02138770 Al, hvilket innholdet av herved er inkorporert ved referanse i sin helhet].

Andre reagenser bringes tilveie i Tabell 2 i Eksempel 4 ovenfor.

Bovin Spongiform Encephalopati: Det finnes intet bevis for at fisk kan overføre eller være vert for spongiform encephalopatier (TSE). For videre detaljer se Eksempel 4 ovenfor.

Assaver

Flere tester utføres for å sikre at konsistensen og kvaliteten av vaksinen og dens komponenter bibeholdes. Disse tester er beskrevet nedenfor.

For IPN- proteinene:

RENHET

Renheten av den spesifiserte arbeidssåkultur inokulant anvendt verifiseres ved å eksaminere kulturplaten for å bekrefte at koloniene dannet er typiske og konsistente og at ingen koloni med kontaminerende organismer er tilstede. Akseptkriterie er at alle kolonier må ha lignende utseende og være typiske for Pichia pastoris.

STERILITET

Denne assay utføres på en prøve av det høstede materialet rett etter blanding av bulk antigenene, men før blanding med oljefasen. Testen utformes for å demonstrere sterilitet av materialet og for å spesifikt kontrollere at det ikke finnes Pichia pastoris- ceWer tilstede.

Fremgangsmåten anvendt er den som beskrives av Ph. Eur. 1 ml høstet prøve inokuleres i hver av to rør inneholdende 9 ml av Thioglykollatbuljong eller Soyabønnebuljong. Prøvene inkuberes ved henholdsvis 32 °C og 22 °C i 14 dager. De rør som ikke viser noen form for vekst i løpet av denne perioden subkultiveres i enda 7 dager til. Positive og negative kontroller inkluderes i alle tester. Alle rør og plater som inokuleres kun med forsøksprøven må ikke vise noen som helst vekst, mens alle rør og plater som inokuleres med positive kontrollorganismer må vise vekst av kontrollorganismen. I tillegg til de normale tester for å bekrefte steriliteten av mediet er fremgangsmåten spesifikt godkjent for å kunne vise at teknikken er i stand til avsløre levende Pichia pastoris. Denne studien viste at så få som 2-3 celler i prøven produserer en rikelig vekst innen 5 dagers inkubering.

SDS- PAGE

En prøve av hver høsting testes med SDS-PAGE for å bekrefte at de forventede proteiner er produsert. Prøvene separeres ved anvendelse av en 15 % akrylamidgel. To identiske geler anvendes for hver prøve, en behandlet med Coomassie Brilliant Blå for å farge proteinene og den andre undergår Western blot på nitrocellulose hvilket deretter immunoblottes med spesifikke monoklonale anti-VP2 og anti-VP3 antistoff. De fargede geler må vise proteinbånd i den korrekte molekylvektsposisjon (30 kDa for VP3 og 42 kDa for VP2 var). Disse båndene må korrespondere spesifikt til bånd gjenkjent av de korresponderende monoklonale antistoff.

PROTEININNHOLD

En test for proteinkonsentrasjon i det høstede materiale utføres for å bringe tilveie et kvantitativt estimat av utbytte og for å danne basis for den endelige blanding av vaksinen. Fremgangsmåten anvendt benytter Coomassie Blå for å binde proteinet og bovin serum albumin (BSA) som proteinstandarden. Intet spesielt kriterium anvendes siden testen utformes kun for å bringe tilveie et kvantitativt resultat. Dog er det normale området for proteinkonsentrasjon i høstingen omtrent 10-50 mg/ml. Det forventes at utbyttet kan variere i tilfelle produksjon i større skala, og det kan dermed være passende å anvende et spesifikt kriterium.

For Piscirickettsia salmonis Antigener:

Assayene utført for å sikre at konsistensen og kvaliteten av disse komponentene vedlikeholdes beskrives i Eksempel 4 ovenfor.

Assav av det endelige produkt

En sterilitetstest utføres i overensstemmelse med Ph. Eur. Som akseptkriterie settes at kulturen er steril. En sterilitetstest av de hele beholdere som omfatter vaksinen utføres i overensstemmelse med Ph. Eur. med akseptkriteriet at kulturen er steril.

En test utføres også for å bekrefte at vaksinen er sikker overfor målartene. Denne danner en del av det eksperimentelle programmet.

Til slutt utføres stabilitetstester på sluttproduktet. Stabilitetstestprogrammet innbefatter tester på produktet ved tidspunktet for fremstilling og etterfølgende lagring i 15 og 27 måneder ved temperaturer mellom 2 °C og 8 °C. Spesiell oppmerksomhet rettes mot produktets utseende og virkeevne av antigenene det inneholder.

EKSEMPEL 6

EN INJISERBAR VAKSINE FOR SRS, IPN OG FURUNKULOSE

Oppsummering

En injiserbar vaksine i henhold til den foreliggende oppfinnelse er en vann-i-olje type vaksine som omfatter en suspensjon av:

(i) to inaktiverte stammer av Aeromonas salmonicida (MT004 og MT423), (ii) to rekombinante IPN virale proteiner (VP2 og VP3) eller antigene fragmenter derav, som uttrykkes av transformerte gjær, Pichia pastoris i 0,85 % p/v steril saline, og (iii) en suspensjon som omfatter inaktiverte rekombinante stammer av Yersinia ruckeri som omfatter antigener fra Piscirickettsia salmonis, som har BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511, sammen med BCCM aksesjonsnummer LMG P-22044, i fosfatbuffret saline.

De VP2 (VP2var) rekombinante proteinene uttrykkes av transformert gjær, Pichia pastoris BCCM aksesjonsnummer IHEM 20069 og/eller BCCM aksesjonsnummer IHEM 20070, mens de VP3 rekombinante proteinene uttrykkes av BCCM aksesjonsnummer IHEM 20071, og/eller BCCM aksesjonsnummer IHEM 20072. Oljeadjuvanten er MONTANIDE ISA711 og omfatter 70 % av vaksinens totale volum. Formuleringen kan inneholde gjenværende mengder av formaldehyd som stammer fra inaktivering av kulturene.

Denne spesielle vaksine utformes og anbefales for administrering ved intraperitonal injisering, for å beskytte mot salmonid rickettsiell septikemi, infeksiøs pankreatisk nekrose og furunkulose i fisk, mer spesielt salmonider, og enda mer spesielt, i laks.

