NO317150B1 - ICAM-4-materialer og metoder - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for screening for neuropatologi, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: a) en fluidprøve erholdes fra et første individ; b) prøven bringes i kontakt med et antistoff som er spesifikt immunreaktivt med ICAM-4; c) ICAM-4/antistoffbindingen i prøven kvantifiseres ; og d) ICAM-4/antistoffbindingen i individet sammenlignes med bindingen i et andre individ kjent for

ikke å være neuropatologisk.

Oppfinnelsens bakgrunn

Forskning som omspenner det siste tiår, har belyst de molekylære hendelser som ledsager celle-celleinteraksjoner i kroppen betydelig, spesielt hendelser involvert i bevegelse og aktivering av celler i immunsystemet, og mer nylig hendelsene involvert i utvikling og normal fysiologisk funksjon av celler i nervesystemet. Se generelt Springer, Nature, 346:425-434

(1990) angående celler i immunsystemet, og Yoshihara et al., Neurosci. Res. 20:83-105 (1991), og Sonderegger og Rathjen, J. Cell Biol. 119:1387-1394 (1992) angående celler i nervesystemet. Celleoverflateproteiner, og spesielt de såkalte cellulære adhesjonsmolekyler ("CAM") har likeledes vært gjenstand for farmasøytisk forskning og utvikling med målet å inngripe i prosessene for leukocyttuttredelse til inflammasjonssteder og leukocyttbevegelse til bestemte målvev, så vel som neuronal differensiering og dannelse av komplekst, neuronalt nettverk. Isolering og karakterisering av cellulære adhesjonsmolekyler, kloning og ekspresjon av DNA-sekvenser som koder for slike molekyler og utvikling av terapeutiske og diagnostiske midler som er relevante for inflammatoriske prosesser og utvikling og funksjon av nervesystemet, har også vært gjenstand for et stort antall US patentsøknader og utenlandske patentsøknader. Se Edwards, Current Opinion in Therapeutic Patents, l(11):1617-1630 (1991) og spesielt de publiserte "patent-litteraturreferanser" anført deri.

Av fundamental interesse for bakgrunnen for foreliggende oppfinnelse er den tidligere identifikasjon og karakterisering av bestemte formidlere av celleadhesjonshendelser, "leukointegrinene", LFA-1, MAC-1 og gp 105.95 (referert til med WHO-nomenklatur som hhv. CD18/CDlla, CD18/CDllb og CD18/CDllc) som danner en underfamilie av heterodimere "inte-grin"-celleoverflateproteiner til stede på B-lymfocytter, T-lymfocytter, monocytter og granulocytter. Se f.eks. tabell 1 i Springer, supra, side 429. Også av interesse er andre enkeltkjedede adhesjonsmolekyler (CAM) som er implisert i leukocytt-aktivering, adhesjon, bevegelighet og lignende, som er hendelser som medfølger den inflammatoriske prosess. Det antas f.eks. i dag at før leukocyttuttredelsen som karakteriserer inflammatoriske prosesser, foregår aktivering av integriner som konstitutivt uttrykkes på leukocytter, og etterfølges av en tett ligand/reseptorinteraksjon mellom integrinene (f.eks. LFA-1) og ett eller begge av to forskjellige intercellulære adhesjonsmolekyler (ICAM) betegnet ICAM-1 og ICAM-2, som uttrykkes på blodkarendotelcelleoverflater og på andre leukocytter.

På samme måte som de andre CAM som hittil er karakterisert [f.eks. vaskulære adhesjonsmolekyler (VCAM-1) som beskrevet i PCT WO 90/13300, publisert 15. november 1990; og blodplateendotelcelleadhesjonsmolekyl (PECAM-1) som beskrevet i Newman et al.. Science, 247:1219-1222 (1990) og PCT WO 91/10683, publisert 25. juli 1991], er ICAM-1 og ICAM-2 strukturelt homologe med andre medlemmer av immunglobulingensuper-familien ved at den ekstracellulære del av hvert av disse er sammensatt av en serie domener som deler et lignende karbok-syterminalmotiv. Et "typisk" immunglobulinlignende domene inneholder en løkkestruktur som vanligvis er forankret ved hjelp av en disulficibinding mellom to cysteiner i ytterkanten av hver løkke. ICAM-1 inkluderer fem immunglobulinlignende domener; ICAM-2 som atskiller seg fra ICAM-1 uttrykt ved cel-lefordeling, inkluderer to slike domener; PECAM-1 inkluderer seks; VCAM inkluderer seks eller syv, avhengig av spleisings-variasjoner, og så videre. CAM inkluderer dessuten typisk et hydrofobt "transmembran"-område som antas å delta i orienter-ingen av molekylet på celleoverflaten og et karboksyterminalt, "cytoplasmatisk" område. Grafiske modeller av den operative plassering av CAM viser generelt at molekylet er forankret i cellemembranen ved det transmembrane område og med den cytoplasmatiske "hale" som strekker seg inn i cellecytoplasmaet og én eller flere immunglobulinlignende løkker som strekker seg utover fra celleoverflaten.

Flere celletyper som ikke stammer fra leukocytter uttrykker også molekyler med likhet til adhesjonsmolekyler. Landsteiner-Wiener (LW)-blodgruppeantigenet, som primært finnes på erytrocytter, ble nylig vist av Bailly et al.

[Proceedings of the National Academy of Sciences 91:5306-5310,

(1994)] å ha to Ig-lignende domener som har sekvenshomologi med de første to Ig-lignende domenene som finnes i de cellulære adhesjonsmolekylene m ICAm-1, ICA-2 og ICAM-3.

Et antall neuronale celler uttrykker overflateresep-torer med ekstracellulære, Ig-lignende domener med strukturell likhet med ICAM. Se f.eks. Yoshihara et al., supra. I tillegg til Ig-lignende domener inneholder også mange adhesjonsmolekyler i nervesystemet tandemaktig gjentatte, fibronektinlign-ende sekvenser i det ekstracellulære domene.

Mange forskjellige terapeutiske anvendelser er planlagt for intercellulære adhesjonsmolekyler, inkludert anvendelser med grunnlag i evnen av ICAM-1 til å binde humant rhinovirus. Europeisk patentsøknad 468 257 A, publisert 29. januar 1992, angår f.eks. utvikling av multimere konfigura-sjoner og former av ICAM-1 (inkludert uforkortede og trun-kerte, molekylære former) foreslått å besitte forhøyet ligand/reseptorbindingsaktivitet, spesielt ved binding til virus, lymfocyttassosierte antigener og patogener, slik som Plasmodium falciparum.

På lignende måte er mange forskjellige anvendelser planlagt for proteiner som immunologisk er beslektet med intercellulære adhesjonsmolekyler. WO 91/16928, publisert 14. november 1991, angår f.eks. humaniserte, kimære anti-ICAM-1-antistoffer og deres anvendelse ved behandling av spesifikk og uspesifikk inflammasjon, virusinfeksjon og astma. Anti-ICAM-1-antistoffer og fragmenter derav er beskrevet som anvendelige ved behandling av endotoksisk ajokk i WO 92/04034, publisert 19. mars 1992. Inhibering av ICAM-l-avhengige, inflammatoriske responser med anti-ICAM-l-anti-idiotypiske antistoffer og antistoff ragmenter er beskrevet i WO 92/06119, publisert 16. april 1992.

Til tross for den fundamentale innsikt i celleadhe-sjonsfenomener som er blitt oppnådd ved identifikasjon og karakterisering av intercellulære adhesjonsproteiner, slik som ICAM-l og lymfocyttinteraktive integriner som LFA-1, er bildet langt fra fullstendig. Det antas generelt at et stort antall andre proteiner er involvert i inflammatoriske prosesser og i målrettet lymfocyttbevegelse gjennom kroppen. Den publiserte PCT-søknad WO 93/14776 (publisert 5. august 1993) beskriver f.eks. kloning og ekspresjon av et ICAM-beslektet protein, ICAM-R. Disse patentsøknader er spesielt inkorporert heri ved referanse, og DNA- og aminosyresekvensene av ICAM-R er vist i SEQ ID NO: 4 heri. Denne nye ligand er funnet å bli uttrykt på humane lymfocytter, monocytter og granulocytter.

Av spesiell interesse for foreliggende patentsøknad ble det identifisert et ytterligere ICAM-lignende overflate-molekyl som har en vevsspesifikk ekspresjon som ikke ligner ekspresjonen av noe kjent ICAM-molekyl. Mori et al., [Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 84:3921-3925 (1987)] rapporterte identifikasjon av et telencefalon-spesifikt antigen i kaninhjerne som er spesifikt immunreaktivt med monoklonalt antistoff 271A6. Dette overflateantigen ble betegnet telencefalin. Imamura et al., [Neurosci. Letts. 119:118-121 (1990)], hevdet ved anvendelse av et polyklonalt antistoff for å bestemme lokalisert ekspresjon, at ekspresjon av telencefalin i den visuelle cortex hos katter viste variasjon innen lag av vevet, og rapporterte også at telencefalinekspresjon var variabel som en funksjon av utvikling. Oka et al., [Neuroscience 35:93-103

(1990)], rapporterte deretter isolering av telencefalin ved anvendelse av monoklonalt antistoff 271A6. Publikasjonen rap-porterer en molekylvekt for overflatemolekylet på ca. 500 kD og at molekylet var sammensatt av fire subenheter, hver med en nativ molekylvekt på 130 kD og ca. 100 kD etter N-glykanase-behandling. Yoshihiro et al., [Neuroscience, Research Supple-ment 18, s. S83 (1994)], rapporterte cDNA- og aminosyresekvensene for kanintelencefalin ved det 17. årlige møte for Japan Neuroscience Society i Nagoya, Japan, 7.-9. desember 1993, og det 23. årlige møte for Society for Neuroscience i Washington, D.C., 9. november 1993 [Society for Neuroscience Abstracts 19 (1-3), s. 646 (1993)]. Den utledede aminosyresekvens som ble rapportert, antydet at det 130 kD telencefalon er et integrert membranprotein med ni ekstracellulære immunglobulin(lg)lignende domener. De distale åtte av disse domener viste homologi med andre ICAM Ig-lignende domener. Den samme informasjon ble rapportert av Yoshihara et al., i Neuron 12:543-553 (1994).

Det foreligger således fortsatt et behov i teknikken for oppdagelse av ytterligere proteiner som deltar i humane celle-celleinteraksjoner, og spesielt et behov for informasjon som spesifikt kan identifisere og karakterisere slike proteiner uttrykt ved deres aminosyresekvens. I den grad at slike molekyler kan danne basis for utvikling av terapeutiske og diagnostiske midler, er det dessuten vesentlig at DNA som koder for proteinene, utredes. En slik forberedende informasjon vil blant annet kunne sørge for produksjon av proteinene i stor skala, tillate identifikasjon av celler som naturlig produserer proteinene, og tillate fremstilling av antistoffmaterialer eller andre nye bindingsproteiner som er spesifikt reaktive med disse og/eller inhibitoriske overfor ligand/- reseptorbindingsreaksjoner som de er involvert i.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse gjør bruk av rensede og isolerte polynukleotider (f.eks. DNA-sekvenser, RNA-transkripter og antisense-oligonukleotider derav) som koder for et nytt polypeptid, "ICAM-4", så vel som polypeptid-varianter (inkludert fragmenter og delesjoner, substitusjoner og ytterligere analoger) derav som oppviser én eller flere biologiske ligand/reseptorbindingsaktiviteter og/eller immunologiske egenskaper som er spesifikke for ICAM-4. ICAM-4-spesifikke, biologiske ligand/reseptorbindingsaktiviteter omfatter interaksjoner av både ICAM-4-ekstracellulære og cytoplasmatiske domener med andre molekyler (f.eks. i prosesser med celle-celleadhesjon og/eller signaltransduksjon). Foretrukne DNA-sekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer genomiske og cDNA-sekvenser, så vel som helt eller delvis kjemisk syntetiserte DNA-sekvenser. Et for tiden foretrukket polynukleotid er vist i SEQ ID NO: 1 og koder for rottetype-ICAM-4. Biologiske replika {dvs. kopier av isolerte DNA-sekvenser fremstilt in vivo eller in vi tro) av DNA-sekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse, er betraktet. Autonomt replikerende, rekombinante konstruksjoner, slik som plasmid-og virus-DNA-vektorer som inkorporerer ICAM-4-sekvenser og spesielt vektorer hvori DNA som koder for ICAM-4 eller en ICAM-4-variant er operativt bundet til en endogen eller ekso-gen ekspresjonskontroll-DNA-sekvens, benyttes også.

Vertsceller, spesielt encellede vertsceller, slik som prokaryotiske og eukaryotiske celler, kan bli stabilt transformert med DNA-sekvenser på en måte som tillater de ønskede polypeptider å uttrykkes deri. Vertsceller som uttrykker slike ICAM-4- og ICAM-4-variantprodukter, kan tjene mange forskjellige nyttige formål. I den grad at uttrykte produkter "fremvises" på vertscelleoverflater, kan cellene utgjøre et verdifullt immunogen for utvikling av antistoffmaterialer som er spesifikt immunreaktive med ICAM-4 og ICAM-4-varianter. Slike vertsceller er påfallende anvendelige i fremgangsmåter for produksjon i stor skala av ICAM-4 og ICAM-4-varianter hvori cellene dyrkes i et egnet kulturmedium og de ønskede polypeptidprodukter isoleres fra cellene eller fra mediet som cellene dyrkes i.

Nye ICAM-4 kan erholdes som isolater fra naturlige cellekilder, men, sammen med ICAM-4-variantprodukter, produseres de fortrinnsvis ved hjelp av rekombinante prosedyrer som involverer vertsceller. En spesielt foretrukket aminosyresekvens for et ICAM-4-polypeptid er vist i SEQ ID NO: 2. Produktene kan erholdes i helt eller delvis glykosylert, delvis eller helt deglykosylert eller ikke-glykosylert form, avhengig av vertscellen utvalgt for rekombinant produksjon og/eller bearbeidelse etter isolering. ICAM-4-varianter kan omfatte vannløselige eller -uløselige, monomere, multimere eller sykliske ICAM-4-fragmenter som inkluderer hele eller en del av ett eller flere av domeneorarådene spesifisert ovenfor, og som besitter en biologisk eller immunologisk egenskap hos ICAM-4, inkludert f.eks. evnen til å binde en bindingspartner av ICAM-4 og/eller inhibere binding av ICAM-4 til en naturlig bindingspartner. ICAM-4-varianter kan også omfatte polypeptid-analoger hvori én eller flere av de spesifiserte aminosyrer er delert eller erstattet: (1) uten tap og fortrinnsvis med økn-ing av én eller flere biologiske aktiviteter eller immunologiske karakteristika for ICAM-4; eller (2) med spesifikk arbeidsudyktighet av en spesiell ligand/reseptorbindingsfunk-sjon. Analoge polypeptider som inkluderer ytterligere amino-syrerester (f.eks. lysin eller cystein) som letter multimer dannelse, er betraktet.

Foreliggende oppfinnelse benytter antistoffmaterialer (f.eks. monoklonale og polyklonale antistoffer, antistoffrag-menter, enkeltkjedede antistoffer, kimære antistoffer, CDR-podede antistoffer og lignende) og andre bindingsproteiner (f.eks. polypeptider og peptider) som er spesifikke (dvs. ureaktive med ICAM-1, ICAM-2 og ICAM-R-intercellulære adhesjonsmolekyler som ICAM-4 er strukturelt beslektet med) for ICAM-4 eller ICAM-4-varianter. Foreliggende oppfinnelse gjør også bruk av hybridomcellelinjer som spesifikt utskiller monoklonale antistoffer. For tiden foretrukne hybridomer inkluderer de som er betegnet 127A, 127H, 173E, 1791 og 179H. Antistoffmaterialer kan utvikles ved anvendelse av isolerte, naturlige eller rekombinante ICAM-4 eller ICAM-4-varianter eller celler som uttrykker slike produkter på deres overflater. Bindingsproteiner er ytterligere anvendelige for karakterisering av bindingssetestruktur(er) (f.eks. epitoper og/eller sensitivitet av bindingsegenskaper overfor modifika-sjoner i ICAM-4-aminosyresekvens).

Bindingsproteiner er i sin tur anvendelige i prepar-ater for immunisering samt for rensing av polypeptider og identifikasjon av celler som fremviser polypeptidene på overflaten. De er også åpenbart anvendelige for modulering (dvs. blokkering, inhibering eller stimulering) av biologiske ligand/reseptorbindingsaktiviteter som involverer ICAM-4, spesielt de ICAM-4-effektorfunksjoner som er involvert i spesifikke og uspesifikke immunsystemresponser. Ved foreliggende oppfinnelse anvendes det også anti-idiotypiske antistoffer spesifikke for anti-ICAM-4-antistoffmaterialer ved modulering av immunresponser. Analyser for påvisning og kvantifisering av ICAM-4 på celleoverflater og i kroppsvæsker, slik som serum eller cerebrospinalvæske, kan f.eks. involvere et enkelt antistoffmateriale, eller flere antistoffmaterialer, i et "sandwich"-analyseformat. Ved påvisning av ICAM-4 i en kroppsvæske er antistoffer også anvendelige for bestemmelse av forekomsten av neuropatologier som kan settes i forbindelse med økte nivåer av sirkulerende ICAM-4. Slike neuropatologier inkluderer, men er ikke begrenset til, cerebral iskemi {dvs. slag) som resulterer fra forskjellige sykdomstilstander, inkludert f.eks. trombose, emboli og lignende.

Den vitenskapelige verdi av informasjonen som gis ved beskrivelsene av DNA og aminosyresekvenser er åpenbar. Som en serie av eksempler muliggjør kunnskap om sekvensen av et cDNA for ICAM-4 isolering av DNA/DNA-hybridisering av genomiske DNA-sekvenser som koder for ICAM-4, og spesifisering av ICAM-4-ekspresjonskontrollregulatoriske sekvenser, slik som promotorer, operatorer og lignende. DNA/DNA-hybridiserings-prosedyrer utført med DNA-sekvenser og under strenge be-tingelser, forventes likeledes å tillate isolering av DNA som koder for allele varianter av ICAM-4, andre strukturelt be-slektede proteiner som deler én eller flere av de biologiske og/eller immunologiske egenskaper som er spesifikke for ICAM-4, og proteiner som er homologe med ICAM-4 fra andre arter. Slikt DNA er anvendelig ved DNA/RNA-hybridiseringsanalyser for å påvise cellers kapasitet til å syntetisere ICAM-4. Som en annen serie av eksempler muliggjør kunnskap om DNA og aminosyresekvensene for ICAM-4 dannelse, ved hjelp av rekombinante midler, av ICAM-4-varianter, slik som hybride fusjonsproteiner (iblant referert til som "immunoadhesjoner") som er kjennetegnet ved tilstedeværelse av ICAM-4-proteinsekvenser og immunglobulin-tung kjede-konstante områder og/eller hengselsområder. Se Capon et al., Nature, 337:525-531

(1989); Ashkenazi et al-, P.N.A.S. (USA), 88:10535-10539

(1991); og PCT WO 89/02922, publisert 6. april 1989. ICAM-4-variant-fusjonsproteiner kan f.eks. også inkludere utvalgte, ekstracellulære domener av ICAM-4 og deler av andre celleadhesj onsmolekyler.

DNA som beskrives i forbindelse med oppfinnelsen tillater også identifikasjon av utranslaterte DNA-sekvenser som spesifikt fremmer ekspresjon av polynukleotider operativt bundet til promotorområdene. Identifikasjon og anvendelse av slike promotorsekvenser er spesielt ønskelige i tilfeller, f.eks. genoverføring, som spesifikt kan fordre heterolog genekspresjon i et begrenset, neuronalt miljø. I forbindelse med oppfinnelsen anvendes det også vektorer som omfatter promotorer, så vel som kimære genkonstruksjoner hvori promotoren er operativt bundet til en heterolog polynukleo-tidsekvens og et transkripsjonstermineringssignal.

Idiotypene av anti-ICAM-4-monoklonale antistoffer som anvendes i forbindelse med foreliggende oppfinnelse er representative for, slike molekyler og kan etterligne naturlige bindingsproteiner (peptider og polypeptider) gjennom hvilke ICAM-4-intercellulære og intracellulære aktiviteter moduleres, eller ved hjelp av hvilke ICAM-4 modulerer intercellulære og intracellulære hendelser. Alternativt kan de representere nye klasser av modulatorer av ICAM-4-aktiviteter. Anti-idiotypiske antistoffer kan i sin tur representere nye klasser av biologisk aktive ICAM-4-ekvivalenter. In vitro-analyser for identifikasjon av antistoffer eller andre forbindelser som modulerer aktiviteten av ICAM-4, kan f.eks. involvere immobilisering av ICAM-4 eller en naturlig ligand som ICAM-4 binder seg til, påvisbar merking av den ikke-immobiliserte bindingspartner, inkubasjon av bindingspartnerne sammen og bestemmelse av virk-ningen av en testforbindelse på mengden av bundet markør, hvori en reduksjon av markør bundet i nærvær av testforbindelsen, sammenlignet med mengden av markør bundet i fravær av testforbindelsen, indikerer at testmidlet er en inhibitor av ICAM-4-binding.

DNA-sekvensinformasjonen som er tilveiebrakt i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, muliggjør også utvikling, ved hjelp av homologe rekombinasjons- eller "knockout"-strategier [se f.eks. Kapecchi, Science, 244:1288-1292 (1989)], av gnagere som ikke uttrykker et funksjonelt ICAM-4-protein, eller som uttrykker en ICAM-4-proteinvariant. Slike gnagere er anvendelige som modeller for undersøkelse av aktivitetene av ICAM-4 og ICAM-4-modulatorer in vivo.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det er blitt beskrevet identifikasjon av et gnager-ICAM-kodende DNA som på dette tidspunkt syntes å være rottehomologen av humant ICAM-R, og anvendelse av dette DNA for å konstruere og uttrykke DNA som koder for glutation-S-transferasefusjonsproteiner. Den detaljerte beskrivelse av hvordan dette gnager-DNA ble identifisert, kan finnes i eksempel 1. Når mer av gnager-ICAM-kodingssekvensen ble identifisert, fremgikk det at gnager-ICAM-DNA ikke kodet for en rotte-typehomolog av humant ICAM-R, men i realiteten kodet for et nytt ICAM-polypeptid betegnet ICAM-4. For å vurdere hendelsene som førte til identifikasjonen av ICAM-4, tilveiebringes en kronologi som etterfølges av en detaljert beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse.

Det ble identifisert en første gnager-genomisk ICAM-4-sekvens som kodet for et område som var homologt med domene 2 (heri SEQ ID NO: 3, av humant ICAM-R (heri SEQ ID NO: 4).

Det ble også identifisert et andre, overlappende, genomisk DNA (heri SEQ ID NO: 5) som kodet for både domene 2-området av SEQ ID NO: 3 og sekvenser for ICAM-1. Ved anvendelse av SEQ ID NO: 3 som en probe ble det identifisert et gnagermilt-cDNA (heri SEQ ID NO: 6) som kodet for domener 2 til 5, så vel som et femte domene som ikke tidligere var observert som et ICAM-domene. På dette tidspunkt syntes disse nyidentifiserte gnager-DNA å kode for en gnagerhomolog av humant ICAM-R, men linjeoppstilling av 3<1->områder av disse DNA med andre ICAM viste seg vanskelig.

Den etterfølgende isolasjon av en 1 kb cDNA-klon fra et rottemiltbibliotek og amplifikasjon av et RT-PCR-fragment indikerte at en del av både cDNA og de genomiske kloner ikke var sekvensert. Et annet RT-PCR-amplifikasjonsprodukt (SEQ ID NO: 7) bekreftet denne utelatelse. Det ble bestemt at et fragment med 177 bp ble utskåret fra de genomiske og cDNA-kloner ved EcoRI-spaltning av klonene for å isolere disse sekvenser fra A-fag for DNA-sekvenseringsundersøkelser. En ny analyse av SEQ ID NO: 5 og 6 i lys av disse andre sekvenser tillot identifikasjon av mer nøyaktige og fullstendige sekvenser for de opprinnelig isolerte, genomiske og cDNA-kloner, presentert i korrekt form heri som SEQ ID NO: 8 og 9.

For å identifisere en komplett kodingssekvens for

ICAM-4 ble et rottehjerne-cDNA (SEQ ID NO: 10) isolert, og 5'-endesekvensen ble bestemt ved 5'-hurtig amplifikasjon av cDNA-ender (5'-RACE), amplifikasjonsproduktet vist i SEQ ID NO: 11. Kombinasjon av informasjon fra RT-PCR-klonen (SEQ ID NO: 7), hjerne-cDNA (SEQ ID NO: 10) og RACE-amplifikasjonsproduktet (SEQ ID NO: 11) tillot identifikasjon av den komplette kodingssekvens for ICAM-4 (SEQ ID NO: 1).

Foreliggende oppfinnelse illustreres således ved hjelp av de følgende eksempler. Nærmere bestemt angår eksempel 1 utvikling av en innfangelsesanalyse for bestemmelse av konsentrasjonen av oppløselig ICAM-4 i et spesielt fluid. Eksempel 2 anvender innfangelsesanalysemetoden for å bestemme ICAM-4-konsentrasjonen i serum hos slagpasienter. Eksempel 3 angår bestemmelse av ICAM-4-transkripsjon i en rotteepilepsi-modell.

Eksempel 1

Innfangelsesanalyseutvikling

Seks monoklonale antistoffer ble testet i forskjellige kombinasjoner for deres evne til å innfange og påvise oppløselig ICAM-4 i løsning. Analysen, som beskrevet nedenfor, ble etablert for å evaluere nivåer av oppløselig ICAM-4 i humane fluider i forhold til normale tilstander og sykdoms t i1st ander.

Antistoff 1791 ble belagt på 11 Immulon" 4 (Dynatech) 96-brønners plater ved 3 ug/ml, 125 ul/brønn, i 2 timer ved 37 °C. Antistoffløsningen ble fjernet ved avsuging, og brøn-nene ble blokkert i 30 minutter ved romtemperatur med 300 ul blokkeringsløsning inneholdende 5% "Teleostean"-gelatin i kal-siumfritt, magnesiumfritt PBS (CMF-PBS). Blokkeringsløsningen ble fjernet ved avsuging, 100 ul prøvefluid fortynnet i "Omni"-fortynningsmiddel (CMF-PBS, 1% gelatin og 0,05% "Tween" 20) ble tilsatt til hver brønn, og blandingen ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter. Platene ble vasket tre ganger med PBST (CMF-PBS, 0,05% "Tween" 20). Antistoff 179H ble biotinylert ved 1,5 mg/ml ved anvendelse av NHS-LC-biotin (Pierce) ved å følge fabrikantens foreslåtte protokoll, fortynnet 1:2000 og tilsatt til brønnene (100 ul/brønn). Den resulterende blanding ble inkubert i 30 minutter ved 37 °C, og platene ble vasket tre ganger med PBST. Streptavidin-HRP (Pierce) ble tilsatt (100 ul, 0,25 ug/ml) til hver brønn, og denne blanding ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter. Platene ble vasket fire ganger med PBST før tilsetning av 100 pl tetrametylbenzidin (Sigma) (10 mg/ml stamløsning i DMSO) fortynnet 1:100 i bufret substrat (13,6 g/l natriumacetattrihydrat, pH ble justert til 5,5 med 1 M sitronsyre, og 150 ul/l 30% hydrogenperoksid ble tilsatt like før fremkalling). Reaksjonen ble tillatt å ut-vikle seg i 30 minutter ved romtemperatur i mørke, hvoretter reaksjonen ble stanset med tilsetning av 50 ul/brønn 15% H2S04. Absorbansen ble avlest ved 450 nm.

Resultatene indikerte at analysen var i stand til å påvise oppløselig HuICAM-4 Dl-3-rekombinant protein ved en konsentrasjon så lav som 5-10 ng/ml, idet den lineære del av kurven er i området 10-100 ng/ml. Ingen kryssreaktivitet med HuICAM4 D4-8 ble observert når dette proteinområde ble testet ved 1 og 10 ug/ml.

Eksempel 2

Bestemmelse av oppløselig ICAM- 4 i serum fra slagpasienter

For å vurdere rollen til ICAM-4 ved neurologiske syk-dommer og tilstander ble serum fra 28 pasienter med akutt slag og 20 unge, friske frivillige (ikke alderstilpassede) analys-ert som beskrevet ovenfor med hensyn til forskjeller i serum-konsentrasjon av oppløselig ICAM-4.

Resultatene indikerte at serum fra de friske frivillige ikke hadde noe påvisbart nivå av ICAM-4. 20 av 28 akutte slagpasienter hadde imidlertid påvisbare nivåer av oppløselig ICAM-4. Signalet fra de positive slagpasienter tilsvarte et område på 5-38 ng/ml av standarden (oppløselig ICAM-4 Dl-3-

rekombinant protein).

Eksempel 3

ICAM- 4- mRNA- nivåer i hippocampus i en rottemodell for epilepsi

Nivåer av uttrykt rotte-ICAM-4-mRNA ble bestemt i hippocampus fra rotter behandlet på en måte som skaper en rottemodell med oppflammende epileptogenese [Lothman et al., Brain Res. 360:83-91 (1985)]. I modellen stimuleres rottehip-pocampus med en serie subkonvulsive, elektriske sjokk gjennom en elektrode implantert i området av hjernen som gradvis ut-løser alvorlige atferdsmessige anfall. Den oppflammende prosess involverer tolv stimuleringer pr. dag administrert annen hver dag i åtte dager. Når den er fullt ut oppflammet, kan en enkel stimulering utløse atferdsmessige anfall og histologiske endringer som er lignende human epilepsi. Fullt ut oppflammede rotter mottok to stimuleringer pr. dag i løpet av to uker, og dyrene ble avlivet 24 timer etter den siste stimulering. Hippocampus ble fjernet og dissekert for RNA-fremstilling.

Totalt RNA ble fremstilt fra hver prøve ved anvendelse av guanidin/fenol/kloroformekstraksjonsprosedyren [Chomezynski og Sacchi, Anal. Biochem. 162:156- 159 (1987)]. RNA ble separert på denaturerende formaldehyd-agarosegeler, overført til nylonmembraner og hybridisert med radiomerket rotte-ICAM-4 og glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase- (GAPDH) spesifikke DNA-prober. GAPDH er et basalt uttrykt gen vanlig anvendt som en kontroll for å påvise felt-til-felt-variasjon av mengden av RNA applisert på en gel. Svingningene i forholdet ICAM-4/GAPDH fortolkes som endringer i nivået av ICAM-4-ekspresjon. Hybridiserende bånd for ICAM-4 og GAPDH ble kvan-tifisert med et fosforavbildningsmiddel, og et forhold ICAM-4/GAPDH ble bestemt.

Forholdet ICAM-/GAPDH var signifikant høyere i kon-trolldyrene som ikke var oppflammet (n=5) sammenlignet med den oppflammede testgruppe (n=5), hvilket antyder at ICAM-4 var nedregulert som en konsekvens av oppflammingsprosessen. Det bør imidlertid bemerkes at kontrollgruppen ikke gjennomgikk noen simuleringsbehandling slik at muligheten eksisterer for at ICAM-4-mRNA-nivåer ble modulert som respons på den kirur-giske behandling forbundet med oppflamming.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for screening for neuropatologi, karakterisert ved at den omfatter trinnene: a) en fluidprøve erholdes fra et første individ; b) prøven bringes i kontakt med et antistoff som er spesifikt immunreaktivt med ICAM-4; c) ICAM-4/antistoffbindingen i prøven kvantifiseres; og d) ICAM-4/antistoffbindingen i individet sammenlignes med bindingen i et andre individ kjent for ikke å være neuropatologisk.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fluidprøven er serum.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fluidprøven er cerebro-spinalfluid.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ICAM-4/antistoffbind-ingen kvantifiseres ved hjelp av radioimmunanalyse (RIA).

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ICAM-4/antistoffbind-ingen kvantifiseres ved hjelp av enzymbundet immunosorbentana-lyse (ELISA).