Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

MXPA05006535A - Acidos nucleicos, proteinas y anticuerpos btl-ii. - Google Patents

Acidos nucleicos, proteinas y anticuerpos btl-ii.

Info

Publication number
MXPA05006535A
MXPA05006535A MXPA05006535A MXPA05006535A MXPA05006535A MX PA05006535 A MXPA05006535 A MX PA05006535A MX PA05006535 A MXPA05006535 A MX PA05006535A MX PA05006535 A MXPA05006535 A MX PA05006535A MX PA05006535 A MXPA05006535 A MX PA05006535A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
seq
btl
protein
amino acids
cells
Prior art date
Application number
MXPA05006535A
Other languages
English (en)
Inventor
L Viney Joanne
Original Assignee
Immunex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunex Corp filed Critical Immunex Corp
Publication of MXPA05006535A publication Critical patent/MXPA05006535A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/40—Mineralocorticosteroids, e.g. aldosterone; Drugs increasing or potentiating the activity of mineralocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

La presente invencion se refiere a a proteinas, acidos nucleicos, anticuerpos, BTL-II, antagonistas y agonistas y metodos de para elaborarlos y usar los mismos. Se proporcionan diagnostico, seleccion y metodos terapeuticos para usar las composiciones de la invencion. Por ejemplo, las composiciones de la invencion pueden ser usadas para el diagnostico y tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino y para mejorar la respuesta mucosal a un antigeno.

Description

ÁCIDOS NUCLEICOS, PROTEÍNAS Y ANTICUERPOS BTL-II CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a proteínas similares a butirofilina, específicamente proteínas similares a butirofilina de la subfamilia B7, las cuales se conocen por modular la función de células efectoras inmunes tales como, por ejemplo, células B y/o células T. También se incluyen ácidos nucleicos para codificar tales proteínas, procesos producir tales proteínas, anticuerpos que se enlazan a tales proteínas, composiciones farmacéuticas que contienen tales proteínas o anticuerpos, métodos para usar tales ácidos nucleicos, proteínas, y anticuerpos contra tales proteínas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La modulación de una respuesta inmune o inflamatoria puede ser una herramienta valiosa en el control de varios tipos de enfermedades que incluyen enfermedades autoinmunes, enfermedades caracterizadas por inflamación anormal y/o respuesta inmune, e infecciones. En el tratamiento de enfermedades caracterizadas por inflamación anormal y/o respuestas inmunes, tales como enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedades autoinmunes o inflamatorias, es deseable la modulación descendente de una respuesta inmune. En otras situaciones, por ejemplo cuando se REF. : 164521 vacuna a un paciente para impartir inmunidad a una enfermedad infecciosa, es deseable la estimulación de una respuesta inmune. En la colocación de la vacuna, los adyuvantes que pueden elevar una respuesta inmune a un antígeno coadministrado, pueden ser valiosos al proporcionar protección de término prolongado contra la enfermedad. Particularmente carentes en la técnica, están adyuvantes capaces de estimular una respuesta inmune mucosal. Una respuesta inmune mucosal, contraria a una respuesta inmune sistémica, es valiosa debido a que puede atacar una infección en un punto muy común de entrada, que es, una superficie mucosal . La presente invención dirige estas necesidades en la técnica proporcionando agentes terapéuticos para diagnosis y tratar enfermedades caracterizadas por inflamación anormal y/o inapropiada y/o respuestas inmunes y agentes terapéuticos que pueden actuar como adyuvantes para estimular una respuesta inmune, particularmente una respuesta inmune mucosal .
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención abarca proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos BTL-II, inhibidores BTL-II y agonistas, y métodos para usar estas composiciones. Se proporciona una proteína BTL-II aislada comprende una secuencia de aminoácido que consiste de Ref: 154521 aminoácidos x-y de la SEC ID NO: 4, en donde x es cualquier aminoácido de la posición 1 a 35 de la SEC ID NO: 4 y y es cualquier aminoácido de la posición 452-462 de la SEC ID NO: 4. Tal proteína BLT-II puede comprender aminoácidos 30 a 453, 1 a 453, 29 a 457, 1 a 457, 1 a 482 y/o 29 a 482 de la SEC ID NO: 4. La invención además proporciona una proteína BTL-II aislada que comprende un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácido de al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96% ó 98%, idéntica a los aminoácidos 127 a 157 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, o la SEC ID NO: 18 o aminoácidos 126 a 156 de la SEC ID NO: 16, en donde la región de identidad de la secuencia de aminoácido alineada con aminoácidos 127 a 157 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 18 o aminoácidos 126 a 156 de la SEC ID NO: 16 es al menos 20, opcionalmente al menos 25, ó 30 aminoácidos prolongados y el polipéptido puede enlazarse a un receptor de superficie celular expresado en células B o células T y/o puede inhibir la proliferación de células T. Tales secuencias de aminoácido pueden ser al menos 150 aminoácidos de longitud y pueden ser al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ó 99.5%, idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18, en donde la región de identidad de la secuencia de aminoácido alineada con aminoácidos 30 a 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18 es al menos 150, opcionalmente al menos 200, 250 ó 300 aminoácidos. Además, la secuencia de aminoácido puede ser al menos 90%, opcionalmente al menos 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ó 99.5% idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18 y/o pueden comprender aminoácidos 30 a 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18. En otra modalidad, la invención abarca una proteína BTL-II aislada que comprende un primer polipéptido que consiste de una primera secuencia de aminoácido al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o 99.5% idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18, en donde la región de identidad de la primera secuencia de aminoácido alineada con aminoácidos 30 a 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18 es al menos 150 aminoácidos, en donde el primer polipéptido comprende un segundo polipéptido que consiste de una segunda secuencia de aminoácido al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o 99.5% idéntica a los aminoácidos 127 a 157 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 18, o aminoácidos 126 a 156 de la SEC ID NO: 16, en donde la región de identidad de la segunda secuencia de aminoácido alineada con aminoácidos 127 a 157 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 18 o aminoácidos 126 a 156 de la SEC ID NO: 16 es al menos 20 aminoácidos de longitud, y en donde el primer polipéptido puede inhibir la proliferación de células T. La primer secuencia de aminoácido puede ser idéntica a los aminoácidos 127 a 157 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, o SEC ID NO: 18, o aminoácidos 126 a 156 de la SEC ID NO: 16. De forma alternativa, la invención proporciona una proteína BTL-II aislada que comprende un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácido al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o 99.5% idéntica a los aminoácidos 30 a 457 de SEC ID NO: 4, en donde el polipéptido comprende no más o menos de 2 dominios similares a Ig, y en donde el polipéptido puede inhibir la proliferación de células T. La secuencia de aminoácido puede ser al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 99.5% o 100% idéntica a los aminoácidos 30 a 247 de la SEC ID NO: 8 o a los aminoácidos 30 a 243 de la SEC ID NO: 12. La secuencia de aminoácido puede ser al menos 90%, opcionalmente al menos 92%, 94%, 96%, 98%, 99%, 99.5% o 100% idéntica a los aminoácidos 30 a 457 de la SEC ID NO: 4. De forma alternativa, una proteína BTL-II de la invención puede comprender un primer polipéptido que consiste de una primera secuencia de aminoácido al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o 99.5% idéntica a los aminoácidos 247 a 452 de la SEC ID NO: 4 o a los aminoácidos 248 a 447 de la SEC ID NO: 6, en donde la primer secuencia de aminoácido no comprende una secuencia de aminoácido al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o 99.5% idéntica a los aminoácidos 32 a 232 de la SEC ID NO: 4 o para aminoácido 27 a 232 de la SEC ID NO: 6 con una región de identidad de la primer secuencia de aminoácido alineada con la SEC ID NO: 4 de al menos 25, opcionalmente, al menos 50, 75, 100 o 150 aminoácidos, y en donde la proteina no comprende un segundo polipéptido que consiste de una segunda secuencia de aminoácido al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o 99.5% idéntica a los aminoácidos 32 a 232 de la SEC ID NO: 4 o para aminoácido 27 a 232 de la SEC ID NO: 6 con una región de identidad de la segunda secuencia de aminoácido alineada con la SEC ID NO: 4 de al menos 25, opcionalmente, al menos 50, 75, 100 ó 150 aminoácidos, y en donde el primer polipéptido puede inhibir la proliferación de células T. En otra modalidad, una proteina BTL-II aislada de la invención puede comprender un primer polipéptido que consiste de una primer secuencia de aminoácidos al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o 99.5% idéntica para los aminoácidos 32 a 242 de la SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 12, en donde la región de identidad de la primer secuencia de aminoácido alineada con la SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 12 es al menos aproximadamente 50, opcionalmente al menos aproximadamente 75, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud, en donde el primer polipéptido comprende un segundo polipéptido que consiste de una segunda secuencia de aminoácido al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ó 99.5% idéntica a los aminoácidos 10 a 40 de la SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 12, en donde la región de identidad de la segunda secuencia de aminoácido alineada con la SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 12 es al menos aproximadamente 20, opcionalmente al menos aproximadamente 25 ó 30 aminoácidos de longitud, y en donde el primer polipéptido puede inhibir la proliferación de células T. En todavía otra modalidad, la invención abarca una proteína BTL-II aislada que comprende un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácido al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% ó 99.5% idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18, en donde la región de identidad de la secuencia de aminoácido alineada con aminoácidos 30 a 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18 es al menos 250, opcionalmente al menos 275 ó 300 aminoácidos, y en donde el polipéptido puede inhibir la proliferación de células T. Las proteínas BTL-II de la invención pueden comprender un polipéptido que puede inhibir la proliferación de células T que pueden ser a lo sumo aproximadamente 480 aminoácidos, aproximadamente 380 aminoácidos, aproximadamente 270 aminoácidos o aproximadamente 160 aminoácidos de longitud. La invención además abarca una proteína BTL-II aislada que comprende un primer polipéptido que consiste de una primer secuencia de aminoácido de al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% o 99.5% idéntica a los aminoácidos 32 a 358 de la SEC ID NO: 10, en donde la región de identidad de la primer secuencia de aminoácido alienada a la SEC ID NO: 10 es al menos aproximadamente 175, opcionalmente aproximadamente 200, 250, 275 o 300 aminoácidos de longitud, en donde la primer secuencia de aminoácido no es más que aproximadamente 380, opcionalmente no más de aproximadamente 390, 270 ó 170 aminoácidos de longitud, en donde el primer polipéptido puede inhibir la proliferación de células T, en donde la primer secuencia de aminoácido no es al menos 80% idéntica a los aminoácidos 148 a 232 de la SEC ID NO: 4 con una región de identidad de la primer secuencia de aminoácido alineada a los aminoácidos 148 a 232 de la SEC ID NO: 4 de al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60 ó 75 aminoácidos, y en donde la proteína BTL-II no comprende una segunda secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica a los aminoácidos 148 a 232 de la SEC ID NO: 4 con una región de identidad de la segunda secuencia de aminoácido alineada a los aminoácidos 148 a 232 de la SEC ID NO: 4 de al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60 ó 75 aminoácidos. Tal proteína BTL-II puede comprender aminoácidos 32 a 242 de la SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 12. En otra modalidad, la invención comprende una proteína de fusión recombinante BTL-II que comprende la proteína BTL-II y un polipéptido heterólogo, el cual puede ser una región Fe de un anticuerpo o un cierre de leucina. La invención también abarca un fragmento inmunogénico de aminoácidos 29 a 457 de la SEC ID NO: 4 que es capaz de estimular anticuerpos que se enlazan específicamente al fragmento, que es al menos 10 aminoácidos de longitud, y que se extiende a la posición 360 de la SEC ID NO: 4. Se proporcionan fragmentos inmunogénicos de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 18 de al menos 10 aminoácidos de longitud, en donde el fragmento inmunogénico se extiende a la posición 141 a 143 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 18 o SEC ID NO: 16 y pueden estimular anticuerpos que se enlazan específicamente al fragmento. De forma alternativa, los fragmentos inmunogénicos pueden extenderse a la posición 142 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, o SEC ID NO: 18 o posición 141 de la SÉC ID NO: 16. En modalidades alternas, se proporcionan proteínas BTL-II de murino. Específicamente, la invención proporciona una proteína BTL-II aislada que comprende una secuencia de aminoácido que consiste de aminoácidos x-y de la SEC ID NO: 6, en donde x es cualquier aminoácido de la posición 1 a 35 de la SEC ID NO: 4 y y es cualquier aminoácido de la posición 450-460 de la SEC ID NO: 6. Tal proteína BTL-II puede comprender los aminoácidos 32-450, 29 a 456, y/o 29 a 514 de la SEC ID NO: 6. Otras modalidades incluyen anticuerpos aislados que se enlazan específicamente a una proteína que consiste de aminoácidos 1-457 de la SEC ID NO: 4, 1-456 de la SEC ID NO: 6, 1-247 de la SEC ID NO: 8, 1-363 de la SEC ID NO: 10, 1-243 de la SEC ID NO: 12, 1-359 de la SEC ID NO: 14, 1-358 de la SEC ID NO: 16, ó 1-362 de la SEC ID NO: 18. Tales anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales , anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos y pueden inhibir el enlace de la BTL-II a su receptor. La invención abarca ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos y células que pueden producir tales anticuerpos, las cuales pueden ser células de hibridoma o células que han sido genéticamente modificadas para producir tal anticuerpo. La invención además abarca métodos para producir anticuerpos cultivando tales células, las cuales pueden secretar el anticuerpo.
Otras modalidades incluyen ácidos nucleicos BTL-II. La invención abarca un ácido nucleico BTL-II aislado que comprende un polinucleótido que consiste de nucleótidos x a y de la SEC ID NO: 3, en donde x es de nucleótido 1 a 105 y y es del nucleótido 1345 a 1375, o que comprende el complemento del polinucleótido. Tal ácido nucleico puede comprender nucleótidos 105 a 1345 ó 1 a 1371 de la SEC ID NO: 3. Además, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican fragmentos inmunogénicos , como son ácidos nucleicos BTL-II que codifican cualquiera de las proteínas BTL-II descritas anteriormente. La invención además proporciona un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos BTL-II descritos anteriormente o ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-BTL-II y una célula hospedera que contiene tal vector. De forma alternativa, la invención proporciona una célula hospedera diseñada genéticamente por ingeniería para expresar una proteína BTL-II, un fragmento inmunogénico BTL-II, o un anticuerpo contra BTL-II. Tales células hospederas pueden ser células de mamífero, que incluyen células CHO. Un método para producir una proteína BTL-II, fragmento inmunogénico o un anticuerpo anti-BTL-II, que comprende cultivar tales células hospederas bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína BTL-II, fragmento inmunogénico o anticuerpo, es también abarcado por la invención. Este método puede además comprender aislar la proteína BTL-II, fragmento inmunogénico, o anticuerpo de las células hospederas o el medio. También están contempladas proteínas BTL-II, fragmentos inmunogénicos o anticuerpos producidos por tales métodos. La invención además abarca células de mamífero que producen anticuerpos contra BTL-II, que incluyen hibridomas o células de mieloma y métodos para elaborar anticuerpos cultivando tales células . También se contemplan varios métodos terapéuticos que emplean las composiciones abarcadas por la invención. La invención proporciona un método para reducir la inflamación en el intestino en una paciente que sufre de una enfermedad inflamatoria del intestino, opcionalmente ya sea enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína BTL-II, opcionalmente una proteína BTL-II soluble. También se proporciona un método para inducir una respuesta inmune, que incluye un sistema y/o una respuesta inmune mucosal, contra un antígeno que comprende, administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista BTL-II y el antígeno. El antagonista BTL-II puede ser un anticuerpo o una molécula pequeña, y el antígeno puede ser administrado directamente a una superficie mucosal o puede ser administrado de forma sistémica. Además se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad inflamatoria del intestino o predecir el comienzo de una enfermedad inflamatoria del intestino que comprende, someter a ensayo una muestra de tejido del intestino de un paciente para determinar si el ARNm de BTL-II o la proteina es sobreexpresada. El tejido puede ser sometido a ensayo para determinar la expresión de la proteína BTL-II usando un anticuerpo anti-BTL-II . La invención además proporciona un método para desalentar una respuesta inmune para un antxgeno, especialmente un auto-antígeno en un paciente que sufre de una enfermedad autoinmune o inflamatoria, que comprende coadministrar el antígeno y una proteína BTL-II soluble. El antígeno puede ser administrado vía una superficie mucosal. En modalidades adicionales, la invención abarca métodos para inhibir la proliferación de células T y producción de citocina. En una modalidad, la invención comprende un método para inhibir la proliferación de células T que comprende, poner en contacto las células T con un polipéptido BTL-II. Las células T pueden ser células T humanas y pueden ponerse en contacto con el polipéptido BTL-II in vivo. Como una alternativa para un polipéptido BTL-II, puede ser usado un anticuerpo agonístico que se enlaza a un receptor BTL-II expresado en células T, siempre que pueda inhibir la proliferación de células T. En otra modalidad, la invención incluye un método para suprimir la producción de citocina por una célula T que comprende, poner en contacto la célula T con un polipéptido BTL-II. Las células T pueden ser células T humanas y pueden ponerse en contacto con el polipéptido BTL-II in vivo. La citocina puede ser, por ejemplo, gama interferon (IFNy) , interleucina 2 (IL2) , o interleucina 5 (IL5) .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra las estructuras del dominio de elementos seleccionados de la familia de proteínas similares a butirofilina. La mayoría de las proteínas seleccionadas son elementos de la subfamilia B7 discutidas abajo. El nombre de cada proteína se muestra a la izquierda del diagrama que representa su estructura. Los dominios "similares a Ig" son dominios similares a inmunoglobulina como se describe posteriormente. Los dominios etiquetados "7" son regiones de repetición heptadas como se describe posteriormente. Los dominios etiquetados "TM" son dominios de transmembrana. Cuadros abiertos son dominios citoplásmicos no identificados que son parte de una familia específica de dominios . Los dominios etiquetados "B30.2" son dominios B30.2 como se explica posteriormente. La protelna BTL-II se representa en este documento por tener cuatro dominios similares a Ig, pero formas de BTL-II también existen que tienen dos o tres dominios similares a Ig. B7-H3 está representada con cuatro dominios similares a Ig, y también existen en una forma que contienen únicamente dos dominios similares a Ig. La figura 2 es un diagrama de la estructura del gen BTL-II humano y ARNm. Los cuadros indican exones. Los números debajo de las lineas horizontales debajo de los cuadros indican las posiciones con la SEC ID NO: 3 de los exones. Las líneas horizontales en la parte inferior de la figura denotan la extensión de la SEC ID NO: 3 que codifica el dominio extracelular de la transmembrana y dominios citoplásmicos ("TM/Cyto") y que forman la región no traducida 3' ("3 URT" ) . Codones de detención se denotan por una marca que puede ser descrita como un resplandor o una explosión pequeña. La figura 3a es un diagrama de la estructura de una primera categoría de variantes de empalme del ARNm de BTL-II humano. Los símbolos son los mismos como se describen para la Figura 2. Las Xs mayúsculas sobre exones 2 y 3 indican que estos exones están perdidos en esta categoría de variantes de empalme. La figura 3b es una secuencia representativa de un elemento de la primera categoría de las variantes de empalme (línea inferior) alineada en una porción de la SEC ID NO: 3 (línea superior) . No existen desigualdades distintas de las hendiduras creadas por los exones perdidos 2 y 3. La figura 4a muestra la estructura de una segunda categoría de variantes de empalme del ARNm de BTL-II humano. Los símbolos son los mismos como se describe para la figura 2. La X mayúscula sobre el exón 3 indica que este exón está perdido en esta categoría de variantes de empalme.
La figura 4b muestra una secuencia representativa de un elemento de la segunda categoría de variantes de empalme (línea inferior) alineadas en una porción de la SEC ID NO: 3 (línea superior) . No existen desigualdades distintas de las hendiduras creadas por el exón perdido 3. La figura 5a muestra la estructura de una tercera categoría de variantes de empalme del ARNm de BTL-II humano. Los símbolos son los mismos como se describe para la Figura 3. Las Xs mayúsculas sobre exones 2 y 3 indican que estos exones están perdidos en esta categoría de variantes de empalme. El inicio acompañado por números adyacentes a los cuadros indica las posiciones de polimorfismos de secuencia presentes en esta categoría de variantes de empalme . Las variaciones están presentes en las siguientes posiciones dentro de la SEC ID NO: 3. la variación 2 está en la posición 1050; la variación 3 está en las posiciones 1136 y 1140; la variación 4 está en las posiciones 1178 y 1179; y la variación 5 está en la posición 1212; y la variación 6 está en la posición 1242. La figura 5b muestra una secuencia representativa de un elemento de la tercera categoría de variantes de empalme (línea inferior) alineada en una porción de la SEC ID NO: 3 (línea superior) . Se indican las bases desigualadas en negritas . La figura 6a muestra la estructura de una cuarta categoría de variantes de empalme del ARNm de BTL-II humano. La X mayúscula sobre el exón 3 indica que este exón está perdido en esta categoría de variantes de empalme. Los polimorfismos de secuencia están indicados como en la Figura 5a, y las variaciones 2 a 6 son como en la Figura 5a. La figura 6b muestra una secuencia representativa de un elemento de la cuarta categoría de variantes de empalme (línea inferior) alineada a una porción de la SEC ID NO: 3 (línea superior) . Se indican las bases desigualadas en negritas. La figura 7a muestra la estructura en una quinta categoría de variantes de empalme del ARNm de BTL-II humano. La X mayúscula sobre el exón 3 indica que este exón está perdido en esta categoría de variantes de empalme . Los polimorfismos de la secuencia están indicados como en la Figura 5a, y las variaciones 2 a 6 son como en la Figura 5a. La variación 1 es una supresión de nucleótidos 78 a 80 de la SEC ID NO: 3. La figura 7b muestra una secuencia representativa de un elemento de la quinta categoría de variantes de empalme (línea inferior) alineada en una porción se la SEC ID NO: 3 (línea superior) . Se indican bases desiguales en negrita. La figura 8 es un diagrama de la estructura del gen y ARNm de BTL-II murino. Los símbolos son como en la figura 5, excepto que el número se refiere a las posiciones en la SEC ID NO: 5. La figura 9a muestra la estructura de una primera categoría de variantes de empalme de ARNm de BTL-II murino. La X mayúscula sobre exón 3 indica que este exón está perdido en esta categoría de variantes de empalme . La figura 9b muestra una secuencia representativa de un número de la primera categoría de variantes de empalme de murino (línea inferior) alineada a la SEC ID NO: 5 (línea superior) . No existen desigualdades distintas de la hendidura creadas por el exón perdido 3. La figura 10 representa la expresión de ARNm de BTL-II en tejido colónico de ratón mdrla-1 (el cual porta la mutación nula mdrla en un antecedente de FVB) cuando no se presentan síntomas de la enfermedad inflamatoria del intestino (franja horizontal) o cuando se presentan síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino (patrón como tablero de ajedrez) con relación a la expresión de ARNm de BTL-II en tejido colónico de ratones FVB de tipo nativo, no sintomáticos. Las mediciones se efectúan ibridizando ADNc fluorescentemente etiquetado en un chip Affymetrix que contiene un oligonucleótido complementario al ARNm de BTL-II. La figura 11 es una gráfica que muestra las concentraciones relativas de ARNm de BTL-II detectadas por un ensayo de RCP en tiempo real de tejido de colon de dos diferentes ratones de tipo nativo de la cepa FVB (FVB#1 y #2; líneas diagonales) y de dos ratones mdrla-/- que muestran síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino (Mdrla -/-#1 y #2; patrones como tablero de ajedrez) . La figura 12a es una gráfica de barras que muestra proliferación (como es evidente por la recuperación de 3H-timidina) de células T humanas purificadas, cultivadas con las siguientes proteínas: anticuerpo anti-CD3e solo, I ? ? anticuerpo anti-CD3e y BTL-II:Fc, INT^i anticuerpo anti-CD3 y B7RP-l:Fc, anticuerpo anti-CD3s, B7RP-l:Fc, y BTL-II:Fc, ES; anticuerpo anti-CD3s y B7-2:Fc, flB; y anticuerpo anti-CD3e, B7-2:Fc, y BTL-II:Fc, La figura 12b es idéntica a la figura 12a, excepto que se usa una línea, en lugar de una escala logarítmica. La figura 13 es una gráfica de barras que muestra la proliferación de células T humanas purificadas en respuesta a una cantidad constante de anticuerpo anti-CD3e y una cantidad variada de BTL-II:Fc, como se indica. La figura 14 es una gráfica de barras que muestra la proliferación de células T murino en respuesta a anticuerpo anti-CD3e solo, I ' f anticuerpo anti-CD3s más BTL-II: Fe, [SwSM , o anticuerpo anti-CD3e más una proteína control que consiste de una región Fe humana, 1—L-LI . La figura 15 es una gráfica de barras que muestra la proliferación de células B murino en respuesta a una proteína no agregada, proteína TALL-1 sola, un anticuerpo anti-Ig solo, SSL TALL-l más anticuerpos anti-IgM, [¿T l TALL-1 anticuerpo anti-IgM, y BTL-II:Fc, La figura 16a muestra proliferación de células T humanas purificadas en respuesta a varias combinaciones de proteínas indicadas como en la Figura 12a. La figura 16b muestra la producción de gamma interferon (IFNY) relativa en respuesta a varias combinaciones de proteínas indicadas como en la Figura 12a. La figura 16c muestra la producción de interleucina 2 (IL2) relativa en respuesta a varias combinaciones de proteínas indicadas como en la Figura 12a. La figura 16d muestra la producción de interleucina 5 (IL5) relativa en respuesta a varias combinaciones de proteínas indicadas como en la Figura 12a. La figura 17 es una gráfica de barras que muestra el número total de células muertas en cultivos de células T purificadas, cultivadas con varias combinaciones de proteínas, como se indica en la Figura 12a. La figura 18 muestra exploración FACS de células transfectadas con ya sea un vector vacío (línea superior) , o un vector que contiene ADNc que codifica a BTL-II murino (segunda línea) , B7 P-1 murino (tercer línea) , o CD80 murino (línea inferior) . Las células se tiñeron con las siguientes proteínas: (1) región extracelular de CTLA.4 murino fusionada - a una región Fe humana de un anticuerpo IgGl (primera columna) ; (2) la región extracelular de CD28 murino fusionada a una región Fe de un anticuerpo IgGl (segunda columna) (3) la región extracelular de ICOS murino fusionada a una región Fe humana de un anticuerpo IgGl (tercera columna) ; y (4) la región extracelular de PD1 fusionada a una región Fe de un anticuerpo IgGl (cuarta columna) . El eje vertical de cada exploración ("Conteos" etiquetados) representa número de células y el eje horizontal (¾FL2-H" etiquetado) representa fluorescencia. La línea horizontal etiquetada "MI" muestra donde se fija la "entrada" en la máquina FACS. Las células abarcadas en esta entrada se consideran positivas; todas las otras se consideran negativas. El letrero pequeño debajo de cada exploración FACS indica un número de muestras individuales .
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIA La SEC ID NO: 1 es la secuencia de nucleótido del ADNc de BTL-II humano de la entrada al Centro Nacional de Información de Biotecnología (CNIB) con el número de acceso NM_019602. La SEC ID NO: 2 es la secuencia de aminoácido de la proteína BTL-II humana predicha de la secuencia de ADNc de la entrada NCBI con en número de acceso NM_019602. La SEC ID NO: 3 es la secuencia de nucleótido de un ADNc de BTL-II humano de longitud completa de la invención.
La SEC ID NO: 4 es la secuencia de aminoácido de la proteina BTL-II humana de longitud completa codificada por la SEC ID NO: 3. La SEC ID NO: 5 es la secuencia de nucleótido de la ADNc de BTL-II murino de longitud completa de la invención. La SEC ID NO: 6 es la secuencia de aminoácido de la proteína BTL-II murino de longitud completa codificada por la SEC ID NO: 5. La SEC ID NO: 7 es la secuencia de nucleótido del ADNc de un elemento representativo de la primera categoría de variantes de empalme de BTL-II humano (Figura 3a) . La SEC ID NO: 8 es la secuencia de aminoácido codificada por la SEC ID NO: 7. La SEC ID NO: 9 es la secuencia de nucleótido de ADNc de un elemento representativo de la segunda categoría de las variantes de empalme de BTL-II humano (Figura 4a) . La SEC ID NO: 10 es la secuencia de aminoácido codificada por la SEC ID NO: 9. La SEC ID NO: 11 es una secuencia parcial de nucleótido de la ADNc de un elemento representativo de una tercera categoría de variantes de empalme de BTL-II humano (Figura 5a) . La SEC ID NO: 12 es la secuencia de aminoácido codificada por la SEC ID NO: 11. La SEC ID NO: 13 es una secuencia parcial de nucleótido del ADNc de un elemento representativo de la cuarta categoría de las variantes de empalme de BTL-II humano (Figura 6a) . La SEC ID NO: 14 es la secuencia de aminoácido codificada por la SEC ID NO: 13. La SEC ID NO: 15 es una secuencia parcial de nucleótido de la ADNc de un elemento representativo de una quinta categoría de variantes de empalme de BTL-II humano (Figura 7a) . La SEC ID NO: 16 es la secuencia de aminoácido codificada por la SEC ID NO: 15. La SEC ID NO: 17 es la secuencia de nucleótido de un elemento representativo de una primera categoría de las variantes de empalme de BTL-II murino (Figura 9a) . La SEC ID NO: 18 es la secuencia de aminoácido codificada por la SEC ID NO: 17. La SEC ID NO: 19 es la secuencia de nucleótido que codifica la proteína de fusión BTL-II: Fe descrita en el Ej emplo 5. La SEC ID NO: 20 es la secuencia de aminoácido de la proteína de fusión de BTL-II: Fe descrita en el Ejemplo 5.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona proteínas BTL-II y ácidos nucleicos, que incluyen vectores recombinantes que codifican proteínas BTL-II, anticuerpos anti-BTL-II, los cuales pueden ser agonistas o antagonistas, así como métodos para producir y usar estas moléculas y composiciones farmacéuticas que las contienen. La expresión BTL-II es restringida a un número pequeño de tipos de tejidos. La BTL-II es sobreexpresada en el intestino antes del comienzo de los síntomas y durante la fase sintomática en un sistema de modelo de enfermedad inflamatoria del intestino de murino como se ilustra en el Ejemplo 4. Los anticuerpos BTL-II pueden por lo tanto servir para diagnosticar o predecir la probabilidad del comienzo de una enfermedad inflamatoria del intestino. Además, la invención proporciona un número de variantes alélicas de la secuencia de nucleótido BTL-II (Figura 5a hasta 7a) . Esto puede encontrar uso prediciendo susceptibilidad para enfermedades inflamatorias del intestino. Además, puesto que una proteína BTL-II soluble puede inhibir la proliferación de células T y producción de citocina (Ejemplos 6-10), las proteínas BTL-II pueden encontrar uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Además, la BTL-II es expresada en parches Payer, los cuales son estructuras especializadas conocidas por desempeñar una función en el muestreo inmune en el intestino. La BTL-II es de forma preferencial expresada en células dendríticas CDllc+ (baja expresión) CD8+ B220+ (también llamadas células dendríticas plasmacitoides) encontradas en parches Peyer comparadas con otras células encontradas en parches Peyer, incluyen otras células dendriticas . Las células dendriticas del parche Peyer se han hipotetizado por desempeñar una función induciendo la tolerancia a las superficies mucosal debido a su influencia en la diferenciación de células T. Weiner (2001) , Nature Immunology 2(8) .-671-71; Weiner (2001), Immunol. Rev. 182:207-14; Iwasaki and Kelsall (1999), American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 276(5): G1074-78. De este modo, anticuerpos anti-BTL-II pueden ser usados para identificar células dendriticas CDllc+ (baja expresión) CD8+ B220+ dentro de los parches Peyer. Como se explica abajo, el BTL-II está dentro de la subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina que desempeñan papeles en la regulación de respuestas mediadas por células T y B. El BTL-II puede desempeñar un papel en ya sea moderar y/o promover la inflamación mediada por el sistema inmune, especialmente en el intestino. Dada la complejidad del sistema inmune, una proteína de la superficie celular única, en muchos casos, tanto estimular o moderar una respuesta inmune por células efectoras inmunes, dependiendo de que receptores en las células efectoras estén disponibles para que la molécula interactúe con éstos. Las proteínas B7-1 y B7-2 discutidas abajo, son ejemplos de proteínas de la superficie celular de regulación inmune con efectos tanto estimuladores como de moderación en las células efectoras inmunes, en este caso, las células T. Por lo tanto, el BTL-II puede desempeñar funciones duales in vivo. Sin embargo, el intestino es, completamente, altamente tolerante a antígenos extraños, como se evidencia por su tolerancia a antígenos de alimentos y microorganismos comensales. Es por lo tanto probable que el BTL-II desempeñe una función en las respuestas inmunes de moderación o inflamación in vivo en al menos algunas situaciones. De este modo, antagonistas BTL-II, los cuales pueden incluir anticuerpos, proteínas de enlace seleccionadas in vitro, o moléculas pequeñas, pueden servir para estimular una respuesta inmune mucosal en un antígeno. Además, proteínas BTL-II solubles, o anticuerpos anti-idiotípicos funcionalmente equivalentes, pueden moderar una respuesta inmune en el intestino o en otras superficies mucosales en el cuerpo, tales como los pulmones . Un "anticuerpo" como se usa en este documento, puede ser un anticuerpo quimérico, puede ser un anticuerpo monomérico, o de cadena sencilla, dimérico, trimérico, tetramérico o multimérico, y puede ser una proteína recombinante o una proteína no recombinante . Un "dominio" es parte o toda una proteína que puede ser distinguida por porciones de secuencia primaria y/o características estructurales. Programas designados para ubicar dominios de proteínas incluyen, por ejemplo, Pfam (Bateman et al. (1999), Nucleic Acids Res. 27:260-62; Bateman et al. (1999), Nucleic Acids Res. 28:263-66), ProDom (Corpet et al. (1999), Nucleic Acids Res 27:263-67; Corpet et al. (1999), Nucleic Acids Res. 28:267-69), Domo (Gracy and Argos (1998), Bioinformatics 14:164-87), y SMART (Ponting et al. (1999), Nucleic Acids Res. 27:229-32). La estructura terciaria puede ser determinada empíricamente, por ejemplo, por cristalografía de rayos-X, o puede ser predicha usando software de computadora designado para tales usos. Por ejemplo, datos estructurales pueden ser accesados a través del sitio de red Entrez de NCBI de la Base de Datos de Modelación Molecular (Wang et al. (2000), Nucleic Acids Res. 28(1) : 243-45) o por el uso de software tal como DALI (Holm and Sander (1993), J. Mol. Biol. 233:123-38). Los dominios similares a inmunoglobulina (similar a Ig) , por ejemplo, se distinguen principalmente por su estructura terciara preferentemente que por sus homologías de secuencia primaria. Véase por ejemplo, Bork et al. (1994), J. Mol. Biol. 242:309-20; Hunkapiller and Hood (1989), Adv. Immunol. 44:1-63; Williams and Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol. 6:381-405. Sin embargo, los dominios IgV e IgC contienen una poca cantidad de aminoácidos altamente conservados que se originan en posiciones conservadas dentro de su secuencia primaria de aminoácido. Véase por ejemplo, Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Dept . of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, NIH Publication No. 91-3242. La presencia de tales aminoácidos altamente conservados que se originan en el espaciamiento apropiado, puede indicar la presencia de un dominio similar a IgC o similar a IgV. ün ácido nucleico "codifica" una proteína, como significa en este documento, si el ácido nucleico o su componente comprenden los codones que codifican la protexna . Células que han sido "diseñadas genéticamente por ingeniería" para expresar una proteína específica cuando las secuencias recombinantes de ácido nucleico que permiten la expresión de la proteína han sido introducidas en las células usando métodos de "ingeniería genética", tales como infección viral, transíección, transformación o electroporación. Véase por ejemplo, Kaufman et al (1990) , Meth. Enzymol . 185:487-511. Estos pueden incluir por ejemplo, la introducción de ácidos nucleicos que codifican la proteína en las células o la introducción de secuencias regulatorias para mejorar la expresión de un gen hospedero que codifica la proteína como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,272,071 por Chappel. Los métodos de "ingeniería genética" abarcan numerosos métodos que incluyen, pero no se limitan a, amplificación de ácidos nucleicos usando reacción en cadena de la polimerasa, moléculas de ADN recombinante parecidas clonándolas en Escherichia coli, digestión de enzima de restricción de ácidos nucleicos, ligación de ácidos nucleicos, síntesis ín vitro de ácidos nucleicos y transferencia de bases a los extremos de ácidos nucleicos, entre numerosos otros métodos que son bien conocidos en el arte. Véase por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Un "polipéptido heterólogo" es un polipéptido que tiene al menos, 3 aminoácidos de longitud que no es un polipéptido BTL-II como significa en este documento. En conjunto con comparaciones para determinar la identidad de secuencia de polinucleótidos o polipéptidos, lo que significa por una "región de identidad" es la porción del polinucleótido o polipéptido que es igualada, parcialmente o exactamente, con otro polinucleótido o polipéptido por el programa de computadora GAP (Devereux et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12: 387-95) usando los parámetros declarados abajo. Por ejemplo, cuando un polipéptido de 20 aminoácidos está alineado con una proteína considerablemente grande, los primeros 10 aminoácidos igualan la proteína más larga exactamente, y los últimos 10 aminoácidos no igualan la proteína más larga en todo, la región de identidad es de 10 aminoácidos. Si,- por otro lado, los primeros y últimos aminoácidos del polipéptido de 20 aminoácidos igualan la proteina más larga, y las otras ocho igualaciones son distribuidas entre sí, la región de identidad es de 20 aminoácidos de longitud. Sin embargo, las extensiones largas en cualquier hebra alineada sin aminoácidos conservativamente sustituidos o idénticos o nucleótidos idénticos de al menos, por ejemplo, 20 aminoácidos ó 60 nucleótidos, constituye un punto final de una región de una identidad como significa en este documento. Dominios "similares a Ig" son dominios similares a inmunoglobulinas y pueden ser ya sea dominio similar a IgV o IgC, o ser dominios que pueden plegarse en una estructura de inmunoglobulina pero no puede ser ambiguamente clasificado como ya sea similar a IgV o similar a IgC. Dominios "similares IgV" son dominios que tienen secuencias de aminoácido que pueden ser plegadas en un pliegue de inmunoglobulina con las características comunes a dominios de regiones variables de inmunoglobulinas. Véase, Bork et al., supra; Miller et al. (1991), Proc . Nati. Acad. Sci USA 88:4377-81; Williams and Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol. 6:381-405. Uno de habilidades en la técnica está conciente que la presencia de aminoácidos que son altamente conservados en dominios IgV en posiciones conservadas, puede identificar un dominio similar a IgV. Dominio "similares a IgC" tienen secuencias de aminoácido que pueden ser plegadas en un pliegue de inmunoglobulina con las características comunes a dominios de regiones constantes de inmunoglobulina. Véase, Bork et al., supra; Williams and Barclay, supra. Uno de habilidades en la técnica está conciente de que la presencia de aminoácidos que son altamente conservados en dominios IgC en posiciones conservadas, pueden identificar un dominio similar a IgC. "Enfermedades inflamatorias del Intestino" incluyen la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, ileítis y cualquier otra enfermedad caracterizada por inflamación crónica del tracto gastrointestinal. Una proteína comprende "no más o menos de 2 dominios similares a g", cuando contiene dos dominios similares a Ig y no contiene toda o alguna porción reconocible de otro dominio similar a Ig. Sin embargo, tal proteína puede contener otras secuencias de aminoácido que no son dominios similares a Ig y todavía contienen "no más o menos de 2 dominios similares a Ig" . De este modo, la frase "no más o menos" se refiere solamente a dominios similares a Ig, no a otras secuencias de aminoácido que pueden ser parte de la proteína. Cuando un polipéptido se dice es capaz de "inhibir la proliferación de las células T", o es capaz de realizar alguna otra función biológica, significa que una proteína que comprende el polipéptido puede realizar la función, y que la adición del polipéptido en al menos algunas de las proteínas, que no pueden realizar la función biológica, permite a estas proteínas realizar la función. En algunos casos, un polipéptido que puede realizar la función biológica puede hacerlo sin alguna secuencia adicional. En otros casos un polipéptido puede requerir otras secuencias, por ejemplo, secuencias de oligomerización para realizar una función biológica. En un escenario, un polipéptido puede ser capaz de realizar efectivamente una función biológica particular cuando está ligado a una región Fe o a un cierre leucina o algún otro dominio de dimerización, pero no sin el dominio de dimerización. Como significa en este documento, tal polipéptido puede realizar la función biológica. Una "proteína" es cualquier polipéptido que comprende al menos 10 aminoácidos, opcionalmente al menos, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, y/o 300 aminoácidos. "Recombinante" , como se aplica a polipéptidos o proteínas, significa que la producción de la proteína es dependiente en al menos, una etapa en la cual los ácidos nucleicos los cuales pueden o no pueden codificar la proteína, son introducidos en una célula en la cual no se encuentran naturalmente . "Proteínas de fusión recombinante" son proteínas recombinantes que comprende parte o toda de al menos dos proteínas, las cuales no se encuentras fusionadas en conjunto en la naturaleza, fusionadas en una cadena de polipéptido sencilla. Una "mutación silente" en una secuencia de ácido nucleico es una que cambia la secuencia del ácido nucleico sin cambiar la secuencia de la proteína codificada por el ácido nucleico. Una proteína "soluble" es una que carece de un dominio de transmembrana o alguna otra secuencia de aminoácido, tal como una secuencia de anclaje GPI, que normalmente causa que la proteína sea embebida en o asociada con una membrana. Tales proteínas podrían típicamente comprender toda o parte de la región extracelular de una proteína de transmembrana. Para propósitos de la invención, dos proteínas o ácidos nucleicos son "sustancialmente similares" si son al menos 80%, opcionalmente al menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, ó 99.7% idénticos a cada uno de las otros en una secuencia de aminoácido o nucleótido y mantienen o alteran en una manera deseable, la actividad biológica de la proteína no alterada. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácido o dos secuencias de ácido nucleico, se puede determinar pos inspección visual y cálculo matemático, o más preferiblemente, la comparación se hace comparando la información de la secuencia usando un programa de computadora. Un programa de computadora ejemplar es el programa GAP paquete Wisconsin Versión 10.0 del Grupo de Computadoras Genéticas (GCG; Madison, I) (Devereux et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12:387-95). Los parámetros de omisión preferidos para el programa GAP incluyen: (1) La implementación GCG de una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación de aminoácido pesado de Gribskov and Burgess, ((1986) Nucleic Acids Res. 14: 6745) como se describe en Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, Schwartz and Dayhoff, eds . , National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) u otras matrices de comparación comparables; (2) una penalización de 8 por cada hendidura y una penalización adicional de 2 por cada símbolo en cada hendidura para secuencias de aminoácido, o una penalización de 50 para cada hendidura y una penalización adicional de 3 para cada símbolo en cada hendidura para secuencias de nucleótidos; (3) sin penalización para hendiduras de extremo; y (4) sin penalización máxima para hendiduras más largas. Pueden ser usados también otros programas usados por aquellos expertos en la técnica de comparación de secuencia.
Proteínas similares a Butirofilina Las proteínas similares a butirofilina reportadas a la fecha, portan algunas características estructurales, y muchas son codificadas dentro o adjuntas al sitio principal de histocompatibilidad (MHC) . Véase por ejemplo, Henry et al. (1999), Immunology Today 20 (S):285-88. La butirofilina es una proteína que constituye 40% de la proteína total asociada con el glóbulo de grasa de la leche bovina, y existe un homólogo humano. Ruddy et al. (1997), Genome Research 7:441-56, citing Jack and Mather (1990), J. Biol. Chem. 265:14481-86. De manera similar, el nivel de secuencia de aminoácido entre las proteínas similares a buritofilina puede ser bajo, pero la estructura de dominio es algunas veces conservada. Todos los miembros comprenden un péptido señal amino terminal seguido por un dominio similar a Ig usualmente reportado por ser un dominio similar a IgV. En muchos casos esto se sigue por otro dominio similar a Ig, usualmente reportado por ser un dominio similar a IgC, un dominio de la transmembrana, y un dominio citoplásmico . Los dos dominios similares a Ig pueden ser repetidos inmediatamente después de su primera ocurrencia, como en BTL-II o B7-H3. Esta estructura de dominio se ilustra en la Figura 1. La mayoría de las proteínas diagramadas en la Figura 1 son miembros de la subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina; solamente tres no son (BTN2A1 humana, butirofilina humana y glicoproteína de oligodendrocito de mielina) . Dominios similares a Ig pueden ser muy divergentes en secuencia y todavía retienen uno de un número de patrones de pliegue conservados, los cuales todos incluye un núcleo de estructura común que comprende hebras ß . Las regiones variable y constante de inmunoglobulina tienen una estructura terciaria la cual se caracteriza por siete a nueve hebras antiparalelas ß que forman una forma similar a barril . Bork et al. (1994), J. Mol. Biol. 242:309-20. Los dominios de inmunoglobulina Ig e IgC, cada uno incluye una poca cantidad de residuos altamente conservados, distintos. Hunkapiller and Hood (1989), Adv. Immunol . 44:1-63; Miller et al. (1991), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4377-81; Williams and Barclay (1988), Ann. Rev. Immunol. 6:381-405. Los residuos conservados son presumiblemente importantes para la estructura o función. Tales residuos conservados se encuentran en los dominios similares a Ig de BTL-II. Por ejemplo, el primer dominio similar a Ig de la proteína BTL-II humana (SEC ID NO: 4), contiene tales residuos altamente conservados característicos de dominios similares a IgV en las ubicaciones apropiadas en por ejemplo, las posiciones G43, C50, W65, L109, D118, G120, Y122 y C124. Véase Tabla 3. El tercer dominio similar a Ig también contiene residuos que corresponden a residuos conservados en dominios similares a IgV. El segundo y cuarto dominios similares a Ig del BTL-II humano, contienen residuos que corresponden a residuos altamente conservados en dominios similares a IgC. Tabla 3. Los dominios de la transmembrana y citoplásmicos, ocurren en proteínas similares a butirofilinas , con respecto a si tienen un segundo dominio similar a Ig. El dominio de la transmembrana puede o no puede ser seguido por una o varias unidades de aminoácido reminiscentes de las repeticiones heptadas típicas de una porción de espiral enrollado a-helicoidal . Las repeticiones heptadas pueden también ocurrir en otras posiciones en una proteína similar a butirofilina. Para una discusión de repeticiones heptadas, véase Miller et al. (1991), Proc. Nati. Acad. Sci. 88:4377-81. Son bien conocidos en la técnica, métodos para predecir dominios de la transmembrana. Véase por ejemplo, Ikeda et al. (2002), In Silico Biol. 2 (l):19-33; Tusnady and Simón (1998), J. Mol. Biol. 283 (2):489-506. Las proteínas similares a butirofilina pueden tener un dominio citoplásmico. Tal dominio citoplásmico puede o no puede comprender un dominio B30.2. Secuencias de varios dominios B30.2 se exhiben, y funciones putativas de dominios de B30.2 se discuten por Henry et al. ((1998), Mol. Biol. Evol . 15 (12) : 1696-1705. Los dominios B30.2 se encuentran en una variedad de proteínas y la función del dominio B30.2 es desconocida. Un ligando propuesto del dominio B30.2 es xantina oxidasa, la cual interactúa con el dominio citoplásmico de butirofilina. Las mutaciones en los dominios B30.2 de dos diferentes proteínas que contienen B30.2, han sido correlacionadas con dos diferentes enfermedades, aunque las relaciones causales entre las mutaciones y los fenotipos de enfermedades no han sido establecidas. Henry et al., supra.
La Subfamilia B7 de Protexnas Similares a Butirofilina La BTL-II porta un dominio de estructura con un número de proteínas reguladoras inmunes similares a butirofilina, que carecen del dominio B30.2 que desempeña papeles en la regulación de las células efectoras inmunes tales como, por ejemplo, células T, células B y células mieloides . Esta subfamilia es referida en este documento como wla subfamilia B7" de proteínas similares a butirofilina. Como significa en este documento, características de los elementos de la subfamilia B7 incluyen sin limitación, los siguientes: (1) que tienen uno o más dominios extracelulares similares a Ig; (2) que tienen dominios de la transmembrana y citoplásmicos ; (3) que carecen de un dominio B30.2; (4) son expresados en células que presentan antxgenos; (5) se someten a regulación de la expresión durante una respuesta inmune activada; y (6) modulan una respuesta inmune. Las proteínas solubles B7 no secretadas, carecen de un dominio de la transmembrana que modula la respuesta inmune, han sido reportadas a la fecha. La mayoría de las protexnas B7 tienen dos dominios extracelulares similares a Ig, pero algunas isoformas de B7-H3 tienen cuatro. Véase Figura 1. El BTL-II humano puede tener desde dos a cuatro dominios extracelulares similares a Ig y tiene todas las características de los miembros de la familia B7 listados anteriormente. Por lo tanto, se considera ser un miembro de la subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina . Todos los otros miembros conocidos de la subfamilia B7 interactúan con receptores o células efectoras inmunes tales como, células B y/o células T, en las cuales, la interacción sirve como una señal para modular una respuesta inmune. El BTL-II es por lo tanto, predicho por interactuar con un receptor en una célula efectora inmune, tal como una célula T y con ello, modular una respuesta inmune . Los miembros de la familia B7 desempeñan papeles modulando la actividad de las células efectoras inmunes, especialmente células T. Henry et al. (1999), Immunology Today 20 (6):285-88; Sharpe and Freeman (2002), Nat. Rev. Immunol. 2:116-26. Los ejemplos mejor caracterizado son, CD80 y CD86 (también llamados respectivamente, B7-1 y B7-2) , los cuales son expresados en células que presentan antígeno y pueden promover la activación de células T cuando están interactuando con CD28, el cual es constitutivamente expresado en la superficie de las células T, o inhiben la activación de las células T cuando interactúan con un CTLA-4, el cual es también expresado en la superficie de las células T. La expresión CTLA-4 no es constitutiva, pero es rápidamente regulada ascendentemente siguiendo la activación de las células T. Véase por ejemplo, Masteller et al. (2000), J. Immunol 164:5319-27; Hehner et al. (2000), J. Biol . Chem. 275 (24) :18160-71; Sharpe and Freeman (2002), Nat. Rev. Immunol. 2:116-26. Sin embargo, se ha reportado que numerosos residuos de aminoácidos individuales en ambos dominios similares a Ig de CD80 son importantes para enlazar CTLA-4 y CD28. Peach et al. (1995), J. Biol. Chem 270 (36) : 21181-87. El CD86 es constitutivamente expresado a niveles bajos y es rápidamente regulado ascendentemente después de la activación, mientras el CD80 es induciblemente expresado último después de la activación. Sharpe and Freeman (2002) , Nature Reviews Immunology 2:116-26. Otra molécula reguladora de células T, referida en este documento como B7RP-1, tiene una plétora de nombres, IAA0653 (Ishikawa et al. (1998), DNA Res. 5:169-76), B7h (S allow et al. (1999), Immunity 11:423-32), GL50 (Ling et al. (2000), J. Immunol 164:1653-57), B7RP-1 (Yoshinaga et al. (1999), Nature 402:827-32), LICOS (Brodie et al. (2000), Curr. Biol. 10:333-36), B7-H2 (Wang et al. (2000), Blood 96:2808-13), e ICOSL (Sharpe and Freeman, supra) . El B7RP-1 es expresado en tejido linfoide periférico, bazos, nodos linfáticos, pulmón, timo, esplenocitos, y células B. La interacción de B7RP-1 con células T puede incrementar la proliferación de células T y producción de citocina. El B7RP-1 señala células T a través del receptor ICOS, el cual es expresado en células T activadas. Yoshinaga et al. (1999), Nature 402:827-32; Swallow et al. (1999), Immunity 11:423-32. El B7RP-1 es constitutivamente expresado en líneas de células B no estimuladas, y su expresión puede ser inducida en monocitos por interferon ?. Aicher et al. (2000), J. Immunol. 164:4689-96. El desarrollo y función regulatoria de las células T regulatorias es dependiente de la interacción entre B7RP-1 y su receptor en células T. Akbari et al. (2002), Nature Medicine 8 (9) : 1024-32. Además, tres de otras moléculas regulatorias de células T, PD-L1 (también llamadas B7-H1) , PD-L2 (también llamada B8-DC) , y B7-H4 (también llamadas B7S1 y B7x) , pueden inhibir la proliferación de células T y producción de citocina. El PD-L1 y PD-L2 actúan a través de su receptor común, PD-1, el cual se expresa en células T, células B y células mieloide. Freeman et al. (2000), J. Exp. Med. 192 (7) :1027-34; Dong et al. (1999), Nature Medicine 5(12):1365-69; Latchman et al. (2001), Nature Immunology 2(3):261-68; Tamura et al 2001), Blood 97 (6) : 1809-16; y Tseng et al. (2001), J. Exp. Med. 193 (7) : 839-45. La expresión de PD-L1 y PD-L2 puede ser inducida por interferon ?, una citocina de manera general proinflamatoria. Latchman et al., supra. B7-H4 es expresado en células B, mac ófagos , y células dendríticas y probablemente actúa a través de BTLA, un receptor inhibidor expresado en células B y T. Watanabe et al. (2003), Nature Immunology 4(7):670-79; Zang et al. (2003), Proc. Nati. Acad. Sci. 100 (18) : 10388-92; Sica et al. (2003), Immunity 18:849-61; Prasad et al. (2003), Immunity 18:863-73; Carreno and Collins (2003), Trends Immunol. 24 (10) : 524-27. Todavía otra proteína similar a butirofilina que desempeña una función coestimulatoria en la estimulación de células T es B7-H3. Chapoval et al. (2001), Nature Immunol. 2(3):269-74. Como los otros elementos de la familia B7, el B7-H3 tiene una secuencia señal, dominios extracelulares similares a Ig, un dominio de la transmembrana, y un dominio citoplásmico. El gen B7-H3 humano codifica isoformas con dos o cuatro dominios extracelulares similares a Ig. Sun et al (2002), J. Immunol. 168:6294-97. La expresión de B7-H3 puede ser inducida en células dendríticas por citocinas inflamatorias. El B7-H3 puede estimular la proliferación y la respuesta citotóxica de células T. El B7-H3 actúa a través de un receptor de células T putativas que es distinto de CD28, CTLA-4, ICOS, y PD-1. Chapoval et al, supra.
Proteínas BTL-II La existencia.de proteínas BTL-II humanas y murino se ha predicho a partir de la secuencia genomica. Stammers et al. (2000), Immunogenetics 51:373-82. Sin embargo, estos autores no encuentran evidencia de una transmembrana o un dominio citoplásmico en proteínas BTL-II humana o murino basadas en el análisis de genoma y sin evidencia de un transcripto que conecta exones 1-4 (los cuales codifican un péptido señal, dos dominios similares a Ig, y una región de repetición heptada, respectivamente) , con exones 5 y 6 (los cuales codifican otros dos dominios similares a Ig, respectivamente) en experimentos de RCP diseñados para detector ANm de BTL-II murino. Stammers et al., supra. Basados en estos hallazgos, el BTL-II no fue colocado en la subfamilia B7 de las proteínas inmunomoduladoras de la superficie celular. La última secuencia proporcionada en bases de datos públicas por estos mismos autores, predice un nucleótido humano ARNm de BTL-II de 1368 nucleótidos, los cuales incluyen los exones 5 y 6, que codifican una proteína de 455 aminoácidos, los cuales carecen de un dominio de la transmembrana y un dominio citoplásmico (NCBI acceso No. NM_019602. el cual describe la SEC ID NO:l (secuencia de i¾DNc de BTL-II humano) y SEC ID NO: 2 (secuencia de proteínas BTL-II humana) ) . Las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos BTL-II de la invención, difieren de estas secuencias en un número de aspectos . La secuencia de ADNc que codifica para una proteína que comprende una secuencia señal, un domino extracelular, un dominio de la transmembrana, y un dominio citoplásmico, distinto de la secuencia de proteína BTL-II previamente reportada, la cual no contiene dominios de la transmembrana o citoplásmico. Estas características, junto con el patrón de expresión BTL-II, colocan BTL-II dentro de la subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina. La Tabla 1 (abajo) destaca las diferencias entre la proteína BTL-II de la invención y la secuencia previamente reportada. Una proteína BTL-II de la invención, se muestra en la línea superior (SEC ID N0:4) , y la proteína BTL-II reportada en NCBI No. de acceso NM_019602, se muestra en la línea inferior (SEC ID NO: 2). De esta comparación, es aparente que existen tres desigualdades entre las dos secuencias (en las posiciones 360, 454 y 455) y que la SEC ID NO: 4 tiene 27 aminoácidos más, los cuales constituyen una secuencia adicional en el dominio extracelular, así como también un dominio de la transmembrana y uno citoplásmico. Estas secuencias, 99.3% idénticas de conformidad con el programa GAP usan los parámetros mencionados anteriormente.
Tabla 1 Comparación de las secuencias de proteína humana predicha de BTL-II MVDFPGYl^SGAVASFLFILLTLKQ 50 MVDFPGYlSttjSGAVASFLFILL I^QSEDFRVIGPAHPIIiAGVGEDALLTC 50 QLLPl^TTMHVEVRWYRSEPSTPVFVHRDGV^ 100 IIIMIII!INII!III!IIII!IMI!!MIMIIIIMIIMIINI QLLPKRT MHVEVRWT-TRSEPSTPWVHRDG^ 100 GIAKGNVALKIHNIQPSDNGQY CHFQDGNYCGETSLLL YAGLGSAPSI 150 IM!!NIIIIMIIIII!MMIIIIMMMIIIlll!l!MIIII!l GIAKGWAL IHNIQPSDNGQYWCHFQDG YCGETSLLL VAGLGSAPSI 150 HMEGPGESGVQLVCTARGWFPEPQVYWEDIRGEKLLAVSEHRIQDKDGLF 200 HffiGPGESGVQLVCTARGWFPEPQVYWEDIRGEKLLAVSEHRIQDKDGLF 200 YAEATLWRNASAESVSCLVHNPVLTEEKGSVISLPE LQTELASLKV G 250 IIMI!MIIM!!lll!l!IMIM!IMII!IIMI!IMIIMIIII YAEATLWRASAESVSCLVH PVLTEE GSVISLPEKLQTELASLKVNG 250 PSQPILWVGEDIQLTCYLSPKANAQSMEWWTORSHRYPAVHVYMDGDHV 300 PSQPILVRVGEDIQLTCYLSPKANAQSM^ 300 AGEQMAEYRGR VLVSDAIDEGRLTLQ1LSARPSDDGQYRCLFEKDDVYQ 350 AGEQMAEYRGRTVLVSDAIDEGRLTLQILSARPSDDGQYRCLFE DDVYQ 350 EASLDLKVVGLGSSPLI VEGQEDGEMQPMCSSDGWFPQPHVP RDMEGK 400 l!!!llill EASLDLKWSLGSSPLI VEGQEDGEMQPMCSSDGWFPQPHVPWRDMEGK 00 TIPSSSQALTQGSHGLFHVQTLLRV NISAVDV CSISIPFLGEEKIATF 450 ???????????????????????????????????????????? TIPSSSQALTQGSHGLFHVQTLLRV ISAVDV CSISIPFLGEE IATF 450 SLSESRMTFL KTLLV GLLLAVAVGLPRKRS 482 !ll SLSGW. 455 Además de una similitud total en la estructura de dominio como se ilustra en la Figura 1, las proteínas de la subfamilia B7 tienen similitudes al nivel de secuencia primaria. Por ejemplo, cuando mismos pares son alineados usando el programa de computadora GAP, la secuencia de proteina humana BTL-II (SEC ID N0:4) es similar a otros miembros de la subfamilia B7 como se presentan en la Tabla 2 abajo .
Tabla 2 Uno de habilidades en la técnica, comprenderá que residuos que son considerados en cualquiera de estas alineaciones son más probable que desempeñen una función esencial en la estructura o función del BTL-II humano que aquellos que no son conservados . En la Tabla 3 (abajo) , la secuencia de aminoácido BTL-II humano (SEC ID NO: , línea superior), está alineada con la secuencia de aminoácido BTL-II murino (SEC ID NO: 6, linea inferior) . Las secuencias de aminoácido idénticas están unidas por una linea vertical, y aminoácidos similares tienen uno o dos puntos entre ellos. El porcentaje de identidad entre estas secuencias como se determina por GAP (descrito anteriormente), es aproximadamente 62%, y el porcentaje de similitud es aproximadamente 68%. Residuos encontrados en dominios similares a IgV o IgC o en la así llamada "serie I" de miembros de la superfamilia de inmunoglobulina similar a IgV o sustituciones conservativas de tales residuos, se muestran en negritas, et al., supra,- Harpaz and Chothia (1994), J. Mol. Biol. 238:528-39. Tales residuos son probablemente estructuralmente importantes y, de este modo, pueden tener efectos funcionales . La ocurrencia de un número sustancial de tales aminoácidos en el espaciamiento apropiado, puede identificar una secuencia similar a IgV o similar a IgC.
Tabla 3 1 ]^FEGY]^SGAVASFLFILLTM QSEDFRVIGPAHPILAGVGEDALLTC III I l-lll ¡IMIMIIM MIMMI Mil MllllMI 1 MVDCPRYSLSGVAASFLFVXJLTI HPDDFR GP-TLPILAKVGEDALLTC 51 QLLPKRTTMKVEVRWY^ IMIIII! ????????· I! -Mí II : II I I IIM- 51 QLLP RTTAHMEVR yRSDPAMPVIMyRDGAWTGLP EGYGGRAEW ED 101 GIAG ALKIHNIQPSDNGQYWCHFQDGNYCGETSLLLVAGLGSAPSI ¦ l-lllll :|??·????? lhl-l MI- 11-11 III. |.| 101 STEEGSVAIi IRQVQPSDDGQYWCKFQEGDYWRETSVLLQVAALGSSPNI 151 H EGPGESGVQLVCTARGWFPEPQVY EDIRGEKLLAVSEHRIQDKDGLF MI II I INI:- II- : M-lll 151 HVEGLGEGEVQLVCTSRGFPEPEVHWEGIWGE LMSFSFJmVPGEDGLF 201 YAFATLVVRASAESVSCLYHNPVLTEEKGSVISLPE LQTELASLKVNG I I ll-IM I |.:|| I I · · I-I hlllll I· 1 I 201 YVEDTIiMVRNDSVETISCFIYSHGLRETQEATIALSERLQTELVSVSVIG 251 PSQPILVRVGEDIQLTCYLSP ANAQSME WDRSHRYPAVHVYMDGDHV MI l-IM-l lhlM- · M - = M M 11 MMMI -I II 251 HSQPSPVQVGE IELTCHLSPQTDAQNLEVRWLRSRYYPAVHVYANGTHV • · · ¦ ¦ 301 AGEQMAEYRGRVLVSDAIDEGRLTLQILSARPSDDGQYRCLFE DDVYQ MUI II 011 II -I II II M II -II MMMMIl II III 301 AGEQMVEY GRTSLVTDAIHEG LTLQIHNARTSDEGQYRCLFG DGVYQ 351 F-ASLDLKWGLGSSPLI VEGQEDGFJIQP CSSDG FEQPHVPWRDMEGK M · I · . I · M I . I I ? ? ,11 M I · 1111 M ¦ II I III I 351 EARVDVQVAVGSTPRITREVL DGGMQLRCTSDGWFPRPHVQWRDRDG 401 TIPSSSQALTQGSHGLFHVQTLLRVTNISAVDV CSISIPFLGEEKIATF 1-M IM MI M Mil! MI I l-MMMM MMI 1 I 401 TMPSFSEAFQQGSQELFQVETLLLVNGSMV-WTCSISL .LGQEKTARF 451 SLSESRMTFLW TLLVWGLLLAVAVGLPR. RS* .Ihh. M M I I ll-l- I : II 450 PLSDSKIALLÍMTLPWVL^ . . . . . 483 500 DENHRRRPPSDERLR .- Uno de habilidades en la técnica apreciará que residuos no conservados son menos probable que desempeñen una función en la determinación de la estructura terciaria total de una proteína BTL-II que los residuos conservados, puesto que esta estructura es más conservada en evolución que la secuencia. Bork et al. (1994), J. Mol. Biol . 242:309-20. Como se usa en este documento, "residuos no conservados" son aminoácidos dentro de una proteína BTL-II que no son conservados cuando las secuencias de proteína BLT-II humana y murino son comparadas como en la Tabla 3. En las proteínas BTL-II codificadas por variantes de empalme, tales residuos se originarán en diferentes posiciones numéricas dentro de la secuencia. Por ejemplo, el residuo no conservado en la posición 397 de la SEC ID NO: 4 es el mismo residuo no conservado visto en la posición 187 de la SEC ID NO: 8. Uno de habilidades en la técnica apreciará que la estructura de la proteína puede afectar la función. Además, aminoácidos no conservados también son menos probable que desempeñen una función directa en la función BTL-II. Por ejemplo, residuos 4, 6, 25, 26, 35, 36 y muchos otros, no son idénticos ni similares. De este modo, uno de habilidades en la técnica podrá comprender que la alteración de tales residuos podría ser menos probable que afecte la función de la proteína BTL-II que lo que podría la alteración de residuos similares o conservados. Sin embargo, sustituciones conservativas son menos probable que afecten la función de la proteína que sin sustituciones conservativas. Ejemplos de sustituciones de aminoácido que son sustituciones conservativas, distintas de afectar la actividad biológica, incluyen las siguientes: Ala por Ser, Val por lie, Asp por Glu, Thr por Ser, Ala por Gly, Ala por Thr, Ser por Asn, Ala por Val, Ser por Gly, Tyr por Phe, Ala por Pro, Lys por Arg, Asp por Asn, Leu por lie, Leu por Val, Ala por Glu, Asp por Gly, y estos cambios a la inversa. Véase por ejemplo, Neurath et al., The Proteins, Academic Press, New York (1979) . Además, un intercambio de un aminoácido dentro de un grupo por otro aminoácido dentro del mismo grupo es una sustitución conservativa en donde los grupos son los siguientes: (1) alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, norleucina y fenilalanina; (2) histidina, arginina, lisina, glutamina y asparagina; (3) aspartato y glutamato; (4) serina, treonina, alanina, tirosina, fenilalanina, triptofano y cisteína; (5) glicina, prolina y analina; La protexna BTL-II humana comprende varios dominios reconocibles. Primero, es una secuencia señal (codificada por el exón 1) , la cual se extiende desde el residuo 1 de la SEC ID NO: 4 a una segunda posición desde aproximadamente el residuo 22 al 29 de la SEC ID NO:4. Después, está un dominio similar a Ig (codificado por el exón 2) , el cual se extiende desde el residuo x al residuo y, en donde x es desde el residuo 22 a 32 y y es desde el residuo 138 a 148 de la SEC ID N0:4. Después de esto, está otro dominio similar a Ig (codificado por el exón 3) , que se extiende desde el residuo v al residuo w, en donde el residuo v es desde el residuo 138 a 148 y w es desde el residuo 232 al 242 de la SEC ID NO: . Después está una región de repetición heptada (codificada por el exón 4) desde al residuo t al residuo u, en donde t es desde 234 a 239 y u es desde el residuo 240 al 247 de la SEC ID NO: 4. Otra región similar a Ig se extiende desde el residuo r al residuo s, en donde r es desde el residuo 240 al 247 y s es desde el residuo 354 al 364 de la SEC ID NO: 4. Una cuarta región similar a la Ig se extiende desde el residuo p al residuo q, en donde p es desde el residuo 355 al 365 y q es desde el residuo 452 a 462 de la SEC ID NO: . Estos primeros seis dominios BTL-II humanos, elaboran la región extracelular BTL-II humana. La secuencia señal puede, pero no necesita, ser escindida del resto de la proteína después de la secreción de la proteina. Un dominio de la transmembrana se extiende desde el residuo n al residuo o, en donde n es desde el residuo 454 al 462 y o es desde el residuo 473 al 481 de la SEC ID NO: 4. Finalmente, un dominio citoplásmico se extiende desde el residuo k al residuo m, en donde k es desde el resido 478 al 481 y m está en aproximadamente el residuo 482 de la SEC ID NO-.4. La proteína BTL-II murino comprende una serie de dominios similares. Primero, una secuencia señal inicia en el residuo 1 y termina en una posición desde aproximadamente el residuo 20 a aproximadamente el residuo 27 de la SEC ID NO: 6.
Segundo, es un dominio similar a Ig que se extiende desde el residuo x a y, en donde x es desde el residuo 21 a 27 y y es desde el residuo 138 a 148 de la SEC ID NO: 6. Tercero es otro dominio similar a Ig del residuo v o w, en donde v es desde 139 a 148 y w es desde 232 hasta 242 de la SEC ID NO: 6. Una región de repetición heptada se extiende desde el residuo t a u, en donde t es desde 233 hasta 242 y u es desde 238 hasta 248 de la SEC ID NO: 6. Otra región similar a Ig se extiende desde el residuo r a s, en donde r es desde 239 hasta 248 y s es desde 355 hasta 365 de la SEC ID NO: 6. Una región final similar a Ig se extiende desde el residuo p a q, en donde p es desde 356 a 365 y q es desde 447 a 457 de la SEC ID NO: 6. Estos primeros seis dominios elaboran la región extracelular de BLT-II murino. Un dominio de la transmembrana se extiende desde el residuo n a o, en donde n es desde 448 a 459 y o es desde 470 a 478 de la SEC ID NO: 5. Finalmente, un dominio citoplásmico se extiende desde el residuo k a m, en donde es desde 471 a 478 y m es aproximadamente 514 de la SEC ID NO: 6. La presente invención abarca versiones solubles, secretadas de BTL-II, asi como también versiones que comprenden un dominio de la transmembrana que puede ser expresado en una superficie celular. La invención además incluye proteínas BTL-II codificadas por los ácidos nucleicos BTL-II descritos abajo. Las versiones recombinantes de todas estas proteínas pueden ser usadas para producir anticuerpos, en la selección y/o como agentes terapéuticos, como se describe en este documento. Por ejemplo, la invención abarca proteínas BTL-II que comprenden toda o parte de la SEC ID N0:4, SEC ID N0:6, SEC ID N0:8, SEC ID NO:10, SEC ID N0:12, SEC ID M0:14, SEC ID NO: 16 y/o SEC ID NO: 18. Las proteínas BTL-II de la invención, incluyen proteínas que difieren de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18, por inserción, supresión, alteración o sustitución en la secuencia de aminoácido primario. Tales secuencias de variante son al menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, o 99.7% idénticas a la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID O:14, SEC ID NO: 16 y/o SEC ID NO: 18, y no contienen hendiduras internas de más de 10 aminoácidos cuando alineaban usando GAP con las secuencias mencionadas anteriormente. Ejemplos de tales secuencias incluyen, las variantes alélicas humanas que se originan naturalmente de BTL-II mostrado en las Figuras 5b, 6b y 7b. Si tales secuencias variantes contienen sustituciones de aminoácido cuando se comparan con la SEC ID NO:4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 y/o SEC ID NO: 18, estas sustituciones pueden ser sustituciones conservativas de aminoácidos. Además, las proteínas BTL-II variantes no pueden contener más de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, ó 25 inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único con respecto a la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID N0:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:12, SEC ID MO-.14, SEC ID NO:16 y/o SEC ID NO: 18. Las proteínas BTL-II de la invención, incluyen proteínas codificadas por varias variantes de empalme de ARNm de BTL-II humano y de ratón. Secuencias de tales variantes de proteínas BTL-II humana, se muestran en la SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, y SEC ID NO: 16. La secuencia de una variante de proteína BTL-II de ratón se muestra en la SEC ID NO: 18. Las variantes de empalme humanas carecen ya sea del exón 3 solo o carecen de ambos exones 2 y 3, y la variante de empalme murino descrita, carece del exón 3 solamente. Véase, la SEC ID NO: 7 SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13 SEC ID NO: 15 y/o SEC ID NO: 17; Figuras 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, y 9a. Proteínas codificadas por estas secuencias y secuencias substancialmente similares, en donde una alineación de la secuencia de proteína con al menos una del grupo que consiste de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:12, SEC ID MO:14, SEC ID NO:16 o SEC ID NO: 18, usando GAP, no comprende hendiduras más largas de 10 aminoácidos, están abarcadas por la invención. Si estas proteínas contienen sustituciones de aminoácido con relación a la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 y/o SEC ID 100% idéntica a los aminoácidos 30 a 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18. La región de identidad de la secuencia de aminoácido alineada con los aminoácidos 30 a 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18, puede ser al menos 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 6 300 aminoácidos. La invención también proporciona proteínas BTL-II que comprenden un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.7%, o 100% idéntica a los aminoácidos 30 a 457 de la SEC ID NO: 4 que no contienen más o menos de 2 dominios similares a Ig y que pueden enlazarse a un receptor de la superficie celular expresado en las células B o células T. La secuencia de aminoácido puede ser al menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.7%, o 100% idéntica a los aminoácidos 30 a 247 de la SEC ID NO: 8 o a los aminoácidos 30 a 243 de la SEC ID NO: 12. En modalidades adicionales, la invención proporciona proteínas codificadas por ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que es 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.7%, ó 100% idéntico a un polinucleótido que consiste de los nucleótidos 34 a 124 de la SEC ID NO: 11, en donde la región de identidad es al menos, 60, 70, 80, 90 o 100 nucleótidos de longitud. Las proteínas BTL-II maduras codificadas por tales polinucleótidos, pueden pero no 55 NO: 18, tales sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas de aminoácidos . Las proteínas BTL-II de la invención, pueden enlazarse a un receptor en la superficie de una célula T y pueden inhibir la proliferación y/o producción de citocina por las células. Además, la invención proporciona proteínas BTL-II codificadas por ácidos nucleicos que expanden las uniones de empalme de los exones 1 y 4 (SEC IDE NO: 8 y SEC ID NO: 12) o exones 2 y 4 (SEC ID NO: 10, SEC IE NO: 14, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 18) y proteínas substancialmente similares que pueden enlazarse a un receptor expresado en la superficie de células T y/o pueden inhibir la proliferación y/o producción de citocina por células T. Estas inducen específicamente proteínas BTL-II que comprenden un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácidos de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.7%, o 100% idéntica a los aminoácidos 127 a 157 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 18 o aminoácidos 126 a 156 de la SEC ID NO: 16. La región de identidad de la secuencia de aminoácido alineada con los aminoácidos 127 a 157 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 18 o aminoácidos 126 a 156 de la SEC ID NO: 16, es preferiblemente de al menos, 20, 23, 25, 27, 30, 35, ó 40 aminoácidos de longitud. Tal secuencia de aminoácido puede ser al menos de 150 aminoácidos de longitud y puede ser al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.7%, o necesariamente, carecer de una secuencia señal (la cual está presente en la versión inmadura de la proteína) , que es al menos parcialmente codificada por este polinucleótido. Tales proteínas pueden enlazarse a una célula T y/o pueden inhibir la proliferación y/o producción de citocina por la célula T. Las proteínas BTL-II pueden ser glicosiladas a grados variantes o no glicosiladas. Como una ilustración, una proteína BTL-II de la invención puede comprender uno o más de un sitio de glicosilación N- y L-ligado además de aquellos ya encontrados en una proteína que comprende la SEC ID NO: 4, SEC ID N0:6, SEC ID N0:8, SEC ID N0:10, SEC ID NO:12, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 y/o SEC ID NO: 18. Tal proteína BTL-II puede tener una vida media in vivo prolongada que una proteína no alterada, puesto que puede tener más porciones de ácido siálico unidas a esta. Las proteínas BLT-II también incluyen proteínas que comprende uno cualquiera, dos cualquiera, tres cualquiera, o todos los cuatro dominios similares a Ig de un BTL-II humano o murino o dominios sustancialmente similares.
Variantes Polipéptidos derivados de cualquiera de las proteínas BTL-II por cualquier tipo de alteración (por ejemplo, pero no limitada a inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos; cambios en el estado de glicosilación del polipéptido; repliegue o isomerización al cambio en su estructura tri-dimensional o estado de auto-asociación; y cambios en su asociación con otros polipéptidos o moléculas) , también son proteínas BTL-II como significan en este documento. Las proteínas BTL-II proporcionadas por la invención incluyen polipéptidos caracterizados por secuencias de aminoácido sustancialmente similares a aquellas de las proteínas BTL-II, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 y/o SEC ID NO: 18, que pueden enlazarse a un receptor expresado en la superficie de las células T y/o pueden inhibir la proliferación y/o producción de citocina de una célula. La región identificada puede iniciar en la posición 30 o superior de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18. Una alineación GAP de tal proteína variante con al menos una de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 y/o SEC ID NO: 18, no puede tener hendiduras internas más grandes de 10 aminoácidos. La porción de la proteína BTL-II que es sustancialmente similar a la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:12, SEC ID MO:14, SEC ID NO:16 o SEC ID NO: 18, puede ser al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, o al menos 250 aminoácidos de longitud. Modificaciones en tales proteínas pueden ser naturalmente proporcionadas o deliberadamente diseñadas por ingeniería. Por ejemplo, la SEC ID NO: 11 (Figura 6a) es una variante alélica o polimórfica de la SEC ID NO: 9 (Figura 4a) que contiene cambios de base en una poca cantidad de posiciones que incluyen en las posiciones. La invención proporciona variantes de proteína BTL-II que contienen alteraciones de aminoácido único o múltiples, las cuales pueden ser inserciones, supresiones o sustituciones de un aminoácido único, con relación a la SEC ID N0:4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18, en donde la proteína variante BTL-II puede inhibir la proliferación de células T y/o producción de citocinas. Las alteraciones pueden ser sustituciones conservativas de aminoácido. Uno de habilidades en la técnica se guía por qué aminoácidos pueden ser cambiados sin afectar la función mediante, por ejemplo, la alineación de proteínas BTL-II de humano y ratón mostradas en la Tabla 3. Aminoácidos que son idénticos o similares en BTL-II humano y de ratón son más probablemente importantes por su función que aquellos que no son. Además, aminoácidos que son altamente conservados en dominios IgV o IgC (mostrados en negritas en la Tabla 3), son también probablemente funcionalmente importantes. Tales variantes polimórficas o alélicas pueden ser valiosas como agentes de diagnóstico para determinar una predisposición a la enfermedad. Variantes alélicas humanas con secuencias variantes de la SEC ID NO: 3, se describen en las Figuras 5a, 5b, 6a, 6b, 7a y 7b. Por ejemplo, entre personas normales sin síntomas de enfermedad inflamatoria de intestino, puede existir una cierta relación entre el número que tienen genes BTL-II que codifican ADNc con la secuencia de la SEC ID NO: 3 y el número que tienen genes BTL-II que codifican las mutaciones de variantes alélicas etiquetadas 3-6 en las Figuras 5a, 6a y 7a. La existencia de variaciones alélicas en tejidos de pacientes puede ser determinada mediante por ejemplo, amplificación por RCP de un segmento de molécula de ADN o AN que expande el sitio polimórfico. Como se mencionó anteriormente, las sustituciones conservativas de aminoácido, particularmente en sitios no conservados entre las secuencias de proteínas BTL-II humana y de ratón, son más probablemente para preservar la función biológica que no son sustituciones conservativas en sitios conservados. Uno de habilidades en la técnica también apreciará que sustituciones que sustancialmente establecen la estructura terciaria de una proteína BTL-II como se predice por programas tales como, por ejemplo, DALI (Holm and Sander (1993), J. Mol. Biol . 233:123-38) , son probablemente para dañar también la función.
Fragmentos Incluidas entre las proteínas BTL-II, están proteínas que comprende fragmentos de las SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID M0:14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO:18, o fragmentos que son al menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, ó 99.7% idénticos a estas secuencias. Preferiblemente, tales fragmentos pueden enlazarse a un receptor expresado en la superficie de una célula T y son al menos, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, tales fragmentos son solubles en solución acuosa y comprenden parte o toda la región extracelular de la proteína BTL-II. La proteína que comprende tal fragmento puede ser secretada. Por ejemplo, las proteínas BTL-II comprenden al menos uno de los dominios de las protexnas BTL-II murino o humana descritos anteriormente o una proteína sustancialmente similar, en donde el dominio tiene al menos, una de las propiedades biológicas de las proteínas BTL-II, están abarcadas por la invención. Por ejemplo, tales proteínas pueden inhibir la proliferación y/o producción de citocina de células T. Además, abarcadas por la invención están las siguientes versiones alteradas de las proteínas BTL-II humana y murino o protexnas sustancialmente similares: (1) versiones de proteína BTL-II murino y humana que carecen del segundo dominio similar a Ig (véase Figura 1) codificada por el exón 3; (2) versiones de una proteína BTL-II humana o murino que carece del primero y segundo dominios similares a Ig codificados por los exones 2 y 3; (3) versiones que carecen de los terceros y cuartos dominios similares a Ig codificados por los exones 5 y 6; (4) versiones que carecen de carecen de cualquiera de los dos de cuatro dominios similares a Ig; y (5) versiones que carecen de cualquiera de los dominios similares a Ig. También abarcada dentro de la presente invención están fragmentos inmunogénicos de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID MO:14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18, que son capaces de provocar anticuerpos que se enlazan específicamente al fragmento. Tales fragmentos son preferiblemente al menos 10 aminoácidos de longitud y preferiblemente comprende residuos de aminoácidos contiguos a partir de secuencias mencionadas anteriormente. Anticuerpos generados inmunizando animales con tales fragmentos pueden ser usados para predicción, diagnosis y tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino, como se discute en otra parte en esta solicitud. Tales fragmentos pueden extender regiones de estas proteínas codificadas por uniones de empalme, las cuales pueden tener la ventaja de generar anticuerpos específicos para proteínas codificadas por las variantes de empalme o la proteína de longitud completa. Alternativamente, un anticuerpo contra una porción BTL-II que es codificada por un exón 3, podría detectar solamente proteínas BTL-II de longitud completa, no proteínas codificadas por cualquiera de las otras variantes de empalme, todas las cuales carecen del exón 3.
Proteínas de fusió recombinante La invención además abarca proteínas de fusión que comprenden al menos un polipéptido, el cual es uno de las proteínas, variantes o fragmentos BTL-II descritos anteriormente, y al menos una de otra porción. La otra porción puede ser un polipéptido heterólogo, esto es, un polipéptido distinto a un polipéptido BTL-II. La otra porción también puede ser una porción no proteína tal como por ejemplo, una porción de polietilenglicol (PEG) o una porción citotóxica, citostática, luminiscente, y/o radioactiva. La unión de PEG se ha mostrado por incrementar la vida media in vivo de la menos algunas proteínas. Sin embargo, porciones citotóxicas, citostáticas, luminiscentes y/o radioactivas han sido fusionadas a anticuerpos para propósitos de diagnóstico o terapéuticos, por ejemplo, para situar, para inhibir la proliferación de, o para matar células a las cuales los anticuerpos se pueden enlazar. De manera similar, los polipéptidos BTL-II fusionados a tales porciones pueden ser usados para situar, para inhibir la proliferación de, o para matar células que pueden enlazarse a BTL-II. Entre tales porciones citotóxicas, citostáticas, luminiscentes y/o radioactivas están, por ejemplo, derivados de maitansina (tales como DM1) , enterotoxinas (tales como enterotoxina Saphylococcal) , isótopos de yodo (tales como yodo-125) , isótopos de tecnetio (tales como Tc-99m) , fluorocromos de cianina (tales como Cy5.518), proteínas inactivadoras del ribosoma (tales como globulina, gelonina o saporina-S6) , y caliquemicina, una sustancia citotóxica que es parte de un producto comercializado bajo la marca comercial MYLOTARG™ (Wyeth-Ayerst) . Una variedad de polipéptidos heterólogos pueden ser fusionadas a un polipéptido BTL-II para una variedad de propósitos tales como, por ejemplo, para incrementar la vida media in vivo de la proteina, facilitar la identificación, aislamiento y/o purificación de la proteína, para incrementar la actividad de la proteína y para promover la oligomerización de la proteína. Puesto que algunas proteínas de la subfamilia B7 tales como, por ejemplo, CD80, se enlazan a sus receptores principalmente en forma oligomérica (dimérica en el caso de CD80; véase Collins et al. (2002), Immunity 17: 201-10), la oligomerización puede ser muy importante para preservar la actividad biológica de una proteína soluble. Muchos polipéptidos heterólogos pueden facilitar la identificación y/o purificación de proteínas de fusión recombinantes de las cuales son una parte. Ejemplos incluyen poliarginina, polihistidina, o HAT™ (Clontech) , el cual es una secuencia que se origina naturalmente de residuos de histidina no adyacentes que poseen alta afinidad para iones metálicos inmovilizados . Las proteínas que comprenden estos polipéptidos heterólogos pueden ser purificadas mediante por ejemplo, cromatografía de afinidad usando resina TALON™ o níquel inmovilizada (Clontech) , la cual comprende iones de cobalto inmovilizados. Véase por ejemplo, Knol et al. (1996), J. Biol. C em. 27 (26) : 15358-15366. Polipéptidos heterólogos que comprenden poliarginina permiten la purificación efectiva por cromatografía de intercambio iónico. Otros polipéptidos heterólogos útiles incluyen por ejemplo, los péptidos de identificación antigénica descritos en la patente Estadounidense No. 5,011,912, y en Hopp et al. (1988), BiolTechnology 6:1204. Uno de tal péptido es el péptido FLAG®, el cual es altamente antigénico y proporciona un enlace reversiblemente epítopo por un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo rápido ensayo y purificación fácil de la proteína de fusión recombinante . Un hibridoma murino designado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se enlaza al péptido FLAG® en la presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, como se describe en la Patente Estadounidense 5,011,912. La línea de células de hibridoma 4E11 ha sido depositada con la American Type Culture Collection bajo el acceso no. HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que se enlazan al péptido FLAG® pueden ser usados como reactivos de afinidad para recuperar un reactivo de purificación de polipéptido que comprende el péptido FLAG® . Otros reactivos de afinidad y etiquetas de proteínas adecuados son: 1) aquellos descritos en el sistema GST-Bind™ (Novagen) , el cual utiliza la afinidad de las proteínas de fusión glutationa-S-transíerasa para glutationa inmovilizada; 2) aquellas descritas en el kit de purificación de afinidad T7-Tag® (Novagen) , el cual utiliza la afinidad de los 11 aminoácidos aminoterminal de la proteína 10 del gen T7 para un anticuerpo monoclonal; o 3) aquellos descritos en el sistema Strep-tag® (Novagen) , el cual utiliza la afinidad de una forma diseñada por ingeniería de estreptavidina para una etiqueta de proteína. Algunas de las etiquetas de proteínas mencionadas anteriormente, así como también otras, se describen en Sassenfeld (1990), TIBTECH 8:88-93, Brewer et al., in Purification and Analysis of Recombinant Proteins, pp. 239-266, Seetharam and Sharma (eds.), Marcel Dekker, Inc. (1991) , y Brewer and Sassenfeld, in Protein Purification Applications, pp. 91-111, Harris and Angal (eds.), Press, Inc., Oxford England (1990). Además, fusiones de dos o más de las etiquetas descritas anteriormente, tales como por ejemplo, una fusión de una etiqueta FLAG y una etiqueta polihistidina, pueden ser fusionadas a una proteína BTL-II de la invención. Las proteínas de fusión recombinante que comprenden otros polipéptidos heterólogos, pueden tener otra clase de ventajas únicas, tales como, por ejemplo, una propensidad para formar dímeros, trímeros o multímeros de orden superior, una vida media in vivo incrementada, y/o actividad biológica incrementada. Técnica para preparar proteínas de fusión se conocen, y se describen por ejemplo, en el documento WO 99/31241 y en Cosman et al. ((2001). Immunity 14: 123-133). Como una ilustración, un polipéptido heterólogo que comprende una región Fe de un anticuerpo IgG, o una proteína sustancialmente similar, puede ser fusionado a un polipéptido o fragmento BTL-II. Una región Fe de un anticuerpo es un polipéptido que comprende dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo de origen humano o animal o dominios de inmunoglobulina sustancialmente similares a estos. Para una discusión, véase Hasemann and Capra, Immunoglobulins : Structure and Function, in William E. Paul, ed. , Fundamental Immunology, Second Edition, 212-213 (1989) . Las formas truncadas de regiones Fe que comprenden la región articulada que promueven la dimerización, también pueden ser usadas . Otras porciones de anticuerpos y otros isotipos de inmunoglobulinas pueden ser usados . Las proteínas de f sión recombinante que comprenden regiones Fe de anticuerpos IgG, son probablemente para formar dímeros. Las proteínas de fusión comprenden varias porciones de proteínas derivadas de anticuerpos que han sido descritas por Ashkenazi-et al. ((1991) Proc . Nati. Acad. Sci.
USA 88:10535-39), Byrn et al. ((1990), Nature 344:677-70), Hollenbaugh and Aruffo (in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pp. 10.19. 1-10.19. 11 (1992)), Baum et al (1994), EMBO J. 13:3992-4001) y en la Patente Estadounidense No. 5,457,035 y el documento WO 93/10151. En algunas modalidades, una región Fe alterada puede tener la ventaja de tener una afinidad inferior para los receptores Fe comparados con una región Fe de tipo nativa. Esta es una ventaja debido a que pueden perder la lisis de células a las cuales tales proteínas de fusión recombinante pueden enlazarse por células efectoras inmunes. El ejemplo 5 describe la producción de una proteína de fusión que contiene la región extracelular de BTL-II murino fusionada a una región Fe humana. La secuencia de ácido nucleico que codifica esta proteína y su secuencia de aminoácido se describe en la SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 20, respectivamente . Como otra alternativa, las proteínas de fusión recombinante de la invención puede comprender un polipéptido heterólogo que comprende un cierre leucina. Entre otras secuencias de cierre de leucina son secuencias que promueven la dimerización y secuencias que promueven la dimerización. Véase por ejemplo, Landschulz et al. (1988), Science 240:1759-64. Los cierres leucina comprenden una repetición heptada repetitiva, a menudo con cuatro o cinco residuos de leucina interesparcidos con otros aminoácidos . El uso y preparación de cierres de leucina es bien conocido en la técnica. Alternativamente, un polipéptido heterólogo que forma parte de una proteína de fusión recombinante puede ser uno o más enlazadores peptldicos, que conectan dos o más polipéptidos . De manera general, un enlazador peptídico es una extensión de aminoácidos que sirven para enlazar polipéptidos idénticos puros, similares o diferentes, para formar multímeros y proporcionar la flexibilidad o rigidez requerida para la función deseada de las porciones enlazadas de la proteína. Típicamente, un enlazador peptídico está entre aproximadamente 1 y 30 aminoácidos de longitud. Ejemplos de enlazadores peptídicos incluyen, pero no se limitan a, --Gly-Gly--, GGGGS (SEC ID NO:l), (GGGGS)n(SEC ID NO: 2), GKSSGSGSESKS (SEC ID NO: 3), GSTSGSGKSSEG G (SEC ID NO: 4), GSTSGSG SSEGSGSTKG (SEC ID NO: 5), GSTSGSGKSSEGKG (SEC ID NO: 6), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 7), o EGKSSGSGSESKEF (SEC ID NO: 8) . Las porciones enlazantes son descritas, por ejemplo, en Huston, J. S., et al., Proc . Nati. Acad. Sci . 85:5879-83 (1988), Whitlo , M. , et al., Protein Engineering 6:989-95 (1993), and Newton, D. L. , et al., Biochemistry 35:545-53 (1996) . Otros péptidos enlazadores adecuados son aquellos descritos en las Patentes Estadounidenses No. 4,751,180 y 4,935,233. Además, una proteína de fusión recombinante puede comprender una proteína BTL-II que carece de su secuencia señal normal y tiene en su lugar una secuencia señal heteróloga que la reemplaza. La elección de una secuencia señal depende del tipo de células hospederas en las cuales la proteína recom inante es producida, y una secuencia señal heteróloga puede reemplazar la secuencia señal negativa. Ejemplos de secuencias señal que son funcionales en células hospederas de mamífero incluyen las siguientes : secuencia señal para interleucina-7 (IL-7) descrita en la Patente Estadounidense No. 4,965,195; la secuencia señal para el receptor de interleucina-2 se describe en Costnan et al. ((1984), Nature 312: 768); el péptido señal del receptor de interleucina-4 se describe en la Patente EP No. 0 367 566; el péptido señal receptor de interleucina-1 tipo I se describe en la Patente Estadounidense No. 4,968,607; y el péptido señal del receptor de interleucina-1 tipo II se describe en la Patente EP No. 0 460 846. Ácidos Nucleicos BTL-II La invención abarca ácidos nucleicos aislados que codifican las proteínas, fragmentos o fragmentos inmunogénicos BTL-II, descritos anteriormente, que incluyen variantes, fragmentos, proteínas de fusión recombinante, proteínas de longitud completa, proteínas solubles y proteínas secretadas. Estos ácidos nucleicos son útiles para, ínter alia, producir proteínas recombinantes y detectar la presencia de ácidos nucleicos BTL-II -en muestras de tejido, por ejemplo, para usos diagnósticos. Tales ácidos nucleicos pueden ser ADN o ADNc genómico. El ácido nucleico puede comprender una estructura lectora abierta ininterrumpida que codifica para una proteína BTL-II de la invención. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen ADN y ARN en formas tanto de hebra sencilla como de hebra doble, así como también las secuencias complementarias correspondientes. Un "ácido nucleico aislado" es un ácido nucleico que ha sido separado de las secuencias genéticas adyacentes presentes en el genoma del organismo a partir del cual el ácido nucleico se aisló, en el caso de ácidos nucleicos aislados a partir de fuentes que se originan naturalmente. En el caso de ácidos nucleicos químicamente sintetizados, tales como oligonucleótidos , o enzimáticamente de una plantilla, tales como productos de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) o ADNc, se entiende que los ácidos nucleicos que resultan de tales procesos son ácidos nucleicos aislados. Una molécula de ácido nucleico aislada se refiere a una molécula de ácido nucleico en la forma de un fragmento separado o como un componente de un constructo de ácido nucleico más grande. Además, la invención abarca fragmentos de un ácido nucleico que codifican para una proteína BTL-II que puede servir (1) como sonda para detectar ácidos nucleicos BTL-II por un número de métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, manchado Southern y Northern, manchado de punto, hibridaciones de colonia, etc., (2) como cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) para amplificar ácidos nucleicos BTL-II, o (3) como un medio para regular la expresión de ácidos nucleicos BTL-II, por ejemplo, a través de inhibición de la expresión con ácidos nucleicos antisentido (que incluyen ácidos nucleicos peptldicos) , ribozimas, moléculas que forman triple hélice, o ARNA o ADN de interferencia que codifican cualquiera de estos ARN. Los cebadores de RCP pueden comprender, además de las secuencias de ácido nucleico BTL-II, otras secuencias tales como sitios de desdoblamiento de enzima de restricción que facilitan el uso del ácido nucleico amplificado. La RCP se describe en las siguientes referencias: Saiki et al. (1988), Science 239: 487-91; PCR Technology, Erlich, ed. , Stockton Press, (1989). Como se explica abajo, la RCP puede ser útil para detectar la sobre expresión de ARNm de BTL-II y cebadores de RCP pueden ser tomados de varias partes del gen y pueden también ser seleccionados para distinguirlos entre diferentes variantes de empalme. Los ARN (y ADN que los codifican) , ADN o nucleótidos sintéticos antisentido y su uso para regular la expresión, son bien conocidos en la técnica y se describen en por ejemplo, Izant and Weintraub (1984), Cell 36(4): 1007-15; Izant and eintraub (1985), Science 229 (4711) : 345-52 ; Harel-Bellan et al . (1988), J. Exp ed. 168 (6) : 2309-18 ; Sarin et al. (1988), Proc. Nati . Acad. Sci. USA 85 (20) : 7448-51 ; Zon (1988), Pharm. Res. 5(9):539-49; Harel-Bellan et al . (1988), J. Immunol 140 (7) : 2431-35; Marcus-Sekura et al . (1987), Nucleic Acids Res. 15 (14) : 5749-63 ; Gambari (2001), Curr. Pharm. Des. 7 (17) : 1839-62 ; y Lemaitre et al. (1987), Proc Nati. Acad. Sci. USA 84 (3 ): 648-52. De manera similar, los ARN de interferencia (y ADN que los codifican) y su uso para inhibir la expresión de genes seleccionados, es bien conocido en la técnica y se describe en, por ejemplo, Fjose et al. (2001), Biotechnol. Ann. Rev. 7:31-57; Bosher and Labouesse (2000) , Nature Cell Biol. 2:E31-E36. Además, ribozimas o ADNzimas, pueden ser dirigidos a los ARN específicos escindidos y de este modo, usados para inhibir la expresión del gen como se describe en, por ejemplo, Lewin and Hauswirth (2001) , Trends Mol. Med. 7(5):221-28; Menke and Hobom (1997), Mol. Biotechnol. 8(1): 17-33; Norris et al (2000), Adv. Exp. Med. Biol. 465:293-301; Sioud (2001), Curr. Mol. Med. l(5):575-88; y Santiago and Khachigian (2001), J. Mol. Med. 79 (12) : 695-706. Los ácidos nucleicos que regulan la expresión BTL-II pueden encontrar uso en estudios in vivo o in vitro de la función de BTL-II o como terapéuticos, opcionalmente como agentes de terapia del gen. La presente invención también incluye ácidos nucleicos que hidridizan bajo condiciones moderadamente rigurosas y más preferiblemente condiciones altamente rigurosas, a ácidos nucleicos que codifican las proteínas BTL-II descritas en este documento. Tales ácidos nucleicos incluyen las SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO:13, SEC ID N0:15 o SEC ID NO: 17. Preferiblemente, tales ácidos nucleicos codifican proteínas que pueden enlazarse a un receptor en la superficie de las células T y/o pueden inhibir la proliferación de las células T y/o la producción de citocinas. Las técnicas de hibridación son bien conocidas en el arte y se describen por Sambrook, J. , E. F. Fritsch, and T. Maniatis [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., capítulos 9 y 11, (1989)) y Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds . , John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4 (1995) ) . Las condiciones moderadamente rigurosas incluyen hibridación en aproximadamente 50% de formamida, 6 x SSC a una temperatura desde aproximadamente 42 hasta 55 °C y lavado a aproximadamente 60°C en 0.5 x SSC, SDS al 0.1%. Las condiciones altamente rigurosas se definen como condiciones de hibridación como anteriormente, pero con lavados a aproximadamente 68 °C en 0.2 x SSC, SDS al 0.1%. Puede ser sustituido SSPE (lxSSPE es 0.15 M de NaCl, 10 mM de NaH2P04, y 1.26 mM de EDTA, pH 7.4) por SSC (lxSSC es 0.15M de NaCl y 15 mM de citrato de sodio) en la hibridación y amortiguadores de lavado; lavados, preferiblemente al menos dos, se realizan por 15 minutos después que la hibridación se completa. Se debe entender que la temperatura de lavado y la concentración de sal de lavado se puede ajustar como sea necesaria para lograr un grado deseado de rigurosidad aplicando los principios básicos que rigen las reacciones de hibridación y estabilidad doble, como se muestra por aquellos expertos en la técnica y se describe además abajo (véase por ejemplo., Sambrook et al., supra) . Cuando se hibridizan ácidos nucleicos de secuencias conocidas, la longitud del híbrido puede ser determinada alineando las secuencias de los ácidos nucleicos e identificando la región o regiones de complementariedad de secuencia óptima. La temperatura de hibridación para híbridos anticipados por ser menores de 50 pares base en longitud, debe ser 5 a 10°C menos que la temperatura de fusión (Tf) del híbrido, en donde Tf se determina de conformidad con las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores de 18 pares base en longitud, Tf (grados C) = 2 (# de bases A + T) + 4 (# de bases G + C) . Para híbridos arriba de 18 pares base en longitud, Tf (grados C) = 81.5 + 16.6 (log10 [Na] +) + 0.41 (% G + C) - (600/N) , en donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el amortiguador de hibridación ( [Na+] para lxSSC = 0.165 M) . Cada uno de tales ácidos nucleicos de hibridación tiene una longitud que es al menos 15 nucleótidos (o al menos 18 nucleótidos, o al menos 20, o al menos 25, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50, o al menos 100. Sambrook et al . , supra . Los ácidos nucleicos BTL-II incluyen ácidos nucleicos que comprende los siguientes polinucleótidos : (1) todo o un fragmento de las SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID N0:7, SEC ID NO:9, SEC ID N0:11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO:15 O SEC ID NO: 17, en donde el fragmento que codifica para una proteina BTL-II puede enlazarse a un receptor expresado en la superficie de una célula T y/o inhibir la proliferación y/o producción de citocina de células T; (2) secuencias al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% O 99.7% idénticas a las SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15 O SEC ID NO: 17, que son al menos de, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 800, 1000, 1200, 1400, ó 1600 nucleótidos de longitud y que codifican una proteína BTL-II que puede enlazarse a un receptor expresado en la superficie de las células T y/o inhibir la proliferación y/o producción de citocinas de células T; (3) fragmentos de las SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15 o SEC ID NO: 17 o secuencias sustancialmente similares que son útiles para detectar o amplificar ácidos nucleicos que codifican las proteínas BTL-II de la invención o para regular la expresión de ARNm de BTL-II y/o proteínas; (4) ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ó 99.7% idéntico a un polinucleótido que consiste de nucleótidos 30 a 130 de la SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 11 o a los nucleótidos '377-477 de las SEC ID NO:9, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, o SEC ID NO: 17, en donde la región de identidad es al menos de 60, 70, 80, 90 ó 100 nucleótidos de longitud y la proteína codificada por el ácido nucleico puede inhibir la proliferación y/o producción de citocina de células T; y (5) ácidos nucleicos que comprenden al menos, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ó 75 alteración (es) relativas a las SEC ID NO:3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO:9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:15 O SEC ID NO: 17, en donde una alteración puede ser una inserción, supresión o sustitución de un nucleotido único.
Anticuerpos que se Enlazan Específicamente a Polipéptidos BTL-II Anticuerpos qüe se enlazan específicamente a las proteínas BTL-II de la invención, que incluyen variantes, fragmentos, y proteínas de fusión recombinante, están abarcadas por la invención. Como se usa en este documento, enlace específico de un epítopo en una proteína BTL-II por otra proteína (tal como un anticuerpo) significa que la proteína específicamente unida puede ser desplazada de la molécula de la proteína BLT-II a la cual se une por otra proteína que comprende el mismo epítopo pero no por otra proteína la cual no comprende este epítopo. Se conocen en la técnica numerosos ensayos, de enlace competitivo. Los epítopos pueden comprender solamente aminoácidos contiguos, pero también pueden comprender aminoácidos no contiguos que se llevan en proximidad por el pliegue terciario de una proteína BTL-II. Pueden ser identificados epítopos por métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Leinonen et al (2002), Clin. Chem. 48 (12) : 2208-16; Kroger et al. (2002), Biosens. Bioelectron 17 (11-12) : 937-4 ; Zhu et al. (2001), Biochem. Biophys . Res. Commun. 282(4): 921- 27. La invención también abarca epítopos de las proteínas BTL-II descritas en este documento que son útiles para generar anticuerpos, los cuales se refieren en este documento como fragmentos inmunogénicos . Los fragmentos inmunogénicos son preferiblemente al menos 10 aminoácidos de longitud y preferiblemente comprenden aminoácidos contiguos a partir de las SEC ID N0:4, SEC ID N0:6, SEC ID N0:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18. Tales epítopos pueden extender las regiones de las proteínas BTL-II codificadas por las uniones de empalme, los cuales pueden tener la ventaja de enlazar específicamente a proteínas codificadas por las variantes de empalme específicas.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales y pueden ser producidos por métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980) ; and Antibodies : A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988); Kohler and Milstein (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. , USA, 77:2197; Kozbor et al. (1984), J Immunol . 133:3001-3005 (que describe la técnica de hibridoma de células B humanas); Colé et al., Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985) (la cual describe la técnica de hibridoma EBV) ; Kuby, Immunology, Segunda Edición, p. 162-64, W. H. Freeman and Co., New York (1994) . Las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para las proteínas BTL-II de la invención, también están contempladas en este documento. Tales hibridomas pueden ser producidos e identificados por técnicas convencionales. El hibridoma que produce el mAb de esta invención, puede ser cultivado in vitro o in vivo. Además, anticuerpos anti-BTL-II de la invención pueden ser producidos en células cultivadas que incluyen por ejemplo, células de ovario de Hámster Chino (CHO) , HeLa, VERO, BHK, Cos, MDC , 293, 3T3, mieloma (por ejemplo NSO, ???) , o WI38, células de levadura, células de insecto y células bacterianas, que incluyen por ejemplo, Eschericha. coli. Tales anticuerpos pueden ser producidos introduciendo ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos más ácidos nucleicos para permitir la expresión de estos ácidos nucleicos en las células hospederas deseadas . Los anticuerpos pueden entonces ser producidos cultivando las células en las cuales estos ácidos nucleico han sido introducidos. Los anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina que incluye IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquiera de las subclases de los mismos . Alternativamente, los anticuerpos pueden ser anticuerpos de cadena sencilla que comprenden un dominio similar a la región variable de cadena ligera y cadena pesada y, opcionalmente, también uno o más dominios similares a la región constante (Patente Estadounidense No. 4,946,778; Bird et al. (1988), Science 242:423-26; Huston et al. (1988), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-83), anticuerpos diméricos o multivalentes [véase por ejemplo, Lantto et al. (2002), J. Gen. Virol. 83:2001-05; Hudson and Souriau (2001), Expert Opin. Biol. Ther. 1 (5):845-55), anticuerpos tetraméricos (véase por ejemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, Fifth Edition, Part II, Ch. 3, Garland Publishing (2001) ) , anticuerpos quiméricos (Hudson and Souriau, supra; Boulianne et al. (1984), Nature 312:643-46; Morrison et al (1984), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-55; Takeda et al. (1985), Nature 314:452-54; Neuberger et al. (1985), Nature 314:268-70), anticuerpos completamente humanos producidos en un mamífero transgénico diferente (descrito en por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6,150,584) o por selección in vitro (Solicitud de Patente US No. 2002/0058033) o anticuerpos humanizados (Morrison et al., supra; Takeda et al., supra; Boulianne et al., supra) . Además, los anticuerpos pueden ser "madurados" por esquemas de selección in vitro para proporcionar un anticuerpo con propiedades alteradas tales como, por ejemplo, una afinidad superior para el epítopo al cual se enlaza. Véase por ejemplo, Jackson et al. (1995), J. Immunol. 154 (7) : 3310-19 ; Pini and Bracci (2000), Curr. Protein Pept. Sci. l(2):155-69; Ellmark et al. (2002), Mol. Immunol. 39 (5-6) :349; O'Connell et al. (2002), J. Mol. Biol . 321 (1) :49-56; Huís et al. (2001), Cáncer Immunol. Immunother. 50:163-71; Hudson and Souriau, supra; Adams and Schier (1999), J. Immunol. Methods 231(1-2): 249-60; Schmitz et al. (2000), Placenta 21 Suppl . A:S106-12. Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos tales como, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, o fragmentos Fv de cadena sencilla (Fv'scs), que pueden enlazarse específicamente a una proteína BTL-II de la invención, también están abarcados por lo que significa en este documento como un anticuerpo anti-BTL-II. Véase Kuby, supra, pp.109-112 y Janeway et al., supra, para discusión de fragmentos Fab y Fv. La invención también abarca anticuerpos anti-idiotípicos que se enlazan específicamente a anticuerpos que se enlazan específicamente a proteínas BTL-II y que imitan los efectos de proteínas BTL-II. Tales anticuerpos anti-idiotípicos son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, uby et al., supra, en 317-72. Varias clases de anticuerpos específicos recombinantes y no recombinantes que se enlazan específicamente a una próteína BTL-II de la invención y otros ep topos están también contemplados. Varias clases de anticuerpos biespecíficos y métodos para elaborarlos se describen en las Patentes Estadounidenses Nos . 4,474,893, 6,060,285, y 6,106,833. Los anticuerpos anti-BTL-II pueden ser anticuerpos antagonísticos que bloquean una función biológica BTL-II, tal como el enlace de BTL-II a su receptor, o anticuerpos agonísticos que promueven la función biológica BTL-II o imitan la función de BTL-II. Los anticuerpos agonísticos pueden incluir anticuerpos anti-idiotípicos agonísticos que imitan la función de la proteína BTL-II. Ensayos para determinar funciones BTL-II se describen en este documento. Anticuerpos anti-BTL-II que bloquean una función biológica BTL-II como se determina en tales ensayos, son anticuerpos antagonísticos como significa en este documento. Anticuerpos antagonísticos pueden por ejemplo, bloquear el enlace de BTL-II a su receptor. Anticuerpos anti-BTL-II que cuando se agregan a tales ensayos, promueven o mejoran una función biológica BTL-II, son anticuerpos antagonisticos como significa en este documento. Un anticuerpos anti-BTL-II antagonístico puede ser usado por ejemplo, como un adyuvante para incrementar una respuesta inmune mucosomal . Además, un anticuerpo agonístico contra un receptor BTL-II puede ser usado para deprimir la respuesta inmune mucosal para tratar por ejemplo, una enfermedad que está caracterizada por inflamación inapropiada de los intestinos, tal como enfermedad de Crohn o enfermedad inflamatoria del intestino. Los anticuerpos de la invención pueden también ser usados en ensayos para detectar la presencia de las proteínas BTL-II de la invención, ya sea in vivo o in vitro. Los anticuerpos también pueden ser empleados en la purificación de proteínas BTL-II de la invención por cromatografía de afinidad. La invención abarca ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención y métodos para producir los anticuerpos introduciendo tales ácidos nucleicos en células y cultivar las células que contienen los ácidos nucleicos.
Agonistas y Antagonistas de Polipéptidos BTL-II La invención comprende agonistas y antagonistas de BTL-II y métodos para seleccionar y usar agonistas y antagonistas. Ensayos para determinar la actividad biológica BTL-II se describen en este documento, tales, como por ejemplo, ensayos de proliferación celular, ensayos de secreción de citocina, ensayos de enlace y ensayos genéticos que involucran la sobre o subexpresion de la proteína BTL-II in vivo o in vitro o una ausencia completa de expresión BTL-II in vivo o in vitro. Las moléculas candidato pueden ser agregadas a tales ensayos para determinar sus efectos en la actividad biológica de las proteínas BTL-II. Los antagonistas BTL-II pueden, por ejemplo, bloquear la interacción BTL-II con su receptor, el cual es preferiblemente expresado en células B o células T. Los antagonistas incluyen anticuerpos antagonísticos y los agonistas incluyen anticuerpos agonísticos . Además , otras moléculas relacionadas con anticuerpos que pueden enlazarse específicamente a las proteínas BTL-II de la invención, tales como aficuerpos ( (Rónnmark et al. (2002), J. Immunol. Methods 261 (1-2): 199-211) y los péptidos biológicamente descritos en el documento WO 00/24782 que pueden enlazarse específicamente a las proteínas BTL-II de la invención e inhibir la actividad biológica de las proteínas BTL-II, están abarcados por la invención. Además, antagonistas BTL-II incluyen los ácidos nucleicos descritos anteriormente que son útiles para modular la expresión de la proteína BTL-II y/ ARm, tales como por e emplo, AR de interferencia (o ADN que los codifica) , o ARN o ADN antisentido.
Antagonistas además incluyen proteínas que comprenden secuencias de aminoácido seleccionadas in vitro para enlazar a BTL-II o su receptor y pueden, opcionalmente, interferir con la interacción BTL-II y su receptor. Alternativamente, tales proteínas pueden ser agonistas BTL-II que promueven o imitan la función biológica BTL-II. Las proteínas que se enlazan a BTL-II o su receptor, se pueden seleccionar por su capacidad para interferir con la interacción BTL-II con su receptor, o alternativamente, puede ser designada una selección para obtener tales proteínas directamente . Las proteínas pueden ser seleccionadas de un número de métodos tales como por ejemplo, exhibición de fago o exhibición de la superficie de una bacteria. Véase por ejemplo, Parmley and Smith (1989), Adv. Exp. ed. Biol. 251:215-218; Luzzago et al. (1995), Biotechnol . Annu. Rev. 1:149-83; Lu et al. (1995), Biotechnology (NY) 13 (4):366-372. En estos métodos, cada miembro de una biblioteca de dominios de enlace puede ser exhibido en partículas de fago individuales o células bacterianas, y se puede seleccionar la bacteria o fago que se enlazan a una proteína de interés, bajo condiciones elegidas. Ácidos nucleicos que codifican los dominios de enlace seleccionados puede ser obtenidos haciendo crecer el fago o bacteria seleccionado y aislar ácidos nucleicos a partir de estos.
Alternativamente, una protelna puede ser seleccionada completamente in vitro. Por ejemplo, cada polipéptido individual en una biblioteca de dominios de enlace potenciales, puede ser unido a ácidos nucleicos que lo codifican, y aquellos que se enlazan a la proteína de interés bajo condiciones elegidas, pueden ser seleccionados. Puesto que los polipéptidos están unidos a ácidos nucleicos que los codifican, operaciones subsecuentes, tales como amplificación, clonación o secuenciamiento de ácidos nucleicos que codifican dominios de enlace efectivo, son facilitados . Varios esquemas para tales selecciones se conocen en la técnica, que incluyen partículas de ARNm anticuerpo-ribosorna, exhibición de ribosoma, fusiones de péptidos de ARN covalente, o fusiones de péptidos ADN-ARN covalente. He and Taussig (1997), Nucleic Acids . Res. 25 (24) :5132-5134; Hanes and Pluckthun (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. 94:4937-4942; Roberts and Szostak (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. 94:12297-12302; Lohse and Wright (2001), Curr. Opin. Drug Discov. Devel . 4 (2) : 198-204 ; Kurz et al. (2000), Nucleic Acids Res. 28(18) :E83; Liu et al. (2000), Methods Enzymol. 318: 268-93; Nemoto et al. (1997), FEBS Lett 414 (2) :405-08; documentos US 6,261, 804; W00032823; y 00034784. Tales proteínas pueden ser seleccionadas por ser antagonistas o agonistas.
Análisis para determinar la Actividad Biológica de proteínas BTL-II Pueden ser usados varios ensayos para detectar la actividad biológica de una proteína BTL-II y para identificar patrones de enlace BTL-II. Las proteínas BTL-II, receptor (es) de BTL-II, y agonistas y/o antagonistas se cualquiera, pueden ser usados en tales ensayos.
Ensayos para Identificar Patrones de Enlace Un patrón de enlace para la proteína BTL-II puede ser identificado determinando primero que tipos de células pueden enlazarse a una proteína BTL-II soluble. Puesto que los receptores conocidos para elementos de la subfamilia B7 de proteínas similares a butirofilina son todos expresados en células T, ya sea constitutivamente (CD28) o después de la activación (CTLA-4, ICOS, PD-1) , las células T pueden ser probadas para determinar si la BTL-II puede enlazarse a ellas. Debido al patrón de expresión BTL-II, células T aisladas de intestino normal e inflamado, pueden ser incluidas en tales pruebas. Además, pueden ser probadas varias subseries de células T, que incluyen memoria de células T, células T nativas, células T aß, células T ?d, y células T en varios estados de activación. Tales experimentos pueden ser conducidos usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una proteína de fusión recombinante BTL-II que comprende el dominio extracelular de BTL-II murino más una región Fe de un anticuerpo, puede ser usada para enlazar a las células que son probadas. Un anticuerpo fluorescentemente etiquetado que puede enlazarse a la región Fe en la proteína de fusión recombinante puede ser agregado. Después del lavado, las células pueden ser analizadas usando un dispositivo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) , para determinar si BTL-II puede enlazarse a las células. Uno de tales análisis se describe por Chapoval et al. (2001), Nature Immunol. 2 (3) : 269-74) . Otros métodos conocidos en la técnica pueden también ser adecuados para determinar si BTL-II se enlaza a poblaciones celulares específicas . Además, receptores conocidos de los miembros de la subfamilia B7 serán probados para determinar si BTL-II se enlaza a cualquiera de estas proteínas. Las proteínas de fusión recombinante que comprenden un dominio extracelular de un receptor de un miembro de la sub-familia B7 (tal como, por ejemplo, CTLA-4, un receptor para B7-1 y B7-2) y una región Fe de un anticuerpo, puede ser elaborada por métodos similares a aquellos usados para elaborar tales proteínas de fusión BTL-II. Las células pueden ser transíectadas con formas de longitud completa de ácidos nucleicos BTL-II que codifican las proteínas BTL-II que incluyen dominios de la transmembrana y citoplásmicos que son expresados en la superficie celular. La proteína de fusión Fe: receptor a ser probados, pueden ser agregados a tales células junto con un anticuerpo fluorescentemente etiquetado que puede enlazarse a la región Fe. Después del lavado, las células pueden ser analizadas por FACS para determinar si el receptor:proteína de fusión Fe se enlaza a la proteína BTL-II expresada en las células transfectadas . El experimento inverso puede también hacerse en donde la proteína de fusión BTL-II: Fe es usada y la proteína del receptor de longitud completa es introducida y expresada .vía transfección. Tales experimentos pueden revelar interacciones de enlace entre las proteínas BTL-II y receptores conocidos de otros elementos de la subfamilia B7. Si BTL-II se enlaza al menos a una variedad de células T, pero no se enlaza a un receptor conocido, puede ser usada una variedad de métodos de purificación de proteína o clonación de expresión conocidos en la técnica, para identificar el receptor que se enlaza a BTL-II. Como un ejemplo, un método de clonación de expresión de ADNc de enlace en portaobjetos radioactivo, puede ser usado. Brevemente, una fuente celular con el enlace más grande al BTL-II soluble es identificada, el ARm es aislado, y la biblioteca de ADNc es construida en un vector de expresión de mamífero. Las células de mamífero son transfectadas con combinaciones de ADNc en portao jetos, y después de una incubación apropiada, permiten que la expresión de la proteína de fusión BTL-II: Fe soluble se una a las células. El enlace específico a las. células que portan el receptor, se detecta siguiendo una serie de etapas : enlace de un reactivo anti-Fc radioactivo a la proteína BTL-II: Fe unida; aplicación de emulsión de película a los portaobjetos; incubación para permitir la exposición, desarrollo de película pera depósito de granos de plata; y detección de granos por el microscopio. El clon que expresa el receptor es entonces aislado a partir de la combinación subdividiendo la combinación de ensayos de enlace de portaobjetos iterativos para identificar el clon de receptor único. Tales métodos de describen en McMahon et al. (1991), EMBO J. 10:2821-32. Cuando el enlace a las células se logra, una variedad de medios, ya sea a través de inmunización animal o por tecnología de exhibición de fago, pueden ser usados para aislar anticuerpos que se enlazan a BTL-II e interrumpen su enlace a las células . Tales anticuerpos pueden ser usados para antagonizar la actividad BTL-II endógeno y por lo tanto, pueden ser usados en ensayos para determinar los efectos de cantidades efectivas disminuidas de BTL-II en respuestas inmune y en modelos de enfermedades, tales como los modelos de enfermedades inflamatorias del intestino, por ejemplo, aquellas descritas por Cooper et al. ((1993), Lab. Invest. 69 (2) : 238-49) y Tokoi et al. ((1996), J Gastroenterol . 31(2) :182-88) .
Ensayo para Determinar la Función BTL-II Las proteínas de la subfamilia B7 han sido mostradas por tener actividad en ensayos "co-estimulatorios" de células T que involucran activación de las células T a través de sus receptores de células T con dosis variantes de "antígeno" . La actividad de las proteínas de la subfamilia B7 no es más evidente en estimulación del receptor de células T "sub-óptimo" . Véase por ejemplo, Latchman et al. (2001), Nature Immunol. 2(3): 261-68. ün "antígeno subrogado" tal como anticuerpo o antígenos anti-CD3e unidos a la caja de petri de cultivo de tejido representados por las moléculas MHC en células que presentan antígeno irradiado, pueden ser usadas. Una proteína BTL-II soluble puede ser agregada para determinar su efecto en las repuestas de las células T al "antígeno" . Pueden ser medidos varios parámetros para determinar si las células T están siendo estimuladas o suprimidas. La proliferación celular, expresión del receptor de superficie celular y niveles de expresión de moléculas inmunomoduladoras (tales como, por ejemplo, interferon ? y/o IL-2) al nivel de la proteína y/o ARNm, pueden ser medidos. Tales métodos son usados y descritos en por ejemplo, Fitch et al. in T Cell Subsets in Infectious and Autoimmune Diseases, John Wiley and Sons, pp. 68-85 (1995); Freeman et al. (2000), J. Exp. Med. 192 (7) : 1027-34; Swallow et al. (1999), Immunity 11:423-32; Hutloff et al. (1999), Nature 397:263-66; Yos inaga et al. (1999), Nature 402:827-32; Latchman et al., supra. Dado el patrón de expresión BTL-II, tales ensayos pueden incluir células T derivadas de tej ido mucosal o los nodos linfáticos que drenan tales tejidos. Además, células T de memoria y nativas, células T CD4+ y CD8+, y células T que expresan receptores de las células T y otros distintos de los receptores de células aß, pueden ser examinados. A partir de tales experimentos, se puede revelar si el BTL-II puede alterar respuestas de un número de clases distintas de células T. Tales experimentos son descritos abajo y muestran que una versión soluble del BTL-II puede inhibir la proliferación celular y suprimir la producción de citocinas, incluyendo gama interferon (IFNy) , interleucina 2 (IL-2) , e interleucina 5 (IL-5) . Ejemplos 6-10; Figuras 12-17. Variaciones de esta clase de experimento incluyen examinar el efecto de incluir formas solubles de proteínas BTL-II en la respuesta co-estimulatoria encontrada con otras proteínas solubles de la subfamilia B7 o varios miembros de la familia T F que pueden ser co-estimulatorios . Esto ayudará a definir si el BTL-II puede alterar la co-estimulación vista con otras moléculas . Variaciones adicionales pueden incluir uso de antígeno no irradiado, presentación de células de varias clases . Esto ayudará a definir los efectos de adición de una proteína BTL-II soluble en la función del antígeno que presenta células. En todavía otra variación, anticuerpos que bloquean el enlace BTL-II a las células (véase anteriormente) , pueden también ser introducidos en tales experimentos de coestimulación para determinar los efectos para prevenir el enlace . En otra clase de experimento, células que presentan antígeno (tales como, por ejemplo, células dendríticas o células B a partir de parches Peyer o células epiteliales intestinales (IECs) ) que expresan BTL-II, pueden ser combinadas con células T (tal como las varias clases listadas anteriormente) , y uno o más de los parámetros listados anteriormente pueden ser medidos. Los resultados obtenidos con estas células pueden ser comparados con los resultados obtenidos cuando ARN, o ADN de interferencia los codifican, designados para disminuir la expresión BTL-II, se introducen en las células que presentan antígeno. Las células regulatorias T actúan para suprimir las respuestas autoinmunes y ayudar a hacerlo, en parte, induciendo diferenciación o mejorando la función regulatoria de células T (reg T) en sistemas de modelo de enfermedades inflamatorias del intestino, células reg T incluyen, por ejemplo, células Trl (Cong et al. (2002), J. Immunol. 169 (11) : 6112-19; Groux et al 1997), Nature 389:737-42), células Th3, células reg T CD4+Cd25+ [Véase por ejemplo, Maloy and Powrie (2001), Nature Immunology 2 (9) : 816-22) , células reg T CD4+Rbl0CD25+, y células reg T CD8+ (Allez et al. (2002), Gastroenterology 123: 1516-26), entre otras. De este modo, valorando los efectos de BTL-JI después de la proliferación y función de las células T regulatorias , puede ser necesario determinar la función precisa BTL-II in vivo. Por ejemplo, se puede medir la proliferación especifica del antígeno de células T y/o producción de citocina por células T en la presencia de células Trl. Tales ensayos se describen en Cong et al, supra. Formas solubles de anticuerpos de bloqueo BTL-II, o inhibición de la expresión BTL-II usando ARN de interferencia, pueden ser usados para determinar si BTL-II desempeña un papel en la proliferación, mantenimiento o capacidad de células T regulatorias o células Trl, para suprimir la activación del antígeno de otras células T. Una subserie de células T, las células Th2, producen el factor ß de crecimiento de transformación (?T?ß) y han sido implicadas en la tolerancia oral a antígenos mucosales . Véase por ejemplo, Fukaura et al. (1996), J. Clin. Invest. 98 (1) : 70-77; Inobe et al. (1998), Eur. J. Immunol. 28:2780-90. Tales células pueden ser generadas a partir de células T nativas por cultivo extensivo con antígeno en la presencia de TGF . Las proteínas BTL-II solubles o anticuerpos de bloqueo, pueden ser usados para preguntar si BTL-II puede alterar la proliferación o función de estas células por métodos similares a aquellos descritos anteriormente.
Serán valorados los efectos para administrar proteínas BTL-II solubles o anticuerpos antagonísticos en modelos de sistemas de células T usando antígenos bien definidos, simples, tales como por ejemplo, ovalbúmina, o antígenos de complejos, que incluyen bacterias o virus. Las respuestas de las células T a tales antígenos (que incluyen proliferación y/o producción de moléculas tales como ? interferon o IL-2) , pueden ser medidas en la presencia y ausencia de proteínas o anticuerpos BTL-II. Se pueden probar efectos similares en sistemas animales. El enfoque previo será en sistemas particularmente relevantes a la respuesta inmune mucosal. Este incluye sistemas de modelos en los cuales el antígeno es alimentado a animales (Véase por ejemplo, Yamashiro et al. (1994), Acta Paediatr. Jpn. 36:550-55; Jain et al. (1996), Vaccine 14 (13) : 1291-97; Chen et al (2002), Immunology 105:171-80), sistemas de enfermedades inflamatorias del intestino tales como en el modelo de enfermedades inflamatorias del intestino inducidas por dextran sulfato de sodio (Cooper et al. 1993), Lab. Invest. 69 (2) : 238-49; Tokoi et al. (1996), J. Gastroenterol . 31 (2) : 182-88) , modelo de enfermedad neurológica mortal inducido por células CD45RBhl/CD4+ (Morrissey et al 1993), J. Exp. Med. 178: 237-44), y/o modelo de sistemas de asma en el cual los antígenos son alimentados o inculcados en las vías respiratorias para provocar una respuesta inmune tal como el modelo de asma inducido por ovalbúmina de murino (Brusselle et al. (1994), Clin. Exp. Allergy 24 (1) : 73-80) . En particular, la magnitud de la respuesta mediada por células u humoral, será medida, y será medido el tipo de citocinas inmunomodulatorias producidas . Tales experimentos pueden revelar si el BTL-II aumentado o disminuido puede ser de beneficio en respuestas moderadas a antígenos, que incluyen auto-antígenos , o incrementan respuestas a aloantígenos . Los efectos de proteínas BTL-II o anticuerpos anti-BTL-II pueden también ser valorados en otros modelos de enfermedades inflamatorias. Ensayos para determinar la proliferación de células T o timocitos incluyen sin limitación, aquellos descritos en Current Protocole in I munology, Coligan et al. eds, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (pp. 3.1-3. 19: In vitro assays for mouse lymphocyte function; Chapter 7: Immunologic studies in humans) ; Takai et al (1986) , J. Immunol. 137:3494-3500; Bertagnolli et al. (1990), J. Immunol. 145:1706-1712; Bertagnolli, et al. (1992), J. Immunol. 149:3778-3783; Bowman et al (1994), J. Immunol. 152 :1756-1761. Ensayos para determinar la producción de citocina y/o proliferación de células de bazos, células de nodo linfático o timocitos incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Kruisbeek and Shevach (1994), Polyclonal T cell stimulation, in Current Protocols in Immunology, Coligan et al . eds . Vol 1 pp. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto (1991) ; y Schreiber, (1994) , Measurement of mouse and human interferon gamma in Current Protocols in Immunology, Coligan et al. eds. Vol 1 pp. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto (1991) . Ensayos para determinar la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y linfopoyéticas incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Bottomly et al., 1991, Measurement of human and murine interleukin 2 and interleukin 4 , in Current Protocols in Immunology, Coligan et al. eds. Vol 1 pp. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto (1991); deVries et al. (1991), J. Exp. Med. 173:1205-1211; oreau et al. (1988), Nature 336:690-692; Greenberger et al. (1983), Proc Nati Acad Sci. USA 80: 2931-2938; Nordan, Measurement of mouse and human interleukin 6 , in Current Protocols in Immunology, Coligan et al. eds. Vol 1 pp. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto (1991); Smith et al., (1986), Proc Nati Acad Sci USA 83:1857-1861; Bennett et al., 1991, Measurement of human interleukin 11, in Current Protocols in Immunology Coligan et al. eds. Vol 1 pp. 6.15. 1 John Wiley and Sons, Toronto (1991); Ciarletta et al., Measurement of mouse and human Interleukin 9, in Current Protocols in Immunology Coligan et al. eds. Vol 1 pp. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto (1991) .
Ensayos para determinar las respuestas de clones de células T a antígenos (los cuales identificarán, entre otros, polipéptidos que afectan las interacciones de células APCT-T así como también efectos directos de células T midiendo la proliferación y producción de citocina) , incluyen sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan et al. eds, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3: In vitro assays for mouse lymphocyte function; Chapter 6:Cytokines and their cellular receptors; Chapter 7 : Immunologic studies in humans) (1991); Weinberger et al. (1980), Proc Nati Acad Sci USA 77:6091-6095; Takai et al. (1986), J. Immunol . 137:3494-3500; Takai et al. (1988), J Immunol. 140:508-512. Ensayos para determinar la citotoxicidad de esplenocito o timocito incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Coligan et al. eds, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans) (1991); Herrmann and Mescher (1981), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2488-2492; Herrmann et al. (1982), J. Immunol. 128:1968-1974; Handa et al. (1985), J. Immunol 135:1564-1572; Takai et al. (1986), J. Immunol. 137:3494-3500; Takai et al. (1988), J. Immunol. 140:508-512; Brown et al. (1994), J. Immunol. 153:3079-3092.
Ensayos para determinar las respuestas e isotipos de inmunoglobulina interrumpidos por células B (los cuales serán identificados, entre otros, polipéptidos que modulan respuestas anticuerpo dependientes de células T y que afectan los perfiles Thl/Th2) , incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Maliszewski (1990), J. Immunol 144:3028-3033; and Mond and Brunsv/ick, Assays for B cell function: in vitro antibody production, in Current Protocols in Imunology Coligan et al. eds . Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto (1994) . Ensayos para determinar la reacción de linfocito mezclado (MLR por sus siglas en Inglés) (los cuales identificarán, entre otros, polipéptidos que generan respuestas predominantemente Thl y CTL) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in I nmunology, Coligan et al. eds, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans) ; Takai et al. (1986), J. Immunol. 137:3494-3500; Takai et al. (1988), J. Immunol. 140:508-512; Bertagnolli et al. (1992), J. Immunol. 149:3778-3783. Ensayos dependientes de células dendrlticas (los cuales identificarán entre otros, polipéptidos expresados por células dendrlticas que activan células T nativas) , incluyen sin limitación, aquellos descritos en: Guery and Adorini (1995), J. Immunol 154:536-544; Inaba et al . (1991), J Exp Med 173:549-559; Macatonia et al . (1995), -J Immunol 154:5071-5079; Porgador and Gilboa (1995), J Exp Med 182:255-260; Nair et al. (1993), J. Virology 67:4062-4059; Huang et al. (1994), Science 264:961-965; Macatonia et al (1989), J Exp Med 169:1255-1264; Bhardwaj et al. (1994), J. Clin. Invest. 94:797-807; y Inaba et al. (1990), J Exp Med 172:631-640. Ensayos para polipéptidos que influencian etapas tempranas de reclusión y desarrollo de células T .incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Antica et al. (1994), Blood 84:111-117; Fine et al. (1994), Cell Immunol 155:111-122; Galy et al. (1995), Blood 85:2770-2778; Toki et al. (1991), Proc Nati Acad Sci. USA 88:7548-7551. Ensayos para determinar la actividad del ligando-receptor incluyen sin limitación aquellos descritos en: Current Protocole in Inznzunology Coligan et al. eds, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 7.28, Measurement of cellular adhesión under static conditions 7.28.1-7.28.22); Takai et al. (1987), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:6864-6868; Bierer et al. (1988), J. Exp. Med. 168:1145-1156; Rosenstein et al. (1989), J. Exp. Med. 169:149-160; Stoltenborg et al. (1994), J. Immunol. Methods 175:59-68; Stitt et al. (1995), Cell 80:661-670.
Ensayo genético para determinar la función utilizando animales transgénicos Se proporcionan animales transgénicos, preferiblemente ratones, que tienen múltiples copias del (los) gen (es) que corresponden a los ácido nucleicos BTL-II descritos en este documento, preferiblemente producidos por transformación de células con constructos genéticos que son establemente mantenidos dentro de las células transformadas y su progenie . Los animales transgénicos que tienen regiones de control genético modificadas que incrementan o reducen los niveles de expresión del gen, o que cambian los patrones espaciales o temporales de la expresión del gen, también se proporcionan (véase Patente Europea No. 0 649 464 Bl) . Además, se proporcionan organismos en los cuales el gen BTL-II ha sido parcialmente o completamente inactivado, a través de la inserción de secuencias extrañas en el gen correspondiente o a través de la supresión de toda o parte del gen correspondiente. La inactivación del gen parcial o completa puede ser acompañada a través de la inserción, preferiblemente seguida por escisión imprecisa de elementos transportables (Plasterk (1992), Bioessays 14 (9) : 629-633 ; Zwaal et al. (1993), Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90(16) :7431-7435; Clark et al., (1994), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 (2) : 719-722) , o a través de recombinación homologa, preferiblemente detectada por estrategias de selección genética positiva/negativa (Mansour et al. (1988), Nature 336: 348-352; Patentes Estadounidenses Nos. 5,464,764; 5,487,992; 5,627,059; 5,631,153; 5,614,396; 5,616,491; y 5,679,523). Como una alternativa, la expresión del gen BTL-II puede ser inhibida en animal transgénico o no transgénico, por introducción de un ARN de interferencia, ARN antisentido o una ribozima, la cual puede ser codificada por un ADN introducido en un animal transgénico. Los fenotipos de tales organismos pueden aclarar la(s) función(es) in vivo del gen BTL-II. Por ejemplo, una propensidad incrementada (comparada con animales de tipo nativo) en animales transgénicos que no expresan la proteína BTL-II por presentar síntomas de enfermedad inflamatoria del intestino en respuesta a la alimentación de dextran sulfato de sodio, puede indicar que BTL-II normalmente disminuye la inflamación en el intestino. Alternativamente, animales transgénicos pueden sobreexpresar BTL-II. Fenotipos de tales animales transgénicos pueden también dar pistas como en la función in vivo de las proteínas BTL-II.
Uso de Proteínas, Anticuerpos, Antagonistas y Agonistas de la Invención El sistema inmuno mucosal opera con una serie de estructuras anatómicas especializadas, las membranas mucosas, y la respuesta inmune que genera, tiene propiedades que la distinguen de una respuesta inmune generada en otros compartimientos anatómicos del cuerpo . Las membranas mocosas son solo uno de los varios compartimentos anatómicos distintos, también incluyen los nodos linfáticos y bazos, las cavidades del cuerpo, es decir, el peritoneo y la pleura, y la piel, en la cual el sistema inmune es activo. Las superficies mucosales se encuentran en los pulmones, el intestino, los ojos, la nariz, la boca, el cuello, el útero y la vagina. Una superficie mucosal es una lámina delgada o capa de tejido flexible que sirve como la cubierta o envoltura de una estructura corporal, tal como el revestimiento de la cavidad corporal, una partición o septo, o una conexión entre dos estructuras . Puesto que las superficies mucosales están la ruta de entrada para la vasta mayoría de agentes infeccioso, un adyuvante que puede promover una respuesta inmune mucosal es particularmente deseable. Janeway et al., Immunobiology :The Immune System in Health and Disease, 5th Edition, Part IV, Ch. 10, Garland Publishing, New York and London (2001) . Enfermedades infecciosas que típicamente entran a través de las superficies mucosales, tales como, por ejemplo, Neisseria cfonorrhoeae, a menudo solamente generan una respuesta inmune mucosal. Russell et al. (1999), 42(1): 58-63. El intestino es único en varias formas . Revestir el intestino es un número de formas especializadas de tejido linfoide colectivamente conocido como tejido linfoide asociado al intestino (GALT) incluye: tonsilos y adenoides, los cuales en conjunto forman el anillo Waldyer en la parte posterior de la boca; los parches Peyer en el intestino delgado; el apéndice; y folículos linfoides solitarios en el intestino grueso y recto. La activación de un linfocito por un encuentro con un antlgeno extraño en el intestino, puede conducir a la distribución de una respuesta inmune adaptiva en el antígeno a través del sistema inmune mucosal. El linfocito activado puede entrar al sistema linfático y, desde ahí, a la corriente sanguínea. La corriente sanguínea puede proporcionar linfocitos activados a sitios mucosales a través del cuerpo, el cual puede ser reconocido por los linfocitos por medio de moléculas tales como la adresina mucosal MAdCAM-1, la cual se expresa en tejido mucosal. Janeway et al. supra. El tipo de anticuerpo dominante producido por el intestino es IgA, el cual, después de la expresión, se encuentra principalmente en la capa mucosa que cubre el epitelio del intestino. Además un número de clases distintas de células T se encuentran en el intestino. Janeway et al., supra. La introducción de un antígeno extraño en el intestino usualmente conduce a la tolerancia inmunológica pero puede conducir a una respuesta inmune específica. El intestino normalmente recibe y tolera (en un sentido inmunológico) un vasto arreglo de antígenos extraños, esto es, alimento y los microorganismos comensales que residen en el intestino. La alimentación de una proteína extraña específica puede conducir a un estado de insensibilidad específica a tal proteína conocida como tolerancia oral, de manera tal que la inyección tardía de la proteína, aún en la presencia de un adyuvante, no proporciona respuestas anticuerpo. Este fenómeno puede involucrar el bazo y nodos linfáticos, así como también el sistema inmune mucosal . Véase Gutgemann et al. (1998), Immunity 8:667-73. Sin embargo, patógenos entéricos, tales como, por ejemplo, Salmonella, Yersinia, o Entamoeba histolytica, pueden provocar una respuesta inmune local o aún sistémica. Los factores que controlan si la introducción de un antígeno extraño en el intestino provoca una respuesta inmune, son incompletamente entendidos. Janeway et al., supra at Part V, Ch. 14. Muchas vacunas emplean adyuvantes para mejorar la respuesta inmune al antígeno. Un adyuvante intensifica o amplifica la especificidad de una respuesta inmune a un antígeno. La respuesta inmune puede incluir un incremento en titulador anticuerpo o un incremento en el número de células T reactivas al antígeno. Métodos para medir tales parámetros existen en la técnica. Véase por ejemplo, Zigterman et al. (1988), J. Immunol. Methods 106 (1) : 101-07. El (los) mecanismo (s) por el cual los adyuvantes incrementan una respuesta inmune no son completamente entendidos, peso su uso puede ser esencial . Existen algunas vacunas que pueden provocar una respuesta inmune mucosal intensa al antígeno seleccionado. La invención abarca un método para promover una respuesta inmune sistémica o mucosal contra un antígeno que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista BTL-II y el antígeno. Los antagonistas BTL-II que pueden ser usados para practicar la invención incluyen, anticuerpos antagonísticas o proteínas de enlace seleccionadas in vivo que se enlazan específicamente a la región extracelular BTL-II, y moléculas pequeñas que pueden inhibir la actividad biológica BTL-II. Opcionalmente, el antagonista de proteína BTL-II y el antígeno pueden ser administrados directamente a una superficie mucosal tal como oralmente, nasalmente, vaginalmente , gástricamente, o rectalmente o por inhalación. Por ejemplo, la administración nasal se ha reportado por ser más efectiva que la administración vaginal induciendo una respuesta inmune durable en al menos, un caso. Russell (2002), Am. J. Reprod. Immunol . 47 (5) : 265-68. Alternativamente, el antagonista BTL-II y/o el antígeno, pueden ser inyectados, por ejemplo, subcutáneamente, intravenosamente, intramuscularmente, intraarterialmente o intraperitonealmente . En algunas modalidades, un antagonista BTL-II, tal como un anticuerpo, puede ser . inyectado y un antígeno puede ser administrado directamente a una superficie mucosal. Antígenos apropiados para practicar la invención incluyen toda o parte de cualquier antigeno infeccioso que es similar a un agente infeccioso. Agentes infecciosos pueden incluir virus vivos o muertos, bacterias y eucariotas infecciosos tales como amibas, flagelados o helmintos. Un agente que es similar a tal agente infeccioso puede, por ejemplo, ser un virus que es análogo a un virus que puede infectar el mamífero siendo vacunado pero no puede, el mismo, infectar el animal a ser vacunado. Un ejemplo de esto es el virus de vaccinia (el cual puede producir enfermedad en vacas pero no en personas) usado por Jenner para producir una vacuna contra pox pequeño, un virus similar que produce enfermedad en humanos. Janeway et al., supra, Part V, Ch. 14. La Tabla 4 indica ejemplos específicos de antígenos que podrían ser usados para practicar la invención.
Tabla 4 Categoría de Algunos ejemplos específicos de Antígenos antígeno representativos Virus otavirus; enfermedades de la boca y pie; influenza, que incluye influenza A y B; parainfluenza; especies de Herpes (Herpes simplex, virus Epstein-Barr, pox de pollo, pseudorabias , citomegalovirus) ; rabias; polio; hepatitis A; hepatitis B; hepatitis C; hepatitis E; sarampión; mal humor; encefalomielitis equina Venezolana; virus de leucemia felina; reovirus; virus sincitial respiratorio; virus sincitial respiratorio bovino; virus de fiebre Lassa; virus de tumor polioma; parvovirus; parvovirus canino; virus del papiloma; encefalitis originada por ácaros; ictericia hematúrica; especies de rinovirus humanos; especies de enterovirus; virus del Mengo; paramixovirus; virus de bronquitis infecciosa de ave; HTLV 1; HIV-1; HIV-2; LCMV (virus coriomeningitis linfocítico) ; adenovirus; togavirus (rubiola, fiebre amarilla, fiebre del dengue) ; corona virus Bacteria Bordetella pertussis; Brucella abortis; Escherichia coli; especies de Salmonella que incluyen Salmonella typhi; streptococci; especies de Vibrio (V. cholera, V. parahaemolyticus) ,· especies de Shigella; especies de Pseudomonas; especies de Brucella; especies de Micobacterias (tuberculosis, avium, BCG, lepra); pneumococci; staphlylococci; especies de Enterobacterias; .Rochalimaia henselae; especies de Pasterurella (P. haemolytica, P. multocida) ; especies de Chlamydia (C. trachomatis, C. psittaci, Lymphogranuloma venereum) ,- Sífilis (Treponema pallidutn) ; especies de Haemophilus ; especies de Micoplasmas ; enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorf ri) ; enfermedades Legionarias; Botulismo (Colstridíum botulinum) ; Corynebacterium diphtheriae; Yersinia entercolitica Categoría de Algunos ejemplos específicos de Antígenos antígeno representati os Infecciones de Fiebre moteada de montaña Rocosa; tifus; Ricketsias Especies de Ehrlichia Parásitos y Malaria (Plamodium falciparum, P. vivax, Protozoarios P. malariae) ; equistosomas ; tripanosomas ; especies de Leishmania; nemátodos filariales; tricomoniasis ; sarcosporidiasis; especies de Tenias ( T. saginata, T. solium) ; Toxoplasma gondii; triquinelosis (Trichinella spiralis) ; coccidiosis (Eimeria species) ; helmintos que incluyen especies de Ascarus Hongos Cryptococcus neoformans; Candida albicans; Apergillus fu igatus,- coccidioidomicosis Proteínas Herpes simplex; virus Epstein-Barr; recombinantes hepatitis B; pseudorabias ; flavivirus (dengue, fiebre amarilla) ; Neisseria gonorrhoeae; malaria: proteína circumesporozoito, proteína merozoito; proteína de antígeno de la superficie; pertusis; alfavirus? adenovirus Proteínas Difteria toxoide; tétanos toxoide; proteína de la membrana exterior del meningococo (OMP) ; proteína M del meningococo; hepatitis B; hemaglutinina de influenza; antígeno cancerígeno; antígenos tumorales; toxinas; exotoxinas; neurotoxinas ; citocinas y receptores de citocinas ; monocinas y receptores de monocinas Péptidos Malaria; influenza; virus de enfermedades sintéticos de pie y boca; hepatitis B; hepatitis C Polisacáridos Polisacárido del pneumococo; poliribosil- ribitolfosfato de la influenza hemofílica (PRP) ; Neisseria meningitides ; Pseudomonas aeruginona; Klebsiella pneumoniae Oligosacáridos pneumococcal Alternativamente, las proteínas BTL-II solubles pueden ser usadas para promover la tolerancia a un antígeno que está implicado en una enfermedad autoinmune o inflamatoria. Por ejemplo, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) , una condición similar en muchos aspectos a la esclerosis múltiple, puede ser inducida en roedores por inyección de, por ejemplo, varios epitopos de proteína básica de mielina o glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG) . El EAE inducido por MOG puede, en algunos casos, ser aliviado previo a la alimentación de porciones pequeñas de MOG o butirofilina. Stefferl et al. (2000) , J. Immunol. 165:2859-65. Proteínas BTL-II solubles pueden ser co-administradas con un antígeno conocido por ser dirigido en una enfermedad autoinmune para promover la tolerancia al antígeno y con ello, aliviar los síntomas de las enfermedades autoinmunes. Opcionalmente, el antígeno puede ser administrado directamente a una superficie mucosal, por ejemplo, nasalmente. Enfermedades inflamatorias del intestino, que incluyen enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, incluyen inflamación crónica del tracto gastrointestinal, posiblemente debido a una respuesta inmune anormalmente incrementada a antígenos de la flora intestinal normal. Ambas enfermedades probablemente tienen al menos, alguna base genética puesto que las incidencias tienden a agruparse en familias y pueden ser asociadas con algunos marcadores genéticos. Por ejemplo, ratones que no expresan el gen de resistencia al fármaco múltiple (mdrla) , espontáneamente desarrollan colitis.
Panwala et al. (1998), J. Immunol . 161:5733-44. La incidencia de enfermedades tanto de Crohn y colitis ulcerativa es probablemente también influenciada por factores ambientales debido a que la incidencia incrementada se observa entre poblaciones urbanizadas. También, tales enfermedades no ocurren en la ausencia de flora intestinal normal. La enfermedad de Crohn involucra una inflamación anormal de cualquier porción del tracto alimentario desde la boca al ano, aunque en la mayoría de los pacientes, la inflamación anormal está confinada a las regiones ileocólicas, del intestino delgado y colónico-anorectal . Típicamente, la inflamación es discontinua. Los síntomas comunes incluyen dolor abdominal, anorexia, pérdida de peso, fiebre, diarrea, plenitud y/o sensibilidad en el cuadrante inferior derecho del abdomen, constipación, vómito e incomodidad y descarga perianal. Otros síntomas posibles incluyen artritis periférica, retardo de crecimiento, episcleritis, estomatitis aftosa, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, piedras del riñon, dilución urinaria deteriorada y alcalinización, malabsorción y cálculos biliares, entre otros. Véase por ejemplo, Strober et al., Medical Immunology, 10a Edition, Section III, Ch. 35(2001); Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th Edition, Section 3, Ch. 31(1999). Los macrófagos aislados de pacientes con enfermedad de Crohn, producen cantidades incrementadas de IL-12, IFNy, T Fa, y otras citocinas inflamatorias . La colitis ulcerativa, aunque es algunas veces difícil distinguir de la enfermedad de Crohn, es distinta de la enfermedad de Crohn en varios aspectos. Primero, está limitada de manera general con el colon, mientras la enfermedad de Crohn puede originarse a través del tracto alimentario. Segundo, la colitis ulcerativa involucra principalmente inflamación solamente de las capas superficiales del intestino, distinta de la enfermedad de Crohn, en la cual la inflamación puede penetrar de todas formas a través de la pared del intestino a otra ubicación en el tracto alimentario. Finalmente, la colitis ulcerativa típicamente involucra un área continua de inflamación, distinta de los sitios discontinuos de inflamación típica de la enfermedad de Crohn. Como la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa se encuentra principalmente en áreas urbanas. También, los factores genéticos probablemente juegan un papel en la colitis ulcerativa, puesto que existe una agregación familiar de casos . Los anticuerpos son observados en pacientes con colitis ulcerativa más a menudo que en pacientes con enfermedad de Crohn. Los autoanticuerpos son a menudo dirigidos a componentes celulares epiteliales . Entre los más comunes están anticuerpos citoplásmicos anti-neutrofílicos con especificidades para catalasa, -enolasa y lactoferrina. En algunos casos, tales anticuerpos reaccionan cruzado con microorganismos colónicos . Los síntomas de colitis ulcerativa son variables. Pueden incluir diarrea, tenesmo, calambres abdominales, sangre y moco en las evacuaciones, fiebre, y sangrado rectal. Puede ocurrir también megacolo tóxico, una condición que potencialmente amenaza la vida en la cual el colon se dilata más allá de aproximadamente 6 centímetros y puede perder su tono muscular y/o perforarse. Otros síntomas que pueden acompañar la colitis ulcerativa incluyen, artritis periférica, espondilitis anquilosante, sacroiliitis , uveítis anterior, eritema nodoso, pioderma gangrenoso, episcleritis , hepatitis autoinmune, colangitis esclerosante primaria, cirrosis, y crecimiento y desarrollo retardado en niños. Anticuerpos o proteínas de enlace seleccionadas in vitro que se enlazan específicamente a las proteínas BTL-II, pueden ser usados para diagnosticar o predecir el comienzo de enfermedades inflamatorias del intestino. Como se ilustra en el Ejemplo 4 abajo, el BTL-II es sobre expresado en el intestino previo al comienzo de síntomas y durante la fase sintomática en un modelo de ratón de enfermedad inflamatoria del intestino. De este modo, la sobre expresión BTL-II puede indicar la existencia de enfermedad inflamatoria del intestino y puede predecir su comienzo. Anticuerpos anti-BTL-II pueden ser usados para detectar la sobre expresión BTL-II ensayando una muestra de tejido a partir del intestino de un paciente usando un ensayo ELISA u otro ensayo de base inmune conocido en la técnica. Véase por ejemplo, Reen (1994) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) , en Basic Protein and Peptide Protocols, ethods Mol. Biol. 32: 461-466. La sobre expresión puede también ser detectada por métodos a base de ácido nucleico para medir la expresión del ARm de BTL-II tal como, por ejemplo, transcripción inversa más RCP (TI-RCP) , entre otros ensayos de expresión de ARNm conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Murphy et al. (1990), Biochemistry 29 (45) : 10351-56. En otra modalidad, las proteínas BTL-II solubles de la invención, pueden ser usadas para tratar una enfermedad inflamatoria del intestino. Una proteína BTL-II soluble puede enlazarse a un receptor especifico expresado en una célula GB o una célula T, con ello, permitiendo la regulación descendente de una respuesta inmune. Tal regulación descendente puede, por ejemplo, prevenir la activación de un macrófago o una célula B por una célula CD4+ T o prevenir la activación de una célula T por un antígeno. Alternativamente, tal regulación descendente puede causar que una célula T llegue a ser enérgica cuando encuentra un antígeno al cual su receptor de células T puede enlazarse específicamente. Anticuerpos o proteínas de enlace seleccionadas in vitro, que se enlazan específicamente a BTL-II, también encuentra uso como reactivos de diagnóstico para identificar pacientes con enfermedad inflamatoria del intestino en riesgo de desarrollar enfermedad inflamatoria del intestino. Puesto que el BTL-II es sobre expresado previo al comienzo de y durante los síntomas de la enfermedad inflamatoria del intestino en un sistema de modelo de ratón (Ejemplo 4) , un nivel anormalmente alto de expresión BTL-II puede indicar la presencia de una enfermedad inflamatoria en el intestino o en alto riesgo de desarrollar una enfermedad inflamatoria en el intestino. Además, las proteínas BTL-II solubles pueden ser útiles en situaciones en donde se desea la modulación descendente de una respuesta inmune, tal como transplante (Manulay et al., 1998, Curr. Opin. Immunol. 10:532-538), enfermedad de injerto contra hospedero, rechazo al injerto, enfermedad autoinmune, terapia del gen (Hackett et al., 2000. Curr. Opin. Mol. Therap. 2:376-382) y similares. Por ejemplo, una proteína BTL-II soluble puede ser administrada antes de, aproximadamente el mismo tiempo (o ya sea brevemente antes o brevemente después) , o concurrentemente con la administración de un vector de terapia del gen a un mamífero, transplante, o como sea apropiado de otro modo, para la inmuno supresión deseada. También apropiado para tal tratamiento es un anticuerpo anti-idiotípico que imita la función de BTL-II. Un anticuerpo BTL-II agonístico, una proteína BTL-II soluble, o un anticuerpo anti-idiotípico, puede ser administrado a un paciente que sufre de una enfermedad autoinmune o inflamatoria, para disminuir el número de anticuerpos detectables, para disminuir la activación de las células efectoras, y/o disminuir o eliminar los síntomas de la enfermedad. Las enfermedades autoinmunes e inflamatorias incluyen todas las condiciones en las cuales los tejidos propios del paciente son sometidos a efectos perjuduciales causados por el sistema inmune del paciente. Tales efectos pueden ser mediados por anticuerpos y/o por la activación de células efectoras inmunes, entre otras posibilidades. Aunque la causa de las enfermedades autoinmunes e inflamatorias no son usualmente claras, una correlación entre la existencia de varias clases de infecciones y varias enfermedades autoinmunes se ha establecido en algunos casos y es un sujeto recurrente de discusión en la literatura científica. Véase por ejemplo, Corapcioglu et al. (2002), Thyroid 12:613-17; Sewell et al. (2002), Immunol . Lett . 82:101-10; Rose (1998), Semin Immunol. 10(1):5-13; Matsiota-Bernard (1996), Clin. Exp. Immunol. 104:228-35; and McMurray and Elbourne (1997), Semin. Arthritis Rheum. 26:690-701. Uno de habilidades en la técnica apreciará que los síntomas de las enfermedades autoinmunes e inflamatorias son extremadamente diversos y pueden depender de que tejidos son dirigidos por el sistema inmune del paciente. Las enfermedades autoinmunes e inflamatorias pueden ser especificas del órgano o sistémicas. Las enfermedades autoinmune e inflamatorias incluyen, por ejemplo, artritis, enfermedad de Addison, diabetes mellitus dependiente de la insulina (diabetes mellitus tipo I) , asma, síndromes de endocrinopatía poliglandular, lupus eritematoso sistémico, hepatitis activa crónica, varias formas de tiroiditis (que incluyen tiroiditis Hashimoto, síndromes de tiroiditis temporal, y enfermedad de Grave), adenohipofisitis linfocítica, falla de ovario prematuro, pioparatiroidismo idiopático, anemia perniciosa, glomerulonefritis , neutropenia autoinmune, síndrome del Buen Pastor, esclerosis múltiple, vitíligo, miastenia gravis, artritis reumatoide, escleroderma, síndrome primario de Sjogren, polimiositis , anemia hemolítica autoinmune, enfermedad inflamatoria del intestino (que incluye enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), psoriasis, artritis psoriática, dermatitis, trombocitopenia púrpura autoinmune, pénfigo vulgaris, fiebre reumática aguda, crioglobulinemia esencial combinada, y anemia hemolítica autoinmune calurosa, entre muchas otras.
Vectores y Células Hospederas La presente invención también proporciona vectores que contienen los ácidos nucleicos de la invención, así como también células hospederas transformadas con tales vectores.
Cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención puede estar contenido en un vector, el cual generalmente incluye un marcador seleccionable y un origen de replicación para propagación en un hospedero. Los vectores además incluyen secuencias reguladoras traduccionales o transcripcionales adecuadas, tales como aquellos derivados de un mamífero, microbio, viral o genes de insectos, operablemente ligado al ácido nucleico BTL-II. Ejemplos de tales secuencias regulatorias incluyen promotores transcripcionales, operadores o mejoradores, sitios de enlace ribosomal de ARNm, y secuencias apropiadas que controlan la transcripción y traducción. Las secuencias de nucleótidos son operablemente ligadas cuando la secuencia regulatoria funcionalmente se refiere al ADN que codifica la proteína objetivo. De este modo, una secuencia de nucleótido promotora es operablemente ligada a una secuencia nucleica BTL-II si la secuencia nucleótida promotora dirige la transcripción de la secuencia BTL-II. La selección de vectores adecuados para la clonación de los ácidos nucleicos BTL-II que codifican las proteínas BTL-II de esta invención, dependerá de las células hospederas en las cuales el vector será transformado, y, en donde sea aplicable, la célula hospedera a partir de la cual el polipéptido objetivo es expresado. Células hospederas adecuadas para expresión de proteínas BTL-II incluyen células procariotas, de levadura, insecto y eucariotas superiores, cada una de las cuales es discutida abajo. Las proteínas BTL-II a ser expresadas en tales células hospederas pueden también ser proteínas de fusión que incluyen regiones a partir de las proteínas heterólogas . Como se discute anteriormente, tales regiones pueden ser incluidas para permitir, por ejemplo, secreción, estabilidad mejorada, purificación facilitada, objetivo u oligomerización de la proteína BTL-II. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia señal apropiada puede ser incorporada en un vector de expresión. Una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia señal (líder secretora) , puede ser fusionada en estructura a una secuencia BTL-II de manera que la BTL-II es traducida como una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal puede ser funcional en la célula hospedera propuesta, puede promover la secreción extracelular de la proteína BTL-II. Un péptido señal heterólogo puede reemplazar la secuencia señal nativa. Ejemplos de péptidos señal funcionales en células hospederas de mamíferos que incluyen la secuencia señal para interleucina-7 (IL-7) , se describen en la Patente Estadounidense No. 4,965,195, la secuencia señal para el receptor de interleucina-2 se describe en Cosman et al. (1984), Nature 312:768); el péptido señal del receptor de interleucina-4 se describe en la Patente EP No. 0 367 56; el péptido señal del receptor de interleucina-1 tipo I se describe en la Patente Estadounidense No. 4,968,607; el péptido señal del receptor de interleucina-1 del tipo II se describe en la Patente EP No. 0 460 846; la secuencia señal del IgK humano (la cual es METDTLLLWVLLLWVPGSTG) ; y la secuencia señal de la hormona de crecimiento humano (la cual es ATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA) . Preferiblemente, la secuencia señal será escindida a partir de la proteínas BTL-II después de la secreción de la proteína BTL-II de la célula. Otras secuencias señal que pueden ser usadas en la práctica de la invención incluyen el factor-a de levadura y el líder de melatina de miel de abeja en células de insecto Sf9. Brake (1989), Biotechnology 13:269-280; Homa et al. (1995), Protein Exp. Purif. 6141-148; Reavy et zal . (2000), Protein Exp. Purif. 6:221-228. Células hospederas adecuadas para expresión de las proteínas de la invención incluyen células procariotas, de levadura y eucarióticas superiores . Los hospederos procarióticos adecuados para ser usados para la expresión de estos polipéptidos incluyen bacterias del género Escherichia, Bacillus y Salmonella, así como también elementos del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus . Para expresión en células procarióticas , por ejemplo, en E. coli, la molécula de polinucleótido que codifica la proteína BTL-II preferiblemente incluye un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante . La Met N-terminal puede ser opcxonalmente escindida del polipéptido expresado. Vectores de expresión para uso en hospederos celulares comprenden de manera general uno o más genes marcadores fenotípicos seleccionables. Tales genes codifican por ejemplo, una proteína que confiere resistencia antibiótica o que proporciona un requerimiento auxotrófico. Una amplia variedad de tales vectores son fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales. Ejemplos incluyen vectores pGEM (Promega) , vectores pSPORT y vectores pPROEX (In Vitrogen, Life Technologies Carlsbad, CA) , vectores Bluescript (Stratagene) y vectores pQE (Qiagen) . El BTL-I.I puede también ser expresado en células hospederas de levarura a partir de géneros que incluyen Saccharomyces, Pichia, y Kluveromyces . Hospederos de levadura preferidos son S. cerevisiae y P. pastoris. Vectores de levadura a menudo contendrán un origen de secuencia de replicación a partir de un plásmido de levadura de 2 µ, una secuencia autónomamente de replicación (ARS) , una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de la transcripción, y un gen marcador seleccionadle. Vectores replicables en tanto levadura como E. coli (llamados vectores lanzadera) , pueden también ser usados. Además de las características mencionadas anteriormente de vectores de levadura, un vector de lanzadera también incluirá secuencias para replicación y selección en E. coli. La secreción directa de los polipéptidos objetivo expresados en hospederos de levadura puede estar acompañada por la inclusión de secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia líder del factor-a de levadura en el extremo 5' de la secuencia de nucleótido que codifica para BTL-II. Brake (1989), Biotechnology 13:269-280. Pueden también ser usados sistemas de cultivo de células hospederas de insecto para la expresión de proteínas BTL-II. Las proteínas de la invención son preferiblemente expresadas usando un sistema de expresión de baculovirus, como se describe por ejemplo, en la revisión por Luckow and Súmmers ((1988), BioTechnology 6:47). Las proteínas BTL-II de la invención, pueden ser expresadas en células hospederas de mamífero. Ejemplos no limitantes de líneas celulares hospederas de mamífero adecuada incluyen la línea COS-7 de células de riñon de mono (Gluzman et al. (1981), Cell 23:175-182), células de ovario de Hámster Chino (CHO) (Puck et al. (1958), PNAS USA 60:1275-1281), CV-1 (Fischer et al. (1970), Int. J. Cáncer 5:21-27) y células de carcinoma cervical humano (HELA) (ATCC CCL 2) . La elección de un vector de expresión adecuado para expresión de proteínas BTL-II de la invención dependerá de la célula hospedera específica del mamífero a ser usada. Ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen ADNpc3. l/Hygro+ (Invitrogen) , pDC409 (McMahan et al. (1991), EMBO J. 10:2821-2832) , y pSVL (Pharmacia Biotech) . Vectores de expresión para uso en células hospederas de mamífero incluyen secuencias de control transcripcional y traduccional derivadas de genomas virales. Secuencias promotoras comúnmente usadas y secuencias mejoradoras que pueden ser usadas para expresar BTL-II incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas de citomegalovirus humano (CMV) , Adenovirus 2, virus Polioma, y virus de Simio 40 (SV40) . Métodos para la construcción de vectores de expresión de mamífero se describen por ejemplo, en Okayama and Berg ((1982) Mol. Cell . Biol. 2:161-170), Cosman et al. ((1986) Mol. immunol. 23:935-941), Cosman et al. ((1984) Nature 312:768-771), documentos EP-A-0367566 y WO 91/18982. La modificación de una molécula de ácido nucleico BTL-II para facilitar la inserción en un vector particular (por ejemplo, modificando sitios de restricción) , fácil de usar en el sistema de expresión particular u hospedero (por ejemplo, usando codones hospederos preferidos), y similares, se conoce y está contemplada para uso en la invención. Métodos de ingeniería genética para la producción de proteínas BTL-II incluyen, la expresión de las moléculas de polinucleótido en los sistemas libres de expresión celular, en un hospedero celular, en tejidos y en modelos animales, de conformidad con los métodos conocidos.
Métodos Terapéuticos "Tratamiento" de cualquier enfermedad mencionada en este documento, abarca un alivio de al menos un síntoma de la enfermedad, una reducción en la severidad de la enfermedad, o el retardo o prevención del progreso a síntomas más serios que pueden, en algunos casos, acompañar la enfermedad o al menos otra enfermedad. La necesidad de tratamiento no significa que la enfermedad sea totalmente curada. Un agente terapéutico útil necesita solamente reducir la severidad de una enfermedad, reducir la severidad de síntoma (s) asociados con la enfermedad o su tratamiento, o retardar el comienzo de síntomas más serios o una enfermedad más seria que puede ocurrir con alguna frecuencia después de las condiciones de tratamiento. Por ejemplo, si la enfermedad es una enfermedad inflamatoria del intestino, un agente terapéutico puede reducir el número de distintos sitios de inflamación del intestino, la extensión total del intestino afectado, reducir el dolor y/o inflamación, reducir síntomas tales como diarrea, constipación, o vomito y/o prevención de la perforación del intestino. Una condición de paciente puede ser evaluada por técnicas estándares tal como rayos X realizados después de un enema de bario o enteroclisis, endoscopía, colonoscopía y/o una biopsia. Procedimientos adecuados pueden variar de conformidad con la condición y síntomas del paciente.
La invención abarca un método de tratamiento de enfermedades inflamatorias, que incluye enfermedades autoinmunes, enfermedad de injerto contra hospedero y enfermedades inflamatorias del intestino, usando una cantidad de una proteína BTL-II o anticuerpo por un tiempo suficiente para inducir un mejoramiento sostenido sobre la línea base de un indicador que refleja la severidad de un trastorno particular o la severidad de síntomas causados por el trastorno o retardar o prevenir el comienzo de una enfermedad más seria que sigue a la condición tratada en algunos o todos los casos. Los tratamientos de la invención pueden ser usados antes, después o durante otros tratamientos para el trastorno en cuestión que son comúnmente usados, o pueden ser usados sin otros tratamientos. Por ejemplo, la enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa son comúnmente tratadas con sulfasalizina, ácido 5-aminosalisílico o corticoesteroides . Estos tratamientos pueden ser usados antes, durante o después de los tratamientos de la invención. Cualquiera de los agentes terapéuticos antes descritos pueden ser administrados en la forma de una composición esto es, con uno o más componentes adicionales tales como un portador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Por ejemplo, una composición puede comprender una proteína BTL-II soluble como se describe en este documento más un amortiguador, un antioxidante tal como ácido ascórbico, un polipéptido de bajo peso molecular (tal como aquellos que tienen menos de 10 aminoácidos) , una proteína, aminoácidos, carbohidratos tales como glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutationa y/u otros estabilizadores, excipientes y/o preservativos. La composición puede ser formulada como un líquido o un liofilizado. Ejemplos adicionales de componentes que pueden ser empleados en formulaciones farmacéuticas se representan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ava Ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pa. , (1980). Las composiciones que comprenden moléculas terapéuticas descritas anteriormente pueden ser administradas por cualquier medio apropiado que incluye, pero no se limita a, administración parenteral, tópica, oral, nasal, vaginal, rectal o pulmonar (por inhalación) . Si se inyecta, la composición (es) puede ser administrada intra-articularmente, intravenosamente, intraarterialmente, intramuscularmente , intraperitonealmente o subcutáneamente por inyección de bolo o infusión continua. Se contempla administración localizada esto es, al sitio de la enfermedad, como son liberación transdérmica y liberación sostenida de implantes, parches para la piel o supositorios. El suministro por inhalación incluye, por ejemplo, inhalación nasal u oral, uso de un nebulizador, inhalación en forma de aerosol y similares. Se puede lograr la administración vía un supositorio insertado en una cavidad corporal, por ejemplo, insertando una forma sólida de la composición en una cavidad corporal escogida y dejarla disolverse. En el caso de las proteínas BTL-II solubles o agonistas para tratar una enfermedad inflamatoria del intestino, la administración vía un supositorio rectal para ser particularmente apropiada puesto que localiza apropiadamente el terapéutico. Otras alternativas incluyen gotas para ojos, preparaciones orales tales como pildoras, pastillas, jarabes y gomas mast cables, y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, atomizadores y ungüentos. En la mayoría de los casos, las moléculas terapéuticas que son polipéptidos pueden ser administradas tópicamente o por inyección o inhalación. Las moléculas terapéuticas descritas anteriormente pueden ser administradas en cualquier dosificación, frecuencia u duración que puede ser efectiva para tratar la condición a ser tratada. La dosificación depende en la naturaleza molecular de la molécula terapéutica y la naturaleza del trastorno a ser tratado. El tratamiento se puede continuar como sea necesario para lograr los resultados deseados. Las moléculas terapéuticas de la invención pueden ser administradas como una dosificación solo o como una serie de dosificaciones proporcionadas periódicamente, que incluyen dosificaciones varias veces por día, diaria, cada tercer día, dos veces a la semana, tres veces por semana, semanalmente, cada tres semanas y mensualmente, entre otros regímenes de dosificación posibles . La periodicidad del tratamiento puede o no puede ser constante a través de la duración del tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento puede inicialmente suceder a intervalos semanalmente y después puede suceder cada tres semanas . Los tratamientos que tienen duraciones de días, semanas, mese o años son abarcados por la invención. El tratamiento puede ser interrumpido y después restaurado. Las dosis de mantenimiento pueden ser administradas después de un tratamiento inicial. La dosificación puede ser medida como miligramos por kilogramo de peso corporal (mg/kg) o como miligramos por metro cuadrado de superficie de piel (mg/m2) o como dosis fija, irrespectivo de altura o peso. Todas estas son unidades de dosificación estándares en la técnica. Un área de superficie de la piel de la persona se calcula de su altura y peso usando una fórmula estándar. La invención se ha descrito con referencia a ejemplos específicos. Estos ejemplos no son significantes para limitar la invención en cualquier forma. Se entenderá para propósitos de esta descripción, que se pueden hacer varios cambios y modificaciones para la invención que están dentro del ámbito de la invención. Pueden hacerse otros numerosos cambios los cuales serán fácilmente sugeridos estos por personas expertas en la técnica y los cuales son abarcados en el espíritu de la invención descrita en este documento, como se define en las reivindicaciones adjuntas. Esta especificación contiene numerosas citas a patentes, solicitudes de patentes y publicaciones. Cada una es incorporada en la presente por referencia para todos los propósitos .
Ejemplo 1: Aislamiento de ADNc de BTL-II humano Se aisló el AR de varias fuentes, muestras de tejido de colon humano de pacientes con la enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa, la línea celular de cáncer de colon humano Caco-2 (American Type Culture Collection (ATCC) No. HTB-37) y una línea celular epitelial de colon llamada T84 (ATCC No. CCL-248) . El ARN se sometió a transcripción inversa y se amplificó por RCP usando cebadores que se designaron en las bases de la secuencia de ácido nucleico descrita en NCBI No. de acceso NM_019602. Esto proporcionó una porción corriente arriba de las secuencias de BTL-II (SEC ID NO: 3) longitud completa y las secuencias de variante de empalme descritas en la SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 15. El aislamiento de un ADNc que contiene el extremo 3' del ARNm de BTL-II se logró usando RACE 3' (Amplificación rápida de extremos ADNc), es decir, esencialmente los protocolos de Frohman et al. ((1988), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85(23): 8998-9002). Del análisis de muchas variantes del ADNc BTL-II por RACE 3' no revela variantes que codifican proteínas solubles que carecen de un dominio de transmembrana. Como se muestra en las Figuras 5a, 6a, y 7a, muchas de las variantes contienen polimorfismo de secuencia (o variaciones alélicas) en un número de sitios en la secuencia BTL-II.
Ejemplo 2: Aislamiento de ADNc de BTL-II murino Se aisló ADNc de BTL-II murino como sigue. Se aisló ARN de colon de murino e intestino delgado usando el kit RNeasy (Qiagen) y se trató con ADNse I (Ambion) , de conformidad con las recomendaciones del fabricante, para eliminar ADN cromosomal residual . El ARN purificado se sometió a transcripción en ADNc, usando una mezcla de reacción que contiene ARN aislado en 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCL, 5 mM MgCl2, 1 mM de cada un dNTP, 2.5 µ? de cebadores de hexámeros aleatorios, 1 ?/µ? de inhibidor de ARNse y 2.5 U/µ? de Transcriptasa Inversa MuLV (PE Biosystems) . La mezcla de reacción se incubó por 10 minutos a 25 °C, seguido por 30 minutos a 48 °C, seguido por 5 minutos a 95°C. Las reacciones de amplificación RCP para el gen BTL-II se realizaron en un volumen final de 100 µ? que contiene 10 mM Tris-HCl, pH 8.3 , 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl2, 200 µ? cada un dNTP y 2.5U polimerasa de ADN ampliTaq (Perkin Elmer) y 25 pmol de ambos cebadores corriente arriba (5'-TTACTGAGAGAGGGAAACGGGCTGTTTTCTCC) y corriente abajo (5' -GGACTTCATTGGTGACTGATGCCATCCAC) . Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo por 35 ciclos de 40 segundos a 94°C, 40 segundos a 55°C, y 40 segundos a 72°C. Los productos de amplificación se analizaron en un gel de agarosa al 2%, se visualizaron por bromuro de etidio, y se secuenciaron. Para estimulación visual, las variantes de empalme que carecen del exón 3 (Figura 9a) fueron más abundantes que las variantes que contienen exones 1 a 8 (Figura 8) .
Ejemplo 3: Expresión de BTL-II en Células y Tejidos de Varias Fuentes La expresión de AR m de BTL-II se midió usando esencialmente RCP de tiempo real de conformidad con los protocolos de Heid et al. ((1996), Genoma Res. 6(10): 986-94) y usando transcripción de fase inversa seguido por RCP (RT-RCP; véase, por ejemplo, Fuqua et al. (1990), Biotechniques 9(2): 206-11). Todos los tipos de células probadas fueron de origen humano excepto las células dendríticas DCllc+ CD8+ B220+ (o plasmacitoide) de parches Peyer las cuales son de ratones . Las células en las cuales se detectó la expresión BTL-II, fueron las siguientes. células B humanas, no estimuladas o estimuladas con Staphylococcus aureus sacrificadas, ligando CD40 e interleucina 4; células epiteliales bronquiales humanas normales (células HBE; véase Lechner et al. (1983), Cáncer Res. 43 (12 pt. 1): 5915-21) estimuladas con interferon ?; células Calu-3, una línea celular epitelial de pulmón (ATCC No. HTB-55) , no estimuladas; células T84, una línea celular epitelial de colon humana, estimulada o no estimulada con interferon ?; células Caco-2, una línea celular de cáncer de colon humana, no estimulada; células CDllc+ (baja expresión) CD8+ B220+ de parches Peyer de murino, las cuales son predominantemente células dendríticas; y leucocitos sanguíneos periféricos de murino. La expresión, en una escala absoluta, fue menor en más células probadas. La expresión de AKNm de BTL-II no se detectó en células dendríticas que resultaron de tratamiento in vivo de monocitos sanguíneos periféricos humanos por inducir la diferenciación en un tipo celular dendrítico. Sin embargo, la expresión BTL-II se detectó en células dendríticas plasmacitoides CD123+ purificadas de sangre humana purificada de sangre periférica humana. El ARNm de BTL-II es altamente enriquecido en la subserie CDllc+ CD8+ B220+ de células dendríticas murino de parches Peyer. Expresiones de ARNm de BTL-II se detectó en un número de tipos de tejido murino por métodos similares que incluyen bazo, nodo linfático, estómago, nodos linfáticos mesentéricos, médula ósea, intestino delgado, intestino ciego, pulmón, intestino grueso, parche Peyer y timo. Los altos niveles de expresión se detectaron en intestino delgado, parche Peyer y tejido ciego.
Ejemplo 4: Expresión de BTL-II en un Modelo Murino para determinar la Enfermedad Inflamatoria del Intestino Los ratones Mdrla -/- pueden ser un sistema modelo para el estudio de enfermedad crónica inflamatoria del intestino. Panwala et al. (1998), J. Immunol. 161: 5733-44. El gen de resistencia a fármacos múltiples de murino, mdrla, que codifica para una proteína de transmembrana de 170 kDa que es expresada en muchos tejido que incluyen células epiteliales intestinales y células linfoides. Los ratones deficientes en mdrla son susceptibles a desarrollar varias inflamaciones intestinales espontáneas caracterizadas por crecimiento celular epitelial desregulado e infiltración de leucocito masivo en la lámina propia del intestino grueso. Tratando ratones mdrla -/- con anticuerpos orales se previene tanto el desarrollo de la enfermedad como se resuelve la inflamación activa. Las células linfoides aisladas de ratones con colitis activa demuestran reactividad mejorada para antigenos bacterianos intestinales . Aunque el mdrla es expresado por tanto células epiteliales como leucocitos, el desarrollo de colitis se correlaciona con la carencia de la expresión mdrla en células epiteliales. Los ratones mdrla -/- usados tiene un antecedente genético FVB. Típicamente, aproximadamente 20% de un grupo de ratones mdrla -/- espontáneamente desarrollaron colitis de 18 hasta 20 semanas de edad, mientras el resto de los ratones en la colonia mdrla -/- permanecieron saludables y no desarrollaron colitis. El porcentaje de animales que desarrollaron enfermedad depende en la limpieza de la instalación del animal . Inicialmente, el ARN se preparó de tejido intestinal y, después de la transcripción inversa que incorpora una etiqueta fluorescente en el ADNc resultante, usada para hibridizar una serie de sondas en un chip Affymetrix habitualmente preparado que contiene un oligonucleótido designado para detectar el AR m de BTL-II basado en la secuencia publicada por Stammers et al. ((2000), Immunogenetics 51: 373-82) . La sobreexpresión de ARNm de BTL-II se detectó en ratones mdrla -/- (con relación a individuos de tipo nativo de la cepa FVB) ambos antes del comienzo de los síntomas de la enfermedad inflamatoria intestinal y durante los síntomas. Una muestra de tales datos se muestra en la Figura 10. Estos datos muestran que el ARNm de BTL-II se expresa a una mayor extensión en ratones mdrla -/- que en ratones FVB de tipo nativo. Sin embargo, incluso la expresión alta de ARNm de BTL-II acompaña el comienzo de síntomas de la enfermedad inflamatoria intestinal. Estos resultados se confirman por análisis del mismo ARN usando una técnica de RCP en tiempo real (Heid et al. (1996), Genome Res. 6(10): 986-94). Este análisis muestra sobreexpresión de ARNm de BTL-II por dos ratones mdrla -/-sintomáticos con relación a dos ratones FVB de tipo nativo saludables . Estos datos son representados en el diagrama en la Figura 11. Los dos ratones parenterales son representados por las dos barras elaboradas con rayas diagonales hacia la izquierda de la Figura 11, y los dos mdrla -/- sintomáticos son representados por las dos barras con patrones de verificación hacia la derecha de la Figura 11. Estos datos indican que existen aproximadamente unas 2 a 5 veces de diferencia en la expresión entre los ratones de tipo nativo y los ratones mdrla -/- sintomáticos. Así, los niveles elevados de ARNm de BTL-II son expresados en ratones con síntomas de la enfermedad inflamatoria intestinal que en los ratones de tipo nativo sin síntomas .
Ejemplo 5: Construcción de una Proteína de Fusión BTL-II: Fe Se produjo una proteína BTL-II soluble que consiste de la región extracelular de BTL-II murino fusionada a una región Fe humana (BTL-II: Fe) en la siguiente forma. Se preparó un constructo ADNc de fusión que codifica para BTL-II: Fe por fusión de ácidos nucleicos que codifican para la región extracelular de BTL-II murino a ácidos nucleicos que codifican para un IgGl humano (en estructura) . Para producir la proteína BTL-II:Fc, las células de mamífero se transíectaron con el constructo de ADNc de fusión usando el método de transfección LIPOFECTAMINA™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) . Las proteínas BTL-II: Fe que contienen sobrenadantes, fueron cosechadas 6-7 días posteriores a la transfección, y la proteína BTL-II: Fe se purificó por cromatografía en columna de Proteína A. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína BTL-II: Fe y la secuencia de aminoácido BTL-II: Fe, se encuentra en la SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 20, respectivamente.
Ejemplo 6: Supresión de la Proliferación de Células T Humanas por BTL-II: Fe Los siguientes experimentos prueban si una forma soluble de BTL-II puede suprimir la proliferación de células T in vitro en respuesta a un anticuerpo anti-CD3c monoclonal con o sin otras moléculas coestimulatorias . El BTL-II: Fe se hizo como se describe en el Ejemplo 5. Se revistió una placa micro i uladora de fondo en U de 96 cavidades, con concentraciones variantes de anticuerpo anti-CD3s con o sin una o más de otras proteínas. La Figura 12 indica que proteínas fueron usadas en cada muestra como sigue: anticuerpo anti-CD3e solo, z=a ; anticuerpo anti-CD3e y BTL-II:Fc, ESS?I ; anticuerpo anti-CD3e y B7RP-l;Fc, anticuerpo anti-CD3e, B7RP-l:Fc y BTL-II: Fe, E£3|; anticuerpo anti-CD3s y B7-2:Fc, HH ; anticuerpo anti-CD3s, B7-2:Fc y BTL-II:Fc, . La B7RP-l:Fc consiste de la región extracelular de B7RP-1 (también conocida como B7h) fusionada a una región Fe de un anticuerpo, y B7-2:Fc consiste de la región extracelular de B7-2 fusionada a una región Fe de un anticuerpo. Ambas de estas proteínas son elementos de la familia B7 de proteínas conocidas por modular respuestas de células T a antígenos . Estas proteínas de fusión pueden ser adquiridas de vendedores comerciales tales como, por ejemplo, R & D Systems (Minneapolis , Minnesota, USA), o pueden ser aisladas como se describe en el Ejemplo 5 para la proteína BTL-II:Fc. La B7-2 se adquirió de R & D Systems, y la B7RP-1 se elaboró esencialmente como se describe en el Ejemplo 5, aunque también está disponible de R & D Systems bajo el nombre B7-H2/Fc. Las cavidades de la placa microtituladora se revistieron agregando 100 µ? de salina amortiguada de fosfato (PBS) que contiene la concentración del anticuerpo anti-CD3e indicada en la Figura 12 con o sin una o más de otras proteínas, esto es BTL-II:Fc (10 ug/ml) , B7RPl:Fc (10 ug/ml) , y/o B7-2:Fc (2 g/ml) . Las placas se incubaron a 4°C durante la noche y después se lavaron dos veces con PBS. Las células T humanas se purificaron de células mononucleares sanguíneas periféricas humanas usando un kit de aislamiento de células T CD4+ de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania) , el cual funciona por etiquetación magnética y reducción de células sanguíneas periféricas distintas a células T CD4+, que resulta en la población relativamente pura de células T CD4+ íntegras . Se agregaron aproximadamente 1 x 105 de células T purificadas a cada cavidad en un volumen de 200 µ? de medio de cultivo (RPMI con suero de bovino fetal al 10%) . Las células se incubaron por un total de 72 horas. A las 64 horas, se agregó 1 µ?? de 3H-timidina a cada cavidad. Al final de las 72 horas, se removió timidina sin incorporar usando un cosechador celular automático (obtenido de Tomtec, Hamden, Connecticut, USA) , el cual depositó las células en un filtro y se lavaron lejos del medio de cultivo. Los filtros con las células en ellos después se contaron en un contador de escintilación para determinar cuanta radioactividad han incorporado las células . Estos resultados se muestran en las Figuras 12a y 12b, las cuales difieren solamente en que la Figura 12a tiene una escala logarítmica y la Figura 12b tiene una escala lineal . Estos resultados indican que la BTL-II:Fc puede suprimir la proliferación de células T inducidas por anticuerpo anti-CD38. La Figura 12a y 12b. En la Figura 12a, las muestras que contienen BTL-II más anticuerpo anti-CD3e ) prolifera menos de las muestras que contienen solamente el anticuerpo 3?^-0?3e ( L==J ) probadas a las altas concentraciones de anticuerpo. Sin embargo, está claro que tanto B7-2 ( BB ) como B7RP-1 ( ) estimulan la proliferación de células T inducidas por el anticuerpo anti- D3s. La concentración de anticuerpo anti-CD3 requerida para observar un efecto en la proliferación de células T por adición de B7-2:Fc es menor que aquel requerido para observar un efecto similar por adición de B7RP-l:Fc. Además, la BTL-II puede también suprimir esta proliferación de células T incrementada en respuesta a la adición de B7-2:Fc ('[f:f::l|) y B7RP-l:Fc (¡SH3) . El efecto de BTL-II: Fe en la proliferación inducida por B7-2:Fc más anticuerpo anti-CD3s es evidente solamente a la concentración más baja de anticuerpo anti-CD3e probada, mientras que los efectos de BTL-II: Fe en la proliferación inducida por B7RP-l:Fc son más aparentes en las tres concentraciones más altas de anticuerpo anti-CD3£ probados. De este modo, los efectos observados dependen de la concentración de anticuerpo anti-CD3e. La Figura 13 muestra que la supresión de la proliferación de células T humanas por BTL-II: Fe es también dependiente de la concentración de BTL-II: Fe. El experimento se realizó como se describe anteriormente excepto que la concentración del anticuerpo anti-CD38 permanece constante a 0.5 g/ml. La concentración de BTL-II varia de 0 hasta 10 µ /??1, como se indica en la Figura 13. Los resultados mostrados en la Figura 13 indican que la supresión de proliferación de células T inducida por anti-CD3s depende de la concentración de BTL-II: Fe.
Ejemplo 7: BTL-II:Fc Suprime la Proliferación de Células T de Murino Este experimento se realizó para determinar si BTL-II: Fe puede suprimir la proliferación de murino, sí como de células T humanas . Se realizó un ensayo de proliferación de células T como esencialmente se describe en el Ejemplo 6 excepto que las células T purificadas usan microperlillas magnéticas de Miltneyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Alemania) se usaron en lugar de células T humanas . Una protelna que consiste de una región Fe humana, la cual se elaboró en células CHO transíectadas , sirve como un control. Las cavidades se revistieron con ya sea anticuerpo anti-CD38 solo (? 1) a las concentraciones indicadas en la Figura 14 o con anticuerpo a ti-CD3e más ya sea BTL-II:Fc ( ) µg/ml o la proteína que consiste de una región Fe humana 1-4-1) a 10 g/ml. Los resultados indican que BTL-II:Fc, pero no una protelna que consiste de una región Fe humana sola, puede suprimir la proliferación de células T de murino en respuesta al anticuerpo anti-CD3s de la Figura 14.
Ejemplo 8: BTL-II:Fc No Suprime la Proliferación de Células B de Murino Se designan los siguientes experimentos para determinar si la BTL-II:Fc humana puede inhibir la proliferación de células B de murino por TALL-1 y un anticuerpo IgM. El experimento se realizó esencialmente como se describe por Khare et al . ( (2000) , Proc . Nati . Acad. Sci . 97 (7) : 3370-75 ) . Brevemente , se purificaron las célula B de murino de bazos , primero purificando linfocitos por centrifugación de gradiente de densidad y después haciendo pasar los linfocitos sobre una columna de células B, la cual remueve monocitos/macróf gos y células CD4+ y CD8+ (Cedarlane , Westbury, ?G?) . Se incubaron aproximadamente 1 x 105 células B purificadas en MEM más suero de bovino fetal inactivado por 4 días a 37 °C en una placa de microlitro de 96 cavidades con o sin IgM anti-ratón F (ab' ) 2 de cabra (2 g/ml) , TALL-l de humano (10 ng/ml) , y/o BTL-II : Fc (10 µg/ml) . Se agregó 3H-timidina ( 1 Ci) durante las últimas 8 horas de incubación . Las células se cosecharon como se describe en el Ejemplo 6 al final del día 4 y se contaron en un contador de escintilación . Las marcas en la Figura 5 indica las siguientes combinaciones de células y proteínas : células B solas, I I (Esta es la barra más a la izquierda en la gráfica mostrada en la Figura 15, pero no existe señal detectable) células B más TALL-l, células B más anticuerpo anti-igM, células B más TALL-l y anticuerpo anti-IgM, y células B más TALL-l, anticuerpo anti-IgM, y BTL-II:Fc, MSI . Los resultados indican que la BTL-II:Fc no tiene efecto en la proliferación de células B inducida por TALL-l y anticuerpo anti-IgM. Figura 15. Por lo tanto, la BTL-II parece inhibir la proliferación de células T, pero no de células B .
Ejemplo 9: Efectos de BTL-II:Fc en la Producción de Citocina por Células T El siguiente experimento se dirigió para determinar si la BTL-II:Fc tiene efectos en la producción de citocina por células T. Las células T se purificaron y las cavidades de la placa microtituladora se revistieron con proteínas como se describe en el Ej emplo 6. Se agregaron aproximadamente 1 x 105 células a cada cavidad en un volumen de 200 µ? del medio (RPMI con suero de bovino fetal al 10%) . Las células se incubaron por 64 horas a 37°C. Después se removió 150 µ? para determinar la concentración de citocina, y se agregó 1 µ? de 3H-timidina a los restante 50 µ? en cada cavidad. La placa microtituladora después se dejó incubar por 8 horas adicionales a 37 °C y después se lavó y se contó como se describe en el Ejemplo 6 para determinar diferencias en la proliferación (mostrado en la Figura 16a) . Las marcas usadas para indicar cuanta proteína se usó para revestir la cavidad son como en las Figuras 12a y 12b (explicado en el Ejemplo 6) . Se determinaron las concentraciones de gama interferon (IFNy) , interleucina 2 (IL2) , e interleucina 5 (IL5) usando un sistema de inmunoensayo basado en electroquímica para detecciones simultáneas de citocinas múltiples vendidas por Meso Scale Discovery (MSD, Gaithersburg, Maryland, USA, la cual está afiliada con IGEN International, Inc.). Se explican los principios y operaciones de este tipo de sistema de detección de citocina, en por ejemplo, Sennikov et al. (2003), J. Immunol . Methods 275: 81-88. Las unidades para las cantidades de citocina se toman de las lecturas generadas por la máquina MSD. Las concentraciones actuales de citocina en el medio no pueden ser determinadas de estos datos sin comparación para generar una curva estándar con una proteína de concentración conocida, la cual no puede acompañar este experimento particular. Sin embargo, las comparaciones entre las lecturas dentro de un experimento sencillo pueden proporcionar cantidades relativas de citocina presente en el control contra las muestras experimentales. Los resultados se muestran en las Figuras 16a-16d. La Figura 16a indica que la BTL-II:Fc inhibe la proliferación en respuesta al anticuerpo anti-CD3s o anticuerpo anti-CD3e más B7RP-l:Fc, pero no en respuesta al anticuerpo anti-CD3e más B7-2:Fc a las concentraciones de anticuerpo anti-CD3a usado. Sin embargo, como se notó en el Ejemplo 6 (Figuras 12a y 12b) , a concentraciones de anticuerpo anti-CD3e bajas, es decir, 0.1 pg/ml, la proliferación celular en respuesta al anticuerpo anti-CD3e más B7-2:Fc es inhibida por BTL-II:Fc. La producción de IFNy, IL2 e IL5 fue baja en las cavidades revestidas con anticuerpo anti-CD3e solo, y la adición de BTL-II:Fc no se incrementa además, significantemente. Figuras 16b-16d. Se inhibió la producción de IFNy incrementada en respuesta a la adición de ya sea B7RP-l:Fc o B7-2:Fc para un anticuerpo anti-CD3£ por BTL-II:Fc. Figura 16b. Además, se inhibió la producción de IL2 e IL5 incrementada en respuesta a la adición de B7-2:Fc al anticuerpo anti-CD3e por BTL-II: Fe. Figuras 16c y 16d. En las concentraciones probadas, la adición de B7RP-l:Fc al anticuerpo anti-CD3e no incrementa apreciablemente la producción de IL2 o IL5. Figuras 16c y 16d. Estos resultados indican que la BTL-II puede inhibir la producción de al menos algunas citocinas en respuesta a una combinación del anticuerpo anti-CD3s más ya sea B7-2:Fc o B7RP-1:FC.
Ejemplo 10: El Tratamiento de Células T con BTL-II: Fe No Resulta en la Muerte Celular Masiva Se realizó el siguiente experimento para determinar si la inhibición de la proliferación de células T por BTL-II: Fe involucra la muerte celular masiva. Se realizó un ensayo de proliferación de células T esencialmente como se describe en el Ejemplo 6, excepto que las células no se etiquetaron con 3H-timidina. Las células se contaron en un homocitómetro después de 72 horas de cultivo, y se determinó la viabilidad celular por teñido de azul tripano. Se indican las proteínas usadas para revestir las cavidades de la placa microtituladora en la Figura 17 como se explica en el Ejemplo 6 y se muestra en las Figuras 12a y 12b. El anticuerpo anti- D3s se usó a una concentración de 2 µg/ml. Los resultados indican que el número de células muertas en cada cavidad cae dentro del intervalo de entre aproximadamente 0.5 x 104 y 0.75 x 104 células, con respecto de las proteínas usadas para revestir las cavidades. Figura 7. Por lo tanto, las diferencias en la proliferación celular observadas en la presencia de BTL-II: Fe no reflejan un efecto tóxico sustancial de BTL-II: e.
Ejemplo 11: BTL-II murino No se enlaza a CTLA4, CD28, ICOS o PD-1 Murino La siguiente serie de experimentos dirige la cuestión de si la BTL-II se enlaza a uno o varios patrones de enlace conocidos de otras proteínas B7. Por ejemplo, la B7RP-1 se conoce por enlazarse a ICOS (Yoshinaga et al., (1999), Nature 402: 827-32), CD80 (también llamado B7-1) se conoce por enlazarse a CTLA4 y CD28, como CD86 (también llamado B7-2; véase, por ejemplo Sharoe and Freeman (2002), Nature Reviews Immunology 2: 116-26), y PD-L1 y PD-L2 se conocen por enlazarse a PD-1 (Latchman et al. (2001), Nature Immunology 2 (3) : 261-68) . Se realizó el experimento como sigue. Primero, se obtienen o se aislan las proteínas de fusión que comprenden la región extracelular de una proteína conocida por enlazarse a una proteína B7, más la región Fe de un anticuerpo IgG humano. Las proteínas de fusión comprenden una región Fe de un anticuerpo humano más la región extracelular de ya sea CD28 de murino (mCD28-huFC) o PD-1 de murino (PDl-huFC) se adquirieron de R & D Systems (Minneapolis, Minnesota, USA) . Las otras dos B7 enlazadas a proteínas (CTLA4-huFC e ICOS-huFC) están también disponibles de & D Systems, pero se elaboran como sigue. Un ADNc que codifica la región extracelular de CTLA4 de murino y otro que codifica la región extracelular de ICOS de murino, fueron cada uno fusionados a ADNc que codifica la región FC de un anticuerpo IgG humano en un vector apropiado para la expresión en células de mamífero. Cada uno de estos constructos se usaron para transfectar células, y las proteínas de fusión se purificaron del medio de cultivo de las células transfectadas por la cromatografía de la célula A. Las versiones de longitud completa de cada uno de tres ADNc de murino (que codifica BTL-II, B7RP-1, CD80) se insertaron en un vector apropiado para expresión. Aproximadamente.10 pg de cada uno de estos constructos, junto con un vector vacío, se usaron separadamente para transfectar 293 células. Dos días después de la transfección, aproximadamente un millón de células de cada una de las cuatro transfecciones se tiñeron con cada una de las proteínas de fusión como se describe anteriormente. La proteína unida se detectó usando un anticuerpo fluorescentemente etiquetado contra la región IgG Fe humana. Las células teñidas se analizaron por FACS . Los resultados se muestran en la Figura 18. Como se esperaba, las células transfectadas con el vector vacío (línea final de la Figura 18) no se tiñeron con alguna de las cuatro proteínas de fusión. Las células transfectadas con BTL-II murino (segunda línea de la Figura 18) se comporta de forma similar, que indica que ninguna de las proteínas de fusión se enlaza a BTL-II. Como se esperaba, las células transfectadas con B7RP-1 se tiñeron con ICOS-huFC, pero no con alguna de otras proteínas de fusión. También como se esperaba, las células transfectadas con CD80 de murino se tiñeron con CTLA4-huFC o mCD28-huFC, pero no con ICOS-huFC p PDl-huFC. Estos resultados indican que la BTL-II falla al enlazarse a cuatro proteínas, CTLA4, PD-1, ICOS, y CD28, cada una de los cuales se conoce por enlazarse al menos a una proteína en la familia B7 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (59)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .
1. Proteína BTL-II aislada, caracterizada porgue comprende una secuencia de aminoácido que consiste de aminoácidos x hasta y de la SEC ID NO: 4, en donde x es cualquier aminoácido de la posición 1 hasta 35 de la SEC ID NO: 4 y y es cualquier aminoácido de la posición 452 hasta 462 de la SEC ID NO: 4.
2. Protelna BTL-II de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína BTL-II comprende aminoácidos 30 hasta 453 de la SEC ID NO: 4.
3. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la proteína BTL-II comprende aminoácidos 29 hasta 457 de la SEC ID NO: 4. 4. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende aminoácidos 29 hasta 482 de la SEC ID NO:
4.
5. Proteína BTL-II aislada, caracterizada porque comprende un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica a los aminoácidos 30 hasta 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18, en donde la región de identidad de la secuencia de aminoácido está alineada con los aminoácidos 30 hasta 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18 es al menos 150 aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácido es al menos 80% idéntica a los aminoácidos 127 hasta 157 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 18, o los aminoácidos 126 hasta 156 de la SEC ID NO: 16, en donde la región de identidad de la secuencia de aminoácido alineada con los aminoácidos 127 hasta 157 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 18 o los aminoácidos 126 hasta 156 de la SEC ID NO: 16 es al menos de 20 aminoácidos de longitud, y en donde el polipéptido puede inhibir la proliferación de células T.
6. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la secuencia de aminoácido es al menos 90% idéntica a los aminoácidos 30 hasta 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18.
7. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizada porque la secuencia de aminoácido es al menos 90% idéntica a los aminoácidos 127 hasta 157 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, o SEC ID NO: 18, o los aminoácidos 126 hasta 156 de la SEC ID NO: 16.
8. Proteína BTL-II de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizada porgue comprende los aminoácidos 30 hasta 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18.
9. Proteína BTL-II aislada, caracterizada porque comprende un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica a los aminoácidos 32 hasta 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18, en donde la región de identidad de la secuencia de aminoácido alineada con los aminoácidos 32 hasta 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18 es al menos de 275 aminoácidos, y en donde el polipéptido puede inhibir la proliferación de células T.
10. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la secuencia de aminoácido es al menos 90% idéntica a los aminoácidos 32 hasta 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18.
11. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la secuencia de aminoácido comprende los aminoácidos 32 hasta 358 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18.
12. Proteína BTL-II aislada, caracterizada porque comprende un primer polipéptido que consiste de una primer secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica a los aminoácidos 32 hasta 358 de la SEC ID NO: 10, en donde la región de identidad de la primer secuencia de aminoácido alineada a la SEC ID NO: 10 es al menos de aproximadamente 175 aminoácidos de longitud. en donde la primer secuencia de aminoácido no es más de aproximadamente 390 aminoácidos de longitud, en donde el primer polipéptido puede inhibir la proliferación de células T, en donde la primer secuencia de aminoácido no es al menos 80% idéntica a los aminoácidos 148 hasta 232 de la SEC ID NO: 4 con una región de identidad de la primer secuencia de aminoácido alineada a los aminoácidos 148 hasta 232 de la SEC ID NO: 4 de al menos aproximadamente 40 aminoácidos, y en donde la proteína BTL-II no comprende una segunda secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica a los aminoácidos 148 hasta 232 de la SEC ID NO: 4 con una región de identidad de la segunda secuencia de aminoácidos alineada a los aminoácidos 148 hasta 232 de la SEC ID NO: 4 de al menos 40 aminoácidos.
13. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la primer secuencia de aminoácido no es más de aproximadamente 270 aminoácidos de longitud .
14. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 12 ó 13 , caracterizada porque la primera secuencia de aminoácido es al menos 90% idéntica a la SEC ID NO: 10.
15. Proteína BTL-II de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 14, caracterizada porque comprende los aminoácidos 32 hasta 242 de la SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 12.
16. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 1, 5, 9 ó 12, caracterizada porque además comprende un polipéptido heterologo.
17. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el polipéptido heterologo es una región Fe de un anticuerpo.
18. Fragmento inmunogénico de la SEC ID NO: 4, caracterizado porque el fragmento inmunogénico es capaz de estimular anticuerpos que se enlazan específicamente al fragmento inmunogénico, en donde el fragmento inmunogénico es al menos de 10 aminoácidos de longitud, y en donde el fragmento inmunogénico se expande a la posición 360 de la SEC ID NO: 4.
19. Fragmento inmunogénico caracterizado porque es de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14 o SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 18, en donde el fragmento inmunogénico se expande a las posiciones 141 hasta 143 de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 18, en donde el fragmento inmunogéncio es capaz de provocar anticuerpos que se enlazan específicamente al fragmento inmunogénico, y en donde el fragmento inmunogénico es al menos de 10 aminoácidos de longitud.
20. Proteína BTL-II aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácido que consiste de aminoácidos x hasta y de la SEC ID NO: 6, en donde x es cualquier aminoácido de la posición 1 hasta 35 de la SEC ID NO: 6 y y es cualquier aminoácido de la posición 450 hasta 460 de la SEC ID NO: 6.
21. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque comprende los aminoácidos 32 hasta 450 de la SEC ID NO: 6.
22. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque comprende los aminoácidos 29 hasta 456 de la SEC ID NO: 6.
23. Proteína BTL-II de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque comprende los aminoácidos 29 hasta 514 de la SEC ID NO: 6.
24. Anticuerpo aislado caracterizado porque se enlaza específicamente a una proteína BTL-II, que consiste de los aminoácidos 1 a 457 de la SEC ID NO: 4.
25. Anticuerpo aislado caracterizado porque que se enlaza específicamente a una protexna BTL-II, que consiste de los aminoácidos 1 hasta 456 de la SEC ID NO: 6.
26. Anticuerpo aislado caracterizado porque se enlaza específicamente a una proteína BTL-II, que consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: aminoácidos 1 hasta 247 de la SEC ID NO: 8; aminoácidos 1 hasta 363 de la SEC ID NO: 10, aminoácidos 1 hasta 243 de la SEC ID NO: 12, aminoácidos 1 hasta 359 de la SEC ID NO: 14, aminoácidos 1 hasta 358 de la SEC ID NO: 16, aminoácidos 1 hasta 362 de la SEC ID NO: 18.
27. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
28. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano .
29. Anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo antagonista de BTL-II.
30. Ácido nucleico BTL-II aislado, caracterizado porque comprende un polinucleótido, o su complemento, que consiste de nucleótidos x hasta y de la SEC ID NO: 3, en donde x es de los nucleótidos 1 hasta 105 y y es del nucleótido 1345 hasta 1375.
31. Ácido nucleico BTL-II de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porgue comprende los nucleótidos 105 hasta 1345 de la SEC ID NO: 3.
32. Ácido nucleico BTL-II de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende los nucleótidos 1 hasta 1371 de la SEC ID NO: 3.
33. Ácidos nucleico BTL-II aislado o su complemento, caracterizado porque el ácido nucleico BTL-II codifica la proteína BTL-II o fragmento inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 23.
34. Vector, caracterizado porque comprende el ácido nucleico BTL-II de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 hasta 33.
35. Célula hospedera, caracterizada porque contiene el vector de conformidad con la reivindicación 34.
36. Método para producir una proteína BTL-II o fragmento inmunogénico, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 35 bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína BTL-II o fragmento inmunogénico.
37. Célula hospedera caracterizada porque es genéticamente modificada para expresar la proteína BTL-II o fragmento inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
38. Célula hospedera de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de mamífero.
39. Célula hospedera de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la célula hospedera es una célula CHO.
40. Método para producir una proteína BTL-II o fragmento inmunogénico, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 37 bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína BTL-II o fragmento inmunogénico.
41. Método de conformidad con la reivindicación 36 ó 40, caracterizado porque además comprende aislar la proteína BTL-II de las células hospederas o el medio.
42. Método, caracterizado porque comprende administrar a un paciente que sufre de una enfermedad inflamatoria del intestino una cantidad terapéutica de una proteína BTL-II de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
43. Método de conformidad , con la reivindicación 42, caracterizado porque el paciente sufre de la enfermedad de Crohn.
44. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el paciente sufre de colitis ulcerativa.
45. Método para inducir una respuesta inmune contra un antígeno, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista BTL-II y el antígeno.
46. Método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la respuesta inmune comprende una respuesta inmune mucosal contra el antígeno.
47. Método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el antagonista es el anticuerpo de la reivindicación 29.
48. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47, caracterizado porque el antígeno es administrado vía una superficie mucosal .
49. Método para amortiguar una respuesta inmune a un antígeno, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero el antígeno y una proteína BTL-II de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y 20 a 23.
50. Método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque al antígeno se administra vía una superficie mucosal.
51. Método para inhibir la proliferación de células T, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula T con la proteína BTL-II de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y 20 a 23.
52. Método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la célula T está en contacto con la protelna BTL-II in vivo.
53. Método de conformidad con la reivindicación 51 ó 52, caracterizado porque la célula T es una célula T humana .
54. Método para inhibir la producción de citocina por una célula T, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula T con un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y 20 a 23.
55. Método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la célula T está en contacto con polipéptido in vivo.
56. Método de conformidad con la reivindicación 54 ó 55, caracterizado porque la célula T es una célula T humana .
57. Método de conformidad con las reivindicaciones 54 a 56, caracterizado porque la producción de gama interferona es inhibida.
58. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 57, caracterizado porque la producción de IL2 es inhibida.
59. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 58, caracterizado porque la producción de IL5 es inhibida.
MXPA05006535A 2002-12-23 2003-12-19 Acidos nucleicos, proteinas y anticuerpos btl-ii. MXPA05006535A (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43618502P 2002-12-23 2002-12-23
US52529803P 2003-11-26 2003-11-26
PCT/US2003/040338 WO2004058986A2 (en) 2002-12-23 2003-12-19 Btl-ii nucleic acids, proteins, and antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA05006535A true MXPA05006535A (es) 2005-09-08

Family

ID=32685440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA05006535A MXPA05006535A (es) 2002-12-23 2003-12-19 Acidos nucleicos, proteinas y anticuerpos btl-ii.

Country Status (9)

Country Link
US (4) US7244822B2 (es)
EP (1) EP1585760B1 (es)
JP (1) JP4671694B2 (es)
AU (1) AU2003299687B2 (es)
CA (1) CA2509999A1 (es)
ES (1) ES2391949T3 (es)
MX (1) MXPA05006535A (es)
PL (2) PL379564A1 (es)
WO (1) WO2004058986A2 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2012011688A (es) * 2010-04-09 2012-11-23 Amgen Inc Proteinas btnl9, acidos nucleicos y anticuerpos y usos de los mismos.
CA2878400A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Amgen Inc. Btnl3 proteins, nucleic acids, and antibodies and uses thereof
JP5830048B2 (ja) * 2013-03-15 2015-12-09 信越化学工業株式会社 チタン含有レジスト下層膜形成用組成物及びパターン形成方法
US11661447B2 (en) 2017-08-03 2023-05-30 The Cleveland Clinic Foundation Human β2-glycoprotein I expression
AU2019227641B2 (en) * 2018-02-28 2024-09-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer using combinations of anti-BTNL2 and immune checkpoint blockade agents
EP4373513A1 (en) * 2021-07-20 2024-05-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Butyrophilin-like 2 for treating inflammatory disorders
CN114437234A (zh) * 2021-12-28 2022-05-06 四川省医学科学院·四川省人民医院 Btnl2重组蛋白及其制备方法与在制备用于治疗炎症性肠病药物中的应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5580756A (en) * 1990-03-26 1996-12-03 Bristol-Myers Squibb Co. B7Ig fusion protein
US6391311B1 (en) * 1998-03-17 2002-05-21 Genentech, Inc. Polypeptides having homology to vascular endothelial cell growth factor and bone morphogenetic protein 1
AU2001236519A1 (en) 2000-01-24 2001-07-31 Millennium Pharmaceuitcals, Inc. Identification, assessment, prevention, and therapy of prostate cancer
DE10032529A1 (de) 2000-06-30 2002-02-07 Epigenomics Ag Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des Major Histocompatibility Complex (MHC)
CA2422215A1 (en) * 2000-09-20 2002-03-28 Amgen Inc. B7-like molecules and uses thereof
EP1334113A4 (en) 2000-10-20 2007-08-08 Expression Diagnostics Inc EVALUATION OF LEUCOCYTAIRE EXPRESSION LEVEL
US20040166490A1 (en) 2002-12-17 2004-08-26 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
ATE427753T1 (de) 2002-02-20 2009-04-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Verfahren zur kontrolle der tumorprogression und invasivitat

Also Published As

Publication number Publication date
US7244822B2 (en) 2007-07-17
JP4671694B2 (ja) 2011-04-20
EP1585760B1 (en) 2012-08-08
AU2003299687A1 (en) 2004-07-22
US7709618B2 (en) 2010-05-04
EP1585760A2 (en) 2005-10-19
US20100330104A1 (en) 2010-12-30
US8173603B2 (en) 2012-05-08
US20090142801A1 (en) 2009-06-04
US20120258097A1 (en) 2012-10-11
CA2509999A1 (en) 2004-07-15
US20040209289A1 (en) 2004-10-21
JP2006525786A (ja) 2006-11-16
WO2004058986A3 (en) 2005-06-23
ES2391949T3 (es) 2012-12-03
PL400309A1 (pl) 2013-10-14
PL379564A1 (pl) 2006-10-16
AU2003299687B2 (en) 2010-01-21
US8674078B2 (en) 2014-03-18
WO2004058986A2 (en) 2004-07-15
EP1585760A4 (en) 2006-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2769822C (en) Methods of modulating immune function
US8674078B2 (en) Methods of using BTL-II proteins
CA2533512C (en) Antagonists and agonists of ldcam and methods of use
US20230192802A1 (en) Btnl3 proteins, nucleic acids and antibodies and uses thereof
EP2556086B1 (en) Btnl9 proteins, nucleic acids, and antibodies and uses thereof
US20090226417A1 (en) Human B7 polypeptides
US20060154313A1 (en) Human B7 polypeptide B7-H3A
JP2002537769A (ja) ヒトエンドカインαおよび使用方法
IL138410A (en) Polypeptides and DNA fragments that activate NK cells and methods for their preparation
CA2715100A1 (en) A novel receptor trem(triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof
NZ619473A (en) Inhibitors of t-cell activation

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration