NO344842B1

NO344842B1 - OPGL bindende antistoff, polynukleotid sammensetning, vertscelle, farmasøytisk sammensetning samt anvendelse av og fremstilling av antistoffet

Info

Publication number: NO344842B1
Application number: NO20190456A
Authority: NO
Inventors: Francis H Martin; William J Boyle; Geoffrey C Davis; Jose R Valan
Original assignee: Amgen Inc; Amgen Fremont Inc
Priority date: 2001-06-26
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2020-05-25
Also published as: JP2012140430A; ES2342820T5; YU103003A; IL159512A; CA2451955C; TWI326285B; ES2706902T3; TR201809008T4; BRPI0210579B1; LU91757I2; JP2022000424A; CY1120656T1; ES2675735T3; EA021242B1; CY1110196T1; EP3492100B1; NO2019039I1; CY2010016I2; CN103232539A; SG173211A1

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelsen angår antistoffer som binder osteoprotegerinligand (OPGL). Det er også beskrevet sammensetninger og fremgangsmåter for behandling av bensykdommer så som osteoporose, bentap på grunn av artritt, Pagets sykdom og osteopeni.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Benvev gir støtte for kroppen og innbefatter mineraler (så som kalsium og fosfor), en matrise av collagene og ikke-collagene proteiner og celler. Levende benvev har en dynamisk likevekt mellom dannelse av ben som kalles avsetning, og nedbrytning av ben som kalles resorpsjon. Det finnes tre celletyper i ben som inngår i denne likevekten, det vil si osteocytter, osteoblaster og osteoklaster. Osteoblastene fremmer dannelsen av benvev, mens osteoklastene er forbundet med resorpsjon. Resorpsjon eller oppløsning av benmatrise og mineraler er en rask og effektiv prosess sammenlignet med bendannelse og kan frigjøre store mengder av mineraler fra bensubstansen. Osteoklaster inngår i reguleringen av den normale remodelleringen av skjelettvevet og i resorpsjon som er indusert av hormoner. For eksempel blir resorpsjon stimulert ved en utskillelse av paratyroidhormon som respons på synkende konsentrasjoner av kalsiumioner i ekstracellulære væsker. I motsetning til dette, er en hemming av resorpsjon en funksjon av kalsitonin. I tillegg vil metabolitter av vitamin D endre bens følsomhet eller reaksjonsevne overfor paratyroidhormon og kalsitonin.

Fra eksperimenter der rekombinant oppløselig OPGL (betegnet ‘sODF’) fremkalte benresorpsjon på en konsentrasjonsavhengig måte, konkluderte Tsukii et al.at OPGL (betegnet ‘ODF’) spiller en kritisk rolle i benresorpsjon i benmikromiljøet. Eksperimentene viste at OPGL-aktivitet kunne hemmes av enten osteoprotegerin ('OPG'; betegnet 'OCIF' ') eller et polyklonalt anti-ODF-antistoff, og at både OCIF og det polyklonale anti-ODF-antistoffet kunne blokkere benresorpsjon indusert av hvilket som helst av 1α, 25-dihydroksyvitamin D3, paratyroidhormon eller prostaglandin E2 (Tsukii, K. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998, Vol. 246 (2), side 337-341).

Osteoprotegerinligand (OPGL) som hører hjemme i TNF-familien eller gruppen av cytokiner, fremmer dannelse av osteoklaster ved binding til reseptoraktivatoren for NF- κB (RANK, også kalt osteoklastdifferensierings- og aktiveringsreseptor eller ODAR). Osteoprotegerin (OPG) på den annen side, hemmer dannelsen av osteoklaster ved å isolere eller ødelegge OPGL og hindrer derved en assosiasjon med ODAR. Mengden av OPGL som er assosiert med ODAR er således korrelert med likevekten mellom benavsetning og resorpsjon.

Etter skjelettets modning vil mengden av ben i skjelettet være et resultat av en balanse (eller ubalanse) mellom bendannelse og benresorpsjon. Størst benmasse opptrer etter skjelettmodning før ca 40-årsalderen. Mellom 40- og 50-årsalderen vil likevekten skifte og benresorpsjon vil dominere. Denne uunngåelige minskningen av benmassen som skjer med alderen starter tidligere hos kvinner enn hos menn og er distinkt akselerert etter menopausen hos enkelte kvinner (prinsipielt de som er av kaukasisk eller asiatisk opprinnelse).

Osteopeni er en tilstand som generelt angår enhver minskning eller nedsettelse av benmassen til nivåer som ligger under det normale. En slik tilstand kan oppstå ved at det er synkende hastighet med hensyn til bensyntese, eller at det skjer en økende bendestruksjon eller begge deler. En vanlig form for osteopeni er primær osteoporose, som ofte betegnes som postmenopausal eller senil osteoporose. Denne formen for osteoporose er en konsekvens av det generelle bentapet som opptrer med økende alder, og er ofte et resultat av økende benresorpsjon, med en normal bendannelse. Mange hvite kvinner i de forente stater utvikler symptomatisk osteoporose. Det er et direkte forhold mellom osteoporose og forekomsten av hofte-, lår-, nakke- og indre leddbrudd hos kvinner som er 45 år eller eldre. Eldre menn kan utvikle symptomatisk osteoporose i aldersintervallet fra 50 til 70 år. Osteoporose kan i enkelte tilfeller også være et resultat av økende nivåer eller aktivitet av OPGL. Det vil således være fordelaktig å kunne ha molekyler som kan regulere aktiviteten til OPGL i osteoklastogenesen.

Det er blitt identifisert flere faktorer som kan bidra til postmenopausal og senil osteoporose. Disse innbefatter blant annet en endring i hormonnivåer som utvikler seg med alderen, foruten utilfredsstillende kalsiumforbruk som skyldes nedsatt absorpsjon i tarmkanalen av kalsium og andre mineraler. Enkelte behandlinger har derfor inkludert hormonterapi og diettilskudd i et forsøk på å forsinke eller å stoppe denne prosessen. I den senere tid er det utviklet antiresorptive midler så som bisfosfonater og selektive østrogenreseptormodifiserende forbindelser (SERM) for å hindre og behandle redusert benmasse. Det kan således være brukbart og fordelaktig å kombinere disse behandlingene med molekyler som kan regulere aktiviteten av OPGL ved behandling av visse osteopene lidelser og sykdommer.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen angår et antistoff som omfatter en tung kjede og en lett kjede, der dne tunge kjeden omfatter det variable området og konstante området av SEKV.ID. NR.

2 som har en, men ikke mer enn en aminosyre delesjon, addering eller substitusjon, der den lette kjeden omfatter det variable området og det konstante området av SEKV.ID. NR.4; og der antistoffet binder til en osteoprotegerinligand (OPGL) og inhiberer binding av OPGL til en osteoklastdifferensierings- og aktiveringsreseptor (ODAR) der et overskudd av antistoff reduserer bindingen med minst 20 % som målt i en in vitro konkurrerende bindingsprøve.

I visse aspekter tilveiebringer beskrivelsen et antistoff som omfatter en tung kjede og lett kjede, og hvor den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 2 eller et fragment av denne, mens den lette kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 4 eller fragment av denne.

I visse aspekter tilveiebringer beskrivelsen et antistoff som omfatter en tung kjede og en lett kjede, og hvor den tunge kjeden omfatter et variabelt område som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 13 eller et fragment av denne, og hvor den lette kjeden omfatter et variabelt område som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 14 eller et fragment av denne.

I visse aspekter tilveiebringer beskrivelsen et antistoff som omfatter en tung kjede og en lett kjede, og hvor den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 2 eller et fragment av denne.

I visse aspekter tilveiebringer beskrivelsen et antistoff som omfatter en tung kjede og en lett kjede, og hvor den tunge kjeden omfatter et variabelt område som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 13 eller et fragment av denne.

I visse aspekter tilveiebringer beskrivelsen et antistoff som omfatter en tung kjede og en lett kjede, og hvor den lette kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 4 eller et fragment av denne.

I visse aspekter tilveiebringer beskrivelsen et antistoff som omfatter en tung kjede og en lett kjede, og hvor sistnevnte omfatter et variabelt område som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 14 eller et fragment av denne.

I visse aspekter tilveiebringer beskrivelsen et antistoff som omfatter en tung kjede og en lett kjede, og (a) hvor den tunge kjeden omfatter et første variabelt område og hvor dette omfatter en sekvens som har minst 90% identitet til den aminosyresekvensen som er angitt i SEKV.ID. NR. 13, og (b) hvor den lette kjeden omfatter et andre variabelt område og hvor dette omfatter en sekvens som har minst 90% identitet til den aminosyresekvensen som er angitt i SEKV.ID. NR. 14, og (c) hvor antistoffet virker sammen med en osteoprotegerinligand (OPGL).

I visse aspekter omfatter det første variable området som har minst 95% identitet til den aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID. NR. 13, mens det andre variable området omfatter en sekvens som har minst 95% identitet til den aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID. NR. 14.

I visse aspekter omfatter det første variable området som har minst 99% identitet til den aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID. NR. 13, mens det andre variable området omfatter en sekvens som har minst 99% identitet til den aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID. NR. 14.

I visse aspekter tilveiebringer beskrivelsen en tung kjede som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 2 eller et fragment av denne. I visse utførelser tilveiebringer oppfinnelsen en tung kjede som omfatter et variabelt område og et konstant område, og hvor det variable området omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 13 eller et fragment av denne.

I visse aspekter tilveiebringer beskrivelsen en lett kjede som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 4 eller et fragment av denne. I visse utførelser tilveiebringer oppfinnelsen en lett kjede som omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR. 14 eller et fragment av denne.

I enkelte aspekter av beskrivelsen er det tilveiebrakt enkeltkjedede antistoffer. I enkelte utførelser av oppfinnelsen er det tilveiebrakt enkeltkjedede Fv-antistoffer. I enkelte utførelser av oppfinnelsen er det tilveiebrakt Fab-antistoffer. I enkelte utførelser av oppfinnelsen er det tilveiebrakt Fab'-antistoffer. I visse utførelser av oppfinnelsen er det tilveiebrakt (Fab')2-antistoffer.

I enkelte utførelser av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en farmasøytisk sammensetning som omfatter et antistoff ifølge oppfinnelsen. I visse utførelser er det tilveiebrakt en farmasøytisk sammensetning som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff til OPGL.

I visse utførelser av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en farmasøytisk sammensetning som omfatter et antistoff til OPGL, og minst ett terapeutisk middel valgt fra en benmorfogen faktor, transformerende vekstfaktor- β (TGF- β), en interleukin-1 (IL-1) inhibitor, IL-1ra, Kineret<TM>, anakinra, en TNF α-inhibitor, en løselig TNF αreseptor, Enbrel<TM>, etanercept, et anti-TNF α-antistoff, Remicade<TM>, infliximab, et D2E7-antistoff, et paratyroidhormon, en analog av et paratyroidhormon, et paratyroidhormonrelatert protein, en analog av et paratyroidhormonrelatert protein, et prostaglandin, et bifosfonat, et alendronat, fluorid, kalsium, et ikke-steroid antiinflammatorisk medikament (NSAID), en COX-2-inhibitor, Celebrex<TM>, celecoxib, Vioxx<TM>, rofecoxib, et immunosuppressivt middel, metotreksat, leflunomid, en serinproteaseinhibitor, en sekretorisk leukocyttproteaseinhibitor (SLPI), en IL-6-inhibitor, et antistoff til IL-6, en IL-8-inhibitor, et antistoff til IL-8, en IL-18-inhibitor, et IL-18-bindende protein, et IL-18-antistoff, en interleukin-1-omdannende enzym (ICE) modulator, en fibroblastvekstfaktor (FGF), en FGF-modulator, en PAF-antagonist, en keratinocyttvekstfaktor (KGF), et KGF-relatert molekyl, en KGF-modulator, en matrise metalloproteinase (MMP) modulator, en nitritoksidsyntase (NOS) modulator, en modulator av glukokortikoidreseptor, en modulator av glutamatreseptor, en modulator av lipopolysakkarid (LPS) nivåer, et noradrenalin, en noradrenalinetterlignende forbindelse, og en

noradrenalinmodulator.

Heri er det beskrevet en fremgangsmåte for å behandle en osteopenisk lidelse som omfatter en administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av et antistoff. Det er også beskrevet en fremgangsmåte for å behandle en osteopenisk lidelse som omfatter en administrering av en farmasøytisk sammensetning.

Heri er det beskrevet en fremgangsmåte for å behandle en inflammatorisk tilstand med medfølgende bentap hos en pasient, som omfatter en administrering av en farmasøytisk sammensetning.

Heri er det beskrevet en fremgangsmåte for å behandle en autoimmun tilstand med medfølgende bentap hos en pasient, som omfatter en administrering av en farmasøytisk sammensetning.

Heri er det beskrevet en fremgangsmåte for å behandle en reumatisk artritt i en pasient, som omfatter en administrering av en farmasøytisk sammensetning.

Heri er det beskrevet en fremgangsmåte for å påvise nivået av OPGL i en biologisk prøve, som omfatter at prøven kontaktes et antistoff.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser en cDNA-sekvens som koder den αOPGL-1-antistoff tunge kjeden (SEKV.ID. NR. 1).

Figur 2 viser aminosyresekvensen for den αOPGL-1-antistoff tunge kjeden (SEKV.ID. NR. 2).

Figur 3 viser en cDNA-sekvens som koder den αOPGL-1-antistoff lette kjeden (SEKV.ID. NR. 3).

Figur 4 viser aminosyresekvensen for den αOPGL-1-antistoff lette kjeden (SEKV.ID. NR. 4).

Figur 5 viser et skjematisk diagram av det αOPGL-1 kappa lettkjede ekspresjonsplasmidet αOPGL-1-kappa/pDSRa19.

Figur 6 viser et skjematisk diagram av det αOPGL-1 IgG2 tungkjede ekspresjonsplasmidet αOPGL-1-IgG2/pDSRa19.

Figur 7 viser den doseavhengige bindingen av αOPGL-1 til OPGL-belagte EIA-plater.

Figur 8 viser spesifikk binding av αOPGL-1 til membranbundet OPGL.

Figur 9 viser inhibering av αOPGL-1-binding til OPGL-belagte EIA-plater ved løselig OPGL.

Figur 10 viser spesifikk binding av αOPGL-1 til OPGL-1-belagte EIA-plater.

Figur 11 viser doseavhengig inhibering av osteoklastdannelse av αOPGL-1.

Figur 12 viser doseavhengig inhibering av OPGL-binding til ODAR ved αOPGL-1.

Figur 13 viser de midlere serumkonsentrasjonstidsprofilene etter administrering av en enkelt dose av αOPGL-1 til cynomolgusaper.

Figur 14 viser den midlere prosentvise forandring i serum N-Tx-konsentrasjon etter administrering av en enkelt dose av αOPGL-1 til cynomolgusaper.

Figur 15 viser prosentvis forandring i urin N-Tx-konsentrasjon etter administrering av en enkelt dose av αOPGL-1 til cynomolgusaper.

Figur 16 viser de antistoffpositive og -negative serumkonsentrasjonstidsprofilene etter administrering av en enkelt dose av αOPGL-1 til cynomolgusaper.

Figur 17 viser aminosyresekvensen til det variable området av αOPGL-1-antistoff tung kjede variable området (SEKV.ID. NR. 13).

Figur 18 viser aminosyresekvensen til det variable området av αOPGL-1-antistoff lett kjede variable området (SEKV.ID. NR. 14).

Figur 19 viser en cellekulturprosess for produksjon av αOPGL-1.

Figur 20 viser den prosentvise forandringen av serumkalsium etter administrering av en enkelt dose av αOPGL-1 til cynomolgusaper.

Figur 21 viser den midlere prosentvise forandringen av alkalisk fosfatase etter administrering av en enkelt dose av αOPGL-1 til cynomolgusaper.

DETALJERT BESKRIVELSE

De avsnittsoverskrifter som her er brukt, er kun angitt for å få en bedre organisering av beskrivelsen og er som sådan ingen begrensning av oppfinnelsen som sådan. Definisjoner

Standardteknikker kan brukes for rekombinant DNA oligonukleotidsyntese og vevskulturer og transformasjoner (for eksempel elektroporering, lipofeksjon).

Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker kan utføres som angitt av fabrikantens beskrivelser eller slik de vanligvis brukes innenfor bioteknologien. Disse teknikker og fremgangsmåter kan generelt utføres ved hjelp av vanlig kjente fremgangsmåter slik disse er kjente innenfor bioteknologien og slik de er beskrevet i forskjellige generelle og mer spesifikke referanser som her er angitt og diskutert i den foreliggende beskrivelsen. Se for eksempel Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Hvis intet annet er angitt, vil den nomenklatur som brukes i forbindelse med laboratorieteknikk og fremgangsmåter, analytisk kjemi, syntetisk organisk kjemi og medisinsk og farmasøytisk kjemi, være de som er velkjente og vanlig brukte innenfor fagområdet. Standardteknikker kan brukes for kjemisk syntese, kjemisk analyse, fremstilling av farmasøytiske preparater, opparbeiding og administrering og behandling av pasienter.

Slik de er brukt i overensstemmelse med den foreliggende søknaden, vil de følgende begreper, hvis intet annet er angitt, ha følgende betydning:

Begrepet "isolert polynukleotid" betyr her et polynukleotid av genomisk, cDNA eller syntetisk opprinnelse, eller en kombinasjon av disse, og på grunn av sin opprinnelse så vil det "isolerte polynukleotidet" (1) ikke være assosiert med hele eller en del av et polynukleotid i hvilket det "isolerte polynukleotidet" finnes i naturen, (2) er forbundet til et polynukleotid som ikke er forbundet til det i naturen, eller (3) ikke opptrer i naturen som en del av en større sekvens.

Begrepet "isolert protein" slik det brukes her, betyr et protein som er kodet av cDNA, rekombinant RNA eller av syntetisk opprinnelse eller en kombinasjon av disse som (1) er fri for i det minste noen proteiner med hvilke det normalt forekommer, (2) er i alt vesentlig fritt for andre proteiner fra den samme kilden, for eksempel fra den samme arten, (3) er uttrykt ved hjelp av en celle fra en annen art, eller (4) ikke forekommer i naturen.

Begrepet "polypeptid" brukes her som et generelt begrep for naturlige proteiner eller sekvenser som har delesjoner, adderinger og/eller substitusjoner av en eller flere aminosyrer i den naturlige sekvensen. Begrepet "polypeptid" omfatter også αOPGL-1 (slik det er beskrevet nedenfor, SEKV.ID. NR. 2 og SEKV.ID. NR. 4), eller sekvenser med delesjoner, adderinger og/eller substitusjoner av en eller f lere aminosyrer i αOPGL-1. Heri er det humane tungkjede immunoglobulinmolekylet som er representert ved figur 2 (SEKV.ID. NR. 2) og det humane lettkjede immunoglobulinmolekylet som er representert ved figur 4 (SEKV.ID. NR. 4) eller fragmenter eller analoger av disse beskrevet.

Begrepet "naturlig forekommende" slik det brukes her i forhold til en gjenstand, refererer seg til det faktum at denne gjenstanden kan finnes i naturen. For eksempel vil et polypeptid- eller en polynukleotidsekvens som er tilstede i en organisme (heri inngår virus) og som kan isoleres fra en kilde i naturen og som ikke med hensikt er modifisert i et laboratorium eller på annen måte, vil være naturlig forekommende.

Begrepet "operativt forbundet" slik det brukes her, refererer seg til komponenter som befinner seg i et forhold som gjør det mulig for dem å fungere på sin påtenkte måte. For eksempel vil en kontrollsekvens som er "operativt forbundet" til en kodende sekvens være ligert på en slik måte at ekspresjonen av den kodende sekvensen oppnås under betingelser som er forenlige med kontrollsekvensene.

Begrepet "kontrollsekvens" slik det brukes her, refererer seg til polynukleotidsekvenser som kan utføre ekspresjonen og bearbeidingen av de kodende sekvensene til hvilke de er ligert. Typen av slike kontrollsekvenser kan være forskjellig avhengig av vertsorganismen. Kontrollsekvenser for prokaryoter kan innbefatte promotorer, ribosomale bindingsseter og transkripsjonstermineringssekvenser. Kontrollsekvenser for eukaryoter kan innbefatte promotorer og transkripsjonstermineringssekvenser. "Kontrollsekvenser" kan innbefatte ledersekvenser og/eller fusjonspartnersekvenser.

Begrepet "polynukleotid" slik det brukes her, betyr en polymer form av nukleotider med en lengde på minst 10 baser. Basene kan være ribonukleotider eller deoksyribonukleotider eller en modifisert form av begge disse typer nukleotider. Begrepet innbefatter både enkelt- og dobbelttrådede former av DNA.

Begrepet "oligonukleotid" refererer seg til naturlig forekommende og modifisert e nukleotider som er forbundet med hverandre ved naturlige forekommende og/eller ikke naturlig forekommende oligonukleotidbindinger. Oligonukleotider er et polynukleotidundersett som generelt omfatter en lengde på 200 baser eller færre. Oligonukleotidene har en lengde på fra 10 til 60 baser. Oligonukleotidene vil ha en lengde på 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 til 40 baser. Oligonukleotidene kan være enkeltrådede eller dobbelttrådede, for eksempel for anvendelse under konstruksjonen av en genmutant. Oligonukleotidene kan være sens- eller antisens oligonukleotider.

Begrepet "naturlig forekommende nukleotider" innbefatter deoksyribonukleotider og ribonukleotider. Begrepet "modifiserte nukleotider" innbefatter nukleotider som er modifiserte eller inneholder substituerte sukkergrupper og lignende. Begrepet "oligonukleotidbindinger" innbefatter oligonukleotidbindinger så som fosfortioat, fosforditioat, fosforselenoat, fosfordiselenoat, fosforanilotioat, fosforaniladat, fosforamidat og lignende. Se for eksempel LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1985); Stein et al. Nucl. Acids res. 16: 3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, sidene 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S. patentsøknad nr. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990). Et oligonukleotid kan inneholde en markør for påvisning.

Identitet og likhet eller slektskap mellom polypeptider kan lett beregnes ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Slike fremgangsmåter innbefatter, men er ikke begrenset til, de som er beskrevet i Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); og Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988).

Foretrukne fremgangsmåter for å bestemme identitet er utformet slik at de gir den best mulige tilpasningen mellom de testede eller undersøkte sekvensene.

Fremgangsmåter for å bestemme identitet er beskrevet i offentlig tilgjengelige dataprogrammer. Foretrukne dataprogrammetoder for å bestemme identitet mellom to sekvenser innbefatter, men er ikke begrenset til, GCG-programpakken som innbefatter GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12: 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN og FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)). BLASTX-programmet er allment tilgjengelig fra "the National Center for Biotechnology Information" (NCBI) og andre kilder (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra (1990)). Den velkjente Smith Watermanalgoritmen kan også brukes for å bestemme identitet.

Visse parallellsammenlignings (alignment) skjemaer for å parallellsammenligne (alligning) to aminosyresekvenser kan resultere i en tilpasning i bare et kort område av de to sekvensene og dette parallellsammenlignede området kan ha meget høy sekvensidentitet selv om det ikke er noe signifikant forhold mellom de to fullengde sekvensene. Følgelig vil den valgte parallsammenligningsmetoden (GAP-programmet) resultere i en parallellsammenligning som griper over eller strekker seg over minst 50 sammenhengende aminosyrer i målpolypeptidet.

