MX2015001630A

MX2015001630A - Inmunoterapia mejorada.

Info

Publication number: MX2015001630A
Application number: MX2015001630A
Authority: MX
Inventors: Christian Klein; Pablo Umana; Christian Gerdes; Valeria G Nicolini
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2013-08-05
Publication date: 2015-08-14
Also published as: RU2015107889A; WO2014023679A1; JP2015525791A; ES2848732T3; PL3434695T3; CN104662045B; NZ702241A; AU2018274836A1; TR201816437T4; EP2882777B1; PL2882777T3; AR092044A1; CN104662045A; US20140072528A1; MX2019006362A; EP3434695A1; US20170056522A1; ES2700978T3; BR112014030414A2; IL236892A0

Abstract

La presente invención proporciona combinaciones de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la utilización en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita del mismo. Se proporcionan además composiciones farmacéuticas que comprenden las combinaciones y métodos de utilización de las mismas.

Description

INMUN OTERAPIA MEJORADA Campo de la invención La presente invención se refiere de manera general a la inmunoterapia. Más concretamente, la invención se refiere a inmunoconjugados con diana en antígenos y anticuerpos de Fe manipulado para la utilización combinada como agentes inmunoterapéuticos. Además, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden combinaciones de dichos inmunoconjugados y anticuerpos y métodos de utilización de los mismos en el tratamiento de enfermedades.

Antecedentes La destrucción selectiva de una célula individual o de un tipo celular específica con frecuencia resulta deseable en una diversidad de contextos clínicos. Por ejemplo, es un objetivo principal de la terapia del cáncer la destrucción específica de células tumorales, dejando las células y tejidos sanos intactos y sin daños.

Un modo atractivo de conseguir lo anterior es mediante la inducción de una respuesta inmunológica contra el tumor, haciendo que las células inmunológicas efectoras tales como las células asesinas naturales (NK) o los linfocitos T citotóxicos (CTL) ataquen y destruyan las células tumorales. Las células efectoras pueden ser activadas por diversos estímulos, incluyendo varias citoquinas que inducen sucesos de señalización mediante la unión a sus receptores sobre la superficie de las células inmunológicas. Por ejemplo, la interleuquina-2 (IL-2) que, entre otros, estimula la proliferación y activación de las células T citotóxicas y las células NK, ha sido autorizada para el tratamiento del carcinoma metástasico de células renales y del melanoma maligno. Sin embargo, la rápida eliminación de la sangre y la falta de especificidad tumoral requieren la administración sistémica de dosis elevadas de una citoquina para alcanzar una concentración suficientemente elevada de la citoquina en el sitio tumoral para activar una respuesta inmunológica o para presentar un efecto antitumoral. Estos niveles sistémicos elevados de citoquina pueden conducir a toxicidad severa y a reacciones adversas, tal como también es el caso para IL-2. Para la utilización en la terapia del cáncer, por lo tanto, resulta deseable dirigir citoquinas específicamente al tumor o microambiente tumoral. Lo anterior puede conseguirse conjugando la citoquina con una fracción de reconocimiento, por ejemplo un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, específico para un antígeno tumoral. Una ventaja adicional de dichos inmunoconjugados es su vida media en suero incrementada en comparación con la citoquina no conjugada. Su capacidad de maximizar las actividades inmunoestimuladoras en el sitio del tumor minimizando simultáneamente los efectos secundarios sistémicos a una dosis más baja, convierte a los inmunoconjugados de citoquina en agentes inmunoterapéuticos óptimos.

Otra manera de activar las células efectoras es mediante el acoplamiento de receptores de Fe activadores sobre su superficie mediante la porción Fe de las inmunoglobulinas o mediante proteínas de fusión recombinantes que comprenden una región Fe. Las funciones denominadas efectoras de un anticuerpo que están mediadas por su región Fe son un mecanismo importante de acción en la inmunoterapia del cáncer basada en anticuerpos. La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, la destrucción de células diana recubiertas de anticuerpos (por ejemplo células tumorales) por parte de las células NK se induce al interactuar un anticuerpo unido a la superficie de las células con receptores de Fe sobre las células NK. Las células NK expresan FcyRIIIa (CDlóa), que reconoce las inmunoglobulinas de subclases IgGi ó IgG3. Entre las funciones efectoras adicionales se incluyen la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y varían según la clase y subclase del anticuerpo, ya que diferentes tipos de célula inmunológica portan diferentes grupos de receptores de Fe, los cuales reconocen diferentes tipos y subtipos de dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo los dominios constantes de cadena pesada a, d, g, e ó m, correspondientes a los anticuerpos de clases IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, respectivamente). Se han utilizado diversas estrategias para incrementar las funciones efectoras de los anticuerpos. Por ejemplo, Shields et al., (J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604, 2001) han demostrado que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración EU de los residuos) mejoran la unión de los anticuerpos al receptor de Fcyllía y la ADCC. Se describen variantes adicionales de anticuerpos que presentan modificaciones de aminoácidos en la región Fe y que muestran una unión de receptor Fe y una Junción efectora mejoradas, en la patente US n° 6.737.056, y en los documentos WO n° 2004/063351 y n° 2004/099249. Alternativamente, puede obtenerse una unión a receptores de Fe y una función efectora incrementadas mediante la alteración de la glucosilación de un anticuerpo. Los anticuerpos de tipo IgGl, los anticuerpos más comúnmente utilizados en la inmunoterapia del cáncer, presentan un sitio de glucosilación N-ligada en Asn297 en cada dominio CH2 de la región Fe. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos a Asn297 se encuentran enterrados entre los dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto polipeptídico, y su presencia resulta esencial para que el anticuerpo medie en funciones efectoras, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely M.R. et al, Glycobiology 5:813-822, 1995; Jefferis R. et al, Immunol. Rev. 163:59-76, 1998; Wright A. y Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15:26-32, 1997). Los estudios de manipulación de proteínas han demostrado que FcyR interactúa con la región bisagra inferior del dominio CH2 de IgG (Lund et al, J. Immunol. 157:4963-69, 1996). Sin embargo, la unión de FcyR tambien requiere la presencia de los oligosacáridos en la región CH2 (Lund et al, J. Immunol. 157:4963-69, 1996; Wright y Morrison, Trends Biotech. 15:26-31, 1997), sugiriendo que el oligosacárido y el polipéptido contribuyen ambos de manera directa al sitio de interacción o que el oligosacárido resulta necesario para mantener una conformación polipeptídica con CH2 activo. La modificación de la estructura del oligosacárido, por lo tanto, puede explorarse como medio para incrementar la afinidad de la interacción entre IgG y FcyR, y para incrementar la actividad de ADCC de los anticuerpos IgGi. Umaña et al (Nat. Biotechnol. 17:176-180, 1999, y la patente US n° 6.602.684 (documento WO n° 99/54342), el contenido de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad) han demostrado que la sobreexpresión de b(1 ,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos bisectados en células de ovario de hámster chino (CHO) incrementa significativamente la actividad de ADCC in vitro de los anticuerpos producidos en dichas células. La sobreexpresión de GnTIII en las líneas celulares de producción conduce a anticuerpos enriquecidos en oligosacáridos bisectados, que generalmente también son no fucosilados y son del tipo híbrido. En el caso de que, además de GnTIII, se sobreexprese manosidasa II (Manll) en las líneas celulares de producción, se obtienen anticuerpos enriquecidos en oligosacáridos no fucosilados bisectados del tipo complejo (Ferrara et al, Biotechn. Bioeng. 93:851-861, 2006). Ambos de tipos de anticuerpos muestran una ADCC fuertemente incrementada, en comparación con anticuerpos con glicanos no modificados, aunque sólo los anticuerpos en los que la mayoría de los N-glicanos son del tipo complejo son capaces de inducir una citotoxicidad dependiente del complemento significativa (Ferrara et al, Biotechn. Bioeng. 93:851-861, 2006). El factor crítico para el incremento de la actividad de ADCC aparentemente es la eliminación de la fucosa del residuo N-acetilglucosamina más interno del núcleo oligosacárido, mejorando la unión del dominio Fe de IgG a FcyRIIIa (Shinkawa et al, J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003). Entre los métodos adicionales para producir anticuerpos con fucosilación reducida se incluyen, por ejemplo, la expresión en células huésped deficientes en a(l,6)-fúcosiltransferasa (Yamane-Ohnuki et al, Biotech. Bioeng. 87:614-622, 2004; Niwa et al, J. Immunol. Methods 306:151-160, 2006).

A pesar de los éxitos conseguidos en la inmunoterapia anticáncer mediante la utilización de citoquinas libres, inmunoconjugados o anticuerpos manipulados, sigue existiendo una necesidad de nuevas opciones de tratamiento eficaces y seguras en la terapia del cáncer.

Descripción resumida de la invención Los presentes inventores han encontrado que la combinación de estas dos estrategias para la activación local de células inmunológicas, es decir, la estimulación simultánea de células efectoras por inmunoconjugados de citoquinas y por anticuerpos manipulados para que presenten funciones efectoras incrementadas, mejora en gran medida la eficacia de la inmunoterapia anticáncer.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención proporciona una combinación de: (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la utilización en el tratamiento de enfermedades en un individuo que necesita del mismo. En una realización, la fracción efectora es una citoquina. En una realización, la citoquina se selecciona de entre el grupo que consiste de IL-2, GM-CSF, IFN-a e IL-12. En una realización particular, la fracción efectora es IL-2. En otra realización, la fracción efectora es IL-12. En otra realización particular, la fracción efectora IL-2 es una fracción efectora IL-2 muíante que comprende por lo menos la mutación de un aminoácido, particularmente una sustitución de aminoácido, que reduce o anula la afinidad de la fracción efectora IL-2 muíante para la subunidad a del receptor de IL-2 pero conserva la afinidad de la fracción efectora IL-2 muíante para el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con la fracción efectora IL-2 no mutada. En una realización específica, la fracción efectora IL-2 muíante comprende una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en una, dos o tres posiciones seleccionadas de entre las posiciones correspondientes a los residuos 42, 45 y 72 de la IL-2 humana (SEC ID n° 1). En una realización más específica, la fracción efectora IL-2 mutante comprende tres sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondiente a los residuos 42, 45 y 72 de la IL-2 humana. En una realización todavía más específica, la fracción efectora IL-2 mutante es la IL-2 humana que comprende las sustituciones de aminoácidos F42A, Y45A y L72G. En determinadas realizaciones, la fracción efectora IL-2 mutante comprende además una mutación de aminoácido en una posición correspondiente a la posición 3 de la IL-2 humana, la cual elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2. En una realización específica de la fracción efectora IL-2 muíante comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2. En una realización, la fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla.

En una realización, el primer anticuerpo es un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, particularmente un anticuerpo de subclase IgGi de longitud completa. En una realización, la fracción efectora comparte un enlace peptídico amino-terminal o carboxi-terminal con el primer anticuerpo. En una realización, la fracción efectora comparte un enlace peptídico amino-terminal con el primer anticuerpo. En una realización, la fracción efectora se encuentra fusionada en su extremo N-terminal al extremo C-terminal de una de las cadenas pesadas del primer anticuerpo. En una realización particular, el inmunoconjugado comprende no más de una fracción efectora. En una realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente de una fracción efectora y un primer anticuerpo unido mediante uno o más péptidos conectores. En una realización específica, el inmunoconjugado comprende una fracción efectora, particularmente una fracción efectora de cadena sencilla, y un primer anticuerpo, particularmente un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, en el que la fracción efectora se encuentra fusionada en su aminoácido amino-terminal con el extremo carboxi-terminal de una de las cadenas pesadas del primer anticuerpo, opcionalmente mediante un péptido conector. En determinadas realizaciones, el primer anticuerpo comprende en la región Fe una modificación que estimula la heterodimerización de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina no idénticas. En una realización específica, dicha modificación es una modificación de botón-en-ojal, que comprende una modificación de botón en una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina y una modificación de ojal en la otra de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una realización, el primer anticuerpo comprende una modificación dentro de la interfaz entre dos cadenas pesadas de anticuerpo en el dominio CH3, en el que i) en el dominio CH3 de una cadena pesada, un residuo aminoácido se sustituye por un residuo aminoácido que presenta un volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia ("botón") dentro de la interfaz en el dominio CH3 de una cadena pesada que es posicionable en una cavidad ("ojal") dentro de la interfaz en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, e ii) en el dominio CH3 de la cadena pesada, un residuo aminoácido se sustituye por un residuo aminoácido que presenta un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad ("ojal") dentro de la interfaz en el segundo dominio CH3 dentro del cual es posicionable una protuberancia ("botón") dentro de la interfaz en el primer dominio CH3. En una realización, el primer anticuerpo comprende la sustitución de aminoácido T366W y opcionalmente la sustitución de aminoácido S354C en una de las cadenas pesadas de anticuerpo y las sustituciones de aminoácidos T366S, L368A, Y407V y opcionalmente Y349C en la otra cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización particular, la fracción efectora se encuentra fusionada con el aminoácido amino-terminal o carboxi-terminal de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de botón.

En una realización, la función efectora reducida del primer anticuerpo se selecciona de entre el grupo de: unión reducida a receptor de Fe activador, ADCC reducida, ADCP reducida, CDC reducida y secreción de citoquinas reducida. En una realización, la función efectora reducida es la unión reducida a un receptor de Fe activador. En una realización, el receptor de Fe activador es un receptor humano. En una realización, el receptor de Fe activador es un receptor de Fcy. En una realización específica, el receptor de Fe activador se selecciona de entre el grupo de FcyRIIIa, FcyRI y FcRylIa. En una realización, el receptor de Fe activador es FcyRIIIa, particularmente FcyRIIIa humano. En una realización, la función efectora reducida es la ADCC reducida. En una realización, la función efectora reducida es la unión reducida a un receptor de Fe activador y la ADCC reducida.

En una realización, el primer anticuerpo es manipulado mediante la introducción de una o más mutaciones de aminoácido en la región Fe. En una realización específica, las mutaciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos. En una realización específica, el primer anticuerpo, particularmente un anticuerpo de subclase IgGi de longitud completa humano, comprende una sustitución de aminoácido en la posición P329 de las cadenas pesadas de inmunoglobulina (numeración Kabat). En una realización más específica, la sustitución de aminoácido es P329A o P329G, particularmente P329G. En una realización, el anticuerpo comprende una sustitución de aminoácido adicional en una posición seleccionada de entre S228, E233, L234, L235, N297 y P331 de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una realización más específica, la sustitución adicional de aminoácido es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En una realización particular, el anticuerpo comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones P329, L234 y L235 de las cadenas pesadas de inmunoglobulina (numeración Kabat). En una realización más particular, el anticuerpo comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G (LALA P329G) en las cadenas pesadas de inmunoglobulina.

En determinadas realizaciones, el primer anticuerpo se dirige a un antígeno presentado sobre una celula tumoral o en un ambiente de célula tumoral. En una realización específica, el primer anticuerpo se dirige a un antígeno seleccionado de entre el grupo de la proteína de activación fibroblástica (FAP), el dominio Al de la tenascina-C (TNC Al), el dominio A2 de la tenascina-C (TNC A2), el dominio B extra de la fibronectina (EDB), el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el proteoglicano condroitín-sulfato asociado al melanoma (MCSP). En una realización particular, el primer anticuerpo se dirige al CEA. En otra realización particular, el primer anticuerpo se dirige a la FAP.

En una realización, la función efectora incrementada del segundo anticuerpo se selecciona de entre el grupo de: unión incrementada a un receptor de Fe activador, ADCC incrementada, ADCP incrementada, CDC incrementada y secreción de citoquinas incrementada. En una realización, la función efectora reducida es la unión incrementada a un receptor de Fe activador. En una realización específica, el receptor de Fe activador se selecciona de entre el grupo de FcyRIIIa, FcyRI y FcRylIa. En una realización, el receptor de Fe activador es FcyRIIIa. En una realización, la función efectora incrementada es la ADCC incrementada. En una realización, la función efectora incrementada es la unión incrementada a un receptor de Fe activador y la ADCC incrementada.

En una realización, el segundo anticuerpo es manipulado mediante la introducción de una o más mutaciones de aminoácido en la región Fe. En una realización específica, las mutaciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos. En una realización, el segundo anticuerpo es manipulado mediante la modificación de la glucosilación en la región Fe. En una realización específica, la modificación de la glucosilación en la región Fe es una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado. En una realización todavía más específica, la proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe es de por lo menos 20%, preferentemente de por lo menos 50%, más preferentemente de por lo menos 70% de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe. En otra realización específica, la modificación de la glucosilación en la región Fe es una proporción incrementada de oligosacáridos bisectados en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado. En una realización todavía más específica, la proporción incrementada de oligosacáridos bisectados en la región Fe es de por lo menos 20%, preferentemente de por lo menos 50%, más preferentemente de por lo menos 70% de oligosacáridos bisectados en la región Fe. En todavía otra realización específica, la modificación de la glucosilación en la región Fe es una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados bisectados en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado. Preferentemente, el segundo anticuerpo presenta por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 35% o por lo menos aproximadamente 50% de oligosacáridos no fucosilados bisectados en la región Fe. En una realización particular, el segundo anticuerpo se manipula para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. Una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe de un anticuerpo resulta en que el anticuerpo presenta una función efectora incrementada, en particular ADCC incrementada. En una realización particular, los oligosacáridos no fucosilados son oligosacáridos no fucosilados bisectados.

En una realización, el segundo anticuerpo es un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, particularmente un anticuerpo de subclase IgG] de longitud completa. En determinadas realizaciones, el segundo anticuerpo se dirige a un antígeno presentado sobre una célula tumoral. En una realización específica, el segundo anticuerpo se dirige a un antígeno seleccionado de entre el grupo de CD20, receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), HER2, HER3, receptor del factor- 1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1R), c-Met, proteína-1 que contiene dominio CUB (CDCP1), antígeno carcinoembrionario (CEA) y proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (MCSP).

En una realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20 manipulado para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. Se describen anticuerpos anti-CD20 adecuados en el documento WO n° 2005/044859, que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad. En otra realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-EGFR manipulado para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. Se describen anticuerpos anti-EGFR adecuados en los documentos WO n° 2006/082515 y n° 2008/017963, los cuales se incorporan como referencia en la presente memoria en su totalidad. En una realización particular adicional, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-IGF-lR manipulado para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. Se describen anticuerpos anti-IGF-lR adecuados en el documento WO n° 2008/077546, que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad. En todavía otra realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-CEA manipulado para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. Se describen anticuerpos anti-CEA adecuados en la publicación PCT n° WO 2011/0237878, que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad. En todavía otra realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-HER3 manipulado para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. Se describen anticuerpos anti-HER3 adecuados en la publicación PCT n° WO 2011/076683, que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad. En todavía otra realización particular, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-CDCPl manipulado para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. Se describen anticuerpos anti-CDCPl adecuados en la publicación PCT n° WO 2011/023389, que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad. En una realización, el segundo anticuerpo se manipula para que presente una glucosilación modificada en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado, mediante la producción del anticuerpo en una célula huésped que presenta alteraciones de actividad de una o más glucosiltransferasas.

En una realización, el segundo anticuerpo se manipula para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado, mediante la producción del anticuerpo en una célula huésped que presenta una actividad incrementada de P(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En una realización particular, la célula huésped además presenta una actividad incrementada de a-manosidasa II (Manll). En otra realización, el segundo anticuerpo se manipula para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado, mediante la producción del anticuerpo en una célula huésped que presenta una actividad reducida de a(l,6)-N-fucosiltransferasa.

En una realización, la enfermedad es un trastorno tratable mediante estimulación de la función de las células efectoras. En una realización, la enfermedad es un trastorno de la proliferación celular. En una realización particular, la enfermedad es el cáncer. En una realización específica, el cáncer se selecciona de entre el grupo de cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer ovárico, cáncer cerebral, linfoma, leucemia y cáncer de piel. En una realización, el individuo es un mamífero. En una realización particular, la individuo es un ser humano.

En una realización particular, la invención proporciona una combinación de: (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo de clase IgG de longitud completa manipulado para presentar una función efectora reducida mediante la introducción de una o más mutaciones de aminoácidos en la región Fe y una citoquina, en la que la fracción efectora se fusiona en su aminoácido aminoterminal con el extremo carboxi-terminal de una de las cadenas pesadas del primer anticuerpo, opcionalmente mediante un péptido conector, y (b) un segundo anticuerpo de clase IgG de longitud completa manipulado para que presente una función efectora incrementada mediante modificación de la glucosilación en la región Fe, para la utilización en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita del mismo. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para presentar una función efectora incrementada, en un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención comprende además la utilización de: (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad en un individuo.

La invención proporciona además un método de tratamiento de una enfermedad en un individuo, que comprende administrar en el individuo una combinación de: (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, en una cantidad terapéuticamente efectiva.

La invención proporciona además un método de estimulación de la función de las células efectoras en un individuo, que comprende administrar en el individuo una combinación de: (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, en una cantidad efectiva para estimular la función de las células efectoras.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un kit destinado al tratamiento de una enfermedad, que comprende en el mismo recipiente o en recipientes separados: (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, (b) un segundo anticuerpo manipulado para presentar una función efectora incrementada, y (c) opcionalmente un impreso en el paquete, que comprende instrucciones impresas que guían la utilización del tratamiento combinado como método para tratar la enfermedad.

Se entiende que el inmunoconjugado y el segundo anticuerpo utilizado en la composición farmacéutica, la utilización, los métodos y el kit según la invención pueden incorporarse cualesquiera de las características, individualmente o en combinación, descritas en los párrafos anteriores en relación a los segundos anticuerpos e inmunoconjugados útiles para la invención.

Breve descripción de los dibujos FIGURA 1A-1B. El inmunoconjugado IgG 28H1-IL-2 con diana en FAP (Fig.lA) o el inmunconjugado IgG DP47G2-IL-2 no dirigido (Fig.lB), que comprenden el muíante cuádruple de IL-2 (qm) que no se une a CD25 y el GlycoMab anti-EGFR, se sometieron a ensayo en la línea celular de carcinoma de cabeza y cuello humano FaDu, inyectados intralingualmente en ratones SCID. Los datos demuestran que la combinación del inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 qm pero no el inmunoconjugado IgG DP47G2-IL2 qm y el GlycoMab anti-EGFR media en una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia incrementada en comparación con el inmunoconjugado respectivo o GlycoMab anti-EGFR por sí solo (ver el Ejemplo 1).

FIGURA 2A-2B. Eliminación global de células tumorales A549 por PBMC (E:T=10:1, 4 horas) pretratadas o no con 0,57 nM (Fig.2A) ó 5,7 nM (Fig.2B) de inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 qm con diana en FAP o IL-2 (proleuquina), en presencia de diferentes concentraciones de GlycoMab anti-EGFR (ver el Ejemplo 2).

FIGURA 3A-3B. El inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL-2 con diana en CEA que comprende el mutante cuádruple de IL-1 (qm) no ligante de CD25 y el GlycoMab anti-EGFR (Fig.3A) o cetuximab (Fig.3B) se sometieron a ensayo en la línea celular de carcinoma colorrectal humano LS174T, inyectados intraesplénicamente en ratones SCID transgénicos para Fc/RIII. Los datos demuestran que la combinación del inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y el GlycoMab anti-EGFR media en una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia y supervivencia global incrementados en comparación con el inmunoconjugado respectivo, el GlycoMab anti-EGFR o cetuximab solo, así como la combinación del inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL2 qm y cetuximab (ver el Ejemplo 3).

FIGURA 4A-4B. El inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL-2 con diana en CEA que comprende el mutante cuádruple de IL-2 (qm) no ligante de CD25 y el GlycoMab anti- EGFR (Fig.4A) o cetuximab (Fig.4B) se sometieron a ensayo en la línea celular de carcinoma de pulmón humano A549, inyectados intraesplénicamente en ratones SCID transgénicos para FCYRIII. LOS datos demuestran que la combinación del inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y el GlycoMab anti-EGFR media en una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia y supervivencia global incrementados en comparación con el inmunoconjugado respectivo o el GlycoMab anti-EGFR por sí solo, así como la combinación del inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL2 qm y cetuximab (ver el Ejemplo 4).

FIGURA 5. El inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL-2 con diana en CEA que comprende el mutante cuádruple de IL-2 (qm) no ligante de CD25 y el GlycoMab anti-Her3 se sometieron a ensayo en la línea celular de carcinoma colorrectal humano LS174T, inyectados intraesplénicamente en ratones SCID transgénicos para FcyRIIL Los datos demuestran que la combinación del inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y el GlycoMab anti-Her3 median en una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia incrementada en comparación con el inmunoconjugado respectivo o el GlycoMab anti-Her3 por sí solo (ver el Ejemplo 5).

FIGURA 6. El inmunoconjugado de IgG 28H1-IL-2 con diana en FAP que comprende el mutante cuádruple de IL-2 (qm) no ligante de CD25 y el GlycoMab anti-EGFR se sometieron a ensayo en la línea celular de carcinoma renal humano ACHN, inyectados intraesplénicamente en ratones SCID transgénicos para FcyRIII. Los datos demuestran que la combinación del inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y el GlycoMab anti-EGFR median en una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia y supervivencia global incrementados en comparación con el GlycoMab anti-EGFR por sí solo o el GlycoMab anti-EGFR en combinación con Proleukin® (ver el Ejemplo 6).

FIGURA 7. Eliminación global de células LS174T por células PBMC con el tratamiento con GlycoMab anti-Her3 solo (panel izquierdo), el inmunoconjugado de IgG CH1A1A1-IL-2 qm solo (panel derecho) o la combinación de inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL-2 qm con el GlycoMab anti-Her3 (panel derecho).

FIGURA 8A-8B. Expresión de CD25 (Fig.8A) o CD69 (Fig.8B) sobre las células NK con el tratamiento de GlycoMab anti-Her3 solo (panel izquierdo), el inmunoconjugado de IgG CH1A1A1-IL-2 qm solo (panel derecho) o la combinación de inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL-2 qm con el GlycoMab anti-Her3 (panel derecho).

Descripción detallada de la invención En un primer aspecto la presente invención proporciona una combinación de: (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la utilización en el tratamiento de enfermedades en un individuo que necesita del mismo.

Definiciones Los términos se utilizan en la presente memoria tal como se utilizan generalmente en la téenica, a menos que se define de manera diferente a continuación.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "inmunoconjugado" se refiere a una molécula de polipéptido que incluye por lo menos una fracción efectora y un anticuerpo. En determinadas realizaciones, el inmunoconjugado comprende no más de una fracción efectora. Los inmunoconjugados particulares según la invención consisten esencialmente de una fracción efectora y un anticuerpo unidos mediante uno o más péptidos conectores. Son inmunoconjugados particulares según la invención las proteínas de fusión, es decir, los componentes del inmunoconjugado se unen mediante enlaces peptídicos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo de control" se refiere a un anticuerpo tal como existiría sin fracciones efectoras. Por ejemplo, al comparar un inmunoconjugado de IgG-IL2 tal como se describe en la presente memoria con un anticuerpo de control, el anticuerpo de control es IgG libre, en el que el inmunoconjugado de IgG-IL2 y la molécula de IgG libre pueden unirse ambos específicamente con el mismo determinante antigénico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "determinante antigénico" es sinónima de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional constituida de diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un anticuerpo, formando un complejo de anticuerpo-antígeno. Pueden encontrarse determinantes antigénicos útiles, por ejemplo, sobre las superficies de las células tumorales, sobre las superficies de las células infectadas por virus, sobre las superficies de otras células enfermedad, libre en el suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC).

La expresión "se une específicamente" se refiere a que la unión es selectiva para el antígeno y puede discriminarse de interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un anticuerpo de unirse a un determinante antigénico específico puede medirse mediante un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) o mediante otras téenicas que resultarán familiares para el experto en la materia, por ejemplo la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR) (analizada en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17:323-329, 2000) y los ensayos de unión tradicionales (Heelcy, Endocr. Res.28:217-229, 2002). Las expresiones “anticuerpo anti-[antígeno]” y “un anticuerpo que se une [antígeno]” se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse al antígeno respectivo con suficiente afinidad para que el anticuerpo resulte útil como agente diagnóstico y/o terapéutico con diana en el antígeno. En una realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-[antígeno] a una proteína no relacionada es inferior a aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo al antígeno según medición mediante, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA). En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se una a [antígeno] presenta una constante de disociación (KD) < 1 mM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo de 108 M o inferior, por ejemplo de entre 108 M y 1013 M, por ejemplo de entre 109M y 1013 M).

El término “afinidad” se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de una pareja de unión (por ejemplo anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X para su pareja Y puede representarse de manera general con la constante de disociación (KD), que es la proporción entre las constantes de disociación y asociación (koff y kon, respectivamente). De esta manera, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes, con la condición de que la proporción de constantes no resulte modificada. La afinidad puede medirse mediante métodos bien establecidos conocidos de la téenica, incluyendo los indicados en la presente memoria. Un método particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (SPR).

Según una realización, se mide KD mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un aparato BIACORE® TI 00 (GE Healthcare) a 25°C con ligando (por ejemplo, receptor de fracción efectora, receptor de Fe o antígeno diana) inmovilizado sobre chips CM5. Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare) con hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ligando recombinante se diluye con acetato sódico 10 mM, pH 5,5, hasta una concentración de entre 0,5 y 30 mg/ml antes de la inyección a un caudal de 10 ml/minuto, alcanzando aproximadamente 100 a 5.000 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección del ligando, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos no reaccionados. Para las mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones en serie de tres a cinco veces de inmunoconjugado (intervalo de entre ~0,01 nM y 300 nM) en HBS-EP+ (GE Healthcare, HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante P20 al 0,05%, pH 7,4) a 25°C a un caudal de aproximadamente 30 a 50 ml/minuto. Las tasas de asociación (kon) y de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo simple de unión uno a uno de Lagmuir (software de evaluación BIACORE® TI 00 versión 1.1.1) mediante ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. La constante del equilibrio de disociación (KD) se calcula como la proporción kog/kon· Ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881, 1999.

La "unión reducida", por ejemplo la unión reducida a un receptor de Fe o a CD25, se refiere a una reducción de la afinidad para la interacción respectiva, según se mide, por ejemplo, mediante SPR. Para mayor claridad, la expresión incluye además la reducción de la afinidad a cero (o a un nivel inferior al límite de detección del método analítico), es decir, la anulación completa de la interacción. A la inversa, la expresión "unión incrementada" se refiere a un incremento de la afinidad de unión para la interacción respectiva.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "primer" y "segundo" con respecto a anticuerpos, fracciones efectoras, etc., se utilizan convenientemente para distinguir en qué casos hay más de una fracción de cada tipo de fracción. La utilización de dichas expresiones no pretende referirse a un orden u orientación específico del inmunoconjugado, a menos que se indique explícitamente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "fracción efectora" se refiere a un polipéptido, por ejemplo una proteína o glucoproteína, que incluye sobre la actividad celular, por ejemplo mediante transducción de señales u otras rutas celulares. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la fracción efectora de la invención puede asociarse a la señalización mediada por receptores que transmite una señal del exterior de la membrana celular para modular una respuesta en una célula que porta uno o más receptores de la fracción efectora. En una realización, una fracción efectora puede inducir una respuesta citotóxica en células que portan uno o más receptores de la fracción efectora. En otra realización, una fracción efectora puede inducir una respuesta proliferativa en células que portan uno o más receptores de la fracción efectora. En otra realización, una fracción efectora puede inducir la diferenciación en células que portan receptores de la fracción efectora. En otra realización, una fracción efectora puede alterar la expresión (es decir, regular positiva o negativamente) de una proteína celular endógena en células que portan receptores de la fracción efectora. Entre los ejemplos no limitativos de fracciones efectoras se incluyen citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. La fracción efectora puede encontrarse asociada a un anticuerpo en una diversidad de configuraciones formando un inmunoconjugado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "citoquina" se refiere a una molécula que media y/o regula una función o proceso biológico o celular (por ejemplo la inmunidad, la inflamación y la hematopoyesis). El término "citoquina" tal como se utiliza en la presente memoria incluye "linfoquinas", "quimoquinas", "monoquinas" e "interleuquinas". Entre los ejemplos de citoquinas útiles se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, GM-CSF, IL-Ia, IL-lp, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-a, IFN-b, IFN-g, MIP-la, MIR-Ib, TGF-b, TNF-a y TNF-b. Son citoquinas particulares IL-2 e IL-12. El termino "citoquina" tal como se utiliza en la presente memoria pretende incluir además variantes de citoquina que comprenden una o más mutaciones de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de la citoquina de tipo salvaje correspondiente, tal como, por ejemplo, las variantes de IL-2 indicadas en Sauvé et al., Proc Nati Acad Sci USA 88:4636-40, 1991; Hu et al, Blood 101:4853-4861, 2003) y la publicación de patente n° 2003/0124678; Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18:1197-1202, 2000; Heaton et al., Cáncer Res 53:2597-602, 1993, y la patente US n° 5.229.109; la publicación de patente US n° 2007/0036752; WO 2008/0034473; WO 2009/061853; o anteriormente y posteriormente en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "de cadena sencilla" se refiere a una molécula que comprende monómeros de aminoácidos unidos linealmente mediante enlaces peptídicos. En una realización, la fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla. Entre los ejemplos no limitativos de fracciones efectoras de cadena sencilla se incluyen citoquinas, factores de crecimiento, hormonas, enzimas, sustratos y cofactores. En el caso de que la fracción efectora sea una citoquina y la citoquina de interés se encuentre normalmente en forma de multímero en la naturaleza, cada subunidad de la citoquina multimérica se encuentra codificada secuencialmente por la cadena sencilla de la fracción efectora. De acuerdo con lo anterior, entre los ejemplos no limitativos de fracciones efectoras de cadena sencilla útiles se incluyen GM-CSF, IL-la, IL-Ib, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-a, IFN-b, IFN-g, MIP-la, MIR-Ib, TGF-b, TNF-a y TNF-b Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "fracción efectora de control" se refiere a una fracción efectora no conjugada. Por ejemplo, al comparar un inmunoconjugado de IL-2 tal como se indica en la presente memoria con una fracción efectora de control, la fracción efectora de control es IL-1 libre, no conjugada. De manera similar, por ejemplo al comparar un inmunoconjugado de IL-12 con una fracción efectora de control, la fracción efectora de control es IL-12 libre, no conjugado (por ejemplo presente en forma de proteína heterodimérica en la que las subunidades p40 y p35 comparten únicamente uno o más enlaces disulfuro).

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "receptor de fracción efectora" se refiere a una molécula de polipéptido capaz de unirse específicamente a una fracción efectora. Por ejemplo, cuando la fracción efectora es IL-2, el receptor de la fracción efectora que se une a una molécula de IL-2 (por ejemplo un inmunoconjugado que comprende IL-2) es el receptor de IL-2. De manera similar, por ejemplo cuando IL-12 es la fracción efectora de un inmunoconjugado, el receptor de fracción efectora es el receptor de IL-12. En el caso de que la fracción efectora se una específicamente a más de un receptor, todos los receptores que se unen específicamente a la fracción efectora son "receptores de fracción efectora" para esa fracción efectora.

El término “anticuerpo” en la presente memoria se utiliza en el sentido más amplio y comprende diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecífícos) y fragmentos de anticuerpo, con la condición de que muestren la actividad de unión a antígeno deseada y comprendan una región Fe o una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina.

Las expresiones “anticuerpo de longitud completa”, “anticuerpo intacto” y “anticuerpo completo” se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a un anticuerpo que presenta una estructura sustancialmente similar a la estructura nativa de una inmunoglobulina.

El término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que presenta la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de clase IgG son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se encuentran unidas mediante enlaces disulfuro. De extremo N-terminal a extremo C-terminal, cada cadena pesada presenta una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también denominados regiones constantes de cadena pesada. De manera similar, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, cada cadena ligera presenta una región variable (VL), también denominada dominio ligero variable o dominio variable de cadena ligera, seguido de un dominio constante de cadena ligera (CL), también denominado región constante de cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina puede asignarse a uno de cinco tipos, denominados a (IgA), d (IgD), e (IgE), g (IgG), o m (IgM), algunos de los cuales pueden dividirse adicionalmente en subtipos, por ejemplo, gi (IgG,), g2 (IgG2), g3 (IgG3), g4 (IgG4), ai (IgAi) y a2 (IgA2) La cadena ligera de una.inmunoglobulina puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (K) y lambda (l), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente de dos moléculas de Fab y una región Fe, unidas mediante la región bisagra de inmunoglobulina.

Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de una cadena y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpos, ver Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134, 2003. Para una revisión de los fragmentos scFv, ver, por ejemplo, Plückthun, en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (editores), Springer-Verlag, New York, páginas 269 a 315, 1994; ver también el documento WO n° 93/16185, y las patentes US n° 5.571.894 y n° 5.587.458. Para un comentario de los fragmentos Fab y F(ab’)2 que comprenden residuos de epítopo ligante de receptor de recielaje y que presentan una vida media incrementada, ver la patente US n° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Ver, por ejemplo, la patente EP n° 404.097, el documento WO n° 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134, 2003; y Hollinger et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993. Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134, 2003. Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una parte del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de único dominio es un anticuerpo de único dominio humano (Domantis Inc., Waltham M.A.; ver, por ejemplo, la patente US n° 6.248.516 Bl). Los fragmentos de anticuerpo pueden prepararse mediante diversas téenicas, incluyendo, aunque sin limitación, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por parte de células huésped recombinantes (por ejemplo E. coli o fagos), tal como se describe en la presente memoria. La expresión "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente y es complementaria de parte o la totalidad de un antígeno. Un dominio de antígeno puede presentar, por ejemplo, uno o más dominios variables de anticuerpo (también denominados regiones variables de anticuerpo). En particular, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).

La expresión “región variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente presentan estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). Ver, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, sexta edición, W.H. Freeman y Co., página 91, 2007. Puede resultar suficiente un único dominio VH o VL para proporcionar especificidad de unión de antígeno. < -30- La expresión "región hipervariable" o "HVR", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que presentan una secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). Generalmente, los anticuerpos de cuatro cadenas nativos comprenden seis CDRs, tres en la VH (Hl, H2 y H3) y tres en la VL (Ll, L2 y L3). Las HVR generalmente comprenden residuos aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), presentando éstas últimas una variabilidad de secuencia más alta y/o participando en el reconocimiento de antígeno. Con la excepción de la CDR1 en VH, las CDRs generalmente comprenden los residuos aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) y estos términos se utilizan intercambiablemente en la presente memoria en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Depto of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1983, y por Chothia et al, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, en las que las definiciones incluyen residuos aminoácidos solapantes o subgrupos de residuos aminoácidos al compararse entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones en referencia a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo pretende encontrarse comprendida dentro del alcance del término tal como se define y se utiliza en la presente memoria. Los residuos aminoácidos apropiados que comprenden las CDR tal como se definen en cada una de las referencias anteriormente citadas se indican posteriormente, en la Tabla 1, a modo de comparación. Los números de residuo exactos que comprende una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. El experto en la materia podrá determinar rutinariamente qué residuos comprende una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de región variable del anticuerpo.

TABLA 1. Definiciones de CDR1 1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 siguen las convenciones de numeración proporcionadas por Kabat et al. (ver posteriormente). 2 "AbM" con una "b" minúscula tal como se utiliza en la Tabla 1 se refiere a las CDR según la definición del software de modelaje de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.

Kabat et al. también han definido un sistema de numeración para las secuencias de región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. El experto ordinario en la materia podría asignar inequívocamente este sistema de "numeración Kabat" a cualquier secuencia de región variable, sin basarse en ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, "numeración Kabat" se refiere al sistema de numeración proporcionado por Kabat et al, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest", 1983. A menos que se indique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones específicas de residuos aminoácidos en una región variable de anticuerpo siguen el sistema de numeración Kabat. Las secuencias polipeptídicas del listado de secuencias (es decir, SEC ID n° 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) no están numeradas según el sistema de numeración Kabat. Sin embargo, se encuentra perfectamente comprendido en los conocimientos del experto ordinario en la materia cómo convertir la numeración de las secuencias del listado de secuencias a numeración Kabat.

El término “marco” o "FR” se refiere a residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable generalmente consiste de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. De acuerdo con lo anterior, las secuencias de HVR y de FR generalmente aparecen en la secuencia siguiente en VH (o en VL) : FR 1 -CDR1 (L 1 )-FR2-CDR2(L2)-FR3-CDR3(L3)-FR4.

La “clase” de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que presenta su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpo: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, g y m, respectivamente.

La expresión "región Fe" o "dominio Fe" en la presente memoria se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una parte de la región constante. El término incluye regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fe de cadena pesada de IgG humana habitualmente se define que se extiende a partir de Cys226 ó a partir de Pro230, hasta el extremo carboxilo-terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede encontrarse presentes o no. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, la numeración de los residuos aminoácidos en la región Fe o en la región constante se lleva a cabo según el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, tal como se describe en Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Healtíl, Bethesda, MD, 1991.

Una "región equivalente a la región Fe de un· ínmunoglobulina" pretende incluir las variantes alélicas naturales de la región Fe de una ínmunoglobulina, así como las variantes que presentan alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones pero que no reducen sustancialmente la capacidad de la Ínmunoglobulina de mediar en funciones efectoras (tales como la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos). Por ejemplo, puede delecionarse uno o más aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal de la región Fe de una ínmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes pueden seleccionarse según reglas generales conocidas de la téenica, de manera que presenten un efecto mínimo sobre la actividad (ver, por ejemplo, Bowie et al., Science 247:1306-10, 1990).

Una "modificación estimuladora de la heterodimerización" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones post-traduccionales de un polipéptido, por ejemplo de una cadena pesada de inmunoglobulina, que reducen o evitan la asociación del polipéptido con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación estimuladora de heterodimerización tal como se utiliza en la presente memoria incluye particularmente modificaciones separadas realizadas en cada uno de dos polipéptidos que se desea que formen un dímero, en el que las modificaciones son complementarias entre sí de manera que estimulan la asociación de los dos polipéptidos. Por ejemplo, una modificación estimuladora de heterodimerización puede alterar la estructura o carga de uno o ambos polipéptidos deseados para formar un dímero, de manera que se provoca que su asociación resulte estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. La heterodimerización se produce entre dos polipéptidos no idénticos, tal como dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, en las que los componentes de inmunoconjugado adicionales fusionados con cada una de las cadenas pesadas (por ejemplo con las fracciones efectoras) no son iguales. En los inmunoconjugados de la presente invención, la modificación estimuladora de la heterodimerización se encuentra en la cadena o cadenas pesadas, concretamente en la región Fe, de una molécula de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la modificación estimuladora de la heterodimerización comprende una mutación de aminoácido, concretamente una sustitución de aminoácido. En una realización particular, la modificación estimuladora de heterodimerización comprende una mutación de aminoácido separada, concretamente una sustitución de aminoácido, en cada una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina.

La expresión “funciones efectoras” utilizada en referencia a anticuerpos se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo que varían con el isotipo del anticuerpo. Entre los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo se incluyen: unión de Clq y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión de receptor de Fe, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citoquinas, incorporación de antígeno por parte de células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico, regulación negativa de los receptores de superficie celular (por ejemplo receptores de células B) y activación de las células B.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "células efectoras" se refiere a una población de linfocitos que muestran receptores de fracción efectora, por ejemplo receptores de citoquina y/o receptores de Fe sobre su superficie, mediante los cuales se unen a una fracción efectora, por ejemplo una citoquina, y/o una región Fe de un anticuerpo, y contribuyen a la destrucción de las células diana, por ejemplo células tumorales. Las células efectoras pueden mediar, por ejemplo, en efectos citotóxicos o fagocíticos. Entre las células efectoras se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, células T efectoras tales como células T citotóxicas CD8+, células T ayudante CD4+, células T gd, células NK, células asesinas activadas por linfoquinas (LAK) y macrófagos/monocitos. Dependiendo de su patrón de expresión de receptores pueden existir diferentes subconjuntos de células efectoras, es decir (a) células que expresan receptores para una fracción efectora particular pero sin receptores de Fe y que resultan estimuladas por los inmunoconjugados pero no por los anticuerpos de la invención (por ejemplo células T, que expresan receptores de IL-2), (b) células que expresan receptores de Fe pero no receptores para una fracción efectora particular y que resultan estimulados por los anticuerpos pero no por los inmunoconjugados de la invención, y (c) células que expresan tanto receptores de Fe como receptores para una fracción efectora particular y que resultan estimuladas simultáneamente por los anticuerpos y los inmunoconjugados de la invención (por ejemplo células NK, que expresan receptores de FcylII y receptores de IL-2).

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "manipular, manipulado, manipulación" se considera que incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones post-traduccionales de un polipéptido recombinante o natural o fragmento del mismo. La manipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de dichos enfoques. El término "manipulación", particularmente con el prefijo "gluco", así como la expresión "manipulación por glucosilación", incluye la manipulación metabólica de la maquinaria de glucosilación de una célula, incluyendo las manipulaciones genéticas de las rutas de síntesis de oligosacáridos para conseguir la glucosilación alterada de las glucoproteínas expresadas en células. Además, la manipulación por glucosilación incluye los efectos de mutaciones y del ambiente celular sobre la glucosilación. En una realización, la manipulación por glucosilación es una alteración de la actividad de glucosiltransferasa. En una realización particular, la manipulación resulta en una actividad alterada de glucosaminiltransferasa y/o de fucosiltransferasa. La manipulación por glucosilación puede utilizarse para obtener una "célula huésped que presenta una actividad de GnTIII incrementada" (por ejemplo una célula huésped que ha sido manipulada para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos con actividad de b( 1 ,4)-N -aceti 1 glucosam in i ltransferasa III (GnTIII)), una "célula huésped con actividad de Manll incrementada" (por ejemplo una célula huésped que ha sido manipulada para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos con actividad de a-manosidasa II (Manll)) o una "célula huésped que presenta una actividad reducida de a(l,6)-fucosiltransferasa) (por ejemplo una célula huésped que ha sido manipulada para expresar niveles reducidos de a(l,6)-fucosiltransferasa). La expresión "mutación de aminoácido" tal como se utiliza en la presente memoria pretende comprender las sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones de aminoácidos. Puede llevarse a cabo cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación para llegar al constructo final, con la condición de que el constructo final presente las características deseadas, por ejemplo un nivel de unión reducido a un receptor de Fe. Entre las deleciones e inserciones de la secuencia de aminoácidos se incluyen deleciones e inserciones amino-terminales y/o carboxi-terminales de aminoácidos. Son mutaciones particulares de aminoácidos las sustituciones de aminoácidos. Con el fin de alterar, por ejemplo, las características de unión de una región Fe, resultan particularmente preferentes las sustituciones no conservadoras de aminoácidos, es decir, la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido con diferentes propiedades estructurales y/o químicas. Entre las sustituciones de aminoácidos se incluyen la sustitución de aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándares (por ejemplo 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, omitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Pueden generarse sustituciones de aminoácidos utilizando métodos genéticos o químicos bien conocidos de la téenica. Entre los métodos genéticos pueden incluirse la mutagénesis sitio-dirigida, la PCR, la síntesis génica y similares. Se encuentra contemplado que los métodos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido mediante metodos diferentes de la ingeniería genética, tal como la modificación química, también pueden resultar útiles. En la presente memoria pueden utilizarse diversas denominaciones para indicar la misma mutación de aminoácido. Por ejemplo, una sustitución de prolina en la posición 329 de región de Fe por glicina puede indicarse como 329G, G329, G329, P329G o Pro329Gly.

“La expresión “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencias, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencias. La alineación con fines de determinación del porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos puede realizarse de diversas maneras que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo utilizando software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El experto en la materia podrá determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los fines de la presente memoria, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos generados utilizando el programa informático de comparación de secuencias llamado ALIGN-2. El autor del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 es Genentech, Inc., y el código fuente ha sido presentado con la documentación para usuario en el U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en donde se encuentra registrado con el n° TXU510087 del U.S. Copyright Office. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible públicamente de Genentech Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debería compilarse para la utilización en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían. En la situaciones en las que se utiliza ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencias de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o que comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula del modo siguiente: 100 veces la fracción X/Y en la que X es el número de residuos aminoácidos puntuados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de este programa de A y B, y en la que Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se aprecia que, en el caso de que la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A frente a B no es igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B frente a A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente memoria se obtienen tal como se describe en el párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa informático ALIGN-2.

Las expresiones “célula huésped”, “línea celular huésped” y “cultivo de células huésped” se utilizan intercambiablemente y se refieren a células en las que se han introducido ácidos nucleicos exógenos, incluyendo la progenie de dichas células. Entre las células huésped se incluyen “transformantes” y “células transformadas”, que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma con independencia del número de pases. La progenie puede no ser completamente idéntica en su contenido de ácidos nucleicos a una célula parental, pero puede contener mutaciones. La progenie muíante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado o selección de entre las células originalmente transformadas se encuentra incluida en la presente memoria. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que puede utilizarse para generar los anticuerpos e inmunoconjugados de la presente invención. En una realización, la célula huésped se manipula para permitir la producción de un anticuerpo con oligosacáridos modificados. En determinadas realizaciones, las células huésped han sido manipuladas para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que presentan actividad de P(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En determinadas realizaciones, las células huésped han sido manipuladas adicionalmente para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que presentan actividad de a-manosidasa II (Manll). Entre las células huésped se incluyen las células en cultivo, por ejemplo las células en cultivo de mamífero, tales como las células CHO, las células BHK, las células NSO, las células SP2/0, las células de mieloma YO, las células de mieloma de ratón P3X63, las células PER, las células PER.C6 ó las células de hibridoma, las células de levadura, las células de insecto y las células vegetales, entre otras, aunque también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal en cultivo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "polipéptido que presenta actividad de GnTIII" se refiere a polipéptidos que son capaces de catalizar la adición de un residuo N-acetilglucosamina (GkNAc) en enlace b-1,4 al manósido b-ligado del núcleo trimanosilo de los oligosacáridos N-ligados. Lo anterior incluye polipéptidos de fusión que muestran una actividad enzimática similar, aunque no necesariamente idéntica, a una actividad de b(1,4)-N-306??^1?u?q83pph?1?G3h8?6G383 III, también conocida como b-1,4-manosil-glucoproteína 4^-N-acetilglucosaminiltransferasa (EC 2.4.1.144), según el Comité de Nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), según medición en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de dosis. En el caso de que exista dependencia de dosis, no es necesariamente idéntica a la de GnTIII, sino que es sustancialmente similar a la dependencia de dosis en una actividad dada en comparación con GnTIII (es decir, el polipéptido candidato mostrará una mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos y, preferentemente, no más de aproximadamente 10 veces menos actividad, y más preferentemente, no más de aproximadamente tres veces menos actividad que GnTIII). En determinadas realizaciones, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización en Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi. Particularmente, el dominio de localización en el Golgi es el dominio de localización de la manosidasa II o GnTI, más particularmente el dominio de localización de la manosidasa II. Alternativamente, el dominio de localización en el Golgi se selecciona de entre el grupo que consiste de: el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de GnTII y el dominio de localización de al,6-fucosiltransferasa nuclear. Los métodos para generar dichos polipéptidos de fusión y la utilización de los mismos para producir anticuerpos con funciones efectoras incrementadas se dan a conocer en el documento WO n° 2004/065540, en la solicitud provisional de patente US n° 60/495.142 y en la solicitud publicada de patente US n° 2004/0241817, el contenido completo de las cuales se incorporar expresamente como referencia en la presente memoria. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "dominio de localización en el Golgi" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido residente en el Golgi que es responsable del anclaje del polipéptido a una localización dentro del complejo de Golgi. Generalmente, los dominios de localización comprenden "colas" amino-terminales de un enzima.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "polipéptido que presenta actividad de Manll" se refiere a polipéptidos que son capaces de catalizar la hidrólisis de los residuos terminales de a-D-manosa 1,3 y 1,6-ligados en el intermediario GlcNAcMan5GlcNAc2 mañosa ramificado de los oligosasacáridos N-ligados. Lo anterior incluye polipéptidos que muestran una actividad enzimática similar, aunque no necesariamente idéntica, a una actividad de a-manosidasa II del Golgi, también conocida como el oligosacárido manosilo 1,3-1,6-a-manosidasa II (EC 3.2.1.114), según el Comité de Nomenclatura del International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC- IUBMB).

Un "receptor de Fe activador" es un receptor de Fe que, tras el acoplamiento de una región Fe de un anticuerpo, induce sucesos de señalización que estimulan la célula portadora de receptor a llevar a cabo funciones efectoras. Entre los receptores de Fe activadores se incluyen FcyRIIIa (CDlóa), FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).

La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunológico que conduce a la lisis de las células diana recubiertas de anticuerpos por parte de las células inmunológicas efectoras. Las células diana son células a las que los anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprende una región Fe se unen específicamente, generalmente mediante una parte proteína situada N-terminalmente respecto a la región Fe. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ADCC incrementada/reducida" se define como un incremento/reducción del número de células diana que resultan Usadas en un tiempo dado, a una concentración dada de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, mediante el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o una reducción/incremento de la concentración de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, necesaria para conseguir la lisis de un número dado de células diana en un tiempo dado mediante el mecanismo de ADCC. El incremento/reducción de la ADCC es respecto a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped, utilizando los mismos métodos estándares de producción, purificación, formulación y almacenamiento (que son conocidos por el experto en la materia), pero que no ha sido inducida artificialmente. Por ejemplo, el incremento de la ADCC mediada por un anticuerpo producido por células huésped manipuladas para que presenten un patrón alterado de glucosilación (por ejemplo para expresar la glucosiltransferasa, GnTIII, u otras glucosiltransferasas) mediante los métodos descritos en la presente memoria, es respecto a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped no manipuladas.

La expresión “anticuerpo que presenta una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementada/reducida” se refiere a un anticuerpo que presenta una ADCC incrementada/reducida según se determina mediante cualquier método adecuado conocido por el experto ordinario en la materia. Un ensayo in vitro de ADCC aceptado es el siguiente: 1) el ensayo utiliza células diana que es conocido que expresan el antígeno diana reconocido por la región de unión a antígeno del anticuerpo, 2) el ensayo utiliza células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas, aisladas a partir de sangre de un donante sano seleccionado aleatoriamente, a modo de células efectoras, 3) el ensayo se lleva a cabo según el protocolo siguiente: i) se aíslan las PBMC utilizando procedimientos estándares de centrifugación en gradiente de densidad y se suspenden a una densidad de 5x106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI, ii) se cultivan las células diana mediante métodos de cultivo de tejido estándares, se recolectan de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior al 90%, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 pCuries de 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular, y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml, iii) se transfieren 100 microlitros de la suspensión final de células diana anteriormente indicada a cada pocilio de una placa de microtitulación de 96 pocilios, iv) el anticuerpo se diluye en serie entre 4.000 ng/ml y 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se añaden 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las células diana en la placa de microtitulación de 96 pocilios, realizando un ensayo por triplicado de diversas concentraciones de anticuerpo que cubren el intervalo completo de concentraciones anteriormente indicado, v) para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocilios adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (v/v) de detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis) en lugar de la solución de anticuerpos (punto iv, anteriormente), vi) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocilios adicionales en la placa que contiene las células diana marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solución de anticuerpos (punto iv, anteriormente), vii) la placa de microtitulación de 96 pocilios seguidamente se centrifuga a 50xg durante 1 minuto y se incuba durante 1 hora a 4°C, viii) se añaden 50 microlitros de la suspensión de PBMC (punto i, anteriormente) a cada pocilio, rindiendo una proporción de células efectorasrdiana de 25:1 y las placas se introducen en un incubador bajo una atmósfera con 5% de CO2 a 37°C durante 4 horas, ix) se recolecta el sobrenadante libre de células de cada pocilio y la radioactividad liberada experimentalmente (ER) se cuantifica utilizando un contador gamma, x) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo según la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, en la que ER es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix, anteriormente) para la concentración de anticuerpos correspondiente, MR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix, anteriormente) para los controles MR (ver el punto v, anteriormente), y SR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix, anteriormente) para los controles SR (ver el punto vi, anteriormente), 4) se define “ADCC incrementada/reducida” como un incremento/reducción del porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a ensayo anteriormente, y/o una reducción/incremento de la concentración de anticuerpos necesaria para alcanzar la mitad del porcentaje máximo de lisis específica observado dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a ensayo anteriormente. El incremento/reducción de la ADCC es respecto a la ADCC medida con el ensayo anteriormente indicado, mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped, utilizando los mismos métodos estándares de producción, purificación, formulación y almacenamiento, que son conocidos por el experto en la materia, pero que no ha sido inducida artificialmente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "combinación" (y variaciones gramaticales de la misma, tales como "combina" o "combinando") comprende combinaciones de un ¡nmunoconjugado y un anticuerpo según la invención en las que el inmunoconjugado y el anticuerpo se encuentran en el mismo recipiente o en recipientes diferentes, en la misma formulación farmacéutica o en diferentes formulaciones farmacéuticas, administrados conjunta o separadamente, administrados simultánea o secuencialmente, en cualquier orden, y administrados por la misma vía o por vías diferentes, con la condición de que el inmunoconjugado y el anticuerpo puedan ejercer simultáneamente sus efectos biológicos en el cuerpo, es decir estimular simultáneamente células efectoras. Por ejemplo, "combinar" un inmunoconjugado y un anticuerpo según la invención puede referirse a administrar en primer lugar el inmunoconjugado en una formulación farmacéutica particular, seguido de la administración del anticuerpo en otra formulación farmacéutica, o viceversa.

Una "cantidad efectiva" de un agente se refiere a la cantidad que resulta necesaria para dar lugar a un cambio fisiológico en la célula o tejido en el que se administra.

Una “cantidad terapéuticamente efectiva” de un agente, por ejemplo de una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente, por ejemplo, elimina, reduce, retrasa, minimiza o impide efectos adversos de una enfermedad. Una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de varios ingredientes activos puede ser una cantidad terapéuticamente efectiva de cada uno de los ingredientes activos. Alternativamente, para reducir los efectos secundarios causados por el tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de varios ingredientes activos pueden ser cantidades de los ingredientes activos individuales que resultan efectivas para producir un efecto aditivo, superaditivo o sinérgico, y que en combinación resultan terapéuticamente efectivas, pero que pueden ser cantidades subterapéuticas de uno o varios de los ingredientes activos en caso de utilizarse solos.

Un “individuo” o “sujeto” es un mamífero. Entre los mamíferos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, animales domesticados (por ejemplo vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.

La expresión “composición farmacéutica” se refiere a una preparación que se encuentra en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma resulte efectiva, y que no contiene componentes adicionales que resulten inaceptablemente tóxicos para un sujeto en el que se administre la formulación.

Un “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, aparte de un ingrediente activo, que no resulta tóxico para el sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, aunque sin limitación, un tampón, excipiente, estabilizador o conservante.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “tratamiento” (y las variaciones gramaticales del mismo tales como “tratar” o “tratando”) se refiere a la intervención clínica en un intento para alterar el curso natural del individuo bajo tratamiento, y puede llevarse a cabo para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Entre los efectos deseables del tratamiento se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la reducción de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de metástasis, la reducción de la velocidad de avance de la enfermedad y la mejora o el alivio del estado de la enfermedad, y la remisión o pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, se utilizan combinaciones de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para enlentecer el avance de la misma.

La expresión “impresos dentro del paquete” se utiliza para referirse a las instrucciones habitualmente incluidas en los paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes a la utilización de dichos productos terapéuticos.

Inmunoconj ugados Los inmunoconj ugados útiles en la presente invención son moléculas de polipéptido que comprenden una fracción efectora y un anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida en comparación con el anticuerpo no manipulado correspondiente.

Los inmunoconj ugados pueden prepararse conjugando químicamente la fracción efectora con el anticuerpo o expresando la fracción efectora y el anticuerpo en forma de proteína de fusión (ver, por ejemplo, Nakamura y Kubo, Cáncer 80:2650-2655, 1997, y Becker et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7826-7831, 1996). Para la utilización en la presente invención, resultan generalmente preferentes los inmunoconj ugados expresados en forma de proteínas de fusión. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en determinadas realizaciones, la fracción efectora comparte un enlace peptídico amino-terminal o carboxi-terminal con el anticuerpo (es decir, el inmunoconjugado es una proteína de fusión). En dichos inmunoconjugados, una fracción efectora puede, por ejemplo, fusionarse con una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. Resultan particularmente útiles en la presente invención inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, particularmente un anticuerpo de subclase IgGi de longitud completa.

En una realización, la fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla. En una realización, la fracción efectora es una citoquina. Entre los anticuerpos y fracciones efectoras del inmunoconjugado se incluyen aquellos descritos anteriormente y posteriormente en la presente memoria. El anticuerpo del inmunoconjugado puede dirigirse contra una diversidad de moleculas diana (por ejemplo un determinante antigénico sobre una molécula de proteína expresada sobre una célula tumoral o estroma tumoral). Se describen ejemplos no limitativos de anticuerpos en la presente memoria. Los inmunoconjugados particularmente útiles tal como se describen en la presente memoria típicamente muestran una o más de las propiedades siguientes: elevada especificidad de acción, toxicidad reducida, buena producibilidad y/o estabilidad mejorada, en particular en comparación con inmunoconjugados de diferentes configuraciones con diana en los mismos determinantes antigénicos y portadores de las mismas fracciones efectoras. Se describen en mayor detalle inmunoconjugados particulares para la utilización en la presente invención en la publicación PCT n° WO 2012/146628, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente memoria como referencia.

Formatos de inmunoconjugado Los inmunoconjugados descritos en la publicación PCT n° WO 2012/146628 comprenden no más de una fracción efectora. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en una realización particular, el inmunoconjugado para la utilización en la presente invención comprende no más de una fracción efectora. En una realización particular, la fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla. El anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado según la invención es particularmente un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, más particularmente un anticuerpo de subclase IgG] de longitud completa. En una realización, el anticuerpo es humano. En otras realizaciones, el anticuerpo es humanizado o quimérico. En una realización, el anticuerpo comprende una región Fe humana, más particularmente una región Fe de IgG humana, más particularmente una región Fe de IgGt humana. Los anticuerpos útiles en la invención pueden comprender una región de cadena constante pesada de Igy-l humana, tal como se indica en SEC ID n° 124 (es decir, los anticuerpos son de la subclase IgGi humana).

En una realización, la fracción efectora comparte un enlace peptídico amino-terminal o carboxi-terminal con el anticuerpo. En una realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente de una fracción efectora y un anticuerpo, particularmente un anticuerpo de clase IgG, más particularmente un anticuerpo de subclase IgGi, unido mediante uno o más péptidos conectores. En una realización específica, la fracción efectora se fusiona en su aminoácido aminoterminal con el aminocarboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente mediante un péptido conector.

En determinadas realizaciones, particularmente en el caso de que el inmunoconjugado comprenda únicamente una única fracción efectora, el anticuerpo comprende en la región Fe una modificación que estimula la heterodimerización de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina no idénticas. El sitio de interacción proteína-proteína más extensiva entre las dos cadenas de polipéptido de una región Fe de IgG humana se encuentra en el dominio CH3 de la región Fe. De esta manera, en una realización, dicha modificación se encuentra en el dominio CH3 de la región Fe. En una realización específica, dicha modificación es una modificación de botón-en-ojal, que comprende una modificación de botón en una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina y una modificación de ojal en la otra de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina. La teenología de botón-en-ojal se describe en, por ejemplo, las patentes US n° 5.731.168 y n° 7.695.936; Ridgway et al., Prot. Eng.9:617-621, 1996, y Cárter, J. Immunol. Meth. 248:7-15, 2001. Generalmente, el método implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfaz de un primer polipéptido y una cavidad correspondiente ("ojal") en la interfaz de un segundo polipéptido, de manera que la protuberancia puede situarse en la cavidad de manera que estimule la formación de heterodímero y dificulte la formación de homodímero. Las protuberancias se construyen sustituyendo las cadenas laterales de aminoácidos de pequeño tamaño de la interfaz del primer polipéptido con cadenas laterales de mayor tamaño (por ejemplo tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensatorias de tamaño igual o similar al de las protuberancias en la interfaz del segundo polipéptido mediante la sustitución de las cadenas laterales de aminoácidos grandes por aminoácidos más pequeños (por ejemplo alanina o treonina). La protuberancia y la cavidad pueden realizarse mediante la alteración del ácido nucleico codificante de los polipéptidos, por ejemplo mediante mutagénesis específica de sitio o mediante síntesis peptídica. En una realización específica, una modificación de botón comprende la sustitución de aminoácido T366W en una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, y la modificación de ojal comprende las sustituciones de aminoácidos T366S, L368A y Y407V en la otra de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina (numeración Kabat). En una realización específica adicional, la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de botón comprende además la sustitución de aminoácido S354C, y la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de ojal comprende adicionalmente la sustitución de aminoácido Y349C. La introducción de dos residuos de cisterna resulta en la formación de un puente disulfuro entre las dos cadenas pesadas, estabilizando adicionalmente el dímero (Cárter, J. Immunol. Methods 248:7-15, 2001).

En una realización particular, la fracción efectora se encuentra fusionada con el aminoácido carboxi-terminal de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la modificación de botón.

En una realización alternativa, una modificación que estimula la heterodimerización de dos cadenas polipeptídicas no idénticas comprende una modificación que media en efectos de orientación por interacción electrostática, por ejemplo tal como se describe en la publicación PCT n° WO 2009/089004. Generalmente, este método implica la sustitución de uno o más residuos aminoácidos en la interfaz de las dos cadenas polipeptídicas por residuos aminoácidos cargados de manera que la formación de homodímero resulta desfavorecida electrostáticamente desfavorable, mientras que la heterodimerización resulta favorecida electrostáticamente.

Una región Fe proporciona al inmunoconjugado propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una vida media en suero prolongada, que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribuciones tejido-sangre favorable. Sin embargo, simultáneamente, puede conducir a un reconocimiento no deseable del inmunoconjugado por células que expresan receptores de Fe y no por las células portadoras de antígeno preferentes. Además, la coactivación de las rutas de señalización de receptores de Fe puede conducir a la liberación de citoquinas, lo que, en combinación con la fracción efectora y la vida media prolongada del inmunoconjugado, resulta en una activación excesiva de los receptores de citoquina y en efectos secundarios severos con la administración sistémica. De acuerdo con lo anterior, se ha descrito que los inmunoconjugados de IgG-IL-2 convencionales se asocian a reacciones de infusión (ver, por ejemplo, King et al., J. Clin. Oncol. 22:4463-4473, 2004). Por consiguiente, el anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado se manipula para que presente una función efectora reducida en comparación con el anticuerpo no manipulado correspondiente. En realizaciones particulares, la función efectora reducida es una unión reducida a un receptor de Fe activador. En una de dichas realizaciones, el anticuerpo comprende en su región Fe una o más mutaciones de aminoácidos que reducen la afinidad de unión del inmunoconjugado para un receptor de Fe activador. Típicamente, se encuentra presente la misma o misas mutaciones de aminoácidos en cada una de las dos cadenas pesadas de inmunoglobulina. En una realización, dicha mutación de aminoácido reduce la afinidad de unión del inmunoconjugado para el receptor de Fe activador en por lo menos 2 veces, en por lo menos 5 veces o en por lo menos 10 veces. En realizaciones en las que se produce más de una mutación de aminoácido que reduce la afinidad de unión del inmunoconjugado para el receptor de Fe activador, la combinación de estas mutaciones de aminoácidos puede reducir la afinidad de unión del inmunoconjugado para el receptor de Fe activador en por lo menos 10 veces, en por lo menos 20 veces o incluso en por lo menos 50 veces. En una realización, el inmunoconjugado que comprende un anticuerpo manipulado muestra una afinidad de unión inferior a 20%, particularmente inferior a 10%, más particularmente inferior a 5% para un receptor de Fe activador respecto a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo no manipulado. En una realización específica, el receptor de Fe activador es un receptor de Fcy, más concretamente un receptor de FcyRIIIa, FcyRI o FcyRIIa. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de dichos receptores. En algunas realizaciones, también se reduce la afinidad de unión para un componente del complemento, concretamente la afinidad de unión para Clq. En una realización, no se reduce la afinidad de unión para el receptor de Fe neonatal (FcRn). Se consigue una unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del anticuerpo a dicho receptor, en el caso de que el anticuerpo (o el inmunoconjugado que comprende dicho anticuerpo) muestre una afinidad de unión superior a aproximadamente 70% respecto a la de una forma no manipulada del anticuerpo (o del inmunoconjugado que comprende dicha forma no manipulada del anticuerpo) para FcRn. Los anticuerpos, o inmunoconjugados que comprenden dichos anticuerpos, pueden mostrar más de aproximadamente 80%, e incluso más de aproximadamente 90% de dicha afinidad. En una realización, la mutación de aminoácido es una sustitución de aminoácido. En una realización, el anticuerpo, particularmente un anticuerpo de subclase IgGi humana, comprende una sustitución de aminoácido en la posición P329 de la cadena pesada de inmunoglobulina (numeración Kabat). En una realización más específica, la sustitución de aminoácido es P329A o P329G, particularmente P329G. En una realización, el anticuerpo comprende una sustitución adicional de aminoácido en una posición seleccionada de entre S228, E233, L234, L235, N297 y P331 de la cadena pesada de la inmunoglobulina. En una realización más específica, la sustitución adicional de aminoácido es S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En una realización particular, el anticuerpo comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones P329, L234 y L235 de la cadena pesada de la inmunoglobulina (numeración Kabat). En una realización más particular, el anticuerpo comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G (LALA P329G) en la cadena pesada de la inmunoglobulina. Esta combinación de sustituciones de aminoácidos anula prácticamente de manera particularmente eficiente la unión de receptores de Fcy de una molécula de IgG humana y por lo tanto reduce la función efectora, incluyendo la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), tal como se indica en la publicación PCT n° W02012/130831, incorporada como referencia en la presente memoria en su totalidad. El documento n° W02012/130831 describe además métodos de preparación de dichos anticuerpos mutantes y métodos para determinar sus propiedades, tales como la unión de receptores de Fe o funciones efectoras. Pueden prepararse anticuerpos mutantes mediante deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos utilizando métodos genéticos o químicos bien conocidos de la téenica. Entre los métodos genéticos pueden incluirse la mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, la PCR, la síntesis génica y similares. Los cambios de nucleótidos correctos pueden verificarse, por ejemplo, mediante secuenciación.

La unión a receptores de Fe puede determinarse fácilmente, por ejemplo mediante ELISA, o mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando instrumentación estándar, tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare) y receptores de Fe tales como los que pueden obtenerse mediante expresión recombinante. Se describe en la presente memoria un ensayo de unión adecuado de este tipo. Alternativamente, la afinidad de unión de anticuerpos o inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo para receptores de Fe puede evaluarse utilizando líneas celulares que es conocido que expresan receptores de Fe particulares, tales como células NK que expresan receptor de FcylIIa.

En algunas realizaciones, el anticuerpo del inmunoconjugado se manipula para que presente una función efectora reducida, particularmente una ADCC reducida, en comparación con un anticuerpo no manipulado.

La función efectora de un anticuerpo o de un inmunoconjugado que comprenda un anticuerpo puede medirse mediante métodos conocidos de la téenica. Se describe en la presente memoria un ensayo adecuado para medir la ADCC. Otros ejemplos de ensayos in vitro de evaluación de la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente US n° 5.500.362; Hellstrom et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986, y Hellstrom et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:1499-1502, 1985; patente US n° 5.821.337; Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987. Alternativamente, pueden utilizarse métodos de ensayo no radioactivos (ver, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA) y el ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Entre las células efectoras útiles para dichos ensayos se incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede someterse a ensayo in vivo, por ejemplo en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:652-656, 1998.

En algunas realizaciones, se altera la unión del anticuerpo a un componente del complemento, concretamente a Clq. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones en las que se manipula el anticuerpo para que presente una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye una CDC reducida. Pueden llevarse a cabo ensayos de unión de Clq para determinar si el inmunoconjugado es capaz de unirse a Clq y por lo tanto si presenta actividad de CDC. Ver, por ejemplo, el ELISA de unión de Clq y C3c en los documentos n° W02006/029879 y n° W02005/ 100402. Para evaluar la activación del complemento puede llevarse a cabo un ensayo de CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202:163, 1996; Cragg et al, Blood 101:1045-1052, 2003; y Cragg y Glennie, Blood 103:2738-2743, 2004).

En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende uno o más sitios de corte proteolítico situados entre la fracción efectora y el anticuerpo. Pueden unirse componentes del inmunoconjugado directamente o mediante diversos conectores, particularmente péptidos conectores que comprenden uno o más aminoácidos, típicamente 2 a 20 aminoácidos aproximadamente, los cuales se describen en la presente memoria o son conocidos de la téenica. Entre los péptidos conectores no inmunogénicos adecuados se incluyen, por ejemplo, los péptidos conectores (G4S)n, (SG4)n o G4(SG4)n, en los que n es generalmente un número entre 1 y 10, típicamente entre 2 y 4.

Anticuerpos de inmunoconiugados El anticuerpo del inmunoconjugado de la invención es generalmente una molécula de inmunoglobulina que se une a un determinante antigénico específico y es capaz de dirigir la entidad a la que se encuentra unido (por ejemplo una fracción efectora) a un sitio diana, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o estroma tumoral que porta el determinante antigénico. El inmunoconjugado puede unirse a determinantes antigénicos presentes, por ejemplo, sobre las superficies de las células tumorales, sobre las superficies de las células infectadas por virus, sobre las superficies de otras células enfermas, libres en el suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC). Entre los ejemplos no limitativos de antígenos tumorales se incluyen MAGE, MART-l/Melán-A, gplOO, dipeptidilpeptidasa-IV (DPPIV), proteína de unión a adenosina desaminasa (ADAbp), ciclofilina-b, antígeno asociado a tumor colorrectal (CRC)-C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etvó, amll, antígeno prostático específico (PSA) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2 y PSA-3, antígeno prostático específico de membrana (PSMA), receptor de células T/cadena zeta de CD3, familia MAGE de antígenos tumorales (por ejemplo MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-All, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4 y MAGE-C5), familia GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, a-fetoproteína, E-cadherina, a-catenina, b-catenina y g-catenina, pl20ctn, gplOO Pmelll7, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de poliposis coli adenomatosa (APC), fodrina, connexina-37, idiotipo Ig, pl5, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, productos víricos tales como las proteínas del virus del papiloma humano, familia Smad de antígenos tumorales, lmp-1, PIA, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-l, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, y c-erbB-2. Entre los ejemplos no limitativos de antígenos víricos se incluyen la hemaglutinina del virus influenza, LMP-1 del virus de Epstein-Barr, glucoproteína-E2 del virus de la hepatitis C, gpl60 del V1H, y gpl20 del V1H. Entre los ejemplos no limitativos de antígenos de la MEC se incluyen sindecano, heparanasa, integrinas, osteopontina, link, cadherinas, laminina, EGF de tipo laminina, lectina, fibronectina, notch, tenascina y matrixina. Los inmunoconjugados de la invención pueden unirse a los ejemplos no limitativos específicos siguientes de antígenos de la superficie celular: FAP, Her2, EGFR, IGF- IR, CD2 (antígeno de superficie de las células T), CD3 (heteromultímero asociado a TCR), CD22 (receptor de las células B), CD23 (receptor de IgE de baja afinidad), CD25 (cadena a de receptor de IL-2), CD30 (receptor de citoquina), CD33 (antígeno de superficie de las células mieloides), CD40 (receptor del factor de necrosis tumoral), IL-6R (receptor de IL6), CD20, MCSP, c-Met, proteína-1 que contiene dominio CUB (CDCP1), y PDGF R (receptor b de factor de crecimiento derivado de plaquetas).

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se dirige a un antígeno presentado sobre una celular o en un ambiente de célula tumoral. En una realización específica, el anticuerpo se dirige a un antígeno seleccionado de entre el grupo de la proteína de activación fibroblástica (FAP), el dominio Al de la tenascina-C (TNC Al), el dominio A2 de la tenascina-C (TNC A2), el dominio extra B de la fibronectina (EDB), el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el proteoglicano condroitín-sulfato asociado al melanoma (MCSP).

El anticuerpo puede ser cualquier tipo de anticuerpo o fragmento del mismo que conserve la unión específica a un determinante antigénico y comprenda una región Fe. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. Los anticuerpos particularmente preferentes son las inmunoglobulinas de la clase IgG, concretamente de la subclase IgG .

En una realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que es específico para el dominio Al y/o A4 de la tenascina (TNC-A1 ó TNC-A4 ó TNC-A1/A4). En una realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 8 ó SEC ID n° 9, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 6 ó SEC ID n° 7, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 8 ó SEC ID n° 9 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 6 ó SEC ID n° 7, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad.

En una realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que es específico para el dominio A2 de la tenascina (TNC-A2). En una realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 5, SEC ID n° 71, SEC ID n° 73, SEC ID n° 75, SEC ID n° 77, SEC ID n° 79, SEC ID n° 81, SEC ID n° 83 y SEC ID n° 85, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 4, SEC ID n° 70, SEC ID n° 72, SEC ID n° 74, SEC ID n° 76, SEC ID n° 78, SEC ID n° 80, SEC ID n° 82 y SEC ID n° 84, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 5, SEC ID n° 71, SEC ID n° 73, SEC ID n° 75, SEC ID n° 77, SEC ID n° 79, SEC ID n° 81, SEC ID n° 83 y SEC ID n° 85 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 3, SEC ID n° 4, SEC ID n° 70, SEC ID n° 72, SEC ID n° 74, SEC ID n° 76, SEC ID n° 78, SEC ID n° 80, SEC ID n° 82 y SEC ID n° 84, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad.

En una realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que es específico para la proteína de activación fibroblástica (FAP). En una realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% identica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 12, SEC ID n° 14, SEC ID n° 15, SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 21, SEC ID n° 23, SEC ID n° 25, SEC ID n° 27, SEC ID n° 29, SEC ID n° 31, SEC ID n° 33, SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43, SEC ID n° 45, SEC ID n° 47, SEC ID n° 49, SEC ID n° 51, SEC ID n° 53, SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 59, SEC ID n° 61, SEC ID n° 63, SEC ID n° 65, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 69, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° SEC ID n° 10, SEC ID n° 11, SEC ID n° 13, SEC ID n° 16, SEC ID n° 18, SEC ID n° 20, SEC ID n° 22, SEC ID n° 24, SEC ID n° 26, SEC ID n° 28, SEC ID n° 30, SEC ID n° 32, SEC ID n° 34, SEC ID n° 36, SEC ID n° 38, SEC ID n° 40, SEC ID n° 42, SEC ID n° 44, SEC ID n° 46, SEC ID n° 48, SEC ID n° 50, SEC ID n° 52, SEC ID n° 54, SEC ID n° 56, SEC ID n° 58, SEC ID n° 60, SEC ID n° 62, SEC ID n° 64, SEC ID n° 66 y SEC ID n° 68, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 12, SEC ID n° 14, SEC ID n° 15, SEC ID n° 17, SEC ID n° 19, SEC ID n° 21, SEC ID n° 23, SEC ID n° 25, SEC ID n° 27, SEC ID n° 29, SEC ID n° 31, SEC ID n° 33, SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43, SEC ID n° 45, SEC ID n° 47, SEC ID n° 49, SEC ID n° 51, SEC ID n° 53, SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 59, SEC ID n° 61, SEC ID n° 63, SEC ID n° 65, SEC ID n° 67 y SEC ID n° 69 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia seleccionada de entre el grupo de SEC ID n° 10, SEC ID n° 11, SEC ID n° 13, SEC ID n° 16, SEC ID n° 18, SEC ID n° 20, SEC ID n° 22, SEC ID n° 24, SEC ID n° 26, SEC ID n° 28, SEC ID n° 30, SEC ID n° 32, SEC ID n° 34, SEC ID n° 36, SEC ID n° 38, SEC ID n° 40, SEC ID n° 42, SEC ID n° 44, SEC ID n° 46, SEC ID n° 48, SEC ID n° 50, SEC ID n° 52, SEC ID n° 54, SEC ID n° 56, SEC ID n° 58, SEC ID n° 60, SEC ID n° 62, SEC ID n° 64, SEC ID n° 66 y SEC ID n° 68, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 12 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 11. En otra realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 17 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 16. En otra realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 47 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 46. En otra realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 63 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 62. En otra realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEC ID n° 67 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEC ID n° 66. En otra realización específica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 125 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 126 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 129, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 127 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 128 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 129, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 130 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 131 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 132, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad.

