MXPA04001190A - Derivados de acido hidroxamico inhibidores de enzima histona deacetilasa como nuevos farmacos inhibidores de sintesis de citocinas anti-inflamatorios. - Google Patents

Abstract

Se describe el uso de derivados de acido hidroxamico que tienen actividad inhibidora de enzima histona de acetilasa para la preparacion de medicamentos anti-inflamatorios.

Description

DERIVADOS DE ACIDO H IDROXAMICO I NH IBIDORES DE ENZI MA HISTONA DEACETILASA COMO NUEVOS FARMACOS IN H IBIDORES DE SINTESIS DE CITOCINAS. ANTI-I NFLAMATORIOS Esta invención se refiere al uso de derivados de ácido hidroxámico que tiene actividad inhibidora de enzima histona deacetilasa para la preparación de medicamentos anti-inflamatorios. Se conocen algunos derivados del ácido hidroxámico que inhiben las histonas deacetilasas. Aquellos que han sido más extensivamente estudiados son el ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA), la N-hidroxi-3-[3-(hidroxiamino)-3-oxo-1 -propenil]-benzamida (CBHA) y tricostatin (TSA). Otros derivados se describen en Proc. Nati. Acad . Sci. E. U. A. 95, 3003-3007, 1 998; Tumori, Nov-Dic 2001 , 87 (6); S 12-4; Fármacos Anticáncer, Enero 1 3, 2002 (1 ): 1 -13; Nature Rev. Cáncer, Dic. 2001 , 1 (3): 1 94-202; Curr. Opin. Oncol., Nov. 2001 , 13 (6): 477-83; Cáncer Chemother. Pharmacol. , Agosto 2001 , Suppl 48 1 :S20-6; Cáncer Chemother. Pharmacol. , Agosto 2001 , Suppl 48 1 :S 17-9; Haematologica, Sept. 2001 ; 86 (9): 908-1 7. Estos compuestos se han estudiado principalmente como fármacos antitumorales potenciales: tricostatin, un antibiótico antimicótico aislado a partir de Streptomyces higroscopicus, es un potente inductor de diferenciación de células eritroleucémicas de murino (Cáncer Res. 47, 3288-3691 , 1 987), mientras que el SAHA y la CBHA han sido estudiadas por el Instituto Sloan Kettering (WO 95/31 977) como agentes ind uctores de diferenciación de células tumorales.

El uso terapéutico de inhibidores de histona deacetilasa para tratar tumores se describe en Anticancer Res. 20, 1471 -1486, 2000 y Exp. Opin. Invest. Drugs 8 (10), 161 1 -1621 , 1999. Se ha encontrado ahora que los derivados conocidos del ácido hidroxámico que tiene una actividad inhibidora de histona deacetilasa, especialmente tricostatin y SAHA, inhiben la síntesis de citocinas pro-inflamatorias, y por lo tanto, pueden usarse para tratar desórdenes que pueden ser aliviados mediante la inhibición de estas citocinas. Ejemplos de tales desórdenes, con una base inflamatoria y/o autoinmune, incluyen esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn y colitis ulcerante, aterosclerosis, artritis reumatoide, psoriasis, espondiloartropatías (espondilitis anquilosante, artritis psoriática, artritis relacionada con colitis ulcerante), neuropatías relacionadas con SIDA, asma, enfermedades de los pulmones obstructivas crónicas, bronquitis, pleuritis, hepatitis aguda y crónica (ya sea viral, bacteriana o tóxica), glomerulonefritis aguda y, hablando ampliamente, todos los desórdenes con un componente inflamatorio. Para los usos terapéuticos considerados, los derivados del ácido hidroxámico serán administrados en dosis que varían entre 1 y 500 mg una o más veces al día, dependiendo del desorden involucrado y las características farmacotoxicológicas del compuesto en cuestión, el cual puede ser administrado en la forma de formulaciones orales, parenterales o tópicas adecuadas. Los siguientes ejemplos ilustran la invención con mayor detalle.

