PL184373B1

PL184373B1 - Izolowany polinukleotyd, sposób wytwarzania izolowanego polinukleotydu, zrekombinowana cząsteczka DNA i kompozycja farmaceutyczna zawierająca polinukleotyd

Info

Publication number: PL184373B1
Application number: PL96322363A
Authority: PL
Inventors: Bernard R. Brodeur; Denis Martin; Josee Hamel; Clement Rioux
Original assignee: Iaf Biochem Int
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 2002-10-31
Also published as: AP1027A; KR100361562B1; HUP9702387A3; AU4934396A; NO974264D0; EA199700248A1; EP2241625A1; SI9620035A; PL322363A1; CZ298646B6; JP4109939B2; BR9607651B1; SK125597A3; NO974264L; CA2215161A1; JP2007159583A; CA2215161C; WO1996029412A1; AU716225B2; HUP9702387A1

Abstract

1 . Izolowany polinukleotyd znamienny tym, ze polinukleotyd hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekw encja DNA kodujaca bialko powierzchniowe o m asie czasteczkowej 22 kD a z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodujacej bialko powierzch- niowe o masie czasteczkowej 22 kDa z Neisseria 39 Zrekombinowana czasteczka DNA, znam ienna tym, ze zawiera izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warun- kach z sekwencja DNA kodujaca bialko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodujacej bialko powierzchnio- we z Neisseria, o masie czasteczkowej 22 kDa i/lub odporne na protemaze K albo izolowany polinukleotyd zawierajacy zasady 200 do 664, SEQIDNO 1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO 1, albo sekwencje SEQ ID NO 1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO 3, albo zasa- dy 116 do 640 SEQ ID NO 3, albo sekwencje SEQ ID NO 3, albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO 5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO 5 albo sekwencje SE Q ID NO 5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO 7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO 7 albo sekwencje SEQ ID NO 7 i zawiera sekwencje kontrolujaca ekspresje funkcjonalnie polaczona polinukleotydem 46. Sposób wytwarzania polinukleotydu, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle jednokomórkowego gospodarza transformowa- nego zrekombinowana czasteczka DNA, która zawiera izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencja DNA kodujaca bialko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodujacej bialko powierzchniowe z Neisseria, o masie czasteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinaze K albo izolowany polinukleotyd zawierajacy zasady 200 do 664, SEQ ID NO. 1 albo zasady 143 d o 664SEQ ID NO 1, albo sekwencje SEQ ID NO 1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO 3, albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO. 3, albo sekwencje SEQ ID NO 3, albo zasady 265 do 729 SEQID NO 5 albo zasady 208 do 729 SE Q ID NO 5 albo sekwencje SEQ ID NO 5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO 7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO 7 albo sekwencje SEQ ID NO 7 1 zawiera sekwencje kontrolujaca ekspresje funkcjonalnie polaczona z polinukleotydem, i wyodrebnia sie ten polinukleotyd 74 Farmaceutyczna kompozycja korzystnie zawierajaca dopuszczalny farmaceutycznie nosnik, znam ienna tym , ze zawiera prze- ciwcialo lub fragment wiazacy antygen majacy specyficzne wiazanie z bedacym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleo- tyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencja DNA kodujaca bialko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodujacej bialko powierzchniowe z Neisseria, o masie czasteczkowej 22 kDa i/lub odporne na protemaze K albo polinukle- otyd zawierajacy zasady 200 do 664, SEQ ID NO 1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO 1 , albo sekwencje SE Q ID NO 1 , albo zasady 173 do640 SEQ ID NO 3, albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO 3 , albo sekwencje SEQ ID NO 3, albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO 5 albo za- sady 208 do 729 SEQ ID NO 5 albo sekwencje SEQ ID NO 5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO 7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO 7 albo sekwencje SEQ ID NO 7 PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowany polinukleotyd, sposób wytwarzania izolowanego polinukleotydu zrekombinowana cząsteczka DNA i kompozycja farmaceutyczna zawierająca polinukleotyd. Bardziej szczegółowo przedmiotem wynalazku jest wysoko konserwowany, immunologicznie dostępny antygen powierzchniowy Neisseria meningitidis o wyjątkowo korzystnych właściwościach. Ten unikalny antygen może być podstawą nowych immunoterapeutycznych, profilaktycznych i diagnostycznych środków użytecznych w leczeniu, zapobieganiu i diagnostyce schorzeń wywoływanych przez Neisseria meningitidis. Przedmiotem wynalazku są w szczególności sekwencje nukleotydowe kodujące odporne na proteinazę K białko powierzchniowe z Neisseria meningitidis o masie cząsteczkowej 22 kDa, (numery sekwencji 1 i 26), sposób rekombinacji DNA w celu otrzymania polipeptydu o masie cząsteczkowej 22 kDa, przeciwciała, które wiążą się z polipeptydu o masie cząsteczkowej 22 kDa, sposoby i środki umożliwiające diagnostykę, leczenie i zapobieganie chorobom wywoływanym przez Neisseria meningitidis.

Neisseria meningitidis jest częstą przyczyną śmiertelności i zachorowalności na całym świecie. Neisseria meningitidis wywołuje zarówno schorzenia endemiczne jak i epidemiczne,

184 373 głównie zapalenie opon mózgowych i posocznicę meningokokową (Gold, Evolution of meningococcal disease, str. 69, Vedros N.A., CRC Press (1987); Schwartz i wsp., Clin. Microbiol. Rev., 2, str. S118 (1989)). W rzeczywistości Neisseria jest jedną z najczęstszych przyczyn, po Haemophilus influenzae typu b, bakteryjnego zapalenia opon mózgowych w Stanach Zjednoczonych, wywołującym około 20% przypadków·'. Wykazano, że antybakteryjna aktywność osocza jest głównym mechanizmem obronnym przeciwko Neisseria meningitidis i że ochrona przed inwazją bakterii jest związana z obecnością w osoczu przeciwciał przeciwko bakterii ((Goidschneider i wsp., J. Exp. Med. 129, str 1307 (1969); Goidschneider i wsp. J.Exp. Med., 129, str 1327(1969)).

Neisseria meningitidis jest podzielona na grupy serologiczne stosownie do obecności antygenów otoczkowych. Do chwili obecnej poznano 12 grup serologicznych, lecz grupy A, B, C, Y i W-135 są najczęściej spotykane. W obrębie grup serologicznych można zidentyfikować serotypy, podtypy i immunotypy na podstawie białek i lipopolisacharydów błony komórkowej (Frasch i wsp., Rev. Infect. Dis. 7, str.504 (1985)).

Dostępne aktualnie szczepionki na bazie polisacharydów otoczki nie są skuteczne przeciwko wszystkim szczepom Neisseria meningitidis i nie są skuteczne w indukowaniu produkcji przeciwciał u niemowląt (Frasch, Clin. Microbiol. Rev. 2, str. S134 (1989);

Reingold i wsp.. Lancet, str. 114 (1985); Zollinger, Woodrow i Levine, New generation vaccines, str.325, Marcel Dekker Inc. N.Y. (1990)). Polisacharydy otoczkowe grup serologicznych A, C, Y i W-135 są aktualnie wykorzystywane w szczepionkach przeciwko drobnoustrojowi. Te szczepionki polisacharydowe są skuteczne w krótkim okresie czasu, a u osób szczepionych nie powstaje pamięć immunologiczna, tak więc muszą one być ponownie szczepione w ciągu 3 lat w celu podtrzymania poziomu odporności.

Wspomniane szczepionki polisacharydowe nie indukują odpowiedniego poziomu przeciwciał antybakteryjnych u dzieci poniżej 2 roku życia, które są głównymi ofiarami choroby. Obecnie nie ma skutecznej szczepionki przeciwko szczepom grupy serologicznej B pomimo, że drobnoustroje te są jedną z głównych przyczyn chorób wywoływanych przez meningokoki w krajach rozwiniętych. Polisacharydy grupy B nie są dobrym immunogenem wywołując jedynie słabą odpowiedź IgM o niskiej specyficzności, która ma słabe działanie ochronne (Gotschlich i wsp., J. Exp. Med., str. 129, 1349 (1969); Skevakis i wsp., J. Infect. Dis.,149, str. 387 (1984); Zollinger i wsp., J. Clin. Invest., 63, str. 836 (1979)). Obecność bardzo podobnych, krzyżowo reagujących struktur w glikoproteinach mózgu noworodków (Finne i wsp., Lancet, str. 355 (1983)) może zniechęcać do badań nad zwiększeniem immugenności polisacharydów grupy serologicznej B.

W celu uzyskania skuteczniejszej szczepionki badane są inne powierzchniowe antygeny, jak lipopolisacharydy, białka rzęskowe i białka obecne w błonie komórkowej. Wykazano wystąpienie odpowiedzi immunologicznej i obecność przeciwciał antybakteryjnych przeciwko niektórym z tych białkowych antygenów powierzchniowych w surowicach immunizowanych ochotników i ozdrowieńców (Mandreli i Zollinger, Infect. Immun., 57, str. 1590 (1989); Poolman i wsp., Infect. Immun., 40, str. 398 (1983); Rosenquist i wsp., J. Clin. Microbiol., 26, str. 1543 (1988); Wedege i Froholm, Infect. Immun. 51, str. 571 (1986); Wedege i Michaelsen, J. Clin. Microbiol., 25, str. 1349 (1987).

Wykazano, że monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko białkom błony komórkowej, jak przeciwciała klasy 1, 2/3 i 5 mają także właściwości antybakteryjne i działają ochronnie w eksperymentalnych infekcjach u zwierząt (Brodeur i wsp., Infec. Immun., 50, str. 510 (1985); Frasch i wsp., Clin. Invest. Med., 9, str. 101 (1986); Saukkonen i wsp. Microb. Pathogen., 3, str. 261 (1987); Saukkonen i wsp., Vaccine, 7, str, 325(1989).

Preparaty antygenowe na bazie białek błony komórkowej Neisseria meningitidis wykazywały działanie immunogenne u zwierząt i ludzi, i niektóre z nich testowano w badaniach klinicznych (Bjune i wsp., Lancet, str. 1093 (1991); Costa i wsp., NIPH Annals, 14, str.25 (1991); Frasch i wsp., Med. Trop., 43, str. 177 (1982); Frasch i wsp., Eur. J. Clin. Microbiol, 4, str. 533 (1985); Frasch i wsp., Robbins, Bacterial Vaccines, str. 262, Praeger Publications, N.Y.

184 373 (1987); Frasch i wsp., J. Infect. Dis., 158, str. 710 (1988); Moreno i wsp., Infec. Immun., 47, str. 527 (1985); Rosenquist i wsp. J. Clin. Microbiol., 26, str. 1543 (1988); Sierra i wsp., NIPH Annals, 14, str. 195 (1991); Wedege i Froholm, Infec. Immun., 51, str. 571 (1986); Wedege i Michaelsen, J. Clin. Microbiol., 25, str. 1349 (19870; Zollinger i wsp., J. Clin. Invest., 63, str. 836 (1979); Zollinger i wsp., NIPH Annals, l^t, str.211 (1991)). Jednakże duża zmienność białek błony komórkowej między poszczególnymi szczepami ogranicza ich przydatność w produkcji szczepionek (Frasch, Clin. Microb., Rev. 2, str.S134 (1989). Większość preparatów indukuje wytwarzanie antybakteryjnych przeciwciał wyłącznie w ograniczeniu do tego samego lub zbliżonego serotypu, z którego wyodrębniono antygen (Zollinger, Woodrow i Levine, New Generation Vaccines, str. 325, Marcel Dekker Inc. N.Y. (1990)). Ochronna rola tych szczepionek u małych dzieci nie jest jeszcze dobrze poznana. Wysoko konserwowane białka błony komórkowej Neisseria meningitidis, podobnie jak białka należące do klasy 4 (Munkley i wsp. Microb. Pathogen., 11, str. 447 (1991) i białko graniczne (nazywane także H.8) (Woods i wsp., Infect. Immun. 55, str. 1927 (1987) nie są odpowiednimi preparatami do produkcji szczepionek, ponieważ nie wywołują wytwarzania przeciwciał antybakteryjnych. Warunkiem ulepszenia tych szczepionek o szerokim spektrum działania jest wykorzystanie zakonserwowanych białek obecnych na powierzchni wszystkich szczepów Neisseria meningitidis zdolnych do indukowania produkcji antybakteryjnych przeciwciał.

Aktualna diagnostyka różnicowa Neisseria meningitidis jest zazwyczaj wykonywana metodą barwienia wymazów metodą Grama, aglutynacji i koaglutynacji lateksowej oraz izolacji i hodowli na wzbogaconych i selektywnych podłożach (Morello i wsp., Ballows, Manual of Clinical Microbiology, str. 258, American Society for Microbiology, Washington (1991)). Testy degradacji węglowodanów są zazwyczaj wykonywane w celu potwierdzenia identyfikacji kultur Neisseria meningitidis. Większość opisanych procedur jest czasochłonna i wymaga wykwalifikowanego personelu. W celu szybkiej identyfikacji Neisseria meningitidis używa się gotowych zestawów do aglutynacji i koaglutynacji zawierających poliwalentne surowice przeciwko antygenom otoczkowym obecnym u najczęściej występujących grup serologicznych. Jednakże te poliwalentne surowice często w sposób niespecyficzny reagują krzyżowo z innymi gatunkami bakterii i dlatego powinny być stosowane obok barwienia metodą Grama i hodowli na pożywkach. Jednocześnie istnieje zapotrzebowanie na skuteczne alternatywne metody diagnostyczne, które mogą przyspieszyć prawidłową diagnozę.

Wynalazek rozwiązuje opisane problemy dzięki wysoko konserwowanemu, immunologicznie dostępnemu antygenowi z powierzchni Neisseria meningitidis.

W czasie badań nad ultrastrukturą błony komórkowej Neisserii meningitidis zidentyfikowano nowe niskocząsteczkowe białko (22 kilodaltony) o unikalnych właściwościach. To białko błony komórkowej jest wyjątkowo odporne na stosowanie enzymów proteolitycznych, jak proteinaza K, proteaza otrzymywana z Tritirachium album. Jest to bardzo zastanawiające, ponieważ białka odporne na proteinazę K bardzo rzadko spotyka się w naturze z powodu wysokiej aktywności, szerokiego optimum pH i niskiej specyficzności wiązania z białkami tego enzymu (Barrett, A.J. i N.D. Rawlings, Biochem. Soc. Transactions (1991), 19, 707-715). Niewiele doniesień opisuje białka pochodzenia prokariotycznego odpornego na enzymatyczną, degradację przez proteinazę K. Białka odporne na proteinazę K zlokalizowano w bakteriach Leptospira species (Nicholson, V.M. i J.F.Prescott, Veterinary Microbiol. (1993), 36: 123-138), Mycoplasma species (Butler, G.H. i wsp. Infec. Immun. (1991) 59:1037-1042), Spiroplasma mirum (Bastian, F.O. i wsp., J. Clin. Microbiol. (1987) 25:2430-2431), w wirusach i prionach (Onodera, T i wsp. Microbiol. Immunol. (1993) 37:311-316, Prusiner, S.B. i wsp. Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1993) 90:2793-2797).

Poniżej opisujemy zastosowanie tego białka w zapobieganiu, leczeniu i diagnostyce infekcji wywołanych przez Neisseria meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd o masie 22 kDa z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd o masie 22 kDa z Neisseria.

184 373

Inna odmiana wynalazku obejmuje izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DnA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, które jest odporne na proteinazę K i ma masę cząsteczkową 22 kDa.

Korzystnie polinukleotydy opisane powyżej hybrydyzują z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd, zawierającą zasady od 200 do 664 albo zasady od 143 do 664 sekwencji SEQ ID NO:1 korzystniej sekwencję SEQ ID NO:1; albo zasady od 173 do 640, korzystniej zasady od 116 do 640 sekwencji SEQ ID NO:3, albo sekwencję SEQ ID NO:3, albo zasady od 265 do 729, korzystniej zasady od 208 do 729 sekwencji SEQ ID NO:5, jeszcze korzystniej komplementarny DNA zawiera sekwencję SEQ ID NO:5, albo zasady od 298 do 762, korzystniej zasady od 241 do 762 sekwencji SEQ ID NO:7, jeszcze korzystniej sekwencję SEQ ID NO:7; albo zasady od 200 do 664 sekwencji SEQ ID NO:1, korzystniej zasady od 143 do 664 sekwencji SEQ ID NO:l jeszcze korzystniej sekwencję SEQ ID NO:1; albo zasady od 173 do 640 sekwencji SEQ ID NO:3, korzystniej zasady od 116 do 640 sekwencji SEQ ID NO:3 jeszcze korzystniej sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady od 265 do 729 lub zasady od 208 do 729 sekwencji SEQ ID NO:5, korzystnie komplementarny DNA zawiera sekwencję SEQ ID NO:5; albo zasady od 298 do 762 lub zasady od 241 do 762 sekwencji SEQ ID NO:7, korzystnie sekwencję SEQ ID NO:7.

Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 lub 143 do 664 SEQ ID NO:1 lub zawierający sekwencję SEQ ID NO:1 zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3 lub 116 do 640 SEQ ID NO:3 lub sekwencję SEQ ID NO:3 lub zawierający zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 lub 208 do 729 SEQ ID NO:5 lub zawierający sekwencję SEQ ID NO:5 lub zawierający zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 lub 241 do 762 SEQ ID NO:7 lub zawierający sekwencję SEQ ID NO:7.

Innym przedmiotem wynalazku jest zrekombinowana cząsteczka DNA, zawierająca izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K, albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ iD NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7 i zawiera sekwencję kontrolującą ekspresję funkcjonalnie połączoną z polinukleotydem. Korzystnie sekwencja kontrolująca ekspresję w zrekombinowanej cząsteczce DNA jest indukowalną sekwencją kontrolującą ekspresję, która może być wybrana z grupy sekwencji indukowanych termicznie, laktozą i IPTG, korzystniej może być wybrana z grupy zawierającej promotory X PL, X PR, TAC, T7, T3, LAC i TRP. W korzystnym rozwiązaniu zrekombinowana cząsteczka DNA jest pNP2204.

Wynalazek obejmuje również jednokomórkowego gospodarza transformowanego zrekombinowaną cząsteczką DNA, zawierającą izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria,, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ Id NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ iD NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID Νθ:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7 i zawiera sekwencję kontrolującą ekspresję funkcjonalnie połączoną z polinukleotydem. Jednokomórkowy gospodarz może być wybrany z grupy obejmującej: szczepy E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli DH5oF'IQ, E. coli W3110, E. coli JM105, E. coli BL21, E . coli TOPP1, E. coli TOPP2, E. coli TOPP3.

184 373

Inna odmiana wynalazku dotyczy sposobu wytwarzania polinukleotydu, w którym prowadzi się hodowlę jednokomórkowego gospodarza transformowanego zrekombinowaną cząsteczką DNA, zawierającą izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K, albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7 i sekwencję kontrolującą ekspresję funkcjonalnie połączoną z polinukleotydem, po czym wyodrębnia się ten polinukleotyd.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest izolowany polipeptyd kodowany przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID nO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, przy czym polipeptyd jest antygenem. Korzystnie izolowany polipeptyd zawiera sekwencję wybraną z SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 i SeQ ID NO:8, korzystniej bez peptydu sygnałowego, lub polipeptyd zawiera aminokwasy od 31 do 55 albo od 51 do 86 albo od 110 do 140 albo od 1do 155 z SeQ ID NO:2.

W innym rozwiązaniu izolowany polipeptyd może zawierać sekwencję wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26.

Izolowany polipeptyd korzystnie jest w czystej postaci i jest otrzymywany z hodowli gospodarza jednokomórkowego transformowanego zrekombinowaną cząsteczką DNA, zawierającą izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7 i zawierającą sekwencję kontrolującą ekspresję funkcjonalnie połączoną z polinukleotydem.

Wynalazek obejmuje sposób otrzymywania polipeptydu, w którym wyodrębnia się hodowlę bakterii Neisseria meningitidis, następnie oddziela się z hodowli bakterii frakcję błon zewnętrznych i z frakcji błon zewnętrznych izoluje się antygen. Korzystnie w sposobie według wynalazku frakcje zewnętrznych błon poddaje się działaniu proteinazy K.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest farmaceutyczna kompozycja lub szczepionka korzystnie zawierająca dopuszczalny farmaceutycznie nośnik zawierająca będący antygenem, polipeptyd kodowany przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID

184 373

NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID No:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID No:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.

Inna odmiana wynalazku obejmuje sposób wytwarzania szczepionki do zapobiegania zakażeniu Neisseria u ludzi, w którym miesza się będący antygenem polipeptyd kodowany przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną, sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseeia, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:l, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, z farmaceutycznie dopuszczalnym rozpuszczalnikiem, zaróbką lub adjuwantem. Korzystnie stosuje się izolowany polipeptyd z Neisseria o masie cząsteczkowej 22 kDa, korzystniej z Neisseria meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało lub fragment wiążący antygen które ma specyficzne wiązanie z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwenqą DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7. Polipeptydem może być izolowany polipeptyd z Neisseria o masie cząsteczkowej 22 kDa, korzystniej z Neisseria meningitidis. Korzystnie, przeciwciało lub fragment jest przeciwciałem monoklonalnym, pochodzącym od myszy, izotypem IgG lub jest Me-1 lub Me-7.

Inna odmiana wynalazku obejmuje sposób otrzymywania przeccwciał lub fragmentu wiążącego antygen w którym wprowadza się preparat z Neisseria meningitidis do ssaka i wyodrębnia się surowicę ssaka zawierającą przeciwciała specyficznie wiążące się z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekw^j DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ iD NO:1; albo sekwencję SeQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7. Korzystnie organizmem Neisseria jest Neisseria meningitidis.

