Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

NO314267B1 - Anvendelse av ekspresjonskassett i multigensystemer, ekspresjonskassett, rekombinant vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av enblanding av eksogeneproteiner, fremgangsmåte for selektiv biokjemisk oksydasjon, samtfremgangsmåtefor osydas - Google Patents

Anvendelse av ekspresjonskassett i multigensystemer, ekspresjonskassett, rekombinant vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av enblanding av eksogeneproteiner, fremgangsmåte for selektiv biokjemisk oksydasjon, samtfremgangsmåtefor osydas Download PDF

Info

Publication number
NO314267B1
NO314267B1 NO19904791A NO904791A NO314267B1 NO 314267 B1 NO314267 B1 NO 314267B1 NO 19904791 A NO19904791 A NO 19904791A NO 904791 A NO904791 A NO 904791A NO 314267 B1 NO314267 B1 NO 314267B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
conversion
expression cassette
pgbscc
proteins
progesterone
Prior art date
Application number
NO19904791A
Other languages
English (en)
Other versions
NO904791D0 (no
NO904791L (no
Inventor
Herman Slijkhuis
Gerardus Cornelis Maria Selten
Eric Bastiaan Smaal
Original Assignee
Roussel Uclaf
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roussel Uclaf filed Critical Roussel Uclaf
Publication of NO904791D0 publication Critical patent/NO904791D0/no
Publication of NO904791L publication Critical patent/NO904791L/no
Publication of NO314267B1 publication Critical patent/NO314267B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/02—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12Y106/02004—NADPH-hemoprotein reductase (1.6.2.4), i.e. NADP-cytochrome P450-reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 16 (17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 17 (20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J21/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having an oxygen-containing hetero ring spiro-condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C07J21/005—Ketals
    • C07J21/006—Ketals at position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/005—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of only two carbon atoms, e.g. pregnane derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0015—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0023—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa substituted in position 16
    • C07J5/003—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group including 16-alkylidene substitutes
    • C07J5/0038—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group including 16-alkylidene substitutes by an alkyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/0015—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa
    • C07J7/002—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/004—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa
    • C07J7/0045—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/008—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms substituted in position 21
    • C07J7/009—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms substituted in position 21 by only one oxygen atom doubly bound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12N9/0042—NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0095—Oxidoreductases (1.) acting on iron-sulfur proteins as donor (1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01053—3-Alpha (or 20-beta)-hydroxysteroid dehydrogenase (1.1.1.53)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15004—Steroid 11-beta-monooxygenase (1.14.15.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15006—Cholesterol monooxygenase (side-chain-cleaving) (1.14.15.6), i.e. cytochrome P450scc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C12Y114/99009—Steroid 17-alpha-monooxygenase (1.14.99.9), i.e. cytochrome-P450-steroid-17-alpha-hydroxylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y118/00—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18)
    • C12Y118/01—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.18.1)
    • C12Y118/01002—Ferredoxin-NADP+ reductase (1.18.1.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Genetisk forandrede vertsceller som inneholder nye ekspresjonskassetter er fremstilt og som er i stand til å utføre biokjemiske oksydasjoner av steroider. Oksydasjonen er spesielt utført med celler som har fått DNA innført og som koder for protein som inngår i den biologiske reaksjonsvei fra kolesterol til hydrokortison. Egnede vertsceller omfatter arter av Bacillus, Saccharomyces eller Kluyveromyces. De nye vertscellene er velegnet for mikrobiologiske oksydasjoner av kolesterol, pregnenolon, progesteron, 17a-hydroksyprogesteron, og cortexolon, som er mellomprodukter i nevnte biologiske reaksjonsvei. De nye ekspresjonskassettene er også.anvendbare i den endelige produksjonen av et multigensystem for en ett- trinns-overføring av kolesterol til hydrokortison.

Description

Oppfinnelsen omhandler en fremgangsmåte for biokjemisk oksydasjon
for fremstilling av farmasøytiske anvendbare steroider. Oppfinnelsen omfatter anvendelse av ekspresjonskassett i multigensystemer, ekspresjonskassett, rekombinant vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av en blanding av eksogene proteiner, fremgangsmåte for selektiv biokjemisk oksydasjon, samt fremgangsmåte for oksydasjon. 11 p,17a,21-trihydroksy-4-pregnen-3,20-dion (hydrokortison) er et viktig farmasøytisk steroid, som er benyttet p.g.a. dets farmakologiske egenskaper som kortikosteroid og som start-forbindelse for fremstilling av tallrike anvendbare steroider, særlig andre kortikosteroider. Hydrokortison blir laget i binyrebarken til virveldyr og ble opprinnelig fremstilt, bare i små mengder, ved hjelp av en arbeids-krevende ekstraksjon fra binyrebarkvev. Først etter klargjøring av strukturen ble nye fremstillingsmåter utviklet, karakterisert ved en kombinasjon av kjemisk syntese og mikrobiologiske omdannelser. Bare fordi utgangsmaterialene som er benyttet slik som steroler, gallesyrer og sapogeniner (detergent) er tallrike og billige, tillater de nåværende fremgangsmåter et mindre dyrt produkt, men disse er fremdeles heller kompliserte. Flere muligheter ble foreslått for å forbedre de foreliggende fremgangsmåtene, og også biokjemiske fremgangsmåter er blitt forsøkt.
Ett forsøk tok sikte på å ha et passende startssteroid som ble overført i et in vitro biokjemisk system ved bruk av isolerte binyrebarkproteiner som er kjent å være ansvarlige for den enzymatiske omdannelse in vivo av steroider til hydrokortison. Imidlertid, syntes den vanskelige isolering av proteinene og den høye prisen på de nødvendige kofaktorene å være til hinder for en økonomisk tiltrekkende storskalafremgangsmåte. En annen fremgangsmåte var å holde de katalyserende proteinene i deres naturlige miljø og å ha binyrebarkceller til å lage det ønskede hydrokortison i en cellekultur. Men p.g.a. lav produksjon i cellene, viste det seg i praksis å være umulig å gjøre en slik biokjemisk fremgangsmåte økonomisk tiltrekkende.
In vivo-fremqangsmåten i binyrebarken til pattedyr og andre virveldyr består av en biokjemisk reaksjonsvei som starter med kolesterol og via forskjellige mellomforbindelser lager til slutt hydrokortison (se figur 1). Åtte proteiner er direkte innblandet i denne reaksjonsvei, fem av disse er enzymer, av disse er fire cytokrom P4so-enzymer, og de andre tre er elektronoverførende proteiner.
Det første trinn i omdannelsen av kolesterol til 3p-hydroksy-5-pregnen-20-en (pregnenolon). I denne overføring, en mono-oksygenasereaksjon, er tre proteiner innblandet: sidekjedekløyvende enzym (P45oSCC, et hem-Fe-inneholdende protein), adrenodoxin (ADX, et FE2S2-inneholdende protein) og adrenodoxin-reduktase (ADR, et FAD-inneholdende protein). Foruten kolesterol som substrat krever reaksjonen dessuten molekylært oksygen og NADPH. Pregnenolon blir deretter overført ved dehydrogenering/isomerisering til 4-pregnen-3,20-dion (progesteron). Denne reaksjon, katalysert av proteinet 3|3-hydroksysteroiddehydrogenase/isomerase (3|3-HSD), krever pregnenolon og
NAD+.
For å oppnå hydrokortison blir progesteron deretter hydroksylert i tre stillinger hvis overføringer er katalysert av mono-oksygenaser. I overføringen av progesteron til 17a-hydroksyprogesteron er to proteiner innblandet: steroid 17a-hydroksylase (P45o17a, et hem-Fe-inneholdende protein) og NADPH cytokrom P4so-reduktase (RED, et FAD- og FMN-inneholdende protein). Reaksjonen bruker progesteron, molekylært oksygen og NADPH.
For overføringen av 17a-hydroksyprogesteron til 17a,21-dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion (cortexolon), er også to proteiner nødvendige: steroid-21-hydroksylase (P4soC21, et hem-Fe-inneholdende protein) og det før-nevnte protein RED. Reaksjonen forbruker 17a-hydroksyprogesteran, molekylært oksygen og
NADPH.
I overføringen av cortexolon til hydrokortison, er tre proteiner innblandet: steroid 11p-hydroksylase (P450IIP), et hem-Fe-inneholdende protein, og de ovenfor nevnte proteinerm ADX og ADR.
Som beskrevet ovenfor er cytokrom P4so-proteiner enzymer som er vesentlig for den biokjemiske overføring av kolesterol til hydrokortison. Disse enzymer tilhører en større gruppe av cytokrom P450 proteiner (eller kort P4so-proteiner). De er tilstede i prokaryoter (forskjellige bakterier) og eukaryoter (gjær, sopp, planter og dyr). I pattedyr er høye nivåer av P45o-proteiner funnet i binyrebarken, ovariet, testikkel og lever. Mange av disse proteiner er blitt renset og er godt karakterisert nå. Deres spesifikke aktivitet er blitt bestemt. Nylig har et antall oversiktsartikler blitt publisert over dette emnet, slik som K. Ruckpaul og H. Rein (eds), "Cytochrome P450" og P.R. Ortiz de Motellano (ed.) "Cytochrome P450, structure, mechanism and biochemistry". Cytokrom P45o-proteiner er karakterisert ved deres spesifikke absorpsjonsmaksimum ved 450 nm etter reduksjon med karbonmonooksyd. I prokaryote organismer er P45o-proteinene enten membran-bundet eller cytoplasmatiske. Så langt som de bakterielle P45o-proteinene er blitt studert i detalj (f.eks. P45omeg og P45ocam) er det blitt vist at en ferredoxin og en ferredoxinreduktase er innblandet i hydroksyleringsaktiviteten. For eukaryote organismer, har to typer av P45o-proteiner, I og II blitt beskrevet. Deres to forskjeller består i: 1. subcellulær lokalisasjon, type I er lokalisert i mikrosomalfraksjonen og type II er lokalisert i den indre membranen til mitokondria; 2. måten elektronene er overført fra P45o-proteinet. Type I er redusert ved NADPH via en P45o-redukstase, mens type II er redusert ved NADPH via en ferredoxin-reduktase (f.eks. adrenodoxinreduktase) og en ferredoxin (f.eks. adrenodoxin).
Ifølge EP-A-0281245 kan cytokrom P450-enzymer bli laget fra Sfreptomyces-arter og benyttet for hydroksyleringen av kjemiske forbindelser.
Enzymene er benyttet i isolert form, som er en heller omstendelig og dyr fremgangsmåte.
JP-A-62236485 (Derwent 87-331234) omtaler at det er mulig å innføre i Saccharomyces cerevisjae-genene til levercytokrom P4so-enzymer og å utrykke dem til enzymer som kan bli benyttet for sin oksydasjonsaktivitet.
Imidlertid, er det i de ovenfor nevnte referanser ingen indikasjon for bruken av cytokrom P45o-enzymer for å lage steroidforbindelser.
Oppfinnelsen omhandler en serie ekspresjonskassetter (enheter) for produksjon av proteiner som er nødvendige i konstruksjonen av et multigensystem for ett-trinns overføring av billige steroidstartforbindelser til mer sjeldne og dyre endeprodukter, der slik overføring blir utført i et naturlig system via en serie av enzymkatalyserte og kofaktorformidlede overføringer, slik som produksjonen av hydrokortison fra kolesterol. Ekspresjonskassettene i oppfinnelsen er anvendbare til den endelige produksjon i multigensystemer for å utføre disse flertrinns-omdannelsene.
Følgelig, er i én henseende, oppfinnelsen rettet mot en anvendelse av en ekspresjonskassett i multigensystemer for utførelse av flertrinnsomdannelser som gjengitt i figur 1 hvor ekspresjonskassetten er operable i en ikke-pattedyr rekombinant vert, kjennetegnet ved at ekspresjonskassetten omfatter en heterolog kodende DNA-sekvens som koder for et protein som er funksjonelt, alene eller sammen med ett eller flere tilleggsproteiner, i å katalysere et oksydasjonstrinn i den biologiske reaksjonsvei for omdannelse av kolesterol til hydrokortison, hvis trinn er valgt fra gruppen bestående av : omdannelse av kolesterol til pregnenolon;
omdannelse av pregnenolon til progesteron;
omdannelse av progesteron til 17cc-hydroksyprogesteron;
omdannelse av 17a-hydroksyprogesteron til cortexolon; og omdannelse av cortexolon til hydrokortison,
og de korresponderende kontrollsekvenser som er effektive i nevnte vert.
Ekspresjonskassettene i oppfinnelsen, operabel i en ikke-pattedyr
rekombinant vert omfattende en heterolog kodende DNA-sekvens som koder for et protein, som er funksjonelt, alene eller sammen med en eller flere tilleggsproteiner i å katalysere et oksydasjonstrinn i den biologiske reaksjonsvei for omdannelse av kolesterol til hydrokortison, hvis trinn er valgt fra gruppen bestående av: omdannelse av kolesterol til pregnenolon;
omdannelse av pregnenolon til progesteron;
omdannelse av progesteron til 17a-hydroksyprogesteron;
omdannelse av 17a-hydroksyprogesteron til cortexolon; og omdannelse av cortexolon til hydrokortison,
og de korresponderende kontrollsekvenser som er effektive i nevnte vert, kjennetegnet ved at proteinet er valgt fra gruppen bestående av: sidekjede-kløyvende enzym (P45oSCC); adrenodoxin (ADX); adrenodoxinreduktase (ADR); 3p-hydroksysteroiddehydrogenase/isomerase (3p-HSD); steroid-17a-hydroksylase (<p>45o17cc); NADPH cytokrom P45o-reduktase (RED); steroid-21-hydroksylase P450C21); og steroid-11 |3-hydroksylase (P4so11p), og at det heterologe DNA koder for i det minste et tilleggsprotein av den nevnte gruppe proteiner.
I andre henseende, er oppfinnelsen rettet mot rekombinante vertsceller omfattende celler av mikroorganismer, planter eller ikke-pattedyr dyr inneholdende en ekspresjonskassett med heterologt DNA, kjennetegnet ved at ekspresjonskassetten er en definert i ethvert av kravene 10-16, og mot fremgangsmåter for å produsere de ovenfor nevnte eksogene proteiner (enzymer) og for å bruke disse enzymene for oksydasjon, og til fremgangsmåter for å bruke nevnte vertsceller for spesifikke oksydasjoner i en kulturblanding.
Kort beskrivelse av figurene
Forkortelser benyttet i alle figurer: Ri, EcoRI: H, Hindlll: Sc, Seal: P, Pstl; K, Kpnl: St, Stul; Sp, Sphl; X, Xbal: N, Ndel: S, Smal: Ss, Sstl; Rv, EcoRV: Si, Sacl; B, BamHI: Sn, Sadl: Sal, SaM; Xh, XhoJ; Pv, Pvull: Bg, BgMI og M, Mlul. Figur 1 viser en skjematisk oversikt av proteinene som er innblandet i de etterfølgende trinnene i overføringen av kolesterol til hydrokortison slik det skjer i binyrebarken i pattedyr. Figur 2 viser konstruksjonen av plasmid pGBSCC-1. P450SCC-sekvensene er indikert i skravert felt (\^/// A ). Figur 3 viser innsettingen av et syntetisk avledet Pstl/ Hindlll-fragment som inneholder 5'-P45oSCC-sekvensene i plasmidet pTZ18R for å oppnå plasmidet pTZ "synlead" (syntetisk sekvens).
Figur 4 viser konstruksjonen av en full-lengde P450SCCCDNA
av syntetisk ) og ved cDNA kloning fra P45oSCC<a>sekvenser i pTZ18R for å oppnå pGBSCC-2.
Figur 5 viser den komplette nukleotidsekvensen til plasmid pBHA-1.
Figur 6 er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av pGBSCC-3. P45oSCCcDNA-sekvenser fra plasmid pGBSCC-2 ble innført i Bacillus/ E. coli skyttel (felles) plasmid pBHA-1. Utfylte felt er som indikert i teksten til figur 4. Figur 7 viser innføringen av et Ndel-restriksionssete i kombinasjon med et ATG startkodon før P45oSCC-modningssete i pGBSCC-3 for å oppnå pGBSCC-4. Figur 8 viser et fysisk kart av pGBSCC-5 som er oppnådd ved å fjerne E coji-sekvenser fra plasmidet pGBSCC-4. Figur 9 viser et Westem-blot analysert med antistoffer mot P450SCC, og viser P450SCC-kspresjon av plasmid pGBSCC-5 innført i B. subtilis (spor c) og B. licheniformis (spor f). Kontrollekstrakter fra B. subtilis og B. licheniformis er vist hhv. i spor a og d. Til sammenligning ble også renset binyrebark P450SCC (30 ng) tilsatt disse kontrollekstraktene (hhv. spor b og e). Figur 10 er en skjematisk representasjon av konstruksjonen til pGBSCC-17. De kodende P450SCC-DNA-sekvensene fra plasmid pGBSCC-4 ble innført i E. coli-ekspresionsvektoren pTZ18RN. P45oSCC-sekvensene er antydet i et felt
Figur 11 viser P4SoSCC-produksjon av pGBSCC-17 i E. coli JM101.
(a) SDS/PAGE og Coomassie brilliant blåfarging av de cellulære protein-fraksjonene (20 ul) laget fra E. coli-kontrollarten (spor 3) og E. coli-transformerte celler SCC-301 og 302 (hhv. sporene 1 og 2). 400 ng renset bovin P45oSCC (spor 4) er vist til sammenligning. (b) Western-blot-analyse undersøkt med antistoffer mot P45oSCC i cellulære proteinfraksjoner (5 (il) laget fra kontrollarten E. coli JM101 (spor 2) og fra E. coli transformanter SCC-301 (spor 3) og SCC-302 (spor 4). 100 ng renset bovin P450SCC (spor 1) er vist i sammenligning.
Figur 12 viser konstruksjonen av plasmid pUCG418.
Figur 13 viser konstruksjonen av gjærekspresjonsvektoren pGB950 ved innsetting av promotoren og terminatoren med multiple kloningsseter (pm) fra laktase i pUCG418. For å få pGBSCC-6 er et syntetisk Sall/ Xhol-fraament som inneholder et ATG-startkodon og kodonene for de første åtte aminosyrer av P450SCC innsatt i pGB950. Figur 14 er en skjematisk fremstilling som viser konstruksjonen av gjær P450SCC-ekspresjonskassetten pGBSCC-7. Figur 15 viser et Western-blot analysert med antistoffer spesifikke for proteinet P450SCC.
Blot A inneholder ekstrakter oppnådd fra Saccharomvces cerevisiae 237-10B transformert med pGBSCC-10 (spor 1); fra S. cerevisiae 273-1 OB som kontroll (spor 2); fra Kluvveromvces lactis CBS 2360 transformert med pGBSCC-7 (spor 3) og fra K. lactis CBS 2360 som kontroll (spor 4).
Blot B inneholder ekstrakter oppnådd fra K. lactis CBS 2360 som kontroll (spor 1) og K. lactis CBS 2360 transformert med pGBSCC-15 (spor 2), med pGBSCC-12 (spor 3) eller med pGBSCC-7 (spor 4).
Blot C inneholder ekstrakter oppnådd fra S. cerevisiae 273-1 OB som kontroll (spor 1), transformert med pGBSCC-16 (spor 2) eller med pGBSCC-13 (spor 3). Figur 16 er en skjematiske fremstilling av konstruksjonen fra gjasr-ekspresjonsvektoren pGBSCC-9 som inneholder isocytokrom Cl (cyc-1) promotoren fra S. cerevisiae.
Figur 17 viser et konstruksjonsdiagram av P45oSCCcDNA som
inneholder ekspresjonsvektoren pGBSCC-10 for S. cerevisiae.
Figur 18 viser konstruksjonen av P45oSCC-ekspresjonsvektoren pGBSCC-12 der et syntetisk fremstilt DNA-fragment som koder for pre-P45oSCC-sekvensen ( tøfiM ) er innsatt 5' for den kodende sekvensen av moden P450SCC. Figur 19 viser konstruksjonen av pGBSCC-13. Denne P450SCC-espresjonskassetten for S. cerevisiae inneholder pre-P4soSCCcDNA-sekvensen plassert 3' for cyc-1-promotoren til S. cerevisiae. Figur 20 viser en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av plasmidene pGBSCC-14 og pGBSCC-15. Den sistnevnte inneholder P450SCC kodende sekvensen i leseramme med cytokromoksydase VI pre-sekvensen ( \//////%\. Figur 21 viser konstruksjonen av plasmidet pGBSCC-16. I dette plasmid er cytokromoksydase VI presekvensen (\$ y // fo av S. cerevisiae bundet til den kodende P450SCC-sekvensen som er plassert 3' for cyc-1-promotoren. Figur 22 viser de fysiske kart av plasmidene pGB17a-1 (A) og pGB17v-2
(B) som inneholder hhv. 3' 1,4 kb fragmentet og 5' 345 bp fragmentet \ W ////// A til P45o17acDNA. I pGB17a-3 (C) som inneholder den fulle lengden av
P45o17acDNA-sekvensen, er posisjonen for ATG startkodonet indikert.
Figur 23 viser mutasjonen av pGB17a-3 ved in vitro-muta<q>enese. Det oppnådde plasmid pGB17a-4 inneholder et Sall-restriksjonssete etterfulgt av optimale gjærtranslasjonssignaler like oppstrøms for ATG-startkodonet. Figur 24 er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av gjær P45017a-ekspresjonskassetten pGB17a-5. Figur 25 viser mutasjonen av pGB17a-3 ved in vitro-mutaaenese. Det oppnådde plasmid pGB17a-6 inneholder et Ndel restriksionssete ved ATG-startkodonet. Figur 26 er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av pGB17a-7. P45o17acDNA-sekvenser fra plasmid pGB17ot-6 ble innført i Bacillus/ E. coli skyttel (felles) plasmid pBHA-1. Figur 27 viser et fysisk kart av pGB17a-8 som er oppnådd ved å fjerne E. coli-sekvenser fra plasmidet pGB17cc-7. Figur 28 viser fysiske kart av pGBC21-1 og 2, som inneholder hhv. 1,53 Kb 3'-P450C21cDNA og et 540 bp 5'-P45oC21cDNA EcoRI-fragment, i EcoRI-setet i kloningsvektoren pTZ18R. Figur 29 viser in vitro-muta<g>enesen ved polymerasekjedereaksjonen (PCR) i pGBC21-2 for å innføre EcoRV og Ndel-restriksionsseter oppstrøms for P450C21 ATG-startkodonet, etterfulgt av molekylær kloning i kloningsvektoren pSP73 for å få pGBC21-3. Figur 30 er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av pGBC21-4, som inneholder full-lengden P450C21 cDNA-sekvensen. Figur 31 er en skjematisk fremstilling av konstruksjonen pGBC21-5. P45oC21cDNA-sekvensen fra plasmid pGBC21-4 ble innsatt i Bacillus/ E. coli skyttel (felles) plasmid pBHA-1. Figur 32 viser et fysisk kart av pGBC21-6 som er oppnådd ved å fjerne E. coli-sekvenser fra plasmidet pGBC21-5. Figur 33 viser mutasjonen av pGBC21-2 ved in vitro-mutagenese. Det oppnådde plasmidet pGBC21-7 inneholder et Sall-restriksionssete etterfulgt av optimale gjærtranslasjonssignaler like oppstrøms for ATG-startkodonet. Figur 34 viser konstruksjonen av pGBC21-8, som inneholder et full-lengde P45oC21cDNA med modifiserte flankerende restriksjonsseter som passer for kloning i gjærekspresjonsvektoren. Figur 35 er en skjematisk fremstiling som viser konstruksjonen av gjær P45oC21 -ekspresjonskassetten pGBC21 -9. Figur 36 viser in vitro-muta<g>ensen ved polymerasekjedereaksjonen i pGB11p-1 for å innføre passende flankerende restriksjonsseter og et ATG-startkodon til den full-lengde P45o1ipcDNA-sekvensen, etterfulgt av molekylær kloning i Bacillus/ E. coli skyttlevektoren pBHA-1 for å oppnå plasmidet pGB1ip-2. Figur 37 viser in vitro-mutagenesen ved polymerasekjedereaksjonen i pGB11 p-1 for å innføre passende flankerende restriksjonsseter og et ATG-startkodon til den full-lengde P45o11pcDNA-sekvensen, etterfulgt av molekylær kloning i gjæreksprepsjonsvektoren pGB950 for å få plasmidet pGB11p-4. Figur 38 er en skjematisk fremstilling av den molekylære kloningen av
ADXcDNA-sekvensen fra en bovinbinyrebarkpolyA<+>RNA/cDNA-blanding ved polymerasekjedereaksjonsmetoden. cDNA-sekvensen som koder for det modne ADX-proteinet var satt inn i de passende setene til gjærekspresjonsvektoren pGB950 for å oppnå plasmidet pGBADX-1.
Figur 39 viser et Western-blot analysert med antistoffer mot ADX, og viser
ADX-produksjon i plasmid pGBADX-1 i K. lactis CBS 2360 transformantene ADX-101 og 102 (hhv. sporene 4 og 5). Ekstrakt av kontrollert K. lactis CBS 2360 er vist i spor 3. Til sammenligning er også renset binyrebark ADX (100 ng) påsatt gelen i spor 1.
Figur 40 viser in vitro-muta<g>enesen ved polymerasekjedereaksjonen av pGBADR-1 for å innføre passende flankerende restriksjonsseter og et ATG-startkodon til full-lengde ADRcDNA-sekvensen, etterfulgt av molekylær kloning inn i gjærekspresjonsvektoren pGB950 for å få pGBADR-2.
Oppfinnelsen vedrører fremstillingen og dyrkingen av celler som er velegnet til å bli benyttet i storskalabiokjemiske produksjonsreaktorer og bruken av disse cellene for oksydasjonen av forbindelser og spesielt for produksjonen av steroider, vist i figur 1. En ombytting av trinn i en multi-trinnsreaksjon er inkludert i oppfinnelsen. Mikroorganismer er foretrukne verter, men andre celler kan også bli benyttet, slik som celler fra planter eller dyr, valgfritt benyttet i en cellekultur eller i vevet til levende transgene planter eller dyr. Cellene ifølge denne oppfinnelsen blir oppnådd ved hjelp av genetisk transformasjon (omdannelse) av passende reseptorceller, fortrinnsvis celler fra passende mikroorganismer, med vektorer som inneholder DNA-sekvenser som koder for proteinene som overfører kolesterol til hydrokortison, omfattende sidekjedekløyvende enzym (P450SCC), adrenodoxin (ADX), adreno-doxin reduktase (ADR), 3p-hydroksysteroiddehydrogenase/- isomerase (3p-HSD), steroid-17a-hydroksylase (P45o17a), NADPH cytokrom P450-reduktase (RED), steroid-21-hydroksylase (P45oC21) og steroid-11 p-hydroksylase (P45011P)- Visse vertsceller kan allerede produsere på egenhånd ett eller flere av de nødvendige proteinene i en tilstrekkelig mengde og må derfor transformeres bare med de nødvendige supplementære DNA-sekvensene. Slike mulige egne proteiner er ferredoxin, ferredoxin reduktase, P45o-reduktase, og 3p-hydroksy-steroiddehydrogenase/isomerase.
For å gjenvinne sekvensene som koder for proteiner som er ansvarlige for overføringen av kolesterol til hydrokortison er passende DNA-kilder blitt valgt. En passende kilde for å oppnå DNA som koder for alle proteinene som overfører kolesterol til hydrokortison er binyrebarkvev fra virveldyr f.eks. bovinbinyrebarkvev. Også fra forskjellige mikroorganismer kan det relevante DNA bli oppnådd, f.eks. fra Pseudomonas testosteroni, Streptomyces qriseocarneus eller Brevibacterium sterolicum for DNA som koder for 3B-hydroksysteroiddehydrogenase/isomerase og fra Curvularia lunata eller Cunnin<g>hamella blakesleeana for DNA-kodende proteiner som utfører 11 (5-hydroksylering av cortexolon. DNA-sekvensene som koder for proteinene bovin P450SCC, bovin P45011P eller et mikrobiologisk ekvivalent protein, bovinadrenodoxin, bovinadrenodoxin-reduktase, 3phydroksy-steroiddehydrogenase/isomerase av bovin eller mikrobiologisk opprinnelse, bovin P45o17a, bovin P450C2I og NADPH cytokrom P4so-reduktase av bovin eller mikrobiologisk opprinnelse, ble isolert ifølge de følgende trinnene:
1. Eukaryote sekvenser fcDNA)
a. Total RNA ble laget fra passende vev.
b. PolyA<+->inneholdende RNA ble transkribert tii dobbelttrådet cDNA og
ligert i bakteriofagvektorer.
c. Det oppnådde cDNA-bibliotek ble undersøkt ved <32>P-merkede oligomerer spesifikt for det ønskede cDNA eller ved å undersøke en isopropyl-p-D-tiogalaktopyranosid (IPTG)-indusert Iambda-gt11 cDNA-bibliotek ved bruk av et spesifikt (12<5>l-merket) antistoff. d. cDNA-innskudd i positive plakkdannende enheter (pfu's) ble innsatt i passende vektorer for å bestemme:
- den fulle lengden av cDNA ved nukleotidsekvensering.
2. Prokarvote gener a. Genomisk DNA ble laget fra en passende mikroorganisme.
b. For å oppnå et DNA-bibliotek ble DNA-fragmenter klonet inn i
passende vektorer og transformert i en passende E. coli-vert.
c. DNA-biblioteket ble undersøkt med <32>P-merkete oligomerer spesifikke for genet av interesse eller ved å undersøke et IPTG-indusert Iambda-gt11 DNA-bibliotek ved bruk av et spesifikt (<1><ø>l-merket) antistoff. d. Plasmider fra positive kolonier ble isolert og innsatte DNA-fragmenter subklonet i passende vektorer for å bestemme:
- den fullstendige lengden av genet.
Merk: Ifølge en forbedret metode, ble det spesielle cDNA (eukaryote sekvenser) eller gen (prokaryote sekvenser) ved bruk av to spesifikke oligomerer ved hjelp av metoden kjent som polymerasekjedereaksjonen (PCR) (Saiki et al., Science, 239, 487-491,1988). Deretter ble det opplagede cDNA eller DNA innsatt i de passende vektorene.
Ifølge én del av oppfinnelsen, ble passende ekspresjonskassetter laget der det heterologe DNA som ble isolert ifølge den tidligere fremgangsmåten og kodende et enzym som katalyserer et oksydasjonstrinn av reaksjonsveien i figur 1 og i det minste et tilleggsprotein i nevnte reaksjonsvei, plassert mellom passende kontrollsekvenser for transkripsjon og translasjon, som setter DNA i stand til å bli uttrykt i det cellulære miljøet i en passende vert, og tillate dannelsen av det ønskede protein eller proteiner. Etter ønske kan startkontrollsekvensene være etterfulgt av en sekresjonssignalsekvens.
Passende kontrollsekvenser er blitt innført sammen med det strukturelle DNA ved hjelp av nevnte ekspresjonskassetter. Produksjon er gjort mulig ved transformasjon av en passende vertscelle med en vektor som inneholder kontrollsekvenser som er kompatible med den relevante vert og er funksjonelt koblet til de kodende sekvensene, hvis ekspresjon er ønsket.
Alternativt, blir passende kontrollsekvenser som er tilstede i vertsgenomet benyttet. Produksjon er gjort mulig ved transformasjon av en passende vertscelle med en vektor som inneholder kodende sekvenser for det ønskede proteinet flankert av vertssekvenser som muliggjør homolog rekombinasjon med vertsgenomet på en slik måte at vertskontrollsekvensene kontrollerer riktig ekspresjonen av det innførte DNA.
Som generell forståelse, er betegnelsen kontrollsekvenser karakterisert ved alle DNA-segmenter som er nødvendige for den riktige regulering av ekspresjonen av den kodende sekvensen som er operativt bundet til, slik som operons (operatorer), enhancere (forsterkere) og, spesielt, promotorer og sekvenser som kontrollerer translasjonen.
Promotoren kan eller kan ikke være kontrollert via regulering av dets omgivelser. Passende promotorer for rokaryoter inkluderer f.eks. trp-promotoren (stimulerbar ved tryptofanmangel), lacpromotoren (stimulerbar med galaktose-analogen IPTG), B-laktamasepromotoren, og fagavledede P|_-promotoren (stimulerbar ved temperaturvariasjon). I tillegg, spesielt for ekspresjon i Bacillus. inkluderer anvendbare promotorer de for alfa-amylase, protease, Spo2, spac og 0105 og syntetiske promotorsekvenser. En foretrukket promotor er den som er avbildet i figur 5 og betegnet med "Hpall". Passende promotorer for ekspresjon i gjær inkluderer 3-fosfo-glycerat kinasepromotoren og de for andre glykolytiske enzymer, så vel som promotorer for alkoholdehydrogenase og gjærfosfatase. Også passende er promotorene for transkripsjonselongeringsfaktor (TEF) og laktase. Pattedyrekspresjonssystemer benytter generelt promotorer som stammer fra virus slik som adenovirus-promotorer og SV40 promotoren, men de inkluderer også regulerbare promotorer slik som metallotioninpromotoren, som er kontrollert ved tunge metaller eller glukokortikoidkonsentrasjon. Nåværende virusbaserte insektcelJeekspresjonssystemer er også passende, så vel som ekspresjonssystemer basert på plantecellepromotorer slik som nopalinsyntetase-promotorer.
Translasjonskontrollsekvenser inkluderer et ribosom bindingssete (RBS) i prokaryote systemer, mens i eukaryote systemer kan translasjon bli kontrollert av en nukleotid sekvens som inneholder et startkodon slik som AUG.
I tillegg til den nødvendige promotoren og translasjonskontrollsekvensene, kan en rekke av andre kontrollsekvenser, inklusive de som regulerer terminering
(f. eks., hvilket resulterer i polyadenyleringssekvenser i eukaryote systemer)
bli benyttet for å kontrollere ekspresjon. Visse systemer inneholder enhancer-elementer som er ønskelige, men som regel ikke obligatoriske for å igangsette ekspresjon.
En gruppe vektorer betegnet med pGBSCC-n, hvor "n" er ethvert tall fra 1 til 17, er spesielt utviklet for DNA som koder på P4soSCC-enzymet.
En annen gruppe vektorer betegnet med pGB17a-n, der "n" er ethvert tall fra 1 til 5, er spesielt utviklet for DNA som koder for P45017<x-enzymet.
En videre gruppe vektorer betegnet pGBC21-n, der "n" er ethvert tall fra 1 til 9, er spesielt utviklet for DNA som koder for P450C2I-enzymet.
Ennå en annen gruppe av vektorer betegnet med pGB1 ip-n, der "n" er ethvert tall fra 1 til 4, er spesielt utviklet for DNA som koder for P45o11 p-enzymet.
Ifølge et ytterligere område for oppfinnelsen har passendevertsceller blitt valgt som aksepterer vektorer beskrevet i oppfinnelsen og tillater det innsatte DNA å bli uttrykt. Når de transformerte vertscellene dyrkes, vil proteinene ansvarlige for overføringen av kolesterol til hydrokortison, opptre i cellens indre. Nærværet av det ønskede DNA kan påvises ved DNA-hybridiseringsfremgangsmåter, deres transkripsjon ved RNA-hybridisering, deres ekspresjon ved immunologiske metoder og deres aktivitet ved å måle nærværet av oksyderte produkter etter inkubasjon med startforbindelsen in vitro eller in vivo.
Transformerte mikroorganismer er foretrukne vertsceller, særlig bakterier (det er mer å foretrekke Escerichia coli og Bacillus og Stre<p>tomvces-arter) og gjær (slik som Saccharomvces og Kluvveromvces). Andre passende vertsorganismer er funnet blant planter og dyr, innbefattet insekter, der de isolerte cellene er benyttet i cellekultur, slik som COS-celler, Ci27-æller, CHO-celler, og Spodoptera frugiperda (Sfg) celler. Alternativt kan en transgen plante eller dyr bli benyttet
En spesiell type rekombinante vertsceller er de hvor enten to eller flere ekspresjonskassetter ifølge oppfinnelsen er blitt innført eller som er blitt transformert ved en ekspresjonskassett som koder for minst to heterologe proteiner, som setter cellen i stand til å lage minst to proteiner som inngår i reaksjonsveien i figur 1.
Et hovedtrekk i oppfinnelsen er at de lagede nye cellene er ikke bare i stand til å produsere proteinene som er ansvarlige for den oksydative overføring av steroider som resulterer til slutt i hydrokortison, men også for å bruke disse proteinene på stedet i den ønskede oksydative omforming av den korresponderende substratforbindelse tilsatt kulturvæsken. Steroider er foretrukne substrater. Cellene som er transformert med det heterologe DNA er spesielt velegnet til å bli dyrket med steroidene nevnt i figur 1, inklusiv andre steroler slik som p-sitosterol. Som et resultat blir oksyderte steroider laget.
Avhengig av nærværet i vertscellen av en rekke heterologe DNA som koder for proteiner som deltar i reaksjonsveien i figur 1, blir resultatet flere biokjemiske omdannelser karakterisert ved sidekjedekløyving av et sterol og/eller oksydative modifikasjoner på C11, C17, C3 og C21. Derfor er ekspresjonskassettene ifølge oppfinnelsen anvendbare til å konstruere et multigensystem som kan utføre en rekke intracellulære om-dannelser karakterisert ved de mange trinn i sekvensen avbildet i figur 1. Det kan være nødvendig å innføre i den ønskede verten, ekspresjonskassetter som koder i sin helhet for de nødvendige proteinene. I visse tilfeller, kan én eller flere av proteinene i reaksjonsveien allerede være tilstede i verten som et naturlig protein som viser den samme aktiviteten. F.eks., ferredoxin, ferredoxinreduktase og P45o-reduktase kan allerede være tilstede i verten. Under disse betingelser, må bare de gjenværende enzymer bli overført ved rekombinant transformasjon.
Som et alternativ til biokjemiske overføringer in vivo, blir proteinene som er ansvarlig for overføringen av kolesterol til hydrokortison samlet, renset så langt det er nødvendig, og benyttet for in vitro-overføring av steroider i et cellefritt system, f.eks. immobilisert på en kolonne. Alternativt, blir den mer eller mindre rensede blanding som inneholder ett eller flere enzymer i reaksjonsveien benyttet som slik for steroidomdannelse. F. eks. en vert som inneholder DNA som koder for to heterologe proteiner det være seg enzymet P450SCC og proteinet ADX nødvendig for produksjonen av pregnenolon. Til sammenligning med en vert som har bare P450SCC DNA, blir utbyttet av pregnenolon i et cellefritt ekstrakt etter tilsetning av ADR, NADPH og kolesterol betraktelig forbedret.
Den foreliggende oppfinnelse gir ekspresjonskassetter som er nødvendig for konstruksjonen av en én-trinnsproduksjonsfremgangsmåte for flere anvendbare steroider. Ved å starte fra billige og rikelig tilgjengelige startforbindelser, er den spesielt velegnet for produksjon av hydrokortison og mellomliggende (intermediære) forbindelser. Oppfinnelsen gjør tradisjonelle dyre kjemiske reaksjoner gammeldagse. Intermediære forbindelser trenger ikke bli isolert. Bortsett fra nye vertsceller, er fremgangsmåtene selv som benyttes for å dyrke disse cellene ut i fra steroidomdannelser analoge til de bio-teknologiske fremgangsmåter som er vel kjente i feltet.
Oppfinnelsen blir videre illustrert ved de følgende eksemplene.
Eksempel 1
Molekylær kloning av en full-lengde cDNA som koder for det bovine cytokrom P450-sidekjedekløyveenzym (P450SCC)
Generelle kloningsteknikker så vel som DNA og RNA analyser er blitt benyttet som beskrevet i håndboken til T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Med mindre noe annet er beskrevet ble alle DNA-modifiserende enzymer, molekylære kloningsverktøy og E. coli-stammer oppnådd fra kommersielle kilder og benyttet ifølge produsentenes instruksjoner. Materialer og apparater for DNA- og RNA-separering og rensing ble benyttet ifølge instruksjoner til produsentene.
Bovin-binyrebarkvev ble laget fra friskt uttatte bovin- (storfe) nyrer, som ble hurtig frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80°C.
Fra frosne storfebinyrebarker ble totalt cellulært RNA laget som beskrevet av Auffrey and Rougeon (Eur. J. Biochem., 107, 303-314,1980). Binyrepoly A+ RNA ble oppnådd ved å varme den totale RNA-prøven til 65°C før polyA-seleksjonen på oligo(dT)-kromatografi.
DNAer komplementære til polyA<+->RNA fra storfebinyrecortex ble laget som følger: 10 ug av polyA<+->RNA, behandlet med metyl-kvikksølvhydroksyd ble nøytralisert med beta-merkaptoetanol. Denne blandingen ble justert til 50 mM Tris/HCI (pH 8,3 ved 42°C), 40 mM KCI, 6 mM MgCI2,10 mM DTT 3000 U RNasin/ml, 4 mM Na4P2C>7, 50 \ ig actinomycin D/ml, 0,1 mg oligo(dT12-i8)/ml,
0,5 mM dGTP, 0,5 mM dATP, 0,5 mM dTTP, 0,25 mM dCTP og 400 nCi alfa <32>P-dCTP/ml, alt i et endelig volum på 100 jil. Blandingen ble satt på is i 10 min., varmet i 2 min. ved 42°C og syntesen ble startet ved tilsetning av 150 U AMV revers transkriptase (Anglian Biotechnology Ltd.); inkubasjonen ble utført i 1 time ved 42°C.
Annen kjedesyntese ble utført ved å tilsette DNA-polymerase og RNase H ifølge Gubler og Hoffman (Gene, 25, 263-269,1983). Etter behandling av ds DNA med T4 DNA polymerase (BRL) for å oppnå like ender, ble decamere EcoR-linkere (hjelpesekvenser) (Biolabs Inc.) ligert til ds DNA-fragmentene. Etter fordøyelse med EcoRI (Boehringer), ble dobbelttrådet cDNA-fragmenter adskilt fra overskudds- EcoRI-linkere ved Biogel A15 m (BioRad) kromatografi. Omtrent 200 ng EcoRI-linkerinneholdende dobbelt-trådet cDNA ble ligert med 10 \ ig EooRI fordøyet og kalvetarm-fosfatase (Boehringer) behandlet med Iambda-gt11 vektor DNA (Promega) ved T4-DNA ligase (Boehringer) som beskrevet av Huynh
et al. (In: "DNA doning techniques: A practical approach", s. 49-78, Oxford IRL-press, 1985). Fag, oppnådd etter in vitro-pakking av ligeringsblandingen ble benyttet for å infisere E. coli Y1090 verten (Promega).
Fra dette cDNA-bibliotek ble omtrent 10<6> plakkdannende enheter (pfu'er) undersøkt med en <32>P-endemerket syntetisk oligomer SCC-1 (5'-GGC TGA CGA AGT CCT GAG ACA CTG GAT TCA GCA CTGG-3'), spesifikk for storfe P450SCC DNA-sekvenser som beskrevet av Morohashi et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, 4647-4651,1984. Seks hybridiserende pfu'er ble oppnådd og videre renset ved to tilleggsrunder med infeksjon, utstrykning og hybridisering. P45oSCCcDNA EcoRI-innsettinger ble subklonet i EcoRI-setet av pTZ18R (Pharmacia). Klon pGBSCC-1 (figur 2), som inneholdt det største EcoRI-innskuddet (1,4 kb), oppnådd fra klon Iambda-gt11 SCC-54 ble videre analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og sekvensering.
Sekvensdata viste at pGBSCC-1 EcoRI-innskuddet var identisk med nukleotidsekvensen til SCCcDNA mellom posisjoner 251 og 1824 på P45oSCCcDNA-kartet som beskrevet av Morohashi et al.
De gjenværende 5'-P45oSCCcDNA-nukleotidene ble syntetisk laget ved å klone et 177 bp Pst/ Hindi I l-fragment inn i de rette setene til pTZ18R, hvilket resulterte i pTZTsynlead" som vist i figur 3, hvilket inneholdt i tillegg til nukleotidene som koder for det modne P45oSCC-proteinet fra stilling 118 til 273 som publisert ved Morohashi et al., restriksjonsseter for Seal. Avrll og Stu I uten å affisere den antatte aminosyresekvens til P45oSCC-proteinet.
Full-lengde P450SCCcDNA ble konstruert ved kloning i E. coli JM101 (ATCC 33876) av en ligeringsblanding som inneholdt 1372 bp Hindlll/ Kpnl pGBSCC-1 fragment, der 177 bp Pst/ H indl 11 pTZ/"svnlead"-f ragmentet og pTZ19R DNA ble fordøyet med Pst og Kpnl.
Det resulterende plasmidet pGBSCC-2, som inneholdt alle nukleotid-sekvensene som kodet for det modne bovine P45o-side-kjedekløyvingsproteinet er vist i figur 4.
Eksempel 2
Konstruksjon, transformasjon og ekspresjon av P450SCC i bakterievert Bacillus subtilis
For å oppnå ekspresjon av cytokrom P450SCC i Bacillus-vert, ble P45oSCCcDNA-sekvenser overført til en E. coli/ Bacillus felles vektor pBHA-1.
Figur 5 viser nukleotidsekvensen av fellesplasmidet pBHA-1. Plasmidet består av posisjonene 11-105 og 121-215: bakterio-fag FD-terminator (dobbel); posisjoner 221-307: en del av plasmid pBR322 (det er posisjonene 2069-2153); posisjonene 313-768: bakteriofag Fl, replikasjonsorigo (det er posisjonene 5482-5943); posisjonene 772-2571: del av plasmid pBR322, det er replikasjonsorigo og B-laktamasegenet; posisjoner 2572-2685: transposon TN903, komplett genom; posisjoner 2719-2772: tryptofan terminator (dobbel); posisjoner 2773-3729: transposon Tn9, kloramfenikolacetyltransferasegnenet. Nukleotidene i posisjon 3005 (A), 3038 (C), 3302 (A) og 3409 (A) adskiller seg fra villtypekatt-kodende sekvens. Disse mutasjoner ble innført for å eliminere Ncol. Ball. EcoRI og Pvull-setene: posisjonene 3730-3804: multippel kloningssete; posisjoner 3807-7264: del av plasmid pUB110 som inneholder Baccillus "HpaH"-promotoren. replikasjonsfunksjon og kanamycinresistensgen (EcoRI-PyuM-fragment)
(McKenzie et al., Plasmid 15, 93-103,1986 og McKenzie et al., Plasmid 17, 83-85, 1987); posisjoner 7267-7331: multippelt kloningssete. Fragmentene ble satt sammen ved hjelp av kjente kloningsteknikker, f.eks. utfylling av overhengende ender med Klenow, adaptorkloning, osv.. Alle resultatene ble oppnådd fra Genbank<R>, National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NIH, USA.
pGBSCC-3 ble oppnådd ved molekylær kloning i E. coli JM101 av Kpnl/ Sph P450SCCCDNA innskuddet til pGBSCC-2 (beskrevet i eksempel 1) inn i de passende setene i pBHA-1 som indikert i figur 6.
Ved hjelp av kloning i E. coli JM101 ble metionin startkodon innsatt ved å bytte Stul/ Sphl-fraamentet i pGBSCC-3 med en syntetisk utviklet Sphl/ Stul-fragment.
som inneholder et Ndel-sete ved ATG-startkodon. Det oppnådde plasmidet pGBSCC-4, er vist i figur 7. "Hpa II" Bacillus-promotoren ble innsatt oppstrøms for P45oSCCcDNA-sekvensene ved å kløyve pGBSCC-4 med restriksjonsenzymet Ndel. fraskillelse av E. coli-delen av det felles (skyttel) plasmidet ved agarosegelelektroforese og deretter sammenbinding og transformasjon i Bacillus subtilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetente celler. Neomycinresistente kolonier ble analysert og plasmidet pGBSCC-5 (figur 8) ble isolert. Ekspresjon av storfe P450SCC ble studert ved å lage en cellulær proteinfraksjon fra en over natten kultur ved 37°C
i TSB medium (Gibco) som inneholder 10 ^g/ml neomycin. Celler fra 100 p\ kultur, som inneholder omtrent 5.10<6> celler, ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i 10 mM Tris/HCI pH 7,5. Lysis ble utført ved å tilsette lysozym (1 mg/ml) og
inkubasjon i 15 min. ved 37°C. Etter behandling med 0,2 mg DNase/ml i løpet av 5 min. ved 37°C ble blandingen justert til 1x SB buffer, som beskrevet av Laemmli, Nature 227, 680-685,1970, i et endelig volum på 200 ul. Etter oppvarming i 5 min. til 100°C, ble 15 \ i\ av blandingen kjørt på en 7,5% SDS/polyakrylamidgel-elektroforese. Som vist i figur 9 (spor c) kunne et 53 kDa bånd bli oppdaget etter immunblotting av gelen analysert med P4soSCCspesifikke antistoffer.
Spesifikke bovine P450SCC antistoffer ble oppnådd ved immunisering av kaniner med renset P450SCC protein isolert fra bovint binyrebarkvev.
Eksempel 3
Ekspresjon av P450SCC i bakteriell vert Bacillus licheniformis
Ekspresjon av bovin P4soSCC i B. licheniformis ble utført ved transformasjon av plasmid pGBSCC-5 inn i den passende vertsstamme B. licheniformis T5(CBS 470.83). En cellulær proteinfraksjon laget som beskrevet i eksempel 2, fra en over natten kultur ved 37°C i Trypton Soy Broth (TSB) medium (Oxoid) som inneholdt 10 ug/ml neomycin, ble analysert ved SDS/PAGE og Western-blotting. Som vist i figur 9 (spor f) ble et 53 kDa stort protein bånd synliggjort etter inkubasjon av nitrocellulosefilter med antistoffer spesifikke for bovin P450SCC. En transformant ble videre analysert in vivo med hensyn på aktivitet av P450SCC (se eksempel 1).
Eksempel 4
Ekspresjon av P450SCC i bakterieverten Escherichia coli
(a) Konstruksjon av ekspresjonskassetten.
For å lage en passende ekspresjonsvektor i verten E. coli for bovin P450SCC, ble pTZ18R mutert ved setespesifikk mutagenese som beskrevet av Zollerog Smith (Methods in Enzymology 100, 468-500,1983); Zollerog Smith (Methods in Enzymology 154, 329-350,1987) og Kramer og Fritz (Methods in Enzymology 154, 350-367,1987). Plasmider og stammer for in vitro mutagenese-eksperimentene ble oppnådd fra Pharmacia Inc.
En syntetisk oligomer med sekvensen:
ble benyttet for å lage et Ndel-restriksionssete ved ATG-startkodonet til lac Z-genetiTZ18R.
Det resulterende plasmidet pTZ18RN ble fordøyet med Ndel og K<p>nl og Ndel/ Kpnl DNA-fragmentet fra pGBSCC-4, som inneholdt full-lengde SCCcDNA, ble innsatt ved molekylær kloning som indikert i figur 10.
Transkripsjonen av P45oSCCcDNA-sekvenser i det oppståtte plasmidet pGBSCC-17 vil bli drevet av E. coli lac-promotoren.
(b) Ekspresjon av P450SCC i verten E. coli JM101
pGBSCC- 17 ble innført i E. coli JM101 kompetente celler ved å selektere for ampicillinresistente kolonier. Ekspresjon av cytokrom P450SCC ble studert ved å lage en cellulær proteinfraksjon (beskrevet i eksempel 2) fra transformantene SCC-301 og 302 fra en overnatten kultur ved 37°C i 2xTY medium (som inneholdt
pr. liter av de-ionisert vann: Bacto trypton (Difco), 16 g; gjærekstrakt (Difco), 10 g og NaCI, 5 g) som inneholdt 50 ^g/ml ampicillin.
Proteinfraksjoner ble analysert ved hjelp av SDS/PAGE farget med Coomassie brilliant blått (figur 11 A) eller ved Western-blot og analysert med antistoffer spesifikke for bovin P450SCC (figur 11B). Begge analyser viser et protein av den ventede lengde (figur 11A, spor 1 og 2 og i figur 11B, sporene 3 og 4) for hhv. transformantene SCC-301 og SCC-302, som er fraværende i E. coli JM101 kontrollstamme (figur 11 A, spor 3 og figur 11B, spor 2).
Eksempel 5
Konstruksjon, transformasjon og ekspresjon av P450SCC i
gjæren Kluweromvces lactis
(a) Innføring av geneticinresistensmarkøren i pUC19
Et DNA-fragment som omfatter Tn5-genet (Reiss et al, EMBO J., 3, 3317-3322, 1984) og overfører resistens overfor geneticin under kontroll av alkoholdehydrogenase I (ADHI) promotoren fra S. cerevisiae. lik den som er beskrevet av Bennetzen og Hall (J. Biol. Chem., 257, 3018-3025,1982) ble satt inn i Smal sete til pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene, 33,103-119,1985). Det oppnådde plasmid pUCG418, er vist i figur 12.
E. coli som inneholder pUCG418, ble deponert ved Centraal Bureau voor Schimmelcultures under CBS 872.87.
(b) Konstruksjon av ekspresjonskassetten
En vektor ble konstruert, som bestod av pUCG418 (for beskrivelse se eksempel 5(a)) kuttet med Xbal og Hindlll. Xbal- Sall-fraqmentet fra pGB901 som inneholdt laktasepromotoren (se J. A. van den Berg et al., Continuation-in-part i US patent-søknad nr. 572.414: Kluyveromyves som en vertsstamme) og syntetisk DNA som omfattet deler av den 3' ikkekodende region til laktasegenet fra K. lactis. Dette plasmid, pGB950, er vist i figur 13. pGB950 ble kuttet med SaJi og Xhol og syntetisk DNA ble innsatt:
som resulterer i plasmid pGBSCC-6 som vist i figur 13.
Stul- EcoRI-fraqmentet fra pGBSCC-2 (se eksempel 1) som inneholdt det P450SCC kodende region, ble isolert og den overhengende ende ble utfylt, ved bruk av Klenow DNA-polymerase. Dette fragment ble innsatt i pGBSCC-6 kuttet med Stu I. Plasmidet som inneholdt fragmentet i den korrekte orienteringen ble kalt pGBSCC-7 (se figur 14).
(c) Transformasjon av K. lactis
K. tactis-stamme CBS 2360 ble dyrket i 100 ml YEPD-medium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukose-monohydrat) som inneholdt 2,5 ml av en 6,7%
(w/w) gjæmitrogenbase (Difco laboratorier) løsning til en ODs-io på omkring 7. Fra 10 ml av kulturen, ble cellene samlet ved sentrifugering, vasket med TE-buffer (10 mM Tris-HCI pH 7,5; 0,1 mM EDTA) og resuspendert i 1 ml TE-buffer. Et likt volum av 0,2 M litiumacetat ble tilsatt og blandingen inkubert i 1 time ved 30°C i et ryste-vannbad. 15 \ ig pGBSCC-7 ble kuttet ved det sjeldne Sacll-setet i laktase-promotoren, etanolpresipitert og resuspendert i 15 ul TE-buffer. Denne DNA-preparasjon ble tilsatt 100 \ i\ av preinkuberte celler, og inkubasjonen ble prolongert i 30 min. Så ble et likt volum av 70% PEG4000 tilsatt, og blandingen inkubert i 1 time ved den samme temperaturen, etterfulgt av et varmesjokk på 5 min. ved 42°C. Så ble 1 ml av YEPD-medium tilsatt og cellene ble inkubert i 1,5 timer i et ristevannbad ved 30°C. Endelig ble cellene samlet ved sentrifugering, resuspendert i 300 ul YEPD og utsådd på agarplater som inneholdt 15 ml av YEPD agar med 300 ^ig/ml geneticin og ble overlagt 1 time før bruk med 15 ml EPD-agar uten G418. Kolonier ble dyrket i 3 dager ved 30°C.
(d) Analyse av transformantene
Transformanter og kontrollstammen CBS 2360 ble dyrket i YEPD-medium i omkring 64 timer ved 30°C. Cellene ble samlet ved sentrifugering, resuspendert i en fysiologisk saltløsning ved OD610 på 300 og ødelagt ved risting med glasskuler i 3 min. på en Vortex-rister ved maksimal hastighet. Cellerester ble fjernet ved sentrifugering i 10 min. ved 4500 rpm i en Hearaeus Christ minifuge GL. Fra supematantene ble 40 (al prøver tatt for analyse på immunoblot (se figur 15A, spor 3 og figur 15B, spor 4).
Resultatene viser at et protein med forventet lengde er uttrykt i K. lactis-celler transformert med pGBSCC-7. Transformanten ble kalt K. lactis SCC-101.
Eksempel 6
Konstruksjon, transformasjon og ekspresjon av P450SCC i
gjæren Saccharomyces cerevisiae
(a) Konstruksjon av ekspresjonskassetten
For å fjerne laktasepromotoren, ble pGB950 (se eksempel 4(b)) kuttet med Xbal og Sali, de overhengende endene ble fylt ut ved bruk av Klenow DNA polymerase og deretter ligert (sammenkoblet). I det resulterende plasmid, pGBSCC-8, er Xbal-setet ødelagt, men Sall-setet er beholdt.
Sall-fraqmentet fra pGB161 (se J.A. van den Berg et al., EP 96430) som inneholder isocytokrom Cl (cyc 1) promotoren fra S. cerevisiae, ble isolert og delvis fordøyet med Xhol. Det 670 bp Xhol- Sall-fraqmentet ble isolert og klonet i Sall-setet til pGBSCC-8. I det utvalgte plasmidet, pGBSCC-9, blir Sall-setet mellom cyc 1 promotoren og 3'-ikke-kodende regionen til laktasegenet beholdt (figur 16) ( Hindlll delvis fordøyet).
Sall- Hindlll-fraqmentet fra pGBSCC-7, som inneholdt den P450SCC-kodende regionen ble innsatt i pGBSCC-9 kuttet med Sali og Hindlll. I det resulterende plasmidet, pGBSCC-10, er den P45oSCC-kodende regionen nedstrøms for cyc 1 promotoren (figur 17).
(b) Transformasjon av S. cerevisiaie
S. cerevisiae-stammen D273-10B (ATCC 25657) ble dyrket i 100 ml YEPD over natten ved 30°C, og deretter fortynnet (1:10000) i friskt medium og dyrket til en ODe-io på 6. Cellene fra 10 ml av kulturen ble samlet ved sentrifugering og suspendert i 5 ml TE-buffer. Igjen ble cellene samlet ved sentrifugering, suspendert i 1 ml av TE-bufferen og 1 ml 0,2 M litiumacetat tilsatt. Cellene ble inkubert i 1 time i et rystevannbad ved 30°C. 15 ^g pGBSCC-10 ble kuttet ved det sjeldne Mlul-setet i cyc 1-promotoren, etanolpresipitert og resuspendert i 15 ul TE. Dette DNA-preparat ble tilsatt til 100 \ i\ av pre-inkuberte gjærceller og inkubert (risting) i 30 min. ved 30°C. Etter tilsetning av 115 uJ av 70% PEG4000 løsning ble inkubasjonen fortsatt i 60 min., uten rysting. Deretter ble et varmesjokk på 5 min. ved 42°C gitt til cellene, 1 ml YEPD medium ble tilsatt, etterfulgt av 1 1/2 time inkubasjon ved 30°C i et ristevannbad. Til slutt ble cellene samlet ved sentrifugering, resuspendert i 300 ul YEPD og utspredt på YEPD agarplater som inneholdt geneticin (300 ug/ml). Kolonier ble dyrket i 3 dager ved 30°C.
(c) Analyse av transformantene
Transformanter og kontrollstammen ble dyrket i YEPL-medium (1 % gjærekstrakt, 2% bactopepton, 3,48% K2HP04 og 2,2% av en 90% L-(+)-melkesyre-løsning; før sterilisering ble pH justert til 6,0 ved bruk av 25% ammoniakkløsning) i 64 timer ved 30°C. Videre analyse ble utført som beskrevet i eksempel 5(d).
Immunoblot-analysen viser ekspresjon av P450SCC i S. cerevisiae (figur 15A, spor 1).
Eksempel 7
Konstruksjon, transformasjon og ekspresjon av pre-P45oSSC-kodende DNA i gjæren Klyveromyces lactis
(a) Konstruksjon av ekspresjonskassetten
Plasmid pGB950 (se eksempel 5(b)) ble kuttet med Sali og Xhol og syntetisk DNA ble innsatt:
som resulterer i plasmid pGBSCC-11 (figur 18). Analogt til det beskrevet i eksempel 5(b), ble den P45oSCC kodende regionen til pGBSCC-2 innsatt i pGBSCC-11 kuttet med Stul. Plasmidet som inneholdt fragmentet i den rette orienteringen ble kalt pGBSCC<a>12 (figur 18).
(b) Transformasjon av K. lactis og analyse av transformantene
Transformasjon av K. lactis med pGBSCC-12 ble utført som beskrevet i eksempel 5(c). Transformantene ble analysert som beskrevet i eksempel 5(d). Analysen viser produksjon av P450SCC ved K. lactis (figur 15B, spor 3).
Eksempel 8
Konstruksjon, transformasjon og ekspresjon av pre-<p>45oSCC-kodende DNA i gjæren Saccharomvces cerevisiae
(a) Konstruksjon av ekspresjonskassetten
Sall- Hindlll ( Hindlll delvis fordøyet) fragment fra pGBSCC-12, som inneholdt pre-P4soSCC kodende region ble innsatt i pGBSCC-9 kuttet med Sali og Hindlll. Det resulterende plasmidet ble kalt pGBSCC-13 (figur 19).
(b) Transformasjon av S. cerevisiae og analyse av trans-formantene
S. cerevisiae-stamme D273-10B ble transformert med pGBSCC-13 som beskrevet i eksempel 6(b). Trasformantene ble anlaysert som beskrevet i eksempel 5(c). Resultatene vist i figur 15C (spor 3), viser ekspresjonen av P450SCC av S. cerevisiae. Én transformant, SCC-105, ble videre analysert for in vitro-aktivitet med hensyn til P450SCC (se eksempel 12).
Eksempel 9
Konstruksjon, transformasjon og ekspresjon i Kluweromvces lactis av P45oSCC-sekvenser koblet til pre-regionen av cyto-kromoksydase VI
fra Saccharomvces cerevisiae
(a) Konstruksjon av ekspresjonskassetten
Plasmid pGB950 (se eksempel 6(b)) ble kuttet med SaH og Xhol og syntetisk DNA innsatt:
som resulterer i plasmid pGBSCC-14.
Aminosyresekvensen fra cytokromoksydase VI (COX VI) pre-sekvens ble tatt fra artikkelen til Wright et al. (J. Biol. Chem., 259,15401-15407,1984). Det syntetiske DNA ble laget ved bruk av de foretrukne gjærkodoner. Den P450SCC kodende regionen til pGBSCC-2 ble innsatt i pGBSCC-14 kuttet med Stul.
på samme måte som beskrevet i eksempel 5(b). Plasmidet som inneholdt den P450SCC kodende sekvensen i leseramme med COX VI pre-sekvensen ble kalt pGBSCC-15(figur20).
(b) Transformasjon av K. lactis og analyse av transformantene
Transformasjon av K. lactis med pGBSCC-15 ble utført som beskrevet i eksempel 5(c). Transformantene ble analysert som beskrevet i eksempel 5(d). Resultatet (figur 15B, spor 2) viser at P450SCC er produsert.
Eksempel 10
Konstruksjon, transformasjon og ekspresjon i Saccharomyes cerevisiae av P45oSCC-sekvenser bundet til pre-regionen av cytokromoksydase VI fra Saccharomvces cerevisiae
(a) Konstruksjon av ekspresjonskassetten
Sall- Hindlll ( Hindlll delvis spaltet) fragment fra pGBSCC-15, som inneholder den kodende regionen for P450SCC bundet til COX VI pre-sekvensen, ble satt inn i pGBSCC-9 kuttet med Sali og Hindlll. Det resulterende plasmid ble kalt pGBSCC-16(figur21).
(b) Transformasjon av S. cerevisiae og analyse av transformantene
S. cerevisiae-stamme D273-10B ble transformert med pGBSCC-16 som beskrevet i eksempel 6(b). Transformantene ble analysert som beskrevet i eksempel 6{c). Resultatet vist i figur 15C (spor 2), demonstrerer ekspresjon av P450SCC i S. cerevisiae.
Eksempel 11
In vivo aktivitet til P450SCC i Bacillus licheniformis SCC-201
B. licheniformis SCC-201 ble oppnådd som beskrevet i eksempel 3. Organismen ble inokulert i 100 ml medium A.
Etter sterilisering og avkjøling til 30°C for å komplettere mediet, ble 60 g maltose-monohydrat løst opp i 200 ml destillert vann (sterilisert 20 min., 120°C), 200 ml 1M kaliumfosfatbuffer (pH 6,8; sterilisert 20 min., 120°C), 1,7 g gjærnitrogenbase (Difco) oppløst i 100 ml destillert vann (sterilisert ved membranfiltrering) tilsatt mediet.
Kulturen ble dyrket i 64 timer ved 37°C og deretter ble 2 ml av denne kulturen tilsatt som inokulum til 100 ml medium A som inneholder 10 mg kolesterol. Kolesterol ble tilsatt som en løsning som inneholdt kolesterol 10 mg; Tergitol™/etanol (1:1, v/v), 0,75 ml og Tween 80™, 20 ul. Kulturen ble dyrket i 48 timer ved 37°C, deretter ble kulturen ekstrahert med 100 ml diklormetan. Blandingen ble separert ved sentrifugering og det organiske løsningslag samlet. Ekstraksjonsprosedyren ble gjentatt to ganger og 3 x 100 ml diklormetanfraksjoner ble samlet. Diklormetan ble fordampet ved vakuumdestillasjon og det tørkede ekstraktet (omtrent 450 mg) ble analysert for pregnenlon ved bruk av gasskromatografi-massespektrometer i kombinasjon.
GC-MS-analyse
Fra det tørkede ekstraktet ble en definert mengde tatt og silylert ved tilsetning av en blanding av pyridin bis-(tri-metylsilyl)-trifluoracetamid og trimetyl-klorsilan. Den silylerte prøve ble analysert ved en GL-MS-DS kombinasjon (Carlo Erba MEGA 5160-Finnigan MAT 311A-Kratos DS 90) i en valgt ionemodus. Gasskromatografi ble utført under de følgende betingelser: injeksjonbevegelig nål ved 300°C; kolonne M. cpsil 29 0,25 indre diameter df 0,2 um operert ved 300°C isotermisk; direkte innføring i MS-kilde.
Prøver ble analysert ved å måle ioner m/z 298 fra pregnenolon med en oppløsning på 800. Fra målingene er det klart at i tilfelle med vertsstammen B. licheniformis T5 kunne ikke noe pregnenolon bli oppdaget (målegrense 1 picogram), mens i tilfelle med B. licheniformis SCC-201 kunne produksjon av pregnenolon enkelt bli målt.
Eksempel 12
In vitro-aktivitet av P450SCC oppnådd fra Saccharom<y>es cerevisiae SCC-105
S. cerevisiae SCC-105 oppnådd som beskrevet i eksempel 8 ble inokulert i 100 ml medium B. Medium B inneholdt pr. I destillert vann:
Denne kulturen ble dyrket i 48 timer ved 30°C og deretter ble denne kulturen benyttet som inokulum for en fermentor som inneholdt medium C.
pH ble justert til pH = 6,0 med ammoniakk (25%) og fermentor inklusive medium ble sterilisert (1 time, 120°C).
Etter avkjøling, ble 2,4 g geneticin løst i 25 ml destillert vann og sterilisert ved membranfiltrering og tilsatt mediet. Den inokulerte blandingen ble dyrket i den omrørte reaktor (800 rpm) ved 30°C, mens steril luft ble passert gjennom mediet i en hastighet på 300 l/h og pH ble automatisk holdt på 6,0 med 4N H2S04 og 5% NH4OH (5% NH4OH i destillert vann; sterilisert ved membranfiltrering). Etter 48 timer ble en tilføring av melkesyre (90%, sterilisert ved membranfiltrering) startet i en hastighet på 20 g/time. Fermenteringen blir så gjenopptatt i 40 timer, mens cellene ble samlet ved sentrifugering (4000xg, 15 min.).
Bunnfallet ble vasket med 0,9% (w/w) NaCI, etterfulgt av sentrifugering (4000xg, 15 min.); bunnfallet vasket med fosfatbuffer (50 mM, pH = 7,0) og cellene samlet ved sentrifugering (4000xg,15 min.). Bunnfallet ble tatt opp i fosfatbuffer (50 mM, pH = 7,0) hvilket resulterte i en suspensjon som inneholdt 0,5 g våtvekt/- ml. Denne suspensjonen ble behandlet i en Dyno<R->mill (Willy A. Bachofen Maschinen-fabrik, Basel, Sveits). Ikke-ødelagte celler ble fjernet ved sentrifugering (4000xg, 15 min.). Det cellefri ekstraktet (2250 ml, 15-20 mg protein/ml) ble lagret ved -20°C.
P450SCC ble grovrenset ved følgende fremgangsmåte. Fra 50 ml av tint cellefritt ekstrakt, ble en uren membranfraksjon sentrifugert ved ultrasentrifugering (125000xg, 30 min.) og resuspendert i 50 ml av 75 mM kaliumfosfatløsning (pH 7,0), som inneholdt 1% av natriumcholat. Denne disperse løsning ble forsiktig omrørt i 1 time ved 0°C, og deretter sentrifugert (125000xg, 60 min.). Til den således oppnådde supernatant, som inneholdt løselige membranproteiner, ble (NH4)2S04 tilsatt (30% w/v), mens pH ble holdt ved 7,0 ved tilsetning av små mengder NhUOH-løsning (6N). Suspensjonen ble så omrørt i 20 min. ved 0°C, etter hvilken ble fraksjonen av bunnfelte proteiner samlet ved sentrifugering (15000xg, 10 min.). Bunnfallet ble resuspendert i 2,5 ml med 100 mM kaliumfosfat-buffer (pH 7,0), som inneholdt 0,1 mM ditiotreitol og 0,1 mM
EDTA. Denne suspensjonen ble eluert gjennom en gelfiltreringssøyle (PD10, Pharmacia), som ga 3,5 ml av avsaltet proteinfraksjon (6 mg/ml), som ble målt for P45oSCC-aktivitet.
P45oSCC-aktivitet ble bestemt ved en metode som er hovedsakelig basert på en fremgangsmåte fra Doering (Methods Enzymology, 15, 591-596,1969). Måleblandingen bestod av de følgende løsningene:
Løsning A (naturlig P450SCC elektronavgivende system): en
10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0), som inneholdt 3 mM EDTA,
3 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 20 nm adrenodoxin og
1 |*M adrenodoxinreduktase (elektronbærere; begge renset fra storfebinyrebark),
1 mM NADPH (elektrondonor) og
15 mM gtukose-6-fosfat og
8 enheter/ml glukose-6-fosfat-dehydrogenase (NADPH regenererende system).
Løsning B (substrat): en micelleløsning av 37,5 \ xM kolesterol (dobbelt radioaktivt merket med [26,27-<14>C]kolesterol (40 Ci/mol) og [7 alfa-<3>H]kolesterol (400 Ci/mol)) i 10% (v/v) Tergitol™ NP40/etanol (1:1, v/v).
Målingen ble startet ved å blande 75 ni løsning A med 50 \ i\ løsning B og 125 ni av den urene rensede P45oSCC-fraksjonen (eller buffer som referanse). Blandingen ble omrørt forsiktig ved 30°C. Prøvene (50 ni) ble trukket etter 0, 30 og 180 min. og fortynnet med 100 ul vann. Metanol (100 og kloroform (150 ni) ble tilsatt til den fortynnede prøven. Etter ekstraksjon og sentrifugering (5000xg, 2 min.) ble kloroformlaget samlet og tørket. Det tørre bunnfallet ble oppløst i 50 ni aceton, som inneholdt 0,5 mg av en steroid blanding (kolesterol, pregnenolon og progesteron (1:1:1, w/w/w)) og deretter ble 110 ni konsentrert maursyre tilsatt. Suspensjonen ble oppvarmet i 15 min. til 120°C. Deretter ble <14>C/<3>H-forholdet bestemt ved hjelp av dobbeltmerket væskescintillasjonstelling. Dette forholdet er et direkte mål for sidekjedekløyvingsreaksjonen, fordi be-merket sidekjede blir fordampet fra blandingen som isokaprylsyre under oppvarmingsfremgangsmåten.
Ved bruk av denne metoden ble det funnet at P45oSCC-fraksjonen, grovrenset fra S. cerevisiae SCC-105, viste sidekjedekløyvingsaktivitet. I løpet av 3 timer med inkubasjon hadde 45% av kolesterolet blitt omdannet. Ved hjelp av tynnsjiktskromatografi ble reaksjonsproduktet identifisert som pregnenolon.
Eksempel 13
Molekylær kloning av en full-lengde cDNA som koder for storfe-cytokrom <p>45o-steroid 17a-hydroksylasen (P4501 7a).
Omtrent 10<6> pfu'er av storfebinyrebark cDNA-bibliotek beskrevet i eksempel 1, ble undersøkt med hensyn til P45o17acDNA-sekvenser ved hjelp av to <32>P-endemerkede syntetiske oligomerer spesifikke for P4so17acDNA. Oligomer 17ct-1 (5"-AGT GGC CAC TTTGGG ACG CCC AGA GAA TTC-3') og oligomer 17a-2 (5-
GAG GCT CCT GGG GTA CTT GGC ACC AGA GTG CTT GGT-3') er
komplementære til storfe P45o17acDNA-sekvensen som beskrevet av Zuber et al.
(J. Biol. Chem., 261, 2475-2482, 1986) fra hhv. posisjon 349 til 320 og 139 til 104.
Seleksjon med oligomer 17a-1 viste ± 1500 hybridiserende pfu<*>er. Flere hybridiserende pfu'er ble valgt, renset og oppskalert for preparativ isolering av fag DNA. EcoRI-innskuddene til det rekombinante Iambda-gt11 DNA'ene ble subklonet i EcoRl-sete i pTZ18R. Én klon, pGB17a-1, ble videre karakterisert ved restriksjonsendonukleasekartlegging og DNA-sekvensering. Plasmid pGB17a-1 inneholder et 1,4 kb EooRI-innskudd komplementært til 3" delen av P4so17a fra EcoRI-setet ved posisjon 320 til polyadenyleringssetet i stilling 1721 som beskrevet av Zuber et al. Et kart av pGB17a-1 er vist i figur 22A.
Åtte hybridiserende pfu'er ble oppnådd ved undersøkelse av cDNA-biblioteket med oligiomer 17a-2. Etter opprensing, oppskalering av rekombinante fag og isolering av rec Iambda-gt11 DNA'er, ble EcoRI-innskuddene subklonet i EcoRI-setet til pTZ18R. EcoRI-innskuddene varierte i lengde fra 270 bp til
1,5 kbp. Bare én klon, pGB17a-2 som inneholdt et 345 bp EcoRI-fragment, ble videre undersøkt ved nukleotidsekvensering og sammenlignet med det publiserte P45o17acDNA-sekvensresultatene til Zuber et al. Som vist i figur 22B startet P45017acDNA-sekvensen i pGB17a-2 72 bp oppstrøms for det antatte AUG-startkodon i posisjon 47 og viser komplett homologi med 5' delen til P4so17acDNA til EcoRI-setet i posisjon 320 som beskrevet av Zuber et al.
En full-lengde storfe P4so17acDNA ble konstruert ved molekylær kloning i E. coli JM101 ved bruk av en sammenkoblingsblanding som inneholdt en delvis EcoRI spalte pGB17a-1 og 345 bp EcoRI-fra<q>mentet til pGB17a-2. Den oppnådde klon pGB17a-3 inneholderen full-lengde storfe P4so17acDNA og er vist i figur 22C.
Eksempel 14
Konstruksjon og transformasjon av en full-lengde P450I7ctcDNA-klon i gjæren Kluyveromvces lactis
(a) Konstruksjon av ekspresjonsvektoren
For å oppnå en passende ekspresjonsvektor i gjærverter for storfe P45017a, ble pGB17a-3 mutert ved setespesifikk mutagenese som beskrevet av Zoller og Smith, (Methods in Enzymol., 100,468-500,1983); Zoller og Smith, (Methods in Enzymol., 154, 329-350,1987) og Kramer og Fritz, (Methods in Enzymol., 154, 350-367,1987). Plasmider og stammer for in vitro-mutagenese-eksperimenter ble oppnådd fra Pharmacia Inc.
Som vist i figur 23, ble 9 bp like oppstrøms for ATG startkodon forandret for å oppnå et Sall-restriksionssete og optimale gjærtranslasjonssignaler benyttet ved hjelp av den syntetiske oligomer 17a-3
Det resulterende plasmid pGB17a-4 ble fordøyet med Sali og Smal; DNA-fragmentet som inneholdt full-lengde P45o17acDNA ble adskilt ved gelelektroforese, isolert og overført ved kloning til E. coli JM101 i pGB950 vektoren (se eksempel 5) som først ble kløvet med Xhol. overhengende ender utfylt med Klenow NA-polymerse og deretter fordøyet med Sali, hvilket resulterte i plasmidet pGB17a-5 som vist i figur 24.
(b) Transformasjon av K. lactis
15 ng pGb17a-5, kuttet i det sjeldne Sacll-setet i laktase-promotoren, ble benyttet for å overføre K. lactis-stamme CBS 2360 som vist i eksempel 5. Transformanter ble analysert for nærværet av integrerte pGB17a-5-sekvenser i vertsgenomet ved Southern analyse. Én transformant 17a-101, som inneholdt minst tre kopier av pGB17a-5 i det genomiske vert DNA, ble videre analysert for jn vivo-aktivitet til P4so17a (se eksempel 16).
Eksempel 15
Konstruksjon og transformasjon av P45017a i de bakterielle verter Bacillus subtilis og Bacillus licheniformis
(a) Konstruksjon av ekspresjonsvektoren
For å få en passende ekspresjonsvektor i Bacillus-vertene for bovin P45o17a, ble pGB17cc-3 mutert ved setespesifikk mutagenese som beskrevet i eksempel 14.
Som indikert i figur 25 ble et Ndel restriksjonssete innført ved ATG-startkodonet ved bruk av den syntetiske oligomer 17a-4:
Det resulterende plasmid pGB 17a-6 ble delvis spaltet med EcoRI: DNA-fragmentet som inneholdt full-lengde P^^acDNA ble separert ved gelelektroforese, isolert og bundet til EcoRI-spaltet pBHA-1 DNA som vist i figur 26. Det sammenbundede DNA ble klonet ved overføring av blandingen til E. coli JM101 foråfåpGB17a-7.
(b) Transformasjon av B. subtilis og B. licheniformis
"Hpall" Bacillus-promotoren ble innført oppstrøms for P45o17acDNA-sekvensene ved å spalte pGB17a-6 med restriksjonsenzymet Ndel. adskillelse av E. coli-delen av fellesplasmidet ved agarosegelelektroforese og deretter sammenbinding og transformasjon av B. subtilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetente celler. Neomycinmotstandsdyktige kolonier ble analysert og plasmidet pGB17a-8 (figur 27) ble oppnådd.
Transformasjon av verten B. licheniformis T5 (CBS 470.83) ble også utført med pGB17a-8. Plasmidet forblir stabilt i den passende Bacillus-verten som vist ved restriksjonsanalyse av pGB17a-8 endog etter mange generasjoner.
Eksempel 16
In vivo-aktivitet til P45o17a i Kluweromvces lactis 17a-101
K. lactis 17a-101 ble oppnådd som beskrevet i eksempel 14. Organismen ble inokulert i 100 ml medium D. Medium D inneholdt pr. liter destillert vann:
Etter sterilisering og avkjøling til 30°C, ble 2,68 g gjærnitrogenbase (Difco) oppløst i 40 ml destillert vann (sterilisert ved membranfiltrering) og 50 mg neomycin oppløst i 1 ml destillert vann (sterilisert ved membranfiltrering) tilsatt til mediet. Deretter ble 50 mg progesteron oppløst i 1,5 ml dimetylformamid og tilsatt 100 ml medium. Kulturen ble dyrket i 120 timer ved 30°C og deretter ble 50 ml kulturvæske ekstrahert med 50 ml diklormetan. Blandingen ble sentrifugert og det organiske løsningslaget adskilt. Diklormetan ble avdampet ved vakuumdestillasjon og det tørkede ekstraktet (omkring 200 mg) ble tatt opp i 0,5 ml kloroform. Dette ekstrakt inneholdt 17a-hydroksyprogesteron som vist ved tynnsjiktskromatografi. Strukturen til forbindelsen ble bekreftet ved H-NMR og <13>C-NMR. NMR-analyse viste også at forholdet 17a-hydroksyprogesteron/progesteron
i ekstraktet var omtrent 0,3.
Eksempel 17
Molekylær kloning av full-lengde cDNA som koder for storfe-cytokrom
P45o-steroid-21 -hydroksylase (P450C2I)
Omtrent 10<6> Pfu'er av storfebinyrebark cDNA biblioteket, laget som beskrevet i eksempel 1, ble hybridisert med en <32>P-endemerket oligo C21-1. Denne oligo, som inneholdt sekvensen 5'- GAT GAT GCT GCA GGT AAG CAG AGA GAA TCC-3', er en spesifikk markør for storfe P450C2I-genet lokalisert nedstrøms for EcoRI-setet i P45oC21cDNA-sekvensen som beskrevet ved Yoshioka et al. (J. Biol. Chem., 261,4106-4109,1986). Fra analysen ble
én hybridiserende pfu oppnådd. EcoRI-innskuddet i dette rekombinante lambda-gt11 DNA, ble subklonet i EcoRI-setet til pTZ18R hvilket resulterte i en
konstruksjon kalt pGBC21-1. Som vist i figur 28, inneholder dette plasmidet et 1,53 kb EcoRI-innskudd komplentært til P450C21cDNA-sekvensene fra EcoRI-setet i posisjon 489 til polyadenyleringssetet som beskrevet av Yoshioka et al., som vist ved nukleotidsekvensering.
For å isolere den gjenværende 5'-delen (490 bp) av P450C2ICDNA, ble ny bovinbinyrebark cDNA bibliotek laget ifølge fremgangsmåten som beskrevet i eksempel 1 med bare én modifikasjon. Som primer for den første cDNA-strengsyntesen, ble en ytterligere oligomer C21-2 tilføyd. Oligomer C21-2 med nukleotidsekvensen 5'- AAG CAG AGA GAA TTC-3' er plassert nedstrøms for EcoRI-setet til P450C21cDNA fra posisjon 504 til 490.
Undersøkelse av dette cDNA-bibliotek med en <32>P-endemerket oligomer C21-3, som inneholder den P450C21 spesifikke sekvensen 5'-CTT CCA CCG GCC CGA TAG CAG GTG AGC GCC ACT GAG-3* (posisjonene 72 til 37) viste omtrent 100 hybridiserende pfu'er. EcoRI-innskuddet av bare én rekombinant Iambda-gt11 DNA ble subklonet i EcoRI-setet til pTZ18R hvilket resulterte i en konstruksjon kalt pGBC21-2.
Dette plasmid (figur 28) inneholder et innskudd på 540 bp komplementært til P450C21cDNA-sekvenser fra posisjon -50 til EcoRI-setet i posisjon 489 som vist ved nukleotidsekvensering.
Eksempel 18
Konstruksjon av P450C21 cDNA Bacillus-ekspresjonsvektor og transformasjon av de bakterielle vertene Bacillus subtilis og Bacillus licheniformis
(a) Konstruksjon av ekspresjonsvektoren
For å konstruere en full-lengde P45oC21cDNA med flankerende sekvenser spesifikke for Bacillus eks<p>resjonsvektoren pBHA-1, ble 5'-delen av P450C21-genet først modifisert ved polymerase kjedereaksjon (PCR) metoden med pGBC21-2 som templat og to spesifikke P4soC21-oligomerer som primere (start DNA). Oligomer C21-4 (5'-CTG ACT GAT ATC CAT ATG GTC CTC GCAGGG CTG CTG-3') inneholder 21 nukleotider komplementære til C21-sekvensene fra posisjon 1 til 21 og 18 ytterligere baser for å gi et EcoRV-restriksionssete og et Ndel restriksjonssete ved ATG-statrkodonet.
Oligomer C21-5 (5'-AGC TCA GAA TTC CTT CTG GAT GGT
CAC-3') er 21 baser komplementære til minuskjeden oppstrøms for EcoRI-setet ved posisjon 489.
PCR ble utført som beskrevet av Saiki et al (Science 239, 487^91,1988) med mindre modifikasjoner. PCR ble utført i et volum på 100 \ i\ som inneholdt: 50 mM KCL, 10 mM Tris-HCL pH 8,3,1.5 mM MgCI2, 0,01% (w/v) gelatin, 200 nM hver dNTP, 1 ^M hver C21 -primer og 10 ng pGBC21-2 templat. Etter denaturering (7' ved 100°C) og tilsetning av 2 U Taq-polymerase (Cetus), ble reaksjonsblandingen gjenstand for 25 amplifikasjons(forsterknings)sykler (hver: 2 min. ved 55°C, 3 min. ved 72°C, 1 min. ved 94°C) i et DNA-forsterkerapparat (Perkin-Elmer).
I den siste syklus, ble denatureringstrinnet utelatt. Et skjematisk syn av dette P45oC21cDNA forsterkning er vist i figur 29.
Det amplifiserte fragment ble spaltet med EcoRV og EcoRI og satt inn ved kloning i de passende setene til pSP73 (Promega). Det oppnådde plasmid er kalt pGBC21-3. Som vist i figur 30 ble 3' P^0C21 - EcoRI-fraqmentet av pGBC21-1 innsatt i den riktige orientering i EcoRI-setet til pGBC21-3. Den oppnådde vektoren pGBC21-4 ble fordøyet med EcoRV og K<p>nl ( Kpnl er plassert i det multiple kloningssetet til pSP73) og fragmentet som inneholdt den full-lengde P450C21cDNA ble isolert ved gelelektroforese og satt inn i de passende setene ti pBHA-1 ved molekylær kloning. Det oppnådde plasmid pGBC21-5 er illustrert i figur 31.
(b) Transformasjon av Bacillus
"Hpall" Bacillus-promotor ble introdusert oppstrøms for P450C21cDNA-genet ved å kløyve pGBC21-5 med restriksjonsenzymet Ndel, separasjon av E. coli-delen av fellesplasmidet ved agarosegelelektroforese og deretter sammenbinding og transformasjon av B. subtilis 1 A40 (BGSC 1 A40) kompetente celler. Neomycinresistente kolonier ble analysert for å få pGBC21-6 (figur 32).
Transformasjon av verten B. licheniformis T5 (CBS 470.83) ble også utført med pGBC21-6. Plasmidet forblir stabilt i både Bacillus-verter bedømt ved restriksjonsanalyse.
Eksempel 19
Konstruksjon av en P450C2ICDNA gjærekspresjonsvektor og transformasjon av gjærverten Kluweromvces lactis
(a) Konstruksjon av ekspresjonsvektoren
For å få en passende restriksjonsvektor i gjærverter for bovin P45oC21, ble pGBC21-2 mutert ved setespesifikk mutagenese som beskrevet i eksempel 14. For mutasjonen ble oligomer C21-6 (5-CCT CTG CCT GGG TCG ACA AAA ATG GTC CTC GCA GGG<a>3') benyttet for å lage et Sall-restriksionssete og optimale gjærtranslasjonssignaler oppstrøms for ATG startkodonet som antydet i figur 33.
Sall/ EcoRI DNA-fragmentet av det oppnådde plasmid pGBC21-7 ble bundet til 3' P450C21 - EcoRI-fraomentet av pGBC21-1 og innsatt ved kloning i de passende setene til pSP73 som indikert i figur 34. Det oppnådde pGBC21-8 ble kuttet med Sali og EcoRV ( EcoRV sete er plassert i det multiple kloningssetet til pSP73) og DNA-fragmentet som inneholdt den full-lengde P45oC21cDNA ble satt inn i gjærekspresjonsvektoren pGB950. Det oppnådde pGBC21-9 er avbildet i figur 35.
(b) Transformasjon av K. lactis
15 ng av pGBC21-9 ble fordøyet med Sadl og transformasjon av K. lactis CBS 2360 ble utført som beskrevet i eksempel 5(c).
Eksempel 20
Molekylær kloning av full-lengde cDNA som koder for det bovine cytokrom P450 steroid 11 p-hydroksylase (P45011B) Storfebinyrebark cDNA-bibliotek ble laget som beskrevet i eksempel 1 med én modifikasjon. En ytterligere P4so11 p-spesifikk primer (oligomer 1 ip-1) med nukleotidsekvensen 5-GGC AGT GTG CTG ACA CGA-3* ble satt til reaksjonsblandingen av den første streng cDNA-syntese. Oligomer 1 ip-1 er plassert like nedstrøms for translasjonsstoppkodonet fra posisjon 1530 til 1513. Nukleotid-sekvensene og kartposisjonene av nevnte P4so11 p-oligomerene er alle tatt fra P450I ipcDNA-sekvensresultatene beskrevet av Morohashi et al. (J. Biochem. 102 (3), 559-568,1987). cDNA-biblioteket ble undersøkt med en <32>P-merket oligomer 11B-2(5'-CCG CAC CCT GGC CTT TGC CCACAG TGC CAT-3')oger lokalisert ved 5'-enden til P45o11 pcDNA fra posisjon 36 til 1.
Undersøkelse med oligomer 11B-2 viste 6 hybridiserende pfu'er. Disse ble videre renset og analysert med oligomer 11 p-3 (5'-CAG CTC AAA GAG AGT CAT CAG CAA GGG GAA GGC TGT-3', posisjoner 990 til 955). To av seks viste et positivt hybridiseringssignal med <32>P-merket oligomer 11 p-3.
EcoRI-innskuddene av både 1 ip-lambda-gt11 rekombinanter ble subklonet i EcoRI-setet til pTZ18R. Én klon med EcoRI-innskudd på 2,2 kb (pGB11 p-1) ble videre analysert ved restriksjonsenzymkartlegging og er vist i figur 36. pGB11 p-1 inneholder alle kodende P45o11 pcDNA-sekvenser som bestemt av Morohashi et al.
Eksempel 21
Konstruksjon av P45oC21cDNA Bacillus-ekspresionsvektor og transformasjon av bakterievertene Bacillus subtilis og Bacillus licheniformis
(a) Konstruksjon av ekspresjonsvektoren
En full-lengde P45o11pcDNA med modifiserte flankerende sekvenser til Bacillus ekspresjonsvektoren pBHA-1, ble oppnådd ved PCR-metoden (beskrevet i eksempel 18) med pGB1ip-1 som templat og to spesifikke P4so11 p-oligomerer som primere.
Oligomer 11p-4(5'-TTT GAT ATC GAA TTC CAT ATG GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3') inneholder 21 baser komplementære til den modne P4so11 pcDNA-sekvensen fra posisjon 72 til 93 og 21 baser for å lage EcoRV. EcoRI og Ndel restriksjonsseter og ATG startkodon.
Oligomer 11 p-5(5*-TAA CGA TAT CCT CGA GGG TAC CTACTG GAT GGC CCG GAA GGT-3) inneholder 21 baser komplementære til minus P4so11 PcDNA strengen oppstrøms for translasjonsstoppkodonet ved posisjon 1511 og 21 baser for å lage restriksjonssetene for EcoRV. Xhol og K<p>nl.
Etter PCR-amplifisering (forsterkning) med ovenfor nevnte templat og P45011 p-primere, ble det amplifiserte fragmentet (1,45 kb), fordøyet med EcoRI og
Kpnl og satt inn ved kloning i Bacillus-ekspresionsvektoren pBHA-1 kuttet med EcoRI og K<p>nl for å oppnå vektoren pGB11 p-2 (se figur 36).
(b) Transformasjon av Bacillus
"HpaH" Bacillus-promotoren ble introdusert oppstrøms for P450I IpcDNA-sekvensene ved å fordøye pGB1ip-2 med Ndel, separasjon av E. coli-delen av fellesplasmidet ved agarose-gelelektroforese og deretter sammenbinding (som beskrevet i eksempel 18) og transformasjon av B. subtilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetente celler. Neomycinresistente kolonier ble analyser, og plasmidet pGB11 p-3 ble oppnådd. Det oppnådde plasmid pGB11 p-3 ble også overført til B. licheniformis-vertsstammen T5 (CBS 470.83).
Eksempel 22
Konstruksjon av P45011 pcDNA gjærekspresjonsvektor og transformasjon av gjærverten Kluvveromvces lactis
(a) Konstruksjon av ekspresjonskassetten
En full-lengde P450I IpcDNA med modifiserte flankerende sekvenser til gjærekspresjonsvektoren pGB950 ble oppnådd ved PCR-metoden (beskrevet i eksempel 18) med pGB11 p-1 som templat og to spesifikke P45011 p-oligomerer som primere.
Oligomer 11 p-6(5'-CTT CAG TCG ACA AAA ATG GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3') inneholder 21 baser komplementære til den modne P450I IpcDNA-sekvensen fra posisjon 72 til 93 og 18 tilleggsbaser for å lage et Sali restriksjonssete, et optimalt gjærtranslasjonssignal og et ATG-startkodon.
Oligomer 11 p-5 er beskrevet i eksempel 21 (a). Etter PCR-amplifikasjon med ovenfor nevnte templat og P45o11 p-primere, ble det forsterkede fragment (1,45 kb), fordøyet med SaH og Xhol og satt inn ved kloning i gjærekspresjonsvektoren pGB950 som var kuttet med SaH for å oppnå vektoren pGB11 p-4 (figur 37).
(b) Transformasjon av K. lactis
15 ng av pGB11B-4 ble kuttet ved det sjeldne Sacll-setet i laktase-promotoren og transformasjon av K. lactis CBS 2360 ble utført som beskrevet i eksempel 5(c).
Eksempel 23
Molekylær kloning og konstruksjon av full-lengde cDNA som koder
for det bovine adrenodoxin (ADX), og deretter transformasjon og ekspresjon av ADXcDNA i gjæren Kluweromvces lactis
(a) Molekylær kloning av ADX
Full-lengde ADXcDNA, med 5* og 3' flankerende sekvenser som var modifisert til gjærekspresjonsvektoren pGB950, ble direkte oppnådd fra storfebinyrebark mRNA/cDNA blanding (for detaljert beskrivelse se eksempel 1) ved forsterkning ved bruk av PCR-metoden (se eksempel 18).
For ADXcDNA-forsterkning ble to syntetiske oligomerprimere syntetisert.
Oligomer ADX-1 (5'-CTT CAG TCG ACA AAA ATG AGC AGC TCA GAA GAT AAA ATA-3") som inneholdt 21 baser komplementære til <5->enden av den modne ADXcDNA-sekvensen som beskrevet av Okamura et al (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82, 5705-5709,1985) fra posisjonene 173 til 194. Oligomeren ADX-1 inneholder ved 5-enden 18 tilleggsnukleotider for å lage et Sall-restriksjonssete, et optimalt gjærtranslasjonssignal og en ATG startkodon.
Oligomeren ADX-2 (5'-TGT AAG GTA CCC GGG ATC CTT ATT CTA TCT TTG AGG AGT T-3') er komplementær til 3-enden av minus strengen til ADXcDNA fra posisjon 561 til 540 og inneholder tilleggsnukleotider for å lage restriksjonsseter for BamHI, Smal og Kpnl.
PCR ble utført som beskrevet i eksempel 18 med 1 \ xM hver av ADX-primere og 10 ni mRNA/cDNA-blanding (som beskrevet i eksempel 1) som templat.
Skjematisk oversikt av denne ADXcDNA amplifisering er vist i figur 38.
Det amplifiserte fragmentet inneholder full-lengde ADXcDNA-sekvens med modifiserte flanker, som ble karakterisert ved restriksjonsseteanalyse og nukleotidsekvensering.
(b) Konstruksjon av ekspresjonsvektoren
Det amplifiserte ADXcDNA-fragmentet ble spaltet med Sali og Smal og satt inn ved kloning i gjærekspresjonsvektoren pGB950 kuttet med Sali og EcoRV. Det oppnådde plasmid pGBADX-1 er avbildet i figur 38.
(c) Transformasjon av K. lactis
15 ug av pGBADX-1 ble kuttet ved det sjeldne Sacll-setet i laktase-promotoren og transformasjon av K. lactis CBS 2360 ble utført som beskrevet i eksempel 5(c).
(d) Analyse av transformantene
To transformanter, ADX-101 og ADX-102 og kontrollstammen CBS 2360 ble valgt for videre analyse. Stammene ble dyrket i YEPD-medium for omtrent 64 timer ved 30°C. Totalt cellulært protein ble isolert som beskrevet i eksempel 5{d). Fra supernatantene ble 8 ^l prøver tatt for analyse på immunoblot (se figur 39, spor 3,4 og 5).
Resultatene viste at et protein av den forventede lengde (14 kDa) blir uttrykt i K. lactis-celler transformert med pGBADX-1.
In vitro ADX-aktiviteten til transformant ADX-102 er beskrevet i eksempel 24.
Eksempel 24
In vitro aktivitet til adrenodoxin oppnådd fra
Kluyveromyces lactis ADX-102
K. lactis ADX-102, oppnådd som beskrevet i eksempel 23, og kontrollstamme K. lactis CBS 2360 ble dyrket i 100 ml YEPD-medium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukosemonohydrat) som inneholdt 2,5 ml 6,7% (w/w) gjærnitrogenbase (Difco laboratorier) løsning og 100 mg 1~<1> av geneticin (G418 surfat; Gibco Ltd.), i 56 timer ved 30°C. Cellene ble samlet ved sentrifugering (4000xg, 15 min.), resuspendert i en fysiologisk saltløsning og vasket med fosfatbuffer (pH 7,0, 50 mM). Etter sentrifugering (4000xg, 15 min.) ble bunnfallet løst opp i fosfatbuffer (pH 7,0, 50 mM), hvilket resulterte i en suspensjon som inneholdt 0,5 g cellevåtvekt/ml. Cellene ble ødelagt ved bruk av en Braun MSK homogenisator (6x15 sekunder, 0,45 - 0,50 mm glasskuler). Ikke-ødelagte celler ble fjernet ved sentrifugering (4000xg, 15 min.). Cellefrie ekstrakter (40 mg protein/ml) ble lagret ved -20°C.
ADX-aktivitet, dvs. elektronoverføringskapasitet fra adrenodoxin reduktase til cytokrom P450SCC, i cellefrie ekstrakter ble bestemt ved P4soSCC-aktivitets-måling. Målingsblandingen bestod av de følgende løsningene: Løsning A (naturlig P450SCC elektronavgivende system med unntaket av ADX): et 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0), som inneholdt 3 mM EDTA, 2 |*M adrenodoxinreduktase (renset fra storfebinyrebark), 1 mM NADPH elektrondonor), 15 mM glukose-6-fosfat og 16 enheter/ml glukose-6-fosfat-dehydrogenase (NADPH regenererende system).
Løsning B (substrat og enzym): en micelleløsning av 75 nM kolesterol (dobbelt radiomerket med [26,27-<14>C]-kolesterol (40 Ci/mol) og [7a-<3>H] kolesterol (400 Ci/mol)) og 1,5 \ M P450SCC (renset fra storfe binyrebark) i 10% (v/v) Tergitol™ NP 40/etanol (1:1, v/v).
Målingen ble startet ved å blande 75 |il løsning A med 50 ni løsning B og 125 \ i\ cellefri ekstrakt eller 125 ni kaliumfosfatbuffer (50 mM, pH 7,0) som inneholdt 10 nM ADX (renset fra bovinbinyrebark). Blandingen ble rørt forsiktig ved 30°C. Prøvene ble trukket etter 15 min. inkubasjon og fortynnet med 100 ni vann. Fra en prøve ble substrat og produkt(er) ekstrahert med 100 n' metanol og 150 ni kloroform. Etter sentrifugering (5000xg, 2 min.) ble kloroformlaget samlet og tørket. Det tørre bunnfallet ble løst opp i 50 ni aceton, som inneholdt 0,5 mg steroidblanding (kolesterol, pregnenolon og progesteron (1:1:1, w/w/w)) og deretter ble 110 ni konsentrert maursyre tilsatt. Suspensjonen ble varmet opp i 15 min. ved 120°C. Deretter ble <14>C/<3>H-forholdet bestemt ved dobbeltmerket væskescintillasjonstelling. Forholdet er et direkte mål på sidekjedeklyøvings-reaksjonen, fordi <14>C-merket sidekjede er fordampet fra blandingen som isokaprylsyre under oppvarmingsfremgangsmåten.
Ved bruk av denne metoden kunne ADX elektronoverføreraktivitet bli lett vist i et cellefritt ekstrakt av K. lactis ADX102. I målingene med cellefritt ekstrakt av K. lactis ADX-102 eller med renset ADX, ble sidekjeden til kolesterol kløyvet innen 15 min. med et utbytte på 50%, mens i metoden med cellefritt ekstrakt av kontrollstammen K. lactis CBS 2360 kunne ikke noe sidekjedespalting bli oppdaget.
Eksempel 25
Molekylær kloning og konstruksjon av et full-lengde cDNA som
koder for storfeadrenodoxinoksydoreduktasen (ADR), og etterfølgende transformasjon av ADRcDNA i gjæren Kluweromvces lactis
(a) Kloning av adrenodoxinoksydoreduktase
Storfebinyrebarkcelle cDNA-bibliotek ble laget som beskrevet i eksempel 1 bortsett fra én forandring. En tilleggs ADR-spesifikk primer (oligomer ADR-1) med nukleotidsekvensen 5-GGC TGG GAT CTA GGC-3' ble satt til reaksjonsblandingen til første streng cDNA-syntesen. Oligomer ADR-1 er lokalisert like nedstrøms for translasjonsstoppkodonet fra posisjon 1494 til 1480. Nukleotid-sekvensene og kartposisjonene av nevnte ADR-oligomerer er alle tatt fra ADRcDNA-sekvensresultatene beskrevet av Nonaka et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 145(3), 1239-1247,1987.
Det oppnådde cDNA-bibliotek ble undersøkt med en <32>P-merket oligomer
ADR-2 (5'-CAC CAC ACA GAT CTG GGG GGT CTG CTC CTG TGG GGA-3"). 4 hybridiserende pfu'er ble identifisert og deretter renset. Imidlertid viste bare 1 pfu også et positivt signal med oligomer ADR-3 (5'-TTC CAT CAG CCG CTT CCT CGG GCG AGC GGC CTC CCT-3'), som er lokalisert i midten av ADRcCDNA (posisjon 840 til 805). ADRcDNA-innskuddet (omtrent 2 kb) ble klonet inn i EcoRI-setet til pTZ18R.
Det oppnådde plasmid pGBADR-1 inneholder en full-lengde ADRcDNA som vist ved restriksjonsenzymkartlegging og nukleotidsekvensering. Det fysiske kart til pGBADR-1 er illustrert i figur 40.
(b) Konstruksjon av ekspresjonskassetten
Full-lengde ADRcDNA med modifiserte flankerende sekvenser til gjærekspresjonsvektoren pGB950 ble oppnådd ved PCR-metoden (se eksempel 18) med pGBADR-1 som templat og to spesifikke ADR-oligomerer som primere.
Oligomer ADR-4 (5"-CGA GTG TCG ACA AAA ATG TCC ACA CAG GAG CAG ACC-3') inneholder 18 baser komplementære til de modne ADRcDNA-sekvensene fra posisjon 96 til 114 og 18 baser for å introdusere et Sall-restriksionssete, et optimalt gjærtranslasjonssignal, og en ATG-startkodon.
Oligomer ADR-5 (5'-CGT GCT CGA GGT ACC TCA GTG CCC CAG CAG CCG CAG-3") inneholder 18 baser komplementære til minusstrengen til ADRcDNA oppstrøms for translasjonsstoppkodonet ved posisjon 1479 og 15 baser for å lage Kpnl og Xhol-restrik-sjonsseter for kloning i forskjellige ekspresjonsvektorer.
Etter amplifisering med ovenfor nevnte templat og ADR-primere, ble det amplifiserte fragmentet (1,4 kb) fordøyet med Sali og Xhol og innsatt ved hjelp av kloning i gjærekspresjonsvektoren pGB950 som var kuttet med Sali og Xhol.
Det oppnådde plasmidet pGBADR-2 er illustrert i figur 40.
(c) Transformasjon av K. lactis
15 ng av pGBADR-2 ble kuttet ved det sjeldne Sacll-setet i laktase-promotoren og transformasjon av K. lactis CBS 2360 ble utført som beskrevet i eksempel 5(c).
Eksempel 26
Kloning av full-lengde cDNA som koder for bovin NADPH-cytokrom
P450 reduktase (RED)
Storfebinyrebark cDNA-bibliotek beskrevet i eksempel 1 ble undersøkt med en <32>P-merket syntetisk oligomer 5'-TGC CAG TTC GTA GAG CAC ATT GGT GCG TGG CGG GTT AGT GAT GTC CAG GT-3" spesifikk for en konservert aminosyreregion i rotte-, gris- og kanin RED som beskrevet av Katagari et al. (J. Biochem., 100, 945-954,1986) og Murakami et al. (DNA, 5,1-10,1986).
Fem hybridiserende pfu'er ble oppnådd og karakterisert videre ved restriksjonsenzymkartlegging og nukleotidsekvensering. Full-lengde REDcDNA ble satt inn i ekspresjonsvektorer og transformert til passende vertsceller som nevnt i eksemplene 2, 3 og 6.
Eksempel 27
Konstruksjon, transformasjon og ekspresjon av en ekspresjonskassett som koder for proteinene P450SCC og ADX i gjæren Kluweromvces lactis
(a) Konstruksjon av ekspresjonskassetten
Ekspresjonskassetten pGBADX-1 (se eksempel 23) ble spaltet med Sadl og Hindlll (delvis) og overhengende ender ble utfylt med bruk av Klenow DNA-polymerase. DNA-fragmentet som omfattet en del av laktasepromotoren (men fremdeles funksjonell), den kodende ADX-sekvensen og laktaseterminatoren
ble adskilt og isolert ved agarose-gelelektroforese og deretter innsatt i pGBSCC-7, som ble først linearisert ved Xbal-fordøvelse (se eksempel 5(b)) og overhengende ender utfylt ved bruk av Klenow DNA-polymerase. Konstruksjonen ble satt opp på en slik måte at et enestående restriksjonssete ( Sadl) blir oppnådd, hvilket er
nødvendig for å overføre plasmidet til K. lactis.
Dette sjeldne Sacll-restriksionssetet er lokalisert i laktasepromotor-sekvensen som flankerer SCC-sekvensen, siden Sacl l-restriksjonssetet i laktase-promotoren som flankerer ADX-sekvensen er ødelagt ved utfyllingsreaksjonen.
Den oppnådde ekspresjonskassetten pGBSCC/ADX-1 inneholder den kodende sekvensen for SCC så vel som for ADX, hver drevet av laktase-promotoren.
(b) Transformasjon av K. lactis
Transformasjon av K. lactis CBS 2360 ble utført som beskrevet i eksempel 5(c) med 15 \ ig pGBSCC/ADX-1, som var linearisert ved det sjeldne Sacll-restriksjonssetet. Én transformant (SCC/ADX-101) ble valgt for SCC og ADX ekspresjonsstudier.
(c) Analyse av transformanten K. lactis SCC/ADX-101
Cellulære proteinfraksjoner ble laget fra kulturer av SCC/ADX-101 og kontrollstamme CBS 2360 som beskrevet i eksempel 5(d) og analysert ved SDS/PAGE og Western-blotting. Blotet ble undersøkt ved hjelp av antistoffer som var spesifikke for hhv. SCC og ADX. Sammenlignet med kontrollstammen, viste den cellulære proteinfraksjonen av transformant SCC/ADX-101 to tilleggsbånd med ventet lengde (hhv. 53 og 14 kDa) hvilket viste produksjon av både proteinene SCC og ADX. Produksjonsnivåer av begge proteiner i transformant SCC/ADX-101 er sammenlignbare med nivåene observert i transformantene som produserte bare ett protein (for SCC se figur 15A, spor 3, og for ADX figur 39, spor 5).
I n vitro SCC og ADX-aktivitet i transformant SCC/ADX-101 er beskrevet i eksempel 28.
Eksempel 28
In vitro aktivitet av P450SCC og adrenodoxin oppnådd fra Kluweromvces lactis SCC/ADX-101
K. lactis SCC/ADX-101 oppnådd som beskrevet i eksempel 27 og kontrollstamme K. lactis SCC-101 som beskrevet i eksempel 5(d) ble dyrket i 1 I YEPD medium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 2% glukosemonohydrat) som inneholdt 100 mg 1"<1> av geneticin (G418-sulfat; Gibco Ltd.), i 72 timer ved 30°C. Cellene ble samlet ved sentrifugering (4000xg, 15 min.), resuspendert i fysiologisk saltløsning og vasket med fosfatbuffer (pH 7,5, 75 mM). Etter sentrifugering (4000xg, 15 min.) ble bunnfallet resuspendert i fosfatbuffer (pH 7,5, 75 mM) hvilket resulterte i en suspensjon som inneholdt 0,5 g celle våtvekt/ml. Cellene ble ødelagt ved bruk av en Braun MSK homongenisator (6x15 sekunder, 0,45 - 0,50 mm glasskuler). Ikke-ødelagte celler ble fjernet ved sentrifugering (4000xg, 15 min.).
I de cellefrie ekstraktene ble aktiviteten til proteinkomplekset P45oSCC/ADX målt, ved å bestemme kolesterol sidekjedekløyvingsreaksjon i nærværet av NADPH og ADR. Testblandingen inneholdt de følgende løsningene: Løsning A (naturlig P450SCC elektronavgivende system med unntagelse av ADX): 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0), som inneholder 3 mM EDTA, 2 \ M adrenodoxinreduktase (renset fra storfebinyrebark), 1 mM NADPH (elektrondonor), 15 mM glukose-6-fosfat og 16 enheter/ml glukose-6-fosfat-dehydrogenase (NADPH regenererende system).
Løsning B (substrat): micelleløsning av 37,5 |iM kolesterol (dobbelt radioaktivt merket med [26,27-<14>C] kolesterol (40 Ci/mol) og [7<x-<3>H] kolesterol (400 Ci/mol)) i 10% (v/v) TergitolTM NP 40/etanol (1:1, v/v).
Målingen ble startet ved å blande 75 ul løsning A med 50 (il løsning B og 125 ni cellefri ekstrakt. Blandingen ble omrørt forsiktig ved 30°C. Prøvene ble trukket etter 60 min. inkubasjon og fortynnet med 100 ni vann. Fra en prøve ble substrat og produkt(er) ekstrahert med 100 n' metanol og 150 [ i\ kloroform. Etter sentrifugering (5000xg, 2 min.) ble kloroformlaget samlet og tørket. Det tørre bunnfallet ble løst opp i 50 ni aceton, som inneholdt 0,5 mg steroid blanding (kolesterol, pregnenolon og progesteron (1:1:1, w/w/w)) og deretter ble 110 ni konsentrert maursyre tilsatt.
Suspensjonen ble oppvarmet 15 min. ved 120°C. Heretter ble 14C/3H-forholdet bestemt ved dobbeltmerket væskescintillasjonstelling. Forholdet er et direkte målt for sidekjedekløyvingsreaksjonen, fordi <14>C-merket sidekjede er fordampet fra blandingen som isokaprylsyre under oppvarmingsfremgangsmåten.
Ved bruk av denne metoden ble kolesterolsidekjedekløyvingsaktivitet vist i det cellefrie ekstraktet til K. lactis SCC/ADX-101, mens i det cellefrie ekstraktet fra K. lactis SCC101 ble ikke noe aktivitet målt.
Ved hjelp av HPLC-analyse, ble reaksjonsproduktet laget av et cellefritt ekstrakt fra K. lactis SCC/ADX-101 identifisert som pregnenolon.

Claims (27)

1. Anvendelse av en ekspresjonskassett i multigensystemer for utførelse av flertrinns-omdannelser som gjengitt i figur 1 hvor ekspresjonskassetten er operable i en ikke-pattedyr rekombinant vert, karakterisert ved at ekspresjonskassetten omfatter en heterolog kodende DNA-sekvens som koder for et protein som er funksjonelt, alene eller sammen med ett eller flere tilleggsproteiner, i å katalysere et oksydasjonstrinn i den biologiske reaksjonsvei for omdannelse av kolesterol til hydrokortison, hvis trinn er valgt fra gruppen bestående av : omdannelse av kolesterol til pregnenolon; omdannelse av pregnenolon til progesteron; omdannelse av progesteron til 17a-hydroksyprogesteron; omdannelse av 17a-hydroksyprogesteron til cortexolon; og omdannelse av cortexolon til hydrokortison, og de korresponderende kontrollsekvenser som er effektive i nevnte vert.
2. Anvendelse av en ekspresjonskassett ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet er valgt fra gruppen bestående av: sidekjede-kløyvende enzym (P450SCC); adrenodoxin (ADX); adrenodoxin reduktase (ADR); 3B-hydroksysteroid dehydrogenase/isomerase (3B-HSD); steroid-17a-hydroksylase (P45o17cc); NADPH cytokrom P45o reduktase (RED); steroid-21 -hydroksylase (P45oC21); og steroid-11 B-hydroksylase (P45011B).
3. Anvendelse av en ekspresjonskassett ifølge krav 2, karakterisert ved at den heterologe kodende DNA-sekvensen stammer fra storfearter.
4. Anvendelse av en ekspresjonskassett pGBSCC-5 ifølge krav 3, karakterisert ved at den heterologe DNA-sekvensen koder for enzymet P450SCC og at ekspresjonskassetten gjengitt i figur 8, er operativ i Bacillus.
5. Anvendelse av ekspresjonskassetten pGBSCC-17 ifølge krav 3, karakterisert ved at den heterologe DNA-sekvensen koder for enzymet P450SCC og at ekspresjonskassetten som er gjengitt i figur 10, er operativ i E. coli.
6. Anvendelse av ekspresjonskassetten ifølge krav 5, karakterisert ved at det heterologe DNA koder for enzymet P450SCC og at ekspresjonskassetten som er operativ i Kluyveromyces lactis, er tatt fra gruppen bestående av pGBSCC-7 gjengitt i figur 14, pGBSCC-12 gjengitt i figur 18 og pGBSCC-15 gjengitt i figur 20, eller at ekspresjonskassetten operativ i Saccharomyces cerevisiae, er tatt fra gruppen bestående av pGBSCC-10 gjengitt i figur 17, pGBSCC-13 gjengitt i figur 19 og pGBSCC-16 gjengitt i figur 21.
7. Anvendelse av ekspresjonskassetten pGB17a-5 ifølge krav 3, karakterisert ved at det heterologe DNA koder for enzymet P45017a og at ekspresjonskassetten gjengitt i figur 24, er operativ i Kluyveromyces lactis.
8. Anvendelse av en ekspresjonskassett pGB17a-8 ifølge krav 3, karakterisert ved at det heterologe DNA koder for et enzym P45017a og at ekspresjonskassetten som er gjengitt i figur 27, er operativ i arter av Bacillus.
9. Anvendelse av en ekspresjonskassett pGB11p-4 ifølge krav 3, karakterisert ved at det heterologe DNA koder for et enzym P45011P og at ekspresjonskassetten som er gjengitt i figur 37, er operativ i Kluyveromyces lactis.
10. Ekspresjonskassett, operabel i en ikke-pattedyr rekombinant vert omfattende en heterolog kodende DNA-sekvens som koder for et protein, som er funksjonelt, alene eller sammen med en eller flere tilleggsproteiner i å katalysere et oksydasjons-trinn i den biologiske reaksjonsvei for omdannelse av kolesterol til hydrokortison, hvis trinn er valgt fra gruppen bestående av: omdannelse av kolesterol til pregnenolon; omdannelse av pregnenolon til progesteron; omdannelse av progesteron til 17a-hydroksyprogesteron; omdannelse av 17a-hydroksyprogesteron til cortexolon; og omdannelse av cortexolon til hydrokortison, og de korresponderende kontrollsekvenser som er effektive i nevnte vert,karakterisert ved at proteinet er valgt fra gruppen bestående av: sidekjede-kløyvende enzym (P450SCC); adrenodoxin (ADX); adrenodoxin reduktase (ADR); 3p-hydroksysteroid dehydrogenase/isomerase (3p-HSD); steroid-17ct-hydroksylase (P4so17a); NADPH cytokrom P45o reduktase (RED); steroid-21 -hydroksylase (P450C2I); og steroid-11 p-hydroksylase (P45011P). og at det heterologe DNA koder for i det minste et tilleggsprotein av den nevnte gruppe proteiner.
11. Ekspresjonskassett ifølge krav 10, operabel i en ikke-pattedyr rekombinant vert omfattende en heterolog kodende DNA-sekvens som koder et protein, som er funksjonelt alene eller sammen med et eller flere tilleggsproteiner i å katalysere et oksydasjonstrinn i den biologiske reaksjonsvei for omdannelse av kolesterol til hydrokortison, hvis trinn er valgt fra gruppen bestående av: omdannelse av kolesterol til pregnenolon; omdannelse av pregnenolon til progesteron; omdannelse av progesteron til 17a-hydroksyprogesteron; omdannelse av 17a-hydroksyprogesteron til cortexolon; og omdannelse av cortexolon til hydrokortison, og de korresponderende kontrollsekvenser som er effektive i nevnte vert,karakterisert ved at proteinet er valgt fra gruppen bestående av : sidekjede-kløyvende enzym (P450SCC); adrenodoxin (ADX); adrenodoxin reduktase (ADR); 3p-hydroksysteroid dehydrogenase/isomerase (3B-HSD); steroid-17a-hydroksylase (P45o17a); NADPH cytokrom P45o reduktase (RED); steroid-21 -hydroksylase (P45oC21); og steroid-11 p-hydroksylase (P45011P), og hvor det heterologe DNA som koder for nevnte tilleggsprotein, er et tilleggs-heterologt DNA med sine egne effektive kontrollsekvenser som koder for et protein fra nevnte gruppe av proteiner.
12. Ekspresjonskassett ifølge kravene 10 og 11, karakterisert ved at det heterologe DNA koder for storfe P450SCC og storfe ADX.
13. Ekspresjonskassett operabel i en ikke-pattedyr rekombinant vert karakterisert ved at den omfatter en heterolog kodende DNA-sekvens som koder for i det minste to proteiner, som er funksjonelle, alene eller sammen med en eller flere tilleggsproteiner, i å katalysere i det minste to oksydasjonstrinn valgt fra gruppen bestående av: omdannelse av kolesterol til pregnenolon; omdannelse av pregnenolon til progesteron; omdannelse av progesteron til 17<x-hydroksyprogesteron; omdannelse av 17a-hydroksyprogesteron til cortexolon; og omdannelse av cortexolon til hydrokortison, og de korresponderende kontrollsekvenser som er effektive i nevnte vert.
14. Ekspresjonskassett ifølge krav 13, operabel i en ikke-pattedyr rekombinant vert omfattende en heterolog kodende DNA-sekvens som koder for minst to proteiner, som er funksjonelle alene eller sammen med et eller flere tilleggsproteiner, i å katalysere et oksydasjonstrinn valgt fra gruppen bestående av: omdannelse av kolesterol til pregnenolon; omdannelse av pregnenolon til progesteron; omdannelse av progesteron til 17cc-hydroksyprogesteron; omdannelse av 17a-hydroksyprogesteron til cortexolon; og omdannelse av cortexolon til hydrokortison,karakterisert ved at det heterologe DNA som koder for det andre proteinet har sine egne effektive kontrollsekvenser.
15. Ekspresjonskassett ifølge kravene 13 eller 14, karakterisert ved at proteinet er valgt fra gruppen bestående av: sidekjede-kløyvende enzym (P450SCC); adrenodoxin (ADX); adrenodoxin reduktase (ADR); 3B-hydroksysteroid dehydrogenase/isomerase (3B-HSD); steroid-17a-hydroksylase (P45017a); NADPH cytokrom P450 reduktase (RED); steroid-21 -hydroksylase (P450C2I); og steroid-11 p-hydroksylase (P45011P)-
16. Ekspresjonskassett ifølge krav 15, karakterisert ved at den heterologe kodende DNA-sekvensen stammer fra storfearter.
17. Rekombinant vertscelle omfattende celler av mikroorganismer, planter eller ikke-pattedyr dyr inneholdede en ekspresjonskassett med heterologt DNA, karakterisert ved at ekspresjonskassetten er en definert i ethvert av kravene 10-16.
18. Rekombinant vertscelle ifølge krav 17, karakterisert ved at verten er en mikroorganisme.
19. Rekombinant vertscelle ifølge krav 18, karakterisert ved at verten er en art av Saccharomyces, Kluyveromyces eller Bacillus eller er Escherichia coli.
20. Rekombinant vertscelle ifølge ethvert av kravene 17-19 og inneholdende i det minste to ekspresjonskassetter, karakterisert ved at de er som definert i ethvert av kravene 10-16.
21. Fremgangsmåte for fremstilling av en blanding av eksogene proteiner av en rekombinant celle i et næringsmedium under betingelser som gjør det mulig for enzymene å dannes og akkumuleres i kulturen, karakterisert ved at den rekombinante cellen er en rekombinant vertscelle som definert i krav 20.
22. Fremgangsmåte for selektiv biokjemisk oksydasjon in vitro hvor prosessen omfatter: inkubering av forbindelsen som skal oksyderes i nærvær av proteiner under betingelser som tillater oksydasjon og akkumulering av oksydert forbindelse i væskekulturen, etterfulgt av gjenvinning av oksydert forbindelse, karakterisert ved at proteinene har blitt fremstilt ved fremgangsmåten i krav 21.
23. Fremgangsmåte for oksydasjon av en valgt forbindelse hvor fremgangsmåten omfatter: dyrking av rekombinante celler i nærvær av nevnte forbindelse under betingelser hvor den ønskede oksydasjonen forekommer og den oksyderte forbindelsen akkumulerer i væskekulturen, fulgt av gjenvinning av den oksyderte forbindelsen, karakterisert ved at de rekombinante celler er de rekombinante vertsceller ifølge ethvert av kravene 17-20.
24. Fremgangsmåte ifølge kravene 22 eller 23, karakterisert ved at oksydasjonen er en valgt fra gruppen bestående av: spalting av sidekjeden av en sterol-forbindelse tii pregnenolon; omdannelse av pregnenolon ti) progesteron; omdannelse av progesteron til 17a-hydroksyprogesteron; omdannelse av 17a-hydroksyprogesteron til cortexolon; og omdannelse av cortexolon til hydrokortison,
25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at oksydasjonen er spalting av sidekjeden av en sterol-forbindelse resulterende i pregnenolon.
26. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at oksydasjonen er 17<x-hydroksylering til progesteron.
27. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at i det minste to oksydasjoner fra nevnte gruppe utføres på det samme substratmolekyl i ett trinn.
NO19904791A 1988-05-06 1990-11-05 Anvendelse av ekspresjonskassett i multigensystemer, ekspresjonskassett, rekombinant vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av enblanding av eksogeneproteiner, fremgangsmåte for selektiv biokjemisk oksydasjon, samtfremgangsmåtefor osydas NO314267B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP88200904 1988-05-06
EP88202080 1988-09-23
PCT/NL1989/000032 WO1989010963A1 (en) 1988-05-06 1989-05-08 Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO904791D0 NO904791D0 (no) 1990-11-05
NO904791L NO904791L (no) 1991-01-04
NO314267B1 true NO314267B1 (no) 2003-02-24

Family

ID=26115083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19904791A NO314267B1 (no) 1988-05-06 1990-11-05 Anvendelse av ekspresjonskassett i multigensystemer, ekspresjonskassett, rekombinant vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av enblanding av eksogeneproteiner, fremgangsmåte for selektiv biokjemisk oksydasjon, samtfremgangsmåtefor osydas

Country Status (16)

Country Link
JP (2) JP2963711B2 (no)
KR (1) KR100256025B1 (no)
CN (1) CN1038667A (no)
AT (1) ATE201235T1 (no)
AU (1) AU635494B2 (no)
CA (1) CA1340616C (no)
DE (1) DE68929296T2 (no)
DK (1) DK175573B1 (no)
ES (1) ES2157883T3 (no)
FI (1) FI109605B (no)
HU (1) HU217411B (no)
IL (1) IL90207A (no)
NO (1) NO314267B1 (no)
NZ (1) NZ229032A (no)
PT (1) PT90484B (no)
WO (1) WO1989010963A1 (no)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1042567A (zh) * 1988-09-23 1990-05-30 吉斯特-布罗卡迪斯公司 类固醇多步氧化方法和所用的遗传工程细胞
EP0477961B1 (en) * 1990-09-26 1996-09-11 Sumitomo Chemical Company, Limited Mitochondrial P450
US5420027A (en) * 1991-01-10 1995-05-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the expression of biologically active fusion proteins comprising a eukaryotic cytochrome P450 fused to a reductase in bacteria
US5240831A (en) * 1991-01-10 1993-08-31 Board Of Regents, The University Of Texas Methods and compositions for the expression of biologically active eukaryotic cytochrome p45os in bacteria
US9255256B2 (en) 1996-07-17 2016-02-09 Btg International Limited Expression of functional cytochorome P450 monooxygenase system in enterobacteria
GB9615032D0 (en) 1996-07-17 1996-09-04 Univ Dundee Enzyme system
FR2820145B1 (fr) * 2001-01-31 2004-01-23 Aventis Pharma Sa Souche de levure produisant des steroides de facon autonome
JPWO2010079594A1 (ja) * 2009-01-07 2012-06-21 三菱化学株式会社 ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用
CN118109544A (zh) 2013-06-17 2024-05-31 赛诺菲 用于细胞色素p450单加氧酶生物催化的全细胞系统
JP6608372B2 (ja) * 2014-01-20 2019-11-20 サノフイ 酵素活性が増大した新規チトクロムｐ４５０ポリペプチド
JP5800040B2 (ja) * 2014-01-29 2015-10-28 三菱化学株式会社 ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4720454A (en) * 1984-04-18 1988-01-19 White Perrin C Genetic probe used in the detection of adrenal hyperplasia

Also Published As

Publication number Publication date
HU893289D0 (en) 1990-12-28
AU635494B2 (en) 1993-03-25
ES2157883T3 (es) 2001-09-01
PT90484A (pt) 1989-11-30
IL90207A0 (en) 1989-12-15
NZ229032A (en) 1992-06-25
HU217411B (hu) 2000-01-28
DK175573B1 (da) 2004-12-13
FI109605B (fi) 2002-09-13
AU3575989A (en) 1989-11-29
JPH11308991A (ja) 1999-11-09
DK264890A (da) 1990-11-05
ATE201235T1 (de) 2001-06-15
JPH04500303A (ja) 1992-01-23
PT90484B (pt) 1994-08-31
HUT54413A (en) 1991-02-28
KR900702022A (ko) 1990-12-05
IL90207A (en) 1994-07-31
DE68929296T2 (de) 2001-12-06
CN1038667A (zh) 1990-01-10
FI905464A0 (fi) 1990-11-05
DE68929296D1 (de) 2001-06-21
KR100256025B1 (ko) 2000-05-01
WO1989010963A1 (en) 1989-11-16
NO904791D0 (no) 1990-11-05
NO904791L (no) 1991-01-04
CA1340616C (en) 1999-06-29
JP2963711B2 (ja) 1999-10-18
DK264890D0 (da) 1990-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Szczebara et al. Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast
EP2386634A1 (en) Sterol side chain-cleaving enzyme protein and use thereof
NO314267B1 (no) Anvendelse av ekspresjonskassett i multigensystemer, ekspresjonskassett, rekombinant vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling av enblanding av eksogeneproteiner, fremgangsmåte for selektiv biokjemisk oksydasjon, samtfremgangsmåtefor osydas
KR100422293B1 (ko) 델타-5,7스테롤,델타-7리덕타제활성을갖는에이.탈리아나의단백질을코딩하는dna서열,델타-7레드단백질,그제조방법,형질전환된효모균주및그용도
CA1340563C (en) Process for the multiple oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
EP0340878B1 (en) Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
US5869283A (en) Expression cassette operable in a recombinant host
AU748129B2 (en) Yeast strains with interrupted ATF2 gene and uses
Chen et al. Molecular Cloning, Expression of CPR Gene from Rhizopus oryzae into Rhizopus nigericans and Its Application in the 11α-Hydroxylation of 16α, 17-Epoxy-progesterone
JP5800040B2 (ja) ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用
JP4668176B2 (ja) トリテルペン水酸化酵素
IE83307B1 (en) Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
JPH0569511B2 (no)

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired