MX2007009091A

MX2007009091A - Formulaciones de polipeptido liquidas estabilizadas.

Info

Publication number: MX2007009091A
Application number: MX2007009091A
Authority: MX
Inventors: Nicholas W Warne; Angela Kantor; Donna Luisi
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2005-01-28
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2008-01-11
Also published as: IL184341A0; CR9294A; SV2008002394A; CA2595380A1; UY29350A1; JP2008528638A; RU2007124933A; CN101111264A; GT200600033A; BRPI0606867A2; NO20073666L; TW200638943A; KR20070107079A; AU2006207901A1; EP1841456A2; ZA200706256B; US20060210557A1; PE20061201A1; WO2006081587A3; AR052469A1

Abstract

La presente invencion suministra formulaciones para mantener la estabilidad de los polipeptidos, en particular, los polipeptidos de union de antigeno terapeuticos tales como anticuerpos y similares, por ejemplo, anticuerpos anti-??. Las formulaciones generalmente incluyen un antioxidante en una cantidad suficiente como para inhibir la formacion de subproducto, por ejemplo, la formacion de agregados de polipeptido de alto peso molecular, fragmentos de degradacion de polipeptido de bajo peso molecular, mezclas de estos. Las formulaciones de la invencion opcionalmente comprenden un agente de tonicidad, tal como manitol, y un agente amortiguante o aminoacido tal como histidina, y asi, las formulaciones son adecuadas para varias diferentes rutas de administracion.

Description

FORMULACIONES DE POLIPEPTIDO LIQUIDAS ESTABILIZADAS INFORMACIÓN RELACIONADA Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional US que lleva el número de Serie 60/648,639 (presentada en Enero 28, 2005), titulada "Stabilized Liquid Polypeptide Formulations". El contenido completo de la solicitud referenciada anteriormente se incorpora aquí como referencia.

El contenido de todas las otras patentes, solicitudes de patentes, y referencias citadas a través de esta especificación también se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Para maximizar el beneficio farmacológico de cualquier polipéptido, es esencial tener formas de dosis terminadas que sean estables, elaboradas en forma fácil y reproducible, y diseñadas para rutas estándar de administración. Específicamente, es deseable tener formas estables, concentradas de proteína en masa, por ejemplo, polipéptidos terapéuticos los cuales, a su vez, son adecuados para la elaboración adicional en formas de dosis terminadas del polipéptido, que puedan ser entonces administradas por vía de una ruta de administración deseada.

Tanto en las formas de dosis de polipéptido en masa como terminada, la estabilidad del polipéptido se puede afectar por factores tales como la concentración iónica, el pH, la temperatura, los sitios repetidos de congelamiento/descongelamiento y las fuerzas de corte. El polipéptido activo se puede perder como resultado de inestabilidades físicas, que incluyen desnaturalización y agregación (tanto de la formación del agregado soluble como insoluble), así como también las inestabilidades químicas, que incluyen, por ejemplo, hidrólisis, desamidación, y oxidación, para nombrar sólo unas pocas. Para una revisión general de la estabilidad de los farmacéuticos de proteína, ver, por ejemplo, Manning, et al., Pharmaceutical Research 6:903-918 (1989). Además, es deseable mantener la estabilidad cuando los polipéptidos vehículo no están incluidos en la formulación.

Aunque se aprecia ampliamente que estas inestabilidades posibles del polipéptido pueden ocurrir, hasta que se halla estudiado un polipéptido es imposible predecir los problemas de estabilidad particulares que pueda tener una proteína particular. Cualquiera de estas inestabilidades puede resultar potencialmente en la formación de un subproducto de polipéptido o derivado que tenga una actividad disminuida, una toxicidad creciente, y/o una inmunogenicidad creciente. De hecho, la precipitación del polipéptido puede conducir a trombosis, no homogeneidad de la forma de dosis y reacciones inmunes. Así, la seguridad y la eficacia de cualquier formulación farmacéutica de un polipéptido están directamente relacionadas con su estabilidad.

De acuerdo con esto, subsiste la necesidad en la técnica métodos para mejorar la estabilidad de la proteína durante el proceso de concentración así como también suministrar estabilidad en ausencia de otras proteínas portadoras en una concentración suficientemente alta para varias rutas de administración.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La presente invención suministra formulaciones diseñadas para suministrar estabilidad y mantener la actividad biológica de una proteína biológicamente activa incorporada, en particular un polipéptido unido a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de éste. La invención suministra además formulaciones de polipéptido, es decir, formulaciones de polipéptido líquido estabilizadas que sean resistentes a la formación de subproductos de polipéptidos indeseables.

La integridad de los polipéptidos unidos a antígeno para uso terapéutico es especialmente importante porque si el polipéptido forma subproductos, por ejemplo, agregados o fragmentos de degradación durante el almacenamiento, por lo cual se puede perder la bioactividad, comprometiendo la actividad terapéutica de la molécula por dosis unitaria. Además, existe la fuerte necesidad de estabilizar polipéptidos terapéuticos destinados a funciones especializadas para suministro y uso de ciertas indicaciones biológicas, por ejemplo, tratamiento de condiciones neurodegenerativas, donde un polipéptido debe atravesar la barrera hematoencefálica (BBB) y unirse a un antígeno blanco.

Anticuerpo de ejemplo que deben ser estabilizados para tal uso incluyen aquellos anticuerpos adecuados para unir blancos de enfermedad, en particular, blancos de enfermedad antigénica, por ejemplo, antígenos de cáncer, antígenos autoinmunes, alérgenos, y patógenos.

De cuerdo con esto, la invención tiene varias ventajas que incluyen, pero no están limitadas a, las siguientes: -formulaciones de polipéptido líquido estabilizadas que se estabilizan contra la formación de subproductos de polipéptido mediante la adición de un antioxidante; -formulaciones de polipéptido líquidas estabilizadas adecuadas para uso en una variedad de rutas de administración; -métodos para preparar polipéptidos terapéuticos para el uso farmacéutico como formulaciones de polipéptido líquidas estabilizadas; y -formulaciones de polipéptido de unión Aß estabilizadas adecuadas para uso en el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa.

De acuerdo, con un aspecto, la invención suministra una formulación de polipéptido líquida estabilizada designada para suministrar estabilidad y mantener la actividad biológica del polipéptido incorporado. En aún otro aspecto, la presente invención suministra una formulación que contiene un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo, y un antioxidante, por ejemplo, metionina o un análogo de estos, en donde el antioxidante está en una cantidad suficiente para reducir la formulación de subproducto del polipéptido durante el almacenamiento de la formulación.

En una modalidad, el componente de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo de la formulación es un anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgG^ lgG2, lgG2, lgG3, lgG4), (por ejemplo, el anticuerpo de isotipo IgM, IgG,, lgG2, lgG2, lgG3, lgG4 humano) un fragmento de anticuerpo Fv, un fragmento de anticuerpo Fab, un fragmento anticuerpo Fab'(2), un fragmento de anticuerpo Fd, un anticuerpo de cadena simple (scFv), un fragmento de anticuerpo de dominio simple (Dab), un polipéptido de lámina plegada beta que comprende al menos una región determinante de complementariedad de anticuerpo (CDR), o un polipéptido no globular que comprende al menos una región determinante de complementariedad de anticuerpo (CDR).

En una modalidad particular, las formulaciones de polipéptido líquido se estabilizan contra la formación de subproductos indeseables tales como agregados de polipéptido de alto peso molecular, productos de degradación de polipéptido de bajo peso molecular, o mezclas de estos.

En una modalidad relacionada, en donde el polipéptido de unión de antígeno terapéutico es un anticuerpo, los agregados de alto peso molecular típicos son, por ejemplo, complejos anticuerpo: anticuerpo, complejos anticuerpo: fragmento de anticuerpo, complejos fragmento de anticuerpo: fragmento de anticuerpo, o mezclas de estos. En general, los complejos de alto peso molecular o los subproductos tienen un peso molecular mayor de un monómero del polipéptido de unión de antígeno, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo IgG, mayor de aproximadamente 150 kD.

En una modalidad relacionada, cuyo el polipéptido terapéutico es un anticuerpo, los productos de degradación del polipéptido de peso molecular bajo típicos son, por ejemplo, complejos que consisten de una cadena ligera de anticuerpo, una cadena pesada de anticuerpo, una cadena ligera de anticuerpo y un complejo de cadena pesado, o mezclas de estos. En general, los complejos de bajo peso molecular o los subproductos tienen un peso molecular menor del de un monómero del polipéptido de unión de antígeno, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo IgG, menos de aproximadamente 150 kD.

En un aspecto, la invención suministra una formulación estabilizada de un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo un anticuerpo o un fragmento de unión de antígeno de éste), metionina, donde la metionina está presente como un antioxidante en una cantidad suficiente para disminuir la formación de subproductos indeseables, un agente de tonicidad (por ejemplo, manitol), donde el agente de tonicidad está presente en una cantidad suficiente para hacer la formulación adecuada para administración, por ejemplo, infusión intravenosa, y un aminoácido (por ejemplo, histidina) o derivado de éste, donde el aminoácido o derivado de éste está presente en una cantidad suficiente para mantener un pH fisiológicamente adecuado.

En un aspecto, la invención suministra una formulación estabilizada de un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión de anticuerpo) de éste, metionina, donde la metionina está presente como un antioxidante en una cantidad suficiente para inhibir la formación de subproductos indeseables, un agente de tonicidad, (por ejemplo, manitol) donde el agente de tonicidad está presente en un cantidad suficiente para hace la formulación adecuada para infusión intravenosa, y un aminoácido (por ejemplo histidina) o derivado de éste, donde el aminoácido o derivado de éste está presente en una cantidad suficiente para mantener el pH fisiológicamente adecuado.

En otro aspecto, la presente invención suministra una formulación que incluye un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión de antígeno de éste), manitol e histidina. En otro aspecto, la invención suministra una formulación estabilizada que incluye u polipéptido de un unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno de éste), metionina, manitol e histidina.

En ciertas modalidades, el polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo es un anticuerpo (o porción o fragmento de este) que se une a un antígeno seleccionado de una clase de antígeno que incluye, por ejemplo, antígenos cancerosos, antígenos autoinmunes, alérgenos, y patógenos.

En ciertas modalidades, el polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo es un polipéptido de unión Aß, por ejemplo, un anticuerpo Aß (o porción o fragmento de éste). En algunas formulaciones, al menos un polipéptido de unión Aß es un anticuerpo anti Aß , por ejemplo, que se una específicamente al epítopo dentro de los residuos 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 15-24, 16-24, 16-21 , 19-22, 33-40, 33-42 de Aß, o Fab, Fab'(2) o fragmento Fv de éste. Los anticuerpos anti Aß de ejemplo se unen específicamente a un epítopo dentro de los residuos 1-10 de Aß, tal como, por ejemplo, dentro de los residuos 1-7, 1-5, 3-7, o 3-6 de Aß. Otros anticuerpo anti Aß d ejemplo se unen específicamente a un epítopo dentro de los residuos 13-28 de Aß, tal como, por ejemplo, dentro de los residuos 16-21 o 19-22 de Aß. Aún otros anticuerpos anti Aß se unen específicamente a un epítopo terminal C de Aß tal como, por ejemplo, 33-40 o 33-42 de Aß. En una modalidad, el anticuerpo Aß es un anticuerpo humanizado, por ejemplo, anticuerpo 3D6 humanizado, un anticuerpo 10D5 humanizado, un anticuerpo 12B4 humanizado, un anticuerpo 15C1 1 humanizado, o un anticuerpo 12A11 humanizado.

El polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste) puede estar presente desde aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml (por ejemplo, a aproximadamente 20 mg/ml o 30 mg/ml). El isotipo del anticuerpo puede ser IgM, Igd, lgG2, lgG3, lgG o cualquier otro isotipo farmacéuticamente aceptable. En formulaciones preferidas, el isotipo es IgGi humano o lgG humano. En algunas formulaciones líquidas, la concentración del anticuerpo anti Aß es de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 60 mg/ml, a aproximadamente 40 mg/ml a aproximadamente 60 mg/ml, a aproximadamente 50 mg/ml, a aproximadamente 30 mg/ml, a aproximadamente 17 mg/ml a aproximadamente 23 mg/ml, a aproximadamente 20 mg/ml, a aproximadamente 17 mg/ml, a aproximadamente 10 mg/ml, a aproximadamente 5 mg/ml, a aproximadamente 2 mg/ml, o a aproximadamente 1 mg/ml, preferiblemente aproximadamente 17 mg/ml a aproximadamente 23 mg/ml.

En ciertas modalidades, el manitol está presente en una cantidad suficiente para mantener la isotonicidad de la formulación. El manitol puede estar presente desde aproximadamente 2% p/v a aproximadamente 6% p/v (por ejemplo, a aproximadamente 4% p/v). En varias modalidades de los aspectos precedentes, la histidina puede estar presente en una cantidad suficiente para mantener un pH fisiológicamente adecuado. La histidina (por ejemplo, L-histidina) puede estar presente desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 25 mM (por ejemplo, a aproximadamente 10 mM).

En otras modalidades, la formulación puede además incluir un antioxidante tal como metionina. La metionina puede estar presente en aproximadamente 0.1 mM aproximadamente 25 mM (por ejemplo, a aproximadamente 10 mM). En una modalidad, en la comulación puede ¡ncluir un estabilizador tal como polisorbato 80. El polisorbato 80 puede estar presente desde aproximadamente 0.001 % p/v a aproximadamente 0.01% p/v (por ejemplo, a aproximadamente 0.005% p/v). En ciertas modalidades, la formulación tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 (por ejemplo, aproximadamente 6).

En ciertas modalidades, la formulación puede ser estable para congelamiento. Adicionalmente, la formulación puede ser adecuada para administrarse parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intracranialmente, o epiduralmente. En varias modalidades, la formulación puede ser adecuada para suministro a blanco al cerebro o al fluido de la columna de un sujeto. En otras modalidades, la formulación puede estar sustancialmente libre de preservativos. La formulación puede ser estables durante al menos 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, o al menos aproximadamente 30 meses. En varias modalidades, la formulación es estable a aproximadamente -80° C a aproximadamente 40° C, a aproximadamente 0° C a aproximadamente 25° C, o a aproximadamente 2° C a aproximadamente 8° C. Algunas formulaciones son estables durante al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses, al menos aproximadamente 24 meses, o al menos aproximadamente 30 meses. Algunas formulaciones son estables a aproximadamente --80° C a aproximadamente 40° C, a aproximadamente 0° C a aproximadamente 25° C, a aproximadamente 0° C a aproximadamente 10° C, preferiblemente a aproximadamente -80° C a aproximadamente -50° C o a aproximadamente 2° C a aproximadamente 8° O Alguna formulaciones son estables durante al menos 12 meses a una temperatura por encima de la de congelamiento a aproximadamente 10° C y tienen un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5.

En un aspecto particular, la presente invención suministra una formulación adecuada para la administración intravenosa que incluye aproximadamente 20 mg/mL de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% de manitol y que tiene un pH de aproximadamente 6. En otro aspecto, la presente invención suministra una formulación adecuada para la administración intravenosa que incluye aproximadamente 20 mg/mL de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste, aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% de manitol, aproximadamente 0.01 % de polisorbato 80, y que tiene un pH de aproximadamente 6. En otro aspecto, la presente invención suministra una formulación adecuada para la administración intravenosa que incluye aproximadamente 20 mg/mL de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión de antígeno de éste, aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% de manitol, aproximadamente 0.005% de polisorbato 80, y que tiene un pH de aproximadamente 6.

Algunas formulaciones son estables durante al menos aproximadamente 12 meses a una temperatura por encima del congelamiento a aproximadamente 10° C y que tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5. Tal formulación incluye al menos un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste) a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, manitol a una concentración de aproximadamente 4% p/v o NaCI a una concentración de aproximadamente 150 mM, de histidina o succinato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM, y 10 mM de metionina. Una de tales formulaciones en un pH de aproximadamente 6.0, aproximadamente 1 mg/ml de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste) aproximadamente 10 mM de histidina y aproximadamente 4% p/v de manitol. Otras formulaciones son estables durante al menos aproximadamente 24 meses a una temperatura de aproximadamente 2° C a 8° C, e incluye polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.001% p/v a aproximadamente 0.01 % p/v. Algunas de tales formulaciones tienen un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.5 e incluyen aproximadamente 10 mM de histidina, aproximadamente 4% p/v de manitol y aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml o aproximadamente 5 mg/ml de un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste). Otras de tales formulaciones incluyen aproximadamente 10 mM de histidina, aproximadamente 4% p/v de manitol, aproximadamente 0.005% p/v polisorbato 80 y aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml o 30 mg/ml de un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), preferiblemente a un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.2.

Un comulación preferida es estables durante menos de aproximadamente 24 meses a una temperatura de aproximadamente 2° C a aproximadamente 8° C, tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, e incluye aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 23 mg/ml, preferiblemente aproximadamente 17 mg/ml a aproximadamente 23 mg/ml, de un anticuerpo 3D6 humanizado, aproximadamente 10 mM de histidina y aproximadamente 10 mM de metionina. Preferiblemente, la formulación incluye además aproximadamente 4% p/v de manitol. La formulación incluye preferiblemente polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.001 % p/v a aproximadamente 0.01% p/v, más preferiblemente aproximadamente 0.005% p/v polisorbato 80. En tales formulaciones, el anticuerpo 3D6 humanizado puede estar presente en una concentración de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 23 mg/ml.