EJ EM PLO 1 - Inhibición de Producción de Citocinas In Vitro El tratamiento de linfocitos con lipopolisacárido (LPS) induce la producción de varias citocinas pro-inflamatorias, tales como TNFa, IL-? ß y IFNy (J. Biol. Chem. 1990; 265 (1 8): 1 0232-1 0237; Science, 1998; 281 : 1 001 -1 005). El efecto del SAHA y del TSA ha sido estudiado mediante la evaluación del efecto inhibidor del compuesto en la producción de citocinas mediante células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de voluntarios saludables (2 a 6 donadores), estimulados con LPS. Se usaron muestras de sangre periférica o cubiertas agamuzadas de voluntarios saludables. Las muestras se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Hypaque, y las PBMCs así obtenidas se sembraron en platos de 96 pozos (500,000, células/pozo), se incubaron durante 60 minutos con SAHA o TSA a varias dosis, y después se estimularon con LPS de E. coli 055: B5 (10 ng/ml) durante 24 horas en la presencia del compuesto. Al final del tratamiento se midieron las citocinas pro-inflamatorias TNFa, IL-? ß por medio de un ensayo de electroquimiluminiscencia (ECL) usando anticuerpos específicos comerciales. Se midió el interferon y (IFNy) con un ensayo de ELISA disponible comercialmente. El IFNy de citocina se produce por los linfocitos T enseguida de su estimulación mediante citocinas pro-inflamatorias, especialmente IL-12 e IL-18 (Dinarello C. A. y oldawer L. L. Citocinas Pro-inflamatorias y Anti- inflamatorias en Artritis Reumatoide. Un manual para clínicos. 2a Edición, Amgen Inc., 2000). El efecto del SAHA y del TSA sobre la síntesis de IFNy inducida mediante la estimulación de PBMCs con IL-12 e IL-18 in vitro se evaluó sobre esta base. Se sembraron PBMCs en platos de 96 pozos de fondo redondo (500,000 células/plato) y se incubaron con varias dosis de SAHA o TSA durante 60 minutos. Al final, las células se estimularon durante 48 horas en la presencia del compuesto mediante la adición simultánea de IL-12 recombínante (10 ng/ml) e IL-18 recombinante (20 ng/ml). Se determinó la cantidad de IFNy producido mediante un ensayo ELISA comercial. Se midió el efecto de las varias dosis de SAHA y de TSA como el porcentaje de inhibición de producción de la citocina en cuestión en comparación con células no tratadas de control. La concentración capaz para inducir el 50% de inhibición de crecimiento de células (!C50) se determinó mediante regresión lineal. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla: Citocina SAHA TSA IC50 (nM) IC50 (nM) TNFa 200 50 IL-1 ß 100 100 IFNy 50 10 IFNy (de IL-12 + IL-18) 740 490 Estos resultados indican claramente que el SAHA y el TSA inhiben la síntesis de todas las citocinas inflamatorias inducidas por LPS con un 1C50 en el rango nanomolar (50-200 nM). El SAHA y el TSA inhiben también la síntesis de IFNy mediante las células T de linfocito, como se demuestra por su eficacia (IC50 740 n M y 490 nM respectivamente) cuando el estímulo utilizado fue la combinación de IL-12 e IL- 18 específica para esa línea de células.

EJ EMPLO 2 - Inhibición de Producción de Citocinas in vivo Se sabe que la administración sistémica de LPS a animales de laboratorio induce la producción masiva, rápida de citocinas pro-inflamatorias (Immunopharmacol, 1 992; 14 (6): 1 045-1050). Se trataron ratones hembra BALB/c (20-22 gramos) oralmente con SAHA en las varias dosis indicadas, después se trataron durante 60 minutos con LPS de E. coli 055: B5 (30 mg/Kg ¡ntraperitonealmente). Después de 90 minutos de la administración de endotoxina, se tomaron muestras de sangre de todos los animales tratados (1 0 animales/grupo), y se midieron las citocinas con ensayos ELISA comerciales. Los resultados se exponen en la Tabla a continuación y expresados como el porcentaje de inhibición de producción de la citocina en cuestión: TRATAM I E NTO % Inhibición de Inhibición de Inhibición de TN Fa IL-1 p I L-6 SAHA 0.1 mg/Kg 40 13 10 1 mg/Kg 53 1 5 3 10 mg/Kg 67 35 7 25 mg/Kg 68 37 25 50 mg/Kg no hecho 51 29 Los resultados anteriores indican que el SAHA es oralmente activo y capaz de inhibir, hasta un grado dependiente de dosis, la síntesis de citocinas pro-inflamatorias inducida in vivo en el ratón mediante la administración de endotoxina, confirmando así los resultados obtenidos in vitro.

EJ EM PLO 3. Daño al Hígado Inducido por Con A Se inyectaron ratones C57B16 i.p. con ya sea agua vehículo o SAHA y después de 1 hora se inyectaron i.v. con Con A como se describe en Proc. Nati. Acad. Scí. EUA, (2000), 97, 2367-2372. Después de 24 horas, se midió la transferasa amino-alanina de suero. La inyección intravenosa de Con A resulta en la muerte de células hepáticas en 12-24 horas con niveles de enzimas hepáticas en suero marcadamente elevados tal como transaminasa de alanina amino (ALT) . En ratones tratados previamente con una sola dosis de SAHA (50 mg/kg) dada i.p. 1 hora antes de Con A, el nivel de ALT en suero a las 24 horas (media ± SE) fue de 8.144 ± 2.091 unidades/litro en comparación con 15.1 90 ± 2.580 en ratones tratados con vehículo (n = 6 por grupo).

EJ EMPLO 4. Producción de Oxido Nítrico a Partir de Macrófaqos Peritoneales de Ratón. Se inyectaron i.p. ratones C57BLy6 con 1 mi de caldo de tioglicolato estéril y se sacrificaron después de 5 días, y se aislaron macrófagos utilizando goteo de 10 mi de PBS enfriado con hielo en la cavidad peritoneal. Las células se centrifugaron (350 x g) y se agregaron 3 mi de reactivo de eritrocito lisante (PharMingen) durante 10 minutos. Se agregaron siete milímetros de DMEM conteniendo FCS al 5% y las células se centrifugaron a 4° C. Las células se resuspendieron en DMEM a 1 millón por mi y se agregaron 0.5 mi a los pozos de una placa de 48 pozos. Se agregó SAHA durante 60 minutos a 37° C y después se estimuló con la combinación de TN F-a más IFN-?. Después de 24 horas, se determinaron niveles de NO en el sobrenadante utilizando el reactivo de Griess como se describe en Am. J . Physiol. Cell Physíol. (2001 ), 280, C441 -C450. Como se muestra en la Figura 1 , el SAHA inhibió la producción de NO; a 200 nM hubo una reducción de 50% (P, 0.05). Se observaron reducciones posteriores de 80 y 85% a 400 y 800 nM , respectivamente.

EJ EM PLO 5. Inhibición de Producción de IL-12 por Monocitos Cultivados.

Se obtuvo sangre venosa de adultos que accedieron y se separó sobre Ficoll-Hypaque. La fracción de PBMC se lavó y se ajustó a cinco millones de células por mi. Se dividieron en alícuotas quinientos microlitros en cada pozo de placas de 24 pozos de fondo plano, se agregaron 100 mi de SAHA, y las placas se incubaron durante 1 hora a 37° C. Las células se estimularon con LPS, OKT3 soluble, o citocinas, y después de 24 ó 48 horas a 37° C el sobrenadante se recogió y se congeló para ensayos de citocinas. Se aislaron monocitos mediante centrifugación en Percoll, se lavaron, se suspendieron en RPMI con FCS al 10% y se dividieron en alícuotas de dos millones de células por mi en platos de cultivo Petriperm recubiertos con . Teflón (Sigma). El ELISA para IL-12 de seres humanos (p70) se compró de Endogen (Woburn, A).

Como se muestra en la Figura 2, hubo una reducción dependiente de la dosis en la producción de IL-12 inducida por LPS/IFN-? en monocitos humanos no adherentes. A 200 n , la reducción fue de 55% (P, 0.01 ) y de 86% a 400 nM (P, 0.001 ).

EJEMPLO 6. Colitis Inducida por Dextran En este estudio se utilizaron ratones hembra, C57BL/6 de 8 semanas de edad (The Jackson Laboratories, Bar Habor, ME) pesando 20-22 g. Los animales se alojaron en recintos a temperatura controlada y un ritmo de día/noche de 12 horas. Se alimentaron con croquetas de comida estándar para ratones ad libitum, tuvieron libre acceso al agua de la llave suministrada en botellas y fueron aclimatados a las condiciones por lo menos siete días antes de que se usaran en los experimentos.

Los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical bajo anestesia de isoflurano (Fort Dodge, lowa City, IA). Se alimentaron ratones con dextrán al 3.5% sulfato de sodio (DSS; peso molecular 40 kDa; ICN, Aurora, OH) disueltos en agua destilada, estéril ad libitum desde el día uno hasta el cinco seguido por un período de observación de cinco días. Se administró SAHA una vez por día de manera oral (p.o.) en un volumen total de 200 al y una concentración de 10 mg/kg de peso corporal (BW) durante todo el experimento (día 1 a 10). Los ratones del control tuvieron libre acceso a agua y recibieron ya sea SAHA (10 mg/kg BW) o agua p.o. diariamente durante 10 días. Diariamente se determinaron los pesos corporales, sangre oculta o la presencia de sangre gruesa por el recto, y consistencia de heces diariamente. Dos investigadores sin ver el protocolo evaluaron la marca clínica (Tabla 1 ). La pérdida de peso < 1 % comparado con el día 1 se contabilizó como 0 puntos, la pérdida de peso de 1 a < 5% como 1 punto, de 5 a < 9.9% como 2 puntos, de 10 a 20% como 3 puntos y más de 20% como 4 puntos. Para la consistencia de heces, se dieron 0 puntos para bolitas bien formadas (formada), 2 puntos para heces pastosas y semi-formadas que no se pegaron al ano (suaves), y 4 puntos para heces líquidas que se pegaron al ano (diarrea). El sangrado fue registrado como 0 puntos para no sangre en hemoccult, 2 puntos para hemoccult positiva y 4 puntos para sangrado abundante. Estas marcas (peso corporal, consistencia de heces, sangrado rectal) se sumaron y dividieron entre 3 lo que resultó en una marca de clínica total que varia desde 0 (saludable) hasta 4 (actividad máxima de colitis).

Post mortem (en el día 10), se retiró el colon entero desde el cecum hasta el ano y se midió la longitud del colon como un marcador indirecto de inflamación. Se había mostrado que la longitud del colon era un parámetro confiable en este modelo ya que la colitis inducida por DSS está asociada con el acortamiento del colon como se describe previamente [Gastroenteroiogy, 1990, 98:694: J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001 , 296:99-105]. De estos resultados, reportados en las siguientes Tablas 1 -6, es evidente que el SAHA contrarresta efectivamente la colitis inducida por dextrán, un modelo válido y establecido de enfermedades de intestino grueso inflamatorias en seres humanos.

TABLA 1 . Marca de Actividad Clínica [Lab. Invest. , 1993, 69: 238-249].

Puntos de Pérdida de Consistencia Sangrado rectal marca Peso de heces 0 0% Formadas Hemoccult negativa 1 (>0%) <5% 2 5-9.9% Suaves Hemoccult positiva 3 10-20% 4 > 20% Diarrea Sangrado macroscópico Oí o Oí Tabla ! Peso Tabla 3. Consistencia de heces como se registró Ni n o Oí Tabla 4. Sangrado Tabla 5, Registro clínico completo Días Grupo 1 2 3 4 s 6 7 8 9 10 DSS + agua 0.0 ± 0.0 0.3 ±0.1 0.2 ±0.1 0.8 ±0.1 1.1 ±0.2 2.1 ±0.1 2.0 ± 0.1 2.1 ±0.1 2.0 ±0.1 1.9 ± 0.2 DSS + SAHA 0.0 ±0.0 0.0 ± 0.0 0.1 ±0.1 0.2 ±0.1 0.7 ±0.3 1.3 ± 0.3 1.5 ±0.1 1.9 ±0.1 1.5 ± 0.4 1.3 ± 0.4 SAHA 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ± 0.1 0.0 ± 0.0 Agua 0.0 ±0.0 0.04:0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ±0.0 0,0 ±0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 TABLA 6. Longitud de Colon Grupo Longitud de colon (cm) DSS + agua 7.6 ± 0.2 DSS + SAHA 9.2 + 0.2 SAHA 10.1 ± 0.2 Agua 10.5 ± 0.3 EJEMPLO 7 Se sujetó una serie de derivados de ácido hidroxámico descritos en la EP 901465 a la histona deacetilasa (HDAC) y pruebas de inhibición de TNFa de acuerdo con los métodos descritos por Lechner y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 1996, 1296, 181-188 y Moreira A. L. y colaboradores, J. Exp. Med. 1993, 177, 1657-1680 respectivamente.

Los resultados, expuestos en la siguiente Tabla, muestran que existe correlación lineal entré la habilidad de estos compuestos para inhibir la síntesis de TNFa y su inhibición de actividad HDAC.

Claims (4)

REIVIN DICACIONES

1 . El uso de derivados de ácido hidroxámico que tienen actividad inhibidora de histona deacetilasa para la preparación de un medicamento que inhibe la síntesis de citocinas pro-inflamatorias.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde los derivados se seleccionan de ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA), N-hidroxi-3-[3-(hidroxiamino)-3-oxo-1 -propenil]-benzamida (CBHA) y tricostatin.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el medicamento está en la forma de formulación oral, parenteral o tópica.

4. El uso como se reivindicó en la reivindicación 1 o 2, para la preparación de medicamentos para el tratamiento de esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn y colitis ulcerante, aterosclerosis, artritis reumatoide, psoriasis, espondiloartropatías (espondilitis anquilosante, artritis psoriática, artritis relacionada con colitis ulcerante), neuropatías relacionadas con SIDA, asma, enfermedades del pulmón obstructivas crónicas, bronquitis, pleuritis, hepatitis aguda y crónica (ya sea viral, bacteriana o tóxica), glomerulonefritis aguda.