En una realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que es específico para el proteoglicano condroitín-sulfato del melanoma (MCSP). En una realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 86 ó SEC ID n° 122, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 87 ó SEC ID n° 123, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 86 ó SEC ID n° 122 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 87 ó SEC ID n° 123, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 86 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 87. En otra realización más específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 122 y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 123.

En una realización, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo que es específico para el antígeno carcinoembrionario (CEA). En una realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 114, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 115, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En una realización más específica, el anticuerpo del inmunoconjugado comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 114 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia de región variable de cadena ligera que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia SEC ID n° 115, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad. En otra realización específica, el inmunoconjugado de la presente invención comprende una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 136 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 137 ó variantes de las mismas que conservan funcionalidad y una secuencia polipeptídica que es por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a SEC ID n° 138, o variantes de las mismas que conservan funcionalidad.

Entre los inmunoconjugados según la invención se incluyen aquellos que comprenden secuencias que son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idénticas a las secuencias indicadas en SEC ID n° 3 a n° 87, n° 108 a n° 132 y n° 136 a n° 138, incluyendo los fragmentos funcionales o variantes de las mismas. Los inmunconjugados según la invención comprenden además anticuerpos que comprenden las secuencias SEC ID n° 3 a n° 127 con sustituciones conservadoras de aminoácidos. Se entiende que en las secuencias SEC ID n° 126, n° 128, n° 131, n° 134 y n° 137, la secuencia de la IL-2 muíante indicada en la presente memoria (ver SEC ID n° 2) puede sustituirse por la secuencia de la IL-2 humana (ver SEC ID n° 1).

Fracciones efectoras de inmunoconiugados Las fracciones efectoras para la utilización en la invención generalmente son polipéptidos que influyen sobre la actividad celular, por ejemplo mediante rutas de transducción de señales. De acuerdo con lo anterior, la fracción efectora del inmunoconjugado que resulta útil en la invención puede asociarse a la señalización mediada por receptores que transmite una señal del exterior de la membrana celular para modular una respuesta dentro de la célula. Por ejemplo, una fracción efectora del inmunoconjugado puede ser una citoquina. En una realización particular, la fracción efectora es una fracción efectora de cadena sencilla tal como se define en la presente memoria. En una realización, la fracción efectora, típicamente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado según la invención es una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste de: IL-2, GM-CSF, lFN-a e 1L-12. En una realización, la fracción efectora es IL-2. En otra realización, la fracción efectora de cadena sencilla del inmunoconjugado es una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste de: IL-8, MIR-Ia, MIR-Ib y TGF-b.

En una realización, la fracción efectora, particularmente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es IL-2. En una realización específica, la fracción efectora de IL-2 puede inducir una o más de las respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: proliferación de células linfocitos T activados, diferenciación en células linfocitos T activados, actividad de células T citotóxicas (CTL), proliferación de células B activadas, diferenciación en células B activadas, proliferación de células asesinas naturales (NK), diferenciación en células NK, secreción de citoquinas por parte de células T activadas o de células NK y citotoxicidad antitumoral de NK/células asesinas activadas por linfoquinas (LAK). En determinadas realizaciones, la fracción efectora de IL-2 es una fracción efectora de IL-2 muíante que comprende por lo menos una mutación de aminoácido que reduce o anula la afinidad de la fracción efectora de IL-2 mutante para la subunidad a del receptor de IL-2 (también conocido como CD25) pero conserva la afinidad de la fracción efectora de IL-2 mutante para el receptor de IL-2 de afinidad intermedia (consisten de las subunidades b y g del receptor de IL-2), en comparación con la fracción efectora de IL-2 no mutada. En una realización, las mutaciones de aminoácido son sustituciones de aminoácidos. En una realización especifica, la fracción efectora de IL-2 mutante comprende una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en una, dos o tres posiciones seleccionadas de entre las posiciones correspondientes a los residuos 42, 45 y 72 de la IL-2 humana (SEC ID n° 1). En una realización más específica, la fracción efectora de IL-2 mutante comprende tres sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a los residuos 42, 45 y 72 de la IL-2 humana. En una realización todavía más específica, la fracción efectora de IL-2 mutante es la IL-2 humana que comprende las sustituciones de aminoácidos F42A, Y45A y L72G. En una realización, la fracción efectora de IL-2 mutante comprende además una mutación de aminoácido en una posición correspondiente a la posición 3 de la IL-2 humana, que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2. En particular, dicha mutación adicional de aminoácido es una sustitución de aminoácido que sustituye un residuo de treonina por un residuo de alanina. La secuencia de una IL-2 muíante cuádruple (QM) que comprende las sustituciones de aminoácidos T3A, F42A, Y45A y L72G se muestra en SEC ID n° 2. Las moléculas de IL-2 mutante adecuadas se describen en mayor detalle en la publicación PCT n° W02012/107417.

Las moléculas de IL-2 mutantes que resultan útiles como fracciones efectoras en los inmunoconjugados pueden prepararse mediante deleción, sustitución, inserción o modificación utilizando métodos genéticos o químicos bien conocidos de la téenica. Entre los métodos genéticos pueden incluirse la mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, la PCR, la síntesis génica y similares. Los cambios de nucleótidos correctos pueden vertificarse, por ejemplo, mediante secuenciación. A este respecto, la secuencia de nucleótidos de la IL-2 nativa ha sido descrita por Taniguchi et al. (Nature 302:305-10, 1983) y el ácido nucleico codificante de la IL-2 humana se encuentra disponible de depósitos públicos tales como la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Se muestra una secuencia ejemplar de la IL-2 humana en SEC ID n° 1. La sustitución o la inserción puede implicar residuos aminoácidos naturales, así como no naturales. La modificación de aminoácidos incluye métodos bien conocidos de modificación química, tales como la adición o eliminación de sitios de glucosilación o de uniones de carbohidratos, y similares.

En una realización, la fracción efectora, particularmente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es GM-CSF. En una realización específica, la fracción efectora GM-CSF puede inducir la proliferación y/o diferenciación en un granulocito, monocito o célula dendrítica. En una realización, la fracción efectora, particularmente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es IFN-a. En una realización específica, la fracción efectora de IFN-a puede inducir una o más de las respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: inhibir la replicación vírica en una célula infectada por virus y regular positivamente la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC-I). En otra realización específica, la fracción efectora IFN-a puede inhibir la proliferación en una célula tumoral. En una realización, la fracción efectora, particularmente una fracción efectora de cadena sencilla, del ¡nmunoconjugado es IL-12. En una realización específica, la fracción efectora de IL-12 puede inducir una o más de las respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: proliferación de células NK, diferenciación en células NK, proliferación de células T y diferenciación en células T. En una realización, la fracción efectora, particularmente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es IL-8. En una realización específica, la fracción efectora IL-8 puede inducir la quimiotaxis en neutrófilos. En una realización, la fracción efectora, particularmente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es MIR-Ia. En una realización específica, la fracción efectora MIP-Ia puede inducir la quimiotaxis en monocitos y en células linfocitos T. En una realización, la fracción efectora, particularmente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es MIR-1b. En una realización específica, la fracción efectora MIP-Ib puede inducir la quimiotaxis en monocitos y en células linfocitos T. En una realización, la fracción efectora, particularmente una fracción efectora de cadena sencilla, del inmunoconjugado es TGF-b. En una realización específica, la fracción efectora de TGB-b puede inducir una o más de las respuestas celulares seleccionadas de entre el grupo que consiste de: quimiotaxis en monocitos, quimotaxis en macró fagos, regulación positiva de la expresión de IL-1 en macrófagos activados y regulación positiva de la expresión de IgA en células B activadas.

Anticuerpos para la combinación con los inmunoconjugados Según la invención, los anticuerpos para la combinación con los inmunoconjugados se manipulan para que presenten una función efectora incrementada. Entre los anticuerpos útiles en la presente invención para la combinación con los inmunoconjugados se incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a un determinante antigénico específico, por ejemplo un antígeno específico de célula tumoral y comprenden una región Fe. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se dirige a un antígeno presentado sobre una célula tumoral. Entre los antígenos diana particulares de los anticuerpos útiles en la presente invención se incluyen antígenos expresados sobre la superficie de las células tumorales, incluyendo, aunque sin limitación, receptores de superficie celular tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), los receptores del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR) y los receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), el antígeno prostético específico de membrana (PSMA), el antígeno carcinoembrionario (CEA), la dipeptidil-peptidasa-IV (CD26, DPPIV), FAP, HER2/neu, HER-3, cadherina-E, CD20, proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (MCSP), c-Met, dominio CUB que contiene proteína-1 (CDCP1) y antígeno del carcinoma de células escamosas (SCCA).

En una realización específica, el anticuerpo se dirige a un antígeno seleccionado de entre el grupo de CD20, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), HER2, HER3, el receptor del factor- 1 de crecimiento similar a insulina (IGF- IR), el antígeno carcinoembrionario (CEA), c-Met, dominio CUB que contiene proteína- 1 (CDCP1) y proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (MCSP). En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico dirigido contra dos o más antígenos seleccionados de entre el grupo de CD20, receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR), HER2, HER3, el receptor del factor-1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1R), el antígeno carcinoembrionario (CEA), c-Met, dominio CUB que contiene proteína- 1 (CDCP1) y proteoglicano condroitín-sulfato asociado a melanoma (MCSP).

Los anticuerpos anti-CD20 específicos útiles en la presente invención son anticuerpos anti-CD20 de clase IgG de tipo II humanizados que presentan la especificidad de unión del anticuerpo de B-Lyl murino (Poppema y Visser, Biotest Bulletin 3:131-139, 1987). Resulta particularmente útil un anticuerpo anti-CD20 de clase IgG de tipo II humanizado que comprende: a) en el dominio variable de cadena pesada, una región CDR1 de secuencia SEC ID n° 88, una región CDR2 de secuencia SEC ID n° 89, y una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 90, y b) en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR1 de secuencia SEC ID n° 91, una región CDR2 de secuencia SEC ID n° 92, y una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 93.

En particular, las regiones marco de región variable de cadena pesada (FR) FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias de FR humana codificadas por la secuencia de línea germinal humana VH1 10, la región FR4 de región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo es una secuencia de FR humana codificada por la secuencia de línea germinal humana JH4, las FR de la región variable de cadena ligera FR1, FR2 y FR3 de dicho anticuerpo son secuencias de FR humanas codificadas por la secuencia de línea germinal humana VK 2 40 y la FR4 de la región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo es una secuencia de FR humana codificada por la secuencia de línea germinal humana JK4.

Un anticuerpo anti-CD20 más particular que resulta útil en la presente invención comprende el dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 94 y el dominio de región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 95.

Dichos anticuerpos anti-CD20 se describen en el documento n° W02005/044859, que se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.

Los anticuerpos anti-EGFR específicos útiles en la presente invención son anticuerpos de clase IgG humanizados que presentan la especificidad de unión del anticuerpo de ICR62 de rata (Modjtahedi et al., Br. J. Cáncer 67:247-253, 1993). Resulta particularmente útil un anticuerpo anti-EGFR de clase IgG humanizado que comprende: a) en el dominio variable de cadena pesada, una CDR1 de secuencia SEC ID n° 96, una región CDR2 de secuencia SEC ID n° 97, y una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 98, y b) en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR1 de secuencia SEC ID n° 99, una región CDR2 de secuencia SEC ID n° 100, y una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 101.

Un anticuerpo anti-EGFR más particular que resulta útil en la invención comprende el dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 102 y el dominio de región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 103.

Dichos anticuerpos anti-EGFR se describen en los documentos n° W02006/082515 y n° W02008/017963, cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.

Entre otros anticuerpos anti-EGFR de clase IgG humanizados adecuados útiles para la invención se incluyen cetuximab/IMC-C225 (Erbitux®, descrito en Goldstein et al., Clin Cáncer Res 1:1311-1318, 1995), panitumumab/ABX-EGF (Vectibix®, descrito en Yang et al, Cáncer Res 59:1236-1243, 1999), Yang et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology 38:17-23, 2001), nimotuzumab/h-R3 (TheraCim®, descrito en Mateo et al., Immunotechnology 3:71-81, 1997; Crombet-Ramos et al, Int. J. Cáncer 101:567-575, 2002; Boland & Bebb, Expert Opin. Biol. Ther. 9:1199-1206, 2009), matuzumab/EMD 72000 (descrito en Bier et al, Cáncer Immunol. Immunother. 46:167-173, 1998; Kim, Curr. Opin. Mol. Ther. 6:96-103, 2004), y zalutumumab/2F8 (descrito en Bleeker et a , J. Immunol. 173:4699-4707, 2004; Lammerts van Bueren, PNAS 105:6109-6114, 2008).

Se describen anticuerpos anti-IGF-lR específicos que resultan útiles en la presente invención en los documentos n° W02005/005635 y n° W02008/077546, el contenido de cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia, y que inhiben la unión del factor- 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) y el factor-2 de crecimiento similar a la insulina (IGF-2) al receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF- IR).

Los anticuerpos anti-IGF-lR útiles para la invención preferentemente son anticuerpos monoclonales y, además, anticuerpos quimericos (dominio constante humano), anticuerpos humanizados y con especial preferencia los anticuerpos totalmente humanos. Algunos anticuerpos anti-IGF-lR particulares que resultan útiles para la invención se unen al IGF-1R humano en competición con el anticuerpo 18, es decir, se unen al mismo epítopo de IGF-1R que el anticuerpo 18, el cual ha sido descrito en el documento n° W02005/005635. Algunos anticuerpos anti-IGF-lR particulares se caracterizan además por una afinidad para IGF-1R de 108 M (KD) O inferior, en particular de entre aproximadamente 109 y 1013 M, y preferentemente no muestran una inhibición detectable dependiente de la concentración de la unión de insulina al receptor de insulina.

Algunos anticuerpos anti-IGF-lR particulares que resultan útiles para la invención comprenden regiones determinantes de complementariedad (CDR) que presentaban las secuencias siguientes: a) una cadena pesada de anticuerpo que comprendía como CDR, CDR1, CDR2 y CDR3 de secuencia SEC ID n° 104 ó 106, b) una cadena ligera de anticuerpo que comprendía como CDR, CDR1, CDR2 y CDR3 de secuencia SEC ID n° 105 ó 107.

En particular, los anticuerpos anti-IGF-lR que resultan útiles para la invención comprenden una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de anticuerpo SEC ID n° 104 y una secuencia del dominio variable de cadena ligera de anticuerpo de SEC ID n° 105 y una secuencia del dominio variable de cadena pesada de anticuerpo de SEC ID n° 106 y una secuencia del dominio variable de cadena ligera de anticuerpo de SEC ID n° 107.

Algunos anticuerpos anti-IGF-lR particulares que resultan útiles para la invención pueden obtenerse a partir de las líneas celulares de hibridoma <IGF-1R> HUMAB-Clón 18 y <IGF-1R> HUMAB-Clón 22, las cuales han sido depositadas en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania, bajo los números de depósito DSM ACC 2587 y DSM ACC 2594, respectivamente.

Otros anticuerpos anti-IGF-lR adecuados que resultan útiles para la invención son, por ejemplo, el mAb IgGi totalmente humano cixutumumab/IMC-A12 (descrito en Burtrum et al, Cáncer Res. 63:8912-21, 2003; Rowinsky et al., Clin. Cáncer Res. 13:5549s-5555s, 2007; el mAb IgGl totalmente humano AMG-479 (descrito en Beltran et al., Mol. Cáncer Ther. 8:1095-1105, 2009; Tolcher et al, J. Clin. Oncol. 27:5800-7, 2009), el mAb IgGi humanizado MK-0646/h7C10 (descrito en Goetsch et al., Int. J. Cáncer 113:316-28, 2005; Broussas et al., Int. J. Cáncer 124:2281-93, 2009; Hidalgo et al, J. Clin. Oncol. 26, resumen n° 3520, 2008; Atzori et al., J. Clin. Oncol. 26, resumen n° 3519, 2008,); el mAb IgGt humanizado AVE1642 (descrito en Descamps et al., Br. J. Cáncer 100:366-9, 2009; Tolcher et al., J. Clin. Oncol. 26, resumen n° 3582, 2008; Moreau et al., Blood 110, resumen n° 1166, 2007; Maloncy et al., Cáncer Res 63:5073-83, 2003), el mAb IgG2 totalmente humano figitumumab/CP-751,871 (Cohen et al., Clin. Cáncer Res. 11:2063-73, 2005; Haluska et al., Clin. Cáncer Res. 13:5834-40, 2007; Lacy et al., J. Clin. Oncol. 26:3196-203, 2008; Gualberto & Karp, Clin. Lung Cáncer 10:273-80, 2009; el mAb IgGi totalmente humano SCH-717454 (descrito en el documento n° W02008/076257 ó en Kolb et al, Pediatr. Blood Cáncer 50:1190-7, 2008); el mAb 2.13.2. (descrito en la patente US n° 7.037.498 (documento n° WO 2002/053596)) o el mAb IgG4 totalmente humano BIIB022. Los anticuerpos anti-CEA específicos útiles en la presente invención son anticuerpos de clase IgG humanizados que presentan la especificidad de unión de PR1A3 murino (Richman y Bodmer, Int. J. Cáncer 39:317-328, 1987). Resulta particularmente útil un anticuerpo anti-CEA de clase IgG humanizado que comprende: a) en el dominio variable de cadena pesada, una CDR1 de secuencia SEC ID n° 108, una región CDR2 de secuencia SEC ID n° 109, y una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 110, y b) en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR1 de secuencia SEC ID n° 111, una región CDR2 de secuencia SEC ID n° 112, y una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 113.

Un anticuerpo anti-CEA más particular que resulta útil en la invención comprende el dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 114 y el dominio de región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 115.

Dichos anticuerpos anti-CEA se describen en la publicación PCT n° WO2011/023787, que se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.

Son anticuerpos anti-HER3 específicos que resultan útiles en la presente invención los anticuerpos de clase IgG humanizados tales como Mab 205.10.1, Mab 205.10.2 y Mab 205.10.3, particularmente Mab 205.10.2, descrito en la publicación PCT n° WO2011/076683. Resulta particularmente útil un anticuerpo anti-HER3 de clase IgG humanizado que comprende: a) en el dominio variable de cadena pesada, una CDR1 de secuencia SEC ID n° 139, una región CDR2 de secuencia SEC ID n° 140, y una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 141, y b) en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR1 de secuencia SEC ID n° 143, una región CDR2 de secuencia SEC ID n° 144, y una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 145.

Un anticuerpo anti-HER3 más particular que resulta útil en la invención comprende el dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 142 y el dominio de región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 146.

Son anticuerpos anti-CDCPl específicos que resultan útiles en la presente invención, los anticuerpos de clase IgG humanizados derivados del anticuerpo CUB4 (número de depósito n° DSM ACC 2551 (DSMZ)), tal como se describe en la publicación PCT n° WO2011/023389.

Se describen anticuerpos anti-MCSP ejemplares que pueden utilizarse en la presente invención, por ejemplo, en la solicitud de patente europea n° EP 11178393.2. Resulta particularmente útil un anticuerpo anti-MCSP de clase IgG humanizado que comprende: a) en el dominio variable de cadena pesada, una CDR1 de secuencia SEC ID n° 116, una región CDR2 de secuencia SEC ID n° 117, y una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 118, y b) en el dominio variable de cadena ligera, una región CDR1 de secuencia SEC ID n° 119, una región CDR2 de secuencia SEC ID n° 120, y una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 121.

Un anticuerpo anti-MCSP más particular que resulta útil en la invención comprende el dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 122 y el dominio de región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 123.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de clase IgG de longitud completa. En una realización particular, el anticuerpo es un anticuerpo IgG]. En una realización, el anticuerpo comprende una región Fe humana, más particularmente una región Fe de IgG humana, más particularmente una región Fe de IgG humana. Los anticuerpos útiles en la invención, tales como los anticuerpos anti-IGF-lR, anti-EGFR y anti-CD20 indicados anteriormente, pueden comprender una región constante de cadena pesada de Igyl humana, tal como se indica en SEC ID n° 124 (es decir, los anticuerpos son de la subclase IgGi humana).

Los anticuerpos que resultan útiles en la presente invención se manipulan para que presenten una función efectora incrementada en comparación con el anticuerpo no manipulado correspondiente. En una realización, el anticuerpo manipulado para presentar una función efectora incrementada presenta una función efectora incrementada en por lo menos 2 veces, en por lo menos 10 veces o incluso en por lo menos 100 veces respecto al anticuerpo no manipulado correspondiente. La función efectora incrementada puede incluir, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: unión de receptor de Fe incrementada, unión de Clq incrementada y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementada, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, secreción de citoquinas incrementada, incorporación incrementada de antígenos por células presentadoras de antígeno mediada por complejo inmunológico, unión incrementada a células NK, unión incrementada a macrófagos, unión incrementada a monocitos, unión incrementada a células polimorfonucleares, señalización directa inductora de apoptosis incrementada, reticulación de anticuerpos unidos a diana incrementada, maduración de células dendríticas incrementada o sensibilización de células T incrementada.

En una realización, la función efectora incrementada es una o más seleccionadas de entre el grupo de unión a receptor de Fe incrementada, CDC incrementada, ADCC incrementada, ADCP incrementada y secreción de citoquinas incrementada. En una realización, la función efectora incrementada es una unión reducida a un receptor de Fe activador. En una de dichas realizaciones, la afinidad de unión para el receptor de Fe activador se incrementa en por lo menos 2 veces, particularmente en por lo menos 10 veces, en comparación con la afinidad de unión de un anticuerpo no manipulado correspondiente. En una realización específica, el receptor de Fe activador se selecciona de entre el grupo de FcyRIIIa, FcyRI y FcyRIIa. En una realización, el receptor de Fe activador es FcyRIIIa, particularmente FcyRIIIa humano. En otra realización, la función efectora incrementada es ADCC incrementada. En una de dichas realizaciones, la ADCC se incrementa en por lo menos 10 veces, particularmente en por lo menos 100 veces, en comparación con la ADCC mediada por el anticuerpo no manipulado correspondiente. En todavía otra realización, la función efectora incrementada es la unión incrementada a un receptor de Fe activador y la ADCC incrementada.

La función efectora incrementada puede medirse mediante métodos conocidos de la téenica. Se describe en la presente memoria un ensayo adecuado para medir la ADCC. Otros ejemplos de ensayos in vitro de evaluación de la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente US n° 5.500.362; Hellstrom et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986, y Hellstrom et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:1499-1502, 1985; patente US n° 5.821.337; Bruggemann et al, J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987. Alternativamente, pueden utilizarse métodos de ensayo no radioactivos (ver, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA) y el ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Entre las células efectoras útiles para dichos ensayos se incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede someterse a ensayo in vivo, por ejemplo en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:652-656, 1998. La unión a receptores de Fe puede determinarse fácilmente, por ejemplo mediante ELISA, o mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando instrumentación estándar, tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare) y receptores de Fe tales como los que pueden obtenerse mediante expresión recombinante. Según una realización particular, la afinidad de unión para un receptor de Fe activador se mide mediante resonancia de plasmón superficial utilizando un aparato BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25°C.

Alternativamente, la afinidad de unión de anticuerpos para receptores de Fe puede evaluarse utlizando líneas celulares que es conocido que expresan receptores de Fe particulares, tales como células NK que expresan el receptor de FcylIIa. También pueden llevarse a cabo ensayos de unión de Clq para determinar si el anticuerpo es capaz de unirse a Clq y por lo tanto si presenta actividad de CDC. Ver, por ejemplo, el ELISA de unión de Clq y C3c en los documentos n° W02006/029879 y n° W02005/100402. Para evaluar la activación del complemento puede llevarse a cabo un ensayo de CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202:163, 1996; Cragg et al, Blood 101:1045-1052, 2003; y Cragg y Glennie, Blood 103:2738-2743, 2004).

Puede resultar una función efectora incrementada, por ejemplo, de la glucomanipulación de la región Fe o de la introducción de mutaciones de aminoácidos en la región Fe del anticuerpo. En una realización, el anticuerpo se manipula mediante la introducción de una o más mutaciones de aminoácidos en la región Fe. En una realización específica, las mutaciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos. En una realización todavía más específica, las sustituciones de aminoácidos se encuentran en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración EU de los residuos). Se describen mutaciones de aminoácidos adecuadas adicionales en, por ejemplo, Shields et al, J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604, 2001; patente US n° 6.737.056 y documentos n° W02004/063351 y n° W02004/099249. Pueden prepararse regiones Fe mutantes mediante deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos utilizando métodos genéticos o químicos bien conocidos de la téenica. Entre los métodos genéticos pueden incluirse la mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, la PCR, la síntesis génica y similares. Los cambios de nucleótidos correctos pueden vertificarse, por ejemplo, mediante secuenciación.

En otra realización, el anticuerpo se manipula mediante modificación de la glucosilación en la región Fe. En una realización específica, el anticuerpo se manipula para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. Una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe de un anticuerpo resulta en que el anticuerpo presenta una función efectora incrementada, en particular ADCC incrementada.

En una realización más específica, por lo menos aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 100%, preferentemente por lo menos aproximadamente 50%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 70% de los oligosacáridos N-ligados en la región Fe del anticuerpo se encuentran no fucosilados. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser de tipo híbrido o de tipo complejo.

En otra realización específica, el anticuerpo se manipula para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos bisectados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. En una realización más específica, por lo menos aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 100%, preferentemente por lo menos aproximadamente 50%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 70% de los oligosacáridos N-ligados en la región Fe del anticuerpo se encuentran bisectados. Los oligosacáridos bisectados pueden ser de tipo híbrido o de tipo complejo.

En todavía otra realización específica, el anticuerpo se manipula para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados bisectados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. En una realización más específica, por lo menos aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 100%, preferentemente por lo menos aproximadamente 15%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 35% o por lo menos aproximadamente 50% de los oligosacáridos N-ligados en la región Fe del anticuerpo se encuentran bisectados y no fucosilados. Los oligosacáridos no fucosilados bisectados pueden ser de tipo híbrido o de tipo complejo.

Las estructuras de oligosacárido en la región Fe de anticuerpo pueden analizarse mediante métodos bien conocidos de la téenica, por ejemplo mediante espectrometría de masas MALDI TOF tal como se describe en Umana et al., Nat. Biotechnol. 17:176-180, 1999, o en Ferrara et al., Biotechn. Bioeng. 93:851-861, 2006. El porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es la cantidad de oligosacáridos que no presentan residuos de fucosa, respecto a la totalidad de oligosacáridos unidos a Asn 297 (por ejemplo estructuras complejas, híbridas y ricas en mañosa) e identificada en una muestra tratada con N-glucosidasa F mediante EM MALDI-TOF. Asn 297 se refiere al residuo de asparagina situado en aproximadamente la posición 297 en la región Fe (numeración EU de los residuos de la región Fe); sin embargo, Asn297 también puede encontrarse situado aproximadamente ± 3 aminoácidos cadena arriba o cadena abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. El porcentaje de oligosacáridos bisecados o no fucosilados bisectados se determina de manera análoga.

En una realización, el anticuerpo se manipula para que presenta una glucosilación modificada en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado, mediante la producción del anticuerpo en una célula huésped que presenta una actividad alterada de una o más glucosiltransferasas. Entre las glucosiltransferasas se incluyen b(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), b( 1 ,4)-galactosi ltransferasa (GalT), b(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnTI), b(1,2)-N-h?6??^1u?08hpph?¾Ghh8?6Gh8h II (GnTII) y a(l,6)-fucosiltransferasa. En una realización específica, el anticuerpo se manipula para que presenta una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado, mediante la producción del anticuerpo en una célula huésped que presenta una actividad incrementada de b(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En una realización todavía más específica, la célula huésped adicionalmente presenta una actividad de a-manosidasa II (Manll) incrementada. La metodología de glucomanipulación que puede utilizarse para la manipulación de anticuerpos que resulten útiles para la presente invención ha sido descrita en mayor detalle en Umana eta 1., Nat. Biotechnol. 17:176-180, 1999; Ferrara et al., Biotechn. Bioeng. 93:851-861, 2006; documento n° W099/54342 (patente US n° 6.602.684, patente EP n° 1071700); documento n° W02004/065540 (solicitud publicada de patente US n° 2004/0241817; patente EP n° 1587921), documento n° W003/011878 (solicitud publicada de patente US n° 2003/0175884), el contenido de cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad en la presente memoria. Los anticuerpos glucomanipulados utilizando dicha metodología se denominan GlucoMabs en la presente memoria.

Generalmente, cualquier tipo de línea celular en cultivo, incluyendo las líneas celulares comentadas en la presente memoria, pueden utilizarse para generar líneas celulares para la producción de anticuerpos anti-TNC A2 con un patrón de glucosilación alterado. Entre las líneas celulares particulares se incluyen las células CHO, las células BHK, las células NS0, las células SP2/0, las células de mieloma YO, las células de mieloma de ratón P3X63, las células PER, las células PER.C6 ó las células de hibridoma, y otras células de mamífero. En determinadas realizaciones, las células huésped han sido manipuladas para expresar niveles incrementadas de uno o más polipéptidos que presentan actividad de b(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). En determinadas realizaciones, las células huésped han sido manipuladas adicionalmente para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que presentan actividad de a-manosidasa II (Manll). En una realización específica, el polipéptido que presenta actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización en Golgi de un polipéptido heterólogo residente en el Golgi. En particular, dicho dominio de localización en el Golgi es el dominio de localización en el Golgi de la manosidasa II. Los métodos para generar dichos polipéptidos de fusión y para utilizarlos para producir anticuerpos con funciones efectoras incrementadas se dan a conocer en Ferrara et al., Biotechn. Bioeng. 93:851-861, 2006 y en el documento n° W02004/065540, el contenido completo de los cuales se incorpora expresamente en la presente memoria como referencia.

Las células huésped que contienen la secuencia codificante de un anticuerpo útil para la invención y/o la secuencia codificante de polipéptidos que presentan actividad de glucosiltransferasa y que expresan los productos génicos biológicamente activos pueden identificarse mediante, por ejemplo, hibridación ADN-ADN o ADN-AR , la presencia o ausencia de funciones génicas "marcadoras", la evaluación del nivel de transcripción medido mediante la expresión de los transcritos de AR m respectivos en la célula huésped, o la detección del producto génico medido mediante inmunoensayo o a partir de su actividad biológica, métodos que son bien conocidos de la téenica. La actividad de GnTIII o de Manll puede detectarse mediante, por ejemplo, la utilización de una lectina que se une a productos biosintéticos de GnTIII o Manll, respectivamente. Un ejemplo de dicha lectina es la lectina E4-PHA, que se une preferentemente a oligosacáridos que contiene GlcNAc bisectado. Los productos biosintéticos (es decir, estructuras de oligosacárido específicas) de polipéptidos que presentan actividad de GnTIII o de Manll también pueden detectarse mediante análisis de espectrometría de masas de oligosacáridos liberados de glucoproteínas producidas por células que expresan dichos polipéptidos. Alternativamente, puede utilizarse un ensayo funcional que mide la función efectora incrementada, por ejemplo una unión incrementada a receptores de Fe, mediada por anticuerpos producidos por las células manipuladas con el polipéptido que presenta actividad de GnTIII o de Manll.

En otra realización, el anticuerpo se manipula para que presenta una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado, mediante la producción del anticuerpo en una célula huésped que presenta una actividad reducida de <x(l,6)-fucosiltransferasa. Una célula huésped que presenta actividad de a(l,6)-fucosiltransferasa reducida puede ser una célula en la que el gen de a(l,6)-fucosiltransferasa ha sido interrumpido o desactivado de otra manera, por ejemplo inactivado (ver Yamane-Ohnuki et al, Biotech. Bioeng. 87:614, 2004; Kanda et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688, 2006; Niwa et al., J. Immunol. Methods 306:151-160, 2006).

Entre otros ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados se incluyen células CHO Lee 13 deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545, 1986; publicación de patente US n° 2003/0157108 y documento n° W02004/056312, especialmente en el Ejemplo 11). Los anticuerpos útiles en la presente invención alternativamente pueden glucomanipularse para que presenten residuos de fiicosa reducidos en la región Fe, según las téenicas dadas a conocer en los documentos n° EP 1 176 195 Al, n° W003/084570, n° W003/085119 y solicitudes publicadas de patente US n° 2003/0115614, n° 2004/093621, n° 2004/110282, n° 2004/110704 y n° 2004/132140, y patente US n° 6.946.292 (Kyowa), por ejemplo mediante reducción o anulación de la actividad de una proteína transportadora de GDP-fucosa en las células huésped utilizada para la producción de anticuerpos.

Los anticuerpos glucomanipulados que resultan útiles en la invención también pueden producirse en sistemas de expresión que producen glucoproteínas modificadas, tales como las que se enseñan en el documento n° W003/056914 (GlycoFi, Inc.) o en los documentos n° W02004/057002 y n° W02004/024927 (Greenovation).

Métodos recombinantes Los métodos para producir anticuerpos e inmunoconjugados que resultan útiles en la invención son bien conocidos de la téenica y se describen, por ejemplo, en los documentos n° WO2012/146628, n° W02005/044859, n° W02006/082515, n° W02008/017963, n° W02005/005635, n° W02008/077546, n° WO2011/0237887, n° WO2011/076683, n° WO2011/023389 y n° W02006/100582. Los métodos establecidos para producir anticuerpo policlonales y anticuerpos monoclonales también se describen en, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies, a laboratory manual, Coid Spring Harbor Laboratory, 1988.

Pueden construirse anticuerpos no naturales o fragmentos de los mismos utilizando síntesis peptídica en fase sólida, pueden producirse recombinantemente (por ejemplo tal como se describe en la patente US n° 4.816.567) o pueden obtenerse, por ejemplo, mediante cribado de bibliotecas combinatoriales que comprenden cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.969.108, de McCafferty). Para la producción recombinante de inmunoconjugados y anticuerpos útiles en la invención, se aísla uno o más polinucléotidos codificantes de dichos inmunoconjugados o anticuerpos, y se insertan en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicionales en una célula huésped.

Dichos polinucleótidos pueden aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Pueden utilizarse métodos que son bien conocidos por el experto en la materia para construir vectores de expresión que contienen la secuencia codificante de un anticuerpo o inmunoconjugado conjuntamente con las señales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Entre estos métodos se incluyen las téenicas in vitro de ADN recombinante, las técnicas de síntesis y la recombinación in v/vo/recombinación genética. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis eí al., Molecular cloning: A LABORATORY MANUAL, Coid Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989; y Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wilcy Interscience, N.Y, 1989.

Los inmunoconjugados útiles en la invención pueden expresarse a partir de un único polinucleótido que codifica el inmunoconjugado completo o a partir de múltiples (por ejemplo dos o más) polinucleótidos que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan pueden asociarse mediante, por ejemplo, enlaces disulfúro u otros medios para formar un inmunoconjugado funcional. Por ejemplo, la porción de cadena ligera de un anticuerpo puede encontrarse codificada por un polinucléotido separado de la porción del inmunoconjugado que comprende la porción de cadena pesada del anticuerpo y la fracción efectora. Al coexpresarse, los polipéptidos de cadena pesada se asocian con los polipéptidos de cadena ligera para formar el anticuerpo. Las células huésped adecuadas para la replicación y que permiten la expresión de proteínas recombinantes son bien conocidas de la técnica. Dichas células pueden transfectarse o transducirse según resulte apropiado con el vector de expresión particular y pueden cultivarse grandes cantidades de células que contienen el vector para la siembra de fomentadores a gran escala con el fin de obtener cantidades suficientes de las proteínas, por ejemplo para aplicaciones clínicas. Entre las células huésped adecuadas se incluyen microorganismos procarióticos tales como E. coli o diversas células eucarióticas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, pueden producirse proteínas recombinantes en bacterias en particular en el caso de que no se requiera la glucosilación. Tras la expresión, la proteína puede aislarse a partir de la pasta celular bacteriana en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o de expresión adecuados para vectores codificantes de proteínas, incluyendo hongos y cepas de levaduras cuyas rutas de glucosilación han sido "humanizadas", resultando en la producción de una proteína con un patrón de glucosilación parcial o totalmente humano. Ver Gemgross, Nat. Biotech. 22:1409-1414, 2004, y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215, 2006. Las células huésped adecuadas para la expresión de proteínas (glucosiladas) también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen las células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas que pueden utilizarse conjuntamente con las células de insecto, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También pueden utilizarse los cultivos de células vegetales como huéspedes. Ver, por ejemplo, las patentes US n° 5.959.177, n° 6.040.498, n° 6.420.548, n° 7.125.978 y n° 6.417.429 (que describen la teenología de PLANTIBODIES™ para la producción de anticuerpos en plantas transgénicas). Las células de vertebrado también pueden utilizarse como huéspedes. Por ejemplo, las líneas celulares de mamífero adaptadas para crecer en suspensión pueden resultar útiles. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles se encuentran la línea CV1 renal de mono transformada por SV40 (COS-7), la línea renal embrionaria humana (HEK) (células 293 ó 293 T tal como se describe en, por ejemplo, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977), las células renales de hámster neonato (BHK), las células de sertoli de ratón (células TM4 tal como se describe en, por ejemplo, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980), las células renales de mono (CV1), las células renales de mono verde africano (VERO-76), las células de carcinoma cervical humano (HELA), las células renales caninas (MDCK), las células hepáticas de rata búfalo (BRL 3 A), las células pulmonares humanas (W138), las células hepáticas humanas (Hep G2), las células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), las células TRI (tal como se describe en, por ejemplo, Mather et al, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982), las células MRC 5 y las células FS4. Entre otras línes celulares huésped de mamífero útiles se incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo las células CHO dhfr-(Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980, y líneas celulares de mieloma, tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, ver, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), páginas 255 a 268, 2003. Entre las células huésped se incluyen células en cultivo, por ejemplo las células en cultivo de mamífero, las células de levadura, las células de insecto, las células bacterianas y vegetales, entre otras, aunque también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal en cultivo. En una realización, la célula huésped es una célula eucariótica, particularmente una célula de mamífero, por ejemplo una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula 293 renal embrionaria humana (HEK), una célula linfoide (por ejemplo una célula YO, NSO ó Sp2/0). En el caso de que el anticuerpo y el inmunoconjugado estén destinados a la utilización humana, pueden utilizarse formas quiméricas de anticuerpos en las que las regiones constantes de anticuerpo son de procedencia humana. También puede prepararse una forma humanizada o totalmente humana del anticuerpo según métodos bien conocidos de la téenica (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.565.332, de Winter). La humanización puede conseguirse mediante diversos métodos, incluyendo, aunque sin limitación, (a) la injertación de las CDR no humanas (por ejemplo del anticuerpo donante) en un marco humano (por ejemplo un anticuerpo receptor) y regiones constantes con o sin retención de residuos de marco críticos (por ejemplo los que resultan importantes para conservan una buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo), (b) injertación de únicamente las regiones determinantes de especificidad no humanas (SDR o a-CDR; los residuos críticos para la interacción de anticuerpo-antígeno) sobre regiones marco y constantes humanas, o (c) trasplante de dominios variables no humanos enteros, aunque "cubriéndolos" con una sección similar a humana mediante sustitución de los residuos de superficie. Los anticuerpos humanizados y métodos para la preparación de los mismos se revisan en, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633, 2008, y se describen adicionalmente en, por ejemplo, Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988; Queen etal., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989; patentes US n° 5.821.337, n° 7.527.791, n° 6.982.321 y n° 7.087.409; Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Morrison et al., Proc Nati Acad Sci 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv Immunol 44:65-92, 1988; Verhocyen et al, Science 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec Immun 31(3): 169-217, 1994; Kashmiri et ai, Methods 36:25-34, 2005 (que describe la injertación de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28:489-498, 1991 (que describe la “resuperficialización”); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60, 2005 (que describe el “mezclado de FR”); y Osboum et al., Methods 36:61-68, 2005, y Klimka et al., Br J Cáncer 83:252-260, 2000 (que describe el enfoque de "selección guiada" al mezclado de FR). Pueden producirse anticuerpos humanos y regiones variables humanas utilizando diversas téenicas conocidas. Se describen anticuerpos humanos de manera general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74, 2001, y en Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459, 2008. Las regiones variables humanas pueden formar parte y derivarse de anticuerpos monoclonales humanos preparados mediante el método del hibridoma (ver, por ejemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51 a 63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). También pueden prepararse anticuerpos humanos y regiones variables humanas mediante la administración de un inmunógeno en un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al reto antigénico (ver, por ejemplo, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125, 2005). También pueden generarse anticuerpos humanos y regiones variables humanas mediante aislamiento de las secuencias de región variable de clon de Fv seleccionadas de bibliotecas de expresión fágicas derivadas de seres humanos (ver, por ejemplo, Hoogenboom et al., en: Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., editor, Human Press, Totowa, NJ, 2001) y McCafferty et al, Nature 348:552-554; Clackson et al, Nature 352:624-628, 1991). Los fagos típicamente expresan fragmentos de anticuerpos, en forma de fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o de fragmentos Fab. En determinadas realizaciones, los anticuerpos que resultan útiles en la presente invención se manipulan para que presenten una afinidad de unión incrementada, según, por ejemplo, los métodos dados a conocer en la solicitud publicada de patente US n° 2004/0132066, el contenido completo de la cual se incorpora como referencia en la presente memoria. La capacidad de los anticuerpos que resultan útiles en la invención de unirse a un determinante antigénico específico puede medirse mediante un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) o mediante otras téenicas que resultarán familiares para el experto en la materia, por ejemplo la técnica de resonancia de plasmón superficial (analizada en un sistema BIACORE TI 00) (Liljeblad et al, Glyco J 17:323-329, 2000) y los ensayos de unión tradicionales (Heelcy, Endocr. Res. 28:217-229, 2002).

Los anticuerpos e inmunoconjugados preparados tal como se describe en la presente memoria pueden purificarse mediante técnicas conocidas, tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento, la cromatografía de intercambio iónico, la electroforesis en gel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales utilizadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como la carga neta, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, etc., y resultarán evidentes para el experto en la materia.

Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, en un portador farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas pueden utilizarse en, por ejemplo, cualquiera de los métodos terapéuticos descritos posteriormente.

Se prepararon composiciones farmacéuticas de un inmunoconjugado y un anticuerpo que presenta una función efectora incrementada tal como se ha descrito en la presente memoria mediante la mezcla de dichos inmunoconjugado y anticuerpo que presentaban el grado deseado de pureza, con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A. (editor), 1990), en forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas y entre ellos se incluyen, aunque sin limitación: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamónico, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenes tales como metilparabén o propilparabén; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptido de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Entre los portadores farmacéuticamente aceptables ejemplares en la presente memoria se incluyen agentes de dispersión de fármaco intersticial, tales como glucoproteínas hialuronidasa activas a pH neutro (sHASEGP), por ejempo las glucoproteínas hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Se describen determinadas sHASEGPs ejemplares y métodos de utilización, incluyendo rHuPH20, en las patentes US n° de publicación 2005/0260186 y n° 2006/0104968. En un aspecto, se combina una sHASEGP con una o más glucosaminoglicanasas adicionales, tales como condroitinasas.

Se describen formulaciones liofilizadas ejemplares de anticuerpos en la patente US n° 6.267.958. Entre las formulaciones acuosas de anticuerpos se incluyen las indicadas en la patente US n° 6.171.586 y documento n° W02006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón de histidina-acetato.

La composición farmacéutica en la presente memoria también puede contener ingredientes activos adicionales, según resulte necesario para la indicación particular bajo tratamiento, particularmente aquellos con actividades complementarias que no presente efectos mutuos adversos. Por ejemplo, en el caso de que la enfermedad que deba tratarse sea cáncer, puede resultar deseable proporcionar además uno o más agentes anticáncer, por ejemplo un agente quimioterapéutico, un inhibidor de la proliferación de células tumorales, o un activador de la apoptosis de las células tumorales. Dichos ingredientes activos se encuentran convenientemente presentes en combinación en cantidades que resultan efectivas para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos pueden atraparse en microcápsulas preparadas mediante, por ejemplo, téenicas de coacervado o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración coloidal de fármacos (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se dan a conocer en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Printing Company, 1990.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, encontrándose las matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas.

Las composiciones que deben utilizarse para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede alcanzarse fácilmente mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estéril.

Métodos de tratamiento La combinación proporcionada en la presente memoria de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, puede utilizarse en métodos terapéuticos.

En un aspecto, se proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la utilización como medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la utilización en el tratamiento de enfermedades. En determinadas realizaciones, se proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la utilización en un método de tratamiento. En determinadas realizaciones, la invención proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la utilización en un método de tratamiento de un individuo que presenta una enfermedad, que comprende administrar en el individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación. En una de dichas realizaciones, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se describe posteriormente. En realizaciones adicionales, la invención proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la utilización en la estimulación de la función de las células efectoras. En determinadas realizaciones, la invención proporciona una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la utilización en un método de estimulación de la función de las células efectoras en un individuo, que comprende administrar en el individuo en el individuo una cantidad efectiva de la combinación para estimular la función de las células efectoras. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano. Una "enfermedad" según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas es una enfermedad tratable mediante estimulación de la función de las células efectoras. En determinadas realizaciones, la enfermedad es un trastorno de la proliferación celular, particularmente cáncer.

En un aspecto adicional, la invención proporciona la utilización de una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, en la fabricación o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento está destinado al tratamiento de enfermedades. En una realización adicional, el medicamento está destinado a la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad, que comprende administrar en el individuo que presenta la enfermedad una cantidad terapéuticamente efectiva del medicamento. En una de dichas realizaciones, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se describe posteriormente. En una realización adicional, el medicamento está destinado a la estimulación de la función de las células efectoras. En una realización adicional, el medicamento está destinado a la utilización en un método de estimulación de la función de las células efectoras, que comprende administrar en el individuo una cantidad del medicamento efectiva para estimular la función de las células efectoras. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano. Una "enfermedad" según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas es una enfermedad tratable mediante estimulación de la función de las células efectoras. En determinadas realizaciones, la enfermedad es un trastorno de la proliferación celular, particularmente cáncer.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para el tratamiento de enfermedades. En una realización, el método comprende administrar en un individuo que presenta dicha enfermedad una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada. En una de dichas realizaciones, el método comprende además la administración en el individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se describe posteriormente. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano. Una "enfermedad" según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas es una enfermedad tratable mediante estimulación de la función de las células efectoras. En determinadas realizaciones, la enfermedad es un trastorno de la proliferación celular, particularmente cáncer.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para la estimulación de la función de las células efectoras en un individuo. En una realización, el método comprende administrar en un individuo una cantidad efectiva de una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, con el fin de estimular la función de las células efectoras. En una realización, un "individuo" es un mamífero, particularmente un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las combinaciones de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, proporcionados en la presente memoria para, por ejemplo, la utilización en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriormente indicados. En una realización, una composición farmacéutica comprende una combinación proporcionada en la presente memoria, de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria y por lo menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo tal como se indica posteriormente. Según cualquiera de las realizaciones anteriormente indicadas, la enfermedad es un trastorno tratable mediante estimulación de la función de las células efectoras. Las combinaciones de la invención resultan útiles en el tratamiento de estados de enfermedad en los que resulta beneficiosa la estimulación del sistema inmunológico, en particular condiciones en las que resulta deseable una respuesta inmunológica celular incrementada. Entre ellas pueden incluirse estados de enfermedad en los que la respuesta inmunológica del huésped resulta insuficiente o deficiente. Los estados de enfermedad en los que pueden administrarse las combinaciones de la invención comprenden, por ejemplo, un tumor o infección en la que una respuesta inmunológica celular resultaría un mecanismo crítico para la inmunidad específica. Entre los estados de enfermedad específicos para los que pueden utilizarse combinaciones de la presente invención se incluyen el cáncer, concretamente el carcinoma de células renales o el melanoma, las inmunodeficiencias, concretamente en pacientes V1H-positivos, pacientes inmunosupresores, infección crónica y similares. En determinadas realizaciones, la enfermedad es un trastorno de la proliferación celular. En una realización específica, la enfermedad es el cáncer, concretamente un cáncer seleccionado de entre el grupo de cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer ovárico, cáncer cerebral, linfoma, leucemia y cáncer de piel.

Pueden utilizarse combinaciones de la invención solas o conjuntamente con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, puede coadministrarse una combinación de la invención con por lo menos un agente terapéutico adicional. En determinadas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un agente anticáncer, por ejemplo un agente quimioterapéutico, un inhibidor de la proliferación de las células tumorales, o un activador de la apoptosis de las células tumorales.

Las terapias de combinación proporcionadas en la presente memoria comprenden la administración conjunta del anticuerpo y el inmunoconjugado (en la que se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y separadamente, en cuyo caso, la administración del anticuerpo puede realizarse antes, simultáneamente y/o después de la administración del inmunoconjugado, agente terapéutico adicional y/o adyuvante. Los combinaciones de la invención también pueden utilizarse en combinación con terapia de radiación.

Puede administrarse una combinación de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) mediante cualquier vía adecuada, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, la administración intralesional. Entre las infusiones parenterales se incluye la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. El anticuerpo y el inmunoconjugado pueden administrarse por las mismas vías o por vías diferentes. La dosificación puede realizarse por cualquier vía adecuada, por ejemplo mediante inyecciones, tales como las inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se encuentran contempladas dentro de la presente memoria diversos programas de dosificación, aunque sin limitación, las administraciones individuales o múltiples en diversos puntos del tiempo, la administración de bolo y la infusión de pulsos. Las combinaciones de la invenicón pueden formularse, dosificarse y administrarse de un modo consistente con la buena práctica médica. Entre los factores a considerar en el presente contexto se incluyen el trastorno particular bajo tratamiento, el mamífero particular bajo tratamiento, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por el profesional médico. La combinación opcionalmente, no necesariamente, se formula con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo e inmunoconjugado presentes en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores comentados anteriormente. Estos generalmente se utilizan en las mismas dosis y por vías de administración tales como las indicadas en la presente memoria, o entre aproximadamente 1% y 99% de las dosis indicadas en la presente memoria, o en cualquier dosis y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que resulta apropiada.

Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo e inmunoconjugado (utilizados en las combinaciones de la invención, opcionalmente con uno o más otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que debe tratarse, del tipo de anticuerpo e inmunoconjugado, de la severidad y curso de la enfermedad, de si la combinación se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia anterior, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al anticuerpo y/o inmunoconjugado, y del criterio del médico responsable. El anticuerpo y el inmunoconjugado se administran convenientemente en el paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, una dosis candidata inicial puede ser de entre aproximadamente 1 mg/kg y 15 mg/kg (por ejemplo de entre 0,1 mg/kg y 10 mg/kg) para la administración en el paciente mediante, por ejemplo, una o más administraciones separadas o mediante la infusión continua. Una dosis diaria típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 1 pg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento generalmente se mantendría hasta producirse una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis ejemplar del anticuerpo se encontraría comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. De esta manera, puede administrarse en el paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ó 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis pueden administrarse intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo de manera que el paciente reciba entre aproximadamente dos y aproximadamente veinte, o por ejemplo aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Puede administrarse una dosis de carga más alta inicial, seguido de una o más dosis inferiores. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis semanal de mantenimiento de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Las mismas consideraciones con respecto a la dosis se aplican al inmunoconjugado que debe utilizarse en las combinaciones según la invención. Sin embargo, pueden resultar útiles otros regímenes de dosificación. Se realiza fácilmente un seguimiento del avance de dicha terapia utilizando téenicas y ensayos convencionales.

Artículos fabricados En otro aspecto de la invención se proporciona un artículo fabricado que contiene materiales que resultan útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos indicados anteriormente. El artículo fabricado comprende uno o más recipientes y una etiqueta o impreso en el paquete o asociado al recipiente. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que resulta, por sí misma o en combinación contra composición, efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición y que puede presentar una abertura de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que presenta un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo para la utilización en las combinaciones de la invención. Otro agente activo es el inmunoconjugado que debe utilizarse en las combinaciones de la invención, que puede encontrarse en la misma composición y recipiente del anticuerpo, o que puede proporcionarse en una composición y recipiente diferentes. La etiqueta o impreso en el paquete indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la condición de elección.

En un aspecto, la invención proporciona un kit destinado al tratamiento de una enfermedad, que comprende en el mismo recipiente o en recipientes separados: (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para presentar una función efectora incrementada, y opcionalmente que además comprende (c) un impreso en el paquete que comprende instrucciones impresas que guían la utilización del tratamiento combinado como método para tratar la enfermedad. Además, el kit puede comprender: (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo manipulado para presentar una función efectora incrementada, (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y opcionalmente (c) un tercer recipiente con una composición contenida en el mismo, en la que la composición comprende un agente terapéutico adicional citotóxico o de otro tipo. El kit en la presente realización de la invención puede comprender además un impreso en el paquete que indica que las composiciones pueden utilizarse para tratar una condición particular. Alternativamente, o adicionalmente, el kit puede comprender además un tercer (o cuarto) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Ejemplos A continuación se proporcionan ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica diversas otras realizaciones, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Métodos generales La glucomanipulación de la región Fe de un anticuerpo conduce a una afinidad de unión incrementada para receptores FcyRIII, que a su vez se traduce en una inducción de la ADCC y eficacia antitumoral incrementadas. Los receptores FcyRIII humanos se expresan sobre macrófagos, neutrófilos y células asesinas naturales (NK), dendríticas y T gd. En el ratón, la especie más ampliamente utilizada para el ensayo de la eficacia preclínica, se encuentran presentes FcyRIV, el homólogo murino de la FcyRIIIa humana, sobre macrófagos y neutrófilos, pero no sobre las células NK. Por lo tanto, en dichos modelos no se refleja la totalidad de cualquier mejora esperada de la eficacia al utilizar anticuerpos glucomanipulados. Los presentes inventores han generado un ratón transgénico para la FcyRIIIa (CDlóa) humana que muestra una expresión estable de la CDlóa humana sobre las células NK murinas en sangre, tejidos linfoides y tumores. Además, el nivel de expresión de CDlóa humano sobre las células NK no estimuladas en la sangre de estos ratones transgénicos es similar al observado en el ser humano. Los presentes inventores también han demostrado que una regulación negativa de la FcyRIIIa humana sobre las células NK asociada a tumor tras la terapia de anticuerpos se correlaciona con la actividad antitumoral. Finalmente, los presentes inventores han demostrado uan eficacia significativamente mejorada del tratamiento de anticuerpos glucomanipulados en modelos tumorales utilizando esta nueva cepa de ratón en comparación con los compañeros de camada negativos para CD16 humana.

Ejemplo 1 Modelo de xenoinjerto de carcinoma FaDu de cabeza y cuello Los inmunoconjugados de IgG 28H1-IL2 con diana en FAP e IgG DP47GS-IL2 no dirigidos que comprenden la IL-2 cuádruple mutante (qm) (SEC ID n° 125, n° 126, n° 129 y SEC ID n° 133 a n° 135, respectivamente) y el GlycoMab anti-EGFR (SEC ID n° 102 y n° 103) se sometieron a ensayo en la línea celular humana FaDu de carcinoma de cabeza y cuello, inyectada intralingualmente en ratones SCID. Este modelo tumoral se demostró mediante IHC sobre tejido fresco congelado que era positivo para FAP. Las células FaDu se obtuvieron originalmente de la ATCC (American Type Culture Collection) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Glycart. La línea celular tumoral se cultivó rutinariamente en DMEM que contenía FCS al 10% (Gibco) a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de CO2. Se utilizó el pase in vitro 9 para la inyección intralingual, con una viabilidad de 95,8%. Se inyectaron intralingualmente veinte ml de suspensión celular (2xl05 células FaDu en medio AimV (Gibco)). Los ratones SCID hembra (Taconics, Dinamarcada) de 8 a 9 semanas de edad al inicio del experimento se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices de una comisión (GV-Solas, Felasa, TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local (P 2008016). Tras la llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para aclimatarse al nuevo entorno y para observarlos. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular. Los ratones recibieron una inyección intralingual el día de estudio 0 de 2x105 células FaDu, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron una inyección i.v. del inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 qm, el inmunoconjugado IgG DP47G2-IL2 qm, el GlycoMab anti-EGFR, la combinación del inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 qm y el GlycoMab anti-EGFR, o la combinación del inmunoconjugado de IgG DP47G2-IL2 qm y el GlycoMab anti-EGFR una vez a la semana durante cuatro semanas. Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 ml de la solución apropiada. Se especifican las dosis en la Tabla 2. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron inyecciones de PBS y los grupos de tratamiento, de inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 qm, del inmunoconjugado IgG DP47GS-IL2 qm, del GlycoMab anti-EGFR, de la combinación del inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 qm y del GlycoMab anti-EGFR, o de la combinación del inmunoconjugado de IgG DP47GS-IL2 qm y el GlycoMab anti-EGFR. Para obtener la cantidad apropiada del inmunoconjugado para cada 200 ml, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario. La figura 1A muestra que únicamente la combinación del inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 qm con diana en FAP pero no el GlycoMab anti-EGFR mediaron en una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia incrementada en comparación con el inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 qm o el GlycoMab anti-EGFR por sí solo. En contraste con lo anterior, la combinación de IgG DP47GS-IL2 qm no dirigido y el GlycoMab anti-EGFR no mostró superioridad respecto a la administración de un solo agente (figura IB).

TABLA 2.

Ejemplo 2 Refuerzo in vitro de la capacidad asesina de las celulas NK con inmunoconjugados de IL-2.

Para determinar el efecto de los inmunoconjugados sobre las células NK, los presentes inventores evaluaron la eliminación de las células tumorales tras el tratamiento con los inmunoconjugados, particularmente inmunoconjugados que comprenden IL-2 como fracción efectora. Con este fin, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) según procedimientos estándares utilizando Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, USA). Brevemente, se extrajo sangre venosa con jeringas heparinizadas de voluntarios sanos. La sangre se diluyó 2:1 con PBS que no contenía calcio o magnesio y se aplicó en capas sobre Histopaque-1077. Se centrifugó el gradiente a 450xg durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA) sin freno. Se recogió la interfase, que contiene las PBMC, y se lavó con PBS en total tres veces (350xg seguido de 300xg durante 10 minutos a TA).

Las PBMC aisladas se incubaron con IL-2 (proleuquina) o inmunoconjugados de IL-2, añadidos al sobrenadante celular, durante 45 horas. A continuación, se recuperaron las PBMC y se utilizaron para la ADCC mediada por GlycoMab anti-EGFR de células A549 en una proporción E:T de 10:1, durante 4 horas. Se detectó la eliminación de las células diana mediante la medición de la liberación de LDH a los sobrenadantes celulares (LDH de kit de detección de citotoxicidad de Roche). La figura 2A-2B muestra la eliminación global de células tumorales A549 por PBMC, pretratadas o no con 0,57 nM (Fig.2A) ó 5,7 nM (Fig.2B) de inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 qm con diana en FAP o IL-2 (proleuquina), en presencia de diferentes concentraciones de GlycoMab anti-EGFR. El gráfico muestra que el pretratamiento con inmunoconjugado de las células efectoras resulta en un mayor incremento de la eliminación de las células diana con concentraciones crecientes de GlycoMab, en comparación con las células efectoras no tratadas.

Ejemplo 3 Modelo de xenoinjerto colorrectal L2174T Se sometieron a ensayo el inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm con diana en CEA (SEC ID n° 136 a n° 138), el GlycoMab anti-EGFR (SEC ID n° 102 y n° 103) y cetuximab en la línea celular colorrectal LS174T humana, inyectados intralingualmente en ratones transgénicos SCID-humano de FcyRIII. Este modelo tumoral se demostró mediante IHC sobre tejido fresco congelado que era positivo para CEA. Las células LS174T (células de carcinoma de colon humano) se obtuvieron originalmente de la ECACC (European Collection of Cell Culture) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Glycart. Se cultivaron LS174T en medio de Eagle MEM que contenía FCS al 10% (PAA Laboratories, Austria), glutamax al 1% y MEM aminoácidos no esenciales al 1% (Sigma). Las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de CO2. Se utilizó el pase in vitro 19 ó 23 para la inyección intraesplénica, con una viabilidad de 99%. Se realizó una pequeña incisión en el sitio abdominal izquierdo de ratones SCID transgénicos de FcyRIII anestesiados. Se inyectaron treinta microlitros de suspensión celular (2x106 células LS174T en medio AimV) por la pared abdominal inmediatamente bajo la cápsula del bazo. Se cerraron las heridas en la piel utilizando pinzas o suturas solubles. Los ratones SCID hembra transgénicos para FcyRIII, de 8 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (obtenidos de Taconics, Dinamarca) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 horas de luz/ 12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices de una comisión (GV-Solas, Felasa, TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local (P 2008016, P2011/128). Tras la llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para aclimatarse al nuevo entorno y para observarlos. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular. Los ratones recibieron una inyección intraesplénica el día de estudio 0 de 2x106 células LS174T, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron una inyección i.v. del inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm, de GlycoMab anti-EGFR, de cetuximab, de la combinación de inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm, del GlycoMab anti-EGFR o de la combinación del inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL2 qm y cetuximab una vez a la semana durante tres semanas. Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 ml de la solución apropiada. Se especifican las dosis en la Tabla 3. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron inyecciones de PBS y los grupos de tratamiento, de inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm, del GlycoMab anti-EGFR, de cetuximab, de la combinación del inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y del GlycoMab anti-EGFR, o de la combinación del inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL2 qm y cetuximab. Para obtener la cantidad apropiada del inmunoconjugado para cada 200 ml, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario. La figura 3A-3B y las Tablas 3A y 3B demuestran que la combinación del inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y el GlycoMab anti-EGFR media en una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia y supervivencia global incrementados en comparación con el inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm respectivo, el GlycoMab anti-EGFR o cetuximab solo, o como la combinación del inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL2 qm y cetuximab.

TABLA 3 TABLA 3A. Resumen de datos de supervivencia correspondientes a la figura 3A.

TABLA 3B. Resumen de datos de supervivencia correspondientes a la figura 3B.

Ejemplo 4 Modelo de xenoinjerto pulmonar A549 Se sometieron a ensayo el inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm con diana en CEA (SEC ID n° 136 a n° 138), el GlycoMab anti-EGFR (SEC ID n° 102 y n° 103) y cetuximab en la línea celular colorrectal NSCLC A549, inyectados i.v. en ratones transgenicos SCID-humano de FCYRIII.

Las células de carcinoma pulmonar de células no pequeñas A549 se obtuvieron oringalmente de la ATCC (n° CCL-185) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Roche-Glycart. La línea celular tumoral se cultivó rutinariamente en DMEM que contenía FCS al 10% (Gibco) a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de CO2. Se utilizó el pase 8 para el trasplante, a una viabilidad de entre 97% y 98%. Se inyectaron i.v. 5xl06 células en cada animal, en la vena de la cola en 200 ml de medio de cultivo celular Aim V (Gibco).

Los ratones SCID hembra transgénicos para FcyRIII (Roche-Glycart, Suiza), de 8 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (obtenidos de Charles River, Lyon, Francia) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices de una comisión (GV-Solas, Felasa, TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local (P 2011/128). Tras la llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para aclimatarse al nuevo entorno y para observarlos. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular.

Los ratones recibieron una inyección i.v. el día de estudio 0 de 5x106 células A549, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana (figura 4A) o dos semanas (figura 4B) después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron una inyección i.v. del inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm, de GlycoMab anti-EGFR, de cetuximab, de la combinación de inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y del GlycoMab anti-EGFR o de la combinación del inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL2 qm y cetuximab una vez a la semana durante tres semanas. Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 ml de la solución apropiada. Se especifican las dosis en la Tabla 4. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron inyecciones de PBS y los grupos de tratamiento, inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm, GlycoMab anti-EGFR, combinación de inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y GlycoMab anti-EGFR, o combinación de inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL2 qm y cetuximab. Para obtener la cantidad apropiada del inmunoconjugado para cada 200 ml, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario.

La figura 4A-4B y las Tablas 4A y 4B demuestran que la combinación de inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 q y GlycoMab anti-EGFR media en una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia y supervivencia global incrementados en comparación con el inmunoconjugado respectivo, el GlycoMab anti-EGFR o cetuximab solo, así como la combinación de inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL2 qm y cetuximab.

TABLA 4 TABLA 4A. Resumen de datos de supervivencia correspondientes a la figura 4A.

TABLA 4B. Resumen de datos de supervivencia correspondientes a la figura 4B.

Ejemplo 5 Modelo de xenoinjerto colorrectal L2174T Se sometieron a ensayo el inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm con diana en CEA (SEC ID n° 136 a n° 138), el GlycoMab anti-Her3 (SEC ID n° 142 y n° 146) en la línea celular colorrectal LS174T humana, inyectados intraesplénicamente en ratones transgénicos SCID-humano de FcyRIII .

Las células LS174T (células de carcinoma de colon humano) se obtuvieron originalmente de la ECACC (European Collection of Cell Culture) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Roche-Glycart. Se cultivaron LS174T en medio de Eagle MEM que contenía FCS al 10% (PAA Laboratories, Austria), glutamax al 1% y MEM aminoácidos no esenciales al 1% (Sigma). Las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de CO2. Se utilizó el pase in vitro 21 para la inyección intraesplénica, con una viabilidad de 97,9%. Se realizó una pequeña incisión en el sitio abdominal izquierdo de ratones transgénicos SCID-humano de FcyRIII anestesiados. Se inyectaron treinta microlitros de suspensión celular (2x106 células LS174T en medio AimV) por la pared abdominal inmediatamente bajo la cápsula del bazo. Se cerraron las heridas en la piel utilizando suturas solubles.

Los ratones transgénicos SCID-humano hembra de FcyRIII, de 8 a 9 semanas de edad al inicio del experimento (obtenidos de Roche-Glycart, Suiza) se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad de acuerdo con directrices de una comisión (GV-Solas, Felasa, TierschG). El protocolo del estudio experimental fue revisado y autorizado por el gobierno local (P 2011/128). Tras la llegada, los animales se mantuvieron durante una semana para aclimatarse al nuevo entorno y para observarlos. Se llevó a cabo un seguimiento continuo de su salud de manera regular.

Los ratones recibieron una inyección intraesplénica el día de estudio 0 de 2x106 células LS174T, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron una inyección i.v. del inmunoconjugado IgG CH1A1A- IL2 qm, GlycoMab anti-Her3, o la combinación de in unoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y GlycoMab anti-Her3 una vez a la semana durante tres semanas.

Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 ml de la solución apropiada. Se especifican las dosis en la Tabla 5. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron inyecciones de PBS y los grupos de tratamiento, inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm, GlycoMab anti-Her3, combinación de inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y GlycoMab anti-Her3. Para obtener la cantidad apropiada del inmunoconjugado para cada 200 ml, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario. La figura 5 y la Tabla 5A demuestran que la combinación del inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm y el GlycoMab anti-Her3 median en una eficacia superior en términos de mediana de supervivencia incrementada en comparación con el inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm o el GlycoMab anti-Her3 por sí solo.

TABLA 5 TABLA 5A. Resumen de datos de supervivencia correspondientes a la figura 5.

Ejemplo 6 Modelo de xenoinjerto de carcinoma renal ACHN Los inmunoconj ugados de IgG 28H1-IL2 con diana en FAP e IL2 cuádruple muíante (qm) (SEC ID n° 125, n° 126 y n° 129) y el GlycoMab anti-EGFR (SEC ID n° 102 y n° 103) se sometieron a ensayo en la línea celular renal ACHN humana, inyectados intrarrenalmente en ratones transgénicos SCID-humano de FcyRIII.

Las células ACHN (células de adenocarcinoma renal humano) se obtuvieron originalmente de la ATCC (American Type Culture Collection) y tras la expansión se depositaron en el banco celular interno de Roche-Glycart. ACHN se cultivó en DMEM que contenía FCS al 10%. Las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera saturada de agua con 5% de CO2. Se utilizó el pase in vitro n° 22 para la inyección intrarrenal, con una viabilidad de 96,4%. Se realizó una pequeña incisión (2 cm) en el flanco derecho y pared peritoneal de ratones transgénicos SCID-humano de FcyRIII anestesiados. Se inyectaron cincuenta ml (lxl O6 células ACHN en medio AimV) de suspensión celular subcapsularmente en el riñón. Se cerraron las heridas en la piel y pared peritoneal utilizando suturas solubles.

Los ratones recibieron una inyección intrarrenal el día de estudio 0 de lxl O6 células ACHN, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, los ratones recibieron inyección i.v. de vehículo, GlycoMab anti-EGFR, la combinación de inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 y GlycoMab anti-EGFR o la combinación de Proleukin® y GlycoMab anti-EGFR. El GlycoMab de EGFR y el inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 se dosificaron una vez a la semana durante 3 semanas. Se inyectó Proleukin® diariamente de lunes a viernes durante 3 semanas.

Todos los ratones recibieron inyecciones i.v. de 200 ml de la solución apropiada. Se especifican las dosis en la Tabla 6. Los ratones en el grupo de vehículo recibieron una inyección de PBS y los grupos de tratamiento, de GlycoMab anti-EGFR, de la combinación de inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 y GlycoMab anti-EGFR o de la combinación de Proleukin® y GlycoMab anti-EGFR. Para obtener la cantidad apropiada del inmunoconjugado para cada 200 ml, las soluciones madre se diluyeron con PBS en caso necesario.

La figura 6 y la Tabla 6A muestran que la combinación del inmunoconjugado IgG 28H1-IL2 y el GlycoMab anti-EGFR median en una eficacia superior en terminos de mediana y supervivencia global incrementadas en comparación con el GlycoMab anti-EGFR por sí solo y la combinación de Proleukin® y GlycoMab anti-EGFR.

TABLA 6 TABLA 6A. Resumen de datos de supervivencia correspondientes a la figura 6.

Ejemplo 7 Refuerzo in vitro de la capacidad asesina de las celulas NK y de la expresión de CD25 y CD69 de células NK con inmunoconjugados de IL-2 Tal como en el Ejemplo 2, los presentes inventores evaluaron la eliminación de las células tumorales (LS174T) por parte de células NK con el tratamiento con un inmunoconjugado, particularmente un inmunoconjugado que comprende IL-2 como fracción efectora y un GlycoMab, en este caso un GlycoMab anti-Her3. Se determinó la eliminación de las células diana mediante la medición de la liberación de LDH al sobrenadante celular.

Se aislaron PBMC de sangre recién extraída. Brevemente, la sangre se diluyó 3:1 con PBS. Aproximadamente 30 mi de la mezcla de sangre/PBS se aplicó sobre 15 mi de Histopaque (Sigma) y se centrifugaron durante 30 minutos a 450g durante 30 minutos sin freno. Se recolectaron los linfocitos con una pipeta de 5 mi en tubos de 50 mi que contenían PBS. Los tubos se rellenaron hasta 50 mi con PBS y se centrifugaron durante 10 minutos a 350g. Se descartó el sobrenadante, se resuspendió el pellet en 50 mi de PBS y se centrifugó durante 10 minutos a 300g. Se repitió la etapa de lavado una vez. Se realizó un recuento de las células y se resuspendieron en RPMI precalentado que contenía glutamina al 1% y FCS al 10% con lxlO6 células por mi. Las células se incubaron durante la noche a 37°C. Al día siguiente se recolectaron las células y se contaron.

LS174T (ECACC n° 870604019 es una línea celular de adenocarcinoma de colon caucásico humano. Las células se cultivaron en EMEM que contenía glutamina al 1%, aminoácidos no esenciales al 1% y FCS al 10% y se dividieron cada dos a tres días antes de alcanzar la confluencia. Se desengancharon las células LS174T utilizando tripsina. Se realizó un recuento de las células y se comprobó su viabilidad. La viabilidad de las células antes del ensayo era de 99,4%. Las células se resuspendieron en su medio respectivo a razón de 0,3x106 por mi. Se sembraron 100 ml de la suspensión celular en una placa de fondo plano tratada de cultivo celular de 96 pocilios y se incubaron durante la noche a 37°C. Al día siguiente, se eliminó el sobrenadante de las células. A continuación, se añadieron 50 ml del GlycoMab anti-Her3 diluido (SEC ID n° 142 y n° 146) a una concentración de 1.000 ng/ml, 100 ng/ml y 10 ng/ml o se añadió medio a los pocilios respectivos. A continuación, se añadieron a cada pocilio 50 m? del inmunoconjugado IgG CH1A1A-IL2 qm con diana en CEA (SEC ID n° 136 a n° 138) a las concentraciones indicadas (ver la figura 7) o se añadió medio. Tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 100 m? de PBMC a razón de 3x106 células por mi o medio, con el fin de alcanzar un volumen final de 200 m? en cada pocilio. Las células se incubaron durante 24 horas en el incubador. Tras la incubación, la placa se centrifugó durante 4 minutos a 400g y se recogió el sobrenadante. Se utilizaron 50 m? por pocilio del sobrenadante para medir la liberación de LDH (LDH de kit de detección de citotoxicidad de Roche). El sobrenadante restante se almacenó a -20°C hasta la utilización posterior. Las células se resuspendieron en tampón FACS y se almacenaron a 4°C antes de iniciar la tinción de FACS (ver posteriormente). La figura 7 muestra la eliminación global de células LS174T por células PBMC con el tratamiento con GlycoMab anti-Her3 solo (panel izquierdo), el inmunoconjugado de IgG CH1A1A1-IL-2 qm solo (panel derecho) o la combinación de inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL-2 qm con el GlycoMab anti-Her3 (panel derecho).

Se recolectaron las PBMC tras 4 horas y se utilizaron para el análisis de FACS de la expresión de CD25 y CD69 de las células NK. Las células se centrifugaron durante 4 minutos a 400g y se lavaron una vez con PBS que contenía BSA al 0,1% (tampón de FACS). A continuación, se añadieron 20 ml por pocilio de la mezcla de anticuerpos a las células. Las células se incubaron durante 30 minutos en la nevera. A continuación, las células se lavaron dos veces con tampón de FACS y se resuspendieron en 200 ml de tampón de FACS que contenía PFA al 2% en cada pocilio. El análisis se llevó a cabo utilizando el BD FACS Fortessa y la mezcla de anticuerpos siguiente: CD3 PE/Cy7 (BioLegend, n° 300420; diluido 1:40), CD56 APC (BioLegend n° 318310; diluido 1:20), CD69 Brilliant Violet 421 (BioLegend n° 310929; diluido 1:40), CD25 PE (BD Bioscience n° 557138; diluido 1:20).

La figura 8A-8B muestra la expresión de CD25 (Fig.8A) o de CD69 (Fig.8B) sobre las células NK con el tratamiento con GlycoMab anti-Her3 solo (panel izquierdo), el inmunoconjugado de IgG CH1A1A1-IL-2 qm solo (panel derecho) o la combinación de inmunoconjugado de IgG CH1A1A-IL-2 qm con el GlycoMab anti-Her3 (panel derecho).

Aunque la invención anteriormente proporcionada ha sido descrita en detalle a título ilustrativo y ejemplar con fines de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitativas del alcance de la invención. Las exposiciones de toda la literatura de patentes y científica citada en la presente memoria se incorporan expresamente en su totalidad como referencia.

Claims

REIVINDICACIONES Combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la utilización en el tratamiento de enfermedades en un individuo que necesita del mismo. Combinación según la reivindicación 1, en la que la fracción efectora es una citoquina. Combinación según la reivindicación 1 ó 2, en la que la fracción efectora es una citoquina seleccionada de entre el grupo que consiste de IL-2, GM-CSF, IFN-a e IL-12. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la fracción efectora es IL-2. Combinación según la reivindicación 4, en la que la fracción efectora IL-2 es una fracción efectora IL-2 mutante que comprende por lo menos una mutación de aminoácido, particularmente una sustitución de aminoácido, que reduce o anula la afinidad de la fracción efectora IL-2 mutante para la subunidad a del receptor de IL-2 pero conserva la afinidad de la fracción efectora IL-2 mutante para el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con la fracción efectora IL-2 no mutada. 6. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el primer anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, particularmente un anticuerpo de clase IgG, más particularmente un anticuerpo de subclase IgGi. 7. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la fracción efectora comparte un enlace peptídico amino-terminal o carboxi-terminal con el primer anticuerpo. 8. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el primer anticuerpo se ha manipulado para que presente una unión reducida a un receptor de Fe activador, particularmente una unión reducida al FcyRIIIa humana. 9. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el primer anticuerpo comprende una sustitución de aminoácido en la posición P329 de las cadenas pesadas de inmunoglobulina (numeración Kabat). 10. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el primer anticuerpo comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235A y P329G en las cadenas pesadas de inmunoglobulina. 11. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el inmunoconjugado consiste esencialmente de una fracción efectora, particularmente una fracción efectora de cadena sencilla, y un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida, en la que la fracción efectora se encuentra fusionada en su aminoácido amino-terminal con el extremo carboxi-terminal de una de las cadenas pesadas del primer anticuerpo, opcionalmente mediante un péptido conector. 12. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el primer anticuerpo se dirige a un antígeno presentado sobre una célula tumoral o en un ambiente de célula tumoral. 13. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el segundo anticuerpo es un anticuerpo de clase IgG de longitud completa, particularmente un anticuerpo de subclase IgGj. 14. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la función efectora se selecciona de entre el grupo de unión a un receptor de Fe activador, ADCC, ADCP, CDC y secreción de citoquinas. 15. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la función efectora es una unión incrementada a un receptor de Fe activador y/o ADCC incrementada. 16. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que el segundo anticuerpo se manipula mediante la introducción de una o más mutaciones de aminoácidos en la región Fe o mediante la modificación de la glucosilación en la región Fe. 17. En una realización particular, el segundo anticuerpo se manipula para que presente una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe en comparación con un anticuerpo no manipulado. 18. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que el segundo anticuerpo se dirige a un antígeno presentado sobre una célula tumoral. 19. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que la enfermedad es un trastorno tratable mediante estimulación de la función de las células efectoras, particularmente cáncer. 20. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que el individuo es un mamífero, particularmente un ser humano. 21. Composición farmacéutica que comprende (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, en un portador farmacéuticamente aceptable. 22. Utilización de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad en un individuo. 23. Método de tratamiento de una enfermedad en un individuo, que comprende administrar en el individuo una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, en una cantidad terapéuticamente efectiva. 24. Método de estimulación de la función de las células efectoras en un individuo, que comprende administrar en el individuo una combinación de (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, y (b) un segundo anticuerpo manipulado para que presente una función efectora incrementada, en una cantidad efectiva para estimular la función de las células efectoras. 25. Kit destinado al tratamiento de una enfermedad, que comprende en el mismo recipiente o en recipientes separados: (a) un inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo manipulado para presentar una función efectora reducida y una fracción efectora, (b) un segundo anticuerpo manipulado para presentar una función efectora incrementada, y (c) opcionalmente un impreso en el paquete, que comprende instrucciones impresas que guían la utilización del tratamiento combinado como método para tratar la enfermedad. 26. Invención según se ha descrito anteriormente en la presente memoria.