Dosage des enzymes

plasmatiques
Introduction
Origine des différentes enzymes
présentes dans le sang
 Intérêts de la détermination des
enzymes
• Déceler une maladie avant qu’elle ne soit
cliniquement décelable
• Préciser l’organe lésé
• Pour certains enzymes, leur taux est un bon
marqueur d’évolution
• Diagnostic des déficits enzymatiques d’origine
génétique
 Répartition des enzymes
Enzymes spécifiquement plasmatiques

• Céruleoplasmine
• Lipoprotéine lipase
• Enzymes de la coagulation et de la fibrinolyse
 Répartition des enzymes
Enzymes non spécifiquement plasmatiques
Enzymes d’excrétion (Glandes exocrines)
• Phosphatase acide de la prostate
• Phosphatase alcaline du foie
• Amylases du pancréas
• Lipases du pancréas
 Répartition des enzymes
Enzymes non spécifiquement plasmatiques
Enzymes cellulaires
• Transaminases (ALAT, ASAT)
• Créatine Kinase (CK)
• αHBDH (LDH1)
 Conditions de prélèvement

• Tube sec ou anticoagulant : héparinate de

lithium (jamais fluorure)
• Pas d’hémolyse (activité enzymatique élevée
dans les GR)
• Conservation 4° C pendant 24H sauf CPK
La mesure de l’activité enzymatique se fait:

soit en mesurant la vitesse d’apparition

du produit de la réaction (∆P)

soit en suivant la vitesse de disparition du

substrat (∆S)

pendant ∆t (entre temps t0 et temps t1) .

Cas des enzymes
Activité enzymatique: capacité de l’enzyme à
transformer son substrat spécifique.
Unité du système international : katal
Katal: capacité d’une enzyme à transformer une
mole d’un substrat pendant une seconde
Unité Usuelle:UI/L
UI= capacité d’une enzyme à transformer une
micromole d’un substrat pendant une minute.
Mesurer l’activité enzymatique en UI c’est mesurer
la variation de la DO par minute :
UI/L= ∆DO/min x 1/ ε x 1 / dil x 106
FACTEUR
∆DO/min = variation de la DO par minute

ε = coefficient d’absorption moléculaire de P ou S

dil = facteur de dilution de l’échantillon
106 = facteur de conversion des moles en micromoles
 Conditions de mesure
• Température doit rester constante (une
thermostatisation parfaite du système de mesure
est indispensable) : mesure à 37°C recommandée
• Concentrations en substrats initiaux et auxiliaires,
enzymes auxiliaires, indicateurs chromogène ou
absorbant dans l’UV (NAD ou NADP) en large excès
pour mesurer des valeurs pathologiques x par 10,
20, 30…( 10 x Km)
• pH du milieu réactionnel : tampon à base de
phosphate, acétate , collidine , triéthanolamine TEA
ou trihydroxyméthyl aminométhane TRIS, la
molarité se situe entre 0,1 et 0,25M
 TRANSAMINASES

Définition et intérêt
Les transaminases ou aminotransférases sont des enzymes
intracellulaires qui catalysent le transfert d’un groupement aminé d’un
acide aminé sur un acide cétonique. Cette réaction aboutit à la
formation d’un nouvel acide aminé et d’un nouvel acide cétonique.
Deux enzymes sont couramment dosés en biologie clinique :
• alanine aminotransférase ( ALAT) ou transaminase glutamique
pyruvique (TGP)
alanine + cétoglutarate ALAT glutamate + pyruvate

• aspartate aminotransférase (ASAT) ou transaminase glutamique

oxaloacétique (TGO)
aspartate + cétoglutarate ASAT glutamate + oxaloacétate
 TRANSAMINASES

Définition et intérêt
• L’ ALAT se retrouve surtout dans le tissu hépatique et à un
moindre degré dans le myocarde et les autres tissus tandis
que l’ASAT est essentiellement présent dans le myocarde et
à un moindre degré dans le foie et les autres tissus. Par
nécrose due à des agents variés (microorganismes,
toxiques, médicaments, mécanique) la cytolyse libère ces
enzymes dans le sang circulant.
• Le dosage de l’ASAT est utile dans les pathologies
cardiaques pour mettre en évidence un infarctus du
myocarde ou myocardite (conjointement au dosage de la
CPK) et celui de l’ALAT dans les hépatites.
 TRANSAMINASES

Principe de dosage
Le dosage de l’ASAT et de l’ ALAT se fait par réduction de l’acide
cétonique obtenu :
(pyruvate, oxaloacétate) en présence de déshydrogénases qui utilisent
NADH2 comme cofacteur. La mesure de la vitesse de disparition de
NADH2 à 340nm permet de déterminer l’activité enzymatique.
LDH
• Pyruvate + NADH,H+ lactate + NAD+
MDH
• oxaloacétate + NADH,H+ malate + NAD+

On mesure la diminution de l’absorbance à 340nm

 TRANSAMINASES

Valeurs normales
• ASAT : 10 à 40UI/L
• ALAT : 8 à 38 UI/L

Variations pathologiques :
• ASAT augmenté
- Infarctus du myocarde,
- Certains médicaments ( anticoagulants , salicylés, ARV).
• ALAT augmenté
- Hépatite virale,
- Cirrhose éthylique,
- Certains médicaments (anticoagulants , salicylés, ARV).
 PHOSPHATASES ALCALINES (PAL)

Définition et intérêt
• Les PAL sont des enzymes qui hydrolysent en milieu alcalin
un grand nombre de phosphates organiques en libérant du
phosphate et un alcool, un phénol ou un ose. Elles jouent
un rôle important dans la calcification et la minéralisation
du squelette.
• Les PAL sont localisées essentiellement dans les membranes
plasmiques des cellules. On les retrouve dans le foie, le rein,
les os, les intestins.
• Le dosage des PAL permet l’exploration des affections
osseuses ou hépatiques (en cas de cholestase), la
surveillance de la maladie de Paget et des affections
néoplasiques.
 PHOSPHATASES ALCALINES (PAL)

Principe de dosage
• Le dosage consiste à mesurer la vitesse d’hydrolyse du
paranitrophénylphosphate PNPP (incolore) en
paranitrophénol PNP (jaune) et acide phosphorique en
présence de PAL contenu dans l’échantillon. Le PNP de
coloration jaune est libéré proportionnellement à l’activité
de la PAL. La réaction est la suivante :
PAL
• PNPP + H2O PNP + PO4H3

On mesure l’augmentation de l’absorbance à 405 nm

 PHOSPHATASES ALCALINES (PAL)

Valeurs normales
• VN : 90 – 230 UI/L

Variations pathologiques
• PAL augmenté :
 hépatites (infectieuses ou médicamenteuses ex : ARV),
 maladie de Paget,
 rachitisme,
 hyperparathyroidie,
 ostéomalacie, métastases osseuses,
 ALPHA AMYLASE

• Définition et intérêt
C’ est une enzyme qui hydrolyse l’amidon alimentaire et
fait apparaître des dextrines, du maltose et du glucose.
L’ amylase est essentiellement élaborée par deux
organes : les glandes salivaires et le pancréas.
• Le dosage des alpha amylases permet l’exploration de
pancréatites et de parotidite (affection des glandes
salivaires)
 ALPHA AMYLASE COLORIMETRIE

Principe de dosage
Le dosage repose sur l’hydrolyse d’un substrat
spécifique par l’alpha amylase contenu dans
l’échantillon.
Ex : 2chloro 4 nitrophényl maltotrioside (CNPG3 Incolore)
Alpha amylase
• 5 CNPG3 3CNP + 3 MALTRIOSE + 2CNPG2 + GLUCOSE

2 chloro 4 nitrophényl maltoside (CNPG2 coloré en jaune)

On mesure l’augmentation de l’absorbance à 405 nm

 ALPHA AMYLASE UV
Principe
alpha amylase
• Maltotétraose + H2O 2 Maltoses
Hydrolase
• Maltose + phosphate glucose + Glu1P
Phosphoglucomutase
• Glu1P Glu6P
Glu6PDéshydrogénase
• Glu6P + NAD+ 6PGluconolactone+ NADH,H+

On mesure l’augmentation de l’absorbance de NADH à 340 nm

 ALPHA AMYLASE

Valeurs normales
• VN : 17 – 81 UI /L

Variations pathologiques
• Amylase augmenté :
• pancréatite aiguë ( toxique,
médicamenteuse ARV),
• Cancer du pancréas
• oreillons.
 CREATINE PHOSPHOKINASE (CPK)

Définition et intérêt
La CPK est une enzyme qui catalyse la réaction suivante :
CPK ou CK
• Créatine + ATP Créatine phosphate + ADP

Cette réaction réversible permet la libération ou le

stockage d’énergie au niveau musculaire. La CPK se repartit
essentiellement dans les muscles squelettiques et le
myocarde et un peu dans le cerveau sous forme de 3
enzymes : CPKMM (muscles) CPKMB (myocarde), CPKBB
cerveau).
En pratique courante l’on dose la CPK totale (CPK-NAC : N
AcétylCystéine) et la forme cardiaque (CPKMB) dans
l’explorations des atteintes musculaires et en particulier
l’infarctus du myocarde.
 CREATINE PHOSPHOKINASE (CPK)

Principe de dosage
CPK
Créatine phosphate + ADP Créatine + ATP
HK
D Glucose + ATP G6 Phosphate + ADP
G6PDH
G6 Phosphate + NADP 6 Phosphogluconate + NADPH,H
L’activité enzymatique est déterminée en mesurant la vitesse
d’apparition de NADPH à 340nm.
HK : hexokinase
G6PDH : G6 Phosphatedéshydrogénase
 CREATINE PHOSPHOKINASE (CPKMB)

• Mesure de l’activité CKMB par la méthode HK/G6PDH après

inhibition immunologique de la fraction CKM (ceci correspond
à la mesure de la moitié de l’activité CKMB) mais cette
méthode n’est indiquée qu’en cas d’absence de traumatisme
cérébrale ou de tumeur cérébrale source de CKBB dans le
sang)
• Détermination de CKMB massique : il s’agit d’un dosage
pondéral et non cinétique de CKMB grâce à des anticorps
monoclonaux . Les résultats sont exprimés en μg/l (test
préférable à la mesure de l’activité CKMB) VN < 7 μg/l
• NB : Macro CK ou macroenzyme, il s’agit d’association CK et
immunoglobulines ou lipoprotéines ( Le signe d’appel biologique
est une valeur anormalement élevée de CKMB parfois supérieur à
CKtotale)
 CREATINE PHOSPHOKINASE (CPK)

Valeurs normales
• VN : 27 à 325 UI/L

Variations pathologiques
• CPK augmenté :
• infarctus du myocarde,
• atteintes musculaires ( traumatisme,
toxiques, médicaments ARV).
 LIPASE

•Définition et intérêt
La lipase est une enzyme spécifiquement
pancréatique qui hydrolyse les esters de
glycérol. Le dosage de cette enzymes pose des
problèmes de reproductibilité d’où l’on préfère
l’alpha amylase en cas d’urgence.
 LIPASE

Principe de dosage
• lipase
• Trioléine acides oléiques +glycérol
• AcylCoA synthétase
• Acide oléique + ATP+ CoA Oléyl CoA +
AMP + Pyrophosphate
OléylCoA oxydase
• Oléyl CoA + H2O +O2 Oléyl CoA
déshydrogéné+ H2O2
• péroxydase
• H2O2 + Chromogène incolore H2O +
chromogène coloré
 LIPASE

Valeurs normales
• VN < 200 mUI/L

Variations pathologiques
• Lipase augmentée:
• pancréatite aiguë( toxique, médicaments
ARV)
• certains cancers du pancréas
 γ-Glutamyltransférase (γGT ou GGT)
• Rôle
La γglutamyltransférase ou gamma glutamyl
transpeptidase exerce son activité dans les
réactions de transfert et d’hydrolyse
γGT
γGlutamylpeptide + acide aminé γglutamylacide aminé
+peptide
γGT sert au transport transmembranaire du radical
glutamyl mais aussi d’autres acides aminés
 γ-Glutamyltransférase (γGT ou GGT)
• Principe de dosage
γGT
• Glutamyl -4- nitranilide + glycylglycine glu-glycylglycine
+ 4 nitraniline

• La vitesse de formation de la 4 nitraniline qui correspond à

l’activité de γGT est déterminée en mesurant l’augmentation
d’absorbance à 405 nm
 γ-Glutamyltransférase (γGT ou GGT)
• VN : 5- 80 UI/l à 37°C
• Variations pathologiques

γGT est augmenté dans les affections suivantes:

• Ethylisme chronique (avec Macrocytose VGM↗)

• Cancers du foie
• Cholestase
• Affections hépatiques (hépatites virales)
• Affections pancréatiques (pancréatites aigues et Kc de la tête du
pancréas )
• Intoxications médicamenteuses ( anticoagulants,
antiépileptiques, neuroleptiques et certains contraceptifs oraux)
 Lactate déshydrogénase (LDH)
• Rôle
La LDH est présente dans de nombreux
organes , cœur , foie, muscles , rein. Elle
catalyse la réaction suivante:
LDH
Pyruvate + NADH,H+ ↔ lactate + NAD+
 Lactate déshydrogénase (LDH)
• Principe de dosage
LDH
• Pyruvate + NADH,H+ ↔ lactate + NAD+

La vitesse initiale d’oxydation du NADH est

proportionnelle à l’activité catalytique de la
LDH. Elles est déterminée par la mesure de la
diminution d’absorbance à 340 nm
 Lactate déshydrogénase (LDH)
• VN: 200- 300UI/L
• Variations pathologiques
LDH augmenté dans les affections suivantes:
Affections cardiaques (IDM)
Affections hépatiques ( hépatites virales,
toxiques et Kc)
Anémies
 Lactate déshydrogénase (LDH)
• Isoenzymes des LDH
• Il s’agit d’un tétramère composé de 2 types
chaines A et B formant ainsi 5 isoenzymes :
• LDH1= B4 (20%) CŒUR +++ ( fraction plus rapide
à l’électrophorèse)
• LDH2 =A1B3 (40%)
• LDH3= A2B2 (20%)
• LDH4= A3B1 (10%)
• LDH5= A4 (10%) FOIE, MUSCLES +++
 αhydroxybutyrate déshydrogénase
(LDH1 ou B4 ou αHBDH)
• La LDH1 est augmenté en cas d’infarctus du
myocarde (pic max entre 30e et 72e heure)
• Principe de dosage
αHBDH
• αhydroxybutyrate + NAD+ ↔ αcétobutyrate + NADH,H+
Synthèse clinique
Intérêt des enzymes et autres
marqueurs en cardiologie
 Intérêt des enzymes et autres
marqueurs en cardiologie
Enzymes du bilan cardiaque par ordre
chronologique:
• CK et CKMB,
• TGO et TGP,
• LDH et αHBDH
• Seul CKMB et αHBDH sont spécifiques du tissu
cardiaque
Intérêt des enzymes et autres marqueurs en cardiologie
Autres marqueurs (marqueurs actuels)
 Intérêt des enzymes en hépatologie
Les enzymes de l’exploration biologique du foie
sont:
• TGO-TGP (ASAT-ALAT)
• Phosphatases alcalines ou 5’nucléotidase
• γGT
• LDH
Ces enzymes augmentent differemment selon
qu’il s’agit de cytolyse ou de cholestase
CYTOLYSE HEPATIQUE
CYTOLYSE HEPATIQUE
CHOLESTASE