Ved å for eksempel å bruke dataalgoritmen GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), kan to polypeptider hvor det er ønskelig å bestemme prosent sekvensidentitet parallellsammenlignes for optimal tilpasning med hensyn til deres respektive aminosyrer (det "tilpassede området" bestemmes ved hjelp av algoritmen). I visse utførelser brukes en såkalt gap åpningspenalitet (som er beregnet som 3X middeldiagonalen og hvor "middeldiagonalen" er gjennomsnittet av diagonalen i den sammenligningsmatrisen som brukes og hvor "diagonalen" er det skår eller det tall som er gitt for hver perfekte aminosyretilpasning i den spesielle sammenligningsmatrisen som brukes), og en såkalt gap forlengelsespenalitet (som vanligvis er en 1/10 av gap åpningspenaliteten), så vel som en sammenligningsmatrise så som PAM 250 eller BLOSUM 62 i forbindelse med algoritmen. I visse utførelser vil algoritmen også anvende en standard sammenligningsmatrise (se Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) for PAM 250 sammenligningsmatrisen;

Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 10915-10919 (1982) for BLOSUM 62 sammenligningsmatrisen.

I visse utførelser vil parametrene for en polypeptidsekvenssammenligning innbefatte følgende:

Algoritme: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970);

Sammenligningsmatrise: BLOSUM 62 fra Henikoff et al., supra (1992);

Gap-penalitet: 12

Gap-lengde penalitet: 4

Terskel for likhet: 0

GAP-programmet kan brukes med de ovennevnte parametrene. De forannevnte parametrene vil være såkalte standardparametere for polypeptidsammenligninger (sammen med ingen penalitet for endegap) ved å bruke GAP-algoritmen.

Slik de brukes her, vil de tjue vanlig kjente aminosyrene og deres forkortelser følge vanlig kjent brukspraksis. Se Immunology - A Synthesis (2. utgave, E.S. Golub og D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoisomerer (for eksempel D-aminosyrer) av de tjue vanlig kjente aminosyrene, unaturlige aminosyrer så som α-, α-disubstituerte aminosyrer, N-alkylaminosyrer, melkesyre og andre uvanlige aminosyrer, er også egnet som komponenter i polypeptider.

Eksempler på uvanlige aminosyrer innbefatter: 4-hydroksyprolin, �-karboksyglutamat, �-N,N,N-trimetyllysin, �-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin, �-N-metylarginin og lignende aminosyrer og iminosyrer (for eksempel 4-hydroksyprolin). I beskrivelsen av polypeptider vil venstrehåndsretningen være den aminoterminale retningen, mens høyrehåndsretningen vil være den karboksyterminale retningen, i overensstemmelse med vanlig kjent bruk og kjente konvensjoner.

På lignende måte, hvis intet annet er angitt, så er venstrehåndsenden av enkelttrådede polynukleotidsekvenser 5'-enden, mens venstrehåndsenden for dobbelttrådede polynukleotidsekvenser er angitt som 5'-retningen. Retningen på 5'-til 3'-adderingen på utviklende RNA-transkripter er betegnet som transkripsjonsretningen, og de sekvensområdene på DNA-tråden som har den samme sekvensen som i nevnte RNA og som er 5' til 5'-enden av RNA-transkriptene, er betegnet som "oppstrøms sekvenser", mens de sekvensområdene på DNA-tråden som har den samme sekvensen som for nevnte RNA og som er 3' til 3'-enden av RNA-transkriptet er betegnet som "nedstrøm sekvenser".

Konservative aminosyresubstitusjoner kan omfatte ikke naturlig forekommende aminosyregrupper og blir typisk inkorporert ved en kjemisk peptidsyntese snarere enn ved syntese i biologiske systemer. Disse innbefatter peptidomimetika og andre reverserte eller inverterte former av aminosyregrupper.

Naturlig forekommende grupper kan deles i klasser basert på felles sidekjedeegenskaper:

1) hydrofobe: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) nøytralt hydrofile: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) sure: Asp, Glu;

4) basiske: His, Lys, Arg;

5) residua som påvirker kildeorientering: Gly, Pro; og

6) aromatiske: Trp, Tyr, Phe.

For eksempel kan ikke-konservative substitusjoner innbefatte en utbytting av en eller flere syrer i en eller flere av disse klassene med en syre i en annen klasse. Slike substituerte grupper eller residua kan innføres i områder av det humane antistoffet som er homologe med ikke-humane antistoffer, eller i ikke-homologe områder av molekylet.

Ved utføringen av slike forandringer, kan det være ønskelig å ta hensyn til aminosyrenes hydropatiske indeks. Hver aminosyre er blitt gitt en hydropatisk indeks på basis av dens hydrofobisitet og ladningsegenskaper. Disse er som følger: Isoleukin (+4,5); valin (+4,2); leukin (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glysin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat

(-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lysin (-3,9); og arginin (-4,5).

Viktigheten av den hydropatiske aminosyreindeksen for å tilveiebringe en interaktiv biologisk funksjon i et protein er velkjent. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Det er kjent at visse aminosyrer kan substitueres for andre aminosyrer med en lignende hydropatisk indeks eller skår, og allikevel beholde en lignende biologisk aktivitet. Ved å utføre slike forandringer basert på den hydropatiske indeksen, så inngår en substitusjon av aminosyrer hvis hydropatiske indekser er innenfor ±2. I visse utførelser inngår de som ligger innenfor ±1, og i visse utførelser inngår de som ligger innenfor ±0,5.

Det er også underforstått at substitusjonen av like aminosyrer effektivt kan utføres på basis av hydrofilisitet, spesielt i de tilfeller hvor det biologisk funksjonelle proteinet eller peptidet som derved skapes er påtenkt brukt i immunologiske utførelser, noe som er tilfellet her. I visse utførelser vil et proteins største lokale midlere hydrofilisitet, slik denne styres av hydrofilisiteten til de tilstøtende aminosyrene, være korrelert med dets immunogenitet og antigenitet, det vil si en biologisk egenskap for proteinet.

De følgende hydrofilisitetsverdier er gitt disse aminosyregruppene: arginin (+3,0); lysin (+3,0); aspartat (+3,0 ± 1); glutamat (+3,0 ± 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glysin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 ± 1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cystein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leukin (-1,8); isoleukin (-1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5) og tryptofan (-3,4). Ved å utføre forandringer basert på lignende hydrofilisitetsverdier, så inngår det i visse utførelser en substitusjon av aminosyrer hvis hydrofilisitetsverdier ligger innenfor ±2, i visse utførelser inngår de som ligger innenfor ±1 og i visse utførelser inngår de som ligger innenfor ±0,5. Det er også mulig å identifisere epitoper ut fra primære aminosyresekvenser på basis av hydrofilisitet. Disse områdene er også betegnet som "epitopiske kjerneområder".

Eksempler på aminosyresubstitusjoner er gitt i tabell 1.

Tabell 1: Aminosyresubstitusjoner

En dyktig fagperson vil være i stand til å bestemme egnede varianter av polypeptidet slik dette er gitt her ved å bruke velkjente teknikker. I visse tilfeller er det mulig å identifisere egnede områder av molekylet som kan forandres uten derved å ødelegge aktiviteten ved å gjøre dette i områder som ikke anses å være viktige for aktivitet. I visse utførelser er det mulig å identifisere residua eller deler av molekylet som er konservert blant like polypeptider. Områder som er viktige for biologisk aktivitet eller struktur kan selv underkastes konservative aminosyresubstitusjoner uten derved å ødelegge den biologiske aktiviteten eller på skadelig måte påvirke polypeptidets struktur.

En dyktig fagperson kan videre ved å utføre strukturelle undersøkelser identifisere residua eller grupper i like polypeptider som er viktige for aktivitet eller struktur. På bakgrunn av en slik sammenligning er det mulig å forutsi viktigheten av aminosyregrupper i et protein som tilsvarer aminosyregrupper eller residua som er viktige for aktivitet eller struktur i lignende proteiner. En fagperson kan så eventuelt utføre kjemisk lignende aminosyresubstitusjoner for slike på forhånd beregnede viktige aminosyreresidua.

En fagperson kan videre analysere den tredimensjonale strukturen og aminosyresekvensen i forhold til strukturen i lignende polypeptider. På bakgrunn av slik informasjon er det mulig å forutsi eller forutberegne parallellsammenligningen av aminosyreresidua i et antistoff med hensyn til dets tredimensjonale struktur. Det er således mulig å ikke utføre radikale forandringer i aminosyreresidua som er forutberegnet til å befinne seg på overflaten av proteinet, ettersom slike residua eller grupper kan inngå i viktige interaksjoner med andre molekyler. Videre er det mulig for en fagperson å utvikle testvarianter som inneholder en enkel aminosyresubstitusjon for hver forønsket aminosyregruppe eller residium.

Variantene kan så screenes ved å bruke velkjente aktivitetsprøver. Slike varianter kan brukes for å samle informasjon om egnede varianter. Hvis man for eksempel oppdager at en forandring av en spesiell aminosyregruppe resulterer i en ødelagt, uønsket, redusert eller uegnet aktivitet, så er det derved mulig å unngå varianter med en slik forandring. Med andre ord, basert på den informasjon som kan samles ved hjelp av rutineeksperimenter, er det derved lett å kunne bestemme de aminosyrene hvor man bør unngå ytterligere substitusjoner, enten alene eller i kombinasjon med andre mutasjoner.

Det er publisert en rekke vitenskapelige undersøkelser som angår slike forutberegninger av sekundære strukturer. Se Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 og Chou et al., Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Videre er det i dag tilgjengelig dataprogrammer som vil kunne brukes for å forutberegne eller forutsi sekundære strukturer. En slik fremgangsmåte for å forutberegne en sekundær struktur er basert på homologimodellering. For eksempel så vil to polypeptider eller proteiner som har en sekvensidentitet på mer enn 30% eller en likhet som er større enn 40% ofte ha lignende strukturelle topologier. Den senere tids forbedring av den proteinstrukturelle databasen (PDB) har gitt bedret forutsigbarhet med hensyn til sekundære strukturer, inklusive mulig antall folder innenfor strukturen for et polypeptid eller et protein. Se Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). Det er blitt foreslått (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)) at et gitt polypeptid eller protein har et begrenset antall folder, og så snart et kritisk antall strukturer er blitt oppløst så vil en strukturell forutsigelse eller forutberegning bli dramatisk mer nøyaktig.

Ytterligere fremgangsmåter for å forutberegne eller forutsi sekundære strukturer innbefatter såkalt "threading" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15-19 (1996)), "profilanalyse" (Bowie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183: 146-159 (199); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358 (1987)) og "evolusjonsmessig binding" (se Holm, supra (1999) og Brenner, supra (1997)).

Antistoffvarianter vil inkludere glykosyleringsvarianter hvor antallet og/eller typen av glykosyleringsseter er blitt endret sammenlignet med aminosyresekvensen i det opprinnelige polypeptidet. Proteinvarianter vil omfatte et større eller mindre antall av N-koblede eller -forbundne glykosyleringsseter enn i det opprinnelige proteinet. Et N-koblet glykosyleringssete er karakterisert ved sekvensen Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr, hvor aminosyregruppen eller residuet med betegnelsen X kan være enhver aminosyregruppe bortsett fra prolin. Substitusjonen av aminosyregrupper for å skape denne sekvensen vil gi et mulig nytt sete for addering av en N-koblet karbohydratkjede. Alternativt vil substitusjoner som eliminerer denne sekvensen fjerne en eksisterende N-koblet karbohydratkjede. Det er også tilveiebrakt en omleiring av N-koblede karbohydratkjeder hvor ett eller flere N-koblede glykosyleringsseter (typisk er de som er naturlig forekommende) blir eliminert og det blir skapt ett eller flere nye N-koblede seter. Ytterligere foretrukne antistoffvarianter innbefatter cysteinvarianter hvor en eller flere cysteingrupper er fjernet eller substituert med en annen aminosyre (for eksempel serin) sammenlignet med den opprinnelige aminosyresekvensen. Cysteinvarianter kan brukes når antistoffer må refoldes til en biologisk aktiv konformasjon så som etter isoleringen av uløselige inneslutningslegemer. Cysteinvarianter har generelt færre cysteingrupper enn det naturlige proteinet, og har typisk et likt antall for å minimalisere interaksjoner som kan være et resultat av uparrede cysteingrupper.

Aminosyresubstitusjoner vil være de som: (1) reduserer sjansen for proteolyse, (2) reduserer sjansen for oksidasjon, (3) endrer bindingsaffiniteten for å danne proteinkomplekser, (4) endrer bindingsaffiniteter og/eller (5) tilveiebringer eller modifiserer andre fysiokjemiske eller funksjonelle egenskaper for slike polypeptider. Ifølge visse aspekter ved beskrivelsen, så kan enkle eller multiple aminosyresubstitusjoner (i visse utførelser også konservative aminosyresubstitusjoner) utføres i den naturlige forekommende sekvensen (i visse utførelser i den delen av polypeptidet som ligger utenfor det eller de domener som danner de intermolekylære kontaktene). En konservativ aminsyresubstitusjon vil typisk ikke i vesentlig grad endre den opprinnelige sekvensens strukturelle egenskaper (for eksempel bør en erstatning av en aminosyre ikke gi en tendens til å bryte den spiralen (heliks) som forekommer i den opprinnelige sekvensen, eller bryte andre typer av sekundære strukturer som karakteriserer den opprinnelige sekvensen). Eksempler på velkjente polypeptid sekundære og tertiære strukturer er beskrevet i Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984); Introduction to Protein Structure (C. Branden og J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); og Thornton et al. Nature 354: 105 (1991).

Begrepet "polypeptidfragment" slik det brukes her, betegner et polypeptid med en aminoterminal og/eller karboksyterminal delesjon. Fragmentene har en lengde på minst fra 5 til 467 aminosyrer. Det er underforstått at i visse utførelser så vil fragmentene være minst 5, 6, 7, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 eller 450 aminosyrer lange.

Peptidanaloger er vanligvis anvendt i den farmasøytiske industrien som ikkepeptidmedikamenter med egenskaper som er analoge til de som forefinnes i templatpeptidet. Disse typer av ikke-peptidforbindelser er betegnet "peptidmimetika" eller "peptidomimetika". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber og Freidinger TINS p. 392 (1985); og Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Slike forbindelser er ofte utviklet ved hjelp av datastyrt molekylmodellering. Peptidmimetika som er strukturelt lignende terapeutiske brukbare peptider, kan brukes for å frembringe en tilsvarende terapeutisk eller profylaktisk effekt. Generelt vil peptidomimetika som er strukturelt lignende et paradigmepolypeptid (det vil si et polypeptid som har en biokjemisk egenskap eller farmakologisk aktivitet) så som humant antistoff, men vil ha en eller flere peptidbindinger eventuelt erstattet med en binding valgt fra:

-CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH (cis og trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- og -CH2SO- ved hjelp av fremgangsmåter som i seg selv er velkjente. Systematisk substitusjon av en eller flere aminosyrer i en konsensussekvens med en D-aminosyre av samme type (det vil si D-lysin i stedet for L-lysin), kan brukes for å utvikle mer stabile peptider. Videre kan begrensede peptider som omfatter en konsensussekvens eller en i alt vesentlig identisk konsensussekvensvariasjon utvikles ved hjelp av kjente fremgangsmåter (Rizo og Gierasch Ann. Rev. Biochem.

61: 387 (1992), , ved for eksempel å addere indre cysteingrupper som er i stand til å danne intramolekylære disulfidbroer som sykliserer peptidet.

"Antistoff" eller "antistoffpeptid(er)" refererer seg til et intakt antistoff, eller et bindende fragment av dette som konkurrerer med det intakte antistoffet for spesi fikk binding. Bindende fragmenter er fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker. De bindende fragmentene er fremstilt ved enzymatisk eller kjemisk spalting av intakte antistoffer. Bindende fragmenter innbefatter, men er ikke begrenset til, Fab, Fab', F(ab')2, Fv og enkeltkjedede antistoffer.

Begrepet "tung kjede" innbefatter ethvert polypeptid som har en tilstrekkelig variabel områdesekvens til å gi spesifitet for et OPGL. Begrepet "lett kjede" innbefatter ethvert polypeptid som har tilstrekkelig områdesekvens til å gi spesifitet for et OPGL. En fullengde tung kjede innbefatter et variabelt områdedomene V H og tre konstante områdedomener CH1, CH2 og CH3. VH-domenet er aminoterminus for polypeptidet, mens CH3-domenet er ved karboksyterminus. Begrepet "tung kjede" slik det brukes her, omfatter en fullengde tung kjede og fragmenter av dette. En fullengde lett kjede innbefatter et variabelt områdedomene VL og et konstant områdedomene CL. På lignende måte som i den tunge kjeden, så vil det variable områdedomenet i den lette kjeden være aminoterminus i polypeptidet. Begrepet "lett kjede" slik det brukes her, omfatter en fullengde lett kjede og fragmenter av dette. Et Fab-fragment omfatter en lett kjede og det CH1 og de variable områdene i en tung kjede. Den tunge kjeden i et Fab-molekyl kan ikke danne en disulfidbinding med et annet tungkjedemolekyl. Et Fab'-fragment inneholder en lett kjede og en tung kjede som inneholder mer av det konstante området mellom CH1- og CH2-domenene, slik at det kan dannes en interkjede disulfidbinding mellom to tunge kjeder slik at det dannes et F(ab')2-molekyl. Fv-området omfatter de variable områdene i både de tunge og lette kjedene, men mangler de konstante områdene. Enkeltkjedede antistoffer er Fv-molekyler hvor de tung- og lettkjedede variable områdene er forbundet ved hjelp av en fleksibel linker, slik at de danner en enkelt polypeptidkjede som danner et antigenbindende område. Enkeltkjedede antistoffer er detaljert beskrevet i WO 88/01649 og U.S. patentene nr. 4,946,778 og 5,260,203.

Et bivalent antistoff annet enn et "multispesifikt" eller "multifunksjonelt" antistoff er i visse utførelser å forstå å ha hvert av sine bindingsseter identiske.

Et antistoff hemmer i alt vesentlig adhesjon av en ligand til en reseptor når et overskudd av antistoff reduserer mengden av reseptor bundet til motreseptor med minst 20%, 40%, 60%, 80%, 85% eller mer (slik dette kan måles i en in vitro konkurrerende bindingsprøve).

Begrepet "epitop" innbefatter enhver polypeptiddeterminant som er i stand til spesifikt å binde seg til et immunoglobulin eller en T-cellereseptor. I visse aspekter vil epitopdeterminanter innbefatte kjemisk aktive overflategrupper på molekyler så som aminosyrer, sukkersidekjeder, fosforyl eller sulfonyl, og kan i visse utførel ser ha spesifikke tredimensjonale strukturelle egenskaper og/eller spesifikke ladningsegenskaper. En epitop er et område av et antigen som er bundet ved hjelp av et antistoff. Det er angitt at et antistoff spesifikt binder seg til et antigen når det preferensielt gjenkjenner sitt målantigen i en kompleks blanding av proteiner og/eller makromolekyler. Et antistoff vil bli angitt å spesifikt binde seg til et antigen når dissosiasjonskonstanten er ≤ 1 μM, i visse utførelser når dissosiasjonskonstanten er ≤ 100 nM, og i visse utførelser når dissosiasjonskonstanten er ≤ 10 nM.

Begrepet "middel" slik det brukes her, betegner en kjemisk forbindelse, en blanding av kjemiske forbindelser, et biologisk makromolekyl eller et ekstrakt fra biologiske materialer.

Med begrepene "markør" eller "merket" forstås inkorporeringen av en påvisbar markør, for eksempel ved å inkorporere en radiomerket aminosyre eller tilknytning til et polypeptid av biotingrupper som kan påvises ved hjelp av merket avidin (for eksempel streptavidin som inneholder en fluorescerende markør eller enzymatisk aktivitet som kan påvises ved hjelp av optiske eller kolorimetriske metoder).

Markøren kan også være terapeutisk. Det er kjent mange forskjellige fremgangsmåter for merking av polypeptider og glykoproteiner. Eksempler på markører for polypeptider innbefatter, men er ikke begrenset til de følgende radioisotoper eller radionuklider (for eksempel 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I), fluorescerende markører (for eksempel FITC, rodamin, lantanidfosfor), enzymatiske markører (for eksempel pepperrotperoksidase, βgalaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase), kjemiluminescerende forbindelser eller grupper, biotinylgrupper, forutbestemte polypeptidepitoper som gjenkjenner en sekundær reporter (for eksempel leukin glidelås ("zipper") parsekvenser, bindende seter for sekundære antistoffer, metallbindende domener, epitoptagger). I visse utførelser er markørene tilknyttet ved hjelp av avstandsskapende armer med forskjellige lengder for å redusere eventuell sterisk hindring.

Begrepet "biologisk prøve" slik det brukes her innbefatter, men er ikke begrenset til, enhver mengde av et stoff fra en levende ting eller en tidligere levende ting eller organisme. Slike levende ting innbefatter, men er ikke begrenset til, mennesker, mus, aper, rotter, kaniner og andre dyr. Slike stoffer innbefatter, men er ikke begrenset til, blod, serum, urin, celler, organer, vev, ben, benmarg, lymfeknuter og hud.

Begrepet "osteopenisk lidelse" innbefatter, men er ikke begrenset til, osteoporose, osteopeni, Pagets sykdom, lytiske benmetastaser, periodonititt, reumatisk artritt og bentap som skyldes immobilisering. I tillegg til disse bensykdommene og lidelsene, er det kjent at visse cancere øker den osteoklastiske aktiviteten og induserer benresorpsjon så som brystkreft, prostatakreft og multippelt myelom. Disse cancere er nå kjent for å fremstille faktorer som resulterer i en overekspresjon av OPGL i benet, noe som fører til økt antall osteoklaster og økt aktivitet.

Begrepet "farmasøytisk middel eller medikament" slik det brukes her, refererer seg til en kjemisk forbindelse eller sammensetning som er i stand til å indusere en forønsket terapeutisk effekt når dette middelet eller medikamentet blir passende administrert til en pasient.

Begrepet "modulator" slik det brukes her, er en forbindelse som endrer aktiviteten eller funksjonen til et molekyl. For eksempel kan en modulator forårsake en økning eller nedsettelse med hensyn til en viss aktivitet eller funksjon av et molekyl sammenlignet med størrelsen på aktiviteten eller funksjonen som ble observert i fravær av modulatoren. I visse utførelser er en modulator en inhibitor som nedsetter størrelsen på minst én aktivitet eller funksjon for et molekyl. Visse eksempler på aktiviteter og funksjoner for molekyler innbefatter, men er ikke begrenset til, bindingsaffinitet, enzymatisk aktivitet og signaloverføring. Visse eksempler på inhibitorer innbefatter, men er ikke begrenset til, proteiner, peptider, antistoffer, peptidlegemer, karbohydrater og små organiske molekyler. Peptidlegemer er for eksempel beskrevet i WO01/83525.

Slik det brukes her, betyr "i alt vesentlig rent" at en forbindelse er den i alt vesentlig tilstedeværende forbindelsen (for eksempel på en molar basis er mer vanlig eller forekommende enn eventuelle andre individuelle forbindelser i sammensetningen). I visse utførelser vil en i alt vesentlig renset fraksjon være en sammensetning hvor den forønskede forbindelsen omfatter minst 50 prosent (på molar basis) av alle de tilstedeværende makromolekylene. I visse utførelser vil en i alt vesentlig ren sammensetning omfatte mer enn 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% av alle makromolekylene som er tilstede i sammensetningen. I visse utførelser vil den forønskede forbindelsen bli renset til en i alt vesentlig homogenitet (forurensende forbindelser kan ikke påvises i sammensetningen ved hjelp av vanlige påvisningsmetoder) og hvor sammensetningen som sådan i alt vesentlig består av bare en type makromolekyler.

Begrepet pasient innbefatter mennesker og dyr.

I den foreliggende søknaden vil bruken av entall også innbefatte flertall hvis intet annet er angitt. I foreliggende søknad vil bruken av "eller" bety "og/eller" hvis intet annet er angitt. Bruken av begrepet "inkluderende" så vel som andre former så som "inkluderer" og "inkludert" brukes uten begrensning. Også begreper så som "element" eller "komponent" innbefatter både elementer og komponenter som omfatter en enhet, og elementer og komponenter som omfatter mer enn en underenhet hvis intet annet spesifikt er angitt.

Osteoprotegerinligand (OPGL) hører hjemme i tumor nekrosefaktor (TNF) gruppen av cytokiner og inngår i dannelsen av osteoklaster. Forøkt osteoklastaktivitet er korrelert med en rekke osteopene lidelser så som postmenopausal osteoporose, Pagets sykdom, lytiske benmetastaser og reumatisk artritt. En reduksjon av OPGL-aktiviteten vil derfor kunne resultere i nedsatt osteoklastaktivitet og kan derved redusere graden av osteopene lidelser. Antistoffer som er rettet inn mot OPGL kan brukes for å behandle osteopene lidelser inklusive, men ikke begrenset til, de som er nevnt ovenfor.

Det er heri beskrevet et helt humant monoklonalt antistoff mot human osteoprotegerinligand (OPGL). I visse utførelser er det tilveiebrakt nukleotidsekvenser som koder det nevnte antistoffet foruten aminosyresekvenser som omfatter tung- og lettkjedede immunoglobulinmolekyler, da spesielt sekvenser som tilsvarer de variable områdene. Det er tilveiebrakt sekvenser som tilsvarer de komplementært bestemmende områdene (CDR), spesifikt fra CDR1 til og med CDR3. Det blir også tilveiebrakt en hybridomcellelinje som uttrykker et slikt immunoglobulinmolekyl og monoklonalt antistoff. Det blir videre tilveiebrakt et renset humant monoklonalt antistoff mot humant OPGL.

Evnen til å klone og rekonstruere megabase store humane loki i gjær kunstige kromosomer (YAC) og føre disse inn i musegermlinjen, gir en fremgangsmåte for å belyse de funksjonelle komponentene i meget store og grovt kartlagte loki, så vel som å kunne utvikle brukbare modeller for humane sykdommer. Videre vil en anvendelse av slik teknologi hvor man erstatter nevnte museloki med deres humane ekvivalenter, kunne gi enestående innsyn eller innblikk i ekspresjonen og reguleringen av humane genprodukter under utvikling, deres kommunikasjon med andre systemer og hvorledes de inngår i induksjon og utvikling av sykdommer.

En viktig praktisk anvendelse av en slik strategi er den såkalte "humaniseringen" av det humane immunsystemet hos mus. Innføring av humane immunoglobulin (Ig) loki i mus hvor de endogene Ig-genene er blitt inaktivert, gir en stor mulighet for å studere de mekanismene som ligger under en programmert ekspresjon og samling av antistoffer så vel som deres rolle ved B-celleutvikling. Videre vil en slik strategi gi en kilde for produksjon av hele humane monoklonale antistoffer (MAbs). Det er forventet at hele humane antistoffer vil kunne minimalisere de intriniske immunogene og allergiske reaksjonene overfor mus eller musederivatiserte monoklonale antistoffene og derfor kunne øke effekten og sikkerheten til de administrerte antistoffene. Hele humane antistoffer vil kunne brukes for behandling av kroniske og tilbakevendende humane sykdommer så som osteoporose, inflammasjon, autoimmunitet og cancer som vil kunne innbefatte gjentatte antistoffadministreringer.

Man kan behandle eller utvikle musestammer som har sviktende museantistoffproduksjon med store fragmenter av de humane Ig-loki i forventning av at slike mus vil kunne produsere humane antistoffer i fraværet av museantistoffer. Store humane Ig-fragmenter kan beholde den store variable gendiversiteten så vel som passende regulering av antistoffproduksjon og ekspresjon. Ved å utnytte musens genmaskineri for antistoffdiversifisering og seleksjon og mangelen på immunologisk toleranse overfor humane proteiner, så kan det reproduserte humane antistoffutvalget i disse musestammene gi høyaffinitets antistoffer mot ethvert antigen av interesse, inklusive humane antigener. Ved å bruke hybridomteknologi, er det mulig å fremstille og velge ut antigenspesifikke MAb med den forønskede spesifiteten.

Det er mulig å bruke konstante områder fra andre arter enn mennesker sammen med de humane variable områdene.

Naturlig forekommende antistoffstruktur

Naturlig forekommende antistoffstrukturelle enheter omfatter typisk en tetramer. Hver slik tetramer er typisk sammensatt av to identiske par av polypeptidkjeder, og hvor hvert par har en fullengde "lett" (i visse utførelser ca 25 kDa) og en fullengde "tung" kjede (i visse utførelser ca 50-70 kDa). Den aminoterminale delen av hver kjede vil typisk innbefatte et variabelt område med fra 100 til 110 eller flere aminosyrer som vanligvis vil være ansvarlig for antigengjenkjennelse. Den karboksyterminale delen av hver kjede vil typisk definere et konstant område som er ansvarlig for effektorfunksjonen. Humane lette kjeder er typisk klassifisert som kappa- og lambdalette kjeder. Tunge kjeder er vanligvis klassifisert som my, delta, gamma, alfa eller epsilon, og definerer antistoffisotypen som henholdsvis IgM, IgD, IgG, IgA og IgE. IgG har flere underklasser, inklusive men ikke begrenset til, IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4. IgM har underklasser som innbefatter, men som ikke er begrenset til, IgM1 og IgM2. IgA er på lignende måte oppdelt i underklasser som inkluderer, men som ikke er begrenset til, IgA1 og IgA2. Innenfor fullengde lette og tunge kjeder vil typisk de variable og konstante områdene være knyttet sammen ved hjelp av et "J"-område med fra 12 eller flere aminosyrer, og hvor den tunge kjeden også innbefatter et "D"-område på fra ca 10 eller flere aminosyrer. Se for eksempel Fundamental Immunology kapittel 7 (Paul, W., red. 2. utgave Raven Press, N.Y. (1989)). De variable områdene i hvert av de lette/tunge kjedeparene vil typisk danne det antigenbindende setet.

De variable områdene vil typisk ha de samme generelle strukturer av relativt konserverte rammeverksområder (FR) knyttet sammen ved hjelp av tre hypervariable områder, også kalt komplementerende bestemmende områder eller CDR. De nevnte CDR fra de to kjedene av hvert par vil typisk være på linje (aligned) ved hjelp av rammeverksområdene, noe som muliggjør en binding til en spesifikk epitop. Fra N-terminal til C-terminal, så vil både de lette og tunge kjedevariable områdene typisk omfatte domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Anvisningen av aminosyrer til hvert domene er typisk i overensstemmelse med de definisjonene som er gitt i Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 og 1991)) eller Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al.

Nature 342: 878-883 (1989).

Bispesifikke eller bifunksjonelle antistoffer

Et bispesifikt eller bifunksjonelt antistoff vil typisk være et kunstig hybridantistoff med to forskjellige par av tunge og lette kjeder og to forskjellige bindingsseter. Bispesifikke antistoffer kan fremstilles ved en rekke forskjellige fremgangsmåter som innbefatter, men som ikke er begrenset til, fusjon av hybridomer eller en sammenbinding av Fab'-fragmenter. Se for eksempel Songsivilai & Lachmann Clin.

Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).

Fremstilling av antistoffer

Ifølge visse utførelser, så inngår visse antistoffer som spesifikt binder seg til OPGL i oppfinnelsen. Antistoffene kan fremstilles ved en immunisering av fullengde OPGL, løselige former av OPGL, eller et fragment av disse. I visse utførelser kan antistoffene ifølge oppfinnelsen være polyklonale eller monoklonale og/eller de kan være rekombinante antistoffer. Antistoffene kan være humane antistoffer, fremstilt for eksempel ved å immunisere transgene dyr som er i stand til å fremstille humane antistoffer (se for eksempel PCT publisert søknad nr. WO 93/12227).

De komplementære bestemmende områdene (CDR) i de variable områdene i de lette og tunge kjedene i αOPGL-1 kan kodes på rammeverksområder (FR) fra den samme eller en annen art. Nevnte CDR i de variable områdene i de lette og tunge kjedene i αOPGL-1 kan podes til konsensus humane FR. For å skape slike, så kan FR i visse utførelser, fra flere tungkjedede eller lettkjedede aminosyresekvenser, bli parallellsammenlignet (aligned) for å identifisere en konsensussekvens. I visse aspekter vil nevnte FR i de αOPGL-1 tunge og lette kjedene bli erstattet med FR fra en annen tung kjede eller lett kjede. I visse aspekter vil sjeldne aminosyrer i FR i de tunge og lette kjedene i αOPGL-1 ikke bli erstattet, mens resten av FR-aminosyrene blir erstattet. Sjeldne aminosyrer er spesifikke aminosyrer som er i posisjoner hvor de vanligvis ikke finnes i rammeverksområdene. I visse aspekter kan de podede variable områdene fra αOPGL-1 brukes sammen med et konstant område som er forskjellig fra det konstante området i αOPGL-1. I enkelte aspekter er de podede variable områdene en del av et enkeltkjedet Fv-antistoff. CDR-poding er blant annet beskrevet i U.S. patentene nr. 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089 og 5,530,101.

Antistoffer kan fremstilles ved å bruke en transgen mus hvor en vesentlig del av det humane antistoffproduserende genomet er innsatt, men hvor samtidig musen har sviktende produksjon av endogene, museantistoffer. Slike mus vil således være i stand til å produsere humane immunoglobulinmolekyler og antistoffer og har sviktende produksjon av muse immunoglobulinmolekyler og antistoffer.

Teknologier som kan brukes for å oppnå dette resultatet er beskrevet i patenter, søknader og de referanser som her er angitt. Man kan bruke de fremgangsmåtene som for eksempel er beskrevet i PCT publisert søknad nr. WO 98/24893. Se også Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997).

Helt humane monoklonale antistoffer som er spesifikke for OPGL kan fremstilles som følger. Transgene mus som inneholder humane immunoglobulingener blir immunisert med antigenet av interesse. Det blir så innvunnet lymfatiske celler (så som B-celler) fra musen som uttrykker antistoffer. Slike innvunne celler blir så fusjonert med en cellelinje av myeloidtypen for derved å få fremstilt immortale hybridomcellelinjer, og slike kan så screenes og velges ut for å identifisere hybridomcellelinjer som produserer antistoffer som er spesifikke for antigenet av interesse. Heri er beskrevet en produksjon av en hybridomcellelinje som fremstiller antistoffer som er spesifikke for OPGL.

I visse aspekter blir antistoffene som er beskrevet heri fremstilt ved hjelp av hybridomlinjene AMG 6.1, AMG 6.4, AMG 6.5, AMG 7.1 og AMG 7.2. I visse aspekter blir antistoffene som er beskrevet heri fremstilt ved hjelp av hybridomlinjene AMG 6.1, AMG 6.4 og AMG 6.5. I visse utførelser vil antistoffene binde seg til OPGL med en dissosiasjonskonstant (Kd) som ligger omtrent mellom 0,23 og 0,29 nM. I visse utførelservil antistoffene binde seg til OPGL med en Kd på mindre enn 0,23 nM.

I visse utførelser er antistoffene av IgG2-isotypen. I visse utførelser vil antistoffene omfatte en human kappa lett kjede og en human IgG2 tung kjede. I visse utførelser vil antistoffene være klonet for ekspresjon i pattedyrceller. I visse aspekter vil de variable områdene i antistoffene være ligert til et konstant område som er forskjellig fra det konstante området i IgG2-isotypen.

I visse aspekter vil konservative modifikasjoner i de tunge og lette kjedene i αOPGL-1 (og tilsvarende modifikasjoner i de kodende nukleotidene) vil produsere antistoffer til OPGL som har funksjonelle og kjemiske egenskaper som er lik de i αOPGL-1. I motsetning til dette, kan vesentlige modifikasjoner med hensyn til de funksjonelle og/eller kjemiske egenskapene for αOPGL-1 oppnås ved å velge substitusjoner i aminosyresekvensen i de tunge og lette kjedene som skiller seg signifikant i sin effekt ved å opprettholde (a) strukturen på den molekylære kjeden i substitusjonsområdet, for eksempel som en plate eller som en spiralkonformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten til molekylet i målsetet, eller (c) volumet på sidekjeden.

For eksempel kan en "konservativ aminosyresubstitusjon" innbefatte en substitusjon av en opprinnelig og naturlige aminosyregruppe med en ikke-naturlig aminosyregruppe slik at det er liten eller ingen effekt på polariteten eller ladningen på aminosyregruppen i denne posisjonen. Videre kan enhver naturlig og opprinnelig gruppe i polypeptidet også substitueres med alanin, slik det tidligere er beskrevet for "alaninskanningmutagenese".

Ønskelige aminosyresubstitusjoner (enten disse er konservative eller ikkekonservative) kan lett bestemmes av innsiktsfulle fagpersoner på det tidspunktet hvor slike substitusjoner er ønskelige. I visse utførelser kan aminosyresubstitusjoner brukes for å identifisere viktige grupper i αOPGL-1, eller for å øke eller å nedsette antistoffenes affinitet til OPGL slik dette er beskrevet her.

Antistoffene kan uttrykkes i cellelinjer som er forskjellige fra hybridomcellelinjer. I visse utførelser vil sekvenser som koder spesielle antistoffer brukes for å transformere en egnet pattedyrvertscelle. Transformasjonen kan utføres ved enhver kjent fremgangsmåte for å føre polynukleotider inn i en vertscelle, for eksempel ved å pakke polynukleotidet i et virus (eller i en viral vektor) og så infisere en vertscelle med nevnte virus (eller vektor), eller ved å anvende transfeksjonsmetoder slik disse er kjente, for eksempel som eksemplifisert i U.S. patentene nr. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 og 4,959,455. Den transformasjonsmetoden som brukes vil være avhengig av den vert som skal transformeres. Fremgangsmåter for å innføre heterologe polynukleotider i pattedyrceller er velkjente innenfor bioteknologien og innbefatter, men er ikke begrenset til, dekstranmediert transfeksjon, kalsiumfosfatutfelling, polybrenmediert transfeksjon, protoplastfusjon, elektroporering, innkapsling av polynukleotider i liposomer og direkte mikroinjeksjon av DNA i kjerner.

Pattedyrcellelinjer som er tilgjengelige som verter for ekspresjon er velkjente innenfor bioteknologien og innbefatter, men er ikke begrenset til, mange immortaliserte cellelinjer som er tilgjengelige fra "the American Type Culture Collection" (ATCC) og som innbefatter, men som ikke er begrenset til, kinesiske hamstereggstokk (CHO) celler, HeLa-celler, fosterhamsternyre (BHK) celler, apenyreceller (COS), humane hepatocellulære karsinomceller (for eksempel Hep G2) og et antall andre lignende cellelinjer. Cellelinjene kan velges ut ved å bestemme hvilken cellelinje som har de høyeste ekspresjonsnivåene og produserer antistoffer med konstitutive OPGL-bindende egenskaper.

Antistoffene vil kunne brukes for å påvise OPGL i biologiske prøver. I visse utførelser vil dette muliggjøre identifikasjonen av celler eller vev som produserer proteinet. Antistoffer som binder seg til OPGL og blokkerer interaksjon med andre bindende forbindelser vil ha terapeutisk anvendelse for å modulere osteoklastdifferensiering og benresorpsjon. Antistoffer til OPGL vil kunne blokkere OPGL-binding til ODAR, og dette vil kunne resultere i en blokkering av signaloverføringskaskaden og tap av NF-kB-mediert transkripsjonsaktivering.

Prøver for å måle NF-kB-mediert transkripsjonsaktivering, for eksempel ved å bruke en luciferase reporterprøve, er velkjente for fagpersoner innenfor fagfel tet.

Det er heri beskrevet fremgangsmåter for å behandle en benlidelse som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff til OPGL. I visse utførelser er det videre beskrevet fremgangsmåter for å behandle en benlidelse som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff til OPGL og et annet terapeutisk middel. Det ytterligere terapeutiske middelet vil bli administrert i en terapeutisk effektiv mengde. I visse fremgangsmåter er benlidelsen en lidelse som er karakterisert ved et netto bentap og innbefatter, men er ikke begrenset til, osteopeni og osteolyse. I visse fremgangsmåter vil behandling med et antistoff til OPGL bli brukt for å nedsette eller å undertrykke hastigheten med hensyns til benresorpsjon. I visse fremgangsmåter kan derfor behandlingen brukes for å redusere hastigheten av benresorpsjon når denne hastigheten ligger over den normale, eller for å redusere benresorpsjonen til nivåer under det normale for å kompensere for tidligere lave nivåer med hensyn til bendannelse. I visse fremgangsmåter kan antistoffene testes for binding til OPGL i fraværet eller nærværet av OPG og derved undersøkes for sin evne til å hemme OPGL-mediert osteoklastogenese og/eller benresorpsjon.

Tilstander som kan behandles innbefatter, men er ikke begrenset til, de følgende:

Osteoporose inklusive, men ikke begrenset til, primær osteoporose, endokrin osteoporose (inklusive, men ikke begrenset til, hypertyroidisme, hyperparatyroidisme, Cushings syndrom og akromegali), arvelige og kongenitale former av osteoporose (inklusive, men ikke begrenset til, osteogenese imperfekta, homocystinuri, Menkes syndrom, Riley-Day syndrom) og osteoporose som skyldes immobilisering av ekstremiteter;

Pagets sykdom i ben (osteititt deformans) hos voksne og unge personer;

Osteomyelitt, det vil si et infeksjonssår i ben som fører til bentap;

Hyperkalsemi inklusive, men ikke begrenset til, hyperkalsemi som er et resultat av faste tumorer (inklusive, men ikke begrenset til, bryst, lunger og nyrer) og hematologisk ondartede sykdommer (inklusive, men ikke begrenset til, multippelt myelom, lymfom og leukemi), idiopatisk hyperkalsemi, foruten hyperkalsemi assosiert med hypertyroidisme og nyrefunksjonslidelser;

Osteopeni inklusive, men ikke begrenset til, osteopeni etter kirurgiske inngrep, osteopeni indusert ved steroid administrering, osteopeni assosiert med lidelser i tynn- eller tykktarmen og osteopeni assosiert med kroniske nyrelidelser;

Osteonekrose, det vil si bencelledød inklusive, men ikke begrenset til, osteonekrose assosiert med traumatisk skade, osteonekrose assosiert med Gauchers sykdom, osteonekrose assosiert med sigdcelleanemi, osteonekrose assosiert med systemisk lupus erytematose, osteonekrose assosiert med reumatisk artritt, osteonekrose assosiert med periodontal sykdom, osteonekrose assosiert med osteolytisk metastase og osteonekrose assosiert med andre tilstander; og

Tap av brusk og ledderosjon som er assosiert med reumatisk artritt.

Et antistoff til OPGL kan brukes alene eller sammen med minst ett ytterligere terapeutisk middel for behandling av benlidelser. Et antistoff til OPGL vil brukes sammen med en terapeutisk effektiv mengde av et ytterligere terapeutisk middel. Eksempler på terapeutiske midler som kan administreres sammen med et antistoff til OPGL innbefatter, men er ikke begrenset til, de benmorfogene faktorene som er betegnet BMP-1 til og med BMP-12; transformerende vekstfaktor- β (TGF- β) og andre faktorer som hører til TGF- β-gruppen; interleukin-1 (IL-1) inhibitorer som innbefatter, men som ikke er begrenset til, IL-1ra og derivater av disse og Kineret<TM>; anakinra, TNF α-inhibitorer som innbefatter, men som ikke er begrenset til, løselige TNF α-reseptorer, Enbrel<TM>, etanercept, anti-TNF α-antistoffer, Remicade<TM >, infliximab, og D2E7-antistoffer; paratyroidhormon og analoger av disse; paratyroidrelatert protein og analoger av dette; E-serier av prostaglandiner; bisfosfonater (så som alendronat og andre); benforbedrende mineraler så som fluorid og kalsium; ikke-steroidale antiinflammatoriske medikamenter (NSAID) som innbefatter, men som ikke er begrenset til, COX-2-inhibitorer så som Celebrex<TM>, celecoxib, og Vioxx<TM>; rofecoxib, immunoundertrykkende midler så som metotreksat eller leflunomid; serinproteaseinhibitorer som innbefatter, men ikke er begrenset til, sekretorisk leukocyttproteaseinhibitor (SLPI); IL-6-inhibitorer (som inkluderer, men ikke er begrenset til, antistoffer mot IL-6); IL-8-inhibitorer (som inkluderer, men ikke er begrenset til, antistoffer mot IL-8); IL-18-inhibitorer (som inkluderer, men ikke er begrenset til, IL-18-bindende proteiner og IL-18-antistoffer); interleukin-1-omdannende enzym (ICE) modulatorer; fibroblastvekstfaktorer FGF-1 til FGF-10 og FGF-modulatorer; PAF-antagonister; keratinocyttvekstfaktor (KGF), KGF-relaterte molekyler og KGF-modulatorer; matrise metalloprotease (MMP) modulatorer; nitrittoksidsyntase (NOS) modulatorer som innbefatter, men ikke er begrenset til, modulatorer av induserbart NOS; modulatorer av glukokortikoidreseptor; modulatorer av glutamatreseptor; modulatorer av lipopolysakkarid (LPS) nivåer; og noradrenalin og modulatorer og mimetika av denne.

Et antistoff til OPGL kan brukes sammen med forskjellige terapeutiske midler for å behandle forskjellige inflammatoriske tilstander, autoimmune tilstander eller andre tilstander med et medfølgende bentap. På bakgrunn av tilstanden og det forønskede behandlingsnivået, kan to eller tre eller flere midler administreres. Slike midler kan tilveiebringes ved at de inkluderes i det samme preparatet eller sammensetningen. Slike midler og et antistoff til OPGL vil bli tilveiebrakt for sammensetning i det samme preparatet. Slike midler kan tilveiebringes ved at de inkluderes i et behandlingssett. Slike midler og et antistoff til OPGL vil kunne tilveiebringes sammen for sammensetning i et behandlingssett. Slike midler kan tilveiebringes separat. Når de administreres ved genterapi, så kan gener som koder for proteinmidler og/eller et antistoff til OPGL inkluderes i den samme vektoren. De gener som koder proteinmidler og/eller et antistoff til OPGL kan være under kontroll av det samme promotorområdet. De genene som koder proteinmidler og/eller et antistoff til OPGL vil være i separate vektorer.

Heri er det beskrevet terapier som omfatter et antistoff til OPGL og minst én interleukin-1 (IL-1) inhibitor og fremgangsmåter for behandling hvor man anvender slike terapier. En terapi vil omfatte et antistoff til OPGL og en IL-1-inhibitor og minst ett ytterligere molekyl som beskrevet her. Fremgangsmåter for behandling vil anvende IL-1-inhibitorer og/eller TNF- α-inhibitorer sammen med et antistoff til OPGL. Et antistoff til OPGL i kombinasjon med IL-1-inhibitorer og/eller TNF- αinhibitorer vil kunne brukes for behandling av tilstander så som astma, reumatisk artritt og multippel sklerose.

