MX2012006083A - Una forma amorfa y una cristalina de hermitartrato de genz 112638 como inhibidor de glucosilceramida sintasa. - Google Patents

Abstract

Se desvela la sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: (ver formula) (Hemitartrato de Fórmula I), que puede utilizarse en aplicaciones farmacéuticas; las formas cristalinas únicas particulares de Hemitartrato de Fórmula (I) se caracterizan por una variedad de propiedades y mediciones físicas; también, se desvelan métodos para producir Hemitartrato cristalino de Fórmula (I), y utilizarlo para inhibir glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glicoesfingolípidos en sujetos para tratar un número de enfermedades; también se describen las composiciones farmacéuticas.

Description

UNA FORMA AMORFA Y UNA CRISTALINA DE HEMITARTRATO DE GENZ 112638 COMO INHIBIDOR DE GLUCOSILCERAMIDA SINTASA SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U.A. no. 61/264,748, presentada el 27 de noviembre de 2009, cuyas enseñanzas etán incorporadas a la presente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los glicoesfingolípidos (GSLs) son una clase de compuestos de origen natural que poseen un sinnúmero de funciones biológicas, incluyendo la capacidad de promover el crecimiento celular, diferenciación celular, adhesión entre células y proteínas de matriz, unión de microorganismos y virus a células, y metástasis de células tumorales. Los GSLs se obtienen de glucosilceramida (GlcCer), que se produce a partir de ceramida y UDP-glucosa por la UDP-glucosa enzimática: N-acilesfingosina glucosiltransferasa (GlcCer sintasa). La estructura de la ceramida se muestra más abajo: Ceramida La acumulación de GSLs se ha conectado a un número de enfermedades, incluyendo enfermedades de Tay-Sachs, Gaucher, y Fabry (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense N° 6,051 ,598). Los GSLs también han estado conectados a ciertos cánceres. Por ejemplo, se ha descubierto que ciertos GSLs aparecen solamente en tumores o en concentraciones anormalmente altas en tumores; ejercen acciones inhibidoras o estimuladoras marcadas en e crecimiento tumoral cuando se añaden a las células tumorales en medio de cultivo; e inhiben el sistema de inmunodefensa normal del cuerpo cuando son depositados por los tumores en el fluido extracelular circundante. La composición de los GSLs de un tumor cambia a medida que los tumores se vuelven cada vez más malignos y los anticuerpos contra ciertos GSLs inhiben el crecimiento de los tumores.

Los compuestos que inhiben la GlcCer sintasa pueden reducir las concentraciones de GSLs y se ha informado que son útiles para tratar un sujeto con una de las enfermedades antes mencionadas. Un número de potentes inhibidores de GlcCer, denominados como "compuestos similares a las amino ceramidas", se desvelan en las Patentes Estadounidenses N° 6,051 ,598, 5,952,370, 5,945,442, 5,916,91 1 y 6,030,995. El compuesto de Fórmula (I), mostrado más abajo, es un inhibidor de GlcCer sintasa actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher: Existe una necesidad de formas de sal de este fármaco candidato que sean cristalinas o de otra manera posean propiedades físicas que sean tratables para la fabricación a gran escala. También existe una necesidad de Formulaciones farmacéuticas en las que este fármaco candidato es estable y suministrado efectivamente al paciente, así como métodos de tratamiento mejorado que utilizan este compuesto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto que la sal de hemitartrato del compuesto de Fórmula (I) (de aquí en adelante "Hemitartrato de Fórmula (I)") puede cristalizarse en condiciones bien definidas para proporcionar ciertas formas cristalinas no higroscópicas. El Hemitartrato de Fórmula (I) posee varias propiedades ventajosas en comparación con otras sales de Fórmula (I).

Según lo descrito en el Ejemplo I, muchas sales de Fórmula (I), incluyendo sal de citrato, malato, fumárica, metilsulfónica, y acética, no podrían obtenerse en forma sólida. Aunque la sal hidroclórica y de tartrato 1 :1 de Fórmula (I) se obtuvieron en forma sólida, no eran cristalinas y ambas eran demasiado higroscópicas para la formulación. El Hemitartrato de Fórmula (I) es más fácil de formular y sintetizar que la base libre las otras sales. El Hemitartrato de Fórmula (I) también es cristalino, no hidroscópico, soluble en agua y fluye mejor que la base libre correspondiente (de aquí en adelante "Base Libre de Fórmula (I)") y otras sales. De ese modo, estas propiedades favorables hacen que el Hemitartrato de Fórmula (I) sea tratable en la fabricación a gran escala como un fármaco candidato.

También se ha descubierto que los granulos estables para las Formulaciones en cápsula de Hemitartrato de Fórmula (I) pueden prepararse utilizando relaciones definidas de un agente de relleno insoluble en agua, un agente de relleno soluble en agua y Hemitartrato de Fórmula (I). En base a este descubrimiento, se desvelan Formulaciones farmacéuticas estables de Hemitartrato de Fórmula (I).

También se ha descubierto que el compuesto de Fórmula (I) o sales aceptables para uso farmacéutico del mismo (incluyendo Hemitartrato de Fórmula (I)) son metabolizadas por el hígado, básicamente por las enzimas del citocromo P450. En base a este descubrimiento, se desvelan métodos para el tratamiento con el compuesto de Fórmula (I) o sales aceptables para uso farmacéutico del mismo (incluyendo Hemitartrato de Fórmula (I)) que reducen el potencial de interacciones fármaco/fármaco.

También se ha descubierto que los ratones con Gaucher a los que se les administró glucocerebrosidasa recombinante y después Hemitartrato de Fórmula (I) mostraron niveles inferiores de GL1 en órganos viscerales y un número reducido de células de Gaucher en el hígado en comparación con el tratamiento con glucocerebrosidasa como único reactivo o Hemitartrato de Fórmula (I) como único reactivo. En base a este descubrimiento, también se desvelan terapias de combinación con el compuesto de Fórmula (I) o sales aceptables para uso farmacéutico del mismo (incluyendo Hemitartrato de Fórmula (I)).

Una modalidad de la presente solicitud es la sal de hemitartrato del compuesto representado por la Fórmula (I). Según lo observado más arriba, la sal de hemitartrato del compuesto representado por la Fórmula (I) se denomina en la presente "Hemitartrato de Fórmula (I)." El compuesto representado por la Fórmula (I) se denomina en la presente "Base Libre de Fórmula (I)." Otra modalidad de la presente solicitud proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente aceptable para uso farmacéutico y Hemitartrato de Fórmula (I).

Otra modalidad proporciona un método para inhibir la glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glicoesfingolípidos en un sujeto que lo necesita administrando al sujeto una cantidad efectiva de Hemitartrato de Fórmula (I).

Otra modalidad proporciona el uso de Hemitartrato de Fórmula (I) para la fabricación de un medicamento para inhibir la glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glicoesfingolípidos en un sujeto que lo necesita.

Otra modalidad proporciona el uso de Hemitartrato de Fórmula (I) para inhibir la glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glicoesfingolípidos en un sujeto que lo necesita.

Otra modalidad es un método para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher. El método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un primer agente terapéutico en combinación con una cantidad efectiva de un segundo agente terapéutico. El primer agente terapéutico está representado por la Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo; y el segundo agente terapéutico es efectivo para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher.

Otra modalidad es un método para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry. El método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un primer agente terapéutico en combinación con una cantidad efectiva de un segundo agente terapéutico. El primer agente terapéutico está representado por la Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo; y el segundo agente terapéutico es efectivo para el tratamiento de la enfermedad de Fabry.

Otra modalidad proporciona la composición farmacéutica que comprende: la sal de hemitartrato de un compuesto representado por la fórmula (I); por lo menos un relleno soluble en agua, por lo menos un relleno insoluble en agua; por lo menos un ligante y por lo menos un lubricante.

Otra modalidad de la invención es un método para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry. El método comprende los pasos de: a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula (I), o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo; b) examinar el sujeto para determinar si el sujeto es un metabolizador lento, intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450; c) si el sujeto es un metabolizador intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450, determinar una cantidad efectiva ajustada del compuesto; y d) administrar al sujeto una cantidad efectiva ajustada del compuesto de Fórmula (I) si el sujeto es un metabolizador intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450 y administrar al sujeto una cantidad efectiva del compuesto de Fórmula (I) si el sujeto es un metabolizador lento de P450.

Otra modalidad de la invención es un método para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher. El método comprende los pasos de: a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula (I), o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo; b) examinar el sujeto para determinar si el sujeto es un metabolizador lento, intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450; c) sujeto es un metabolizador intermedio extensivo/ultra-rápido de P450, determinar una cantidad efectiva ajustada del compuesto; y administrar al sujeto una cantidad efectiva ajustada del compuesto de Fórmula (I) si el sujeto es un metabolizador intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450 y administrar al sujeto una cantidad efectiva del compuesto de Fórmula (I) si el sujeto es un metabolizador lento de P450.

Otra modalidad de la invención es un método para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry. El método comprende los pasos de: a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo; b) evaluar los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto; y c) ajustar la cantidad de compuesto administrado al sujeto de manera que los niveles plasmáticos mínimos del compuesto sean al menos 5 ng/ml. Alternativamente, los niveles plasmáticos mínimos y la Cmax del compuesto en el sujeto se evalúan en el paso b) y en el paso c) la cantidad de compuesto administrado al sujeto se ajusta de manera que los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto sean al menos 5 ng/ml y la Cma del compuesto en el sujeto esté por debajo de 100 ng/ml.

Otra modalidad de la invención es un método para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher. El método comprende los pasos de: a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo; b) evaluar los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto; y c) ajusfar la cantidad de compuesto administrado al sujeto de manera que los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto sean al menos 5 ng/ml. Alternativamente, los niveles plasmáticos mínimos y la Cmax del compuesto en el sujeto se evalúan en el paso b) y en el paso c) la cantidad de compuesto administrado al sujeto se ajusta de manera que los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto sean al menos 5 ng/ml y la Cma del compuesto en el sujeto esté por debajo de 100 ng/ml BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 muestra el patrón experimental XRPD (temperatura ambiente) para el Hemitartrato de Fórmula (I).

La FIG. 2 es un gráfico de la eficacia de las terapias de reducción de sustratos y enzimas en la reducción de los niveles de glucosilceramida en el hígado de los ratones con Gaucher. Se midieron los niveles de GL 1 en el hígado en ratones con Gaucher de 3 meses no tratados (A) y después de 2 semanas de tratamiento con glucocerebrosidasa recombinante (B). Los ratones tratados con glucocerebrosidasa recombinante se analizaron 10 semanas más tarde sin tratamiento adicional (C) o después de la terapia con Hemitartrato de Fórmula (I) (D) en 150 mg/kg de alimento. También se muestran los niveles de GL1 en el hígado de los ratones a los que se les administró Hemitartrato de Fórmula (I) como único reactivo durante el período completo del estudio (E) y en controles de la misma edad, no tratados (F). Los datos se expresan como medias ± error estándar de la media (SEM) (n = 5). Se determinó la significancia estadística utilizando la prueba t para datos no pareados.

La FIG. 3 es un gráfico de la eficacia de las terapias de reducción de sustratos y enzimas en la reducción de los niveles de glucosilceramida en el bazo de los ratones con Gaucher. Los niveles de GL1 en el bazo se midieron en ratones con Gaucher de 3 meses no tratados (A) y después de 2 semanas de tratamiento con glucocerebrosidasa recombinante (B). Los ratones tratados con glucocerebrosidasa recombinante se analizaron 10 semanas más tarde sin tratamiento adicional (C) o después de la terapia con Hemitartrato de Fórmula (I) (D). También se muestran los niveles de GL 1 en el bazo de los ratones a los que se les administró Hemitartrato de Fórmula (I) como único reactivo durante el período completo de estudio (E) en los controles de la misma edad, no tratados (F). Los datos se expresan como medias ± error estándar de la media (SEM) (n = 5). Se determinó la significancia estadística utilizando la prueba t para datos no pareados.

La FIG. 4 es un gráfico de la eficacia de terapias de reducción de sustratos y enzimas en la reducción de los niveles de glucosilceramida en el pulmón de ratones con Gaucher. Los niveles de GL 1 en el pulmón se midieron en ratones con Gaucher de 3 meses no tratados (A) y después de 2 semanas de tratamiento con glucocerebrosidasa recombinante (B). Los ratones tratados con glucocerebrosidasa recombinante se analizaron 10 semanas más tarde sin tratamiento adicional (C) o después de la terapia con Hemitartrato de Fórmula (I) (D). También se muestran los niveles de GL 1 en el pulmón de los ratones a los que se les administró Hemitartrato de Fórmula (I) como único reactivo durante el período completo de estudio (E) y en los controles de la misma edad, no tratados (F). Los datos se expresan como medias ± error estándar de la media (SEM) (n = 5). Se determinó la significancia estadística utilizando la prueba t para datos no pareados.

La FIG. 5 es un gráfico que muestra la cuantificación del grado de tinción de CD68 en el hígado. El grado de tinción CD68-positiva en las secciones de hígado se cuantificó utilizando software MetaMorph. Se muestran los niveles en hígado con Gaucher de 3 meses no tratado (A) o después del tratamiento con glucocerebrosidasa (B). También se ilustran los ratones tratados con enzima y analizados después 10 semanas más tarde sin intervención terapéutica adicional (C) o después de la terapia con Hemitartrato de Fórmula (I) (D). También se muestra grado de tinción en el hígado de los ratones con Gaucher a los que se les administró Hemitartrato de Fórmula (I) como único reactivo (E) y en ratones de control de la misma edad, no tratados (F). Los datos se compararon a partir de un análisis de diez imágenes 400x por sección de cada uno de los ratones. Se determinó la significancia estadística utilizando la prueba t para datos no pareados.

La FIG. 6 es un gráfico que muestra la eficacia de Hemitartrato de Fórmula (I) en ratones D409V/mutantes jóvenes. Se administró Hemitartrato de Fórmula (I) a ratones D409V/mutantes de 10 semanas por día mediante cebadura oral en una dosis de 75 o 150 mg/kg durante 10 semanas. Se evaluaron los niveles glucosilceramídicos en el hígado, pulmón, vasculatura y bazo al final del estudio mediante HP-TLC. Los datos se presentan como un porcentaje de GL-1 en ratones de control de la misma edad no tratados. Las líneas de puntos indican los niveles de glucosilceramida observados en ratones de tipo salvaje normales. *p< 0.05; **p < 0.01 respecto del control no tratado (prueba t de datos no pareados, de dos colas). Los datos están representados como medias + error estándar de la media (SEM) n= 5 para 75 mg/kg; n = 6 para 150 mg/kg).

La FIG. 7 muestra el efecto de la terapia con Hemitartrato de Fórmula (I) en la acumulación de GL-3 en hígado, corazón, riñon, bazo, cerebro, y sangre de ratón Fabry.

La FIG. 8 muestra un gráfico del efecto de I terapia con Hemitartrato de Fórmula (I) en la aparición y avance de la neuropatía periférica en ratones con Fabry.

La FIG. 9 muestra gráficos de mediciones de algunos marcadores de la función del riñon en ratones con Fabry tratados con Hemitartrato de Fórmula (I).

La FIG. 10 muestra una línea de tiempo para los estudios de ERT y SRT de las poblaciones de ratón que reciben diferentes terapias con fármacos: A) Fabrazyme dos veces al mes, nada de Hemitartrato de Fórmula (I); B) Fabrazyme dos veces al mes y Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; C) Fabrazyme administrado al comienzo del estudio y al mes cuatro del estudio y Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; D) nada de Fabrazyme, Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; y E) ninguna terapia con fármaco.

La FIG. 11 muestra gráficos de los niveles de GL-3 en sangre en ng/ml de sangre en seis poblaciones (n=?) de los ratones (A-E con Fabry-Rag; y F de tipo salvaje); las poblaciones de ratones recibieron las siguientes terapias: A) Fabrazyme dos veces al mes, nada de Hemitartrato de Fórmula (I); B) Fabrazyme dos veces al mes y Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; C) Fabrazyme administrado al comienzo del estudio y al mes cuatro del estudio y Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; D) nada de Fabrazyme, Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; E) ninguna terapia con fármaco; y F) ninguna terapia con fármaco.

La FIG. 12 muestra gráficos de los niveles de GL-3 en hígado y riñon de ratones con Fabry-Rag; las poblaciones de ratones (n=?) recibieron las siguientes terapias: A) Fabrazyme dos veces al mes, nada de Hemitartrato de Fórmula (I); B) Fabrazyme dos veces al mes y Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; C) Fabrazyme administrado al comienzo del estudio y al mes cuatro del estudio y Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; D) nada de Fabrazyme, Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; y E) ninguna terapia con fármaco La FIG. 13 muestra gráficos de los niveles de GL-3 en orina en ratones con Fabry-Rag; las poblaciones de ratones (n=?) recibieron las siguientes terapias: A) Fabrazyme dos veces al mes, nada de Hemitartrato de Fórmula (I); B) Fabrazyme dos veces al mes y Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; C) Fabrazyme administrado al comienzo del estudio y al mes cuatro del estudio y Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; D) nada de Fabrazyme, Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; y E) ninguna terapia con fármaco.

La FIG. 14 es un gráfico que muestra la latencia en segundos de la sensibilidad al calor de los ratones con Fabry-Rag que recibe las siguientes terapias: Fabrazyme dos veces al mes, nada de Hemitartrato de Fórmula (I); Fabrazyme dos veces al mes y Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; Fabrazyme administrado al comienzo del estudio y al mes cuatro del estudio y Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; nada de Fabrazyme, Hemitartrato de Fórmula (I) en alimento; ninguna terapia con fármaco; ratones de tipo salvaje; y no tratados al mes tres.

La Figura 15 es un gráfico que muestra la cantidad total de área de degradación de una traza de HPLC de diversas mezclas que comprenden Hemitartrato de Fórmula (I), Monohidrato de lactosa apta para encapsulado y Avicel PH 301 (Celulosa microcristalina) después de haber sido expuestas a 85°C durante 3 días. El área de degradación de la traza de HPLC es la relación del área total de picos correspondientes a la degradación respecto del área total de picos correspondientes al Hemitartrato de Fórmula (I) y productos de degradación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente solicitud proporciona formas cristalinas únicas de Hemitartrato de Fórmula (I) y nuevas composiciones farmacéuticas de Hemitartrato de Fórmula (I) que comprenden las formas cristalinas de Hemitartrato de Fórmula (I) descritas en la presente. La presente solicitud también proporciona métodos para inhibir glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glicoesfingolípidos en un sujeto que lo necesita. Adicionalmente, la presente solicitud proporciona métodos para preparar formas cristalinas específicas de Hemitartrato de Fórmula (I). La presente solicitud también proporciona Formulaciones farmacéuticas estables de Hemitartrato de Fórmula (I), terapias de combinación con el compuesto de Fórmula (I) o ventas aceptables para uso farmacéutico del mismo (incluyendo Hemitartrato de Fórmula (I)) y métodos de tratamiento con el compuesto de Fórmula (I) o sales aceptables para uso farmacéutico del mismo (incluyendo Hemitartrato de Fórmula (I)) que minimiza el riesgo de interacciones fármaco/fármaco.

Formas cristalinas de Hemitartrato de Fórmula (I) En una modalidad particular, al menos un porcentaje particular en peso de Hemitartrato de Fórmula (I) es cristalino. Los porcentajes particulares en peso incluyen 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, p un porcentaje entre 70% y 100%.

En otra modalidad particular, al menos un porcentaje particular en peso de Hemitartrato de Fórmula (I) es un forma cristalina única de Hemitartrato de Fórmula (I). Los porcentajes particulares en peso incluyen 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, o un porcentaje entre 70% y 100%.

Según lo utilizado en la presente, "cristalino" se refiere a un sólido que posee una estructura de cristal en donde las moléculas individuales poseen una configuración química encerrada regular altamente homogénea. El Hemitartrato de Fórmula (I) cristalino puede ser cristales de una única forma cristalina de Hemitartrato de Fórmula (I), o una mezcla de cristales de diferentes formas cristalinas únicas. Una forma cristalina única significa Hemitartrato de Fórmula (I) como un único cristal o una pluralidad de cristales en los que cada posee la misma forma cristalina.

Cuando un porcentaje particular en peso de Hemitartrato de Fórmula (I) es una forma cristalina única, el resto del Hemitartrato de Fórmula (I) es alguna combinación de Hemitartrato de Fórmula (I) amorfo, y/o una u otras formas cristalinas más de Hemitartrato de Fórmula (I) excluyendo la forma cristalina única. Cuando el Hemitartrato de Fórmula (I) cristalino se define como un porcentaje especificado de una forma cristalina particular de Hemitartrato de Fórmula (I), el resto está compuesto de forma amorfa y/o formas cristalinas distintas de una o más formas particulares que están especificadas. Los ejemplos de una forma cristalina única incluyen Forma A de Hemitartrato de Fórmula (I) caracterizada por una o más propiedades según lo debatido en la presente.

Debido a que el ácido tartárico posee dos grupos de ácido carboxílico, puede formar sales con distintas relaciones molares del compuesto representado por la Fórmula (I) y tartrato (la base conjugada de ácido tartárico). Por ejemplo, la sal en la que existe aproximadamente una relación molar uno a uno de tartrato y Fórmula (I) es Tartrato de Fórmula (I) (1 tartrato: 1 Fórmula (I)); y la sal en la que existe aproximadamente una relación molar uno a dos de tartrato y Fórmula (I) es Hemitartrato de Fórmula (I) (1 tartrato: 2 Fórmula (I)).

La sal de hemitartrato puede existir en diversas formas estereoisoméricas. Los estereoisómeros son compuestos que difieren solamente en su disposición espacial. Los enantiómeros son pares de estereoisómeros cuyas imágenes espejo no son superponibles, más comúnmente debido a que contienen un átomo de carbono simétricamente sustituido que actúa como un centro quiral. Los diastereómeros son estereoisómeros que no están relacionados como imágenes espejo, más comúnmente debido a que contienen dos o más átomos de carbono asimétricamente sustituidos.

Cuando la estereoquímica se denomina (como en, por ejemplo, L-(+)-ácido tartárico) o está representada por la estructura (como en, por ejemplo la Fórmula (I)), el estereoisómero nombrado o representado es al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 99% o 99.9% en peso puro con respecto a otros estereoisómeros. Cuando se nombra un único enantiómero (como en, por ejemplo, L-(+)-ácido tartárico) o está representado por la estructura (como en, por ejemplo la Fórmula (I)), el enantiómero nombrado o representado es al menos 80%, 90%, 99% o 99.9% en peso ópticamente puro. La pureza óptica porcentual en peso es las relación del peso del enantiómero sobre el peso del enantiómero más el peso de su isómero óptico.

"Racemato" o "mezcla racémica" significa un compuesto de cantidades equimolares de dos enantiómeros, en donde dichas mezclas no exhiben ninguna actividad óptica; es decir, no rotan el plano de luz polarizada.

El ácido tartárico posee tres estereoisómeros: L-(+)-ácido tartárico o ácido dextrotartárico y su enantiómero, ácido levotartárico o D-(-)-ácido tartárico, y la forma aquiral, ácido mesotartárico. La designación L o D no indica la capacidad del ácido de rotar el plano de luz polarizada.

Puede utilizarse cualquiera de los estereoisómeros de ácido tartárico para preparar Hemitartrato de Fórmula (I). Por ejemplo, el hemitartrato puede formarse solamente a partir de uno de sus estereoisómeros, o una combinación de los mismos. La sal de hemitartrato se selecciona de D-hemitartrato, L-hem ¡tartrato, ácido hemimesotartárico o D,L-hemitartrato racémico. En una modalidad específica, la sal de hemitartrato es L-hemitartrato. "L-hemitartrato" significa que la sal de hemitartrato se forma a partir de ácido L-tartárico. D, L-hemitartrato racémico significa que ambos D-tartrato y L-tartrato se utilizaron en la preparación de Hemitartrato de Fórmula (I). La cantidad de D-tartrato en D, L-hemitartrato racémico puede ser mayor que, igual a, o menor que la cantidad de L-tartrato presente.

"Levorrotatorio" significa que la luz polarizada se rota a la izquierda cuando pasa a través de un compuesto asimétrico. El prefijo para designar levorrotario es "L".

"Dextrorrotatorio" significa que la luz polarizada se rota a la derecha cuando pasa a través de un compuesto asimétrico. El prefijo para designar dextrorrotatorio levorrotario es "D".

Preparación de Hemitartrato de Fórmula (í) El Hemitartrato de Fórmula (I) puede prepararse mezclando la Fórmula (I) con ácido L-tartárico en un disolvente apropiado. La precipitación de Hemitartrato de Fórmula (I) puede ayudarse mediante la adición de un cristal de siembra. Los disolventes que pueden utilizarse son metanol, agua, etanol, acetona, acetato de etilo, o combinaciones de los mismos.

Las formas sólidas particulares de Hemitartrato de Fórmula (I) pueden prepararse, por ejemplo, mediante evaporación lenta, enfriamiento lento, y precipitación de antidisolvente. Los disolventes que pueden utilizarse en estos métodos incluyen agua, heptano, hexano, tolueno, diclorometano, etanol, alcohol isopropílico, acetonitrilo, acetato de etilo, metanol, acetona, metil terciario-butil éter (denominado "TBME" en la presente), pdioxano, y tetrahidrofurano (denominado "THF" en la presente).

Las formas sólidas de Hemitartrato de Fórmula (I) pueden prepararse mediante evaporación de disolvente a partir de una solución de Hemitartrato de Fórmula (I) en un disolvente o una mezcla de disolventes. Las mezclas de disolventes apropiados incluyen metanol, etanol, acetona, agua, acetato de etilo y diclorometano. Las mezclas de disolvente preferibles incluyen etanol, metanol, agua y acetona.

Las formas sólidas de Hemitartrato de Fórmula (I) pueden prepararse a través de enfriamiento lento de una solución calentada de Hemitartrato de Fórmula (I) en un disolvente. Los disolventes apropiados incluyen etanol, metanol, agua, acetona, y acetato de etilo.

Las formas sólidas de Hemitartrato de Fórmula (I) pueden prepararse a través del enfriamiento rápido de una solución calentada de Hemitartrato de Fórmula (I) en un disolvente, colocando la solución en un baño de enfriamiento. Los disolventes apropiados incluyen etanol, metanol, acetona, agua, acetato de etilo o mezclas de estos disolventes.

Las formas sólidas de Hemitartrato de Fórmula (I) pueden prepararse añadiendo una solución de Hemitartrato de Fórmula (I) en un disolvente según lo descrito más arriba a un anti-disolvente en una temperatura dada. Más particularmente, el anti-disolvente es acetato de etilo, acetona, acetonitrilo, tolueno, THF, TBME, p-dioxano, isopropanol, o heptano. Las mezclas particulares de disolvente/antidisolvente incluyen metanol/acetato de etilo, metanol/acetona, metanol /hexano, metanol/heptano, metanol/acetonitrilo, metanol/tolueno, metanol THF, metanol/TBME, metanol/p-dioxano, etanol/acetato de etilo, etanol/hexano, etanol/heptano, etanol, acetona, etanol/acetonitrilo, etanol/tolueno, etanol/TBME, etanol/THF, agua/THF, agua/isopropanol, agua/acetonitrilo, agua/acetona, diclorometano/heptano, diclorometano/acetona, diclorometano/acetato de etilo, diclorometano/acetonitrilo, diclorometano/tolueno, diclorometano/THF, diclorometano/TBME, diclorometano/p-dioxano, y diclorometano/isopropanol.

Las mezclas preferibles de disolvente/antidisolvente incluyen metanol/acetato de etilo, metanol/acetona, metanol/TBME, y agua/acetona.

Según lo utilizado en la presente, "anti-disolvente" se refiere a un disolvente, en el que el Hemitartrato de Fórmula (I) posee baja solubilidad y hace que el Hemitartrato precipite fuera de la solución en forma de polvo fino o cristales.

Los métodos adicionales para generar las formas sólidas de Hemitartrato de Fórmula (I) incluyen precipitar el sólido del acetato de etilo/acetona y opcionalmente secar el sólido formado a temperatura ambiente. En otro método, el sólido después puede recristalizarse a partir de acetona con o sin la adición de un cristal de siembra. Alternativamente, el Hemitartrato de Fórmula (I) puede precipitarse a partir de acetato de los disolventes etilo/acetona y recristalizarse a partir de acetato de etilo. Alternativamente, el Hemitartrato de Fórmula (I) después puede recristalizarse a partir de isopropanol. Alternativamente el Hemitartrato de Fórmula (I) puede prepararse utilizando acetona solamente con o sin recristalización adicional. Alternativamente el Hemitartrato de Fórmula (I) puede precipitarse a partir de acetona después de un breve reflujo, sin recristalización adicional.

Alternativamente, el Hemitartrato de Fórmula (I) después puede recristalizarse a partir de metanol/acetona con o sin la adición de un cristal de siembra. Alternativamente, el Hemitartrato de Fórmula (I) después puede recristalizarse a partir de agua/acetona con o sin la adición de un cristal de siembra.

Caracterización de formas cristalinas de Hemitartrato de Fórmula 01 En una modalidad particular, la forma cristalina de Hemitartrato de Fórmula (I), Forma A cristalina, se caracteriza por uno, dos, tres, cuatro o cinco picos XRPD principales en los ángulos 2T de 5.1 °, 6.6°, 10.7°, 1 1.0°, 15.9°, y 21.7°. En una modalidad aún más particular, la forma cristalina se caracteriza por picos XRPD en los ángulos 2T de 5.1 °, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 13.3°, 15.1 °, 15.9°, 16.5°, 17.6°, 18.6°, 18.7°, 19.0°, 20.2°, 21.7° y 23.5°. Se debe entender que un ángulo 2T especificado significa el valor especificado ± 0.2°.

Según lo utilizado en la presente, "pico XRPD principal" se refiere a un pico XRPD con una intensidad relativa mayor que 25%. La intensidad relativa se calcula como una relación de la intensidad pico del pico de interés versus la intensidad pico del pico mayor.

Métodos de tratamiento utilizando Hemitartrato de Fórmula (I) Según lo utilizado en la presente, un sujeto es un mamífero, preferiblemente un paciente humano, pero también puede ser un animal con necesidad de tratamiento veterinario, tal como un animal de compañía (por ejemplo, perros, gatos, y similares), un animal de granja (por ejemplo, vacas, oveja, cerdos, caballos, y similares) o un animal de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, conejillo de Indias, y similares). Sujeto y paciente se utilizan en forma intercambiable.

Una modalidad de la presente solicitud es un método para reducir la velocidad, por ejemplo, inhibir o reducir la actividad de la glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glicoesfingolípidos en un sujeto que lo necesita administrando al sujeto una cantidad efectiva de sal de Hemitartrato de Fórmula (I), incluyendo formas cristalinas de la misma, según lo descrito más arriba.

Un sujeto con necesidad de tratamiento es un sujeto con una afección o enfermedad que se beneficia de la inhibición de la glucosilceramida sintasa o reducción de las concentraciones de glicoesfingolípidos en las células, particularmente la lisosoma o la membrana de células. Los inhibidores de glucosilceramida sintasa han demostrado ser útiles para tratar enfermedades de almacenamiento lisosomal tales como enfermedad de Tay-Sachs, Gaucher o Fabry (véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses N° 6,569,889; 6,255,336; 5,916,911 ; 5,302,609; 6,660,749; 6,610,703; 5,472,969; 5,525,616, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia).

Los ejemplos de las afecciones o enfermedades incluyen enfermedad policística del riñon y glomerulopatía membranosa (véanse las Solicitudes de Patentes Provisionales Estadounidenses 61/130,401 y 61/102,541 , cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia), Glomerulonefritis y Glomerulosclerosis (véase la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense 61/137,214) lupus (Véase PCT/US2009/001773, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia) diabetes, incluyendo diabetes de tipo 2 (véase WO 2006/053043, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia); tratamiento de trastornos que incluyen crecimiento y división celular, incluyendo cáncer, enfermedades vasculares del colágeno, arteriesclerosis, y hipertropia renal de pacientes diabéticos (véanse las Patentes Estadounidenses N° 6,916,802 y 5,849,326, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia); inhibición del crecimiento de células epiteliales arteriales (véanse las Patentes Estadounidenses N° 6,916,802 y 5,849,326); tratamiento de pacientes que sufren de infecciones (véase Svensson, M. et al., "Epithelial Glucosphingolipid Expression as a Determinant of Bacterial Adherence and Cytokine Production," Infecí and Immun., 62:4404-4410 (1994), cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia); prevención de que el huésped, es decir, paciente, genere anticuerpos contra el tumor (véase Inokuchi, J. et al., "Antitumor Activity in Mice of an Inhibitor of Glicoesfingolípido Biosynthesis," Cáncer Lett., 38:23-30(1987), cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia); y tratamiento de tumores (véase Hakomori, S. "New Directions in Cáncer Therapy Based on Aberrant Expression of Glycosphingolipids: Anti-adhesion and Ortho-Signaling Therapy," Cáncer Cells 3:461-470 (1991), Inokuchi, J. et al., "Inhibition of Experimental Metástasis of Murino Lewis Long Carcinoma by an Inhibitor of Glucosylceramide Synthase and its Possible Mechanism of Action," Cáncer Res., 50:6731-6737 (1990) and Ziche, M. et al., "Angiogenesis Can Be Stimulated or Repressed ¡n In Vivo by a Change in GM3 :GD3 Ganglioside Ratio," Lab. Invest, 67:711-715 (1992) cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia).

Hemitartrato de Fórmula (I) también puede utilizarse para una preparación similar a la vacuna para el cáncer (véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses N° 6,569,889; 6,255,336; 5,916,911 ; 5,302,609; 6,660,749; 6,610,703; 5,472,969; 5,525,616).

El compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato del mismo) puede utilizarse en los métodos desvelados como una mono-terapia, es decir, como el único principio farmacéuticamente activo que es administrado para tratar la indicación.

Alternativamente, el compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato del mismo) puede utilizarse en los métodos desvelados como una terapia de combinación con otros fármacos terapéuticamente activos conocidos en el arte para tratar las enfermedades o indicaciones deseadas. "Co-terapia" o "combinación" o "terapia de combinación" o "co-administrado" se utilizan en forma intercambiable en la presente y significan que el compuesto de Fórmula (I) o sal aceptable para uso farmacéutico del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato) se administra antes, después, o en forma concurrente con uno u otros agentes terapéuticos más. En una modalidad, una terapia de combinación se utiliza para tratar una enfermedad lisosomal tal como enfermedad de Gaucher o enfermedad de Fabry. Alternativamente, el compuesto de Fórmula (I) o sal aceptable para uso farmacéutico del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato) se co-administra simultáneamente (por ejemplo, en forma concurrente) como Formulaciones separadas o como Formulación conjunta. Alternativamente, los agentes pueden administrarse en forma secuencial, como composiciones separadas, dentro de un marco de tiempo apropiado, según lo determinado por el médico clínico experto (por ejemplo, un tiempo suficiente para permitir una superposición de los efectos farmacéuticos de las terapias). El compuesto de Fórmula (I) o sal aceptable para uso farmacéutico del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato) y uno u otros agentes terapéuticos más pueden administrarse en una única dosis o en múltiples dosis, en un orden y en un cronograma apropiado para lograr un efecto terapéutico deseado.

Los agente terapéuticos efectivos para el tratamiento de enfermedad de Gaucher incluyen glucocerebrosidasa, análogos de glucocerebrosidasa, inhibidores de glucosilceramida sintasa y chaperonas moleculares que se unen a la glucocerebrosidasa y restauran su conformación correcta. La glucocerebrosidasa o análogos de la misma pueden obtenerse de seres humanos o mamíferos. Alternativamente, la glucocerebrosidasa y análogos de la misma pueden obtenerse en forma recombinante. Los análogos de glucocerebrosidasa incluyen formas truncadas de la enzima y/o enzimas con sustituciones de aminoácidos respecto de la secuencia de aminos original de la enzima original, siempre que la actividad biológica sea retenida. Los ejemplos de análogos de glucocerebrosidasa incluyen Imiglucerasa (vendida bajo el nombre comercial Cerezyme®} por Genzima Corporation), Taliglucerase Alfa (a ser comercializada bajo el nombre comercial Uplyso® y desarrollada por Protalix Biotherapeutics, Inc.) y Velaglucerase Alfa (desarrollada por Shire PLC), que son análogos producidos con ADN recombinante de la ß-glucocerebrosidasa humana. Los ejemplos de chaperonas moleculares incluyen isofagomina (en desarrollo bajo el nombre comercial Plicera™ por Amicus Therapeutics, Cranbury, NJ). Isofagomina es también conocido como afegostat tartrato y contiene la forma de sal de tartrato de isofagomina como su principio activo. Los ejemplos de inhibidores de glucocerebrosidasa incluyen miglustat (desarrollado bajo el nombre comercial de Zavesca™ por Actelion Pharmaceuticals Ltd. Allschwil, Suiza).

Los agentes terapéuticos efectivos para el tratamiento de enfermedad de Fabry incluyen una galactosidasa A, análogos de una galactosidasa A y chaperonas moleculares que se unen a una galactosidasa A y restauran su correcta conformación. Una galactosidasa A o análogos de la misma puede obtenerse de seres humanos o mamíferos. Alternativamente, una galactosidasa A y análogos de la misma pueden obtenerse en forma recombinante. Los análogos de una galactosidasa A incluyen formas truncadas de la enzima y/o enzimas con sustituciones de aminoácidos respecto de la secuencia de aminos original de la enzima original, siempre que la actividad biológica sea retenida. Los ejemplos de análogos de una galactosidasa A incluyen Agalsidasa beta (una a-galactosidasa humana recombinante vendida bajo el nombre comercial Fabrazyme® como una medicina liofilizada por Genzima Corporation) y Agalsidasa alfa (una proteína recombinante vendida bajo el nombre comercial Replagal® por Shire PLC). Los ejemplos de chaperonas moleculares incluyen migalastat (desarrollada bajo el nombre comercial Amigal™ por Amicus Therapeutics, Cranbury, NJ como un fármaco que contiene hidrocloruro de migalastat como su principio activo).

En una modalidad, la terapia de combinación para el tratamiento de enfermedad de Gaucher o Fabry se lleva a cabo en dos tapas. En una primera etapa, un fármaco efectivo para el tratamiento de enfermedad de Gaucher o enfermedad de Fabry (típicamente, glucocerebrosidasa de un análogo de la misma para la enfermedad de Gaucher y galactosidasa A o una análogo de la misma para la enfermedad de Fabry) se utiliza para estabilizar el sujeto. Por ejemplo, en la enfermedad de Gaucher (o enfermedad de Fabry), uno de estos fármacos se utiliza para reducir la carga de almacenamiento de GL-1 en los órganos viscerales tales como en el hígado, bazo, pulmón y/o riñon. Una vez que se ha logrado, el compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato) se utiliza en la segunda etapa como una terapia de mantenimiento conveniente. La primera etapa típicamente dura hasta una, dos, tres o cuatro semanas o hasta uno, dos, tres, cuatro, seis, nueve o doce meses, o hasta que el recuento de plaquetas del sujeto es igual a o mayor que 100,000 mm3 ; concentración de hemoglobina es igual a o mayor que 11 g/dl (mujer) o 12 g/dl (hombre); y/o el volumen del bazo del sujeto es menor que o igual a 10 múltiplos del normal y los volúmenes de hígado son menores que o iguales a 1.5 múltiplos del normal. La administración de la primera etapa típicamente se finaliza una vez que se inicia la terapia con el compuesto de Fórmula (I).

Según lo utilizado en la presente, una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva para aliviar los síntomas existentes del sujeto que es tratado con mínimos efectos colaterales inaceptables en el sujeto. La formulación exacta, vía de administración, y dosificación son elegidas por el médico del individuo en vistas de la afección del paciente. L cantidad e intervalo de dosificación puede ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del compuesto activo que sean suficientes para mantener los efectos terapéuticos deseados. Además de la afección del paciente y el modo de administración, la dosis administrada dependería de la gravedad de los síntomas del paciente y la edad y peso del paciente. Una cantidad efectiva típicamente dará como resultado niveles plasmáticos mínimos del compuesto arriba de al menos 5 ng/ml. Si los niveles plasmáticos mínimos están por debajo de 5 ng/ml después de la administración de una cantidad efectiva del compuesto, la dosis que está siendo administrada a ese sujeto se cambia a una "cantidad efectiva ajustada" de manera tal que los niveles mínimos del compuesto sean al menos 5 ng/ml. Alternativamente, si los niveles plasmáticos mínimos del compuesto están por debajo de 5 ng/ml y/o la Cmax está por arriba de 100 ng/ml después de la administración de una cantidad efectiva del compuesto, la dosis que está siendo administrada al sujeto se cambia a una "cantidad efectiva ajustada" de manera tal que los niveles plasmáticos mínimos del compuesto sean al menos 5 ng/ml y la Cmax esté por debajo de 100 ng/ml. Las cantidades efectivas pueden variar de 0.1 a 500 mg/por día. Alternativamente, la cantidad efectiva varía de 50-300 mg/día. En otra alternativa, la cantidad efectiva varía de 100-300 mg/día. El compuesto de la presente solicitud puede administrarse en forma continua o en intervalos de tiempo especificados. Por ejemplo, el compuesto de la presente solicitud puede administrarse 1 , 2, 3, o 4 veces por día, tal como, por ejemplo, una formulación diaria o dos veces por día. Pueden emplearse ensayos comercialmente disponibles para determinar los intervalos de dosis óptimos y/o cronogramas para la administración.

En una modalidad, una cantidad efectiva para el compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato descrita más arriba) es (como una monoterapia o como una co-terapia) una dosis diaria de 25 miligramos a 300 miligramos (alternativamente 25 miligramos a 150 miligramos; en otra alternativa de 50 miligramos a 300 miligramos; y en otra alternativa de 100 miligramos a 300 miligramos), tal como 25, 50, 100, 200 o 300 miligramos por día. En una modalidad específica, una cantidad efectiva del compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo (incluyendo Hemitartrato de Fórmula (I)) es (como monoterapia o como una co-terapia) una dosis de dos veces por día de 50 miligramos (para un total de 100 miligramos por día), 100 miligramos (para un total de 200 miligramos por día) o 150 miligramos (para un total de 300 miligramos por día). En una modalidad alternativa, una cantidad efectiva para el compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo (incluyendo Hemitartrato de Fórmula (I)) es (como una monoterapía o como una co-terapia) administrada como una dosis una vez por día de 100 miligramos/día, 200 miligramos/día o 300 miligramos/día.

En otra modalidad, una cantidad efectiva se determina suponiendo que el sujeto es un "metabolizador lento de P450" y evaluando después los niveles plasmáticos mínimos y/o Cmax. La cantidad administrada al sujeto después se cambia a una cantidad efectiva ajustada, según lo descrito más abajo, si los niveles plasmáticos mínimos están por debajo de 5 ng/ml; o los niveles mínimos del compuesto están por debajo de 5 ng/ml y/o la Cmax está por arriba de 100 ng/ml; o si se determina que el sujeto es un metabolizador intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450. Una cantidad efectiva para los metabolizadores lentos de P450 está (como una monoterapia o como una co-terapia) comúnmente entre 100-200 miligramos por día, por ejemplo 100 o 200 miligramos, como una dosis una vez por día o dosis dos veces por día.

Típicamente, la composiciones farmacéuticas de la presente solicitud pueden administrarse antes o después de una comida, o con una comida. Según lo utilizado en la presente, "antes" o "después" de una comida es típicamente dentro de las dos horas, preferiblemente dentro de una hora, más preferiblemente dentro de treinta minutos, mucho más preferiblemente dentro de diez minutos de comenzar o finalizar una comida, respectivamente.

Ahora se ha descubierto que el compuesto de Fórmula (I) y las sales aceptables para uso farmacéutico del mismo (incluyendo Hemitartrato de Fórmula (I)) es metabolizado por el hígado, básicamente por enzimas del citocromo P450. Los citocromos P450 ("CYPs") son las principales enzimas metabolizadoras de xeobióticos hepáticas. Existen once citocromos P450 metabolizadores de xenobióticos expresados en el hígado humano típico (es decir, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8/9/18/19, CYP2D6, CYP2E1 y CYP3A4/5). También se ha descubierto ahora que CYP2D6 y CYP3A4 son las isoformas primarias de citocromos P450 que son responsables de destoxificar el compuesto de Fórmula (I) sus sales farmacéuticamente activas, tales como Hemitartrato de Fórmula (I). El nivel de actividad de las enzimas P450 difiere conforme al individuo. Por ejemplo, los individuos pueden clasificarse como metabolizadores lentos, intermedios y extensivos/ultra-rápidos de P450. Debido a que los niveles inferiores de actividad de P450 en un individuo pueden dar origen a interacciones fármaco/fármaco ("DDI"), otra modalidad de la invención es para determinar si el sujeto es un metabolizador lento, intermedio y extensivo/ultra-rápido de P450. Si el sujeto es un metabolizador intermedio o extensivo/ultra-rápido, entonces la dosis administrada a ese la cantidad que da como resultado niveles plasmáticos mínimos del compuesto de al menos 5 ng/ml; o la cantidad que da como resultado niveles mínimos del compuesto o al menos 5 ng/ml y una Cmax del compuesto por debajo de 100 ng/ml. La dosis puede elevarse en forma incremental y el sujeto puede reexaminarse una vez, dos veces, tres, cuatro o tantas veces como sea necesario para lograr una dosis efectiva ajustada.

Para el gen CYP 2D6 existen cuatro fenotipos previstos: Un "metabolizador lento de P450" porta dos alelos mutantes, que da como resultado una pérdida completa de la actividad enzimática.

Un "metabolizador intermedio de P450" posee un alelo de actividad reducida y un alelo nulo.

Un "metabolizador extensivo de P450" posee al menos uno o más de dos alelos funcionales normales.

Un "metabolizador ultra-rápido de P450" porta múltiples copias (3-13) de alelos funcionales y produce actividad enzimática en exceso.

Un sujeto típicamente se evalúa como que es un metabolizador lento, intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450 a través de la genotipificación o a través del monitoreo de los niveles plasmáticos mínimos de un fármaco que es metabolizado por una enzima P450 tal como CYP2D6 o CYP3A4. Comúnmente, los niveles plasmáticos mínimos y/o Cmax del compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, incluyendo Hemitartrato de Fórmula (I) son monitoreados en el sujeto durante hasta una, dos, tres o cuatro semanas, o hasta una, dos, tres, seis, nueve o doce meses o más después de la iniciación del tratamiento con el compuesto. Los ajustes a la dosis se realizan, según sea necesario, para mantener los niveles dentro de los límites descritos, es decir, un nivel plasmático mínimo en o arriba de 5 ng/ml.

Los sujetos pueden volverse metabolizadores lentos de P450 como resultado de ser tratados con ciertos fármacos que son inhibidores de la enzima P450. Los ejemplos de dichos fármacos incluyen paroxetina, fluoxetina, quinidina, o ketoconazol. Alternativamente, un sujeto es un metabolizador lento de P450 como resultado de la baja expresión de la enzima P450. En dichos casos, la baja expresión puede evaluarse determinando la expresión de la enzima P450 en el sujeto, es decir, genotipificando el sujeto en cuanto a la enzima P450. Por ejemplo, la expresión de CYP2D6 comúnmente se evalúa por PCR (McEIroy et.al. "CYP2D6 Genotyping as an Alternative to Phenotyping for Determination of etabolic Status in a Clinical Trial Setting", AAPS Pharmsi (2000) 2(4): artículo 33 (http://www.pharmsci.org/)) o por ensayo farmacogenómico en base a microarreglos (Background Information, Roche Diagnostics "The CYP450 Gene Family and Drug Metabolism", Hoffmann La Roche Ltd.), cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia. Como tal, el sujeto puede genotipificarse convenientemente en cuanto a la expresión de P450 (por ejemplo, CYP2D6) previo a la iniciación del tratamiento y se le puede administrar una cantidad efectiva ajustada, so es necesario. En el caso de la genotipificación previa a la iniciación del tratamiento, aún es aconsejable monitorear los niveles plasmáticos mínimos y Cma> del compuesto y ajustar la dosis, según sea necesario.

Las cantidades efectivas para migalastat, agalsidasa P, imiglucerasa, isofagomina y miglustat son según se describen en la etiqueta del fármaco o según lo llevado a cabo en los ensayos clínicos de cada fármaco.

El compuesto de Fórmula (I) puede reaccionar con ácidos aceptables para uso farmacéutico para formar una sal aceptable para uso farmacéutico. Los ejemplos de ácidos aceptables para uso farmacéutico incluyeron ácidos inorgánicos tales como ácido hidroclórico, ácido hidrobrómico, ácido hidroyódico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido p-toluenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido oxálico, ácido pbromofenil-sulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético, y similares. Los ejemplos de dichas sales incluyen sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfato, fosfato, monohidrogenfosfato, dihidrogenfosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, hombreato, butino-1,4-dioato, hexino-1 ,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxíbenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gamma-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanosulfonato, propanesulfonato, naftaleno-l-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato, y similares.

Composiciones farmacéuticas que incluyen Hemitartrato de Fórmula (i) Las formulaciones apropiadas y modos de administración para el compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo (incluyendo la sal de hemitartrato del mismo) incluyen aquellos descritos en la Patente Estadounidense N° 7,253,185, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia. Una formulación preferible para Hemitartrato de Fórmula (I) se describe en los siguientes párrafos.

Una modalidad de la invención es una composición farmacéutica que comprende Hemitartrato de Fórmula (I), al menos un agente de relleno soluble en agua, al menos un agente de relleno insoluble en agua, al menos un ligante, y al menos un lubricante. Los agentes de relleno solubles en agua apropiados pueden incluir, por ejemplo, lactosa anhidra, monohidrato de lactosa, manitol, cloruro de sodio, azúcar en polvo, sorbitol, sacarosa, inositol y almidón pregelatinizado. Los agentes de relleno insolubles en agua apropiados pueden incluir, por ejemplo, celulosa microcristalina, fosfato de calcio y almidón. Los ligantes apropiados pueden incluir, por ejemplo, almidón pre-gelatinizado, carboximetil celulosa sódica, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, polivinil pirrolidona, copolividona, gelatina, gomas naturales, pasta de almidón, sacarosa, jarabe de maíz, polietilenglicoles y alignato de sodio. Los lubricantes apropiados pueden incluir, por ejemplo, aceite vegetal hidrogenado, estearato de calcio, y gliceril behenato. En una modalidad de la composición farmacéutica, el agente de relleno soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en lactosa anhidra, monohidrato de lactosa, manitol, cloruro de sodio, azúcar en polvo, sorbitol, sacarosa, inositol y almidón pregelatinizado; el agente de relleno insoluble en agua se selecciona del grupo que consiste en celulosa microcristalina, fosfato de calcio y almidón el ligante se selecciona del grupo que consiste en almidón pregelatinizado, carboximetil celulosa sódica, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, polivinil pirrolidona, copolividona, gelatina, gomas naturales, pasta de almidón, sacarosa, jarabe de maíz, polietilenglicoles y alignato de sodio; y el lubricante se selecciona del grupo que consiste en aceite vegetal hidrogenado, estearato de calcio, y gliceril behenato.

La fórmula farmacéutica comprende entre 8 % en peso a 32 % en peso, entre 8 % en peso a 24 % en peso, entre 12 % en peso a 20 % en peso o entre 14 % en peso a 18 % en peso del agente de relleno insoluble en agua en forma de sólidos secos.

La fórmula farmacéutica comprende entre 26 % en peso a 50 % en peso, entre 30 % en peso a 46 % en peso, entre 34 % en peso a 46 % en peso o entre 38 % en peso a 44 % en peso del agente de relleno soluble en agua en forma de sólidos secos.

La composición farmacéutica comprende entre 30 % en peso y 45 % en peso, entre 35 % en peso y 40 % en peso y 36 % en peso a 39 % en peso de Hemitartrato de Fórmula (I) en forma de sólidos secos.

La formulación farmacéutica típicamente comprende entre 2 % en peso y 6 % en peso de ligante en forma de sólidos secos.

La formulación farmacéutica típicamente comprende entre 0.1 % en peso y 2 % en peso de ligante en forma de sólidos secos.

En una modalidad específica, la fórmula farmacéutica comprende entre 8 % en peso a 32 % en peso agente de relleno insoluble en agua, entre 26 % en peso a 50 % en peso de agente de relleno soluble en agua, entre 30 % en peso y 45 % en peso de Hemitartrato de Fórmula (I), entre 2 % en peso y 6 % en peso de ligante y entre 0.1 % en peso y 2 % en peso de ligante, todo en forma de sólidos secos. Más específicamente, el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; y el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina. Aún más específicamente el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina; el ligante es hidroxipropil metilcelulosa; y el lubricante es gliceril behenato.