Presentasjon

Denne vaksine presenteres i 500 ml høytetthets infusjonsflasker, lukket med grå nitrilkorker og med aluminiumsforseglinger. Flaskene og korkene er i samsvar med kravene i de relevante monografer av den europeiske farmakopea (Ph. Eur). Beholderne autoklaveres ved 121 °C i 20 minutter. Korkene autoklaveres ved 121 °C i 60 minutter.

Produksjon

Produksjon av A salmonicida MT004 antigen: En ampulle av frysetørket arbeidskultur fjernes fra lagring og rekonstitueres og inkuberes. Denne kulturen inokuleres deretter i 4 liter steril, jern-begrenset TSB for å danne produksjonskulturen og inkuberes deretter ved omtrent 21,5 °C i 36-48 timer. Den resulterende kultur inokuleres deretter aseptisk i 15-18 liter steril, jern-begrenset TSB. Den inkuberes ved omtrent 21,5 °C i 24 til 48 timer. Deretter tilsettes en løsning av steril formaldehyd til flaskene for å inaktivere kulturen. Hver kultur blandes kraftig etterfølgende tilsetningen av formaldehydløsningen og overføres deretter aseptisk til en steril lagringsflaske. Kulturen holdes ved omtrent 22 °C i 96-100 timer for å sikre inaktivering av bakteriekulturer og proteaseaktivitet. Formaldehyden nøytraliseres ved tilsetning av en løsning av 15 % natriummetabisulfitt. Nøytralisering avsluttes innen 20-24 timer ved en temperatur på omtrent 22 °C. De inaktiverte høstingene lagres ved 2-8 °C inntil de kreves for blanding. Produksjonen av A salmonicida MT004-antigen kan også utføres som beskrevet nedenfor for MT423.

Produksjon av A salmonicida MT423- antiqen: En ampulle frysetørket arbeidskultur fjernes fra lagring og rekonstitueres og inkuberes. Denne kulturen inokuleres deretter i 300 ml av steril jern-supplementert TSB for å danne produksjonskulturen, og inkuberes deretter ved omtrent 21,5 °C i 36-48 timer.

Kulturen inokuleres deretter aseptisk i 4 liter av steril, jernsupplementert TSB. Det inkuberes ved omtrent 21,5 °C i 36 til 48 timer. Kulturen av produksjonssåkultur overføres aseptisk til 150 liter av steril, jernsupplementert TSB i en fermentor og inkuberes ved omtrent 21,5 °C i 20-24 timer.

Deretter tilsettes en løsning av steril formaldehyd til kulturflaskene for å inaktivere disse. Hver kultur blandes kraftig etterfølgende tilsetning av formaldehydløsningen og overføres aseptisk til en steril lagringsflaske. Kulturen holdes ved omtrent 22 °C i 96-100 timer for å sikre inaktivering av bakteriekulturen og proteaseaktivitet. Formaldehyden nøytraliseres ved å tilsette en løsning av 15 % natriummetabisulfitt. Nøytralisering avsluttes innen 20-24 timer ved en temperatur på omtrent 22 °C. De inaktiverte høstinger lagres ved 2-8 °C inntil de behøves for blanding.

Produksjon av rekombinante proteiner IPN ( VP2 VAR) og IPN VP3: Rekombinante proteiner IPN (VP2 VAR) og IPN VP3 fremstilles og lagres som beskrevet i Eksempel 5 ovenfor.

Produksjon av Antigener av Piscirickettsia salmonis: Rekombinante stammer av Yersinia ruckeri av BCCM aksesjonsnummer LMG P-22511 og BCCM aksesjonsnummer. LMG P-22044 fremstilles og lagres som beskrevet i Eksempel 4 ovenfor.

Blanding av den endelige vaksine

Blanding av antigenene for å danne den endelige vaksine utføres som beskrevet i Eksempel 5 ovenfor.

Validering

Utstyr, installasjoner og fremstillingsprosedyrer: Validering av utstyret, installasjoner og fremstillingsprosedyre er som beskrevet i Eksempel 4 ovenfor.

Materialer

Piscirickettsia sa/ mon/ s- antioen: Produktet inneholder to bakteriner som indikert ovenfor, som inneholder antigener av Piscirickettsia salmonis, isolert fra atlantisk laks i Chile. Renkulturer av organismene ble mangfoldiggjort og DNA ekstrahert fra de som ble anvendt til å fremstille en genpool. De passende gener ansvarlig for ekspresjon av antigenene ble satt inn i separate kulturer av Yersinia ruckeri. Siden antigenene uttrykkes i cellemembranen innbefatter produktet inaktiverte kulturer av komplette celler av Y. ruckeri for å kunne bringe tilveie antigenene (se Eksempler 1, 2 og 4 ovenfor for flere detaljer).

I tillegg anvendes to stammer av Aeromonas salmonicida, hvilket er stammer fra isolert naturlig infektert fisk oppnådd fra fiskeoppdrett i Skottland. Til tross for det faktum at det ikke finnes bevis for at det er en serologisk distinksjon mellom ulike stammer av Aeromonas salmonicida, finnes det en vitenskapelig basis for å inkludere flere enn en stamme i denne vaksinen. Dette er på grunn av det faktum at ulike isolater kan enten være A-lag positive eller negative. Når man betrakter at nærvær eller fravær av dette laget kan være direkte knytet til virulens, tillater fravær av et A-lag større eksponering for ytre membranproteiner (OMP), og i særdeleshet, de OMP produsert kun ved jernbegrensende betingelser, som kan forekomme under infeksjonsprosessen. Som et resultat antas produksjon og immunologisk tilgjengelighet av de jernbegrensede ytre membranproteiner (IROMP), å være viktig for effektiviteten av vaksinen.

Aeromonas salmonicida ( MT004 ) : MT004-stammen er en A-lag negativ stamme, hvilket dyrkes ved jernbegrensede betingelser. Utvikling under disse betingelser fører til produksjon av spesifikke jernbegrensede ytre membranproteiner som stimulerer produksjon av bakterieantistoff etterfølgende intraperitonal inokulering.

Stammen ble opprinnelig isolert fra døende atlantisk laks under et utbrudd av furunkulose i en laksefarm på vestkysten av Skottland i oktober 1985. Den ble tatt gjennom trypton soya buljong seks ganger og forble virulent overfor vertsorganismedyr.

Aeromonas salmonicida ( MT423 ) : MT423-stammen er en A-lag positiv stamme som er dyrket i en fermentor ved jernbegrensnings supplementering. A-lag er en komponent av suksesfulle A. salmonicida- vaks\ ner og supplementering med jern har økt beskyttelsen brakt tilveie av furunkulosevaksinen.