W innym rozwiązaniu sposobu otrzymywania przeccwciał monoklonalnych wprowadza się preparat z Neisseria do komórek ssaka produkujących przeciwciała i prowadzi się fuzję tych komórek z komórkami szpiczaka tworząc komórki hybrydomy i wyodrębnia się z komórek hybrydomy monoklonalne przeciwciała specę-licznie wiążące się z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją, DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3;

184 373 albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7. Korzystnie organizmem Neisseria jest Neisseria meningitidis.

Wynalazek obejmuje równieZ farmaceutyczną kompozycję korzystnie zawierającą dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, zawierającą przeciwciało lub fragment wiąZący antygen specyficznie wiąZący się z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:l; albo sekwencję SEQ iD NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ iD NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera przeciwciała Me-1 lub Me-7.

Przedmiotem wynalazku jest równieZ szczepionka, która zawiera przeciwciało lub fragment wiązący antygen specyficznie wiąZący się z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, sEq ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.

Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania zakaZeniu Neisseria u ludzi, w którym miesza się razem będący antygenem polipeptyd kodowany przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:l; albo sekwencję SEQ iD NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, z farmaceutycznie dopuszczalnym rozpuszczalnikiem lub zaróbką. Korzystnie polipeptydem jest izolowany polipeptyd z Neisseria o masie cząsteczkowej 22 kDa, korzystniej z Neisseria meningitidis.

Sposób wykrywania antygenu Neisseria w uzyskanych od pacjenta próbkach biologicznych, w którym inkubuje się przeciwciała specyficznie wiąZące się z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ iD NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID No:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID No:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, z próbkami biologicznymi i wykrywa się przeciwciało specyficznie związane z antygenem. Patogenem moZe być Neisseria meningitidis, a przeciwciałem moZe być Me-1 lub Me-7.

184 373

Sposób wykiywania antygenu Neisseria w uzyskanych od pacjenta próbkach biologicznych, w którym inkubuje się przeciwciała specyficznie wiążące się z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO: 1 albo zasady 143 do 664 SEQ iD NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7; z próbkami biologicznymi, a następnie wykrywa się przeciwciało specyficznie związane z antygenem. Korzystnie przeciwciałem jest przeciwciało Neisseria meningitidis lub izolowany polipeptyd z Neisseria meningitidis o masie cząsteczkowej 22 kDa.

Sposób wykrywania patogenu Neisseria u pacjenta, w którym znakuje się przeciwciało specyficznie wiążące się z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją. DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ iD NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, umożliwiając jego wykrywanie; podaje się znakowane przeciwciało pacjentowi i wykrywa się znakowane przeciwciało specyficznie związane z patogenem. Patogenem może być Neisseria meningitidis.

Zestaw do wykrywania lub diagnozy Neisseria meningitidis u ludzi, zawierający polipeptyd kodowany przez będący antygenem polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ iD NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.

Sposób wykrywania bakterii Neisseria w uzyskanych od pacjenta próbkach biologicznych, w którym inkubuje się tę próbkę z sondą DNA, która może hybrydyzować w surowych warunkach z polinukleotydem, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ iD NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ iD NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, kodującym izolowany polipeptyd z Neisseria i wykrywa się hybrydyzację sondy DNA z polinukleotydem. Korzystnie sonda DNA zawiera polinukleotyd, który hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej izolowany polipeptyd, zawierającym sekwencję SEQ ID NO:1 albo sekwencję SEQ ID NO:3 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:7.

W innym rozwiązaniu jako sondę DNA stosuje się oligomer o sekwencji komplementarnej do przynajmniej 6 sąsiadujących nukleotydów jednego z polinukleotydów, które hybrydyzują w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie

184 373 cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotydów zawierających zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO: 7 albo sekwencję SEQ ID NO: 7.

Korzystnie w sposobie według wynalazku prowadzi się ampifikację w reakcji łańcuchowej polimerazy docelowej sekwencji z użyciem zestawu oligomerów o sekwencji komplementarnej do przynajmniej 6 sąsiadujących nukleotydów jednego z polinukleotydów, które hybrydyzują w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria lub z komplementarną sekwencją DNA kodującą izolowany polipeptyd z Neisseria, o masie czząsteczkowej 22 kDa iill^db odporne na proteinazę K albo p(dii^i^l^lt^(Ht^y^kv^v rających zasady 200 do 664, SEQ ID nO:1 albo zasady 143 do 664 SeQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ iD NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7 i flankujących docelową sekwencję DNA.

Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydów i uzyskanych kwasów nukleinowych. Symbole trzyliterowe są używane do oznaczania reszt aminokwasowych. Struktura rozpoczyna się od kodonu w pozycji 143 i kończy na kodonie w pozycji 667, ramka oznacza przypuszczalne miejsce wiązania na rybosomie, podczas gdy sekwencja przypuszczalnego promotora 10 jest podkreślona. 19-aminikwasowe białko sygnałowe jest również podkreślone; fig. 2 jest fotografią żelu 14% SDS-PAGE barwionego barwnikiem Coomassie Blue przedstawiającą wytrawione a-chymotrypsyną i trypsyną preparaty błony komórkowej szczepu Neisseria meningitidis 608B (B:2a:pl.2). Pozycja 1 zawiera następujące wzorce masy cząsteczkowej: fosforylazę b (97,400), albuminę surowicy bydlęcej (66,200), albuminę jajka (45,000), anhydrazę węglową (31,000), inhibitor trypsyny sojowej (21,500) i lizozym (14,400). Pozycja 2 zawiera nietrawione preparaty kontrolne z błony komórkowej. Pozycja 3 zawiera preparaty potraktowane a-chymotrypsyną (2 mg enzymu na mg białka); pozycja 4 zawiera preparaty potraktowane trypsyną; fig. 3a jest fotografią żelu 14% SDS-PAGE barwionego barwnikiem Coomassie Blue przedstawiającą preparaty z błony komórkowej szczepu Neisseria meningitidis 608B trawiony proteinaząK (B:2a:pl.2). Pozycje 1, 3, 5 i 7 zawierają wytrawione preparaty kontrolne. Pozycje 2, 4, 6 i 8 zawierają preparaty z błony komórkowej wytrawione proteinaza K (2 j.m. na mg białka). Pozycje 1 do 4 zawierają preparaty przygotowane przy pH=7,2. Pozycje 5 do 8 zawierają preparaty przygotowane przy pH=9,0. Pozycje 1, 2, 5 i 6 zawierają preparaty przygotowane bez SDS. Pozycje 3, 4, 7 i 8 zawierają preparaty przygotowane w obecności SDS. Wzorce masy cząsteczkowej są uwidocznione po lewej stronie (w kilodaltonach); fig. 3b jest fotografią żelu 14% SDS-PAGE barwionego barwnikiem Coomassie Blue przedstawiającą profile migracji oczyszczonego białka rekombinowanego 22 kDa. Pozycja 1 zawiera wzorce masy cząsteczkowej: fosforylazę b (97,400), albuminę surowicy bydlęcej (66,200), albuminę jajka (45,000), anhydrazę węglową (31,000), inhibitor trypsyny sojowej (21,500) i lizozym (14,400). Pozycja 2 zawiera 5 mg kontrolnego oczyszczonego rekombinowanego białka 22 kDa. Pozycja 3 zawiera 5 mg oczyszczonego rekombinowanego białka 22 kDa ogrzewanego w 100°C przez 5 minut. Pozycja 4 zawiera 5 mg oczyszczonego białka rekombinowanego 22 kDa ogrzewanego w 100°C przez 10 minut. Pozycja 5 zawiera 5 mg oczyszczonego białka rekombinowanego 22 kDa ogrzewanego w 100°C przez 15 minut; fig. 4 jest fotografią żelu 14% SDS-PAGE barwionego barwnikiem Coomassie Blue i odpowiadających mu precypitatów (immunobloty Westerna) będących wynikiem reakcji monoklonalnych przeciwciał specyficznych dla białka powierzchniowego Neisseria meningitidis 22 kDa. Preparaty z błony komórkowej Neisseria meningitidis szczep 608B (B:2a:pl.2): (A) nie traktowany preparatami, (B) traktowany proteinaząK

184 373 (2 j.m. ma mg białka). Pozycja 1 zawiera wzorce masy cząsteczkowej i charakterystyczny profil migracji preparatów z błony komórkowej na żelu 14% SDS-PAGE. Pozycja 2 zawiera Me-2, pozycja 3 zawiera Me-3, pozycja 4 zawiera Me-5, pozycja 5 zawiera Me-7 i pozycja 6 zawiera niezwiązane kontrolne przeciwciało monoklonalne. Wzorcami masy cząsteczkowej są: fosforylaza b (97,400), albumina surowicy bydlęcej (66,200), albumina jaja kurzego (45,000), anhydraza węglowa (31,000), inhibitor trypsyny sojowej (21,500) i lizozym (14.400) . Rezultaty strącania pokazane na rysunku 4 dla Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 i Me-7 są zgodne z rezultatami precypitacji dla Me-1; fig. 5 przedstawia graficznie aktywność wiązania przeciwciał monoklonalnych z nieuszkodzonymi komórkami bakteryjnymi. Wyniki wiązania reprezentatywnych przeciwciał monoklonalnych Me-5 i Me-7 są przedstawione w zliczeniach na minutę (CPM) na osi pionowej. Jako kontroli negatywnej użyto przeciwciała monoklonalnego Haemophilus influenzae. Wartości wyjściowe poniżej 500 CPM zostały zanotowane i odjęte od wartości wiązania; fig. 6 jest fotografią żelu 14% SDS-PAGE zabarwionego barwnikiem Coomassie Blue i azotanem srebra. Pozycja 1 zawiera następujące wzorce masy cząsteczkowej: fosforylazę b (97,400), albuminę surowicy bydlęcej (66,200), albuminę jaja kurzego (45,000), anhydrazę węglową (31,000), inhibitor trypsyny sojowej (21,500) i lizozym (14.400) . Pozycja 2 zawiera preparat z błony komórkowej otrzymany z Neisseria meningitidis szczep 608B (serotyp B:2a:pl.2) (10 mg). Pozycja 3 zawiera stężony supernatant kultury Escherichia coli BL 21(DE3) (10 mg). Pozycja 4 zawiera oczyszczone rekombinowane białko powierzchniowe z Neisseria meningitidis 22 kDa (1 mg); fig. 6(B) jest fotografią żelu 14% SDS-PAGE barwionego barwnikiem Coomassie Blue zawierającego rekombinowane białko powierzchniowe z Neisseria meningitidis wytrawione a-chymotrypsyną, trypsyną i proteinazą K. Pozycja 1 zawiera następujące wzorce masy cząsteczkowej: fosforylazę b (97,400), albuminę osocza bydlęcego (66,200), albuminę jaja kurzego (45,000), anhydrazę węglową (31.000), inhibitor trypsyny sojowej (21,500) i lizozym (14,400). Pozycje 2 do 5 zawierają oczyszczone rekombinowane białko powierzchniowe z Neisseria meningitidis 22 kDa (2 mg). Pozycje 7 do 10 zawierają albuminę osocza bydlęcego (2 mg). Pozycje 2 i 7 zawierają nietrawione białko („NT”). Pozycje 3 i 8 zawierają białko potraktowane a-chymotrypsyną („C”) (2 mg enzymu na mg białka). Pozycje 4 i 9 zawierają białko potraktowane trypsyną („T”) (2 mg enzymu na mg białka). Pozycje 5 i 10 zawierają, białko potraktowane proteinazą K („K”) (2 j.m. na mg białka); fig. 6 (C) jest fotografią precypitacji (Western immunoblotting) w duplikacie żelu przy użyciu monoklonalnego przeciwciała Me-5; fig. 7 przedstawia graficznie antybakteryjną aktywność monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko Neisseria meningitidis oczyszczonych z białka A przeciwko Neisseria meningitidis szczep 608B (B:2a:pl.2). Oś pionowa rysunku ukazuje procent bakterii Neisseria meningitidis, które przeżyły ekspozycję różnorodnych stężeń przeciwciał monoklonalnych (ukazanych na osi poziomej rysunku); fig. 8 ukazuje sekwencję nukleotydów i otrzymanych aminokwasów białka powierzchniowego z Neisseria meningitidis szczepu MCH88 22 kDa (numer sekwencji 3 i 4). Symbole trzyliterowe są używane do oznaczenia reszt aminokwasowych. Struktura zaczyna się od kodonu w pozycji 116 i kończy w kodonie w pozycji 643; fig. 9 ukazuje sekwencję nukleotydów i otrzymanych kwasów nukleinowych białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis szczep Z4063 (numer sekwencji 5 i 6). Symbole trzyliterowe użyto dla oznaczenia reszt aminokwasowych. Struktura zaczyna się od kodonu w pozycji 208 i kończy w kodonie w pozycji 732; fig. 10 ukazuje sekwencje nukleotydów i otrzymanych kwasów nukleinowych białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria gonorrhoeae szczep b2 (numer sekwencji 7 i 8). Symbole trzyliterowe użyto do oznaczania reszt aminokwasowych. Struktura zaczyna się od kodonu w pozycji 241 i kończy w kodonie w pozycji 765; fig. 11 ukazuje konsensus sekwencji ustalonej na podstawie sekwencji DNA 4 szczepów Neisseria i wskazuje na zastąpienie lub uzupełnienie nukleotydów specyficzne dla każdego szczepu; fig. 12 ukazuje konsensus sekwencji ustalonej na podstawie sekwencji białek 4 szczepów Neisseria i wskazuje na zastąpienia lub uzupełnienia reszt aminokwasowych specyficznych dla każdego szczepu; fig. 13 ukazuje czas odpowiedzi immunologicznej na rekombinowane białko 22 kDa u królików wyrażony jako

184 373 miana wzajemne w teście ELISA. Królikom wstrzyknięto preparaty błony komórkowej E. coli szczep JM109 z plazmidem pN2202 lub z plazmidem kontrolnym pWKS30. Rozwój specyficznej odpowiedzi humoralnej był analizowany testem ELISA przy użyciu preparatów z błony komórkowej otrzymanej z Neisseria meningitidis szczep 608B (B:2a:pl.2) jako antygenem pokrywającym; fig. 14 przedstawia czas odpowiedzi immunologicznej na białko 22 kDa u małp Macaca fascicularis (cynomolgus) wyrażony jako miana wzajemne w teście ELISA. Dwie małpy były immunizowane oczyszczonym białkiem 22 kDa w ilości 100 mg (K28) i 200 mg (1276) przez wstrzyknięcie. Małpa kontrolna (K65) była immunizowana 150 mg niezwiązanego rekombinowanego białka według tej samej procedury'. Rozwój specyficznej odpowiedzi humoralnej był analizowany przy użyciu testu ELISA za pomocą preparatów błony komórkowej otrzymanych z Neisseria meningitidis szczep 608B (B:2a:P1.2) wykorzystanych jako antygen kryjący; fig. 15 jest graficznym przedstawieniem syntetycznych białek według wynalazku oraz ich pozycji w pełnym białku 22 kDa ze szczepu Neisseria meningitidis 608B (B:2a:Pl:2); fig. 16 jest mapą plazmidu pNP2204 zawierającego gen kodujący białko powierzchniowe 22 kDa Neisseria meningitidis 22 kDa, Ampi^p, obszar kodujący oporność na ampicylinę, ColEl, początek replikacji, cI857, wrażliwy na temperaturę gen represyjny bakteriofaga X cI857, X PL, promotor transkrypcji bakteriofaga X, terminator transkrypcji Tl. Kierunek transkrypcji wskazują strzałki. Bglll i BamHl są obszarami restrykcyjnymi używanymi do umieszczania genu 22 kDa w plazmidzie p629.

Termin „wysoko konserwowane” oznacza tutaj, że gen białka powierzchniowego Neisseria meningitidis i samo białko występuje u więcej niż 50% znanych szczepów Neisseria meningitidis. Korzystnie, gen i jego białko występują u więcej niż 99% znanych szczepów Neisseria meningitidis. Przykłady II i IV ilustrują sposoby, dzięki którym osoba biegła w sztuce może przetestować wiele różnorodnych białek powierzchniowych Neisseria meningitidis w celu sprawdzenia, czy są one „wysoko konserwowane”.

„Immunologicznie dostępne” oznacza tutaj, że białko powierzchniowe Neisseria meningitidis jest obecne na powierzchni drobnoustroju i jest dostępne dla przeciwciał. Przykład II ilustruje metody, dzięki którym osoba biegła w sztuce może przetestować wiele różnorodnych białek powierzchniowych w celu sprawdzenia, czy są one „immunologicznie dostępne”. Dostępność immunologiczną można stwierdzić za pomocą innych sposobów: testem aglutynacji, testem ELISA, RIA, testem precypitacji, testem dotenzyme, testem dostępności powierzchniowej, mikroskopią elektronową lub za pomocą kombinacji tych sposobów.

Fragmenty białka powierzchniowego Neisseria meningitidis oznaczają tutaj polipeptydy posiadające przynajmniej jeden peptydowy epitop lub jego analogi lub pochodne. Białka tego typu można otrzymać metodami biologii molekularnej lub za pomocą syntezy przy użyciu metod ciekłej lub stałej fazy peptydowej.

Przedmiotem wynalazku są także formy polimeryczne białek powierzchniowych Neisseria meningitidis, fragmenty, analogi i pochodne. Do tych form polimerycznych należy, na przykład, jeden lub więcej polipeptydów, które były traktowane substancjami takimi jak: awidyna/biotyna, aldehyd glutarowy lub dwumetylosuberimidan. Do tych form polimerycznych należą także polipeptydy z Neisseria meningitidis zawierające sekwencje wyprodukowane z multicistronicznych mRNA otrzymanych dzięki technologii rekombinacji DNA.

„W czystej postaci” oznacza tutaj, że izolowany polipeptyd według wynalazku nie zawiera domieszek innych białek pochodzących od Neisseria meningitidis. Izolowany polipeptyd w czystej postaci może być otrzymany za pomocą wielu konwencjonalnych metod, na przykład za pomocą metody opisanej w przykładach III i XI.

Jest oczywiste, że jakiekolwiek odwołanie się do białka 22 kDa z Neisseria meningitidis także dotyczy białek wyizolowanych (lub wytworzonych za pomocą genów) innych gatunków Neisseriacae, jak Neisseria gonorrhoeae lub Neisseria iactamica.

Białko powierzchniowe 22 kDa z Neisseria meningitidis według wynalazku może być dalej charakteryzowane przez jedną lub więcej następujących cech:

(1) posiada pr/.ybliżrną masę cma^tęcczostą zk k.Da jak wykazano az pomocą żelu SDS-PAGE;

184 373 (2) jego ruchliwość elektroforetyczna w żelu SDS-PAGE nie jest modyfikowana za pomocą środków redukcyjnych;

(3) ma punkt izoelektryczny (pi) w granicach pi 8 do pi 10;

(4) jest w wysokim stopniu odporne na degradację za pomocą enzymów proteolitycznych, jak a-chymotrypsyna, trypsyna i proteinaza K;

(5) proces utleniania nie znosi specyficznego łączenia przeciwciał skierowanych przeciwko białku powierzchniowemu 22 kDa z Neisseria meningitidis;

(6) jest wysoko konserwowanym antygenem;

(7) jest dostępne dla przeciwciał na powierzchni nieuszkodzonych komórek Neisseria meningitidis, (8) może stymulować produkcję antybakteryjnych przeciwciał;

(9) może stymulować produkcję przeciwciał, które chronią przed infekcjami eksperymentalnymi;

(10) może stymulować, po wstrzylotięciu zwierzęciu doświadczaldcmu, rozwój odpowiedzi immunologicznej, która chroni przed zakażeniami Neisseria meningitidis.

Korzystnie, alternatywną metodą produkcji prlipeptydu według wynalazku są techniki biologii molekularnej, jak szczegółowo opisano w przykładzie III. Użycie metod biologii molekularnej jest szczególnie odpowiednie dla uzyskania czystego rekombinowanego białka powieręohniowrgr 22 kDa z Neisseria meningitidis.

Warunki hybrydyzacji analogów i pochodnych genu według wynalazku z Neisseria meningitidis do genu kodującego izolowany polipeptyd 22 kDa opisano w przykładzie IV.

Zgodnie z wynalazkiem, fragmenty, analogi i pochodne polipeptydu o masie cząst. 22 kDa z Neisseria meningitidis wykazują „aktywność immunologiczną” izolowanego polipeptydu 22 kDa z Neisseria meningitidis, jeżeli mogą stymulować, po wstrzyknięciu zwierzęciu doświadczalnemu, rozwój odpowiedzi immunologicznej, która chroni przed zakażeniem Neisseria meningitidis. Osoba biegła w sztuce może stwierdzić, czy odpowiednia sekwencja DNA koduje produkt, który wykazuje aktywność immunologiczną izolowanego prlipeptydu 22 kDa z Neisseria meningitidis stosując sposób opisany w przykładzie VI.

Korzystnie, alternatywną metodą produkcji izolowanego polipeptydu według wynalazku są techniki biologii molekularnej, jak szczegółowo opisano w przykładzie III. Użycie metod biologii molekularnej jest szczególnie odpowiednie do uzyskania czystego rekomUnowanego peptydu o masie cząsteczkowej 22 kDa z Neisseria meningitidis.