En una modalidad específica, la fórmula farmacéutica comprende entre 8 % en peso a 32 % en peso de agente de relleno insoluble en agua, entre 26 % en peso a 50 % en peso de agente de relleno soluble en agua, entre 35 % en peso y 40 % en peso de Hemitartrato de Fórmula (I), entre 2 % en peso y 6 % en peso de ligante y entre 0.1 % en peso y 2 % en peso de ligante, todo en forma de sólidos secos. Más específicamente, el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; y el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina. Aún más específicamente el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina; el ligante es hidroxipropil metilcelulosa; y el lubricante es gliceril behenato.

En otra modalidad específica, la fórmula farmacéutica comprende entre 8 % en peso a 24 % en peso de agente de relleno insoluble en agua, entre 30 % en peso a 46 % en peso de agente de relleno soluble en agua, entre 35 % en peso y 40 % en peso de Hemitartrato de Fórmula (I), entre 2 % en peso y 6 % en peso de ligante y entre 0.1 % en peso y 2 % en peso de ligante, todo en forma de sólidos secos. Más específicamente, el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; y el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina. Aún más específicamente el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina; el ligante es hidroxipropil metilcelulosa; y el lubricante es gliceril behenato.

En otra modalidad específica, la fórmula farmacéutica comprende entre 12 % en peso a 20 % en peso de agente de relleno insoluble en agua, entre 34 % en peso a 46 % en peso de agente de relleno soluble en agua, entre 35 % en peso y 40 % en peso de Hemitartrato de Fórmula (I), entre 2 % en peso y 6 % en peso de ligante y entre 0.1 % en peso y 2 % en peso de ligante, todo en forma de sólidos secos. Más específicamente, el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; y el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina. Aún más específicamente el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina; el ligante es hidroxipropil metilcelulosa; y el lubricante es gliceril behenato.

En otra modalidad específica, la fórmula farmacéutica comprende entre 14 % en peso a 18 % en peso de agente de relleno insoluble en agua, entre 38 % en peso a 44 % en peso de agente de relleno soluble en agua, entre 35 % en peso y 40 % en peso de Hemitartrato de Fórmula (I), entre 2 % en peso y 6 % en peso de ligante y entre 0.1 % en peso y 2 % en peso de ligante, todo en forma de sólidos secos. Más específicamente, el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; y el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina. Aún más específicamente el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina; el ligante es hidroxipropil metilcelulosa; y el lubricante es gliceril behenato.

En otra modalidad específica, la fórmula farmacéutica comprende entre 14 % en peso a 18 % en peso de agente de relleno insoluble en agua, entre 38 % en peso a 44 % en peso de agente de relleno soluble en agua, entre 36 % en peso y 39 % en peso de Hemitartrato de Fórmula (I), entre 2 % en peso y 6 % en peso de ligante y entre 0.1 % en peso y 2 % en peso de ligante, todo en forma de sólidos secos. Más específicamente, el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; y el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina. Aún más específicamente el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina; el ligante es hidroxipropil metilcelulosa; y el lubricante es gliceril behenato.

La invención está ilustrada por los siguientes ejemplos, que no tienen como objetivo ser restrictivos de ninguna manera.

Experimental EJEMPLO 1 Preparación de sales de la Fórmula (I) La sal de Hemitartrato de Fórmula I se cristaliza fácilmente y exhibe muchas propiedades beneficiosas en comparación con otras sales. Por ejemplo, los siguientes ácidos se utilizaron en la preparación de sales del compuesto representado por la Fórmula (I): ácido cítrico (que genera sales en relaciones de 1 :1 , 1 :2, y 1:3 (sakFórmula I)); L-málico (1 :1 y 1 :2); ácido metano sulfónico (1 :1); ácido fumárico (1:1 y 1 :2); ácido hidroclórico (1 :1); ácido acético (1 :1) y ácido tartárico (1 :1 y 1:2). Solamente las sales generadas por ácido hidroclórico (1 :1); ácido tartárico (1:1) y ácido tartárico (1:2) fueron de forma sólida. De estas tres sales se descubrió que el ácido hidroclórico (1 :1) y ácido tartárico (1 :1) son higroscópicas y no cristalinas y por ello inaceptables para el uso en un producto farmacéutico. Se descubrió que el hemitartrato (1 sal: 2 Fórmula I) del compuesto representado por la Fórmula I es cristalino y no higroscópico.

Preparación de acetona de Hemitartrato de Fórmula (I) Se disolvió ácido L-tartárico (6.02 g , 40.11 mmoles, 0.497 equivalentes) en acetona (175 mi) sometiendo a reflujo la solución y enfriando después hasta temperatura ambiente. Se disolvió la Base Libre de Fórmula (I) (32.67 g, 80.76 mmoles) en acetona (300 mi) a temperatura ambiente. Se añadió solución de ácido L-tartárico a la solución de Base Libre de Fórmula (I) a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se formó a mitad de camino un precipitado blanco a través de la adición. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 0.5 horas y después se sometió a reflujo por corto tiempo y se enfrió hasta temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 0.5 horas, se filtró el precipitado blanco. El sólido blanco se lavó dos veces con acetona (2 x 130 mi). El sólido se secó al aire y después se secó al vacío a 55-60 °C. El rendimiento fue 36.66g (95 %).

Metanol al 5% en preparación de acetona de Hemitartrato de Fórmula (I).

Se disolvió la Base Libre de Fórmula (I), 10 g/24.7 mmoles, en Metanol/Acetona al 5% 120 mi o 240 mi. Se disolvió ácido L-tartárico, 1.85 g/12.3 mmoles, en Metanol/Acetona al 5% 60 mi o 120 mi (N o 2N) entibiando hasta 40-45 °C, y esta solución se añadió a la primera solución. Después de 1 hora sin precipitación, se añadió 1 mg de Hemitartrato de Fórmula (I) como un cristal de siembra. Se produjo la precipitación después de 5 minutos, y la reacción continuó agitando durante 30 minutos más. La reacción después se calentó bajo reflujo durante 5 minutos (el precipitado era completamente soluble) y después se enfrió hasta temperatura ambiente en un baño de agua 20-22 °C. Se formó el precipitado y la reacción continuó agitando durante 3 horas. Se recolectó el producto final mediante filtración y se lavó con acetona, 2 x 40 mi, y después se secó en el horno al vacío a 55-60 °C durante 16 horas. El peso del producto fue 8.72 g/74% de rendimiento.

Agua al 1% en la preparación de acetona de Hemitartrato de Fórmula (I).

Se disolvió la Base Libre de Fórmula (I) (10 g/24.7 mmoles) en Agua/Acetona al 1% 120 mi o 240 mi a temperatura ambiente. Se disolvió ácido L-tartárico, 1.85 g/12.3 mmoles, en Agua/Acetona al 1% 60 mi o 120 mi (N o 2N) entibiando hasta 40-45 °C, y se añadió esta solución a la primera solución. Después de 1 hora sin precipitación, se añadió 1 mg de Hemitartrato de Fórmula (I) como un cristal de siembra. Se produjo la precipitación después de 5 minutos, y la reacción continuó agitando durante 30 minutos. Después se calentó la reacción bajo reflujo durante 5 minutos (el precipitado no era completamente soluble) y después se enfrió hasta temperatura ambiente en un baño de agua 20-22 °C. Se formó el precipitado y la reacción continuó agitando durante 3 horas. Se recolectó el producto final mediante filtración y se lavó con acetona, 2 x 40 mi, y después se secó en el horno al vacío a 55-60 °C durante 16 horas. El peso del producto fue 8.62 g 73% de rendimiento.

Metanol al 5% en la recristalización en acetona de Hemitartrato de Fórmula (I).

Se disolvió Hemitartrato de Fórmula (I) (3.06 g) en 116 mi de metariol al 5% en acetona bajo reflujo. La solución se enfrió hasta temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se filtró el precipitado blanco y se lavó con 10 mi de metanol al 5% en acetona y después acetona (15 mi). Después del secado al vacío durante 18 horas a 55-60 °C, se recibió 2.38 g de Hemitartrato de Fórmula (I) (78 % de recuperación).

H?Q al 1% en Recristalización en acetona de Hemitartrato de Fórmula (I).

Se disolvió Hemitartrato de Fórmula (I) (3.05 g) en 125 mi de H2O al 1% en acetona bajo reflujo. La solución se enfrió hasta temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se filtró el precipitado blanco y se lavó con 10 mi de H2O al 1% en acetona y después acetona (15 mi). Después del secado al vacío durante toda la noche a 55-60 °C, se obtuvieron 2.35 g de Hemitartrato de Fórmula (I) (77 % de recuperación).

EJEMPLO 2 Preparación de Hemitartrato de Fórmula (I) cristalino Se cristalizó Hemitartrato de Fórmula (I) mediante diversos métodos. Se preparó el Lote 1 utilizando disolventes de acetato de etilo/acetona y se secó a temperatura ambiente. Se preparó el Lote 3 utilizando disolventes de acetato de etilo/acetona y se recristalizó a partir de acetato de etilo. Se recristalizó el Lote 4 a partir de acetona utilizando el material del Lote 1. El Lote 5 se recristalizó a partir de isopropanol. Se preparó el Lote 7 utilizando disolvente de acetato de etilo/acetona similar al Lote 1 pero en a gran escala, se preparó el Lote 8 utilizando acetona solamente sin recristalización adicional. Se preparó el Lote 9 utilizando acetona solamente con reflujo corto, nuevamente sin recristalización adicional.

TABLA 1 Resumen de detección de polimorfismo de los Lotees 1-9 de Hemitartrato de Fórmula (I) *: que contiene algo de base libre en el termograma DSC. **: que contiene hábitos cambiados en estos lotes con forma de vara, lámina a aguja, varas y formas irregulares.

Las formas de cristal de Hemitartrato de Fórmula (I) también se prepararon utilizando evaporación lenta, enfriamiento lento, enfriamiento rápido y precipitación en anti-disolvente con una variedad de disolventes.

Método de evaporación lenta. Se trató una muestra ponderada (usualmente 20 mg) con alícuotas del disolvente de ensayo. Las alícuotas fueron típicamente 100-200 L. Entre las adiciones de disolvente, la mezcla se agitó o se sometió a sonicación. Cuando se disolvieron los sólidos, según lo juzgado por inspección visual, se permitió que la solución evapore en condiciones ambiente en un vial abierto cubierto con lámina de aluminio perforada con agujeros minúsculos. Se estimaron las solubilidades a partir de estos experimentos en base al disolvente total añadido para obtener una solución clara.

TABLA 2 Solubilidad aproximada de Hemitartrato de Fórmula (I) a temperatura ambiente (20-25 °C).

TABLA 3 Resumen de polimorfismo utilizando metodología de evaporación lenta : las partículas tenían forma de vara y lámina Método de enfriamiento lento/rápido. Se disolvió Hemitartrato de Fórmula (I) en un disolvente de ensayo a 50-60 °C. Después se permitió que la solución resultante enfríe hasta temperatura ambiente (enfriamiento lento). Si no se formaron sólidos después de un día, los viales se colocaron en un refrigerador. Para los experimentos de enfriamiento rápido, después se permitió que la solución resultante se enfríe en un refrigerador. Se recolectaron los sólidos mediante filtración y se secaron al aire.

TABLA 4 Resumen de polimorfismo utilizando metodología de enfriamiento lento ': las partículas tenían forma de vara y lámina.

TABLA 5 Resumen de polimorfismo utilizando metodología de enfriamiento rápido : las partículas tenían forma de vara y lámina.

Método de anti-disolvente. Se disolvió Hemitartrato de Fórmula (I) en un disolvente. Se añadió un anti-disolvente a la solución. Los sólidos que se formaron se recolectaron mediante filtración y se secaron al aire.

TABLA 6 Resumen de detección de polimorfismo utilizando metodología de antidisolvente EJEMPLO 3 Propiedades físicas del Hemitartrato de Fórmula (I) Calorimetría de barrido diferencial (DSC). Se recolectaron los datos de DSC en un instrumento TA Q100 utilizando nitrógeno como gas de purga. Se ponderaron aproximadamente 2-5 mg de muestra con precisión en un crisol de aluminio para DSC. El crisol se cubrió con una tapa y se perforó con un fórceps. La células de muestra se equilibró a 30 °C y se calentó a una velocidad de 10 °C por minuto hasta una temperatura final de 220 °C.

Microscopía de platina caliente. La microscopía en etapa caliente se realizó utilizando una platina caliente Linkam (modelo FTIR 600) montada en un microscopio Leica DM LP equipado con cámara Sony DXC-970MD 3CCD para la recolección de imágenes. Se utilizó un objetivo 40x con luz polarizada para ver las muestras. Cada una de las muestras se colocó entre dos tapas de vidrio. Cada muestra se observó visualmente a medida que la platina se calentaba. Se capturaron las imágenes utilizando Links versión 2.27 (Linkam). La platina caliente se calibró utilizando normas de punto de fusión USP.

La transición endotérmica observada en el perfil de DSC se confirmó que era una transición de fusión a una temperatura entre 160-163°C por microscopía de platina caliente.

EJEMPLO 4 Difracción de polvo de rayos X de Hemitartrato de Fórmula (I) Todos los análisis de Difracción de polvo de rayos X (XRPD) se realizaron en SSCI, Inc. (West Lafayette, IN 47906). Los análisis de XPRD se llevaron a cabo utilizando un difractómetro de polvo de rayos X Shimadzu XRD-6000 X utilizando radiación Cu K a. El instrumento está equipado con un tubo de rayos X de foco fino. El voltaje y amperaje del tubo se fijaron en 40 kV y 40 mA, respectivamente. La divergencia y franjas de desviación se fijaron a 1 ° y la franja de recepción se fijó en 0.15 mm. La difracción refractada se detectó mediante un detector de centelleo de Nal. Se utilizó detección continua theta theta-dos a 3 min (paso de 0.4 sec/0.02°) de 2.5 a 40 °20. Se analizó el patrón del silicio para controlar la alineación del instrumento. Se recolectaron los datos y se analizaron utilizando XRD-6000 v 4.1.

EJEMPLO 5 Comparación de Hemitartrato de Fórmula (I) y Base Libre de Fórmula (I) La caracterización del sólido de la base libre y la sal de hemitartrato se resumen en la Tabla 7. El Hemitartrato de Fórmula I posee propiedades superiores en comparación con la base libre de Fórmula I. Por ejemplo, el Hemitartrato de Fórmula I posee un punto de fusión superior (> 150 °C), energía de empaquetado superior (mayor entalpia endotérmica), inferior variación en tamaño de partícula, superior solubilidad acuosa (sobre 300 mg/ml en agua), forma de cristal apropiada, y superior densidad a granel en comparación con la Base Libre de Fórmula I.

TABLA 7 Resumen de estado sólido y propiedades químicas y físicas de la Base Libre de Fórmula (I) y Hemitartrato de Fórmula (I) EJEMPLO 6 ACTIVIDAD IN VITRO Y ESPECIFICIDAD Actividad de Hemitartrato de Fórmula (I) en la inhibición de la síntesis in vitro de glicoesfingolípidos. Se utilizaron dos ensayos para cuantificar la actividad inhibidora de Hemitartrato de Fórmula (I) para la glucosilceramida sintasa. Debido a que la glucosilceramida es el primer paso y paso restrictivo de velocidad en la biosíntesis de glicoesfingolípidos, se utilizó un ensayo de citometría de flujo que midió los niveles de superficie celular de GM 1 y GM3 para evaluar indirectamente la actividad del inhibidor en células intactas. La incubación de células K562 o B 16/F 10 durante 72 horas con crecientes cantidades de Hemitartrato de Fórmula (I) (0.6-1000 nM) dio como resultado una reducción dosis dependiente de los niveles de superficie celular de ambos GM1 y GM3. El valor IC5o medio para inhibir la presentación de superficie celular de GM1 en células K562 fue 24 nM (intervalo 14-34 nM) (Tabla 8) y aquel para GM3 en células B 16/F 10 fue 29 nM (intervalo 12-48 nM). No se observó ninguna toxicidad celular evidente en cualquiera de las líneas celulares aún cuando se ensayaron en las dosis más grandes.

Un ensayo alternativo para la actividad midió la inhibición de la glucosilceramida sintasa en microsomas obtenidos de células humanas. En este ensayo, los microsomas se prepararon a partir de células de melanoma A375 humano por sonicación centrifugación. La preparación microsomal se incubó con un sustrato de ceramidas fluorescentes (NBD-C6-ceramida), UDP- glucosa, y crecientes cantidades de Hemitartrato de Fórmula (I) (0-1000 nM) durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, se separaron la glucosilceramida etiquetada en forma fluorescente y la ceramida sin reaccionar y se cuantificaron mediante HPLC de fase inversa y detección de fluorescencia. En este ensayo el valor IC50 para inhibir la síntesis de glucosilceramidas varió de 20 a 40 nM. Este valor fue similar a aquellos obtenidos más arriba para GM1 y GM3 y sugiere que las mediciones de estos glicolipidos de superficie celular son buenos sustitutos de la actividad de Hemitartrato de Fórmula (I) para la glucosilceramida sintasa.

Especificidad de la inhibición de la síntesis del sustrato por Hemitartrato de Fórmula (I). Se evaluó la especificidad del Hemitartrato de Fórmula (I) en una serie de ensayos libre de células y basados en células in vitro. Las enzimas de glicosidasa intestinal se ensayaron en homogenatos de tejido de rata (véase U. Andersson, et al., Biochem. Pharm. 59 (2000) 821-829, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia), y se ensayó la enzima desramificadora de glicogen en un ensayo libre de células según lo descrito (véase U. Andersson, et al., Biochem. Pharm. 67 (2004) 697-705, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia). No se encontró ninguna inhibición detectable de glicosidasas intestinales (lactasa, maltasa, sucrasa), a-glucosidasa I y II, y la enzima desramificadora citosolica (a-1 ,6-glucosidasa), en concentraciones hasta 2500 µ? (Tabla 8).

Se ensayaron glucosilceramidasa no lisosomal y glucocerebrosidasa lisosomal en células humanas intactas utilizando C6-NBD-glucosilceramida como sustrato (véase H.S. Overkleeft, et al. J. Biol. Chem. 273 (1998) 26522-26527, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia). Se utilizó epóxido de conduritol (a un inhibidor específico de la glucocerebrosidasa lísosomal) para diferenciar la actividad lisosomal versus la actividad no lisosomal. También se midió la actividad de la glucocerebrosidasa mediante distribución celular activada por fluorescencia (FACS). Se cultivaron las células K562 con crecientes cantidades de Hemitartrato de Fórmula (I) en presencia de di^-D-glucopiranosida de 5-(pentafluorobenzoilamino)-fluoresceina 1 µ? (PFB-FDGlu, Sondas moleculares/lnvitrogen. Carlsbad, CA) durante 30-60 minutos. Las células se enfriaron inmediatamente en hielo y la fluorescencia cuantificada está más arriba. La glucosilceramidasa no lisosomal se inhibió débilmente con un IC50 de 1600 µ?. No hubo inhibición de glucocerebrosidasa lisosomal, la enzima que es deficiente en enfermedad de Gaucher, hasta la concentración más grande de 2500 µ? (Tabla 8). En consecuencia, se requirió un diferencial de aproximadamente 40,000 e la concentración para inhibir la glucosilceramida sintasa en comparación con cualquiera de las enzimas ensayadas.

TABLA 8 Actividades bioquímicas de Hemitartrato de Fórmula (I) in Vitro EJEMPLO 7 Manejo mejorado de los niveles de Glucosilceramida lisosomal en un modelo de ratón A. Enfermedad de Fabry.

Para determinar si el uso combinado de ambas terapia de reemplazo enzimático (ERT) y terapia de reducción de sustrato (SRT) puede mantener la reducción enzimática o proporcionar beneficios adicionales, se compararon las eficacias relativas de terapias separadas y combinadas en un modelo murino de enfermedad de Fabry (Fabry-Rag). El ratón progenitor con Fabry se describe en Wang, AM et al. Am. J. Hum. Genet. 59: A208 (1996). El Fabry-Rag se cruza con un ratón RAG-1 y no desarrolla linfocitos maduros o células T (inmunocomprometido).

Estudios de animales.

Para los estudio de monoterapia, los ratones con Fabry se colocaron en el estudio con 1 mes de edad (modelo de prevención). Los grupos de tratamiento recibieron Hemitartrato de Fórmula (I) (Genzima Corp., Cambridge, MA) como componente de la dieta alimenticia en pélets. El fármaco se formuló al 0.15% (p/p) en alimento de ratón 5053 estándar (TestDiet, Richmond, IN) y se proporcionó ad libitum. Esta Formulación proporcionó 300 mg/kg de Hemitartrato de Fórmula (I) por día e un ratón de 25 g- Para los estudios de terapia de combinación, los ratones con Fabry-Rag se colocaron en estudio a los 3 meses de edad (modelo de tratamiento). Los ratones en el grupo A recibieron inyecciones intravenosas de la alfa-galactosidasa A recombinante humana (Genzima Corp.) en una dosis de 1 mg/kg cada 2 meses (es decir a los 3, 5, 7 y 9 meses de edad). El grupo B recibió la misma dosis intravenosa enzimática más recibieron Hemitartrato de Fórmula (I) (Genzima Corp., Cambridge, MA) como componente de la dieta alimenticia en pélets. El fármaco se formuló al 0.15% (p/p) en alimento de ratón 5053 estándar (TestDiet, Richmond, IN) y se proporcionó ad libitum. Esta Formulación proporcionó 300 mg/kg de Hemitartrato de Fórmula (I) por día en un ratón de 25 g. El grupo C recibió inyecciones enzimáticas cada 4 meses (es decir a los 3 y 7 meses de edad) y estaba con la misma dieta de fármaco en alimento que el grupo B. El grupo D recibió solamente la dieta de fármaco en alimento (la misma que los grupos B y C). El grupo E eran ratones con Fabry-Rag no tratados y el grupo F eran controles de tipo salvaje. Véase la FIG 10.

Cuantificación de los niveles de globotriaosilceramida de tejido (GL-3. Gb3) La cuantificación de GL-3 fue por Espectrometría de masa Tándem esencialmente para GL-1. Se llevó a cabo el ensayo de placa caliente según lo descrito previamente (Ziegler, RJ et al. Molec. Ther. 15(3), 492-500 (2007).

Resultados Monoterapia de ratones con Fabry con Hemitartrato de Fórmula ül Se evaluó SRT en un modelo de ratón de enfermedad de Fabry, que es causada por una deficiencia de la actividad de a-galactosidasa A. La terapia con Hemitartrato de Fórmula (I) comenzó con un ratón con Fabry de un mes y se continuó hasta que los ratones alcanzaron el año de edad. Los animales se dosificaron con 300 mg/kg de Hemitartrato de Fórmula (I) en su dieta cada día. Se llevaron a cabo ensayos de comportamiento (es decir, ensayo de placa caliente) y ensayos bioquímicos (es decir, urinálisis y análisis del nivel de GL-3 I en tejidos/sangre/orina) de los ratones dos veces al mes. Según lo que se muestra en la FIGURA 7, la administración de Hemitartrato de Fórmula (I) a ratones con Fabry-Rag durante un periodo de 11 meses disminuyó el índice de acumulación lisosomal de la globotriaosliceramida (GL-3) e los órganos somáticos (hígado, riñon, corazón y bazo) en aproximadamente 50%. Esto traducido a un retardo en el avance de la enfermedad según lo evidenciado por una presentación posterior de insensibilidad a un estímulo aversivo de corazón (véase la FIGURA 8) y una prevención del deterioro de los factores del urinálisis, por ejemplo, volumen de orina, creatinina y niveles de sodio (véase la FIGURA 9). En consecuencia, la inhibición mediada por Hemitartrato de Fórmula (I) de la glucosilceramida sintasa que cataliza el primer paso en la síntesis de glicoesfingolípidos, no sólo es ventajosa en los modelos animales de la enfermedad de Gaucher sino también de la enfermedad de Fabry, y también podría tener efectos positivos en otros glicoesfingolípidos.

Terapia de combinación de ratones con Fabry con or-qalactosidasa A y Hemitartrato de Fórmula (I) Se evaluó la eficacia de ERT como único reactivo y en combinación con SRT utilizando Hemitartrato de Fórmula (I) en cinco poblaciones de ratones con Fabry-Rag (n=12/grupo). Comenzando a los tres meses de edad, los ratones se sometieron a un cronograma de ensayos de comportamiento (es decir ensayo de lámina caliente) y ensayos bioquímicos (es decir, análisis del nivel de GL-3 en tejidos/sangre/orina), según lo que se muestra en la FIGURA 10. En los ratones sometidos a ERT, se administraron 1 mg/kg de dosis de a-galactosidasa A en el cronograma según lo que se muestra en la FIGURA 10. En los ratones sometidos a SRT, se administraron 300 mg/kg de dosis de Hemitartrato de Fórmula (I) por día en la dieta del ratón.

Según lo que se muestra en la FIGURA 11 , ERT reduce los niveles de GL-3 en sangre en los ratones con Fabry-Rag, mientras que SRT no. Según lo que se muestra en la FIGURA 12, la combinación ERT/SRT es mucho más efectiva en la reducción de los niveles de GL-3 en el hígado y riñon de los ratones con Fabry-Rag.

Según lo que se muestra en la FIGURA 13, SRT reduce los niveles de GL-3 en orina en ratones con Fabry-Rag, mientras que ERT no. Según lo que se muestra en la FIGURA 14, SRT pero no ERT retarda la aparición de insensibilidad del corazón en ratones con Fabry-Rag.

En resumen, los ratones con Fabry-Rag tratados con una combinación de Fabrazyme y Hemitartrato de Fórmula (I) exhibieron mejoras en los marcadores de enfermedad en ERT o SRT como único reactivo en un modelo de tratamiento de la siguiente manera: acumulación de GL-3 en hígado y riñon significativamente reducida con la terapia de combinación; una mejora de GL-3 en orina en los grupos SRT; una mejora de GL-3 en sangre en los grupos ERT; y neuropatía periférica retardada en los grupos SRT.

B. Enfermedad de Gaucher. Para determinar si el uso secuencial de ambas terapia de reemplazo enzimático (ERT) y terapia de reducción de sustrato (SRT) puede proporcionar beneficios adicionales, se compararon las eficacias relativas de las terapias separadas y secuenciales en un modelo murino de la enfermedad de Gaucher (D409V/mutante).

Métodos Estudios en animales. Los procedimientos que incluyen animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional para el Uso y Cuidado de los Animales (IACUC) en Genzima Corporation siguiendo los lineamientos emitidos por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). El ratón Gaucher (D409V/mutante) es un modelo de enfermedad de Gaucher de tipo 1 que exhibe la acumulación de glucosilceramida en el hígado, bazo y pulmones pero carece de patología de cerebro u ósea (véase Y-H. Xu, et al., Am. J. Pathol. 163, 2003, 2093-2101 , cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia). Los animales de ambos sexos se colocaron en el estudio a los 3 meses de edad ya que los experimentos anteriores habían indicado que no había diferencia en la respuesta entre machos y hembras a la glucocerebrosidasa recombinante o Hemitartrato de Fórmula (I). El estudio tenía 6 grupos de los ratones siendo el grupo A sacrificado después de 2 semanas para proporcionar niveles básales de glucosilceramida en tejido. Todos los grupos B, C, y D recibieron glucocerebrosidasa recombinante humana (Genzima Corp., Cambridge, MA) (10mg/kg) por vía intravenosa a través de una vena de la cola (100 µ?_) cada 2 días para un total de 8 inyecciones. El grupo B se sacrificó al final de este régimen (al mismo tiempo que el grupo A) para proporcionar niveles reducidos en enzimas de glucosilceramida en tejido. A ambos grupos D y E se les administró Hemitartrato de Fórmula (I) (Genzima Corp., Cambridge, MA) como un componente de la dieta alimenticia en pélets. El fármaco se formuló al 0.075% (p/p) en alimento para ratón 5053 estándar (TestDiet, Richmond, IN) y se proporcionó ad libitum. Esta Formulación proporcionó 150 mg/kg de Hemitartrato de Fórmula (I) por día en un ratón de 25 g. El grupo F no recibió ningún tratamiento y se sacrificó junto con los grupos C, D y E 12 semanas después del inicio del estudio. El consumo de alimento y los pesos de los ratones se monitorearon tres veces por semana para determinar la ingesta de fármaco y el potencial impacto del fármaco en la salud en general. Se mataron los animales por inhalación de dióxido de carbono y sus tejidos se cosecharon inmediatamente. La mitad de cada tejido fue crioprotegida en hielo seco y se almacenó a -80°C hasta que esté lista para procesamiento adicional. La otra mitad se procesó para el análisis histológico .

Cuantificación de los niveles de glucosilceramida en tejido. Se cuantificaron los niveles de glucosilceramida por espectrometría en masa según lo descrito previamente (véase K. McEachern, et al., J. Gene. Med. 8 (2006) 719-729; T. Doering, J. Biol. Chem. 274 (1999) 1 1038-1 1045, las enseñanzas completas de ambos se incorporan en la presente por referencia).

Una masa conocida de tejido se homogeneizó en 2:1 (v/v) cloroformo:metanol y se incubó a 37°C durante 15 minutos. Se centrifugaron las muestras y se extrajeron los sobrenadantes con 0.2 volúmenes de agua durante toda la noche a 4°C. Se centrifugaron las muestras, se descartó la fase acuosa, y la fase orgánica se secaron hasta una película bajo nitrógeno. Para el análisis de espectrometría en masa, ionización por electrospray (ESI/MS), se reconstituyeron las muestras de tejido al equivalente de 50 ng de peso de tejido original en 1 mi cloroformo: metanol (2:1 , v/v) y se agitaron con vórtex durante 5 minutos. Se suministraron alícuotas (40 µ?_) de cada muestra a viales de recuperación total Waters y se añadieron 50 µ?_ de patrón interno d3-C16-GL-1 10pg/ml (Matreya, Inc., Pleasant Gap, PA). Las muestras se secaron bajo nitrógeno y se reconstituyeron con 200 µ?_ de 1 :4 (v/v) DMSO:metanol. Se llevó a cabo el análisis de ESI/MS de glucosilceramidas de diferentes longitudes de cadenas de carbono en una HPLC de alliance Waters (Separation Modulo 2695) acoplada a un sistema Micromass Quattro Micro equipado con una fuente de iones por electrospray. Las muestras de extracto de lípidos (20 pL) se inyectaron en una columna C8 (4 mi X 3 mm i.d; Phenomenex, Torrance, CA) a 45°C y se eluyeron con un gradiente de 50 a 100% de acetonitrilo (acetato de amonio 2mM, ácido fórmico al 0.1 %) en 0.5 ml/min. Los primeros 0.5 minutos se mantuvo en 50% orgánico y después rápidamente se cambió a 100% para los 3.5 minutos finales. La temperatura de la fuente se mantuvo constante a 150°C y se utilizó nitrógeno como gas de evaporación de solvente a una velocidad de flujo de 670 L/h. El voltaje capilar se mantuvo a 3.80 KV con un voltaje de cono de 23 V, mientras el tiempo de permanencia para cada especie iónica fue 100 ms. Se adquirieron los espectros por el modo MRM para monitorear las ocho isoformas dominantes (C16:0, C18:0, C20:0, C22:1 , C22:0, C22:1-OH, C24:1 , y C24:0). La cuantificación de glucosilceramida se basa en la suma de estas ocho isoformas al patrón interno, con un intervalo de curva de calibración de 0.1 a 10 pg/mL Histología. Para el análisis histológico, se fijaron los tejidos en formalina de zinc (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) a temperatura ambiente durante 24 horas, después se almacenaron en PBS a 4°C hasta que estuvieran listos para procesamiento adicional. Se deshidrataron todas las muestras en etanol, se depuraron en xilenos, se infiltraron y se embebieron en parafina R Surgipath (Surgipath, Richmond, IL). Se cortaron secciones de cinco micrones utilizando un micrótomo rotatorio y se secaron en un horno a 60°C previo a la tinción. Las secciones se desparafinaron en Hemo-De (Scientific Safety Solvents, Keller, TX) y se rehidrataron en concentraciones decrecientes de etanol seguido por un lavado con agua. Las secciones se tiñeron con Hematoxylin y Eosin (H&E) y se etiquetaron utilizando un anticuerpo monoclonal CD68 anti-ratón de rata (Serotec, Raleigh, NC) para identificar los macrófagos. Después del lavado durante 5 minutos en PBS, las láminas se deshidrataron en etanol y se depuraron en Hemo-De previo al montado con medio de montado en cubiertas de vidrio SHUR/Mount™ (TBS, Durham, NC). El área porcentual de inmunopositividad de CD68 en el hígado se cuantificó utilizando análisis de MetaMorph (MDS Analytical Technologies, Toronto, Canadá) de diez imágenes 400X por sección de tejido. Un patologista veterinario certificado del consejo ciego a la designación del grupo examinó todas las secciones.

Resultados Régimen de dosificación de glucocerebrosidasa para quitar el GL1 acumulado en el hígado, bazo y pulmón de ratones de 3 meses con Gaucher. Para investigar los méritos relativos de la combinación y monoterapia con terapia de reducción de sustrato o enzima, primero se determinó el régimen de enzimas que redujo máximamente los niveles de GL 1 en los órganos viscerales de ratones con Gaucher. A los ratones de 3 meses con Gaucher (D409V/mutante) se les administró por vía intravenosa 2, 4 o 8 dosis de 10 mg/kg de glucocerebrosidasa recombinante humana. Los ratones que fueron tratados con 2 o 4 dosis de la enzima recibieron infusiones de fármaco cada 3 días mientras que aquellos que fueron tratados con 8 dosis recibieron la enzima cada 2 días. Se designó el uso de un intervalo de tiempo más corto entre infusiones en animales que recibieron 8 tratamientos para minimizar el potencial impacto de cualquier respuesta inmune a la enzima humana administrada. Se mataron los animales 7 días después de la última infusión enzimática y se midió la cantidad de GL 1 remanente en sus hígados, bazos, y pulmones.

El tratamiento con 2 dosis de glucocerebrosidasa redujo los niveles de GL1 en el hígado en un 50%. Incrementar el número de infusiones enzimáticas a 4 o 8, según lo esperado, redujo los niveles de GL1 en hígado en una mayor medida (en aproximadamente 75%). Menos de la reducción completa de los niveles de GL 1 , aún con 8 dosis, es consistente con la experiencia en los sujetos con Gaucher que muestra que la hepatoesplenomegalia se reduce solamente después de un período extendido de tratamiento (véase G.A. Grabowski, et al., Ann. Int. Med. 122 (1995) 33-39, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia). Los niveles de sustrato en el bazo de ratones con Gaucher eran más refractarios al tratamiento enzimático. La administración de 2 dosis de glucocerebrosidasa no alteró significativamente los niveles de GL 1 de aquellos observados en los controles no tratados. El incremento del número de infusiones enzimáticas a 4 o 8 redujo los niveles de GL1 esplénicos en aproximadamente 50%. En el pulmón, se observó una reducción hasta aproximadamente 60% de control no tratado después de 8 dosis. La medida levemente inferior de reducción de sustrato en el pulmón probablemente se debió a la accesibilidad más pobre de la enzima infundida a los macrofagos alveolares de cargados de lípidos. La observación de mayor depuración de GL 1 en el hígado en comparación con el bazo y pulmón posiblemente refleja la biodistribución de la enzima después de la infusión sistémica (véase S.M. Van Patten, et al. Glycobiology 17 (2007) 467-478, cuyas enseñanzas completas se incorporan por referencia). En base a estos resultados, se utilizó el régimen de tratamiento que consistía en 8 dosis consecutivas de 10 mg/kg de glucocerebrosidasa administradas en intervalos de 2 días para los estudios posteriores.

Capacidades relativas de la terapia de reducción de sustrato y enzima para reducir los niveles de GL1 en el hígado de ratones con Gaucher. Los grupos de ratones de 3 meses de edad con Gaucher fueron tratados con glucocerebrosidasa recombinante o Hemitartrato de Fórmula (I) en forma separada o en forma secuencial. A los ratones en los grupos B, C y D se les administró 8 dosis de enzima según lo descrito más arriba (en un período de 2 semanas) para depurar el GL 1 acumulado. A los diferentes grupos después se les suministró alimento regular o alimento que contenía Hemitartrato de Fórmula (I) (150 mg/kg/día) durante 10 semanas adicionales, no recibiendo el grupo F ningún tratamiento sirviendo como control sin afectación. Sin tener en cuenta la Formulación de alimento, los ratones comieron cantidades comparables de alimento y no hubo ninguna diferencia discernible en la ganancia de peso. Aproximadamente el 80% de los niveles de GL1 almacenados se depuraron del hígado después de 2 semanas de la terapia enzimática como único reactivo. Cuando se permitió que estos animales avancen sin tratamiento adicional durante 10 semanas, los niveles de GL 1 en su hígado aumentaron indicando que la re-acumulación del sustrato se había producido durante el período interviniente (Figura 2, columna C). Estos niveles no fueron significativamente diferentes de aquellos de los controles no tratados (Figura 2, columna F). Sin embargo, si los ratones fueron tratados con enzima y después Hemitartrato de Fórmula (I) en su alimento durante un período de 10 semanas, los niveles de GL 1 en su hígado fueron significativamente más bajos que los controles no tratados (Figura 2, columna D & F). Este resultado sugiere que el tratamiento adicional con Hemitartrato de Fórmula (I) bahía reducido la velocidad de la re-acumulación del sustrato. De manera interesante, los ratones con Gaucher tratados con Hemitartrato de Fórmula (I) como único reactivo durante el período completo del estudio (12 semanas) también mostraron niveles de GL-1 inferiores (Figura 2, columna E) en comparación con los controles de la misma edad, no tratados (Figura 2, columna F) aunque la diferencia no fue significativa. La capacidad de SRT como único reactivo para reducir los niveles de GL 1 en este modelo animal es consistente con nuestro informe previo (véase K.A. McEachern, et al., Mol. Genet. Metab. 91 (2007) 259-267, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia) y posiblemente refleja el hecho de que los ratones con Gaucher (D409V/mutante) retienen actividad enzimática residual (véase Y-H. Xu, et al., Am. J. Pathol. 163, 2003, 2093-2101 , cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia).

Capacidades relativas de la terapia de reducción de sustrato y enzima para reducir los niveles de GL1 en el bazo de ratones con Gaucher. El tratamiento de ratones de 3 meses de edad con Gaucher con glucocerebrosidasa recombinante como único reactivo durante 2 semanas redujo los niveles esplénicos de GL1 en aproximadamente 60% (Figura 3, columna B). Cuando se permitió que estos animales envejezcan durante 10 semanas adicionales sin intervención adicional, los niveles de sustrato retornaron a aquellos observados al comienzo del estudio (Figura 3, columna C) y no fueron significativamente diferentes del control no tratado (Figura 3, columna F). Esto sugiere que el índice de re-acumulación de GL1 en el bazo fue mayor que en el hígado. Esta suposición también estuvo respaldada pro la observación de mayores niveles básales del sustrato en el bazo (1500 mg/g de tejido; Figura 2, columna A) que en el hígado (-500 mg/g de tejido; Figura 3, columna A). Los animales que habían sido tratados con enzima y después Hemitartrato de Fórmula (I) durante las siguientes 10 semanas mostraron la mayor reducción en los niveles esplénicos de GL1 (Figura 3, columna D) y estos fueron significativamente inferiores que aquellos en los bazos de control no tratados (Figura 3, columna F). Esto indicó que el despliegue de SRT no solamente retardó la re-acumulación de sustrato sino que también actuó para además reducir la carga de almacenamiento en este órgano. Parecería que al menos en este caso, el efecto neto de la reducción de sustrato y enzima endógena residual llevó a una reducción adicional en los niveles generales del sustrato. La observación de los niveles esplénicos de GL1 inferiores en los ratones tratados con Hemitartrato de Fórmula (I) como único reactivo durante 12 semanas (Figura 3, columna E) que en los controles no tratados (Figura 3, columna F) es consistente con esta noción, aunque la diferencia no fue significativa. En consecuencia, en los pacientes con Gaucher del tipo 1 suave con alta actividad enzimática residual, el tratamiento con ERT seguido por SRT podría acelerar potencialmente el índice y tal vez aún el grado de depuración del sustrato ofensivo.

Capacidades relativas de la terapia de reducción de sustrato y enzima para reducir los niveles de GL1 en el pulmón de ratones con Gaucher. Según lo observado antes, los niveles pulmonares de GL1 fueron menos efectivamente depurados por la administración intravenosa de glucocerebrosidasa recombinante. El tratamiento de ratones de 3 meses de edad con Gaucher con enzima durante 2 semanas dio como resultado solamente una reducción del 30% en los niveles de sustrato en el pulmón (Figura 4, columna B). El grupo de animales alimentados con alimento normal durante las siguientes 10 semanas mostró, según lo esperado, la re-acumulación de GL 1 y no fue significativamente diferentes de los niveles no tratados (Figura 4, columna C & F). En oposición, los animales alimentados con alimento que contenía Hemitartrato de Fórmula (I) durante el mismo período interviniente mostraron una reducción en los niveles de sustrato hasta debajo de aquellos a los que se les administró enzima como único reactivo (Figura 4, columna D) y fueron significativamente inferiores que aquellos en los controles no tratados (Figura 4, columna F). Nuevamente, esto sugiere que en el pulmón, como en el bazo, el efecto neto de Hemitartrato de Fórmula (I) (en presencia de actividad enzimática endógena residual) no sólo retardó la re-acumulación de GL 1 sino que también actuó para reducir además los mismos hasta debajo de los niveles iniciales. Como con los otros órganos viscerales, el tratamiento mediante Hemitartrato de Fórmula (I) como único reactivo fue efectivo en la reducción de los niveles pulmonares de GL1 (Figura 4, columna E) en comparación con los controles no tratados (Figura 4, columna F).

Análisis histopatológico del hígado de los ratones con Gaucher después del tratamiento de reducción de sustrato y enzima. Para visualizar los efectos de los diferentes regímenes terapéuticos en el hígado, las secciones de tejido se tiñeron para CD68, un marcador demacrófagos. El análisis de las secciones de hígado de los ratones con Gaucher de 3 meses no tratados mostró la presencia de grandes números de células de Gaucher CD68-positivas congestionadas con lípidos que permanecían en gran parte sin cambios cuando se analizaron 12 semanas más tarde. Consistente con los datos bioquímicos anteriores, los hígados de los animales a los que se les administró glucocerebrosidasa recombinante durante un período de 2 semanas mostró depuración sustancial del lípido en estos macrófagos anormales. Si se les permitía a estos animales envejecer 10 semanas adicionales sin tratamiento adicional, habría evidencia de la re-acumulación de GL 1 según lo indicado por la re-emergencia de las células de Gaucher. Sin embargo, este incremento en las células de Gaucher fue negado si a los ratones se les administró terapia de reducción de sustrato con Hemitartrato de Fórmula (I) durante el mismo período interviniente. Según lo observado antes, los ratones con Gaucher que recibieron Hemitartrato de Fórmula (I) como único reactivo también mostraron acumulación reducida del sustrato, aunque no al mismo grado que aquellos que recibieron una combinación de ERT y SRT. El grado de tinción CD68-positiva en las diversas secciones también se cuantificó utilizando MetaMorph software (Figura 18). El grado de tinción en estas secciones representó las cantidades de los niveles de GL 1 en hígado determinados bioquímicamente (Figura 15) respaldando además la sugerencias de los méritos relativos de los diferentes regímenes de tratamiento.

EJEMPLO 8 Eficacia de Hemitartrato de Fórmula (I) en un modelo de ratón de enfermedad de Gaucher Estudios en animales. Los procedimientos que incluyen animales fueron revisados y aprobados por un Comité Institucional para el Uso y Cuidado de los Animales (IACUC) siguiendo los lineamientos federales y estatales de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Anímales de Laboratorio (AAALAC). Se permitió que los ratones gDaD4o9V nu'° con Gaucher (Véase Y.-H. Xu. et al., Am. J. Pathol. 163 (2003) 2093-2101 , cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia) maduraran conforme a los requerimientos del estudio. No se ha encontrado ninguna diferencia en el fenotipo o respuesta al Hemitartrato de Fórmula (I) entre machos y hembras, así que se utilizaron ambos sexos en los estudios. El suministro de Hemitartrato de Fórmula (I) fue mediante una cebadura oral diaria única en un volumen de 10 ml/kg. Los anímales se aclimataron a la cebadura oral con un volumen similar de agua durante una semana previo a la iniciación del tratamiento. Se disolvió Hemitartrato de Fórmula (I) en Agua para inyección (WFI; VWR, West Chester, PA) y se administró en una escala de dosis de 75 mg/kg/día a 150 mg/kg/día durante el transcurso de nueve días, con tres días en cada dosis e incrementos de 25 mg/kg/día. Los ratones se pesaron tres veces por semana para monitorear el potencial impacto del fármaco en la salud general. Se mataron los animales por inhalación de dióxido de carbono y sus tejidos se cosecharon inmediatamente. La mitad de cada tejido se crioprotegió en hielo seco y se almacenó a -80 °C hasta que estuviera lista para procesamiento adicional. La otra mitad se recolectó para análisis histológico.

Cuantificación de los niveles de glucosilceramida en tejido mediante cromatografía de capa delgada de alto desempeño. El análisis de la cromatografía de capa delgada de alto desempeño (HP-TLC) fue según lo descrito (A. Abe, et al., J. Clin. Inv. 105 (2000) 1563-1571 ; H. Zhao, et al. Diabetes 56 (2007) 1341-1349; y S.P.F. Miller, et al. J. Lab. Clin. Med. 127 (1996) 353-358, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia). En resumen, se obtuvo una fracción de lípidos total homogeneizando el tejido en PBS frío, extrayendo con cloroformo:metanol 2:1 (v/v) y sometiendo a sonicación en un sonicador de baño de agua. Se centrifugaron las muestras para separar las fases y se recuperó el sobrenadante. Los pélets se sometieron a sonicación nuevamente en cloroformo:metanol:solución salina, se centrifugaron y el segundo sobrenadante resultante se recolectó y se combinó con el primero. Se agregó una mezcla 1 :1 (v/v) de cloroformo:solución salina a los sobrenadantes combinados, se agitaron con vórtex, y se centrifugaron. Después de descartar la capa acuosa superior, se añadió metanol:solución salina, se agitó con vórtex y se centrifugó nuevamente. La fase orgánica se tomó y se secó bajo nitrógeno, se disolvió en cloroformo:metanol 2:1 (v/v) a 1 mi por 0.1 g de peso de tejido original y se almacenó a -20 °C.

Una porción del extracto de lípidos se utilizó para medir el fosfato total, (Véase B.N. Ames, Methods Enzymol. 8 (1966) 1 15-118, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente por referencia), es decir, el contenido de fosfolípidos para utilizar como un patrón interno. El remanente pasó por metanolisis alcalina para eliminar so fosfolípidos que migran con la glucosilceramida en la placa de HP-TLC. Alícuotas de los extractos que contenían cantidades equivalentes del fosfato total se colocaron sobre una placa de HP-TLC junto con patrones conocidos de glucosilceramida (Matreya inc. Pleasant Gap, PA). Los lípidos se descompusieron y se visualizaron con acetato cúprico monohidratado al 3% (p/v). Ácido fosfórico al 15% (v/v) seguido por calcinación durante 10 minutos a 150 °C. Las bandas de lípidos fueron barridas en un densitómetro (GS-700, Bio-Rad, Hercules, CA) y fueron analizadas por Quantity One software (Bio-Rad).

Cuantificación de los niveles de glucosilceramida en tejido mediante espectrometría en masa. Se cuantificó la glucosilceramida mediante espectrometría en masa según lo descrito. (Véase K. McEachern, et al. J. Gene Med. 8 (2006) 719-729; T. Doering, et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 11038-11045, las enseñanzas competas de cada uno se incorporan en la presente por referencia). El tejido se homogeneizó en cloroformo:metanol 2:1 (v/v) y se incubó a 37 °C. Se centrifugaron las muestras y se extrajeron los sobrenadantes con 0.2 volúmenes de agua durante toda la noche. Se centrifugaron las muestras nuevamente, se descartó la fase acuosa, y la fase orgánica se secó hasta una película bajo nitrógeno.

Para el análisis de ionización por espectrometría en masa, ionización por electrospray (ESI/MS), las muestras de tejido se reconstituyeron al equivalente de 50 ng de peso de tejido original en 1 mi de cloroformo/metanol (2:1 , v/v) y se agitaron con vórtex durante 5 minutos. Se suministraron alícuotas de cada muestra (40 µ?_) a viales de recuperación total Waters y se añadieron 50 µ?_ patrón interno d3-C16-GL-1 10 Mg/ml (Matreya, Inc., Pleasant Gap, PA). Las muestras se secaron bajo nitrógeno y se reconstituyeron con 200 µ?_ de DMSO:metanol 1 :4. El análisis ESI/MS de glucosilceramidas de diferentes longitudes de cadena de carbono se llevó a cabo en una Alliance HPLC de Waters (Separation Modulo 2695) acoplado a un sistema Micromass Quattro Micro equipado con una fuente iónica por electrospray. Se inyectaron muestras de extractos liquidas de veinte microlitros en una columna C8 (4 mi x 3 mm i.d; Phenomenex, Torrance, CA) a 45 °C y se eluyeron con un gradiente de acetonitrilo al 50-100% (acetato de amonio 2 mM, ácido fórmico al 0.1 %) a 0.5 ml/min. Los primeros 0.5 minutos se mantuvieron en 50% orgánico y después rápidamente se cambiaron a 100% para los 3.5 minutos finales. La temperatura de la fuente se mantuvo constante a 150 °C y se utilizó nitrógeno como gas de evaporación de solvente en una velocidad de flujo de 670 Un. El voltaje capilar se mantuvo a 3.80 KV con un voltaje de cono de 23 V, mientras el tiempo de permanencia para cada especie iónica fue 100 ms. Se adquirieron los espectros por el modo MRM para monitorear las ocho isoformas dominantes (C16:0, C18:0, C20:0, C22:1 , C22:0, C22:1-OH, C24:1 , y C24:0). La cuantificación de glucosilceramida se basa en la suma de estas ocho isoformas al patrón interno, con un intervalo de curva de calibración de 0.1 a 10 pg/ml.

Histología. Para el análisis histológico, se fijaron los tejidos en formalina de zinc (Electron Microscopy Sciences, Hatfieid, PA) a temperatura ambiente durante 24 horas, después se almacenaron en PBS a 4°C hasta que estuvieran listos para procesamiento adicional. Se deshidrataron todas las muestras concentraciones crecientes de alcohol, se depuraron en xilenos, se infiltraron y se embebieron en parafina R Surgipath (Surgipath, Richmond, IL). Se cortaron secciones de cinco micrones utilizando un micrótomo rotatorio y se secaron en un horno a 60°C previo a la tinción. Las secciones se desparafinaron en xilenos y se rehidrataron en concentraciones decrecientes de alcohol seguido por un lavado con agua. Después del un enjuague de 1 minuto en ácido acético al 3%, las láminas se mancharon durante 40 minutos en Alcian Blue 8GX al 1 % (Electron Microscopy Sciences) en ácido acético al 3% pH 2.0. Después del enjuague en agua y oxidación del ácido periódico al 1% durante 1 minuto, las láminas se mancharon con reactivo de Schiff (Surgipath) durante 12 minutos. Después del lavado durante 5 minutos en agua caliente, las láminas se deshidrataron en alcohol y se depuraron en xilenos previo al montado con medio de montado en cubierta de vidrio SHUR/Mount™ (TBS, Durham, NC). Las células de Gaucher identificadas morfológicamente en el hígado se cuantificaron utilizando un recuento celular manual por 10 campos de polvo elevados (HPFs, 400x).

Resultados Efecto de la administración de Hemitartrato de Fórmula (I) a ratones D409V/mutantes. Se evaluó el efecto de la administración de Hemitartrato de Fórmula (I) a ratones D409V/mutantes. Aproximadamente a ratones de 7 meses de edad se les administraron 150 mg/kg/día de Hemitartrato de Fórmula (I) (una dosis que se mostró en los estudios preliminares que es efectiva en la inhibición de la glucosilceramida sintasa) mediante cebadura oral durante 10 semanas. Este tratamiento no tuvo ningún efecto notable en el bienestar o hábitos de alimentación de los ratones. Las mediciones de su peso corporal a lo largo de todo el estudio no mostraron ninguna desviación significativa de aquellas de los ratones no tratados sugiriendo que el Hemitartrato de Fórmula (I) fue bien tolerado en una dosis que se mostró que es efectiva en la inhibición de la sintasa.

Eficacia de Hemitartrato de Fórmula (I) en el tratamiento de ratones con pre-sintomáticos jóvenes. El Hemitartrato de Fórmula (I) se evaluó en cuanto a la disminución de la acumulación lisosomal de glucosilceramida y la aparición de células con Gaucher en ratones D409V/mutantes jóvenes (10 semanas). Estos ratones jóvenes con Gaucher exhiben bajo niveles de GL-1 en los tejidos afectados. A los animales de diez semanas de edad se les administraron 75 o 150 mg/kg/dia de Hemitartrato de Fórmula (I) mediante cebadura oral durante 10 semanas. La medición de los niveles de glucosilceramida mostró una reducción dosis dependiente en comparación con los controles tratados con vehículo de la misma edad. En el grupo que había sido tratado con 150 mg/kg/día, los niveles de glucosilceramida fueron 60, 40 y 75% de aquellos en los grupos, en el hígado, pulmón y bazo, respectivamente (FIG. 6). Los niveles estadísticamente significativamente inferiores de glucosilceramida observados en el hígado y pulmón de los ratones D409V/mutantes tratados indicaron que el Hemitartrato de Fórmula (I) fue efectivo en la reducción de la acumulación de este glicoesfingolípido en estos tejidos.

La evaluación histopatológica de los hígados de los ratones D409V/mutantes no tratados al final del estudio (20 semanas de edad) mostró la presencia de células de Gaucher en todo el hígado. Los ratones tratados con 150 mg/kg/día de Hemitartrato de Fórmula (I) durante 10 semanas mostraron solamente la presencia ocasional de células de Gaucher que también fueron en forma invariable más pequeñas en tamaño. La cuantificación de estas células en un número de secciones diferentes confirmó que la frecuencia de las células de Gaucher fueron significativamente inferiores en los ratones tratados con Hemitartrato de Fórmula (I). Juntos, estos descubrimientos bioquímicos e histológicos sugirieron que la administración oral diaria de Hemitartrato de Fórmula (I) a ratones con Gaucher pre-sintomáticos fue efectiva en la reducción de la acumulación de glucosilceramida en los tejidos afectados y la formación consecuente de células de Gaucher en el hígado.

Eficacia de Hemitartrato de Fórmula (I) en el tratamiento de ratones con Gaucher de mayor edad con patología pre-existente. También se evaluó la eficacia de Hemitartrato de Fórmula (I) en detener o revertir el avance de la enfermedad en ratones con Gaucher sintomáticos de mayor edad. A ratones D409V/mutantes de siete meses de edad se les administraron 150 mg/kg/día de Hemitartrato de Fórmula (I) mediante cebadura oral durante 10 semanas. Los análisis de los niveles de glucosilceramida en el hígado, pulmón y bazo de los ratones tratados a las 5 y 10 semanas posteriores al tratamiento mostraron que no habían aumentado más allá de aquellos observados al comienzo del estudio. Después de 10 semanas del tratamiento, se determinó que los niveles de glucosilceramida eran 60% más bajos en el hígado, 50% más bajos en el pulmón y 40% más bajos en el bazo que en os ratones tratados con vehículo. Estos resultados mostraron que el Hemitartrato de Fórmula (I) fue efectivo en la inhibición de la acumulación adicional de glucosilceramida en ratones con una carga existente de patología de almacenamiento.

El análisis histopatológico de las secciones de tejido mostró un número reducido de células de Gaucher en el hígado de los ratones D409V/mutantes tratados en comparación con los controles no tratados. La cuantificación del número de células de Gaucher corroboró los descubrimientos bioquímicos; los ratones D409V/mutantes tratados mostraron recuentos de células de Gaucher que no fueron significativamente diferentes a aquellos al comienzo del tratamiento en ambos puntos de tiempo de 5 y 10 semanas. Los números de las células de Gaucher en ambos puntos de tiempo fueron significativamente más bajos que aquellos de los ratones D409V/mutantes no tratados. Juntos, estos datos demostraron que el Hemitartrato de Fórmula (I) inhibió efectivamente la acumulación adicional de glucosilceramida y el desarrollo de células de Gaucher en animales con patología pre-existente.

Debate El Hemitartrato de Fórmula (I) demostró un alto grado de especificidad para la enzima glucosilceramida sintasa. También no hubo inhibición medible de la actividad de glucocerebrosidasa en la dosis efectiva, que es una característica importante al tratar los pacientes con enfermedad de Gaucher tipo 1 , la mayoría de los cuales retienen actividad de glucocerebrosidasa residual. En la dosis efectiva de 150 mg/kg/día, no hubo ningún tema gastro-intestinal observable y no hubo diferencia en los pesos corporales entre los grupos tratados y no tratados de control. Las concentraciones séricas en y arriba de IC5o (24-40 nM) fueron fácilmente alcanzables con dosis orales que estaban por debajo del nivel máximo tolerado. El Hemitartrato de Fórmula (I) también se metabolizó fácilmente y fue depurado: ambos metabolitos y compuesto progenitor se depuraron efectivamente dentro de las 24 horas según lo que se muestra en los estudios ADME de dosis oral repetida y única con el compuesto radioetiquetado por 14C en ratas y perros.

Utilizando un régimen de dosificación no optimizado de una cebadura oral diaria única previo exitosamente la acumulación de glucosilceramida tanto en ratones resintomáticos jóvenes como en ratones de mayor edad con Gaucher que ya exhibieron patología de almacenamiento. Los ratones de 10 semanas de edad, jóvenes, aunque albergaban elevados niveles de glucosilceramida respecto de los controles de tipo salvaje, aún no habían desarrollado los macrófagos de tejido congestionados característicos, denominados células de Gaucher. El tratamiento con 150 mg/kg/día de Hemitartrato de Fórmula (I) interrumpió todo el avance de la enfermedad medible e inhibió el desarrollo de las células de Gaucher. En los ratones de mayor edad que exhibían un mayor nivel de glucosilceramida lisosomal y número de células de Gaucher, no hubo incremento adicional en los niveles del glicoesfingolípido o en el número de células de almacenamiento después de 5 semanas o 10 semanas del tratamiento. Como se informa que la principal fuente de glucosilceramida en las células de Gaucher es extracelular en origen estos resultados sugirieron que la inhibición del Hemitartrato de Fórmula (I) de la glucosilceramida sintasa era sistemática.

La observación de que el Hemitartrato de Fórmula (I) fe efectivo en la prevención de la acumulación adicional de glucosilceramida sugiere una estrategia terapéutica que podría incluir además el tratamiento de la enfermedad de Gaucher.

En resumen, los datos presentados aquí demostraron que el Hemitartrato de Fórmula (I) es un inhibidor activo y específico de la glucosilceramida sintasa que no exhibe ningún efecto adverso manifiesto en un modelo de ratón de la enfermedad de Gaucher. Exitosamente previno el avance de la enfermedad en ambos ratones presintomáticos y de mayor edad con Gaucher inhibiendo la acumulación de glucosilceramida y formación de células de Gaucher. Estos descubrimientos sugieren que el Hemitartrato de Fórmula (I) puede representar aún otra opción terapéutica para la enfermedad de Gaucher tipo 1 en adultos y pediátrica y potencialmente otros trastornos de almacenamiento de glicoesfingolípidos.

EJEMPLO 9 Ensayo clínico de fase 2 de Hemitartrato de Fórmula (I) Métodos. Este ensayo clínico de Hemitartrato de Fórmula (I), administrado en forma oral en 50 o 100 mg, trató 26 adultos con enfermedad de Gaucher tipo 1 (GD1) (16F:10M¡ edad promedio de 34 años, intervalo 18-60; todos caucásicos) en 7 sitios en 5 países. Los paciente iban a tener esplenomegalia (volumen 10 normal) y trombocitopenia (placas 45,000-100,000/mm3) o anemia (hemoglobina 8-10 g/dl, mujer; 8-1 1 g/dl, hombre). Ninguno recibió el reemplazo de enzima o terapia de reducción de sustrato en los 12 meses previos. El criterio de valoración de eficacia primario compuesto es el nivel de globina (+0.5 g/dl) o recuento de plaquetas (+15 %) después de 52 semanas del tratamiento. También se evalúan el volumen del hígado, citotriosidasa, glucosilceramida. Los pacientes continúan siendo tratados y monitoreados a largo plazo.

Resultados. Los datos de la semana 52 estuvieron disponibles para hasta 20 pacientes; otros 4 se retiraron prematuramente y 2 estaban en curso. El criterio de valoración primario compuesto se alcanzó en 19 de los 20 pacientes. Los cambios medios (1 SD) de la evaluación basal a la Semana 52 fueron: hemoglobina +1.6 (11.35) g/dl; recuento de plaquetas +43.6% (137.59%); volumen de bazo y hígado (múltiplos de normal) 40.2% (110.44%) y 15.8% (110.39%), respectivamente; y citotriosidasa 49.9% (120.75 %). Los niveles de glucosilceramida en plasma se normalizaron después de 4 semanas en todos los pacientes, el Hemitartrato de Fórmula (I) se toleró bien con un perfil de seguridad aceptable. Se han informado siete eventos adversos relacionados en 6 pacientes como relacionados; todos fueron suaves y transitorios en naturaleza.

EJEMPLO 10 Composición farmacéutica de Hemitartrato de Fórmula (I), Cápsulas de 100 mq Método de Preparación de Cápsulas de 100 mg. El Hemitartrato de Fórmula (I), celulosa microcristalina, monohídrato de lactosa, y hipromelosa, E15 se pasaron en forma separada a través de una selección de malla 20. Las cantidades de ingredientes seleccionados indicadas en la Tabla 9 se mezclaron en un granulador de alto corte durante nueve a doce minutos.

TABLA 9 Formulación farmacéutica para cápsulas de 100 mq Los ingredientes después se granularon en proceso húmedo mediante la adición de agua purificada (2.2 kg; 11.7% del peso de los ingredientes secos) al recipiente del granulador hasta la terminación, según lo confirmado visualmente. La granulación húmeda se descargó del recipiente y se pasó a través de un molino de selección de impulsor rotatorio. La granulación húmeda después se secó en un horno seco de bandeja, de lecho sólido, estático, de calentamiento directo a 50±5°C para humedecer el contenido de no más que 3.5%, según lo confirmado por el control dentro del proceso. Los gránulos secos después se pasaron a través de un molino de selección y los gránulos seleccionados se transfirieron a una mezcladora en V. Se añadió gliceril behenato (0.2 kg) a la mezcladora en V, y la mezcla final se mezcló hasta que la mezcla era uniforme, según lo determinado por un ensayo de uniformidad de mezcla en línea o fuera de línea, típicamente durante diez a doce minutos. La mezcla final después se encapsuló en una cápsula tamaño #2 utilizando un llenador de cápsula semiautomático hasta el eso de relleno apropiado (270 mg promedio), y las cápsulas llenas se desempolvaron antes del envasado.

EJEMPLO 11A Composición farmacéutica de Hemitartrato de Fórmula (I), Cápsulas de 10 mq Método de Preparación de Cápsulas de 10 mg: Se siguió el procedimiento del Ejemplo 10 hasta el paso de encapsulación. Para producir una cápsula de 10 mg, la mezcla final se encapsuló en una cápsula tamaño #4 o #5 utilizando una máquina de llenado de cápsulas hasta el peso de llenado apropiado (27 mg promedio), y las cápsulas llenas se desempolvaron antes del envasado.

EJEMPLO 11 B Composición farmacéutica de Hemitartrato de Fórmula (I), Cápsulas de 50 mq Método de preparación de Cápsulas d 50 mg. Se siguió el procedimiento del Ejemplo 10 hasta el paso de encapsulación. Para producir una cápsula de 50 mg, la mezcla final se encapsuló en una cápsula tamaño #3 utilizando una máquina de llenado de cápsulas hasta el peso de llenado apropiado (135 mg promedio), y las cápsulas llenas se desempolvaron antes del envasado.

EJEMPLO 11C Composición farmacéutica de Hemitartrato de Fórmula (I), Cápsulas de 150 mg Método de preparación de Cápsulas de 150 mg. Se siguió el procedimiento del Ejemplo 10 hasta el paso de encapsulación. Para producir una cápsula de 150 mg, la mezcla final se encapsuló en una cápsula tamaño #0 utilizando una máquina de llenado de cápsulas hasta el peso de llenado apropiado (405 mg promedio), y las cápsulas llenas se desempolvaron antes del envasado.

EJEMPLO 12 Composición farmacéutica de Hemitartrato de Fórmula (I), Cápsulas de 25 mg Método de preparación de Cápsulas de 25 mg. Se siguió el procedimiento del Ejemplo 10 hasta el paso de encapsulación. Para producir una cápsula de 25 mg, la mezcla final se encapsuló en una cápsula tamaño #4 utilizando una máquina de llenado de cápsulas hasta el peso de llenado apropiado (67.5 mg promedio), y las cápsulas llenas se desempolvaron antes del envasado.

EJEMPLO 13 Interacciones fármaco Hemitartrato de Fórmula (I) - Inhibidores de CYP2D6 Se realizó un estudio para evaluar la fármacocinética, seguridad y tolerabilidad de las múltiples dosis orales de Hemitartrato de Fórmula (I) (100 mg BID) administradas con o sin paroxetina (30 mg una vez al día), un potente inhibidor de CYP2D6. Este fue un estudio de etiqueta abierta, secuencia fija en 36 sujetos saludables (17 hombres y 19 mujeres). Los objetivos secundarios fueron evaluar la PK de paroxetina en combinación con múltiples dosis de Hemitartrato de Fórmula (I) (100 mg BID) en sujetos saludables para además evaluar la PK de Hemitartrato de Fórmula (I) siguientes múltiples dosis en comparación con la administración de Hemitartrato de Fórmula (I) de dosis única.

Los parámetros de PK medios de la base libre de Hemitartrato de Fórmula (I) tal como existe en plasma fueron no lineales y mostraron una acumulación de 2 veces en AUC y Cmax con la administración repetida (100 mg BID) en comparación con la administración de dosis única. La administración concomitante de Hemitartrato de Fórmula (I) y paroxetina di como resultado un incremento de 7 veces en Cmax y un incremento de 9 veces en 9 AUC en comparación con la administración de Hemitartrato de Fórmula (I) de múltiples dosis como único reactivo. Estos resultados indican que la paroxetina puede inhibir el metabolismo del Hemitartrato de Fórmula (I) y aumenta las concentraciones plasmáticas en sangre del fármaco. Se esperarían efectos similares con otros inhibidores de CYP2D6 potentes (por ejemplo fluoxetina y quinidina) y el monitoreo cuidadoso de los niveles plasmáticos del fármaco y ajustes de dosis potenciales son necesarios cuando Hemitartrato de Fórmula (I) se co-administra con un fármaco que se sabe que es potente inhibidor de CYP2D6. Las concentraciones de paroxetina fueron aproximadamente 1.5 a 2 veces más altas que lo esperado lo que sugiere que el Hemitartrato de Fórmula (I) o uno de sus metabolitos puede ser un inhibidor suave de CYP2D6.

EJEMPLO 14 Interacciones de fármaco Hemitartrato de Fórmula (I) - Inhibidores de CYP3A4 e inhibidores de p-qlicoproteina (PGP) Se llevó a cabo un estudio para evaluar la fármacocinética, seguridad, y tolerabilidad de múltiples dosis de Hemitartrato de Fórmula (I) (100 mg dos veces al día) con o sin múltiples dosis de ketoconazol (400 mg una vez al día) en sujetos hombre y mujer saludables. Este fue un estudio de secuencia fija etiqueta abierta en 36 sujetos saludables (18 hombres y mujeres) que consistía en 3 períodos que incluyeron la administración de Hemitartrato de Fórmula (I) de única dosis de 100 mg, la administración de Hemitartrato de Fórmula (I) de múltiples dosis, y la administración concomitante de Hemitartrato de Fórmula (I) 100 mg (dos veces al día) con ketoconazol 400 mg (una vez al día). La administración repetida de Hemitartrato de Fórmula (I) y ketoconazol, un fuerte inhibidor del Citocromo p450 3A4 ("CYP 3A4") y p-glicoproteina, dio como resultado un incremento de 4 veces en la exposición de la base libre de Hemitartrato de Fórmula (I) como existe en plasma en un estado estable. De ese modo, los pacientes que ya reciben Hemitartrato de Fórmula (I) pueden requerir una reducción temporaria de dosis mientras estén en terapia concomitante con fuertes inhibidores de CYP 3A4 o p-glicoproteína.

EJEMPLO 15 Estudios de estabilidad para la Formulación de Hemitartrato de Fórmula ÍU Se prepararon las mezclas mezclando Hemitartrato de Fórmula (I) y excipientes (Monohidrato de lactosa apta para encapsulado, Avicel PH 301 (Celulosa microcristalina) y Methocel El 5 Prem LV (Hidroxipropilmetilcelulosa) en un vial de centelleo en aproximadamente una escala de dos gramos, se añadió 15.6% de agua a la mezcla y se mezcló para formar gránulos húmedos. Los gránulos húmedos se seleccionaron utilizando un tamiz #10 (abertura de 2000 micrones). Los gránulos seleccionados después se secaron en un horno a 50°C durante 2 horas. Los gránulos secos se seleccionaron utilizando un tamiz #18 (abertura de 1000 micrones). Se añadió lubricante, gliceril behenato, a la mezcla y se mezcló para formar la mezcla final. Las mezclas preparadas se muestran en la tabla más abajo: TABLA Se utilizó Methocel (HPMC) en un intervalo de 2 a 4% Se utilizó Compritol ATO 88 en el intervalo de 1 a 1.6% Las siete mezclas de Formulación, que poseen diferentes relaciones de API:lactosa:Avicel, detalladas más arriba se expusieron a una temperatura alta a 85°C durante 3 días (una condición de estudio de degradación forzada) para entender la velocidad de degradación y la estabilidad de cada Formulación. Esta condición acelerada se eligió en base a los resultados del estudio que los productos de grado de degradación del producto de fármaco de 50mg a los 24 meses fue similar aquellos obtenidos a 85°C durante 3 días.

El estudio de degradación forzada se realizó utilizando un método de HPLC de gradiente de fase inversa que utilizó una columna C18 (Waters T3, 3 m, 100 x 4.6 mm), fases móviles que consistían en agua y acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA), detección UV a 280 nm, temperatura de columna a 40°C, y velocidad de flujo a 2 ml/min. El gradiente comenzó en la detención a 5% B (acetonitrilo y TFA al 0.1%) durante 0.5 minutos, y trepando después hasta un componente orgánico a 4.83% B por minuto hasta 15 minutos.

Los degradantes totales de cada mezcla de Formulación se sumaron y se representaron contra la relación de API : Lactosa : Avicel y los resultados se muestran en la Figura 15. Los resultados del estudio sugieren que mientras se mantiene la relación de API y Lactosa constante, la reducción de la cantidad de avicel mejora la estabilidad de la Formulación. Cuando avicel se elimina, la Formulación posee una relación API:Lactosa:Avicel de 1 :2.1:0, esta es la Formulación más estable. Cuando se elimina la lactosa, la Formulación posee una relación API:Lactosa:Avicel de 1 :0:2.1 , y esta Formulación no es la más inestable en comparación con otras relaciones. La información combinada sugiere que la lactosa estabiliza la Formulación, mientras avicel desestabiliza la Formulación. Sin embargo, cuando ambos excipientes están presentes, interactúan uno con otro. La relación debe ajustarse para obtener una Formulación estable.

Para los ingredientes farmacéuticos activos como el Hemihidrato de Fórmula (I) que son solubles en agua, la celulosa microcristalina ayuda a formar gránulos durante la granulación húmeda ya que es insoluble en agua. Si la celulosa microcristalina no se utilizara, se produce un cambio abrupto de la etapa de gránulos a una forma de pasta. La forma de pasta fue difícil de manejar y las partículas resultantes después del secado no tienen la resistencia mecánica apropiada y distribución de tamaño de partículas. La composición farmacéutica que posee 37 % en peso de un Hemitartrato de Fórmula (I), 41.0 % en peso de un agente de relleno soluble en agua; 16.7 % en peso de un agente de relleno insoluble, 2 % en peso a aproximadamente 6 % en peso de un ligante; y aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 2 % en peso de un lubricante, todo en forma de sólidos secos posee e mejor perfil de estabilidad con respecto a la cantidad de degradantes formados.

Las enseñanzas de todas las patentes, solicitudes publicadas y referencias citadas se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

Si bien esto se mostró particularmente y se describió con referencia a las modalidades ejemplares de la misma, aquellos expertos en el arte entenderán que pueden realizarse diversos cambios en la forma y detalles de la misma sin apartarse del alcance de lo abarcado por las reivindicaciones anexadas.

Claims (93)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: en donde la sal es una sal amorfa.

2.- Una sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: en donde al menos el 70% en peso de la sal es cristalina.

3.- Una sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: en donde al menos 70% en peso de la sal está en una forma cristalina única .

4.- Una sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: en donde al menos el 99% en peso de la sal es cristalina.

5.- Una sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: en donde al menos 99% en peso de la sal está en una forma cristalina única.

6.- La sal de hemitartrato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada además porque la sal de hemitartrato se selecciona de D-hemitartrato, L-hemitartrato, ácido hemimesotartárico o D,L-hemitartrato racémico.

7. - La sal de hemitartrato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada además porque la sal de hemitartrato es L-hemitartrato.

8. - La sal de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 5, cracterizada además porque al menos 70 % en peso de la sal es la forma cristalina única Forma A.

9.- La sal de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 5, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de al menos un pico principal de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 20 de 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9°, y 21.7°.

10. - La sal de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 5, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de al menos dos picos principales de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 2T de 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9°, y 21.7°.

11. - La sal de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 5, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de al menos tres picos principales de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 2T de 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9°, y 21.7°.

12. - La sal de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 5, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de al menos cuatro picos principales de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 2T de 5.1 °, 6.6°, 10.7°, 1 1.0°, 15.9°, y 21.7°.

13. - La sal de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 5, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de picos principales de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 2T de 5.r, 6.60, 10.7°, 11.0°, 15.9°, y 21.7°.

14. - La sal de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 5, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de picos de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 2T de 5.1 °, 6.6o, 10.7°, 11.0°, 13.3°, 15.1 °, 15.9°, 16.5°, 17.6°, 18.6°, 18.7°, 19.0°, 20.2°, 21.7° y 23.5°.

15. - La sal de conformidad con las reivindicaciones 3 ó 5, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de el patrón de difracción de polvo de rayos x de la FIG. 1.

16.- Una composición farmacéutica que comprende la sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: y un vehículo o diluyente aceptable para uso farmacéutico.

17. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la sal es una sal amorfa.

18. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque al menos el 70% en peso de la sal es cristalina.

19. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque al menos el 70% en peso de la sal está en una forma cristalina única.

20 - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque al menos el 99% en peso de la sal es cristalina.

21.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque al menos el 99% en peso de la sal está en una forma cristalina única.

22.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la sal de hemitartrato se selecciona de D-hemitartrato, L-hemitartrato, ácido hemimesotartárico o D,L-hemitartrato racémico.

23. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la sal de hemitartrato es L-hemitartrato.

24. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19 ó 21 , caracterizada además porque al menos el 70 % en peso de la sal es la forma cristalina única Forma A.

25. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19 ó 21, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de al menos un pico principal de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 2T de 5.1o, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9°, y 21.7°.

26. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19 ó 21, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de al menos dos picos principales de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 2T de 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9°, y 21.7°.

27.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19 ó 21, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de al menos tres picos principales de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 2T de 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9°, y 21.7°.

28. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19 ó 21, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de al menos cuatro picos principales de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 2T de 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9°, y 21.7°.

29. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19 ó 21 , caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de picos principales de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 29 de 5.1 °, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 15.9°, y 21.7°.

30. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19 ó 21 , caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica de picos de difracción de polvo de rayos x en los ángulos 2T de 5.1°, 6.6°, 10.7°, 11.0°, 13.3°, 15.1°, 15.9°, 16.5°, 17.6°, 18.6°, 18.7°, 19.0°, 20.2°, 21.7° y 23.5°.

31. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19 ó 21, caracterizada además porque la forma cristalina única tiene la característica del patrón de difracción de polvo de rayos x de la FIG. 1.

32. - El uso de la sal de hemitartrato de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para preparar un medicamento para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher.

33.- El uso de la sal de hemitartrato de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para preparar un medicamento para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry.

34 El uso de la sal de hemitartrato de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para preparar un medicamento para inhibir la glucosilceramida sintasa o reducir las concentraciones de glicoesfingolípidos en un sujeto que lo necesita.

35.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 32, 33 ó 34, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en una dosis dos veces por día de 25 miligramos a 200 miligramos.

36.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 32, 33 ó 34, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en una dosis dos veces por día de 50 miligramos.

37.- El uso de un primer compuesto representado por la o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo en combinación con un segundo agente terapéutico que es efectivo para tratar la enfermedad de Gaucher, para preparar un medicamento para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher.

38. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en donde el segundo agente terapéutico es imiglucerasa.

39. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en donde el segundo agente terapéutico es isofagomina.

40.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en donde el segundo agente terapéutico es miglustat.

41.- El uso de un primer agente terapéutico representado por la siguiente fórmula estructural: o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo en combinación con un segundo agente terapéutico que es efectivo para tratar la enfermedad de Fabry, para preparar un medicamento para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry

42. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 41 , en donde el segundo agente terapéutico es migalastat.

43. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 41 , en donde el segundo agente terapéutico es agalsidasa ß.

44. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 37-43, en donde el primer agente terapéutico se administra como el hemitartrato de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

45. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 37-43, en donde el tratamiento con el primer agente terapéutico se comienza después del tratamiento durante un período de al menos diez semanas con el segundo agente terapéutico.

46.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 37-43, en donde el tratamiento con el primer agente terapéutico se comienza después del tratamiento con el segundo agente terapéutico y en donde el tratamiento con el primer agente terapéutico se inicia después de que el recuento de plaquetas del sujeto es igual a o mayor que 100,000 mm3 ; la concentración de hemoglobina es igual a o mayor que 11 g/dl (mujer) o 12 g/dl (hombre); y/o el volumen del bazo del sujeto es menor que o igual a 10 múltiplos del normal y los volúmenes de hígado son menores que o iguales a 1.5 múltiplos del normal.

47. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 45 ó 46, en donde el tratamiento con el segundo agente terapéutico se finaliza después de la iniciación del tratamiento con el primer agente terapéutico.

48. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 37-47, en donde el primer agente terapéutico está adaptado para ser administrable en una dosis dos veces por día de 25 miligramos a 200 miligramos.

49. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 37-47, en donde el primer agente terapéutico está adaptado para ser administrable en una dosis dos veces por día de 50 miligramos.

50. - Una composición farmacéutica que comprende: la sal de hemitartrato de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: al menos un agente de relleno soluble en agua; al menos un agente de relleno insoluble en agua; al menos un ligante; y al menos un lubricante.

51. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada además porque la sal de hemitartrato es la sal de hemitartrato de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

52. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada además porque el agente de relleno soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en lactosa anhidra, monohidrato de lactosa, manitol, cloruro de sodio, azúcar en polvo, sorbitol, sacarosa, inositol y almidón pregelatinizado.

53. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada además porque el agente de relleno insoluble en agua se selecciona del grupo que consiste en celulosa microcristalina, fosfato de calcio y almidón.

54.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada además porque el ligante se selecciona del grupo que consiste en almidón pre-gelatinizado, carboximetil celulosa sódica, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, polivinil pirrolidona, copolividona, gelatina, gomas naturales, pasta de almidón, sacarosa, jarabe de maíz, polietilenglicoles y alignato de sodio.

55.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada además porque el lubricante se selecciona del grupo que consiste en aceite vegetal hidrogenado, estearato de calcio, y gliceril behenato.

56. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada además porque el agente de relleno soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en lactosa anhidra, monohidrato de lactosa, manitol, cloruro de sodio, azúcar en polvo, sorbitol, sacarosa, inositol y almidón pregelatinizado; el agente de relleno insoluble en agua se selecciona del grupo que consiste en celulosa microcristalina, fosfato de calcio y almidón; el ligante se selecciona del grupo que consiste en almidón pre-gelatinizado, carboximetil celulosa sódica, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, polivinil pirrolidona, copolividona, gelatina, gomas naturales, pasta de almidón, sacarosa, jarabe de maíz, polietilenglicoles y alignato de sodio; y el lubricante se selecciona del grupo que consiste en aceite vegetal hidrogenado, estearato de calcio, y gliceril behenato.

57. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque la composición comprende 26 % en peso a 50 % en peso del agente de relleno soluble en agua en forma de sólidos secos.

58. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque la composición comprende 8 % en peso a 32 % en peso del agente de relleno insoluble en agua en forma de sólidos secos.

59. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque la composición comprende 8 % en peso a 24 % en peso del agente de relleno insoluble en agua en forma de sólidos secos.

60. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque la composición comprende 12 % en peso a 20 % en peso del agente de relleno insoluble en agua en forma de sólidos secos.

61. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque la composición comprende 14 % en peso a 18 % en peso del agente de relleno insoluble en agua en forma de sólidos secos.

62. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque la composición comprende 2 % en peso a 6 % en peso del ligante en forma de sólidos secos.

63. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque la composición comprende 0.1 % en peso a 2 % en peso de un lubricante en forma de sólidos secos.

64. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque la composición comprende 35 % en peso a 40 % en peso de la sal de hemitartrato, 26 % en peso a 50 % en peso del agente de relleno soluble en agua; 8 % en peso a 32 % en peso del agente de relleno insoluble en agua; 2 % en peso a 6 % en peso del ligante; y 0.1 % en peso a 2 % en peso del lubricante, todo en forma de sólidos secos.

65. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque el agente de relleno soluble en agua es monohidrato de lactosa; el agente de relleno insoluble en agua es celulosa microcristalina; el ligante es hidroxipropil metilcelulosa; y el lubricante es gliceril behenato.

66.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada además porque la composición comprende 35 % en peso a 40 % en peso de la sal de hemitartrato, 26 % en peso a 50 % en peso del monohidrato de lactosa; 8 % en peso a 32 % en peso de la celulosa microcristalina; 2 % en peso a 6 % en peso de la hidroxipropil metilcelulosa; y 0.1 % en peso a 2 % en peso del gliceril behenato, todo en forma de sólidos secos.

67.- Un método para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry, el método que comprende: a) administrar al sujeto una cantidad efectiva deun compuesto de Fórmula (I): o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo; b) examinar el sujeto para determinar si el sujeto es un metabolizador lento, intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450; c) si el sujeto es un metabolizador intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450, determinar una cantidad efectiva ajustada del compuesto; y d) administrar al sujeto una cantidad efectiva ajustada del compuesto de Fórmula (I) si el sujeto es un metabolizador intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450 y administrar al sujeto una cantidad efectiva del compuesto de Fórmula (I) si el sujeto es un metabolizador lento de P450.

68.- Un método para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher, el método que comprende: a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo; b) examinar el sujeto para determinar si el sujeto es un metabolizador lento, intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450; c) si el sujeto es un metabolizador intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450, determinar una cantidad efectiva ajustada del compuesto; y d) administrar al sujeto una cantidad efectiva ajustada del compuesto de Fórmula (I) si el sujeto es un metabolizador intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450 y administrar al sujeto una cantidad efectiva del compuesto de Fórmula (I) si el sujeto es un metabolizador lento de P450.

69. - El método de conformidad con la reivindicación 67 ó 68, caracterizado además porque el compuesto es la sal de hemitartrato de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

70. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-69, caracterizado además porque ensayar comprende monitorear los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto durante un período de al menos una semana.

71. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-69, caracterizado además porque ensayar comprende monitorear a través de los niveles plasmáticos del compuesto en el sujeto durante un período de al menos diez semanas.

72. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-71 , caracterizado además porque el sujeto es un metabolizador intermedio o extensivo/ultra-rápido de la enzima P450 si los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto están por debajo de 5 ng/ml y se selecciona la cantidad efectiva ajustada del compuesto para dar como resultado niveles mínimos del compuesto en el sujeto de al menos 5 ng/mg.

73. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-71 , caracterizado además porque el sujeto es un metabolizador lento de la enzima P450 si los niveles plasmáticos mínimos del compuesto son al menos 5 ng/ml después de administrarle una cantidad efectiva del compuesto.

74. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67 ó 68, en donde ensayar en el paso b) se produce antes o después de que comience el tratamiento.

75. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-74, caracterizado además porque la enzima P450 es enzima CYP2D6 y/o enzima CYP3A4.

76. - El método de cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 67-75, caracterizado además porque el sujeto es un metabolizador lento de P450 como resultado de administrarle un inhibidor de enzima CYP2D6 o enzima CYP3A4.

77. - El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado además porque el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en paroxetina, fluoxetina, quinidina, y ketoconazol.

78. - El método de conformidad con la reivindicación 67 ó 69, caracterizado además porque el ensayo en el paso b) es por genotipificación para la enzima P450.

79. - El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado además porque la enzima P450 es CYP2D6.

80. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-79, caracterizado además porque a cantidad efectiva del compuesto es una dosis dos veces por día de 25 miligramos a 200 miligramos.

81. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-79, caracterizado además porque la cantidad efectiva del compuesto es una dosis dos veces por día de 50 miligramos.

82. - Un método para tratar un sujeto con enfermedad de Fabry que comprende los pasos de: a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo; b) evaluar los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto; c) ajustar la cantidad de compuesto administrado al sujeto de manera que los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto sean al menos 5 ng/ml.

83.- Un método para tratar un sujeto con enfermedad de Gaucher que comprende los pasos de: a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de un compuesto representado por la siguiente fórmula estructural: o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo; b) evaluar los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto; c) ajustar la cantidad de compuesto administrado al sujeto de manera que los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto sean al menos 5 ng/ml.

84.- El método de conformidad con la reivindicación 82 u 83, caracterizado además porque el sujeto se ensaya antes de que comience el tratamiento con el compuesto para evaluar si el sujeto es un metabolizador lento, intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450, y en donde la cantidad efectiva se determina en base a si el sujeto es un metabolizador lento, intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450.

85. - El método de conformidad con la reivindicación 82, 83 u 84, caracterizado además porque el compuesto es la sal de hemitartrato de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

86. - El método de conformidad con la reivindicación 82 u 83, caracterizado además porque en el paso b) también se evalúa la Cmax del compuesto en el sujeto y en donde en el paso c) la cantidad de compuesto administrado al sujeto se ajusta de manera que los niveles plasmáticos mínimos del compuesto en el sujeto sean al menos 5 ng/ml y la Cmax del compuesto en el sujeto esté por debajo de 100 ng/ml.

87. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82-86, caracterizado además porque la enzima P450 es enzima CYP2D6 y/o enzima CYP3A4.

88. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82-86, caracterizado además porque el sujeto es un metabolizador lento de enzima P450 como resultado de la co-administración de un inhibidor de la enzima P450.

89.- El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado además porque el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en paroxetina, fluoxetina, quinidina, y ketoconazol.

90.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82-86, caracterizado además porque la expresión de la enzima P450 en el sujeto se evalúa para determinar si el sujeto es un metabolizador lento, intermedio o extensivo/ultra-rápido de P450.

91. - El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado además porque la enzima P450 es CYP2D6 o CYP3A4.

92. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82-90, caracterizado además porque la cantidad efectiva del compuesto es una dosis dos veces por día de 25 miligramos a 200 miligramos.

93.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82-90, caracterizado además porque la cantidad efectiva del compuesto es una dosis dos veces por día de 50 miligramos.