Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

DK175573B1 - Anvendelse af en ekspressionskassette förende til biokemisk oxidation af steroider, sådanne ekspressionskassetter, - Google Patents

Anvendelse af en ekspressionskassette förende til biokemisk oxidation af steroider, sådanne ekspressionskassetter, Download PDF

Info

Publication number
DK175573B1
DK175573B1 DK199002648A DK264890A DK175573B1 DK 175573 B1 DK175573 B1 DK 175573B1 DK 199002648 A DK199002648 A DK 199002648A DK 264890 A DK264890 A DK 264890A DK 175573 B1 DK175573 B1 DK 175573B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
conversion
expression cassette
progesterone
heterologous dna
pgbscc
Prior art date
Application number
DK199002648A
Other languages
English (en)
Other versions
DK264890A (da
DK264890D0 (da
Inventor
Harmen Slijkhuis
Gerardus Cornelis Maria Selten
Eric Bastiaan Smaal
Original Assignee
Aventis Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Sa filed Critical Aventis Pharma Sa
Publication of DK264890A publication Critical patent/DK264890A/da
Publication of DK264890D0 publication Critical patent/DK264890D0/da
Application granted granted Critical
Publication of DK175573B1 publication Critical patent/DK175573B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/02—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12Y106/02004—NADPH-hemoprotein reductase (1.6.2.4), i.e. NADP-cytochrome P450-reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 16 (17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J13/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17
    • C07J13/007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a carbon-to-carbon double bond from or to position 17 with double bond in position 17 (20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J21/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having an oxygen-containing hetero ring spiro-condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C07J21/005—Ketals
    • C07J21/006—Ketals at position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/005—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of only two carbon atoms, e.g. pregnane derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0015—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J5/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond
    • C07J5/0007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa
    • C07J5/0023—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa substituted in position 16
    • C07J5/003—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group including 16-alkylidene substitutes
    • C07J5/0038—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane and substituted in position 21 by only one singly bound oxygen atom, i.e. only one oxygen bound to position 21 by a single bond not substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a saturated or unsaturated hydrocarbon group including 16-alkylidene substitutes by an alkyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/0015—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa
    • C07J7/002—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/004—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa
    • C07J7/0045—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/008—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms substituted in position 21
    • C07J7/009—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms substituted in position 21 by only one oxygen atom doubly bound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12N9/0042—NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0095—Oxidoreductases (1.) acting on iron-sulfur proteins as donor (1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01053—3-Alpha (or 20-beta)-hydroxysteroid dehydrogenase (1.1.1.53)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15004—Steroid 11-beta-monooxygenase (1.14.15.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15006—Cholesterol monooxygenase (side-chain-cleaving) (1.14.15.6), i.e. cytochrome P450scc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C12Y114/99009—Steroid 17-alpha-monooxygenase (1.14.99.9), i.e. cytochrome-P450-steroid-17-alpha-hydroxylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y118/00—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18)
    • C12Y118/01—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.18.1)
    • C12Y118/01002—Ferredoxin-NADP+ reductase (1.18.1.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

DK 175573 B1 i
Opfindelsen angår anvendelse af en ekspressionskassette i multigeniske systemer til gennemføring af mangetrinsomdannelser som vist på figur 1 i den ledsagende tegning, hvor ekspressionskassetten kan fungere i 5 en ikke pattedyrs rekombinant vært. Endvidere angår opfindelsen en ekspressionskassette, der kan fungere i en ikke patedyrs rekombinant vært, omfattende en heterolog DNA kodende for et protein, der alene eller i samarbejde med et eller flere yderligere proteiner fungerer ved 10 at katalysere et oxidationstrin i den biologiske reaktionsvej for omdannelse af cholesterol til hydrocorti-son, samt en sådan ekspressionskassette kodende for mindst to proteiner, der alene eller i samarbejde med et eller flere yderligere proteiner fungerer ved at ka-15 talysere mindst to sådanne oxidationstrin. Yderligere angår opfindelsen en rekombinant værtscelle og afkommet deraf omfattende celler af mikroorganismer, planter eller dyr og indeholdende en ekspressionskassette med heterolog DNA og en række fremgangsmåder, nemlig til 20 fremstilling af en blanding af endogene proteiner ved hjælp af en rekombinant celle i et næringsmiddel under sådanne betingelser, at enzymerne kan dannes og akkumuleres i kulturen; til selektiv biokemisk oxidation in vitro omfattende at man inkuberer den forbindelse, der 25 skal oxideres, under tilstedeværelse af et eller flere proteiner under betingelser, der tillader denne oxidation og en akkumulering af den dannede oxiderede forbindelse i dyrkningsvæsken, hvorefter man udvinder den oxiderede forbindelse; og endelig til oxidation af en 30 udvalgt forbindelse omfattende at man dyrker rekombinant celler under tilstedeværelse af den udvalgte forbindelse under betingelser, hvorved den ønskede oxidation sker og den oxiderede forbindelse akkumuleres i 2 DK 175573 B1 dyrkningsvæsken, hvorefter man udvinder den oxiderede forbindelse.
11β,17a,21-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion (hydrocortison) er et vigtigt farmaceutisk steroid, der 5 benyttes på grund af sine farmakologiske egenskaber som et corticosteroid og som en udgangsforbindelse til fremstilling af adskillige nyttige steroider, især andre corticosteroider. Hydrocortison frembringes i binyrebarken hos hvirveldyr og blev oprindelig opnået i 10 små mængder ved hjælp af en omstændelig ekstraktion fra binyrebarkvæv. Man kunne først udvikle nye produktionsveje efter opklaring af strukturen, idet disse bestod af en kombination af trin med kemisk syntese og mikrobielle omdannelser. Den i øjeblikket tilgængelige pro-15 ces giver kun et billigere produkt, fordi udgangsforbindelserne såsom steroler, galdesyrer og sapogeniner er let tilgængelige og billige, men processen er stadig temmelig kompliceret. Man har forsøgt adskillige muligheder for at forbedre de nuværende processer og 20 også forsøgt biokemiske veje.
Ved et forsøg skulle et passende udgangssteroid omdannes i et in vitro biokemisk system under anvendelse af de isolerede binyrebarkproteiner, der vides at være ansvarlige for den enzymatiske omdannelse in vivo 25 af steroider til hydrocortison. Imidlertid forekom den besværlige isolation af proteinerne og den høje pris for de nødvendige cofaktorer at være prohibitive for en økonomisk tiltrækkende proces i stor skala, ved et andet forsøg skulle man holde de katalyserende proteiner 30 i deres naturlige omgivelser og lade binyrebarkceller-ne producere det ønskede hydrocortison i en cellekultur. Men i praksis forekom det umuligt på grund af den lave produtivitet af cellerne at gøre en sådan biokemisk proces økonomisk tiltrækkende.
DK 175573 B1 3
In vivo processen i binyrebarken hos pattedyr og andre hvirveldyr udgør en biokemisk omdannelsesvej, der begynder med cholesterol og over forskellige mellemprodukter til slut fører til hydrocortison (se fig. 1).
5 otte proteiner er direkte involveret i denne omdannelsesvej , idet fem af disse er enzymer, hvoriblandt fire cytochrom P450 enzymer, og de andre tre er elektronoverførende proteiner.
Det første trin er omdannelsen af cholesterol 10 til 33-hydroxy-5-pregnen-20-on (pregnenolon). Ved denne omdannelse, en monooxygenasereaktion, er tre proteiner involverede; sidekædespaltende enzym (P45QSCC, et hæme-Fe-holdigt protein), adrenodoxin (ADX, et Fe2S2 holdigt protein) og adrenodoxinreduktase (ADR, et FAD-holdigt 15 protein). Reaktionen kræver ud over cholesterol som substrat yderligere molekylært oxygen og NADPH.
I det følgende omdannes pregnenolon ved dehy-drogenering/isomerisering til 4-pregnen-3,20-dion (progesteron).
20 Denne reaktion, der katalyseres af protein 3β- hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase (3p-HSD), kræver pregnenolon og NAD+.
Til opnåelse af hydrocortison bliver progesteron derefter hydroxyleret ved tre stillinger, idet disse 25 omdannelser katalyseres af monooxygenaser. Ved omdannelse af progesteron til 17a-hydroxyprogesteron er to proteiner involveret; steroid 17a-hydroxylase (P450l7a^ et hæm-Fe-holdigt protein) og NADPH cytochrom P45q re-duktase (RED, et FAD- og FMN-holdigt protein). Ved 30 reaktionen forbruges progesteron, molekylært oxygen og NADPH.
Til omdannelsen af 17a-hydroxyprogesteron til 17a,2l-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion (cortexolon) kræ- 4 DK 175573 B1 ves også to proteiner: steroid-2l-hydroxylase (P450C2i, et hæm-Fe-holdigt protein) og det ovennævnte protein RED. Ved reaktionen forbruges 17a-hydroxyprogesteron, molekylært oxygen og NADPH.
5 Ved omdannelsen af cortexolon til hydrocortison er tre proteiner involverede: steroid Ιΐβ-hydroxylase (Ρ45011β, et hæm-Fe-holdigt protein) og de ovenfor nævnte proteiner ADX og ADR.
Som ovenfor beskrevet er cytochrom P45Q protei-10 ner enzymer, der er essentielle for den biokemiske omdannelse af cholesterol til hydrocortison. Disse enzymer hører til en større gruppe af cytochrom P450 proteiner (eller kort P450 proteiner). Man har fundet disse i prokaryoter (forskellige bakterier) og eukaryoter 15 (gærarter, skimmelsvampe, planter og dyr). Hos pattedyr findes et højt niveau af P450 proteiner i binyrebark, æggestokke, testikler og lever.
Mange af disse proteiner er nu blevet oprenset og er godt karakteriserede, og man har bestemt deres 20 specifikke aktivitet. I de senere år er et antal oversigtsartikler herom blevet offentliggjort, såsom K. Ruckpaul og H. Rein (eds), "Cytochrome P450" og P.R.
Ortiz de Montellano (ed.) "Cytochrome P45q structure, mechanism and biochemistry". Cytochrom P45Q proteiner 25 er ejendommelige ved deres specifikke absorbansmaksi-mum ved 450 nm efter reduktion med carbonmonoxid. I prokaryotiske organismer er P450 proteinerne enten bundet til membraner eller er cytoplasmatiske. Såvidt man har detaljerede studier over bakterielle Ρ450 proteiner 30 (f.eks. P450meg og P450cam), har man vist, at et ferre-doxin og en ferredoxinreduktase er involveret i den hydroxylerende aktivitet. Hvad angår eukaryotiske organismer findes to typer af P450 proteiner I og II beskrevet. De to forskelle mellem disse er: 5 DK 175573 B1 1. Hvad angår subcellulær lokalisering er type I lokaliseret i den mikrosomale fraktion, og type II er lokaliseret i den indre membran af mitochondria; 2. Hvad angår den måde, hvor elektroner overfø-5 res til Ρ450 proteinet, vil type I blive reduceret af NADPH via en P450 reduktase, hvorimod type II reduceres af NADPH via en ferredoxinreduktase (f.eks. adreno-doxinreduktase) og et ferredoxin (f.eks. adrenodoxin).
Ifølge EP-A-0281245 kan man fremstille cytochrom 10 P450 enzymer fra Streptomyces specier og benytte disse til hydroxylering af kemiske forbindelser.
Enzymerne benyttes på isoleret form, hvilket er en temmelig omstændelig og kostbar procedure.
JP-A-62236485 (Derwent 87-331234) belærer os om, 15 at det er muligt at indføre gener fra lever cytochrom P450 enzymer i Saccharomyces cerevisiae og at eksprime-re disse til opnåelse af enzymer, der kan benyttes med henblik på deres oxiderende aktivitet.
Imidlertid er der i ovenstående referencer ingen 20 henvisning til anvendelse af cytochrom P450 enzymer til fremstilling af steroidforbindelser.
Opfindelsen tilvejebringer en lang række ekspressionskassetter til produktion af proteiner, der er nødvendige ved konstruktionen af et multigent system 25 til omdannelse i ét trin af billige steroidudgangsmaterialer til sjældnere og kostbarere slutprodukter, idet en sådan omdannelse udføres i native systemer ved en række enzymkatalyserede og cofaktormedierede omdannelser, såsom produktionen af hydrocortison fra 30 cholesterol. Ekspressionskassetterne ifølge opfindelsen er nyttige i den sluttelige produktion af multigene systemer til udførelse af disse mangetrinsomdannelser.
I overensstemmelse hermed er den ovenfor definerede anvendelse af en ekspressionskassette ejendommelig 6 DK 175573 B1 ved, at ekspressionskassetten omfatter en heterolog DNA kodende sekvens, der koder for et protein, idet dette alene eller i samarbejde med et eller flere yderligere proteiner fungerer ved at katalysere et oxidationstrin 5 i den biologiske omdannelsesvej fra cholesterol til hy-drocortison, hvor dette trin er udvalgt blandt omdannelsen af cholesterol til pregnelonon; omdannelse af pregnenolon til progesteron; omdannelse af progesteron til 17«<-hydroxyprogesteron; omdannelse af 17o(-hydroxy-10 progesteron til cortexolon; og omdannelse af cortexolon til hydroxycortison; samt de i værten effektive kontrolsekvenser. Ekspressionskassetterne ifølge opfindelsen omfattende DNA kodende for henholdsvis et eller mindst to proteiner, der katalyserer et eller mindst to 15 oxidationstrin er begge ejendommelig ved, at dette/dis-se oxidationstrin er valgt fra omdannelsen af cholesterol til pregnelonon; omdannelse af pregnenolon til progesteron; omdannelse af progesteron til 17©c-hydroxy-progesteron; omdannelse af 17c* -hydroxyprogesteron 20 til cortexolon; og omdannelse til cortexolon til hydroxycortison; samt ved de i værten effektive kontrolsekvenser. Den rekombinante værtscelle eller afkommet deraf ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at ekspressionskassetten er en sådan ifølge opfindelsen; og 25 endelig er de tre nævnte fremgangsmåder Ifølge opfindelsen ved første og tredje fremgangsmåde ejendommelige ved, at de udnytter en rekombinant værtscelle ifølge opfindelsen, og i andet tilfælde ved udnyttelse af et protein fremstillet ved den førstnævnte fremgangsmåde.
30 7 DK 175573 B1
KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGEN
På alle figurer benyttes følgende forkortelser: R-L, EcoRI; H, Hindlll; Sc, Seal; P, PstI; K, Kpnl; St, 5 Stul; Sp, SphI; X, Xbal; N, Ndel; S, Smal; Ss, SstI;
Ry, EcoRV; S-j-, SacI; B, BamHI; Sjj, SacII; Sal, Sall;
Xh, Xhol; Pv, PvuII; Bg, Bglll og M, Mlul.
Figur 1 viser en skematisk oversigt over de proteiner, der er involveret i trinnene i rækkefølge under 10 omdannelsen af cholesterol til hydrocortison som den forekommer i binyrebarken hos pattedyr.
Figur 2 viser konstruktionen af plasmid pGBSCC-1. P450SCC-sekvenserne ses i en firkant ()·
Figur 3 viser indsættelsen af et syntetisk af-15 ledt Pstl/Hindlll fragment indeholdende S'-P^qSCC-sekvenserne i plasmidet pTZl8R til opnåelse af plasmi-det pTZ synlead.
Figur 4 viser konstruktionen af et p450SCCcDNA i fuld længde af syntetiske (1,..-,..-1 ) og ved cDNA kloning 20 ( W//Å ) opnåede P450SCC-sekvenser i pTZ18R til opnåelse af pGBSCC-2.
Figur 5 viser den fuldstændige nucleotidsekvens af plasmidet pBHA-i.
Figur 6 er en skematisk repræsentation af kon-25 struktionen af pGBSCC-3. P450SCCcDNA sekvenser fra plasmid pGBSCC-2 blev Indført i Baclllus/E. coll overfø-ringsplasmidet pBHA-1. Udfyldte firkanter er som forklaret på figur 4.
Figur 7 viser indførelsen af et Ndel restrikti-onssted i kombination med et ATG starteodon før P45oSCC-modningsstedet i pGBSCC-3 til opnåelse af pGBSCC-4.
8 DK 175573 B1
Figur 8 viser en fysisk afbildning af pGBSCC-5, der er opnået ved fjernelse af E. coll sekvenser fra plasmid pGBSCC-4.
Figur 9 viser et Western blot analyseret med an-5 tistoffer mod p4cjqSCC, der demonstrerer P450SCC ekspressionen af plasmid pGBSCC-5 indført i B♦ subtllls (bane c) og B. lichenlformis (bane f). Kontrolekstrakter fra B. subtilis og B. lichenlformis ses endvidere henholdsvis i bane a og d. Af sammenligningsgrunde sat-1° te man også 30 ng renset P450SCC fra binyrebark til disse kontrolekstrakter (henholdsvis bane b og bane e).
Figur 10 er en skematisk repræsentation af konstruktionen af pGBSCC-17. De kodende P45qSCC-DNA sekvenser fra plasmid pGBSCC-4 blev indført i E. coll 15 ekspressionsvektoren pTZlBRN. P450SCC-sekvenserne ses i en firkant {&77Z\ ) ·
Figur 11 viser P450SCC ekspressionen af pGBSCC-17 i E. coil JM101.
(a) SDS/PAGE og Coomassie brilliantblå farvning 20 af celleproteinfraktionerne (20μ1) fremstillet fra E. coll kontrolstammen (bane 3) og E. coll transformanter SCC-301 og 302 (henholdsvis bane 1 og bane 2). Der vises til sammenligning 400 ng renset bovin P45QSCC (hane 4).
25 (b) Western blot analyse analyseret med anti stoffer mod P450SCC fra celleproteinfraktioner (5μ1) fremstillet af kontrolstammen E. coli JM101 (bane 2) og af E. coll transformanterne SCC-301 (bane 3} og SCC-302 (bane 4). Der vises 100 ng renset bovin P450SCC (bane 30 i) til sammenligning.
Figur 12 viser konstruktionen af plasmid PUCG418.
Figur 13 viser konstruktionen af gærekspressionsvektoren pGB950 ved indsættelse af promoteren og 9 DK 175573 B1 terminatoren med multiple kloningssteder ( pgjW, ) fra lactase i puCG418. Til afledning af pGBSCC-6 indsætter man et syntetisk Sall/Xhol fragment indeholdende et ATG startkodon og kodonerne for de første 8 aminosyrer af 5 P450SCC 1 PGB950 *
Figur 14 er en skematisk repræsentation, der viser konstruktionen af gær P450SCC-ekspressionskassetten pGBSCC-7.
Figur 15 viser et Western blot analyseret med antistoffer, der er specifikke for proteinet P^qSCC.
Blot A indeholder ekstrakter afledt af Saccharo-myces cerevlsiae 273-10B transformeret med pGBSCC-10 (bane l); fra S. cerevislae 273-10B som kontrol (bane 2); fra Kluyveromyces lactls CBS 2360 transformeret med 15 pGBSCC-7 (bane 3) og fra K. lactls CBS 2360 som kontrol (bane 4).
Blot B indeholder ekstrakter afledt af K. lactls CBS 2360 som kontrol (bane 1) og K♦ lactls CBS 2360 transformeret med pGBSCC-15 (bane 2), med pGBSCC-12 20 (bane 3) eller med pGBSCC-7 (bane 4).
Blot C indeholder ekstrakter afledt af S. cerevislae 273-10B som kontrol (bane 1), transformeret med pGBSCC-16 (bane 2) eller med pGBSCC-13 (bane 3).
Figur 16 er en skematisk repræsentation af kon-2·* struktionen af gærekspressionsvektoren pGBSCC-9 indeholdende den isocytochrome Cl (cyc-1) promoter fra S. cerevislae.
Figur 17 viser et konstruktionsdiagram for den P450SCCcDNA indeholdende ekspressionsvektor pGBSCC-10 til S. cerevislae.
Figur 18 viser konstruktionen af P450SCC ekspressionsvektoren pGBSCC-12, hvori et syntetisk afledt DNA-fragment, der koder for præ-P450SCC sekvensen, 10 DK 175573 B1 (Jggggg ) er indsat 5' -stillet for den kodende sekvens for moden P450SCC-
Figur 19 viser konstruktionen af pGBSCC-13. Den-ne P4cjqSCC ekspressionskassette for S. cerevlsiae inde-5 holder præ-P45øSCCcDNA sekvensen anbragt 3'-stillet for cyc-1 promotoren fra S. cerevisiae.
Figur 20 viser en skematisk repræsentation af konstruktionen af plasmiderne pGBSCC-14 og pGBSCC-15.
Den sidstnævnte indeholder den P45QSCC kodende sekvens 10 i ramme med cytochromoxidase VI præsekvensen ).
Figur 21 viser konstruktionen af plasmidet pGBSCC-16. I dette plasmid er cytochromoxidase VI præsekvensen (VÆ/Ά ) fra S. cerevisiae sammenføjet med den kodende P45qSCC sekvens anbragt 3'-stillet i forhold 15 til cyc-1 promotoren.
Figur 22 viser fysiske afbildninger af plasmiderne pGB17a-l (A) og pGB17a-2 (B) indeholdende henholdsvis det 3'-stillede 1,4 kb fragment og det 5'-stillede 345 bp fragment (Eggsg ) fra P45q17cicDNA. I 20 pGB17a-3 (C), der indeholder P45017acDNA sekvensen i fuld længde, er positionen af ATG startkodonet angivet.
Figur 23 viser mutationen af pGB17a-3 ved in vitro mutagenese. Det herved opnåede plasmid pGBl7a-4 indeholder et Sall restriktionssted fulgt af optimale 25 gærtranslationssignaler netop opstrøms for ATG initie-ringskodonet.
Figur 24 er en skematisk oversigt over konstruktionen af gær Ρ45ο17α ekspressionskassetten pGBl7a-5.
Figur 25 viser mutationen af pGB17a-3 ved in vi-tro mutagenese. Det herved opnåede plasmid pGB17a-6 indeholder et Ndel restriktionssted ved ATG-initierings-kodonet.
Figur 26 er en skematisk repræsentation af konstruktionen af pGB17a-7. P45Q17acDNA sekvenser fra 11 DK 175573 B1 plasmid pGB17a-6 blev indført i Bacillus/E. coli over-føringsplasmidet pBHA-1.
Figur 27 viser en fysisk afbildning af pGBl7a-8, der er opnået ved fjernelse af E. coli sekvenser fra 5 plasmidet pGB17a-7.
Figur 28 viser fysiske afbildninger af pGBC2l-l og 2, der henholdsvis indeholder et 1,53 Kb 3'-P450C21cDNA og et 540 bp 5'-P450C21cDNA EcoRI fragment i EcoRI-stedet på kloningsvektoren pTZ18R.
10 Figur 29 viser in vitro mutagenese ved polymera- sekædereaktion (PCR) af pGBC21-2 til indførelse af EcoRV og Ndel restriktionssteder opstrøms for P45qC21 ATG-initieringskodonet fulgt af molekylær kloning i kloningsvektoren pSP73 til opnåelse af pGBC2l-3.
15 Figur 30 er en skematisk oversigt over konstruk tionen af pGBC21-4, der indeholder P4gQC2lcDNA sekvensen i fuld længde.
Figur 31 er en skematisk repræsentation af kon-20 struktionen af pGBC21-5. P450C21cdna sekvensen fra plasmidet pGBC21-4 blev indført i Bacillus/E. coli overføringsplasmidet pBHA-1.
Figur 32 viser en fysisk afbildning af pGBC21-6, der er opnået ved fjernelse af E. coli sekvenser fra 25 plasmidet pGBC2l-5.
Figur 33 viser mutationen af pGBC21-2 ved in vitro mutagenese. Det opnåede plasmid pGBC21-7 indeholder et Sall restriktionssted fulgt af optimale gærtranslationssignaler netop opstrøms for ATG initieringskodo-30 net.
Figur 34 repræsenterer konstruktionen af pGBC21-8, der indeholder P45qC21cDNA i fuld længde med modificerede flankerende restriktionssteder, der er egnede til kloning i gærekspressionsvektoren.
12 DK 175573 B1
Figur 35 er en skematisk repræsentation, der viser konstruktion af gær P450C21-ekspressionskassetten pGBC21-9.
Figur 36 viser in vitro mutagenese ved polymera-5 sekædereaktion af pGBlip-l til indførelse af passende flankerende restriktionssteder og et ATG initieringskodon på P45QllpcDNA sekvensen i fuld længde fulgt af molekylær kloning i Bacillus/E. coll overføringsvektoren pBHA-1 til opnåelse af plasmidet pGB113-2.
10 Figur 37 viser in vitro mutagenese ved polymera- sekædereaktion af pGBlip-l til indførelse af passende flankerende restriktionssteder og et ATG initieringskodon på p45q11£cDNA sekvensen i fuld længde, fulgt af molekylær kloning i gærekspressionsvektoren pGB950 til 15 opnåelse af plasmidet pGBllp-4.
Figur 38 er en skematisk oversigt over den mole-kulære kloning af ADXcDNA sekvensen fra en bovin binyrebark polyA+RNA/cDNA blanding ved polymerasekædereak-tionen. Man indsatte cDNA sekvensen, der koder for det 20 modne ADX protein, i passende steder på gærekspressionsvektoren pGB95Q til opnåelse af plasmidet pGBADX-l.
Figur 39 viser et Western blot analyseret med antistoffer mod ADX og demonstrerer ADX ekspressionen af plasmid pGBADX-l i K. lactls CBS 2360 transfor'manter ADX-101 og 102 (henholdsvis banerne 4 og 5). Ekstrakter af kontrolstammen K. lactis CBS 2360 ses i bane 3. Af sammenligningsgrunde er der også sat 100 ng renset binyrebarks ADX til gelen i bane i.