Jak wiadomo, w celu osiągnięcia wysokiego poziomu ekspresji transferowanego genu u gospodarza, gen musi być operacyjnie związany z sekwencjami kontroli transkrypcji i translacji, które są funkcjonalne w komórce gospodarza. Korzystnie, sekwencje kontroli ekspresji i gen będący przedmiotem zainteresowania, będą zawarte w wektorze ekspresji, który zawiera również bakteryjny marker selekcyjny i początek replikacji. Jeżeli gospodarzem jest komórka eukariotyczna, wektor ekspresji powinien składać się z markera ekspresji użytecznego dla gospodarza. Szeroka gama kombinacji gospodarz/wektor może być wykorzystana do ekspresji sekwencji DNA według wynalazku. Użytecznymi wektorami ekspresji dla gospodarzy eukariotycznych są np.: wektory zawierające sekwencje kontrolne z SV40, bydlęcy wirus papilloma, adenowirus i cytowegalowirus. Użytecznymi wektorami ekspresji dla gospodarzy bakteryjnych są znane plazmidy bakteryjne, jak np. plazmidy z E. coli, włącznie z col El, pCRl, pBR322, pMB9 i ich pochodne, plazmidy o większej liczbie gospodarzy, jak RP4, fag DNA, np. wiele pochodnych faga lambda, np. NM989 i inne fagi DNA, jak M13 i filamentowane fagi pojedynczej nici DNA. Użytecznymi wektorami ekspresji dla komórek drożdży jest 2 mu i jego pochodne. Użytecznym wektorem dla komórek owadów jest pVL 941.

Ponadto, dowolna znana sekwencja kontrolująca ekspresję może być użyta w tych wektorach w celu ekspresji sekwencji DNA według wynalazku. Do użytecznych sekwencji kontrolujących ekspresję należą: sekwencje kontrolujące ekspresję związane ze strukturalnymi genami powyższych wektorów ekspresji. Przykładami użytecznych sekwencji kontroli ekspresji są wczesne i późne promotory SV40 lub adenowirus, system lac, system trp, systemy

184 373

TAC lub TRC, główne obszary operatora i promotora faga lambda, obszary kontrolne białka fd, promotor kinazy 3-fosfogliceranowej i innych enzymów glikolitycznych, promotory kwaśnej fosfatazy np. Pho 5, promotory systemu łączącego alfa droZdZy i inne sekwencje znane z kontroli ekspresji genów prokariotycznych i eukariotycznych komórek lub ich wirusów i róZnorodne ich kombinacje. Sekwencja kontrolna izolowanego polipeptydu 22 kDa z Neisseria meningitidis jest szczególnie użyteczna w ekspresji izolowanego polipeptydu 22 kDa z Neisseria meningitidis u E. coli (przykład III).

Wiele jednokomórkowych organizmów gospodarza moZe być uZytych do ekspresji sekwencji DNA według wynalazku. Do gospodarzy tych naleZą dobrze znane organizmy eukariotyczne i prokariotyczne takie, jak szczepy E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, grzyby, droZdZe, komórki owadów, jak Spodoptera frugiperda (SF9), komórki zwierzęce, jak CHO i komórki myszy, komórki zielonej małpy afrykańskiej, jak COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 i BMT 10 oraz komórki ludzkie i roślinne w hodowlach tkankowych. Do poZądanych organizmów gospodarzy naleZą bakterie, jak E. coli i Bacillus subtilis oraz komórki ssaków w hodowli tkankowej.

NaleZy rozumieć, Ze nie wszystkie wektory i sekwencje kontrolujące ekspresję będą jednakowo dobrze funkcjonować w procesie ekspresji sekwencji DNA według wynalazku. TakZe nie wszyscy gospodarze będą jednakowo dobrze funkcjonować w odniesieniu do określonego systemu ekspresji. JednakZe osoba biegła w sztuce moZe wybierać spośród tych wektorów, sekwencji kontroli ekspresji i gospodarzy bez niepotrzebnego eksperymentowania i bez wykraczania poza zakres wynalazku. Na przykład przy selekcji wektora naleZy uwzględnić gospodarza, w którym wektor musi się replikować. NaleZy takZe wziąć pod uwagę ilość kopii wektora, zdolność do kontroli ilości kopii i ekspresję innych białek kodowanych przez wektor, takie jak markery antybiotykowe.

NaleZy takZe wziąć pod uwagę wiele czynników w doborze sekwencji kontroli ekspresji. NaleZą do nich np.: względna moc sekwencji, moZliwość jej kontrolowania, jej kompatybilność z sekwencją DNA według wynalazku, szczególnie przy uwzględnianiu potencjału struktur wtórnych. Gospodarze jednokomórkowi powinni być selekcjonowani ze względu na ich kompatybilność z wybranym wektorem, toksyczność produktu kodowanego przez sekwencję DNA według wynalazku, ich charakterystykę wydzielniczą, ich zdolność do prawidłowego uformowania białka, warunki fermentacji i hodowli, i moZliwości oczyszczania produktów kodowanych przez sekwencję DNA według wynalazku.

W zakresie tych parametrów, osoba biegła w sztuce moZe wyselekcjonować wiele kombinacji wektor/ sekwencja kontroli ekspresji/ gospodarz, które umoZliwią ekspresję sekwencji DNA według wynalazku w procesie fermentacji lub w hodowli komórek zwierzęcych na duZą skalę.

Polipeptydy kodowane przez sekwencje DNA według wynalazku mogą być wyizolowane za pomocą fermentacji lub hodowli komórkowej i oczyszczone za pomocą jednej z wielu konwencjonalnych metod. Osoba biegła w sztuce moZe wybrać najbardziej odpowiednią metodę izolacji i oczyszczania bez wykraczania poza zakres wynalazku.

Izolowany polinukleotyd według wynalazku moZe być uZyteczny w preparatach słuZących profilaktyce, leczeniu i diagnostyce schorzeń wywoływanych przez Neisseria meningitidis, jak i przez Neisseria gonorrhoeae lub Neisseria lactamica.

Izolowany polinukleotyd według wynalazku moZe być uZyteczny szczególnie do wywoływania odpowiedzi immunologicznej i reakcji przeciwciał przeciwko Neisseria meningitidis, a takZe przeciwko Neisseria gonorrhoeae i Neisseria lactamica.

Do wykorzystania izolowanych polinukleotydów według wynalazku jako immunogenów lub jako szczepionki mogą posłuZyć standardowe metody stosowane w immunologii. W szczególności moZna wstrzyknąć farmaceutycznie skuteczną dawkę izolowanego polipeptydu 22 kDa z Neisseria meningitidis odpowiedniemu gospodarzowi w celu pobudzenia wytwarzania monoklonalnych lub poliwalentnych przeciwciał przeciwko Neisseria meningitidis lub wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko chorobie wywoływanej przez Neisseria meningitidis.

184 373

Przed dokonaniem iniekcji gospodarza, izolowany polipeptyd według wynalazku musi być połączony z odpowiednim nośnikiem, dlatego też opisano kompozycję farmaceutyczną zawierającą jeden lub więcej antygenów powierzchniowych z Neisseria meningitidis lub jego fragmenty. Korzystnie, antygen jest izolowanym polipeptydem według wynalazku lub jego fragmentem, analogiem lub pochodną razem z jednym (lub więcej) składnikiem akceptowanym farmaceutycznie. „Farmaceutycznie skuteczna dawka” oznacza tutaj ilość antygenów powierzchniowych z Neisseria meningitidis lub ich fragmentów zdolnych do pobudzenia produkcji przeciwciał przeciwko Neisseria meningitidis zdolnych do leczenia lub zapobiegania zakażeniu wywołanemu przez Neisseria meningitidis.

Sondy DNA według wynalazku mogą być także używane do wykrywania krążących w próbce kwasów nukleinowych Neisseria meningitidis stosując jako sposób diagnozowania zakażenia Neisseria meningitidis np. łańcuchową reakcję. Sonda może być zsyntetyzowana przy użyciu konwencjonalnej techniki i może być unieruchomiona w fazie stałej lub może być oznaczona wykrywalnym związkiem.

Odpowiednie przeciwciała mogą być oznaczane przy użyciu właściwych metod skriningowych np. przez ocenę zdolności określonego przeciwciała do biernej ochrony przed zakażeniem Neisseria meningitidis na modelu testowym. Przykładem modelu zwierzęcego jest model myszy opisany w przykładach. Przeciwciałem może być całe przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen i może ogólnie należeć do którejkolwiek klasy immunoglobulin. Przeciwciało lub fragment może pochodzić od zwierzęcia, szczególnie od ssaka, a bardziej szczegółowo od myszy, szczura lub człowieka. Może to być naturalne przeciwciało lub jego fragment lub przeciwciało rekombinowane lub jego fragment. Termin „przeciwciało rekombinowane” (lub jego fragment) oznacza tutaj przeciwciało lub jego fragment, które zostało wyprodukowane przy użyciu technik biologii molekularnej. Przeciwciało lub fragmenty przeciwciała mogą być poliklonalne lub, co bardziej pożądane, monoklonalne. Może ono być specyficzne dla jednego epitopu.

Korzystnie, przeciwciało lub jego fragmenty są specyficzne dla jednego lub więcej epitopów związanych z izolowanym polipeptydem według wynalazku. Preferowane są także opisane tutaj monoklonalne przeciwciała Me-1 i Me-7.

W celu lepszego zrozumienia istoty wynalazku opisano poniższe przykłady. Te przykłady mają tylko charakter ilustracyjny i nie powinny być interpretowane w sposób ograniczający zakres wynalazku.

Przykład I opisuje traktowanie preparatów z błony komórkowej Neisseria meningitidis enzymami proteolitycznymi i późniejszą identyfikację białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis.

Przykład II opisuje przygotowanie monoklonalnych przeciwciał specyficznych dla białka powierzchniowego 22 kDa.

Przykład III opisuje przygotowanie powierzchniowego białka rekombinowanego 22 kDa.

Przykład IV opisuje użycie próbek DNA do identyfikacji organizmów dokonujących ekspresji białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis.

Przykład V opisuje użycie przeciwciała monoklonalnego przeciwko białku powierzchniowemu 22 kDa z Neisseria meningitidis w celu ochrony myszy przed zakażeniem Neisseria meningitidis.

Przykład VI opisuje użycie oczyszczonego rekombinowanego powierzchniowego białka 22 kDa w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko zakażeniu Neisseria meningitidis.

Przykład VII opisuje identyfikację sekwencji dla białka 22 kDa i genu kodującego białko innych szczepów Neisseria meningitidis (MCH88 i Z4063) i jednego szczepu Neisseria gonorrhoeae.

Przykład VIII opisuje odpowiedź immunologiczną u królików i małp na białko powierzchniowe 22 kDa z Neisseria meningitidis.

184 373

Przykład IX opisuje procedurę służącą oznaczeniu mapy różnych immunologicznych epitopów białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis.

Przykład X opisuje indukcję cieplną wektora ekspresji w celu produkcji białka powierzchniowego 22 kDa na dużą skalę.

Przykład XI opisuje proces oczyszczania białka powierzchniowego 22 kDa produkowanego metodą rekombinacji.

Przykład XII opisuje użycie białka powierzchniowego 22 kDa jako szczepionki u ludzi.

Przykład I.

Traktowanie preparatów z błony komórkowej Neisseria meningitidis enzymami proteolitycznymi i późniejsza identyfikacja białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis odpornego na enzymy

Do analizowania ultrastruktury błony komórkowej Neisseria meningitidis używano kilku preparatów antygenowych otrzymanych z całej komórki, metodą chlorku litu lub ekstraktów sarkosylu. Błona komórkowa bakterii Gram-ujemnej oddziela środowisko zewnętrzne od wnętrza komórki i zawiera większość antygenów wyeksponowanych na odpowiedź immunologiczną gospodarza. Głównym celem badań była identyfikacja nowych antygenów, które mogą indukować odpowiedź immunologiczną przeciwko Neisseria meningitidis. Jedną z metod używanych przez wynalazców w celu identyfikacji tych antygenów było częściowe rozerwanie wyżej wymienionych preparatów antygenowych za pomocą enzymów proteolitycznych. Determinanty antygenowe generowane przez enzymy mogą być zidentyfikowane przez analizę właściwości immunologicznych i ochronnych preparatów antygenowych. Ku naszemu zdziwieniu obserwowaliśmy, że po elektroforezie ekstraktów błony komórkowej Neisseria meningitidis (chlorek litu), jedno niskocząsteczkowe białko (barwiące się barwnikiem Coomassie Brilliant Blue R-250) nie ulegało zniszczeniu przez enzymy proteolityczne. Coomassie Blue jest używany do barwienia białek i peptydów, i nie wykazuje żadnego lub bardzo niewielkie powinowactwo do polisacharydów lub lipidów, które są także głównymi składnikami błony komórkowej. Fakt barwienia tego antygenu o niskiej masie cząsteczkowej barwnikiem Coomassie Blue wskazuje na to, że co najmniej jego część jest utworzona z polipeptydów, które nie są trawione przez enzymy proteolityczne lub są chronione przed działaniem tych enzymów przez inne struktury powierzchniowe. Ponadto, jak opisano poniżej, bardzo silny enzym proteinaza K nie trawi tego antygenu o niskiej masie cząsteczkowej nawet po intensywnym stosowaniu.

W celu uzyskania preparatów błony komórkowej od różnych szczepów Neisseria meningitidis używano ekstraktów chlorku litu i stosowano metodę uprzednio opisaną (Brodeur i wsp., Infect. Immun., 50, str.510 (1985)). Zawartość białek w tych preparatach oznaczano metodą Lowrego przystosowaną do frakcji błony komórkowej (Lowry i wsp., J.Biol.Chem.,193, str. 265 (1951)). Preparaty z błony komórkowej otrzymane z Neisseria meningitidis szczep 608B (B:2a:P1.2) umieszczono na 24 godziny w 37°C oraz wytrząsano w sposób ciągły z a-chymotrypsyną otrzymaną z trzustki bydlęcej (E.C.3.4.21.1) (Sigma) lub trypsynątypu 1 z trzustki bydlęcej (E.C.3.4.21.4) (Sigma). Stężenie enzymu wynosiło 2 mg na mg białka. Te same preparaty z błony komórkowej były także traktowane różnymi stężeniami (0,5 do 24 mg na mg białka) proteinazy K z Tritirachium album (Sigma lub Boehringer Mannheim, Laval, Canada) (E.C.3.4.21.14). W celu nasilenia trawienia białka przez proteinazę K stosowano różne warunki eksperymentu. Próbki były inkubowane przez 1 godzinę, 2 godziny, 24 godziny i 48 godzin w 37°C lub 56°C z użyciem lub bez użycia wstrząsania. pH próbek wynosiło 7,2 lub 9,0. W niektórych próbkach zastosowano 1% dodecylosiarczan sodowy (SDS). Bezpośrednio potem próbki zostały rozdzielone za pomocą elektroforezy (żel SDS-PAGE) przy użyciu systemu Mini Protean II (Bio-Rad, Missistauga, Ontario, Canada). Białka ogrzewano do 100°C przez 5 minut w obecności 2-merkaptoetanolu i SDS, rozdzielono w żelach 14% SDS i zabarwiono barwnikiem Coomassie Brilliant Blue R-250.

184 373

Figura 2 ukazuje profil migracji białek zawartych w preparatach błony komórkowej otrzymanych z Neisseria meningitidis szczep 608B (B:2a:P1.2) na żelu 14% SDS-PAGE po potraktowaniu ich σ-ehymotrypso^r^pą i trypsyną w 37°C przez 24 godziny. Intensywne trawienie proteolityczne może być zaobserwowane w odniesieniu do białek o wysokiej masie cząsteczkowej i kilku głównych białek błony komórkowej w badanych próbkach (fig. 2, pozycje 3 i 4) w porównaniu z kontrolą nie poddaną tej procedurze (fig. 2, pozycja 2). W przeciwieństwie do nich białko o masie cząsteczkowej 22 kDa nie zostało uszkodzone nawet na skutek 24-godzinnego kontaktu z którymś z enzymów żroteulityczpych.

To unikalne białko było dalej badane przy użyciu silniejszego enzymu proteolitycznego proteinano K (fig. 3). Proteinaza K jest jednym z najsilniejszych enzymów proteolitycznych, ponieważ posiada niską specyficzność wiązania z białkami i szerokie optimum pH. Białko 22 kDa okazało się odporne na trawienie przez 2 jednostki międzynarodowe (j.m.) żroteipazy K przez 24 godziny w 56°C (fig. 3, pozycja 2). Takie postępowanie jest często stosowane w naszym laboratorium w celu wyprodukowania liżożulisacharydów lub DNA, które są niemal wolne od białek.

W rzeczywistości dzięki tej agresywnej metodzie proteolitycznej można wykryć tylko niewielkie żuliżeptydo w preparatach z błony komórkowej. Dłuższe postępowanie, do 48 godzin lub wyższe stężenie enzymów (do 24 j.m.) nie wywoływało uszkodzeń białka 22 kDa. Ilość i migracja białka 22 kDa na żelu SDS-PAGE nie ulegała zmianie, gdy zwiększono pH mieszaniny do 9, lub gdy dodano 1% SDS, który jest silnym środkiem denaturującym białko (fig. 3, pozycja 4,6 i 8). Kombinowane zastosowanie tych dwóch czynników denaturujących normalnie spowodowałoby całkowite strawienie białek obecnych w błonie komórkowej, pozostawiając jedynie reszty aminu2wasuwe. Polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej są często obserwowane w strawionej pozostałości i zostały uznane za fragmenty wrażliwych białek, które zostały nieskutecznie strawione w czasie procesów enzymatycznych. Te fragmenty były najprawdopodobniej chronione przed dalszą degradacją przez węglowodany i lipidy obecne w błonie komórkowej. Białka o masie cząsteczkowej 28 kDa i 34 kDa, które były obecne w badanych próbkach są odpowiednio, enzymami rezydualnymi i białkami zanieczyszczającymi wszystkie badane preparaty enzymatyczne.

Co interesujące, badania nad odpornością białka 22 kDa na działanie proteazy wykazały, że inne białko o masie cząsteczkowej 18 kDa wydaje się także odporne na degradację enzymatyczną (fig. 3a). Na ślad tego białka (18 kDa) natrafiono analizując profil migracji oczyszczonego białka rekombinowapego 22 kDa na żelu SDS-PAGE (fig. 3b). Białko 18 kDa było widoczne tylko kiedy oczyszczone białko rekombinowane 22 kDa było ogrzewane w próbce bufora zawierającej detergent SDS przez dłuższy okres czasu zanim zostało umieszczone na żelu. Analiza N-końca kwasów nukleinowych przy użyciu degradacji Edmana (przykład III) jasno wykazała, że reszty aminokwasowe (E-G-A-S-G-F-Y-V-Q) zidentyfikowane w białku 18 kDa odpowiadają aminokwasom 1-9 (numer sekwencji 1). Wyniki wykazują, że prążki 18 i 22 kDa widoczne na żelu SDS-PAGE w rzeczywistości pochodzą z tego samego białka. Ten ostatni wynik także wskazuje, że sekwencja wiodąca jest rozszczepiona z dojrzałego białka 18 kDa. Wykonane zostaną dalsze badania w celu identyfikacji modyfikacji molekularnych wyjaśniających tę zmianę w masie cząsteczkowej i w celu oceny jej wpływu na antygenowe i ochronne właściwości białka.

W rezultacie odkrycie białka błony komórkowej Neisseria meningitidis o bardzo rzadkich właściwościach oporności na enzymy proteolityczne było powodem dalszych badań nad jego molekularnymi i immunologicznymi właściwościami. Oczyszczone białko rekombinowane 22 kDa wytwarzane przez Escherichia coli w przykładzie III jest także wysoce odporne na trawienie przez proteinazę K. Aktualnie próbujemy zrozumieć mechanizm, dzięki któremu białko powierzchniowe 22 kDa z Neisseria meningitidis posiada tę nietypową oporność na enzymy proteolityczne.

184 373

Przykład II.

Generowanie monoklonalnych przeciwciał specyficznych dla białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis

Przeciwciała monoklonalne opisane tutaj zostały uzyskane na drodze trzech niezależnych eksperymentów fuzyjnych. Myszy balb/c, samice (Charles River Laboratories, St-Constant, Quebec, Canada) zostały immunizowane preparatami z błony komórkowej Neisseria meningitidis szczepy 604A, 608B i 2241 C należące do, odpowiednio, grup serologicznych A, B i C. Ekstrakcja chlorkiem litu zastosowana w celu otrzymania preparatów z błony komórkowej została wykonana w sposób uprzednio opisany przez wynalazców (Brodeur i wsp., Infect. Immun.,50, str. 510 (1985)). Zawartość białek w tych preparatach została określona metodą Lowr/ego przystosowaną do frakcji błony komórkowej (Lowry i wsp., J. BiokChem^W, str.265 (1951)). Grupom myszy wstrzyknięto dootrzewnowo lub podskórnie dwukrotnie w odstępach 3-tygodniowych po 10 mg różnych kombinacji preparatów błony komórkowej opisanych wyżej. W zależności od grupy myszy, adjuwantem używanym do immunizacji był kompletny lub niekompletny adjuwant Freund'a (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.) lub QuilA (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont., Canada). Trzy dni przed fuzją immunizowane myszy otrzymały końcowy zastrzyk dożylny z 10 mg jednego z opisanych wyżej preparatów błony komórkowej. Sposób fuzji zastosowany w celu produkcji linii komórek hybrydowych wydzielających pożądane monoklonalne przeciwciała został opisany poprzednio przez wynalazców (Hamel i wsp., J.Med.Microbiol.,25,str. 2434 (1987)). Klasa, podklasa i typ łańcucha lekkiego monoklonalnych przeciwciał Me-1, Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 i Me-7 zostały określone w teście ELISA, jak poprzednio opisano (Martin i wsp., J. Clin. Microbiol., 28, str. 1720 (1990)) i są przedstawione w tabeli 1.

Specyficzność monoklonalnych przeciwciał została określona przy użyciu precypitacji (Western immunoblotting) zgodnie z metodą uprzednio opisaną przez wynalazców (Martin i wsp., Eur. J. Immunol., 18, str. 601 (1988) z następującymi modyfikacjami. Preparatyz błony komórkowej otrzymane od różnych szczepów Neisseria meningitidis zostały rozdzielone w żelach 14% SDS-PAGE. Białka zostały przeniesione z żelów na membrany nitrocelulozowe przy użyciu pół-suchego aparatu (Bio-Rad). Rodnik 60 mA na żel (6x10 cm) był stosowany przez 10 minut w buforze zawierającym 25 mM Tris-HCI, 192 ml glicyny i 20% metanol, pH=8,3. Precypitacja (Western immunoblotting) wykazała, że monoklonalne przeciwciała Me-1, Me-2, Me-3, Me-5, Me-6 i Me-7 rozpoznają swoje specyficzne epitopy na białku 22 kDa z Neisseria meningitidis (fig. 4A). Analiza żeli SDS-PAGE i odpowiadających im precypitatów (Western immunoblotting) także wykazuje, że masa molekularna tego białka nie wykazuje zmienności między poszczególnymi szczepami. Jednakże ilość białka obecnego w preparatach z błony komórkowej zmieniała się między poszczególnymi szczepami i nie była związana z grupą serologiczną szczepu. Co więcej, te monoklonalne przeciwciała wciąż rozpoznawały swoje epitopy na białku powierzchniowym 22 kDa z Neisseria meningitidis po zastosowaniu na preparaty z błony komórkowej 2 j. m. proteinazy K na mg białka (postępowanie opisane w przykładzie I, supra) (fig. 4B). Co interesujące, epitopy pozostawały nieuszkodzone po potraktowaniu enzymem potwierdzając, że nawet jeżeli są dostępne w preparatach dla przeciwciał, nie są one niszczone przez enzym. Ostatni wynik wskazuje, że mechanizm wyjaśniający opisaną oporność na proteinazę K prawdopodobnie nie ma związku z blokowaniem dostępu enzymu do białek przez struktury powierzchniowe lub z ochroną głęboko osadzonych białek przez błonę komórkową. Rezultaty precypitacji (nie ukazane na rysunku 4) dla Me-1 są zgodne z rezultatami dla pozostałych pięciu przeciwciał monoklonalnych.

Przeprowadzono szereg eksperymentów w celu częściowego scharakteryzowania białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis i różnicowania go od innych znanych białek powierzchniowych występujących u meningokoków. Nie stwierdzono zmian masy cząsteczkowej na żelu SDS-PAGE białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis, gdy preparaty z błony komórkowej ogrzewano w 100°C przez 5 minut lub w 37°C i 56°C

184 373 przez 30 minut w buforze elektroforetycznym z 2-merkaptoetanolem lub bez niego. Świadczy to o tym, że migracja białka powierzchniowego 22 kDa, obecnego w błonie komórkowej, nie była modyfikowana przez ogrzewanie lub merkaptoetanol.

W celu ustalenia, czy monoklonalne przeciwciała reagują z epitopami węglowodanowymi obecnymi w preparatach z błony komórkowej ekstrachowanych z Neisseria meningitidis stosowano proces utleniania nadjodanem sodowym. Metoda zastosowana do przeprowadzenia tego eksperymentu była uprzednio opisana przez wynalazców (Martin i wsp., Infect. Immun., 60, str. 2718-2725 (1992)). Zastosowanie 100 mM nadjodanu sodowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej nie zaburzało reakcji monoklonalnych przeciwciał z białkiem powierzchniowym 22 kDa z Neisseria meningitidis. To postępowanie normalnie znosi wiązanie przeciwciał specyficzne dla węglowodanów.

Monoklonalne przeciwciało 2-1-CA2 (otrzymane od dr A. Bhattacharjee, Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C.) jest specyficzne dla białka brzegowego (lip protein) nazywanego także H. 8, antygenu powierzchniowego typowego dla patogennych drobnoustrojów Neisseria species. Reaktywność tego monoklonalnego przeciwciała z preparatami z błony komórkowej była porównywana z reaktywnością monoklonalnego przeciwciała Me-5. Monoklonalne przeciwciało specyficzne dla H.8 reagowało z białkiem o masie cząsteczkowej 30 kDa, podczas gdy monoklonalne przeciwciało Me-5 reagowało z białkiem 22 kDa. Ten wynik jasno wskazuje, że nie ma związku między białkiem powierzchniowym 22 kDa z Neisseria meningitidis a H.8, innym wysoko zakonserwowanym białkiem błony komórkowej.

W celu weryfikacji ekspozycji białka 22 kDa na powierzchni nieuszkodzonych komórek Neisseria meningitidis przeprowadzono test radioimmunologiczny, jak opisano uprzednio przez wynalazców (Proulx i wsp., Infec. Immun., 59, str.963 (1991)). W teście tym użyto sześcio- i osiemnastogodzinnych hodowli bakteryjnych. Sześć monoklonalnych przeciwciał reagowało z 9 szczepami Neisseria meningitidis (grupy serologiczne szczepów oznaczono w nawiasach na rysunku 5), 2 szczepy Neisseria gonorrhoeae („NG”), 2 szczepy Moraxella catarrhalis („MC”) i 2 szczepy Neisseria lactamica („NL”). Test radioimmunologiczny potwierdził, że epitopy rozpoznawane przez monoklonalne przeciwciała występują na powierzchni nieuszkodzonych komórek Neisseria meningitidis różnych serotypów i grup serologicznych, i powinny także być dostępne dla enzymów proteolitycznych (fig. 5). Monoklonalne przeciwciała wiązały się silnie ze swoimi epitopami na powierzchni wszystkich testowanych szczepów Neisseria meningitidis. Wartości wiązania (pomiędzy 3,000 i 35,000 CPM) różniły się pomiędzy poszczególnymi szczepami i zależały od stanu fizjologicznego bakterii. Monoklonalne przeciwciało specyficzne dla Haemophilus influenzae było używane jako kontrola negatywna dla wszystkich szczepów bakterii. Wartości poniżej 500 CPM były notowane i następnie odejmowane od każdej wartości wiązania. Wyniki ukazane na fig. 5 dla monoklonalnych przeciwciał Me-5 i Me-7 są reprezentatywne dla wyników uzyskanych dla monoklonalnych przeciwciał Me-1, Me-2, Me-3 i Me-6 w odniesieniu do badanych szczepów Neisseria meningitidis. W odniesieniu do innych badanych szczepów bakterii, aktywność wiązania dla Me-7 jest reprezentatywna dla aktywności wiązania otrzymanej dla innych monoklonalnych przeciwciał, które rozpoznawały ten sam szczep bakterii.

Brano także pod uwagę antygenową konserwację epitopów rozpoznawanych przez monoklonalne przeciwciała. Test immunologiczny „dot enzyme” był stosowany dla szybkiego przeszukiwania monoklonalnych przeciwciał przeciwko dużej liczbie szczepów bakteryjnych. Test ten był przeprowadzany jak uprzednio opisano przez wynalazców (Lussier i wsp., J. Immunoassay, 10, str. 373 (1989)). W badaniu tym użyto 71 szczepów Neisseria meningitidis. Próbki zawierały 19 szczepów grupy serologicznej A, 23 szczepy grupy serologicznej B, 13 szczepów serologicznej C, 1 szczep grupy serologicznej 29E, 6 szczepów grupy serologicznej W-135, 1 szczep grupy serologicznej X, 2 szczepy grupy serologicznej Y, 2 szczepy grupy serologicznej Z i 4 szczepy nie zakwalifikowane do żadnej grupy serologicznej („NS”). Szczepy te uzyskano z Caribbean Epidemiology Centre, Port of Spain, Trinidad, Children's

184 373

Hospital of Eastern Ontario, Ottawa, Kanada, Department of Saskatchewan Health, Regina, Kanada, Laboratoire de Sante Publique du Quebec, Montreal, Kanada, Max-Planck Institut fur Molekulare Genetik, Berlin, FRG, Montreal Children Hospital, Montreal, Kanada, Victoria General Hospital, Halifax, Kanada i z naszych własnych hodowli. Testowano także następujące gatunki bakterii: 16 Neisseria gonorrhoeae, 4 Neisseria cinerea, 5 Neisseria lactamica, 1 Neisseria flava, 1 Neisseria flaeescens. 3 Neisseria mucosa, 4 Neisseria perflaval sicca, 4 Neisseria perflava, 1 Neisseria sicca, 1 Neisseria subflava i 5 Moraxella catarrhalis, 1 AlcaIgenes feacalis (ATCC 8750), 1 Citrobacter freundi (ATCC 2080), 1 Edwardsiella tarda (ATCC 15947), 1 Enterobacter cloaca (ATCC 23355), 1 Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), 1 Escherichia coli, 1 Flavobacterium odoratum, 1 Haemophilus influenzae typu b (szczep Eagan), 1 Klebsiellapneumoniae (ATCC 13883), 1 Proteus rettgeri (ATCC 25932), \ Proteus wdgaris (ATCC 13315). 1 aeruginosa (ATCC 9027), 1 SaLmornsllu typhimurium (ATCC 14028), 1 Serrati marcescens (ATCC 8100), 1 Shigella flexneri (ATCC 12022), 1 Shigella sonnei (ATCC 9290). Uzyskano je z American Type Culture Collection lub z Laboratory Centre for Disease Control, Ottawa, Kanada. Reaktywność monoklonalnych przeciwciał z większością odpowiednich szczepów Neisseria przedstawia tabela 1. Jedno monoklonalne przeciwciało Me-7, rozpoznawało swój specyficzny epitop u 100% z 71 badanych szczepów Neisseria meningitidis. To monoklonalne przeciwciało, podobnie jak Me-2, Me-3, Me-5 i Me-6, także reagowało z pewnymi szczepami należącymi do innych gatunków Neisseria wskazując, że ich specyficzny epitop także podlega ekspresji przez inne spokrewnione drobnoustroje należące do Neisseriaceae. Z wyjątkiem jednej słabej reakcji z Neisseria lactamica, monoklonalne przeciwciało Me-1 reagowało tylko ze szczepami Neisseria meningitidis. Me-1 było dalej badane za pomocą innej próbki szczepów Neisseria meningitidis 177 i było zdolne do prawidłowego zidentyfikowania powyżej 99% wszystkich badanych szczepów Neisseria meningitidis. Poza szczepami Neisseria przedstawionymi w tabeli 1, przeciwciała monoklonalne nie reagowały z innymi gatunkami bakterii wymienionymi wyżej.

Wynalazcy wygenerowali sześć monoklonalnych przeciwciał specyficznie reagujących z białkiem powierzchniowym 22 kDa z Neisseria meningitidis. Przy użyciu tych monoklonalnych przeciwciał wykazano, że ich specyficzne epitopy są:

1) zlokalizowane na opornym na proteinazę białku 22 kDa obecnym w błonie komórkowej Neisseria meningitidis,

2) konserwowane wśród szczepów Neisseria meningitidis,

3) obecne na powierzchni nieuszkodzonych komórek Neisseria meningitidis i dostępne dla przeciwciał

4) i reaktywność tych monoklonalnych przeciwciał z białkiem powierzchniowym 22 kDa z Neisseria meningitidis nie jest modyfikowana przez nadjodan sodowy, co wskazuje na to, że ich specyficzne epitopy nie są zlokalizowane na węglowodanach.

Pomimo stwierdzenia, że białko 22 kDa z Neisseria meningitidis migruje do masy cząsteczkowej około 18kDa w czasie ogrzewania w surowych warunkach zaobserwowano, że migracja nie jest modyfikowana przez zastosowanie 2-merkaptoetanolu.

Wykazano także, że białko powierzchniowe 22 kDa nie ma podobieństwa antygenowego z H.8, innym niskocząsteczkowym i wysoko zakonserwowanym białkiem obecnym w błonie komórkowej Neisseria meningitidis.

Jak przedstawiono w przykładzie III, te monoklonalne przeciwciała także reagowały z oczyszczonym, rekombinowanym białkiem powierzchniowym wytwarzanym w wyniku transformacji Escherichia coli szczep BL21 (DES) za pomocą wektora plazmidowego pNP2202 zawierającego gen kodujący białko powierzchniowe z Neisseria meningitidis.

184 373

Tabela 1

Reaktywność monrklrnalncoh przeciwciał ze szczepami Neisseria

Liczba szczepów Neisseria rozpoznanych przez mrnrklonαlnr przeciwciała
Nazwa	Izotop	Grupa serologiczna Neisseria meningitidis	Morcreella catarrhalis \ (5)	ęs V. u. s S S*'· O Ό 2 V >3	Neisseria lactamica (5)
A (19)	B (23)	C (13)	29E (1)	W135 (6)	X (1)	Y (2)	Z (2)	XS' (4)	Razem (71)
Me-1	lqG2a(k)	19	22	13	1	6	1	2	2	3	69	0	0	1
Me-2	1qG2a(k)	19	20	13	1	6	0	2	2	4	67	0	2	0
Me-3	1qG3(k)	19	22	13	1	6	1	2	2	3	69	0	2	4
Me-5	1qG2a(k)	19	22	13	1	6	1	2	2	3	69	0	2	0
Me-6	1qG3(k)	19	23	13	1	6	1	2	2	3	70	0	2	4
Me-7	1qG2a(k)	19	23	13	1	6	1	2	2	3	71	5	2	4

szczepy me zaliczone do żadnej grupy serologicznej

Przykład III.

Klonowanie molekularne, sekwencjonowanie genu, wysoko wydajna ekspresja i oczyszczanie białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis

A. Klonowanie

Grnomową bibliotekę DNA z Neisseria meningitidis szczepu 608B (B:2a:P1.2) skonstruowano na wektorze Lambda GEM-11 zgodnie z zaleceniami producenta (Promega CO, Madison, WI). Krótko, genomowy DNA szczepu 608B częściowo strawiono Sau3A i fragmenty o wielkości od 9 do 23 kb oczyszczono w żelu αgarrzoyyw przed wrekombInowαnIrw w miejsce BamHI ramion LambdaGEM-11. Otrzymanymi wrekombinowαncmi fagami infekowano komórki Escherichia coli szczepu LE392 (Promega) które następnie wysiewano na szalki z pożywką LB. Przeszukując bibliotekę, zgodnie z poniższym protokołem, przeciwciałami wonoklrnalncmś specyficznymi dla białka powierzchniowego o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis z przykładu II, zidentyfikowano dziewiętnaście pozytywnie reagujących łysinek. Aby miękki agar zakrzepł szalki inkubowano przez 15 minut w -20°C. Dla zaadsorbowania białek wytwarzanych przez zrekombinowane klony wirusowe na powierzchniach szalek delikatnie umieszczano filtry nitrocelulozowe w temperaturze 4°C na 30 minut. Następnie filtry płukano w PBS-Tween 0,02% (obj./obj.) i imwunoblrtrwano jak to opisano uprzednio [Lussier i wsp., J. ^munoassay, 10, str. 373 (1989)]. Po namnożeniu i oczyszczeniu DNA do doświadczeń z subklonowaniem wyselekcjonowano jeden z klonów wirusowych, oznaczony jako klon 8, który przenosił wstawkę o wielkości 13 kb. Po trawieniu tego klonu Sac I otrzymywano dwa fragmenty o wielkości 5 i 8 kb. Fragmenty te oczyszczano w żelu agarowym i wrekrwbInrwcwano w sekwencję rozpoznawaną przez Sac I niskokopijnego plazmidu pWKS30 [Wang i Kushner, Gene, 100, str. 195 (1991)]. Zrekowbinrwanyoh plazmidów użyto do transformacji przez elektroporację (Bio-Rad, Mississauga, Ont., Kanada) wykonaną zgodnie z zaleceniami producenta, komórek Escherichia coli szczepu JM109 (PTOmega), a otrzymane kolonie analizowano mrnoklrnalncwI przeciwciałami z przykładu II specyficznymi dla białka powierzchniowego Neisseria meningitidis o masie 22 kDa. Pozytywną reakcję obserwowano jedynie gdy kolonie były ztransformowane plazmidem przenoszącym wstawkę o wielkości 8 kb. Analizy wykonane z zastosowaniem techniki Western biot (metodologię opisano w przykładzie II) dla pozytywnych klonów pokazały, że białko eksprywowane przez

184 373 komórki Escherichia coli było kompletne i migrowało w Zelu SDS-PAGE tak jak białko powierzchniowe z Neisseria meningitidis o wielkości 22 kDa. Dalej ograniczając wielkość wstawki klon przenoszący fragment o wielkości 8 kb trawiono Cla I, a fragment o wielkości 2,75 kb wrekombinowano w miejsce Cla I plazmidu pWKS30. Analizy Western blot otrzymanych klonów ponownie jasno wykazały, Ze białko wyraZane przez komórki Escherichia coli było pełnym i migrowało w Zelu SDS-PAGE jak naturalne powierzchniowe białko o masie 22 kDa z Neisseria maningili.dis.

Po analizie restrykcyjnej do sekwencjonowania genu kodującego białko powierzchniowe o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis, wyselekcjonowano dwa klony oznaczone jako pNP2202 i pNP2203, które przenosiły wstawkę o wielkości 2,75 kb w przeciwnej orientacji. Celem wytworzenia serii zagnieZdZonych delecji w obu klonach uZyto, zgodnie z instrukcją producenta, zestaw „Double Stranded Nested Deletion Kit” z Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ). Otrzymane skrócone wstawki sekwencjonowano ze startera M13 forward wiąZącego się z wektorem pWKS30 stosując zestaw „Taq Dye Deoxy Termination Cycle Sequencing Kit” oraz zautomatyzowany sekwencer model 373A firmy Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) zgodnie z zaleceniami producenta.

B. Analiza sekwencji

Gdy wstawkę zsekwencjonowano w obu kierunkach otrzymana sekwencja nukleotydową ujawniła otwartą ramkę odczytu obejmującą 525 nukleotydów (włącznie z kodonem stop) kodującą białko złoZone z 174 aminokwasów i przewidywanej masie cząsteczkowej 18 000 Daltonów i punkcie izoelektrycznym pl= 9,93. Na fig. 1 przedstawiono otrzymaną sekwencję nukleotydową i wydedukowaną sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO:2).

Dla potwierdzenia prawidłowej ekspresji sklonowanego genu określono N-końcową sekwencję aminokwasową natywnego białka powierzchniowego 22 kDa pochodzącego z Neisseria meningitidis szczepu 608B dla porównania jej z sekwencją aminokwasową wydedukowaną z sekwencji nukleotydowej. Preparat zewnętrznej błony z Neisseria meningitidis szczepu 608 B rozwinięto poprzez elektroforezę w 14% Zelu SDS-PAGE i przeniesiono na filtr PVDF (Millipore Products, Bedford MA) zgodnie z wcześniej opisaną metodą [Sambrook i wsp., Molecular Cloning; a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. PrąZek białka o masie 22 kDa wycinano z Zelu i poddawano degradacji Erdmana z zastosowaniem automatycznego sekwencera białek model 473A z Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) zgodnie z zaleceniami producenta. Sekwencja aminokwasową E-G-A-S-G-F-Y-V-Q-A odpowiadająca aminokwasom 1-10 (SEQ ID NO:2) otwartej ramki odczytu wykazuje, Ze białko powierzchniowe o masie 22 kDa ze szczepu 608B Neisseria meningitidis na 19 aminokwasowy peptyd liderowy (aminokwasy -19 do -1 z SEQ ID NO:2).

Badania przeprowadzone na dostępnych bazach danych potwierdziły, Ze białko powierzchniowe 22 kDa ze szczepu 608B Neisseria meningitidis (SEQ ID NO:2) lub kodujący je gen (SEQ ID NO:1) nie były wcześniej opisane.

C. Wysokowydajna ekspresja i oczyszczanie zrekombinowanego białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis

Następujące procedury rozwinięto celem maksymalizacji wytwarzania i oczyszczania zrekombinowanego białka powierzchniowego 22 kDa z Neisseria meningitidis wyraZanego w Escherichia coli. Preparatyki te opierały się na obserwacji, Ze zrekombinowane białko powierzchniowe 22 kDa wytworzone w szczepie BL21(DE3) Escherichia coli [Studier i Moffat, J. Mol. Biol., 189, str. 113 (1986)] niosącym plazmid pNP2202, moZna znaleźć w duZych ilościach w błonie zewnętrznej, lecz równieZ moZna było je otrzymywać z nadsączu hodowli w którym było ono najpospoliciej występującym białkiem. Tym samym nadsącz był materiałem uZytym do oczyszczenia zrekombinowanego 22 kDa białka poprzez chromatografię powinowactwa (fig. 6A).

Celem wytworzenia złoZa dla chromatografii powinowactwa, przeciwciała monoklonalne Me-2, Me-3 i Me-5 (opisane w przykładzie II) wiązano z aktywowaną CNBr Sepharozą4B (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) zgodnie z instrukcją producenta.

184 373

Celem przygotowania nadsączu całonocną hodowlą Escherichia coli szczepu BL(DE3) niosącego plazmid pNP2202 zaszczepiano pożywkę LB (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.) zawierającą 25 mg/ml ampicyliny (Sigma) a następnie inkubowano wytrząsając przez 4 godziny w 37°C. Komórki bakterii usuwano z podłoża hodowlanego przez dwukrotne wirowanie przy 10 000xg przez 10 minut w 4°C. Nadsącz z hodowli filtrowano przez 0,22 mm membranę (Milipore, Bedfords, MA) a następnie zatężano 100 razy przy pomocy membrany do ultrafiltracji (Amicon Co., Beverly, MA) o wartości odcięcia 10 000 Daltonów. Dla całkowitego upłynnienia pęcherzyków błonowych dodano do zatężonego nadsączu z hodowli Empigen BB (Calbiochem Co., LaJolla, Ca)) do końcowego stężenia 1% (obj./obj.). Zawiesinę inkubowano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, dializowano przez noc wobec kilku litrów 10 mM buforu Tris-HCl o pH 7,3 zawierającego 0,05% Empigen BB (obj./obj.) i wirowano przez 20 miii przy K00)()xg w 4°C. Preparat antygenu dodano do złoża powinowactwa i inkubowano przez noc w 4°C przy ciągłym wytrząsaniu. Gęstą zawiesiną żelu upakowywano kolumnę do chromatografii i płukano ją biernie 10 mM buforem Tris-HCl pH 7,3 zawierającym 0,05% Empigen BB (obj./obj.). Następnie zrekombinowane białko o masie 22 kDa wypłukiwano z kolumny 1 M LiCl w 10 mM buforze Tris-HCl o pH 7,3. Roztwór zawierający wypłukane białko dializowano biernie wobec kilku litrów 10 mM buforu Tris-HCl pH 7,3 zawierającego 0,05% Empigen BB. Dla oszacowania czystości zrekombinowanego białka o masie 22 kDa na każdym etapie jego czyszczenia stosowano SDS-PAGE żele barwione Coomassie Blue i azotanem srebra [Tsai i Frasch, Analitical Biochem., 119, str. 19 (1982)], a reprezentatywne wyniki przedstawiono na fig. 6a. Barwienie żeli azotanem srebra jasno pokazało, że proces oczyszczania wytwarza zadawalająco czyste zrekombinowane białko o masie 22 kDa jedynie z niewielką ilością lipopolisacharydów z Escherichia coli.

Sprawdzono również oporność zrekombinowanego białka powierzchniowego o masie 22 kDa na proteolityczne trawienie, a wyniki przedstawiono na fig. 6B. Powierzchniowe zrekombinowane białko o masie 22 kDa poddano działaniu, w sposób opisany w przykładzie I, a-chymotrypsyny i trypsyny w ilości 2 mg na mg białka i 2 jednostek proteinazy K na mg białka, trawienie nieprzerwanie wytrząsano przez 1 godzinę w 37°C. W wyniku takiego postępowania nie obserwowano zmniejszenia ilości białka. Dla porównania, częściowe lub całkowite trawienie, zależnie od wybranego enzymu, obserwowano dla białka kontrolnego którym w tym przypadku była albumina z surowicy wołu (BSA, Sigma). Co więcej wydłużenie czasu trawienia nie spowodowało żadnych modyfikacji białka. Późniejsze wyniki dowiodły, że stransformowane komórki Escherichia coli mogą wyrażać całe zrekombinowane białko powierzchniowe o masie 22 kDa, oraz białko to jest również wysoce odporne na działanie tych trzech enzymów proteolitycznych podobnie jak ma to miejsce w przypadku naturalnego białka znajdywanego w Neisseria meningitidis. Dodatkowo oczyszczone zrekombinowane białko powierzchniowe o masie 22 kDa, które nie jest zakotwiczone w zewnętrznej błonie Escherichia coli jest nadal wysoce odporne na działanie enzymów proteolitycznych.

Sprawdziliśmy również efekt działania enzymów na właściwości antygenowe zrekombinowanego białka o masie 22 kDa. Jak określono testem ELISA i przez immunoblot typu Western, opisane w przykładzie II przeciwciała monoklonalne jednoznacznie rozpoznają zrekombinowane białko powierzchniowe o masie 22 kDa, które oczyszczono zgodnie z procedurą opisaną powyżej (fig. 6C). Co więcej, reaktywność przeciwciała monoklonalnego Me-5, tak jak i reaktywność innych przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla białka o masie 22 kDa, nie została zmieniona wobec oczyszczonego zrekombinowanego białka powierzchniowego o masie 22 kDa poddanego działaniu enzymów, co potwierdza, że właściwości antygenowe zrekombinowanego białka o masie 22 kDa są podobne do tych, które opisano dla naturalnego białka.

Ważne dane przedstawiono w przykładzie III, można je podsumować w następujący sposób:

1) Otrzymano peiną. sekwencje nuklcotydową i aminoawasowij dla bi abaa powierzcwniowego z Neisseria meningitidis o masie 22 (SEQ ID NO:l ; SEQ ID NO:2);

184 373

2) N-końcowa sekwencja naturalnego białka potwierdziła, że rzeczywiście sklonowano gen kodujący białko o masie 22 kDa z Neisseria meningi.ti.dis)',

3) białko to nie było wcześniej opisane;

4) jest możliwym zdeformowanie gospodarza takiego jak Escherichia coli i uzyskanie z wysoką wydajnością ekspresji zre2ombinowapegu białka powierzchniowego o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis;

5) jest możliwym uzyskanie zrekumbinowapego białka wolnego od innych cząsteczek z Neisseria meningitidis i prawie wolnego od składników wytwarzanych przez Escherichia coi),

6) oczyszczone zre2ombinowape białko powierzchniowe o masie 22 kDa pozostaje wysoce opornym na dziełanie enzymów proteolitycznych takich jak α-chymot:rożsypa, trypsyna i proteinaza K; oraz

7) właściwości antygenowe zre2ombipuwapegu białka o masie 22 kDa są porównywalne z wykazywanymi przez naturalne powierzchniowe białko o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis.

Przykład IV.

Konserwacja na poziomie molekularnym genu kodującego białko powierzchniowe o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis

Dla sprawdzenia konserwacji na poziomie molekularnym u różnych izolatów Neisseria genu kodującego u Neisseria meningitidis białko powierzchniowe o masie 22 kDa zastosowano oznaczenie przez hybrydyzację DNA typu dot blot w którym sprawdzano różne gatunki Neisseria i różne inne gatunki bakterii. Początkowe 525 par zasad genu kodującego białko powierzchniowe o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis zampifi2owapo przez PCR, oczyszczono w żelu agarozowym i znakowano losowymi starterami stosując pleradiua2tywny system znakowania DIG i wykrywania DNA (Boehringer Mannheim, Laval, Kanada) zgodnie z zaleceniami producenta.

Oznaczenie typu DNA dot blot wykonano zgodnie z zaleceniami producenta (Boehringer Mannheim). W skrócie, testowany szczep bakterii nakraplano na posiadającą pozytywny ładunek błonę nylonową (Boehringer Mannheim), suszono, a następnie procesowano zgodnie z opisem zawartym w „DlG System's user's guid” w części dotyczącej przeszczepionych kolonii. Wstępną hybrydyzację i hybrydyzację prowadzono w 42°C w roztworze zawierającym 50% formamid (Sigma). Roztwór do wstępnej hybrydyzacji zawierał również, jako dodatkowy czynnik blokujący filtr dla zapobiegnięcia niespecyficznej hybrydyzacji sondy DNA, zdenaturowapy DNA ze spermy śledzia (Boehringer Mannheim) w stężeniu 100 mg/ml. Płukania zapewniające specyficzność wykrywania i samo wykrywanie dla którego używano substratu chemlluminescyjpegu lumigen PPD prowadzono również tak jak opisano to w „DIG System's usels guide”.

W przypadku 71 badanych szczepów Neisseria meningitidis wyniki uzyskane przy pomocy przeciwciała mupoklunalpego Me-7 i DNA sondy o długości 525 par zasad były ze sobą doskonałe zgodne. Zgodnie z uzyskanymi wynikami wszystkie badane szczepy Neisseria meningitidis posiadają gen kodujący powierzchniowe białko o masie 22 kDa i wytwarzają to białko gdyż wszystkie one były rozpoznawane przez przeciwciało moiwklonalne, tym samym potwierdzono, że białko to jest silnie konserwowane u różnych izolatów Neisseria meningitidis (tab. 2).

Również u wszystkich badanych szczepów Neisseria gonorrhoeae DNA sonda wykrywała gen kodujący u Neisseria meningitidis białko powierzchniowe o masie 22 kDa.

Przeciwnie, przeciwciało mopoklonalpe Me-7 reagowało tylko z 2 z 16 badanych szczepów Neisseria gonorrhoeae wykazując, że w przypadku szczepów Neisseria gonorrhoeae specyficzny epitop jest w jakiś sposób nieobecny, niedostępny lub zmodyfikowany, lub że większość szczepów Neisseria gonorrhoeae nie wytwarza białka nawet jeśli mają w swoim genomie sekwencję je kodującą (tab. 2).

Dobrą zgodność pomiędzy dwoma metodami wykrywania zaobserwowano dla Neisseria lactamica bowiem jedynie w przypadku jednego szczepu Neisseria. lactamica stwierdzono, że posiada on gen, a równocześnie nie wytwarza białka (tab. 2). Wynik ten można wyjaśnić w ten sam sposób jak zrobiono to w poprzednim paragrafie.

184 373

Może to wskazywać, że pomimo iż białko o masie 22 kDa nie jest wytwarzane lub jest niedostępne na powierzchni szczepów Neisseria gonorrhoeae i Neisseria lactamica to geny kodujące białko o masie 22 kDa u Neisseria gonorrhoeae i Neisseria lactamica mogą być użyte dla konstrukcji zrekombinowanych plazmidów użytych do wytwarzania białka powierzchniowego o masie 22 kDa lub jego analogów. Wszystkie takie białka lub analogi mogą być użyte dla zapobiegania, wykrywania lub diagnozowania infekcji wywołanych Neisseria. W szczególności zarażenia takie mogą być odróżniane od wywoływanych przez Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae i Neisseria lactamica. Tak więc białko powierzchniowe o masie 22 kDa lub analogi może być użyte do wytwarzania szczepionek przeciw takim zakażeniom.

Co więcej białko o masie 22 kDa lub analogi może być użyte w produkcji zestawów do wykrywania lub diagnozowania takich zakażeń.

Wyniki uzyskane dla szczepów Moraxella catharralis pokazały, że z pośród 5 badanych szczepów 3 reagowały z przeciwciałem monoklonalnym Me-7 lecz żaden z nich nie reagował z sondą DNA co wykazuje, że w genomie tych szczepów nie występuje gen kodujący u Neisseria meningitidis białko powierzchniowe o masie 22 kDa.

Z szeregu innych testowanych gatunków Neisseria jak również innych gatunków bakterii (patrz tab. 2) żaden nie okazał się być pozytywnym w obu testach. Te, później uzyskane, wyniki wydają się wykazywać że gen kodujący białko powierzchniowe o masie 22 kDa występuje jedynie u blisko ze sobą spokrewnionych gatunków Neisseriaceae.

Tabela 2

Reaktywność różnych gatunków Neisseria względem DNA sondy o długości 525 par zasad i przeciwciała monoklonalnego Me-7

Gatunki Neisseria (liczba badanych gatunków)	Liczba gatunków zidentyfikowanych przez
przeciwciało monoklonalne Me-7	sondę DNA
Neisseria meningitidis (71)	71	71
Moraxella catharallis (5)	3	0
Neisseria gonorrhoeae (16)	2	16
Neisseria lactamica (5)	4	5

Następujące gatunki Neisseria i innych bakterii które również były badane dały negatywne wyniki w dwóch oznaczeniach: 1 Neisseria cinerea, 1 Neisseria flava, 1 Neisseria flavescens, 2 Neisseria mucosa, 4 Neisseria perflaval sicca, 1 Neisseria perflavd, 1 N. sicca, 1 N. subflava, 1 Alcaligenes feacalis (ATCC 87.50). \ Bordetella pertussis (9340), 1 Bordetella bronchiseptica, 1 Citrobacterfreundi (ATCC 2080), 1 Edwarsiella tarda (ATCC 15947), 1 Enterobacter cloaca (ATCC 2.3.3.5.5.), \ Enterobaccer aerogenes (ATCC 13048), 1 Eschcrichia coli, 1 Flavobacterium odoratum, 1 Haemophilus influenzae typ b (szczep Eagan), 1 Klebsiella pne.umoniae. (ATCC 13883), 1 Proteus rettgeri (ATCC 25932), Proteus vulgaris (ATCC 13315), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), 1 Salmonella typhimurium (ATCC 14028), 1 Serrati marcescens (ATCC 8100), 1 Shigella flexneri (ATCC 12022), 1 Shigella sonnei (ATCC 9290) i 1 Nanthomonas malthopila.

Podsumowując, oznaczenie przez hybrydyzację DNA jasno wykazuje, że gen kodujący u Neisseria meningitidis białko powierzchniowe o masie 22 kDa jest silnie konserwowany w obrębie patogenów Neisseria. Co więcej otrzymane wyniki jasno pokazują że sonda DNA może stać się wartościowym narzędziem dla szybkiego i bezpośredniego wykrywania patogennych bakterii Neisseria wśród gatunków klinicznych. Sonda ta może być nawet udoskonalona dla rozróżnienia pomiędzy Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae.

184 373

Przykład V.

Bakteriolityczne i ochronne właściwości przeciwciał monoklonalnych

Aktywność bakteriolotyczną monoklonalnych przeciwciał specyficznych przeciw powierzchniowemu białku o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis oceniano in vitro zgodnie z wcześniej opisaną metodą [Brodeur i wsp., Infect. Immun., 50, str. 510 (1985); Martin i wsp., Infect. Immun., 60, str. 2718 (1992)]. W obecności komplementu surowicy świnki morskiej oczyszczone przeciwciała monoklonalne Me-1 i Me-7 wydajnie zabijały bakterie Neisseria meningitidis szczepu 608B. Względnie niskie stężenie każdego z tych przeciwciał monoklonalnych ogranicza bardziej niż w 50% liczbę żywotnych bakterii. Używanie wyższych stężeń oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych Me-11 i Me-7 powoduje gwałtowny spadek (do 99%) w liczbie bakterii zdolnych do tworzenia kolonii. Co ważne bakteriolityczna aktywność tych przeciwciał monoklonalnych jest zależna od komplementu gdyż inaktywacja cieplna surowicy świnki morskiej prowadzona przez 30 minut w 56°C całkowicie znosi zdolność zabijania bakterii. Inne przeciwciała monoklonalne nie wykazują znaczącej aktywności bakteriolitycznej względem tego samego szczepu. Połączone reprezentatywne wyniki szeregu eksperymentów przedstawiono na fig. 7, gdzie wyniki przedstawione dla Me-7 są reprezentatywne i spójne z wynikami otrzymanymi dla Me-1. Wyniki pokazane dla Me-2 są reprezentatywne i spójne z wynikami otrzymanymi dla innych przeciwciał monoklonalnych Me-3, Me-5 i Me-6.

Dla oszacowania ochronnej aktywności każdego z przeciwciał monoklonalnych użyto opisanego wcześniej (Brodeur i wsp. Infect. Immun., 50, str. 510 (1985); Brodeur i wsp., Can.

J. Microbiol., 32, str. 33 (1986)] mysiego modelu infekcji. Krótko, na 18 godzin przed zarażeniem bakteriami myszy Balb/c nastrzykiwano dootrzewnowo 600 ml płynu puchlinowego zawierającego przeciwciała monoklonalne. Następnie myszy zarażano jednym mililitrem zawiesiny zawierającej 1000 jednostek tworzących kolonie Neisseria meningitidis szczepu 608B, 4% mucyny (Sigma) i 1,6% hemoglobiny (Sigma). Połączone wyniki szeregu eksperymentów przedstawiono w tab.3. Należy odnotować, że jedynie posiadające bakteriolityczne właściwości, przeciwciała monoklonalne Me-1 i Me-7 chronią myszy przed doświadczalnymi zakażeniami Neisseria meningitidis. Rzeczywiście wstrzyknięcie płynu puchlinowego zawierającego te dwa przeciwciała monoklonalne przed zarażeniem bakteriami znacząco zwiększa przeżywalność myszy Balb/c do 70% lub więcej w porównaniu z 9% obserwowanymi dla grup kontrolnych otrzymujących zarówno 600 ml płynu puchlinowego po indukcji Sp2/0 lub 600 ml płynu puchlinowego zawierającego inne, przypadkowe przeciwciała monoklonalne. Wyniki wykazują również, że 80% myszy przeżywa również infekcję jeśli wcześniej, na 18 godzin przed zarażeniem bakteriami, wstrzyknięto im 400 fig oczyszczonego przy pomocy białka A Me-7. Obecnie wykonywane są kolejne doświadczenia celem określenia minimalnego stężenia przeciwciał koniecznego dla ochrony 50% myszy. Dla innych przeciwciał monoklonalnych specyficznych przeciw białku powierzchniowemu Neisseria meningitidis o masie 22 kDa obserwowano niższy poziom przeżywalności wynoszący od 20 do 40%.

Podsumowując, wyniki jasno pokazują, że przeciwciała specyficzne przeciw białku powierzchniowemu z Neisseria meningitidis o masie 22 kDa mogą wydajnie chronić myszy przed eksperymentalnym zarażeniem śmiertelną dawką. Możliwość indukcji wytwarzania ochronnych przeciwciał przez antygen jest jednym z najważniejszych kryteriów uzasadniających dalsze badania nad potencjalnym kandydatem na szczepionkę.

184 373

Tabela 3

Ocena zdolności do ochrony immunologicznej przed szczepem 608B (B:2a.P1.2) Neisseria meningitidis przeciwciał monoklonalnych specyficznych przeciw białku o masie 22 kDa

Przeciwciała monoklonalne	Liczba myszy żywych po zarażeniu	% przezywalności
24 godz.	72 godz.
Me-1	29/30	23/30	76
Me-2	17/20	3/20	25
Me-3	5/10	2/10	20
Me-5	11/20	8/20	40
Mo-7	10/10	7/10	70
Oczyszczone Me-7	13/15	12/15	80
Kontrola	31/100	9/100	9

Przykład VI.

Immunizacja oczyszczonym zrekombinowanym białkiem powierzchniowym o masie 22 kDa ustala ochronę przed późniejszymi zarażeniami bakteriami

Celem określenia ochronnego działania przed zainfekowaniem letalną dawką Neisseria meningitidis szczepu 608B (B:2a:P1.2) myszy szczepu Balb/c immunizowano preparatem powierzchniowego białka o masie 22 kDa oczyszczonego w sposób zgodny z protokołem przedstawionym w przykładzie III. W przeprowadzonych doświadczeniach zdecydowano użyć oczyszczonego zrekombinowanego białka zamiast naturalnego białka meningokokowego aby uzyskać pewność, że w szczepionce nie ma innego meningokokowego antygenu. Mysi model infekcji użyty w tych doświadczeniach był opisany wcześniej przez jednego z wynalazców [Brodeur i wsp., Infec. Immun., 50, str 510 (1985); Brodeur i wsp., Can. J. Microbiol, 32, str. 33 (1986)]. Każda z myszy była trzykrotnie, w trzytygodniowych odstępach nastrzykiwana podskórnie 100 ml preparatu antygenu zawierającego 10 lub 20 pg na mysz oczyszczonego zrekombinowanego białka powierzchniowego o masie 22 kDa. W doświadczeniu tym jako adjuwanta używano QuilA w stężeniu 25 pg na wstrzyknięcie. Myszy z grup kontrolnych nastrzykiwano w ten sam sposób zarówno 10 lub 20 pg BSA, 20 jig stężonego nadsączu z hodowli Escherichia coli szczepu BL21(DE3) niosącego plazmid pWKS30 nie posiadający jako wstawki, genu kodującego białko meningokokowe przygotowanego jak opisano w przykładzie III lub bufor fosforanowy. Celem badania rozwoju odpowiedzi immunologicznej przeciw zrekombinowanemu białku, przed nastrzykiwaniem od każdej myszy pobierano próbki surowicy. W dwa tygodnie po trzeciej immunizacji myszy we wszystkich grupach nastrzykiwano dootrzewnowo 1 ml zawiesiny zawierającej 1000 jednostek tworzących kolonie Neisseria meningitidis szczepu 608B w 4% mucynie (Sigma) i 1,6% hemoglobinie (Sigma).

Wyniki tych eksperymentów przedstawiono w tab. 4. Osiemdziesiąt procent (80%) myszy immunizowanych oczyszczonym zrekombinowanym białkiem powierzchniowym o masie 22 kDa przeżyło zarażenie bakteriami w porównaniu z 0 do 42% w grupach kontrolnych. Co ważne myszy w grupie kontrolnej nastrzykiwanej stężonym nadsączem z hodowli Escherichia coli nie były chronione przed infekcją bakteryjną. Późniejsze doświadczenia pokazały, że składniki obecne w pożywce hodowlanej i antygeny Escherichia coli, które mogły być obecne w małych ilościach w oczyszczonym preparacie nie wspomagają obserwowanej ochrony przeciw Neisseria meningitidis.

184 373

Tabela 4

Immunizacja oczyszczonym zrekombinowanym białkiem powierzchniowym o masie 22 kDa ustala ochronę przeciw późniejszym zakaZeniom bakteriami Neisseria meningitidis szczepu 608B (B :2a.Pl. 2)

Doś- wiad- czenie	Grupa	Liczba Zywych myszy po zaraZeniu	% przeZywalności
24 godz.	48 godz.	72 godz.
1	10 pg oczyszczonego 22 kDa	20/20		16/20	80
10 pg BSA	17/19		8/19	42
2	20 pg oczyszczonego 22 kDa	9/10	8/10	8/10	80
20 fig stęZonego nadsączu z E coli	7/10	5/10	2/10	20
20 pg BSA	6/10	4/10	2/10	20
bufor fosforanowo solny	8/10	0/10	0/10	0

Wnioski

Wstrzyknięcie oczyszczonego zrekombinowanego białka powierzchniowego o masie 22 kDa w ogromnym stopniu chroni immunizowane myszy przed rozwojem śmiertelnej infekcji Neisseria meningitidis.

Przeciwciała z obecnego wynalazku są zilustrowane przez linie komórkowe mysich hybrydom wytwarzających przeciwciała monoklonalne Me-1 i Me-2 złoZone 21 lipca 1995 roku w American Type Culture Collection w Rockville, Maryland. USA. Depozyt oznaczono numerami przyjęcia HB11959 (Me-1) i HB 11958 (Me-7).

Przykład VII.

Analiza sekwencji innych szczepów Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae

Fragment DNA o wielkości 2,75 kb otrzymywany w wyniku trawienia Cla I zawierający gen kodujący białko powierzchniowe o masie 22 kDa wyizolowano z genomowego DNA róZnych szczepów Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae w sposób opisany w przykładzie III.

a) szczep MCH88: Sekwencję nukleotydową szczepu MCH88 (kliniczny izolat) przedstawiono na fig. 8 (SEQ ID NO:3). Na podstawie danych eksperymentalnych otrzymanych dla szczepu 608B (przykład III), wydedukowano przypuszczalną sekwencję lidera odpowiadającą aminokwasom -19 do -1 (MKKALAALIALALPAAALA).

Przeszukanie utworzonych baz danych potwierdziły, Ze powierzchniowe białko o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis szczepu MCH 188 (SEQ ID NO:4) lub kodujący je gen (SEQ ID NO:3) nie były wcześniej opisane.

b) szczep Z4063: Sekwencję nukleotydową szczepu Z4063 [Wang J.-F. i wsp. Infect Immun., 60, str. 5267 (1992)] przedstawiono na fig. 9 (SEQ ID No:5). Na podstawie danych doświadczalnych uzyskanych dla szczepu 608B (przykład 3), wydedukowano przypuszczalną sekwencję lidera odpowiadającą aminokwasom od -19 do -1 (M-K-K-A-L-A-T-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A). Przeszukiwanie utworzonych baz danych potwierdziło, Ze powierzchniowe białko o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis szczepu Z4063 (SEQ ID NO:6) lub kodujący je gen (SEQ ID NO:5) nie były wcześniej opisane.

c) Neisseria gonorrhoeae szczep b2: Sekwencję nukleotydową Neisseria gonorrhoeae szczepu b2 (serotyp 1. Nat. Ref. Center for Neisseria, LCDC, Ottawa, Kanada) przedstawiono na fig. 10 (SEQ ID NO:7). Na podstawie danych doświadczalnych uzyskanych dla szczepu 608B (przykład III), wydedukowano przypuszczalną sekwencję lidera odpowiadającą aminokwasom od -19 do -1 (M-K-K-A-L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A). Przeszukiwanie utworzonych baz danych potwierdziło, Ze białko powierzchniowe o masie 22 kDa z Neisseria gonorrhoeae szczepu b2 (SEQ ID NO:8) lub kodującego je genu (SEQ ID NO:7) nie były wcześniej opisane.

184 373

Figura 11 pokazuje sekwencję najwyższej zgodności ustaloną w oparciu o sekwencje wszystkich czterech badanych szczepów. Szczep MCH posiada insercję jednego kodonu (TCA) przy nukleotydzie 217 lecz ogólnie wszystkie cztery szczepy wykazują uderzającą howologię.

Figura 12 obrazuje homologię pomiędzy awinrkwasrwymI sekwencjami pomiędzy wydrukowanymi sekwencjami awinokwasrwcwi otrzcwancwś z czterech szczepów. Jest ona wyższa od 90% identyczności pomiędzy wszystkimi czterema szczepami.

Przykład VIII.

Odpowiedź immunologiczna królików i małp na białko powierzchniowe o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis

Dla oznaczenia wytwarzania przeciwciał jako odpowiedzi na immunizację zrekrwbinowanym białkiem o masie 22 kDa u zwierząt innych niż mysz iosu^z^^o króliki i małpy.

a) Króliki

Samce królików rasy Nowa Zelandia iwwunśzowαnr preparatami zewnętrznych błon otrzymanych z E. coli szczepu JJM109 niosącego plazmid pN2202 lub plazmid kontrolny pWKS30 (szczepy i plazmidy opisano w przykładzie III). Ekstrakcję chlorkiem litu użytą, dla otrzymania preparatów zewnętrznych błon przeprowadzono w sposób wcześniej opisany przez wynalazców [Brodeur i wsp. Infect. tamm. 50, 510 (1985)]. Zawartość białek w tych preparatach oznaczano metodą LowiT/ego zaadaptowaną dla frakcji błonowych [Lowry i wsp.

J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)]. Króliki nastrzykiwano podskórnie i domięśniowo w kilka miejsc dwukrotnie co trzy tygodnie 150 jog jednego z opisanych wyżej preparatów zewnętrznych błon. W iwwunizaojś tej jako adjuwanta użyto QuilA o końcowym stężeniu 20% (obj./obj.) (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont., Kanada). Rozwój specyficznej odpowiedzi humoralnej analizowano przez ELISA używając jako opuszczającego antygenu preparatów zewnętrznych błon z Neisseria meningitidis szczepu 608B (B:2a:P1.2) i technikę iwwunrblotu typu Western, które to metody były już opisane przez wynalazców [Brodeur i wsp., Infect. Immun. 50, 510 (1985); Martin i wsp., Eur. J. Immunol. 18, 601 (1988)]. W oznaczeniu tym użyto przeciwciał oślich skierowanych przeciw iwwunrglrbulInrm królika i wyznakowanych fosfatazą alkaliczną lub peroksydazą (Jackson IwwunrResearoh Laboratories, West Grove,PA).

Wstrzyknięcie preparatów zewnętrznych błon E. coli zawierających zrekombinowane białko o masie 22 kDa w kombinacji z adjuwantem QuilA wywoływało u królika silną specyficzną odpowiedź humoralną. oznaczoną przez ELISA na 1/32 000 (fig. 13). Przeciwciała których wytwarzanie zostało wywołane zrekombinowanyw białkiem o masie 22 kDa reagowały z oczyszczonym zrekowbśnrwanyw białkiem o masie 22 kDa, lecz co ważniejsze, rozpoznawały również naturalne białko jakie wytwarzane jest i zakotwiczone w zewnętrznej błonie Neisseria meningitidis. Doświadczenia typu Western i immunoblot jasno wykazały, że przeciwciała obecne po drugim wstrzyknięciu rozpoznają na błonach nitrocelulozowych takie samo pasmo białkowe jakie ujawniane jest przez Mab Me-2 (opisane w przykładzie TI) które jest specyficzne dla białka o masie 22 kDa.

b) Małpy

Dwa osobniki Macaca fascicnlaris imwunśzowano przez wstrzyknięcie każdemu 100 jog (K28) i 200 fig (1276) oczyszczonego przez powinowactwo zrekombinowanego białka o masie 22 kDa na wstrzyknięcie. Metody użyte do wytworzenia i oczyszczenia białek z E. coli szczepu BL21De3 opisano w przykładzie III. Jako adjuwanta w tej śmwunizacji użyto Alhydrogel o końcowym stężeniu 20% (obj./obj.) (CedarLane Laboratories, Hornby, Ont., Kanada). Małpy otrzymały dwa domięśniowe zastrzyki w trzctygrdnirycoh odstępach czasu. Małpy kontrolne iwwunizrwano preparatem niezależnego zrekrwbinowanego białka otrzymanym zgodnie z takimi samymi procedurami. Surowice badano w wyżej opisany sposób. W oznaczeniu tym użyto znakowanych alkaliczną fosfatazą lub peroksydazą kozich przeciwciał skierowanych przeciw Iwmunoglobulinom człowieka (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove,PA).

184 373

W przypadku małpy K28 którą immynIząwauą 100 pg oczyszczonego białka na wstrzykuiękie, specyficzne przeclwkiała będące odpowiedzią pojawiały się szybciej i były silniejsze niż te które obserwowano u małpy 1276 której wstrzykiwano 200 pg białka (fig. 14). Przeciwciała specyficzne przeciw naturalnemu białku o masie 22 kDa IoW wykrywosą przez immunąblot Westerna, były obecne w surowicach immynlząwαsych małp już w dwadzieścia jeden dni po pierwszej immumzacji, lecz nie występowały w surowicach małpy kontrolnej po dwóch wstrzyknięciach kontrolnego antygenu.

Wuiosnk

Wymki pnoeantawlonn w przykładach II i V jasno pokozuj¾ że wstrzyknięcie zrekombmowouego białka o 22 kDa może wywołać u myszy skierowoaą. przeciw szczepom Neisseria meningitidis obronną odpowiedź humąnaluą. Co ważniejsze, wyniki proeastawioun w przykładzie dowodzą, że odpowiedź lmmunolągIkzua nie jest ągnanikzoua do jednego gatunku, lecz znekąmbiuowαse białko pąwlnnzchuiown będące przedmiotem wynalazku może również pobudzać układ immunologiczny innych gatunków takich jak szczur lub małpa.

Przykład IX.

Mapowanie epitopu białka o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis

Epitopy białka powierzchniowego z Neisseria meningitidis o masie 22 kDa mapowano stosując metodę ąs-sauą przez jednego z wynalazców [Martin i wsp. Infect. Immun (1991): 59:1457-1464). Identyfikację linIąwngo nsitąsu dąkąuaną używając 18 zachodzących na siebie syntetycznych peptydów pokrywających całą sekwencję białka o masie 22 kDa pochodzącego z Neisseria meningitidis szczepu 608B (fig. 15) i wysąkąoktywnej surowicy otrzymanej po immusizacjl tym białkiem. Identyfikacja dąmiuującej immuuologikznie części białka o masie 22 kDa może być pomocnym dla projnktąwauia nowych wydajnych szkzesionek. Ponadto zlokalizowanie nsltopu rozpoznawanego przez komórki B dostarcza również wartościowych informacji dotyczących struktury przestrzennej białka zlokolioąwanegą w zewnętrznej błąuie Neisseria meningitidis.

Wszystkie peptydy zsyutetyząwann przez BioChem Immunąsystems Inc. (Montreal, Kanada) przy użyciu automatycznego syntetyzero peptydów Applieb Biąsystnms (Foster City, Calif.). Ztynteąyzowane polisepąyay oczyszczono przez wysąkokIśuien-ową chromatografię cieczową na odwrotnej fazie. Peptydy CS-845, CS-847, CS-848, CS-851, CS-852 i CS-856 (fig. 15) usłysuiauą w małej objętości 6M chlorowodorku guanidyny (J.T. Baker, Ontario, Kanada) lub DMSO (J.T. Baker, Ontario, Kanada). Stężenie peptydów doprowadzano destylowaną wodą do 1 mg/ml. Wszystkie pozostałe peptydy bezpośrednio rozpuszczano w destylowanej wodzie, a ich stężenie również doprowadzano do 1 mg/ml.

Oznaczenie peptydów przez ązuaczeuin lmmuuątorbkyjne na osadzonym enzymie (ELISA) przeprowadzono powlekając syntetycznymi peptydami, o stężeniu 50 pg/ml w 50 mM buforze węglanowym pH 9,6, płytki mikrotitracyjun (Immulon 4, Dynatech Laboratories Inc., ΟΗοιΙΕ-Πυ, VA). Po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej płytki płukano buforem fosforanowo solankowym (PBS) zawierającym 0,05% (wag./obj.) Tween 20 (Sigma Chemicals Co., St.-Lou-s, Mo.) i blokowane PBS zawierającym 0,5% (wag/obj.) albuminy z surowicy wołu (Sigma). Surowicę otrzymywaną z myszy i małp immuuizowouych oczyszczonym przez sowiuąwactwą zrekombmowanym białkiem powierzchniowym o 1110^^ 22 kDa rozkieńkzauą, a następnie szouą po 100 pl każdego rozcieńczenia na oddzielną studzienkę płytki ELISA i inkubowauo przez 1 godz. w 37°C. Płytki płukano trzykrotnie, dodawano rozcieńczonych zgodnie z zaleceniomi producenta, komugowanych z alkaliczną fosfataza kozich przeciwciał skierowanych przeciw mysim lub ludzkim immunoglobulinom (Jackson ImmusąRnsearch Laboratories. West Grove, PA). Po 1 godzisnnj inkubacji w 37°C płytki płukano 100 pl dwuetauoląomIuy [10% (obj./obj.), pH 9,8) zawierającej p-nltro-fenylofąsforan (Sigma) w stężeniu 1 mg/ml. Po 60 min aąkąuywoną przy pomocy czytnika do mikropłytek odczytu reakcji (przy λ = 410 nm).

184 373

Dla zlokalizowania w białku epitopu rozpoznawanego przez komórki B z powodzeniem użyto mysich i małpich przeciwciał otrzymanych po immunizacji oczyszczonym przez powinowactwo zrekombinowanym białkiem o masie 22 kDa (przykład VIII) w kombinacji z osiemnastoma zachodzącymi na siebie syntetycznymi peptydami. Epitopy te zlokalizowano w obrębie rozmieszczonych na białku trzech domen antygenowych.

Pierwszy obszar zlokalizowano pomiędzy aminokwasami 51 i 86. Przeprowadzona analiza komputerowa z wykorzystaniem różnych algorytmów wykazała iż region z najwyższym prawdopodobieństwem jest immunologicznie ważnym gdyż jest hydrofilowy i wyeksponowany na powierzchni. Co więcej porównanie sekwencji czterech białek, które przedstawiono na fig. 12 pokazuje, że jedna z większych zmian jaką jest insercj a jednego aminokwasu w pozycji 73 jest również zlokalizowana na tym obszarze.

Surowice odpornościowe zlokalizowały drugą domenę antygenową, lokującą się na obszarze między aminokwasami 110 i 140. Co interesujące analiza sekwencji wykazała, że siedem z czternastu aminokwasów nie konserwowanych pomiędzy sekwencjami czterech białek jest zgrupowanych na tym obszarze białka.

Trzecia domena antygenowa stanowiąca bardzo konserwatywną część białka zlokalizowana pomiędzy aminokwasami 31 a 55 była rozpoznawana tylko przez surowicę z małpy.

Przykład X.

Indukowany termicznie wektor ekspresyjny dla produkcji na dużą skalę białka powierzchniowego o masie 22 kDa

Gen kodujący białko powierzchniowe o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis wrekombinowano do plazmidu p629 [George i wsp. Bio/technology 5: 600-603 (1987)]. Kasetę ekspresyjną z wrażliwego na temperaturę genu represorowego pochodzącego z bakteriofaga XcI857 z której wydeletowano funkcjonalny promotor Pr przenosił plazmid p629 wykorzystujący promotor PL dla kontroli syntezy białka powierzchniowego o masie 22 kDa. Inaktywacja represora cl857 przez zmianę temperatury hodowli z 30°C da około 38°C powoduje wytwarzanie białek kodowanych przez plazmid. Indukcja ekspresji genów w komórkach E. coli przez podniesienie temperatury jest korzystne przy hodowli na dużą skalę gdyż może być łatwo osiągnięta przez nowoczesne fermentory. Inne indukowalne wektory ekspresyjne zazwyczaj wymagają dodania szczególnych cząsteczek takich jak laktoza lub izopropylotio-p-D-galaktozyd (IPTG) do podłoża hodowlanego celem indukcji ekspresji pożądanych genów.

Stosując jako startery następujące dwa oligonukleotydy

OCRR8: 5' - TAATAGATCIAraAA/\AAACX'WCTT'GCCAC-3' i OCRR9:3'- CACGCGCAGTTTAAGAtAGCCAGATTA-S' SAtnpizikowano przez

PCR fragment o długości 540 nukleotydów z genomu Neisseria meningitidis szczepu 608B. Startery te odpowiadają sekwencjom znalezionym na obu końcach sekwencji nukleotydowej genu kodującego białko o masie 22 kDa. Dla uproszczenia klonowania produktów PCR do starterów tych włączono sekwencję rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny Bglll (AGATCT). Przed trawieniem Bgl II produkt PCR oczyszczano w żelu agarozowym. Otrzymany po trawieniu Bgl II fragment o długości około 525 par zasad wrekombizowywano do plazmidu p629 wykorzystując występujące w nim sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Bgl II i Bam HI. Plazmid zawierający wrekombinowany produkt PCR, nazwany pNP2204, użyto do transformacji komórek E. coli szczepu DH5aF'IQ. Częściową mapę restrykcyjną plazmidu pNP2204 przedstawiono na fig. 16. Otrzymane kolonie sprawdzano przy pomocy przeciwciał monoklozalzych skierowanych przeciw białku powierzchniowemu o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis opisanych w przykładzie II. Analiza typu Western biot jakiej poddano otrzymane klony jasno dowiodła, że białko syntetyzowane przez E. coli było kompletne i migrowało w żelu w trakcie SDS-PAGE jak naturalne białko powierzchniowe o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis. Z wyselekcjonowanych klonów oczyszczono plazmidowy DNA, a następnie oznaczono jego sekwencję nukleotydową.

Sekwencja nukleotydowa wstawki przenoszonej przez plazmid jest doskonale zgodna z przedstawioną na fig. 1 sekwencją nukleotydową kodującą u Neisseria meningitidis białko o masie 22 kDa.

184 373

W badaniach nad poziomem syntezy białka powierzchniowego o masie 22 kDa w oparciu o temperaturowo indukowany plazmid żNP2204 użyto w transformacji następujących szczepów E. coli: W3110, JM105, BL21, TOPP1, TOPP2 i TOPP3. Dla każdego szczepu określono poziom syntezy białka powierzchniowego o masie 22 kDa oraz jego lokalizację w różnych frakcjach komórkowych. Hodowle wytrząsano w szklanych kolbach stożkowych zawierających pożywkę LB (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY) wykazując, że podniesienie temperatury z 30°C do 39°C wydajnie indukuje ekspresję genu. Analiza zależności syntezy białka od czasu przeprowadzona przy pomocy SDS-PAGE wykazała, że białko pojawia się już w 30 min po indukcji oraz, że jego poziom rośnie w sposób ciągły wraz z wydłużaniem czasu indukcji. Dla szczepów E. coli W3110 i TOPP1 poziom białka o masie 22 kDa określono na 8 do 10 mg na litr hodowli. W przypadku obu tych szczepów większość białka o masie 22 kDa jest wbudowana w zewnętrzną błonę bakterii.

Przykład XI

Oczyszczanie białka o masie 22 kDa z Neisseria meningitidis

Sposób oczyszczania białka przedstawiony w tym przykładzie jest odmienny od wcześniej opisanego w przykładzie III bowiem w przypadku szczepów E. coli znamienita większość białka o masie 22 kDa jest związana z zewnętrzną błoną komórki, a nie uwalniana do nadsączu z podłoża w którym prowadzono hodowlę. Pożywkę LB zawierająca ampicylinę o stężeniu 50 fJgml (Sigma) szczepiono całonocną hodowlą E. coli (wyhodowaną w temperaturze 30°C) szczepu W3110 lub TOPP1, a następnie hodowlę wytrząsano (250 obrotów na minutę) w temperaturze 30°C, aż do osiągnięcia przez nią gęstości optycznej 0,6 (A = 600 nm), następnie celem zaindukowania wytwarzania białka temperaturę hodowli podnoszono na trzy do pięciu godzin do 39°C. Komórki bakterii zbierano przez wirowanie przez 15 min przy 8 000 xg w 4°C i dwukrotnie płukano buforem fosforanowo solnym (PBS) o pH 7,3. Komórki bakterii rozbijano ultradźwiękami (można również użyć dezintegracji balistycznej lub rozbijania ciśnieniowego). Nierozbite komórki usuwano przez wirowanie przez 5 min przy 5 000 xg. Zewnętrzne błony oddzielano od składników cytoplazmatycznoch przez ultrawirowanie przez 1 godz. przy 100 000 xg w 10°C. Zawierający błony osad podnoszono w małej objętości PBS pH 7,3. Do wypłukania z błon białka powierzchniowego o masie 22 kDa używano takich detergentów jak Empigen BB (Calbiochem Co., LaJolla, Ca), Zwittergent-3,14 (Calbiochem Co.) lub β-oktyloglukozod. Detergent dodawano do frakcji błon do stężenia 3, po czym mieszaninę lp2ubowapo przez 1 godz. w 20°C. Nie upłynniony materiał usuwano przez ultrawiruwapie przez 1 godz. przy 100 000 xg w 10°C.

Białko o masie 22 kDa było wydajnie upłynniane przez wszystkie trzy detergenty jakkolwiek Joktyloglukozyd miał tę przewagę, że łatwo usuwał szereg niepożądanych białek błonowych gdyż były one nierozpuszczalne w tym detergencie co za tym idzie można je było łatwo oddzielić, przez wirowanie, od nadsączu. Celem usunięcia detergentu nadsącz zawierający białko o masie 22 kDa dializowano biernie wobec kilku zmian buforu PBS. Dla dalszego usuwania niepożądanych białek z preparatu białka powierzchniowego o masie 22 kDa można użyć trawienia proteinazą K (jak w przykładzie I). Dla usunięcie niepożądanych zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi i liżopulisacharodami można wprowadzić dwa dodatkowe etapy oczyszczania polegające na różnicowym wosalamu siarczanem amonu lub wytrącaniu rozpuszczalnikiem organicznym oraz ultrafiltrację po czym dla otrzymania oczyszczonego białka o masie 22 kDa próbka może zostać przepuszczona przez żel lub poddana chromatografii jonowymiennej. Dla oczyszczenia białka o masie 22 kDa można użyć również, jak opisano to w przykładzie III chromatografii powinowactwa.

Przykład XII.

Użycie białka powierzchniowego o masie 22 kDa jako szczepionki dla człowieka

Celem przygotowania szczepionki dla człowieka z pośród opisanych wcześniej żolipeżtydów mogą być wyselekcjonowane odpowiednie dla białka powierzchniowego o masie 22 kDa antygeny. Przykładowo biegły w sztuce może zaprojektować szczepionkę opartą na żullpeptydzie o masie 22 kDa lub jego fragmencie, a tym samym zawierającą immupugenpy epitop.

184 373

Szczególnie użytecznym jest użycie technik biologii molekularnej dla przygotowania zasadniczo czystego zrekombinowanego antygenu.

Kompozycja szczepionki może przyjmować różnorodne postacie. Przykładowo może być ona podawana jako substancja stała, półstała lub płynna, być proszkiem, roztworem, zawiesiną lub liposomami. Przypuszczamy że antygeny powierzchniowe białka o masie 22 kDa, które przedstawiono w tym wynalazku, mogą wywoływać obronną odpowiedź immunologiczną gdy zostaną podane ludziom to kompozycja omawianej szczepionki będzie podobna do używanych dla immunizacji ludzi innymi białkami i polipeptydami przykładowo tężec i błonica. Co za tym korzystnym będzie by w składzie tego wynalazku znalazły si<ę farmaceutycznie akceptowalne adjuwanty takie jak niepełny adjuwant Freunda czy wodorotlenek glinu, peptyd muramylowy, emulsja wody w oleju, liposomy, ISCOM lub CTB lub nietoksyczna podjednostka B toksyny cholery. Najkorzystniej jeśli kompozycja będzie zawierała jako adjuwant emulsję wody w oleju lub wodorotlenek glinu. Kompozycja będzie podawana pacjentom w jeden z wielu farmaceutycznie akceptowalnych sposobów w tym: domięśniowo, śródskórnie, podskórnie lub miejscowo. Korzystnie szczepionka będzie podawana domięśniowo. Ogólnie podawanie będzie obejmowało początkowe wstrzyknięcie, najprawdopodobniej z adjuwantem w ilości 0,01 do 10 mg korzystnie 0,1 do 1,0 mg antygenu powierzchniowego białka o masie 22 kDa na pacjenta, po którym nastąpi najprawdopodobniej jedno lub więcej doszczepień. Najprawdopodobniej doszczepienia będą wykonane w około 1 do 6 miesięcy po pierwszym zastrzyku.

Wraz z rozwojem szczepionki rozważyć należy możliwość immunizacji przez śluzówkę. Idealna szczepionka do podania przez śluzówkę będzie bezpiecznie podawana doustnie lub donosowo jako jedna lub kilka dawek i wywoływać będzie obecność przeciwciał ochronnych na stosownych powierzchniach w obrębie całego układu immunologicznego. W skład szczepionki śluzówkowej może wchodzić adjuwant, szczególne bierne nośniki lub zrekombinowane żywe wektory.

Przeciwciała przeciw białku powierzchniowemu o masie 22 kDa z wynalazku są użyteczne dla biernej immunoterapii i immunoprofilaktyki ludzi zarażonych Neisseria meningitidis lub spokrewnionymi bakteriami takimi jak Neisseria gonorrhoeae lub Neisseria lactamica. Sposób podawania i harmonogram takiej biernej immunizacji byłby podobnym do stosowanego dla innych pasywnych immunoterapii.

Przeciwciała. Przykładowymi przeciwciałami zgodnymi z tym wynalazkiem są wytwarzane przez hybrydomy przeciwciała monoklonalne Me-1 lub Me-7 złożone w American Type Culture Collection w Rockville, Maryland, USA, 21 lipca 1995 roku, oznaczone jako Linie Mysich Komórek hybrydomy Me-1 i Me-7. Depozytom tym nadano numery przyjęcia HB 11959 (Me-1) i HB 11958 (Me-7).

Podczas gdy opisujemy tu szereg realizacji wynalazku jest oczywistym, że nasza podstawowa realizacja może być zmodyfikowana w celu wprowadzenia innych realizacji, które wykorzystywać będą kompozycje i sposoby według wynalazku. Co za tym idzie wskazane jest, aby zasięg wynalazku obejmował wszystkie alternatywne realizacje i odmiany które są określone w powyższym opisie i dołączonych zastrzeżeniach. Wynalazek nie jest ograniczony przez szczególne realizacje, które nie mogą być przedstawione tutaj w przykładowy sposób.

184 373 (2) Informacja o SEQ ID NO:23 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 15 aminokwasy (B) Rodzaj aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (ii) Źródło (A) Organizm: Neisseria meningitidis (B) Szczep: 608B (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:23

Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val 1 5 10 15 (2) Informacja o SEQ ID NO:24 (i) Charakterystyka sekwencji.

(A) Długość 15 aminokwasy (B) Rodzaj: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (ii) Źródło (A) Organizm: Neissena meningitidis (B) Szczep: 608B (xi) Opis sekwencji' SEQ ID NO'24

Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu 15 10 15 (2) Informacja o SEQ ID NO'25 (i) Charakterystyka sekwencji.

(A) Długość: 14 aminokwasy (B) Rodzaj: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (ii) Źródło (A) Organizm: Neisseria meningitidis (B) Szczep. 608B (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:25

Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe 15 10

184 373 (2) Informacja o SEQ ID NO 26 (i) Charakterystyka sekwencji (A) Długość: 25 aminokwasy (B) Rodzaj, aminokwasowa (D) Topologia liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki białko (ii) Źródło (A) Organizm Neisseria meningitidis (B) Szczep: 608B (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:26

Phe Ala Val Asp Tyr Tnr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Th_r15 10 15

Asp Phe Lvs Leu Tyr Ser Ile Gly Ala 20 25

184 373

FZGURB 1

TCCGCAAAOC AGCCGCATAC CGCTACGTAT CTTGAAGTAT TGAAAATATT ACGATGCAAA 60

AAAGAAAATT TAAGTATAAT ACAGCAGGAT TCTTTAACGG ATTCTTAACA ATTTTTCTAA 120

CTCACCATAA IagGaIccaĄA AT ATS AAA AAA GCA CTT CCC ACA CTG ATT CCC 172

Mac Lys Lys Ale Leu Ala Thr Lau Ile Ala

-19

-15

-10

CTC

GCT

CTC

CCC

GCC

GCA

CTG

GCG

GAA

GGC

GCA

TCC

GCC

TTT

TAC

220

Leu

Ala

Lau

Pro

Ala -5

Ala

Leu

Ala

Glu 1

Gly

Ala

Ser

Gly 5

Phe

Tyr

CTC

CAA

GCC

GAT

GCC

GCA

CAC

GCA

AAA

GCC

TCA

AGC

TCT

TTA

GGT

TCT

268

Val

Gin

Ala 10

Asp

Ala

His

Ala 15

Lya

Ala

Ser

Ser 20

Leu

Gly

Ser

CCC

AAA

GGC

TTC

AGC

CCG

CGC

ATC

TCC

GCA

GGC

TAC

CGC

ATC

AAC

GAC

316

Ala

Lys 25

Gly

Phe

Ser

Pro

Arg 30

Ile

Ser

Ala

Gly

Tyr 35

Arg

Ile

Asn

Asp

CTC

CGC

TTC

GCC

GTC

GAT

TAC

ACG

CGC

TAC

AAA

AAC

TAT

AAA

GCC

CCA

364

Leu «0

Arg

Phe

Ala

Val

Asp 45

Tyr

Thr

Arg

Tyr

Lye 50

Asn

Tyr

Lys

Ala

Pro 55

TCC

ACC

GAT

TTC

AAA

CTT

TAC

AGC

ATC

GGC

GCG

TCC

GCC

ATT

TAC

GAC

412

Ser

Thr

Asp

Phe

Lys 60

Leu

Tyr

Ser

Ile

Gly 65

Ala

Ser

Ala

Ile

Tyr 70

Asp

TTC

GAC

ACC

CAA

TCG

CCC

GTC

AAA

CCG

TAT

CTC

GGC

GCG

CGC

TTG

AGC

460

Phe

Asp

Thr

Gin 75

Ser

Pro

Val

Lys

Pro 80

Tyr

Leu

Gly

Ala

Arg 85

Leu

Ser

CTC

AAC

CGC

GCC

TCC

GTC

GAC

TTG

GGC

AGC

GAC

AGC

TTC

AGC

CAA

508

Leu

Asn

Arg 90

Ala

Ser

Val

Asp

Leu 95

Gly

ser

Asp

Ser 100

Phe

Ser

Gin

ACC

TCC

ATC

GGC

CTC

GGC

GTA

TTG

ACG

GGC

GTA

AGC

TAT

GCC

CTT

ACC

556

Thr

Ser 105

Ile

Gly

Leu

Gly

Val 110

Leu

Thr

Gly

Val

Ser 115

Tyr

Ala

Val

Thr

CCG

AAT

CTC

GAT

TTG

GAT

GCC

GGC

TAC

CGC

TAC

AAC

TAC

ATC

GGC

AAA

604

Pro 120

Asn

Val

Asp

Leu

Asp 125

Ala

Gly

Tyr

Arg

Tyr 130

Asn

Tyr

Ile

Gly

Lys 135

CTC

AAC

ACT

GTC

AAA

AAC

GTC

CGT

TCC

GGC

GAA

CTG

TCC

GTC

GGC

GTC

652

Val

Asn

Thr

Val

Lys

Asn

Val

Arg

Ser

Gly

Glu

Leu

Ser

Val

Gly

Val

140 145 150

CGC CTC AAA TTC TCATATGCGC CTTATTCTGC AAACCGCCGA GCCTTCCGCG 704

Arg Val Lye Phe

155 gttttctttt ctgccaccgc aactacacaa gccggcggtt ttgtacgata atcccgaatg 764

CTGCGGCTTC TGCCGCCCTA TTTCTTGAGG AATCCGAAAT GTCCAAAACC ATCATCCACA 824

CCGACA

830

184 373

Fig. 2

184 373

Fig 3a pH7.2 pH9.0

1-1 |-1

-SDS +SDS -SDS +SDS I I I I I I | | NT T NT T NT T NT T

3 4 5 6 7 8

Fig 3b

184 373

Fig. 4a

ł 2 3 4 5 6

Fig. 4b

I 23456

184 373

Fig 5

35000

30000 £ 25000

20000 c3

15000 >

10000 c

-§ 5000

N

Szczep bakterii

5

2

s?

2?

ffl

O

S

<n

<o Ol

<o

o>

<r>

o σ>

o

<*>

«Ο

o

o>

Cl

r*.

o

<5

o

*“

ΙΛ

<o

o

V

in

V

<o

2

*«·

c-

O

o

<©

e—

Ci

oo

<o

r**

co

·*“

o

_ł

w

fSĆ

2

Z

N. meningftidis

184 373

Fig. 6A

3 4

Fig. 6B

I 2345 789 10

Fig.óc

NTCT K

184 373

Fig- 7

184 373

Fig. 8 gtrtcttg&g ccattgaaaa tattacaatg caaaaagaaa ΑτττοΑβϊΑΤ mwmcm co

GA3TCTTTAA COOATTVWA ACCATTTTTC TOCCTGROCA TAM^SMSC Wa»S ATC 118

Hat -19

AAA AAA GCA CTT CCC GCA	CTG ATT GOC Leu Ilo Ala -10	CTC Leu	GOC CTC CCG GCC GOC GCA	166
Lys	Lys	Ala	Leu Ala Ala -15	Ala Lou Pro Ala -5	Ala Ala
ero	GCG	GAA	GGC GCA TCC	GGC TTT TAC	GTC	CAA GOC GAT GCC	GCA CAC	214
Leu	Ala	Glu 1	Gly Ala Ser	Gly Phe Tyr 5	Val	Gla Ala Asp Ala 10	Ala Ols
GCC	AAA	GCC	TCA AGC TCT	TTA GGT TCT	GCC	AAA GGC TTC AGC	CCG CGC	262
Ala 15	Lys	Ala	Ser Ser Ser 20	Leu Gly Ser	Ala	Lys Gly Phe Ser 25	Pro Arg 30
ATC	TCC	GCA	GGC TAC CGC	ATC AAC GAC	CTC	CGC TTC GCC GTC	GAT TAC	310
Ile	Ser	Ala	Gly Tyr Arg 35	Ile Asn Asp	Leu 40	Arg Phe Ala Tal	Asp Tyr 45
ACG	CGC	TAC	AAA AAC TAT	AAA CAA GTC	CCA	TCC ACC GAT TTC	AAA CTT	358
Thr	Arg	Tyr	Lys Asa Tyr 50	Lys Gla Val 55	Pro	Ser Thr Asp Phe 60	Lys Leu
TAC	AGC	ATC	GGC GCG TCC GCC ATT TAC	GAC	TTC GAC ACC CAA	TCC CCC	406
Tyr	Ser	Ile CS	Gly Ala Ser	Ala Ile Tyr 70	Asp	Phe Asp Thr Gla 75	Sar Pro
GTC	AAA	CCG	TAT CTC GGC	GCG CGC TTG	AGC	CTC AAC CGC GCC	TCC GTC	454
Val	Lys 00	Pro	Tyr Leu Gly	Ala Arg Leu 85	Ser	,Leu Asa Arg Ala 90	Ser Val
GAC	TTT	AAC	GGC AGC GAC	AGC TTC AGC	CAA ACC TCC ACC GGC	CTC GGC	502
Asp 95	Phe	Asa	Gly Ser Asp 100	Ser Phe Ser	Gla Thr Ser Thr Gly 105	Leu Gly 110
CTA	TTG	GCG	GGC CTA AGC	TAT GCC GTT	ACC	CCG AAT GTC GAT	TTG GAT	550
Val	Leu	Ala	Gly Val Ser 115	Tyr Ala Val	Thr 120	Pro Asa Val Asp	Leu Asp US
GCC	GOC	TAC	CCC TAC AAC	TAC ATC GGC	AAA	GTC AAC ACT GTC	AAA AAT	598
Ala Gly Tyr Arg Tyr Asa 130	Tyr 11® Gly 135	Lyc	Val Asa Thr Val 140	Lys Asa
GTC CCT TCC <3SC GAA CTC V«1 Arg Sar Gly Gla Lsa 145	TCC GOC GGC CTA CGC GIC AAA TTC Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Sfca 150 155	TCATM7&30C	650

CTTKTTOO9C AMGCeaceA GCOTgOBGC OCrmOTK TOCOCOBOOG CRACTACftCA 710

184 373

Fig. 9

CRCOCATOCG CCGOGTGATG CCGCCACCAC CATTTAAAGG CftAOGCOOGG CTTAACCGCT 60

TTGCCCTOGG CAMOCAGCC GGATAOCCCT AOGTATCTTG AAGTRTTAAA AATATTSCCA 120

TGCAAAAAGA AAASTTAACT ATAATAAACC ACAA3TCTTT AACGGATTCT TAACAATTTT ISO

TCTAACTGAC CATAAACGAA CCAAAAT ATG ΑΛΑ AAA CCA CTT CCC ACA CTG 231

Kai Lyo Lys Ala Leu Ala Thr Leu -19 -15

ATT Ile	GCC CTC CCT	CTC CCC GCC CCC CCA CTG OCG GAA CCC GCA TCC GCC	279
Ala -10	Leu Ala	Leu	Pro	Ala Ala Ala Lau -5	Ala	Glu Cly Ala Ser Gly
1	5
TTT	TAC	CTC CAA	GCC	CAT	GCC GCA CAC GCA	AAA	GCC TCA	AGC TCT TTA	327
Phe	Tyr	Val Cln	Ala 10	Asp	Ala Ala His Ala 15	Lys	Ala Ser	Ser Ser Leu 20
GGT	TCT	CCC AAA	GGC	TTC	AGC CCC CGC ATC	TCC	CCA CGC	TAC CGC ATC	375
Gly	Ser	Ala Lys 25	Gly	Phe	Ser Pro Arg Ile 30	Ser	Ala Gly	Tyr Arg Ile 35
AAC	GAC	CTC CGC	TTC	GCC	GTC GAT TAC ACG	CGC	TAC AAA	AAC TAT AAA	423
Asn	Asp	Leu Arg 60	Phe	Ala	Val Asp Tyr Thr 05	Arg	Tyr Lys 30	Asn Tyr Lys
GCC	CCA	TCC ACC	CAT	TTC	AAA CTT TAC AGC	ATC	GGC GCG	TCC GCC ATT	471
Ala	Pro 55	Ser Tfar	Asp	Phe	Lys Leu Tyr Sar 60	Ilo	Cly Ala 6S	Sar Ala Ile
TAC	GAC	TTC GAC	ACC	CAA	TOG CCC CTC AAA	CCG	TAT CTC	GGC GCG CGC	519
Tyr 70	Asp	Phe Asp	Thr	Gin 75	Ser Pro Val L^s	Pro 80	Tyr Leu	Gly Ala Arg 85
TTG	ACC	CTC AAC	CGC	GCC	TCC GTC GAC TTG	CGC	GGC ACC	GAC AGC TTC	567
Leu	Ser	Leu Asn	Arg 90	Ala	Ser Val Asp Lou 95	Gly Cly Ser	Asp Ser Pfea 100
ACC	CAA	ACC TCC	ACC	GGC	CTC GGC CTA TTG	GCC	GGC CTA	ACC TAT GCC	615
Ser	Gin	Thr Ser 105	Thr	Gly	Lou Gly Val Lau 110	Ala	Cly Val	Ser Tyr Ala 115
GIT	ACC	CCC AAT	GTC	CAT	ttc gat ccc ccc	TAC	CCC TAC	AAC TAC ATC	663
Val	Thr	l?ro Asn 120	Val	Asp	Lou Asp Ala Cly Tyr 123	Ar? Tyr 130	Aon Tyr Ile
CCC	AAA	CTC AAC	ACT	CTC	AAA AAC CTC CCT TCC	GGC CAA	CTG TCC CCC	711
Gly Lyo 133	Val Asa	Thr	Val	Lyg Asa Val Ar? Ser 160	Gly da 145	Leu Ser Ala

CCT GTE CCC GTC AAA TTC TOaTATCOGC CTTATTCTSC AAACOCCOSA 739 dy Val Ar? Vol Lyo Sho ISO 155

CCCTTCCGCC GTTTrcmT CTGCCAOCGC AftCTACACAA GCCSCCCCTT TTCTfiCGATA 819

ATCOOGAATG CTGCGGCTTC TCCOCCCCTA T

830

184 373

Fig 10

CCCCGCCTTT CCCGTTTTTT CCKAACCGTT TCCAAGTTTC ACCCATOCGC CGCGTCATGC 60 CGCCGTTTAA GGGCAACGCG ΟΟΟσίΤΜΟΒ GATTTCOCCT CGGCAAAGCA OOCGGATGCC 120 GCCCCOTATC TTGAGGCATT CAAAATATTA CGATCCAAAA AGAAAA3TTC MSSKSMONZ ISO GGCACGATTC TTTAACGGAT TATTAACAAT TTTTCTOOCT GACCASAAAG GAACCAAAAT 240

ATS Αλλ AAA	GOI Ala	CTT CCC GCA CTG ATT GCC CTC GCA CTC CCC GCC GCC	288
Mec Lys -1S	Lys	Leu -15	Ala	Ala Leu	Ile	Ala Leu -10	Ala	Lou Pro Ala -5	Ala
GCA CTC	GCC	GAA	GCC	GCA	TCC ccc	TTT	TAC CTC	CAA	GCC GAT CCC	GCA	336
Ala Leu	Ala	Clu 1	Cly	Ala	Ser Gly 5	Phe	Tyr Val	Gin Ala Asp Ala 10	Ala
CAC GCC	AAA	CCC	TCA	ACC	TCT TTA	GGT	TCT GCC	AAA	GGC TTC AGC	CCC	384
His Ala 15	Lys	Ala	Ser	Ser	Ser Leu 20	Cly	Ser Ala	Lys 25	Cly Phe Ser	Pro
CGC ATC	TCC	GCA	GCC	TAC	CGC ATC	AAC	GAC CTC	CGC	TTC GCC GTC	GAT	432
Arg Ile 30	Ser	Ala	Gly	Tyr 35	Arg Ile	Asn	Asp Leu 40	Arg	Phe Ala Val	Asp 45
TAC ACC	CCC	TAC	AAA	AAC	TAT AAA	GCC	CCA TCC	ACC	GAT TTC AAA	CTT	480
Tyr Thr	Arg	Tyr	Lys 50	Asn	Tyr Lys	Ala	Pro Ser 55	Thr	Asp Phe Lys 60	Leu
TAC ACC	ATC	GGC	CCG	TCC	GTC ATT	TAC	GAC TTC	GAC	ACC CAA TCC	CCC	528
Tyr Ser	Ile	Cly 65	Ala	Ser	Val Ile	Tyr 70	Asp Phe	Asp	Thr Gin Ser 75	Pro
GTC AAA	CCC	TAT	TTC	GCC	GCC CGC	TTC	AGC CTC	AAC	CCC GCT TCC	GCC	S76
Val Lys	Pro ¢0	Tyr	Phe	Gly Ala Arg 85	Leu	Ser Leu	Asa	Arg Ala Ser 90	Ala
CAC TTC	ccc	CGC	ACC	GAC	AGC TTC	AGC	AAA ACC	TCC	CCC GGC CTC	GGC	624
His Leu 95	Gly Cly	Ser	Asp	Ser Phe 100	Ser	Lys Thr	Ser 105	Ala Cly Leu	Gly
GTA TTC	CCG	GCC	GTA	AGC	TAT GCC	CTT	ACC CCC	AAT	GTC GAT TTC	GAT	672
Val Leu 110	Ala	Gly	Val	Ser 115	Tyr Ala	Val	Thr Pro 120	Asa	Val Asp Leu	Asp 12S
CCC COC	TAC	CGC	TAC	AAC	TAC GTC	CCC	AAA GTC	AAC	ACT GTC AAA	AAC	720
Ala Gly Tyr	Arg	Tyr 130	Asn Tyr Val	Cly Lył! Val 135	Asn	Thr Val lys 140	Asn
GTC CGT TCC GOC GAA Val Arg Ser Gly Glu	CTC TCC CCC GCC GTC COC Leu Ser Ala Gly Wal Arg	GIC Val	AAA TTC TCATATAOCC Lys Phe	772

145 150 155

GTTATTOCGC AAACOGOOGA GCCTTCGGCG GTTTTTTC

810

184 373

Fig U

MCH88-CRF	________ ________G_
eoea-GRF		........A.		.... .T....
24063 -ORF		........A.		.....T.___
gono b2~GR7 Consensus		........G.		.....A....
ATGAAAAAAG	CACTTGCCBC	ACTGATTGCC	CTCGCHCTCC	CGGCCOCCGC
MCHeS-aRT 60SB-CRF Z4063-ORP gono b2-ORF Consensus



ACTGGCGGAA	GGCGCATCCG	GCTTTTACGT	CCAAGCCGAT	GCCGCACACG
WCH88-ORP 608B-OBF Z4063-ORF gono b2-ORF Consensus	c........
X........
.A........ c........

CMAAAGCCTC	AAGCTCTTTA	GCTTCTGCCA	AAGGCTTCAG	CCCGCGCKTC
MCH88-ORF 608B-ORF Z4063-ORF gono b2~ORF Consensus



TCCGCAGGCT	ACCGCATCAA	CGACCTCCGC	TTCGCCCTCG	ATTACACGCG
MCH88-ORF 608B-ORF Z4063-ORF gono b2-ORF Consensus			T.........
	— ——	c.........
	___	c.........
	—-	c.........
CTACAAAAAC	TATAAACAAG	TCCCATCCAC	CGATTTCAAA	CTTTACAjGCA
MCH88-OK7 608B-ORF 28063-OFP gono b2-ORF Consensus		. .c.......		.......c..
	. .c.......		.......G..
	. .c.......		.......G. .
	. .T.......		.......G..
TCGGCGCGTC	CGTCATTTAC	GACTTCGACA	CCCAATCSCC	CGTCAAACCG
MCH88-ORR 608B-OFP Z40S3-ORP gono b2-GRP	.c......			. .C___.T.G	....TAK...
. .c......			..C...-T.G	...GGG...
. .c......			. .C.___T.G	. ...GGG...
...T......			. .T... .c.c	....osa...

TXTXTCGGCG

CGCGCTTCAG

100

ISO

150

ISO

150

200

250

247

250

100

297

298 300

350

347

Consensus

CCTCAACCGC

AClTKRItCGG 350

MCH38-ORP «ΟβΒ-CRF Z4083-OKF gono bJ-ORP

......C........AC...

......C........AT...

......C........AC...

.....-A........GC...

.. -G...... 400

.. -A...... 397 . . .G...... 397

.. .G...... 397

Consensus

CAGCGACAGC

TTCAGORAA ccrcaaooG

CCTCGGCCTA

TTGBCCOGCG 400

ΜΟΜβ-ΟΚΡ «08B-0RF 24043-ORT 9000 b2-OFT

450

447

Consensus

TAAOCTATGC

CGTTACCCCG

AATSTCGATT

TGGATGCCGG

CTACCGCTAC 450

tia/nt-aur	.....
ton-esT	......A.
Z40C3-GR7	.....-A
gono b2-ORR	......C.

Consensus . -T.......

. -C.......

..C.......

..c.......

300

497

CACTCTCAAA

AATGTCCCTT

OCGGCGAACT 500

AACTACKTCG

OCAAACTCAA

MCH88-OK7	.....C.	,.c	. -A. ......
C08B-0RP	.....T.	..c	..G.......
Z4063-OBF	.....c.	..T	..C.......
gono b2-OKP	.....c.	..c	..G.......

528

523

525

523

Consensus

GTCCGYCGGT

GTBCGCCICA

AATICTGA

528

184 373

Fig. 12 gonoB2 ......A.. Z4053 ......T...

608B ......T...

MCH88 ......A...

so

Consensus

MKKALA.LIA

LALPAAAtAE GASGFYVQAD AAHAKASSSL

GSAKGFSPRI gonoB2

Z4063

608B

MCH88

QV

DFDTQSFVKP

100

Consensus

SAGYRINBLR

FAVDYTRYKN YK-APSTDFK LYSIGASAIY

gonoB2 Ζ4Ο/Π	• F......	.. .-AH......	..K.-A.............. .....T..............
608B			.....I. . .	. .T........
MCH88		......FN....	.....T. . .

Consensus

YLGARLSLNR

ASVDLGGSDS FSQTS.GLGV LAGVSYAVTP

149

150

NVDLDAGYRY

ISO gonoB2 . - V......................

Z4063 .........................

608B ..................V......

MCH88 .........................

174

175

Consensus

NYIGKVNTVK

NVRSGELSAG VRVKF

175

184 373

Fig- 13

184 373

Fig 14

CQ o

\O

Oznaczenie ELISA stężenia wobec N meningitidis OMP

Czas (dni)

A 1 zastrzyk A 2 zastrzyk

184 373

F>g 15

MKKAIATLIA	LALPAAALAE	GASGFYVQAD	AAHAKASSSL GSAKGFSPRI	50
CS-840		CS-842	CS-844
	CS-841		CS-843
SAGYRINDLR	FATDYTRYKN	YKAPSTDFKL	YSIGASAIYD FDTQSPVKPY	100
	CS-846		CS-848
CS-845		CS-847	CS-849
		CS-857
LGARLSLNRA	SVDLGGSDSF	SQTSIGLGVL	TGVSYAVTPN VDLDAGYRYN	150
CS-850		CS-852	CS-854
	CS-851		CS-853
YIGKVNTVKN	VRSGELSVGV	RVKF		174

CS-856

CS-855

184 373

Fig 16

AmpiR

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Izolowany polinukleotyd znamienny tym, że polinukleotyd hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe o masie cząsteczkowej 22 kDa z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe o masie cząsteczkowej 22 kDa z Neisseria.
2. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym zasady od 200 do 664 sekwencji SEQ ID NO:1.
3. Polinukleotyd według zastrz. 2, znamienny tym, że komplement zawiera zasady od 143 do 664 sekwencji SEQ ID NO:1.
4. Polinukleotyd według zastrz. 3, znamienny tym, że komplement zawiera sekwencję SEQ ID NO: 1
5. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym zasady od 173 do 640 sekwencji SEQ ID NO:3.
6. Polinukleotyd według zastrz. 5, znamienny tym, że komplement zawiera zasady od 116 do 640 sekwencji SEQ ID NO:3.
7. Polinukleotyd według zastrz. 6, znamienny tym, że komplement zawiera sekwencję SEQ ID NO:3.
8. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym zasady od 265 do 729 sekwencji SEQ ID NO:5.
9. Polinukleotyd według zastrz. 8, znamienny tym, że komplement zawiera zasady od 208 do 729 sekwencji SEQ ID NO:5.
10. Polinukleotyd według zastrz. 9, znamienny tym, że komplement zawiera sekwencję SEQ ID NO:5.
11. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym zasady od 298 do 762 sekwencji SEQ ID NO:7.
12. Polinukleotyd według zastrz. 11, znamienny tym, że komplement zawiera zasady od 241 do 762 sekwencji SEQ ID NO:7.
13. Polinukleotyd według zastrz. 12, znamienny tym, że komplement zawiera sekwencję SEQ ID NO:7.
14. Izolowany polinukleotyd znamienny tym, że polinukleotyd hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją, DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, które jest odporne na proteinazę K i ma masę cząsteczkową 22 kDa.
15. Polinukleotyd według zastrz. 14, znamienny tym, że hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym zasady od 200 do 664 sekwencji SEQ ID NO: 1.
16. Polinukleotyd według zastrz. 15, znamienny tym, że komplement zawiera zasady od 143 do 664 sekwencji SEQ ID NO:1.
17. Polinukleotyd według zastrz. 16, znamienny tym, że komplement zawiera sekwencję SEQ ID NO: 1

184 373
18. Polinukleotyd według zastrz. 14, znamienny tym, że hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym zasady od 173 do 640 sekwencji SEQ ID NO:3.
19. Polinukleotyd według zastrz. 18, znamienny tym, że komplement zawiera zasady od 116 do 640 sekwencji SEQ ID NO:3.
20. Polinukleotyd według zastrz. 19, znamienny tym, że komplement zawiera sekwencję SEQ ID NO:3.
21. Polinukleotyd według zastrz. 14, znamienny tym, że hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym zasady od 265 do 729 sekwencji SEQ ID NO:5.
22. Polinukleotyd według zastrz. 21, znamienny tym, że komplement zawiera zasady od 208 do 729 sekwencji SEQ ID NO:5.
23. Polinukleotyd według zastrz. 22, znamienny tym, że komplement zawiera sekwencję SEQ ID NO:5.
24. Polinukleotyd według zastrz. 14, znamienny tym, że hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym zasady od 298 do 762 sekwencji SEQ ID NO:7.
25. Polinukleotyd według zastrz. 24, znamienny tym, że komplement zawiera zasady od 241 do 762 sekwencji SEQ ID NO:7.
26. Polinukleotyd według zastrz. 25, znamienny tym, że komplement zawiera sekwencję SEQ ID NO:7.
27. Izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1
28. Izolowany polinukleotyd zawierający zasady 143 do 664 SEQ ID NO: 1.
29. Izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję SEQ ID NO: 1
30. Izolowany polinukleotyd zawierający zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3.
31. Izolowany polinukleotyd zawierający zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3.
32. Izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję SEQ ID NO:3.
33. Izolowany polinukleotyd zawierający zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5.
34. Izolowany polinukleotyd zawierający zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5.
35. Izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję SEQ ID NO:5.
36. Izolowany polinukleotyd zawierający zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7.
37. Izolowany polinukleotyd zawierający zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7.
38. Izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję SEQ ID NO:7.
39. Zrekombinowana cząsteczka DNA, znamienna tym, że zawiera izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7 i zawiera sekwencję kontrolującą ekspresję funkcjonalnie połączoną, polinukleotydem.
40. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 39, znamienna tym, że sekwencja kontrolująca ekspresję jest indukowalną sekwencją kontrolującą ekspresję.
41. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 40, znamienna tym, że indukowalna sekwencja kontrolująca ekspresję jest wybrana z grupy sekwencji indukowanych termicznie, laktozą i IPTG.
42. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 40, znamienna tym, że indukowalna sekwencja kontrolująca ekspresję jest wybrana z grupy zawierającej promotory X PL, X PR, TAC, T7, T3, LAC TRP.

184 373
43. Zrekombinowana cząsteczka DNA według zastrz. 39, znamienna tym, że cząsteczką DNA jest pNP2204.
44. Jednokomórkowy gospodarz transformowany zrekombinowaną cząsteczką DNA, która zawiera izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7 i zawiera sekwencję kontrolującą ekspresję funkcjonalnie połączoną z polinukleotydem.
45. Jednokomórkowy gospodarz według zastrz. 45, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej: szczepy E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli DH5oF'IQ, E. coli W3110, E. coli JM105, E. coli BL21, E. coli TOPP1, E. coli TOPP2, E. coli TOPP3.
46. Sposób wytwarzania polinukleotydu, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę jednokomórkowego gospodarza transformowanego zrekombinowaną cząsteczką DNA, która zawiera izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ iD NO:l; albo sekwencję SeQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7 i zawiera sekwencję kontrolującą ekspresję funkcjonalnie połączoną z polinukleotydem, i wyodrębnia się ten polinukleotyd.
47. Izolowany polipeptyd znamienny tym, że jest kodowany przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID nO:7, przy czym polipeptyd jest antygenem.
48. Izolowany polipeptyd według zastrz. 47, znamienny tym, że zawiera sekwencję wybraną z SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 i SEQ ID NO:8.
49. Izolowany polipeptyd według zastrz. 47, znamienny tym, że zawiera sekwencję wybraną z SEQ ID NO:2, SeQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 i SEQ ID NO:8, oprócz peptydu sygnałowego.
50. Izolowany polipeptyd według zastrz. 47, znamienny tym, że zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11, 10 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26.
51. Izolowany polipeptyd według zastrz. 49, znamienny tym, że zawiera aminokwasy od 31 do 55 z SEQ ID NO:2.
52. Izolowany polipeptyd według zastrz. 49, znamienny tym, że zawiera aminokwasy od 51 do 86 z SEQ ID NO:2.

184 373
53. Izolowany polipeptyd według zastrz. 49, znamienny tym, że zawiera aminokwasy od 110 do 140 z SEQ ID NO:2.
54. Izolowany polipeptyd według zastrz. 49, znamienny tym, że zawiera aminokwasy od 1 do 155 z SEQ ID NO:2.
55. Izolowany polipeptyd według zastrz. 47, znamienny tym, że ten polipeptyd jest w czystej postaci i jest otrzymywany z hodowli gospodarza jednokomórkowego transformowanego zrekombinowaną cząsteczką DNA, która zawiera izolowany polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ iD NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7 i zawiera sekwencję kontrolującą ekspresję funkcjonalnie połączoną z polinukleotydem.
56. Sposób otrzymywania polipeptydu, znamienny tym, że wyodrębnia się hodowlę bakterii Neisseria meningitidis, następnie oddziela się z hodowli bakterii frakcję błon zewnętrznych i izoluje się antygen z frakcji błon zewnętrznych.
57. Sposób według zastrz. 56, znamienny tym, że frakcje zewnętrznych błon poddaje się działaniu proteinazy K.
58. Farmaceutyczna kompozycja korzystnie zawierająca dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, znamienna tym, że zawiera będący antygenem, polipeptyd kodowany przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:l; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID No:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.
59. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera będący antygenem, polipeptyd kodowany przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencja DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SeQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.
60. Sposób wytwarzania szczepionki do zapobiegania zakażeniu Neisseria u ludzi, znamienny tym, że miesza się będący antygenem polipeptyd kodowany przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SeQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID No:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, z farmaceutycznie dopuszczalnym rozpuszczalnikiem, zaróbką lub adjuwantem.

184 373
61. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że polipeptydem jest białko powierzchniowe z Neisseria o masie cząsteczkowej 22 kDa.
62. Sposób według zastrz. 61, znamienny tym, że białko powierzchniowe z Neisseria o masie cząsteczkowej 22 kDa jest białko powierzchniowe z Neisseria meningitidis o masie cząsteczkowej 22 kDa.
63. Przeciwciało lub fragment wiążący antygen, znamienne tym, że ma specyficzne wiązanie z będącym antygenem polipeptydem, kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującąbiałko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:l, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.
64. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 63, znamienne tym, że polipeptydem jest białko powierzchniowe z Neisseria o masie cząsteczkowej 22 kDa.
65. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 64, znamienne tym, że białko powierzchniowe z Neisseria o masie cząsteczkowej 22 kDa jest białko powierzchniowe z Neisseria meningitidis o masie cząsteczkowej 22 kDa.
66. Przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 63, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.
67. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 66, znamienne tym, że pochodzi od myszy.
68. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 67, znamienne tym, że jest izotypem IgG.
69. Przeciwciało lub fragment według zastrz. 66, znamienne tym, że jest Me-1 lub Me-7.
70. Sposób otrzymywania przeciwciał lub fragmentu wiążącego antygen znamienny tym, że wprowadza się preparat z Neisseria do organizmu ssaka i wyodrębnia się surowicę ssaka zawierającą przeciwciała mające specyficzne wiązanie z będącym antygenem polipeptydem, kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ iD NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.
71. Sposób według zastrz. 70, znamienny tym, że Neisseria jest Neisseria meningitidis.
72. Sposób otrzymywania przeciwciał monoklonalnych, znamienny tym, że wprowadza się preparat z Neisseria do komórek ssaka produkujących przeciwciała i prowadzi się fuzję tych komórek z komórkami szpiczaka tworząc komórki hybrydomy i wyodrębnia się z komórek hybrydomy monoklonalne przeciwciała mające specyficzne wiązanie z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodujacabiałko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ iD NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.

184 373
73. Sposób według zastrz. 72, znamienny tym, że Neisseria jest Neisseria meningitidis.
74. Farmaceutyczna kompozycja korzystnie zawierająca dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, znamienna tym, że zawiera przeciwciało lub fragment wiążący antygen mający specyficzne wiązanie z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO: 1; albo sekwencję SEQ ID NO: 1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID No:7.
75. Farmaceutyczna kompozycja według zastrz. 74, znamienna tym, że zawiera przeciwciała Me-1 lub Me-7.
76. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera przeciwciało lub fragment wiążący antygen mający specyficzne wiązanie z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko 5 powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.
77. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania zakażeniu Neisseria u ludzi, znamienny tym, że miesza się razem będący antygenem polipeptyd kodowany przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, z farmaceutycznie dopuszczalnym rozpuszczalnikiem lub zaróbką.
78. Sposób według zastrz. 77, znamienny tym, że polipeptydem jest białko powierzchniowe z Neisseria o masie cząsteczkowej 22 kDa.
79. Sposób według zastrz. 78, znamienny tym, że jako białko powierzchniowe z Neisseria o masie cząsteczkowej 22 kDa stosuje się białko powierzchniowe z Neisseria meningitidis o masie cząsteczkowej 22 kDa.
80. Sposób wykrywania antygenu Neisseria w uzyskanych od pacjenta próbkach biologicznych, znamienny tym, że inkubuje się przeciwciała mające specyficzne wiązanie z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, próbkami biologicznymi i wykrywa się przeciwciało specyficznie związane z antygenem.

184 373
81. Sposób według zastrz. 80, znamienny tym, że patogenem jest Neisseria meningitidis.
82. Sposób według zastrz. 80, znamienny tym, że przeciwciałem jest Me-1 lub Me-7.
83. Sposób wykrywania antygenu Neisseria z uzyskanych od pacjenta próbkach biologicznych, znamienny tym, że inkubuje się przeciwciała mające specyficzne wiązanie z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7; z próbkami biologicznymi, a następnie wykrywa się antygen specyficznie związany z przeciwciałem.
84. Sposób według zastrz. 83, znamienny tym, że antygenem jest antygen z Neisseria meningitidis.
85. Sposób według zastrz. 83, znamienny tym, że antygenem jest białko powierzchniowe z Neisseria meningitidis o masie cząsteczkowej 22 kDa.
86. Sposób wykrywania patogenu Neisseria u pacjenta, znamienny tym, że znakuje się przeciwciało mające specyficzne wiązanie z będącym antygenem, polipeptydem kodowanym przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, umożliwiając jego wykrywanie; podaje się znakowane przeciwciało pacjentowi i wykrywa się znakowane przeciwciało specyficznie związane z patogenem.
87. Sposób według zastrz. 86, znamienny tym, że patogenem jest Neisseria meningitidis.
88. Zestaw do wykrywania lub diagnozy Neisseria meningitidis u ludzi, znamienny tym, że zawiera polipeptyd będący antygenem, kodowany przez polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:l albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID No:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.
89. Sposób wykrywania bakterii Neisseria w uzyskanych od pacjenta próbkach biologicznych, znamienny tym, że inkubuje się tę próbkę z sondą DNA, która może hybrydyzować w surowych warunkach z polinukleotydem, hybrydyzującym w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo izolowany polinukleotyd zawierający zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEq ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7, kodującym białko powierzchniowe z Neisseria wykrywa się hybrydyzację sondy DNA z polinukleotydem.

184 373
90. Sposób według zastrz. 89, znamienny tym, że sonda DNA zawiera polinukleotyd, który hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym sekwencję SEQ ID NO:1.
91. Sposób według zastrz. 89, znamienny tym, że sonda DNA zawiera polinukleotyd, który hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym sekwencję SEQ ID NO:3.
92. Sposób według zastrz. 89, znamienny tym, że sonda DNA zawiera polinukleotyd, który hybrydyzuje z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe, zawierającym sekwencję SEQ ID NO:5.
93. Sposób według zastrz. 89, znamienny tym, że sonda DNA zawiera polinukleotyd, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującąbiałko powierzchniowe, zawierającym sekwencję SEQ ID NO:7.
94. Sposób według zastrz. 89, znamienny tym, że jako sondę DNA stosuje się oligomer o sekwencji komplementarnej do przynajmniej 6 sąsiadujących nukleotydów jednego z polinukleotydów, które hybrydyzują w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotydów zawierających zasady 200 do 664, SEQ ID nO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID nO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo 10 sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ iD NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7.
95. Sposób według zastrz. 89, znamienny tym, że prowadzi się ampifikację docelowej sekwencji DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy z użyciem zestawu oligomerów o sekwencji komplementarnej do przynajmniej 6 sąsiadujących nukleotydów jednego z polinukleotydów, które hybrydyzują w ostrych warunkach z sekwencją DNA kodującą białko powierzchniowe z Neisseria lub z komplementem sekwencji DNA kodującej białko powierzchniowe z Neisseria, o masie cząsteczkowej 22 kDa i/lub odporne na proteinazę K albo polinukleotydów zawierających zasady 200 do 664, SEQ ID NO:1 albo zasady 143 do 664 SEQ ID NO:1; albo sekwencję SEQ ID NO:1, albo zasady 173 do 640 SEQ ID NO:3; albo zasady 116 do 640 SEQ ID NO:3; albo sekwencję SEQ ID NO:3; albo zasady 265 do 729 SEQ ID NO:5 albo zasady 208 do 729 SEQ ID NO:5 albo sekwencję SEQ ID NO:5 albo zasady 298 do 762 SEQ ID NO:7 albo zasady 241 do 762 SEQ ID NO:7 albo sekwencję SEQ ID NO:7 i flankujących docelową sekwencję DNA.