Otra formulación es estable durante al menos 24 meses a una temperatura de aproximadamente 2° C a aproximadamente 8° C, tiene un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, e incluye aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 23 mg/ml de un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 10 mM de succinato, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% p/v de manitol y aproximadamente 0.005% p/v polisorbato 80. En algunas de tales formulaciones, la concentración del polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activa (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste) está presente en una concentración de aproximadamente 17 mg/ml a aproximadamente 23 mg/ml.

La invención también suministra una formulación que es estable cuando se descongela desde aproximadamente -50° C a aproximadamente -80° C, tiene un pH de aproximadamente 6.0 e incluye aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mg/ml de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 1.0 mg/ml a aproximadamente 2.0 mg/ml de histidina, aproximadamente 1.0 mg/ml a 2.0 mg/ml de metionina y aproximadamente 0.05 mg/ml de polisorbato 80. Preferiblemente, se excluye el manitol.

La presente invención también suministra una formulación líquida que incluye un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), manitol e histidina. En algunas de tales formulaciones, el polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), se presenta desde aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml. Preferiblemente, el manitol está presente en una cantidad suficiente para mantener la isotonicidad de la formulación. Preferiblemente, la histidina está presente en una cantidad suficiente para mantener un pH fisiológicamente adecuado. Una de tales formulaciones incluye aproximadamente 20 mg/mL de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% de manitol y tiene un pH de aproximadamente 6. Otra de tales formulaciones incluye aproximadamente 30 mg/mL de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 10 mM de succinato, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 6% de manitol y tiene un pH de aproximadamente 6.2. Aún otra de tales formulaciones incluye aproximadamente 20 mg/mL de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% de manitol, aproximadamente 0.005% de polisorbato 80, y tiene un pH de aproximadamente 6. Otra de tales formulaciones incluye aproximadamente 10 mg/mL de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 10 mM de succinato, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 10% de manitol, aproximadamente 0.005% de polisorbato 80, y tiene un pH de aproximadamente 6.5.

Aún otra de tales formulaciones incluye aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% de manitol, aproximadamente 0.005% de polisorbato 80, y tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.5. Aún otra de tales formulaciones incluye aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente a 5 mM a aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 150 mM de NaCI, aproximadamente 0.005% de polisorbato 80, y tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.5.

La presente invención también suministra una formulación adecuada para la administración intravenosa que incluye aproximadamente 20 mg/mL de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% de manitol y tiene un pH de aproximadamente 6. Preferiblemente, tal formulación incluye aproximadamente 0.005% de polisorbato 80.

La invención suministra un método para incrementar la estabilidad de un polipéptido de unión de antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, una formulación farmacéutica líquida, donde el polipéptido exhibiría de otra forma una formación de subproducto durante el almacenamiento de una formación líquida. De acuerdo con esto, el método comprende incorporar en la formulación un antioxidante, por ejemplo, metionina o un análogo de éste, en una cantidad suficiente para reducir la cantidad de formación de subproducto.

La presente invención también suministra un método para mantener la estabilidad de un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste) la formulación a ser almacenada a una temperatura de aproximadamente -50° C a aproximadamente -80° C seguida por almacenamiento a una temperatura de aproximadamente 2° C a aproximadamente 8° C, que comprende (i) combinar aproximadamente 40 mg/ml a aproximadamente 60 mg/ml de un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de L-histidina, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de metionina y aproximadamente 0.05 mg/ml de polisorbato 80; (ii) ajustar el pH a aproximadamente 6.0; (iii) filtrar en un c orecipiente y congelar; (iv) descongelar; (v) agregar manitol o NaCI y un diluyente en cantidades suficientes para resultar en una concentración final de aproximadamente 4% de manitol o aproximadamente 150 mM de NaCI, aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml de un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste); aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM de histidina; aproximadamente 10 mM de metionina y aproximadamente 0.005% de polisorbato 80; (vi) filtrar; (vii) transferir a un recipiente de vidrio y sellar; y (viii) almacenar a una temperatura de aproximadamente 2° C a aproximadamente 8° O La presente invención también suministra un kit que incluye un recipiente con una formulación descrita aquí e instrucciones para uso.

La presente invención también suministra una forma de dosis unitaria farmacéutica, que incluye una formulación de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 250 mg de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 4% de manitol o aproximadamente 150 mM de NaCI, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM de histidina o succinato, y aproximadamente 10 mM de metionina. Algunas de tales formas de dosis unitarias farmacéuticas incluyen aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.1 % de polisorbato 80. Algunas de tales formas de dosis unitarias farmacéuticas incluyen aproximadamente 40 mg a aproximadamente 60 mg, aproximadamente 60 mg a aproximadamente 80 mg, aproximadamente 80 mg a aproximadamente 120 mg, aproximadamente 120 mg a aproximadamente 160 mg, o aproximadamente 160 mg a aproximadamente 240 mg del polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste). Algunas de tales formulaciones se pueden mantener en un recipiente de vidrio a una temperatura de aproximadamente 2° C a aproximadamente 8° C antes de la administración a un paciente.

Además, la presente invención suministra un producto terapéutico que incluye un frasco de vidrio con una formulación que incluye aproximadamente 10 mg a aproximadamente 250 mg de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), aproximadamente 4% de manitol o aproximadamente 150 mM de NaCI, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM de histidina, y aproximadamente 10 mM de metionina. Alguno de tales productos terapéuticos incluyen además una etiqueta para uso que incluye instrucciones para usar el volumen apropiado necesario para lograr una dosis de aproximadamente 0.15 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg en un paciente. Típicamente, el frasco es un frasco de un 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL o 50 mL. La dosis de algunas de tales productos terapéuticos es aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, preferiblemente aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg. En algunos de tales productos terapéuticos, la concentración de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste) es aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 60 mg/ml, preferiblemente aproximadamente 20 mg/ml. El producto terapéutico preferiblemente incluye aproximadamente 0.005% de polisorbato 80. La formulación de algunos de tales productos terapéuticos es para administración subcutánea o administración intravenosa.

En otro aspecto, la invención suministra un método para incrementar la estabilidad de un polipéptido de unión de antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, una formulación farmacéutica líquida, donde el polipéptido exhibiría de otra forma formación de subproducto durante el almacenamiento de una formulación líquida. De acuerdo con esto, el método comprende incorporar en la formulación un antioxidante, por ejemplo, metionina o un análogo de ésta, en una cantidad suficiente para reducir la cantidad de formación de subproducto.

En aún otro aspecto, la presente invención suministra un kit que incluye un recipiente con una formulación descrita aquí e instrucciones para uso.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 describe una representación esquemática de la estructura predicha de un anticuerpo IgG y posiciones aproximadas de uniones disulfuro intra- e intercadena, sitios de glicosilación (símbolo hexagonal), regiones determinantes de complementariedad (CDR), regiones de estructura (sombreadas), y regiones constantes.

La Figura 2 identifica la secuencia de aminoácido completa de las cadenas ligeras y pesada del anticuerpo anti Aß 3D6 versión 2 humanizadas (hu3D6.v2), SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente. Regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR), es decir, CDR1 , CDR2, y CDR3 están, respectivamente, en las posiciones del residuo 24-39, 55-61 , y 94-102 (panel superior). Las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR), es decir, CDR1 , CDR2, y CDR3 están, respectivamente, en las posiciones de residuo 40-44, 50-65, y 99-108 (panel inferior). Las uniones disulfuro intramoleculares predichas se ilustran por medio de conexiones de los residuos de cisteína involucrados. Las cisteínas esperadas para formar las uniones disulfuro intramolecular están subrayadas y la conectividad indicad. El sitio de consenso de glicosilación ligado a N de la cadena pesada de anticuerpo indicada en cursiva y negrilla en las posiciones de residuo 299-301 (panel interior). La lisina C-terminal de cadena pesada predicha se muestra en paréntesis.

La Figura 3 describe gráficamente las predicciones de vida útil para las formulaciones de anticuerpo (con y sin polisorbato 80 (PS80)) hecho de acuerdo con la presente invención y almacenada a 5° C.

La Figura 4 describe gráficamente las predicciones de vida útil para formulaciones de anticuerpo (con y sin PS80) hecho de acuerdo con la presente invención y almacenada a 25° C.

La Figura 5 describe gráficamente las predicciones de vida útil para formulaciones de anticuerpo (con y sin PS80) hecho de acuerdo con la presente invención y almacenada a 40° C.

La Figura 6 describe gráficamente las predicciones de degradación para las formulaciones con PS80 hecho de acuerdo con la presente invención y almacenada a 5° C.

La Figura 7 describe gráficamente el análisis de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) de las formulaciones con PS80 hecho de acuerdo con la presente invención, almacenada a 5° C, y reprocesada para minimizar la variabilidad de ensayo.

La Figura 8 describe gráficamente las predicciones de degradación de formulaciones sin PS80 hecho en de acuerdo con la presente invención y almacenada a 5° C.

La Figura 9 describe un cromatograma que indica que la presencia del PS80 cambia los subproductos encontrados dentro de la formulación de polipéptido estabilizada desde especies de alto peso molecular a especies de bajo peso molecular sin cambiar el perfil del anticuerpo de monómero.

La Figura 10 describe gráficamente la inhibición de la formación de los subproductos indeseables en una formulación de polipéptido que comprende lgG4, en particular, agregados de polipéptido de alto peso molecular, luego de la adición de un antioxidante tal como metionina libre.

La Figura 11 describe gráficamente la inhibición de la formación de subproductos indeseables en una formulación de polipéptido que comprende lgG2, en particular, agregados de polipéptido de alto peso molecular, luego de la adición de un antioxidante tal como metionina libre.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Con el fin de suministrar un entendimiento claro de las especificaciones y reivindicaciones, las siguientes definiciones se suministran convenientemente adelante.

Como se utiliza aquí, el término "polipéptido de unión de antígeno" incluye polipéptidos capaces de unirse específicamente a la molécula objetivo, por ejemplo, un antígeno, por ejemplo, un Péptido Aß (s) o epítopo(s) dentro de dichos Péptidos Aß. Típicamente, los polipéptidos de unión de antígeno comprenden al menos una porción funcional de una inmunoglobulina o un dominio similar a inmunoglobulina (por ejemplo, un receptor) que comprende una o más regiones de variabilidad o regiones determinantes de complementariedad (CDR) que imparten una característica de unión específica al polipéptido. Los polipéptidos de unión de antígeno preferidos incluyen anticuerpos, por ejemplo, IgM, lgG1 , lgG2, lgG3, o lgG4.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (que incluye anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos infectados con CDR, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos y anticuerpos de cadena simple (scFvs). El término "anticuerpo de cadena simple" se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena de dos polipéptidos que consisten de una cadena pesada y una ligera, dichas cadenas son estabilizadas, por ejemplo, mediante ligadores de péptido intercadena, que tiene la capacidad de unirse específicamente a antígeno. El término "fragmento de anticuerpo" incluye fragmentos F(ab')2, fragmentos, Fab, fragmentos Fd, fragmentos Fv, y fragmentos de anticuerpo de dominio simple (DAbs).

El término "dominio" se refiere a una región globular de polipéptido de cadena pesada o ligera que comprende un pliegue de inmunoglobulina. El pliegue de inmunoglobulina está comprendido de una estructura secundaria de lámina plegada ß que incluye un enlace disulfuro. Los dominios son además denominados aquí como "constante" o "variable", con base en la falta relativa de variación de secuencia dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio "constante", o la variación significativa dentro de los dominios de varias clases de varios miembros en la clase en el caso de un dominio "variable". Los "dominios" de anticuerpo o polipéptido son a menudo denominados intercambiablemente en la técnica como "regiones" de anticuerpo o polipéptido. Los dominios "constante" de una cadena ligera de anticuerpo son denominados intercambiablemente como "regiones constantes de cadena ligera", "dominios constantes de cadena ligera", regiones "CL" o dominios "CL". Los dominios "constante" de una cadena pesada de anticuerpo son denominados intercambiablemente como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena", regiones "CH" o dominios "CH"). Los dominios "variable" de una cadena ligera de anticuerpo son denominados intercambiablemente como "regiones variables de cadena ligera", "dominios variables de cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL"). Los dominios "variable" de una cadena pesada de anticuerpo son denominados intercambiablemente como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena pesada", regiones "VH" o dominios "VH").

El término "región" se puede referir una parteo porción de una cadena de anticuerpo o un dominio de cadena de anticuerpo (por ejemplo, una parte o porción de una cadena pesada o ligera o una parte o porción de un dominio constante o variable, como se definió aquí), así compuesto también a partes o porciones más discretas de dichas cadenas o dominios. Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada o los dominios de variable de cadena ligera y pesada incluyen "regiones determinantes complementariedad" o "CDR" esparcidos entre las "regiones de estructura" o "FR", como se definió aquí.

El término "anticuerpo anti Aß" incluye anticuerpos (y fragmentos de éstos) que son capaces de unirse a epítopo (s) del péptido Aß. Los anticuerpo anti Aß incluyen, por ejemplo, aquellos anticuerpos descritos en la Solicitud de Patente U.S. No. 20030165496A1 , la Publicación de Patente U.S. No. 20040087777A1 , la Publicación de Patente Internacional No. WO02/46237A3, y la Publicación de Patente Internacional No. WO04/080419A2. Otros anticuerpos anti Aß se describen en, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nos. WO03/077858A2 y WO04/108895A2, ambas titulas "Humanized Antibodys que Recognize Beta Amiloide Péptido", la Publicación de Patente Internacional No. WO03/016466A2, titulada "Anticuerpos anti-Aß", la Publicación de Patente Internacional No. WO0162801 A2, titulada "Humanized Antibodys that Sequester Amyloid Beta Peptide", y la Publicación de Patente Internacional No. WO02/088306A2, titulada "Anticuerpos Humanizados".

El término "fragmento" se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende más pocos residuos de aminoácidos que un anticuerpo intacto o completo o una cadena de anticuerpo. Los fragmentos se pueden obtener por vía de un tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo intacto o completo o una cadena de anticuerpo. Los fragmentos también se pueden obtener mediante medios recombinantes. Fragmentos de ejemplo incluyen Fab, Fab', F(ab')2, y/o fragmentos Fv. El término "fragmento de unión de antígeno" se refiere a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del cual ellos se derivaron) para la unión de antígeno (es decir, la unión específica).

El término "conformación" se refiere a la estructura terciaria de una proteína o polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo, una cadena de anticuerpo, dominio o región de ésta). Por ejemplo, la frase "conformación de cadena ligera (o pesada)" se refiere a la estructura terciaria de una región variable de cadena ligera (o pesada), y la frase "conformación de anticuerpo conformación" o "conformación de fragmento de anticuerpo" se refiere a la estructura terciaria de un anticuerpo o fragmento de este.

"Unión específica" de un anticuerpo significa que el anticuerpo exhibe afinidad apreciable por el antígeno o epítopo particular y, en general, no exhibe reactividad cruzada significativa. En las modalidades de ejemplo, el anticuerpo no exhibe reactividad cruzada (por ejemplo, no reacciona de manera cruzada con péptidos no Aß o con epítopos remotos por ejemplo, epítopos no contiguos de Aß). "Apreciable" o de unión preferida incluye unión con una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 M'1, o 1010 M"1. Las afinidades mayores de 107 M"1, preferiblemente mayores de 108 M" son las más preferidas. Los valores intermedios de aquellos establecidos aquí también pueden estar dentro del alcance de la presente invención y una afinidad de unión preferida se puede indicar compuesto un rango de afinidades, por ejemplo, 106 a 1010 M"1, preferiblemente 107 a 1010 M"1, más preferiblemente 108 a 1010 M 1. Un anticuerpo que "no exhiba reactividad cruzada significativa" es uno que no se unirá apreciablemente a una entidad indeseable (por ejemplo, a una proteína indeseable, polipéptido o péptido). Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Aß se unirá apreciablemente a Aß pero no reaccionará significativamente con proteínas o péptidos no-Aß (por ejemplo, proteínas o péptidos no-Aß incluidos en placas). Un anticuerpo específica para un epítopo particular, por ejemplo, no reaccionará de manera cruzada significativamente con epítopos remotos sobre la misma proteína o péptido. La unión específica se puede determinar de acuerdo a cualesquier medios reconocidos en la técnica para determinar tal unión. Preferiblemente, la unión específica se determina de acuerdo al análisis Scatchard y/o los ensayos de modo competitivos.

Los fragmentos de unión se producen mediante técnicas de ADN recombinantes, o mediante clivaje enzimático o químico de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, cadenas simples, y anticuerpos de cadena simple. Diferentes a las inmunoglobulinas o anticuerpos "biespecífico" o "bifuncional", una inmunoglobulina o anticuerpo se entiende por tener cada uno de sus sitios de unión idéntico. Un "biespecífico" o "anticuerpo bifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos diferentes sitios de unión. Lo anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Un "antígeno" es una molécula (por ejemplo, una proteína, polipéptido, péptido o carbohidrato) que contiene un determinante antigénico al cual se une específicamente el anticuerpo.

El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al cual una inmunoglobulina o anticuerpo (o fragmento de unión de antígeno de éste) se une específicamente. Los epítopos se pueden formar tanto de aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante pliegues terciarios de una proteína. Los epítopos formados de aminoácidos contiguos son típicamente retenidos sobre exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados mediante pliegue terciario son típicamente perdidos en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bi-dimensional. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

El término "formulación estabilizada" o "formulación de polipéptido líquido estabilizado" incluye formulaciones en las cuales el polipéptido allá retiene esencialmente su identidad física y química y la integridad luego de almacenamiento. Varias técnicas analíticas para la medición de la estabilidad de la proteína están disponibles en la técnica y se describen aquí (revisado en, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301 , Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)). La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. Para un ensayo rápido, la formulación se puede mantener a una temperatura mayor o "acelerada", por ejemplo, 40° C durante 2 semanas o 1 mes o más en cuyo tiempo se mide la estabilidad. En modalidades de ejemplo, la formulación es refractaria a la formación de subproductos del polipéptido componente, por ejemplo, productos de agregación de alto peso molecular, productos de degradación o fragmentación de bajo peso molecular, o mezclas de éstos.

El término "subproducto" incluye productos indeseados, que afectan, o disminuye la proporción del polipéptido terapéutico en una formulación dada. Los subproductos típicos incluyen agregados del polipéptido terapéutico, los fragmentos del polipéptido terapéutico (por ejemplo, producidos mediante la degradación del polipéptido mediante la desamidación o hidrólisis), o mezclas de éstos.

El término "agregados de polipéptido de alto peso molecular" incluye agregados de polipéptido terapéutico, fragmentos del polipéptido terapéutico (por ejemplo, producidos mediante la degradación de polipéptido mediante, por ejemplo, hidrólisis), o mezclas de éstos, que se agregan luego. Típicamente, los agregados de alto peso molecular son complejos los cuales tienen un paso molecular que es mayor que el polipéptido monómero terapéutico. En el caso de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo IgG, tales agregados son mayores que aproximadamente 150 kD. Sin embargo, en el caso de éstos polípéptidos terapéuticos, por ejemplo, anticuerpos de cadena simple, que típicamente tienen un peso molecular de 25 kD, tales agregados tendría un peso molecular mayor de aproximadamente 25 kD.

El término "producto de degradación de polipéptido de bajo peso molecular" incluye, por ejemplo, fragmentos del polipéptido terapéutico, por ejemplo, llevados por la desamidación o hidrólisis. Típicamente, los productos de degradación de bajo peso molecular son complejos que tienen un peso molecular que es menor del polipéptido de monómero terapéutico. En el caso de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo IgG, tales productos de degradación son menos desde aproximadamente 150 kD. Sin embargo, en el caso de éstos polipéptido terapéuticos, por ejemplo, los anticuerpos de cadena simple, que tienen típicamente un peso molecular de 25 kD, tales agregados tendrían un peso molecular de menos de aproximadamente 25 kD.

El término "ruta de administración" incluye rutas de administración reconocidas en la técnica para el suministro de polipéptido terapéuticos tales como, por ejemplo, parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, ¡ntracranealmente, o epiduralmente. Para la administración de un polipéptido terapéutico, para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, se pueden desear rutas intravenosas, epidurales, o intracraneales.

El término "enfermedad amiloidogénica" incluye cualquier enfermedad asociada con (o causada por) la formación o depósito de fibrillas amiloides insolubles. Ejemplos de enfermedad amiloidogénicas incluyen, pero no están limitadas a amiloidosis sistémica, enfermedad de Alzheimer, diabetes de ataque maduro, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, demencia fronto-temporal, encefalitis espongiforme transmisible almacenada con pieles (enfermedad de kuru y Creutzfeldt-Jacob en humanos y encefalopatía espongiforme en BSE en ovejas y ganado, respectivamente). Las enfermedades amiloidogénicas son definidas o caracterizadas por la naturaleza del componente polipéptido de las fibrillas depositadas. Por ejemplo, en sujetos o pacientes que tienen enfermedad de Alzheimer, la proteína ß-amiloide (por ejemplo, tipo silvestre, variante, o proteína ß-amiloide truncada) es el componente polipéptido que caracteriza el depósito amiloide. De acuerdo con esto, la enfermedad de Alzheimer es un ejemplo de una "enfermedad caracterizada por depósitos de Aß" o una "enfermedad asociada con depósitos de Aß", por ejemplo, en el cerebro de un sujeto o paciente.

Los términos "proteína ß-amiloide", "péptido ß-amiloide", "ß-amiloide", "Aß" y "péptido Aß" se usan intercambiablemente aquí.

El término "tratamiento" como se utiliza aquí, se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido aislado a una línea celular de un paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de una enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el propósito de cura, sanar, aliviar, retrazar, mejorar, alterar, remediar, mejorar, alentar o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.

El término "dosis efectiva" o "dosificación efectiva" se define como una cantidad suficiente para lograr al menos parcialmente el efecto deseado. El término "dosis terapéuticamente efectiva" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos disminuir parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya sufre de la enfermedad. Cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la infección y el estado general del sistema inmune propio del paciente.

El término "paciente" incluye sujetos humanos u otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

El término "forma de dosis unitaria" (o "forma de dosificación unitaria") como se utiliza aquí se refiere a una unidad físicamente discreta adecuada como dosis unitarias para los paciente a ser tratados, cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con los vehículos farmacéuticos requeridos, diluyentes, o excipientes. La especificación para las formas unitarias de dosis de la invención están dictadas por y directamente dependientes de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular a ser logrado, y los parámetros conocidos en la técnica de compuestos tales como compuesto activo para el tratamiento de pacientes.

Los niveles de dosis actual dosis del ingrediente de activo (por ejemplo Aß polipéptidos) en las formulaciones de la presente invención se pueden variar con el fin de obtener una cantidad del ingrediente de activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, la composición, el modo de administración, sin ser tóxicos al paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleada, la ruta de administración, el tiempo de administración, la taza de excreción del compuesto particular que está siento empleado, las duración del tratamiento, otra drogas, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia clínica anterior del paciente que está siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las ciencias médicas.

El término "diluyente" como se utiliza aquí se refiere a una solución adecuada para altear o lograr una concentración de ejemplo o apropiada, o concentración como se describió aquí.

REVISIÓN La presente ¡nvención suministra formulaciones para polipéptidos de unión de antígeno, en particular, anticuerpos, así como también porciones y/o fragmentos de éstos. En ciertos aspectos, la invención suministra formulaciones de polipéptido líquido estabilizadas para uso terapéutico. En particular, la invención suministra la estabilización de polipéptidos de unión de antígeno, por ejemplo, anticuerpos, y fragmentos unión de antígeno de éstos, para el uso en el tratamiento de enfermedades y/o trastornos. En particular, la invención suministra formulaciones que son estabilizadas de tal forma que el polipéptido terapéutico activo es estable durante un periodo extendido de tiempo y puede ser administrar a través de una variedad de rutas de administración. Este es especialmente crítico para aquellos polipéptidos de unión de antígeno (por ejemplo, anticuerpos) destinados para el uso en el tratamiento de ciertas enfermedades y/o trastornos, por ejemplo, enfermedad neurológica o afección neurológica. En otros aspectos, la invención suministra una formulación de anticuerpo estable única que, por ejemplo, es estables a varias agresiones tales como congelamiento, liofilización, calor y/o reconstitución. Más aún, las formulaciones de ejemplo de la presente invención son capaces de mantener la estabilidad, la actividad biológica, la pureza y calidad del anticuerpo durante un periodo de tiempo extendido y aún a temperaturas desfavorables (por ejemplo, un año durante el cual la formulación se almacena). Además, las formulaciones de ejemplo de la presente invención son adecuadas para la administración a sujeto o paciente (por ejemplo, administración intravenosa a un sujeto o paciente), por ejemplo, un humano que tiene o se predice que tiene una enfermedad o afección neurológica, por ejemplo, enfermedad amiloidogénica que involucra el polipéptido Aß amiloide.

FORMULACIONES En un aspecto, la presente invención suministra una formulación que incluye un polipéptido de unión de antigeno terapéuticamente activo (por ejemplo, un fragmento de unión de anticuerpo o antígeno de éste), un agente de tonicidad (por ejemplo, manitol), donde el agente de tonicidad está presente en una cantidad suficiente para hacer la formulación adecuada para infusión intravenosa, y un aminoácido (por ejemplo, histidina) o derivado de éste, donde el aminoácido o derivado de éste está presente en una cantidad suficiente para mantener un pH fisiológicamente adecuado. En una modalidad de ejemplo, la presente invención suministra una formulación que incluye un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno de éste), manitol e histidina.

En otro aspecto, la presente invención suministra una formulación estabilizada que incluye un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo. Los polipéptidos de unión de antígeno adecuados para la estabilización en una formulación de la invención incluyen anticuerpos y fragmentos de éstos, y en particular, anticuerpos capaces de unirse a un blanco terapéutico involucrado en enfermedad o trastorno. De acuerdo con esto, los polipéptido terapéuticos se estabilizan de acuerdo con la invención para evitar le formación de subproductos, típicamente agregados de alto peso molecular, fragmentos de degradación de bajo peso molecular, o mezclas de éstos, mediante la adición de un antioxidante en una cantidad suficiente con el fin de inhibir la formación de tales subproductos. Los agentes antioxidantes incluyen metionina y análogos de éstos, a concentraciones suficientes para obtener la inhibición deseada de los subproductos indeseables como se discute adelante. Opcionalmente, las formulaciones de polipéptido estabilizadas de la invención comprenden además un agente de tonicidad (por ejemplo, manitol), donde el agente de tonicidad está presente en una cantidad suficiente para hacer la formulación adecuada para varias diferentes rutas de administración, por ejemplo, la infusión intravenosa, y un aminoácido (por ejemplo histidina) o derivado de este, donde el aminoácido o derivado de este está presente en una cantidad suficiente para mantener un pH fisiológicamente adecuado. En una modalidad de ejemplo, la presente invención suministra una formulación que incluye un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo, metionina, manítol e histidina.

Polipéptidos para uso en las Formulaciones de la Invención El polipéptido a ser formulado de acuerdo con la invención como se describió aquí se prepara utilizando técnicas que están bien establecidas en el arte e incluyen, por ejemplo, técnicas sintéticas (tales como técnicas recombinantes y síntesis de péptido o combinación de estas técnicas), o se puede aislar de una fuente endógena del polipéptido. En ciertas modalidades de la ¡nvención, el polipéptido de elección es un polipéptido de unión de antigeno, más preferiblemente, un anticuerpo, y en particular, un anticuerpo anti-Aß. Las técnicas para la producción del polipéptido de unión de antígeno, y en particular, los anticuerpos, se describen adelante.

Anticuerpos El término "anticuerpo" como se utiliza aquí se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a pociones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión de antígeno que se unen específicamente (reconoce) un antígeno. Ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que se generan al tratar el anticuerpo con una enzima tal como pepsina o producidos mediante técnicas de ingeniería recombinantes reconocidas en el arte. Las modalidades de la invención son relevantes para la estabilización de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a un antígeno, por ejemplo un antígeno blanco terapéutico, tal como, Aß. El término "anticuerpo monoclonal" o "formulación de anticuerpo monoclonal", como se utiliza aquí, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de un sitio de unión de antígeno capaz de reconocer y unirse a un epítopo particular epitopo de un antígeno blanco, por ejemplo, un epítopo(s) de Aß Una formulación de anticuerpo monoclonal despliega así típicamente una especificidad de unión simple y afinidad para un antígeno blanco particular con el cual éste inmunoreacciona Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales se puede preparar como se describió anteriormente al inmunizar un sujeto adecuado con un inmunógeno El título de anticuerpo en el sujeto inmunizado se puede monitorear durante el tiempo mediante técnicas estándar, tales como con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) utiliza antígeno blanco inmovilizado Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra el antígeno blanco se pueden aislar del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y además purificar mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de Sefarosa™ de proteína para obtener el anticuerpo, por ejemplo, IgG, fracción En un tiempo apropiado después de inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpo anti-antígeno son más altos, las células que producen anticuerpos se pueden obtener del sujeto y utilizar para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándar, tales como la técnica de hibpdoma originalmente descrita por Kohier y Milstein (1975) Nature 256 495-497) (ver también, Brown et al (1981 ) J Immunol 127 539-46, Brown et al (1980) J Biol Chem 255 4980-83, Yeh et al (1976) Proc Nati Acad Sci USA 76 2927-31 , and Yeh ef al (1982) Int J Cáncer 29 269-75) Para la preparación de los anticuerpos policlonales quiméricos, ver Buechler er al Patente U S No 6,420,1 13 Anticuerpos Monoclonales Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos utilizados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas se pueden aplicar para el propósito de generar un anticuerpo monoclonal (ver, por ejemplo, G. Galfre ef al. (1977) Nature 266:55052; Gefter ef al. Somatic Cell Genet., cited supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citados supra). Más aún, el trabajador experto apreciará que existen muchas variaciones de tales métodos que serían útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se deriva de las mismas especies de mamífero como los linfocitos. Por ejemplo, los hibridomas de murino pueden hacer al fusionar linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente ¡nvención con una línea celular de ratón inmortalizada. Las líneas celulares inmortales preferidas son líneas de células de mieloma de ratón que son sensibles a hipoxantina contenida en medio de cultivo, aminopterina y timidina (medio "HAT"). Cualquiera de un número de líneas celulares de mieloma se pueden utilizar como un compañero de fusión de acuerdo a técnicas estándar, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1 , P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles del ATCC. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan a esclerositos de ratón que utilizan polietilenglicol ("PEG"). Las células de hibridoma que resultan de la fusión son entonces seleccionadas utilizando medio HAT, que mata las células de mieloma no fusionadas o improductivamente fusionadas (esclerositos no fusionados muertos después de varios días por que ellos no son transformados). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan al seleccionar los sobrenadantes de cultivos de hibridoma para los anticuerpos que se unen a un antígeno blanco, por ejemplo, Aß, utilizando un ensayo ELISA estándar.

Anticuerpos Recombinantes Las alternativas para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoclonal se puede identificar y aislar al seleccionar una librería de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo, una librería de despliegue de fago de anticuerpo) con un antígeno blanco para aislar de esta manera miembros de librería de inmunoglobulina que se unen a un antígeno blanco. Kits para generar y seleccionar librerías de despliegue de fago y disponibles comercialmente (por ejemplo, (the Pharmacia Recombinant Fage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01 ; y el Stratagene SurfZAP™ Fage Display Kit, Catalogo No. 240612). Adicionalmente, ejemplos y métodos de reactivos particularmente adecuados para uso para generar y seleccionar librería de despliegue de anticuerpos se puede encontrar en, por ejemplo, Ladner ef al. Patente U.S. No. 5,223,409; Kang ef al. Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 92/18619; Dower ef al. Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 91/17271 ; Winter et al. Publicación de Patente Internacional PCT WO 92/20791 ; Markland ef al. Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 92/15679; Breitling ef al. Publicación de Patente Internacional PCT WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 92/01047; Garrard et al. Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 92/09690; Ladner et al. Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 90/02809; Fuchs ef al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay ef al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281 ; Griff?ths ef al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson ef al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad ef al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom ef al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas ef al. (1991) Proc. Nati. /Acao1. Sci. USA 88:7978-7982; and McCafferty ef a/. ?/afure (1990) 348:552-554.

Anticuerpos Quiméricos y Humanizados Adicionalmente, los anticuerpo recombinantes, tales como los anticuerpos quiméricos y monoclonales humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, que se pueden utilizar usando técnicas de ADN recombinante estándar, que están dentro del alcance de la invención.

El término "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo que incluye al menos una inmunoglobulina humanizada o una cadena de anticuerpo (es decir, al menos una cadena ligera o pesada humanizada). El término "cadena de inmunoglobulina humanizada" o "cadena de anticuerpo humanizado" (es decir una "cadena ligera de inmunoglobulina humanizada" o "cadena pesada de inmunoglobulina humanizada") se refiere a una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo (es decir, una cadena ligera o pesada, respectivamente) que tiene una región variable que incluye una región de estructura variable sustancialmente de una inmunoglobulina humana o un anticuerpo y regiones determinantes de complementariedad (CDR) (por ejemplo, al menos un CDR, preferiblemente dos CDR, más preferiblemente tres CDR) sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano, y además incluye regiones constantes (por ejemplo, al menos una región constante o porción de ésta, y en el caso de una cadena ligera, y preferiblemente tres regiones constantes en el caso en donde una cadena pesada). El término "región variable humanizada" (por ejemplo, "región variable de cadena ligera humanizada" o "región variable de cadena pesada humanizada") se refiere a una región variable que incluye una región de estructura variable sustancialmente de una inmunoglobulina humana o anticuerpo y regiones determinantes de complementariedad (CDR) sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano.

La frase "sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano" o "sustancialmente humano" significa que, cuando se alinea a una inmunoglobulina humana o a una secuencia amino de anticuerpo para propósitos de comparación, la región comparte al menos 80-90%, 90-95%, o 95-99% de identidad (es decir identidad de secuencia local) con la estructura humana o la secuencia de región constante, permitiendo, por ejemplo, las sustituciones conservadoras, las sustituciones de secuencia de consenso, las sustituciones de línea germinal, la retromutaciones, y similares. La introducción de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de línea germinal, retromutaciones, y similares, se denominan a menudo como "optimización" de un anticuerpo humanizado o cadena. La frase "sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano" o "sustancialmente no humano" significa que tiene una secuencia de inmunoglobulina o anticuerpo de al menos 80-95%, preferiblemente al menos 90-95%, más preferiblemente, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica con aquella del organismo no humano, por ejemplo un mamífero no humano.

De acuerdo con eso, todas las regiones o residuos de la inmunoglobulina o anticuerpo humanizado, o de una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo humanizado, excepto los CDR, son sustancialmente idénticos a las regiones correspondientes o a los residuos de uno o más secuencias de ¡nmunoglobulina humana. El término "región correspondiente" o "residuo correspondiente" se refiere a una región o residuo sobre un segundo aminoácido o secuencia de nucleótido que ocupa la misma (es decir equivalente) posición que la región o residuo sobre un primer aminoácido o secuencia de nucleótido, cuando la primera y segunda secuencias están óptimamente alineadas para propósitos de comparación.

El término "identidad significativa" significa que dos secuencias de polipéptido, cuando están óptimamente alineadas, tales como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan pesos de espacio por defecto, combaten al menos 50-60% de la identidad de secuencia, preferiblemente al menos 60-70% de la identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 70-80% de la identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 80-90% de identidad, y aún más preferiblemente al menos 90-95% de la identidad de secuencia, y aún más preferiblemente al menos 95% de la identidad de secuencia o más (por ejemplo, 99% de identidad de secuencia o más). El término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de polipéptido, cuando se alinean óptimamente, tales como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan peso de espacio por defecto, comparten al menos 80-90% de la identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90-95% de la identidad de secuencia, y más preferiblemente al menos 95% de la identidad de secuencia o más (por ejemplo, 99% de la identidad de secuencia o más). Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, a la cual las secuencias de ensayo se comparan.

Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, el ensayo y las secuencias de referencia son ingresadas a una computadora, y son diseñadas coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros de programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces la identidad de secuencia porcentual para las secuencias de ensayo con relación a la secuencia de referencia con base en los parámetros de programa designados.

El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación se pueden conducir por ejemplo mediante un algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda de un método de similaridad de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante inspección visual (ver generalmente Ausubel ef al., Current Protocols in Molecular Biology). Un ejemplo de algoritmo es adecuado para determinar la identidad de secuencia porcentual y la similaridad de secuencia en el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). El Software para desarrollar los análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (públicamente accesible a través de los servidores Internet de los Institutos Nacionales de Salud NCBI). Típicamente, los parámetros de programa por defecto se pueden utilizar para desarrollar la comparación de secuencia, aunque los parámetros de costumbre también se pueden utilizar. Para la secuencia de aminoácido, el programa BLASTP utiliza como defectos una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y una matriz de calificación BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

Preferiblemente, las posiciones de residuo que no son idénticas difieren en las sustituciones de aminoácido conservadores. Para los propósitos de clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos se agrupan como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): leu, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo lll (cadenas laterales acidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influencian la orientación de cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras involucran sustituciones entre los aminoácidos en al misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.

Preferiblemente, las inmunoglobulinas humanizadas o los antígenos de unión de anticuerpos con una afinidad que está dentro de un factor de tres, cuatro o cinco de aquella del anticuerpo no humanizado no correspondiente. Por ejemplo, si el anticuerpo no humanizado tiene una afinidad de unión de 109 M'1, los anticuerpos humanizados tendrán una afinidad de unión de al menos 3 x 109 M"1, 4 x 109 M"1 o 5 x 109 M"1. Cuando se describen las propiedades de unión de una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo, esta cadena se puede describir con base en su capacidad para "dirigir unión de antígeno (por ejemplo, Aß)". Se dice que una cadena "dirige la unión de antígeno" cuando esta le confiere luego de una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión de antígeno de éste) una propiedad de unión especifica o afinidad de unión. Una mutación (por ejemplo retromutación) se dice que afecta sustancialmente a la capacidad de la cadena pesada o ligera a dirigir la unión de antígeno si ésta afecta por ejemplo disminuye) la afinidad de unión de una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión de anticuerpo de este) que comprende dicha cadena mediante al menos un orden de magnitud comparado con aquel del anticuerpo (o fragmento menor de antígeno de éste) que comprende una cadena equivalente a la que le falta dicha mutación. Una mutación "no afecta sustancialmente (por ejemplo disminuye) la capacidad de una cadena a dirigir la unión de antígeno" si esta afecta (por ejemplo disminuye) la afinidad de unión de la inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmentos de unión de antígeno de éste) que comprende dicha cadena por solo un factor de dos, tres, o cuatro de aquel del anticuerpo (o fragmento de unión de antígeno de éste) que comprende una cadena equivalente a la que le falta dicha mutación.

El término "inmunoglobulina quimérica" o anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo cuyas regiones variables se derivan de unas primeras especies y cuyas regiones constantes se derivan de unas segundas especies. Las inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos se pueden construir, por ejemplo, mediante ingeniería genética, de segmentos de gen de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Los términos "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humanizado" no están destinados a comprender inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, como se define infra. Aunque las inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados son quiméricos en su construcción (es decir comprende regiones de más de una especie de proteínas), ellas incluyen características adicionales (es decir regiones variables que comprenden residuos CDR donadores y residuos de sutura aceptadora) no encontrados en las inmunoglobulinas o anticuerpo quiméricos, como se definió aquí.

Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en el arte, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en Robinson ef al. Solicitud Internacional No. PCT/US86/02269; Akira, ef al. Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171 ,496; Morrison et al. Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger ef al. Publicación de Internacional PCT No. WO 86/01533; Cabilli ef al. Patente U.S. No. 4,816,567; Cabilli et al. Solicitud de Patente Europea 125,023; Better ef al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu ef al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun ef al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura ef al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood ef al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Nati. Cáncer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi ef al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter Patente U.S. 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321 :552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler ef al. (1988) J. Immunol. 141 :4053-4060.

Los Anticuerpos Humanos Provenientes de Animales Transgénicos y de Despliegue de Fago Alternativamente, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, luego de inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena.

Por ejemplo, se ha descrito que la supresión de homocigoto del gen de la región de unión de la cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal resulta en la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógena. La transferencia de la disposición del gen de inmunoglobulina de línea germinal de humano en tales ratones mutantes de línea germinal resulta de la producción de anticuerpos humanos luego de la disposición al antígeno. Ver, por ejemplo, Patente U.S. Nos. 6,150,584; 6,114,598; y 5,770,429.

Los anticuerpos completamente humanos también se derivan de la librerías de despliegue de fago (Hoogenboom ef al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks ef al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)).

Anticuerpos Bioespecíficos, polipéptidos de fusión de anticuerpo y anticuerpo de cadena simple Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos diferentes epítopos. Tales anticuerpos se pueden derivar de anticuerpos de longitud completa o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab)'2). Los métodos para elaborar los anticuerpos biespecíficos son conocidos en el arte. La producción tradicional de los anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein ef al., Nature, 305:537-539 (1983)). En razón a la clasificación aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, éstos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diferentes moléculas de anticuerpo (ver, WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)).

Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina a biotina u otra carga neta. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden hacer utilizando cualesquier métodos de reticulación convenientes. Los agentes reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y son descritos en la Patente U.S. No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación.

En aún otra modalidad, el anticuerpo se puede fusionar, química o genéticamente, a un dominio de carga neta, tal como una porción reactiva, detectable, o funcional, por ejemplo, una inmunotoxina para producir un polipéptido de fusión de anticuerpo. Tales cargas netas incluyen, por ejemplo, inmunotoxinas, quimioterapéuticos, y radioisótopos, todos los cuales son bien conocidos en la arte.

Los anticuerpos de cadena simple son también adecuados para la estabilización de acuerdo a la invención. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) con un ligador, que le permite a cada región variable hacer interfase una con la otra y recrear el bolsillo de unión de antígeno de un anticuerpo padre del cual se derivan las regiones VL y VH. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se entiende que cualquiera de las moléculas de polipéptido anteriores, sola o en combinación, son adecuadas para la preparación de formulaciones estabilizadas de acuerdo con la invención.

Polipéptidos de unión de antí eno terapéutico Un número de los polipéptidos de unión de antígeno terapéutico son adecuados para ser formuladas de acuerdo con las condiciones de estabilización de la presente invención. Típicamente, los polipéptidos de unión de antígeno son anticuerpos o fragmentos de éstos (ver supra), que comprenden una región variable de anticuerpo y/o región Fc de anticuerpo o al menos una porción de una inmunoglobulina, proteínas de la superfamilia de inmunoglobulina, o receptor o dominio similar a receptor, que puede interactuar con un antígeno blanco o una molécula del sistema inmune, por ejemplo, un receptor Fc. Por conveniencia, los polipéptidos de unión de antígeno que se pueden beneficiar de los métodos y formulaciones de la presente invención se discuten adelante de acuerdo a su clase de antígeno blanco. Tales polipéptidos de unión de antígeno representativos se unen a las clases de antígeno que incluyen, por ejemplo, antígenos cancerosos, antígenos autoinmunes, alérgenos, y patógenos.

Polipéptidos de Unión de Antíqeno Terapéutico que se Unen s Antíaenos de Cáncer En ciertas modalidades, los polipéptidos de unión de antígeno sometidos a los métodos y composiciones de la presente invención se pueden unir bajo una molécula específica para células tumorales por ejemplo, un antígeno específico de tumor. Tales antígenos específicos de tumor incluyen, por ejemplo, el antígeno pemfigoide buloso 2, el antígeno mucin de próstata (PMA), el antígeno Thomsen-Friedenreich asociado a tumor, el antígeno específico de próstata (PSA), el antígeno epitelial luminar (LEA. 135) de carcinoma mama y el carcinoma de célula transicional de vejiga (TCC), I antígeno de suero asociado a cáncer (CASA) y el antígeno de cáncer 125 (CA 125), la glicoproteína epitelial 40 (EGP40), el antígeno de carcinoma de célula escamosa (SCC), la catepsina E, la tirosinasa en melanoma, el antígeno nuclear de célula (PCNA) de cavenomas cerebrales, el antígeno de cáncer de mama DF3/MUC1 , el antígeno carcinoembriónico, el antígeno asociado a tumor CA 19-9, los antígenos del melanoma humano MTÉCNICA-l/Melan-A27-35 y gp100, y los epítopos de glicopéptido de pancarcinoma T y Tn (CA), un autoantígeno asociado a tumor de 35 kD en carcinoma de tiroides papilar, el antígeno de adenocarcinoma KH-1 , el antígeno a micobacterial A60, las proteínas de choque de calor (HSP), los productos de oncogen mutante, por ejemplo, p53, ras, y HER-2/neu.

Los polipéptidos de unión de antíqeno terapéuticos que se unen a Moléculas de Inflamación y la Enfermedad Autoinmune En ciertas modalidades, los polipéptidos de unión de antígeno sometidos a los métodos y composiciones de la presente invención se pueden unir a una molécula responsable de la inflamación o trastorno autoinmune. Tales polipéptidos de unión de antígeno se pueden unir a moléculas asociadas con artritis reumatoide, SLE, diabetes melitus, miastenia gravis, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, IBD, psoriasis, pancreatitis, y varias inmunodeficiencias. Otros antígenos blancos incluyen 2-GPI, glicoproteína de 50 kDa, antígeno Ku (p70/p80), o su proteína de subunidad de 80-kd, los autoantígenos nucleares La (SS-B) y Ro (SS-A), antígenos de escleroderma Rpp 30, Rpp 38 o Scl-70, el antígeno de centrosoma PCM-1 , el autoantígeno de polimiositis-escleroderma (PM-Scl), escleroderma (y otras enfermedad autoinmune sistémicas) el autoantígeno CENP-A, U5, una ribonucleoproteína nuclear pequeña (snRNP), la proteína de 100-kd del autoantígeno PM-Scl, las ribonucleoproteínas U3- y Th(7-2) nucleolares, la proteína ribosomal L7, la proteína de 36-kd proveniente del antígeno de matriz nuclear, insulina, proinsulina, GAD65 y GAD67, proteína de choque de calor 65 (hsp65), y el antígeno de célula islote 69 (ICA69), la proteína tirosina fosfatasa relacionada con antígeno de célula islote (PTP), el gangliosido GM2-1 , la descarboxilasa de ácido glutámico (GAD), el antígeno de célula islote (ICA69), Tep69, el epítopo de célula T simple reconocido por las células T de pacientes diabéticos, ICA 512, un antígeno de diabetes tipo I, una tirosina fosfatasa de proteína de célula islote y el antígeno de 37-kDa derivado de éste en la diabetes tipo 1 (que incluye IA-2, IA-2), la proteína de 64 kDa de las células ln-11 1 de células foliculares de tiroides humana que se inmunoprecipita con suero de pacientes con anticuerpos de superficie de célula islote (ICSA). En particular, los antígenos de artritis reumatoide incluyen un antígeno nuclear 45 kDa DEK, en particular artritis reumatoide de ataque juvenil e iridociclitis, glicoproteína-39 de cartílago humano, y autoantígeno en artritis reumatoide, un antígeno de 68 k en artritis reumatoide, colágeno, colágeno tipo II, proteína de enlace de cartílago, ezrina, radixina y moesina, proteína de choque de calor micobactehal 65, peroxidasa de tiroides y el receptor de hormona estimulante de tiroides, la peroxidasa de tiroides proveniente de la enfermedad de tiroides de Grave, un antígeno de 64-kDa asociado con la oftalmopatía asociada a tiroides, el receptor de TSH humano, y la proteína de 64 kDa de las células ln-111 o las células foliculares de tiroides humana que se inmunoprecipitan con los sueros de los pacientes con los anticuerpos de superficie de célula islote.

Los Polipéptidos de Unión de Antíqeno Terapéuticos que se Unen a Alérgenos En ciertas modalidades, los polipéptidos que se unen a antígeno someten sujetos a los métodos y composiciones de la presente invención se pueden unir a un alérgeno o molécula responsable de una enfermedad o afección alérgica. Tales polipéptidos de unión de antígeno se pueden unir a IgE, los receptores IgE, receptor de célula T (TCR), citoquinas, o alérgenos, por ejemplo, de los ácaros de polvo casero, el polen de pasto, el polen de abedul, el polen de altamiza, el polen de avellano, cucaracha, arroz, el polen de árbol de oliva, hongos, mostaza, veneno de abejas, alérgenos a animales, por ejemplo, provenientes de caballo, perro o gato, y similares. Los alérgenos también incluyen alérgenos de látex.

Los Polipéptidos de Unión de Antíqeno Terapéuticos que se unen a Patógenos v a Toxinas Asociadas En ciertas modalidades, los polipéptidos de unión de antígeno sometidos a los métodos y composiciones de la presente invención se pueden unir a un patógeno, por ejemplo, un patógeno bacterial, fúngico, o vírico, o, por ejemplo, una toxina de éstos.

Tales polipéptidos de unión de antígeno se unen a patógenos (o toxinas de éstos) que ¡ncluyen Yersinia, por ejemplo, Yersinia pestis, el agente causante de la plaga, en particular el antígeno V, Bacillus antracis, el agente causante del ántrax, en particular, el antígeno protector ántrax (PA)o factor letal (LF), Stafilococcus, por ejemplo, S. aureus y S. epidermidis, y Streptococcus y/o sus toxinas asociadas, E. coli, por ejemplo, la sepa O-157:H7 que origina la enfermedad de origen en alimentos; la bacteria del Cólera, por ejemplo, el Vibrio colera, o la enterotoxina de este; el Helicobacter pilori, por ejemplo, los antígenos CagA y VacA; la Clamidia; la Neisseria gonorroeae; y Meisseria meningitidis; la Bordetella pertussis; la Brucella abortus; los antígenos meningocóxicos; los antígenos de pneumococo; los monocitógenos de listeria; la Salmonela; la Shigella y el Micobacterio en tuberculosis; los patógenos vírico, por ejemplo, el virus del Hanta, las flavivirus, la influencia; el VIH, por ejemplo, los antígenos Gag, Pol, Vif y Nef; los rotavirus; el virus del herpes simplex tipo l/ll; la Hepatitis A, B, C; o G; rabias; el papilomavirus; el virus de Epstein-Barr (EBV); sarampión; CMV; y parásitos.

Anticuerpos Anti Aß Generalmente, las formulaciones de la presente invención incluyen una variedad de anticuerpos para tratar las enfermedades amiloidogénicas, en particular, la Enfermedad de Alzheimer, mediante péptido Aß blanco.

Los términos "anticuerpo Aß", "anticuerpo anti Aß" y "anti Aß" se utilizan intercambiablemente aquí para referirse a un anticuerpo que se une a uno o más epítopos o determinantes antigénicos de la proteína precursora amiloide humana (APP), la proteína Aß, o ambas. Los epítopos de ejemplos o los determinantes antigénicos se pueden encontrar dentro del APP, pero son preferiblemente encontrados dentro del péptido Aß del APP. Las isoformas múltiples del APP existen, por ejemplo el APP695, el APP751 y el APP770. Los aminoácidos dentro del APP son asignados a números de acuerdo a la secuencia de la isoforma APP770 (ver por ejemplo, GenBank No. de Acceso P05067). Ejemplos de isotipos específicos de APP que son habitualmente conocidos por existir en los humanos son el polipéptido de aminoácido 695 descrito por Kang et. al. (1987) Nature 325:733-736 que se designa como el APP "normal"; el polipéptido del aminoácido 751 descrito por Ponte ef al. (1988) Nature 331 :525-527 (1988) y Tanzi ef al. (1988) Nature 331 :528-530; y el polipéptido de aminoácido 770 descrito por Kitaguchi et. al. (1988) Nature 331 :530-532. Como resultado de procesamiento proteolítico de APP por diferentes enzimas de secretasa in vivo o in situ, el Aß se encuentra tanto en la "forma corta", 40 aminoácidos de longitud, como en la "forma larga", que varían desde 42-43 aminoácidos de longitud. La forma corta, Aß 0, consiste de los residuos 672-71 1 de APP. La forma larga, por ejemplo, Aß42 o Aß43, consiste de los residuos 672-713 o 672-714, respectivamente. Parte de dominio hidrófobo del APP se encuentra en el extremo carboxi del Aß, y puede contar para la capacidad del Aß, a agregarse. Particularmente en el caso de la forma larga. El péptido Aß se puede encontrar en, o purificado de, los fluidos del cuerpo de humanos y otros mamíferos, por ejemplo el fluido cerebroespinal, que incluyen tanto los individuos normales como los individuos que sufren de trastornos amiloidogénicos.

Los términos "proteína ß-amiloide", "péptido ß-amiloide", "ß-amiloide", "Aß" y "péptido Aß" se utilizan intercambiablemente aquí. El péptido Aß (por ejemplo, el Aß39, Aß40, Aß41 , Aß42 y Aß43) es un fragmento interno de 4-kDa de 39-43 aminoácidos de APP. El Aß40, por ejemplo, consiste de los residuos 672-71 1 del APP y el Aß42 consiste de los residuos 672-713 del APP. Los péptidos Aß incluyen los péptidos que resultan del clivaje de secretasa del APP y los péptidos sintéticos que tienen la misma o esencialmente la misma secuencia que los productos de clivaje. Los péptidos Aß se pueden derivar de una variedad de fuentes, por ejemplo, tejidos, líneas celulares, o fluidos de cuerpo (por ejemplo suero o fluido cerebroespinal). Por ejemplo, un Aß se puede derivar de células que expresan APP tales como las células de ovario de hámster Chino (CHO) establemente transfectadas con APP717V_.F, como se describió, por ejemplo, en Walsh et al., (2002), Nature, 416, pp 535-539. Una preparación Aß se puede derivar de fuentes de tejido que utiliza los métodos previamente descritos (ver, por ejemplo, Johnson-Wood et al., (1997), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:1550). Alternativamente, los péptidos Aß se pueden sintetizar utilizando métodos que son bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Fields ef al., Synthetic Péptidos: A User's Guide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p 77). De esta manera, los péptidos se pueden sintetizar utilizando unas técnicas Merrifield automatizadas de síntesis de fase sólida con el grupo a-amino protegido por la química t-Boc o F-moc utilizando aminoácidos protegidos de cadena lateral sobre, por ejemplo, un Sintetizador de Péptido de Applied Biosystems Modelo 430A o 431. Los antígenos de péptido más largo se pueden sintetizar utilizan las técnicas de ADN recombinantes-conocidas. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica el péptido o el péptido de fusión se puede sintetizar o clonar molecularmente e insertar en un vector de expresión adecuado para la transfección y la expresión heteróloga mediante una célula huésped adecuada. El péptido Aß también se refiere a las secuencias Aß que resultan de las mutaciones en la región Aß del gen normal.

El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio o a un antígeno al cual una inmunoglobulina o anticuerpo (o fragmento de unión de antígeno de éste) se une específicamente. Los epítopos de ejemplo o los determinantes antigénicos a los cuales un anticuerpo Aß se une se pueden encontrar dentro de la proteína precursora amiloide humana (APP), pero se encuentran preferiblemente dentro del péptido Aß del APP. Los epítopos de ejemplo o determinantes antigénicos dentro del Aß se localizan entro del N-terminal, la región central, o el terminal C del Aß. Un "epítopo N-terminal", es un epítopo o determinante antigénico localizado dentro del terminal N del péptido Aß. Los epítopos N-terminales de ejemplo incluyen residuos dentro de los aminoácidos 1-10 o 1-12 del Aß, preferiblemente de los residuos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 2-6, 2-7, 3-6, o 3-7 del Aß42. Otros epítopos N-terminales de ejemplo inician en los residuos 1-3 y en los extremos en los residuos 7-11 de Aß. Ejemplos adicionales de epítopos N-terminales incluyen los residuos 2-4, 5, 6, 7 o 8 de Aß, los residuos 3-5, 6, 7, 8 o 9 de Aß, o los residuos 4-7, 8, 9 o 10 de Aß42. Los epítopos "centrales" son epítopos o determinantes antigénicos que comprenden los residuos localizados dentro de la porción central o media del péptido Aß. Los epítopos centrales de ejemplo incluyen residuos dentro de los aminoácidos 13-28 de Aß, preferiblemente de los residuos 14-27, 15-26, 16-25, 17-24, 18-23, o 19-22 de Aß. Otro epítopos centrales de ejemplo incluyen los residuos dentro de los aminoácidos 16-24, 16-23, 16-22, 16-21 , 18-21 , 19-21 , 19-22, 19-23,0 19-24 de Aß. Los epítopos "C-terminales" o los determinantes antigénicos se localizan dentro del terminal C del péptido Aß e incluyen los residuos dentro de los aminoácidos 33-40, 33-41 , o 33-42 de Aß. Los epítopos C-terminales adicionales de ejemplo o los determinantes antigénicos incluyen los residuos 33-40 del Aß.

Cuando se dice que un anticuerpo se une a un epítopo dentro de los residuos especificados, tales como el Aß 3-7, lo que se significa que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que contiene los residuos específicos (es decir, Aß 3-7 en este ejemplo). Tal anticuerpo no contacta necesariamente cada residuo dentro del Aß 3-7. Ni cada sustitución o supresión de aminoácido simple dentro del Aß 3-7 necesariamente afecta significativamente la afinidad de unión. En varias modalidades, un anticuerpo Aß es específico de extremo. Como se utiliza aquí, el término "específico de extremo" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a los residuos N-terminales o C-terminales de un péptido Aß pero que no reconocen los mismos residuos cuando se presentan en las especies Aß más largas que comprenden los residuos o en el APP. En varias modalidades, un anticuerpo Aß es "específico del terminal C". Como se utiliza aquí, el término "específico de terminal C" significa que el anticuerpo reconoce específicamente el terminal C libre de un péptido Aß. Los ejemplos de los anticuerpos Aß específicos de terminal C incluyen aquellos que: reconocen un péptido Aß que termina en un residuo 40 pero que no reconoce un péptido Aß que termina en el residuo 41 , 42, y/o 43; reconoce un péptido Aß que termina en el residuo 42 pero no reconoce un péptido Aß que termina en el residuo 40, 41 , y/o 43; etc.

En una modalidad, el anticuerpo Aß puede ser un anticuerpo 3D6 o una variante de este, o un anticuerpo 10D5 o una variante de este, ambos los cuales se describen en la Publicación de Patente U.S. No. 20030165496A1 , Publicación de Patente U.S. No. 20040087777A1 , Publicación de Patente Internacional No. WO02/46237A3 y Publicación de Patente Internacional No. WO04/080419A2. La descripción de los anticuerpos 3D6 y 10D5 también se puede encontrar, por ejemplo, en la Publicación de Patente Internacional No. WO02/088306A2 y Publicación de Patente Internacional No. WO02/088307A2. Los anticuerpos 3D6 adicionales se describen en la Solicitud de Patente U.S. No. 11/303,478 y la Solicitud Internacional No. PCT/US05/45614. El 3D6 es un anticuerpo monoclonal (mAb) que se une específicamente a un epítopo N-terminal localizado en el péptido ß-amiloide humano, específicamente, los residuos 1-5. Por comparación, el 10D5 en el mAb que se une específicamente a un epítopo N-terminal localizado en el péptido ß-amiloide humano, específicamente, los residuos 3-6. En una modalidad, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 12B4 o una variante de este, como se describió en la Publicación de Patente U.S. No. 20040082762A1 y Publicación de Patente Internacional No. WO03/077858A2. El 12B4 es un mAb que se une específicamente a un epítopo N-terminal localizado en el péptido ß-amiloide, específicamente, los residuos 3-7. En aún una modalidad, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 12A1 1 o una variante de este, como se describió en la Publicación de Patente U.S. No. 200501 18651A1 y Publicación de Patente Internacional No. WO04/10885A2. El 12A11 es un mAb que se une específicamente a un epítopo N-terminal localizado en el péptido ß-amiloide humano, específicamente, los residuos 3-7. En aún una modalidad, el anticuerpo pueden ser un anticuerpo 15C11 o una variante de este, como se describió en la Solicitud de Patente U.S. No. 11/304,986 y la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US05/45515 titulada "Humanized Antibodies that Recognize Beta Amiloid Peptide." El 15C11 es un mAb que se une específicamente a un epítopo central localizado en el péptido ß-amiloide, específicamente, los residuos 19-22. En aún otra modalidad, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 266 como se descrió en la Publicación de Patente U.S. No. 20050249725A1 , y la Publicación de Patente Internacional No. WO01/62801A2. Los anticuerpos designados para unirse específicamente a los epítopos C-terminales en el péptido ß-amiloide humano, para uso en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, 369.2B, como se describió en la Patente U.S. No. 5,786,160.

Los anticuerpos para uso en la presente invención se pueden producir recombinante o sintéticamente. Por ejemplo, el anticuerpo se puede producir mediante un proceso de cultivo de células de ovario de hámster Chino recombinantes (CHO). Además, los anticuerpos con modificaciones menores que retienen la propiedad funcional primaria de la unión del péptido Aß se contempla por medio de la presente invención. En una modalidad particular, el anticuerpo es un anticuerpo 3D6 de péptido anti Aß humanizado que se une selectivamente al péptido Aß. Más específicamente, el anticuerpo 3D6 de péptido anti Aß humanizado se designa para unirse específicamente al epítopo terminal NH2 localizado en el péptido 1-40 o 1-42 ß-amiloide humano encontrado en los depósitos de placa en el cerebro (por ejemplo, en pacientes que sufren de enfermedad de Alzheimer).

La Figura 1 suministra una representación esquemática de la estructura predicha de un anticuerpo 3D6 de péptido Aß humanizado de ejemplo denominado h3D6v2. Las secuencias de los aminoácidos completos de las cadenas ligera y pesada h3D6v2 predichas de las secuencias de ADN de los correspondientes vectores de expresión se muestran en la Figura 2 (donde los residuos son numerados partiendo con el terminal NH2 de las cadenas ligera y pesada como el número de residuo 1). El último residuo de aminoácido codificado por la secuencia de ADN de cadena pesada, Lis449, no ha sido observado en la forma secretada madura del h3D6v2 y, sin querer estar ligado por ninguna teoría particular, este presumiblemente se remueve durante el procesamiento intracelular mediante las proteasas celulares CHO. Por lo tanto, el terminal COOH de la cadena pesada h3D6v2 es opcionalmente Gli448. El procesamiento de la lisina terminal COOH ha sido observado en anticuerpos recombinantes y derivados de plasma y no parece impactar su función (Harris (1995) J. Chromatogr. A. 705:129-134). El h3D6v2 es post-traduccionalmente modificado mediante la adición de glicanos N-ligados a la porción Fc de la cadena pesada, que es conocida por contener un sitio de consenso de N-glicosilación. El sitio de N-glicosilación despliega tres complejos principales de estructuras de oligosacárido neutras biantenarias comúnmente observadas por el sitio de N-glicosilación análogo de las proteínas IgG de mamífero.

Otro anticuerpo de péptido anti Aß humanizado de ejemplo es la versión 1 3D6 humanizada (hu3D6v1 ) que tiene la secuencia establecida en la Figura 2 pero para sustitución D- Y en la posición 1 de la cadena ligera.

En varias modalidades de la presente invención, el anticuerpo anti Aß (por ejemplo, un anticuerpo 3D6 de péptido anti Aß humanizado) está presente desde aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, desde aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 75 mg/ml, desde aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, desde aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 60 mg/ml, desde aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml, desde aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, desde aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, desde aproximadamente 20 mg/ml a 30 mg/ml, o mayor, por ejemplo, hasta aproximadamente 100 mg/ml, a aproximadamente 200 mg/ml, a aproximadamente 500 mg/ml, o a aproximadamente 1000 mg/ml o más. En varias modalidades, el anticuerpo anti Aß está presente en aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 o 25 mg/ml. En una modalidad particular, el anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo 3D6 de péptido anti Aß humanizado) está presente en aproximadamente 17 mg/ml. En una modalidad particular, el anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo 3D6 de péptido anti Aß humanizado) está presente en aproximadamente 20 mg/ml. En una modalidad particular, el anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo 3D6 de péptido anti Aß humanizado) en aproximadamente 30 mg/ml. Los rangos intermedios a las concentraciones anteriormente citadas, por ejemplo, aproximadamente 12 mg/ml a aproximadamente 17 mg/ml, también pretenden ser parte de esta invención. Por ejemplo, los rangos de valores que utilizan una combinación de cualquiera de los valores citados anteriores como límites superiores y/o inferiores pretenden estar incluidos.

Excipientes En varias modalidades, la presente invención suministra una formulación que puede incluir varios excipientes, que incluyen, pero no está limitada a, amortiguador, antioxidante, un agente de tonicidad, y un estabilizador. Además, las formulaciones pueden contener un agente para ajuste de pH (por ejemplo, HCl) y un diluyente (por ejemplo, agua). En parte, los excipientes sirven para, en parte, mantener la estabilidad y la actividad biológica del anticuerpo (por ejemplo, al mantener la conformación adecuada de la proteína), y/o mantener el pH.

Agente Amortiguante En varios aspectos de la presente invención, la formulación incluye un agente amortiguante (amortiguador). El amortiguador puede servir para mejorar la isotonicidad y estabilidad química de la formulación. Además, el amortiguador sirve para mantener el pH fisiológicamente adecuado (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6.0). En general, la formulación debe tener un pH fisiológicamente adecuado. En varias modalidades de la presente invención, la formulación debe tener un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 o desde aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5. En una modalidad particular, la formulación tiene un pH de aproximadamente 6. Los rangos intermedios a los niveles de pH citados anteriormente, por ejemplo, aproximadamente pH 5.2 a aproximadamente pH 6.3 (por ejemplo, pH 6.2), también pretenden ser parte de esta invención. Por ejemplo, los rangos de valores que utilizan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente citados como límite superior y/o inferior pretenden estar incluidos. El pH se puede ajustar según sea necesario mediante las técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, se puede agregar HCl según sea necesario para ajustar el pH a los niveles deseados o a diferentes formas de histidina se pueden agregar según sea necesario para ajustar el pH en los niveles deseados.

El amortiguador puede incluir, pero no está limitado a, succinato (sodio o fosfato), histidina, fosfato (sodio o potasio), Tris (tris (hidroximetil) aminometano), dietanolamina, citrato, otros ácidos orgánicos y mezclas de éstos. En una modalidad particular, el amortiguador es histidina (por ejemplo, L-histidina). En otra modalidad particular, el amortiguador es succinato. En otra modalidad, la formulación incluye un aminoácido tal como histidina que está presente en una cantidad suficiente para mantener la formulación en un pH fisiológicamente adecuado. La histidina es un aminoácido de ejemplo que tiene las capacidades de amortiguamiento en el rango de pH fisiológico. La histidina deriva su capacidad de amortiguamiento de su grupo imidazol. En una modalidad de ejemplo, el amortiguador es L-histidina (base) (por ejemplo C6H9N3O2, FW: 155.15). En otra modalidad, el amortiguador es monohidrato de monocloruro de L-histidina (por ejemplo C6H9N3O2.HCI.H2O, FW: 209.63). En otra modalidad de ejemplo, el amortiguador es una mezcla de L-histidina (base) y Monohidrato de monocloruro de L-histidina.

En una modalidad, el amortiguador (por ejemplo, L-histidina o succinato) está presente desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 50 mM, desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 40 mM, desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 25 mM, desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 30 mM, desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM, o desde aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, preferiblemente aproximadamente 5 mM o 10 mM. En varias modalidades, el amortiguador puede estar presente en aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, o 15 mM. En una modalidad particular, el amortiguador está presente en aproximadamente 10 mM. Los rangos intermedios a las concentraciones anteriormente citadas, por ejemplo, aproximadamente 12 mM a aproximadamente 17 mM, también pretenden ser parte de esta invención. Por ejemplo, los rangos de valores que utilizan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente citados como límites superior y/o inferior pretenden estar incluidos. En ciertas modalidades, el amortiguador está presente en una cantidad suficiente para mantener el pH fisiológicamente adecuado.

Agente de Tonicidad En varios aspectos de la presente invención, la formulación incluye un agente de tonicidad. En parte, el agente de tonicidad contribuye a mantener la isotonicidad de la formulación, y a mantener niveles de proteína. En parte, el agente de tonicidad contribuye a preservar el nivel, tasa, o proporción del polipéptido terapéuticamente activo presente en la formulación. Como se utiliza aquí, el término "tonicidad" se refiere al comportamiento de los componentes biológicos en un ambiente solución de fluido. Las soluciones isotónicas poseen la misma presión osmótica que el plasma de la sangre, y así se pueden infundir intravenosamente a un sujeto sin cambiar la presión osmótica del plasma de la sangre del sujeto. De hecho, en una modalidad de acuerdo con la invención, el agente de tonicidad está presente en una cantidad suficiente para hacer la formulación adecuada para infusión intravenosa. A menudo, el agente de tonicidad sirve como un agente de masa también. Como tal, el agente puede permitirle a la proteína solucionar varias tensiones tales como el congelamiento y el corte.

El agente de tonicidad puede incluir, pero es no está limitado a, CaCI2, NaCI, MgCI2, lactosa, sorbitol, sucrosa, manitol, trehalosa, rafinosa, polietilenglicol, hidroxietil almidón, glicina y mezclas de éstos. En una modalidad particular, el agente de tonicidad es manitol (por ejemplo, D-manitol, por ejemplo, C6H?4O6, FW: 182.17).

En una modalidad, el agente de tonicidad (por ejemplo, manitol) está presente en aproximadamente 2% a aproximadamente 6% p/v, o aproximadamente 3% a aproximadamente 5% p/v. En otra modalidad, el agente de tonicidad está presente en aproximadamente 3.5% a aproximadamente 4.5% p/v. En otra modalidad, el agente de tonicidad es porcentual a aproximadamente 20mg/ml a aproximadamente 60 mg/ml, a aproximadamente 30 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, o aproximadamente 35 mg/ml a aproximadamente 45 mg/ml. En una modalidad particular, el agente de tonicidad está presente en aproximadamente 4% p/v o en aproximadamente 40 mg/ml. En otra modalidad particular, el agente de tonicidad está presente en aproximadamente 6% p/v. En aún otra modalidad particular, el agente de tonicidad está presente en aproximadamente 10% p/v.

Los rangos intermedios a las concentraciones anteriormente citadas, por ejemplo, aproximadamente 3.2% a aproximadamente 4.3% p/v o aproximadamente 32 a aproximadamente 43 mg/ml, también pretenden ser parte de esta invención. Por ejemplo, los rangos de valores que utilizan una combinación de cualquiera de los valores citados anteriormente como límites superior y/o inferior pretenden estar incluidos. El agente de tonicidad debe estar presente en una cantidad suficiente con el fin de mantener la tonicidad de la formulación.

Antioxidante En varios aspectos de la presente invención, la formulación incluye un antioxidante para, en parte, preservar la formulación (por ejemplo, al prevenir la oxidación).

El antioxidante puede incluir, pero es no está limitado a, GLA (ácido gamma-linolénico)-ácido lipóico, DHA (ácido docosahexaenóico)-ácido lipóico, GLA-tocoferol, di-GLA-ácido 3,3'-tiodipropiónico y en general cualquiera de, por ejemplo, GLA, DGLA (ácido dihomo-gamma-linolénico), AA (ácido araquidónico), SA (ácido salicílico), EPA (ácido eicosapentaenóico) o DHA (ácido docosahexaenóico) con cualquier antioxidante natural o sintético con el cual ellos puedan estar químicamente ligados. Estos incluyen antioxidantes fenólicos (por ejemplo, eugenol, ácido carnósico, ácido caféico, BHT (hidroxianisol butilado), ácido gálico, tocoferoles, tocotrienoles y antioxidantes flavenóides (tales como miricetina y fisetina)), polienos (por ejemplo, ácido retinóico), esteróles insaturados (por ejemplo, ?5-avenosterol), compuestos de organosulfuro (por ejemplo, alicina), terpenos (por ejemplo, geraniol, ácido abiético) y antioxidantes de aminoácido (por ejemplo, metionina, cisteína, camosina). En una modalidad, el antioxidante es ácido ascórbico. En una modalidad particular, el antioxidante es metionina, o un análogo de este, por ejemplo, selenometionina, ácido hidroxi metil butanéico, etionina, o trifluorometionina.

En una modalidad, el antioxidante (por ejemplo, una metionina tal como L-metionina, por ejemplo CH3SCH2CH2CH(NH2)CO2H, FW=149.21 ) está presente desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 50 mM, desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 40 mM, desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 30 mM, desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM, o desde aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM. En varias modalidades, el antioxidante puede estar presente en aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 M, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, o 15 mM. En una modalidad particular, el antioxidante está presente en aproximadamente 10 mM. En una modalidad particular, el antioxidante está presente en aproximadamente 15 mM. Los rangos intermedios a las concentraciones anteriormente citadas, por ejemplo, a aproximadamente 12 mM a aproximadamente 17 mM, también pretenden ser parte de esta invención. Por ejemplo, los rangos de valores que utilizan una combinación de cualquiera de los valores anteriores citados como límites superior y/o inferior pretenden estar incluidos. En ciertas modalidades, el antioxidante debe estar presente en una cantidad suficiente con fin de preservar la formulación, en parte, al prevenir la oxidación.

Estabilizador En varios aspectos de la presente invención, la formulación incluye un estabilizador, también conocido como tensoactivo. Los estabilizadores son compuestos químicos específicos que interactúan y estabilizan las moléculas biológicas y/o los excipientes farmacéuticos generales en una formulación. En ciertas modalidades, los estabilizadores se pueden utilizar en conjunto con un almacenamiento a temperatura inferior. Los estabilizadores generalmente protegen la proteína de la tensión inducida por la interfaz aire/solución y la tensión inducida por solución/superficie, que a menudo resulta en agregación de la proteína.

El estabilizador puede incluir, pero es no está limitado a, glicerina, polisorbatos tales como polisorbato 80, ácidos dicarboxílicos, ácido oxálico, ácido succínico, ácido adípico, ácido fumárico, ácidos itálicos, y combinaciones de éstos. En una modalidad particular, el estabilizador es polisorbato 80.

En una modalidad, el estabilizador (por ejemplo, polisorbato 80) está presente entre aproximadamente 0.001% p/v a aproximadamente 0.01% p/v, entre aproximadamente 0.001% p/v a aproximadamente 0.009% p/v, o entre aproximadamente 0.003% p/v a aproximadamente 0.007% p/v. En una modalidad particular, el estabilizador está presente en aproximadamente .005% p/v de la formulación. En una modalidad particular, el estabilizador está presente en aproximadamente 0.01% p/v. Los rangos intermedios a las concentraciones anteriormente citadas, por ejemplo, aproximadamente 0.002% p/v a aproximadamente 0.006% p/v, también pretenden ser parte de esta invención. Por ejemplo, los rangos de valores que utilizan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente citados como límites superior y/o inferior pretenden estar incluidos. El estabilizador debe estar presente en una cantidad suficiente como para estabilizar el polipéptido de unión Aß (por ejemplo, anticuerpo anti Aß).

Otros vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores tales como aquellos descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) pueden estar incluidos en la formulación siempre y cuando ellos no afecten adversamente las características deseadas de la formulación. En una modalidad particular, la formulación está sustancialmente libre de preservativos, aunque, en modalidades alternativas, los preservativos se pueden agregar según sea necesario. Por ejemplo, los crioprotectores o lioprotectores pueden estar incluidos, por ejemplo, si la formulación es liofilizada.

En varios aspectos de la presente invención, las formulaciones opcionalmente ¡ncluyen algunas o todas las clases de excipientes descritos anteriormente. En un aspecto, las formulaciones de la presente invención incluyen un polipéptido de unión de antígeno (por ejemplo, anticuerpo anti Aß, manitol e histidina. En modalidades particulares, las formulaciones pueden incluir un antioxidante tal como metionina, y/o un estabilizador tal como polisorbato 80. En ciertas modalidades, las formulaciones tienen un pH de aproximadamente 6. En otro aspecto, la formulación incluye un polipéptido de unión de antígeno (por ejemplo, un anticuerpo anti Aß), manitol, histidina y metionina. En aún otro aspecto, la formulación incluye un polipéptido de unión Aß (por ejemplo, un anticuerpo anti Aß), manitol, histidina, metionina y polisorbato 80. En un aspecto particular de la invención, la formulación incluye aproximadamente 20 mg/ml un polipéptido de unión Aß (por ejemplo, un anticuerpo anti Aß), 10 mM de histidina, 10 mM de metionina, 4% de manitol y tiene un pH de aproximadamente 6. En otro aspecto de la invención, la formulación incluye aproximadamente 20 mg/ml de polipéptido de unión Aß (por ejemplo, anticuerpo anti Aß), 10 mM de histidina, 10 mM de metionina, 4% p/v de manitol, 0.01 % p/v de polisorbato 80 y tien un pH de aproximadamente 6. En otro aspecto de la invención, la formulación incluye aproximadamente 20 mg/ml de polipéptido de unión Aß (por ejemplo, anticuerpo anti Aß), 10 mM de histidina, 10 de mM metionina, 4% p/v de manitol, 0.005% p/v de polisorbato 80 y tiene un pH de aproximadamente 6.

Las modalidades de ejemplos de la presente invención suministran preparaciones concentradas de un polipéptido de unión de antígeno (por ejemplo, anticuerpo anti Aß), a menudo útil como un producto de droga en masa. Adicionalmente, las modalidades de ejemplo de la presente invención son estables al congelamiento, liofilización y/o reconstitución. Más aún, las modalidades de ejemplo de la presente invención son estables durantes periodos prolongados de tiempo. Por ejemplo, las formulaciones de la presente invención son estables durante al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 meses. En modalidades particulares, las formulaciones de la presente invención son estables durante al menos aproximadamente 12 meses, durante al menos aproximadamente 18 meses, durante al menos aproximadamente 24 meses, o durante al menos aproximadamente 30 meses.

De acuerdo con la invención, la formulación se puede almacenar a temperaturas desde aproximadamente -80° C a aproximadamente 40° C, desde aproximadamente 0° C a aproximadamente 25° C, desde aproximadamente 0° C a aproximadamente 15° C, o desde aproximadamente 0° C a aproximadamente 10° C, preferiblemente desde aproximadamente 2° C a aproximadamente 8° C. En varias modalidades, la formulación se puede almacenar en aproximadamente 0° C, 1° C, 2° C, 3° C, 4° C, 5° C, 6° C, 7° C, 8° C, 9° C o 10° C. En una modalidad particular, la formulación se almacena a aproximadamente 5° C. En general, la formulación es estable y retiene la actividad biológica en éstos rangos. Los rangos intermedios a las temperaturas citadas anteriormente, por ejemplo, desde aproximadamente 2° C a aproximadamente 17° C, también pretenden ser parte de esta ¡nvención. Por ejemplo, los rangos de valores que utilizan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente citados como límites superior y/o inferior pretenden estar incluidos.

Las formulaciones de la presente invención son adecuadas para el suministro mediante una variedad de técnicas. En ciertas modalidades, la formulación se administra parenteralmente, tal como intravenosamente o intramuscularmente. Adicionalmente, uno puede apuntar al suministro de la formulación al cerebro (por ejemplo, de tal forma que el anticuerpo pueda cruzar la barrera sangre cerebro) o el fluido de la columna. En una modalidad particular, la formulación se administra intravenosamente.

Las dosis efectivas de las formulaciones de la presente invención varían dependiendo de muchos diferentes factores, que incluyen medios para administración, sitio blanco, estado fisiológico del paciente, sea el paciente humano o animal, otras medicaciones administradas, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Usualmente, el paciente es un humano pero un mamífero no humano que incluye mamíferos transgénicos también se puede tratar. Las dosis de tratamiento necesitan se tituladas para optimizar la seguridad y eficacia.

Para inmunización pasiva con un anticuerpo, los rangos de dosis de ejemplo desde aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente desde aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 0.15 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg, preferiblemente aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg de peso del cuerpo del huésped. Por ejemplo las dosis pueden ser 1 mg/kg de peso de cuerpo o 20 mg/kg de peso de cuerpo o dentro del rango de 1-20 mg/kg, preferiblemente aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, o aproximadamente 15 mg/kg. En otras modalidades de ejemplos, las dosis pueden ser al menos 0.5 mg/kg (por ejemplo 0.5, 0.6, 0.7, 0.75, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.25, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.75, 1.8, 1.9, o 2.0 mg/kg), al menos 0.75 mg/kg, al menos 1.25 mg/kg, al menos 1.5mg/kg, al menos 1.75 mg/kg, o al menos 2 mg/kg. A los sujetos les pueden administrar tales dosis diariamente, o alternativamente diariamente, semanalmente de acuerdo a cualquier otra programación determina por análisis empírico. Un tratamiento de ejemplo indica la administración de múltiples dosis durante un periodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Las regiones de tratamiento de ejemplo adicionales indican administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los programas de dosis de ejemplo incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos 60 mg/kg semanalmente. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se administran simultáneamente, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado cae dentro de los rangos indicados.

El anticuerpo es usualmente administrado en ocasiones múltiples, Los intervalos entre las dosis múltiples puede ser semanalmente, mensual o anual. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indican mediante la medición de los niveles de sangre del anticuerpo a Aß en el paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para logra una concentración de anticuerpo del plasma de 1-1000 µg/ml y en algunos métodos 25-300 µg/ml. Alternativamente, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere administración de menos frecuentes. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguido por anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos, y los anticuerpos no humanos.

La dosis y la frecuencia de administración puede variar dependiendo los entrenamientos profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las formulaciones que contienen los anticuerpos presentes o un cóctel de éstos se administran a un paciente ya no en estado de enfermedad para mejorar la resistencia del paciente. Tal cantidad se define como "una dosis profiláctica efectiva". En este uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado del paciente de la salud y la inmunidad general, pero generalmente varían desde 0.1 a 25 mg por dosis, especialmente 0.5 a 2.5 mg por dosis. Una dosis relativamente baja se administra a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo largo de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento durante el resto de sus vidas.

En aplicaciones terapéuticas, una dosis relativamente alta (por ejemplo, desde aproximadamente 0.5 o 1 a aproximadamente 200 mg/kg de anticuerpo por dosis (por ejemplo 0.5, 1 , 1.5, 2, 5, 10, 20, 25, 50, o 100 mg/kg), con las dosis desde 5 a 25 mg/kg siendo la más comúnmente utilizada) a intervalos relativamente cortos se requiere algunas veces hasta que se reduzca la progresión de la enfermedad o se termine, y preferiblemente hasta que el paciente muestre el mejoramiento parcial o completo de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, el paciente le puede ser administrado un régimen profiláctico.

Puede ser útil suministrar las formulaciones de la invención en forma de unidad de dosis para la fácil administración y la uniformidad de la dosificación. Las formulaciones de la invención se pueden presentar en cápsulas, ampollas o en recipientes multi-dosis. La forma de dosis unitaria puede comprende cualquier formulación descrita aquí que incluye suspensiones, soluciones o emulsiones del ingrediente activo junto con agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. En una modalidad de ejemplo, la unidad de dosis farmacéutica se puede agregar a o reconstituir en una bolsa de goteo intravenoso (por ejemplo una bolsa de goteo de 50 ml, 100 ml, 250 ml, o 500 ml) con un diluyente adecuado, por ejemplo, una solución de agua o salina libre de pirógeno estéril, antes de la administración al paciente, por ejemplo, mediante infusión intravenosa. Algunas formas de dosis unitarias farmacéuticas pueden requerir reconstitución con un diluyente adecuado antes de la adición a una bolsa de goteo intravenoso, particularmente formas liofilizadas. En modalidades de ejemplo, la forma de dosis de la unidad farmacéutica es un recipiente que contiene una formulación descrita aquí. El término "recipiente" se refiere a algo, por ejemplo, un soporte, receptáculo, o recipiente, en el cual un objeto o líquido se puede colocar o contener, por ejemplo, para almacenamiento. Por ejemplo, le recipiente puede ser un frasco de tubería tipo I, de vidrio de 10 mL. Generalmente, el recipiente debe mantener la esterilidad y estabilidad de la formulación. Por ejemplo, el recipiente puede ser cerrado con un tapón de suero. Adicionalmente, en varias modalidades, el recipiente se debe diseñar con el fin de permitir el retiro de 100 mg de la formulación o ingrediente activo (por ejemplo, para uso simple). Alternativamente, el recipiente puede ser adecuado para cantidades mayores de formulación o ingrediente activo, por ejemplo, desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 5000 mg, desde aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1000 mg, y desde aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 40 mg a aproximadamente 250 mg, aproximadamente 60 mg a aproximadamente 80 mg, aproximadamente 80 mg a aproximadamente 120 mg, aproximadamente 120 mg a aproximadamente 160 mg, o rangos o intervalos de este, por ejemplo, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 200 mg. Los rangos intermedios a las cantidades anteriormente citadas, por ejemplo, desde aproximadamente 25 mg a aproximadamente 195 mg, también pretenden ser parte de esta invención. Por ejemplo, los rangos de valores que utilizan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente citados como límites superior y/o inferior pretenden estar incluidos. En una modalidad particular, la formulación a menudo es abastecida con un líquido en forma de dosificación unitaria.

En otro aspecto, la presente invención suministra un kit que incluye una forma unitaria de dosificación farmacéutica (por ejemplo, un recipiente con una formulación descrita aquí), e instrucciones para uso. De acuerdo con esto, el recipiente y el kit se pueden diseñar para suministrar una formulación suficiente para usos múltiples. En varias modalidades, el kit puede incluir además un diluyente. El diluyente puede incluir excipientes, separados o combinados. Por ejemplo, el díluyente puede incluir un modificador de tonicidad tal como manitol, un agente amortiguante tal como histidina, un estabilizador tal como polisorbato 80, un antioxidante tal como metionina, y/o combinaciones de éstos. El diluyente puede contener otros excipientes, por ejemplo, lioprotectores, según se considera necesario por un experto en la técnica.

Las modalidades de uso adicionales de la invención se establecen en la sección de esta aplicación titulada "Resumen de la invención".

Esta invención se ilustra además en los siguientes ejemplos que no deben ser considerados como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud, así como también las figuras, se incorporan aquí como referencia.

EJEMPLOS En todos los ejemplos, los siguientes materiales y métodos fueron utilizados a menos que se establezca otra cosa.

Materiales y Métodos En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpo), y técnicas estándar de separación de polipéptido. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodys: A Laboratory Manual, Harlow ef al., C.S.H.L Press, Pub (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel ef al., John Wiley & Sons (1992).

EJEMPLO 1 CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE UN POLIPEPTIDO TERAPÉUTICO En este ejemplo, se describe la clonación y expresión de un polipéptido terapéutico, en particular, un polipéptido de unión de antígeno, esto es, un anticuerpo capaz de unirse a Aß.

Un anticuerpo de ejemplo para la formulación de acuerdo con los métodos de presente invención es el 3D6. El 3D6 mAb es específico para el N-terminal del Aß y se ha mostrado por mediar la fagocitosis (por ejemplo, inducir fagocitosis) de la placa amiloide 3D6 no reconoce el APP secretado o el APP de longitud completa, si no que detecta solamente las especies Aß con un ácido aspártico amino-terminal. Por lo tato, el 3D6 es un anticuerpo específico de extremo. La línea celular designada RB96 3D6.32.2.4 que produce el anticuerpo 3D6 tiene un número de acceso ATCC PTA-5130, que ha sido depositado en Abril 8, 2003. La clonación, caracterización y humanización del anticuerpo 3D6 se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente U.S. No. 20030165496 A1.

En resumen, la humanización del anticuerpo monoclonal de murino del péptido anti Aß péptido (designado como m3D6) se llevó a cabo al aislar las secuencias de ADN para las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada (VL y VH) mediante reacción de cadena de polimerasa de transcripción (RT-PCR).

Con base en las secuencias de ADN m3D6 vL y vH determinadas, se identificaron las regiones de estructura humana homologas. Para asegurar que el anticuerpo humanizado retuvo la capacidad para interactuar con el antígeno de péptido Aß, los residuos de estructura vL y vH se retuvieron en la secuencia 3D6 humanizada para preservar la estructura total de las regiones de dominio constante (CDR) en el contexto de las secuencias de cadena ligera kapa y pesada lgG1 humanas. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias VL y VH 3D6 humanizadas identificadas mediante este proceso (que incluyen la secuencia de señal 5' y la secuencia del donante del empalme de intrón 3') se fueron generados al hibridizar oligonucleótidos de ADN traslapantes sintetizados seguidos por reacciones de llenado y polimerasa de ADN. La integridad de cada una de las secuencias de la región variable humanizada se identifica mediante la secuenciación de ADN. La figura 1 describe una representación esquemática de la estructura predicha de un anticuerpo 3D6 de péptido anti-Aß humanizado de ejemplo denominado h3D6v2. La figura 2 identifica las secuencias de aminoácido completas de las cadenas ligera y pesada h3D6v2.

El anticuerpo 3D6 humanizado se expresa mediante la transfección de la línea celular de huésped de Ovario de Hámster Chino (CHO) con los plásmidos de expresión que codifican la cadena ligera del anticuerpo antí-Aß y los genes de cadena pesada. Las células CHO que expresan el anticuerpo se aislaron utilizando procedimientos de selección de droga/amplificación de gen con base en metotrexato estándar. Una línea celular de clonación de CHO que exhibe la productividad deseada y los genotipos de crecimiento se selecciona y utiliza para establecer una línea celular que expresa anticuerpo utilizando un medio químicamente definido libre de los componentes derivados animales o humanos.

EJEMPLO 2 PREPARACIÓN DE UN POLIPEPTIDO TERAPÉUTICO QUE UTILIZA BIRREACTOR A GRAN ESCALA En este ejemplo, se describe la preparación de polipéptido terapéutico, en particular un anticuerpo anti-Aß.

El proceso de fabricación del polipéptido inicia con el descongelamiento de un cultivo de partida de células clónales que expresan establemente el anticuerpo anti-Aß. Las células fueron cultivadas utilizando un medio químicamente definido que no contiene proteínas derivadas de animal o humano. Los cultivos fueron entonces expandidos y utilizados para inocular un biorreactor semilla, el cual a su vez se utiliza para inocular múltiples sitios de biorreactor de producción. La producción del biorreactor se opera en un modo de alimentación de tanda. Al final del ciclo de producción la cosecha del medio condicionado se clarifica mediante microfiltración en la preparación de un procesamiento corriente abajo adicional.

El proceso de purificación consiste de las etapas cromatográficas estándar seguidas por filtración. El anticuerpo purificado se concentra mediante ultrafiltración y se diafiltra en polisorbato 80 ausente del amortiguador de formulación. Opcionalmente, el polisorbato 80 (derivado vegetal) se agrega al grupo de retención de ultrafiltracion/diafiltración, seguido por la filtración de retención bacteriana. La sustancia de drogas se almacena congelada a -80° C y se mantiene para la elaboración adicional en un producto de droga, que incluye las formulaciones líquidas estabilizadas descritas aquí.

EJEMPLO 3 PREPARACIÓN DE UNA FORMULACIÓN DE POLIPEPTIDO LIQUIDA ESTABILIZADA En este ejemplo, se describe una composición típica de una formulación de polipéptido líquida estabilizada.

Dos tandas de producto de droga de anticuerpo se elaboran. Una tanda inicial se elabora al componer la sustancia de droga en una formulación libre de proteína animal y humana que contiene 20 mg de la sustancia activa de anticuerpo anti-Aß por mL, 10 mM de histidina, 10 mM de metionina, 4% de manitol, 0.005% de polisorbato 80, pH 6.0. El producto de droga fue asépticamente llenado en frascos, a 100 mg de sustancia activa/frasco de anticuerpo anti-Aß. El frasco de producto de droga terminado no contenía preservativos y se destina solamente a un uso simple.

Una segunda tanda de producto de droga se elabora mediante un método similar utilizando un amortiguador de formulación sin polisorbato 80.

EJEMPLO 4 ANÁLISIS DE FORMULACIONES DE POLIPEPTIDOS LÍQUIDOS ESTABILIZADOS En este ejemplo, se describe el análisis de varias formulaciones de polipéptido líquido estabilizadas.

La estabilidad, y en particular, la integridad físico química (tal como la agregación y desamidación) de la formulación fueron evaluadas mediante los siguientes métodos bien conocidos en la técnica: aparición; pH; concentración de proteína (A280); ELISA, en parte como ensayo de bioactividad; electrofóresis de gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), en parte como un ensayo de agregación; cromatografía líquida de alto desempeño de exclusión de tamaño (SEC-HPLC), en parte; cromatografía líquida de alto desempeño de intercambio de cationes (CEX-HPLC), en parte, como un ensayo de amidación y estabilidad en general; y un mapeo de péptido. Estos métodos evaluaron la recuperación y la integridad de la proteína bajo las condiciones de ensayo a varias temperaturas.

El análisis de aparición de las formulaciones se conduce con el fin de determinar la calidad de las formulaciones en varios puntos de tiempo. El análisis se conduce con base en la inspección visual para claridad, color y la presencia de partículas. Por ejemplo, el grado de opalescencia se analiza en términos de las suspensiones de referencia. El análisis de aparición de las formulaciones hecho con y sin polisorbato 80 de acuerdo con la presente invención demostró que ambas formulaciones fueron aceptables cuando se almacenaron cada una a -80° C, 5° C, 25° C, y 40° C en cada uno de los siguientes puntos de tiempo: inicial, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, y 12 meses.

El análisis de pH busca determinar el mantenimiento del pH de la formulación dentro de un rango aceptable de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5. El análisis de pH de las formulaciones hecho con y sin el polisorbato 80 de acuerdo con la presente invención demuestra que ambas formulaciones eran aceptables cuando se almacenaban cada una a -80° C, 5° C, 25° C, y 40° C en cada uno de los siguientes puntos de tiempo: inicial, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, y 12 meses. En general, el pH nunca varía por debajo de 5.8 o por encima de 6.2.

El análisis de concentración de proteína mediante ensayos A280 se desarrolla para determinar el mantenimiento de la concentración de la proteína de formulación dentro de un rango aceptable de aproximadamente 17 mg/ml a aproximadamente 23 mg/ml. El análisis de concentración de proteína de la formulación hecho con y sin polisorbato 80 de acuerdo con la presente invención demostró que ambas formulaciones fueron generalmente aceptables cuando se almacenaron cada una a -80° C, 5° C, 25° C, y 40° C en cada uno de los siguientes puntos de tiempo: inicial, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, y 12 meses. Con la excepción de las concentraciones de proteína que varía ligeramente por encima de 23 mg/ml para la formulación sin el polisorbato 80 cuando se almacena a 5° C, 25° C, y 40° C en los puntos de tiempo de 3 meses, la concentración de proteína permanece sin embargo dentro de rangos aceptables. De cuerdo con esto, el análisis de concentración de proteína no demuestra pérdida detectable de proteína que ocurra a unas condiciones aceleradas, particularmente para las formulaciones con polisorbato 80. Más aún, la concentración de proteína generalmente falla en demostrar un tiempo o cambio dependiente de temperatura significativo subsecuente al punto de tiempo inicial.

El mantenimiento de la actividad biológica se ensaya, en parte, mediante técnicas ELISA. La actividad biológica se analiza como BU/mg con una actividad aceptable que > 2500 BU/mg o 50% (es decir, 5000 BU/mg que igual al 100%). El análisis ELISA de las formulaciones hecha con o sin polisorbato 80 de acuerdo con la presente invención demostró que ambas formulaciones fueron generalmente aceptables cuando se almacenaron cada una a -80° C, 5° C, 25° C, y 40° C en cada uno de los siguientes puntos de tiempo: inicial, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, y 12 meses. Con la excepción de la actividad biológica que varía ligeramente por debajo del 50% en el punto de tiempo de los 12 meses para ambas formulaciones cuando se almacena a 40° C, la actividad biológica permanece sin embargo dentro de rangos aceptables.

El análisis SEC-HPLC se conduce como un ensayo de agregación, pureza y estabilidad en general. El SEC-HPLC corre bajo condiciones que utilizan cromatografía de fase móvil con un amortiguador dibásico de fosfato de sodio indicando que la formulación era aceptable si el análisis SEC-HPLC identificaba > al 90% del monómero IgG, comparado con el porcentaje del producto de alto peso molecular y el producto de bajo peso molecular. El análisis SEC-HPLC de las formulaciones hecho con y sin el polisorbato 80 de acuerdo con la presente invención demostró que ambas formulaciones fueron generalmente aceptables cuando se almacenaron cada una a -80° C, 5° C, 25° C, y 40° C en cada uno de los siguientes puntos de tiempo: inicial, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, y 12 meses. Con la excepción del porcentaje de monómero que varía por debajo del 90% para ambas formulaciones cuando se almacena a 40° C en cada punto de tiempo y después de 6 meses (donde se identificó un análisis mayor de al menos el 10% del producto de bajo peso molecular para ambas formulaciones en cada punto de tiempo), el monómero porcentual estuvo sin embargo dentro de un rango aceptable. El análisis SEC-HPLC demostró en general que aunque los perfiles de alto peso molecular y bajo peso molecular fueron diferentes durante el tiempo en las muestras con y sin polisorbato, la forma monomérica del anticuerpo generalmente permaneció constante por ejemplo en el punto de tiempo de 12 meses, cuando la formulación se almacenó a 5° C.

El análisis CEX-HPLC se condujo como un ensayo de aminación y estabilidad en general. El CEX-HPLC corre bajo condiciones que utilizan cromatografía de fase móvil con un amortiguador de NaCI produciendo un perfil de dilución y los tiempos de retención de picos predominantes que fueron analizados por ser comparables o no comparables con los perfiles estándares de referencia. El análisis CEX-HPLC de las formulaciones hecho con y sin el polisorbato 80 de acuerdo con la presente invención demostró que ambas formulaciones fueron generalmente aceptables cuando se almacenaron cada una a -80° C, 5° C, 25° C, y 40° C en cada uno de los siguientes puntos de tiempo: inicial, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, y 12 meses. Con la excepción del perfil de elusión y el tiempo de retención de los picos predominantes que no son comparables para ambas formulaciones cuando se almacenan a 40° C en cada punto de tiempo en y después de 3 meses, los picos predominantes fueron sin embargo comparables con los picos de referencia.

En general, el análisis de las formulaciones con polisorbato 80 almacenado a 5° C permitió las siguientes conclusiones particularmente importantes: 1) opalescencia, pH, ELISA, CEX-HPLC, SEC-HPLC y análisis SDS-PAGE todos mostraron cambios mínimos en la formulación durante los 9 meses; 2) formulaciones almacenadas a 5° C aparecían más como las muestras de referencia durante los 9 meses que las muestras aceleradas; 3) el mapeo de péptido mostró cambios a 5° C; y 4) los datos de la tendencia del SEC-HPLC a 5° C predijeron al menos 17.2 meses de estabilidad (ver figura 6), sin embargo, luego de remover la columna, la variabilidad del instrumento y el amortiguador, los datos permitieron una producción mayor de 30 meses de estabilidad (ver figura 7). Adicionalmente, las mezclas aceleradas con polisorbato 80 almacenadas a 25° C pasaron todas las especificaciones a los 9 meses (figura 4).

Más aún, el análisis de la formulaciones sin polisorbato 80 almacenado a 5° C permitieron las siguientes conclusiones particularmente importantes: 1) opalescencia, pH, y análisis ELISA todos mostraron cambios mínimos en la formulación durante los 9 meses; 2) los resultados del CEX-HPLC y SDS PAGE mostraron hallazgos comparables a las muestras de referencia o el control a -80° C a los 9 meses; 3) el análisis SEC-HPLC mostró cambios menores durante los 9 meses aunque los cambios fueron más pronunciados a temperaturas aceleradas; y 4) los datos de la tendencia del SEC-HPLC predijeron al menos 18 meses de estabilidad, aún con temas de variabilidad de ensayo (ver figura 8).

Las figuras 3-5 son descripciones gráficas de las predicciones de vida de almacenamiento para las formulaciones (con y sin PS80), hecha de acuerdo con presente invención y almacenada a 5° C, 25° C, y 40° C, respectivamente. En general, las figuras 3-5 indican que el almacenamiento de las formulaciones de la presente invención a temperaturas mayores reducen la vida de almacenamiento esperada. La figura 3, en particular, indica que la formulación tiene una vida de almacenamiento esperada de al menos 18 meses cuando la formulación se almacena a 5° C. La figura 4 indica el almacenamiento de la formulación a temperatura ambiente (25° C) puede servir para reducir la vida de almacenamiento esperada a aproximadamente 12 meses. La figura 5 demuestra adicionalmente que el almacenamiento de la formulación a 40° C puede servir para reducir la vida de almacenamiento esperada a aproximadamente 4 meses. Aún adicionalmente, la figura 9 indica que en por ejemplo 5° C en 12 meses, el PS80 reduce la presencia de los subproductos de alto peso molecular, por ejemplo, agregados de polipéptido.

EJEMPLO 5 ESTUDIOS DE ESTABILIDAD EN USO DE METIONINA COMO UN ANTIOX1DANTE En este ejemplo, se describe el análisis de las varias formulaciones de polipéptido líquido estabilizadas con un antioxidante, en particular, metionina.

Los estudios fueron conducidos para determinar el efecto de la metionina para mantener la estabilidad de un anticuerpo en una formulación de anticuerpo terapéutica. El análisis SEC-HPLC se condujo durante 6 meses a varias temperaturas sobre cuatro muestras anticuerpos (un anticuerpo anti-CD22 lgG4): una formulación de anticuerpo con 20 mM de succinato a pH de 6.0; una formulación de anticuerpo con 20 mM de succinato y 10 mM de metionina; una formulación de anticuerpo con 20 mM de succinato y 0.01% de PS80; y una formulación de anticuerpo con 20 mM de succinato, 10 mM de metionina y 0.01% de PS80. En general, los resultados indicaron que la metionina disminuye deseablemente la formación de alto peso molecular (HMW), por ejemplo, la formación de agregados. Más aún, la metionina disminuye el incremento de la dependencia de temperatura en el porcentaje de HMW (ver figura 10).

Adicionalmente, un estudio de estabilidad de pH (a pH 5.8, 6.0 y 6.2) se condujo durante 6 semanas a varias temperaturas (5° C y 40° C) en las siguientes cuatro muestras de anticuerpo (un anticuerpo anti-B7.2 lgG2): (1) una muestra que incluye anticuerpo, 10 mM de histidina y 150 mM de NaCI; (2) una muestra que incluye anticuerpo, 10 mM de histidina, 150 mM de NaCI y 0.01% de PS80; (3) una muestra que incluye anticuerpo, 10 mM de histidina, 150 mM de NaCI y 10 mM de metionina; y (4) una muestra que incluye anticuerpo, 10 mM de histidina, 150 mM de NaCI, 10 mM de metionina y 0.01% de PS80. Se condujo un análisis SEC-HPLC. Los resultados demostraron que la metionina disminuye el incremento dependiente de temperatura en el porcentaje de formación de subproducto (por ejemplo, subproductos HMW) sobre el rango de pH indicado, (ver figura 11 ). Como se muestra en la figura 11 , las muestras que contienen metionina desplegaron una baja cantidad de agregación cuando se mantuvieron a 0° C durante 6 semanas, lo cual es similar a aquellas muestras mantenidas a 5° c durante 6 semanas.

EJEMPLO 6 ANÁLISIS DE EXCIPIENTE DE FORMULACIONES DE POLIPEPTIDO LIQUIDO ESTABILIZADAS UTILIZANDO CALORIMETRÍA DE EXPLORACIÓN DIFERENCIAL En este ejemplo, se describe el análisis de excipiente de varias formulaciones de polipéptido líquido que utilizan diferente calorimetría de exploración.

Una meta primaria de la formulación de droga de proteína es estabilizar una proteína en su forma biológicamente activa nativa. Típicamente esto se puede hacer al seleccionar varios excipientes en una formulación base y monitorear su efecto sobre el peso molecular de la molécula y la actividad. Estos parámetros son indicativos de estabilidad. Otra medición de la estabilidad es la desnaturalización térmica que se puede utilizar monitoreando una variedad de técnicas biofísicas. En general, los niveles crecientes de la estabilidad de la proteína se han atribuido a la alta fusión, desnaturalización o las temperaturas de descomposición. De acuerdo con esto, las propiedades térmicas de un polipéptido de unión de antígeno de ejemplo, en particular, un anticuerpo monoclonal lgG1 se monitoreó en la presencia de varios excipientes que utilizan Calorimetría de Exploración Diferencial Capilar VP. Específicamente, el Tms aparente se determinó para las formulaciones que contienen 10 mM de histidina (pH 6.0) con varios excipientes. Se muestran varios excipientes que suministran una estabilidad térmica incrementada o decreciente. En razón a que los niveles crecientes de estabilidad de la proteína se han tribuido a temperaturas de fusión alta, los excipientes en las muestras que imparten un Tm2 o Tm3 creciente, comparados con los valores Tm2/Tm3 de control (respectivamente, 74.9° C y 83.4° C), fueron considerados excipientes especialmente deseables (ver Tabla 1 adelante).

De acuerdo con esto, se concluyó que los excipientes tales como glucosa (formulada a una concentración de 4% y 10%), sucrosa (formulada a una concentración de 4% y 10%), sorbitol (formulado a una concentración de 4% y 10%), y manitol (formulado a una concentración de 4% y 10%), se desarrollaron especialmente bien para estabilizar una formulación de polipéptido líquida, en particular, una formulación IgG de anticuerpo.

Tabla 1 Resultados de Análisis de Excipiente Excipientea Concentraci?np Tm1*p Tm2*p Tm3? f Histidma (Control)» 10 mM» 74 9» 83 4» NaCI» 10 mM» 69 3» 74 8» 82 9» 100 mM» 67 9» 74 4» 82 4» 500 mM» 66 5» 74 5» 81 9» 1 M» 65 4» 74 9» 82 3» CaCI2» 10 mM» 68 7» 74 6» 82 7» 100 mM» 68 5» 74 5» 82 4» Metionina» 30 mM» 74 5» 83 7» Vitamina C» -30 mM» 52 2» 68 7» -ia Polisorbato 20» 0 005%» 74 5» 83 7» 0 01 %» 74 5» 83 8» 0 1 %» 74 4» 83 7» Polisorbato 80» 0 005%» 74 6» 83 8» 0 01 %» 74 5» 83 7» 0 1 %» 74 5» 83 7» Glucosa» 0 5%» -C¡ 74 7» 83 8» 2%» 74 9» 83 9» 4%» -c¡ 75 0» 84 3» * En el control (10 mM de histidina, pH 6 0) se observaron dos transiciones Tm2 y Tm3 Una transición temprana (Tm1 ) se vio en la presencia de algunos excipientes Equivalentes Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de aseverar utilizando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descrita aquí Tales equivalentes pretenden estar comprendidos por las siguientes reivindicaciones

Claims

REIVINDICACIONES Una formulación líquida que comprende, un polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo, en donde el polipéptido exhibe formación de subproducto durante el almacenamiento, y un antioxidante, en donde dicho antioxidante está presente en una cantidad suficiente para reducir la formación de subproducto del polipéptido durante el almacenamiento de la formulación. La formulación de la reivindicación 1 , en donde el componente de polipéptido de unión de antígeno terapéuticamente activo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento Fv de anticuerpo, un fragmento Fab de anticuerpo, un fragmento Fab'(2) de anticuerpo, un fragmento Fd de anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple (scFv), un fragmento de anticuerpo de dominio simple (Dab), un polipéptido de lámina plegada beta que comprende al menos una región determinante de complementariedad de anticuerpo (CDR), y un polipéptido no globular que comprende al menos una región determinante de complementariedad de anticuerpo. La formulación de la reivindicación 1 , en donde el polipéptido de unión de antigeno terapéuticamente activo es un anticuerpo. La formulación de la reivindicación 3, en donde el anticuerpo es un subtipo seleccionado del grupo que consiste de lgG1 , lgG2, lgG3, y lgG4. La formulación de la reivindicación 3, en donde el subproducto se selecciona del grupo que consiste de un agregado de polipéptido de alto peso molecular, producto de degradación de polipéptido de bajo peso molecular, y combinaciones de estos. La formulación de la reivindicación 5, en donde el agregado de alto peso molecular se selecciona del grupo que consiste de complejos anticuerpo:anticuerpo, complejos de anticuerpo:fragmento de anticuerpo; complejos de fragmento de anticuerpo:fragmento de anticuerpo, y combinaciones de estos. La formulación de la reivindicación 5, en donde el producto de degradación del polipéptido de bajo peso molecular se selecciona del grupo que consiste de una cadena ligera de anticuerpo, una cadena pesada de anticuerpo, un complejo de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y combinaciones de estos. La formulación de la reivindicación 1 , en donde el antioxidante se selecciona del grupo que consiste de metionina y un análogo de estos. . La formulación de la reivindicación 8, en donde la metionina está presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 25 mM. 0. La formulación de la reivindicación 8, en donde la metionina está presente en una cantidad de aproximadamente 10 mM. 1. La formulación de la reivindicación 1 , en donde la formulación es adecuada para administrar parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intracranealmente, o epiduralmente. 12. La formulación de la reivindicación 1 , en donde la formulación es capaz de atravesar la barrera sangre-cerebro. 13. La formulación de la reivindicación 1 , en donde la formulación comprende además un agente de tonicidad. 14. La formulación de la reivindicación 13, en donde el agente de tonicidad es manitol. 15. La formulación de la reivindicación 13, en donde la formulación es adecuada para administración intravenosa. 16. La formulación de la reivindicación 1 , en donde la formulación comprende además histidina. 17. Una formulación líquida que comprende un polipéptido de unión de antígeno, metionina, histidina, y manitol. 18. La formulación de la reivindicación 17, en donde la formulación es adecuada para administración intravenosa. 19. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido de unión de antígeno se une a un antígeno de una clase de antígeno seleccionada del grupo que consiste de antígenos de cáncer, antígenos autoinmunes, alérgenos, y patógenos. 20. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido de unión de antígeno está presente desde aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. 21. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido de unión de antígeno está presente en aproximadamente 17 mg/ml. 22. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en donde el polipéptido de unión de antígeno está presente en aproximadamente 20 mg/ml. 23. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en donde el polipéptido de unión de antígeno está presente en aproximadamente 30 mg/ml. 24. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 14 y 17-23, en donde el manitol está presente en una cantidad suficiente para mantener la isotonicidad de la formulación. 25. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 14 y 17-24, en donde el manitol está presente desde aproximadamente 2% p/v a aproximadamente 10% p/v. 26. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 14 y 17-24, en donde el manitol está presente en aproximadamente 4% p/v. 27. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 14 y 17-24, en donde el manitol está presente en aproximadamente 6% p/v. 28. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 14 y 17-24, en donde el manitol está presente en aproximadamente 10% p/v. 29. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 16-28, en donde la histidina está presente en una cantidad suficiente para mantener un pH fisiológicamente adecuado. 30. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 16-29, en donde la histidina está presente desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 25 mM. 31. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 16-29, en donde la histidina está presente en aproximadamente 10 mM. 32. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además un estabilizador. 33. La formulación de la reivindicación 32, en donde el estabilizador comprende polisorbato 80. 34. La formulación de la reivindicación 33, en donde el polisorbato 80 está presente desde aproximadamente 0.001% p/v a aproximadamente 0.01% p/v. 35. La formulación de la reivindicación 33, en donde el polisorbato 80 está presente en aproximadamente 0.005% p/v. 36. La formulación de la reivindicación 33, en donde el polisorbato 80 está presente en aproximadamente 0.01% p/v. 37. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9. 38. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 7. 39. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estable al congelamiento. 40. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estable durante al menos aproximadamente 12 meses. 41. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estable durante al menos aproximadamente 18 meses. 42. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estable durante al menos aproximadamente 24 meses. 43. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estable durante al menos aproximadamente 30 meses. 44. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estable a aproximadamente -80° C hasta aproximadamente 40° C. 45. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estable a aproximadamente 0° C hasta aproximadamente 25° C. 46. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la formulación es estable a aproximadamente 2° C hasta aproximadamente 8° C. 47. Una forma de dosis unitaria farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de la formulación de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para tratar enfermedad en un paciente por vía de la administración de dicha forma de dosificación a dicho paciente. 48. La forma de dosificación unitaria farmacéutica de la reivindicación 47 que es un recipiente que contiene dicha formulación. 49. El recipiente de la reivindicación 47, el cual es un frasco que contiene aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2000 mg de dicho polipéptido de unión Aß. 50. El recipiente de la reivindicación 47, que es un frasco que contiene aproximadamente 50 mg a aproximadamente 1500 mg de dicho polipéptido de unión Aß. 51. El recipiente de la reivindicación 47, que es un frasco que contiene aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg de dicho polipéptido de unión Aß. 52. La forma de dosificación unitaria farmacéutica de la reivindicación 47, en donde dicho frasco tiene un volumen de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 ml. 53. La forma de dosificación unitaria farmacéutica de la reivindicación 47, en donde dicho frasco tiene un volumen de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 ml. 54. La forma de dosificación unitaria farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 47-53, adecuada para infusión intravenosa a dicho paciente. 55. Un kit que comprende, a) la forma de dosificación unitaria farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 47-54; y b) instrucciones para uso. Un recipiente que comprende una forma de dosificación unitaria farmacéutica de la reivindicación 47 la cual es un recipiente etiquetado para uso. El recipiente de la reivindicación 56 etiquetado para uso profiláctico. El recipiente de la reivindicación 56 etiquetado para uso terapéutico. Un método para incrementar la estabilidad de un polipéptido de unión de antígeno en una formulación farmacéutica líquida, en donde el polipéptido exhibe formación de subproducto durante almacenamiento en una formulación líquida, el método comprende incorporar en la formulación un anti-oxidante en una cantidad suficiente para reducir la cantidad de formación de subproducto del polipéptido. El método de la reivindicación 59, en donde el componente de polipéptido de unión de antígeno se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo, un fragmento Fv de anticuerpo, un fragmento Fab de anticuerpo, un fragmento Fab'(2) de anticuerpo, un fragmento Fd de anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple (scFv), un fragmento de anticuerpo de dominio simple (Dab), un polipéptido de lámina plegada beta que comprende al menos una región determinante de complementariedad de anticuerpo (CDR), y un polipéptido no globular que comprende al menos una región determinante de complementariedad de anticuerpo. El método de la reivindicación 59, en donde el subproducto se selecciona del grupo que consiste de un agregado de polipéptido de alto peso molecular, un producto de degradación de polipéptido de bajo peso molecular, y combinaciones de estos. El método de la reivindicación 59, en donde el antioxidante se selecciona del grupo que consiste de metionina y un análogo de estos. Un método para preparar la formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1- 46, que comprende combinar los excipientes de la formulación. Un método para preparar la formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1- 46, que comprende combinar el polipéptido de unión de antígeno con uno o más diluyentes, en donde dicho uno o más diluyentes comprenden los excipientes de la formulación. Un método para preparar una forma de dosis unitaria farmacéutica que comprende combinar la formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-46 en un recipiente adecuado. Un método para preparar la formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-46 que comprende combinar una solución que comprende el polipéptido de unión de antígeno y al menos una porción de los excipientes con un diluyente que comprende el resto de los excipientes. Una formulación estable durante al menos aproximadamente 12 meses a una temperatura por encima del congelamiento hasta aproximadamente 10° C y tiene un pH de aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 6.5, que comprende: al menos el polipéptido de unión de antígeno a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml; manitol a una concentración de aproximadamente 4% p/v o NaCI a una concentración de aproximadamente 150 mM; ¡ii. aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM de histidina o succinato; y iv. 10 mM de metionina. La formulación de la reivindicación 67, en donde la formulación es estable durante al menos aproximadamente 24 meses a una temperatura de aproximadamente 2° C a 8° C, y comprende polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.001% p/v a aproximadamente 0.01 % p/v. 69. La formulación de la reivindicación 67, en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.5 y comprende aproximadamente 10 mg/ml de polipéptido de unión a antígeno, aproximadamente 10 mM de histidina y aproximadamente 4% p/v manitol y aproximadamente .005% p/v polisorbato 80. 70. La formulación de la reivindicación 67, en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.2 y comprende aproximadamente 20 mg/ml de polipéptido de unión a antígeno, aproximadamente 10 mM de histidina, aproximadamente 4% p/v manitol y aproximadamente .005% p/v polisorbato 80. 71. La formulación de la reivindicación 67, en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.2 y comprende aproximadamente 30 mg/ml de polipéptido de unión a antígeno, aproximadamente 10 mM de histidina, aproximadamente 4% p/v manitol y aproximadamente .005% p/v polisorbato 80. 72. La formulación de la reivindicación 71 , que comprende además aproximadamente 4% p/v manitol. 73. La formulación de la reivindicación 71 , que comprende además polisorbato 80 a una concentración de aproximadamente 0.001% p/v a aproximadamente 0.01 % p/v. 74. La formulación de la reivindicación 73, que comprende aproximadamente 0.005% p/v polisorbato 80. 75. La formulación de la reivindicación 71 , en donde el polipéptido de unión de antígeno está presente a una concentración de aproximadamente 17 mg/ml a aproximadamente 23 mg/ml. 76. Una formulación estable durante al menos aproximadamente 24 meses a una temperatura de aproximadamente 2° C hasta aproximadamente 8° C y tiene un pH de aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 6.5, que comprende aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 23 mg/ml de un polipéptido de unión de antígeno, aproximadamente 10 mM de succinato, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% p/v de manitol y aproximadamente 0.005% p/v polisorbato 80. 77. Una formulación estable cuando se descongela desde aproximadamente -50° C a aproximadamente -80° C, comprende aproximadamente 40 a aproximadamente 60 mg/ml de polipéptido de unión de antígeno, aproximadamente 1.0 mg/ml a aproximadamente 2.0 mg/ml histidina, aproximadamente 1.0mg/ml a 2.0 mg/ml metionina y aproximadamente 0.05 mg/ml polisorbato 80, en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 6.0. 78. La formulación de la reivindicación 77, en donde el manitol está excluido. 79. Una formulación que comprende aproximadamente 20 mg/ml de polipéptido de unión a antígeno, aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% de manitol y que tiene un pH de aproximadamente 6. 80. Una formulación que comprende aproximadamente 30 mg/ml de polipéptido de unión a antígeno, aproximadamente 10 mM de succinato, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 6% de manitol y tiene un pH de aproximadamente 6.2. 81. Una formulación que comprende aproximadamente 20 mg/ml de polipéptido de unión a antígeno, aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% de manitol, aproximadamente 0.005% de Polisorbato 80, y que tiene un pH de aproximadamente 6. 82. Una formulación que comprende aproximadamente 10 mg/ml de polipéptido de unión a antígeno, aproximadamente 10 mM de succinato, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 10% de manitol, aproximadamente 0.005% de Polisorbato 80, y que tiene un pH de aproximadamente 6.5. Una formulación que comprende aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/ml de polipéptido de unión a antígeno, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 4% de manitol, aproximadamente 0.005% de Polisorbato 80, y tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.5. Una formulación que comprende aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 20 mg/ml de polipéptido de unión a antígeno, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM de L-histidina, aproximadamente 10 mM de metionina, aproximadamente 150 mM de NaCI, aproximadamente 0.005% de Polisorbato 80, y tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.5. Una forma de dosificación unitaria farmacéutica, comprende una formulación que comprende: aproximadamente 10 mg a aproximadamente 250 mg de un polipéptido de unión de antígeno; b. aproximadamente 4% de manitol o aproximadamente 150 mM de NaCI; c. aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM de histidina o succinato; y aproximadamente 10 mM de metionina 86. La forma de dosificación unitaria farmacéutica de la reivindicación 85, que comprende aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.1 % de Polisorbato 80. 87. La forma de dosificación unitaria farmacéutica de la reivindicación 86, que comprende aproximadamente 40 mg a aproximadamente 60 mg del polipéptido de unión de antígeno. 88. La forma de dosificación unitaria farmacéutica de la reivindicación 86, que comprende aproximadamente 60 mg a aproximadamente 80 mg del polipéptído de unión de antígeno. 89. La forma de dosificación unitaria farmacéutica de la reivindicación 86, que comprende aproximadamente 80 mg a aproximadamente 120 mg del polipéptido de unión de antígeno. 90. La forma de dosificación unitaria farmacéutica de la reivindicación 86, que comprende aproximadamente 120 mg a aproximadamente 160 mg del polipéptido de unión de antígeno. 91. La forma de dosificación unitaria farmacéutica de la reivindicación 86, que comprende aproximadamente 160 mg a aproximadamente 240 mg del polipéptido de unión de antígeno. 92. Un producto terapéutico, que comprende: a. un frasco de vidrio, que comprende una formulación que comprende: i. aproximadamente 10 mg a aproximadamente 250 mg de un polipéptido de unión de antígeno, ii. aproximadamente 4% de manitol o aproximadamente 150 mM de NaCI, iii. aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM de histidina, y iv. aproximadamente 10 mM de metionina; y etiquetar para uso que comprende las instrucciones para utilizar el volumen apropiado necesario para lograr una dosis de aproximadamente 0.15 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. 93. El producto terapéutico de la reivindicación 92, en donde la dosis es aproximadamente .5 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg. 94. El producto terapéutico de la reivindicación 92, en donde la dosis es aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg. 95. El producto terapéutico de la reivindicación 92, en donde la concentración de polipéptido de unión de antígeno es aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 60 mg/ml. 96. El producto terapéutico de la reivindicación 92, en donde la concentración de polipéptido de unión de antígeno es aproximadamente 20 mg/ml. 97. El producto terapéutico de la reivindicación 92, que comprende además aproximadamente 0.005% de Polisorbato 80. 98. El producto terapéutico de la reivindicación 92, en donde el uso es una administración subcutánea. El producto terapéutico de la reivindicación 92, en donde el uso es una administración intravenosa.