00 Figur 40 viser in vitro mutagenese ved polymera- sekædereaktion af pGBADR-1 til indførelse af passende flankerende restriktionssteder og et ATG-initieringskodon på ADRcDNA sekvensen i fuld længde fulgt af mole- 13 DK 175573 B1 kylær kloning i gærekspressionsvektoren pGB950 til opnåelse af pGBADR-2.
Opfindelsen omfatter fremstilling og dyrkning af celler, der er egnede til anvendelse i biokemiske 5 produktionsreaktorer i stor skala og anvendelse af disse celler til oxidation af forbindelser og især til produktion af steroider som vist i fig. 1. Hver af de afbildede reaktioner kan udføres separat, og ombytning af trinnene i en mangetrinsreaktion er inkluderet.
10 Mikroorganismer er foretrukne værter, men man kan ligeså godt benytte andre celler såsom celler fra planter eller dyr, eventuelt i en cellekultur eller i vævet hos levende transgene planter eller dyr.
Cellerne ifølge opfindelsen opnås ved genetisk 15 transformation af egnede receptorceller, foretrukket celler af egnede mikroorganismer, med vektorer indeholdende DNA-sekvenser, der koder for proteiner involveret i omdannelsen af cholesterol til hydrocortison, omfattende sidekædespaltende enzym (P450SCC), adrenodoxin 20 (ADX), adrenodoxinreduktase (ADR), 3p-hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase (3P-HSD), steroid-17a-hydroxy-lase (P45017a), NADPH cytochrom P450 reduktase (RED), steroid-21-hydroxylase (P45qC21) og steroid-lip-hydro-xylase (Ρ45011β). Visse værtsceller kan eventuelt alle-25 rede selv producere et eller flere af de nødvendige proteiner i et tilstrækkeligt niveau og skal derfor kun transformeres med supplementerende DNA-sekvenser. Sådanne mulige egne proteiner er ferredoxin, ferredoxin-reduktase, P45g reduktase og 3p-hydroxysteroid dehydro-30 genase/isomerase.
Til udvindelse af sekvenser, der koder for proteiner, der er involveret i omdannelsen af cholesterol til hydrocortison, har man udvalgt passende DNA-kilder.
14 DK 175573 B1
En egnet kilde til udvindelse af DNA, der koder for alle proteiner, der er involveret i omdannelsen af cholesterol til hydrocortison, er binyrebarkvæv fra hvirveldyr f.eks. bovint binyrebarkvæv. Man kan også udvin-5 de relevant DNA fra forskellige mikroorganer, f.eks. fra Pseudomonas testosteron!, Streptomyces qriseocar-neus eller Brevlbacterium sterollcum for DNA, der koder for 3β-Ι^Γθχγε1βΓθ1ά dehydrogenase/isomerase, og fra Curvularia lunata eller Cunninghatnella blakesleeana 10 for DNA, der koder for proteiner involveret i Ιΐβ-hy-droxylering af cortexolon. DNA-sekvenser, der koder for proteinerne bovin P450SCC, bovin P45qH3 eller et mikrobielt ækvivalent protein, bovin adrenodoxin, bovin adenotoxinreeduktase, 33-hydroxysteroid dehydrogenase/ 15 isomerase af bovin eller mikrobiel oprindelse, bovin Ρ45θ17α, bovin P450C21 og NADPH cytochrom P45Q reduk-tase af bovin eller mikrobiel oprindelse blev isoleret ved følgende trin: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1. Eukaryotlske sekvenser (cDNA * er) 2 a. Man fremstillede total RNA fra passende væv.
3 b. Man transkriberede polyA+ indeholdende RNA til 4 dobbeltstrenget cDNA og ligerede i bakteriofag- 5 vektorer.
6 c. Man gennmsøgte det opnåede cDNA bibliotek med 7 32P-mærkede oligomerer, der var specifikke for 8 det ønskede cDNA eller ved gennemsøgning af et 9 isopropyl^-D-thiogalactopyranosid (IPTG)-indu 10 ceret λ-gtll cDNA bibliotek under anvendelse 11 af et specifikt (125I-mærket) antistof.
15 DK 175573 B1 <3. Man indsatte cDNA indsætningsstykker af positive plakdannende enheder (pfu'er) i passende vektorer for at fastslå hele længden af cDNA ved nucleotidsekvensopdeling.
5 2. Prokaryotlske gener a. Man fremstillede genomisk DNA fra en passende mikroorganisme.
b. Til opnåelse af et DNA bibliotek klonede man DNA-fragmenter i passende vektorer og transformerede i en passende coli vært.
c. Man gennemsøgte dette DNA bibliotek med 32p-mærkede oligomerer, der var specifikke for det relevante gen, eller gennemsøgte et IPTG- 15 induceret λ-gtll DNA bibliotek under anvendelse af et specifikt (125I-mærket) antistof.
d. Man isolerede plasmider fra positive kolonier og underklonede de indsatte DNA-fragmenter i passende vektorer for at fastslå hele længden af 20 genet.
Bemærk: Ifølge en forbedret fremgangsmåde mangfoldiggjorde man det specielle cDNA (eukaryotiske sekvenser) eller gen (prokaryotlske sekvenser) under anvendelse af 25 to specifikke oligomerer ved fremgangsmåden kendt som polymerasekædereaktionen (PCR) (Saiki et al.. Science, 239, 487-491, 1988). Derefter indsatte man det mangfol-diggjorte cDNA eller DNA i de passende vektorer.
Ved et aspekt af opfindelsen tilvejebringes eg-30 nede ekspressionskassetter, hvori det heterologe DNA, der er isoleret ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, er anbragt mellem passende kontrolsekvenser for transkription og translation, hvilket tillader, at DNA
16 DK 175573 B1 kan eksprimeres i cellerne hos en egnet vært til opnåelse af det ønskede protein eller proteiner. Eventuelt kan initieringskontrolsekvenserne følges af en signalsekvens for udskillelse.
5 Egnede kontrolsekvenser skal indføres sammen med det strukturelle DNA ved hjælp af ovennævnte ekspressionskassetter. Ekspression gøres mulig ved transformation af en egnet værtscelle med en vektor, der indeholder kontrolsekvenser, der er forligelige med denne 10 vært, og er operativt forbundet til de kodende sekvenser, for hvilke man ønsker ekspression.
Alternativt kan man anvende egnede kontrolsekvenser, der findes i værtsgenomet. Ekspression gøres mulig ved transformation af en egnet værtscelle med en 15 vektor, der indeholder kodende sekvenser for det ønskede protein flankeret af værtssekvenser, der tillader homolog rekombination med værtens genom på en måde, så værtens kontrolsekvenser på rette vis kontrollerer ekspressionen af den indførte DNA.
20 Som de alment forstås, omfatter betegnelsen kon trolsekvenser alle DNA-segmenter, der er nødvendige til en ordentlig regulering af ekspressionen af den kodende sekvens, til hvilken de er operativt forbundet, såsom operatorer, forstærkere og især promotorer og sekven-25 ser, der kontrollerer translationen.
Promotoren kan eller kan ikke være kontrollerbar ved påvirkning fra omgivelserne. Egnede promotorer fra prokaryoter inkluderer f.eks. trp promotoren {inducerbar ved tryptophanudsultning), lac promotoren 30 (inducerbar med galactoseanalog IPTG), β-lactamasepro-moteren og den fagafledte PL promotor (inducerbar ved temperaturvariation). Derudover inkluderer nyttige promotorer, især til ekspression i Bacillus, sådanne for 17 DK 175573 B1 α-amylase, protease, Spo2, spac og 0/105 samt syntetiske promotersekvenser. En foretrukket promotor er en sådan som afbildet i fig. 5 og betegnet "Hpall". Egnede promotere til ekspression i gær inkluderer 3-phospho-5 glyceratkinasepromotoren og sådanne for andre glycoly-tiske enzymer såvel som promotorer for alkoholdehydrogenase og gærphosphatase. Endvidere er promotere for transkription forlængelsesfaktor (TEF) og lactase også egnede. Pattedyrsekspressionssystemer benytter sædvan-10 ligvis promotorer afledt fra vira såsom adenoviruspro-motorer og SV40 promotor, men de inkluderer også regulerbare promotorer såsom metallothioninpromoteren, der kontrolleres af tungmetaller eller koncentrationen af glycocorticoid. virusbaserede insektcelleekspres-15 sionssystemer anses i øjeblikket også som egnede såvel som ekspressionssystemer baseret på plantecellepromotorer såsom nopalinsyntetasepromotorer.
Translationskontrolsekvenser inkluderer et ribo-somblndingssted (RBS) i prokaryotiske systemer, hvor-20 imod translationen i eukaryotiske systemer kan være kontrolleret af en nucleotldsekvens med indhold af et initieringskodon såsom AUG.
Ud over den nødvendige promotor og translationskontrolsekvenserne kan man benytte en række andre kon-25 trolsekvenser, deriblandt sådanne der regulerer termi-nering (f.eks. til opnåelse af polyadenyleringssekvenser i eukaryotiske systemer) til at kontrollere ekspressionen. Visse systemer indeholder forstærkende elementer, der kan være gavnlige, men oftest ikke obliga-toriske til opnåelse af ekspression.
Opfindelsen beskriver endvidere ekspressionskassetter, der indeholder en yderligere heterolog kodende sekvens, der koder for et enzym, der alene eller i sam- 18 DK 175573 B1 arbejde med ét eller flere yderligere proteiner katalyserer et andet trin i reaktionsvejen på figur 1.
En gruppe vektorer benævnt pGBSCC-n, hvori "n" er et hvilket som helst heltal mellem 1 og 17, er især 5 udviklet for DNA, der koder for P450SCC enzymet.
En anden gruppe vektorer, der betegnes pGB17a-n, hvori "n" er et hvilket som helst heltal mellem 1 og 5, er særlig udviklet for DNA, der koder for P45017ct en~ zymet.
10 En yderligere gruppe vektorer betegnet med pGBC21-n, hvor "n" er et hvilket som helst heltal mellem 1 og 9, er specielt udviklet for DNA, der koder for P450C21 enzymet.
En yderligere gruppe vektorer betegnet med 15 pGBllp-n, hvori "n" er et hvilket som helst heltal mellem 1 og 4, er specielt udviklet for DNA, der koder for Ρ45011β enzymet.
Man har ifølge et yderligere aspekt af opfindelsen udvalgt egnede værtsceller, der accepterer 20 vektorer ifølge opfindelsen og tillader, at det indførte DNA kan eksprimeres. Når man dyrker de transformerede værtsceller, findes de proteiner, der er involveret i omdannelsen af cholesterol til hydrocorti-son, i celleindholdet. Man kan påvise tilstedeværelse 25 af det ønskede DNA ved DNA hybridiseringsfremgangsmå-der, transkriptionen deraf ved RNA hybridisering, ekspression deraf ved immunologiske assays og aktiviteten deraf ved at fastslå tilstedeværelse af oxiderede produkter efter inkubering med udgangsforbindelsen in 30 vitro eller in vivo.
Transformerede mikroorganismer er foretrukne værter, især bakterier (mere foretrukket Escherichia col i og Bacillus og Streptomyces specier) og gærarter DK 175573 B1 19 (såsom Saccharomyces og Kluyveromyces♦) Andre egnede værtsorganismer findes blandt planter og dyr, deriblandt insekter, fra hvilke man benytter de isolerede celler i en cellekultur, såsom COS celler, C^27 celler, 5 CHO celler og Spodoptera fruqlperda (Sfg) celler. Alternativt kan man benytte en transgenisk plante eller dyr.
En særlig type af rekombinante værtsceller er sådanne, hvori to eller flere ekspressionskassetter 10 ifølge opfindelsen er blevet indført, såsom pGBSCC/ ADX-1, eller som er blevet transformeret med en ekspressionskassette, der koder for mindst to heterologe proteiner, hvilket tillader cellen at producere mindst to proteiner involveret i reaktionsvejen fra fig. 1.
15 Et vigtigt træk ved opfindelsen er, at de frem stillede nye celler er ikke blot i stand til at producere proteiner, der er involveret i den oxidative omdannelse af steroider, der til slut fører til hydrocor-tison, men også til at benytte disse proteiner på ste-20 det ved den ønskede oxidative omdannelse af den tilsvarende substratforbindelse, der sættes til kulturvæsken. Steroider er foretrukne substrater. Cellerne transformeret med heterolog DNA er især egnet til at dyrkes med de steroider, der er nævnt i fig. 1, deriblandt andre 25 steroler, såsom β-sltosterol. Som et resultat opnår man oxiderede steroider.
Afhængig af tilstedeværelse i værtscellen af forskelligt heterologt DNA, der koder for proteiner involveret i reaktionsvejen på fig. 1, er adskillige bio-30 kemiske omdannelser mulige omfattende sidekædespaltning af en sterol og/eller oxidative modifikationer på Cll, C17, C3 og C21. Af denne grund er ekspressionskassetterne ifølge opfindelsen nyttige ved konstruktion af et 20 DK 175573 B1 multigenisk system, der kan udføre successive intra-cellulære transformationer af de mange trin i sekvensen vist på fig. l. Det kan være nødvendigt at indføre ekspressionskassetter i den ønskede vært, der samlet 5 koder for de ønskede proteiner. I visse tilfælde kan en eller flere af proteinerne, der er involveret i reaktionsvejen, allerede være til stede i værten som et naturligt protein, der udøver samme aktivitet. F.eks. kan ferredoxin, ferredoxinreduktase og P450 reduktase 10 allerede være til stede i værten. Under disse omstændigheder skal man kun tilvejebringe de resterende enzymer ved rekombinant transformation.
Som et alternativ til biokemiske omdannelser in vivo indsamler man de proteiner, der er involveret i omdannelse af cholesterol til hydrocortison, renser dem efter behov og benytter dem til in vitro omdannelse af steroider i et cellefrit system, f.eks. immobiliseret på en kolonne. Alternativt kan man benytte den mere eller mindre rensede blanding, der indeholder ét eller 20 flere enzymer for reaktionsvejen som sådan til steroidomdannelsen. Et eksempel på en vært indeholder DNA, der koder for to heterologe proteiner, nemlig enzymet P450SCC og proteinet ADX, der er nødvendige for produktionen af pregnenolon. Ved sammenligning med en 25 vært med kun P450SCC DNA er udbyttet af pregnenolon i en cellefri ekstrakt efter tilsætning af ADR, NADPH og cholesterol betydelig forbedret.
Opfindelsen tilvejebringer ekspressionskassetter, der er nødvendige til konstruktion af en ettrins-30 produktionsproces for adskillige nyttige steroider.
Idet man udgår fra billige og let tilgængelige udgangsforbindelser, er den især egnet til produktionen af hydrocortison og mellemproduktforbindelser. Opfindelsen 21 DK 175573 B1 gør de traditionelle kostbare kemiske reaktioner forældede. Mellemprodukterne behøver ikke at blive isolerede. Bortset fra de nye værtsceller er selve processerne, der benyttes til dyrkning af disse celler ved 5 steroidomdannelserne, analoge til bioteknologiske fremgangsmåder, der er velkendte.
Opfindelsen illustreres yderligere af de følgende eksempler.
10 Eksempel 1
Molekylær kloning af et fuld længde cDNA, der koder for det bovine cytochrom P450 sidekædespaltende enzym (P450SCC).
15 Almene kloningsteknikker såvel som analyser for DNA og RNA er blevet benyttet som beskrevet i håndbogen af T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Med mindre andet angives, blev alle DNA modificerende enzymer, molekylære kloningsbæ- 20 rere og E. coli stammer opnået kommercielt og benyttet under anvendelse af fabrikantens instruktioner. Materialer og apparater til adskillelse og rensning af DNA og RNA blev benyttet, idet man fulte fabrikantens instruktioner.
25 Man fremstillede binyrebarkvæv af kvæg fra fri ske bovine nyrer, der blev lynfrosset i flydende nitro-
O
gen og lagret ved -80 C.
Ud fra dette frosne bovine binyrebark fremstillede man total cellulær RNA, som beskrevet af Auffrey 30 0g Rougeon (Eur. J. Biochem., 107, 303-314, 1980). Man opnåede adrenal poly A+ RNA ved at opvarme den totale RNA prøve til 65 C før polyA udvælgelse på oligo(dT) chromatografi.
22 DK 175573 B1 DNA'er, der var komplementære til polyA+ RNA fra bovint binyrebark, blev syntetiseret på følgende måde:
Man neutraliserede 10 yg polyA+ RNA behandlet med methylmercurihydroxid med β-mercaptoethanol. Denne 5 blanding blev tilpasset til 50 mM Tris/HCl (pH 8,3 ved
42°C), 40 mM KCl, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3000 U
RNasin/ml, 4 mM Na4P207, 50 yg actinomycin D/ml, 0,1 mg
oligo(dT12_18)/ml, 0,5 mM dATP, 0,5 mM dTTP, 0,25 mM
dCTP og 400 yCi a32P-dCTP/ml, alt i et slutrumfang på 10 100 yl. Blandingen blev holdt på is i 10 minutter, op- 0 varmet i 2 minutter til 42 C og man påbegyndte syntesen ved at tilsætte 150 U AMV revers transkriptase (Anglian Biotechnology Ltd.); inkubation blev foretaget i l time ved 42°c.
15 Syntese af den anden streng blev udført, idet man tilsatte DNA polymerase og RNase H ifølge Gubier og Hoffman (Gene, 25, 263-269, 1983). Efter behandling af ds DNA med T4 DNA polymerase (BRL) til opnåelse af stumpe ender ligerede man decamere EcoRI linkere 20 (Biolabs Inc.) til ds DNA fragmenterne. Efter fordøjelse med EcoRI (Boehringer) adskilte man dobbeltstrenget DNA fragmenter fra de mange EcoRI linkere ved hjælp af Biogel AIS m (Bio-Rad) chromatografi. Man ligerede omtrent 200 ng EcoRI-linker med indhold af dobbeltstren-25 get cDNA med 10 yg EcoRI fordøjet og kalvetarmsphospha-tase (Boehringer) behandlet λ-gtll vektor DNA (Promega) ved hjælp af T4-DNA ligase (Boehringer) som beskrevet af Huynh et al. (I: "DNA cloning techniques: A practical approach", side 49-78, Oxford IRL-press, 1985). Man 30 benyttede fager opnået efter in vitro sammenpakning af ligeringsblandingen til at inficere coli Y1090 værten {Promega).
Fra dette cDNA bibliotek gennemsøgte man omtrent 106 plak-dannende enheder (pfu'er) med en 32P endemar- 23 DK 175573 B1 keret syntetisk oligomer SCC-1 (5'-GGC TGA CGA AGT CCT GAG ACA CTG GAT TCA GCA CTGG-3'), specifik for bovine P450SCC DNA sekvenser som beskrevet af Morohashi et al.
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4647-4651, 1984). Man 5 opnåede seks hybridiserende pfu'er og rensede yderligere disse ved to yderligere serier af infektion, udplat-ning og hybridisering. Man underklonede P450SCCcDNA EcoRl indsætningsstykkerne i EcoRI stedet på pTZl8R (Pharmacia). Klonen pGBSCC-1 (figur 2), der indeholdt 10 det største EcoRI indsætningsstykke (1,4 kb) afledt af klonen λ-gtil SCC-54, blev yderligere analyseret ved restriktionsenzymkortlægning og sekvensopdeling.
Sekvensdata afslørede, at pGBSCC-1 EcoRI indsætningsstykket var identisk med nucleotidsekvensen fra 15 sCCcDNA mellem positionerne 251 og 1824 på P450SCCcDNA kortet, som beskrevet af Morohashi et al.
De resterende 5’-P450SCCcDNA nucleotider blev syntetisk afledt ved at klone et 177 bp Pst/Hindlll fragment i de passende steder på pTZ18R til opnåelse af 20 pTZ/synlead som vist på figur 3, der ud over nucleoti-derne, der kodede for det modne P450SCC protein fra positionerne 118 til 273 som meddelt af Morohashi et al., yderligere indeholdt restriktionssteder for Seal, Avrll og Stul uden at påvirke den beregnede aminosyresekvens 25 for P450scc proteinet.
Man konstruerede P45qSCCcDNA i fuld længde ved molekylær kloning i E. coll JM101 (ATCC 33876) af en ligationsblanding, der indeholdt det 1372 bp lange Hindlll/Kpnl pGBSCC-1 fragment, det 177 bp lange 30 pst/Hindlll pTZ/synlead fragment og pTZ19R DNA fordøjet med PstI og KpnI.
Det opnåede plasmid, pGBSCC-2, der indeholdt alle nucleotidsekvenserne, der koder for det modne bovine 24 DK 175573 B1 p450 sidekædespaltende protein, ses på figur 4.
Eksempel 2 5 Konstruktion, transformation og ekspression af P450SCC i bakterieværten Bacillus subtills.
Til opnåelse af ekspression af cytochrom p450scc i en Bacillus vært overførte man P450SCCcDNA sekvenser 10 til en E. coll/Baclllus overføringsvektor pBHA-1.
Figur 5 viser nucleotidsekvensen for overfø-ringsplasmidet pBHA-1. Plasmidet består af positionerne 11-105 og 121-215: bakteriofag FD terminator (dobbelt); positionerne 221-307: en del af plasmid pBR322 (nemlig 15 positionerne 2069-2153); positionerne 313-768: bakte riofag Fl, replikationsorigo (nemlig positionerne 5482-5943); positionerne 772-2571: en del af plasmid pBR322, nemlig replikationsorigo og β-lactamasegenet; positionerne 2572-2685: transposon TN903, komplet gen-20 om; positionerne 2719-2772: tryptophanterminator (dobbelt); positionerne 2773-3729: transposon Tn9, chloramphenicolacetyltransferasegenet. Nucleotiderne ved positionerne 3005 (A), 3038 (C), 3302 (A) og 3409 (A) afviger fra den cat kodende sekvens af Vild type. Disse 25 mutationer blev indført for at eliminere Ncol, Ball,
