Chromato Liquide 2007

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CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
Professeur Jean-Louis CUQ

LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
TABLE DES MATIERES
I. HISTORIQUE 3
II. PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE 4
III. CLASSIFICATION DES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES 5
1. Selon la nature des phases

2. Selon la nature des phénomènes mis en jeu
3. Selon la technique mise en jeu
IV. THEORIE DE BASE - GRANDEURS FONDAMENTALES 6
Coefficient de distribution
1. Grandeurs de rétention tR, VR, k' 7
2. Sélectivité d'une colonne α 9
3. Efficacité d'une colonne N, HEPT, 10
Equations de Van Deempter , Knox, Giddings, Nef
4. Résolution Rs 12
5. Temps d'analyse Nef / tR 12
6. Elution linéaire 12
7. Perte de charge ∆P 13
V. OPTIMISATION DES CONDITIONS D'UNE ANALYSE 14
1. Optimisation de la résolution 14
1) Action sur α
2) Action sur k'
3) Action sur l'efficacité
1. Influence de la vitesse de la phase mobile
2. Influence du diamètre des particules
3. Influence de la colonne (longueur et diamètre)
4. Influence de l'injection (position, volume, injecteur)
2. Optimisation du temps d'analyse 20
1) Optimisation de NeF/tR
2) Pression et temps d'analyse
3. Optimisation de la perte de charge 22
4. Conclusion 23
5. Détermination graphique 24
VI. DIFFERENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE 25
1. La chromatographie d'adsorption 26
1) Thermodynamique de l'adsorption 26
2) Adsorbants utilisés en CLS 28
1. Adsorbants de type I - silice ou alumine 28

2. Adsorbants de type III - Phases greffées polaires 31
3. Adsorbants de type IV - Phases greffées apolaires 32
a) mécanisme de rétention 33
b) influence de la phase mobile 35
- élution en mode isocratique
- élution en mode gradient
c) augmentation de k' (fixation covalente, appariement d'ions) 39
2. La chromatographie de partage 43
1) Phases stationnaires
2) Phase mobile
3. La chromatographie d'échange d'ions 46
1) Principaux types de groupements fonctionnels 48
2) Principaux types de matrice 48
3) Influence du pH de la phase mobile 50
4) Influence du type et de la concentration en contre ion 51
5) Effet de la température et de solvants organiques 51
6) Analyse avec suppresseur de phase 52
4. La chromatographie d'exclusion 52
5. La chromatographie chirale 58
6. La chromatographie d'affinité 60
VII. EQUIPEMENTS UTILISES EN CHROMATOGRAPHIE 62
1. Dispositifs d’obtention de gradients 63

2. Les pompes 65
3. Les injecteurs 66
4. La colonne 67
5. Les particules support de phase stationnaire 67
6. La nature des phases stationnaires 69
7. Les connexions 69
8. Les détecteurs 70
VIII. QUANTIFICATION 76
1. Mesure de l’aire par triangulation ou au moyen d’intégrateurs 76

2. Mesure des coefficients de réponse 77
3. Influence des conditions opératoires sur l’analyse quantitative 78
IX. TRANSPOSITION COLONNE - COUCHE MINCE 78
X. COMPARAISON CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE -

CHROMATOGRAPHIE GAZ 79
XI. EXERCICES ET CORRIGES 80

I. HISTORIQUE
La chromatographie est une science très ancienne.
Ainsi on trouve la première référence d'un processus chromatographique dans l'Ancien Testament qui fait
mention de propriétés adsorptives de certaine variété de bois pour adoucir de l'eau amère. Ce sont les
tanins hydrophobes qui constituaient une phase stationnaire apolaire (chromatographie d’adsorption)
Aristote décrit les propriétés que possèdent certaines terres pour purifier l'eau de mer. Les phénomènes
mis en jeu relèvent ici de l’échange d’ions.
Au XVIème siècle, le strasbourgeois BRUNSWIG purifiait de l'éthanol en faisant passer la vapeur à

travers une éponge imprégnée d'huile d'olive et réalisait une expérience de chromatographie gaz-liquide
400 ans avant la "découverte" de cette technique.
Toutefois, ce n'est qu'au début du XXème siècle, plus précisément le 21 mars 1903, que naquit la
chromatographie. Ce jour-là TSWETT, botaniste d'origine russe, présenta à Varsovie son premier article
sur une nouvelle sorte de phénomène d'adsorption et son application à l'analyse biochimique. Il y décrivait
la formation de zone colorées lors de l'élution par l'éther de pétrole de pigments végétaux dans une
colonne remplie de carbonate de calcium.
L'origine du mot chromatographie vient peut-être de cette séparation de composés colorés puisque
CHROMA (Κρωµα) en grec, signifie couleur.
Puis les travaux de TSWETT tombèrent dans l'oubli pendant une vingtaine d'années et il faudra attendre
1931 la publication de KUHN et LEDERER sur la séparation des isomères du carotène et de la
xanthophylle pour assister au développement de la chromatographie en tant qu'outil analytique.
A partir de cette date, la chromatographie prit son véritable essor
- 1934, premier livre de ZECHMEISTER et CHOLNOKY, qui par son succès, contribua à vulgariser la
chromatographie.
- 1938, KUHN reçut le Prix Nobel.

Livre La chromatographie en phase mince par IZMAILOV et SCHRAIBER
Chromatographie d'échange d'ions sur zéolithes.
- 1941, La chromatographie de partage, MARTIN-SYNGE
- 1944, La chromatographie sur papier, CONSDEN-GORDON, MARTIN
- 1948, Prix Nobel à TISELIUS (premier détecteur optique par mesure du changement d'indice de
réfraction, premier système de gradient d'élution)
- 1952, Prix Nobel à MARTIN et SYNGE

MOORE et STEIN Chromatographie d'échange ionique (Prix Nobel)
- 1959, Chromatographie sur gel (PORATH, FLODIN)
- 1969, Avènement de la chromatographie liquide moderne (HPLC, FPLC)

II. PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE
Il s'agit de la réalisation d'un tri entre les différentes espèces moléculaires d'un mélange.
On va ainsi forcer toutes les molécules à effectuer un parcours commun parsemé d'obstacles : certaines
espèces le franchiront aisément d'autres auront plus de difficultés. A l'arrivée, il y aura échelonnement.
Pour entraîner les molécules il faut les véhiculer dans un fluide : la phase mobile qui peut être soit un
liquide soit un gaz.
L'obstacle à franchir, qui ne doit pas être entraîné par la phase mobile, doit être fixe et produire des effets
reproductibles : il constitue la phase stationnaire. Cette phase stationnaire, le plus souvent emprisonnée
dans une colonne, peut être un solide ou un liquide immobilisé sur un solide.
La séparation idéale est schématisée sur la Figure 1.
application
développement réponse
temps
Figure 1. Séparation chromatographique idéale
Les facteurs qui contrôlent la séparation sont surtout d'ordre thermodynamique: la rétention de
l'échantillon sur la colonne est donc contrôlée thermodynamiquement. Il est nécessaire qu’il y ait
interaction entre l’analyte et la phase stationnaire. En pratique la séparation idéale n'est pas réalisable.
Ainsi il se produit un élargissement des bandes en raison surtout des phénomènes de diffusion. Les
facteurs qui contrôlent la diffusion sont surtout de nature cinétique et peuvent être considérés
indépendamment des facteurs thermodynamiques qui influencent la rétention (figure 2).
application développement
réponse
temps
Figure 2. Séparation chromatographique réelle (non idéale)
On peut classer les méthodes chromatographiques de trois manières:
- selon la nature des phases
- selon la nature des phénomènes mis en jeu dans la séparation
- selon la technologie mise en oeuvre.

III. CLASSIFICATION DES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES
III.1. Classification selon la nature des phases
Selon la nature de la phase mobile on distingue:

- la chromatographie en phase liquide CPL
- la chromatographie en phase gazeuse CPG
- la chromatographie en phase supercritique CPS
Selon la nature de la phase stationnaire on distingue:

- la chromatographie gaz / solide CGS
- la chromatographie gaz / liquide CGL
- la chromatographie liquide / solide CLS
- la chromatographie liquide / liquide CLL
La chromatographie en phase supercritique est une chromatographie dans laquelle la phase mobile est un
gaz comprimé (à sa température et à sa pression critique) ou une phase liquide / vapeur de même densité
(au-delà de la température critique, le gaz ne peut être liquéfié quelle que soit sa pression). Avec cette
phase mobile, le plus souvent l’anhydride carbonique, la durée de l’analyse est de 5 à 10 fois plus courte
qu’avec les phases mobiles liquides. De viscosité très faible, cette phase mobile permet un couplage facile
avec des détecteurs comme le spectromètre de masse ou le détecteur par mesure de la diffusion de la
lumière.
III.2. Classification selon la nature des phénomènes mis en jeu
Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les molécules à
séparer.
On distingue ainsi:
III.2.1. La chromatographie d'adsorption
C'est la méthode la plus ancienne et "encore" la mieux connue. La séparation entre les molécules est
fondée sur le processus répété d'adsorption et désorption par la phase stationnaire. Dans les premières
études les phases stationnaires « modèles d’études » étaient la silice et la cellulose. En conséquence, les
phénomènes étudiés correspondaient essentiellement à des interactions de type liaison hydrogène. D’autres
phases ont été utilisées depuis avec des mécanismes d’échange impliquant des liaisons Van der Waals,
hydrogène et des interactions hydrophobes (cf chapitre VI).
Il s'agit de chromatographie liquide-solide (CLS)
III.2.1. La chromatographie de partage
La séparation est fondée sur les différences de solubilité des molécules à séparer entre phase mobile et
phase stationnaire liquide (phase qui imprègne ou qui est greffée sur un solide).
Il s'agit alors de chromatographie liquide-liquide (CLL).
On multiplie ici les partages entre phases de la même façon que si l'on disposait de plusieurs milliers
d'ampoules à décanter contenant deux solvants non miscibles.
III.2.3. La chromatographie d'échange d'ions
La phase stationnaire est un solide à la surface duquel se trouvent des groupements ionisés : échangeur
d'ions. Un soluté ionisé de charge opposée se trouvera d'autant plus retenu que sa charge (opposée à celle
de la phase stationnaire) sera plus forte. C’est la loi de COULOMB qui régit ces échanges de forte énergie
(40 à 80 kJ.mole-1) :
q . q' 1
F= .
d
2 ε .ε 0
La phase stationnaire solide est généralement poreuse et renferme dans ses pores une phase liquide qui
peut jouer un rôle très important dans les séparations. On peut ainsi parler pour ce type de
chromatographie de CLS mais aussi de CLL.
III.2.4. La chromatographie d'exclusion encore qualifiée de chromatographie de perméation ou de

filtration sur gel
La phase stationnaire est un solide poreux dont la dimension des pores est voisine de celle des molécules à
séparer : celles qui sont trop volumineuses pour pénétrer dans les pores sont exclues de la phase
stationnaire et sont éluées les premières.
Ici encore on peut parler indifféremment de CLS ou de CLL.
III.2.5. La chromatographie d'affinité
Très utilisée par les biochimistes, elle consiste à fixer par exemple une enzyme sur la phase stationnaire de
façon à complexer sélectivement les substrats correspondants (ou vice versa). Il s’agit là d’une association
entre une molécule polyfonctionnelle et une phase stationnaire comportant des sites stériquement définis et
de capacité d’échange multiple. Il s’agit souvent d’un système coopératif d’interactions différentes
(ioniques, hydrophobe, Van der Waals, hydrogène), liaisons parfaitement positionnées dans l’espace.
Il est bon de rappeler qu’il ne peut pas exister de phase stationnaire « inerte ». Quelle que soit sa structure
elle sera toujours capable de donner des interactions d’un type donné. Dans la mesure où le système
requiert un niveau d’interaction le plus faible possible, c’est par les choix judicieux des phases mobiles et
stationnaires qu’il sera possible d’y parvenir.
III.2. Classification selon la technique mise en jeu
Selon la technologie mise en jeu on distingue:

- la chromatographie sur colonne
- la chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou chromatographie sur couche
mince).
IV. THEORIE DE BASE - GRANDEURS FONDAMENTALES
En chromatographie en phase liquide, les séparations sont basées sur la différence de distribution des
espèces entre deux phases non miscibles l'une stationnaire (particules solides imprégnées ou non d'un
liquide), l'autre mobile (liquide).
Pour un système chromatographique donné, le coefficient de distribution K (ou coefficient de partage)
est défini par:
Cs
K =
Cm
Cs : concentration du soluté dans la phase stationnaire

Cm : concentration du soluté dans la phase mobile.
Si les molécules d'un mélange ont des affinités différentes pour chacune des deux phases, il apparaît des
différences entre deux vitesses de migration d'où possibilité de séparation. La migration sera d'autant plus
lente que l'affinité de la molécule pour la phase stationnaire sera grande.
Rappelons que la solubilité d’un analyte dans une phase mobile donnée passe d’abord par la possibilité
d’établissement d’échanges (liaisons). Sans échange il n’y a pas de solubilité possible et deux phases
apparaissent.
Une bonne séparation en chromatographie liquide implique :
1. que les divers constituants du mélange soient retenus sur la colonne, donc présentent une
affinité pour la phase stationnaire suffisante pour qu'ils apparaissent dans l'effluent après un volume
supérieur au volume interstitiel de la colonne
2. que les différents pics soient bien séparés, ce qui pour deux pics successifs dépend de la
distance séparant les sommets et leur largeur.
3. que l'analyse soit aussi rapide que possible.
IV.1. GRANDEURS DE RETENTION
Si la quantité injecté est petite on obtient pour chaque composé élué un pic symétrique et gaussien (figure
3). On définit ainsi les paramètres suivants :
IV.1.1. Le temps de rétention (tR)
C'est le temps d'élution au maximum du pic mesuré à partir de l'injection.

Un chromatogramme type est schématisé, avec les paramètres principaux d’évaluation, sur la figure 3.
2 σ h
O,607
0,5
∂
injection
point mort
O,607 h
0,5 h
0 4 σ largeur du pic
VM
ω ω à la base
volume mort
volume de rétention
ou temps de rétention
temps de rétention réduit
ou temps de rétention réduit
figure 3. Principaux paramètres d’un chromatogramme
IV.1.2. Le volume de rétention (VR)
Connaissant le débit D de la phase mobile, supposé maintenu constant, on définit le volume de rétention
VR = tR . D = tR . v. s VM = to . D
v : vitesse linéaire de la phase mobile s : section réduite de la colonne

s = s'.εε avec s' : section de la colonne et ε = VM / VT (porosité)
VR représente, à l'étalement près, le volume de phase mobile nécessaire pour éluer chaque composé.
VM est le volume de phase mobile dans la colonne.
tR et VR sont des grandeurs caractéristiques d'un composé (pour une colonne donnée, un éluant donné et
des conditions expérimentales fixées) qui servent à l'analyse qualitative d'un mélange.
Les espèces non retenues par la phase stationnaire apparaissent dans l'effluent après le temps to
correspondant à l'écoulement du volume interstitiel de la colonne ou volume de phase mobile VM contenu
dans la colonne.
Le volume de rétention VR est relié directement au coefficient de distribution K par la relation:
VR = VM + K VS
VS : volume de la phase stationnaire (ou masse ou surface spécifique selon les unités de K)
Cette relation ne s'applique que dans le cas d'élution linéaire c'est-à-dire quand K varie linéairement avec
la concentration du composé dans chaque phase.
IV.1.3. Le facteur de capacité k' (ou facteur de rétention)
Pour s'affranchir des paramètres géométriques de la colonne, on utilise, pour caractériser la rétention d'un
composé le facteur de capacité. En effet si K varie non linéairement avec la concentration en composé
dans chaque phase, un pic asymétrique se produit et VR varie avec la concentration du composé.
Si on considère une petite section de bandes de longueur dx le rapport des quantités du composé dans les
deux phases de cette section est le facteur de capacité de la colonne k'.
dx
concentration
phase mobile
phase stationnaire
support de phase
distance x
q
k' = q s = Cs .As .dx = Cs .Vs = K Vs
M CM .AM .dx CM .VM VM
AS et AM surface des sections de la phase stationnaire et de la phase mobile.
k' est le paramètre le plus important en chromatographie liquide.
De l'équation VR = VM + K VS on tire
Vs = VR - VM
K
d'où :
VR - VM VR - VM tR - t0
k' = K . = =
K . VM VM t0
Le temps et le volume de rétention sont liés au facteur de capacité par les relations :
tR = to (1 + k') VR = VM (1 + k')
IV.2. SELECTIVITE D’UNE COLONNE
Pour caractériser la distance séparant les sommets de deux pics on utilise le facteur de sélectivité :
tR2 - t0
α=
tR1 - t0
Il s’agit du rapport des temps de rétention réduits
tR - t0 V
k' = soit tR - t0 = k'. t0 et k' = K . s
t0 VM
k' 2 K
α= = 2
k' 1 K1
to et VM ne dépendent que de la colonne
Le facteur de sélectivité mesure la différence de distribution thermodynamique des deux composés. On

démontre que si ∆(∆G°o) = ∆G°2 - ∆G°1 (différence des énergies libres de distribution des deux
composés) on a :
∆(∆
∆G°) = - RT ln α
IV.3. EFFICACITE D’UNE COLONNE. Nombre de plateaux théoriques et de plateaux efficaces
L'efficacité d'une colonne chromatographique, dont dépend l'étalement des pics, est mesurée, pour chaque
composé, par le nombre de plateaux théoriques N de la colonne.
Cette théorie est née de la recherche d'un modèle statique permettant de décrire le fonctionnement d'une
colonne chromatographique comme celui d'une colonne à distiller.
Au lieu de considérer le déplacement réel, continu de la phase mobile, on admet que celle-ci progresse par
sauts successifs et se met en équilibre avec la phase stationnaire entre deux transferts, ce qui permet de
découper fictivement la colonne en un certain nombre de zones dans lesquelles les équilibres sont réalisés
et que l'on appelle plateaux théoriques. On peut ainsi calculer le profil de répartition des espèces, de
proche en proche, après chaque transfert et dans chaque plateau.
Une colonne est alors dite comporter N plateaux théoriques si, dans des conditions données, elle a la
même efficacité qu'une colonne fictive de N plateaux théoriques.
La théorie des plateaux établit qu'après un certain parcours dans la colonne, les pics d'élution peuvent être
assimilés à des courbes de Gauss dont l'écart type (exprimé en unité de temps) est lié au nombre de
plateaux théoriques parcourus par la relation :
N = tR
2
σ
Les caractéristiques géométriques de la courbe de Gauss (figure 3) permettent de calculer, pour un soluté
donné, N à partir du chromatogramme.
2 2
N = 16. tR = 5,54. tR
ω δ
ω largeur du pic à la base: distance entre les points d'intersection des tangentes au point d'inflexion avec la
ligne de base et δ largeur du pic à mi-hauteur.
Pour comparer entre elles des colonnes de différentes longueurs on définit la hauteur équivalente à un
plateau théorique.
HEPT = L L longueur de la colonne.

N
En HPLC les HEPT sont comprises entre 0,001 et 1 mm.
Dans la théorie des plateaux, la HEPT (= L . σ2 / t2R) déduite de la variance n'apparaît que comme une
mesure globale de l'influence de tous les paramètres expérimentaux. Divers modèles ont été élaborés pour
préciser les divers paramètres intervenant dans l'élargissement des pics.
Ainsi l'étalement d'une bande de soluté a trois origines :
- la dispersion par diffusion axiale

- l'existence de chemins multiples dus au remplissage (hétérogénéité d'écoulement)
- la résistance au transfert de masse dans chacune des 2 phases.
largeur initiale
diffusion axiale
de bande
étalement
Hétérogénéité d'écoulement résistance au transfert de masse
dans la phase mobile dans la phase stationnaire
étalement
étalement
étalement
Principales origines de l’étalement d’un « pic » d’analyte en CSL
Ainsi la HEPT totale est la somme de termes dans lesquels les variances seront égales à la variance totale.
HEP T = HEP T i
i
Ainsi la théorie cinétique conduit à l'équation de VAN DEEMTER
Y
HEP T = X + + Z. v
v
v vitesse réduite = vitesse linéaire de la phase mobile.
• X est l'influence de la diffusion turbulente due aux hétérogénéités dans l'écoulement. Il existe plusieurs
chemins possibles pour la phase mobile. Cet effet sera d'autant moins prononcé que les particules seront de
même forme (sphérique) et de même dimension (d’où la nécessité d’utiliser de telles phases).
• Y / v est l'influence de la dispersion des molécules par diffusion longitudinale; Y / v est proportionnel au
coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile DM.
Y = 2 γ DM γ facteur de tortuosité (> 1)
Y / v diminue quand v augmente. Comme DM est faible en milieu liquide, Y / v est généralement
négligeable.
• Zv est l'influence de la résistance au transfert de masse. Z peut être diminué en réduisant les distances à
parcourir par le soluté dans chaque phase (diminution du diamètre des particules).
Cette approche est surtout utilisée en chromatographie phase vapeur.
En chromatographie liquide on utilise souvent l'équation de KNOX

1
HEP T = X. v 3
+ Y + Z. v '
v'
v' vitesse réduite

v . dp
v'=
DM
DM coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile
dp diamètre des particules
HEPT' = H
dp
L'équation de GIDDINGS, basée sur les théories du cheminement aléatoire conduit à une expression
analogue pour la HEPT.
Y 1
HEPT = X +
v
+ Z.v + Σ
1 +1Z .v
X M
Au concept du nombre de plateaux théoriques, on peut associer la notion de plateaux efficaces :

2 2
2 16. t R- t 0 5,54 t R - t 0
k' N ef = N ef =
N ef = .N 2 2
1 + k' soit ω soit encore δ
Ce nombre de plateaux efficaces permet d'apprécier de manière plus concrète la véritable efficacité de
séparation de la colonne. En effet, si k' est petit, la séparation peut être impossible même avec N grand.
La capacité de pics d’une colonne est définie par :
n=1+ N . ln tω
16 tα
N : nombre de plateaux théoriques

t α et tω temps de rétention du premier et du dernier pic du chromatogramme.

Il est nécessaire que n soit supérieur au nombre de coposés pour que la résolution soit correcte. HERMAN
(1985) a montré qu’avec n = 60 on a 90 % de probabilité de séparer 9 composés.
IV. 4. RESOLUTION
La résolution Rs entre deux pics est définie par la relation :
t R1 - t R2
Rs = 2 .
ω1 + ω2
t R2- t R1
ω ω
1 2
Plus Rs est grand, meilleure est la séparation.
La séparation est complète quand Rs = 1 (2 % de recouvrement des 2 pics)
En supposant ω2 = ω1, on a :
1 α- 1 k' 2
Rs = . . . N2
4 α 1 + k' 2
IV.5. TEMPS D'ANALYSE. (Nombre de plateaux efficaces par unité de temps)
L
t R = ( 1 + k' ) .
v
v vitesse linéaire de la phase mobile. Comme HEPT = L / N et to = L / v
HEPT
t R = N .( 1 + k' ) .
v
2
k'
N ef = .N
1 + k' d’où ( division )
2
N ef v k'
= .
tR HEPT 3
1 + k'
IV.6. ELUTION LINEAIRE
Dans le cas d'une élution linéaire, le coefficient de distribution varie linéairement avec la quantité injectée.
A une température donnée, la courbe CS en fonction de CM est l'isotherme d'adsorption. Cet isotherme
peut être linéaire, concave ou convexe (figure 4).
En général en chromatographie liquide la sensibilité des détecteurs est suffisante pour permettre l'injection
de faibles quantités et l'on se trouve dans la partie linéaire de l'isotherme. La pente est égale
CS = K . CM
au coefficient de distribution K.
C C
C isotherme s isotherme s isotherme
s
C M
CM CM
réponse du réponse du réponse du
détecteur détecteur détecteur
t t t
R R R
t t t
R R R
quantité injectée quantité injectée quantité injectée
Figure 4. Influence de la forme de l'isotherme d'adsorption sur la géométrie du pic et sur le temps de
rétention.
IV.7. PERTE DE CHARGE DANS UNE COLONNE (Loi de DARCY)
ηLv
∆P =
Ko avec
2 3
o
K =
dp
.
ε
180 2
1 - ε
∆P perte de charge (en barye = 10-6 bars)

η viscosité (poise)
L longueur de la colonne (cm)
v vitesse de la phase mobile (cm.s-1)
K° constante de perméabilité (cm2)
dp diamètre des particules (cm)
ε porosité interstitielle (volume interstitiel de la colonne/volume total).
VERILLON et al., International Laboratory, July 1992, 29-35 proposent la loi suivante :
F.L . η
∆ P = 400 .
d2p . d2c
avec ∆P en MPa
F débit en ml.min-1
L longueur de la colonne en cm
η viscosité en cP
dp diamètre des particules en µm et dc diamètre de la colonne en mm
V. OPTIMISATION DES CONDITIONS D'UNE ANALYSE
L'idéal est d'obtenir une résolution élevée en un temps très court.
• On peut envisager d'augmenter la longueur de la colonne (la vitesse d'analyse va augmenter ainsi que la
perte de charge).
• On peut diminuer le diamètre des particules (HEPT diminue, mais la perte de charge augmente).
• On peut augmenter la vitesse de la phase mobile (HEPT augmente, la pression aussi).
V.1. OPTIMISATION DE LA RESOLUTION
Il faut augmenter Rs
1 α- 1 k' 2 1 α- 1 1
Rs = . . . N2 Rs = . Nef 2
4 α 1 + k' 2 4 α
ou
Rs doit être > 1
V.1.1. Action sur la sélectivité α
tR2 - t0
α=
tR1 - t0
La résolution augmente quand α augmente.

La séparation n'est possible que si α 1.
Le nombre de plateaux efficace (Nef) nécessaires pour obtenir une résolution donnée en fonction de α
diminue très vite quand α > 1 (tableau 1).
Cette forte influence de α justifie l'utilisation de phases stationnaires ayant des groupements fonctionnels
adéquats.
La sélectivité peut être modifiée :
- en changeant la nature et la composition de la phase mobile ce qui induit des effets secondaires (pH -
ionisation etc...)
- en changeant la nature de la phase stationnaire
- en modifiant la température.
Tableau 1. Variation du nombre de plateaux efficaces en fonction de α pour obtenir Rs = 1 ou Rs = 1,5
α Nef
RS = 1 RS = 1,5
1,01 160 000 360 000

1,05 6 800 15 700
1,10 1940 4 360
1,15 940 2 110
1,20 575 1 300
1,25 400 900
V.1.2. Action sur le facteur de capacité k' (nature de phase stationnaire surtout)
Si k' = 0 les deux solutés sont élués simultanément et après écoulement du volume interstitiel.
La résolution augmente quand k' augmente , mais de moins en moins vite car k' tend rapidement vers
1. k'+1
Le temps d'analyse augmente beaucoup plus rapidement que k' car on a :
L
t R2 = 1 + k' 2 .
v
L longueur de la colonne et v vitesse linéaire réduite.
(si k' augmente de 5 à 10, Rs augmente de 9 %, le temps d'analyse de 80 %).
V.1.3. Action sur l'efficacité
Doubler N multiplie Rs par 1,41. Il n'y a pas de limite à l'accroissement de Rs avec N. Si on augmente N
en doublant la longueur de la colonne, on double tR car tR = L / v .(1+k'). Il faut diminuer HEPT.
V.1.3.1. Influence de la vitesse de la phase mobile sur HEPT
L'équation de VAN DEEMTER (ou de KNOX) permet de suivre les variations de HEPT en fonction de la
vitesse linéaire de la phase mobile.
HEPT
CPG
CPL
Cependant, dans un certain domaine de vitesse de la phase mobile, la HEPT déterminée

expérimentalement vérifie la relation de SNYDER.
HEPT = Avn
n généralement compris entre 0,2 et 0,7. A constante pour une colonne donnée; v : vitesse linéaire
réduite de la phase mobile; n : coefficient fonction de la séparation étudiée.
140
dp = 12 µm
dp = 5 µm
120
HEPT (µm)
100
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
vitesse linéaire (cm/min)
On peut accroître l'efficacité d'une colonne en diminuant v. Cependant en-dessous de 3 ml.min-1 HEPT
passe par un minimum puis croit en raison de la diffusion longitudinale.
V.1.3.2. Influence du diamètre des particules sur HEPT
La résistance au transfert de masse constitue le facteur limitatif à la cinétique des échanges et pour
augmenter celle-ci il faut diminuer au maximum la distance que doit parcourir le soluté entre les différents
sites, ce qui est possible en diminuant la taille des particules.
Empiriquement il a été démontré que
HEPT = B . dpß
dp diamètre des particules; B et b constantes pour une colonne donnée. Les valeurs de ß sont sensiblement
constantes et voisines de 1,6 à 1,8.
HEPT
5 (mm)
0,5
0,1
diamètre des
0 particules (µm)
2 5 10 20
La figure ci-dessus illustre le gain d'efficacité quand on passe d'une silice avec dp = 20 mm à dp = 3 mm.
Le remplissage des colonnes avec des phases stationnaires de fine granulométrie entraîne une
augmentation importante de l'efficacité, donc de la résolution . Un compromis doit cependant être réalisé
car si dp diminue, la perte de charge augmente de façon inversement proportionnelle à dp2
2
η. L . v . 1 8 0 . 1 - ε
∆P =
2 3
dp . ε
et des difficultés de remplissage apparaissent. L’exemple de séparation chromatographique de
phénothiazines obtenu pour deux dp est donné ci-dessous.
1 2
A 3 B
2 3
0 5 10 t R (min) 0 5 10 t (min)
R
currentpoint
S S S
N Cl Cl N Cl
N
(CH 2)3 (CH 2 )3 (CH 2 )3
N N N O
CH 3 H CH3 CH 3
(CH 2)3 CH 3
N
CH 3 CH 3 currentpoint
dérivé 1 dérivé 2 dérivé 3
Figure 4. Comparaison des chromatogrammes de 3 phénothiazines (k'1 = 3 ; k'2 = 6,5 ; k'3 = 15) en
fonction du diamètre des particules d'un gel de silice. Colonne de 25 cm L et 2,1 mm de Ø, v = 0,7 cm.s-1,
détection 254 nm. Phase mobile : acétate d'éthyle / méthanol / éthylamine à 33 % (80/20/0,25).
A dp = 40 mm, P = 3 bars B dp = 10 mm, P = 35 bars
V.1.3.3. Influence des caractéristiques de la colonne
a) Influence de la longueur de la colonne
Dans des conditions idéales de remplissage de la colonne, la HEPT est indépendante de la longueur de la
colonne et l'efficacité de la colonne est proportionnelle à sa longueur HEPT = L / N. En réalité, selon dp, le
remplissage de la colonne n'est pas idéal et HEPT varie (Tableau 2 pour la phénothiazine 1).
Rappelons que la perte de charge est proportionnelle à la longueur de la colonne.
tableau 2. Variation de la HEPT pour la phénothiazine I en fonction de la longueur de la colonne (L) et de

dp et en fonction du diamètre de la colonne.
diamètre de la HEPT (mm) colonne L = 15 cm

colonne 21 mm silice dp 10 µm
L (cm) silice dp 10 silice dp 10 diamètre de la HEPT

µm µm colonne (mm)
(mm)
15 0,33 4,1 6,36 0,17

25 0,34 4,0 4,3 0,17
50 0,5 3,4 2,1 0,33
100 0,6 à 3,3 4,5
Le modèle de colonne le plus utilisé a 25 cm de longueur et 4,6 mm de diamètre.
Ces colonnes sont en acier inoxydable. Remplies d’une phase stationnaire avec des particules sphériques
de 5 µm de diamètre, elles permettent, selon la nature de la phase stationnaire, de réaliser la plupart des
séparations attendues dans les sciences des aliments. Des colonnes de 3 cm x 4,6 mm permettent des
analyses de mélanges simples en routine.
Dans le plupart des analyses une pré-colonne qui ne diffère de la colonne « analytique » que par sa très
faible longueur (par exemple 1 à 2 cm pour une colonne de 25 cm) permet de protéger la colonne et d’en
augmenter la durée de fonctionnement.
b) influence du diamètre
D'une façon générale les colonnes de faible diamètre (< 5 mm) sont plus efficaces, la différence étant
d'autant plus grande que dp est petit (tableau 2). Le phénomène est dû à un remplissage plus homogène des
colonnes de faible diamètre par rapport à celui des colonnes de très faible diamètre (cf IV-7).
Les colonnes Microbore ont des diamètres internes de 1 à 2,1 mm. Leur mauvais succès résulte surtout de
la généralisation d’équipement adaptés aux colonnes de 4,6 mm de diamètre. Le passage d’une colonne de
4,6 mm à 1 mm se traduit par une diminution de débit d’un facteur 21. Il faut alors disposer de pompes
capables de délivrer avec constance des débits de l’ordre de 30 à 50 µL.min-1. Si un système d’élution par
gradient est utilisé il faut alors disposer de pompes capables de délivrer les phases mobiles avec des débits
contrôlés de quelques µL.min-1.pour la pompe qui délivre les plus petits débits de phase mobile.
Il existe des colonnes capillaires dont le diamètre varie entre 10 et 300 µm. Elles sont remplies avec des
particules de 0,2 à 0,5 µm de diamètre.
Par exemple une colonne de 192 mm x 0,3 mm permet la séparation de 5 protéines en 30 secondes avec un
débit de 1,2 mL.min-1 ce qui représente une vitesse linéaire de phase mobile de 128 cm.min-1. La pression
atteinte n’est que de 24 bar.
De tels systèmes qualifiés de nano-chromatographiques.
Dupont de Nemours propose de telles colonnes qui posent actuellement des problèmes d’utilisation du fait
de la difficulté à trouver les pompes et les connexions nécessaires à leur utilisation mais aussi en raison du
manque de sensibilité de la plupart des détecteurs. En effet les quantités d’analytes sont très faibles et
souvent en dessous du seuil de sensibilité des appareils actuels.
V.1.3.4. Influence de l'injection
L'injection en chromatographie en phase liquide est une opération délicate actuellement automatisée .
a) Influence de la position de l'injection.
La position de l'injection par rapport au niveau de la phase stationnaire revêt une grande importance
(figure 5). L'efficacité passe par un maximum quand l'injection est effectuée quelques mm en-dessous du
niveau supérieur de la phase stationnaire.
b) Influence du volume injecté.
Le volume injecté doit être de quelques ml; s'il augmente, l'efficacité de la colonne diminue (figure 5).
disque injection injection HEPT

poreux type I (µm)
type II côte 0 volume
8 mm
type
type III (µl)
15 mm
I 36
type IV II 83
5 cm
1 III 37
IV 58
silice
dp = 5 µm I 43
II 95
10
III 45
4,8 mm
IV 64
Figure 5. Influence du mode et du volume d'injection sur la HEPT (phénothiazine) v = 0,25 cm.s-1
De plus l'injection de grands volumes entraîne souvent des déformations des pics. Il apparaît des
épaulements ou des dédoublements qui indiquent alors une injection en deux temps.
L'injection doit être rapide et continue avec ou sans interruption de l'écoulement de la phase liquide.
En résumé, il est préférable d'injecter 2 µl d'une solution 10-3 M plutôt que 20 µl dune solution 10-4 M.
c) Influence du type d'injecteur

.
Il existe deux types d'injection (figure 6) :
- l'injection par seringue qui ne se rencontre pratiquement pas en HPLC.
Il est impossible d'emprisonner le volume injecté dans le disque poreux situé sur la tête de colonne, et de
ce fait, il se produit une dilution importante du volume injecté dans l'éluant, ce qui entraîne une efficacité
plus faible qu'avec l'injection par seringue.
- l'injection par vanne (boucle d'échantillonnage). Ce type d'injection qui est celui retenu dans les
systèmes automatisés, ne permet pas d'atteindre l'efficacité maximale.
disque
d'étanchéité
v
a b
b
fritté a
colonne colonne
pompe colonne
pompe
remplissage injection
1/3 de tour
Injection par seringue
Vanne à boucle interne
Vanne à boucle externe
pompe pompe
colonne colonne
boucle externe boucle externe
qualibrée qualibrée
remplissage 1/6 de tour injection
Figure 6. Systèmes d'injection de l'échantillon à analyser en CPL
V.2. OPTIMISATION DU TEMPS D'ANALYSE
Il est important, pour des raisons pratiques, que la durée de l'analyse soit la plus courte possible (environ
10 min). Pour une résolution donnée, il faut donc déterminer les conditions conduisant au temps d'analyse
minimum.
V.2.1. Optimisation du nombre de plateaux efficaces par seconde
A résolution et sélectivité données, le nombre de plateaux efficaces nécessaires à la séparation est fixé et
donné par :
1 α- 1
Rs = . . N ef
4 α
Dans ce cas, le temps d'analyse sera d'autant plus court que le nombre de plateaux efficaces par seconde
sera plus grand.
N ef 2
= v . k'
tr HEPT 1 + k' 3
a) Effet du terme en k' (figure 7)
2
k'
(1 + k' ) 3
0,15
0,10
0,05
0
0 k'
5 10 15
Figure 7. Variation de k'2 en fonction de k’

(1+k) 3
Les variations de k'2 en fonction de k' montrent que la courbe passe par un
(1+k')3
maximum pour k' = 2 si HEPT est indépendant de k'.
b) Effet du terme v / HEPT
Les deux variables ne sont pas indépendantes HEPT = Avn et HEPT = B dßp
En combinant les deux relations on peut écrire :

HEPT = KH . dßp . vn avec ß ~ 1,8
v =v.v
n n-1 0,3 < n < 0,7
v 1-n
v n
= 1 = v
HEPT K H. d2p HEPT K H . d2p
d’où
On peut augmenter ce rapport :

- en augmentant v (puisque n < 1)
- en diminuant le diamètre des particules.
La perte de charge va cependant augmenterdans ces conditions.
V.2.2. Pression et temps d'analyse
* tR = L (1+ k') HEPT = L

v N
tR = N (1 + k') HEPT avec ** HEPT = KH dßp vn

v
La perte de charge est donnée par la loi de DARCY

η Lv d2p
∆P = K° = . ε3
K° 180 (1 - ε )2
180 (1 - ε )2
∆P = J v.l. η. avec J =
d2p ε3
En combinant *, ** et *** on obtient :
a . (η .J )b . N a . dc
KH p
tR = (1 + k')
∆ Pb
2 1 - n 1 - n
a= b= c= β- 2 -β
1 + n 1 + n 1 + n
en prenant n = 0,5 et b = 1,8
KH1,33. (η.J)0,33 . N 1,33 . dp1,73

tR = ________________________________ ( 1 + k' )
∆P0,33
A KH, J, N et k' constants, on peut donc diminuer tR en diminuant dp ou en augmentant ∆P. La figure 8
montrent les variations de tR en fonction de ∆P pour divers dp.
Ainsi pour une pression de 70 atm, le passage de dp 40 à 5 mm permet de réduire le temps d'analyse de
7h30 à 10 min.
t (sec)
R
5
10
10 h
4
10 1h
d = 40 µm
p
3 30 min d
p = 20 µm
10
10 min d = 10 µ m
p
5 min
1 min d = 5 µm
2 p
10 pression (bars)
0 10 100 1000 10000
Figure 8. Variation du temps d'analyse en fonction de la pression à différentes granulométries

η = 1,8 cp ; α = 1,05 ; Rs = 1 ; N = 28 250 ; n = 0,6.
V.3. OPTIMISATION DE LA PERTE DE CHARGE
Il est important de réduire les pertes de charge car travailler sous haute pression est toujours synonyme de
difficultés techniques.
Pour maintenir RS et tR constants il faut que :

1 - le volume de la phase stationnaire reste constant
2 - le nombre total de plateaux théoriques reste constant quels que soient le débit ou la longueur de la
colonne
3 - le nombre de plateaux efficaces par unité de temps soit constant.
HEPT = KH.dpβ vn β = 1,8 et n compris entre 0,3 et 0,7
L L
N= = const ant e tR= . 1 + k'
HEPT v d’où
HEPT
t R = N ( 1 + k' ) .
v
k' est constant pour un composé donné avec phases stationnaire et mobile données.
Il faut donc que L / v = constante
Si on divise dp par 2, HEPT est divisé par 2β.
Pour que tR reste constant il faut diviser L et v par 2β ce qui entraîne que HEPT est divisé par 2βn. Il faut
donc à nouveau divisier L et v par 2 βn et ainsi de suite.
On obtient une série convergente dont la somme des termes est :
ß
21-n
Ainsi avec β = 1,8 et n = 0,5 diviser dp par 2 permet de diviser L et v par 23.6 soit environ 12.
Si dp est divisé par 2
ηLv . 180 (1-ε)2
∆P = _______________
2 3
dp . ε
23,6 . 23,6
∆P est divisé par ________ soit par 37
22
En divisant par 2, on obtient une séparation identique quant à sa durée et sa résolution avec une
colonne 12 fois plus courte et un débit 12 fois plus faible ce qui nécessite une ∆P 37 fois plus faible.
Plus la colonne sera courte et plus son diamètre sera grand car Vs = Cte.
Il faut signaler deux limites à ces diminutions de L, v et dp
1 - il est impossible d'augmenter beaucoup le diamètre des colonnes sans entraîner des perturbations
notables dans l'écoulement de la phase mobile.
2 - il est peu probable que l'on puisse diminuer le diamètre des particules en dessous de 1 µm.
V.4 . CONCLUSION
L'optimisation d'une analyse par CPL est difficile en raison de multiples paramètres sur lesquels on peut
agir. En fait, dans la pratique, on s'efforcera d'abord de choisir les conditions chimiques de la séparation
(nature et composition chimique de la phase stationnaire, nature et composition chimique de l'éluant,
modification éventuelle des produits à séparer) pour que le facteur de sélectivité ne soit pas trop proche de
1 et pour les facteurs de capacité soient compris entre 1 et 10.
Le choix de la colonne (limité par les fournisseurs) se limitera à celles de faible longueur (25 cm) et de
4,8 mm de diamètre par exemple. Les particules devront avoir un dp de l'ordre de 5-10 µm.
On veillera à ce que l'injection soit la "moins mauvaise" possible.
V.5. DETERMINATION GRAPHIQUE DES PARAMETRESopt
Les principaux paramètres pour optimiser une analyse sont indiqués sur la figure 9 pour une viscosité de la
phase mobile faible et égale à 0,44 cP. Il existe de tels diagrammes pour des phases mobiles de viscosités
autres.
1000 ∆ P ( bar)
L ( cm) 300
1000 N 100
30
300 10
1000000 3
100 1
30
10
100000
η = 0,44 cp
10000
1000
d ( µ m)
p
1 3 20 30 100
t R (sec)
10000
3000
1000
300
100
30
10
10 5 2 1 0,5 0,1 -1
v ( cm. sec )
5 10 20 50 100 200
HEPT ( µ m)
-1
(sec )
5000 500 100 20 5 0,2 Nef / t
R
figure 9. Détermination graphique des paramètres optima en chromatographie en phase liquide

VI. DIFFERENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE EN FONCTION DES PHENOMENES

MIS EN JEU
En chromatographie en phase liquide les principales interactions qui régissent les mécanismes de rétention
et d’élution de solutés sont, en fonction de l’énergie mise en jeu, liées à des liaisons chimiques:
- soit de Van der Waals (1 à 9 kJ.mole-1). Il s’agit d’interactions dipolaires liées à la présence de dipôles
induits et instantanés ou permanents dans la molécules. Ces interactions existent dans pratiquement tous
les systèmes chromatographiques. Leur rôle est souvent négligé en raison de leur faible énergie. Ces
interactions se produisent à faible distance (0,3 à 0,6 nm) et diminuent d’intensité quand la température
augmente.
- soit hydrophobes (4 à 12 kJ.mole-1). Dans ce cas, c’est l’attraction entre deux (ou plus) molécules d’eau
séparées par une molécule ne donnant que peu ou d’interaction avec elles qui chasse cette molécule
currentpoint
H H H
molécule
O apolaire O O
H H H
currentpoint
Dans ce cas, moins la molécule est polaire (incapable de donner des interactions avec l’eau) et plus forte
est la répulsion. La chaleur augmente l’agitation des molécules d’eau et augmente donc la force de
répulsion.
Ces interactions se produisent entre 0,2 et 0,4 nm.
- soit hydrogène (8 à 40 kJ.mole-1). Il s’agit d’une interaction dans laquelle deux atomes électronégatifs
dont l’un est lié à un atome d’hydrogène “partagent” inégalement cet atome. La distance de ces liaisons est
d’environ 0,2 nm.
currentpoint
N H O C O
O H
currentpoint
Ces interactions sont données par l’eau ; elles diminuent d’intensité avec la température.
- soit polaires ionisées (électrostatiques ou de Coulomb, 40 à 85 kJ.mole-1). Ces interactions entre ions
dépendent, pour la plupart des groupes ionisables organiques, du pH. Ainsi par exemple les groupements
carboxyles ne sont ionisés significativement qu’à des pH > pKa.
L’intensité de ces liaisons de forte énergie diminue avec la température.
- soit covalentes (330 à 400 kJ.mole-1). L’énergie de ces liaisons est très élevé et leur réversibilité
nécessaire à leur implication en chromatographie en phase liquide n’est pas toujours accessible.
Les seules liaisons covalentes réversibles utilisables en chromatographie en phase liquide sont les liaisons
par pont disulfure. Ces liaisons sont peu sensibles aux variations de température dans des conditions de pH
ou de potentiel d’oxydoréduction données.
Les différents systèmes chromatographiques diffèreront les uns des autres par la nature des interactions
chimiques échangées entre soluté, solvant et phase stationnaire. Pour qu’une phase stationnaire soit
utilisable il est donc nécessaire qu’elle donne une (ou plusieurs) interaction avec le soluté (pour le retenir),
mais il est aussi nécessaire que le solvant constituant la phase mobile donne des interactions avec le soluté
(pour l’éluer) et avec la phase stationnaire.
Il n’existe pas de phase stationnaire « inerte » et il faudra toujours se préoccuper des interactions qu’elle
est susceptible de donner même dans des chromatographies où elle n’intervient en principe que par un
aspect « stérique ».
VI.1. LA CHROMATOGRAPHIE D'ADSORPTION
La phase stationaire est un adsorbant et la séparation est fondée sur les différences d'adsorption des
molécules du mélange sur cette phase (CLS). Les premières séparations chromatographiques ont utilisées
comme phases stationnaires « principales » soit la silice, soit la cellulose. Il en résulte que tous les modèles
réalisés à partir de ces phases reposaient sur un échange analyte - phase mobile - phase stationnaire
essentiellement du type liaison hydrogène. Sans indication quant à la nature de la phase stationnaire, toutes
les données qui seront inhérentes à la « chromatographie d’adsorption » seront donc fondées sur ce type
d’échange.
C'est cette technique, couramment utilisée qui offre les possibilités les plus vastes. Elle s'applique très bien
aux composés organiques dont la masse molaire est comprise entre 200 et 1000, que ces composés soient
volatils ou non. Son domaine d'élection est la séparation de composés organiques renfermant des
groupements fonctionnels différents ainsi que celle de certains types d'isomères.
Elle s'applique mal à la séparation de solutés très peu polaires (par exemple ceux qui ne se différencient
que par la longueur de leur chaîne aliphatique).
VI.1.1. Thermodynamique de l'adsorption
SNYDER (Principles of Adsorption Chromatography, M. Dekker, NY, 1968) a traité ce sujet en détail.
Le volume de rétention d'un soluté est directement lié à la compétition entre les molécules de solvant M et
de soluté S à la surface de l'adsorbant a. On admet généralement que cette surface est recouverte d'une
couche monomoléculaire constituée par des molécules de la phase mobile M et de soluté S.
L'équilibre d'adsorption et de désorption peut s'écrire :

currentpoint
S (M ) + nM(a) currentpoint
S(a) +nM(M)
soluté phase soluté phase

dans mobile adsorbée adsorbé mobile "libre"
phase
mobile
currentpoint
L'adsorption d'une molécule de soluté S(M)
currentpointcurrentpoint
S(a) se traduit par le départ de n molécules de
solvants de la surface de l'adsorbant nM(a) currentpoint
nM(M).
L'énergie d'adsorption est donnée par :
Ea = ES(a) + n EM(M) - ES(M) - n EM(a)
Les termes des énergies en solution sont faibles et on a :
Ea = ES(a) - n EM(a)
ES(a) est constante et ne dépend pas du solvant.

EM(a) dépend du solvant et du support mais pas de l'échantillon .
Une équation reliant le facteur de capacité k' du soluté aux propriétés de l'adsorbant a été proposée
par SNYDER
o o VS
log k' = log V a + β (S - ε . A S ) + log
VM
Va : volume de phase mobile adsorbée par gramme d'adsorbant

β : activité de l'adsorbant (en général comprise entre 0,5 et 0,9)
S° - ε°AS est lié aux propriétés de l'éluant et du soluté.
S° : énergie libre d'adsorption du soluté par unité de surface d'adsorbant dans des
conditions d'activité standard (b = 1)
As : surface occupée sur l'adsorbant par une mole de soluté
ε° : énergie libre d'adsorption des molécules de la phase mobile par unité de surface
d'adsorbant
VS: volume phase stationnaire
VM : volume phase mobile.
o
o
∆G
S = -
2 , 3 RT
∆G° : variation d'énergie libre d'adsorption
R : constante des gaz parfaits
T : température absolue (°Kelvin)
Cette loi peut se simplifier de la façon suivante:
o
log k' = A - ε .B A et B = constantes
Il apparaît alors que plus la valeur de εo augmente et plus le log de k’ diminue et inversement. Il s’agit
donc là d’un paramètre très important dans ce type de chromatographie : il permet de maîtriser tR
SNYDER a décrit une série éluotropique (force éluante d'un solvant) à partir des valeurs de l'énergie libre
d'adsorption e° des molécules de solvant sur la surface de l'adsorbant (tableau 3).
Tableau 3. Série éluotropique pour l'alumine. Pour la silice, les valeurs sont à multiplier par 0,77.
εo εo εo
n-pentane O benzène 0,32 diméthylsulfoxyde 0,62

isooctane 0,01 bromure d'éthyle 0,37 aniline 0,62
n-heptane 0,01 éther éthylique 0,38 nitrométhane 0,64
cyclohexane 0,04 chloroforme 0,40 acétonitrile 0,65
cyclopentane 0,05 chlorure de méthylène 0,42 pyridine 0,71
sulfure de carbone 0,15 tétrahydrofurane 0,45 alcool isopropylique 0,82
CCl4 0,18 méthyl éthylcétone 0,51 alcool éthylique 0,88
chlorure d'amyle 0,26 acétone 0,56 alcool méthylique 0,95
éther isopropylique 0,28 dioxane 0,56 éthylène glycol 1,11
toluène 0,29 acétate d'éthyle 0,58 acide acétique grand
chlorobenzène 0,30 alcool amylique 0,69
Si εo augmente, log k’ diminue et la rétention diminue
(avec ce type de chromatographie d’adsorption à phase stationnaire polaire)
VI.1.2. Adsorbants utilisés en CLS
Le processus de l'adsorption est complexe et les forces mises en jeu qui dépendent du soluté, du solvant et
de l'adsorbant sont nombreuses (forces de dispersion de London, forces électrostatiques, forces de liaisons
hydrogène etc...). Il devient alors impossible de préciser la part relative de ces différentes forces
d'adsorption car pratiquement on n'observe que leur résultante.
Par ailleurs, du fait de la présence d'eau (même à l'état de traces) dans les phases stationnaire et mobile il
est également impossible de préciser la part de la chromatographie de partage à côté de la chromatographie
d'adsorption.
Malgré ces nombreuses interactions, les prévisions en chromatographie liquide d'adsorption sont
relativement simples (particulièrement quand des adsorbants polaires où les liaisons hydrogène constituent
les forces dominantes sont utilisés : silice ou alumine ou cellulose).
SNYDER distingue ainsi 4 types d'adsorbants
I inorganiques polaires silice, alumine

II inorganiques apolaires graphite, charbon
III greffés polaires aminopropyl (NH2), cyanopropyl (CN)
IV greffés apolaires C18 - C8
VI.1.2.1. Adsorbant de type I - Silice ou Alumine
Les sites actifs sur lesquels s'adsorbent les molécules de solutés sont, pour la silice, des groupes silanol*.
Ces groupes sont de trois types :
H H H H H
O O O O O HO OH
Si Si Si Si Si
Si
silanols à liaison hydrogène silanols géminaux
ssilanol isolés
- H2 O
O
siloxane
Si Si
isolé à liaison hydrogène
Pour des pH supérieurs à 8 la silice n’est pas stable et se dissout. Toutes les phases qui utiliseront une
base silice seront donc limitées au niveau du pH de leur phase mobile à 8.
En présence d'eau, la plupart de ces groupes sont associés cette molécule. Cette eau doit être éliminée par
chaufface prolongé à 150°C. Un chauffage à température supérieure à 200°C se traduit à partir des silanols
à liaison hydrogène, par la formation de siloxane dont le caractère apolaire est important.
OH
OH
O Si OH
O Si
O Si
O
O Si O O OH
OH
Si Si
O O
O
Si O
O Si + :NR3 :NR3
O OH Si O H
O
O Si O O
Si
O OH Si
O O OH
Si
O
Si OH
L'expérience montre que la silice convient bien à la séparation de solutés qui sont des bases au sens de
Brönsted (exemple : amines qui se fixent néanmoins de façon souvent de façon irréversible) ; on dit que
cet adsorbant a un caractère acide.
Le gel de silice est préparé par précipitation acide de silicate de sodium : il se produit une polymérisation
de l’acide silicique formé en un réseau appelé hydrogel. En solution diluée un gel « faible »ou un précipité
est obtenu tandis qu’en milieu concentré l’hydrogel est ferme. Le séchage de ce dernier conduit à un
xérogel (photographie b obtenue par microscopie électronique à balayage).
a Les gels de silice présentent une structure poreuse.
KIRKLAND J.J. (LC.GC, 1996, 14, (6), 486-500) a obtenu la gélification

de silicates solubles par cohalescence avec formation de structures de
type sil-gel (photographie a obtenue par microscopie électronique à
balayage). Les subparticules de ce gel sont homogènes; la porosité est de
50%; le gel a une surface de 150 m2 / g et les pores ont 10 nm de
diamètre. Relativement stables aux pH élevés.
Le xérogel b est spongieux; sa porosité est de 70% et sa surface de 300

b m2 / g. Les pores ont un diamètre de 10 nm
Quand la surface est complètement hydroxylée, le gel de silice a une

densité de groupements silanols de 8 µmole / m2. Ces silanols sont
localisés pour la plupart dans des micropores de 1 nm de diamètre ce qui
ne les rend accessibles qu’à des analytes de faibles dimensions
moléculaires.
La silice peut être utilisée en milieux aqueux et non aqueux.
Inversement, l'alumine convient bien pour la séparation de solutés acides (phénols, acides carboxyliques) ;
cet adsorbant est dit basique.
Al Al
O O O
Al OH O- Al O H
R
O O
Al O + R C Al O O-
O
O Al OH O Al OH
O O
Al Al
a) Influence des groupements fonctionnels du soluté
Avec ces adsorbants de type I, les molécules polaires sont toujours plus adsorbées que les molécules non
polaires.
amides > amines > acides carboxyliques >alcools > cétones > esters > composés nitrés > éthers >
hydrocarbures aromatiques > hydrocarbures non saturés > hydrocarbures saturés.
b) Influence de la force d'élution du solvant
La force élutive d'un solvant est caractérisée par ε° (tableau 3). Une augmentation de 0,05 de la force
élutive diminue environ de moitié la valeur du facteur de capacité k'.
En pratique, on recherche une valeur de force élutive qui donne une rétention convenable.
c) Différents types de support
Deux paramètres caractérisent ce type de phase stationnaire :

- la granulométrie. Ainsi de 60 µm pour dp pour la chromatographie liquide/solide classique, on est passé
à des valeurs de dp comprises entre 1 et 10 µm.
- la forme. Les grains de silice avaient à l'origine une structure irrégulière. Actuellement ces grains sont le
plus souvent sphériques.
Il existe des grains constitués par un noyau compact (ø 30 µm) recouverts d'une fine pellicule poreuse (1
µm) : ce sont les supports pelliculaires.
Généralités sur les phases greffées sur les particules de silice.
Ces phases reposent sur l’établissement d’une liaison silyléther. Elle est obtenue par réaction de la silice
avec des dérivés du type monochlorodiméthylsilane ou trichlorosilane pour les plus importants.
CH 3 CH 3
Si O + Cl Si R Si O Si R
H CH 3 CH 3
monochlorodiméthylsilane
Si O Si O
Cl Cl
H + R Si
Cl Si
R
Si O Cl Si O
H
trichlorosilane
La liaison Si - O - Si n’est pas stable pour des pH inférieurs à 2. La plage d’utilisation des phases
greffées s’étend donc de pH 2 à pH 8. Néanmoins de nombreux travaux ont été réalisés pour élargir cette
gamme. Par exemple la substitution des groupements méthyls par des groupes plus volumineux (propyls
par exemple) minimise les possibilités d’hydrolyse et permet donc d’élargir la gamme d’utilisation
possible de ces phases stationnaires.
CH3
CH2
CH3 CH2
Si O Si Si O Si
CH3 CH2 CH
2
Si OH CH3
Si
CH2
CH3 CH2
Si O Si Si O Si
CH3 CH2
CH2
Si OH CH3
Si
OH
silice greffée avec du chlorodiméthyl- silice greffée avec du chlorodipropyl-
octadécyl silane octadécylsilane
IV.1.2.2. Adsorbant de type III. Phases greffées polaires
Les principaux groupes fonctionnels des phases greffées polaires sont indiqués dans le tableau 4. Ces
phases sont classées en fonction de leur polarité.
analyse de :
- faiblement polaires (glycophase ou diolphase diméthylamino) composés carbonylés
- moyennement polaires (cyano) phénols , amines , esters
- fortement polaires (amino, diamino) oses, osides, peptides, nucléotides
Un exemple de chromatrogramme d’oses obtenu sur une silice greffée NH2 est donné sur la figure 10.
3
2
1 5
t
(min)
0 10 20 R
Figure 10. Séparation fructose (1), glucose (2), saccharose (3), maltose (4) et lactose (5) sur Si greffée
NH2. dp = 10 mm. Colonne L = 30 cm, Ø = 3,9 mm. Eluant acétonitrile/eau (80/20). Débit 2 ml/min.
Détection réfractométrique.
Tableau 4. Groupes fonctionnels de phases polaires greffées et applications principales
Type de phase Structure du greffon Applications

CH2 OH
quinones, flavones, amines,
glycophase (Diol) Si O Si (CH2 )3 O CH2 CH peptides, protéines,etc...
OH
glucides (oses), vitamines,
amino Si O Si (CH2 )3 NH 2 isomères D-L, peptides,
alcools, nucléosides, etc...
CH3
diméthylamino Si O Si (CH2 )3 N cf diol
CH3
diamino Si O Si (CH2 )3 NH (CH2 )2 NH 2 cf amino
cyano Si O Si (CH2 )2 C N lipides, stéroïdes, pesticides,

phénols, amines, esters, etc..
VI.1.2.3. Adsorbant de type IV. Phases greffées apolaires
Les phases greffées apolaires représentent les phases stationnaires les plus utilisées en HPLC. Ces phases
(qualifiées de réverses ou d'inverses) sont préparées à partir de silice par formation d’une liaison
éthersilyl (cf généralités sur les phases greffées)
La longueur du greffon alkyle R s’il s’git d’une chaîne aliphatique ou la nature même de cette chaîne
(groupements phényl, etc) sert à caractériser la phase.
RP 8 implique R = (CH2)7 - CH3 (octyl)

RP18 implique R = (CH2)17 - CH3 (octadécyl)
.
Les phases RP 8 et RP 18 sont les plus répandues et les plus utilisées.
Les applications possibles de ce type de phases stationnaires sont très nombreuses:
RP 8 substances lipophiles ou moyennement polaires

Bien adaptable à la chromatographie par appariemment d'ions
Substances polyaromatiques, antibiotiques, vitamines hydrosolubles, acides et
esters organiques, hydrocarbures, corticostéroïdes, barbituriques, phospholipides, etc...
RP 18 Substances lipophiles, acides aminés, etc..
En réalisant une surface hydrophobe on inverse totalement la nature des interactions fournies par la silice.
L'eau n'a pas d'affinité pour le greffon hydrophobe et la force éluante des solvants est exactement l'inverse
de celle qui est observée sur supports polaires d'où le terme reversed phase (RP) appliqué à ce genre de
support.
Les solutés les plus polaires seront les moins retenus, les solutés apolaires seront retenus d’autant
plus fortement que leur hydrophobicité est élevée.
La rétention des composés apolaires croit avec la longueur du greffon et avec le taux de greffage de la
surface (surface coverage). La taille des particules n'a pas d'effet sur la rétention exprimée par le facteur de
capacité k', les effets de la taille ne concernant que la pression et la HEPT.
a) mécanisme de rétention
Malgré tous les travaux qui lui sont consacrés, il existe encore beaucoup de flou dans son interprétation.
Dans la théorie solvophobique, ce sont les interactions apolaires dans un solvant polaire qui sont décrites.
On peut schématiser les forces mises en jeu, forces dont la résultante est la force de liaison entre le soluté
et la phase greffée (figure 11).
zone hydrophile
1 forces de Van der Waals entre soluté
et phase stationnaire
eau
2 forces liées à l'hydrophobicité
particule 3
greffon 1 3 interactions hydrophobes entre
de
apolaire molécules de solutés
silice 2 4 interactions polaires entre
4 molécules de solutés et entre molécules
de solutés et l'eau
zone hydrophobe
du soluté
Figure 11. Représentation schématique des interactions mises en jeu dans la chromatographie en phase inverse.
Le coefficient de distribution (ou coefficient de partage) est : K = CS / CM

La variation d'énergie libre DG° de la liaison du soluté à la phase greffée est égale à :
∆G° = - RT Ln K
Le facteur de capacité k' est égal : k' = K .VS / VM
o
VS ∆G
ln k' = ln -
VM RT
Avec VS volume du soluté dans la phase stationnaire et VM volume du soluté dans la phase mobile.
Pour un éluant donné et une phase stationnaire greffée donnée, on constate que le facteur de capacité k'
augmente avec l'hydrophobicité du soluté. Ainsi les variations de log k' en fonction du nombre de
groupements méthylène (CH2) d’une famille de composés organiques donnés sont linéaires (figure 12, a ).
log k'
a d ln k' b
acides
c
2 4
b acides aminés
1 2
a amines
0 0
-1 -2
60 100 140
0 2 4 6 8
n CH surface moléculaire
2 o
apolaire (A )2
figure12. Variations du logarithme du facteur de capacité en fonction
a. du nombre de CH2 d'alkyl benzènes (n = 0 = benzène). Phase stationnaire greffée en C8.

méthanol / eau : a = 1/0, b = 9/1, c = 8/2, d = 6 / 4
b. de la surface moléculaire apolaire
Pour des composés biologiques (amines, acides carboxyliques, acides aminés), on observe également une
relation linéaire entre ln k' et la surface apolaire de la molécule (figure 12,b). Plus l'ionisation
augmente et plus le facteur de capacité diminue. Pour les acides monoprotonés, le facteur de capacité est
égal à :
Ka
k' 0 + k' -1
H
+ ( )
+
H COO
-
k' = avec K a =
Ka COOH
1 +
H
+ ( )
currentpoint
pour l’équilibre COOH COO- + H+
currentpoint
k'o facteur de capacité de la forme non protonée (COOH), k'-1 facteur de capacité pour la forme
déprotonée (COO-), Ka constante de dissociation de l'acide et H+concentration en proton.
Le facteur de capacité sera donc le plus élevé pour ces acides carboxyliques quand les conditions de pH
empêcheront l’ionisation de la fonction acide c’est à dire pour des valeurs de pH inférieures au pKa de
l’acide. Généralement on ajoute à la phase mobile un acide fort dilué (acide phosphorique par exemple)
pour atteindre ces valeurs de pH qui doivent néanmoins rester supérieures à 2 pour éviter l’hydrolyse de la
liaisons silyléther.
Pour les bases faibles, on a une expression similaire (amine par ex.). Il faut remarquer ici que les valeurs
des pKa de ces bases sont souvent supérieurs à la limite de stabilité pH des silices. De fait il n’est pas
d’exemple d’analyse à des pH supérieur à 12.
currentpoint
NH3+ currentpoint
NH2 + H+
k' 0 + k' 1 ( KH )
a
+
H
+
NH 2
k' = avec K a =
( KH )
a +
1 + NH 3
+
avec Ka constante de dissociation de la forme protonée, k'1 facteur de capacité pour la forme protonée
(NH3+).
Les variations de k' pour quelques acides carboxyliques sont indiquées sur la figure 13.
k'
15
3 currentpoint
COOH acide benzoïque
10
2 OCH 3
OH CH2 COOH a.homovanillique

1
5
4 COOH a.salicylique
OH
OH
0 pH
2 4 6 OH CH 2 COOH a.3,4-dihydroxyphénylacétique
currentpoint
Figure 13. Variations du facteur de capacité pour quelques acides mono protonés en fonction du pH
(chromatographie en phase inverse C8) 1 acide benzoïque; 2 acide homovanillique; 3 acide salicylique; 4
acide 3,4 - dihydroxyphénylacétique.
L'effet de la température sur le facteur de capacité peut être étudié à partir de la loi de VAN'T HOFF
(effet de la température sur la constante d'équilibre)
o o
d ln K ∆ H ∆H
= soit ln K = + cte
dt 2 RT
RT Ici on aura:
o o
∆H ∆S VS
ln k' = + + ln
RT R VM
∆H° variation d'enthalpie et ∆S° variation d'entropie.
Si on porte ln k' en fonction 1 / T, ∆Ho correspondra à la pente de la droite.
Ce type de représentation est indiqué sur la figure 14 pour quelques acides aromatiques. On constate que
quand la température augmente k' diminue.
ln k'
3 currentpoint
2,3 OH CH2 COOH 2
2
3
OH
1
0 1 OH CH2 COOH 3
OH OH
3
-2,3 10 / T OH CH COOH 1
2,9 3 3,1 3,2 3,3
currentpo
Figure 15. Variations en ln k' en fonction de 103/T (Van't Hoff) pour quelques acides arômatiques en
chromatographie en phase inverse (C8). Eluant tampon phosphate 50 mM pH2 ( ), et même tampon
additionné de 5 % d'acétonitrile (1, 2, 3)
1 = acide dihydroxymandélique
2 = acide hydroxyphénylacétique
3 = acide dihydroxyphénylacétique.
b) influence de la phase mobile
L'eau constitue la base de toute phase mobile en chromatographie liquide sur phases greffées apolaires.
• Elution en mode isocratique
Dans ce type d’élution, la composition de la phase mobile reste constante tout au long de l’analyse
chromatographique. On utilise généralement soit un mélange binaire type eau / méthanol, eau / acétonitrile
ou eau / tétrahydrofurane, soit un mélange ternaire eau / acétonitrile / méthanol. Ce type d’élution est
applicable à des analytes dont les valeurs de k’ ne sont pas trop différentes.
On constate généralement une variation linéaire du log k' en fonction du pourcentage d'eau dans la phase
mobile (figure 15) (voir aussi figure 12).
log k'
nitrobenzène
1
toluène
0 phénol
aniline
-1
0 40 % d'eau
20
Figure 15. Variations du log k' en fonction de la teneur en eau du mélange méthanol / eau en
chromatographie en phase inverse.
La phase stationnaire subit des changements de structure selon la nature de la phase mobile. Il n’est pas
actuellement possible de prévoir de tels changements et seule l’expérimentation permet d’en déterminer
les effets. Ainsi l'ordre d'élution de composés benzéniques varie avec l'éluant (Tableau 5 et figure 16).
Tableau 5. Ordre d'élution de dérivés benzéniques en fonction de la nature de l'éluant. Chromatographie en

phase inverse (C18).
MeOH/eau 50/50 ACN/eau 30/70 THF/eau 25/75
- CONH2 - CONH2 - CONH2

- CH2OH - CH2OH - CH2OH
- OH - OH - CH2-CH2OH
- CHO - CH2 -CH2OH - CHO
- CH2-CH2 OH - CHO - COCH3
- CN - COCH3 - OH
- COCH3 - CN - CN
- NO2 - NO2 - COOCH3
-H - COOCH3 - NO2
- OCH3 -H - OCH3
- COOCH3 - OCH3 -H
- CH3 - COOCH2CH3 - COOCH2CH3
- Cl - CH3 - CH3
- COOCH2CH3 - Cl - Cl
absorbance
254 nm 2 4
3 6
7 8
9
1
1
5
currentpoint
O O
1 C 6 C
NH 2 OCH 3
0,5 2 CH 2OH 7 OCH 3
3 CH 2 CH 2 OH 8 O CH 2 CH 3
CH 2 OH 9 CH 3
0
4
0 5 10 temps de rétention
(min) 5 NO 2
currentpoint
Figure 16. Chromatogramme en phase inverse C18 (dp = 10 µm), colonne 250 x 4 mm. Solvant
CH3CN/eau 49/5, (v/v). Débit 1,2 ml.min-1, ∆P 60 bars.
Par ailleurs, SHOEMAKERS et al. (1978, J. Chromatography) ont montré que le facteur de capacité était
relié à la concentration en solvant organique par la relation:
ln k’ = A Φ2 + B Φ + C
avec Φ fraction de solvant organique dans la phase mobile.
Mais c’est SNYDER et al. (1979, J. Chromatography) puis CSOKAN P. et al. (LC-GC, 1993, 6, n° 6,
361-369) qui ont montré que la valeur du facteur de capacité dans une phase mobile composée d’eau et de
solvant B était égale à :
log k’ = log k’eau + S . Φ
avec k facteur de capacité, k’eau facteur de capacité avec 100 % d’eau, S constante pour chaque analyte
avec des valeurs typiques de 4 pour les petites molécules (poids moléculaire inférieur à 1000) et Φ le
pourcentage de solvant B. Cette équation peut être validée par deux ou trois chromatogrammes.
L'interaction de Van der Waals varie avec la surface de contact entre la partie apolaire du soluté et la phase
stationnaire greffée. Ainsi, les phases greffées possèdent une capacité de reconnaissance suivant la forme
de la molécule. Il sera ainsi possible de séparer certains isomères de position, par contre la séparation des
isomères géométriques (cis/trans) ou optiques (D/L) est plus difficile (cf phases greffées chirales.)
currentpoint -
CH3 COO CH3 CH 2 COO
-
CH CH 2 CH leucine CH CH isoleucine
CH3 NH 3+ NH3+
CH3
COO
-
CH3 (CH2)3 CH norleucine
NH 3+ currentpoint
Les rétentions sont liées aux solubilités dans la phase mobile. Si l'on ajoute un sel neutre, l'activité de l'eau
diminue et log k' = f ([sel]) est linéairement décroissant.
En conclusion on peut dire que plus le soluté sera soluble dans la phase mobile, moins il sera retenu.
• Elution en mode gradient
En mode gradient, le facteur de capacité moyen k* est analogue au k’ en mode isocratique. Les mêmes
modifications du chromatogramme apparaissent pour k* comme pour k’. Par exemple la rétention reste
toujours plus grande avec des valeurs élevées de ces deux paramètres.
Le mode gradient permet l’élution de composés dont les k* sont très différents (pente de variation du
solvant élevée) ou au contraire de composés dont les k* sont très voisins (pente de variation nulle :
isocratique). Si tous ces composés sont présents dans l’échantillon à analyser, il est clair qu’il faudra faire
varier dans le temps la concentration en solvant de façon différente, d’où la nécessité d’utiliser un système
d’élution à gradient. Dans ce dernier cas, les meilleurs résultats sont obtenus pour des valeurs de k*
comprises entre 2 et 10. Il faut donc adopter une phase mobile dont la composition permettra d’obtenir la
valeur désirée de k*.
En mode isocratique k’ n’est pas affecté par des variations de longueur, de diamètre, de débit, et par la
taille des particules, ce qui permet des changements d’échelle relativement simples.
En mode gradient, k* est modifié par de tels changements et le changement d’échelle reste toujours
délicat.
C’est SNYDER et al. (Practical HPLC Method development, 2nd Edition, Wiley Interscience, New York,
USA, 1997) qui décrit le plus en détail les paramètres à prendre en considération dans ces systèmes
d’élution.
Le facteur de capacité moyen en mode gradient est égal à :
t G . D . 100 d(log k)
k* = avec S =
VM . S . ∆Φ dΦ
avec tG le temps dans le système à gradient, D le débit, VM le volume de phase mobile dans la colonne, S
constante pour chaque analyte avec des valeurs typiques de 4 pour les petites molécules (poids moléculaire
inférieur à 1000), DF est la modification de la fraction volumique de B (0 à 100).
En mode gradient on a donc :
k* . VM . S . ∆Φ
tG =
D . 100
Pour k* désiré de 5 et une valeur moyenne de S égale à 4, cette équation devient :
20 . VM . ∆Φ
tG =
D . 100
VM est égal à VM = ε . VT . Avec ε voisin de 0,5 on a alors :

2
L . š . dC . ε 2
VM = ° 0,5 . L .d C
4
(L longueur de la colonne, dC diamètre interne, ε porosité interstitielle, VM volume de phase mobile).
Ainsi avec une colonne de 15 cm x 0,46 cm : VM est environ de 1,6 mL.

Avec un gradient de 5 à 100 % de solvant B ( ∆Φ = 95) et D = 1,5 mL.min-1 tG est égal à 20 min.
Dans le système considéré, l’analyste obtiendra donc un chromatogramme satisfaisant en réalisant un
gradient en 20 minutes, la fraction de B passant alors linéairement de 5 à 100 % dans la phase mobile.
Les appareils modernes proposent des systèmes gérés par microordinateurs qui permettent de réaliser des
gradients par mélange de deux solvants. Le plus souvent les gradients réalisés sont linéaires, c’est à dire
que les variations de B dans la phase mobile en fonction du temps sont linéaires. Certaines appareils
permettent des gradients curvilignes ou complexes et il existe même des systèmes qui autorisent la mise en
place de gradients par mélange ternaire (3 solvants) voire quaternaire. Dans ces cas seule
l’expérimentation et le « savoir » faire de l’analyste peuvent répondre à un besoin analytique : les
paramètres à prendre en considération restent cependant très nombreux et il devient souvent illusoire de
maîtriser toutes les inconnues introduites dans ces conditions.
c) Augmentation de k' par modification du soluté
a) fixation sur un soluté polaire d'un composé apolaire par liaison covalente
Cette méthode est de plus en plus largement utilisée pour séparer les acides aminés par chromatographie
en phase greffée apolaire.
Il existe aujourd’hui de nombreuses réactions chimiques de modification/détection des acides aminés. La
plupart de ces réactions ont les particularités suivantes: elles sont rapides, stoechiométriques, et donnent
des dérivés dont certains sont très stables et de détection facile. La sensibilité de détection a été multipliée
par un facteur 1000 en comparaison avec la détection “ninhydrine,” par l’utilisation de produits donnant
avec les acides aminés des dérivés fluorescents.
1) Réaction avec l’ O-phtaldialdéhyde (OPA)
L’OPA réagit à froid, en présence de ß mercaptoéthanol et en milieu alcalin avec les acides aminés pour
donner des dérivés isoindoliques fluorescents ( λ ex = 340 nm , λ ém = 455 nm ).
currentpoint
S CH2 CH2OH
CHO HS CH2 CH2 OH
+ N CH COOH + 2H 2O
NH2 CH COOH R
CHO
R currentpoint
La proline et l’hydroxyproline ne donnant pas directement la réaction, il est nécessaire, pour pouvoir les
détecter, de traiter au préalable les hydrolysats par de l’hypochlorite de sodium. La stabilité de certains
dérivés isoindoliques formés n’est pas très grande, ce qui implique donc une analyse extemporanée.
2) Réaction avec la fluorescamine ( 4-phénylspiro ( furan-2(3H),1’-phatal)-3,34 dione ).
La réaction se fait à température ambiante et est complète entre pH 7 et 9 en environ 1 seconde (λ ex = 390
nm et λ ém = 475 nm ).
currentpoint
COOH
R CH
N
O
NH2 CH COOH
O OH O
O R
+ H 2O
COOH
O currentpoint
Il s’agit d’une réaction très sensible (seuil de détection voisin de la pmole) qui permet des dosages de
quantités d’acides aminés de l’ordre de 0,1 nmole. La fluorescamine ne réagit pas non plus avec les amines
secondaires comme la proline ou ses dérivé. Pour réaliser le dosage de ces acides aminés il faut donc les
transformer en amines primaires par traitement à l’hypochlorite ou à la N-chlorosuccinimide .
3) Réaction avec le chlorure de dansyle
Ce réactif permet d’obtenir des dérivés sulfamides très fluorescent .

currentpoint
CH3 CH3
NH2 CH R + H Cl
N N
CH3 + COOH CH3
SO2 Cl SO 2 NH CH COOH
R currentpoint
Il existe actuellement beaucoup d’autres méthodes de détection fluorimétrique des acides aminés (FMOC
etc.). Il s’agit toujours de méthodes très performantes dont le choix est fonction de paramètres comme la
stabilité des dérivés formés, la simplicité de mise en oeuvre, le coût etc. Il faut signaler que tous les
dérivés décrits (OPA, fluorescamine, dansyl ) absorbent dans l’UV, ce qui permet leur détection et leur
dosage avec une sensibilité moindre que par la méthode fluorimétrique.
4) Réaction au phénylisothiocyanate ( PITC )
Le phényl isothiocyante réagit avec les acides aminés pour former des dérivés facilement détectables dans
l’UV. Les phénylthiocarbamyl (PTC) sont transformables en dérivés phénylthiohydantoïne (PTH ) en
milieu chlorhydrique en présence de méthylnitrosamine.
S
H Cl , CH 3NO 2
NH2 CH R - NH
OH NH C NH CH R N
N C S +
COOH S COOH R
O
+H O
2
5) Réaction avec le 9,fluorénylméthyl-chloroformate (FMOC-HCl)

currentpoint
pH 8 , 60°C
+ NH 2 - R
5 min
CH2 O C NH R
CH2 O C Cl O
O currentpoint
6) Réaction avec le chlorure de Dabsyl

currentpoint
NH 2 -R
CH3 pH 9 CH3
N N 70°C 10 min N N
CH3 N SO2Cl CH3 N SO2 NH R
currentpoint
Les dérivés obtenus ont des facteurs de capacité beaucoup plus importants que l'acide aminé de départ. Il
est ainsi possible de réaliser leur séparation par HPLC en phase inverse (figure 17).
De plus ces dérivés sont détectables par fluorescence ou par absorption UV, ce qui facilite le dosage. La
limite de détection atteint respectivement 10-13 et 5.10-12 g.
Les avantages et inconvénients des principales méthodes de dérivation des acides aminés sont indiquées
dans le Tableau de synthèse ci-dessous
mode de dérivation
dabsyl PITC OPA FMOC
amines 2aires oui oui non oui

sensibilité 5 pmoles UV 5 pmoles UV 150 fmoles Fluo 100fmoles Fluo
stabilité bonne moyenne mauvaise bonne
interférence du réactif oui oui non oui
automatisable moyen mauvais oui moyen
Il existe des possibilités de combinaisons de certaines de ces méthodes. Ainsi la combinaison OPA -
FMOC permet d’obtenir après chromatographie en phase inverse et par mesure de l’absorbance à 338 nm
tous les acides aminés avec des NH2 primaires jusqu’à l’élution de la lysine puis, par lecture à 262 nm
l’élution et la détection de la proline et de l’OH-proline (GODEL H. et al, 1992, 5, LC-GC, 44-49 ).
14 16
8 9 11 15 17
12
1 7 13
10
3
6
2 4
18
A
0 10 20 temps de rétention
(min)
6 12 13
7 20 11 21
4 9 10 19 14 17
23 3
1 2 5 16
8
22
15
B
temps de rétention (min)
0 5 10
Figure 17 : Chromatogramme en phase inverse (C18) des dérivés d’acides aminés

A réactif OPA - dérivés isoindoliques ; détecteur fluorimétrique
B dérivés PTH
1.Asp, 2.Glu, 3.Asn, 4.Ser, 5.Gln, 6.His, 7.Gly, 8.Thr, 9.Arg, 10.Ala, 11.acide γ-butyrique, 12.Tyr, 13.Met,
14.Val, 15.Phe, 16.Ile, 17.Leu, 18.Lys, 19.Pro, 20.Trp, 21.NorLeu, 22.acide cystéique, 23.CH3Cys
b) Fixation sur un soluté ionique d'un composé apolaire par liaison ionique : Appariement d'ions
Le but de cette méthode est de lier, par formation d’une paire d’ion, une molécule polaire ionisée (acide,
base par exemple) qui n’est donc pas directement analysable en HPLC-RP, à un ion de charge opposée
mais porteur d’un groupement apolaire qui permet l’analyse dans ces conditions.
- +
réactif formeur de paire d'ions analytite
+ -
currentpoint
(A+)M + (B-)M (A+ B-) s
currentpoint A+M soluté ionique (ion)
B-M ou (B+) soluté ionique apolaire
(contre-ion) hétaérion
+ -
(A B ) paire d'ion
+ -
AB s
K AB =
+ -
A M B M
La paire d'ion formée peut posséder un facteur de capacité autorisant une bonne séparation
chromatographique sur phase stationnaire greffée apolaire. k' sera d'autant plus grand, que l'hydrophobicité
du contre ion sera grande.Les principaux réactifs formeurs de"paire d'ions" sont indiqués dans le tableau 6.
Tableau 6. Principaux réactifs formeurs de paires d'ions

(B+) (B-)
bromure d'hexadécyltriméthyl-ammonium 1 heptane sulfonate (Na+)

bromure de tétrabutylammonium 1 hexane sulfonate (Na+)
bromure de tétradécyltriméthyl ammonium 1 octane sulfonate (Na+)
bromure de tétraméthyl ammonium 1 pentane sulfonate (Na+)
bromure de tétrapropyl ammonium Dodécyl sulfate de sodium
Naphtalène sulfonate (Na+)
On peut par exemple obtenir des séparations d'acides organiques (figure 18) ou d'amines (figure 19).
2 3
4
1 5 6 7
0 10 20
t (minutes)
R
Figure 18. Chromatographie par appariement d'ions en phase inverse d'acides organiques (RP2) Phase
mobile 0,03 M tétrabutylammonium pH 7,4.
1 = acide 4-aminobenzoïque ; 2 = acide 3-aminobenzoïque ; 3 = acide 4-hydroxybenzoïque ; 4 = acide 3-
hydroxybenzoïque ; 5 = acide benzène sulfonique ; 6 = acide benzoïque ; 7 = acide toluène 4-sulfonique.
DOPA+NM
VMA
DHMA
DOPAC
MGA
SH/AA
N.Syn
3-M-tyrm
NE
MN
3-H-tyrm
Syn
E
Isopron
Tyrm
0
20 40
t (minutes)
R
Figure 19. Séparation isochratique de catécholamines par chromatographie par appariement d'ions en
phase inverse. Le contre-ion est le SDS.
L'ion d'appariemment (hetærion : ion compagnon) se trouve dans la phase aqueuse à une concentration
beaucoup plus élevée que celle du soluté A+. Le coefficient de distribution du soluté est :
[A+B-]s
Ks = _______ = KAB [B-]M
[A+]M
Le facteur de capacité est proportionnel à Ks en chromatographie de phases inversées et à 1/ KS en
chromatographie dite normale, k' sera proportionnel à la concentration de l'agent d'appariement dans le
premier cas, et à son inverse dans le second.
VI.2. LA CHROMATOGRAPHE DE PARTAGE
Dans cette technologie la phase stationnaire est un liquide qui imprègne un support en principe inerte ou
est greffée par liaison chimique covalente sur ce support. La séparation des solutés est fondée sur leur
partage entre cette phase stationnaire et la phase mobile liquide.
Le coefficient de distribution est appelé coefficient de partage :
CS VS
K= et k' =
CM VM
k' facteur de capacité
VS volume de phase stationnaire contenue dans la colonne
VM volume de phase mobile contenue dans la colonne
CM Cs : concentrations respectives du soluté dans la phase mobile et dans la phase stationnaire.
Cette technique s'apparente à l'extraction liquide/liquide basée sur les différences de solubilités dans deux
phases non miscibles, mais ici une des deux phases est immobilisée sur un solide dont les particules ont
des diamètres très petits (dp) ; l'augmentation considérable de la surface de contact entre les deux phases
fait que l'on obtient des efficacités très supérieures à celles obtenues en extraction liquide/liquide classique
à contre-courant.
Comme en extraction, il faut que la solubilité de l'une des deux phases dans l'autre soit aussi faible que
possible.
Dans la chromatographie de partage classique, on choisit une phase stationnaire polaire et une phase
mobile apolaire.
Dans la chromatographie de partage à polarité de phases inversée, on choisit une phase stationnaire
apolaire et une phase mobile polaire.
La chromatographie de partage donne de très bons résultats pour la séparation de composés à groupements
fonctionnels différents, de composés d'une série homologue.
La chromatographie liquide-liquide classique (phase stationnaire polaire) est surtout utilisée pour la
séparation de composés polaires, tandis que la chromatographie à polarité de phase inversée est utilisée
pour la séparation de composés apolaires (hydrocarbures à longue chaîne).
VI.2.1. Phases stationnaires utilisées en chromatographie liquide / liquide
a) Tous les supports utilisés en chromatographie solide-liquide peuvent être utilisés à condition
qu'ils soient rendus inertes.
On utilise soit :
• des supports poreux tels que la silice sur laquelle la phase stationnaire liquide est une multicouche liée au
support par des liaisons hydrogène ou polaire aux groupements silanols. Il existe des supports pelliculaires
(poreux en surface).
• des supports poreux apolaires tels que la silice dans laquelle les groupements silanol ont été transformés
en groupements triméthyl apolaires (ou hexaméthyl) par réaction avec le triméthylchlorosilane. Il s'agit ici
d'une chromatographie
currentpoint en phase inverse.
CH 3
Si CH 3
CH 3 Si O
Si OH CH 3
O + 2 Cl Si CH 3 O
CH 3
CH 3 Si O
Si OH
Si CH 3
CH 3 currentpoint
La phase stationnaire sera liée au support par des interactions hydrophobes.
b) La phase stationnaire
Elle doit tapisser de façon aussi uniforme que possible les parois des pores du support.
Cette phase doit être très peu miscible avec la phase mobile et sa viscosité doit être la plus faible possible
pour que les phénomènes de transfert de masse et de diffusion soient facilités.
L'imprégnation peut être réalisée de plusieurs façons :
• par évaporation du solvant : la phase stationnaire est dissoute dans un solvant approprié puis mélangée
avec le support. Le solvant est ensuite éliminé par évaporation.
• par filtration du solvant : dans ce cas le solvant de la phase stationnaire est éliminé par filtration.
• par percolation : la phase stationnaire est "dissoute" dans un solvant volatil, puis on la fait percoler à
travers la colonne ; on chasse le liquide interstitiel puis on évapore le solvant par un courant gazeux. En
faisant varier la concentration des solutions de phases stationnaires, on peut faire ainsi varier l'épaisseur du
film sur le support.
VI.2.2. La phase mobile
Le choix de la phase mobile est empirique ; on se laisse guider par la notion de polarité que l'on peut
estimer par le paramètre de solubilité d'Hildebrand (tableau 7). Ce paramètre d résulte de la combinaison
de trois principales interactions entre le soluté et le solvant
Tableau 7. Classement des solvants selon le paramètre de solubilité d'Hildebrand (G = grand).
SOLVANT δ δp δo δa δd SOLVANT δ δp δo δa δd
Perfluoroalcanes 6 6 0 1 0 Pyridine 10,4 9 4 5 0

isooctane 7 7 0 0 0 Ethanol 11,2 6,8 4 5 5
n-Pentane 7,1 7,1 0 0 0 Acétonitrile 11,8 6,5 8 2,5 0
n-Hexane 7,3 7,3 0 0 0 Acide acétique 12,4 7
n-Heptane 7,4 7,4 0 0 0 Diméthylsulfox. 12,8 8,4 7,5 5 0
Ether diéthylique 7,4 6,7 2 2 0 Méthanol 12,9 6,2 5 7,5 7,5
Cyclohexane 8,2 8,2 0 0 0 Ethanolamine 13,5 8,5 G G G
Tétrachlorure carb. 8,6 8,6 0 0,5 0 Ethylène glycol 14,7 8 G G G
Toluène 8,9 8,9 0 0,5 0 Formamide 17,9 8,3 G G G
Chloroforme 9,1 8,1 3 0,5 3 Eau 21 6,3 G G G
Tétrahydrofurane 9,1 7,6 4 3 0
Benzène 9,2 9,2 0 0,5 0
Acétone 9,4 6,8 5 2,5 0
Propanol 10,2 7,2 2,5 4 4
- interactions de dispersion (forces de London) mesurées par δp. Les solvants avec des δp élevées
donneront des interactions fortes avec des dérivés polarisables (composés arômatiques, composés
halogénés ou soufrés de masse molaire élevée).
- interactions dipôles-dipôles mesurées par δο. Les solvants avec des δο élevées donneront des interactions
fortes avec des solutés à fort moment dipolaire (nitriles, sulfoxydes, amides, dérivés nitrés).
- interactions hydrogène résultant soit d'un pouvoir accepteur de proton mesuré par δp soit d'un pouvoir
donneur mesuré par δa . Les solvants de δa élevé donneront des liaisons hydrogène avec des solutés
donneurs (phénols, acides carboxyliques etc...) et les solvants de δp élevé avec les solutés accepteurs
(amines, sulfoxydes etc...).
Chacun des 4 paramètres (δa , δp, δo, δd,) pris isolément ne peut rendre compte de la polarité de tel ou tel
solvant envers un soluté donné: c'est la combinaison (δ) qui permet d'apprécier le mieux cette propriété.
On commence en général par choisir un solvant de telle sorte que les facteurs de capacité des divers
solutés soient compris entre 1,5 et 10. En CLL classique (phase stationnaire polaire) la force d'un solvant
augmente avec sa polarité et il suffit de diminuer d pour que les facteurs de capacité diminuent. C'est
l'inverse en CLL à polarité de phase inversée.
Les couples phases stationnaire-phase mobile les plus employés en chromatographie liquide-liquide sont
indiqués dans le tableau 8.
Tableau 8. Quelques systèmes utilisés en CLL
phases stationnaires phases mobiles
Chromatographie liquide classique
β β'propionitrile pentane, hexane, isooctane

carbowax idem + 20 % de chloroforme, THF
triéthylène glycol acétonitrile
éthylène glycol éther di n-butylique
diméthylsulfoxyde isooctane
éthylène diamine hexane
eau n-butanol
polyamide hexane/méthanol
Chromatographie liquide à polarité de phases inversée
cyanoéthylsilicone méthanol/eau
diméthylpolysiloxane acétonitrile/eau
heptane méthanol/eau
polymère hydrocarboné méthanol/eau
squalane acétonitrile/eau
VI.3. LA CHROMATOGRAPHIE D'ECHANGE D'IONS
La phase stationnaire est un support insoluble contenant des groupements chargés. Ceux d'un certain signe
sont fixes car liés chimiquement, les autres de signe opposé sont mobiles. Ces derniers peuvent être
échangés réversiblement avec d'autres ions de même charge sans aucun changement de la partie insoluble.
Les groupes ioniques fixes déterminent le type et la force de l'échangeur. Le nombre et l'accessibilité
déterminent la capacité.
Pour des composés monovalents (ion du soluté et contre-ion) le processus d'échange peut être simplement
décrit par les équilibres suivants :
KXY
currentpoint
échange d'anions B+ Y- + X- currentpoint
B+ X- + Y-
avec
+ - -
B X Y
K XY =
+ - -
B Y X on tire [ B+X-] que l’on porte dans DX
KNM
currentpoint
échange de cations A- M+ + NH+ A- NH+ + M+
currentpoint
KXY et KNM sont les constantes d'équilibre de la réaction d'échange. X- et NH+ sont les solutés
Y- et M+ sont les contre-ions. B+ et A- sont les groupements ionisés fixés sur la phase stationnaire.
Ka
currentpoint
Pour des acides on a XH H+ + X-
currentpoint
avec
+ -
H X
Ka =
XH
on tire [XH] que l’on porte dans DX
currentpoint
et pour les bases NH+ currentpoint
N + H+
Le coefficient de distribution D (rapport des concentrations du soluté chargé dans la phase stationnaire
sur la somme des concentrations du soluté chargé et non chargé dans la phase mobile) sera égal à :
échange d'anions échange de cations
+ - + - + - + -
B X B Y 1 NH A MA 1
DX = = K XY . . DN = = K NM . .
-
X + XH Y
-
H
+
N + NH
+
M
+ Ka
1+ 1+
+
Ka H
D est proportionnel à la constante d'équlibre de l'échange (KXY, KNM) et au nombre de groupes ionisés de
la matrice ([B+Y-], [A-M+].
D est inversement proportionnel à la concentration en contre-ion ([Y-], [M+]) dans la phase mobile.
D est fonction du pH et du pKa.
Le mécanisme d'élution est schématisé sur la figure 20.
- +
-- - -+ +
- +
+
- +
Echangeur d'anions Echangeurs de cations
et contre-ions interchangeables et contre-ions interchangeables
5 6
1 2 3 4
Figure 20 . Chromatographie d'échange d'ions. Types d'échangeurs et mécanisme de l'élution.

1. l'échangeur d'ions est en équilibre aves les contre-ions (O). Les ions à échanger et à séparer
pénètrent dans l'échangeur
2. les contre-ions ont été échangés avec les ions à séparer

3. on applique un gradient d'élution
4. la désorption d'1 des constituants intervient , il est élué
5. les ions restants sont échangés et élués
6. l'échangeur est régénéré.
VI.3.1. Principaux types de groupements fonctionnels
Les groupements les plus utilisés sont de type sulfonate (- SO3-), phosphonate
(- PO2-3) et carboxylate (- COO-) pour les échangeurs de cations et de type ammonium quaternaire (- N+
R3), tertiaire (- N+HR2) ou secondaire (- N+H2R).
Les groupements de type sulfonate ou ammonium quaternaire sont des échangeurs d'ions forts, les autres
des échangeurs faibles. Ainsi la fraction chargée d'échangeurs de type sulfonate ou ammonium quaternaire
n'est pas influencée dans une zone large de pH (figure 21) tandis que les échangeurs faibles présentent des
variations importantes de leurs ionisations entre pH 4 et 8.
fraction molaire
chargée
1
A B C D
0
0 7 pH 14
Figure 21. Variation de la charge de groupements fonctionnels utilisés en chromatographie
d'échange ionique en fonction du pH
A échangeur de cations fort B échangeur de cations faible C échangeur d'anions faible D échangeur d'anions fort
Certains groupements possèdent des propriétés complexantes vis-à-vis de certains cations métalliques
(phosphonate, aminodiacétate).
VI.3.2. Principaux types de matrice
Il existe des matrices de type organique (polystyrène, métacrylate, dextrane) cellulosique ou silice.
Les résines de type polystyrène (BARNES N., Internat. Lab., oct 1993, 16, P4-P8) résultent de la
polymérisation de vinylbenzène avec comme agent de pontage du divinylbenzène (4 à 8 %). Ces matrices
sont synthétisées dans une phase apolaire solvante des monomères dispersée sous forme d’émulsion dont
la taille des particules dispersées est parfaitement contrôlée.
CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2

n styrène ou
vinylbenzène
n CH CH2
CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2
A CH CH2
A
divinylbenzène
Structure d’une matrice de phase stationnaire de type polystyrène.

A = groupement fonctionnel ionisable (souvent SO3H).
Les matrices dont le support est la silice ont par exemple les structures suivantes :
Si OH CH Si OH CH3
3
SI O Si CH2 CH2 SO3 H SI (CH2 )3 O CH2 CH CH2
CH 3 NH 2
Si OH Si OH
Il existe des échangeurs d’ions à “bras mobiles” (J.Chromatogr., 1988, 443, 73-83) qui permettent une
séparation non dénaturante de macromolécules (protéines, acides nucléiques, particules virales etc) et qui
confèrent à la phase stationnaire une propriété exclusive d’échangeur d’ions, les interactions hydrophobes,
hydrogène, - étant pratiquement négligeables.
Les interactions entre une protéine globulaire et cette phase ou une phase “classique” sont schématisées
sur la figure 22.
protéine
phase stationnaire globulaire
classique à pH > pHi
phase stationnaire à bras
mobiles
figure 22 . Effets d’une échangeur d’anions classique et “tentaculaire” sur la conformation

d’une protéine globulaire .
Ces phases stationaires sont obtenues en utilisant des supports sphériques de silice ou polymériques
comportant de très larges pores et de diamètre voisin de 5 µm, particules à la surface inactivée. Les
échangeurs d’anions de type diméthylaminoéthyle, faiblement basiques, ou les échangeurs de cations de
type carboxyle ou sulfonate ont été liés au support par l’intermédiaire de polymères linéaires greffés. La
configuration flexible des groupes d’échangeurs contribue alors à diminuer le trajet et donc la diffusion du
soluté mais aussi d’atteindre plus de groupements acides sur la molécule protéique ou d’acide nucléique ce
qui contribue à augmenter la sélectivité.
Un exemple de chromatogramme de protéines sur échangeurs de cations et d’anions à bras mobiles ou

classique est schématisé sur la figure 24 .
B
B A
C
A C
1 2
absorbance 280 nm
absorbance 280 nm
0 0
30 60 30 60
B
D
A C F
3 E 4
absorbance 280 nm
absorbance 280 nm
0
0 30 60 0 30 60
temps de rétention (minutes) temps de rétention (minutes)
figure 24 . Séparations de protéines par échange de cations.

A = chymotrypsinogène A, B = cytochrome C, C = lysozyme.
1 : échangeur à bras mobiles sur une phase de type gel porteuse de groupements carboxyles (colonne de 15
cm x 0,5 cm).
2 : échangeur sulfoné tentaculaire dp = 5 µm, colonne de 5 cm x 0,5 cm, élution par gradient
(dihydrogénophosphate de sodium 20 mM pH 6 avec Na Cl de 0 à 1 M en 60 min).
3 : échangeur traditionnel de type TSK-CM. Pour 1 et 2 élution par gradient (tampon acétate pH 5; 10 mM
avec Na Cl de 0 à 1 M en 100 min, débit 1ml.min-1.
4 : séparation de conalbumine (D), ovalbumine (E), ß-lactoglobuline A ( F) et ß-lactoglobuline B (G) sur
échangeur d’anions TMAE, colonne de 15 cm x 1 cm, élution par gradient (pipérazine 20 mM pH 6 et Na
Cl de 0 à O,3 M entre 10 et 45 min), débit 1,2 ml.min-1.
VI.3.3. Influence du pH de la phase mobile
Il s'agit du paramètre principal de rétention .

Ainsi pour un acide faible, une augmentation de pH se traduit
currentpoint
AH A- + H+
currentpoint
par un déplacement de l'équilibre vers la gauche, l'acide AH étant peu (ou pas) retenu.
Avec les acides aminés, on utilise une colonne échangeuse de cations (polystyrène sulfoné). On se place
initialement dans des conditions de pH ( 2) pour lesquelles tous les acides aminés sont sous la forme
+ NH3 - CH - COOH
R
Si on injecte sur la colonne des solutions tampon de pH croissant, les acides aminés seront élués en
fonction de leur pHi. En effet, quand le pH de la phase mobile est égal au pHi l'acide aminé se trouve sous
forme de switterion non chargé, donc non retenu.
+ NH3 -CH - COO-

R
Avec les composés polyhydroxylés (oses, diholosides etc...) on réalise un complexe avec l'acide borique,
complexe chargé négativement.
-
H C OH H C O O C H +
+ H
H3BO3 + 2 B
H OH H C O + 3 H 2O
O C H
Ces complexes peuvent être séparés sur résines échangeuses d'anions (tampon borate avec gradient de pH
de 7 à 10).
VI.3.4. Influence du type et de la concentration en contre-ion
La constante d'équilibre de l'échange reflète l'affinité du soluté ionique ou du contre-ion pour l'échangeur.
En général les échangeurs d'ions ont une grande affinité pour :
- les ions possédant une forte charge
- les ions avec un petit volume d'hydratation.
Il est possible de classer les ions en fonctions de leur affinité pour l'échangeur, donc de leur "force
d'élution".
Ainsi avec un échangeur d'anions du type ammonium quaternaire on a :
citrate > ClO4- > SO24 > oxalate > I- > NO3- > Br- > SCN- > Cl- > formiate > acétate >OH- > F-
Avec les résines échangeuses de cations de type sulfonate on a :
Ce3+ > Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Ca2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mn2+ > Ti+ > Ag+ > Cs+ > Rb+
> K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+.
Quand le soluté et le contre ion sont complètement chargés, la pente de la droite log D(N ou X) en fonction
de la concentration en contre-ion est en général égale à a/b, avec a valence du soluté, b valence du contre
ion.
Quand la concentration en contre-ion augmente (X-)

currentpoint
B+ Y- + X- B+ X- + Y-
currentpoint
on déplace l'équilibre vers la droite.
VI.3.5. Effet de la température et de solvants organiques
Si on augmente la température de la colonne, la rétention du soluté diminue. De plus la viscosité de la

phase mobile diminue ce qui permet d'augmenter le débit.
L'addition de solvants organiques à la phase aqueuse mobile affecte la rétention. En effet, les effets
secondaires de la matrice (adsorption hydrophobe dans le cas de polystyrène et perméation) jouent un rôle
prépondérant dans la distribution des ions et plus particulièrement des ions organiques.
VI.3.6. Analyse par chromatographie d’échange d’ion avec suppresseur de phase

(SAARI-NORDHAUS R., ANDERSON J.M., Intern. Lab., 1994, 18, P4)
Cette méthode est utilisée pour supprimer la conductance apportée par l’éluant sous forme de contre-ion.
Les phases suppresseurs sont des matrices de type polystyrène et sont souvent présentées sous forme de
fibres creuses.
Ces phases permettent le dosage d’anions avec une résolution remarquable.
NaOH
µ siemens F- Cl- SO4 --
µS
NaF ; NaCl , Na 2SO 4
dans Na OH
analyse en sortie
temps
µS F- Cl- SO4 --
égoût
H+
HF , HCl , H2 SO4
0,5 dans H 2O
fibre creuse temps
NaX NaOH
anode cathode
O2 Na+ H2
H+ H+ + X- OH-
H2 O HX H2 O
détecteur
Cette méthode est utilisable pour analyser des anions ou des cations .
VI.4. LA CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION
VI.4.1. Principe
La chromatographie d'exclusion, ou gel filtration ou gel perméation est fondée sur la “rétention” des
molécules de soluté en fonction de leur taille en raison de leur pénétration dans les pores, remplis de
solvant, d'une phase stationnaire appropriée. Si on suppose que les molécules de soluté ne présentent
aucune affinité pour les parois de la phase stationnaire particulaire, les grosses molécules ne pourront pas
pénétrer dans les pores ; elles migreront plus rapidement que les petites molécules qui peuvent, quant à
elles, pénétrer dans un plus grand nombre de pores (figure 25
S s
molécules de soluté
Figure 25. Chromatographie d'exclusion. Schéma de "trajet " d'un soluté de masse molaire élevée (S) et
d'un soluté de masse molaire faible (s).
Les grosses molécules sont élués par un volume Vo de solvant qui correspond au volume entre les "grains"
de la phases stationaire. Les petites molécules pénètrent dans le réseau du gel et sont éluées par un volume
Vt égal au volume total de solvant contenu dans la colonne.
La séparation est donc fondée ici, non sur des interactions physicochimiques avec la phase stationnaire,
mais sur la dimension des molécules en solution. Le volume de rétention VR des molécules X est égal à:
VR = Vo + K . F. Vi
Vo = volume total de la phase mobile ou volume mort , Vi = Vt - Vo - Vmatrice du gel

Vi = volume total de la phase stationnaire
F est la fraction du volume poreux de la phase stationnaire accessible aux molécules X.
F est compris entre 0 et 1.
K coefficient de distribution des molécules X K = Cs / C M, Cs et CM étant les concentrations respectives
de X dans la phase stationnaire et dans la phase mobile.
Les représentations de Vo, Vt et Vt - Vo sont schématisées sur la figure 26.
Vo Vt-Vo Vt
Figure 26. Diagramme représentatif de Vt et Vo
En chromatographie d'exclusion pure K est égal à 1 et on a : VR = Vo + F. Vi
Il y a 2 cas limites importants :
1) F = O. Les molécules sont totalement exclues de la phase stationnaire et on a VR = Vo. Toutes ces
molécules émergent ensemble de la colonne après le passage d'un volume de phase mobile égal au volume
interstitiel de la colonne.
2) F = 1. Tous les pores de la phases stationnaire sont accessibles aux molécules considérées et on a VR =
Vo + Vi.
Entre les deux limites, VR varie linéairement en fonction de la fraction du volume poreux accessible.
Ainsi, à chaque valeur de VR correspond théoriquement une taille de molécule elle-même porportionnelle
à la masse molaire (figure 27).
log (masse F = 0 (exclusion totale)
molaire)
perméation sélective
F = 1 (permeation totale)
VR
0 Vo Vo+Vi
Figure 27 : Relation entre la taille ou la masse molaire et le volume de rétention.
Si VR > Vt cela implique K > 1 : il se superpose alors un autre mécanisme de rétention (adsorption -
échange d'ions). Quand K = 1, les isothermes sont des droites et les pics sont des courbes de Gauss
parfaites. Tous les constituants du mélange chromatographié sont élués dans un volume inférieur à Vt.
VR = Vo + F V
VR - V0
F=
Vi avec V = V - V - V
i t o matrice du gel
En pratique on remplace Vi par Vt - Vo ; on obtient alors :
VR - V0
K av =
Vt - V0
Kav est la fraction du volume du gel stationnaire où diffuse une molécule donnée.
Pour des composés de densité et de forme moléculaire identiques, il existe une relation sigmoïdale entre
les valeurs de leur Kav et le logarithme de leur masse molaire. Ces courbes présentent dans une partie
importante, une relation linéaire entre Kav et log MM (figure 28); cette relation est du type :
Kav = A log (η.M) + B A et B sont des constantes, η viscosité intrinsèque (ml.g-1)
Kav
1
A
0,5 B
0
3 4 5 Log (poids moléculaire)
Figure 28. Variation du Kav en fonction du logarithme de la masse molaire

A gel à "grande" taille" de pores, faible réticulation B gel à "moyenne" taille de pores, réticulation plus élevée.
Un exemple de courbe de calibration pour la chromatographie d'exclusion est donné sur la figure 29.
log MM
3 érythromycine
réserpine
palmitate de acétate de cholestérol
vitamine A
prednisone
2,5 probecenid
aspirine
propylparaben
méthylparaben acide salicylique
2
0 5 10 VR (ml)
Figure 29. Courbe d'étalonnage pour la chromatographie d'exclusion Colonne Styragel 100 A, 30 cm x 0,7
cm ; solvant THF 2 ml / min-1.
VI.4.2. Différents types de gel existent actuellement
On distingue les gels mous, semi-rigides et rigides. Seul ce dernier peut être utilisé avec des vitesses de
phase mobile élevées (FPLC par ex.).
Certains gels sont rendus apolaires par modification des fonctions hydroxyliques. L'alcoylation des
polymères de dextrane conduit à des gels stables en présence de solvants organiques ce qui permet le
fractionnement des substances insolubles dans l'eau (LH). Ces gels sont vendus sous forme de grains secs
et doivent être mis à gonfler avant utilisation dans une colonne dans la phase mobile appropriée en doivent
être dégazés avant utilisation pour chasser les bulles d’air qui pourraient rester prisonnières de la matrice.
a) Gels mous :
Ce sont des polymères à faible taux de pontage pour lesquels le gonflement est important. Il s'agit le plus
souvent de dextrane rendu insoluble dans l'eau par réaction à l'épichlorhydrine (figure 30).
currentpoint
O H
CH2
O O H
OH H CH 2
H H O O H
OH H
OH CH 2
OH H H O O
O OH H
OH H H OH
CH2
OH O
agent de pontage H C
OH
CH2 CH2 CH CH 2 Cl
OH
O épichlorhydrine
H H
OH H
H O O H
O CH 2
CH2 CH2
O O H O O
OH H OH H
H H H
H OH OH
O OH
CH2
H C OH
CH2
OH currentpoint
Figure 30. Structure partielle d’un gel de dextrane.

La résistance mécanique augmente avec le taux de réticulation tandis que le diamètre des pores diminue. Il
existe des gels dont le polymère est du polyacrylamide et des gels mixtes composés d'acrylamide et de
dextranes. L'agent de pontage est le N-N'-méthylène bisacrylamide (figure 31).
currentpoint
O
CH2
CH2 NH
NH O H H
C OH O
O C CH CH2 OH H H
CH2 O
CH CH
OH
CH2 C O CH2
n NH H H
OH O
CH2 NH OH H H O
C CH CH2 O CH2
O CH
CH2 H H
CH2 OH O
CH CH2 OH H H O
OH OH
CH2
OH H O
H
H OH O
O O H H OH
CH2 H OH
H O O OH H H
CH2 H OH
H O O
CH2
H O currentpoint
Figure 31. Gel mixte dextrane-acrylamide
b) Gels semi-rigides
- Gels de polystyrène. Ce type de gel possède des propriétés remarquables et ne gonfle pratiquement pas. Il
peut être utilisé dans la plupart des solvants sauf : l'eau, les alcools, l'acétone, l'acide formique. Il est
utilisable en haute pression.
- Gel d'acétate de polyvinyle.
- Gels mixtes (dextrane-acrylamide) à taux de réticulation élevé. Plus le taux de réticulation augmente et
plus la résistance aux contraintes mécaniques augmentent : ces gels supportent des ∆P relativement
élevées.
c) Gels rigides
Ils sont constitués par des silices poreuses ou des verres poreux. Les colonnes HPLC du type TSK
correspondent à des phases stationnaires de ce type (poreuses, mais résistantes aux déformations
mécaniques et donc utilisables sous des débits et pression élevés).
Un chromatogramme de protéines solubles de haricot est indiqué sur la figure 32. Ce type de
chromatographie (associé ou non à des phénomènes d’échanges d’ions) est qualifié de FPLC (Fast Protein
Liquid Chromatography).
absorbance 206 nm
0,5
0
0 10 20 t R (minutes)
figure 32 . FPL Chromatogramme par exclusion des protéines de pois

VI.4.3 Principales applications de ce type de chromatographie :
a) La séparation de groupes de molécules de masses molaires très différentes
Le gel est choisi pour que les plus grosses molécules aient un Kav voisin de 1
- dessalage : les protéines et les polypeptides peuvent être dessalés ou séparés de substances de faibles
masses molaires avant concentration.
- extraction du phénol dans la préparation d'acides nucléiques.
- interruption de réactions entre macromolécules et réactifs de faible masse molaire.
- extraction de produits, cofacteurs ou inhibiteurs d'enzymes
b) Détermination de la masse molaire
c) Détermination des constantes d'équilibre
Pour le dessalage ou la séparation de protéines / petites molécules, la comparaison de diverses méthodes

est indiquée dans le tableau 9.
Tableau 9. Comparaison de méthodes de séparation protéines / petites molécules
Critère Filtration sur gel Dialyse conventionnelle Méthode

en sacs de cellulose des fibres creuses
Simplicité Facile Facile Facile
Efficacité du Approche habituelle- Peut atteindre 100 % Environ 95 %

dessalage ment 100 % si le procédé est
conduit à son terme
Sécurité Absolument sûr Sacs de dialyse Les fibres peuvent

susceptibles de se fuir ou se casser
fissurer ou de casser
Coût Faible Faible Cher
Durée 100 % de dessalage Très longue, le procédé 95 % de dessalage

obtenu en 15 minutes peut prendre en 20 minutes au
plusieurs jours mieux
Rendement des Habituellement proche Adsorption gênante Peut atteindre 70

protéines de 100 % pour de faibles % au moins pour
concentrations de faibles
concentrations
Récupération des Habituellement proche Habituellement Habituellement

petites molécules de 100 % impossible impossible
Dilution Dépend du volume et Faible Faible

de la concentration de
l'échantillon
Durée d'utilisation Habituellement 1.000 Une seule utilisation Jusqu'à 50

utilisations au utilisations ou 4
minimum. Les colonnes mois.
peuvent être
fréquemment être utilisées
1 à 2 ans sans qu'il soit
nécessaire de les refaire.
VI.5. LA CHROMATOGRAPHIE CHIRALE
(ARMSTRONG D.W., Current issues in HPLC Technology, LC.GC International, april 1998, 22-31).
C’est W. PIRKLE (PIRKLE W.H. and HYUN M.H., J. Chromatography, 1985, 322, 309) qui est un des
principaux initiateurs des ces méthodes analytiques.
Traditionnellement c’est la séparation des énantiomères qui est considérée comme le problème le plus
difficile à résoudre en chromatographie. Avant 1980 aucune solution n’était disponible. Entre 1980 et
1990 de nombreuses méthodes ont été mises au point pour atteindre de tels objectifs.
Ce sont surtout les séparations des acides aminés D et L qui ont suscité le plus de travaux. DAVANKOV
et al. (Advances in Chromatpgraphy, Giddings et al. Eds, M. Dekker, New York, 1983, vol 22, p 71) ont
ainsi proposé une phase stationnaire avec de la L-proline greffée. En présence de Cu2+ dans la phase
mobile, les interactions qui s’établissent varient en fonction de l’énantiomère.Il en est de même avec des
phases stationnaires silice greffée C8 en présence de composé amphipolaire à C asymétrique.
O
N
O- H
CH3
Cu2+ Si O CH3 (CH2)7 S C
H
O- NH 2 Si (CH2)17 CH3
C R Si O CH3 (CH2)7 NH
COO_
O H 1/2 Cu++
Un exemple de séparation de D et L tyrosine et de D et L tryptophane est présenté ci-dessous.

TYR TRP La phase mobile est constituée d’un mélange
α = 1,34 α =1,11 eau/méthanol (85/15) contenant 2 mM de
CuSO4. Le débit est de 1 ml/ min. La colonne de
15 x 0,4 cm est remplie de particules de 5 µm de
diamètre. La détection est réalisée à 254 nm.
20 40 temps d'élution (min)
En dehors de cette méthode de séparation par échange de ligand, des phases stationnaires chirales ont été
développées comme par exemple les phases polyéthers (formule indiquée ci-dessous) ou encore les phases
qui contiennent des molécules complexes comme certains antibiotiques glycopeptidiques (téicoplanine par
exemple). Elles permettent entre autre la séparation des D et L acides aminés.
O
O C O-
O
H
H
O N+
H H O R
O O
acide aminé
éther chiral en couronne

LIPKOWITZ K.B. (Intern. Lab., 1993, 15, 8-12) a proposé une modélisation moléculaire en
chromatographie chirale qui aboutit à :
k’ = A + Σi bi. k’ avec A = constante, bi moindre carré des coefficients de régression multiple.
Dans cette équation tous les échanges phase stationnaire - analyte sont pris en considération. Selon les
conformation relatives des deux structures, la somme de ces échanges sera variable en fonction des
possibilités stériques d’établissement de liaisons et k’ sera différent selon la structure spatiale des analytes.
Avec des phases comportant des carbones asymétriques, il sera alors possible de séparer des analytes qui
sont des diastéréoisomères.
currentpoint
H
B C R
H O N H
phase C O
chirale N C
C O
H R
currentpoint
Les échanges sont qualifiés par PIRKLE de :
donneur d’électron : analyse de sulfoxydes, lactames etc
accepteur d’électron : analyse d’amines, alcools, acides aminés thiols etc.
Le schéma d’analyse des composés isomères est le suivant :
isomères
constitution stéréoisomères (conformation)
géométriques énantiomères
(diastéréoismères)
phase stationnaire complexe avec un phase stationnaire

achirale dérivé chiral chirale
Il existe une classification des phases chirales basée sur les mécanismes impliqués dans la séparation des
énantiomères qui est la suivante :
type description chimie mécanisme
Pirkle sélecteurs chiraux variés liaisons H
1 liaisons ioniques interactions š-š
dipôle - dipôle
polymères celluloses et liaisons H
2 hélicoïdaux dérivés complexes d'inclusion
cyclodextrines complexes
3 cavité polymétacrylates d'inclusion
polyacrylamides
4 échange de ligand
5 protéines SAH , SAB interactions multiples

glycoprotéine hydrophobes
VI.5. LA CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE
C'est en 1910 qu’a été observée l'adsorption sélective de l'amylase sur un amidon insoluble.
Cette technique, encore qualifiée de bio-chromatographie ou encore de bio-reconnaissance, permet de

purifier presque toutes les molécules biologiques selon leur fonction ou leur structure chimique
individuelle. Il s'agit d'une chromatographie d'adsorption dans laquelle la molécule à purifier est adsorbée
spécifiquement de façon réversible sur un ligand immobilisé sur la phase stationnaire. Le facteur de
purification est très élevé car l’énergie échangée est très élevée et résulte de l’établissement de nombreuses
liaisons souvent de nature différente et coopératives.
De nombreuses séparations ont pu être accomplies en une seule étape.
Elle est utilisée pour :

- purifier des produits présents dans ses mélanges biologiques
- purifier la forme active d'un produit de son dérivé inactif
- séparer des traces de molécules biologiques de grandes quantités d'impuretés.
VI.5.1. Principe
Un ligant biospécifique est fixé par liaison covalente à une matrice (dextrane, agarose) sans perdre son
affinité pour le produit à purifier.
A Li + P A Li P
Li-P
K=
Li P
A agent de pontage
Li ligand
P produit à purifier
KD constante de dissociation
Tout composé peut servir de ligand pour purifier les produits qui sont à même de se fixer sur lui :
enzyme : analogue de substrat, inhibiteur, cofacteur
anticorps : antigène, virus, bactérie, cellule
lectine : polyoside, glycoprotéine, récepteur de surface cellulaire
acide nucléique : séquence complémentaire de bases, histone, acide nucléique, polymérase
hormone, vitamine : récepteur, protéine porteuse
cellule : protéine de surface.

VI.5.2. Couplage et ligand
Il existe plusieurs méthodes de couplage. La plus utilisée fait appel à la carbodiimide
NH2 Li O
O NHR1
COOH + R1 N C N R2 C O C C NH Li
NR2
matrice carbodiimide Li = ligand
Il est possible de fixer sur la matrice des thiols (type glutathion -2-pyridyl disulfure)
fixation R' SH
S S + SH R S S R S S R'
N élution
+ R SH
RSH peut être une protéine, un peptide etc.
Par cette méthode chromatographique, on peut par exemple purifier les immunoglobulines en utilisant la
protéine A comme ligand.
Quelques enzymes et protéines possèdent une affinité pour un colorant bleu (bleu Cibacron F3GA) et
plus particulièrement les kinases, les déshydrogénases et les enzymes contenant des groupements adényl
(620 sur 2000 enzymes).
O NH2
SO2ONa R1 R1 = H ou SO2 ONa
R2 R2 = SO2 ONa ou H
NH
O NH
N
N
NH N
O matrice
SO 2ONa
Dans ce type de chromatographie, il y a reconnaissance et interactions souvent multiples (hydrogène,

hydrophobe, ionique, transferts de charge - ) entre deux molécules : le soluté et la phase stationnaire.
Des essais de préparation de phase stationnaire par empreinte moléculaire sont souvent couronnés de
succès. Pour ce faire, la molécule à séparer est “complexée” avec des monomères réactifs et le complexe
molécule-monomères est placé dans un milieu contenant un polymère que l’on réticule alors. On
débarrasse ensuite le polymère phase stationnaire de la molécule empreinte. Les monomères sont souvent
des composés vinyliques ou acryliques, des styrènes ou des silices tandis que l’acrylate diméthylique de
l’éthylène glycol constitue la phase réticulante. Cette méthode permet par exemple la séparation des
racémiques d’acides aminés.
-
polymère
+ COO CH CH2
CH2
CH2
H + polymère
H
COOH NH3+
COOH NH3+
D-phénylalanine
COO- CH CH2
empreinte de D-PHE extraction de la molécule

de D-PHE
D-PHE
CH2
polymère
H
COOH NH3+
COO- CH CH2
CH2
H L-PHE
NH3+ COO-
VII. EQUIPEMENTS UTILISES EN CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
Le schéma général d’un système chromatographique en phase liquide est indiqué sur la figure 33. Ce
système comprend :
- l’éluant qui peut constituer une phase mobile de composition constante (système isocratique) ou variable
en fonction du temps (système à gradient )
- le système de pompage à pompe unique (système isocratique ou à gradient basse pression) ou multiple
(amortissement ou sytème à gradient haute pression)
- un système d’injection
- une colonne (thermostatée ou non) précédée ou non d’une pré-colonne
- éventuellement un réacteur post-colonne
- un ou plusieurs détecteurs avec enregistreur et intégrateur

PHASE solvant : réservoir(s) Dégazage par entrainement

MOBILE à l'hélium ou par ultra-sons
filtre 0,45 µm
différence de
pression système de pompage isochratique ou gradient
hydrostatique basse ou haute pression
faible
dérivatisation pré-colonne
injecteur dispositif automatique
passeur automatique
pré-colonne
phase
thermorégulation colonne stationnaire
dérivatisation post-
collecteur colonne
de détecteur(s)
fractions
enregistreur traitement des

intégrateur données
figure 33. Schéma d’un système de chromatographie en phase liquide.
Un système de chromatographie liquide doit satisfaire un certain nombre de contraintes dont deux sont
primordiales :
- l'élution à travers des colonnes contenant des phases stationnaires de fine granulométrie qui nécessite des
pressions élevées
-l’obtention d’une bonne reproductibilité des temps de rétention qui nécessite un débit de la phase mobile
constant.
VII.1. DISPOSITIFS D'OBTENTION DE GRADIENTS
Les plus anciens sont des réservoirs communicants. Actuellement les plus répandus sont obtenus par des
systèmes gérés par microordinateurs et programmation.
L’élution peut être obtenue au moyen de dispositifs permettant de réaliser des gradients basse pression de
“polarité”, de pH, de force ionique, de concentrations en divers composés (dispositifs à chambres
communiquantes, figure 34)
C/Co
7 6 5 4 3 2 1 C/Co
1
1 7
2 6
4
3 5
0
0 0,5 1
Ve / Vt
figure 34 . Schéma d’un dispositif d’élution “par gradient” à chambres communicantes
Dans ces dispositifs, les variations de concentration C (par rapport à la concentration initiale Co) d’un
composé donné placé dans un des compartiments en fonction du volume élué (pompé) sont indiquées sur
la figure 34.
A un volume d’élution donné (ou à un temps d’élution donné) on peut, avec ces systèmes, évaluer
la”chambre” dont l’incidence est dominante et celles intervenant à un degré moindre dans l’élution. Ainsi,
au début de l’analyse c’est la composition de la chambre n°1 qui est déterminante tandis qu’à mi-analyse,
ce sont dans l’ordre les chambres n°4, puis n°3 et 5 et enfin n°3 et 6 qui par leur composition
influenceront le plus l’élution.
En choisissant judicieusement la composition de ces chambres pour obtenir des variations de pH, force
ionique, concentration en méthanol et en thiodiglycol permettant la séparation (figure 35), il est possible
de réaliser en quelques heures ou moins (avec des colonnes de particules de résines échangeuses de cations
de type polystyrène sulfoné de 5 à 15 mm de diamètre et 5 à 50 cm de longueur, le plus souvent à 50°C et
avec des débits de tampons citrates voisins de 1 ml.min-1 ) la séparation complète de tous les acides
aminés .
+
méthanol pH Na (M) thiodiglycol
(%) (%)
6 pH
1,2
méthanol
10
+
Na 0,5
5
2,5
0,2
0 0
0 0,5 Ve /Vo 1
CYS VAL
ARG
LEU
TYR
MET
LYS
SER
ASP
TRP
PHE
NorLEU
HIS
ALA
PRO
CYSSO3H
GLU
THR
LEU
GLY
figure 32. Variations des paramètres de séparation des acides aminés par chromatographie d’échange
ionique (gradient).
Le chromatogramme obtenu est schématisé ci-après.

cysSO3 H met O2 ala
thr glu
asp leu
met O met lys
ser val ile
norleu his
cys phe arg
gly tyr
trp
pro
NH4
temps d'élution
- L’élution peut également être obtenue par des systèmes à trois éluants (ou plus) dont les
mélanges, gérés en fonction du temps par ordinateur, conduisent à des gradients d’élutions qui permettent
des variations des paramètres de l’élution tels que le pH, la force ionique, la polarité (valeur de εo, nature
des éluants etc.) (figure 36 ).
Si le mélange est réalisé avant le système de pompage, le système est qualifié de système à gradient basse
pression . Une seule pompe suffit alors à l’élution, mais il est nécessaire de bien mélanger les différents
éluants ”primaires” dans des systèmes dont le volume mort peut constituer un handicap.
Si le “gradient” d’élution est réalisé par autant de pompes qu’il y a d’éluants primaires (au maximum 3
actuellement), le système est qualifié de gradient à haute pression. Les débits des différentes pompes sont
réglés électroniquement de telle sorte que la somme de leurs débits respectifs soit égale au débit d’élution
choisi.
A B C
A B
tampons
d'élution
électro-
vannes
mélangeur
pompe SYSTEME
HAUTE
SYSTEME PRESSION
BASSE injecteur à
boucle colonne
PRESSION
exyterne détecteur
enregistreur
figure 36 . Schéma des systèmes basse et haute pression d’analyse en “HPLC”
VII.1. LES POMPES
Il existe des pompes à pression de gaz, mais les plus utilisées sont les pompes électriques de type seringue
(jusqu’à 20-50 bars) et surtout les pompes de type piston (figure 34). C’est avec ce dernier type de pompe
que des débits constants très faibles (0,1 mL.min-1 ) ou très grands (plusieurs mL.min-1) sont accessibles à
des pressions qui peuvent atteindre environ 500 bars.
Les pistons de ces pompes sont en saphir, en tantale ou en matériau résistant et inaltérable, les pistons en
acier inoxydable étant relativement sensibles à la corrosion. Il faut rappeler ici que les solutions salines
sont particulièrement corrosives et qu’il est bon de rincer l’ensemble du système pour éviter ces
phénomènes. Par ailleurs si des sels sont présents dans la ou les phases mobiles, l’évaporation de ces
dernières conduit à leur cristallisation ce qui est particulièrement gênant quand ce phénomène se produit
dans des zones sensibles (cellules de détection, vannes d’injection, etc) difficilement accessibles au
nettoyage.
sortie
piston
vannes à billes
(saphir)
partie joint torique

motorisée
entrée
Pompe de type seringue ( 50 à 500 ml déplacés)
sortie
ressort de rappel
piston
vannes à
billes
came
excentrique
joints
toriques
entrée
variation de la pression en sortie
Pompe à piston unique
sortie
pompe A pompe B
entrée de la phase mobile
variations de P pour la pompe A variations de P pour la pompe B
variation globale de P
Pompe à 2 pistons opposés fonctionnant en opposition de phases
figure 37 . Schéma de quelques pompes utilisées en chromatographie en phase liquide
Il est important aujourd’hui de choisir des pompes pouvant assurer des débits de l’ordre de quelques µL.
min-1 afin de pouvoir les utiliser avec les nouvelles colonnes (capillaires de moins de 0,5 mm de diamètre
et contenant des particules de phase stationnaire de 1 µm de diamètre).
VII.3. LES INJECTEURS
Il faut absolument éviter de dissoudre les solutés dans un solvant plus éluant que la phase mobile. Il est
souhaitable de dissoudre les solutés dans le liquide vecteur.
Il existe deux types d’injection :
- par seringue
- par vanne (boucle d’échantillonnage). Ce type d’injection automatisable ne permet pas d’atteindre
l’efficacité maximale. Il existe des vannes à boucles internes et des vannes à boucles externes (cF V.1.3.4
figure 6).
Dans l’analyse des acides aminés, il faut que la phase solvante de l’hydrolysat contenant les acides aminés
à analyser ait un pH et une force ionique équivalents à ceux du tampons d’élution au temps 0 pour une
séparation par chromatographie d’échange ionique mais aussi possède une polarité égale à celle de la
phase mobile au temps 0 de l’analyse dans le cas d’une séparation par chromatographie en phase inverse.
VII.4. LA COLONNE (cf chapitre V.1.3.2.)
Les frités limitant la colonne ont des porosités comprises entre 0,5 et 5 µm. L’inconvénient majeur des
frités de faible porosité est le colmatage qui se traduit par des augmentations importantes de pression.
L’utilisation de particules de 5 µm requiert la présence de frités de 0,5 µm.
VII.5. LES PARTICULES SUPPORT DE PHASE STATIONNAIRE
Comme indiqué dans le tableau ci-après, la silice reste le matériau de base le plus utilisé en HPLC. Ses
caractéristiques sont largement développées dans le chapitre VI.1.2.1.
matériau utilisation
estimée (%)
gel de silice 75
polymère organique 20
polymétacrylates
polystyrène-DVB
polyéthylène
glycol
alumine 1
autres 4
graphite, carbone
zirconium
hydroxyapatite
Le plus utilisé des polymères organiques reste le polystyrène réticulé avec du divinyl benzène. De
porosités variables, ils sont en général stables dans une gamme de pH comprise entre 1 et 14. Leurs
caractéristiques principales sont indiquées dans le chapitre VI.3.2.
Parmi les polymères commercialisés comme phase stationnaire on peut citer : les polystyrènes -
divinylbenzène, le polydivinylbenzène, les polymétacrylates, le polybutadiène, le polyvinylpyrrolidone, le
polydextrane, la cellulose, le polyhydroxymétacrylate, l’éthylvinylbenzène, alcools polyvinyliques alkylés,
polyosides, polyhydroxyéthyl aspartamide, chlorure de polyvinyle, triacétate de cellulose, méthylène bis
acrylamide, polyéthylène glycol, agarose réticulé, etc..
Les matrices organiques sont moins utilisées que la silice comme support de phase inverse. Néanmoins
elles permettent des séparations chromatographiqes dans des conditions de pH pour lesquelles la silice
n’est pas utilisable.
La figure 22 schématise des résines de type polystyrène ou silice qui peuvent être :
microporeuses ( très réticulées par le DVB ) ; ces résines

ne gonflent pas , leur sélectivité est élevée
mais les transferts de masse y sont mauvais
(cinétique lente)
micropores
macroporeuses (peu réticulées) ; ces résines ont des
canalicules et une surface interne importante.
Une grosse molécule peut pénétrer à l'inérieur
(cinétique moyenne)
macropores
1 µm pelliculaires L'épaisseur de résine sur la bille de verre

est de l'ordre de1 µm (cinétique d'échange
très rapide)
film échan- bille de verre :
geur d'ions particule de silice
microsphères
superficiellement poreuses
La résine échangeuse d'ions est fixée sur des
microsphères de silice , elles-mêmes
40 µm fixées sur des billes de verre .
L'épaisseur de la couche de résine est
inférieure à 1 µ m
figure 22. Différents type de particules de phase stationnaire en chromatographie liquide.
Les résines pelliculaires ont une capacité d'échange de 260 à 1000 fois plus faible que celle des résines
poreuses. Par contre leurs HEPT sont environ 10 fois plus faibles.
La taille des pores des particules varie entre 4 et 300 nm. La plupart des colonnes proposées sont replies
de particules pour lesquelles la porosité est d’environ 8-12 nm.
Les particules macroporeuses (perfusives) permettent des chromatographie préparatives nécessitant des
débits élevés avec peu de perte de charge. Leur efficacité est en général inférieure à celle des particules
« normales ».
Actuellement la tendance est à l’utilisation de particules dont le diamètre est compris entre 3,5 et 5 µm.
Ces supports permettent un bon compromis entre la facilité d’usage et l’optimisation de l’analyse (temps,
résolution etc.). Il s’agit le plus souvent de partcicules aux dimensions polydisperses. La distribution
gaussienne des diamètres présente des écarts-types relativement faibles comme schématisé sur la figure ci-
après :
nombre de
particules
4 5 6 diamètre en µm
Distribution de diamètre de particules de silice avec une valeur moyenne de 5 µm
VII.6. LA NATURE DE LA PHASE STATIONNAIRE (cf chapitre VI.1)
Le gel de silice a été substitué, à partir des années 1975, par des gels greffés et depuis 1984 ce sont les
phases inverses qui dominent les applications de l’HPLC. Plus de 95 % des analystes utilisent en HPLC,
au moins de temps en temps, des phases inverses.
L’utilisation relative en 1998 des différentes phases disponibles en HPLC est indiquée dans le tableau ci-
après :
méthode Utilisateurs méthode Utilisateurs

chromatographique relatifs (%) chromatographique relatifs (%)
phase inverse 50,4 exclusion 6,7
C18 24 phase aqueuse 3,5
C8 15,9 non aqueuse 3,2
phényl 7,1 chirale 2,8
C4 2,3
C1-C2 1,1 interaction
phase normale 24,1 hydrophobe 1,1
cyano 8,9
silice 8,5 affinité 0,6
amino 4,7 partage 0,2
diol 2,0
échange d'ions 14 autres 0,3
anion 7,4
cation 6,6
L’influence de la méthode de préparation des particules de silice influence de façon très significative les
performances de la séparation
Le grains de silice greffés avec des C8 à C18 possèdent encore des silanols libres qui sont « neutralisés »
par réaction avec du triméthylmonochlorosilane.
La longueur des chaînes greffées aliphatiques (phase inverse) influence la stabilité : plus le nombre de CH2
du greffon est élevé et plus la stabilité aux pH inférieurs à 2 et supérieurs à 8 augmente ( C30 > C22 > C18
> C12 > C8 > C6 > C4 > C2 > C1).
Le dopage de la silice par de l’aluminium qui réagit avec les silanols géminaux conduit à une structure
pseudo-zéolithique stable jusqu’à pH 10.
VII.7. LES CONNEXIONS
Les connexions injecteur-colonne-détecteur constituent un volume mort qui en diluant les solutés dans la
phase mobile entraînent une perte d'efficacité non négligeable.
Pour ne pas perdre plus d'une fraction

2
α 2 2
4 24 . α . D M. VR
2 r .l Š
1+α de l'efficacité il faut que : π.N.D
r et l : rayon intérieur et longueur du tube

DM : coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile de débit de l'éluant.
Ainsi pour r = 0,2 mm l doit être inférieur ou égal à 320 mm et pour r = 0,5 mm l 8 mm.
Rappelons que la dispersion dans la colonne est égale à :
2
2 tr
σ =
Ν et que la largeur à la base des pics ω est égale à 4 σ.
TAYLOR a montré que la dispersion liée aux tubes de liaisons entre l’injecteur, la pré-colonne, la colonne
et le détecteur était égale à :
4
2 dt . l . D
σ = Α.
DM
A est une constante, dt le diamètre intérieur des tubes de liaison, l leur longueur, D le débit de la phase
mobile et DM le coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile.
La présence de cavités ou de volumes morts divers contribue aussi à la dispersion.
VII.8. LES DETECTEURS (tableau 10)
Il existe actuellement 3 types principaux de détection :
- mise en évidence d'une propriété du soluté directement ou après réaction pré ou post-colonne avec un
composé révélateur (spectrophotomètre UV/visible, fluorimètres),
- mise en évidence d'une modification de l'éluant (conductimètre, réfractomètre),
- séparation du soluté de l'éluant (couplage chromatographie - spectrométrie).
VII.5.1. Critères de choix
Les paramètres les plus importants à considérer sont :
1.le bruit donné en unités de la mesure du détecteur.
2.la sensibilité : concentration pour laquelle le rapport signal/bruit est égal à 2.
3.la dérive exprimée en unités de la mesure par unité de temps.
4.le domaine de linéarité : domaine de concentration de réponse linéaire du détecteur.
5.le volume de la cellule qui peut être considérée comme une chambre de mélange.
6.la possibilité d'utiliser un gradient d’élution.
Depuis 1971 l’évolution de l’emploi des divers dans les laboratoires a beaucoup évolué comme le montre
le tableau 10a ci-après :
Tableau 10a. Evolution de l’utilisation (en %) des détecteurs en CLS
année type de détecteur
UV-visible fluor. Indice Electro Conduc- Spectro Diffusion

fixe var. Baret. réfract. chim. -timét. masse
1991 63 10 43 10 12 4 7 4 8 4
1986 69 21 43 5 10 5 8 3 1,5 2
1981 66 25 41 - 12 9 6 2 1 -
1976 73 48 24 - 7 13 3 1,5 0,3 -
1971 61 46 15 - 1 34 - 2 - -
Les principales caractéristiques des détecteurs sont indiquées dans le tableau 10b.
Tableau 10b. Principaux détecteurs utilisés en chromatographie liquide.
type Universalité Limite de Destructeur Identification facilité d’ Remarques

détection de composés utilisation et coût
Détecteur UV- +++ 0,3 ng/ml - + +++++ Le plus utilisé

visible peu coûteux
UV-visible +++ 1 ng/ml - ++ +++++ bande passante

barettes diodes assez coûteux
Fluorimètre + 5 pg/ ml +/- ++ ++++ nécessite

souvent une
dérivatisation
Réfractomètre +++++ 0,7 mg/ml - - ++ peu coûteux

cellule lecture
Détecteur ++++ pg/ml + - + détecteur

électrochimique d’avenir
Détecteur par sélective 0,1 ng/ml - + ++ limité aux ions

conductivité d'ions
Spectromètre ++++++ ng /ml +++++ ++++++ +/- très cher

de masse
Diffusion de ++++++ 1 ng glucose +++ - + détecteur

lumière d’avenir
VII.5.2. Détecteurs par absorption UV/visible
C'est le détecteur le plus utilisé. Le faisceau de longueur d’onde λ donnée traverse une cuve dans laquelle
circule l'effluent. Suivant la loi de BEER l'absorbance est définie par :
Io
A = log = ε . l . c
I
Io intensité incidente
I intensité émergeante
ε coefficient d'extinction molaire du soluté
c concentration
l longueur du trajet optique
Le bruit est de l'ordre de 10-5 unités d'absorbance, le domaine de linéarité voisin de 104 et le temps de
réponse est de l'ordre de 0,5 seconde.
Il existe des détecteurs à barettes de diodes (35 à 100 diodes par barettes, 1 barette référence et 1 barette
dosage), diodes sensibles à des longueurs d'onde définies, en général de 2 nm en 2 nm (parfois 10); ces
détecteurs permettent de réaliser des spectres d'absorption en des temps très courts donc en cours de
chromatographie (BERTOLIN M., Intern. Labor., oct 1991,44-50). Les résultats sont présentées sur des
chromatogrammes en trois dimensions.
VII.5.3. Les fluorimètres

l
Certains solutés qui absorbent des photons h . C / λex , peuvent réémettre des photons d’énergie h . C /
λém
La longueur d'onde d'excitation λex est inférieure à celle d'émission.
L'intensité de fluorescence F émise par une solution de concentration C irradiée par une radiation
d'intensité Io est donnée par :
F = Q K Io (1 - 10-εcl)
K est le rendement de collecte de la fluorescence

Q fraction de radiation réémise.
La détection très sélective et très sensible nécessite parfois une dérivatisation préalable.
VII.5.4 Détecteur à diffusion de lumière
(WYATT P.J., Intern. Labor., 1993 ; STOCKWELL P.B. et KING B.W., 1991)
Le solvant est nébulisé par un courant de gaz inerte (azote) et vaporisé à une température inférieure ou
égale à 180°C. Le soluté dont la tension de valeur est supérieure à celle de l’éluant reste à l’état de
brouillard et est amené par le gaz vecteur jusqu’à la chambre de détection. La quantité de lumière diffusée
mesurée par un photomultiplicateur placé à 120° par rapport à la lumière incidente est proportionnelle à la
masse éluée.
Il s’agit d’un excellent moyen de détection quand la masse moléculaire est supérieure à 200 Da.
VII.5.5. Détecteurs électrochimiques
Un potentiostat impose à l'électrode de travail un potentiel fixe par rapport à celui de l'électrode de
référence tel que le soluté à détecter soit oxydé ou réduit. Au cours du passage du soluté dans la cellule, un
courant d'électrode proportionnel à sa concentration circule entre l'électrode de travail et sa contre
électrode.
VII.5.6. Détecteurs réfractométriques
On mesure en continu la différence d'indice de réfraction entre le solvant pur et l'effluent de la colonne.
Ces détecteurs surtout utilisés pour les glucides sont de loin les moins sensibles. Il faut veiller à ce que leur
cellule de mesure soit rincée à l’eau ou avec un solvant organique comme le méthanol après chaque série
de mesures car si la phase mobile contient des sels, ceux-ci risquent de cristalliser dans le système et leut
solubilisation est extrêmement difficile.
VII.5.7. Couplage chromatographie liquide / spectrométrie de masse
Le couplage CL- SM permet d’obtenir un système analytique très performant. Par chromatographie liquide
il est possible de séparer n’importe quelles molécules en choisissant judicieusement le système et les
composés séparés peuvent être injectés dans un spectromètre de masse qui donne des informations
immédiatres sur la masse molaire et la structure .
a) Principe
Le composé à analyser est d’abord vaporisé à basse pression. Ce transfert en phase gazeuse empêche les
molécules de l’échantillon de réagir avec les autres et facilite l’ionisation qui est l’étape analytique
suivante. Le spectromètre détermine la masse moléculaire des composés en mesurant leurs rapports masse
/ charge ( m / z ). L’ionisation de la molécule génère des formes chargées du composé qui sont dirigées
vers une série de champs magnétiques ou électrostatiques. Plusieurs méthodes ont été développées pour
ioniser le composé séparé par chromatographie liquide .
b) Méthodes d’ionisation
L’ionisation des molécules peut être obtenue par un faisceau d’électrons dirigé dans la phase gazeuse.
L’énergie cinétique de ces électrons permet de rompre des liaisons covalentes intramoléculaires. Les
fragments obtenus donnent des informations permettant de “structurer” la molécule. Un des désavantages
de cette ionisation est que de nombreuses molécules ont des liaisons covalentes de faible énergie qui sont
rompues sans donner d’ions détectables correspondants, ce qui empêche alors de détermijner la masse
moléculaire.
L’ionisation chimique est employée pour minimiser la fragmentation tout en produisant l’ion détectable .
Le produit est ionisé par transfert de proton à partir de gaz (méthane) ionisé par des électrons accélérés , ce
gaz étant injecté automatiquement à l’interface .
c) L’interface chromatographie liquide / spectrométrie de masse

Elle permet de transformer le liquide correspondant à la phase mobile en un gaz dans un milieu à pression
très faible. De nombreuses interfaces ont été imaginées (ceinture mobile, thermovaporisateur, injecteur
direct de liquide, transport par un faisceau de particules, bombardement atomique rapide et continu etc.).
Dans un thermovaporisateur la phase mobile contenant le soluté à analyser est chauffée dans le liquide
“vaporisateur” et ensuite vaporisée dans la zone sous vide; il se forme un fin brouillard. Si la phase mobile
contient des ions NH4+, acétate) , quelques microgouttes peuvent porter des charges. Sous vide solvant
s’évapore rapidement et les molécules de soluté sont désolvatées et associées à la charge. Le résultat est
une molécule chargée “isolée” de la phase mobile.
Pour des solutés non ionisés le système de vaporisation est associé à un filament source d’électrons qui
décharge des ions pour faciliter la formation d’ions ou encore à une électrode de fragmentation qui génère
des fragments en augmentant la vitesse des collisions intermoléculaires.
d) Différents types d’analyseurs de masse

Ainsi ionisées, les molécules sont dirigées vers des zones à champs électrique et magnétique. Il existe à ce
niveau quatre types d’analyseurs de masse:
- à secteur magnétique. Dans ce système, pour un champ magnétique donné et une vitesse donnée de la
particule, seuls les ions moléculaires d’une masse et d’une charge données peuvent passer dans le détecteu
. Pour évaluer la gamme de masses moléculaires présentes, l’intensité du champ est modifiée plusieurs fois
afin de détecter tous les ions présent . Ce détecteur a une résolution de 0,001 U de masse moléculaire.
- l’analyseur quadrupole est basé sur l’interaction de la molécule ionisée avec un champ électrique
oscillant. En faisant varier le potentiel appliqué aux électrodes, seuls les ions d’une masse donnée oscillent
dans une direction stable et atteignent le détecteur. Les autres molécules entrent en collision avec les
électrodes et ne sont pas détectées. L’analyse des masses présentes est obtenue en faisant varier le potentiel
appliqué aux électrodes et en déterminant pour un potentiel donné les ions présents. Avec ce système le
balayage des masses est rapide (1 seconde) et ce système est utilisable en couplage CPV ou CPL.
- l’ion trap analyseur utilise aussi des interactions dans un champ électrique. Alors que dans l’analyseur
quadrupole l’ion avec une trajectoire stable est dirigé vers le détecteur, dans ce système, ce sont les ions
stabilisés dans la cellule qui sont analysés.
- l’analyseur de temps de transfert mesure le temps nécessaire à un ion pour atteindre le détecteur (50 à
100 µsec).
Un exemple de couplage chromatographie liquide / spectrométrie de masse est donné sur la figure 39.
B colonne C18 , 10 cm L , 0,4 Di

absorbance à 280 nm
C éluant tampon acétate pH 4 0,01 M

A / méthanol ( 80 / 20 ; V/V )
débit 0,8 ml / min
temps de rétention (minutes)
100 160 204
50
currentpoint
NH2
m/z CH2 CH COOH
A
0
261
abondance relative (%)
32 76 N
H
50 NH2
CH2
CH2 CH CO NH COOH
B
0
N CH3
47 91 276 H
50 NH2 CH
CH2 CH CO NH COOH C
0 N
m/z H currentpoint
figure 39 . Couplage chromatographie liquide - spectrométrie de masse
VII.5.8. Les réacteurs post-colonne
Une réaction chimique peut être réalisée entre un chromophore et les solutés à détecter. Plusieurs types de
réacteurs sont utilisés : capillaire, segmentation de flux
Pour l’analyse des acides aminés le système suivant est souvent utilisé.
O O
O
NH2 OH COOH
OH COOH
+R CH
NH CH
N CH
OH COOH R
O R
O O
ninhydrine + H2O
+ H2O
O O O
H HO
2 H
N CH2 R
NH2
N CHR
O O O +CO
+ R-CHO
2
+ ninhydrine
H O
2
O O O
OH
N
H +NH 3
O O O
hydrindantine pourpre de Ruheman
+ ninhydrine
O O
OH
composé violet
OH
NH 3 O O
OH
O O
NH2
O O
Les acides aminés élués individuellement sont soumis en continu à une réaction colorée permettant leur
dosage. Il s’agit le plus souvent dans la chromatographie d’échange ionique de la réaction à la ninhydrine
qui est réalisée à pH 5,5 en présence de méthylcellosolve, sous azote et à chaud.
Parmi les nombreux dérivés qui se forment certains sont violets, d’autres jaunes ou encore rouges, leur
formation dépendant entre autre de la nature de l’acide aminé. La mesure de l’absorbance à plusieurs
longueurs d’onde (570 et 440 nm ) aide à l’ “identification” des acides aminés élués.
Le schéma du réacteur est indiqué sur la figure 40. Pour éviter que des phénomènes de diffusion
“n’élargissent les pics”, le flux est segmenté par de l’azote.
1 bain d'huile
éluat réfrigérant
ninhydrine 2
azote 3 95°C
4
sulfate d' hydrazine 5 bobines de mélange
pompe péristaltique détecteurs

colorimétriques
440 nm 570 nm dégazeur
enregistreur
intégrateur
figure 40 . Dosage continu des acides aminés par réaction à la ninhydrine
La pompe péristaltique est une pompe à galets animée d’un mouvement de rotation très précis. Les tubes
de pompe ont des diamètres internes parfaitement calibrés donc des débits parfaitement contrôlés .
galets
V
azote
tube de pompe
La réalisation de réactions chimiques en continu avec ce type de réacteur repose sur le principe suivant : si
la réaction en “batch” nécessite 3 réactifs A , B , C en quantités x , y et z, la réaction en tube se fera avec
des tubes de pompes permettant des débits de x’ , y’ et z’ ml.min-1 , avec x/x’ = y/y’ = z/z’. Si la
réaction nécessite un chauffage, une bobine est immergée dans un bain d’huile, sa longueur permettant de
contrôler le temps de passage.
Après réaction, le flux segmenté est dégazé par différence de débits et un évent vertical, le dégazage étant
nécessaire à la mesure de l’absorbance. Les cuves des spectrophotomètres de mesure en continu ont des
trajets optiques compris entre 1 cm et 0,2 cm, leur volume étant compris entre 500 µl et 5 µl .
VIII. QUANTIFICATION
Après avoir obtenu des pics bien résolus, il faut relier, pour chaque composé, le signal obtenu sur le
détecteur à sa concentration dans l'échantillon analysé.
Sur le papier enregistreur on observe un pic gaussien (ou plus ou moins gaussien).
L'aire du pic est proportionnelle à la quantité injectée.
+
A= R . dt
-
A aire du pic
R réponse du détecteur
mi = Ki Ai
mi masse de soluté détecté

Ai aire de son pic
Ki coefficient de réponse.
VIII.1. LA MESURE DE L'AIRE d'un pic peut s'effectuer :
1) par intégration électronique
2) par pesée du pic découpé
3) par triangulation (figure 3, p 6)
A = h x δ x 1,066 avec h hauteur du pic δ hauteur à mi-hauteur
4) par mesure de la hauteur des pics

2
tR
N = 5,54
δ
(mi = Ki Ai mi = Ki.hi.δi 1,066)

2,35 . t R
m=K. h. . 1,066
Ν
Cette méthode n'est utilisable qu'avec tR et N-2 constants (débit parfaitement constant). Cette méthode est
valable en chromatographie en phase gazeuse pour les pics étroits.
VIII.2. MESURE DES COEFFICIENTS DE REPONSE Ki et de mi
Elle peut être effectuée

- par étalonnage direct
- par mesure relative en rapportant la surface du pic du soluté à un composé de référence.
Ki n'est pas le coefficient de réponse du détecteur mais celui de l'appareillage tout entier, colonne
comprise.
La détermination des concentrations peut se faire :
a) par normalisation interne

On mesure la proportion relative des aires en admettant que l'on connaît Ki.
La teneur d'un composé est
Ai . K i
m i (%) = . 100
Σ iAi . K i
b) par étalonnage externe

Cette technique n'est valable qu'avec une excellente qualité d'injection
mref = K A ref
On injecte une masse mref de composé étalon en solution (Vréf injecté).
m réf
m réf =
Aréf
On injecte un même volume de solution contenant le composé (me) et on mesure me.
mi = K. Ai
soit
m réf
mi = . Ai
Aréf
c) par étalonnage interne

On introduit dans le mélange à analyser un composé (étalon interne) qui n'interfère pas avec les
constituants du mélange et qui possède un k' voisin du ou de solutés à doser. Avec cet étalon interne on
connaît
m ei
K ei =
Aei
Si on a introduit m'ei dans le mélange à analyser on doit trouver à l'analyse une aire égale à A'ei = Kei/m’ei.
Si on trouve une aire différente (A"ei) c'est qu'il y a eu une perte (le plus souvent) de produit (par exemple
au cours de la préparation de la solution).
Cette "perte" est alors compensée et on a :

m réf A" ei
mi = . Ai .
Aréf A' ei
La répétabilité est la mesure de l'intervalle dans lequel sont trouvés des résultats obtenus par un même
opérateur sur un même appareil en opérant de façon identique.
La reproductibilité est la mesure de l'intervalle dans lequel sont trouvés des résultats obtenus par des
opérateurs différents sur des appareils différents mais avec un mode opératoire identique.
La précision caractérisée par l'écart-type représente les écarts par rapport à la moyenne connue ou
inconnue.
La justesse est la valeur des écarts entre la moyenne des mesures et la valeur réelle.
VIII.3. INFLUENCE DES CONDITIONS OPERATOIRES SUR L'ANALYSE QUANTITATIVE
L'aire du pic A est égale à

+
A= R . dt
− (R réponse du détecteur)
A = K C.dt. La réponse du détecteur est fonction de la concentration C du soluté.
Si Q est le débit de la phase mobile

m = CdV = CQ dt
Si le débit de la phase mobile est constant on a :
m = Q . C dt or
A A
C . dt = m=Q
K et K
Toute variation du débit entraînera une variation de l'aire d'où la
nécessité de posséder de très bonnes pompes.
IX. TRANSPOSITION CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE EN COLONNE SUR COUCHE

MINCE
La chromatographie d'adsorption en colonne présente certains avantages par rapport à la chromatographie

d'adsorption sur couche mince :
- durée de séparation plus courte
- analyse quantitative précise
- utilisable à des fins préparatives
- automatisation aisée.
La CCM est beaucoup plus facile à mettre en oeuvre et peu coûteuse. De plus, avec un mélange inconnu, il
est possible de pratiquer une séparation sur CCM avec révélation universelle (carbonisation par chauffage
après pulvérisaton d'acide sulfurique). Les données bibliographiques sont très nombreuses.
En CCM on caractérise la migration d'un soluté par son RF
distance parcourue par le soluté

RF =
distance parcourue par le front du solvant
Le facteur de capacité k' est

WS
k' = K
VM
WS masse de phase stationnaire
VM volume de phase mobile
K coefficient de distribution
On a par ailleurs
v
v' =
1 + k'
v' vitesse linéaire du soluté

v vitesse linéaire du front du solvant
Les distances parcourues sont proportionnelles à leurs vitesses linéaires d'où :

v' 1 1
RF = = =
v 1 + k' WS
1+K
VM
Si les phases mobiles et stationnaires en colonne et sur couche sont identiques K sera le même dans les
deux cas.
Soit Ktr le coefficient de transposition
WS
colonne
VM
K tr =
WS ' 1
CCM k cc = k tr( - 1)
VM RF
Pour des substances données il est alors possible, en connaissant leur RF sur couche mince de déterminer
leur temps de rétention sur colonne :
TR = to (1 + k'cc)
X. COMPARAISON AVEC LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
20 % environ des substances organiques connues sont justiciables de la CPG sans modification préalable
de l'échantillon. La CPG présence des limitations dans trois cas :
- substances peu volatiles (mM > 300)
- substances sensibles à une élévation même modérée de la température (la plupart des substances d'intérêt
biologique)
- substances ionisées.
La CPL est souvent plus efficace que la CPG pour 3 raisons :

- en CPG il n'existe que des interactions soluté-phase stationnaire alors qu'en CPL il y a des interactions
additionnelles avec la phase mobile.
- les phases stationnaires sont plus variées en CPL (échange d'ions, exclusion).
- la température est moins élevée en CPL qu'en CPG. Or les interactions moléculaires diminuent quand la
température augmente.
La CPL manque par contre de détecteurs aussi universels que les détecteurs à catharomètre ou à ionisation
de flamme. D'autre part l'appareillage est plus complexe donc plus onéreux.
La CPG est une méthode simple, souvent plus rapide et plus sensible que la CPL. De ce fait, les deux
méthodes ne sont pas concurrentes mais complémentaires.
XI - EXERCICES - ANNALES D’EXAMENS
Sujet n° 1.
La séparation d’acides gras est effectuée sur une colonne de 15 cm de longueur et 4,6 cm de diamètre interne dont
la phase stationnaire est constituée de particules sphériques d’octyl- silice de 4 µm de diamètre. La phase mobile a
la composition suivante :
CH3 CN H3 PO4 à1%

O
V/V = 50 22 28
La colonne est régulée à 35°C et le débit est de 1 ml.min-1. Le schéma d’un chromatogramme étalon est donné sur
la figure 1 .
6 8 9
2 3 4 7 10
5
0 3 6 9 12
minutes
figure 1 . Schéma du chromatogramme étalon obtenu par injection de 10 µl d’une solution 0,1 mM d’acides
gras dans la phase mobile
2 : acide linolénique (C18:3,cis) 7: acide palmitique (C16:O)
3: acide palmitoléique (C16:1,cis) 8: acide oléique (C18:1,cis)
4: acide trans-héxadécénoïque (C16:1,trans) 9: acide élaïdique (C18:1,trans)
5: acide linoléique (C18:2,cis) 10: acide stéarique (C18:O)
6: acide trans-linoléique (C18:2,trans)
1 - Quel sont le type et le principe de cette séparation ? Quel est le rôle de l’acide phosphorique dans la
phase mobile ? Pourquoi la séparation est-elle réalisée à 35°C ? Expliquez l’ordre délution des différents acides
gras ? Quel est le système de détection le mieux adapté ?
2 - La porosité interstitielle est égale à 0,5 . Quel est le facteur de capacité de ces composés ?
3 - A quoi correspond le pic n° 1 ?
4 - Comment diminueriez-vous la durée de l’analyse ? ( εo = 0,45 et 0,65 respectivement pour le
tétrahydrofurane et pour l’acétonitrile). Quelles sont les limites à vos propositions ?
5 - Quelle est la surface moléculaire apolaire des acides gras de la série C18 sachant que :
ln k’ = 0,04 Sapolaire - 2 avec Sapolaire en 10-20 m2 .
Interprétez les résultats obtenus .
6 - Dans quelles conditions peut-on écrire :
(t - t )
Rs = N 2 1
2 ( t 2 + t 1)
7 - Quelle est la perte de charge , la viscosité de phase mobile étant égale à 1 cP
On donne
2 3
o dp εo
K = . 2
180
(1 - ε ο )
Corrigé n° 1
1 - Il s’agit d’une chromatographie solide-liquide en mode isochratique dont la phase stationnaire est greffée
apolaire ( C8) .
L’acide phosphorique permet d’atteindre un pH inférieur au pKa des acides gras à séparer ; les groupements
carboxyliques sont alors sous la forme COOH ce qui permet la séparation sur la phase greffée apolaire en fonction
du caractére hydrophobe de ces acides gras .
La séparation est effectuée à 35° C d’une part pour diminuer la viscosité apparente de la phase mobile et donc
diminuer la perte de charge et d’autre part pour favoriser la solubilité de certains des acides gras étudiés et agir sur
leur k’.
Les acides gras saturés ( C:16 et C:18) sont séparés en fonction du nombre de leur CH2 . Plus celui-ci est élevé
et plus leur hydrophobicité est élevée et donc leur k’ aussi . Pour un même nombre nombre de CH2 et une même
conformation ( cis par exemple) , le facteur de capacité est d’autant plus grand que le degré d’insaturation est faible
. Pour un même nombre de CH2 et un même degré d’insaturation , k’ est plus élevé pour la forme trans qui donne
une molécule avec une surface apolaire plus grande que l’isomère cis .
Le système le plus simple est la mesure de l’absorbance à 210 - 215 nm . La mesure de le diffusion de la
lumière est également possible .
2 - Volume de la colonne Vt = L . section = 15 . 3,141. (0,46)2 / 4 = 2,49 cm3

VM = ε . Vt = 0,5 . 2,49 = 1,25 cm3
to = VM / D = 1,25 min
k’ =( tR - to) / to
acide linolénique (4,82 - 1,25) / 1,25 = 2,86 acide palmitoléique (6 - 1,25 ) / 1,25 = 3,8
acide trans-héxa (6,35 - 1,25) / 1,25 = 4,08 acide linoléique ( 6,94 - 1,25) / 1,25 = 4,55
acide trans-linol. ( 8 - 1,25 ) / 1,25 = 5,4 acide palmitique (9,53 - 1,25) / 1,25 = 6,62
acide oléique ( 10,47 - 1,25 ) / 1,25 = 7,38 acide élaïdique ( 11,18 - 1,25 ) / 1,25 = 7,94
acide stéarique ( 11,53 - 1,25 ) / 1,25 = 8,22
3 - Le pic 1 correspond au pic d’injection
4 - Une diminution de la durée d’analyse est possible en diminuant εo (donc k’) ; ceci est réalisable en
augmentant les proportions d’acétonitrile et surtout de tétrahydrofurane dans la phase mobile : risque de perte de
résolution. La durée d’analyse peut être réduite en augmentant v : risque de voir ∆P augmenter
5 - Calcul de la surface moléculaire apolaire ( en 10-20 m2) des acides gras en C18 :
acide stéarique lnk’ = 2,106 Sapol = 102,7
acide élaïdique lnk’ = 2,072 Sapol = 101,8
acide oléique lnk’ = 1,998 Sapol = 100
acide trans-linoléique lnk’ = 1,686 Sapol = 92,2
acide linoléique lnk’ = 1,515 Sapol = 87,9
acide linolénique lnk’ = 1,05 Sapol = 76,3
Les acides cis , cis-cis ou cis-cis-cis ont une structure “repliée” qui leur confère une surface apolaire d’autant
plus petite ( en donc un k’ bas) que le nombre de doubles liaisons est grand . Les isomères trans occupent un
volume plus grand que les isomères cis (voir Strutures des acides gras p2).L’hydrophobicité d’une double liaison est
inférieure à celle de la liaison σ .
6 - La résolution est donnée par :

2 ( t 2 - t 1)
Rs =
( ω 2 + ω 1)
On a :
2
tR
N = 16 ( )
2
ω Si les pics sont gaussiens et si on suppose que le nombre de plateaux théoriques est voisin
pour les divers composés analysés , on a alors :
4
ω = . tR
N ce qui permet d’obtenir la relation proposée .
7 - La perte de charge est égale à :
2 3
o dp εo
η. L . v K = .
∆P = o 180 2
K avec (1 - ε ο )
On a :
D
v=
ε .s soit v = (1/60) / 0,5. . (0,23)2 .
v = 12 cm.min soit 0,2 cm.sec-1.
-1
Ko = (16.10-8 /180) . 0,5 = 4,44. 10-10
∆P = 10-2 . 15 . 0,2 / (4,44 . 10-10) = 3.10-2 / (4,44 . 10-10) = 0,675.10-8 baryes = 67,5 bars
Structures des acides gras analysés :

currentpoint
CH3
COOH acide stéarique
CH3
COOH acide élaïdique
COOH
acide oléique
CH3
CH3
COOH acide trans-linoléique
COOH
acide cis-linoléique
CH3
COOH
acide linolénique
CH3
Sujet n° 2.
La structure chimique d’une phase stationnaire qualifiée de “phényl-urée” et utilisée en chromatographie LS est la
suivante :
currentpoint
H
O CH3 H H
N
Si CH 2 N
C CH3
CH2 CH2
O
O
Le diamètre des particules qui constituent cette phase est de 3 µm. La colonne qui les contient a une longueur et un
diamètre respectivement égaux à 15 cm et 0,4 cm. Cette colonne est utilisée dans un système chromatographique
complet pour analyser des acides aminés et dipeptides de synthèse (MET, GLY et GLY-MET). Un
chromatogramme type obtenu est schématisé ci-dessous :
4
2
1
réponse du détecteur
3 5
injection
0 5 10 temps de rétention (min)
1) Expliquez le résultat obtenu .

2) Proposez , en les justifiant , une éventuelle préparation de l’échantillon et une composition satisfaisante de
phase mobile permettant d’obtenir un tel chromatogramme.
3) Quel est le système de détection le mieux adapté ?
4) Sachant que la porosité interstitielle est égale à 0,5 quel est le débit de la phase mobile ?
Le volume de phase mobile compris entre l’injecteur et la colonne d’une part et la colonne et le détecteur d’autre
part est égal à 5,75 . 10-2 cm3.
5) Quelle est la perte de charge avec une phase mobile de η = 1,24 cP ? On donne :
2 3
K =
o dp
.
ε
180 2
1 -ε
6) Quel est le facteur de capacité des acides aminés et dipeptides analysés ?
7) Quelle est la résolution entre les composés 2 et 3 et entre les composés 4 et 5 ? Discuter.
Corrigé n° 2
1 ) La phase stationnaire est une phase chirale (par la présence d’un C asymétrique) greffée en phase inverse. La
glycine ne possède pas de C asymétrique et est éluée sous forme d’un pic unique n°1. La méthionine se présente
sous forme de deux isomères L-MET et D-MET (ou S et R ; énantiomères) et le dIpeptide GLY-MET sous forme
de deux isomères : GLY-L-MET et GLY-D-MET (pics n° 4 et 5 ou 5 et 4)
2) La présence de deux fonctions (COO- et NH3+) ionisables nuit à la séparation dans un système en phase
inverse.
• 2-1. Il est possible de s’affranchir de l’éventuel effet de ces groupements en formant par exemple des dérivés
hydrophobes par condensation au niveau du NH3 ( réaction avec par exemple l’ OPA ou la fluorescamine ou le PITC
etc.)
Dans ce systèle de dérivatisation précolonne , la phase mobile sera tamponnée ou acidifiée à un pH
inférieur au pKa des composés analysés soit aux environs de 2 par exemple . Le temps de rétention des composés
sera dans ces conditions d’autant plus élevé que leur hydrophobicité sera grande et que le εo de la phase mobile
sera élevé . La proportion de méthanol ou de THF ou d’acétonitrile dans la phase mobile est corrélée au εo .
• 2-2. Il est possible d’envisager le “blocage “ des fonctions COOH par estérification par exemple .
• 2-3 . Il est aussi possible de proposer de tamponner la phase mobile à pH = 5,90 , pH correspondants
sensiblement aux pHi des acides aminés et peptides analysés . Dans ce cas il n’est pas nécessaire de procéder à
une dérivatisation préalable . La composition de la phase mobile est à envisager comme décrit en 2-1 .
3) Si une dérivatisationpré-colonne par des dérivés “fluorescents” comme l’OPA a été réalisée , la détection
fluorimétrique s’impose . En absence de dérivatisation pré-colonne , une mesure de l’absorbance à 210 - 220 nm
est possible . La dérivatisation post-colonne est aussi possible .
4) Le volume de la colonne est égal à ( D2 / 4 ) . 15 = 1,885 cm3.
Le volume mort de la colonne est égal à :
VM = VT . ε soit 0,9425 cm3.
Le volume mort total du système est égal à :
VM = 0,9425 + 0,0575 = 1 cm3.
A partir du chromatogramme on mesure to à 2 min .
Comme VM = to . D , on a : D = 1 / 2 = 0,5 cm3. min-1 .
5) La loi de Darcy donne :
η .L . v
∆P = o
K
Ko = 4,445.10-10
v= D / ε.s soit v = 0,5 / 0,5 . 0,125 v = 8 cm.min-1 soit v = 0,133 cm . sec-1
∆P = 55,6 bars
6) Valeurs de k’ :
k’ = tR - to / to
tR pic n° 1 = 5 min (GLY) soit k’ = 3/2 = 1,5
tR pic n°2 ( L ou D-MET ) = 8 min soit k’ = 6/2 = 3
tR pic n°2 ( D ou L-MET ) = 8 ,3 min soit k’ = 6,3/2 = 3,15
tR pic n°2 ( L ou D-GLY-MET ) = 10 min soit k’ = 8/2 = 4
tR pic n°2 ( Dou L-GLY-MET ) = 10,6 min soit k’ = 8,6/2 = 4,3
7) La résolution est égale à :

t R2 - t R1
Rs = 2 .
ω2 + ω1
Entre 4 et 5 : Rs = 2 ( 0,6 ) / 0,8 = 1,5 : la résolution est complète car > 1
Entre 3 et 2 : Rs = 2 ( 0,3 ) / 0,8 = 0,75 : la résolution n’est pas excellente comme le montre le schéma
Sujet n°3
1°)- En CLS , quelles sont les phases stationnaire et mobile utilisables pour séparer la diméthylamine, la gramine et
l’hordénine. Donner, en fonction du système choisi , l’ordre d’élution de ces trois composés .
2°)- Quel est le type de détecteur le mieux adapté aux systèmes de phases choisis ?
3°)- Si pour analyser ces composés on utilise , en système isochratique , une phase mobile qui contient du
naphtalène sulfonate de sodium 0,03M , quelle phase stationnaire et quel détecteur sont alors nécessaires ? Quel
doit être le pH de la phase mobile ?
Avec ce système VT = 2 mL , la porosité e = 0,5, le débit de la phase mobile = 1 mL.min-1 .
4°) Quel est le facteur de capacité des composés analysés pour lesquels les tR sont respectivement de 3 , 6 et 9
min ? Quelle est la sélectivité de la colonne ?
Corrigé n°3
1) Il s’agit d’amines R - NH2 séparables par :
- échange d’ions à des pH < pKa : élution avec un gradient de pH , échangeurs d’ions de type sulfonate :
élution du composé de pKa le plus faible vers celui du pKa le plus élevé : gramine , hordénine , triméthylamine
- chromato hydrophobe sur C18 ou C 8 : élution en fonction de l’hydrophobicité (méthylamine , hordénine ,
gramine ) avec une phase mobile d’εo adapté à pH voisin ou supérieur au pKa
- chromato par appariement d’ions ( avec un réactif paire d’ions du type sulfonate par exemple naphtalène
sulfonate ) : élution idem qu’avec C18 mais avec une phase mobile contenant le réactif paire d’ions à pH < pKa
2) Sans paire d’ions le détecteur le mieux adapté est le spectrophotomètre à λ = 200 nm , deux des composés
cycliques absorbent aux environs de 260 - 280 nm
Avec la paire d’ions sulfonate naphtalène une détection fluorimétrique est possible ( sensibilité accrue)
Diffusion de la lumière
Détecteur électrochimique
3) Voir réponse en 1 et 2
4) ε = VM / VT d’où VM = 1 ml
VM = to . D d’où to = 1 min
tR - to
k' =
to
k’ méthylamine = 3 - 1 / 1 = 2
k’ hordénine = 6 - 1 / 1 = 5
k’gramine = 9 - 1 / 1 = 8
Sélectivité entre méthylamine et hordénine :

α = k’2 / k’1 = 2,5
Sélectivité entre gramine et hordénine :
α = k’2 / k’1 = 1,6
Sélectivité entre méthylamine et gramine :
α = k’2 / k’1 = 4
Sujet n°4
Des colonnes chromatographiques récentes sont proposées avec 0,1 cm de diamètre interne et 5 cm de longueur .
Ces colonnes sont garnies de particules sphériques de 0,8 µm de diamètre et de porosité interstitielle égale à 0,45 .
Ces particules sont constituées de propyl silice et la phase mobile contenant du 1-hexane sulfonate a une viscosité
égale à 0,5 centipoise .
1) Quels sont les classes ou catégories de composés susceptibles d’être analysés au moyen de ce système ?
2) Quels avantages et inconvénients présente l’utilisation de telles colonnes ?
3) Quel débit de phase mobile doit-on fixer pour que la perte de charge soit égale à 300 bars ?
4) Avec ce P , quel sera le to ?
5) Quel est la facteur de capacité d’un composé élué à 5 min ?
6) Quelle est la nombre de plateaux théoriques ?
On donne :
2 3
dp ε
Ko = .
180 2
(1 - ε)
ηLv
∆P =
ko
β
HEPT = B .d p avec ß = 1,6 et B = 1
Corrigé n°4
1) Appariement d’ions . Phase mobile B- , donc formation de paires d’ions avec les composés chargés + : il s’agit en
sciences des aliments surtout d’amines qui à pH < pKa sont chargées -
2) Avantages : temps d’analyse très court , HEPT très petit , N très grand , volume d’échantillon faible , utilisation
d’un faible volume de phase mobile
Inconvénients : système à débit très faible (nnécessité de pompes de technologie avancée ) , connexions ,
volumes morts , détection très difficile pour une masse très faible de soluté
3) dp = 0,8.10-4 cm , L = 5 cm , η = 0,5 . 10-2 cP
-8
0,64.10 0,091 -11
ko = . = 1,065 10
180 0,303
8 −11
∆P . k o 3.10 . 1,065.10
v= =
η. L −2
0,5.10 .5
v = 0,128 cm/ sec
D = v . s avec s = 0,785 . 10-3 cm2
D = 10-4 ml/sec = 6 µl / min
4) to = L / v = 5 / 0,128 = 39 sec
5) tR = to ( 1 + k’) 300 = 39 ( 1 + k’ ) d’où k’ = 6,7
6) HEPT = 1 ( 0,8 . 10-4)1,6 = 9.10-8 cm d’où N = L / HEPT = 5 / 9.10-8 = 5.107
Sujet n°5
1) Des colonnes chromatographiques de 0,1 cm de diamètre interne et 10 cm de longueur sont actuellement

proposées garnies de particules sphériques de 1 µm de diamètre et de porosité interstitielle égale à 0,5. Ces
particules sont constituées de butyl silice et la phase mobile contenant du 1-hexane sulfonate a une viscosité égale
à 0,5 centipoise .Quels sont les classes ou catégories de composés susceptibles d’être analysés au moyen de ce
système ?
2) Justifier le rôle du pH .
3) Quels avantages et inconvénients présente l’utilisation de telles colonnes ?
4) Quel débit de phase mobile doit-on fixer pour que la perte de charge soit égale à 200 bars ?
5) Avec ce P , quel sera le to ?
6) Quel est la facteur de capacité d’un composé élué à 7 min ?
7) Quelle est la nombre de plateaux théoriques ?
On donne :
2 3
dp ε
Ko = .
180 2
(1 - ε)
β
HEPT = B .d p avec ß = 1,6 et B = 1
Corrigé n°5
1) Appariement d’ions . Phase mobile B- , donc formation de paires d’ions avec les composés chargés + : il s’agit en
sciences des aliments surtout d’amines qui à pH < pKa sont chargées +
2) Se placer dans des conditions dee pH pour lesquelles l’appariement d’ion est possible , par ex à un pH pour
lequel les amines sont chargées + donc à pH < pKa mais à un pH > au pKa du sulfonate ( voisin de 1,5)
3) Avantages : temps d’analyse très court , HEPT très petit , N très grand , volume d’échantillon faible , utilisation
d’un faible volume de phase mobile
Inconvénients : système à débit très faible (nnécessité de pompes de technologie avancée ) , connexions ,
volumes morts , détection très difficile pour une masse très faible de soluté
4) dp = 10-4 cm , L = 10 cm , η = 0,5 . 10-2 cP
-8 0,125
ko = 10 . = 2,78. 10-11
180 0,25
²P . Ko
v=
η . L d’où :
8 2,78 . 10-11
v = 2.10 .
0,5. 10-2 10
v = 0,111 cm / sec
D = v . s avec s = (0,785 . 10-3 ) . 0,5 cm2
D = 4,36.10-4 ml/sec = 26 µl / min
5) to = L / v =10 / 0,111 = 90 sec
6) tR = to ( 1 + k’) 420 = 90 ( 1 + k’ ) d’où k’ = 3,67
7) HEPT = 1 ( 10-4)1,6 = 4.10-7 cm d’où N = L / HEPT = 10 / 4.10-7 = 2,5.107
Sujet n° 6
De très nombreux travaux de recherche ont été réalisés pour prédire le temps de rétention de solutés au cours de
leur analyse par chromatographie liquide . Quels sont les principaux paramètres à prendre en considération dans le
cas d’une chromatographie dont la phase stationnaire est constituée de: 1) silice , 2) n-octadécyl silice .
Une des définitions de l’hydrophobicité des solutés a été proposée par De Waterbeemd :
S 1-octanol
log10 P =
Seau
( Si solubilité du soluté dans le 1-octanol et l’eau) ; les valeurs de log P sont disponibles pour de très nombreux
composés . En chromatographie en phase inverse on a :
log10 P = a log10 K + b équation 1
( K coefficient de distribution) , a et b étant des constantes . Quelles relations peut-on écrire entre log P et k’ d’une
part ( k’ facteur de capacité) et logP et tR d’autre part ?
Deux composés A et B ont des solubilités respectivement égales à 4 et 3,5 moles.l-1 dans le 1-octanol et de 0,4 et
0,5 mole.l-1 dans l’eau . Dans l’équation 1 les valeurs de a et b sont pour les deux composés respectivement de 15
et 2,5 . Avec une colonne de 4 mm de diamètre et de 10 cm de longueur dont la phase stationnaire à une porosité
interstitielle de 0,5 ,un débit de phase mobile de 1 ml.min-1 , quels sont les temps de rétention de A et B et quelle
est la sélectivité de cette colonne .
Dans un système isocratique à phase mobile binaire ( eau : solvant organique ) avec une phase stationnaire du type
octyl-silice, on démontre expérimentalement que :
log k’ = - S Φ + log k’eau , équation dans laquelle k’ est le facteur de capacité , Φ la fraction volumique du
solvant organique , S la variation de pente liée à un changement de 1 % de la concentration du solvant organique
considéré dans la phase mobile.Comment exploiteriez-vous cette équation ?
Corrigé n° 6
Le temps de rétention d’un soluté en CLS est essentiellement fonction de la “colonne” ( L, nature et propriétés et
nature de la phase stationnaire ), de la phase mobile ( vitesse linéaire , nature , température ), de la nature du
soluté.
tR = ( 1 + k’ ) L / v , équation de Snyder log k’ = - a . εo + b
Silice : chromato d’adsorption de solutés
polaires ( k’ augmente avec la polarité du soluté), tR d’autant plus court que εo est élevé .
n-octadécyl silice : chromato en phase inverse : adsorption de composés apolaires (k’ augmente avec
l’hydrophobicité du soluté) , tR d’autant plus court que εo est faible .
log10 K = log10 k’ - log10 ( Vs / VM )
k’ = tR - to / to
Pour répondre remplacer les symboles par leur développement
A partir de l’équation de De Waterbeemd :
S 1-octanol
log10 P =
Seau
pour A log10 P = 4 / 0,4 = 10
pour B log10 P = 3,5 / 0,5 = 7
pour A 10 = 15 . log10 K + 2,5 soit log10 K = 0,5

pour B 7 = 15 . log10 K + 2,5 soit log10 K = 0,3
VT de la colonne πD2 /4 . L = 1,26 cm3 ε = VM / VT = 0,5 donc VM = 0,5 VT = VS
k’ = K .VM / Vs = K
pour A log10 K = 0,5 = log k’ soit k’ = 3,16
pour B log10 K = 0,3 = log k’ soit k’ = 2
α = k’2 / k’1 = 3,16 / 2 = 1,58
VM = to . D d’où to = 0,63 . 1 = 0,63 min
tRA = to ( 1 + k’ ) = 0,63 ( 1 + 3,16 ) = 2,62 min
tRB = to ( 1 + k’ ) = 0,63 ( 1 + 3 ) = 1,89 min
Avec un système isocratique à phase mobile binaire (eau : solvant organique) et avec une phase stationnaire du
type octyl-silice, on peut “choisir” k’ en fonction du pourcentage de solvant organique dans la phase mobile.
log k’ = - S Φ + log k’eau , équation dans laquelle k’ est le facteur de capacité, Φ la fraction volumique du
solvant organique , S la variation de pente liée à un changement de 1 % de la concentration du solvant organique
considéré dans la phase mobile.Comment exploiteriez-vous cette équation ?
Sujet n° 7
1 - De très nombreux travaux de recherche sont réalisés pour prédire le temps de rétention de solutés au cours de
leur analyse par chromatographie liquide. Quels sont les principaux paramètres à prendre en considération dans le
cas d’une chromatographie dont la phase stationnaire est constituée de: 1) silice, 2) n-octadécyl silice, 3)
polystyrène sulfoné, 4) silice-sérum albumine humaine.
2 - Une des définitions de l’hydrophobicité des solutés proposée par De Waterbeemd est :
S 1-octanol
log10 P =
Seau
( Si solubilité du soluté dans le 1-octanol et l’eau); les valeurs de log P sont disponibles pour de très nombreux
composés. En chromatographie en phase inverse on a :
( K coefficient de distribution), a et b étant des constantes. Quelles relations existe-t-il entre log P et k’ d’une part (
k’ facteur de capacité) et logP et tR d’autre part ?
3 - Deux composés A et B ont des solubilités respectivement égales à 4 et 3,5 moles.l-1 dans le 1-octanol et de 0,4
et 0,5 mole.l-1 dans l’eau. Dans l’équation 1 les valeurs de a et b sont pour les deux composés respectivement de
15 et 2,5 . Avec une colonne de 4 mm de diamètre et de 10 cm de longueur dont la phase stationnaire à une
porosité interstitielle de 0,5 ,un débit de phase mobile de 1 ml.min-1 , quels sont les temps de rétention de A et B et
quelle est la sélectivité de cette colonne .
4 - La largeur à la base du pic A est de 10 secondes. Quelle est la HEPT ?
Corrigé n°7
1) Le temps de rétention d’un soluté en CLS est essentiellement fonction de la “colonne” (L, nature et propriétés et
nature de la phase stationnaire ), de la phase mobile (vitesse linéaire, nature, température), de la nature du soluté.
tR = ( 1 + k’ ) L / v , équation de Snyder log k’ = - a . εo + b
Silice : chromato d’adsorption de solutés polaires ( k’ diminue avec la polarité du soluté), tR d’autant plus
court que εo est élevé. Si t° augmente k’ diminue.
n-octadécyl silice : chromato en phase inverse : adsorption de composés apolaires ( k’ augmente avec
l’hydrophobicité du soluté ) , tR d’autant plus court que εo est faible.
Polystyrènesulfoné : échange de cations. Deux paramètres importants : pH et µ .
Silice-SAB : chromato chirale.
2) log10 P = a log10 K + b équation 1

log10 K = log10 k’ - log10 ( Vs / VM )
k’ = tR - to / to
Pour répondre remplacer les symboles par leur développement
tR V
log10 P = a log10 -1 . M +b
t0 VS
3) A partir de l’équation de De Waterbeemd :
S 1-octanol
log10 P =
Seau
pour A log10 P = 4 / 0,4 = 10 et pour B log10 P = 3,5 / 0,5 = 7
pour A 10 = 15 . log10 K + 2,5 soit log10 K = 0,5
pour B 7 = 15 . log10 K + 2,5 soit log10 K = 0,3
VT de la colonne πD2 /4 . L = 1,26 cm3 ε = VM / VT = 0,5 donc VM = 0,5 VT = VS
k’ = K .VS / VM = K
pour A log10 K = 0,5 = log k’ soit k’ = 3,16
pour B log10 K = 0,3 = log k’ soit k’ = 2
α = k’2 / k’1 = 3,16 / 2 = 1,58
VM = to . D d’où to = 0,63 . 1 = 0,63 min

tRA = to ( 1 + k’ ) = 0,63 ( 1 + 3,16 ) = 2,62 min
tRB = to ( 1 + k’ ) = 0,63 ( 1 + 3 ) = 1,89 min
4) N = 16 ( tR / ω )2 et HEPT = L / N
HEPT = 10 = 10 = 25 µm
t 2 2
16 . R 16 . 157
ω 10
Sujet n° 8
Des composés dérivés du benzène sont analysés au moyen d’un chromatographe haute performance équipé d’une
colonne C8 (porosité = 0,5 , dp = 5 µm, 15 cm de longueur et 3,9 mm de diamètre interne); le débit de la phase
mobile composée d’eau et d’isopropanol est de 1 mL.min-1. Ces dérivés sont le nitrobenzène (NB), le 1,3-
dinitrobenzène (DNB), le 1,3,5-trinitrobenzène (TNB), le 3-nitrotoluène (NT), le 2,4-dinitrotoluène (DNT)et le 2,4,6-
trinitrotoluène (TNT). Le chromatogramme obtenu est schématisé sur la figure 1.
TNB
DNB
TNT
NB
réponse du détecteur
DNT
NT
0 10 20
temps (min)
figure 1 : chromatogramme de dérivés de benzène (C8)
Expliquez le mécanisme de rétention et interprétez l’ordre d’élution de ces divers composés. Quel type de détecteur
est bien adapté à ce système ?
Si on représente le ln k’ en fonction du pourcentage d’isopropanol de la phase mobile on obtient pour le NB la droite

schématisée sur la figure 2.
Comment interprétez-vous cette droite ?
Quel est le pourcentage d’isopropanol de la phase mobile utilisée ?
ln k'
0
10 15 20
% isopropanol
figure 2. Variation du ln k’ en fonction du pourcentage d’isopropanol de la phase mobile pour NB
La loi
ln k’ = ln k’eau - SΦ
dans laquelle k’ est le facteur de capacité dans la phase mobile considérée, k’eau est le facteur de capacité avec
l’eau, S un paramètre de force du solvant et Φ la fraction de ce solvant dans la phase mobile binaire, vous permet-
elle de contrôler les temps de rétention des composés analysés.
Avec un pourcentage d’isopropanol de 18 % dans la phase mobile, les variations du ln k’ en fonction de 103 / T (T :
température absolue) sont indiquées sur la figure 3.
ln k'
0
3,28 3,36 3,44
10 3 / T
figure 3. Variations du ln k’ en fonction de 103 / T pour le NB
Discutez ce résultat. A quelle température est réalisée la chromatographie ?

Quelle est la perte de charge en sachant que la viscosité de la phase mobile est de 1 cpoise ?
Corrigé n°8
Les dérivés benzéniques analysés ont la structure suivante :
CH3
(NO2 ) NO 2 (NO2 ) NO2
(NO2 ) (NO 2 )
NB et (DNB et TNB) NT et (DNT et TNT)
Il s’agit d’une chromatographie en phase inverse. Plus le nombre de NO2 est élevé, plus la polarité du composé
augmente et plus son temps de rétention est faible. Par la présence du groupe méthyl, les dérivés du toluène ont
une hydrophobicité plus élevée que les dérivés du benzène; leur temps de rétention, toutes conditions étant égales
par ailleurs, sont donc plus élevés.
Le noyau benzénique absorbe dans l’UV à 254 nm : détection par spectrophotomètre UV.
Si le pourcentage d’isopropanol de la phase mobile augmente, εo et l’apolarité diminuent et donc le temps de
rétention diminue.
tR est lié au facteur de capacité par
tR = t0 ( 1 + k’) . Si k’ diminue, ln k’ diminue et tR également.
VM = t0 . D = ε . VT d’où
ε . VT 0,5 . 15 . 0,39 2 . π
t0 = = = 0,9 min
D 4.1
Pour NB on a :
10 - 0,9
k' = = 10,1
0,9
Par analyse graphique ln 10,1 = 2,32 soit % isopropanol 17,5 %
C’est la loi de Van’t Hoff qui montre que la température affecte l’enthalpie de liaison des analytes sur la phase
stationnaire :
0 0 V
ln k' = - ∆ H + ∆ S + ln Φ avec Φ = S
RT R VM
Pur 18 % d’isopropanol on a ln k’ = 2,3 soit 103/ T = 3,38
La température est de 23 °C.
La perte de charge est :
η . L. v
∆P =
K0
h = 0,01 poise , L = 15 cm, v = D / s et s = s’ . ε
v = 0,28 cm.sec-1
K0 = 0,07. 10-8
∆P = 60 bars
Sujet n° 9
L’analyse des oses présents dans du jus d’orange est réalisée au moyen d’un chromatographe haute performance
équipé d’une colonne de 15 cm de longueur , 0,39 cm de diamètre dont la phase stationnaire a une porosité de 0,5
et un dp de 5 µm. Le débit de la phase mobile composée d’un mélange acétonitrile / eau est de 1 mL.min-1 . La
viscosité de cette phase mobile est de 1 cpoise.
Le chromatogramme obtenu après injection de 100 µL de jus est schématisé sur la figure 5 A.
3 S1 = 300 1 2
S1 = 150 S2 = 300
S2 = 150 A B
S3 = 300
1 2
0 5 10 15 0 5 10
temps (min) temps (min)
Figure 5 . Chromatogrammes de jus d’orange (A) et de jus d’orange traité à l’invertase (B). S est la surface relative
des pics. Les coefficients de réponse des composés 1 , 2 et 3 sont identiques.
Après action de l’invertase sur le jus, le chromatogramme obtenu dans les mêmes conditions analytiques est
représenté sur la figure 5B. Interprétez le résultat.
Quel est le mécanisme de rétention et quelle pourrait être la nature de la phase stationnaire ?
Interprétez l’ordre d’élution des composés 1 , 2 et 3.
Quel est le facteur de capacité du composé 3 ?
Les variations du Ln k’ du composé 3 en fonction du pourcentage d’acétonitrile sont schématisées sur la figure 6.
Comment interprétez-vous cette droite ? Quel est le pourcentage d’acétonitrile de la phase mobile utilisée ?
3 Ln k’
0
0 25 50 75
% acétonitrile dans la phase mobile
Figure 6. Variations du Ln k’ en fonction du % d’acétonitrile dans la phase mobile pour le composé 3
Comment procèderiez-vous pour obtenir un temps de rétention de 10 min pour le composé 3 ?

Quelle est la perte de charge ?
Corrigé n°9
L’invertase hydrolyse le saccharose en glucose et fructose. Le pic 3 qui disparaît correspond donc au saccharose et
les pics 2 et 3 qui augmentent au glucose et au fructose. Le jus d’orange contient donc du glucose et du fructose en
quantités identiques et du saccharose en quantité double comme le montrent les surfaces des pics et leurs
variations (avec un coefficient de réponse identique pour les 3 oses).
La rétention se fait par liaison hydrogène : chromatographie d’adsorption. En effet tR diminue avec la masse
molaire de l’ose et donc avec le nombre d’OH susceptibles de donner une interaction hydrogène avec la phase
stationnaire. Il est donc normal que les hexoses soient élués avec des tR inférieurs au diholoside qu’est la
saccharose. Il pourrait s’agir d’une phase greffée polaire type NH2.
Calcul du k’ pour le composé 3 qui est le saccharose :

VM = t0 . D = ε . VT d’où
ε . VT 0,5 . 15 . 0,39 2 . π
t0 = = = 0,9 min
D 4.1
tR est lié au facteur de capacité par
tR = t0 ( 1 + k’) .
Avec tR = 15 min pour le composé 3,
k’ = 15,7
En chromatographie d’adsorption, k’ diminue avec l’augmentation de εo, c’est à dire avec la polarité de la phase
mobile. Donc si le % d’acétonitrile diminue, le % d’eau augmente et la polarité aussi
Si k’ diminue, ln k’ diminue et tR également.
Si k’ = 15,7 , Ln k’ = 2,75 et le graphe donne un % d’acétonitrile voisin de 75 %.
Un tR de 10 min correspond à un k’ de : 10 = 0,9 ( 1 + k’) soit k’ = 10,1
et Ln k’ = 2,3. Par le graphe de la figure 6 il apparaît alors qu’un pourcantage d’acétonitrile de 55 % dans la phase
mobile permet d’obtenir ce temps de rétention.
La perte de charge est :
η . L. v
∆P =
K0
h = 0,01 poise , L = 15 cm, v = D / s et s = s’ . ε
v = 0,28 cm.sec-1
K0 = 0,07. 10-8
∆P = 60 bars
Sujet n°10
Un broyat de graines de soja préalablement délipidé par pression est traité par de l’hexane au moyen d’un soxhlet.
Le solvant est récupéré et soumis à une évaporation à sec sous vide partiel. Le résidu est repris par un mélange
composé d’acétonitrile, de méthanol et d’acide sulfurique à 0,5 % (50/25/25 , V/V/V). Une partie aliquote est injectée
sur une colonne de 25 cm de longueur et 4,6 cm de diamètre interne dont la phase stationnaire est constituée de
particules sphériques de dodécyl- silice de 5 µm de diamètre. La phase mobile, dont le débit est de 1 ml.min-1, a la
même composition que celle du mélange ternaire déjà décrit.
Les schémas des chromatogrammes étalon et dosage sont donnés sur la figure 1.
dosage
0 3 6 9 12 minutes
6 8 9 10
2 7
étalon 3 4 5
0 3 6 9 12 minutes
figure 1 . Schémas des chromatogrammes de l’extrait et de l’étalon obtenu par injection de 10 µl d’une solution 10
µM d’acidesgras dans la phase mobile
2: acide linolénique (C18:3,cis) 7: acide palmitique (C16:O)
3: acide palmitoléique (C16:1,cis) 8: acide oléique (C18:1,cis)
4: acide trans-héxadécénoïque (C16:1,trans) 9: acide élaïdique (C18:1,trans)
5: acide linoléique (C18:2,cis) 10: acide stéarique (C18:O)
6: acide trans-linoléique (C18:2,trans)
1 - Expliquer la démarche analytique. L’ajout d’un étalon interne serait-il judicieux ; quelle molécule choisiriez-vous,
comment procèderiez-vous et comment en tiendriez-vous compte dans la quantification.
2 - Quel est le principe de cette séparation ? Quel est le rôle de l’acide sulfurique dans la phase mobile ?
3 - Quel est le système de détection le mieux adapté ?
4 - La porosité interstitielle est égale à 0,5. Quel est le facteur de capacité des composés majeurs séparés à partir
de l’extrait ?
5 - Comment peut-on agir sur les temps de rétention ?
6 - Quelle est la perte de charge, la viscosité de phase mobile est égale à 1,2 cP
7 - Quelle est la résolution entre les acides palmitique et oléique ?
8 - Quelle est la sélectivité de la colonne pour ces deux composés ?
Sujet n° 11
Le dosage de l’acide ascorbique et de quelques uns de ses dérivés présents dans une préparation à base d’orange
est réalisé de la façon suivante : 10 g de préparation sont mélangés à 80 ml d’eau préalablement additionnés avec
précision de 2,5 mg d’acide propionique ; le broyat est alors complété à 100 ml. Après centrifugation à 5000 g
pendant 10 min, le surnageant est passé sur une colonne de 5 cm de long et 1 cm de diamètre contenant des
particules sphériques (dp = 10 µm) de silice greffée C18. L’éluat est récupéré et 100 µl sont injectés sur une
colonne de 20 cm de longueur et 4,5 mm de diamètre contenant une phase stationnaire de type octadécyl silice
dont les particules sphériques ont un diamètre moyen de 5 µm. La phase mobile, d’un débit égal à 1 ml.min-1 est
composée d’une solution aqueuse de bromure de tétrabutyl ammonium (0,2 %) et d’un tampon phosphate 10 mM
pH 6,5. L’absorbance de l’éluat est mesurée à 210 nm.
Le chromatogramme étalon obtenu à partir de solutions étalons à 0,025 g.l-1 et celui résultant de l’analyse sont
schématisés sur la figure 1 (avec dans tous les cas une boucle externe de 100 µl).
3
1 2
étalon dosage
4
1200
1000
1000
740
370
350
320
1000
0 5 10 15 0 5 10 15
tR (min) tR (min)
figure 1 : chromatogrammes étalon et dosage. ( 1 : acide ascorbique, 2 : acide déhydroascorbique,
3 : acide dicétogulonique , 4 : acide propionique ). Les surfaces des pics sont indiquées en valeurs relatives.
1) Expliquez le principe de cette séparation chromatographique.

2) Pourquoi passer le surnageant sur la colonne de 5 cm de longueur (C18) avant analyse ?
3) Sachant que la porosité de la colonne analytique de 20 cm de longueur est de 0,5, quelle est la valeur de to.
4) Dans ce système, quels sont le facteur de capacité et la HEPT de l’acide ascorbique.
5) La capacité de pics de la colonne définie par HERMAN est égale à :
n=1+ N . ln tω
16 tα
avec N nombre de plateaux théoriques, tα et tω les temps de rétention du premier et dernier pic du
chromatogramme.
Comment exploiter cette donnée ?
6) Comment diminueriez-vous les temps de rétention pour accélérer l’analyse ?
7) Quelle sont les concentrations en acides ascorbique, déhydroascorbique et dicétogulonique de la préparation à
base d’orange. Quel est le rôle joué par l’acide propionique ?
Corrigé n° 11
1) Séparation des acides organiques après appariement d’ions avec un ammonium “apolaire”. La paire d’ions
formée apolaire est séparée par chromatographie en phase inverse. Le pH est ajusté à une valeur supérieure au
pKa de l’acide et inférieure à celui de l’ion d’appariement.
O
HO O COOH
O OH H
H
HO C O C
H CH2 OH H CH2 OH
OH OH
Acide ascorbique acide dicétogulonique
Le pK1 de l'hydroxyle en C 3 est égal à 4,04 à 25°C
RCOO- ou RO- + N+ ((CH2)3 CH3)4 RO- N+ ((CH2)3 CH3)4

paire d’ions apolaire
2) Le passage du surnageant sur C18 permet de retenir les composés apolaires qui pourraient géner dans la suite
du dosage.
3) Graphiquement to est voisin de 1,5 min
Le volume de la colonne est égal à Vt = L . r2 soit 20 . 3,14 . (0,45 / 2)2 = 3,18 cm3
VM = to.D = ε.Vt
d’où
to = ε.Vt / D = 0,5 . (3,18 / 1 ) = 1,6 min
4) tR = to ( 1 + k’)
Pour l’acide ascorbique tR = 6 min
d’où k’ = 2,75
Graphiquement on a ω = 1 min
N = 16 ( tR / ω )2 soit N = 16 ( 6 / 1 )2 soit N = 576
HEPT = L / N d’où HEPT = 20 / 576 = 0,035 cm
5) n = 96 et les pics sont bien séparés. Cet indice permet d’estimer la capacité d’une colonne en terme de nombre
de pics séparables avec une bonne résolution.
6) La diminution des temps de rétention peut être obtenue par une augmentation du débit ou en diminuant le facteur
de capacité en choisissant un réactif paire d’ions moins apolaire (par exemple un sel d’ammonium de type
tétrapropyl ou tétraméthyl).
7) L’acide propionique est un étalon interne.Sa concentration initiale dans la préparation de fruit est de 2,5 mg / 100
ml. L’étalon analysé directement a une concentration de 0,025 g.l-1 soit de 2,5 mg / 100 ml.
On devrait donc obtenir sur les chromatogrammes étalons et dosage la même surface pour l’acide propionique. Or
pour l’étalon on obtient une surface relative de 740 et pour le dosage de 370. Il faut donc corriger les résultats par
un facteur de 740 / 370 = 2.
Pour l’acide ascorbique : 0,025 . 2 = 0,050 g.l-1 de surnageant soit 5 mg / 100 ml ou 10 g de fruit
Pour l’acide déhydroascorbique : (0,025 . 2). 320 / 1000 = 1,6 mg / 100 ml ou 10 g de fruit
Pour l’acide dicétogulonique : (0,025 . 2). 370 / 1200 = 1,54 mg / 100 ml ou 10 g de fruit
Sujet n° 12
Une colonne chromatographique de 30 cm de longueur et 7,8 mm de diamètre interne contient une phase
stationnaire constituée de sphères de polystyrène réticulée avec du divinylbenzène; leur diamètre est de 5 µm et
leur porosité de 0,5. Elle est utilisée avec une phase mobile composée d’une solution aqueuse d’acide
phosphorique à 0,05 N dont le débit est de 0,5 ml.min-1. La température est de 30°C.
Les analyses de 10 µl d’un mélange d’acides organiques en solution à 0,5 g pour 100 ml, ou d’un extrait de
pommes (20 g de pommes broyés dans 80 ml d’eau et filtrés; on suppose que le volume final est de 100 ml) sont
schématisées sur la figure 1.
Absorbance à 210 nm
2 3
1 4
extrait de
étalon pomme
0 5 10 15 0 5 10 15
tR (min) tR (min)
Figure 1 : chromatogrammes étalon et dosage. ( 1 : acide tartrique, 2 : acide malique, 3 : acide succinique , 4 : acide
fumarique ).
acide tartrique : COOH-CHOH-CHOH-COOH
acide malique : COOH-CH2-CHOH-COOH

acide succinique : COOH-CH2-CH2-COOH
acide fumarique : COOH-CH=CH-COOH
2) Quelle est la valeur de to.
3) Quels sont le facteur de capacité et la HEPT de l’acide malique.
4) Quel serait l’effet d’une augmentation de la température de la colonne ?
6) Quelle est la concentration en acide malique de la pomme ?
7) Quelles autres méthodes de dosage chromatographique sont-elles utilisables pour ce dosage ?
Sujet n° 13
Pour analyser les acides organiques contenus dans du jus de raisin muscat on utilise une colonne
chromatographique de 10 cm de longueur et 1 mm de diamètre interne. Elle contient une phase stationnaire
constituée de sphères de polystyrène réticulée avec du divinylbenzène; leur diamètre est de 1 µm et leur porosité de
0,64. Elle est utilisée avec une phase mobile composée d’une solution aqueuse d’acide phosphorique à 0,06 N dont
le débit est de 25 µL.min-1. La température est de 35°C.
Les analyses de 5 µL d’un mélange d’acides organiques en solution à 0,4 g pour 100 mL, ou d’un jus de raisin filtré
sur membrane 0,2 µm et préalablement additionné de 0,4 g d’acide fumarique pour 100 mL sont schématisées sur
la figure 1 (l’acide fumarique est considéré comme absent du jus de raisin).
Absorbance à 210 nm
S=1500
5
jus de
raisin
800
600
2 4 t (min) 6 2 4 t (min) 6
R R
Figure 1 : chromatogrammes étalon et dosage (1 : acide tartrique; 2 : acide ascorbique; 3 : acide

malique ; 4 acide succinique ; 5 : acide fumarique).
acide tartrique : COOH-CHOH-CHOH-COOH S = 1000 (exprimée en unité arbitraire)
acide ascorbique : CO-COH=COH-CH-CHOH-CH2OH S = 1200
O
acide malique : COOH-CH2-CHOH-COOH S = 1050
acide succinique : COOH-CH2-CH2-COOH S = 1125
acide fumarique : COOH-CH=CH-COOH S = 975
2) Quelle est la valeur de to.
3) Quels sont le facteur de capacité et la HEPT des acides tartrique et ascorbique.
4) Quel serait l’effet d’une augmentation de la température de la colonne ?
6) Quelle est la concentration en acide tartrique du jus ? Quel est le rôle de l’acide fumarique ?
7) Quelles autres méthodes de dosage chromatographique sont-elles utilisables pour ce dosage ?
Corrigé n° 13
1) Séparation des acides organiques par chromatographie en phase inverse. Le pH est ajusté à une valeur
inférieure aux pKa des acides organiques pour éviter leur ionisation et donc une trop forte polarité. Les acides sont
séparés en fonction de leur polarité : pour un même nombre de carbone total (quatre par exemple) plus le nombre
de fonctions OH est élevé et plus le facteur de capacité est faible.
2) Graphiquement to est voisin de 2 min
Le volume de la colonne est égal à Vt = L . r2 soit 10 . 3,14 . (0,1 / 2)2 = 0,0785 cm3
VM = to.D = ε.Vt
d’où
to = ε.Vt / D = 0,64 . (0,0785 / 0,025 ) = 2 min
3) tR = to ( 1 + k’)
Pour l’acide tartrique tR = 3,5 min
d’où k’ = 0,75
Pour l’acide ascorbique tR = 4 min
d’où k’ = 1
Graphiquement on a ω 0,35 min pour les deux acides
Pour l’acide tartrique N = 16 (tR /ω)2 soit N = 16 (3,5 / 0,35)2 soit N = 1600
HEPT = L / N d’où HEPT = 10 / 1600 = 62,5 µm
Pour l’acide ascorbique N = 16 (tR /ω)2 soit N = 16 (4 / 0,35)2 soit N = 2090
HEPT = L / N d’où HEPT = 10 / 2090 = 48 µm
4) Une augmentation de la température augmentera k’ donc le temps de rétention.
5) La diminution des temps de rétention peut être obtenue par une augmentation du débit ou en diminuant le facteur
de capacité (en abaissant le température ou en choisissant une phase mobile moins polaire (acétonitrile ou
méthanol en proportion adaptée avec l’eau acidulée).
6) L’acide fumarique constitue un étalon interne.
La concentration non corrigée par cet étalon interne est de :
0,4 . S dosage 0,4. 1500
concentration = = = 0,6 g. L-1
S étalon 1000
L’acide fumarique est à la même concentration dans l’étalon et l’échantillon dosé. Or la surface du pic dosage
montre qu’une perte est intervenue. La compensation de cette perte donne la concentration réelle du jus de raisin :
0,4 . Sdosage S A fumarique étalon 0,4. 1500 975
concentration corrigée = . = . = 0,73 g.L-1
Sétalon Sac fumarique dosage 1000 800
7) Chromatographie d’échange d’ions, par appariement d’ions ou encore CPG après dérivatisation.

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Professeur Jean-Louis CUQ

TABLE DES MATIERES

II. PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE 4

III. CLASSIFICATION DES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES 5

1. Selon la nature des phases

IV. THEORIE DE BASE - GRANDEURS FONDAMENTALES 6

V. OPTIMISATION DES CONDITIONS D'UNE ANALYSE 14

VI. DIFFERENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE 25

1. Adsorbants de type I - silice ou alumine 28

VII. EQUIPEMENTS UTILISES EN CHROMATOGRAPHIE 62

1. Dispositifs d’obtention de gradients 63

1. Mesure de l’aire par triangulation ou au moyen d’intégrateurs 76

IX. TRANSPOSITION COLONNE - COUCHE MINCE 78

X. COMPARAISON CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE -

XI. EXERCICES ET CORRIGES 80

La chromatographie est une science très ancienne.

Au XVIème siècle, le strasbourgeois BRUNSWIG purifiait de l'éthanol en faisant passer la vapeur à

A partir de cette date, la chromatographie prit son véritable essor

- 1938, KUHN reçut le Prix Nobel.

- 1941, La chromatographie de partage, MARTIN-SYNGE

- 1944, La chromatographie sur papier, CONSDEN-GORDON, MARTIN

- 1952, Prix Nobel à MARTIN et SYNGE

- 1959, Chromatographie sur gel (PORATH, FLODIN)

- 1969, Avènement de la chromatographie liquide moderne (HPLC, FPLC)

II. PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE

La séparation idéale est schématisée sur la Figure 1.

Figure 1. Séparation chromatographique idéale

Figure 2. Séparation chromatographique réelle (non idéale)

On peut classer les méthodes chromatographiques de trois manières:

- selon la nature des phases

- selon la nature des phénomènes mis en jeu dans la séparation

- selon la technologie mise en oeuvre.

III. CLASSIFICATION DES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES

III.1. Classification selon la nature des phases

Selon la nature de la phase mobile on distingue:

Selon la nature de la phase stationnaire on distingue:

III.2. Classification selon la nature des phénomènes mis en jeu

III.2.1. La chromatographie d'adsorption

III.2.1. La chromatographie de partage

III.2.3. La chromatographie d'échange d'ions

III.2.4. La chromatographie d'exclusion encore qualifiée de chromatographie de perméation ou de

III.2.5. La chromatographie d'affinité

III.2. Classification selon la technique mise en jeu

Selon la technologie mise en jeu on distingue:

IV. THEORIE DE BASE - GRANDEURS FONDAMENTALES

Cs : concentration du soluté dans la phase stationnaire

Une bonne séparation en chromatographie liquide implique :

IV.1. GRANDEURS DE RETENTION

IV.1.1. Le temps de rétention (tR)

C'est le temps d'élution au maximum du pic mesuré à partir de l'injection.

figure 3. Principaux paramètres d’un chromatogramme

IV.1.2. Le volume de rétention (VR)

v : vitesse linéaire de la phase mobile s : section réduite de la colonne

Le volume de rétention VR est relié directement au coefficient de distribution K par la relation:

IV.1.3. Le facteur de capacité k' (ou facteur de rétention)

AS et AM surface des sections de la phase stationnaire et de la phase mobile.

k' est le paramètre le plus important en chromatographie liquide.