Interleukin-1 (IL-1) er et antiinflammatorisk cytokin. I visse tilfeller er IL-1 en mediator i mange sykdommer og medisinske tilstander. I visse tilfeller blir IL-1 fremstilt av celler av makrofag-/monocyttopprinnelse. I visse tilfeller blir IL-1 fremstilt i to former: IL-1 alfa (IL-1 α) og IL-1 beta (IL-1 β).

En sykdom eller en medisinsk tilstand er ansett å være en "interleukin-1-mediert sykdom" hvis den spontane eller eksperimentelt frembrakte sykdommen eller medisinske tilstanden er assosiert med forhøyede nivåer av IL-1 i kroppsvæsker eller vev og/eller hvis celler eller vev tatt fra kroppen produserer forhøyede nivåer av IL-1 i kultur. Slike interleukin-1-medierte sykdommer vil også kunne gjenkjennes ved de følgende to ytterligere tilstandene: (1) Patologiske observasjoner assosiert med sykdommen eller den medisinske tilstanden kan etterlignes eller frembringes eksperimentelt i dyr ved å administrere IL-1 eller foreta en oppregulering av ekspresjonen av IL-1; og (2) en patologi indusert i eksperimentelle dyremodeller av sykdommen eller den medisinske tilstanden kan hemmes eller fjernes ved behandling av midler som hemmer virkningen av IL-1. En eller flere av de ovennevnte tilstandene vil opptre i en IL-1-mediert sykdom. Alle tre tilstandene vil i visse tilfeller opptre i en IL-1-mediert sykdom.

Akutte og kroniske interleukin-1 (IL-1) medierte sykdommer innbefatter, men er ikke begrenset til, følgende: Akutt pankreatitt; amyotrofisk lateral sklerose (ALS eller Lou Gehrigs sykdom); Alzheimers sykdom; cachexi/anoreksi som innbefatter, men som ikke er begrenset til, AIDS-indusert cachexi; astma og andre lungesykdommer; aterosklerose; autoimmun vaskulitt; kronisk tretthetssyndrom; clostridium-assosiert sykdom som innbefatter, men ikke er begrenset til, clostridium-assosiert diaré; koronare tilstander og indikasjoner som innbefatter, men som ikke er begrenset til, kongestiv hjertesvikt, koronar restenose, myokardialt infarkt, myokardial dysfunksjon (for eksempel relatert til sepsis) og koronar arterie bypass transplantering; cancer som innbefatter, men som ikke er begrenset til, leukemi som innbefatter, men ikke er begrenset til, multippel myelom leukemi og myelogene leukemier (for eksempel AML og CML) og tumormetastaser; diabetes (som inkluderer, men ikke er begrenset til, insulinavhengig diabetes); endometriose; feber; fibromyalgi; glomerulonefritt; transplanterte organer versus vertssykdommer og/eller avstøtning av transplanterte organer; blødningssjokk; hyperalgesi; inflammatorisk tarmsykdom; inflammatoriske tilstander i et ledd som innbefatter, men ikke er begrenset til, osteoartritt, psoriatisk artritt og reumatisk artritt; inflammatoriske øyesykdommer som innbefatter, men ikke er begrenset til, de som for eksempel er assosiert med korneatransplanteringer; ischemi som innbefatter, men ikke er begrenset til, cerebral ischemi (som innbefatter, men ikke er begrenset til, en hjerneskade som et resultat av for eksempel traume, epilepsi, blødninger elle slag som alle kan føre til nevrodegenerering); Kawasakis sykdom; læringsproblemer; lungesykdommer (som inkluderer, men ikke er begrenset til, akutt respiratorisk stressyndrom eller ARDS); multippel sklerose; myopatier (for eksempel muskelproteinmetabolisme som inkluderer, men som ikke er begrenset til, muskelproteinmetabolisme i sepsis); nevrotoksitet (som inkluderer, men ikke er begrenset til, slike tilstander som er indusert av HIV); osteoporose; smerte som innbefatter, men ikke er begrenset til, cancerrelatert smerte; Parkinsons sykdom; periodontal sykdom; for tidlige veer; psoriasis; reperfusjonsskade; septisk sjokk; sideeffekter av strålingsterapi; temporal mandibular leddsykdom; søvnforstyrrelser; uveititt; og en inflammatorisk tilstand som for eksempel er et resultat av en forstrekning, en forstuing, bruskskade, traume, ortopedisk kirurgisk inngrep, infeksjon eller andre sykdomsprosesser.

I visse tilfeller kan en IL-1-inhibitor være ethvert protein eller molekyl som er i stand til spesifikt å hindre aktivering av cellulære reseptorer til IL-1 som kan være et resultat av en rekke forskjellige mekanismer. Eksempler på mekanismer innbefatter, men er ikke begrenset til, en nedregulering av IL-1-produksjon, binding av fritt IL-1, påvirkning av IL-1-binding til dens reseptor, påvirkning av dannelsen av IL-1-reseptorkomplekset (for eksempel assosiasjon av IL-1-reseptor med IL-1-reseptorassesorisk protein) og en påvirkning av moduleringen av IL-1-signaliseringen etter bindingen til dens reseptor.

Visse interleukin-1-inhibitorer innbefatter, men er ikke begrenset til, IL-1-reseptorantagonister og disse innbefatter, men er ikke begrenset til, Kineret <TM>, anakinra, IL-1ra, IL-1ra-varianter og IL-1ra-derivater som kollektivt betegnes "IL-1ra-proteiner"; anti-IL-1-resptor monoklonale antistoffer (se for eksempel EP 623674); IL-1-bindende proteiner som innbefatter, men ikke er begrenset til, løselige IL-1-reseptorer (se for eksempel U.S. patent nr. 5,492,888, U.S. patent nr.

5,488,032 og U.S. patent nr. 5,464,937, U.S. patent nr. 5,319,071 og U.S. patent nr.

5,180,812); anti-IL-1-monoklonale antistoffer (se for eksempel WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, U.S. patent nr. 4,935,343, EP 364778, EP 267611 og EP220063); IL-1-reseptor assesoriske proteiner og antistoffer til disse (se for eksempel WO 96/23067 og WO 99/37773); inhibitorer av interleukin-1 betakonverterende enzym (ICE) eller kaspase I (se for eksempel WO 99/46248, WO 99/47545 og WO 99/47154) som kan brukes for å hemme IL-1 betaproduksjon og -sekresjon; interleukin-1beta proteaseinhibitorer; og andre forbindelser og proteiner som blokkerer en in vivo syntese eller ekstracellulær frigjøring av IL-1.

Eksempler på IL-1-inhibitorer er blant annet beskrevet i U.S. patentene nr.

5,747,444; 5,359,032; 5,608,035; 5,843,905; 5,359,032; 5,866,576; 5,869,660; 5,869,315; 5,872,095; 5,955,480; 5,965,564; internasjonal (WO) patentsøknader 98/21957, 96/09323, 91/17184, 96/40907, 98/32733, 98/42325, 98/44940, 98/47892, 98/56377, 99/03837, 99/06426, 99/06042, 91/17249, 98/32733, 98/17661, 97/08174, 95/34326, 99/36426, 99/36415; europeiske (EP) patentsøknader 534978 og 894795; og fransk patentsøknad FR 2762514. En interleukin-1-reseptorantagonist (IL-1ra) er et humant protein som virker som en naturlig inhibitor av interleukin-1 og som hører hjemme i IL-1-gruppen som innbefatter IL-1 α og IL-1 β. Visse reseptorantagonister inklusive IL-1ra og varianter og derivater av disse, så vel som fremgangsmåter for fremstilling og bruk av dem er beskrevet i U.S. patent nr. 5,075,222; WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221; WO 93/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626; WO 94/20517; WO 96/22793; WO 97/28828; og WO 99/36541. I visse tilfeller kan en IL-1-reseptorantagonist være glykosylert. I visse tilfeller vil en Il-1-reseptorantagonist være ikke-glykosylert.

Tre former av IL-1ra og varianter av denne er beskrevet i U.S. patent nr. 5,075,222 (det såkalte '222-patentet). Den første formen som i nevnte '222-patentet kalles "IL-1i" er karakterisert som et 22-23 kD molekyl på SDS-PAGE med et omtrentlig isoelektrisk punkt på 4,8 og som elueres fra en Mono Q FPLC-kolonne ved omkring 52 mM NaCl i Tris-buffer, pH 7,6. Den andre formen, IL-1ra β, er karakterisert som et 22-23 kD protein som elueres fra en Mono Q-kolonne ved 48 mM NaCl. Både IL-1ra α og IL-1ra β er glykosylerte. Den tredje formen, IL-1rax, er karakterisert som et 20 kD protein som elueres fra en Mono Q-kolonne ved 48 mM NaCl og som er ikke-glykosylert. '222-patentet beskriver også visse fremgangsmåter for å isolere gener som koder for inhibitorene, fremgangsmåter for kloning av disse genene i egnede vektorer foruten en transformering og transfektering av disse genene inn i visse celletyper, og ekspresjon av disse genene for fremstilling av inhibitorene.

Det kan utføres delesjoner, innsettinger og/eller substitusjoner (individuelt eller samlet betegnet som "variant(er)") i aminosyresekvensene i IL-1ra. I visse tilfeller vil en IL-1ra-variant være biologisk aktiv (det vil si ha evnen til å hemme IL-1).

Det er heri beskrevet terapier som omfatter et antistoff til OPGL og minst én TNF αinhibitor og fremgangsmåter for behandling hvor man anvender slike terapier. I visse tilfeller vil en terapi omfatte et antistoff til OPGL og en TNF α-inhibitor og minst ett ytterligere molekyl som beskrevet her.

Visse sykdommer og medisinske tilstander er kontrollert eller mediert av TNF og kan kategoriseres som inflammatoriske tilstander. Slik begrepet brukes her, innbefatter en "TNF-mediert sykdom", men er ikke begrenset til, en sykdom eller medisinsk tilstand som er assosiert med forhøyede nivåer av TNF i kroppsvæsker eller i vev og/eller hvor celler eller vev som er tatt fra kroppen produserer forhøyede nivåer av TNF i kultur. I visse tilfeller vil en sykdom være en TNF-mediert sykdom hvis (1) patologiske observasjoner assosiert med sykdommen eller den medisinske tilstanden kan etterlignes eksperimentelt i dyr ved administrering eller ved en oppregulering av ekspresjonen av TNF og/eller (2) en patologi indusert i eksperimentelle dyremodeller av sykdommen, eller en medisinsk tilstand kan hemmes eller fjernes ved behandling med midler som hemmer virkningen av TNF.

Visse akutte og kroniske TNF-medierte sykdommer innbefatter, men er ikke begrenset til: Cachexi og anoreksi; cancer som innbefatter, men som ikke er begrenset til, leukemi; kronisk tretthetssyndrom; koronare tilstander og/eller indikasjoner som innbefatter, men som ikke er begrenset til, kongestiv hjertesvikt, koronar restenose, myokardialt infarkt, myokardial dysfunksjon (som innbefatter, men ikke er begrenset til, slike tilstander som er relatert til sepsis) og koronare arterie bypass transplanteringer; depresjon; diabetes som innbefatter, men som ikke er begrenset til, ungdoms type 1 diabetes, diabetes mellitus og insulinresistens (som innbefatter, men som ikke er begrenset til, insulinresistens assosiert med overvekt); endometriose, endometritt og relaterte tilstander; fibromyalgi og analgesi; vertsavstøtning av innpodede organer; hyperalgesi; inflammatoriske tarmsykdommer som inkluderer, men ikke er begrenset til, Crohns sykdom og Clostridium difficile-assosierte diaré; ischemi som innbefatter, men ikke er begrenset til, cerebral ischemi som innbefatter, men ikke er begrenset til, hjerneskade som et resultat av traume, epilepsi, blødninger og/eller slag; lungesykdommer som innbefatter, men ikke er begrenset til, voksent respiratorisk stressyndrom, astma og lungefibrose; multippel sklerose; nevroinflammatoriske sykdommer; øyesykdommer og tilstander som innbefatter, men ikke er begrenset til, korneatransplantering, okular degenerering og uveititt; smerte som innbefatter, men ikke er begrenset til, cancerrelatert smerte; pankreatitt; periodontale sykdommer; Pityriasis rubra pilaris (PRP); prostatitt som innbefatter både bakteriell og ikkebakteriell prostatitt og relaterte tilstander; psoriasis og relaterte tilstander; lungefibrose; reperfusjonsskade; reumatiske sykdommer som innbefatter, men som ikke er begrenset til, reumatisk artritt, osteoartritt, ungdomsartritt (som innbefatter, men ikke er begrenset til, juvenil reumatisk artritt), seronegativ polyartritt, ankyloserende spondylitt, Reiters syndrom og reaktiv artritt, psoriatisk artritt, enteropatisk artritt, polymyositt, dermatomyositt, skleroderma, systemisk sklerose, vaskulitt (for eksempel Kawasakis sykdom), cerebral vaskulitt, Lymes sykdom, stafylokokkindusert ("septisk") artritt, Sjögrens syndrom, reumatisk feber, polykondritt og polymyalgi reumatika og gigantcelleartritt); septisk sjokk; sideeffekter av strålingsterapi; systemisk lupus erytematose (SLE); temporal mandibular leddsykdom; tyroiditt; og vevstransplantering og/eller en inflammatorisk tilstand som er et resultat av forstrekning, forstuing, bruskskade, traume, ortopediske kirurgiske inngrep, infeksjon (for eksempel HIV, Clostridium difficile og relaterte arter) eller andre sykdomsprosesser.

I visse tilfeller vil TNF-inhibitorene virke slik at de i det minste nedregulerer eller hemmer TNF-produksjon, binder fritt TNF, påvirker TNFs binding til dens reseptor og påvirker moduleringen av TNF-signaliseringen etter bindingen til dens reseptor. Begrepet "TNF-inhibitor" inkluderer, men er ikke begrenset til, løseliggjorte TNF-reseptorer inklusive, men ikke begrenset til, løselig tumor nekrosefaktor reseptor type I (sTNF-RI; også kalt p55-reseptoren), løselig tumor nekrosefaktor reseptor type II (også kalt p75-reseptoren) og Enbrel<TM>; etanercept, antistoffer til TNF som inkluderer, men ikke er begrenset til, Remicade<TM >, infliximab,og D2E7 (se for eksempel U.S. patentene nr. 6,090,382 og 6,258,562); antistoffer ti l TNF-reseptor; sTNF-RI (se for eksempel WO 98(24463), etanercept (Enbrel<TM>), Avakin<TM>; inhibitorer av TNF- α-omdannende enzym (TACE); og andre molekyler som påvirker TNF-aktivitet.

Eksempler på TNF- α-inhibitorer er blant annet beskrevet i europeiske patentsøknader EP 308 378; EP 422 339; EP 393 438; EP 398 327; EP 415 486; EP 418 014; EP 417563; EP 433900; EP 464 533; EP 512 528; EP 526 905; EP 568 928; EP 607776 som beskriver bruken av leflunomid for inhibering av TNF- α; EP 663 210; EP 542795; EP 818439; EP 664 128; EP 542 795; EP 741 707; EP 874 819; EP 882714; EP 880970; EP 648783; EP 731791; EP 895988; EP 550376; EP 882 714; EP 853 083; EP 550 376; EP 943 616; EP 939 121; EP 614 984; EP 583 083; U.S. patent nr. 5,136,021; 5,929,117; 5,948,638; 5,807,862; 5,695,953; 5,834,435; 5,817,822; 5830742; 5,834,435; 5,851,556; 5,853,977; 5,359,037;

5,512,544; 5,695,953; 5,811,261; 5,633,145; 5,863,926; 5,866,616; 5,641,673; 5,869,677; 5,869,511; 5,872,146; 5,854,003; 5,856,161; 5,877,222; 5,877,200; 5,877,151; 5,886,010; 5,869,660; 5,859,207; 5,891,883; 5,877,180; 5,955,480; 5,955,476; 5,955,435; 5,994,351; 5,990,119; 5,952,320; 5,962,481; internasjonale patentsøknader WO 90/13575, WO 91/03553, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, WO 93/07863, WO 93/21946, WO 93/19777, WO 95/34326, WO 96/28546, WO 98/27298, WO 98/30541, WO 96/38150, WO 96/38150, WO 97/18207, WO 97/15561, WO 97/12902, WO 96/25861, WO 96/12735, WO 96/11209, WO 98/39326, WO 98/39316, WO 98/38859, WO 98/39315, WO 98/42659, WO 98/39329, WO 98/43959, WO 98/45268, WO 98/47863, WO 96/33172, WO 96/20926, WO 97/37974, WO 97/37973, WO 97/47599, WO 96/35711, WO 98/51665, WO 98/43946, WO 95/04045, WO 98/56377, WO 97/12244, WO 99/00364, WO 99/00363, WO 98/57936, WO 99/01449, WO 99/01139, WO 98/56788, WO 98/56756, WO 98/53842, WO 98/52948, WO 98/52937, WO 99/02510, WO 97/43250, WO 99/06410, WO 99/06042, WO 99/09022, WO 99/08688, WO 99/07679, WO 99/09965, WO 99/07704, WO 99/06041, WO 99/37818, WO 99/37625, WO 97/11668, WO 99/50238, WO 99/47672, WO 99/48491; japanske patentsøknader 10147531, 10231285, 10259140 og 10130149, 10316570, 11001481 og 127,800/1991; tysk patentsøknad nr.

19731521; og britiske patentsøknader nr. 2 218 101, 2 326 881, 2 246 569.

EP 393 438 og EP 422339 beskriver aminosyren og nukleinsyresekvensene for en løselig TNF-reseptor type I (også kjent sTNFR-I eller 30 kDa TNF-inhibitor) og en løsning TNF-reseptor type II (også kjent som sTNFR-II eller 40 kDa TNF-inhibitor) som kollektivt betegnes "sTNFRs". EP 393438 og EP 422 339 beskriver også modifiserte former av sTNFR-I og sTNFR-II som innbefatter, men ikke er begrenset til, fragmenter, funksjonelle derivater og varianter. Videre beskriver EP 393438 og EP 422 339 fremgangsmåter for å isolere gener som koder for inhibitorene, fremgangsmåter for å klone genene inn i egnede vektorer, fremgangsmåter for å transformere og transfektere genene inn i visse celletyper og å uttrykke genene for derved å få fremstilt inhibitorene.

sTNFR-I og sTNFR-II hører til nervevekstfaktor/TNF-reseptorsupergruppen av reseptorer som innbefatter nervevekstfaktorreseptoren (NGF), B-celleantigenet CD40, 4-1BB, rotte T-celleantigenet MRC OX40, fasantigenet og Cd27- og CD30-antigenene (Smith et al. (1990) Science, 248: 1019-1023). En konservert del i denne gruppen av celleoverflatereseptorer er et cysteinrikt ekstracellulært ligandbindende domene som kan oppdeles i fire gjentatte motiver med ca 40 aminosyrer som inneholder fra 4 til 6 cysteinresidua i posisjoner som er godt konservert (Smith et al. (1990), supra).

EP 393 438 beskriver en 40 kDa TNF-inhibitor Δ51 og en 40 kDa TNF-inhibitor

Δ53 som er trunkerte (forkortede) versjoner av det fullengde rekombinante 40 kDa TNF-inhibitorproteinet. Δ51 og Δ53 har henholdsvis 51 eller 53 aminosyrer, fjernet fra karboksylterminus i det modne eller fullengde proteinet.

Publisert PCT-søknad nr. WO 98/01555 beskriver trunkerte former av sTNFR-I og sTNFR-II som ikke inneholder det fjerde domenet (aminosyreresiduaene Thr<127>-Asn<161 >i sTNFR-I og aminosyreresiduaene Pro<141>-Thr<179 >i sTNFR-II); en del av det tredje domenet (aminosyreresiduaene Asn<111>-Cys<126 >i sTNFR-I og aminosyreresiduaene Pro<123>-Lys<140 >i sTNFR-II); og eventuelt ikke inneholder en del av det første domenet (aminosyreresiduaene Asp<1>-Cys<19 >i sTNFR-I og aminosyreresiduaene Leu<1>-Cys<32 >i sTNFR-II). I visse utførelser vil de trunkerte sTNFR inkludere proteiner representert ved formelen R1-[Cys<19>-Cys<103>]-R2 og R4-[Cys<32>-Cys<115>]-R5. Disse proteinene er trunkerte former av henholdsvis sTNFR-I og sTNFR-II.

Slik det brukes her, representerer "R1-[Cys<19>-Cys<103>]-R2" ett eller flere proteiner hvor [Cys<19>-Cys<103>] er residuaene eller gruppene 19 til og med 103 i sTNFR-I, og hvor sekvensen er gitt på figur 1 i WO 98/01555; hvor R1 representerer en metionylert eller ikke-metionylert amingruppe av Cys<19 >eller en eller flere aminoterminale aminosyreresidua valgt fra Cys<18 >til Asp<1>; og hvor R2 representerer en karboksygruppe av Cys<103>, eller en eller flere karboksyterminale aminosyreresidua valgt fra Phe<104 >til Leu<110>.

Eksempler på trunkerte sTNFR-I innbefatter, men er ikke begrenset til, sTNFR-1 2.6D/C105, sTNFR-1 2.6D/C106, sTNFR-1 2.6D/N105, sTNFR-1 2.3D/d8, sTNFR-1 2.3D/d18, sTNFR-1 2.3D/d15, enten metionylerte eller ikke-metionylerte, og varianter og derivater av disse. Visse eksempler på trunkerte sTNFR-I er beskrevet for eksempel i publisert PCT-søknad nr. WO 98/01555.

Slik det brukes her, representerer "R3-[Cys<32>-Cys<115>]-R4" ett eller flere proteiner hvor [Cys<32>-Cys<115>] er residuaene Cys<32 >til og med Cys<115 >i sTNFR-II, og hvis sekvens er gitt på figur 8 i WO 98/01555; og hvor R3 representerer en metionylert eller ikke-metionylert amingruppe av Cys<32 >eller en eller flere aminoterminale aminosyreresidua valgt fra Cys<31 >til Leu<1>; og hvor R4 representerer en karboksygruppe av Cys<115 >eller en eller flere karboksyterminale aminosyreresidua valgt fra Ala<116 >til Arg<122>.

Det er her beskrevet terapier som omfatter et antistoff til OPGL og minst én serinproteaseinhibitor, og fremgangsmåter for behandling hvor man anvender slike terapier. I visse tilfeller vil terapien omfatte et antistoff til OPGL og en serinproteaseinhibitor og minst ett ytterligere molekyl som beskrevet her.

Endogene proteolytiske enzymer kan bryte ned invaderende organismer, antigenantistoffkomplekser og visse vevsproteiner som ikke lenger er nødvendige eller brukbare. Infiserende midler kan innføre ytterligere proteolytiske enzymer i organismen. Proteaseinhibitorer kan regulere både endogene og invaderende proteolytiske enzymer.

I visse tilfeller vil naturlig forekommende proteaseinhibitorer tjene til å kontrollere endogene proteaser ved å begrense deres reaksjoner lokalt og temporært. I visse tilfeller vil proteaseinhibitorer kunne hemme proteaser som er ført inn i kroppen av infiserende organismer. I visse tilfeller er vev som er spesielt utsatt for proteolytiske angrep og infeksjon inklusive, men ikke begrenset til, de i luftveiene, rike på proteaseinhibitorer.

Proteaseinhibitorer omfatter ca 10% av proteinene i humant plasma. Minst åtte inhibitorer er blitt isolert fra denne kilden og karakterisert i litteraturen. Disse innbefatter, men er ikke begrenset til, alfa 2-makroglobulin (alfa 2M), alfa 1-proteaseinhibitor (alfa 1PI), alfa 1-antichymotrypsin (alfa 1Achy), alfa 1-anticollagenase (alfa 1AC) og inter-alfa-trypsininhibitor (I-alfa-I).

I visse tilfeller vil en forstyrrelse av protease/proteaseinhibitorbalansen føre til en proteasestyrt vevsdestruksjon som inkluderer, men ikke er begrenset til, emfysem, artritt, glomerulonefritt, periodontitt, muskulær dystrofi, tumorinvasjon og forskjellige andre patologiske tilstander. I visse situasjoner, for eksempel under alvorlige patologiske prosesser så som sepsis eller blodforgiftning eller akutt leukemi, vil mengden av frie proteolytiske enzymer kunne øke på grunn av at enzymet frigjøres fra sekretoriske celler.

En svekket regulering av organismens inhibitorkapasitet kan videre i visse tilfeller også endre protease/proteaseinhibitorbalansen. Et ikke-begrensende eksempel på en slik svekket regulerende inhibitorkapasitet er en alfa 1-proteaseinhibitorsvikt som er korrelert med utviklingen av lungeemfysem.

I visse tilfeller kan organismen skades alvorlig når slike avvikende tilstander er tilstede hvis det ikke tas forholdsregler for å kontrollere de proteolytiske enzymene. Det er derfor ønskelig å kunne tilveiebringe proteaseinhibitorer som kan administreres en organisme for å kontrollere proteolytiske enzymer.

Leukocyttelastase, trypsin, katepsin G og pankreatisk elastase er ikke-begrensende eksempler på en gruppe av proteaser som er kjent som serinproteaser.

I visse tilfeller kan leukocyttelastase, når det frigjøres ekstracellulært, bryte ned bindevev og andre verdifulle proteiner. Mens en normalt fungerende organisme bryter ned en viss mengde bindevev og andre proteiner, så vil et nærvær av forhøyede mengder av leukocyttelastase kunne være assosiert med forskjellige patologiske tilstander som inkluderer, men ikke er begrenset til, emfysem og reumatisk artritt. I visse tilfeller, for å motvirke effektene av leukocyttelastase når dette enzymet er tilstede i større mengder enn det som er normalt, vil det være ønskelig å kunne tilveiebringe en proteaseinhibitor som er spesifikk for leukocyttelastase. En slik proteaseinhibitor kan være verdifull hvis den er i stand til å kunne isoleres og fremstilles i en renset form og i tilstrekkelige mengder til å kunne brukes farmasøytisk.

Visse leukocyttelastaseinhibitorer er beskrevet, for eksempel i Schiessler et al., "Acid-Stable Inhibitors of Granulocyte Neutral Proteases in Human Mucous Secretions: Biochemistry and Possible Biological Function", i Neutral Proteases of Human Polymorphoneuclear Leucocytes, Havemann et al. (red), Urban and Schwarzenberg, Inc. (1978) og i Travis og Salvesen, Ann. Rev. Biochem. 52: 655-709 (1983).

I visse tilfeller vil trypsin starte en nedbrytning av visse typer mykt organvev så som pankreasvev under en rekke forskjellige akutte tilstander som innbefatter, men ikke er begrenset til, apkreatitt. En trypsininhibitor kan således være verdifull hvis den kan isoleres og fremstilles i en renset form og i tilstrekkelige mengder til å kunne brukes farmasøytisk.

Kathepsin G er en annen protease som er tilstede i leukocytter. I visse tilfeller vil kathepsin G være i stand til å bryte ned en rekke proteiner in vitro, inklusive de i komplementreaksjonsveien. Pankreatisk elastase er en annen protease som kan spille en rolle i pankreatitt. Inhibitorer av disse proteasene vil således også være av farmasøytisk verdi.

I visse tilfeller er det antatt at substratspesifiteten og sensitiviteten for de forskjellige inhibitorene av serinproteaser er et resultat av forandringer i bare noen få aminosyreresidua eller grupper. Ved analogi er det mulig å forestille seg en klasse eller gruppe av serinproteaseinhibitorer hvor en forandring av relativt få aminosyrer vil resultere i en inhibering av forskjellige proteaser. I visse tilfeller vil et enzym i denne gruppen eller klassen kunne hemme hver eneste serinprotease.

Et eksempel på en serinproteaseinhibitor er sekretorisk leukocyttproteaseinhibitor (SLPI) og fragmenter og analoger av denne. Eksempler på serinproteaseinhibitorer innbefatter også, men er ikke begrenset til, antileukoprotease (ALO), slimhinneproteaseinhibitor (MPI), human seminal plasmainhibitor-I (HUSI-I), bronkieslimhinneinhibitor (BMI) og cervical slimhinneinhibitor (CUSI). I visse tilfeller kan en serinproteaseinhibitor også være en LPS-modulator. Se for eksempel Jin et al. (1997), Cell 88(3): 417-26. I visse tilfeller er disse molekylene godt egnet for bruk i tilstander som fører til bentap, ettersom de preferensielt er rettet inn mot brusken.

Eksempler på serinproteaseinhibitorer er blant annet beskrevet i U.S. patent nr. 4,760,130; U.S. patent nr. 5,900,400; og U.S. patent nr. 5,633,227. De molekyler som er beskrevet i de forannevnte referanser så vel som eventuelle varianter eller analoger av disse, er kollektivt betegnet "serinproteaseinhibitorer".

IL-18 er et proinflammatorisk cytokin som har vist seg å indusere interferon- � og som tidligere ble betegnet interferon gammainduserende faktor (IGIF). I visse tilfeller har det vist seg at IL-1 oppregulerer IL-18-produksjon, og IL-18 induserer produksjon av en rekke proinflammatoriske cytokiner inklusive IL-6 og MMP-1. Se for eksempel Dinarello et al. (1998), J. Leukocyte Biol. 63: 658-64. I visse tilfeller er kaspase I også viktig for IL-18-produksjon. Eksperimenter antyder at TNF- α regulerer IL-18-produksjon og at en samtidig inhibering av TNF- α og IL-18 beskytter mot levertoksitet. Se for eksempel Faggioni et al. (2000), PNAS 97: 2367-72.

IL-18 virker in vivo gjennom et reseptorsystem som minner om IL-1-systemet. IL-18 virker sammen med en celleoverflatereseptor (IL-18R) som virker sammen med et assesorisk protein (IL-18RAcP). IL-18 styrer signalet som fører opp til dannelsen av komplekset av IL-18, IL-18R og IL-18RAcP. En naturlig inhibitor for IL-18 er IL-18bp. I visse tilfeller vil IL-18bp virke som en "avledende reseptor" ved å binde seg til IL-18-molekyler og derved hindre interaksjonen med IL-18R.

Det er heri beskrevet terapier som omfatter et antistoff til OPGL og minst én IL-18-inhibitor foruten fremgangsmåter for behandling hvor man anvender slike terapier. I visse tilfeller vil en terapi omfatte et antistoff til OPGL og en IL-18-inhibitor og minst ett ytterligere molekyl som beskrevet her. Eksempler på tilstander som kan behandles innbefatter, men er ikke begrenset til, inflammasjon, autoimmune sykdommer, IL-1-medierte sykdommer og TNF-medierte sykdommer. Eksempler på tilstander som kan behandles med et antistoff til OPGL og minst én IL-18-inhibitor innbefatter, men er ikke begrenset til, artritt, inklusive, men ikke begrenset til, reumatisk artritt; systemisk lupus erytematose (SLE); transplanterte organer versus vertssykdommer (GvHD); hepatitt, sepsis; og tap av ben og brusk som følger disse sykdommene.

Eksempler på IL-18-inhibitorer innbefatter, men er ikke begrenset til, antistoffer som binder seg til IL-18; antistoffer som binder seg til IL-18R; antistoffer som binder seg til IL-18RAcP; IL-18bp; IL-18R-fragmenter (for eksempel et løseliggjort ekstracellulært domene av IL-18-reseptoren); peptider som binder seg til IL-18 og reduserer eller hindrer dets interaksjon med IL-18R; peptider som binder seg til IL-18R og derved reduserer eller hindrer dets interaksjon med IL-18 eller med IL-18RAcP; peptider som binder seg til IL-18RAcP og reduserer eller hindrer dets interaksjon med IL-18R; foruten små molekyler som reduserer eller hindrer IL-18-produksjon eller interaksjonen med enhver av IL-18, IL-18R og IL-18RAcP.

Visse IL-18-inhibitorer er for eksempel beskrevet i US patent nr. 5,912,324 utstedt 14. juli 1994; EP 0962 531 publisert 8. desember 1999; EP 712 931 publisert 15. november 1994; US patent nr. 5,914,253 utstedt 14. juli 1994; WO 97/24441 publisert 10. juli 1997; US patent nr. 6,060,283 utstedt 9. mai 2000; EP 850 952 publisert 26. desember 1996; EP 864585 publisert 16. september 1998; WO 98/41232 publisert 24. september 1998; US patent nr. 6,054,487 utstedt 25. april 2000; WO 99/09063 publisert 14. august 1997; WO 99/22760 publisert 3. november 1997; WO 99/37772 publisert 23. januar 1998; WO 99/37773 publisert 20. mars 1998; EP 0974 600 publisert 26. januar 2000; WO 00/12555 publisert 9. mars 2000; japansk patentsøknad JP 111,399/94 publisert 31. oktober 1997; israelsk patentsøknad IL 121554 A0 publisert 8. februar 1998.

I visse tilfeller kan et antistoff til OPGL brukes sammen med minst ett terapeutisk middel for inflammasjon. I visse tilfeller kan et antistoff til OPGL brukes sammen med minst ett terapeutisk middel for behandling av en immunlidelse. Eksempler på terapeutiske midler for inflammasjon og immunlidelser og sykdommer innbefatter, men er ikke begrenset til, kortikosteroider inklusive, men ikke begrenset til, prednisolon; ikke-steroidale antiinflammatoriske medikamenter (NSAID) som inkluderer, men ikke er begrenset til, syklooksygenase type 1 (COX-1) og syklooksygenase type 2 (COX-2) inhibitorer; sykdomsmodifiserende antirevmatiske medikamenter (DMARD) som inkluderer, men ikke er begrenset til, metotreksat, hydroksyklorkin, klorkin, syklosporin, gullforbindelser (så som auranofin, aurotiomalat og aurotioglukose) og leflunomid; type IV fosfodiesteraseinhibitorer inklusive, men ikke begrenset til, rolipram og pentoksifyllin; takrolimus (FK-506); sirolimus (rapamycin); mykofenolinsyre; 5-lipoksygenaseinhibitorer inklusive, men ikke begrenset til, zileuton; modulatorer av interleukin-6 (IL-6); små molekylmodulatorer av 38 kDa mitogenaktivert proteinkinase (p38-MAPK); små molekylmodulatorer av intracellulære molekyler som inngår i inflammasjonsreaksjonsveier hvor slike intracellulære molekyler innbefatter, men ikke er begrenset til, jnk, IKK, NF- κB, ZAP70 og Ick. Visse eksempler på terapeutiske midler for behandling av inflammasjon er blant annet beskrevet i C.A.

Dinarello og L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians 3. utgave (2001) Amgen Inc.

Thousand Oaks, CA. Visse eksempler på terapeutiske midler for inflammasjon og autoimmune sykdommer innbefatter, men er ikke begrenset til, interferon gamma (IFN- γ)-modulatorer; modulatorer av OX40/OX40L (inklusive løselige former av OX40); modulatorer av 4-1BB/4-1BB-ligand (inklusive løselige former av 4-1BB); og modulatorer av B-celle-T-celle samstimulerende reaksjonsveier som innbefatter, men ikke er begrenset til, modulatorer av reseptorligandparene CD28/B7, CD40/CD40L, ICOS/B7RP1 og AGP-3/TACI/BAFFR (AGP-3 binder seg både til TACI- og BAFFR-reseptorene). Visse eksempler på modulatorer av B-celle-T-celle samstimulerende reaksjonsveier innbefatter, men er ikke begrenset til, inhibitorer av CD28, B7.1 og B7.2 (inklusive løselige former av B7.1 eller B7.2 og løselige former av CTLA4 som begge kan være fusjonert til et heterologt peptid eller protein som reduserer eller hindrer nedbrytningen og/eller en økning av halvlivet, reduserer toksisitet, reduserer immunogenisitet eller øker den biologiske aktiviteten til et terapeutisk protein ved å øke løseligheten eller det sirkulerende halvlivet); inhibitorer av CD40 og CD40L (inklusive løselige former av CD40 som kan være fusjonert til et heterologt peptid eller protein); inhibitorer av ICOS og B7RP1 (inklusive løselige former av ICOS som kan være fusjonert til et heterologt peptid eller protein) og inhibitorer av AGP-3, TACI og BAFFR (inklusive løselige former av TACI og BAFFR). ICOS, B7RP1 og inhibitorer av disse er blant annet beskrevet i WO00/46240. AGP-3, TACI og BAFFR og inhibitorer av disse er blant annet beskrevet i WO00/47740, WO01/85872, WO02/15273, WO98/39361 og von Bulow og Bram (1997) Science 278: 138-140.

I visse tilfeller blir et antistoff til OPGL brukt for å behandle bentap som innbefatter, men som ikke er begrenset til, bentap som er et resultat av en osteolytisk destruksjon av benet forårsaket av ondartede eller metastatiske tumorer. I visse tilfeller kan et antistoff til OPGL brukes for å behandle bentap som er assosiert med cancer. Eksempler på cancere innbefatter, men er ikke begrenset til, cancer i bryst, prostata, skjoldbruskkjertelen, nyrer, lunger, svelge, endetarmen , urinblæren, livmoren, eggstokker og lever, så vel som cancer i tarmkanalen. I visse tilfeller kan et antistoff til OPGL brukes for å behandle bentap som er assosiert for eksempel med visse hematologiske ondartede lidelser som innbefatter, men ikke er begrenset til, multippelt myelom og lymfom inklusive Hodgkins sykdom.

I visse tilfeller blir et antistoff av OPGL administrert alene. I visse tilfeller blir et antistoff til OPGL administrert sammen med minst ett annet terapeutisk middel inklusive, men ikke begrenset til, minst ett annet cancerterapimiddel. Eksempler på cancerterapimidler innbefatter, men er ikke begrenset til, strålingsterapi og kjemoterapi. I visse tilfeller vil en kjemoterapi innbefatte en behandling med en eller flere av de følgende: Antrasykliner, taksol, tamoksifen, doksorubicin, 5-fluoruracil og andre medikamenter som er kjente innenfor cancerbehandlingen. I visse tilfeller vil et cancerterapimiddel være en luteiniserende hormonfrigjørende hormon (LHRH) antagonist. I visse tilfeller er en LHRH-antagonist en peptidantagonist.

I visse tilfeller vil en LHRH-antagonist omfatte peptidet: Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2 (SEKV.ID. NR. 20) hvor Nal er 3-(2-naftyl)alaninyl; 4-Cl-Phe er (4'-klorfenyl)alaninyl; Pal er 3-(3'-pyridyl)alaninyl; og Lys(iPr) er N-epsilon-2-propyllysinyl.

I visse tilfeller er en LHRH-antagonist et LHRH-antagonist dekapeptid. Visse eksempler på dekapeptider er blant annet beskrevet i U.S. patent nr. 5,843,901.

Eksempler på terapeutiske antistoffer innbefatter, men er ikke begrenset til, muse, musehumane kimæriske, CDR-podede, humaniserte og hele humane antistoffer og syntetiske antistoffer som innbefatter, men ikke er begrenset til, de som er valgt ut ved å screene antistoffbiblioteker. Eksempler på antistoffer innbefatter, men er ikke begrenset til, de som binder seg til celleoverflateproteinene Her2, CDC20, CDC33, mucinlignende glykoprotein og den epidermale vekstfaktorreseptoren (EGFR) som er tilstede på tumorceller og som eventuelt induserer en cytostatisk og/eller cytotoksisk effekt på tumorceller som fremviser disse proteinene. Eksempler på antistoffer innbefatter også HERCEPTIN<TM >(trastuzumab) som kan brukes for å behandle brystkreft eller andre former av cancer og RITUXAN<TM >(rituksimab), ZEVALIN<TM >(ibritumomab tiuksetan) og LYMPHOCIDE<TM >(epratuzumab) som brukes for å behandle ikke-Hodgkins lymfom og andre former for cancer. Visse eksempler på antistoffer innbefatter også ERBITUX<TM >(IMC-C225), BEXXAR<TM >(jod 131 tositumomab) og Campath.

I visse tilfeller er cancerterapimidlene polypeptider som selektivt induserer apoptose i tumorceller og som inkluderer, men som ikke er begrenset til, det TNF-relaterte polypeptidet TRAIL. I visse tilfeller vil et antistoff til OPGL kunne administreres minst en gang før, sammen med eller etter en behandling med et cancerterapimiddel. I visse tilfeller vil et antistoff til OPGL kunne administreres profylaktisk for å hindre eller å svekke utviklingen av bentap som skyldes metastatisk cancer. I visse tilfeller vil et antistoff til OPGL kunne administreres for å behandle en eksisterende tilstand av bentap som skyldes metastase.

I visse tilfeller vil et antistoff til OPGL kunne brukes for å hindre og/eller å behandle bentap som er assosiert med multippelt myelom og/eller for å hindre og/eller behandle sykdommen som sådan. Multippelt myelom er en B-celleavledet tumor som kan resultere i signifikant morbiditet og/eller mortalitet. I visse tilfeller vil en klinisk manifestasjon av multippelt myelom være fokalt bentap som kan skyldes en økt osteoklastaktivering i lokaliserte områder. Mange myelompasienter har bensår som er synlige ved hjelp av radiologisk analyse og lider dessuten av skjelettsmerter. I visse tilfeller vil pasienter med myelom være utsatt for patologiske brudd i de angrepne knokler eller ben, noe som enten kan opptre spontant eller skyldes annen skade. I visse tilfeller vil de skjelettsår som opptrer under myelom ikke bare føre til benbrudd, men også til deformiteter og eventuelt nervekompresjon, spesielt i ryggraden. Hos enkelte pasienter vil man kunne observere en patologisk økning av serumkalsium (hyperkalsemi) og dette kan forårsake signifikante og alvorlige problemer under sykdomsbehandlingen. I visse tilfeller vil et antistoff til OPGL kunne administreres pasienter for å redusere eller blokkere benresorpsjon og frigjøring av kalsium, noe som vil redusere risikoen for brudd og ryggradsdeformitet.

I visse tilfeller vil myelomcellene ikke direkte delta i bendestruksjonen, men i stedet gi ekstracellulære signaler som fører til osteoklastdifferensiering og aktivering. I visse tilfeller vil osteoklastene gi høye nivåer av cytokin IL-6, spesielt når de blir aktivert. IL-6 er en B-celle vekstfaktor som bidrar til veksten av ben både hos muse og humane myelomceller in vitro. Myelomceller kan også enten direkte eller indirekte produsere OPGL, noe som kan resultere i en lokal benoppløsning som omgir de myelomcellene som er innleiret i hulrom i benmargen. I visse tilfeller vil de normale osteoklastene som ligger inntil myelomcellene så igjen produsere IL-6 som så igjen kan føre til en lokal ekspansjon av tumorcellene. Myelomcellene vil således utvikle seg på en klonaktig måte og kan fylle de benhulrommene som skapes ved en for sterk benresorpsjon.

Det er blitt observert at OPG-administrering i gnagere induserer en rask død av osteoklastpopulasjonen (se for eksempel Lacey et al. (2000) Am. J. Pathol. 157: 435-448). En reduksjon av antallet osteoklaster kan motvirke effekten av den forøkede IL-6-produksjonen av disse cellene, og vil derved kunne påvirke veksten og overlevelse av myelomceller innenfor trabekulært ben. I visse tilfeller vil således en administrering av et antistoff til OPGL til en myelompasient ikke bare blokkere hyperresorpsjonen av ben, men kan også påvirke ekspansjonen og overlevelsen til selve tumoren.

B-celler uttrykker reseptoren for OPGL, ODAR. Myelomceller uttrykker også ODAR og kan i tillegg produsere OPGL. I visse tilfeller vil ekspresjonen av både OPGL og ODAR i den samme cellepopulasjonen skape en autokrin stimulans som påvirker overlevelsen til myelomcellene. I visse tilfeller vil således en administrering av et antistoff til OPGL kunne redusere tumorcelleoverlevelsen og derved nedsette eller eliminere den tumorbelastning som ofte ses hos myelompasienter.

I visse utførelser tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytiske sammensetninger som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff til OPGL ifølge oppfinnelsen sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærerstoff, løselighetsgjørende stoff, emulgeringsmiddel, konserveringsmiddel og/eller adjuvant.

I visse utførelser tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytiske sammensetninger som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff til OPGL ifølge oppfinnelsen og en terapeutisk effektiv mengde av minst ett ytterligere terapeutisk middel sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærerstoff, løselighetsgjørende stoff, emulgeringsmiddel, konserveringsmiddel og/eller adjuvant. I visse tilfeller er minst ett ytterligere terapeutisk middel valgt fra benmorfogene faktorer som er betegnet BMP-1 til og med BMP-12; transformerende vekstfaktor- β (TGF- β) og TGF- β-gruppestoffer eller forbindelser; interleukin-1 (IL-1) inhibitorer som innbefatter, men ikke er begrenset til, IL-1ra og derivater av denne og Kineret<TM>; anakinra, TNF α-inhibitorer som inkluderer, men ikke er begrenset til, en løselig TNF α-reseptor, Enbrel<TM>, etanercept, anti-TNF αantistoffer, Remicade<TM >, infliximab, og D2E7-antistoff; paratyroid hormon og analoger av dette, paratyroidrelatert protein og analoger av dette; E-serier av prostaglandiner; bisfosfonater (så som alendronat og andre); benforbedrende mineraler så som fluorid og kalsium; ikke-steroidale antiinflammatoriske medikamenter (NSAID) inklusive COX-2-inhibitorer så som Celebrex<TM>, celecoxib, og Vioxx<TM>; rofecoxib, immunoundertrykkende midler så som metotreksat og leflunomid; serinprotaseinhibitorer så som sekretorisk leukocyttproteaseinhibitor (SLPI); IL-6-inhibitorer (for eksempel antistoffer til IL-6), IL-8-inhibitorer (for eksempel antistoffer til IL-8); IL-18-inhibitorer (for eksempel IL-18-bindende protein eller IL-18-antistoffer); interleukin-1-omdannende enzym (ICE) modulatorer; fibroblastvekstfaktorer FGF-1 til og med FGF-10 og FGF-modulatorer; PAF-antagonister; kertinocyttvekstfaktor (KGF), KGF-relaterte molekyler eller KGF-modulatorer; matrise metalloproteinase (MMP) modulatorer; nitrittoksidsyntase (NOS) modulatorer, heri inngår modulatorer av induserbart NOS; modulatorer av glukokortikoidreseptor; modulatorer av glutamatreseptor; modulatorer av lipopolysakkarid (LPS) nivåer; og noradrenalin og modulatorer og mimetika av dette.

I visse tilfeller vil akseptable preparatmaterialer fortrinnsvis være ikke-toksiske for mottakeren ved de doser og konsentrasjoner som blir anvendt.

I visse tilfeller vil den farmasøytiske sammensetningen kunne inneholde stoffer eller materialer for å modifisere, opprettholde eller bevare for eksempel pH, osmolaritet, viskositet, klarhet, farge, isotonisitet, lukt, sterilitet, stabilitet, oppløsningshastighet eller frigjøringshastighet, absorpsjon eller inntrengning av sammensetningen. I visse tilfeller vil egnede sammensetningsmaterialer eller stoffer innbefatte, men ikke være begrenset til, aminosyrer (så som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin); antimikrobielle stoffer; antioksidanter (så som askorbinsyre, natriumsulfitt eller natriumhydrogensulfitt); buffere (så som borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrater, fosfater eller andre organiske syrer); volumgivende midler (så som mannitol eller glysin); gelateringsmidler (så som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)); kompleksdannende midler (så som kaffein, polyvinylpyrrolidon, beta-syklodekstrin eller hydroksypropyl-beta-syklodekstrin); fyllstoffer; monosakkarider; disakkarider; og andre karbohydrater (så som glukose, mannose eller dekstriner); proteiner (så som serum albumin, gelatin eller immunoglobuliner); fargestoffer; smaksstoffer og fortynningsmidler; emulgeringsmidler; hydrofile polymerer (så som polyvinylpyrrolidon); polypeptider med lav molekylvekt; saltdannende motioner (så som natrium); konserveringsmidler (så som benzalkoniumklorid, benzosyre, salisylsyre, timerosal, fenetylalkohol, metylparaben, propylparaben, klorheksidin, sorbinsyre eller hydrogenperoksid); løsemidler (så som glyserin, propylenglykol eller polyetylenglykol); sukkeralkoholer (så som mannitol eller sorbitol); suspenderingsmidler; overflateaktive midler eller fuktemidler (så som pluronics, PEG, sorbitanestere, polysorbater så som polysorbat 20, polysorbat 80, triton, trometamin, lecitin, kolesterol, tyloksapal); stabilitetsforbedrende midler (så som sukrose eller sorbitol); tonisitetsforbedrende midler (så som alkalimetallhalogenider, fortrinnsvis natriumeller kaliumklorid, mannitol, sorbitol); tilførende væsker; faste eller flytende fortynningsmidler; eksipienter og/eller farmasøytiske adjuvanter. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, A.R. Gennaro, red., Mack Publishing Company (1999)).

I visse utførelser er et antistoff til OPGL ifølge oppfinnelsen og/eller et terapeutisk molekyl forbundet til en halvlivforlengende bærervæske av velkjent type. Slike bærervæsker innbefatter, men er ikke begrenset til, Fc-domener, polyetylenglykol og dekstran. Slike bærervæsker er for eksempel beskrevet i U.S. patent nr.

6,660,843 og publisert PCT-søknad nr. WO 99/25044.

I visse tilfeller vil den optimale farmasøytiske sammensetningen kunne bestemmes av en dyktig fagperson avhengig av for eksempel den påtenkte administreringsveien, tilførselsformatet og den forønskede dosen. Se for eksempel Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. I visse tilfeller vil slike sammensetninger kunne påvirke den fysiske tilstanden, stabiliteten, hastigheten med hensyn til in vivo frigjøring og hastigheten med hensyn til in vivo eliminering av antistoffene ifølge oppfinnelsen.

I visse tilfeller vil den primære bærervæsken eller bærerstoffet i en farmasøytisk sammensetning enten være vandig eller ikke-vandig av natur. I visse tilfeller vil for eksempel en egnet bærervæske eller bærerstoff være vann for injeksjon, en fysiologisk saltløsning eller en kunstig ryggradsvæske, eventuelt supplert med andre stoffer eller materialer som er velkjente i sammensetninger for parenteral administrering. I visse tilfeller vil en nøytral bufret saltløsning eller saltløsning blandet med serum albumin være eksempler på slike bærervæsker. I visse tilfeller vil de farmasøytiske sammensetningene omfatte en Tris-buffer ved pH 7,0-8,5, eller acetatbuffer ved pH 4,0-5,5, som videre kan innbefatte sorbitol eller en egnet erstatning for denne. I visse tilfeller vil en sammensetning som omfatter et antistoff til OPGL med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel fremstilles for lagring ved å blande den valgte sammensetningen med den forønskede grad av renhet sammen med eventuelle andre tilsetningsstoffer og midler (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) i form av en frysetørket kake eller en vandig oppløsning. I visse tilfeller kan videre en sammensetning som omfatter et antistoff til OPGL, med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel, opparbeides som et frysetørket preparat ved å bruke passende fortynningsmidler så som sukrose.

I visse tilfeller kan farmasøytiske sammensetninger opparbeides for parenteral administrering. I visse tilfeller kan sammensetningene opparbeides for inhalering eller administrering gjennom fordøyelseskanalen, for eksempel oralt. Fremstillingen av slike farmasøytisk akseptable sammensetninger er velkjente innenfor den farmasøytiske industrien.

I visse tilfeller vil komponentene i preparatene være tilstede i konsentrasjoner som er akseptable for administreringsstedet. I visse tilfeller kan man anvende buffere for å holde sammensetningen på en fysiologisk pH eller ved en noe lavere pH, typisk i et pH-område fra ca 5 til ca 8.

I visse tilfeller så som i forbindelse med parenteral administrering, kan en terapeutisk sammensetning være i form av en pyrogenfri, parenteralt akseptabel vandig løsning som omfatter det forønskede antistoffet til OPGL, med eller uten ytterligere terapeutiske midler i en farmasøytisk akseptabel bærervæske. I visse tilfeller vil en bærervæske for en parenteral injeksjon være sterilt destillert vann hvor antistoffet til OPGL, med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel, er opparbeidet som en steril isoton løsning og passende konservert. I visse tilfeller vil fremstillingen innbefatte en opparbeiding av det forønskede molekylet med et middel så som injiserbare mikrokuler, bionedbrytbare partikler, polymere forbindelser (så som polyeddiksyre eller polyglykolsyre), perler eller liposomer som kan gi en kontrollert eller vedvarende frigjøring av produktet som så kan tilføres eller administreres via en depotinjeksjon. I visse tilfeller kan man også bruke hyaluronsyre som effektivt fremmer en vedvarende varighet av preparatet i sirkulasjonen. I visse tilfeller er det også mulig å anvende implanterbare medikamenttilføringsanordninger for å tilføre det forønskede molekylet.

I visse tilfeller kan en farmasøytisk sammensetning opparbeides for inhalering. I visse tilfeller vil et antistoff til OPGL med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel, opparbeides som et tørt pulver for inhalering. I visse tilfeller vil en inhaleringsløsning omfatte et antistoff til OPGL, med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel, være opparbeidet sammen med et drivstoff for aerosol bruk. I visse tilfeller kan løsningene forstøves. Lungeadministrering er videre beskrevet i PCT-søknad nr. PCT/US94/001875 som beskriver lungetilførsel av kjemisk modifiserte proteiner.

I visse tilfeller kan preparater administreres oralt. I visse tilfeller vil således et antistoff til OPGL, med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel, bli administrert på denne måten og kan da opparbeides med eller uten de bærerstoffer som vanligvis brukes for opparbeiding av faste doseringsformer så som tabletter og kapsler. I visse tilfeller kan en kapsel være utformet slik at den frigjør den aktive delen av preparatet på det punktet i fordøyelseskanalen hvor bioti lgjengeligheten er maksimal og den presystemiske degraderingen er minimal. I visse tilfeller kan minst ett ytterligere middel inkluderes for å lette absorpsjon av antistoffet til OPGL og/eller eventuelle andre terapeutiske midler. I visse tilfeller er det også mulig å anvende fortynningsmidler, smaksstoffer, vokstyper med lavt smeltepunkt, vegetabilske oljer, smøremidler, suspenderingsmidler, tablettnedbrytningsmidler og bindemidler.

I visse tilfeller kan en farmasøytisk sammensetning innbefatte en effektiv mengde av antistoffer til OPGL, med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel, i en blanding med ikke-toksiske fortynningsmidler som er egnet for fremstillingen av tabletter. I visse tilfeller kan man ved å løse tablettene i steril vann eller annen passende bærervæske fremstille løsninger i enhetsdoseform. I visse tilfeller vil egnede fortynningsmidler innbefatte, men ikke være begrenset til, inerte fortynningsmidler slik som kalsiumkarbonat, natriumkarbonat eller bikarbonat, laktose eller kalsiumfosfat; eller bindemidler så som stivelse, gelatin eller akasia; eller smøremidler så som magnesiumstearat, stearinsyre og talkum.

Ytterligere farmasøytiske sammensetninger vil være innlysende for fagfolk innenfor den farmasøytiske industrien, og slike innbefatter preparater som inneholder antistoffer til OPGL, med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel, så som preparater for vedvarende eller kontrollert frigjøring av de aktive bestanddelene. I visse utførelser er teknikker for å opparbeide en rekke forskjellige andre anordninger for vedvarende eller kontrollert tilførsel av aktive bestanddeler så som liposombærerstoffer, bionedbrytbare mikropartikler eller porøse perler eller depotinjeksjoner, velkjente innenfor den farmasøytiske industrien. Se for eksempel PCT-søknad nr. PCT/US93/00829 som beskriver den kontrollerte frigjøringen av porøse polymere mikropartikler for tilførsel av farmasøytiske sammensetninger. I visse tilfeller vil preparatene for vedvarende frigjøring innbefatte semipermeable polymermatriser i form av formede artikler, for eksempel filmer eller mikrokapsler. Matriser for vedvarende frigjøring kan innbefatte polyestere, hydrogeler, polyaktider (U.S. 3,773,919 og EP 058,481), sampolymerer av L-glutaminsyre og gamma etyl-L-glutama (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poly (2-hydroksyetylmetakrylat) (Langer et al., J. Biomed Mater. Res., 15: 167-227 (1981) og Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), etylenvinylacetat (Langer et al., supra) eller poly-D(-)-3-hydroksysmørsyre (EP 133,988). I visse tilfeller vil preparatene eller sammensetningene for vedvarende frigjøring også innbefatte liposomer som kan fremstilles ved flere kjente fremgangsmåter. Se for eksempel Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 og EP 143,949.

Den farmasøytiske sammensetningen som skal brukes for in vivo administrering vil typisk være steril. I visse tilfeller kan dette oppnås ved filtrering gjennom sterile filtreringsmembraner. I visse tilfeller, når sammensetningen er fremstilt ved frysetørking, så kan sterilisering ved å bruke denne fremgangsmåten utføres enten før eller etter frysetørkingen og en eventuell rekonstituering. I visse tilfeller vil sammensetningen for parenteral administrering kunne lagres i frysetørket form eller i en løsning. I visse tilfeller vil de parenterale sammensetningene generelt bli plassert i en beholder som har en steril inngangsåpning, for eksempel en intravenøs oppløsningspose eller ampulle med en forsegling som lar seg gjennomstikke av en hypodermisk injeksjonsnål.

I visse tilfeller så vil den farmasøytiske sammensetningen, så snart den er opparbeidet, kunne lagres i sterile ampuller som en løsning, suspensjon, gel, emulsjon, som fast stoff eller som et dehydrert eller frysetørket pulver. I visse tilfeller vil slike preparater kunne lagres enten i en form som er klar for bruk, eller i en form (for eksempel frysetørket) som må rekonstitueres før administrering.

Det er beskrevet heri sett for å fremstille en enkeltdose administreringsenhet. I visse tilfeller vil settene hvert kunne inneholde en første beholder som inneholder et tørket protein og en andre beholder som inneholder et vandig preparat. I visse tilfeller vil disse settene inneholde enkle eller flerkamrede på forhånd fylte sprøyter (for eksempel væskesprøyter og såkalte lyosprøyter).

I visse tilfeller vil den effektive mengden av en farmasøytisk sammensetning som omfatter et antistoff til OPGL, med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel, som anvendes terapeutisk vil for eksempel være avhengig av den terapeutiske sammenhengen og hensiktene. En medisinsk innsiktsfull person vil lett kunne fastslå passende dosenivåer for behandling og ifølge visse tilfeller vil således disse nivåene være avhengige, delvis av det molekyl som skal levers, den indikasjon for hvilken antistoffet til OPGL med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel skal brukes, administrasjonsveien og størrelsen (kroppsvekt, kroppsoverflate eller organstørrelse) og/eller tilstand (alder og generell helse) til pasienten. I visse tilfeller vil legen lett kunne justere dosen og modifisere administrasjonsmåten for derved å oppnå den optimale terapeutiske effekten. I visse tilfeller vil typiske doser variere fra ca 0,1 μg/kg til omtrent 100 mg/kg eller mer, avhengig av de faktorer som er nevnt ovenfor. I visse utførelser vil dosen variere fra 0,1 μg/kg og opp til 100 mg/kg; eller 1 μg/kg og opp til 100 mg/kg; eller 5 μg/kg og opp til 100 mg/kg.

I visse tilfeller vil doseringsfrekvensen måtte ta hensyn til de farmakokinetiske parametrene for antistoffet til OPGL og/eller eventuelle andre terapeutiske midler som anvendes. I visse tilfeller vil en klinisk lege administrere sammensetningen inntil man når et dosenivå som gir den forønskede effekten. I visse tilfeller kan derfor sammensetningen administreres som en enkelt dose eller som to eller flere doser (som kan eller ikke kan inneholde den samme mengden av det forønskede molekylet) over tid, enten som en kontinuerlig infusjon via en implanter t anordning eller et kateter. Ytterligere finjustering av passende doser ligger rutinemessig innenfor det som legen til enhver tid kan bestemme. I visse tilfeller vil passende doser kunne oppnås ved å bruke passende doseresponsdata.

I visse tilfeller vil administrasjonsveien av den farmasøytiske sammensetningen være i overensstemmelse med kjente fremgangsmåter, for eksempel oralt, gjennom injeksjon ved intravenøse-, intraperitoneale-, intracerebrale- (intraparenchymale), intracerebroventrikulære-, intramuskulære-, intraokulære-, intraarterielle-, intraportale- eller intralesjonale veier; ved systemer for vedvarende frigjøring eller ved hjelp av implanterte anordninger. I visse tilfeller vil sammensetningene kunne administreres ved en bolusinjeksjon eller kontinuerlig ved infusjon eller ved hjelp av implantert anordning.

I visse tilfeller vil sammensetningen kunne administreres lokalt via en implantering av en membran, svamp eller et annet passende materiale, i hvilket det forønskede molekylet er blitt absorbert eller innkapslet. I visse tilfeller, når det anvendes en implantert anordning, så kan denne implanteres i ethvert egnet vev eller organ og tilførselen av det forønskede molekylet kan skje via diffusjon, tidsfrigjort bolus eller en kontinuerlig administrering.

I visse tilfeller kan det være ønskelig å bruke en farmasøytisk sammensetning som omfatter et antistoff til OPGL, med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel, på en ex vivo måte. I visse tilfeller vil celler, vev og/eller organer som er fjernet fra pasienten bli eksponert for en farmasøytisk sammensetning som omfatter et antistoff til OPGL, med eller uten minst ett ytterligere terapeutisk middel, hvoretter cellene, vevet og/eller organet deretter implanteres tilbake i pasienten.

I visse tilfeller kan et antistoff til OPGL og/eller eventuelle andre terapeutiske midler tilføres ved å implantere visse celler som er genetisk manipulert eller behandlet ved å bruke fremgangsmåter av den type som er beskrevet her for deretter å kunne uttrykke og utskille polypeptidene. I visse tilfeller kan slike celler være animalske eller humane celler, og kan være autologe, heterologe eller xenogene. I visse tilfeller kan cellene være såkalt immortaliserte. I visse tilfeller, for å øke sjansen for en immunologisk respons eller reaksjon, kan cellene være innkapslet for å unngå infiltrering i det omkringliggende vevet. I visse tilfeller vil innkapslingsmaterialene være typisk bioforenlige semipermeable polymere materialer eller membraner som muliggjør frigjøringen av proteinproduktene, men hindrer destruksjonen av cellene på grunn av pasientens immunsystem eller andre skadelige faktorer fra det omkringliggende vev

EKSEMPLER

De følgende eksemplene som innbefatter eksperimenter som ble utført og de oppnådde resultatene, er utelukkende tilveiebrakt for illustrerende formål.

Eksempel 1

Kloning av de αOPGL-1 tunge og lette kjedene

CHO-celler som uttrykker det fullengde humane OPGL cDNA ble brukt for å immunisere transgene mus som inneholdt humane immunoglobulingener.

Lymfekjertler fra de immuniserte musene ble fusjonert til musemyelomceller for å utvikle hybridomer. Supernatantene fra hybridomlinjene ble testet i en ELISA-prøve for antistoffer som reagerer med humant OPGL. Anti-OPGL-uttrykkende hybridomlinjer AMG 6.5, AMG 6.4 og AMG 6.1 viste seg å uttrykke antistoffer med høy affinitet for OPGL (Kd på henholdsvis 0,28 nM, 0,29 nM og 0,23 nM), og AMG 6.5 ble valgt ut for kloning. Tung- og lettkjedede cDNA-kloner fra AMG 6.5 og AMG 6.4 er identiske, og AMG 6.5 ble brukt for å klone det αOPLG-1 lettkjedede cDNA, mens AMG 6.4 ble brukt for å klone det αOPGL-1 tungkjedede cDNA.

Kloning av den αOPGL-1 lette kjeden

Det αOPGL-1 kappa lettkjedede variable området ble oppnådd ved å bruke PCR amplifiseringsmetoder fra første tråds cDNA fremstilt fra AMG 6.5 totalt RNA. Første tråds cDNA ble fremstilt fra AMG 6.5 totalt RNA ved å bruke en vilkårlig primer med en forlenget 5'-adapter (5'-GGCCGGATAGGCCTCACNNNNNNT-3' (SEKV.ID. NR. 15)) og de materialer og fremgangsmåter som var tilveiebrakt av Gibco SuperScript II<TM >Preamplification System for første tråds cDNA syntesesett (katalog nr. 18089-011). De nedenfor angitte oligonukleotidene ble brukt for PCR-reaksjonen:

5' kappa RACE-primer:

5'-GAT GAC CCA TGC TCC AGC CAC CCT G-3' (SEKV.ID. NR. 5)

3' kappa RACE-primer:

5'-AAG GGT CAG AGG CCA AAG GAT GG-3' (SEKV.ID. NR. 6)

De amplifiserte DNA ble klonet inn i pCRII-TOPO (Invitrogen) og de resulterende plasmidene ble så sekvensert. Kappakjede konsensussekvensen ble brukt for å utforme primere for PCR-amplifisering av fullengde αOPGL-1 kappakjeden. 5' αOPGL-1 kappaprimeren inkorporerer et XbaI-sete (TCTAGA) for kloning, og en "CCACC" Kozaksekvens foran initiator Met-kodonet. 3' αOPGL-1 kappaprimeren inkorporerer et SalI-sete (GTCGAC) etter stoppkodonet for kloning.

5' αOPGL-1 kappaprimer:

5'-CAA CTC TAG A CC ACC ATG GAA ACC CCA GCG-3' (SEKV.ID. NR. 7)

XbaI-sete Kozak M E T P A (SEKV.ID. NR. 16)

3' αOPGL-1 kappaprimer:

5'-TTT GAC GTC GAC TTA TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA G-3' (SEKV.ID. NR. 8)

SalI-sete * * C E G R N F (SEKV.ID. NR. 17)

Fullengde αOPGL-1 kappakjede cDNA-klonen ble oppnådd ved å bruke AMG 6.5 første tråds cDNA slik dette er beskrevet ovenfor ved en PCR-amplifisering med nevnte 5' og 3' αOPGL-1 kappaprimere. PCR-reaksjonen utvikler et 738 bp fragment som koder 235 aminosyreresidua (inklusive den 20 aminosyrer kappakjede signalsekvensen) i αOPGL-1 kappakjeden (figur 4, SEKV.ID. NR. 4). Etter rensing ved å bruke et QIAquick PCR-rensesett (Qiagen katalognr. 28104), ble dette fragmentet brukt for å konstruere den kappa lettkjedede ekspresjonsvektoren.

Det 738 bp fullengde kappafragmentet utviklet som beskrevet ovenfor ble kuttet med XbaI og SalI, ble så renset ved å bruke Promega Wizard DNA rensesystem (Promega katalognr. A7100) og ble så klonet inn i pDSR α19 for å utvikle plasmid αOPGL-1-kappa/pDSR α19 (figur 5). pDSR α19 er tidligere beskrevet (se WO 90/14363 (se for eksempel figur 12)). Kort beskrevet, for å fremstille pDSR α19, ble pDSR α2 modifisert på følgende måter: FSH polyA ble forkortet med ca 1400 basepar til ca 885 basepar, hvoretter man fjernet now-endene ved NdeI-setet; dihydrofolatreduktase (DHFR) promotoren som nå inneholder 209 basepar etter å ha blitt forkortet fra 5'-enden med ca 1 kilobase; og et omtrentlig 550 basepar BgIII-fragment fra DHFR polyA-sekvensen.

Den αOPGL-1 kappa lettkjedede ekspresjonsklonen ble sekvensert for å bekrefte at den kodet det samme peptidet som var identifisert i AMG 6.5-hybridomet. Den endelige ekspresjonsvektoren, αOPGL-1-kappa/pDSR α19, inneholder 5476 basepar og inneholder 7 funksjonelle områder som vist i tabell 2.

Tabell 2: Karakteristiske trekk for αOPGL-1-kappa/pDSR α19

Plasmidbaseparnummer:

2 til 881 Et transkripsjonsterminerings/polyadenyleringssignal fra αunderenheten av det storfehypofyse glykoproteinhormonet ( α-FSH) (Goodwin, et al, Nucleic Acids Res. 198311: 6873-82;

Genbank tilvekstnummer X00004)

882 til 2027 Et muse dihydrofolatreduktase (DHFR) minigen som inneholder den endogene muse DHFR-promotoren, de cDNA-kodende sekvensene og DHFR-transkripsjonsterminerings/

polyadenyleringssignalene (Gasser et al, Proc Natl Acad Sci U S A.

1982 79: 6522-6; Nunberg et al, Cell 198019: 355-64; Setzer et al, J Biol Chem. 1982 257: 5143-7; McGrogan et al, J Biol Chem. 1985 260: 2307-14)

2031 til 3947 pBR322-sekvenser som inneholder ampicillinresistensmarkørgenet og replikasjonsorigo for plasmidet i E. coli (Genbank tilvekstnummer J01749)

3949 til 4292 En SV40 tidlig promotor, forsterker og replikasjonsorigo (Takebe et al, Mol Cell Biol. 19888: 466-72., Genbank tilvekstnummer J02400)

4299 til 4565 Et translokerende forsterkende element fra HTLV-1 LTR-domenet (Seiki et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 198380: 3618-22, Genbank tilvekstnummer J02029)

4574 til 4730 Et intron fra SV4016 S, 19S spleise donor/akseptorsignalene (Okayama og Berg, Mol Cell Biol. 1983 3: 280-9, Genbank tilvekstnummer J02400)

4750 til 5476 Det αOPGL-1 kappa lettkjedede cDNA mellom XbaI- og SalI-setene.

Et sirkulært plasmidkart av vektoren er vist på figur 5.

Kloning av den αOPGL-1 tunge kjeden

Den αOPGL-1 IgG2 tunge kjeden ble klonet fra AMG 6.4 hybridom dobbelttrådet cDNA fremstilt med Clontech Marathon<TM >cDNA amplifiseringssettet (katalognr. K1802-1). Amplifisering av AMG 6.4 tungkjedet cDNA ble utført med 5' og 3' rask amplifisering av cDNA-ender (RACE) teknikk utført med de humane germlinje IgG2 tungkjedede konstante områdespesifikke primerne (vist nedenfor) og RACE-primere og andre materialer og fremgangsmåter tilveiebrakt i nevnte Marathon<TM >cDNA amplifiseringssett.

5' IgG2 RACE-primer

5'-GGC ACG GTC ACC ACG CTG CTG AG-3' (SEKV.ID. NR. 9)

3' IgG2 RACE-primer

5'-CCT CCA CCA AGG GCC CAT CGG TCT-3' (SEKV.ID. NR. 10)

Det 600 bp 5' RACE-produktet og 1200 bp 3' RACE-produktet ble klonet inn i pCR2.1 (Invitrogen) og ble så sekvensert. Denne sekvensinformasjonen ble så brukt for å utforme αOPGL-1 tungkjedede spesifikke primere for kloning av hele sekvensen. Den tungkjedede 5'-primeren (5' αOPGL-1 IgG2-primer) ble rettet inn mot senstråden og har et HindIII-sete og en konsensus Kozaksekvens før det naturlige startsetet. Den tungkjedede 3'-primeren (3' αOPGL-1 IgG2-primer) er en antisensprimer som inneholder et SalI-sete og stoppkodon etter den siste aminosyren i den tungkjedede IgG2-sekvensen.

5' αOPGL-1 IgG2-primer:

5'-CAGAAGCTTGACCACC ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG CTT TTT CTT GTG GC-3' (SEKV.ID. NR. 11)

HindIII Kozak M E R G L S W L F L V A (SEKV.ID. NR 18)

3' αOPGL-1 IgG2-primer:

5'-GCA TGTCGAC TTA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG-3' (SEKV.ID. NR. 12)

SalI * * K G P S L S L (SEKV.ID. NR. 19)

Det dobbelttrådede cDNA som er beskrevet ovenfor ble brukt for å utvikle fullengde tungkjedet cDNA ved PCR-amplifisering med nevnte 5'- og 3'- αOPGL-1 IgG2-primere. PCR utvikler et 1433 bp fragment som koder de 467 aminosyreresiduaene eller gruppene (inklusive den 19 aminosyrer lange IgG signalsekvensen) i det αOPGL-1 IgG2 tungkjedede proteinet (figur 2, SEKV.ID. NR. 2). Etter rensing ved å bruke et QIAquick PCR-rensesett (Qiagen katalognr.

28104), ble dette fragmentet brukt for å konstruere en tungkjedet ekspresjonsvektor som følger.

DNA som koder det hele IgG2 tunge fragmentet utvikles som beskrevet ovenfor ble kuttet med HindIII og SalI, renset ved å bruke et QIAquick gelekstraksjonssett (Qiagen katalognr. 28704), og dette fragmentet ble så klonet inn i pDSR α19. Det resulterende ekspresjonsplasmidet fikk så betegnelsen αOPGL-1-IgG2/pDSR α19 (figur 6). Alle vektorkomponentene er identiske til αOPGL-1-kappa/pDSR α19-vektoren som er beskrevet ovenfor, bortsett fra at det αOPGL-1 IgG2 tungkjedede cDNA er erstattet med det αOPGL-1 kappa lettkjedede cDNA mellom XbaI- og SalI-setene. Den αOPGL-1 IgG2 tungkjedede ekspresjonsklonen ble sekvensert for å bekrefte at den kodet for det samme polypeptidet som ble identifisert i AMG 6.4 -hybridomet.

Eksempel 2

αOPGL-1-ekspresjon i CHO-celler

Stabil ekspresjon av αOPGL-1-antistoff ble oppnådd ved en kotransfeksjon av αOPGL-1-kappa/pDSR α19- og αOPGL-1-IgG2/pDSR α19-plasmider i de hydrofolatreduktasesviktende (DHFR-) kinesiske hamstereggstokkcellene (CHO AM-1/D, U.S. patent nr. 6,210,924) etter isolering og testing av individuelle kloner.

En 100 mm vevskulturplate ble utplatet med 1,5 x 10<6 >AM-1/D-celler dyrket i CHO d--medium (DMEM høy glukose, 10% storfefosterserum, 1% penicillin/streptomycin/glutamin, 1X NaPyruvat, 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA)) (Gibco ®) og 1% ht-supplement (Gibco ®) dagen før transfeksjoner (dag 0). På dag en ble 400 μl serumfritt RPMI 1640-medium (Gibco ®) porsjonert over i 12 x 75 mm polypropylenrør. 24 μl av TransIT ®-LT1-reagens (Mirus Corporation) ble dråpevis tilsatt mediet, og blandingen ble hensatt for innkubering ved romtemperatur i 10 minutter. Totalt 15 μg linearisert plasmid DNA (7m5 μg av αOPGL-1-kappa/pDSR α19 og 7,5 μg av αOPGL-1-IgG2/pDSR α19 ble kuttet med Pvu1), ble så dråpevis tilsatt blandingen og denne ble så innkubert ved romtemperatur i 10 minutter.

CHO d-mediet ble fjernet fra cellene som så ble vasket med 10 ml Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (Gibco ®). 6 ml serumfritt MEM-medium supplert med NT, L-glu, NEAA og Na pyruvat (Gibco ®) ble tilsatt cellene. DNA/LT1-komplekset ble dråpevis tilsatt platene som så forsiktig ble beveget frem og tilbake for å fordele nevnte DNA jevnt utover cellene. Etter 6 timer i en vevskulturinnkubator, ble mediet erstattet med friskt CHO d-medium. 48 timer senere ble cellene splittet og overført til 10 100 mm kulturplater i CHO-utvalgt medium (DMEM høyglukose, 10% dialysert storfefosterserum (FBS), 1% penicillin/streptomycin/glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1X Na pyruvat) (Gibco ®). Mediet ble forandret to ganger i uken inntil koloniene var synlige.

Etter 10-14 dager ble koloniene tatt ut ved å bruke 5 mm kloningsskiver (Labcore ®) dynket med 1 x trypsin-EDTA (Gibco ®) og så dyrket i 24 brønners vevsdyrkningsplater med CHO-valgt medium. Da cellene ble sammenflytende, ble serumfritt medium (CHO-valgt medium minus FBS) tilsatt, og dette ble så oppsamlet 48 timer senere. Dette kondisjonerte mediet ble analysert for antistoffekspresjon ved hjelp av Western blot med pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert geite antihumant IgG Fc-antistoff (Pierce, Rockford, IL) for å påvise nevnte αOPGL-1 tunge kjede og geite antihumant kappakjede antistoff (Pierce, Rockford, IL) fulgt av HRP-konjugert kanin antigeit IgG(H+L) antistoff (Pierce, Rockford, IL) for å påvise den αOPGL-1 lette kjeden. Klonene med den høyeste ekspresjonen ble utvidet og lagret i flytende nitrogen.

Eksempel 3

Produksjon av αOPGL-1

Fremstilling og dannelse av cellelinje 125Q

CHO-celler som produserte αOPGL-1 ble klonet ved to runder av begrensende fortynning i 96 brønners plater under serumfrie betingelser. Klonene ble så valgt ut basert på produksjon og vekstegenskaper i forskjellige suspensjonskar. EIA ble utført for å velge den klonen som produserte det høyeste nivået av αOPGL-1.

Vekstegenskaper, heri inngår doblingstider og tettheter, ble så målt ved å dyrke klonene i 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1 l og 3 l kolber, så vel som i 3 l Aplikon bioreaktorer. Klonen med den raskeste doblingstiden som gir den høyeste tettheten i kultur ble så valgt ut og betegnet cellelinje 125Q. Når klonen var utvidet til å gi tilstrekkelige celler til at det var mulig å fryse 360 ampuller som hver inneholdt ca 1 x 10<7 >celler/ml, ble cellene resuspendert i et kryokonserverende, serumfritt medium (90% VM-Soy Batch Medium (se tabell 3 for detaljer) supplert med 10 ml/l ikke-essensielle aminosyrer og 10 ml/l L-glutamin (Gibco/LTI/Invitrogen) og 10% dimetylsulfoksid (JT Baker)) og så frosset. Ampullene ble lagret i en enhet med begrenset tilgang og nedsenket i flytende nitrogen i beholdere med flytende nitrogen.

Basert på vekst og produksjon i småskalasentrifuger og storskala bioreaktorer, ble cellelinje 125Q valgt ut som cellelinjen for produksjon av αOPGL-1.

Cellekultur

αOPGL-1 blir produsert ved ekspresjon i cellelinje 125Q, en klonal linje av CHO-celler som uttrykker αOPGL-1 fra plasmidene αOPGL-1-kappa/pDSR α19 og αOPGL-1-IgG2/pDSR α19. Celledyrkningsprosessen for αOPGL-1 er vist på figur 19. For hver produksjonsrunde ble celler fra en ampulle av cellelinje 125Q først dyrket i 50 ml VM-Soy Batch Medium (se tabell 3 for sammensetning) supplert med 10 ml/l ikke-essensielle aminosyrer og 10 ml/l L-glutamin (Gibco/LTI/Invitrogen) (VM-Soy Supp) i 125 ml erlenmeyerkolber ved 100 rpm i 5 dager. Hele kulturen ble så brukt for å inokulere VM-Soy Supp i en 500 ml sentrifugekolbe til 3 x 10<5 >synlige celler/ml (3E5 vc/ml) og så dyrket med 70 rpm sentrifugering i 3-4 dager. Hele kulturen fra 500 ml sentrifugekolbene ble så anvendt for å inokulere VM-Soy Sopp i en 3 liters sentrifugekolbe til 3E5 vc/ml og ble dyrket med 70 rpm sentrifugering i 3-4 dager.

Kulturen fra nevnte 3 liters sentrifugekolbe ble så delt i to og plassert i 3 liters sentrifugekolber ved 3E5 vc/ml i VN-Soy Supp uten fenolrødt og dyrket under de samme betingelsene. Disse sentrifugekolbekulturene ble så brukt for å inokulere fire ytterligere kolber av samme type ved 3E5 vc/ml i VM-Soy Supp uten fenolrødt og dyrket under samme betingelser. 4 liter av kulturen fra disse fire 3 liters sentrifugekolbene ble brukt for å inokulere 10 l VM-Soy Supp uten fenolrødt i en 20 liters bioreaktor, hvoretter bioreaktoren ble kjørt på en porsjonsvis måte i 7-10 dager. I denne metoden blir en næringstilførsel som inneholder konsentrerte mediekomponenter ("tilførsel" som angitt nedenfor i tabell 3) tilsatt for å opprettholde cellevekst og kulturlevedyktighet.

Hele kulturen fra nevnte 20 l bioreaktor ble så brukt for å inokulere 70 l VM-Soy Supp uten fenolrødt i en 150 l bioreaktor, og denne ble så kjørt på nevnte porsjonsmåte i 9-10 dager. Endelig ble hele kulturen fra den nevnte 150 l bioreaktoren brukt for å inokulere ca 880 l VM-Soy (uten supplement eller fenolrødt) i en 2000 l bioreaktor, og denne ble kjørt på en porsjonsvis måte.

Tilførselen av næringsstoffer i denne fremgangsmåten bestemmes slik at glukosenivået i kulturen holdes på 0,6 g/l i hver bioreaktor. Celletetthet og glukosekonsentrasjon ble målt daglig, og tilførselen av næringsstoffer ble justert tilsvarende.

Produksjon i nevnte 2000 l bioreaktor varer i ca 2 uker og i dette tidsrommet ble αOPGL-1 konstitutivt produsert av cellene og skilt ut i celledyrkningsmediet.

Produksjonsreaktoren ble kontrollert ved en fast pH, temperatur og oppløst oksygen: pH er 7,0 og dette ble kontrollert ved hjelp av karbondioksidgass og tilsetning av natriumkarbonat; oppløst oksygen er 120 mmHg og blir kontrollert ved gjennomstrømning av luft, nitrogen- og oksygengass. Cellene ble holdt på 37 ºC under hele prosessen. Alle gassene ble ført gjennom membranfiltre med porestørrelse på 0,22 μm eller mindre.

Ved slutten av produksjonen, ble cellemediet ført inn i en såkalt lagdelt skivesentrifuge og kultursupernatanten ble skilt fra cellene. Supernatanten ble ytterligere renset gjennom et Cuno 90SP dybdefilter fulgt av et 0,2 μm Posidynfilter (Pall Co.). Det rensede kondisjonerte mediet ble så konsentrert ved tangentiell strøm ultrafiltrering (UF) ved å bruke 50 kD NMWL-membraner (Millipore Biomax 50). Det kondisjonerte mediet ble konsentrert 15 til 30 ganger. Det resulterende konsentrerte kondisjonerte medium (CCM) ble enten bearbeidet ved rensing eller frosset for rensing på et senere tidspunkt. Produksjonsprosessen er vist på figur 19.

Celledyrkningsmedium

Det celledyrkningsmediet som ble brukt i hele celledyrkningsprosessen er basert på Dulbeccos modifiserte Eagles medium/Hams Nutrient F-12 (DMEM/F-12, 1:1) og inneholder supplerende nivåer av aminosyrer, ytterligere næringsstoffer og salter, et soyahydrolysat og rekombinant humant insulin (Nucellin <®>Zn, Eli Lilly).

Komponentene er angitt i tabell 3. Dette mediet er betegnet som VM-Soy.

Medieløsningene ble filtrert gjennom membranfiltrere med en porestørrelse på 0,2 μm før bruk.

Tabell 3. Komponenter i celledyrkningsmedia KOMPONENTER FOR BASALT media og TILFØRT media

Renseprosess

αOPGL-1 som ble uttrykt i CHO-celler ble skilt ut i det ekstracellulære mediet. En serie trinn kan brukes for å fremstille rent produkt. Prosessen bruker hydrofob ladningsinduksjon, kationutbytting og hydrofob interaksjonskromatografi sammen med et lavt pH-trinn og viralt filter. Disse prosedyrene er beskrevet i det etterfølgende.

A. Hydrofob ladningsinduksjonskromatografi (HCIC)

Dette kromatografitrinnet fjerner hovedmengden av vertscelleproteinene og DNA. Det konsentrerte kondisjonerte mediet (CCM) ble filtrert gjennom et Cuno 30SP-filter og så gjennom et Cuno VR07-ladet cellulosebasert filtrert og så påsatt en MEP HyperCel harpiks. Etter ladningen ble kolonnen vasket med en ekvilibreringsbuffer (20 mM Tris pH 7,2). Antistoffet ble eluert fra harpiksen ved å bruke en lav pH-buffer (20 mM natriumacetat, pH 5,0). Etter hvert som det ble eluert fra kolonnen, ble produktet oppsamlet basert på absorpsjonen ved 280 nm i kolonneeulatet.

B. Viral inaktivering

MEP eluatet fra harpikskolonnen ble titrert til pH 3,7 og holdt på denne verdien i ca 60 minutter for å inaktivere mulige forurensende retrovirus. Etter dette trinnet, ble pH justert til ca 6,0.

C. Viral filtrering

Det pH-justerte eluatet ble filtrert gjennom et Millipore Viresolve NFR-filter eller tilsvarende. Antistoffet vil da strømme gjennom filteret, mens mulige forurensende virus ≥ 50 nm vil bli holdt tilbake.

D. Kationutbyttingskromatografi (CEX)

Antistoffet ble ytterligere renset ved kationutbyttingskromatografi ved å bruke SP Sepharose HP (Amersham Pharmacia) eller tilsvarende.

Kationutbyttingskromatografitrinnet fjernet ytterligere CHO-celleproteiner, DNA, lavmolekylære proteiner og aggregerte former av αOPGL-1. Det viralfiltrerte eluatet ble påsatt kationutbyttingsharpiksen. Etter påsetting, ble kolonnen vasket med ekvilibreringsbuffer (20 mM NaMES pH 6,2). Antistoffet ble så eluert med en lineær gradient med økende saltkonsentrasjon (20 mM NAMES pH 6,2, 0 M NaCl til 20 mM NaMES pH 6,2, 0,3 M NaCl). Etter hvert som produktet ble eluert fra kolonnen, ble det oppsamlet basert på absorpsjonen ved 280 nm i kolonneeluatet.

E. Hydrofob interaksjonskromatografi (HIC)

Antistoffet ble ytterligere renset ved hydrofob interaksjonskromatografi ved å bruke fenyl Toyapearl 650S (Tosoh Biosep) eller tilsvarende. Det hydrofobe interaksjonskromatografitrinnet blir brukt som et avsluttende trinn for å fjerne ytterligere CHO-celleproteiner, DNA, lavmolekylære proteiner og aggregerte former av αOPGL-1. Kationutbyttingseluatet ble kondisjonert før det ble påsatt kolonnen ved å tilsette ammoniumsulfat til en ledningsevne på > 105 mS/cm ved 15-25 ºC. Etter påsetting ble kolonnen vasket med ekvilibreringsbufferen (1 M kaliumfosfat pH 8). Antistoffet ble så eluert med en lineær gradient med synkende saltkonsentrasjon (1 M kaliumfosfat, 0 mM Tris pH 8 til 0 M kaliumfosfat, 20 mM Tris pH 8). Etter hvert som det ble eluert fra kolonnen, ble produktet oppsamlet basert på absorpsjonen ved 280 nm i kolonneeluatet.

F. Konsentrasjon og diafiltrering.

HIC-kolonneeluatet ble konsentrert og diafiltrert i en sammensetningsbuffer ved tangentiell strøm ultrafiltrering ved å bruke 50 kD NMWL-membraner (Millipore Biomax 50). Sammensetningsbufferen inneholder 10 mM acetat, 5% sorbitol, pH 5,2 og αOPGL-1 er ved 30 mg/ml.

Endelig filtrering og lagring

Det rensede og samlede volumet ble ført gjennom et 0,22 μm PVDF-filter (Millipore), oppsamlet og lagret ved ca -30 ºC i en sikret fryser.

Eksempel 4

Bindingsspesifitet for αOPGL-1

Antistoffer som er produsert i CHO-celler ble transfektert med de to ekspresjonsvektorene som er beskrevet i eksemplene 1 og 2, kan brukes som angitt i de følgende eksemplene 4, 5 og 6.

Humant OPG binder og nøytraliserer OPGL i rotter, mus og cynomolgusaper så vel som i mennesker. αOPGL-1 binder humant OPGL med høy affinitet, men binder seg ikke signifikant til muse OPGL (tabell 4).

Tabell 4: Affinitet for αOPGL-1 til cellemembranuttrykt OPGL fra mennesker, cynomolgusaper eller musesekvens

OPGL fra disse artene blir uttrykt i CHO-celler som fullengde, membranbundet protein. Binding av αOPGL-1 til celleoverflateuttrykt OPGL ble bedømt ved FACS-analyse av celler innkubert med αOPGL-1 og et FITC-merket sekundært antistoff til humant IgG2. αOPGL-1 binder humant og cynomolgus OPGL, men det er ingen spesifikk binding til muse OPGL.

I tillegg er det blitt rapportert at humant OPG viser svak binding til tumornekrosefaktorrelatert apoptoseinduserende ligand (TRAIL) (Truneh et al, 2000), som er nærstående til TNF-gruppen, som viser DNA og aminosyresekvenshomologi til OPGL (Lacey et al., 1998). OPG binder seg imidlertid ikke påvisbart til andre TNF-relaterte proteiner som TNF α, TNF β eller CD40-ligand.

αOPGL-1 binder seg spesifikt til OPGL på EIA-plater (figur 7). Rekombinant løselig OPGL (2 μg/ml) ble pålagt 96 brønners EIA-plater ved romtemperatur i fra 16 til 24 timer. Etter blokkering med 1% BSA i PBS, så ble brønnene tilsatt varierende konsentrasjoner av αOPGL-1 (ca 2 ng/ml til 1000 ng/ml) fortynnet i 1% BSA/PBS og platene ble innkubert i 2 timer ved romtemperatur. Bundet antistoff ble påvist ved hjelp av geit antihumant IgG (Fab')-HRP ved å bruke TMB-H2O2 (tetrametylbenzidin og hydrogenperoksid) substratblanding. Absorpsjonen ble avlest ved 450 nm og 650 nm.

αOPGL-1 binder seg spesifikt til OPGL som er uttrykt på overflaten av transfekterte celler (figur 8). αOPGL-1 (100 ng/ml) fortynnet i FACS-buffer (PBS, 0,1% BSA, 0,01% natriumazid) som var preinnkubert med varierende konsentrasjoner av OPGL, TNFa, TNFb, TRAIL eller CD40-ligand (fra ca 0,1 ng/ml til 1000 ng/ml), og ble så tilsatt ca 200000 CHO REN 218-9-celler som er CHO-celler som stabilt uttrykker membranbundet OPGL på celleoverflaten. Etter 1 time ved 2-8 ºC ble ubundet antistoff fjernet ved sentrifugering og vasking. Cellene ble så innkubert i 30 minutter i 2-8 ºC med FITC-merket F(ab')2 geit antihumant IgG (Fc γ fragmentspesifikt). Etter sentrifugering og vasking, ble celleoverflatefluorescensen målt ved hjelp av flowcytometri. Figur 8 viser at bindingen av αOPGL-1 til CHO REN 218-9-celler er spesifikk og blir kompetitivt redusert ved å tilsette løselige OPGL, men ikke ved en tilsetning av TNFa, TNFb, TRAIL eller CD40-ligand.

I konkurranseeksperimenter blir αOPGL-1-binding til OPGL på EIA-plater hemmet ved å tilsette eksogent OPGL (figur 9), men ikke ved å tilsette TNF α, TNF β, TRAIL eller CD40-ligand (figur 10). Fremgangsmåten ble i alt vesentlig utført på samme måte som beskrevet ovenfor for binding av αOPGL-1 til OPGL på EIA-plater, bortsett fra at en konstant konsentrasjon av αOPGL-1 (100 ng/ml) var preinnkubert med varierende konsentrasjoner av løselig OPGL eller andre ligander (ca 1 ng/ml til 1000 ng/ml for hver av dem) før tilsetning til de OPGL-belagte platene.

Eksempel 5

αOPGL-1-nøytraliserende aktivitet

Inhibering av osteoklastdannelse

RAW 264.7 (ATCC nr. TIB-71, Manassas, VA) er en musemakrofagcellelinje som er avledet fra en Abelson museleukemi virusindusert tumor. RAW 264.7-celler vil differensiere seg til osteoklastlignende celler i nærværet av OPGL. Den grunnleggende prøven for utvikling av osteoklaster i kultur fra RAW-celler i nærværet av OPGL er detaljert beskrevet i Simonet et al (1997) Cell 89 side 309 og Lacey et al (1998) Cell 93 side 165.

Ved hjelp av ligander blir RAW-cellene stimulert til å differensiere seg til osteoklastlignende celler, og denne differensieringen kan måles ved TRAP-aktivitet, en egenskap ved osteoklaster. Effekten av αOPGL-1 på osteoklastgenesen kan således måles.

RAW-celler ble innkubert i 4 dager i nærværet av en konstant mengde av OPGL (40 ng/ml) og varierende mengder av αOPGL-1 (6.3 ng/ml til 200 ng/ml) i et celledyrkningsmedium (DMEM, 10% FBS, 0,292 mg/ml L-Glut, 100 enheter/ml penicillin G, 100 μg/ml streptomycinsulfat). Etter perioden på 4 døgn ble cellene farget for tartratresistent syrefosfatase (TRAP) aktivitet ved permeabilisering og surgjøring fulgt av en behandling med para-nitrofenylfosfat i 5 minutter. Kort beskrevet ble medium suget av cellene og hver brønn ble tilsatt 100 μl citratbuffer (410 ml 0,1 M sitronsyre, 590 ml 0,1 M citrat, trinatriumsalt, 1 ml triton X-100) og platene ble innkubert i fra 3 til 5 minutter ved romtemperatur. 100 μl av PNPP-løsning ble så tilsatt (157,8 mg sur fosfatasereagens (Sigma 104-100), 7,2 ml tartratløsning (Sigma katalognr. 387-3) og 22,8 ml citratbuffer) og platene ble innkubert i fra 3 til 5 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble avsluttet ved å tilsette 50 μl 0,5 M NaOH-løsning.

TRAP vil omdanne para-nitrofenylfosfat til para-nitrofenol som kan kvantifiseres ved en måling av den optiske tettheten ved 405 nm. TRAP-aktiviteten som er en erstatningsmarkør for osteoklastutvikling vil derfor være korrelert med den optiske tettheten ved 405 nm. Et diagram som viser optisk tetthet i forhold til αOPGL-1-konsentrasjonen er vist på figur 11, og viser at αOPGL-1 hemmer osteoklastdannelse i denne prøven.

Inhibering av OPGL-binding til dens reseptor

αOPGL-1 sine evner og muligheter ble vist ved dets evne til å blokkere bindingen av OPG-ligand til dens tilhørende reseptor, det vil si osteoklastdifferensiering og aktiverende reseptor (ODAR, også kjent som RANK). Denne prøven bruker homogeniseringstidsoppløs flurescensresonnans (HTRF) for å påvise binding av αOPGL-1 til europiumkonjugert osteoprotegerinligand (Eu-OPGL). Hvis αOPGL-1 hemmer Eu-OPGL-binding til ODAR, så vil fluorescensstyrken avta og mengden av tilstedeværende αOPGL-1 vil således være inverst relatert til styrken eller mengden av fluorescens.

OPGL ble merket med europium som emitterer lys ved 620 nm når det blir eksitert ved lys med en bølgelengde på 337 nm. ODAR ble fusjonert til FLAG og Fc, og Fc-ODAR-FLAG-fusjonsproteinet ble merket med et anti-FLAG-antistoff forbundet med allofykocyanin (APC), en fluorofor som emitterer lys ved 665 nm når det blir eksitert med lys ved en bølgelengde på 620 nm. Når Eu-merket OPG-ligand binder seg til det nevnte Fc-ODAR-FLAG/anti-FLAG-APC-komplekset, så vil derfor det tertiære komplekset emittere lys ved 665 nm når det eksiteres med lys ved en bølgelengde på 337 nm.

Eu-OPGL ved en konsentrasjon på 0,05 μg/ml ble preinnkubert med forskjellige konsentrasjoner (fra 0,1 til 150 ng/ml) av αOPGL-1 i en prøvebuffer (50 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 0,05% NaN3, 0,1% BSA og 0,05% Tween 20) ved romtemperatur i ca 1 time (preinnkuberingsblanding). En blanding av Fc-ODAR-FLAG (1 μg/ml) og anti-FLAG-APC (2,5 μg/ml) ble også fremstilt i prøvebuffer og innkubert ved romtemperatur i 1 time (fluorokromblanding). Like volumer av preinnkuberingsblandingen og fluorokromblandingen ble så blandet, og innkubert ved romtemperatur i 3 timer. Fluorescensen ble målt ved å lese platene i et Packard Discovery HTRF mikroplateanalyseapparat ved å bruke en eksitasjonslengde på 337 nm og en emisjonsbølgelengde på 665 nm.

Når αOPGL-1 ble preinnkubert med Eu-OPG-ligand og så blandet med Fc-ODAR-FLAG/anti-FLAG-APC, så synker fluorescensintensiteten ved 665 nm på en doseavhengig måte slik dette er vist på figur 12, og som viser at αOPGL162 effektivt kan hemme OPGL-binding til ODAR.

Eksempel 6

Farmakokinetikk i cynomolgusaper

Seks hannlige og seks hunnlige cynomolgusaper, ikke eldre enn 4,5 år og med en kroppsvekt på fra 2 til 4 kg, ble fordelt i 4 dosegrupper. Gruppe 1 besto av 3 hanner og 3 hunner. Gruppene 2, 3 og 4 besto hver av 1 hann og 1 hunn. Dyrene i gruppe 1 ble administrert en enkelt subkutan dose av 1 mg/kg αOPGL-1, mens dyrene i gruppene 2, 3 og 4 ble administrert enkle intravenøse doser av henholdsvis 0,1, 1,0 eller 10,0 mg/kg αOPGL-1.

Dyrene ble dosert med αOPGL-1 uttrykt fra transfekterte kinesiske hamstereggstokkceller (CHO). Det ble så tatt serumprøver for å bestemme nivået av αOPGL-1, analyse av antistoffer og analyse av benomsetningsmarkøren N-telopeptid i serum (serum N-Tx), alkalisk fosfatase (ALP) og serumkalsium (serum Ca). Urin ble også oppsamlet for analyse av N-telopeptid (urin N-Tx) og kreatinin.

Tidsprofilene for serumkonsentrasjonen etter IV-administrering er karakterisert ved en trefaset fordeling (figur 13). Først er det en rask fordelingsfase fu lgt av en signifikant langsommere platåfase som synes å være konsentrasjonsavhengig. Den tredje observerte fasen er en rask elimineringsfase.

Det ble brukt en ikke-kompartemental analyse av fullstendige serumkonsentrasjonstidsprofiler ved å bruke WinNonlin Professional (v1.5) foruten en eksponentiell analyse av data opp til 14 dager etter at testforbindelsene var administrert og ved 10000 ng/ml ved å bruke SAAM II (v.1.1.2) for å undersøke farmakokinetikkene for αOPGL-1 i aper. Det opprinnelige fordelingsvolumet for alle IV-dosene er i gjennomsnitt 28,9 ml/kg, noe som tilsvarer plasmavolumet. Stabilt tilstandsvolum (VSS) for fordeling er i gjennomsnitt 39 ml/kg for alle IV-dosene. Eksponentiell analyse indikerer at αOPGL-1 har et midlere fordelingshalvliv (t1/2 α) på 6,02 timer, og en forlenget sekundær fase med et halvliv (t1/2 β) som øker med dosen fra 86,9 timer ved en dose på 0,1 mg/kg til et maksimum på 444 timer ved en dose på 10,0 mg/kg. Endelig elimineringshalvliv (t1/2z) beregnet ikke-kompartementalt, er i gjennomsnitt 31 timer for alle IV-dosegruppene. Elimineringen (Cl, CL/F) for αOPGL-1 viste seg å være ikke-lineær, og hvor dyrene som fikk IV-doser på 10 mg/kg hadde en midlere eliminasjon (0,120 ml/time/kg) som er 3,3 ganger lavere enn de som fikk 0,1 mg/kg (0,401 ml/time/kg).

Etter en subkutan administrering, er absorpsjonen langsom med en midlere toppkonsentrasjon (Cmax) på 11600 ng/ml etter 132 timer. Det er stor variabilitet med hensyn til eksponeringen etter SC-administrering, noe som resulterer i en midlere eliminasjon på 0,387 ± 0,281 ml/time/kg og en midlere oppholdstid på 202 ± 80,1 timer. Midlere biotilgjengelighet er 89%.

De foregående data er oppsummert i tabell 5.

Tabell 5: Gjennomsnitt ( ± SD) for ikke-kompartementale farmakokinetiske parametere<a >i cynomolgusaper etter administrering av en enkelt dose av αOPGL-1 IV og SC

<a >Verdier angitt i forhold til 3 signifikante tall

<b >Ikke bestemt, PK-prøvene endte under platå ( β) fasen, følgelig ble den terminale fasen ikke observert

<c >Ikke anvendbart

αOPGL-1 forårsaker en rask senkning av serum N-Tx-nivåene i løpet av 24 timer etter dosering (figur 14). Den midlere tiden for maksimal effekt opptrer mellom 12 timer og 7 dager etter dosering ettersom IV-dosene øker fra 0,1 til 10 mg/kg, og mellom 12 timer og 11 dager i dyr som mottar en SC-dose på 1,0 mg/kg. Maksimal effekt øker med dosen fra ca 80 til 91% i et doseområde fra 0,1 til 1 mg/kg. Ved høyere doser ble det imidlertid ikke observert noen ytterligere suppresjon med en maksimal inhibering på 91%. Midlere nivåer av serum N-Tx gikk tilbake til basislinjen på dag 28 etter administrering av 0,1 mg/kg intravenøst og på dag 70 etter administrering av 1 mg/kg subkutant. Urin N-Tx viser tilsvarende utvikling som for serum N-Tx, bortsett fra at alle gruppene gikk tilbake til basislinjeverdier på dag 105 (figur 15).

Suppresjon av serum Ca øker med en dose en midlere nadir på 31,6% under basisgjennomsnittet syv dager etter IV-administrering av en dose på 10,0 mg/kg. Alle andre dosegrupper har en midlere senkning av serum Ca på mindre enn 26,4% fra deres basismiddelverdier. På dag 17 var nivået av serum Ca i alle de behandlede dyrene returnert til verdier som ligger 10% innenfor deres basislinjemiddelverdier (figur 20).

Ettersom benresorpsjon og -dannelse er intimt forbundet, ble det også observert forandringer i bendannelsesmarkører (ALP) med en langt lavere senkning av ALP-nivåene og en mer forlenget suppresjon enn for dannelsesmarkøren N-Tx (figur 21). Observasjoner viser at benresorpsjonsmarkørene synker før bendannelsesmarkørene (ALP) etter dosering med αOPGL-1, bekrefter at αOPGL-1 er et benantiresorptivt middel.

Flesteparten av dyrene (9 av 12) utvikler antistoffer til αOPGL-1. Forekomsten av antistoffer til αOPGL-1 er ikke dose- eller administrasjonsveiavhengig. Det er ikke mulig å bedømme effekten av antistoffene til αOPGL-1 på αOPGL-1-farmakokinetikkene over en dose på 0,1 mg/kg når ingen dosegruppe har både antistoffnegative og -positive dyr. Ved 0,1 mg/kg IV var mesteparten av αOPGL-1 eliminert før antistoffutvikling, og det var følgelig ikke mulig å observere ef fektene på en αOPGL-1-disposisjon (figur 16).

Claims

PATENTKRAV

1. Antistoff,

k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en tung kjede og en lett kjede, der den tunge kjeden omfatter det variable området og det konstante området til SEKV. ID. NR. 2 med en, men ikke mere enn en aminosyredelesjon, addisjon eller substitusjon; der den lette kjeden omfatter det variable området og det konstante området til SEKV.ID. NR. 4; og der antistoffet binder til en osteoprotegerinligand (OPGL) og inhiberer binding av OPGL til en osteoklastdifferensieringsreseptor og -aktiveringsreseptor (ODAR) der et overskudd av antistoff reduserer bindingen med minst 20% som målt i en in vitro konkurrerende bindingsprøve.

2. Antistoff ifølge krav 1,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den tunge kjeden omfatter det variable området og det konstante området til SEKV. ID. NR. 2 med en, men ikke mere enn en karboksylterminal-aminosyredelesjon.

3. Antistoff ifølge krav 1 eller krav 2,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den tunge kjeden omfatter aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID. NR. 13; og der den lette kjeden omfatter aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID. NR. 14.

4. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 3,

k a r a k t e r i s e r t v e d at det er oppnåelig ved uttrykk i en vertscelle omfattende et første polynukleotid og et andre polynukleotid, der det første polynukleotidet koder for den tunge kjeden og det andre polynukleotidet koder for den lette kjeden.

5. Antistoff ifølge krav 4,

k a r a k t e r i s e r t v e d at vertscellen er en pattedyrvertscelle.

6. Antistoff ifølge krav 5,

k a r a k t e r i s e r t v e d at vertscellen er valgt fra gruppen av pattedyrvertsceller bestående av en kinesisk hamstereggstokkcelle, en HeLa-celle, en babyhamsternyrecelle, en apenyrecelle, en humane hepatocellulær karsinomcelle.

7. Sammensetning,

k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte et første polynukleotid og et andre polynukleotid, der;

(a) det første polynukleotidet koder for en tung kjede omfattende det variable området og det konstante området til SEKV. ID. NR. 2 med en, men ikke mere enn en aminosyredelesjon, addisjon eller substitusjon; og

(b) det andre polynukleotidet koder for den lette kjeden omfattende det variable området og det konstante området til SEKV.ID. NR. 4; og der antistoffet omfattende den tunge kjeden og den lette kjeden binder til en osteoprotegerinligand (OPGL) og inhiberer binding av OPGL til en osteoklastdifferensieringsreseptor og -aktiveringsreseptor (ODAR) der et overskudd av antistoff reduserer bindingen med minst 20% som målt i en in vitro konkurrerende bindingsprøve.

8. Sammensetning ifølge krav 7,

9. Vertscelle,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter sammensetningen ifølge krav 7 eller krav 8.

10. Vertscelle ifølge krav 9,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den er en pattedyrvertscelle.

11. Vertscelle ifølge krav 10,

k a r a k t e r i s e r t v e d at vertscellen er valgt fra en kinesisk hamstereggstokkcelle, en HeLa-celle, en babyhamsternyrecelle, en apenyrecelle og en human hepatocellulær karsinomcelle.

12. Antistoff,

k a r a k t e r i s e r t v e d å omfatte en tung kjede og en lett kjede, der antistoffet binder til en osteoprotegerinligand (OPGL) og inhiberer binding av OPGL til en osteoklastdifferensieringsreseptor og -aktiveringsreseptor (ODAR) der et overskudd av antistoff reduserer bindingen med minst 20% som målt i en in vitro konkurrerende bindingsprøve, og der antistoffet er oppnåelig ved uttrykk i en vertscelle omfattende det første polynukleotidet og det andre polynukleotidet av sammensetningen ifølge krav 7 eller krav 8.

13. Antistoff ifølge krav 12,

k a r a k t e r i s e r t v e d at vertscellen er vertscellen ifølge ethvert av kravene 9 til 11.

14. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6, 12 og 13,

k a r a k t e r i s e r t v e d at være et monoklonalt antistoff av IgG2-isotypen.

15. Antistoff ifølge krav 12,

k a r a k t e r i s e r t v e d at antistoffet omfatter i) en human IgG2 tung kjede omfattende SEKV.ID. NR. 13, og ii) en human kappa lett kjede omfattende SEKV.ID. NR. 14.

16. Antistoff ifølge krav 15,

k a r a k t e r i s e r t v e d at det er uttrykt av en pattedyrvertscelle som omfatter et første vertscellepolynukleotid og et andre vertscellepolynukleotid, der det første vertscellepolynukleotidet koder for en tung kjede omfattende en human IgG2 tung kjede omfattende SEKV.ID. NR. 13 og det andre vertscellepolynukleotidet koder for en lett kjede omfattende kappa lett kjede omfattende SEKV.ID. NR. 14.

17. Antistoff ifølge krav 15,

k a r a k t e r i s e r t v e d at det er uttrykt av en pattedyrvertscelle som omfatter et første vertscellepolynukleotid og et andre vertscellepolynukleotid, der det første vertscellepolynukleotidet koder for en tung kjede omfattende det variable området og det konstante området av aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 2 og det andre vertscellepolynukleotid koder for en lett kjede omfattende det variable området og det konstante området av aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 4.

18. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 17,

k a r a k t e r i s e r t v e d at det er fullt humant.

19. Farmasøytisk sammensetning,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter et antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18.

20. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller den farmasøytiske sammensetning ifølge krav 19, til anvendelse i terapi.

21. Anvendelsen av et antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller av den farmasøytiske sammensetning ifølge krav 19, i fremstillingen av et medikament til administrering med minst et terapeutisk antistoff valgt fra anti-Her2-antistoff, et anti-CDC20-antistoff, et antistoff som binder til EGFR tilstede på tumorceller, et antistoff som binder til celleoverflateprotein CDC 33, et antistoff som binder til celleoverflateprotein mucinlignende glykoprotein, trastuzumab, rituksimab, ibritumomab tiuksetan, epratuzumab, IMC-C225, jod 131, tositumomab og alemtuzumab.

22. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, til anvendelse i behandling av bentap.

23. Antistoff til anvendelse eller den farmasøytiske sammensetning til anvendelse ifølge krav 22, der bentapet er assosiert med minst en tilstand valgt fra osteoporose, Pagets sykdom, osteomyelitt, hyperkalsemi, osteopeni, osteonekrose, en inflammatorisk tilstand, en autoimmun tilstand, revmatisk artritt, og kreft.

24. Anvendelsen av et antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller av en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, i fremstillingen av et medikament til behandling av bentap.

25. Anvendelsen ifølge krav 24, der bentapet er assosiert med minst en tilstand valgt fra osteoporose, Pagets sykdom, osteomyelitt, hyperkalsemi, osteopeni, osteonekrose, en inflammatorisk tilstand, en autoimmun tilstand, revmatisk artritt, og kreft.

26. Anvendelsen av et antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller av en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, i fremstillingen av et medikament til administrering med minst et terapeutisk middel valgt fra en benmorfogenetisk faktor, en transformerende vekstfaktor-ß (TGF-ß), et paratyroidhormon, en analog av et paratyroidhormon, et paratyroidhormonbeslektet protein, en analog av et paratyroidbeslektet protein, et prostaglandin, et bisfosfonat, et alendronat, fluorid, kalsium, en fibroblastvekstfaktor (FGF), for behandling av bentap.

27. Anvendelsen av et antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller av en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, i fremstillingen av et medikament til administrering med minst et terapeutisk middel valgt fra interleukin-1 (IL-1) inhibitor, IL-1ra, anakinra, en TNFα-inhibitor, en løselig TNFα-reseptor, etanercept, et anti-TNFα-antistoff, infliximab, et D2E7-antistoff, et ikke-steroid antiinflammatorisk legemiddel (NSAID), en COX-2-inhibitor, celecoxib, rofecoxib og leflunomid, for behandling av bentap assosiert med en inflammatorisk tilstand.

28. Anvendelsen av et antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller av en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, i fremstillingen av et medikament til administrering med minst et terapeutisk middel valgt fra interleukin-1 (IL-1) inhibitor, IL-1ra, anakinra, en TNFα-inhibitor, en løselig TNFα-reseptor, etanercept, et anti-TNFα-antistoff, infliximab, et D2E7-antistoff, metotrexat, en løselig form av CTLA4 og en modulator av glukokortikoidreseptor, for behandling av bentap assosiert med en autoimmun tilstand.

29. Anvendelsen av et antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller av en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, i fremstillingen av et medikament til administrering med minst et terapeutisk middel valgt fra interleukin-1 (IL-1) inhibitor, IL-1ra, anakinra, en TNFα-inhibitor, en løselig TNFα-reseptor, etanercept, et anti-TNFα-antistoff, infliximab, et D2E7-antistoff, et ikke-steroid antiinflammatorisk legemiddel (NSAID), en COX-2-inhibitor, celecoxib, rofecoxib, leflunomid, metotrexat, en løselig form av CTLA4, og en modulator av glukokortikoidreseptor, for behandling av bentap assosiert med reumatoid artritt.

30. Anvendelsen av et antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller av en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, i fremstillingen av et medikament for administrering med minst én av strålingsterapi og kjemoterapi, for behandling av bentap assosiert med kreft.

31. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, til anvendelse i behandling av bentap ved administrering med minst et terapeutisk middel valgt fra benmorfogenetisk faktor, en transformerende vekstfaktor-ß (TGF-ß), et paratyroidhormon, en analog av et paratyroidhormon, et paratyroidhormonbeslektet protein, en analog av et paratyroidbeslektet protein, et prostaglandin, et bisfosfonat, et alendronat, fluorid, kalsium, og en fibroblastvekstfaktor (FGF).

32. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, til anvendelse i behandling av bentap assosiert med en inflammatorisk tilstand ved administrering med minst et terapeutisk middel valgt fra en interleukin-1 (IL-1) inhibitor, IL-1ra, anakinra, en TNFα-inhibitor, en løselig TNFα-reseptor, etanercept, et anti-TNFα-antistoff, infliximab, et D2E7-antistoff, et ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel (NSAID), en COX-2-inhibitor, celecoxib, rofecoxib og leflunomid.

33. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, til anvendelse i behandling av bentap assosiert med en autoimmun tilstand ved administrering med minst et terapeutisk middel valgt fra en interleukin-1 (IL-1) inhibitor, IL-1ra, anakinra, en TNFα-inhibitor, en løselig TNFα-reseptor, etanercept, et anti-TNFα-antistoff, infliximab, et D2E7-antistoff, metotrexat, en løselig form av CTLA4, og en modulator av glukokortikoidreseptor.

34. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, til anvendelse i behandling av bentap assosiert med rheumatoid arthritis ved administrering med minst et terapeutisk middel valgt fra en interleukin-1 (IL-1) inhibitor, IL-1ra, anakinra, en TNFα-inhibitor, en løselig TNFα-reseptor, etanercept, et anti-TNFα-antistoff, infliximab, et D2E7-antistoff, et ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel (NSAID), en COX-2-inhibitor, celecoxib, rofecoxib, leflunomid, metotrexat, en løselig form av CTLA4, og en modulator av glukokortikoidreseptor.

35. Antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, til anvendelse i behandling av bentap assosiert med kreft ved administrering med minst et av strålingsterapi og kjemoterapi.

36. Anvendelsen ifølge krav 30, der kreften er valgt fra bryst, prostata, skjoldbruskkjertel, nyre, lunge, esofagus, rektal, blære, livmorhals, ovaria, lever, gastrointestinal, multippelt myelom, lymfom og Hodgkins sykdom.

37. Antistoffet til anvendelse eller den farmasøytiske sammensetning til anvendelse ifølge krav 35, der kreften er valgt fra bryst, prostata, skjoldbruskkjertel, nyre, lunge, esofagus, rektal, blære, livmorhals, ovaria, lever, gastrointestinal, multippelt myelom, lymfom og Hodgkins sykdom.

38. Anvendelsen ifølge krav 30, der kjemoterapien involverer behandling med minst et middel valgt fra et antrasyklin, taxol, tamoxifen, doxorubicin, 5-fluoruracil og en luteiniserende hormon-frigjørende hormon (LHRH) antagonist.

39. Antistoffet til anvendelse eller den farmasøytiske sammensetning til anvendelse ifølge krav 35, der kjemoterapien involverer behandling med minst et middel valgt fra et antrasyklin, taxol, tamoxifen, doxorubicin, 5-fluoruracil og en luteiniserende hormon-frigjørende hormon (LHRH) antagonist.

40. Anvendelse av antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 6 og 12 til 18, eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 19, i fremstillingen av et medikament for administrering med TRAIL.

41. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff som interagerer med osteoprotegerinligand (OPGL),

k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter dyrking av vertscellen ifølge ethvert av kravene 9 til 11.