EcoRI og PvuII stederne: Positionerne 3730-3804: multipelt kloningssted; positionerne 3807-7264: en del af plasmid pUBHO, der indeholder Bacillus "Hpall” promoter, replikationsfunktionen og kanamycinresistensgenet 30 (EcoRI-PvuII fragment) McKenzie et al., Plasmid 15, 93-103, 1986 og McKenzie et al., Plasmid 17, 83-85, 1987); positionerne 7267-7331: multipelt kloningssted. Fragmenterne blev sammensat ved kendt kloningsteknik, DK 175573 B1 25 f.eks. ved udfyldning af klæbende ender med Klenow, adapterkloning, etc. Alle data stammede fra Genbank, National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NIH, USA.
pGBSCC-3 blev afledt ved molekylær kloning i 5 coli JM101 af KpnI/Sphl P45qSCCcDNA indsætningsstykket fra pGBSCC-2 (beskrevet i eksempel 1) i passende steder på pBHA-1 som vist på figur 6.
Ved molekylær kloning i E. coll JM101 kunne man indføre methioninitieringskodonet ved at udveksle 10 Stul/Sphl fragmentet i pGBSCC-3 med et syntetisk afledt SphI/StuX fragment.
SPH 1 STU 1 CATATGATCAGTACTAAGACCCCTAGG GTACGTATACTAGTCATGATTCTGGGGATCC NDE 1 15 indeholdende et Ndel sted ved ATG initieringskodonet.
Det opnåede plasmid pGBSCC-4 vises på figur 7. Man indførte "Hpa II" Bacillus promoteren opstrøms for P450SCCCDNA sekvenser ved fordøjelse af pGBSCC-4 med 20 restriktionsenzymet Ndel, adskillelse af E. coli delen af overføringsplasmidet ved agarosegelelektroforese og påfølgende religering og transformation i Bacillus subtills 1A40 (BGSC 1A40) kompetente celler. Man analyserede neomycinresistente kolonier til opnåelse af pla-25 smidet pGBSCC-5 (figur 8). Man studerede ekspression af bovin P450SCC ved at fremstille en celleproteinfraktion af en kultur dyrket natten over ved 37 C i TSB medium (Gibco) med indhold af 10 μρ/πιΐ neomycin. Celler fra 100 μΐ kultur, der indeholdt omtrent 5xl06 celler, blev 30 indhøstet ved centrifugering og udsuspenderet i 10 mM Tris/HCl pH 7,5. Lysering blev udført ved tilsætning af 1 mg/ml lysozym og påfølgende inkubering i 15 minutter ved 37*C. Efter behandling med 0,2 mg DNase/ml i 5 mi- 26 DK 175573 B1 nutter ved 37 C tilpassede man blandingen til l x SB puffer, som beskrevet af Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970, i et slutrumfang på 200 μΐ. Efter opvarmning i 5
O
minutter til 100 C underkastede man 15 μΐ af blandin-5 gen en 7,5% SDS/polyacrylamidgelelektroforese. Som vist på figur 9 (bane c) kunne man påvise et 53 kDa bånd efter immunblotning af gelen, der var sondebehandlet med P45qSCC specifikke antistoffer.
Man kunne opnå specifikke bovine P450SCC anti-10 stoffer ved at immunisere kaniner med renset P450SCC protein isoleret fra bovint binyrebarkvæv.
Eksempel 3 15 Ekspression af P45oscc 1 bakterieværten Bacillus llchenlformls.
Man udførte ekspression af bovin p450scc 1 — llchenlformls ved at transformere plasmidet pGBSCC-5 i 20 den egnede værtsstamme B. llchenlformls T5(CBS 470.83).
Man analyserede en celleproteinfraktion fremstillet som beskrevet i eksempel 2 fra en kultur dyrket natten over i tryptonsojaurt (TSB) medium (Oxoid) med indhold af 10 pg/ml neomycin, ved hjælp af SDS/PAGE og Western blot.
25 som vist på figur 9 (bane f) kunne man synliggøre et proteinbånd på 53 kDa efter inkuberlng af nitrocellulosefilteret med antistoffer, der var specifikke for bovin P450SCC. En transformant, SCC-201 blev yderligere analyseret for in vivo aktivitet af P450SCC (se eksem-30 pel 11).
DK 175573 B1 27
Eksempel 4
Ekspression af P450SCC i bakterieværten Escherichia coll.
5 (a) Konstruktion af ekspressionskassetten.
Til opnåelse af en egnet ekspressionsvektor i værten E. coll for bovin P450SCC muterede man pTZl8R ved positionsrettet mutagenese som beskrevet af Zoller 10 og Smith {Methods in Enzymology 100, 468-500, 1983);
Zoller og Smith (Methods in Enzymology 154, 329-350, 1987) og Kramer og Fritz (Methods in Enzymology 154, 350-367, 1987). Plasmider af stammer til in vitro mutagenese eksperimenter blev opnået fra Pharmacia Inc.
15 Man benyttede en syntetisk afledet oligomer med sekvensen: 51 -CAG G AA ACA CAT ATG ACC ATG ATT-3'
I_I
Ndel 20 til at danne et Ndel restriktionssted ved ATG initie-ringskodonet i lac Z genet i pTZl8R.
Det herved opnåede plasmid pTZl8RN blev fordøjet med Ndel og Kpnl, og man indsatte Ndei/κρηΙ DNA fragmentet fra pGBSCC-4, der indeholdet SCCcDNA i fuld 25 længde, ved molekylær kloning som vist på figur 10.
Transkriptionen af P450SCC sekvenser i det heraf afledte plasmid pGBSCC-17 vil være drevet af E. coli lacpromoteren. 1 (b) Ekspression af P450SCC i værten E. coll JM101.
Man indførte pGBSCC-17 i E. coll JM101 kompetente celler ved at udvælge ampicillinresistente kolonier. Ekspressionen af cytochrom P450SCC blev studeret, idet 28 DK 175573 B1 man fremstillede en celleproteinfraktion (beskrevet i eksempel 2) af trans formanterne SCC-301 og 302 fra en kultur dyrket natten over ved 37°C i 2 x TY medium (der indeholder pr. liter deioniseret vand: Bacto trypton 5 (Difco), 16 g; gærekstrakt (Difco), 10 g og NaCl, 5 g) med indhold af 50 vig/ml ampicillin.
Man analyserede proteinfraktioner ved SDS/PAGE farvet med Coomassie brilliantblåt (figur 11A) eller ved Western blot, hvorved man som sonder anvendte anti-10 stoffer, der var specifikke for bovint P450SCC (figur 11B). Begge analyser viser et protein af den forventede længde (figur 11A, banerne 1 og 2 og figur 11B, banerne 3 eller 4) for henholdsvis transformanterne SCC-301 og SCC-302, der ikke findes i E. coli JM101 kontrolstammen 15 (figur 11A, bane 3 og figur 11B, bane 2).
Eksempel 5
Konstruktion, transformation og ekspression af P450SCC 20 i gæren Kluyveromyces lactls.
(a) Indførelse af geneticinresistensmarkøren i pUC19.
Man indsatte et DNA fragment omfattende Tn5 genet (Reiss et al., EMBO J., 3, 3317-3322, 1984), der 25 overfører resistens mod geneticin under styring af al-koholdehydrogenase I (ADHI) promoteren fra S. cerevi-slae, på lignende måde som beskrevet af Bennetzen og Hall (J. Biol. Chem., 257, 3018-3025, 1982) i Smal stedet på pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 30 103-119, 1985). Det opnåede plasmid pUCG418 vises på figur 12.
E. coli med indhold af pUCG418 blev deponeret ved Centraal Bureau vor Schimmelcultures med depone- 29 DK 175573 B1 ringsnummer CBS 872.87.
(b) Konstruktion af ekspressionskassetten.
Man konstruerede en vektor omfattende pUCG418 5 (beskrevet i eksempel 5(a)), gennemskåret med Xbal og Hindlll, Xbal-Sall fragmentet fra pGB901 med indhold af lactasepromoter (se J.A. van den Berg et al., Continuation in part af US patentansøgning SN 572.414: "Kluyveromyces as a host strain") og syntetisk DNA om-10 fattende en del af den 3'-ikke kodende region af lacta-segenet fra K. lactis. Dette plasmid pGB950 ses på figur 13.
Man gennemskår pGB950 med Sall og Xhol og indsatte syntetisk DNA: 15 SAL 1 STU 1 XHO 1
TCGACAAAAATGATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC
GTTTTTACTAGTCATGATTCTQAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT
til opnåelse af plasmid pGBSCC-6 som vist på figur 13.
20 Man isolerede StuI-EcoRI fragmentet fra pGBSCC-2 (se eksempel 1) med indhold af den P45qSCC kodende region og fyldte den klæbende ende under anvendelse af Klenow DNA polymerase. Dette fragment blev indsat i pGBSCC-6, der var gennemskåret med Stul. Plasmidet, der 25 indeholdt fragmentet i korrekt orientering, blev kaldt pGBSCC-7 (se figur 14).
(c) Transformation af K. lactis.
Man dyrkede K. lactis stamme CBS 2360 i 100 ml 30 YEPD-medium (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% glucosemono-hydrat) med indhold af 2,5 ml af en 6,7% (w/w) gærni-trogenbase (Difco laboratories) opløsning til en OD610 på omkring 7. Celler blev indsamlet fra 10 ml af denne 30 DK 175573 B1 kultur ved centrifugering, man vaskede dem med TE-puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 0,1 mM EDTA) og udsuspenderede dem i 1 ml TE-puffer. Hertil blev sat et lige så stort rumfang 0,2 ml lithiumacetat, og man inku- 0 5 berede blandingen i 1 time ved 30 C i et vandbad under omrystning. Man gennemskår 15 yg pGBSCC-7 ved det unikke Sadl sted i lactasepromotoren, udfældede med ethanol og suspenderede igen i 15 μΐ TE-puffer. Dette DNA præparat blev sat til 100 yl af de præinkuberede cel-10 ler, og man lod inkuberingen foregå i yderligere 30 minutter, man tilsatte et lige så stort rumfang 70% PEG4000 og inkuberede blandingen i 1 timer ved samme temperatur, hvorefter man gav den et varmechok på 5 mi-
O
nutter ved 42 C. Nu tilsatte man 1 ml YEPD-medium og 15 inkuberede cellerne i 1½ time under omrystning i et 0 vandbad ved 30 C. Endelig fracentrifugerede man cellerne, suspenderede dem igen i 300 yl YEPD og udspredte dem på agarplader med indhold af 15 ml YEPD agar med 300 yg/ml geneticin, som man overlagde l time 20 før anvendelse med 15 ml YEPD-agar uden G418. Kolonierne blev dyrket i 3 dage ved 30°C.
(d) Analyse af transformanterne.
Man dyrkede transformanterne og kontrolstammen 25 CBS 2360 i YEPD medium i omkring 64 timer ved 30°C. Cellerne blev fracentrifugeret, igen udsuspenderet i en fysiologisk saltopløsning til en værdi for 0D61Q på 300 og sønderrevet ved rystning med glasperler i 3 minutter på en Vortex omryster ved højeste hastighed. Man fra-30 centrifugerede celleaffaldet i 10 minutter ved 4500 o/m i en Hearaeus Christ minifuge GL. Man udtog fra super-natanterne 40 yl prøver til analyse på immunblot (se figur 15A, bane 3 og figur 15B, bane 4).
31 DK 175573 B1
Resultaterne viser, at et protein af den ventede længde eksprimeres i K. lactis celler, transformeret med pGBSCC-7. Transformanten blev betegnet K. lactis SCC-101.
5
Eksempel 6
Konstruktion, transformation og ekspression af p450scc i gæren Saccharomyces cerevlsiae.
10 (a) Konstruktion af ekspressionskassetten.
Til sletning af lactasepromotoren gennemskår man pGB950 (se eksempel 4(b)) med Xbal og Sall, fyldte de klæbende ender under anvendelse af Klenow DNA polymera-15 se og ligerede derefter. I det opnåede plasmid pGBSCC-8 er Xbal-stedet ødelagt, men Sall stedet er opretholdt.
Man isolerede Sall-fragmentet fra pGB161 (se J.A. van den Berg et al., EP 96430) indeholdende den isocytochrome Cl (eye l) promotor fra S. cerevisiae og 20 fordøjede den delvis med Xhol. Man isolerede et 670 bp Xhol-Sall fragment og klonede dette i Sall-stedet på pGBSCC-8. I det udvalgte plasmid pGBSCC-9 er Sall-stedet mellem eye 1 promotoren og den 3'-ikke kodende region af lactasegenet opretholdt (figur 16) (Hindlll 25 delvis fordøjet).
Man Indsatte Sall-Hindlll fragmentet fra pGBSCC-7 med indhold af den P450SCC kodende region i pGBSCC-9 gennemskåret med Sall og HindIIi. X det opnåede plasmid pGBSCC-10 findes den P450SCC kodende region 30 nedstrøms for eye 1 promotoren (figur 17).
32 DK 175573 B1 (b) Transformation af S. cerevlsiae.
Man dyrkede S. cerevlsiae stamme D273-10B {ATCC 25657) i 100 ml YEPD natten over ved 30°C, hvorefter man fortyndede (1:10000) i frisk medium og dyrkede til 5 en OD610 6. Cellerne fra 10 ml af kulturen blev fra centrifugeret og suspenderet i 5 ml TE-puffer. Igen fracentrifugerede man cellerne, suspenderede disse i 1 ml TE-puffer og tilsatte 1 ml 0,2 M lithiumacetat. Man inkuberede cellerne i 1 time under omrystning i et 10 vandbad ved 30°C. 15 yg pGBSCC-10 blev gennemskåret ved det unikke Mlul-sted i eye 1 promoteren, udfældet med ethanol og igen suspenderet i 15 yl TE, dette DNA præparat blev sat til 100 yl af de præinkuberede gærceller og inkuberet under omrystning i 30 minutter ved 15 30°C. Efter tilsætning af 115 yl af en 70% PEG4000 op løsning forlængede man inkubationen med 60 minutter uden omrystning. Derefter gav man cellerne et varmechok 0 på 5 minutter ved 42 C, man tilsatte 1 ml YEPD medium 0 og inkuberede derefter i 1½ time ved 30 C i vandbad un- 20 der omrystning. Endelig fracentrifugerede man cellerne, udsuspenderede dem i 300 yl YEPD og udspredte dem på YEPD agarplader med indhold af geneticin (300 yg/ml).
0
Kolonierne blev dyrket i 3 dage ved 30 C.
25 (c) Analyse af transformanterne.
Man dyrkede transformanterne og kontrolstammen i YEPL-medium (1% gærekstrakt, 2% bactopepton, 3,48% K2HP04 og 2,2% af en 90% L-( + )-mælkesyreopløsning; før steriliseringen blev pH tilpasset til 6,0 under anven-30 delse af en 25% ammoniakopløsning) i 64 timer ved 30 C.
Den yderligere analyse blev foretaget som i eksempel 5 (d).
Immunblotanalysen viser ekspressionen af P45oscc i S. cerevlsiae (figur 15A, bane l).
33
Eksempel 7 DK 175573 B1
Konstruktion, transformation og ekspression af præ-P450SCC-kodende DNA i gæren Kluyveromyces lactis.
5 (a) Konstruktion af ekspressionskassetten.
Man gennemskår plasmid pGB950 (se eksempel 5(b)) med Sall og xhol og indsatte syntetisk DNA:
SAL I
10 TCGACAAAAAJOTTtXXrrCGAGGTTTCO^ITGAGATCCGCTTTGCriTAAGCXrrTGTCC
GTTTTTACAACCXIAGCTOCAAACGGTAACTCTAGGCGAAACCAATTCCGAACAGG
ACCAATCnTGTTCX^CTGTTCXn’GAAGGTTGGGGTCACCACAGAGTTGGTACTGGTGAAGG
TGGTTAGAAC^GGTGACAACCACTTCX^AACCCCAGTGGTGTCTCAACCATGACCACTTCC
STD 1 XHO 1
λ 5 TGCTGGTATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCXSATrC
ACGACCATAGTCATGATXCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT
til opnåelse af plasmidet pGBSCC-11 (figur 18). På lignende måde, som beskrevet i eksempel 5(b) indsatte man den P450SCC kodende region fra pGBSCC-2 i pGBSC-11, der 20 var gennemskåret med Stul. Plasmidet, der indeholdt fragmentet i korrekt orientering, blev kaldt pGBSCC-12 (figur 18).
(b) Transformation af K. lactis og analyse af transfor- 25 manterne.
Man udførte transformation af K. lactis med pGBSCC-12 som beskrevet i eksempel 5(c). Transformanterne blev analyseret som beskrevet i eksempel 5(d).
Analysen viste produktion af P450SCC i K. lactis (figur 30 15B, bane 3).
DK 175573 B1 34
Eksempel 8
Konstruktion, transformation og ekspression af præ- P45oSCC-kodende DNA i gæren Saccharomyces cerevislae.
5 (a) Konstruktion af ekspressionskassetten.
Man indsatte Sall-Hindlll (Hindlll delvis fordøjet) fragmentet fra pGBSCC-12 med indhold af den præ-P45oSCC-k°dende region i pGBSCC-9, der var gennemskåret 10 med Sall og Hindlll. Det herved opnåede plasmid blev benævnt pGBSCC-13 (figur 19).
(b) Transformation af S. cerevislae og analyse af transformanterne.
15 Man transformerede S. cerevisiae stamme D273-10B
med pGBSCC-13 som beskrevet i eksempel 6(b). Transformanterne blev analyseret som beskrevet i eksempel 5(c). Resultatet, der er vist i figur 15C (bane 3), demonstrerer eksprimering af P450SCC i S. cerevisiae. En 20 transformant SCC-105 blev yderligere analyseret for in vitro aktivitet af P45qSCC (se eksempel 12).
Eksempel 9 25 Konstruktion, transformation og ekspression i Kluyvero-myces lactis af P450SCC sekvenser sammensmeltet med præregionen af cytochromoxidase VI fra Saccharomyces cerevislae. 1 (a) Konstruktion af ekspressionskassetten.
Man gennemskår plasmid pGB950 (se eksempel 6(b)) med Sall og Xhol og indsatte syntetisk DNA: DK 175573 B1 35
SAL I
tcgacaaaaatgttgtctcgagctatcttcagaaacccagttatcaacagaactttgtt
GTTTTTACAACAGAGCTCGATAGAAGTCTTrGGGTCAATAGTTGTCTTGAAACAA
GAGAGCTAGACCAGGTGCTTACCACGCTACTAGATTGACTAAGAACACTTTCATCCAATC
CTCTC^TCTCGTCCACGAATGGTGCGATGATCTAACTGATTCTTGTGAAAGTAGGTTAG
5 STU 1 XHO 1
CAGAAAGTACATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTC GTCTTTCATGTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT
til opnåelse af plasmidet pGBSCC-14.
Aminosyresekvensen fra cytochromoxidase vi (COX 10 VI) præsekvensen blev taget fra en artikel af Wright et al. (J. Biol. Chem., 259, 15401-15407, 1984). Man kontrollerede det syntetiske DNA under anvendelse af foretrukne gærkodoner. Den P450SCC kodende region fra pGBSCC-2 blev indsat i pGBSCC-14 gennemskåret med Stul *·* på lignende måde som beskrevet i eksempel 5(b). Det plasmid, der indeholdt den P450SCC kodende sekvens i ramme med COX VI præsekvensen, blev benævnt pGBSCC-15 (figur 20). 1 (b) Transformation af K. lactis og analyse af transformanterne .
Man udførte transformation af K. lactis med pGBSCC-15 som beskrevet i eksempel 5(c). Transformanterne blev analyseret som beskrevet i eksempel 5(d).
. 25 Resultatet (figur 15B, bane 2) viser, at P450SCC bliver eksprimeret.
36
Eksempel 10 DK 175573 B1
Konstruktion, transformation og ekspression i Saccharo-myces cerevisiae af P450SCC sekvenser sammensmeltet med 5 præregionen fra cytochromoxidase VI fra Saccharomyces cerevisiae.
(a) Konstruktion af ekspressionskassetten.
Man indsatte Sall-Hindm (Hlndm delvis fordø-10 jet) fragmentet fra pGBSCC-15 indeholdende den kodende region for P45QSCC sammensmeltet med COX VII præsekvensen i pGBSCC-9, der var gennemskåret med Sall og Hindlll. Det herved opnåede plasmid blev benævnt pGBSCC-16 (figur 21).
15 (b) Transformation af S. cerevisiae og analyse af transformanterne.
Man transformerede S. cerevisiae stamme D273-10B med pGBSCC-16 som beskrevet i eksempel 6(b). Transfor-20 manterne blev analyseret som beskrevet i eksempel 6(c). Resultatet, der vises i figur 15C (bane 2), viser eks-primering af P45QSCC i S. cerevisiae.
Eksempel 11 25
In vivo aktivitet af P450SCC i Bacillus licheniformis SCC-201.
Man opnåede B. licheniformis SCC-201 som beskre-30 vet i eksempel 3. Organismen blev inokuleret i 100 ml medium A. Medium A bestod af:
DK 175573 B1 I
37
Calciumchlorid hexahydrat 1 g
Ammoniumsulfat 5 g j
Magnesiumchlorid hexahydrat 2,25 g j
Mangansulfat, tetrahydrat 20 mg 5 Cobaltchlorid, hexahydrat 1 mg j
Citronsyre, monohydrat 1,65 g
Destilleret vand 600 ml
Lageropløsning af sporelementer 1 ml
Antiskum (SAG 5693) 0,5 mg ! 10
Lageropløsningen af sporelementer indeholdt pr. 1 de stilleret vand:
CuS04,5H20 0,75 g H^BOj 0,60 g 15 Kl 0,30 g
FeS04(NH4)2S04,2H20 27 g
ZnS04,7H20 5 g
Citronsyre, H20 15 g
MnS04,H20 0,45 g 20 Na2Mo04,H20 0,60 g H2S04 (96%) 3 ml
Efter sterilisering og afkøling til 30°C satte man til fuldstændiggørelse af mediet hertil 60 g malto- 25 se, monohydrat opløst i 200 ml destilleret vand (steriliseret 20 minutter ved 120 C), 200 ml 1M kali- umphosphatpuffer (pH 6,8; steriliseret i 20 minutter 0 ved 120 C), 1,7 g gærnitrogenbase (Difco) opløst i 100 ml destilleret vand (steriliseret ved membranfiltre-30 ring).
Kulturen blev dyrket i 64 timer ved 37 C, og derefter benyttede man 2 ml af denne kultur til at inoku-lere 100 ml medium A indeholdende 10 mg cholesterol.
38 DK 175573 B1
Man tilsatte cholesterol som en opløsning med indhold af cholesterol 10 mg; Tergitol/ethanol (1:1 v/v), 0,75 ml og Tween 80, 20 μΐ. Kulturen blev dyrket i 48 timer ved 37°C, hvorefter man ekstraherede den med 100 ml 5 dichlormethan. Blandingen blev adskilt ved centrifugering, og man benyttede det organiske lag. Man gentog ekstraktionsproceduren to gange og samlede de 3 x 100 ml dichlormethanfraktioner. Dichlormethanen blev bortfordampet ved vakuumdestillation og man analyserede den 10 tørrede ekstrakt (ca. 450 mg) for pregnenolon under anvendelse af en gaschromatografi-masse-spektrometer kombination.
GC-MS analyse.
15 Fra den tørrede ekstrakt udtog man en bestemt mængde og silylerede denne ved at tilsætte en blanding af pyridin-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid og trimethylchlorsilan. Den silylerede prøve blev analyseret ved en GL-MS-DS kombination {Carlo Erba MEGA 20 5160-Finnigan MAT 311A-Kratos DS 90) i den udvalgt ion modus. Man udførte gaschromatografien under følgende 0 betingelser: injektion med bevægelig nål ved 300 C: kolonne M.cpsil29 0,25 indre diameter df 0,2 pm drevet ved 300 C isothermt; direkte indførsel i MS-kilde.
25 Man analyserede prøverne ved at følge ionerne m/z 298 fra pregnenolon ved en opløsning på 800. Fra målingerne var det tydeligt, at man i tilfælde af værtsstammen B. llchenlformis T5 ikke kunne påvise noget pregnenolon (påvisningsgrænse 1 picogram), hvorimod 30 man let i tilfælde af B. licheniformis SCC-201 kunne følge en produktion af pregnenolon.
39
Eksempel 12 DK 175573 B1
In vitro aktivitet af P450SCC opnået fra Saccharomyces cerevisiae SCC-105.
5
Man inokulerede S. Cerevisiae SCC-105 opnået som beskrevet i eksempel 8 i 100 ml medium B. Medium B indeholdt pr. 1 destilleret vand: Gærekstrakt 10 g 10 Bactopepton (Oxoid) 20 g Mælkesyre (90%) 20 g
Dikaliumphosphat 35 g pH = 5,5 (tilpasset med 25% w/w ammoniak) 15 Denne kultur blev dyrket i 48 timer ved 30*C og blev derefter benyttet til at inokulere en fermenteringsbeholder med indhold af medium C. Medium C bestod af: Gærekstrakt 100 g 20 Bactopepton (Oxoid) 200 g Mælkesyre (90%) 220 ml
Dikaliumhydrogenphosphat 35 g
Destilleret vand 7800 ml 25 pH blev tilpasset til en værdi på 6,0 med 25% ammoniak, og man steriliserede fermenteringsbeholderen og mediet (1 time, 120°C).
Efter afkøling steriliserede man 2,4 g geniticin opløst i 25 ml destilleret vand ved membranfiltrering 30 og satte dette til mediet. Den inokulerede blanding blev dyrket under omrøring (800 o/m) i reaktionsbehol-0 deren ved 30 C, idet man lod steril luft passere dyrkningsurten med en mængde på 300 1/t og automatisk holdt 40 DK 175573 B1 pH ved 6,0 ved hjælp af 4N H2S04 og 5% NH4OH (5% NH^OH i destilleret vand; steriliseret ved membranfiltrering) . Efter 48 timer påbegyndte man en tilførsel af mælkesyre (90%, steriliseret ved membranfiltrering) med 5 en hastighed på 20 g/t. Fermenteringen fortsatte derefter i 40 timer, hvorefter man fracentrifugerede cellerne (4000 g, 15 minutter).
Centrifugebundfaldet blev vasket med 0,9% (w/w)
Nacl fulgt af centrifugering (4000 g, 15 minutter); man 10 vaskede centrifugebundfaldet med phosphatpuffer (50 mM, pH = 7,0) og fracentrifugerede igen cellerne (4000 g,
15 minutter). Centrifugebundfaldet blev optaget i phosphatpuffer (50 mM, pH = 7,0) til opnåelse af en suspension med indhold af 0,5 g våd vægt/ml. Denne su-15 spension blev behandlet i en Dyno-mill (Willy A. Bacho-fen Maschinenfabrik, Basel, CH). Ikke sønderdelte celler blev fracentrifugeret (4000 g, 15 minutter). Den I
cellefrie ekstrakt (2250 ml, 15-20 mg protein/ml) blev o lagret ved -20 C.
20 Man grovrensede P450SCC ved følgende fremgangs- j måde. Fra 50 ml optøet cellefri ekstrakt udfældede man en rå membranfraktion ved ultracentrifugering (125000 g, 30 minutter) og suspenderede igen i 50 ml 75 mm ka- liumphosphatopløsning (pH 7,0) med indhold af 1% 25 natriumcholat. Denne dispersion blev holdt under 0 blid omrøring i 1 time ved 0 C og derefter centrifugeret (125000 g, 60 minutter). Til den således opnåede supernatant med indhold af solubiliseret membranproteiner satte man (NH4)2S04 (30% w/v), idet man holdt pH 30 ved 7,0 ved at tilsætte små mængder af en 6N NH40H opløsning. Suspensionen blev holdt under omrøring i 20 minutter ved 0°C, hvorefter man indsamlede en fraktion af udfældede proteiner ved centrifugering (15000 g, 10 i 41 DK 175573 B1 minutter). Centrifugebundfaldet blev igen suspenderet til et rumfang på 2,5 ml med 100 mM kaliumphosphatpuf-fer (pH 7,0) med indhold af 0,1 mM dithiothreitol og 0,1 mM EDTA. Denne suspension blev elueret over en gel-5 filtreringskolonne (PD10, Pharmacia) til opnåelse af 3.5 ml af en af saltet proteinfraktion (6 mg/ml), der blev analyseret for P450SCC aktivitet.
P45qSCC aktiviteten blev bestemt ved et assay, der i det væsentlige er baseret på en fremgangsmåde af 10 Doering (Methods Enzymology, 15, 591-596, 1969). Assay-blandingen bestod af følgende opløsninger:
Opløsning A (naturlig P45qSCC elektrondonerende system): en 10 mM kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), med indhold af 3 mM EDTA, 3 mM phenylmethylsulfonylfluorid 15 (PMSF), 20 pM adrenodoxin og 1 pM adrenodoxinreduktase (elektronbærere; begge oprenset fra bovin binyrebark), 1 mM NADPH (elektrondonor) og 15 mM glucose-6-phosphat og 8 enheder/ml glucose-6-phosphat-dehydrogenase (NADPH regenererende system).
20 Opløsning B (substrat): en micelleopløsning af 37.5 pM cholesterol (dobbelt radiomærket med [26,27-14C] cholesterol (40 Ci/mol) og [7 a-3HJ cholesterol (400 Ci/mol)) i 10% (v/v) Tergitol NP40/ethanol (1:1, v/v).
25 Man påbegyndte assayet ved at blande 75 pi af opløsning A med 50 pi af opløsning B og 125 pi af den groft oprensede P450SCC fraktion (eller puffer som reference). Blandingen blev holdt under blid omrøring véd 30°C. Man udtog prøver på 50 pi efter 0, 30 og 180 ΟΛ minutter og fortyndede disse med 100 pi vand. Til den fortyndede prøve blev sat 100 pi methanol og 150 pi chloroform. Efter ekstraktion og centrifugering (5000 g, 2 minutter) indsamlede og tørrede man chloroform- 42 DK 175573 B1 laget. Den tørre remanens blev opløst i 50 μΐ acetone, der indeholdt 0,5 mg af en steroidblanding (cholesterol, pregnenolon og progesteron (1:1:1, w/w/w)), hvorefter man tilsatte 110 μΐ koncentreret myresyre og op- 0 5 varmede suspensionen i 15 minutter til 120 C. Herefter bestemte man forholdet 14C/3H ved dobbeltmærket væskescintillationstælling. Dette forhold er et direkte mål for sidekædespaltningsreaktionen, idet den 14C-mær-kede sidekæde bortfordampes fra blandingen som isoca-10 prylsyre under opvarmningen.
Under anvendelse af dette assay fandt man, at den P450SCC fraktion, der var groft oprenset fra S. cerevisiae SCC-105, viste sidekædespaltende aktivitet.
Under 3 timers inkubering var 45% af cholesterolen ble-15 vet omdannet. Man kunne ved hjælp af tyndtlagschromato-grafi identificere reaktionsproduktet som pregnenolon.
Eksempel 13 20 Molekylær kloning af en fuld længde cDNA, der koder for bovint cytochrom p4so steroid l7a-hydroxylase (P45017a)·
Man udvalgte ca. 106 pfu'er af det bovine biny-25 rebark cDNA bibliotek beskrevet i eksempel 1 for p45017acDNA sekvenser, idet man gennemsøgte med to 32P endemærkede syntetiske oligomere, der var specifikke for P45017acDNA. Oligomer 17α-1 (5’-AGT GGC CAC TTT GGG ACG CCC AGA GAA TTC-3') og oligomer 17a-2 (5'-GAG GCT 30 CCT GGG GTA CTT GGC ACC AGA GTG CTT GGT-3') er komplementære til den bovine P45017acDNA sekvens, som beskrevet af Zuber et al. (J. Biol. Chem., 261, 2475-2482, 1986) fra henholdsvis position 349 til 320 og 139 til 104.
DK 175573 B1 43
Udvælgelse med oligomer 17α-1 gav omtrent 1500 hybridiserende pfu'er. Man udvalgte adskillige hybri-diserende pfu'er, rensede disse og scalede op til præparativ fag DNA isolering. Man underklonede EcoRI 5 indsætningsstykkerne fra de rekombinante λ-gtll DNA*er i EcoRI stedet på pTZ18R. En klon, pGB17a-l, blev yderligere karakteriseret ved restriktionsendonucleasekort-lægning og DNA sekvensopdeling. Plasmid pGB17a-l indeholder et 1,4 kb EcoRI ind sætnings s tykke, der er kom-10 plementært til 3'-delen af P45017a fra EcoRI stedet ved position 320 til polyadenyleringsstedet ved position 1721 som beskrevet af Zuber et al.
Et kort over pGB17a-l ses på figur 22A.
Man opnåede otte hybridiserende pfu'er ved at 15 gennemsøge cDNA biblioteket med oligomer 17ct-2. Efter rensning, opformering af rekombinante fager og isolering af rekombinant λ-gtll DNA'er underklonede man EcoRI indsætningsstykker i EcoRI stedet på pTZ18R. Disse EcoRI Indsætningsstykker varierer i længde fra 270 20 kp til 1,5 kbp. Man undersøgte kun en klon yderligere, nemlig pGB17a-2, der indeholdt et 345 bp EcoRI-fragment, ved nucleotidsekvensopdeling og sammenlignede med den offentliggjorte P450l7acDNA sekvens ifølge Zuber øt al. Som vist på figur 22B begynder P45017acDNA 25 sekvensen i pGB17a-2 72 bp opstrøms for det antagne AUG startkodon ved position 47 og viser fuldstændig homologt med 5'-delen af P45017acDNA indtil EcoRI stedet ved position 320 som beskrevet af Zuber et al.
Man konstruerede en bovin P45q17ocDNA i fuld 30 længde ved molekylær kloning i E. coll JM101 af en ligationsblanding, der indeholdt en delvis EcoRI fordøjelsesprodukt af pGB17a-l og det 345 bp lange EcoRI fragment fra pGB17ct-2. Den opnåede klon pGB17a-3 inde- 44 DK 175573 B1 holder en fuld længde bovin P45017acDNA °9 vises på figur 22 C.
Eksempel 14 5
Konstruktion og transformation af en fuld længde p45017acDNA klon i gæren Kluyveromyces lactls.
(a) Konstruktion af ekspressionsvektoren.
10 Til opnåelse af en passende ekspressionsvektor i gærværter for bovin P45017a muterede man pGB17a-3 ved positionsrettet mutagenese som beskrevet af Zoller og Smith, (Methods in Enzymol., 100, 468-500, 1983); Zoller og Smith, (Methods in Enzymol., 154, 329-350, 1987) 15 og Kramer og Fritz, (Methods in Enzymol., 154, 350-367, 1987). Plasmider og stammer til in vitro mutageneseek-sperimenter blev opnået fra Pharmacia Inc.
Som vist på figur 23 ændrede man 9 bp netop opstrøms for ATG initieringskodonet til opnåelse af et 20 Sall restriktionssted og optimale gærtranslationssignaler under anvendelse af den syntetiske oligomer 17α-3.
SAL 1 5 ’ - TCTTTGTCCTGACTGCTGCCAGTCGACAAAAATGTGGCTGCTC- 3 * 1 2 3 4 5 6
Det opnåede plasmid pGB17a-4 blev fordøjet med 2
Sall og Smal; DNA fragmentet indeholdende P4gQl7acDNA i 3 fuld længde blev fraskilt ved gelelektroforese, isole 4 ret og overført ved molekylær kloning i E. coli JM101 5 til vektoren pGB950 (se eksempel 5), der først blev 6 fordøjet med Xhol, fik klæbende ender fyldt med Klenow DNA polymerase og derefter blev fordøjet med Sall til opnåelse af plasmidet pGB17a-5 som afbildet på figur 24.
45 DK 175573 B1 (b) Transformation af K. lactis.
Man benyttede 15 pg pGB17a-5 gennemskåret ved det unikke SacII sted i lactasepromotoren til at transformere K. lactis stamme CBS 2360 som beskrevet i 5 eksempel 5. Man analyserede transformanterne for tilstedeværelse af integrerede pGB17a-5 sekvenser i værts-genomet ved Southern analyse. Én transformant, 17ct-10l, der indeholdt mindst tre kopier af pGB17a-5 i det geno-miske vært DNA, blev yderligere analyseret for in vivo 10 aktivitet af P45Q17a (se eksempel 16).
Eksempel 15
Konstruktion og transformation af £45017° i bakterie-15 værterne Bacillus subtilis og Bacillus llcheniformis.
(a) Konstruktion af ekspressionsvektoren.
Til opnåelse af en passende ekspressionsvektor i Bacillus værter for bovin £450170 muterede man pGB17a-3 20 ved positionsrettet mutagenese som beskrevet i eksempel 14.
Som vist på figur 25 blev et Ndel restriktionssted indført ved ATG initieringskodonet under anvendelse af den syntetiske oligomer 17α-4: 25 S'-GCT GCC ACC CAG AQC ATA TG,T GGC TGC TCC T-3'
Ndel
Det opnåede plasmid pGB 17a-6 blev delvis fordø-30 jet med EcoRI: Man fraskilte DNA fragmentet, der indeholdt P450l7acDNA i fuld længde, ved gelelektroforese, isolerede det og ligerede til EcoRI fordøjet pBHA-1 DNA som vist på figur 26. Ligatet blev klonet molekylært 46 DK 175573 B1 ved overføring af ligeringsblandingen i E. coli JM101 til opnåelse af pGB17a-7.
(b) Transformation af B. subtilis og B. licheniformis.
5 Man indførte "Hpall" Bacillus promoteren op strøms for P45q17c<cDNA sekvenserne ved at fordøje pGB17a-6 med restriktionsenzymet Ndel, fraskille E. coll delen af overføringsplasmidet ved agarosegelelektro-forese og derefter at religere og transformere B. sub-10 tilis 1A40 (BGSC 1A40) kompetente celler. Man analyserede neomyclnresistente kolonier og kunne herved opnå plasmldet pGB17a-8 (figur 27).
Man udførte også transformation af værten B. lichenlformls T5 (CBS 470.83) med pGB17a-8. Plasmldet 15 forbliver stabilt i den passende Bacillus vært som det kan ses ved restriktionsanalyse af pGB17a-8, selv efter mange generationers forløb.
Eksempel 16 20
In vivo aktivitet af P45017a i Kluyveromyces lactls 17a-101.
Man opnåede K. lactls I7a-101 som beskrevet i 25 eksempel 14. Denne organisme blev inokuleret i 100 ml medium D. Medium D indeholdt pr. liter destilleret vand: Gærekstrakt (Difco) 10 g
Bactopepton (Oxoid) 20 g 30 Dextrose 20 g
Efter sterilisering og afkøling til 30 C satte man 2,68 g gærnit rogenbase (Difco) opløst i 40 ml de- 47 DK 175573 B1 stilleret vand (steriliseret ved membranfiltrering) og 50 mg neomycin opløst i 1 ml destilleret vand (steriliseret ved membranfiltrering) til mediet. Derefter satte man 50 mg progesteron opløst i 1,5 ml dimethyl-5 formamid til 100 ml medium og dyrkede kulturen i 120 timer ved 30°C, hvorefter man ekstraherede 50 ml dyrkningsurt med 50 ml dichlormethan. Man centrifugerede blandingen og fraskilte det organiske solventlag. Di-chlormethan blev bortfordampet ved vakuumdestillation 10 og man optog den tørrede ekstrakt (ca 200 mg) i 0,5 ml chloroform. Denne ekstrakt indeholdt I7a-hydroxypro-gesteron, som det kunne vises ved tyndtlagschromato-grafi. Strukturen af forbindelsen kunne bekræftes ved hjælp af H-NMR og 13C-NMR. NMR analyse viste også, at 15 forholdet I7a-hydroxyprogesteron/progesteron i ekstrakten omtrent var 0,3.
Eksempel 17 20 Molekylær kloning af en fuld længde cDNA, der koder for bovin cytochrom P450 steroid 21-hydroxylase (P450C2l).
Man hybridiserede omtrent 106 pfu'er af det bovine binyrebark cDNA bibliotek, fremstillet som beskre-25 vet i eksempel 1, med en 32P endemærket oligo C21-1.
Denne oligo, der indeholdt sekvensen 5'- GAT GAT GCT GCA GGT AAG CAG AGA GAA TTC-3', er en specifik sonde for det bovine P450C21 gen anbragt nedstrøms for EcoRl stedet i p450C21 cDNA, sekvensopdelt som beskrevet af 30 Yoshioka et al. (J. Biol. Chem., 261, 4106-4109, 1986).
Fra denne gennemsøgning opnåede man én hybridiserende pfu. EcoRl indsætningsstykket i dette rekombinante λ-gtll DNA blev underklonet i EcoRl stedet på pTZlBR
DK 175573 B1 48 til opnåelse af en konstruktion, der blev benævnt pGBS2l-i. Som vist i figur 28 indeholder dette plasmid et 1,53 kb EcoRl indsætningsstykke, der er komplementært til P450C21cDNA sekvenser fra EcoRl stedet ved po-5 sition 489 til polyadenyleringsstedet som beskrevet af Yoshioka et al., som vist ved nucleotidsekvensopdeling.
Til isolering af den resterende 5'-del (490 bp) af P45qC21cDNA fremstillede man et nyt bovint binyrebark cDNA bibliotek ved fremgangsmåden som beskrevet i 10 eksempel 1 med kun én modifikation. Som primer for syntesen af den første cDNA streng tilsatte man en yderligere oligomer til C21-2. Oligomer C21-2 med nucleotid-sekvensen 5'- AAG GAG AGA GAA TTC-3' er anbragt ned-strøms for EcoRI-stedet på P450C21cDNA fra position 504 15 til 490.
En gennemsøgning af dette cDNA bibliotek med en 32P endemærket oligomer C21-3 indeholdende den P450C21 specifikke sekvens 5'-CTT CCA CCG GCC CGA TAG CAG GTG AGC GCC ACT GAG-31 (positionerne 72-37) gav om-20 trent 100 hybridiserende pfu'er. Man underklonede EcoRl indsætningsstykket fra kun én rekombinant λ-gtll DNA i EcoRI-stedet på pTZ18R til opnåelse af en konstruktion, der.blev benævnt pGBC21-2.
Dette plasmid (figur 28) indholder et indsæt-25 ningsstykke på 540 bp, der er komplementært til P450C21CDNA sekvenserne for position -50 til EcoRl stedet ved position 489, som vist ved nucleotidsekvensopdeling.
49
Eksempel 18 DK 175573 B1
Konstruktion af en P450C21cDNA Bacillus ekspressionsvektor og transformation til bakterieværterne Bacillus 5 subtilis og Bacillus llchenlformls.
(a) Konstruktion af ekspressionsvektoren.
Til konstruktion af en P450C21cDNA i fuld længde med flankerende sekvenser, der er specifikke for Bacil-10 lus ekspressionsvektoren pBHA-1, modificerede man først 5'-delen af F45qC21 genet ved fremgangsmåden med poly-merasekædereaktion (PCR) med pGBC21-2 som skabelon og to specifikke P45QC21-oligomere som primere. Oligomer C21-4 (5' -CTG ACT GAT ATC CAT ATG GTC CTC GCA GGG CTG 15 CTG-3') indeholder 21 nucleotider, der er komplementære til C21-sekvenser fra positionerne 1-21, og 18 yderligere baser til opnåelse af et EcoRV restriktionssted og et Ndel restriktionssted ved ATG initieringskodonet.
Oligomer C21-5 (5'-AGC TCA GAA TTC CTT CTG GAT 20 GGT CAC-31) er 21 baser, der er komplementære til minusstrengen opstrøms for EcoRI-stedet ved position 489.
Man udførte PCR som beskrevet af Saiki et al (Science 239, 487-491, 1988) med små modifikationer.
PCR blev udført i et rumfang på 100 pi indeholdende: 50 2 5 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,01% (w/v) gelatine, 200 pM af hver af dNTP, 1 pM af hver af C21-primerne og 10 ng pGBC2i-2 skabelon. Efter denaturering (7 minutter ved 100°C) og tilsætning af 2 enheder Tag-polymerase (Cetus) lod man reaktionsblandingen 30 undergå 25 amplificeringscykler (hver: 2 minutter ved 55°C, 3' ved 72°C, 1 minut ved 94°C) i et DNA-amplifier apparat (Perkin-Elmer).
I den sidste cyklus udelod man denatureringen.
En skematisk oversigt over denne P450C21cDNA opforme-35 ring vises på figur 29.
50 DK 175573 B1
Det opformerede fragment blev fordøjet med Ecorv og EcoRl og indsat ' ved molekylær kloning i passende steder på pSP73 (Promega). Det opnåede plasmid benævnes pGBC21 -3. Som vist i figur 30 indsatte man 3'-P450C21 5 EcoRl fragmentet fra pGBC21-l i rigtig orientering i EcoRl stedet på pGBC21-3. Den herved opnåede vektor pGBC21-4 blev fordøjet med EcoRV og Kpnl (Kpnl findes ved det multiple kloningssted på pSP73), og man isolerede fragmentet med indhold af P450C21cDNA i fuld læng-10 de ved gelelektroforese og indsatte dette i de relevante steder på pBHA-1 ved molekylær kloning. Det heraf opnåede plasmid pGBC21-5 illustreres på figur 31.
(b) Transformation af Bacillus.
15 Man indførte "Hpall" Bacillus promotoren op strøms for P450C21cDNA genet ved fordøjelse af pGBC21-5 med restriktionsenzymet Ndel, fraskillelse af E. coli delen af overføringsplasmidet ved agarosegelelektrofo-rese og en påfølgende religering og transformation af 20 B. subtilis 1 A40 (BGSC 1 A40) kompetente celler. Man analyserede neomycinresistente kolonier til opnåelse af PGBC21-6 (figur 32).
Man udførte også transformation af værten B. licheniformis T5 (CBS 470.83) med pGBC21-6. Plasmidet 25 forbliver stabilt i begge Bacillus værter, som det kan ses ved restriktionsanalyse.
51
Eksempel 19 DK 175573 B1
Konstruktion af en P450C21cDNA gærekspressionsvektor og transformation til gærværten Kluyverornyces lactis.
5 (a) Konstruktion af ekspressionsvektoren.
Til opnåelse af en egnet ekspressionsvektor i gærværter for bovin P450C21 muterede man pGBC21-2 ved positionsrettet mutagenese som beskrevet i eksempel 14.
10 Til denne mutation benyttede man oligomer C21-6 (S’-CCT CTG CCT GGG TCG ACA AAA ATG GTC CTC GCA GGG-3') til at opnå et Sall restriktionssted og optimale gærtranslationssignaler opstrøms for ATG initieringskodonet, som vist på figur 33.
15 Sall/EcoRl DNA fragmentet fra det heraf afledte plasmid pGBC21-7 blev ligeret til 3'-P450C21-EcoRI-fragmentet fra pGBC21-l og indsat ved molekylær kloning i de relevante steder på pSP73 som vist på figur 34.
Det heraf afledte pGBC21-8 blev gennemskåret med Sall 20 og EcoRV (EcoRV stedet findes ved det multiple kloningssted for pSP73), og man indsatte DNA fragmentet, der indeholdt P4gøC21cDNA i fuld længde, i gærekspressionsvektoren pGB950. Den heraf afledte pGBC21-9 ses på figur 35.
,25.
(b) Transformation af K. lactis.
Man fordøjede 15 ug pGBC21-9 med SacII og udførte transformation af K. lactis CBS 2360 som beskrevet i eksempel 5(c).
52
Eksempel 20 DK 175573 B1
Molekylær kloning af fuld længde cDNA, der koder for bovin cytochrom Ρ450 steroid ΐΐβ-hydroxylase (Ρ450ΐΐβ).
5
Man fremstillede et bovint binyrebark cDNA bibliotek som beskrevet i eksempel 1 med én modifikation.
En yderligere F450118-specifik primer (oligomer 11β-1) med nucleotidsekvensen 5'-GGC AGT GTG CTG ACA CGA-3' 10 blev sat til reaktionsblandingen ved syntesen af den første streng cDNA. Oligomer 11β-1 findes netop ned-strøms for translationsstopkodon fra position 1530 til 1513. Nucleotidsekvenser og positioner på kortet af de nævnte P450l^-oligomere stammer alle fra Ρ450ΐΐβοϋΝΑ 15 sekvensdata beskrevet af Morohashi et al. (J. Biochem.
102 (3), 559-568, 1987). Man gennemsøgte cDNA biblioteket med en 32P-mærket oligomer 11β-2 (5'-CCG CAC CCT GGC CTT TGC CCA CAG TGC CAT-3'), og denne findes ved S'-enden af Ρ45011βοϋΝΑ fra position 36 til 1.
20 Gennemsøgning med oligomer 11β-2 gav 6 hybri- diserende pfu'er. Disse blev yderligere renset og analyseret med oligomer 11β-3 (5'-CAG CTC AAA GAG AGT CAT CAG CAA GGG GAA GGC TGT-3’ , positionerne 990 til 955).
To ud af seks viste et positivt hybridiseringsslgnal 25 med 32P-mærket oligomer 11β-3.
Man underklonede EcoRI indsætningsstykkerne fra begge ΐΐβ-λ-gtll rekombinanter i EcoRI stedet på pTZ18R. En klon med et EcoRI indsætningsstykke på 2,2 kb (ρΟΒΙΙβ-Ι) blev yderligere analyseret ved restrik-•30 tionsenzymkortlægning og vises på figur 36. ρσΒΙΙβ-ΐ indeholder alle kodende P4cjø118cDNA sekvenser som bestemt af Morohashi et al.
53
Eksempel 21 DK 175573 B1
Konstruktion af en P450C21cDNA Bacillus ekspressionsvektor og transformation til bakterieværterne Bacillus 5 subtilis og Bacillus llcheniformls.
(a) Konstruktion af ekspressionsvektoren.
Man opnåede en P450lipcDNA i fuld længde med modificerede flankerende sekvenser til Bacillus eks-10 pressionsvektor pBHA-1 ved PCR metoden (beskrevet i eksempel 18), idet man benyttede pGB118-l som skabelon og to specifikke P450llp-oligomere som primere.
Oligomer 11β-4 (5' -TTT GAT ATC GAA TTC CAT ATG GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3') indeholder 21 baser, 15 der er komplementære til den modne P450lipcDNA sekvens fra position 72 til 93, og 21 baser til opnåelse af EcoRV, EcoRI og Ndel restriktionssteder og et ATG initieringskodon.
Oligomer 11β-5 (5’-TAA CGA TAT CCT CGA GGG TAC 20 CTA CTG GAT GGC CCG GAA GGT-3) indeholder 21 baser, der er komplementære til minus P450lipcDNA strengen opstrøms for translationsstopkodonet ved position 1511, og 21 baser til opnåelse af restriktionssteder for EcoRV, Dhol og KpnI.
' 25 Efter PCR opformering med den ovenfor nævnte skabelon og de ovenfor nævnte P45Qll8-primere fordøjede man det opformerede fragment (1,45 kb) med EcoRI og KpnI og indsatte det ved molekylær kloning i Bacillus ekspressionsvektoren pBHA-1 gennemskåret med EcoRI og . 30 KpnI til opnåelse af vektoren pGBlip-2 (se figur 36).
54 DK 175573 B1 (b) Transformation af Bacillus.
Man indførte "Hpall" Bacillus promoteren opstrøms for P45011PcDNA sekvenserne ved fordøjelse af pGBll3-2 med Ndel, adskillelse af E. coll delen af 5 overføringsplasmidet ved agarosegelelektroforese og en påfølgende religering (som beskrevet i eksempel 18) og transformation af B. subtills 1A40 (BGSC 1A40) kompetente celler. Man analyserede neomycinresistente kolonier og opnåede herved plasmid pGB118-3. Det afledte 10 plasmid pGBlip-3 blev også overført til B. llchenifor-mis værtsstammen T5 (CBS 470.83).
Eksempel 22 15 Konstruktion af en P450110cDNA gærekspressionsvektor og transformation til gærværten Kluyveromyces lactis.
(a) Konstruktion af ekspressionskassetten.
Man opnåede P45q113cDNA i fuld længde med modi-20 ficerede flankerende sekvenser til gærekspressionsvektoren pGB950 ved PCR metoden (beskrevet i eksempel 18) med pGBll(3-l som skabelon og to specifikke P^ølip-oli-gomere som primere.
Oligomer 11(3-6 (S'-CTT CAG TCG ACA ΑΑΑ ATG GGC ‘25 ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3’) indeholder 21 baser, der er komplementære til den modne P45q11P cDNA sekvens fra position 72 til 93, og 18 yderligere baser til opnåelse af et Sall restriktionssted, et optimalt gærtranslationssignal og et ATG Initieringskodon.
30 Oligomer 11β-5 findes beskrevet i eksempel 21(a). Efter PCR opformering med den ovenfor nævnte skabelon og de ovenfor nævnte P45QllB-primere fordøjede man det opformerede fragment (1,45 kb) med Sall og Xhol DK 175573 B1 55 og indsatte det ved molekylær kloning i gærekspressionsvektoren pGB950, der var gennemskåret med Sall, til opnåelse af vektoren pGBlip-4 (figur 37).
5 (b) Transformation af K. lactls.
Man gennemskår 15 yg pGBllp-4 ved det unikke Sadl sted i lactasepromotoren og udførte transformation af K. lactis CBS 2360 som beskrevet i eksempel 5(c).
10 Eksempel 23
Molekylær kloning og konstruktion af cDNA i fuld længde, der koder for bovin adrenodoxin (ADX) og påfølgende transformation og ekspression af ADXcDNA i gæren Kluy-15 veromyces lactis.
(a) Molekylær kloning af ADX.
Man opnåede direkte en fuld længde ADXcDNA med 5*- og 3’-flankerende sekvenser modificeret til gæreks-20 pressionsvektoren pGB950 fra en bovin binyrebarks mRNA/cDNA samling (for detaljeret beskrivelse se eksempel 1) ved opformering under anvendelse af PCR metoden (se eksempel 18).
Til opformering af ADXcDNA syntetiserede man to 25 syntetiske oligomerprimere.
Oligomer ADX-1 (5'-CTT CAG TCG ACA AAA ATG AGC AGC TCA GAA GAT AAA ATA-3') indeholdt 21 baser, der var komplementære til 5'-enden af moden ADXcDNA sekvens, som beskrevet af Okamura et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
30 USA, 82, 5705-5709, 1985) fra positionerne 173 til 194. Oligomeren ADX-1 indeholder ved 5'-enden 18 yderligere nucleotider til opnåelse af Sall restriktionssted, et optimalt gærtranslationssignal og en ATG initieringskodon.
DK 175573 B1 , 56
Oligomeren ADX-2 (5'-TGT AAG GTA CCC GGG ATC CTT ATT CTA TCT TTG AGG AGT T-3') er komplementær til 3'-enden af minusstrengen af ADXcDNA fra position 561 til 540 og indeholder yderligere nucleotider til dan-5 nelse af restriktionssteder for BamHI, Smal og KpnI.
Man udførte PCR som beskrevet i eksempel 18 med 1 μΜ af hver ADX-primer og 10 μΐ mRNA/cDNA blanding (som beskrevet i eksempel 1) som skabelon.
En skematisk oversigt over denne ADXcDNA opfor-10 mering vises på figur 38.
Det opformerede fragment indeholder en ADXcDNA sekvens i fuld længde med modificeret flankeringer, og man karakteriserede dette ved restriktionsstedsanalyse og nucleotidsekvensopdeling.
15 (b) Konstruktion af ekspressionsvektoren.
Man fordøjede det opformerede ADXcDNA fragment med Sall og Smal og indsatte det ved molekylær kloning i gærekspressionsvektoren pGB950, der var gennemskåret 20 med Sall og EcoRV. Det heraf afledte plasmid pGBADX-1 ses på figur 38.
(c) Transformation af K. lactis.
Man gennemskår 15 μρ pGBADX-1 ved det unikke 25 SacII-sted i lactasepromotoren og udførte transformation af K. lactis CBS 2360 som beskrevet i eksempel 5(c).
(d) Analyse af transformanterne.
30 Man udvalgte to transformanter ADX-101 og ADX-102 og kontrolstamme CBS 2360 til yderligere analyse. Stammerne blev dyrket i YEPD-medium i ca. 64 timer ved 30 C. Man isolerede det totale cellulære pro- 57 DK 175573 B1 tein som beskrevet i eksempel 5(d). Fra supernatanterne udtog man prøver på 8 μΐ til analyse på immunblot (se figur 39, bane 3, 4 og 5).
Resultaterne viser, at et protein med den vente-5 de længde (14 kDa) eksprimeres i K. lactls celler transformeret med pGBADX-1.
In vitro ADX-aktiviteten af transformant ADX-102 beskrives i eksempel 24.
Eksempel 24
In vitro aktivitet af adrenodoxin opnået fra Kluyvero-myces lactis ADX-102.
13 Man dyrkede K. lactls ADX-102, opnået som be skrevet i eksempel 23, og kontrolstammen K. lactis CBS 2360 i 100 ml YEPD medium (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% glucose, monohydrat) med indhold af 2,5 ml af en 6,7% (w/w) gærnitrogenbase (Difco laboratories) opløs- 20 ning og 100 mg l-1 af geneticin (G418 sulfat; Gibco 0
Ltd.)/ i 56 timer ved 30 C. Cellerne blev fracentrifu-geret (4000 g, 15 minutter), igen suspenderet i fysiologisk saltopløsning og vasket med en phosphatpuffer (pH 7,0, 50 mM). Efter centrifugering (4000 g, 15 mi-25 nutter) suspenderede man centrifugebundfaldet i en phosphatpuffer (pH 7,0, 50 mM) til opnåelse af en suspension med indhold af 0,5 g våd vægt af celler pr. ml. Man knuste cellerne under anvendelse af en Braun MSK Homogenizer (6 x 15 sekunder, 0,45-0,50 mm 30 glasperler). Ikke sønderdelte celler blev fjernet ved centrifugering (4000 g, 15 minutter). Den cellefrie ek- 0 strakt (40 mg protein/ml) blev lagret ved -20 C.
ADX aktivitet, dvs. kapacitet for elektronoverførsel fra adrenodoxinreduktase til cytochrom P450ssc' 58 DK 175573 B1 i de cellefrie ekstrakter blev bestemt ved et p45oSSC-aktivitetsassay. Assayblandingen bestod af følgende opløsninger:
Opløsning A (naturlig P450SSC elektrondonerende 5 system med undtagelse af ADX): en 50 mM kaliumphosphat-puffer (pH 7,0), indeholdende 3 mM EDTA, 2 yM adrenodo-xinreduktase (oprenset fra bovin binyrebark), 1 mM NADPH (elektrondonor), 15 mM glucose-6-phosphat og 16 enheder/ml glucose-6-phosphat-dehydrogenase (NADPH re-10 genererende system).
Opløsning B (substrat og enzym): en micelleop-løsning af 75 yM cholesterol (dobbelt radiomærket med [26,27-14C] cholesterol (40 Ci/mol) og [7a-3H] cholesterol (400 Ci/mol)) og 1,5 yM P45qSSC (oprenset fra 15 bovin binyrebark) i 10% (v/v) Tergitol NP 40/ethanol (1:1, v/v).
Man påbegyndte assayet ved at blande 7 5 yl af opløsning A med 50 yl opløsning B og 125 yl cellefri ekstrakt eller 125 yl af en kallumphosphatpuffer (50 20 mM, pH 7,0) med indhold af 10 ym ADX (oprenset fra bovin binyrebark). Man holdt blandingen under blid omrø-
O
ring ved 30 C og udtog prøver efter 15 minutters inku-bering, idet man fortyndede disse med 100 yl vand. Fra hver prøve ekstraherede man substrat og produkt eller 25 produkter med 100 yl methanol og 150 yl chloroform. Efter centrifugering (5000 g, 2 minutter) samlede man chloroformlaget og tørrede det, hvorefter man opløste den indtørrede remanens i 50 yl acetone med indhold af 0,5 mg af en steroidblanding (cholesterol, pregnenolon og progesteron (1:1:1, w/w/w)), hvorefter man tilsatte 110 yl koncentreret myresyre og opvarmede suspensionen 0 til 120 C i 15 minutter. Herefter bestemte man forholdet *4c/3H ved hjælp af dobbeltmærket væskescintilla- 59 DK 175573 B1 tionstælling. Forholdet er et direkte mål for sidekædespal tnings reakt ionen, idet den 14C-mærkede sidekæde bortfordampes fra blandingen som isocaprylsyre under opvarmningen. Ved dette assay kunne ADX elektronbære-5 raktivitet let demonstreres i den cellefrie ekstrakt fra K. lactis ADX-102. Ved assays med cellefrie ekstrakter fra K. lactis ADX-102 eller med renset ADX, blev sidekæden på cholesterol spaltet inden for 15 minutter med et udbytte på 50%, hvorimod man ikke i as-sayet med cellefrie ekstrakter fra kontrolstammen K. lactis CBS 2360 kunne påvise nogen form for sidekædespal tning .
Eksempel 25 15
Molekylær kloning og konstruktion af fuld længde cDNA, der koder for bovin adrenodoxinoxidoreduktase (ADR), og påfølgende transformation af ADRcDNA i gæren Kluyvero-myces lactis.
20 (a) Molekylær kloning af adrenodoxinoxidoreduktase.
Man fremstillede et bovint binyrebark cDNA bibliotek som beskrevet i eksempel 1 med en modifikation.
En yderligere ADR specifik primer (oligomer ADR-1) med 25 nucleotidsekvensen 5'-GGC TGG GAT CTA GGC-3' blev sat til reaktionsblandingen for syntesen af den første streng af cDNA. Oligomer ADR-1 findes netop nedstrøms for translationsstopkodon fra position 1494 til 1480. Nucleotidsekvenser og positioner på kortet af de nævnte 30 ADR-oligomere stammer alle fra ADRcDNA sekvensdata beskrevet af Nonaka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
145(3), 1239-1247, 1987.
Det opnåede cDNA bibliotek blev gennemsøgt med en 32P-mærket oligomer ADR-2 (5' -CAC CAC ACA GAT CTG GGG GGT CTG CTC CTG TGG GGA-3').
60 DK 175573 B1
Man kunne identificere fire hybridiserende pfu'er, som derefter blev renset. Imidlertid viste kun én pfu også et positivt signal med oligomer ADR-3 (5' -TTC CAT CAG CCG CTT CCT CGG GCG AGC GGC CTC 5 CCT-3' ), der findes i midten af ADRcDNA (position 840 til 805). ADRcDNA indsætningsstykker (ca. 2 kb) blev molekylært klonet i EcoRI-stedet på pTZ18R.
Det opnåede plasmid pGBADR-1 indeholder ADRcDNA i fuld længde, som det kan ses ved restriktionsenzym-10 kortlægning og nucleotidsekvensopdeling. En fysisk kortlægning af pGBADR-1 ses på figur 40.
(b) Konstruktion af ekspressionskassetten.
Man opnåede en ADRcDNA af fuld længde med modi-15 ficeret flankerende sekvenser til gærekspressionsvektor pGB950 ved PCR metoden (se eksempel 18) med pGBADR-1 som skabelon og to specifikke ADR-oligomere som prime-re.
Oligomer ADR-4 (5'-CGA GTG TCG ACA AAA ATG TCC
20 ACA CAG GAG CAG ACC-3') indeholder 18 baser, der er komplementære til de modne ADRcDNA sekvenser fra position 96 til 114 og 18 baser til indførelse af Sall restriktionssted, et optimalt gærtranslationssignal og et ATG initieringskodon.
25 Oligomer ADR-5 (5' -CGT GCT CGA GGT ACC TCA GTG
CCC CAG CAG CCG CAG-3') indeholder 18 baser, der er komplementære til minusstrengen af ADRcDNA opstrøms for translationsstopkodonet ved position 1479, og 15 baser til opnåelse af Kpnl og Xhol restriktionssteder for mo-30 lekylær kloning i forskellige ekspressionsvektorer.
Efter opformering med de ovenfor nævnte skabeloner og ADR primere fordøjede man det opformerede fragment (1,4 kb) med Sall og Xhol og indsatte det ved mo- 61 DK 175573 B1 lekylær kloning i gærekspressionsvektoren pGB950 gennemskåret med Sall og Xhol.
Det heraf afledte plasmid pGBADR-2 ses illustreret på figur 40.
5 (c) Transformation af K. lactis.
Man gennemskår 15 yg pGBADR-2 ved det unikke SacII-sted i lactasepromotoren og udførte transforma-tioen af K. lactis CBS 23 60 som beskrevet i eksempel .10 5(c).
Eksempel 26
Molekylær kloning af en fuld længde cDNA, der koder for 15 bovin NADPH-cytochrom P45Q reduktase (RED).
Man gennemsøgte det bovine binyrebark cDNA bibliotek beskrevet i eksempel 1 med en 32P-mærket syntetisk oligomer 5'-TGC CAG TTC GTA GAG CAC ATT GGT GCG 20 TGG CGG GTT AGT GAT GTC CAG GT-3', der er specifik for en bevaret aminosyreregion hos rotte-, svine- og kanin-RED som beskrevet af Katagari et al. (J. Biochem., 100, 945-954, 1986) og Murakami et al. (DNA, 5, 1-10, 1986).
Herved opnåede man fem hybridiserende pfu'er og 25 karakteriserede disse yderligere ved restriktionsenzymkortlægning og nucleotidsekvensopdeling. Man indsatte en fuld længde REDcDNA i ekspressionsvektorer og transformerede disse til passende værter som nævnt i eksemplerne 2, 3 og 6.
DK 175573 B1 62
Eksempel 27
Konstruktion, transformation og ekspression af en ekspressionskassette, der koder for proteinerne P45QSSC og 5 ADX i gæren Kluyveromyces lactis.
(a) Konstruktion af ekspressionskassetten.
Man fordøjede ekspressionskassetten pGBADX-1 (se eksempel 23) med SacII og Hindlll (delvis) og udfyldte 10 klæbende ender under anvendelse af Klenow DNA polymerase. DNA fragmentet, der omfattede en del af lactase-promotoren (der stadig fungerede), den kodende ADX sekvens og lactaseterminatoren blev fraskilt og isoleret ved agarosegelelektroforese og derefter indsat i 15 pGBSCC-7, der først blev lineariseret ved Xbal fordøjelse (se eksempel 5(b)) og fik klæbende ender udfyldt under anvendelse af Klenow DNA polymerase. Konstruktionen blev foretaget på en sådan måde, at man opnåede et unikt restriktionssted (SacII), der er nødvendigt for 20 at overføre plasmidet til K. lactis.
Dette unikke SacII restriktionssted findes i lactasepromotersekvensen, der flankerer SCC sekvensen, idet SacII restriktionsstedet i lactasepromoteren, der flankerer ADX sekvensen, bliver ødelagt ved udfyldnin-2 5 gen.
Den opnåede ekspressionskassette pGBSCC/ADX-1 indeholder både den kodende sekvens for SCC og for ADX, og de drives begge af lactasepromoteren. 1 (b) Transformation af K. lactis.
Man udførte transformation af K. lactis CBS 2360 som beskrevet i eksempel 5(c) med 15 yg pGBSCC/ADX-1, lineariseret ved det unikke SacII restriktionssted. Man 63 DK 175573 B1 udvalgte en transformant (SCC/ADX-101) for SCC og ADX ekspressionsstudier.
(c) Analyse af transformanten K. lactis SCC/ADX-101.
5 Man fremstillede cellulære proteinfraktioner fra kulturer af SCC/ADX-101 og kontrolstammen CBS 2360 som beskrevet i eksempel 5(d) og analyserede disse ved SDS/PAGE og Western blot. Man sondeundersøgte blottet med antistoffer, der var specifikke for henholdsvis SCC 10 og ADX. Ved sammenligning med kontrolstammen opviser det cellulære proteinfraktion fra transformanten SCC/ADX 101 to yderligere bånd med den ventede længde (henholdsvis 53 og 14 kDa), hvilket viser ekspression af begge proteiner SCC og ADX. Ekspressionsniveauer for 15 begge proteiner i transformanten SCC/ADX-101 er sammenlignelige med niveauer observeret hos transformanter, der kun eksprimerer ét protein (for SCC se figur 15A, bane 3, og for ADX figur 39, bane 5).
In vitro SCC og ADX aktivitet af transformant 20 SCC/ADX-101 ses beskrevt i eksempel 28.
Eksempel 28
In vitro aktivitet af P450SSC og adrenodoxin opnået fra 25 Kluyveromyces lactis SCC/ADX-101.
Man dyrkede K. lactis SCC/ADX-101 opnået som beskrevet i eksempel 27 og kontrolstamme K. lactis SCC-101 som beskrevet i eksempel 5(d) ill YEPD medium 30 (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% glucose, monohydrat) med indhold af 100 mg l"1 geneticin (G418 sulfat; Gibco Ltd.), i 72 timer ved 30 C. Cellerne blev fracentrifugeret (4000 g, 15 minutter), suspenderet i en fysiolo- 64 DK 175573 B1
gisk saltopløsning og vasket med en phosphatpuffer (pH
7.5, 75 mM) . Efter centrifugering (4000 g, 15 minutter), suspenderede man pelleten i en phosphatpuffer (pH
7.5, 75 mM) til opnåelse af en suspension, der inde-5 holdt 0,5 g våd cellevægt pr. ml. Cellerne blev sprængt under anvendelse af Braun MSK Homogenizer (6 x 15 sekunder, 0,45-0,50 mm glasperler). Hele celler blev fjernet ved centrifugering (4000 g, 15 minutter).
Man foretog analyse for aktiviteten af protein-komplekset P45qSSC/ADX i de cellefrie ekstrakter, idet man bestemte den sidekædespaltende reaktion i cholesterol under tilstedeværelse af NADPH og ADR. Assayblan-dingen bestod af følgende opløsninger:
Opløsning A (naturlig P450SSC elektrondonerende 15 system med undtagelse af ADX): en 50 mM kaliumphosphat-puffer (pH 7,0), indeholdende 3 mM EDTA, 2 yM adrenodo-xinreduktase (oprenset fra bovin binyrebark), 1 mM NADPH (elektrondonor), 15 mM glucose-6-phosphat og 16 enheder/ml glucose-6-phosphat-dehydrogenase (NADPH 20 regenereringssystem).
Opløsning B (substrat): en micelleopløsning af 37,5 yM cholesterol (dobbelt radiomærket med [26,27-14C] cholesterol (40 Ci/mol) og [7a-3H] cholesterol (400 Ci/mol)) i 10% (v/v) Tergitol NP 40/ethanol 25 (1:1, v/v).
Man startede assayet ved at blande 75 yl af opløsning A med 50 yl opløsning B og med 125 yl af cellefri ekstrakt. Blandingen blev holdt under blid omrøring ved 30°C, og man udtog prøver efter 60 minutters inku-30 bering og fortyndede disse med 100 yl vand. Fra en prøve ekstraherede man substrat og produkt eller produkter med 100 yl methanol og 150 yl chloroform. Efter centrifugering (5000 g, 2 minutter) samlede man chloroformla- 65 DK 175573 B1 get og tørrede det. Den tørrede remanens blev opløst i 50 μΐ acetone med indhold af 0,5 mg af en steroidblanding (cholesterol, pregnenolon og progesteron (1:1:1, 5 w/w/w)), hvorefter man tilsatte 110 μΐ koncentreret myresyre.
0
Suspensionen blev opvarmet til 120 C i 15 minutter. Derefter bestemte man forholdet 14C/3H ved dobbelt mærket væskescintillationstælling. Dette for-10 hold er et direkte mål for den sidekædespaltende reaktion, idet den 14C-mærkede sidekæde bortfordampes fra blandingen som isocaprylsyre under opvarmningen.
Under anvendelse af dette assay kunne man påvise cholesterol sidekædespaltende aktivitet i den cellefrie 15 ekstrakt fra K. lactis SCC/adx-101, hvorimod man ikke kunne påvise nogen aktivitet i den cellefrie ekstrakt fra K. lactis SCC-101.
ved hjælp af HPLC-analyse kunne man identificere reaktionsproduktet og frembragt af en cellefri ekstrakt 20 af K. lactis SCC/ADX-101 som pregnenolon.
··

Claims (27)

66 DK 175573 B1
1. Anvendelse af en ekspressionskassette i mul-tigeniske systemer til gennemføring af mangetrinsomdannelser som vist på figur 1, hvor ekspressionskas- 5 setten kan fungere i en ikke pattedyrs rekombinant vært, kendetegnet ved, at ekspressionskassetten omfatter en heterolog DNA kodende sekvens, der koder for et protein, idet dette alene eller i samarbejde med et eller flere yderligere proteiner funge-10 rer ved at katalysere et oxidationstrin i den biologiske omdannelsesvej af cholesterol til hydrocorti-son, hvor dette trin er udvalgt blandt: omdannelsen af cholesterol til pregnenolon; omdannelsen af pregnenolon til progesteron; 15 omdannelsen af progesteron til I7o:-hydroxy- progesteron; omdannelsen af 17a-hydroxyprogesteron til cor-texolon; og omdannelsen af cortexolon til hydrocortison, 20 samt de i værten effektive tilsvarende kontrolsekvenser.
2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at proteinet er udvalgt blandt: sidekædespaltende enzym (P450SCC) ; 25 adrenodoxin (ADX); adrenodoxinreduktase (ADR); 3/3-hydroxys teroiddehydrogenase/isomerase (3/3- HSD) ; steroid-17a;-hydroxylase {P4sol7“) ;
30 NADPH cytochrom P450 reduktase (RED) ; steroid-21-hydroxylase (P450C2D ; og steroid 11/3-hydroxylase (P450II) - 67 DK 175573 B1
3. Anvendelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den heterologe DNA kodende sekvens er af bovin oprindelse.
4. Anvendelse ifølge krav 3 af ekspressionskas-5 setten pGBSCC-5, kendetegnet ved, at den heterologe DNA koder for enzymet P4s0SCC, og at ekspressionskassetten er vist på figur 8 fungerer i Bacillus arter.
5. Anvendelse ifølge krav 3 af ekspressionskas-10 setten pGBSCC-17, kendetegnet ved, at den heterologe DNA koder for enzymet P4S0SCC, og at ekspressionskassetten vist på figur 10 fungerer i E. co-li.
6. Anvendelse ifølge krav 3 af en ekspressions-15 kassette, kendetegnet ved, at den heterologe DNA koder for enzymet P450SCC, og at den i Kluy-veromyces lactis fungerende ekspressionskassette er valgt blandt pGBSCC-7 vist på figur 14, pGBSCC-12 vist på figur 12 og pGBSCC-15 vist på figur 20; eller 20 at den i Saccharomyces cerevisiae fungerende ekspressionskassette er valgt blandt pGBSCC-10 vist på figur 17, pGBSCC-13 vist på figur 19 og pGBSCC-16 vist på figur 21.
7. Anvendelse ifølge krav 3 af ekspressionskas-25 setten pGB17or-5, kendetegnet ved, at den heterologe DNA koder for enzymet P45t>17a, og at ekspressionskassetten vist på figur 24 fungerer i Kluy-veromyces lactis
8. Anvendelse ifølge krav 3 af en ekspressions-30 kassette pGB17o!-8, kendetegnet ved, at den heterologe DNA koder for enzymet P4S017cx, og at ekspressionskassetten vist på figur 27 fungerer i Bacillus arter. 68 DK 175573 B1
9. Anvendelse ifølge krav 3 af en ekspressions-kassette pGBll/3-4, kendetegnet ved, at den heterologe DNA koder for enzymet Ρ45ο11/3, og at ekspressionskassetten vist på figur 37 fungerer i Kluy- 5 veromyces lactis.
10. Ekspressionskassette, der kan fungere i en ikke pattedyrs rekombinant vært, omfattende en heterolog DNA kodende for et protein, der alene eller i samarbejde med et eller flere yderligere proteiner 10 fungerer ved at katalysere et oxidationstrin i den biologiske reaktionsvej for omdannelse af cholesterol til hydrocortison, kendetegnet ved, at dette er valgt blandt: omdannelsen af cholesterol til pregnenolon; 15 omdannelsen af pregnenolon til progesteron; omdannelsen af progesteron til 17a-hydroxyproge-steron; omdannelsen af 17a-hydroxyprogesteron til corte-xolon; og 20 omdannelsen af cortexolon til hydrocortison; og de tilsvarende kontrolsekvenser, der er effektive i denne vært, kendetegnet ved, at proteinet er valgt blandt: s idekædespal t ende enzym (P450SCC) ; 25 adrenodoxin (ADX); adrenodoxinreduktase (ADR); 3 β-hydroxysteroiddehydrogenase/i somerase (3 β- HSD) ; steroid-17a-hydroxylase (P4S0l7a) ;
30 NADPH cytochrom P4S0 reduktase (RED) ; steroid-21-hydroxylase (P450C21) ; og steroid 11/3-hydroxylase (P4S0ll) ; 69 DK 175573 B1 og at den heterologe DNA koder for mindst et yderligere protein fra denne gruppe af proteiner.
11. Ekspressionskass'ette ifølge krav 10, der kan fungere i en ikke pattedyrs rekombinant vært, omfat-5 tende en heterolog DNA kodende for et protein, der alene eller i samarbejde med et eller flere yderligere proteiner fungerer ved at katalysere et oxidationstrin i den biologiske reaktionsvej for omdannelse af cholesterol til hydrocortison, hvor dette trin 10 er valgt blandt: omdannelsen af cholesterol til pregnenolon; omdannelsen af pregnenolon til progesteron; omdannelsen af progesteron til 17a-hydroxyproge-steron; 15 omdannelsen af 17a-hydroxyprogesteron til cor- texolon; og omdannelsen af cortexolon til hydrocortison, og de hertil svarende kontrolsekvenser, der er effektive i denne vært, kendetegnet ved, at 20 proteinet er valgt blandt: s idekæde spalt ende enzym (P45oSCC) ; adrenodoxin (ADX); adrenodoxinreduktase (ADR); 3/3-hydroxy s t ero i ddehydr ogena s e / i s ome rase (3/3-
12. Ekspressionskassette ifølge krav 10 eller 11, kendetegnet ved, at den heterologe DNA koder for bovin P450SCC og bovin ADX.
13. Ekspressionskassette, der kan fungere i en 5 ikke pattedyrs rekombinant vært omfattende en heterolog DNA kodende for mindst to proteiner, der alene eller i samarbejde med et eller flere yderligere proteiner fungerer ved at katalysere mindst to oxidationstrin, kendetegnet ved, at disse er 10 valgt blandt: omdannelsen af cholesterol til pregnenolon; omdannelsen af pregnenolon til progesteron; omdannelsen af progesteron til 17oi-hydroxyproge-steron; 15 omdannelsen af 17a-hydroxyprogesteron til corte- xolon; og omdannelsen af cortexolon til hydrocortison, og de i værten effektive kontrolsekvenser.
14. Ekspressionskassette ifølge krav 13, der kan 20 fungere i en ikke pattedyrs rekombinant vært, omfattende en heterolog DNA kodende for mindst to proteiner, der alene eller i samarbejde med et flere yderligere proteiner fungerer ved at katalysere mindst to oxidationstrin, hvor disse er valgt blandt: 25 omdannelsen af cholesterol til pregnenolon; omdannelsen af pregnenolon til progesteron,-omdannelsen af progesteron til 17of-hydroxyprogest eron; omdannelsen af 17ar-hydroxyprogesteron til corte- 30 xolon; og omdannelsen af cortexolon til hydrocortison, og de i værten effektive kontrolsekvenser, kendetegnet ved, at den heterologe DNA kodende 71 DK 175573 B1 for det andet protein har sin egen effektive kontrolsekvens .
15. Ekspressionskassette ifølge krav 13 eller 14, kendetegnet ved, at proteinet er valgt 5 blandt: sidekaedespaltende enzym (P450SCC) ; adrenodoxin (ADX); adrenodoxinreduktase (ADR); 3/?-hydroxysteroiddehydrogenase/isomerase (3β-10 HSD); steroid-17a-hydroxylase (Ρ45ο17α) ; NADPH cytochrom P45o reduktase (RED) ; steroid-21-hydroxylase {P45oC21) ; og steroid 11β-hydroxyl ase (P450ll) .
16. Ekspressionskassette ifølge krav 15, ken detegnet ved, at den kodende heterologe DNA-sekvens er af bovin oprindelse.
17. Rekombinant værtscelle og afkommet deraf omfattende celler af mikroorganismer, planter eller dyr 20 og indeholdende en ekspressionskassette med heterolog DNA, kendetegnet ved, at ekspressionskassetten er en sådan ifølge et hvilket som helst af kravene 10-16.
18. Rekombinant værtscelle og afkommet deraf 25 ifølge krav 17, kendetegnet ved, at værten er en mikroorganisme.
19. Rekombinant værtscelle og afkommet deraf ifølge krav 18, kendetegnet ved, at værten er en art af Saccharomyces, Kluyveromyces eller Ba- 30 cillus eller er Escherichia col i. 72 DK 175573 B1
20. Rekombinant værtscelle og afkommet deraf ifølge et hvilket som helst af kravene 17-19, kendetegnet ved, at den indeholder mindst to ekspressionskassetter ifølge et hvilket som helst af 5 kravene 10-16.
21. Fremgangsmåde til fremstilling af en blanding af endogene proteiner ved hjælp af en rekombi-nant celle i et næringsmiddel under sådanne betingelser, at enzymerne kan dannes og akkumuleres i kultu- 10 ren, kendetegnet ved, at man som rekombi-nant celle benytter en rekombinant værtscelle ifølge krav 20.
22. Fremgangsmåde til selektiv biokemisk oxidation in vitro omfattende, at man inkuberer den for- 15 bindelse, der skal oxideres, under tilstedeværelse af et eller flere proteiner under betingelser, der tillader denne oxidation og en akkumulering af den oxiderede forbindelse i dyrkningsvæsken, hvorefter man udvinder den oxiderede forbindelse, kendeteg- 20. e t ved, at proteinerne er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 21.
23. Fremgangsmåde til oxidation af en udvalgt forbindelse, omfattende at man dyrker rekombinante celler under tilstedeværelse af den udvalgte forbin- 25 delse under betingelser, hvorved den ønskede oxidation sker, og den oxiderede forbindelse akkumuleres i dyrkningsvæsken, hvorefter man udvinder den oxiderede forbindelse, kendetegnet ved, at man som rekombinante celler benytter rekombinante værtsceller 30 ifølge et hvilket som helst af kravene 17-20. 73 DK 175573 B1
24. Fremgangsmåde ifølge krav 22 eller 23, kendetegnet ved, at oxidationen er udvalgt blandt: spaltning af sidekæden i en sterolforbindelse 5 til opnåelse af pregnelonon; omdannelse af pregnelonon til progesteron; omdannelse af progesteron til 17n-hydroxyproge-steron; omdannelse af 17a-hydroxyprogesterol til cor-10 texolon; og omdannelse til cortexolon til hydrocortison.
25. Fremgangsmåde ifølge krav 24, kendetegnet ved, at oxidationen er spaltning af sidekæden i en sterolforbindelse til opnåelse af 15 pregnelonon.
25 HSD); steroid-17af-hydroxylase (P45017a) ; NADPH cytochrom P450 reduktase (RED) ; steroid-21-hydroxylase (P450C21) ; og steroid 11 β-hydroxylase (Ρ45011) ; 30 kendetegnet ved, at den heterologe DNA kodende for det yderligere protein er en yderligere heterolog DNA med sine egne effektive kontrolsekvenser, der for et protein i denne gruppe af proteiner. 70 DK 175573 B1
26. Fremgangsmåde ifølge krav 24, kende tegnet ved, at oxidationen er en 17a-hydrox-ylering af progesteron.
27. Fremgangsmåde ifølge krav 24, kende- 20 tegnet ved, at der i et trin udføres mindst to af de i krav 21 nævnte oxidationer med samme sub stratmolekyle .
DK199002648A 1988-05-06 1990-11-05 Anvendelse af en ekspressionskassette förende til biokemisk oxidation af steroider, sådanne ekspressionskassetter, DK175573B1 (da)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP88200904 1988-05-06
EP88200904 1988-05-06
EP88202080 1988-09-23
EP88202080 1988-09-23
PCT/NL1989/000032 WO1989010963A1 (en) 1988-05-06 1989-05-08 Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
NL8900032 1989-05-08

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK264890A DK264890A (da) 1990-11-05
DK264890D0 DK264890D0 (da) 1990-11-05
DK175573B1 true DK175573B1 (da) 2004-12-13

Family

ID=26115083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK199002648A DK175573B1 (da) 1988-05-06 1990-11-05 Anvendelse af en ekspressionskassette förende til biokemisk oxidation af steroider, sådanne ekspressionskassetter,

Country Status (16)

Country Link
JP (2) JP2963711B2 (da)
KR (1) KR100256025B1 (da)
CN (1) CN1038667A (da)
AT (1) ATE201235T1 (da)
AU (1) AU635494B2 (da)
CA (1) CA1340616C (da)
DE (1) DE68929296T2 (da)
DK (1) DK175573B1 (da)
ES (1) ES2157883T3 (da)
FI (1) FI109605B (da)
HU (1) HU217411B (da)
IL (1) IL90207A (da)
NO (1) NO314267B1 (da)
NZ (1) NZ229032A (da)
PT (1) PT90484B (da)
WO (1) WO1989010963A1 (da)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1042567A (zh) * 1988-09-23 1990-05-30 吉斯特-布罗卡迪斯公司 类固醇多步氧化方法和所用的遗传工程细胞
EP0477961B1 (en) * 1990-09-26 1996-09-11 Sumitomo Chemical Company, Limited Mitochondrial P450
US5420027A (en) * 1991-01-10 1995-05-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the expression of biologically active fusion proteins comprising a eukaryotic cytochrome P450 fused to a reductase in bacteria
US5240831A (en) * 1991-01-10 1993-08-31 Board Of Regents, The University Of Texas Methods and compositions for the expression of biologically active eukaryotic cytochrome p45os in bacteria
US9255256B2 (en) 1996-07-17 2016-02-09 Btg International Limited Expression of functional cytochorome P450 monooxygenase system in enterobacteria
GB9615032D0 (en) 1996-07-17 1996-09-04 Univ Dundee Enzyme system
FR2820145B1 (fr) * 2001-01-31 2004-01-23 Aventis Pharma Sa Souche de levure produisant des steroides de facon autonome
JPWO2010079594A1 (ja) * 2009-01-07 2012-06-21 三菱化学株式会社 ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用
CN118109544A (zh) 2013-06-17 2024-05-31 赛诺菲 用于细胞色素p450单加氧酶生物催化的全细胞系统
JP6608372B2 (ja) * 2014-01-20 2019-11-20 サノフイ 酵素活性が増大した新規チトクロムｐ４５０ポリペプチド
JP5800040B2 (ja) * 2014-01-29 2015-10-28 三菱化学株式会社 ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4720454A (en) * 1984-04-18 1988-01-19 White Perrin C Genetic probe used in the detection of adrenal hyperplasia

Also Published As

Publication number Publication date
HU893289D0 (en) 1990-12-28
AU635494B2 (en) 1993-03-25
ES2157883T3 (es) 2001-09-01
PT90484A (pt) 1989-11-30
IL90207A0 (en) 1989-12-15
NZ229032A (en) 1992-06-25
HU217411B (hu) 2000-01-28
FI109605B (fi) 2002-09-13
AU3575989A (en) 1989-11-29
JPH11308991A (ja) 1999-11-09
DK264890A (da) 1990-11-05
ATE201235T1 (de) 2001-06-15
JPH04500303A (ja) 1992-01-23
NO314267B1 (no) 2003-02-24
PT90484B (pt) 1994-08-31
HUT54413A (en) 1991-02-28
KR900702022A (ko) 1990-12-05
IL90207A (en) 1994-07-31
DE68929296T2 (de) 2001-12-06
CN1038667A (zh) 1990-01-10
FI905464A0 (fi) 1990-11-05
DE68929296D1 (de) 2001-06-21
KR100256025B1 (ko) 2000-05-01
WO1989010963A1 (en) 1989-11-16
NO904791D0 (no) 1990-11-05
NO904791L (no) 1991-01-04
CA1340616C (en) 1999-06-29
JP2963711B2 (ja) 1999-10-18
DK264890D0 (da) 1990-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Szczebara et al. Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast
EP1385980B1 (fr) Souches de levures produisant des steroides de facon autonome
DK175573B1 (da) Anvendelse af en ekspressionskassette förende til biokemisk oxidation af steroider, sådanne ekspressionskassetter,
WO2010079594A1 (ja) ステロール側鎖切断酵素蛋白質およびその利用
US5965417A (en) Arabidepsi thaliana proteins having Δ-5,7-sterol-Δ-7-reductase activity
CA1340563C (en) Process for the multiple oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
EP0340878B1 (en) Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
Li et al. Improved 11α-hydroxycanrenone production by modification of cytochrome P450 monooxygenase gene in Aspergillus ochraceus
US5869283A (en) Expression cassette operable in a recombinant host
CA2285686C (fr) Souches de levure ayant le gene atf2 interrompu et leurs applications
JP4668176B2 (ja) トリテルペン水酸化酵素
IE83307B1 (en) Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
JPH0569511B2 (da)

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired