LAPORAN PRAKTIKUM

MEDIA DAN REAGENSIA

PEMBUATAN REAGENT & PEWARNA UNTUK PENGECATAN

BAKTERI & FUNGI

Disusun Oleh:

Nama : PUPUT AYU SAPUTRI

NIM : 1911050018

Kelas : TLM 1A

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK D4

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO

2023

i
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Pewarnaan Gram adalah salah satu teknik pewarnaan paling penting dalam
mikrobiologi. Namanya diambil dari ahli bakteriologi Denmark Hans
Christian Gram yang pertama kali memperkenalkannya pada tahun 1882,
terutama untuk mengidentifikasi organisme penyebab pneumonia. Seringkali
pengujian pertama dilakukan, pewarnaan gram melibatkan penggunaan kristal
violet atau biru metilen sebagai warna primer. Istilah organisme yang
mempertahankan warna primer dan tampak ungu kecokelatan di bawah
mikroskop adalah organisme Gram positif. Organisme yang tidak menyerap
pewarna primer tampak berwarna merah di bawah mikroskop dan merupakan
organisme Gram-negatif.
Langkah pertama dalam pewarnaan gram adalah penggunaan pewarna
kristal violet untuk pewarnaan awal slide. Langkah selanjutnya, juga dikenal
sebagai fiksasi pewarna, melibatkan penggunaan yodium untuk membentuk
kompleks kristal violet-iodin untuk mencegah penghilangan pewarna dengan
mudah. Selanjutnya, penghilang warna, seringkali pelarut etanol dan aseton,
digunakan untuk menghilangkan pewarna. Prinsip dasar pewarnaan gram
melibatkan kemampuan dinding sel bakteri untuk mempertahankan pewarna
kristal violet selama perlakuan pelarut. Mikroorganisme gram positif
memiliki kandungan peptidoglikan yang lebih tinggi, sedangkan organisme
gram negatif memiliki kandungan lipid yang lebih tinggi.
Awalnya, semua bakteri menyerap pewarna kristal violet; Namun, dengan
penggunaan pelarut, lapisan lipid dari organisme gram negatif dilarutkan.
Dengan larutnya lapisan lipid, gram negatif kehilangan pewarna utamanya.
Sebaliknya, pelarut mendehidrasi dinding sel gram positif dengan penutupan
pori-pori yang mencegah difusi kompleks violet-iodine, sehingga bakteri tetap
ternoda. Durasi dekolorisasi merupakan langkah penting dalam pewarnaan
gram karena kontak yang terlalu lama dengan bahan dekolorisasi dapat
menghilangkan semua noda dari kedua jenis bakteri tersebut.

1
1.2. Tujuan Praktikum
1) Mahasiswa mampu menjelaskan dan membuat reagent dan pewarna
yang digunakan dalam proses pengecatan bakteri dan fungi
2) Mahasiswa mampu menjelaskan fungsi dari masing-masing reagent
dan pewarna yang digunakan dalam proses pengecatan bakteri dan
fungi
1.3. Manfaat Praktikum
1. Mahasiswa mendapat pengetahuan tentang cara pembuatan reagent dan
pewarna yang digunakan dalam proses pengecatan bakteri dan fungi
2. Mahasiswa mendapat pengetahuan tentang fungsi dari masing – masing
reagent dan pewarna yang digunakan dalam proses pengecatan bakteri dan
fungi

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya
berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa- senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri- bakteri, karena
reaksinya dengan sel bakteri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah
yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi
menjadi 2 golongan, yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif
dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif,
maka disebut zat warna asam. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat
bersenyawa lebih cepat dengan bgaian sitoplasma sel, sedangkan zat warna basa
mudah bereaksi dengan bagian- bagian inti sel. Pewaranaan bakteri dipengaruhi
oleh beberapa faktor, seperti fiksasim pelunturan warna, substrat, intesifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah
meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan alkohol, maka semua zat warna
terhapus. Sebaliknya, terdapat juga preparat yang tahan terhadap alkohol.

Pewarnaan terhadap bakteri, secara garis besar dibedakan menjadi dua,

yaitu :

1. Pewarnaan bakteri hidup

Pewarnaan bakteri hidup dilakukan dengan menggunakan bahan yang
tidak toksik, tetapi jarang dikerjakan karena bakteri yang masih hidup sulit
menyerap warna. Pewarnaan bakteri hidup dilakukan untuk melihat
motilitas (pergerakan) bakteri dan pemeriksaannya dilakukan dengan
menggunakan tetes bergantung
2. Pewarnaan bakteri mati
Pewarnaan pada bakteri yang telah dimatikan bertujuan untuk melihat
struktur luar dan dalam dari bakteri, memperjelas ukuran bakteri dan
melihat reaksi bakteri terhadap pewarnaan yang diberikan sehingga dapat
diketahui sifat fisik dan kimia dari bakteri tersebut.

3
 Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya bisaa, karena
bakteri tampak tidak berwarna pada sediaan hidup. Bakteri lebih sering diamati
dalam olesan terwarnai dari pada dalam keadaan hidup. Untuk menyiapkan
bakteri agar dapat diwarnai, biakan disebarkan dalam setes air pada obyek
glass/gelas preparat yang disebut sebagaisediaan. Sediaan dikeringkan pada suhu
kamar dan bakteri dilekatkan erat (difiksasi) dengan jalan melewatkan obyek glass
preparat (olesan permukaan di atas) sebanyak 2 atau 3 kali dengan cepat pada
nyala api bunsen. Jika sudah dingin preparat siap untuk diwarnai.

 Macam-macam Pewarnaan

1. Pewarnaan sederhana (simple/progressive staining)

Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan yang menggunakan pewarna

tunggal. Pewarna yang bisaanya. Pewarna sederhana bertujuan untuk
memberikan kontras antara bakteri dan latar belakangnya. Pewarnaan
sederhana dilakukan saat kita ingin mengamati bentuk dan ukuran sel
bakteri.

2. Pewarnaan differential (regressive staining)

Pewarnaan ini dilakukan untuk mengamati perbedaan antara sel-sel dari

tiap-tiap mikroba. Pewarnaan differential menggunakan lebih dari 1 zat
warna, pewarnaan menampilkan perbedaan diantara sel- sel
mikroorganisme/bagian-bagian sel mikroorganisme

Macam zat warna yang digunakan :

1) Pewarna Gram
2) Pewarna Ziehl-Neelsen/Acid Fast Stain (pewarnaan tahan asam)
3) Pewarna Giemsa
4) Pewarna untuk spora bakteri
5) Pewarna kapsul bakteri
6) Pewarna flagella bakteri
7) Pewarna granula bakteri

4
 BAB III
METODE PRAKTIKUM
3.1. Alat Praktikum
1) Beaker glass
2) Batang pengaduk
3) Magnetic stirrer
4) Hot plate
5) Gelas ukur
6) Botol reagen
7) Corong kaca
8) Kertas saring
9) Mortar dan stemper
10) Kertas label
11) Pensil/spidol
12) Pipet ukur
13) Pipet tetes

3.2. Bahan Praktikum

1. Crystal violet
2. Alcohol aseton
3. Safranin 0,5%
4. Karbol fuchsin
5. Lactofenol cotton blue solution
6. Methylene blue solution

3.3. Prosedur Kerja

1) Crystal Violet 3% (Gram A)
1. Dilarutkan serbuk crystal violet 0,75 g dengan alcohol 95% kedalam
gelas bekker, diaduk sampai homogen
2. Dilarutkan ammonium oxalate 5 ml dengan akuades 20 ml kedalam
gelas bekker, diaduk sampai homogen.

5
 3. Dicampurkan kedua larutan tersebut kedalam gelas beker, diaduk
sampai homogen.
4. Dimasukkan kedalam botol reagen yang berlabel crystal violet 3%
2) Alkohol Aseton
1. Dituangkan alcohol 95% sebanyak 17,5 ml kedalam beker glass
2. Ditambahkan aseton 7,5 ml kedalam beker glass
3. Di homogenkan
4. Dimasukkan ke dalam botol gelap berlabel alcohol aseton
3) Safranin 0,5%
1. Dilarutkan serbuk safranin dengan alcohol 95% ke dalam beker glass,
dihomogenkan
2. Ditambahkan aquades 22,5 ml, dihomogenkan
3. Disaring larutan tersebut menggunakan kertas saring dan corong kaca
4. Dimasukkan ke dalam botol gelap tertutup yang berlabel safranin 0,5%
4) Karbol funchsin
1. Dilarutkan basic fuchsin 0,075 g dengan ethyl alcohol 95% sebanyak
2,5 ml kedalam gelas bekker, dihomogenkan
2. Dilarutkan phenol 1,25 h dengan akuades 23,8 ml, di homogenkan.
3. Dicampurkan kedua larutan tesebut ke dalam bekker glass, diaduk
sampai homogen
4. Dipanaskan larutan tersebut menggunakan hotplate sampai mendidih
5. Dimasukkan ke dalam botol gelap berlabel Karbol fuchsin
5) Lactofenol cotton blue solution
1. Dimasukkan lactic acid sebanyak 5 ml, glycerol 10 ml, dan akuades 10
ml ke dalam bekker glass, dihomogenkan
2. Ditambahkan phenol 5 g ke dalam glass beker
3. Dipanaskan menggunakan hot plate sampai mendidih
4. Di tambahkan anilin blue 0,5 g, di homogenkan
5. Disaring larutan tersebut dengan menggunakan kertas saring dan
corong kaca
6. Dimasukkan ke dalam botol berlabel lactofenol cotton blue solution

6
6) Methylene blue solution
1. Di larutkan methylene blue powder sebanyak 0,0075 g dengan akuades
25 ml ke dalam gelas bekker
2. Di homogenkan
3. Di saring menggunakan kertas saring
4. Dimasukkan ke dalam botol gelap berlabel methylene blue solution

7
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Praktikum

no Nama reagent Formula gambar

1 Crystal violet Crystal violet 0,75
3% Alcohol 95% 5 ml
Ammonium oxalate 0,2 g
Akuades 20 ml
2 Alcohol aseton Alcohol 95%, 17,5 ml
Aseton 7,5 ml
3 safranin Safranin 0,125 g
Alcohol 95% 2,5 ml
4 Karbol fuchsin Basic fuchsin 0,075 ml
Ethyl alcohol 95% 2,5 ml
Phenol 1,25 g
Akuades 23,8 ml
5 Lactofenol Lactic acid 5 ml
cotton blue Phenol 1,25 g
solution Anilin blue 0,05 g
Akuades 10 ml
6. Methylene Methylene blue powder 0,0075
blue solution g
Akuades 25 ml

8
4.2. Pembahasan
Teknik pewarnaan pada bakteri bertujuan menampilkan perbedaan di
antara sel-sel bakteri atau bagian-bagian sel bakteri. Teknik pewarnaan
pada bakteri dibedakan menjadi empat macam yaitu pewarnaan sederhana,
pewarnaan gram, pewarnaan diferensial dan pewarnaan struktural.

Kristal violet berperan sebagai pewarna primer dalam proses

pewarnaan Gram. Pewarnaan ini melibatkan beberapa tahap yang
melibatkan beberapa reagen, namun kristal violet adalah langkah awal
yang penting. Fungsinya adalah untuk memberi warna pada dinding sel
bakteri yang memiliki kemampuan menyerap zat pewarna kation. Pada
tahap awal pewarnaan Gram, kristal violet diaplikasikan pada sampel
mikroorganisme. Bakteri gram positif dan gram negatif akan merespons
pewarna ini secara berbeda. Kristal violet akan masuk ke dalam dinding
sel bakteri melalui pori-pori dan lubang di dinding sel. Di sini, peran
kristal violet adalah untuk memberikan warna yang kontras pada
mikroorganisme target.
Carbol fuchsin merupakan basa yang di larutkan di larutkan dalam
fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna
kedalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk
melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin bisa masuk
walaupun BTA dicuci dengan larutan dekolorisasi yaitu asam alkohol
sehingga zat warna pertama tidak mudah dilunturkan.
larutan alkohol (Gram C), berfungsi untuk melunturkan zat warna
sebelumnya; zat pewarna safranin (Gram D), berfungsi untuk memberi
warna bakteri nontarget. Aseton atau propanon adalah cairan kimia yang
sangat mudah menguap, tidak berwarna, dan mudah terbakar bila terkena
api
Safranin merupakan pewarna yang digunakan dalam beberapa
pewarnaan preparat salah satunya yaitu pewarnaan gram pada bakteri dan
memberikan warna merah preparat khusunya pada bakteri gram negatif.

9
Fungsi zat warna safranin hanyalah sebagai pembeda (kontras) terhadap
zat warna kristal violet. Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas
katalase pada bakteri yang diuji.
Pewarnaan LPCB (Lactophenol Cotton Blue) terdiri dari cotton
blue, asam laktat, gliserol dan kristal fenol. Cotton blue berfungsi untuk
memberi warna biru pada sel jamur, asam laktat berfungsi untuk
mempertahankan struktur jamur dan membersihkan jaringan, gliserol
berfungsi untuk menjaga sel terhadap kekeringan

10
 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan
1. Beberapa reagent yang dibuat yaitu cystal violet, alcohol aseton, safranin,
lactofenol cotton blue solution, methylene blue solution.
2. Cara membuat rreagent dan pewarna untuk pengecatan bakteri dan fungi
adalah dengan cara menimbang formula yang sudah di tentukan, lalu
dimasukkan ke dalam beker glass lalu diahomogenkan dan dimasukkan ke
dalam botol gelap berlabel sesuai dengan yang dibuat. Adapun yang
sebelum dimasukkan ke dalam botol dipanaskan terlebih dahulu dan
disaring menggunakan kertas saring baru dimasukkan ke dalam botol,
tergantung pembuatan reagennya
3. Fungsi dari masing masing reagen :
1. Crystal violet ; untuk memberikan warna kontras pada bakteri/fungi
2. Alcohol aseton : untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat
warna pada sel bakteri (mikroorganisme)/ melunturkan zat warna
utama yaitu zat violet kristal
3. Safranin ; untuk memberikan warna merah pada bakteri/fungi

5.2. SARAN
Bagi praktikan harus tetap datang tepat waktu dan menggunakan
alat pelindung diri secara lengkap, medium tidak boleh dipanaskn pada
suhu yang terlalu tinggi, medium ditimbang secara tepat dan akurat jangan
melebihi batas yang telah ditentukan, dilihat dengan cermat label medium.

11
 DAFTAR PUSTAKA

Manurung. 2012. PEWARNAAN GRAM.Jurnal Indobiosains. Vol 1. (1)

Irianto, 2006. Macam-Macam Pengenalan zat pewarna pada bakteri. Jurnal
Universitas Muhammadiyah Malang. Vol. 2 (1)
Rizky, W.D. 2013. Jurnal Poltekkes Kemenkes Semarang.
Adi. 2019, BUKU AJAR BAKTERIOLOGI, Jurnal Kedokteran
Komunitas. 6(3) : 472- 479
Zimbro. 2009.reagen dan pewarnaan gram bakteri. Universitas
Muhammadiyah Surakarta.

12