MT423-stammen ble isolert fra syk atlantisk laks fra en laksefarm ved Stirling University. Den ble tatt 16 ganger gjennom atlantisk laks og forble virulent overfor vertsorganismedyrene og er derfor passende for anvendelse som en vaksinestamme.

Begge stammer er inaktivert ved eksponering overfor formaldehyd, værende i ikke-infiserende organismer, mens det bibeholder dets evne til å stimulere en immunrespons i vaksinert fisk.

Vaksinen inneholder også de rekombinante proteiner VP2 var og VP3 av IPNV som beskrevet i Eksempel 5 ovenfor.

Andre reagenser bringes tilveie i Tabell 2 av Eksempel 4 ovenfor.

Bovine Spongiform Encephalopati: Det finnes intet bevis på at fisk kan overføre eller være vert for spongiform encephalopatier TSE). For videre detaljer se Eksempel 4 ovenfor.

Assa<y>er

Flere tester utføres for å sikre at konsistensen og kvaliteten på vaksinen og dens komponenter bibeholdes. Disse tester er beskrevet nedenfor.

Aeromonas salmonicida stammer MT004 og MT423: Testmetodene anvendt for begge antigener er de samme, foruten at testen for nærvær av IROMP ikke anvendes for MT423-stammen, siden dette multipliseres i et jern-beriket medie. I tillegg er kriteriene anvendt for enkelte tester ulike for hver stamme. Med hensyn til enkelthet spesifiserer de følgende testbeskrivelser kriteriet for hver stamme hvor det er passende.

Renhetstester - Gramfar<g>in<g>: Gram farging renhetstester utføres på hver subkultur under multiplisering fra såkultur til produksjonskultur. Testen bringer tilveie en hurtig indikasjon på at den kultiverte organisme har det forhåpede mikroskopiske utseende og at ingen atypisk organisme er tilstede.

Testmetoden er en enkelt Gramfarging som anvender konvensjonelle teknikker og materialer. Kjente Gram-positive og negative kontrollorganismer farges hver gang for å bekrefte at farging og avfarging er passende. Forsøksprøven må kun vise små Gram-negative staver.

Renhetstest og karakteristika av kulturen: En ytterligere renhetstest utføres på hver av de 20-liters fullstendige kulturer og på kulturen i den endelige fermentor. Testen bekrefter renheten av kulturen og bidrar til global identitetssikkerhet. En prøve av kulturen dyrkes på plater av trypton soya agar og inkuberes ved 22 °C for i det minste 48 timer, lenge nok til at de ulike kolonier blir synlige. Plater inokulert med testkulturen må utvise kun en type av bakteriekolonier. Disse koloniene må være typiske for Aeromonas salmonicida.

Aeromonas salmonicida MT004-stammen danner semi-gjennomskinnelige, runde, konvekse, kremfargede kolonier med regulære kanter. En rødbrun pigmentering produseres hvilket sprer seg gjennom mediet etter omtrent 24 timers dyrkning. Aeromonas salmonicida MT423-stamme: Semigjennomskinnelige, runde, konvekse, kremfargede kolonier med regulære kanter, men som utvikler seg senere enn MT004-stammen.

Identitet av kulturen: Identiteten av en gitt kultur bekreftes i prøvene av endelig fermentering. Identitetstester utføres på den endelige kultur før inaktivering for å bekrefte at de riktige organismer ble dyrket. De må legges vekt på at ingen av disse tester kan differensiere stammene, men alle bidrar til sikkerheten ved å identifisere artene. I tillegg til renhetstestene bekreftes identiteten ved hjelp av biokjemiske og agglutineringskarakterstika:

• Demonstrering av bruk av glukose uten gassproduksjon. En prøve fra sluttkulturen inokuleres i peptonvann inneholdende 1 % glukose og fenolrød i rør inneholdende et invertert Durhamrør. De inokulerte kulturer inkuberes ved 22 °C i 24-48 timer. Forsøksprøven må vise bruk av glukose, indikert ved syreproduksjon, uten at gass produseres. • Demonstrering av positiv metabolisme av cytochrom oksidase ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige impregnerte filterpapir: En enkeltkoloni fra renhetstestplaten (kulturkarakteristika) spres over filterpapiret. Et positivt resultat indikeres av utvikling av et blekrødt, purpurpigment mens et negativt resultat indikeres av ingen endring i fargen. Kulturene må frembringe en blekrødt, purpur farging på testpapiret, hvilket indikerer positiv cytochrom oksidase metabolisme. • Lattes dekk-glass test ved anvendelse av et diagnostisk kit av patogener fra kommersielle fisk (Bionor MONO-AS - Code DD020). En enkeltkoloni fra renhetstestplaten (kulturkarakteristika) blandes med en dråpe av antiserum på et mikroskopglass. Testen anvender et spesifikt kanin antiserum mot Aeromonas salmonicida. En negativ kontrollkultur er på samme måte blandet med en dråpe av antiserum. Positiv agglutinering må observeres med forsøksprøven. Den negative kontrollprøve må ikke vise noen som helst agglutinering.

Optisk tetthet: Optisk tetthetsmålinqer ved 580 nm registreres ved slutten av hver kultur i 20 liter flasker og ved intervaller gjennom sluttfermenteringen. Optisk tetthetsmålinger tas fra 20 liters kulturflasker for å sikre at hver av disse inokulanter har vokst tilfredsstillende. Optisk tetthetsmålinger registreres ved intervaller under den endelige fermentering for å bestemme optimal tid for høsting, som indikert av slutten av den eksponentielle vekstfasen.

En prøve av kulturen plasseres i en kyvette og den optiske tettheten måles direkte ved anvendelse av et spektrofotometer. Hvis nødvendig kan prøven fortynnes i 0,85 % steril salineløsning for å kunne oppnå opasitet innen spektrofotometeret område. Fremgangsmåten er kun anvendt for å bekrefte tilfredsstillende vekst av inokulanten og for å bestemme optimal tid for høsting av den endelige fermentering. Den endelige optiske tetthetsavlesning er ikke kritisk og intet fastsatt kriterium brukes. Dog er den endelige verdi oppnådd fra kulturen i fermentoren normalt innen det følgende område:

8 - 11 for MT004-stammen (uten jern)

13-18 for MT423-stammen (jernsupplementert)

Et absolutt kriterium for optisk tetthet er ikke passende på grunn av flere årsaker. Først, når man betrakter at mediet anvendt er av biologisk opprinnelse finnes det, hvilket er uunngåelig, en variasjon i til hvilke grad en spesifikk batch vil støtte vekst. Dernest er prøvetakingsfrekvensen for optisk tetthet begrenset til 45 minutters intervaller på grunn av nødvendigheten av å re-sterilisere prøveuttaksporten. Følgelig kan den eksakte høstingstiden tillate at kulturen vedlikeholdes i den stasjonære fase over en kortere tidsperiode, i løpet av hvilket en reduksjon i optisk tetthet kan observeres.

Antall levedyktige

En prøve av kulturen tas for bestemmelse av levedyktige ved slutten av fermenteringen og før tilsetting av inaktivatoren. Antall levedyktige virker som et endelig mål på utbytte og danner basis for den påfølgende blanding av vaksinen. Bestemmelse av levedyktige utføres ved anvendelse av Miles og Misra-metoden [se for eksempel, Hedges', Int J Food Microbiol. 25:76(3):207-14 (2002)] med Trypton Soya Buljong som fortynningsmiddel og Trypton Soya Agar som vekstmedie. Passende ti-ganger seriefortynninger av prøven fremstilles og ti replikate 0,025 ml dråper av hver fortynning plasseres på agarplaten. Platene inkuberes ved 22 °C i 24-48 timer. Kun de fortynninger hvor kolonier tydelig kan telles, anvendes for å beregne antall levedyktige.

Antall levedyktige anvendes som basis for blanding av vaksinen. Det faktiske antall er ikke kritisk og intet satt kriterium anvendes. Dog er normale antall i området mellom 0,3 - 1,5 x 10<10>/ml for begge stammer MT004 og MT423. Det absolutte kriterium er ikke passende på grunn av flere årsaker. Først, når man betrakter at mediet anvendt er av biologisk opprinnelse, er det uunngåelig en variasjon i til hvilken grad en spesifikk batch vil støtte vekst.

Dernest er prøvetakingsfrekvensen for optisk tetthet begrenset til 45 minutters intervaller på grunn av nødvendigheten av å re-sterilisere prøveuttaksporten. Følgelig kan den eksakte høstingstiden tillate at kulturen vedlikeholdes i den stasjonære fase over en kortere tidsperiode, i løpet av hvilket en reduksjon i optisk tetthet kan observeres.

Proteasetest

Proteasetesten utføres på en prøve av materiale tatt umiddelbart etterfølgende inaktiveringsperioden, men før tilsetning av natriumthiosulfat. Med den forbedrede kontroll av kulturens tilstander har ingen frigjøring av protease blitt observert. Dog er det, fordi det ikke er mulig å prøveta kulturen fra den endelige fermentor ved intervaller på mindre enn 45 minutter, mulig at enkelte celler vil dø, og påfølgende lysering kan forekomme før inaktivering. Denne testen bringer tilveie forsikring om at hvilken som helst protease som kan frigjøres inaktiveres fullstendig.

Proteaseassay: 3 ml inaktivert kultur tilsettes 20 mg SKY BLUE-pulver suspendert i 2,5 ml PBS og inkuberes i 15 minutter ved ambient temperatur. En positiv kontroll i hvilket 20 mg trypsin erstatter forsøks prøve ne inkuberes også. SKY BLUE-pulveret er uløselig i PBS, men hvis proteaseaktivitet er tilstede vil materialet brytes ned og blåfarge frigjøres i løsningen. Den positive kontroll må vise en blå farge, mens negative kontroller må forbli fargeløse. For å være aksepterbare må forsøksprøvene ikke utvise noen som helst proteaseaktivitet. Positive prøver må vise en blå farging.

Inaktiveringstest

En spesifikk test for inaktivering av kulturen utføres etterfølgende nøytralisering av den gjenværende inaktivator. En påfølgende test for kontinuerlig og fullstendig inaktivering utføres på den blandede vandige fase av vaksinen. Testen bekrefter fullstendig, tilfredsstillende inaktivering av alle viable organismer.

Inaktiveringsassav: 1 ml av inaktivert kultur inokuleres i hvert av seks rør

inneholdende 9 ml TSB. To av disse inokulerte rør inokuleres med 0,1 ml av positiv kontrollkultur med Aeromonas salmonicida av de samme stammer som prøven som testes, inokulering med en angitt konsentrasjon lik mellom 1 og 10 organismer. To ytterligere inokuleringsrør inokuleres ytterligere med 0,1 ml ved anvendelse av den samme positive kontrollkultur fortynnet 1 til 10. Også 0,1 ml av begge positive kontrollpreparater inokuleres i to rør, hvert inneholdende 9,9 ml TSB og to andre rør med TSB medium holdes kun som negative kontroller. Derfor fremstilles duplikater av de følgende rør (totalt 12 rør i alt):

• Inokulert med 1 ml forsøksprøve

• Inokulert med 1 ml forsøksprøve + 0,1 ml positiv kontroll

• Inokulert med 1 ml forsøksprøve + 0,1 ml positiv kontroll (fortynnet 1/10)

• Inokulert med 0,1 ml positiv kontroll

• Inokulert med 0,1 ml positiv kontroll fortynnet 1/10

• Ikke inokulert

Alle av rørene ovenfor inkuberes i 48 timer ved 22 °C. Ved slutten av denne perioden subkultiveres ethvert rør hvor vekst ikke kan ses. Subkultivering utføres ved å spre 1 ml medie på hver av to plater av trypton soya agar. Mediet gis deretter muligheten til å absorbere inn i agaren i 1 time ved ambient temperatur og platene inkuberes (vendt opp ned) i 48 timer ved 22 °C. Opprinnelige rør inkuberes også i 48 timer ved 22 °C.

Ved slutten av denne perioden registreres tidspunkt, vekst (eller fravær av vekst) i alle kulturer. Kriteriet for å akseptans er at alle prøvene inokulert kun med forsøksprøven og alle plater inokulert fra disse ikke må vise noen som helst vekst. I tillegg må alle rør inokulert med den høyeste konsentrasjon av organismer av den positive kontroll og/eller alle plater inokulert fra disse, vise vekst av kontrollorganismen. Hvis prøvene eksklusivt inokulert med den laveste fortynning av den positive kontrollkultur og/eller platene inokulert fra disse viser vekst må lignende resultater observeres for prøvene og plater inokulert med forsøksprøven pluss fortynnet positiv kontroll. Kontrollmediene må forbli negativ.

Test for IROMP

Denne testen retter seg kun mot materialet fra stamme MT004 og anvendes til en prøve av endelig sammenslått antigen etterfølgende inaktivering og nøytralisering, men før distribuering av materialet mellom lagringsbeholderne. Testen er en kvalitativ metode for å bekrefte nærvær av typiske jern-begrensede proteiner i preparatet.

SDS-PAGE-elektroforese utføres på prøven. SDS-PAGE- gelene elektroblottes til PVDF-membraner som deretter inkuberes med et rotte monoklonalt antistoff mot IROMP. Kobling av det monoklonale antistoff påvises ved et konjugat av geit anti-rotte alkalisk fosfatase og fremvises ved anvendelse av et NBT-BCIP-substrat. Et positivt kontrollpreparat av Aeromonas salmonicida IROMP spres på den samme gel sammen med molekylvektsmarkører. Fremgangsmåten er kvalitativ, men akseptkriteriet er at prøvene utviser bånd som er konsistente med kontrollpreparatet. Mer spesielt må proteinbånd påvises ved omtrent 70, 72, 77 og 82 kilodalton.

Sterilitet

Steriliteten av hver beholder av endelig sammenslått antigen bekreftes ved anvendelse av en spesifikk sterilitetstest selv om inaktiveringstesten også bringer tilveie ytterligere bevis på sterilitet av det sammenslåtte produktet før distribuering. Testen bringer tilveie forsikring om at hver beholder av sammenslått antigen er sterilt.

Fremgangsmåten anvendt er indikert i Ph. Eur. Ved anvendelse av direkte inokulering inkuberes thioglykollat og soya buljonger ved henholdsvis 32 °C og 22 °C, og begge subkultiveres etter 14 dagers inkubering. Subkulturene inkuberes i 7 dager, mens opprinnelige kulturer inkuberes i totalt 21 dager. Fremgangsmåten innbefatter positive kontrollkulturer spesifisert i Ph. Eur.

For å være akseptable må prøvene testet være sterile. De positive kontrollkulturer must vise rikelig tidlig vekst (innen 3 dager).

For Piscirickettsia salmonis- antiqener:

For IPN Proteiner VP2 var og VP3:

Assayene utført for å sikre at konsistensen og kvaliteten av disse komponentene bibeholdes beskrives i Eksempel 5 ovenfor.

Assav av det endelige produkt

Assayene utføres for å sikre at sterilitet av den endelige vaksine og beholdere som inneholder den endelige vaksine bibeholdes beskrives i Eksempel 5 ovenfor. I tillegg beskriver Eksempel 5 fremgangsmåtene som angår sikkerhet av vaksinen i målartene, så vel som dets stabilitet etter lagring.

EKSEMPEL 7

SIKKERHET OG EFFEKTIVITET AV SRS VAKSINE I ATLANTISK LAKS

Introduksjon

Atlantisk laks i Chile utsettes for infeksjon med Piscirickettsia salmonis. Mortalitet på grunn av P. salmonis forekommer vanligvis mellom 6-12 uker etter at fisken overføres til sjøvannsbur, men utbrudd kan forekomme i sjøvann frem til slutten av produksjonssyklusen.

Oppsummering

Grupper av 50 atlantiske laks med en middelverdi for vekt lik 50 g ble vaksinert i ferskvann ved injisering med SRS-vaksine ved en dose lik 0,1 ml per fisk. Testen ble gjennomført ved anvendelse av en pilotskalabatch av vaksinen fremstilt i henhold til GLP, som i Eksempel 4 ovenfor.

En kontrollgruppe av 50 fisk ble injisert med 0,1 ml of fosfatbuffret saline (PBS).

En verifiseringsenhet ble satt opp med i det minste 10 fisk injisert med hvert preparat indikert ovenfor. Selv om det forekom noe mortalitet i verifiseringsenheten på grunn av dårlig tilpasning av fisken til sjøvann, døde ingen ytterligere fisk i løpet av hele forsøksperioden, hvilket forsikret at eksterne infeksjoner var fraværende i fasilitetene i løpet av forsøket.

Vaksinens sikkerhet ble demonstrert ved å observere fiskens oppførsel, foring, og generelle tilstand i 21 dager post-vaksinering for hver gruppe. Ingen negative reaksjoner ble observert på grunn av vaksinen eller vaksinasjonsprosessen. Effektivitet av vaksinen ble demonstrert ved utfordring. Ved 540 °dager (som definert i den detaljerte beskrivelse ovenfor) etter vaksinering (38 dager etter vaksinering), ble fisk gradvis overført til sjøvann i løpet av tre dager. Ved 800 °dager etter vaksinering (56 dager etter vaksinering) ble fisk i alle grupper utfordret med en intraperitonal injisering (0,1 ml/fisk) ved anvendelse av supernatanten fra en Piscirickettsia salmonis kultur (Chilensk isolat) dyrket på CHSE-214-celler.

Mortalitet ble registrert i 6 uker etter utfordring. Mortalitet i utfordret kontrollgruppe injisert med PBS var 93,8 %, mens i vaksinerte var mortaliteten kun 53,1 %.

Verdier for relativ prosent overlevelse (RPS) ble kalkulert når kumulativ mortalitet i kontrollgruppen var > 60 % (RPS 60), og ved slutten av forsøket (RPS slutt). Vaksinert fisk viste en RPS 60 lik 100 % og en RPS slutt lik 43,4 %.

Når administrert ved injisering i atlantisk laks ved en dose lik 0,1 ml vaksine/fisk var SRS-vaksinen sikker og utviste høye nivåer av effektivitet i å beskytte atlantisk laks mot eksperimentell infeksjon av Piscirickettsia salmonis.

Resultatene av denne studien viser at SRS-vaksinen er sikker når den administreres med injisering ved den anbefalte dose. SRS-vaksinen viste effektivitet overfor eksperimentelle infeksjoner med Piscirickettsia salmonis.

Materialer og Metoder

Holdebetingelser: atlantisk laks ( Salmo salar) som veide 50 g ble holdt i sirkulære tanker 1 m diameter og 60 cm dybde ved en gjennomstrømningshastighet lik 150 - 200 l/time på en standarddiett. Oksygen ble kontinuerlig tilført og temperaturkontrollert ved 14 °C. Biomasse var identisk (2,5 kg fisk) i alle testenhetene foruten verifiseringsenheten, hvor biomassen var 3,25 kg fisk.

Fisk ble vedlikeholdt i ferskvann i 540 °dager etter vaksinering (38 dager etter vaksinering). Deretter ble sjøvann gradvis introdusert i tankene i løpet av 3 dager. Mat ble tilbakeholdt 24 timer før vaksinering.

Vaksinen var den oljebaserte injiserbare SRS-vaksinen av Eksempel 4 ovenfor.

Akklimatiserinq: Fisk ble overført fra stamholdefasiliteten for å teste akvariumfasilitetene en uke før vaksinasjonen var planlagt utført for å tillate akklimatisering. Foring opphørte i det minste 24 timer før vaksinering.

Vaksineringsprosedvre: Vaksinen ble administrert ved injisering som beskrevet nedenfor: Vaksinen ble tillatt oppvarming til romtemperatur og blandet grundig med kraftig rysting i to minutter foregående bruk. Fisk ble anestisert ved anvendelse av benzocain ved standardmetoder, og 0,1 ml av det passende preparat ble avlevert intraperitonalt. To preparater ble benyttet, som følger, med de gjenværende fisk (33) holdt i en separat enhet som sentineler??.

• Injisering med SRS-vaksinen

• Injisering med PBS

Totalt 133 fisk var inkludert i studien.

Grupper med 50 fisk ble vaksinert med hver av de to preparatene indikert ovenfor. Etter å ha blitt injisert ble fisk fra hver gruppe distribuert i fem tanker, til et endelig antall av 10 fisk/gruppe/tank.

I det minste 10 fisk ble injisert med hvert av preparatene indikert ovenfor.

Sikkerhetsvurderin<g>: Etterfølgende vaksinering ble fisk kontrollert for generell tilstand, og hvilke som helst negative effekter ble registrert i 21 dager etter vaksinering for å vurdere sikkerheten av den testete vaksinen. Enhver mortalitet ble observert for tegn på adhesjoner. Hvis noen adhesjoner ble disse klassifisert i henhold til Spielberg-skalaen.

Vurdering av effektivitet: Etterfølgende vaksinering og 21-dagers observasjon for sikkerhet ble fisk utfordret. Etter utfordring ble oppførsel, foring, generell tilstand, og mortalitet registrert daglig i 6 uker for å vurdere vaksinens effektivitet.

Effektivitet ble definert som en sammenlignende reduksjon i spesifikk mortalitet på grunn av SRS i vaksinert fisk, sammenlignet med ikke-vaksinerte kontrollgrupper. Reduksjon i mortaliteten ble evaluert ved anvendelse av en beskyttelsesindeks kjent som Relativ Prosent Overlevelse (R.P.S.). Denne beregnes som:

l-((% Mortalitet i vaksinerte /% Mortalitet i kontroll)) X 100

Eksperimentell utfordring: Piscirickettsia salmonis stamme var MHC401-2001. Stammen ble isolert i februar 2001 fra Salmo sa/ar-nyrevev i Chile. Isolering og multiplisering av stammen er utført på CHSE-214-celler. Eksperimentell utfordring ble gjennomført i sjøvann 800 °dager etter vaksinering (56 dager etter vaksinering). Piscirickettsia salmonis ble inokulert i CHSE-214-celler (80 % konfluens) og inkubert i MEM-5 ved 15 °C i 25 dager. Supernatant ble samlet og titrert på CHSE-214 i 96-brønns mikroplater inkubert ved 15 °C i 14 dager.

Supernatanttiteren var 5,99 x IO<5>TCID50/ml. Fisk ble utfordret med intraperitonale injeksjoner ved en rate av 0,1 ml supernatant, hvilket ga en dose per fisk lik 5,99 x

IO<4>TCID.

Prøveuttak: Under utfordringen ble alle døde fisk fjernet og lagret frossent ved -20 °C. Da forsøket ble avsluttet ble nyreprøver fra enhver mortalitet etter utfordring testet for nærvær av P. salmonis i nyre ved anvendelse av det immunodiagnostiske kit SRS ELISA kommersialisert av BlOSChile Ingeniera Genetica S.A.

Statistisk analyse: Fisketanken ble betraktet som en tilfeldig blokkeringseffekt. Delen av kumulativ mortalitet for hver behandlingsgruppe i hver tank ble analysert ved blandet modell ANOVA, ved anvendelse av tank nested?? innen behandlingsgruppen som den tilfeldige effekt i modellen og Satterthwaite frihetsgrader. Signifikansetester for tilfeldig varians benevnelser ble utført ved anvendelse av covtest-valget.

Statistisk analyse ble utført ved anvendelse SAS version 8.2 (SAS Institute, Cary NC, USA) og StatXact 4.0.2 (Cytel Software Corporation, Cambridge MA, USA) for eksakte konfidensintervaller og eksakte tester for forskjeller i samlede proporsjoner for kumulativ mortalitet. Statistisk signifikans ble erklært for p<0,05.

RESULTATER

I verifiseringsenheten døde 2 fisk (av 13) fra den vaksinerte gruppe, og 4 fisk (av 20) fra kontrollgruppen to dager etter overføring til sjøvann, men ingen mortalitet forekom i forsøksenhetene.

Kun en fisk i den vaksinerte gruppe og en i PBS-kontrollgruppen døde i løpet av 21 dager etter vaksinering. Mortaliteten forekom 7 dager etter vaksinering og ingen adhesjoner ble observert i noen av fiskene.

Vaksinens effektivitet: siden tanken ikke ble funnet å være en signifikant effekt i modellen ble forskjeller i kumulativ mortalitetsprosent og tester for signifikans, inkludert for helhetlige mortalitets prosenter, mortalitet slått sammen for alle replikater (tanker).

Mortalitet på grunn av SRS begynte 9 dager etter utfordring i PBS-kontrollgruppen, og 15 dager etter utfordring i den vaksinerte gruppe (se Figur 1 nedenfor).

Forskjeller i kumulative mortalitetsprosenter mellom vaksine og den PBS-injiserte kontroll gruppe var statistisk signifikant ved 60 % mortalitetstidspunktet, og ved slutten av studien (p<0,0021).

Effektivitet ble definert som en sammenlignet reduksjon i spesifikk mortalitet på grunn av SRS i fisk gitt injiseringsvaksinering med SRS-vaksinen sammenlignet med ikke-vaksinerte kontrollgrupper. Relativ Prosent Overlevelse (R.P.S.) ble beregnet når den kumulative mortalitet i kontrollgruppen var >60 % (R.P.S. 60), og ved slutten av forsøket (R.P.S, slutt):

R. P. S. 60

SRS Diaqnostika: Det immunodiagnostiske kit SRS ELISA kommersialisert av BlOSChile Ingenieria Genetica S.A. ble anvendt for å vurdere nærvær av P. salmonis i nyrene av de utfordrede fiskene.

DISKUSJON

Ingen signifikante mortaliteter forekom i den vaksinerte gruppe i løpet av vaksinasjonsprosessen eller i de følgende 21 dager etter vaksinering. Vaksinerte fisk viste det samme nivå av mortalitet som PBS-kontrollgruppen. I tillegg ble det ikke observert adhesjoner. Disse resultater indikerer at SRS-vaksinen er sikker når den administreres ved injisering ved en dose lik 0,1 ml vaksine/fisk i atlantisk laks. Dataene frembrakt ved anvendelse av ELISA testkit (BlOSChile Ingenieria Genetica) må tolkes med en viss forsiktighet. Nesten 50 % av de vaksinerte mortaliteter undersøkt for P. salmonis med ELISA-kittene i nyre var positive for SRS, mens nesten 40 % var positive i kontrollmortalitetene. I begge grupper, vaksinerte fisker og kontrollfisker, var omtrent 10 % av prøvene forventet å være positive. Dette etterlater et gjenværende av mellom 40-50 % av mortaliteten, hvilket var negative for nærvær av P. salmonis i nyre. Det finnes intet bevis for noen som helst annen infeksjon i enhetene, hvilket ble bevist av de sentinele enheter. De negative nyrer kan være på grunn av flere faktorer, som for eksempel testens sensitivt, at nivået av nyreinfeksjon var nok til å drepe fisken, men ikke høyt nok til å påvises av testen, eller at det infeksiøse middel ble forringet i de frosne prøver og dermed var mindre lett å påvise.

Konklusjonen gitt at distribuering av positive, mistenkt positive, og negative tester er omtrent den samme i alle grupper av fisk i forsøket, og det faktum at verifiseringsenhetene ikke var påvirket, er at årsaken til mortalitet i forsøket er SRS. Dataene ble analysert på denne basis.

Vaksinering med SRS-vaksine forsinket forekomst av infeksjon av P. salmonis når sammenlignet med PBS-injisert fisk. Relativ Prosent Overlevelse i de vaksinerte fisk var 100 % når kontrollmortaliteten var >60 %, mens ved slutten av forsøket var R.P.S, for den vaksinerte gruppe 43,4 %. Resultatene indikerer at SRS var effektiv i å redusere mortalitet fra P. sa/mon/s-infeksjon når fisk ble vaksinert ved injisering med 0,1 ml vaksine/fisk.

EKSEMPEL 8

SIKKERHET OG EFFEKTIVITET AV SRS/ IPN VAKSINE I ATLANTISK LAKS

Oppsummering

Den samme studie som den brakt for dagen i Eksempel 7 ovenfor ble utført, foruten at vaksinen også inneholdt IPN-antigener.

Mortalitet ble registrert over 6 uker etter utfordring. Mortalitet i den utfordrede kontrollgruppe injisert med PBS var 93,8 %, mens i den vaksinerte fisken var mortalititene 65,2 %. Relativ Prosent Overlevelses- (RPS) verdier ble beregnet når kumulativ mortalitet i kontrollgruppen var >60 % (RPS 60), og ved slutten av forsøket (RPS slutt). Vaksinert fisk viste en RPS 60 lik 93,6 % og en RPS slutt lik 30,5 %.

SRS/IPN-vaksinen var sikker når den ble administrert ved en dose lik 0,1 ml vaksine/fisk ved injisering i atlantisk laks, og utviser høye effektivitetsnivåer når det gjelder å beskytte atlantisk laks mot eksperimentell infeksjon med Piscirickettsia salmonis.

Resultatene av denne studien viser at den kombinerte SRS og IPN-vaksine er sikker når den administreres ved injisering ved den anbefalte dose. Enn videre viste SRS/IPN-vaksinen seg å være effektiv mot eksperimentelle infeksjoner med Piscirickettsia salmonis.

Materialer og Metoder

Holdebetingelsene, atlantisk laks, akklimatisering, vaksineringsprosedyre, sikkerhetsvurdering, effektivitetsvurdering, eksperimentell utfordring, prøvetaking, og statistisk analyse var alle identiske med de beskrevet i Eksempel 7 ovenfor.

Vaksinen var olje-basert injiserbar SRS/IPN-vaksine av Eksempel 5 ovenfor, inneholdende IPN-antigener deponert henholdsvis som BCCM aksesjonsnummer IHEM 20069 og BCCM aksesjonsnummer IHEM 20071.

RESULTATER

I verifiseringsenhetendøde 3 fisk (av 13) fra den vaksinerte gruppe, og 4 fisk (av 20) fra kontrollgruppen to dager etter overføring til sjøvann, men ingen mortalitet forekom i forsøksenhetene.

SIKKERHET AV SRS/ IPN- VAKSINE

Ingen av fiskene i den vaksinerte gruppe, og kun en fisk i PBS-kontrollgruppen døde i løpet av 21 dager etter vaksinering. Mortaliteten i kontrollgruppen inntraff 7 dager etter vaksinering.

Effektivitet av SRS/ IPN- vaksinen: Siden tanken ikke ble funnet å være en signifikant effekt i modellen ble forskjeller i kumulativ mortalitetsprosent og tester for signifikans inkludert for helhetlige mortalitetsprosenter, mortalitet slått sammen for alle replikater (tanker).

Mortalitet på grunn av SRS begynte 9 dager etter utfordring i PBS kontrollgruppen, og 11 dager etter utfordring i den vaksinerte gruppe (se Figur 2 nedenfor).

Forskjeller i kumulative mortalitetsprosenter mellom vaksine og den PBS-injiserte kontrollgruppe var statistisk signifikant ved 60 % -mortalitetstidspunktet, og ved slutten av studien (p<0,0171).

Effektivitet ble definert som en sammenligning av reduksjon i spesifikk mortalitet på grunn av SRS i fisk gitt injeksjonsvaksinering med den kombinerte SRS/IPN-vaksine sammenlignet med ikke-vaksinerte kontrollgrupper. Relativ Prosent Overlevelse (R.P.S.) ble beregnet da den kumulative mortalitet i PBS-kontrollgruppen var >60 % (R.P.S. 60), og ved slutten av forsøket (R.P.S, slutt):

R. P. S. 60

DISKUSJON

Ingen mortaliteter forekom i den vaksinerte gruppen under vaksinasjonsprosessen eller i de følgende 21 dager etter vaksinering, hvilket indikerer at SRS/IPN-vaksinen i henhold til den foreliggende oppfinnelse er sikker når den administreres ved injisering med en dose av 0,1 ml vaksine/fisk i atlantisk laks.

Dataene frembrakt ved anvendelse av ELISA testkit (BlOSChile Ingenieria Genetica) må tolkes med en viss forskitighet. Nesten 50 % av de vaksinerte mortaliteter undersøkt for P. salmonis med ELISA-kittene i nyre var positive for SRS, mens nesten 40 % var positive i kontrollmortalitetene. I begge grupper, vaksinerte fisker og kontrollfisker, var omtrent 10 % av prøvene forventet å være positive. Dette etterlater et gjenværende av mellom 40-50 % av mortaliteten, hvilket var negative for nærvær av P. salmonis i nyre. Det finnes intet bevis for noen som helst annen infeksjon i enhetene, som bevist av de sentinele?? enheter. De negative nyrer kan være på grunn av flere faktorer, som for eksempel testens sensitivitet, at nivået av nyreinfeksjon var nok til å drepe fisken, men ikke høyt nok til å påvises av testen, eller at det infeksiøse middel ble forringet i de frosne prøver og var mindre lett å påvise.

Vaksinering med SRS/IPN-vaksinen forsinket litt forekomsten av infeksjon av P. salmonis relativt til PBS-injisert fisk. Relativ Prosent Overlevelse i de vaksinerte fisk var 93,6 % når mortalitet av PBS kontroll var >60 %, mens ved slutten av forsøket var R.P.S, for den vaksinerte gruppe 30,5 %. Resultatene indikerer at SRS/IPN-vaksinen var effektiv i å redusere mortalitet fra P. Sa/mon/s-infeksjon når fisk ble vaksinert ved injisering med 0,1 ml vaksine/fisk.

Claims

1. Isolert PsP4 5-protein som omfatter i det minste en av de følgende: (a) aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 4 som omfatteren konservativ aminosyresubstitusjon; og (b) aminosyresekvens som har i det minste 70 % identitet med aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID.NR.: 2 eller 4.

2. Rekombinant polypeptid omfattende aminosyresekvensen av PsP4 5-proteinet i følge krav 1.

3. Rekombinant polypeptid i følge krav 2 som er et kimerisk protein.

4. Antistoff reaktivt mot i det minste en av de følgende: (a) det isolerte<Ps>P45-protein i følge krav 1; (b) det rekombinante polypeptid i følge krav 2; og (c) det rekombinante polypeptid i følge krav 3.

5. Isolert eller rekombinant nukleinsyre som koder for i det minste en av de følgende: (a) det isolerte PsP4 5-protein i følge krav 1; (b) det rekombinante polypeptid i følge krav 2; og (c) det rekombinante polypeptid i følge krav 3.

6. Nukleinsyre i følge krav 5 omfattende en nukleotidsekvens valgt fra gruppen bestående av SEKV.ID.NR.: 1 og SEKV.ID.NR.: 3

7. Ekspresjonsvektor som omfatter nukleinsyren av hvilke som helst av kravene 5-6 og en transkripsjonen kontrollsekvens, hvor nukleinsyren er operativt tilknyttet transkripsjonen kontrollsekvens.

8. En vertscelle omfattende ekspresjonsvektoren i følge krav 7.

9. Fremgangsmåte for å fremstille et rekombinant polypeptid som omfatter å dyrke vertscellen i følge krav 8 i et kulturmedium,karakterisert vedat vertscellen uttrykker nukleinsyren som koder for det rekombinante polypeptid; og hvorved det rekombinante polypeptid dannes.

10. Fremgangsmåte i følge krav 9, hvor vertscellen er en E. Co//'-celle.

11. Fremgangsmåte for å fremstille et renset rekombinant polypeptid som omfatter å rense det rekombinante polypeptid produsert ved hjelp av fremgangsmåten i følge krav 10 fra kulturmediet.

12. Renset rekombinant polypeptid fremstilt ved fremgangsmåten i følge krav 11.

13. Rekombinant Yersinia ruckeri- ceWe som omfatter en nukleinsyre i henhold til hvilke som helst av kravene 5-6.

14. Yersinia ruckeri- ceWe som har BCCM deponeringsnummer LMG P-22044.

15. Yersinia ruckeri- ceWe som har BCCM deponeringsnummer LMG P-22511.

16. Vaksine som omfatter i det minste en av de følgende: (a) det rekombinante polypeptid i følge krav 2; og (b) det rekombinante polypeptid i følge krav 3.

17. Vaksine som omfatter nukleinsyren i henhold til hvilke som helst av kravene 5-6.

18. Vaksine som omfatter den rekombinante Yersinia ruckeri- ceWe i følge krav 13 eller 14.

19. Vaksine i følge krav 18,hvor nevnte rekombinante Yersinia ruckeri- ceWe er et bakterin.

20. Vaksine som omfatter den rekombinante Yersinia ruckeri- ceWe i følge krav 15 eller en rekombinant celle av Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Mohtella viscosus eller Photobacteria damsela omfattende en nukleinsyre ifølge et hvilket som helst av kravene 5-6.

21. Vaksine i følge krav 20, karakterisert vedat nevnte rekombinante celle er et bakterin.

22. Vaksine ifølge krav 21, som ytterligere omfatter en Yersinia ruckeri- ceWe som har BCCM depoonseringsnummer LMG P-22044, hvor nevnte andre Yersinia ruckeri- ceWe er et bakterin.

23. Vaksine ifølge hvilke som helst av kravene 16-22 som videre omfatter et antigen oppnådd fra et Infektsiøst Pankreatisk Nekrose (IPN)-virus.

24. Vaksine ifølge krav 23, hvor antigenet oppnådd fra IPN-viruset velges fra gruppen bestående av VP2 var-proteinet og VP3-proteinet.

25. Vaksine ifølge hvilke som helst av kravene 16-22 som ytterligere omfatter både VP2 var-proteinet og VP3-proteinet fra Infektsiøst Pankreatisk Nekrose (IPN)-virus.

26. Vaksine i følge krav 25, hvor VP2 var-proteinet er fremstilt fra en transformert Pichia pastoris- ceWe, BCCM deponeringsnummer IHEM 20069 og VP3-proteinet er fremstilt fra en transformert Pichia påstoris-celle, BCCM deponeringsnummer IHEM 20071.

27. Vaksine i følge krav 25, hvor VP2 var-proteinet er fremstilt fra en transformert Pichia pastoris- ceWe, BCCM deponeringsnummer IHEM 20070 og VP3-proteinet er fremstilt fra en transformert Pichia påstoris-celle, BCCM deponeringsnummer IHEM 20072.

28. Vaksine ifølge hvilke som helst av kravene 16-27 som videre omfatter et antigen oppnådd fra Aeromonas salmonicida.