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Numér o S péc ia l m a i 2 0 0 5
Sommaire
TECHNIQUES UTILISÉES EN AUTO-IMMUNITÉ
Immunofluorescence indirecte. Joëlle GOETZ, Alain CHEVAILLER 1
Les méthodes de double immunodiffusion en milieu gélifié. Pascale CHRÉTIEN 5
Les radio-immunodosages ont-ils encore une place

dans notre pratique quotidienne ? Françoise FORTENFANT, Sylvain DUBUCQUOI 7
Techniques ELISA en auto-immunité. Catherine JOHANET, Éric BALLOT 10
L’immunodot. René-Louis HUMBEL 12
Principe, avantages et inconvénients de la technique d’immunotransfert dans le cadre

de la détection des autoanticorps. Nicole FABIEN, Jean-Claude MONIER 14
Biopuces à autoantigènes pour la caractérisation des autoanticorps

dans les maladies auto-immunes. Chantal ANDRÉ 19
La technologie Luminex® : application à la recherche des autoanticorps.

Nils-Olivier OLSSON 23
Apport de l’analyse sérologique du protéome dans l’identification

des autoantigènes. Éric BALLOT, Catherine JOHANET 28
Liste des membres 32

Immunofluorescence indirecte
Joëlle GOETZ, Laboratoire d’Immunologie, CHU Hautepierre, 67098 Strasbourg Cedex
Alain CHEVAILLER, Laboratoire d’Immunologie et d’Immunopathologie, CHU, Hôpital Larrey, 49033 Angers
L’immunofluorescence indirecte (IFI) représente la technique maîtresse de dépistage des autoanticorps

puisqu’elle permet la détection de la plupart des anticorps (Ac) utiles au diagnostic, pronostic et suivi des
maladies auto-immunes spécifiques et non spécifiques d’organe (Tableau 1).
HISTORIQUE FACTEURS INFLUENÇANT L’IFI

Dès 1936, Albert Hewitt Coons (1912-1978), médecin biologiste, La recherche des autoanticorps s’effectue le plus souvent en
professeur de bactériologie et d’immunologie de l’école de Harvard, première intention par IFI [7]. L’utilisation de différents types de
cherche à colorer les anticorps pour rechercher leur cible [2]. En substrats (coupes congelées d’organes de rat, de cobaye, voire de
1942, grâce à des anticorps marqués à la fluorescéine par ses amis singe, ou cellules humaines en culture, telles que les cellules HEp-2
chimistes, il réussit à mettre en évidence des antigènes pneumo- [carcinome laryngé]) permet la mise en évidence des différents
cocciques dans les lésions de rhumatisme articulaire aigu. Ce tour autoanticorps dont on précisera le titre et l’aspect de fluorescence.
de force marque le début de sa gloire. Il interrompt ses travaux Eu égard à l’hétérogénéité des immunoglobulines au sein des-
pendant la guerre et finalise la technique d’immunofluorescence quelles s’expriment quelques clones auto-immuns, les résultats de
au début des années 50. Cette mise au point va révolutionner le ces tests d’IFI ne peuvent être rendus en unités de masse. On est
monde de la biologie médicale, en particulier celui de la sérologie obligé de définir une valeur seuil au-delà de laquelle la fluorescen-
et de l’auto-immunité. ce observée avec le sérum étudié est significativement différente de
En 1957, naît le dépistage des anticorps antinucléaires par immu- l’aspect donné par un sérum humain normal et considérée comme
nofluorescence [8]. Grâce à une lampe UV récupérée dans un avion positive. Le titre de l’anticorps se définit comme l’inverse de la der-
de la seconde guerre mondiale et un Ac anti-immunoglobulines nière dilution donnant une réaction positive.
humaines marqué par de la fluorescéine dans des conditions dan- L’objectif de l’IFI est de visualiser l’interaction de l’autoanticorps
gereuses (utilisation de phosgène), George Friou, chef du service avec son antigène cible à travers un système de révélation néces-
des maladies infectieuses de l’hôpital de West Haven (Connecticut), sitant une interprétation [12, 14].
montre que le sérum des lupiques se fixe sur le noyau des cellules Le devoir du biologiste est de maîtriser la connaissance de tous les
[4]. La même année, Anderson décrit les Ac anti-surrénales, puis paramètres pour produire, à partir des faits observés, une conclu-
en 1961 Beck décrit les premiers aspects de fluorescence des Ac sion qui ne soit pas erronée. L’absence de réaction positive ne
antinucléaires [1], en 1962 Taylor les Ac anti-cellules pariétales signifie pas l’absence d’autoanticorps, de même que l’existence
gastriques, en 1965 Walker les Ac anti-mitochondries… d’une fluorescence ne signe pas à tout coup leur présence.
Avec la mise sur le marché des microscopes à fluorescence à la fin ◗ Paramètres liés au substrat
des années 60, l’immunofluorescence s’est généralisée dans les
La cible, le substrat, est le premier élément à prendre en compte.
laboratoires et de nombreux autoanticorps ont été découverts :
C’est une tautologie que d’affirmer qu’il doit contenir l’autoanti-
anticorps anti-LKM (Rizzetto, 1973), îlots de Langerhans
gène, dans sa bonne conformation épitopique. C’est l’avantage de
(Bottazzo, 1974), ANCA (Davies, 1982 et Van der Woude, 1985),
l’IFI sur les tests en phase solide (ELISA, immunodot) que d’offrir
cytosol hépatique (Martini, 1989), ASCA (1998 )… [9].
les cibles, qui sont souvent des complexes macromoléculaires
[10], sous leur conformation native dans leur milieu « naturel ».
PRINCIPE DE L’IMMUNOFLUORESCENCE Les anticorps non spécifiques d’organes peuvent être recherchés
sur des tissus de rongeurs, alors que ceux spécifiques d’organes
INDIRECTE demandent des tissus de primates comme substrats.
L’IFI utilise les propriétés de la réaction antigène/anticorps. Un
Il peut arriver que l’autoantigène soit masqué par des molécules
anticorps possède la propriété unique, par son paratope ou site
combinées, nécessitant le traitement préalable de la coupe par un
anticorps, de se combiner spécifiquement à l’épitope ou détermi-
agent dénaturant (urée par exemple), comme c’est le cas pour la
nant antigénique d’un antigène, que celui-ci soit exogène ou
recherche des anticorps anti-membrane basale glomérulaire sur
endogène (autoantigène en ce cas).
rein de singe.
L’IFI s’effectue en deux temps : le complexe antigène-anticorps est
La nature du substrat est un paramètre, sa préparation en est un
révélé par un anticorps marqué spécifique de l'isotype du premier
autre. Qu’importe que l’autoantigène soit présent si la fixation du
anticorps. Lors d’une première incubation, le sérum du patient,
substrat le fait disparaître ! L’exemple typique en est l’antigène
source potentielle des autoanticorps, est mis au contact d’un sub-
Ro/SS-A particulièrement sensible aux mélanges d’alcools utilisés
strat (tissus ou cellules déposés dans les puits d’une lame de
pour fixer les lames de cellules HEp-2 [5].
microscope). Après lavage, pour éliminer les protéines fixées
faiblement de manière non spécifique, une deuxième incubation La bonne pratique est donc, pour les substrats (tissus ou cellules),
est réalisée avec un antisérum spécifique des immunoglobulines de tester les lames à chaque changement de lot en appréciant les
humaines marqué par un fluorochrome. paramètres critiques (richesse et morphologie cellulaire, nombre
de cellules en mitoses pour les cellules HEp-2, distribution et
Les fluorochromes sont des substances qui ont pour propriétés qualité des différents tissus) vis-à-vis de sérums témoins validés
d’émettre une fluorescence dans le visible lorsqu’ils sont excités car de spécificité connue.
par une lumière dans les longueurs d’onde de l’ultra-violet. Trois
sont d’utilisation courante : l’isothiocyanate de fluorescéine ◗ Paramètres liés au sérum
(FITC), la phycoérythrine (PE) et la rhodamine. La lecture se fait La recherche des autoanticorps s’effectue sur du sérum qui peut
à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé en épiillumination. être conservé au maximum 48 heures à + 4 °C, ou congelé à
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IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE
– 20 °C pour des périodes de conservation plus longues. Il est • sensibilité : l’IFI est environ 100 fois plus sensible que l’immu-
classique de diluer le sérum dans du tampon phosphate salin noprécipitation, comme le démontre la mise en évidence, à
(0,01 M pH 7,4, 0,15 M NaCl) additionné éventuellement de l’aide d’antisérums spécifiques de chaînes lourdes et légères
Tween 20 (0,05 %) et d’albumine bovine (2 %) pour diminuer la d’immmunoglobulines, d’autoanticorps monoclonaux, alors
fluorescence non spécifique [3]. La dilution de dépistage varie même qu’il n’existe pas d’anomalie détectable à l’immunoélec-
avec chaque autoanticorps, le bruit de fond étant donné par un trophorèse ou à l’immunofixation [13] ;
sérum humain normal à la même dilution passé obligatoirement • possibilité de détecter plusieurs anticorps en même temps,
dans chaque série. Une étude a ainsi montré que 13,3 % des puisque par définition le substrat est une mosaïque d’antigènes.
sérums de sujets sains possédaient des anticorps antinucléaires au Contrairement aux tests en phase solide où le plus souvent un
titre du 1/80e, classique dilution de dépistage pour ce type seul antigène (ou un petit nombre d’antigènes définis) est
d’autoanticorps [15]. couplé au support, l’IFI offre l’avantage de pouvoir répondre
Concernant le titre et la pratique de dilution de dépistage, il faut au-delà de la question posée par le clinicien. Ainsi, dans le cas
garder à l’esprit la possibilité du phénomène de prozone [14] d’une suspicion de lupus, il est certes important de répondre,
s’expliquant, pour les anticorps de titre très élevé, par l’inaccessi- par IFI sur cellules HEp-2, à la question de savoir s’il existe ou
bilité des épitopes isotypiques pour le conjugué quand il y a trop non des anticorps antinucléaires, mais il peut être également
d'autoanticorps fixés, et entraînant donc une fausse négativité : intéressant de signaler la présence d’anticorps anti-ribosomes ;
ceci est bien connu pour les anticorps anti-mitochondries [11]. • maintien de l’antigène dans sa conformation native et quasi
L’interprétation d'une recherche positive doit tenir compte de assurance de détecter les autoanticorps dirigés contre tous les
l’âge : si la présence d’anticorps antinucléaires, détectés par IFI types d’épitopes, séquentiels et conformationnels.
sur cellules HEp-2, au titre du 1/100e est quasi physiologique chez Les prérequis indispensables à l’IFI ne peuvent être appelés incon-
un adulte âgé, il n’en est pas de même chez l’enfant. L’interpré- vénients qu’en cas de manque de disponibilité pour y satisfaire. Ils
tation des fluctuations de titre doit être prudente (cf. infra). ne sont mis en avant que si le gain de productivité est le seul
moteur du biologiste, comme c’est l’idéologie dominante au USA.
◗ Paramètres liés au conjugué
Ces prérequis sont :
Il n’y a pas de consensus concernant la spécificité du conjugué. Il • l’investissement dans un microscope à fluorescence avec des
peut être polyvalent, reconnaissant les trois isotypes principaux objectifs de qualité ;
(IgG, IgA et IgM : anti-, anti- et anti-) ou restreint à la seule
• le caractère non automatisable pour la totalité de la méthode
classe IgG (anti-) parce que la majorité des autoanticorps
avec le nécessaire contrôle de qualité de chaque étape ;
immuns, et donc pathologiques, sont de cet isotype. Avec ce
deuxième type de conjugué, on risque de passer à côté de la majo- • l’expertise de lecture indispensable à une interprétation perti-
rité des autoanticorps monoclonaux, qui sont le plus souvent de nente des résultats.
nature IgM, et qui ne sont pas exceptionnels [14]. Certains font S’il utilise des réactifs commerciaux, le biologiste doit en
appel à des conjugués anti-IgG totaux à la fois anti- et anti- connaître toutes les caractéristiques pour pouvoir interpréter
chaînes légères qui vont révéler les IgG, mais aussi les IgA et les avec pertinence les résultats. Les industriels doivent donc jouer la
IgM grâce aux anti-chaînes légères. transparence et les mettre à disposition dans les notices tech-
Si l’on n’utilise pas le conjugué de la trousse commerciale, il niques d’accompagnement (nature des antigènes, du conjugué,
importe à chaque lot de définir la dilution optimale d’utilisation. adsorption, fixation, etc.).
Une fois dilué, il faut prendre soin de centrifuger le conjugué pour Compte tenu de tous les paramètres mis en jeu en IFI, pour les
éliminer les agrégats, sources de fluorescence parasite. Pour les anticorps dont le titre peut être en corrélation avec l’activité
coupes d’organes de primates, il est nécessaire d’utiliser un anti- clinique d’une maladie, seule une variation d’au moins trois dilu-
sérum anti-globulines préalablement adsorbé avec des extraits tions entre deux titrages doit être considérée comme significative
d’organes de primates. Aucun consensus n’existe sur l’adjonction si l’on veut comparer les résultats de deux sérums d’un même
d’un contre-colorant comme le bleu d’Evans pour faciliter la lecture. patient prélevés et analysés à deux dates différentes.
◗ Paramètres liés à la lecture au microscope ◗ Contrôle de qualité
La lecture se fait avec un microscope UV équipé en épiillumination De tout ce qui précède, il est évident qu’il ne peut qu’exister des
d’une lampe à vapeur de mercure et permettant un grossissement variations inter-laboratoires compte tenu de tous les paramètres
minimum de 400. La maintenance de cet outil est un facteur clef mis en jeu. Ces variations doivent être soigneusement encadrées
de la qualité de la lecture (réglage du faisceau lumineux, degré par des contrôles de qualité : internes, avec des témoins positifs et
d’usure de la lampe). Néanmoins, la lecture reste observateur- négatifs systématiques dans chaque série, externes comme le
dépendante, certains lecteurs étant plutôt lynx et d’autres plutôt programme de contrôle de qualité national mis en place par
taupes. L’entraînement des techniciens et des biologistes doit faire l’AFSSaPS depuis 1997.
en sorte qu’il n’y ait pas plus d’une dilution de différence entre
deux personnes pour une même lecture. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Lecture à sec ou à immersion, voilà encore un sujet de débat, le
L’interprétation des résultats doit tenir compte non seulement des
plus important étant peut-être l’habitude de lecture et le façonnage
données microscopiques mais aussi du contexte clinique et/ou
de l’œil.
biologique qui a nécessité la prescription d’une recherche d’auto-
◗ Avantages et inconvénients de l’IFI anticorps.
Les avantages de l’IFI sont nombreux :
1. DONNÉES MICROSCOPIQUES
• facilité d’exécution : deux incubations de 30 minutes entrecou-
pées de lavages, ne nécessitant que des dilutions du sérum à La lecture au microscope à fluorescence constitue l’étape ultime
tester. À l’heure actuelle, l’IFI est rendue encore plus facile de la technique d’immunofluorescence indirecte.
grâce aux automates de préparation de lames de fluorescence La caractérisation des anticorps présents dans le sérum des
qui sont capables de réaliser les dilutions des échantillons à patients est basée sur plusieurs paramètres : la nature, la locali-
tester, le dépôt des dilutions effectuées et du conjugué sur les sation et parfois aussi la comparaison des intensités de la fluores-
lames, les incubations et lavages des lames [6] ; cence dans les tissus ou/et cellules utilisées que l’on résume sous
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le terme d’aspect de la fluorescence ou pattern. Elle nécessite une actuelle. Elles sont liées au caractère subjectif de la lecture, aux
parfaite connaissance de la structure histologique et/ou cytolo- variations méthodologiques, à l’absence de consensus sur la
gique du substrat utilisé. nomenclature et sur le seuil de positivité de certains Ac, en parti-
Le plus souvent, d’autres techniques sont nécessaires pour identi- culier pour les antinucléaires, et parfois aussi au manque de
fier les anticorps détectés (Tableau 1). C’est l’aspect de la fluores- connaissances approfondies des différents aspects de fluorescence.
cence sur le substrat qui va orienter les examens complémen- Tous ces facteurs constituent autant de handicaps à la standardi-
taires qui permettront de définir leur cible exacte : Ac anti-PR3 et sation des résultats.
anti-MPO en cas de fluorescence de type c-ANCA ou p-ANCA, Ac Les différences intra-laboratoires peuvent être minimisées par la
anti-ADN natif en cas de fluorescence de type anti-chromatine sur lecture des lames par deux personnes différentes, l’introduction
cellules HEp-2, Ac anti-ENA en cas de fluorescence mouchetée ou de contrôles positifs et négatifs dans chaque série et l’automatisa-
homogène des cellules HEp-2 avec ou sans Ac anti-nucléole, Ac tion de la technique par des préparateurs de lames qui améliore
anti-cytochrome P450 II D6 en cas de présence d’anticorps anti- considérablement la reproductibilité et la répétabilité des tests.
réticulum endoplasmique sur coupes de rein-foie-estomac de rat, …
2. LE CONTEXTE CLINIQUE
Parfois, l’image de la fluorescence est suffisamment évocatrice
pour que l’on puisse déduire la nature de l’antigène reconnu sans La signification clinique des autoAc n’est pas univoque.
autres investigations : Ac anti-centromère, ASCA, Ac anti-îlot de La plupart des maladies auto-immunes, dont le diagnostic repose
Langerhans, … sur un ensemble de signes cliniques et d’anomalies biologiques,
Pour certains Ac, en particulier les Ac antinucléaires et antithy- sont caractérisées par la présence d’autoanticorps. Quand l’inter-
roïdiens, l’interprétation doit aussi tenir compte du titre de la rogatoire et l’examen clinique d’un patient évoquent une maladie
fluorescence, des titres faibles étant fréquemment retrouvés chez auto-immune, certains Ac marqueurs permettent de conforter ou
les sujets âgés sans pathologie auto-immune avérée. de poser le diagnostic (Tableau 1).
Des différences d’interprétation des données microscopiques, par- La présence d’autoanticorps n’est cependant pas synonyme de
fois importantes, entre les laboratoires existent encore à l’heure maladie auto-immune :
Tableau 1 : Principaux autoanticorps ayant un intérêt clinique et détectés par IFI
EXAMEN COMPLÉMENTAIRE : MALADIES

ANTICORPS ANTI- SUBSTRATS IDENTIFICATION AUTO-IMMUNES ASSOCIÉES
DES Ac ANTI-
Ag solubles du noyau (ENA) Connectivites
Nucléaires Cellules HEp-2
ADN natif, nuclésome Lupus systémique
ADN natif Crithidia luciliae Non Lupus systémique
Cytoplasme
Polynucléaires neutrophiles Protéinase 3 (PR3)
des polynucléaires neutrophiles Vascularites primitives
humains fixés à l’éthanol Myéloperoxydase (MPO)
(ANCA)
Pyruvate déshydrogénase,
Mitochondries de type 2 Rein-foie-estomac de rat Cirrhose biliaire primitive
BCOADC, OGDC
Muscles lisses Rein-foie-estomac de rat Actine F Hépatite auto-immune de type 1
Ilots de Langerhans Pancréas de primate Non Diabète insulino-dépendant
Cellules pariétales gastriques Estomac de rongeur Non Gastrite A, Biermer
Saccharomyces cerevisiae (ASCA) Saccharomyces cerevisiae Non Maladie de Crohn
Cytochrome P450 II D6
LKM1 Rein-foie-estomac de rat Hépatite auto-immune de type 2
(CYP2D6)
Pancréas exocrine Pancréas de primate Non Maladie de Crohn
Rein de primate traité Chaîne alpha-3
Membrane basale glomérulaire Syndrome de Goodpasture
par l’urée à pH 3,5 du collagène IV (COLIVA3)
Peau (membrane basale, substance Dermatoses bulleuses
Œsophage de primate Non
intercellulaire épidermique) (pemphigoïdes, pemphigus)
Hu, Yo, Ri, CV2, Syndromes neurologiques
Neurones Cervelet de primate
amphiphysine, Ma paranéoplasiques
MAG
DADS
Myéline Nerf sciatique de primate (IgM) (myelin-associated glycoprotein)
GALOP syndrome
Sulfatides
Thyroglobuline Thyroïdite auto-immune
Thyroïde Thyroïde de primate
Thyréoperoxydase (Basedow, Hashimoto)
Maladie cœliaque,
Endomysium Œsophage de primate (IgA) Non
dermatite herpétiforme
Corticosurrénale Surrénale de primate 21-hydroxylase Maladie d’Addison
Surrénale, ovaire, testicule
Cellules stéroïdes 20,22-desmolase Polyendocrinopaties
de primate, placenta
BCOADC : Branched Chain 2-Oxoacid Dehydrogenase Complex.
DADS : Distal Acquired Demyelinating Symmetrical Neuropathy.
GALOP : Gait disorder, Autoantibody, Late-age Onset, Polyneuropathy.
OGDC : 2-Oxo-Glutarate Dehydrogenase Complex.
• nombre d’Ac peuvent être induits par une infection virale aiguë radiologiques associées, … Ce n’est que de la confrontation clini-
ou chronique (infection à EBV, VHC, Parvovirus B19, …), ils cobiologique que va résulter un diagnostic, voire un pronostic ou
sont généralement présents à titre faible et transitoires ; une décision thérapeutique.
• nombre d’Ac peuvent être induits par des médicaments (bêta- Ainsi, dès que le clinicien suspecte l’existence d’une maladie auto-
bloquants, certains anti-épileptiques, anti-hypertenseurs, …). immune, la recherche des Ac marqueurs par immunofluorescence
Ils peuvent être présents isolément ou associés à des signes est légitime. Dans bon nombre de cas, l’identification précise de
cliniques (lupus induit) et disparaissent après l’arrêt du traite- leur cible (Tableau 1) apporte plus d’informations. Ces résultats
ment ; ne seront interprétables qu’une fois intégrés dans le contexte
• certains Ac comme les Ac anti-neurones ou antinucléaires de clinique et biologique qui aura justifié leur prescription.
type pseudo-PCNA sont associés à des cancers ;
Lorsque le clinicien relève des symptômes pouvant apparaître lors
• l’âge du malade peut déterminer le seuil de significativité d’un
de maladies auto-immunes ou lors d’une affection non auto-
résultat en particulier pour les Ac antinucléaires : leur préva-
immune, la recherche d’autoanticorps par immunofluorescence
lence augmente avec l’âge, en particulier après 60 ans.
est effectuée pour confirmer la réalité d’une maladie auto-immune
L’âge du malade peut aussi orienter le diagnostic : chez l’adulte, ou pour l’éliminer. L’interprétation des données clinicobiologiques
les Ac anti-LKM1 sont essentiellement associés à l’hépatite virale C, peut alors être rendue difficile par certains pièges diagnostiques :
alors que chez l’enfant, en particulier de sexe féminin, ils consti- • les Ac peuvent manquer au début de l’affection et apparaître par
tuent un marqueur de l’hépatite auto-immune de type 2. la suite ;
L’interprétation d’un résultat positif d’autoanticorps doit donc • les Ac ne sont pas constants au cours d’une maladie ;
tenir compte des données cliniques et des examens complémen- • les Ac peuvent ne pas être détectés en cas de déficit immunitaire
taires : âge, sexe, antécédents personnels et familiaux, notion de (exemple des anticorps anti-transglutaminase et anti-endomy-
prise médicamenteuse, symptômes cliniques, anomalies biolo- sium de classe IgA, marqueurs de la maladie cœliaque pouvant
giques (hypergammaglobulinémie, cytopénie périphérique, …), être associée à un déficit sélectif en IgA).
CONCLUSION
L’immunofluorescence indirecte reste à l’heure actuelle la technique de dépistage pour la plupart des autoanticorps. Les images de
fluorescence observées donnent une première information sur l’identité de la cible. D’autres méthodes vont permettre l’identifica-
tion précise de la nature moléculaire de l’antigène contre lequel est dirigé l’anticorps détecté.
La recherche d’autoanticorps doit être confiée à un laboratoire capable de mettre en œuvre l’ensemble des techniques nécessaires
à leur détection et leur identification.
Tout résultat doit être interprété en fonction du contexte clinique, d’où la nécessité d’une collaboration étroite entre le médecin
prescripteur et le biologiste. Les biologistes doivent parfaitement connaître les limites des techniques et des substrats utilisés et les
cliniciens savoir que, dans une maladie donnée, aucun anticorps n’est constant ni spécifique à 100 %.
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Les méthodes de double immunodiffusion
en milieu gélifié
Pascale CHRÉTIEN, Service d’Hématologie et d’Immunologie, CHI, 94000 Créteil
Dans ce groupe de méthodes de précipitation en milieu gélifié, les antigènes et les anticorps (Ac) migrent à
la rencontre les uns des autres à partir de réservoirs séparés par un gel. Leur progression à travers la gélose
s’effectue soit sous l’effet des forces de diffusion spontanées (méthode d’Ouchterlony), soit sous l’influence
d’un champ électrique (électrosynérèse). Ces deux méthodes ont été historiquement développées pour le
dépistage et l’identification des anticorps dirigés contre les antigènes nucléaires solubles grâce à l’utilisation
de sérums étalons.
I/ IMMUNODIFFUSION DOUBLE
Dans le passé, cette technique a été très largement utilisée pour la
recherche des anticorps dirigés contre les antigènes nucléaires
solubles (Ac anti-ENA). Cependant, elle a vu son intérêt diminuer
D’OUCHTERLONY au profit de techniques plus sensibles comme l’ELISA, soit en
microplaque, soit sur bandelettes (immunodot).
Dans cette technique, la diffusion de l’antigène et de l’anticorps se
fait l’un vers l’autre à partir de réservoirs creusés dans une gélose. Elle reste cependant souvent utilisée en première intention pour
Généralement, le puits central contient l’extrait antigénique, les la recherche de ces autoanticorps, recherche complétée par une
sérums à tester étant disposés à la périphérie. méthodologie plus sensible.
Pour un couple antigène-anticorps donné, l’emplacement de l’arc Les antigènes utilisés sont principalement un extrait de thymus
de précipitation dans le gel est uniquement fonction des coeffi- de veau ou de lapin dont la préparation s’effectue au laboratoire.
cients de diffusion des réactants et non pas de la concentration. Cependant, ces derniers ne contenant pas l’antigène SS-A (Ro), les
Cependant plusieurs facteurs influencent la précipitation : Ac correspondant seront recherchés sur un autre substrat comme
• la qualité de la gélose ; un extrait de rate humaine ou de primate. La commercialisation
• le pH et la température ; d’extrait antigénique polyvalent (contenant la plupart des cibles
• la nature de l’antigène ; d’autoanticorps) permet une seule réaction par sérum.
• les concentrations des constituants qui influencent le délai Ainsi, cette méthode a été étendue à la recherche d’Ac dirigés
d’apparition. contre des antigènes nucléaires insolubles (Scl-70), cytoplasmiques
Cette méthode s’applique en auto-immunité à l’analyse qualitative (Jo-1), ou encore très rares (Ku, PCNA).
d’un mélange d’anticorps parfois complexe. L’apparition de plu- De même, elle est utilisée pour rechercher et identifier des Ac
sieurs lignes de précipitation indique la présence d’un nombre au dirigés contre un constituant du cytoplasme comme les Ac anti-
moins égal de couples antigène-anticorps (certaines pouvant se ribosome, anti-LKM1 ou anti-LC1 en utilisant les extraits antigé-
superposer). Elle permet en outre d’identifier les anticorps en niques adéquats. La Figure 2 présente la recherche d’Ac anti-LC1
comparant leurs réactivités vis-à-vis de celles obtenues avec des par immunodiffusion à l’aide d’un extrait de foie de rat.
sérums étalons monospécifiques dits « sérums de référence ».
Ainsi, en comparant les arcs formés par les deux systèmes antigène-
anticorps, il est possible de déduire leur parenté (Figure 1) :
Figure 1 / Schéma des réactions d’identité totale (1),

Figure 2 / Application de l’immunodiffusion double
partielle (2) et de non identité (3) par immunodiffusion
à la recherche et à l’identification d’Ac anti-LC1 à l’aide
double d’Ouchterlony.
d’un extrait de foie de rat.
Le puits du bas reçoit la préparation antigénique,
L’extrait antigénique est déposé dans les puits 3 et 6.
et les puits du haut reçoivent les sérums (sérum à tester
Le sérum de référence est déposé dans le puits central (7),
et sérum de référence).
et les sérums à tester dans les puits 1, 2, 4 et 5.
• si les arcs se croisent sans interférer, les deux systèmes ne sont La fusion des traits de précipitation indique la présence
pas identiques et, par voie de conséquence, les anticorps conte- d’Ac anti-LC-1 dans les sérums déposés en 1, 2 et 4.
Le sérum déposé en 5 donne une réaction de non identité
nus dans le sérum à tester ne sont pas identiques à ceux de
avec le sérum de référence.
l’étalon. Il s’agit d’une réaction de non identité ;
• les lignes de précipitation issues des deux couples fusionnent et Le principal inconvénient de l’immunodiffusion double
se raccordent pour ne former qu’une ligne continue : les anti- d’Ouchterlony reste son manque de sensibilité. Il lui a longtemps
corps sont identiques. C’est une réaction d’identité ; été reproché de ne mettre en évidence que des anticorps précipi-
• les arcs issus des deux systèmes antigène-anticorps se raccor- tants. Cependant, ce problème se pose peu en auto-immunité
dent en donnant une image en éperon : les couples sont partiel- puisque la grande majorité des anticorps incriminés sont soit des
lement apparentés. Il s’agit d’une réaction d’identité partielle. IgG, soit plus rarement des IgM, ces deux isotypes étant en général
Cette dernière est rarement mise à profit en auto-immunité où précipitants. Il faut souligner qu’un certain nombre d’autoanti-
seule la réaction d’identité est recherchée. corps ont été définis par cette réaction de précipitation avec un
LES MÉTHODES DE DOUBLE
IMMUNODIFFUSION EN MILIEU GÉLIFIÉ
extrait antigénique. C’est le cas par exemple des anti-PL-7 ou anti- Ici, la migration n’est plus uniquement gouvernée par les coeffi-
PL-12 associés aux polymyosites : PL désigne precipitin line. cients de diffusion, mais par les mobilités électrophorétiques. Cette
Parfois, la lecture peut être délicate, notamment si deux arcs se migration forcée accélère l’apparition des arcs de précipitation.
superposent. Dans ce cas, il faut soit changer de technique, soit Les conditions opératoires doivent être telles que les charges
diluer le sérum afin de séparer les traits de précipitation. électriques des antigènes et des anticorps doivent être de sens inverse.
Enfin, cette technique ne convient pas aux dépistages urgents. En Le pH sera choisi afin d’être à mi-chemin des points isoélectriques. La
effet, il est nécessaire d’effectuer plusieurs lectures des boîtes de lecture reprend les principes énoncés pour l’immunodiffusion : le
gélose à 24, 48 et 72 heures, la cinétique de formation des com- nombre de systèmes antigène-anticorps est au moins égal à celui du
plexes variant d’un système antigène-anticorps à l’autre. nombre d’arcs de précipitation. Une réaction d’identité vis-à-vis d’un
sérum monospécifique de référence est recherchée.
Malgré ces inconvénients, l’immunodiffusion double reste encore
utilisée du fait de sa facilité de mise en œuvre et de son faible coût, Cette technique reste utilisée dans certains laboratoires pour la
notamment pour les préparations antigéniques faites maison. recherche et l’identification des Ac anti-SS-A (Ro). Elle serait plus
sensible que l’immunodiffusion double d’Ouchterlony, cependant
II/ L’ÉLECTROSYNÉRÈSE elle présente plus de difficultés techniques dans sa réalisation. En

effet, il faut choisir soigneusement le pH réactionnel. En outre, il
faut disposer d’un appareillage adapté avec cuve de migration et
Dans cette technique essentiellement qualitative, antigènes et générateur électrique, si bien qu’en pratique elle reste moins
anticorps sont déposés dans des réservoirs creusés dans une utilisée que la simple immunodiffusion.
plaque de gélose où ils migrent à la rencontre l’un de l’autre sous
l’influence d’un champ électrique.
Les radio-immunodosages ont-ils encore

une place dans notre pratique quotidienne ?
Françoise FORTENFANT, Laboratoire d’Immunologie, CHU PURPAN de Toulouse, fortenfant.f@chu-toulouse.fr
Sylvain DUBUCQUOI, Laboratoire d’Immunologie, CHRU de Lille, s-dubucquoi@chru-lille.fr
La compréhension des mécanismes d’interaction entre une molé- En contrepoint de ces grandes performances analytiques, la radio-
cule cible (par exemple, un antigène) et un récepteur spécifique immunologie (RIA, radioimmunoassay) pose des difficultés
(un anticorps) a très vite trouvé des applications pratiques à partir importantes. La nécessité de locaux répondant à des normes
du moment où l’on pouvait tracer le comportement de l’un des strictes de sécurité constitue son principal inconvénient. En effet,
deux protagonistes présents dans la réaction. Historiquement, la ces locaux doivent être adaptés pour obtenir l’agrément de
méthode de marquage la plus simple consistait à utiliser un l’Institut de radioprotection et de sûreté nucléaire (IRSN), en
isotope radioactif, traceur qui ne modifie en rien le comporte- appui technique de la direction générale de la sûreté nucléaire et
ment de la molécule marquée. Les méthodes radio-immunolo- de la radioprotection (DGSNR). Le personnel doit être formé aux
giques ont été utilisées dès 1959 pour des dosages hormonaux règles de base de protection contre les rayonnements ionisants et
(Yalow et Berson, 1959, pour l’insuline [1, 2]). Leur grande sensi- doit être soumis à une surveillance médicale annuelle. Le matériel
bilité permettant la quantification de substances présentes à de technique doit être réservé à cette activité. Certains tests requiè-
très faibles concentrations, leur utilisation s’est ensuite étendue à rent du matériel spécifique, notamment une centrifugation à
d’autres domaines de la biologie médicale et notamment en haute vitesse (au moins 2 000 g), le comptage s’effectuant après
immunologie pour l’exploration de l’allergie (on parle d’ailleurs précipitation des immuns complexes. Le stockage et l’élimination
encore de RAST, Radio[active] AllergoSorbent Tests) et la quan- des déchets répondent également à des règles précises, liées à la
tification des autoanticorps (autoAc). L’expansion des radio- décroissance isotopique. Leur gestion est particulièrement coû-
immunodosages a suivi une courbe exponentielle jusque dans les teuse. L’infrastructure est donc contraignante et onéreuse, même
années 80, le marquage étant adapté aux dosages par compétition si, avec les trousses commerciales, la radioactivité est générale-
(phase hétérogène) en milieu liquide (Figure 1). D’autres ment faible et le radio-isotope fixé (donc non volatile), ce qui
méthodes utilisent également des traceurs radioactifs (IRMA : présente peu de risques de contamination. La décroissance plus
immunoradiometric assay) mais la réaction ne s’effectue plus à ou moins rapide de l’activité du radioélément et la « radiolyse »
l’équilibre mais dans une situation où un anticorps (Ac, en excès) (dégradation des réactifs, notamment protéiques, par le rayon-
est fixé à une phase solide, et prend l’antigène en « sandwich » nement ionisant) représentent d’autres inconvénients. Il est
avec un autre Ac radiomarqué reconnaissant un épitope différent préférable d’effectuer les dosages dans des délais rapides après la
(méthode immunométrique à 2 sites). Cette méthode nécessite réalisation du marquage.
donc un antigène avec deux épitopes accessibles pour des Ac de À partir des années 1980, l’apparition des traceurs froids (notam-
haute affinité (Figure 2). ment enzymatiques) a révolutionné l’approche méthodologique
L E S R A D I O - I M M U N O D O S A G E S O N T- I L S E N C O R E
U N E P L A C E D A N S N O T R E P R AT I Q U E Q U O T I D I E N N E ?
Figure 1 / Immunodosage par compétition.

Les différentes étapes d’une méthode de dosage en phase hétérogène par compétition.
1) En l’absence d'antigène (Ag) à doser, l’Ag marqué (en excès) est le seul à interagir avec l’anticorps spécifique
(en quantité limitée et précisément définie) (B/B0).
2) Introduction de l’antigène à doser.
3) À l’équilibre (temps d’incubation), l’antigène à doser a déplacé l’antigène marqué de l’anticorps, dans une proportion
d’autant plus importante que sa concentration dans l’échantillon à doser est élevée.
4) Séparation des molécules d’antigènes liées à l’Ac des molécules d’antigènes libres (précipitation).
5) Mesure du signal (125I et 32P : émission gamma ; 3H : émission bêta).
6) Courbe de calibration : le signal mesuré est inversement proportionnel à la quantité de l’analyte à doser.
des immunodosages, et relégué la RIA à quelques cas d’espèces, en molécule en configuration native. Il faut au préalable dissocier les
voie de disparition. Il est vrai que la balance « coût-bénéfice » des complexes insuline – Ac anti-insuline qui peuvent être présents
différentes méthodes penche au détriment des radio-isotopes dans le sérum du patient à la phase initiale de la maladie. Cette
(Tableau I) et des principes méthodologiques qui leur sont géné- étape est suivie de l’élimination de l’insuline endogène afin qu’elle
ralement associés (Tableau II). n’entre pas en compétition avec l’insuline radiomarquée. Dans le
En 2005, quelle place reste-t-il pour la RIA ? Dans la grande majo- diabète, toujours, la recherche d’Ac anti-glutamate décarboxylase
rité des cas, cette approche est devenue le parent pauvre des (GAD) répond aux mêmes exigences méthodologiques, car ces Ac
immunodosages. Plus aucune méthode n’est développée à partir réagissent en phase liquide avec des épitopes conformationnels
de tels traceurs écologiquement indésirables ! Presque tous les tests présents sur la molécule native. Une méthode immunoenzy-
basés sur l’utilisation des traceurs radioactifs ont été convertis en matique originale a toutefois été récemment développée (RSR,
dosages utilisant des traceurs froids, d’utilisation plus aisée et Cardiff, UK) et semble donner une qualité de résultats comparable
plus automatisables. Ne persistent donc en RIA que quelques tests à la radio-immunologie.
très spécialisés à indications restreintes, réservés à certains Un autre cas de figure est rencontré avec le test de Farr, là encore
centres dont le recrutement est suffisant pour justifier leur utili- dans le domaine de l’auto-immunité. Les performances de ce test
sation, comme les dosages d’anticorps anti-récepteurs (acétylcho- ne sont pas tant liées au traceur (125I) qu’à la méthode de sépara-
line, TSH par exemple). La persistance d’un test utilisant un tion des Ac liés à l’ADN natif. En effet, la concentration du sulfate
traceur radio-isotopique peut également se justifier par le fait que d’ammonium, utilisé pour précipiter les complexes immuns, est
les performances des tests utilisant des traceurs froids et sensés telle que seuls les Ac anti- ADN natif de forte avidité (quel que soit
remplacer la première génération de RIA ne sont pas suffisantes leur isotype) sont précipités et mesurés. Une « aura » de plus
pour totalement la supplanter. Jusque très récemment, la radio- grande spécificité lui est associée. Le test de Farr pourrait donc
immunologie était la méthode de choix pour la recherche encore trouver des applications dans le suivi des patients
d’autoAc dans le cadre du diabète insulinodépendant. En effet, les lupiques, permettant notamment d’apprécier l’activité de la mala-
tests en phase liquide sont particulièrement adaptés aux anticorps die lupique ou le risque de poussées [3].
anti-insuline qui reconnaissent des déterminants présents sur la
Figure 2 / Dosage « sandwich ».

Les différentes étapes d’une méthode de dosage immunométrique à 2 sites.
1) L’anticorps (Ac) en excès est fixé à une phase solide, et l’analyte (antigène) à doser est introduit.
2) Interaction entre l’Ac et un épitope de l’antigène (Ag).
3) Le lavage permet d’éliminer les éléments qui n’ont pas interagi avec les Ac fixés.
4) Introduction des Ac marqués par le radio-isotope.
5) Après incubation, lavage pour éliminer l’excès d’Ac marqués, et mesure du signal.
6) Courbe de calibration : le signal mesuré est directement proportionnel à la quantité de l’analyte à doser.
Cette méthode de dosage présente de nombreux avantages par rapport aux dosages compétitifs. Elle présente
notamment une sensibilité accrue par la présence d’Ac en excès. La vitesse de réaction est également accélérée par l’excès
d’Ac (réduction du délai de rendu de résultat). Enfin, la zone de travail est plus grande (plus large gamme de mesure).
La précision au pipetage est moins contraignante, l’étape cruciale étant l’introduction de l’échantillon à doser. La réalisation
du blanc est facile : il suffit de ne pas immobiliser d’Ac sur la phase solide.
Le principal inconvénient est lié à l’existence d’effets « crochets » pour les concentrations élevées.
Tableau 1 / Avantages et inconvénients liés à l’utilisation de traceurs isotopiques
Avantages Inconvénients
Simplicité du marquage (iodination) Toxicité
Pas de modification du comportement de la molécule tracée Environnement
Grande spécificité du signal (peu de bruit de fond) Péremption rapide (radiolyse, décroissance)
Grande sensibilité de la détection Législation
Précision de la mesure Coût
Pas (peu) d’automatisation
Tableau 2 / Avantages et inconvénients de la méthode d’immunodosage par compétition en milieu liquide généralement associée
aux traceurs isotopiques
Avantages Inconvénients
Adaptée aux dosages de petites molécules (hormones) Manque de précision aux 2 extrémités de la courbe de calibration
(faibles et fortes concentrations d’analytes à doser)
Gamme de mesure limitée
Précision requise à chaque étape de manipulation (pipetages,
lavages, …)
Blanc échantillon parfois difficile à réaliser.
Références
[1] HARRIS C. [3] SPRONK PE, LIMBURG PC, KALLENBERG CG.
RIA, death, and the Nobel Prize. Serological markers of disease activity in systemic lupus erythematosus.
N Engl J Med 1982 ; 307 : 1462. Lupus 1995 ; 4 : 86-94.
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Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods.
Nature 1959 ; 184 : 1648-69.
Techniques ELISA en auto-immunité

Catherine JOHANET, Eric BALLOT,
Laboratoire d’Immunologie et d’Hématologie Biologiques, hôpital Saint-Antoine, Paris
Le nombre d’autoanticorps (AAc) identifiés (plus de 200) a considérablement augmenté ces dernières
années. Mais c’est surtout l’identification des cibles moléculaires de ces AAc qui a progressé grâce à l’im-
munocriblage de banques d’ADNc et, très récemment, grâce au développement de l’analyse protéomique.
Aujourd’hui encore, l’immunofluorescence indirecte sur coupe de tissus ou culture cellulaire reste la tech-
nique de choix pour le dépistage de la plupart des AAc. Cependant, l’identification des autoantigènes a
permis le développement de techniques de seconde intention, monospécifiques, nécessitant l’emploi d’an-
tigènes (Ag) hautement purifiés telles que les techniques ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) [3].
Ce sont des techniques relativement récentes, puisqu’elles datent de 1971 [1, 7], et qui ont bénéficié à par-
tir de 1983 des Ag recombinés. La généralisation des techniques ELISA en microplaques s’est accompagnée
de leur automatisation (modules séparés puis chaînes modulables ou automates intégrés). De ce fait, elles
sont actuellement très largement utilisées pour la détection des AAc.
I/ PRINCIPE
Aujourd’hui, la plupart des techniques immunoenzymatiques en
microplaques utilisent le principe du sandwich plutôt que celui de
la compétition, et l’utilisation du terme ELISA a été élargie pour
Il s’agit d’un dosage dans lequel un des réactifs (l’Ag ou l’Ac) est désigner toute technique en microplaque utilisant un conjugué
adsorbé sur un support plastique. La révélation de la réaction Ag-Ac enzymatique. Pour la détection d’AAc, le procédé le plus utilisé est
est possible grâce au marquage du réactif libre par une enzyme. celui de ELISA indirect.
Plusieurs modalités de dosage sont possibles. Dans sa description
initiale [1], la technique ELISA était utilisée pour doser un anti-
gène (IgG humaines) et reposait sur le principe de la compétition : I.1. DÉTECTION D’AAC PAR ELISA INDIRECT
l’Ag apporté par le sérum entrait en compétition avec une quantité Dans ce procédé, les Ac à doser réagissent dans un premier temps
définie du même Ag conjugué à une enzyme pour se fixer sur une avec l’Ag immobilisé. Dans un deuxième temps, la quantité d’Ac
quantité limitée d’anticorps adsorbés sur le support plastique. fixé sur l’Ag en excès est mesurée à l’aide d’un deuxième Ac conju-
P A G E 1 0 - G E A I L ’ I N F O N u m é r o S p é c i a l M A I 2 0 0 5
TECHNIQUES ELISA EN AUTO-IMMUNITÉ
gué à une enzyme. L’activité enzymatique, et donc la coloration conjugué, puis du substrat sont identiques à l’ELISA indirect
du substrat chromogénique spécifique de l’enzyme est le reflet de (Figure 3). Cette technique serait quantifiable grâce à une courbe
la quantité mais aussi de l’affinité des Ac à doser (Figure 1). standard unique constituée d’IgG biotinylées. Elle aurait pour
avantage une meilleure conservation des Ag sous forme native en
évitant les modifications conformationnelles des protéines, suite à
leur adsorption sur un support solide et une plus grande souplesse
d’utilisation due à l’utilisation de la microplaque commune.
Figure 1 / Détection d’Ac par ELISA indirect.
La plupart des AAc peuvent être caractérisés par cette technique

dès lors que l’Ag a été caractérisé et purifié : Ac anti-ADNn, anti-
nucléaires solubles, antithyroïdiens, anti-MPO et anti-PR3, anti-
gliadine, anti-transglutaminase tissulaire…
Figure 3 / ELISA indirect avec capture de l’Ag sous forme

I.2. DE NOMBREUSES VARIANTES DE LA TECHNIQUE liquide par le système avidine-biotine.
EXISTENT
Nous en donnerons deux exemples.
◗ Premier exemple : technique d’immunoextraction-immuno-
saturation.
II/ AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS
La technique de référence utilisée pour la détection des Ac anti- L’ELISA présente de nombreux avantages. C’est une technique
SLA (soluble liver antigen) est une variante complexe de l’ELISA très sensible qui permet la réalisation rapide de grandes séries
[2]. Brièvement, des Ac anti-SLA sont fixés sur une microplaque d’analyses et qui est automatisable. Parallèlement, les automates
puis incubés avec une fraction cellulaire contenant l’Ag SLA sont devenus de plus en plus performants et ont pour avantages :
(cytosol de foie de rat). Les Ac sur la phase solide fixent l’Ag dans une économie de temps de travail, une reproductibilité souvent
cette fraction cellulaire. Après lavages, les Ac du sérum à tester meilleure qu’en technique manuelle, une gestion informatisée
sont épuisés sur l’Ag. Puis, après lavage, on ajoute un large excès des résultats et des contrôles de qualité…
d’Ac anti-SLA marqués dont la fixation dépend alors de la satura- C’est une technique qui permet de quantifier les Ac avec précision,
tion des épitopes de l’Ag par les Ac du sérum à tester. L’intensité les résultats peuvent être exprimés en unités internationales s’il
du signal fourni est donc inversement proportionnelle à la quan- existe un sérum de référence ou en unités arbitraires dans le cas
tité d’Ac contenus dans les sérums à tester (Figure 2). Cette contraire. Enfin, on peut préciser l’appartenance des Ac aux diffé-
variante permet l’utilisation d’un Ag qui n’est pas hautement rentes classes d’immunoglobulines (en utilisant des conjugués
purifié. monospécifiques).
Cependant, l’ELISA est influencée par de nombreux facteurs,
principalement la nature et la qualité de l’antigène ainsi que l’effi-
cacité de son adsorption sur le support solide. Elle est exposée à
de nombreuses causes d’erreur, en particulier des réactions faus-
sement positives.
III/ PROBLÈMES LIÉS À L’ELISA

III.1. NATURE ET QUALITÉ DE L’AG
De nombreux Ag peuvent être utilisés, Ag natif ou dénaturé, d’ori-
gine humaine ou animale. L’utilisation de peptides synthétiques
ou de protéines recombinantes peut entraîner une perte de sensi-
Figure 2 / Technique d’immunoextraction-immunosaturation. bilité du test par rapport à la protéine native. L’ELISA repose sur
la reconnaissance d’épitopes conformationnels ; or, une protéine
◗ Deuxième exemple : ELISA indirect avec capture de l’Ag recombinante peut ne pas subir de modifications post-traduction-
sous forme liquide par le système avidine-biotine nelles intervenant dans sa structure tridimensionnelle. A fortiori,
Une méthode récente (BIOONE®, Zentech), se distingue de pour un peptide synthétique. Par ailleurs, l’utilisation de peptides
l’ELISA indirect classique par l’utilisation d’Ag biotinylés sous synthétiques ou recombinants tronqués ne peut mettre en
forme liquide et d’une microplaque commune recouverte de step- évidence que les seuls Ac dirigés contre l’épitope porté par ces
tavidine. Pendant la première étape, les Ag biotinylés réagissent peptides, et néglige les autres Ac de la réaction polyclonale.
avec les Ac du sérum et le complexe Ag-Ac se fixe à la steptavidi- Il est donc fondamental de connaître de façon exacte la nature de
ne adsorbée à la microplaque. Les étapes suivantes, fixation du l’Ag fixé sur la plaque.
G E A I L ’ I N F O N u m é r o S p é c i a l M A I 2 0 0 5 - P A G E 1 1
TECHNIQUES ELISA EN AUTO-IMMUNITÉ
III.2. IMMOBILISATION DES AG support. Certains constituants, agrégats d’IgG, Ig monoclonales,

Le choix du support à utiliser pour l’immobilisation des Ag est facteurs rhumatoïdes, peuvent conduire à des résultats fausse-
très important car il conditionne non seulement la quantité de ment positifs.
protéines pouvant être adsorbées mais aussi la bonne orientation
de la molécule et sa stabilité. Par exemple, pour détecter les Ac
III.4. PROBLÈMES DE STANDARDISATION
anti-2-GPI, on utilise des plaques de polystyrène préalablement
irradié ou des plaques de chlorure de polyvinyle [6]. La grande variété des Ag pouvant être fixés sur les plaques ainsi
que l’extrême diversité des Ac (affinité, avidité, diversité des épi-
topes reconnus…) et l’absence dans la plupart des cas de sérum
III.3. PROBLÈMES DE FIXATIONS NON SPÉCIFIQUES étalon montrent bien la difficulté de standardisation de ces tech-
RESPONSABLES DE FAUX POSITIFS niques. De nombreuses publications comparant les performances
de différentes trousses commerciales ont montré de grandes
La fixation non spécifique de protéines plasmatiques sur le sup-
divergences de résultats [4, 5, 8].
port peut être due à une mauvaise saturation des sites libres du
CONCLUSION
Ces techniques sensibles et automatisables se sont fortement développées. Elles restent néanmoins des techniques délicates.
Le problème majeur est leur standardisation qui reste difficile en auto-immunité.
Références
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J Clin Lab Anal 1994 ; 8 : 284-92. J Rheumatol 2000 ; 27 : 391-6.
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L’immunodot
René-Louis HUMBEL, Laboratoire Luxembourgeois d’Immunopathologie, L-4149 Esch-sur-Alzette, Luxembourg
La technique de l’immunodot pour la recherche des anticorps a avec le sérum. Les anticorps capturés sont localisés par immuno-
été introduite en 1982 par Paul Herbrinck et col. sous l’appella- détection, à l’aide d’un antisérum marqué par une enzyme, et
tion de « Antigen Spot Test » ou AST [1]. Les auteurs se sont ins- révélés par le substrat correspondant. La lecture des résultats par
pirés de la technique du Western blot, ou immunotransfert ou simple appréciation visuelle de la coloration fournit des résultats
immunoempreinte, développée quelques années auparavant par qualitatifs, à la limite semi-quantitatifs si l’on tient compte de
Towbin [2]. Mais, contrairement à cette dernière, les protéines ne l’intensité de la coloration. Il existe également la possibilité d’ana-
sont pas transférées d’un gel d’acrylamide sur une membrane de lyser les bandelettes à l’aide d’un scanner qui mesure l’intensité
nitrocellulose, mais sont directement appliquées sur des bande- de coloration des spots ou des bandes, permettant une évaluation
lettes sous forme de spots pour former des « dots ». Le terme de quantitative.
dot-blot quelquefois employé est donc tout à fait impropre La plupart des immunodots comportent un spot appelé « cut-off »
puisque le procédé ne comporte aucune opération de transfert, (valeur seuil). L’intensité de coloration de ce spot est comparée à
c’est-à-dire de « blotting ». celle des autres spots et permet d’interpréter les résultats comme
Le dépôt des antigènes peut se faire sous forme d’une petite tache positifs ou négatifs. La coloration des spots varie en effet en fonc-
ronde (dot-spot) ou en ligne fine (dot-line). La matrice doit avoir tion de la température et de la durée des incubations, d’où l’im-
une bonne affinité pour les antigènes et une bonne capacité d’ad- portance de ce « cut-off », dont la coloration varie parallèlement
sorption. La nitrocellulose, hydrophobe, a été utilisée en premier à celle des spots réactionnels obtenus avec les sérums.
et l’est encore fréquemment pour l’adsorption des protéines. L’immunodot, tout comme les autres méthodes immunologiques
D’autres supports ont été développés à partir de dérivés de la voisines, est grandement dépendant de la nature et de la qualité
cellulose ou du nylon, pour augmenter la capacité d’adsorption de l’antigène immobilisé sur la membrane. On fait appel à des
et pour diminuer le bruit de fond lors de la coloration. Le PVDF antigènes natifs, extraits de tissus par des méthodes physico-
(polyvinylidène difluorure) est une membrane hydrophile ayant chimiques ou par immunoaffinité, à des protéines recombinées
une bonne résistance aux solvants organiques. Ce support est ou encore des antigènes synthétiques. Le premier dot pour la
utilisé pour l’immobilisation d’antigènes de nature non protidique, détection d’autoanticorps a été présenté en 1990 par la firme
comme les gangliosides, qui sont déposés en solution alcoolique. LipoGen (USA), le RheumaStrip ANA, utilisant des protéines
La capacité d’adsorption sur membrane est nettement supérieure recombinées RNP, Sm, SS-A et SS-B, ainsi que de l’ADN de thymus
à celle des plaques ELISA. La fixation est rapide, voire instantanée, de veau. Depuis, de nombreux immunodots ont été commerciali-
ce qui réduit le risque de dénaturation des antigènes. Une des pré- sés pour la recherche des anticorps antinucléaires et des autoan-
occupations essentielles est d’adsorber l’antigène en le concen- ticorps spécifiques d’organes (Tableaux 1 et 2), et ils sont de plus
trant au centre du dépôt sans diffusion latérale. Ceci peut être en plus utilisés dans les laboratoires. Ils prennent tout leur inté-
obtenu en utilisant des tampons de forces ioniques adaptées. rêt pour les analyses au coup par coup : soit pour confirmer un
Plusieurs antigènes différents peuvent être déposés sur la même aspect de fluorescence (exemple : anticorps anti-mitochondries),
membrane permettant la détection simultanée de nombreux anti- soit pour répondre à une demande urgente (exemple : anticorps
corps différents. Une fois séchée, la membrane est saturée par des anti-membrane basale glomérulaire), soit, plus généralement,
agents bloquants et stabilisants puis conservée à l’abri de l’humi- pour répondre à des demandes de recherches d’autoanticorps trop
dité. Ces antigènes alors situés à la surface de la membrane peu- peu nombreuses pour justifier l’utilisation de techniques comme
vent se complexer avec leurs anticorps spécifiques par incubation l’ELISA qui sont mieux adaptées aux analyses en série.
Références
[1] HERBRINK P, VAN BUSSEL FJ, WARNAAR SO. [2] TOWBIN H, STÆHELIN T, GORDON J. USA.
REFERENCES
The antigen spot test (AST) : a highly sensitive assay for the detection Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels
of antibodies. to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.
J Immunol Methods 1982 ; 48 : 293-8. Proc Natl Acad Sci USA 1979 ; 76 : 4350-4.
L’ I M M U N O D O T
Fabricants
Tableau 1 /
INNOGENETICS
Principaux immunodots actuellement disponibles en France
EUROIMMUN
ORGENTEC
MIKROGEN
et en Belgique.
ZENTECH
MILENIA
IMTEC
RAVO
D-tek
BMD
Ac ANTICYTOPLASMIQUES
Anti-Jo-1 P P P R R R P
Anti-PL-7 R
Anti-PL-12 R
Anti-ribosomes (P0) P P P S R P
Anti-SRP R
Ac ANTINUCLÉAIRES
Anti-ADN P P P R
Anti-centromère (CENP-B) R R R R R R
Anti-centromère (CENP-A et CENP-B) R
Anti-histones P P P P P
Anti-Ku R
Anti-Mi-2 R
Anti-nucléosomes P P P P
Anti-PCNA R R R
Anti-PM-Scl R R R
Anti-RNP P R R
Anti-RNP/Sm P P P
Anti-Scl-70 P P P R R R P
Anti-Sm P P P R R, S R P
Anti-Sp100 R
Anti-SS-A P R P R P, R R R
Anti-SS-B P P P R R R P
Anti-TRIM21 (« SS-A 52 kDa ») R R R R
Ac ANTI-POLYNUCLÉAIRES NEUTROPHILES
ANCA-myéloperoxydase (MPO) P P P P
ANCA-protéinase 3 (PR3) P P P P
Ac ANTI-ESTOMAC
Anti-cellules pariétales P P
Anti-facteur intrinsèque P P R
Ac / FOIE
Anti-F-actine P
Anti-LC1 (FTCD) R R
Anti-LKM1 (P450-2D6) R R R R
Anti-mitochondries (PDH) P P P P
Anti-mitochondries (PDH + OGDC + BCOADC) P
Anti-SLA/LP P R R
Ac / INTESTIN
Ac anti-gliadine (IgA) P P
Ac anti-gliadine (IgG) P
Ac anti-gliadine (IgA ou IgG) P
Ac anti-lactoglobuline P
Ac anti-Saccharomyces cerevisiae (IgA ou IgG) P
Ac anti-soja P
Ac anti-transglutaminase tissulaire (IgA) R R R
Ac anti-transglutaminase tissulaire (IgG) R
Ac anti-transglutaminase tissulaire (IgA ou IgG) R
Ac ANTI-REIN
Ac anti-membrane basale glomérulaire P R R
Ac ANTI-SYSTÈME NERVEUX
Ac anti-gangliosides P P
Anti-glutamate décarboxylase I (GAD 67) R
Anti-glutamate décarboxylase II (GAD 65) R R
Anti-neurones : anti-amphiphysine R R
Anti-neurones : anti-CV2 (CRMP5) R
Anti-neurones : anti-HuD R R
Anti-neurones : anti-Ma2 (Ta) R
Anti-neurones : anti-Ri (Nova-1) R R
Anti-neurones : anti-Yo (CDR62) R R
FACTEURS RHUMATOÏDES
Anti-IgG animales P
Anti-IgG humaines P
R = Antigène recombinant ; P = Antigène purifié ; S = Antigène synthétique.
L’ I M M U N O D O T
Tableau 2 / Fabricants et distributeurs de dots en France et en Belgique.
FABRICANTS DISTRIBUTEURS
BMD, Marne-la-Vallée, France BMD, Bruges, Belgique
D-tek, Mons, Belgique Alpha-Dia, Wavre, Belgique
DiaSorin, Antony, France
Ingen, Rungis, France
Diamed, Reims, France
EUROIMMUN, Lübeck, Allemagne BioAdvance, Emerainville, France
Biognost, Heule, Belgique
IMTEC, Berlin, Allemagne ORGENICS France, Courbevoie, France
INNOGENETICS, Gand, Belgique InGen, Rungis, France
MIKROGEN, Martinsried, Allemagne ALL.DIAG, Strasbourg, France
ORGENTEC DIAGNOSTIKA, Mainz, Allemagne Orgentec, Plaisir, France
MILENIA BIOTEC, Bad Nauheim, Allemagne DPC, La Garenne-Colombes, France
DPC, Humbeek, Belgique
Ingen, Rungis, France
RAVO, Freiburg, Allemagne
ZENTECH, Liège, Belgique Alpha-Dia, Wavre, Belgique
InGen, Rungis, France
Principe, avantages et inconvénients

de la technique d’immunotransfert dans
le cadre de la détection des autoanticorps
Nicole FABIEN, Jean-Claude MONIER, Centre Hospitalier Lyon-Sud, Unité Fonctionnelle « Auto-immunité »,
laboratoire d’Immunologie, 69495 Pierre-Bénite Cedex
I/ PRINCIPE
Le gel de polyacrylamide s’obtient par polymérisation de mono-
mères d’acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) et de son comonomère
N, N’ méthylène bisacrylamide (CH2=CH- CO-NH-CH2-NH-CO-
La technique d’immunotransfert nommée Western blot ou immu- CH=CH2). Cette polymérisation est initiée chimiquement par le
noblotting (Figure 1) comprend trois étapes : persulfate d’ammonium combiné au N-N-N’-N’-tétra-méthylène-
diamine (TEMED).
1) L’électrophorèse des antigènes en gel.
Une migration sur système multiphasique est utilisée avec l’effet
2) Le transfert des antigènes du gel sur un support de nitrocel-
combiné discontinu de tampons de force ionique et de nature
lulose.
d’ions différents qui vont permettre d’obtenir deux gels superpo-
3) La réaction immunologique : antigène-anticorps. sés, l’un de faible concentration en polyacrylamide où commen-
cent à migrer les protéines et où elles se concentrent, et l’autre de
1. ÉLECTROPHORÈSE DES ANTIGÈNES EN GEL forte concentration où elles vont se séparer. L’objectif de l’asso-
L’électrophorèse permet de séparer un mélange protéique par la ciation de ces deux gels est d’éviter les problèmes liés aux faibles
migration de ses constituants sous l’effet d’un champ électrique. quantités de protéines et aux volumes parfois non négligeables
Effectuée sur un support en gel de polyacrylamide et en présence déposés dans les puits. Le taux de réticulation, qui correspond à la
de dodécyl sulfate de sodium, elle sépare les protéines en fonction porosité du gel, dépend du poids d’acrylamide et de bisacrylamide
de leur poids moléculaire [1]. Le terme utilisé fréquemment pour contenu dans 100 ml. La concentration du premier gel est de 4 %,
désigner cette technique est le SDS-PAGE : SDS-PolyAcrylamide et celle du gel de séparation entre 5 et 20 % suivant la taille des
Gel Electrophoresis. protéines que l’on veut séparer.
P R I N C I P E , AVA N TA G E S E T I N C O N V É N I E N T S D E L A T E C H N I Q U E D ’ I M M U N O -
TRANSFERT DANS LE CADRE DE LA DÉTECTION DES AUTOANTICORPS
Poids moléculaire (kDa) Pourcentage d’acrylamide Les protéines ou antigènes utilisés correspondent à des extraits
bruts ou semi-purifiés d’organes, de cellules ou d’organites cellu-
10 - 40 15 - 20 laires ou à des antigènes recombinants.
40 - 100 10 - 15
100 - 300 5 - 10
2. LE TRANSFERT DES ANTIGÈNES DU GEL
300 - 500 5
SUR DE LA NITROCELLULOSE
> 500 2-5
Les différentes protéines contenues dans le gel seront adsorbées
sur un support immobilisant qui doit avoir une bonne affinité
Le but de l’électrophorèse est d’obtenir une séparation des pro-
pour la protéine et une forte capacité d’adsorption. Il s’agit le plus
téines selon leur poids moléculaire (PM). L’encombrement sté-
souvent d’une membrane de nitrocellulose, mais d’autres supports
rique à l’origine de l’effet filtrant est fonction du PM et de la forme
sont parfois utilisés, comme le nylon ou le fluorure de polyvinyli-
de la molécule. Par l’intermédiaire d’un détergent anionique, le
dène (PVDF). L’empreinte se dit blot en anglais d’où le nom de
dodécyl sulfate de sodium (SDS), les effets de la charge et de la
Western blot, par référence à la technique initiale du Southern
forme de la protéine sont supprimés. En effet, par sa très forte
blot pour l’ADN (technique inventée par E. Southern). La tech-
affinité pour les protéines auxquelles il se lie par liaisons hydro-
nique du transfert électrophorétique des protéines a été introduite
phobes, le SDS va conférer une charge électrique constante, large-
pour la première fois par Towbin [2]. Les protéines séparées par
ment supérieure à la charge intrinsèque de la protéine. C’est ainsi
électrophorèse sont transférées par l’intermédiaire d’un courant
que chaque protéine acquiert une densité de charge identique, ce
électrique sur une membrane par un système semi-sec ou sec. Les
qui permet de les séparer en fonction de leurs tailles (donc de la
protéines se fixent par liaisons hydrophobes et électrostatiques
masse molaire) et non pas en fonction de leurs charges. De plus,
sur la membrane de nitrocellulose où elles peuvent être facile-
par son effet détergent, le SDS déroule les protéines et les met sous
forme de bâtonnets, inhibant l’effet de leur configuration spatiale. ment reconnues par des anticorps.
La dénaturation par le SDS est complétée par le chauffage à 100 °C Le principe du transfert est le même que l’électrophorèse de zone
de la solution où se trouve l’échantillon. Outre le SDS, cette solu- monophasique. Les protéines, après séparation, sont toujours
tion comporte du 2-mercaptoéthanol (ME) et du glycérol. Grâce à entourées de SDS et donc, sous l’influence d’un champ électrique,
son pouvoir réducteur, le ME dissocie les ponts disulfures. Le les protéines vont migrer de l’anode vers la cathode. Le méthanol
glycérol confère à la solution d’échantillon une forte densité lui (contenu dans la solution de transfert) « active » le gel en enlevant
permettant de ne pas se diluer dans le tampon lors du dépôt. De la le SDS des protéines et en augmentant la liaison des protéines à
pyronine est rajoutée dans le tampon de l’échantillon comme mar- la membrane, mais il peut diminuer le transfert de certaines
queur de la migration : elle n’est pas retenue par le gel et indique protéines. Il y a deux facteurs critiques durant le transfert : d’une
donc le front de migration électrophorétique. Quand le colorant part, l’efficacité d’élution des protéines hors du gel, qui est déter-
atteint le bas du gel, l’électrophorèse est arrêtée. minée par la concentration en acrylamide du gel, la force ionique,
Les protéines présentent une migration électrophorétique inver- le pH du tampon et la composition du tampon de transfert,
sement proportionnelle au logarithme de leur masse moléculaire. d’autre part, la capacité de la matrice à lier les protéines, qui est
Les petites protéines vont vite car elles passent facilement dans les principalement déterminée par la nature de la membrane mais
pores du gel, alors que les grosses protéines sont retardées par aussi par la composition du tampon de transfert. Le méthanol
friction avec le polymère. Le logarithme du PM est proportionnel favorise l’adsorption sur la membrane chargée négativement. Il
à la mobilité relative, c’est-à-dire au rapport entre la distance de permet aussi d’augmenter la capacité de liaison de la matrice par
la migration de la protéine et celle du marqueur du front de exposition des domaines hydrophobes des protéines, mais il réduit
migration, la pyronine. Le « Rf » représente ainsi le rapport de la l’efficacité de l’élution en diminuant la taille des pores.
distance parcourue par la protéine sur la distance parcourue par Après le transfert, il est possible de colorer la membrane avec un
le front de migration. À l’aide de protéines « standards », une colorant spécifique des protéines, comme par exemple le rouge de
courbe d’étalonnage est établie. ponceau pour valider cette étape de transfert. Puis tous les sites de
fixation potentiels non utilisés de la membrane doivent être
bloqués ou saturés pour assurer une bonne spécificité (diminu-
tion du bruit de fond). Cette étape est effectuée avec un détergent
non ionique, le Tween-20, et comme protéine, de la BSA (bovine
serum albumin) ou du lait écrémé en poudre, délipidé. Le
Tween 20 minimise l’adsorption non spécifique protéine-protéine
et protéine-matrice en empêchant les interactions non-covalentes
et hydrophobes et affecte peu les interactions antigènes-anticorps.
3. LA RÉACTION IMMUNOLOGIQUE :
ANTIGÈNE-ANTICORPS
La technique d’immunotransfert permet la mise en évidence de
différents autoanticorps présents dans le sérum de patients avec
une identification précise des PM des antigènes cibles.
Une première étape consiste à mettre en contact le sérum et la
membrane de nitrocellulose sur laquelle ont été transférés les anti-
gènes. La dilution des sérums s’effectue le plus souvent dans un
tampon Tween 20-lait délipidé et elle varie de 1/100 au 1/500 selon
les autoanticorps recherchés. Une forte dilution est parfois néces-
saire pour certains autoanticorps ; en effet, des quantités excessives
d’immunoglobulines tendent à augmenter le bruit de fond plus que
la sensibilité de la technique ; ainsi les liaisons non spécifiques peu-
Figure 1 / Immunotransfert. vent souvent être réduites avec une dilution du sérum plus élevée.
La seconde étape consiste à éliminer les immunoglobulines du les antigènes ne sont pas dénaturés et, en général, il s’agit de
sérum non fixées sur la membrane de nitrocellulose, grâce à des protéines purifiées ou recombinantes.
lavages par le PBS-Tween.
La troisième étape consiste à détecter les anticorps fixés et ce,
grâce à des anticorps anti-immunoglobulines humaines générale-
ment conjugués à la peroxydase (HorseRadish Peroxydase : HRP)
II/ AVANTAGES
ou à la phosphatase alcaline ou à l’or colloïdal. Après lavages en La technique d’immunotransfert permet de détecter des autoanti-
PBS-Tween, l’activité enzymatique de la HRP est mise en évidence corps non détectés par les techniques immunoenzymatiques de
par l’addition de son substrat : le chloronaphtol. La réaction est type ELISA.
arrêtée par lavage à l’eau distillée. Les bandelettes de nitrocellu- Elle permet d’identifier avec précision le PM et, donc, la nature de
lose sont ensuite séchées et conservées à l’abri de la lumière à l’antigène cible reconnu par les autoanticorps.
température ambiante. Le conjugué peut être remplacé par un
Elle permet de réaliser une identification de plusieurs antigènes
ligand spécifique de certaines immunoglobulines, par exemple la
présents dans un échantillon contenant plusieurs protéines
protéine A marquée provenant du staphylocoque doré et qui a une
(exemples des protéines ribosomiques, mitochondriales, des
grande affinité pour les IgG humaines.
histones et des protéines du réticulum endoplasmique).
Une lecture qualitative ou semi-quantitative (densitomètre) de
l’intensité des colorations peut ensuite être réalisée.
Des procédés d’amplification comme la méthode de chimilumines-
cence peuvent améliorer la sensibilité de la technique. On emploie
III/ INCONVÉNIENTS
comme traceur un substrat qui, au contact de l’enzyme, est trans- Les protéines sont dénaturées par le SDS et, ainsi, seuls les
formé en un produit insoluble : il précipite sur place et devient chi- épitopes « linéaires » persistent ; la technique ne permet pas de
miluminescent. La matrice est alors mise en contact avec un film détecter des autoanticorps dirigés contre des épitopes conforma-
très sensible qui sera impressionné par les photons provenant du tionnels. Différents procédés de renaturation des protéines sur la
traceur ayant précipité à l’endroit où se trouvait l’antigène. membrane ont été proposés comme celui de Durin, mais aucune
Les traceurs radioactifs sont employés particulièrement quand preuve sérieuse de renaturation des protéines n’a été apportée.
une grande sensibilité est requise. La détection peut alors se faire Le méthanol utilisé dans le transfert des protéines du gel sur la
par autoradiographie ou fluorographie. nitrocellulose peut diminuer le transfert de certaines protéines en
réduisant l’affinité du SDS pour ces protéines, qui seront ainsi en
4. VARIANTES quantité insuffisante pour être reconnues par les anticorps.
◗ Les gels à concentration déterminée peuvent être remplacés L’interprétation peut être difficile lorsque les préparations antigé-
par un seul gel mais avec un gradient de concentration. niques sont contaminées par d’autres protéines comme dans le cas
L’avantage est de séparer de façon convenable sur le même gel des protéines non histoniques dans les préparations d’histones.
les peptides et protéines de 4 à 400 kDa. Un sérum témoin connu positif doit être utilisé dans chaque réac-
◗ Des immunotransferts peuvent aussi être réalisés avec des élec- tion. En effet, le PM attendu dit « apparent » peut varier de 5 à 8 %
trophorèses en double dimension : électrofocalisation (IEF : par rapport au PM théorique.
IsoElectric Focusing) en première dimension et SDS-PAGE en Cette technique est d’une durée beaucoup longue par rapport aux
seconde dimension. techniques immunoenzymatiques de type ELISA.
Dans l’IEF, la migration est effectuée dans un gradient de pH ;
chaque molécule migre jusqu’à l’endroit où le pH est égal à son
pHi. Un gel de forte porosité (polyacrylamide ou agarose) est
utilisé, pour que la taille n’influence pas la migration. Le
IV/ APPLICATIONS PRATIQUES
gradient de pH est généré par des ampholytes, molécules EN AUTO-IMMUNITÉ
amphotères de synthèse introduites dans le gel au moment de
sa fabrication : on utilise un mélange de telles molécules, La technique d’immunotransfert est utilisée pour caractériser les
possédant des pHi dans une certaine gamme (gamme large, ex. antigènes cibles en pratique courante, mais le plus souvent en
3-9, ou ± étroite, ex. 4-5 ou 5-6,5). Ces molécules migrent rapi- seconde intention lorsque ces antigènes n’ont pas été identifiés par
dement dans le gel jusqu’à atteindre une zone où leur charge un test immunoenzymatique de type ELISA utilisé en première
devient nulle. Elles ont alors une distribution qui génère un intention. Ainsi, peuvent être recherchés les autoanticorps anti-
gradient de pH sensiblement linéaire le long du gel. Il existe de protéines ribosomiques, anti-histones, anti-mitochondries, anti-
telles molécules de petit poids moléculaire et solubles (ampho- réticulum endoplasmique, anti-filagrine et anti-récepteur sensible
lines) et il existe également des gels à base d’acrylamide du calcium (ELISA non disponible pour ces derniers autoanticorps).
modifiée contenant des groupements acides et basiques fixés
(gels d’immobilines). 1. DÉTECTION DES AUTOANTICORPS
Les immunotransferts en double dimension sont réservés à la ANTI-MITOCHONDRIES (Figure 2)
recherche. L’immunotransfert utilise des antigènes extraits de cœur de porc
◗ Rarement, des immunotransferts sont réalisés en utilisant riche en mitochondries ; des antigènes d’autres origines, notam-
seulement une IEF pour séparer les protéines ; dans ce cas, on ment du muscle humain, peuvent également être utilisés.
fait sortir les protéines du gel par simple diffusion par contact L’antigène M2 est un système antigénique complexe comportant
avec la membrane. plusieurs peptides. Les trois 2-oxo déshydrogénases acides repré-
◗ Enfin, les protéines antigènes sont parfois immobilisées en sentent les cibles majeures des autoanticorps anti-mitochondries.
déposant directement une solution de l’Ag sur la matrice. C’est Ces complexes sont la Pyruvate DeHydrogenase (PDH) principale-
le principe de l’adsorption ponctuelle (« dot blot » ou « slot- ment de 78 kDa, la 2-Oxo GlutarateDeHydrogenase (OGDH) de
blot ») qui ressemble au transfert Western. Les protéines y sont 48 kDa et la Branched Chain 2-Oxo Acid DeHydrogenase (BCO-
donc immobilisées par application directe sous forme de petites ADH) de 52 kDa. Le complexe PDH est constitué par 60 copies de
taches. Après leur immobilisation, elles peuvent être soumises dihydrolipoamide acetyltransferase (sous-unité E2) associées à
au même genre de traitement qu’un Western blot. Dans ce cas, deux décarboxylases (sous-unités E1 et E1) et à la dihydrolipoa-
mide dehydrogenase (sous-unité E3). La PDH-E2 comprend 2 auto-

épitopes dont l’un est commun avec la protéine X (E3 Binding
Protein : E3BP) de 54 kDa. Le complexe OGDH comporte 24 copies
de E2 acétyltransférase entourées de E1 et E1ß décarboxylases et
de E3. La structure est analogue pour la BCOADH. La sous-unité
E3 est la même pour PDH, OGDH et BCOADH.
La fréquence des autoanticorps contre les sous-unités E2 au cours
des cirrhoses biliaires primitives (CBP) se fait comme suit : PDH-
E2 : 90-95 %, BCODH-E2 : 30 à 45 % et OGDH-E2 : 20 %.
Dans 5 à 10 % des CBP positives en immunofluorescence sur triple
substrat mais négatives en autoanticorps anti-PDH-E2 par ELISA
ou dot, d’autres constituants de la mitochondrie, cibles de ces
autoanticorps, peuvent être ainsi identifiés par la technique d’im-
munotransfert. Il s’agit principalement de BCODH-E2 (52 kDa),
OGDH-E2 (48 kDa), PDH-E1 (41-43 kDa) et/ou PDH-E1 (32-
33 kDa) et E3 (53 kDa). Il existe également des cas où l’immuno-
Figure 3 / Autoanticorps anti-réticulum endoplasmique.
fluorescence sur triple substrat est négative avec une réaction
Immunotransferts réalisés avec des sérums donnant en
positive en immunotransfert. Ces cas sont souvent observés dans immunofluorescence indirecte un aspect d’Ac anti-LKM1.
des affections hépatiques autres que la CBP ; l’antigène est prin- La cible moléculaire la plus fréquemment reconnue est le
cipalement la BCOADH-E2 et la cause de la maladie est souvent cytochrome CYP2D6 de 50 kDa.
une infection par le virus C ; des autoanticorps anti-E3 de 53 kDa
ont aussi été décrits chez 53 % des patients atteints d’hépatite C.
3. DÉTECTION DES AUTOANTICORPS ANTI-HISTONES
L’antigène X peut également être la cible d’autoanticorps dans la (Figure 4)
cirrhose alcoolique. Enfin, dans de rares cas, certaines CBP n’ont L’immunotransfert utilise des préparations d’histones extraits de
que des anticorps anti-PDH d’origine humaine. thymus de veau et permet d’identifier le type d’histones reconnu
par les autoanticorps : H1, H3, H2a, H2b, H4 présentant un PM de
respectivement 23, 15, 14, 14 et 11 kDa par comparaison à la tech-
nique immunoenzymatique de type ELISA qui ne permet pas
l’identification du type d’histones.
Les autoanticorps anti- H1, H2a, H2b sont surtout présents dans
le lupus érythémateux disséminé (LED) et les autoanticorps anti-
H3, H4 plutôt dans le lupus iatrogène.
Figure 2 / Autoanticorps anti-mitochondries.

Immunotransferts réalisés avec des mitochondries
de cœur de porc. Sérums avec différentes réactivités
présentant différents autoanticorps anti-mitochondries. Figure 4 / Autoanticorps anti-histones.
Immunotransfert utilisant des préparations d’histones
extraits de thymus de veau. Sérums avec différentes
2. DÉTECTION DES AUTOANTICORPS réactivités présentant différents autoanticorps
ANTI-RÉTICULUM ENDOPLASMIQUE (ANTI-LIVER anti-H1, H3, H2a, H2b, H4.
& KIDNEY MICROSOMES OU ANTI-LKM) (Figure 3)
L’immunotransfert utilise des antigènes extraits de foie de rat 4. DÉTECTION DES AUTOANTICORPS
riche en réticulum endoplasmique. L’antigène majeur des autoan- ANTI-PROTÉINES RIBOSOMIQUES (Figure 5)
ticorps anti-LKM est le cytochrome CYP2D6 de 50 kDa (LKM1). L’immunotransfert utilise des antigènes extraits de foie de rat,
Les anticorps sont surtout retrouvés au cours des hépatites de enrichis en protéines de 60S. Il permet d’identifier trois phospho-
type II, mais également dans les hépatites C : dans ce cas, ils recon- protéines P0 (38 kDa), P1 (19 kDa) et P2 (17 kDa) de la sous-unité
naissent des épitopes différents de ceux de l’hépatite de type II. 60S. Les sérums de LED (12 % des LED d’adultes et 42 % des LED
Dans les hépatites chroniques actives de type II du jeune, avec juvéniles) contiennent des autoanticorps se fixant sur ces pro-
autoanticorps anti-LKM1 mis en évidence par IFI, les autoanti- téines. Selon certains auteurs, ils seraient également présents
corps anti-CYP2D6 ne sont présents que dans 60 à 70 % des cas. dans les manifestations neuropsychiatriques du LED, mais cette
D’autres polypeptides peuvent être la cible des autoanticorps anti- association n’a pas été retrouvée par d’autres auteurs.
LKM1, par exemple les protéines de 62 à 66 kDa. Ces autoanti- Ces autoanticorps sont majoritairement dirigés contre l’extrémité
corps anti-p62/66 peuvent coexister avec les autoanticorps anti- C-terminale commune aux 3 phosphoprotéines (11AA), mais des
cytochrome (20 % des cas environ) ou peuvent être présents en épitopes situés notamment du côté N-terminal, spécifiques de P1
l’absence de ces autoanticorps (30 % des cas environ). Trois autres ou P2, sont aussi les cibles des autoanticorps anti-P.
cibles moléculaires (58, 40 et 35 kDa) des autoanticorps anti- Ainsi, le test en immunotransfert est plus sensible que la tech-
LKM1 ont été décrites. Dans ces cas, l’immunotransfert permet de nique ELISA car cette dernière utilise le plus souvent des peptides
révéler l’ensemble de ces anticorps en comparaison de l’ELISA qui correspondant à la partie C-terminale commune des trois pro-
utilise un antigène unique « le cytochrome P450 IID6 ».
téines, alors que 50 % des sérums positifs ne réagissent pas avec

les épitopes communs aux trois protéines.
La technique d’immunotransfert permet également de détecter des
autoanticorps dirigés contre d’autres protéines ribosomiques telles
que des protéines de 31 kDa spécifiques du lupus par comparaison
à la polyarthrite rhumatoïde (PR) ou à d’autres maladies auto-
immunes, et des autoanticorps anti-protéine L7 (28 kDa) présents
dans 34 à 71 % des LED, 57 % des greffés du cœur développant une
coronarite, 54 % des connectivites mixtes, 38 % des scléroder-
miques, 28 % des PR et 25 % des syndromes de Gougerot-Sjögren.
Figure 6 / Autoanticorps anti-filagrine.

Acm 1 : Ac monoclonal anti-filagrine AKH1.
Acm 2 : Ac monoclonal anti-kératine KL1.
Bande 1 : Protéines de l’extrait d’épiderme humain enrichi
en filagrine.
Bande 2 : Standard de PM.
Bandes PR : Sérums de PR avec Ac anti-filagrine.
L’antigène reconnu a un PM de 70 kDa. Ces autoanticorps sont

décrits dans 30 % des hypoparathyroïdies acquises isolées et dans
certaines hypoparathyroïdies qui se manifestent chez 80 % des
patients atteints de polyendocrinopathie de type I, pour la plupart
des enfants et adolescents et, plus rarement, chez les patients
adultes atteints de polyendocrinopathie de type II. La technique
d’immunotransfert est plus sensible que la technique radio-
immunologique.
Figure 5/ Autoanticorps anti-protéines ribosomiques
80/60S.
5. DÉTECTION DES AUTOANTICORPS ANTI-FILAGRINE

(Figure 6)
L’immunotransfert utilise un extrait d’épiderme humain ou, mieux,
des extraits de filagrine enrichie ou purifiée surtout obtenus à
partir d’épiderme humain par différentes techniques. Les autoan-
ticorps anti-filagrine se fixent au niveau d’une bande diffuse qui
s’étend de 37 à 40 kDa, mais parfois aussi au niveau de molécules
de plus de 40 jusqu’à 400 kDa correspondant probablement aux
formes de transition de la profilagrine à la filagrine.
Cette méthode permet de confirmer la spécificité « anti-filagrine »
des autoanticorps antistratum corneum détectés en IFI. Les
autoanticorps détectés sont dirigés contre des épitopes séquen-
tiels, alors que la technique d’IFI permet en plus de révéler des
anticorps dirigés contre les épitopes conformationnels. Elle peut
être utile également dans les rares cas d’ELISA négatifs utilisant
des mélanges de peptides de synthèse citrullinés (anti-CCP) appa-
rentés à la filagrine et correspondant surtout à la région C-termi- Figure 7/ Autoanticorps anti-récepteur sensible du calcium.
nale de la protéine. Antigène humain recombinant du domaine extracellulaire
du récepteur sensible du calcium. La réactivité est observée
au niveau du poids moléculaire de 70 kDa ; Ac monoclonal
6. DÉTECTION DES AUTOANTICORPS anti-CaSR (ligne 1), sérums positifs de patients avec
ANTI-RÉCEPTEUR SENSIBLE DU CALCIUM (Figure 7) hypoparathyroïdie (lignes 2 à 8), sérums négatifs de
patients avec hypoparathyroïdie (lignes 9 à 11), sérums
L’immunotransfert utilise un antigène recombinant correspon- négatifs de patients avec PEA type II (lignes 12 à 16).
dant au domaine extracellulaire du récepteur sensible du calcium. Marqueurs de poids moléculaire (ligne à droite).
CONCLUSION
La technique d’immunotransfert est particulièrement intéressante pour la recherche, notamment dans sa variante en double
dimension. Elle a permis de mettre en évidence de nouveaux autoanticorps dont l’antigène cible n’était pas encore identifié. En pra-
tique courante, cette technique est utilisée en seconde intention pour identifier des autoanticorps non caractérisés par des
techniques plus faciles à mettre en œuvre, comme les techniques immunoenzymatiques de type ELISA.
Références
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Biopuces à autoantigènes
pour la caractérisation des autoanticorps
dans les maladies auto-immunes
Chantal ANDRÉ, Service d’Immunologie biologique, CHU Henri-Mondor, 94010 Créteil
E-mail : chantal.andre@hmn.ap-hop-paris.fr
I/ INTRODUCTION
L’étude des autoanticorps par la technique des biopuces fait ainsi
partie des méthodes de caractérisation en « multiplex » des auto-
anticorps. Les premiers travaux rapportant cette technique pour
De nouvelles technologies permettant d’étudier globalement le l’analyse de nombreux autoanticorps dans les maladies auto-
génome, le transcriptome et le protéome se sont largement déve- immunes ont été publiés en 2002 [14]. Mais si les technologies
loppées dans les dix dernières années. Appliquées aux maladies basées sur les puces (notamment à ADN) donnent lieu à de très
auto-immunes, elles permettent une classification moléculaire nombreuses publications, les progrès semblent lents sur les puces
des pathologies, autant pour l’aide au diagnostic, l’identification à protéines étant donné la rareté des études rapportées, notam-
de nouvelles entités et l’étude de la physiopathologie [3] que pour ment pour la détection des autoanticorps.
la caractérisation de nouvelles cibles pour la thérapeutique [17].
La protéomique, l’étude à grande échelle de l’expression, des
fonctions et de l’interaction des protéines exprimées dans un
tissu ou organisme, s’est ainsi plus récemment développée. Des
avancées importantes ont été faites au cours des trois dernières
II/ MÉTHODOLOGIE
années dans le développement de méthodes permettant d’analy- II.1. TECHNIQUE
ser plusieurs protéines ou autres biomolécules en même temps Différents systèmes de puces à protéines existent. La technique de
[9]. La technologie des biopuces (microarrays ou micro-réseaux) base, utilisée pour l’identification des autoanticorps à partir de
dérivée des technologies des puces à ADN, puis à ARN, s’est élar- puces à autoantigènes décrite par l’équipe de Robinson [14, 15]
gie à l’étude des protéines (puces à protéines) et même aux puces qui a modifié le protocole expérimental introduit par Haab et coll.
à cellules ou tissus. Plusieurs groupes ont développé des [6], est basée sur la technologie des puces à ADN. Elle permet le
méthodes dérivées des puces à ADN en utilisant les appareils dépôt de très nombreux antigènes en microquantité sur une
robotisés destinés aux dépôts précis des cDNA pour générer des surface plane. Elle nécessite l’utilisation d’un robot diluteur qui
« réseaux organisés de protéines », dépôts de nombreuses prépare les solutions d’antigènes, d’un micropipetteur robotisé
protéines différentes en vue d’étudier leurs interactions avec qui dépose les antigènes sur la surface de la puce, de marqueurs
d’autres protéines, enzymes ou médicaments [12] et les systèmes fluorescents, d’un scanner analyseur d’images en fluorescence et
antigène-anticorps [6]. d’un logiciel d’interprétation.
B I O P U C E S À A U T O A N T I G È N E S P O U R L A C A R A C T É R I S AT I O N
DES AUTOANTICORPS DANS LES MALADIES AUTO-IMMUNES
D’autres protocoles, sur un nombre plus limité d’antigènes, ont II.3. LIMITES ET INCONVÉNIENTS DE LA TECHNIQUE
aussi été décrits [5, 7]. Divers problèmes se sont révélés qui n’existent pas pour les puces
La technique peut se diviser en 3 temps : à ADN, notamment en ce qui concerne l’immobilisation des anti-
◗ Préparation des biopuces gènes et les stratégies de détection.
Les antigènes prédilués sont transférés par un robot dans des Les autoantigènes ont des structures moléculaires de natures
microplaques de 384 puits. Un robot micropipetteur est utilisé différentes : ainsi les protéines, peptides, ADN, phospholipides,
pour déposer les antigènes sur des lames de microscope dans un lipoprotéines, glycoprotéines ou organelles complètes n’ont pas
ordre précis. Des centaines de protéines, peptides ou autres toutes et tous les mêmes propriétés de fixation sur un support,
biomolécules (acides nucléiques) peuvent être ainsi attachées à alors que l’ADN chargé négativement se fixe sur le support d’une
la surface de la lame. Les lames ainsi préparées peuvent être façon bien définie. Les protéines peuvent être hydrophobes,
conservées à 4 °C et gardent leur réactivité pendant des mois [14]. hydrophiles, acides, basiques, glycosylées, et sont notamment
Différents types de support ont été testés : lames de verre ou poly- sensibles à la dénaturation [4, 11]. Différents supports ont été tes-
styrène prétraitées selon divers procédés ou des membranes [7]. tés, lames de verre ou polystyrène, traitées ou non, ou des mem-
◗ Marquage des puces branes de nitrocellulose, nylon, polyfluorure de vinylidène (PVDF)
Les lames sont incubées avec les sérums (dilués) à étudier. Après [5, 7, 14], avec des résultats variables. Robinson [14] signale que
lavages, les lames sont incubées avec des anticorps anti-immuno- les anticorps dirigés contre certains antigènes ne sont pas détec-
globulines humaines conjugués avec les fluorophores vert Cy-3 tables (protéines Sm, histones) dans leur protocole, ceci pouvant
(indocarbocyanine) ou rouge Cy-5 (indodicarbocyanine) [14]. être expliqué par l’absence de structures tridimensionnelles, des
Après lavage, les puces sont séchées rapidement. interférences stériques ou des répulsions électrostatiques.
Hiepe et al. [7] ont développé un système sur membrane utilisant Les sérums des patients peuvent donner un bruit de fond élevé
des antiglobulines marquées par la peroxydase de Raifort (HRP) et variable selon les supports ou les systèmes de révélation.
révélation par le substrat tétraméthylbenzidine (TMB), tandis Des conditions d’incubation (tampons, etc.) compatibles avec tous
qu’une autre équipe [5] a utilisé un support de polystyrène, des
les types d’antigènes doivent être trouvées.
anti-globulines marquées à l’HRP et un système de révélation en
chemiluminescence. La corrélation entre le signal mesuré sur la puce et la concentra-
tion en anticorps est imparfaite, les affinités variables des auto-
◗ Lecture
anticorps étant probablement en cause.
Les lames marquées par les fluorochromes sont analysées en
utilisant un scanner numérique basé sur la fluorescence (laser)
(exemple : GenePix 4000 Scanner) et un logiciel approprié
(exemple : logiciel GenePix Pro 3.0, [10]).
Une description de la technologie utilisée par l’équipe de Stanford
III/ RÉSULTATS ET APPLICATIONS
ACTUELLES
et des informations sur la construction des robots, sur les proto-
coles, logiciels et outils statistiques peuvent être trouvées sur Peu de travaux ont été publiés jusqu’à présent et essentiellement
différents sites de la Stanford (USA) University School of Medicine par les équipes de la Stanford University School of Medicine. Elles
dont http://www.stanford.edu/group/antigenarrays. sont en train de développer des puces représentant le « protéome »
Le système de révélation présenté par Hiepe [7] ne nécessite de cibles tissulaires de différentes maladies auto-immunes.
qu’un scanner optique conventionnel.
III.1. PUCES POUR L’ÉTUDE DES CONNECTIVITES
II.2. AVANTAGES Le travail le plus détaillé et validé concerne la détection sensible
Les avantages retenus à partir des travaux de Robinson [14] sont et spécifique d’autoanticorps dans les connectivites, essentielle-
multiples : ment le lupus érythémateux systémique, la sclérodermie, le
• La recherche des autoanticorps par miniaturisation permet syndrome de Gougerot-Sjögren et les connectivites mixtes. Le
l’étude d’un large profil d’anticorps : 196 molécules différentes système est basé sur celui des puces à ADN [14]. Des spots en 4
ont été étudiées, et plus dans d’autres études en cours ; ou 8 copies de 196 biomolécules différentes dans une puce de
• La quantité d’antigènes nécessaire est très faible : 1 nl de solution 1 152 caractères ont été préparés. Les résultats ont été comparés
contenant 200 pg d’antigène (protéines, peptides, ADN, enzymes, à ceux obtenus par les techniques ELISA, d’immuno-précipitation
complexes ribonucléoprotéiques). Le dépôt de l’antigène se fai- ou d’analyse en Western blot. Parmi les antigènes déposés, les
sant sur une aire de 150 microns de diamètre, 15 000 caractères protéines recombinantes ou purifiées suivantes ont été utilisées :
pourraient être ainsi déposés sur une surface de 1,8 cm x 5,4 cm ; « Ro52 », La, Jo-1, H2A, Sm-B/B’, U1 70 kD, U1snRNP-C, com-
• La quantité de sérum nécessaire est très faible : 2 microlitres en plexe Sm/RNP, DNA topo-isomérase I, protéine CENP-B, pyruvate
utilisant un protocole standard normal de dépôt sur lame, seu- déshydrogénase (PDH), divers dsDNA et ssDNA, différents
lement 0,15 microlitre lorsqu’on emploie une lamelle. Il est peptides de protéines Sm, protéines snRNP, histones H1, H2A, H3
possible d’utiliser d’autres fluides, tels que le liquide céphalo- et H4. Des anticorps spécifiques des IgG et les IgM humaines, des
rachidien, le liquide synovial ou des éluats de tissus ; vaccins (antigènes du virus de la grippe et du pneumocoque) ont
• Les anticorps sont détectés au nanog/ml. La technique serait été fixés sur la puce pour servir de contrôles. Les anticorps secon-
4 à 8 fois plus sensible que l’ELISA pour la détection des daires étaient marqués à Cy-3. Les essais effectués avec 50 sérums
autoanticorps dirigés contre 5 autoantigènes recombinants ; de pathologies diverses ont montré des résultats comparables aux
• La technique de dépistage est rapide et permet aussi de diffé- autres techniques pour beaucoup d’antigènes. Les 10 sujets sains
rencier les isotypes ou sous-classes d’anticorps. Si actuellement contrôlés étaient négatifs pour tous les anticorps sauf pour la
2 isotypes peuvent être détectés simultanément, de nouveaux détection des anticorps contre les antigènes de pneumocoques et
scanners permettant d’examiner en même temps 4 couleurs de de la grippe. Il a aussi été montré que ce test permet de faire une
fluorescence ou plus permettraient l’analyse de plus de 2 iso- cartographie de la réponse anticorps, par exemple sur des épitopes
types [18] ; d’histones, et d’étudier les sous-classes IgG1, 2 et 3 en utilisant
• Cette technologie serait peu coûteuse du fait de l’utilisation de des anticorps monoclonaux conjugués à Cy-5 dirigés contre les
très infimes quantités d’antigènes. 3 sous-classes.
III.2. PUCES À ANTIGÈNES

DANS D’AUTRES PATHOLOGIES
Des biopuces ont été construites et sont en cours de validation
V/ LIMITES ET PERSPECTIVES
La validation de cette nouvelle technologie des puces à antigènes
pour certaines maladies dont la polyarthrite rhumatoïde, le dia-
est nécessaire : une étude extensive doit être entreprise sur des
bète insulinodépendant [8, 15], la cirrhose biliaire primitive, la
milliers de sérums déjà caractérisés par les méthodes standards
maladie de Wegener, la cholangite sclérosante primitive [18]. Des
pour montrer la valeur et la reproductibilité des résultats, leur
puces à protéome de myéline sont en cours d’étude pour le profil
sensibilité et spécificité, avant de l’utiliser dans une pratique
de la réponse anticorps dans la SEP et dans le modèle expérimental
clinique de routine.
de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et des
essais de vaccination chez la souris [8, 15, 16]. Ceci ne pourra être effectué qu’après avoir résolu et optimisé les
différents problèmes techniques qui se posent : la production et la
III.3. DÉVELOPPEMENT INDUSTRIEL purification des antigènes, les conditions de dépôts et les supports
plans pour éviter l’altération des épitopes, la détection de la fluo-
Aucune étude en série suite à un développement industriel ne
rescence ou d’un autre système de révélation (scanner laser ou
semble avoir été publiée à ce jour. Mais cette technologie intéresse
optique) et la quantification des concentrations d’anticorps.
les firmes qui vont proposer probablement dans l’avenir des puces
prêtes à l’emploi et ne nécessitant pas de scanner laser [7]. Dans Médecine Science, B JORDAN [10] résume bien les difficul-
tés posées par les puces à protéines : « 1- disposer de nombreuses
IV/ APPLICATIONS POTENTIELLES protéines pures à déposer sur le réseau, 2- maîtriser leurs inter-
actions avec les entités qu’elles sont censées fixer, 3- avoir une
méthode de détection sensible et quantitative… Ces 3 points sont
• La première application est d’obtenir un dépistage rapide en résolus pour les puces à ADN mais les difficultés sont présentes
multiplex des spécificités anticorps connues associées aux mala- pour les puces à protéines ».
dies auto-immunes pour permettre un diagnostic précoce.
Enfin, le prix de revient des détections des autoanticorps par les
• La possibilité de déterminer les isotypes et sous-classes des
puces à autoantigènes n’a pas encore été correctement évalué ; il
anticorps est un argument pour étudier leur potentiel pathogè-
dépendra des technologies utilisées, notamment du matériel
ne (IgG1 et IgG3, anticorps fixant le complément).
nécessaire pour les dépôts, la lecture et l’interprétation et de la
• Ce type de technologie peut constituer un outil judicieux pour finalité (recherche ou utilisation en routine).
identifier rapidement de nouveaux autoantigènes et épitopes en
Même si peu d’études sont actuellement disponibles concernant
utilisant des banques d’expression de cDNA, des banques de
l’étude des maladies auto-immunes [13], les technologies basées
peptides ou des fractions de tissus cibles, et ainsi de nouveaux
sur les biopuces vont être dans les prochaines décades d’un grand
autoanticorps d’intérêt diagnostique.
apport pour la compréhension des mécanismes physiopatho-
• La caractérisation à grande échelle de l’évolution de la réponse
logiques impliqués et pour leur traitement, tant par l’usage des
immune humorale, c’est-à-dire l’étude de la diversification épi-
puces à ADN pour l’étude des génomes [1] que par celui des puces
topique inter- et intra-moléculaire chez l’animal et dans les
à protéines pour l’étude du protéome, des cytokines et autres
maladies humaines, pourrait être obtenue.
molécules de la signalisation cellulaire [2] ou l’identification de
• Par la découverte de nouveaux autoantigènes, des thérapies nouveaux autoantigènes.
spécifiques d’antigènes (administration d’agents thérapeu-
tiques spécifiques, ou induction d’une tolérance, en particulier
par des vaccins ADN) [16, 17] pourraient se développer.
CONCLUSION
Les tests récemment publiés basés sur des biopuces composées d’antigènes répartis sous forme de multiples spots sur des surfaces
planes semblent offrir des protocoles simples et prometteurs pour la détection de nombreux anticorps dans un sérum et ainsi définir
un « profil » d’autoanticorps. Mais il faudra du temps avant que cette technologie ne puisse être appliquée à une utilisation courante
pour le dépistage clinique.
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La technologie Luminex® : application
à la recherche des autoanticorps
Nils-Olivier OLSSON, Laboratoire d’Immunologie, Centre Hospitalier Universitaire, BP 77908, 21079 Dijon Cedex
E-mail : nils.olsson@chu-dijon.fr
L’intérêt croissant porté aux maladies auto-immunes et aux autoanticorps entraîne une augmentation impor-
tante des analyses de sérologie auto-immune. Pour faire face à cette inflation, aggravée par la réduction
légale du temps de travail (35 heures), l’automatisation de ces analyses s’impose de plus en plus. De nom-
breux appareils sont disponibles pour automatiser les techniques ELISA, qu’il s’agisse de modules séparés
(diluteurs/distributeurs, incubateurs, laveurs, lecteurs) ou d’automates plus ou moins complets. Néanmoins,
le rendement de ces automates est limité. Dans les années 90, la firme Luminex® Corp (Austin, Texas)
[http://www.luminexcorp.com] a développé une technologie analytique originale, dérivée de la cytométrie
en flux, permettant d’analyser simultanément un grand nombre de molécules différentes dans un même
échantillon. Plusieurs fabricants de réactifs ont acquis une licence auprès de Luminex ® pour adapter cette
technologie aux recherches d’autoanticorps. C’est le cas pour quatre firmes présentes sur le marché français :
BIO-RAD avec le BioPlex™ 2200, BMD avec le système FIDIS™, INOVA (distribué par MENARINI) avec le
système QUANTA Plex™ et Zeus (distribué par InGen) avec le système AtheNA Multi-Lyte™.
PRINCIPE DE LA TECHNOLOGIE Pour permettre la détection simultanée de plusieurs analytes, il

faut pouvoir distinguer les billes porteuses des molécules complé-
LUMINEX® mentaires. Ceci est rendu possible en incorporant dans ces billes
Il s’agit d’un système analytique multiplex (technologie xMAP® : des quantités déterminées de deux marqueurs fluorescents, orange
Multiple Analyte Profile). Il repose sur trois éléments principaux : et rouge. Dix niveaux de fluorescence de chaque couleur peuvent
un support solide constitué de microbilles, des marqueurs fluo- être combinés, générant cent types de billes (Figure 1). Pour la
rescents, et un fluorimètre en flux. sérologie auto-immune, un autoantigène différent est fixé sur
chaque type de billes, permettant de capturer autant d’autoanti-
Le support analytique est représenté par des microbilles en poly- corps différents. Cette fixation est ensuite révélée par un conjugué
styrène de 5,6 mm de diamètre. Les fonctions carboxyliques de ces fluorescent : anticorps anti-immunoglobulines humaines sur lequel
billes permettent de fixer de façon covalente différents types de est fixé un fluorochrome différent de ceux qui sont incorporés
molécules porteuses de groupements aminés : antigènes, anticorps, dans les billes.
acides nucléiques ou autres types de récepteurs ou de ligands. Le
Le troisième élément essentiel est le dispositif de mesure de la
domaine d’application potentiel est donc immense, pourvu que
fluorescence (Luminex 100™). Il s’agit d’un fluorimètre en flux,
l’on soit capable de réaliser de façon satisfaisante le couplage de la
abusivement appelé cytomètre en flux, puisque cet appareil
molécule complémentaire de l’analyte [13, 18, 19].
n’analyse pas de cellules. Au fluorimètre proprement dit est asso-
Figure 1 / Codage fluorescent des billes dans le système ciée une pompe de circulation (Luminex SD™). La suspension de
Luminex®.
billes est entraînée par une veine liquide et les billes passent l’une
après l’autre dans le trajet de deux faisceaux lasers (Figure 2).
L’analyse de la lumière diffractée latéralement (SSC : side scatter)
permet de détecter les doublets de billes, qui seront automatique-
ment exclus du comptage par le logiciel d’acquisition des don-
nées. Par ailleurs, les deux lasers permettent l’analyse simultanée
des différents fluorochromes associés à une même bille. Le pre-
mier laser (635 nm) excite les colorants internes orange et rouge
qui émettent à deux longueurs d’onde très différentes, ce qui per-
met d’identifier la bille, donc l’autoanticorps qu’elle a pu capturer.
Le deuxième laser (532 nm) excite le fluorochrome du conjugué
qui s’est fixé à la surface de la bille au cours de la réaction,
permettant de quantifier l’autoanticorps. Ce fluorochome est en
général la phycoérythrine (PE) : elle se caractérise par un rende-
ment quantique élevé, une faible photosensibilité et une bonne
stabilité.
Dans sa configuration classique, deux autres éléments viennent
compléter ce système : d’une part, un passeur d’échantillon
(Luminex XYP™), placé sous le fluorimètre, qui permet d’auto-
La combinaison de 10 niveaux de concentration matiser l’étape de lecture ; d’autre part, un logiciel informatique
d’un fluorochrome orange et d’un fluorochrome rouge qui pilote l’ensemble et enregistre les mesures de fluorescence
permet d’obtenir 100 types de billes. (Figure 3).
L A T E C H N O L O G I E L U M I N E X ® : A P P L I C AT I O N
À LA RECHERCHE DES AUTOANTICORPS
Figure 2 / Analyse des billes dans le fluorimètre en flux. tantes doivent être effectuées en deux étapes afin de ne pas avoir
à mesurer un volume d’échantillon trop faible.
Les billes doivent être soigneusement remises en suspension dans
l’échantillon dilué. C’est une étape critique pour laquelle l’un des
fabricants préconise de soniquer la suspension avant de la distri-
buer, un autre ne recommandant qu’une simple agitation au
vortex. Dans les trousses proposées par un troisième fabricant, les
billes sont pré-distribuées dans les puits et remises en suspension
dans l’échantillon dilué à l’aide d’une pipette automatique ou d’un
diluteur/distributeur.
Les analyses se déroulent en deux étapes : par rapport aux tech-
Chaque bille passe niques ELISA classiques, on économise le temps de l’étape de
simultanément dans
le faisceau des deux lasers.
chromogénèse. La durée des incubations des billes avec les échan-
tillons puis avec le conjugué est comparable à celle des techniques
ELISA. En revanche, il n’est pas toujours nécessaire d’effectuer un
lavage entre l’incubation des billes avec le sérum et l’incubation
avec le conjugué. Deux fabricants proposent en effet des réactifs
permettant une addition directe du conjugué dans le mélange
réactionnel. Les avantages sont évidents : simplicité de manipula-
tion, gain de temps, automatisation facile. Dans une autre gamme
de réactifs (FIDIS™), les billes sont lavées : les réactions sont
effectuées dans des plaques à fond semi-perméable qui sont
placées sur un dispositif d’aspiration pour l’étape de lavage.
Pour l’étape de lecture, la plaque est placée dans le passeur
d’échantillon situé sous le fluorimètre. Cette étape est donc entiè-
rement automatique. La définition du nombre de billes de chaque
type qui doivent être comptées (au moins 100), ainsi que le mode
de calibration des analyses, sont propres à chaque fabricant de
réactifs. La grande étendue du domaine de mesure du fluorimètre
permet de s’affranchir des redilutions qui sont éventuellement
Le laser rouge identifie la bille (donc l’autoantigène) réalisées dans les techniques ELISA classiques pour les échan-
par sa fluorescence intrinsèque, et le laser vert mesure tillons donnant des résultats hors gamme. Les comptages sont
la quantité de conjugué (donc d’autoanticorps) fixé
à sa surface.
traités par le logiciel de pilotage du fluorimètre, mais certains
fabricants complètent ce dispositif par un deuxième logiciel
permettant un traitement mieux adapté des résultats.
Figure 3 / le système Luminex.
Le système Bioplex™ 2200 diffère des autres par différents points.
Il s’agit d’un automate complet qui inclut le fluorimètre en flux.
Les réactions ne se déroulent pas dans des puits de microplaques
mais dans des cupules. Les billes sont un peu plus grosses
(8 microns) que les billes classiques de Luminex, et sont magné-
tisées, ce qui facilite les étapes de lavage. Les réactions se dérou-
lent à 37 °C, ce qui permet de réduire la durée des incubations
C (20 et 10 mn).
INTÉRÊT ET LIMITES
A DE LA TECHNOLOGIE LUMINEX®
Les microbilles font l’objet de multiples applications en cytomé-
trie [12]. Leur utilisation comme support solide pour des dosages
B immunologiques n’est pas nouvelle : elle a été appliquée dès 1982
au dosage des IgG humaines [11]. Son automatisation avait déjà
A : Fluorimètre (Luminex 100™). été proposée il y a quelques années (système Copalis, DiaSorin).
B : Passeur d’échantillons (Luminex XYP™). Mais l’intérêt majeur de la technologie Luminex est la possibilité
C : Pilote informatique. d’analyse multiplex, grâce au marquage interne des billes. Il est
théoriquement possible d’analyser simultanément, dans un même
échantillon biologique, jusqu’à 100 analytes différents.
MODALITÉS PRATIQUES
Néanmoins, pour réaliser une telle prouesse, il faut satisfaire à un
D’UTILISATION POUR LA RECHERCHE certain nombre de conditions. Comme pour tous les systèmes
DES AUTOANTICORPS récepteur/ligand utilisant une phase solide, il faut tout d’abord
disposer de récepteurs suffisamment spécifiques des ligands
À l’exception du système Bioplex™ 2200, les réactions se dérou- recherchés, et parvenir ensuite à coupler tous ces récepteurs sur
lent dans des cupules en plastique comparables aux classiques les billes, sans perte de spécificité et de façon stable. La définition
microplaques utilisées en ELISA. de la matrice liquide dans laquelle se déroule la réaction est
Les analyses sont en général réalisées sur des sérums très dilués également critique, puisqu’elle doit convenir à des couples récep-
(entre 1/200 et 1/1000 selon les fabricants). Les dilutions impor- teur-ligand qui peuvent être assez différents. Si les conditions de
capture d’acides nucléiques (amplicons) par des sondes oligonu- corps, dont les anti-gliadines et les anti-transglutaminases tissu-
cléotidiques fixées sur les billes sont relativement homogènes, il laires qui peuvent être recherchés par ce type de technique. De
n’en est pas de même pour la capture d’anticorps par des antigènes plus, la possibilité de rechercher des panels étendus d’autoanti-
très différents. Par ailleurs, on peut s’interroger sur la capacité du corps peut déboucher sur l’identification de nouveaux profils
fluorimètre à différencier parfaitement des billes qui ne différe- d’intérêt clinique [8].
raient que par un niveau de concentration de l’un des deux Un autre intérêt de cette technologie est son caractère ouvert. Si
fluorochromes internes. Les billes sont sensibles à la lumière, en elle n’a pénétré que récemment dans les laboratoires d’analyses
particulier celles qui sont les plus fortement chargées en fluoro- médicales, elle est présente depuis longtemps les laboratoires de
chromes : leur exposition prolongée à la lumière pourrait rendre recherche qui ont développé de nombreuses applications dans le
leur codage moins précis et perturber leur identification. Enfin domaine des cytokines [5], de la sérologie infectieuse [2, 10, 14],
les performances des lasers sont sensibles aux variations de tem- du génotypage bactérien [20], des maladies génétiques [7], …
pérature, et il est souhaitable de les recalibrer fréquemment. Rien n’empêche un laboratoire situé à la frontière entre ces deux
La possibilité de réaliser plusieurs analyses simultanément sur un pôles, comme un laboratoire hospitalo-universitaire, de mettre au
même sérum et dans la même cupule diminue considérablement point lui-même la détection d’autoanticorps particuliers en ache-
le temps de travail. Néanmoins, l’étape de mesure est plus longue tant séparément les billes, les antigènes et le conjugué. Le logiciel
que dans les techniques ELISA : alors qu’un lecteur de micro- de pilotage du fluorimètre fourni par Luminex® n’interdit pas
plaque effectue la mesure photométrique de 96 puits en trois l’utilisation de réactifs non commerciaux. La limite risque plutôt
secondes, il faut 10 à 90 secondes au fluorimètre en flux pour de venir des firmes qui développent les applications analytiques et
acquérir un nombre suffisant de mesures de fluorescence dans un qui pourraient associer au système un logiciel de pilotage et
mélange réactionnel. Ce temps de comptage est évidemment d’exploitations des résultats qui ne permettrait de n’utiliser que
fonction du nombre d’analytes (nombre de billes différentes) leurs réactifs.
mesuré(e)s. Autre limite : dans l’état actuel des choses, cette technologie ne
Il faut également souligner que cette étape finale de mesure est la permet pas de détecter séparément des anticorps d’isotypes diffé-
seule qui soit automatisée. Il faut donc envisager l’utilisation en rents dans le même mélange réactionnel. Ainsi, la recherche dans
amont d’un automate de dilution/distribution pour la réalisation un même sérum des IgA et des IgG anti-gliadine doit être effec-
des étapes réactionnelles. Cette automatisation est évidemment tuée dans deux puits distincts. Luminex® Corporation pourrait
plus facile si les analyses ne nécessitent pas de lavage. Les sociétés proposer prochainement un fluorimètre équipé de trois lasers qui
BMD, Menarini et InGen proposent des plate-formes préanalyti- supprimerait cette limite en autorisant la détection de deux
ques qui permettent d'automatiser plus ou moins complètement conjugués porteurs de fluorochromes différents.
ces étapes. Avec le BioPlex™ 2200, BIO-RAD a fait le choix d’une
automatisation totale, le fluorimètre étant intégré à l’automate.
De nombreuses firmes américaines, européennes ou asiatiques LA TECHNOLOGIE LUMINEX®
ont déjà développé des réactifs utilisables sur le système Luminex,
en particulier dans les domaines des cytokines, du système HLA PARVIENDRA-T-ELLE À S’IMPOSER
[6], des hormones peptidiques, du génotypage moléculaire et la POUR LA SÉROLOGIE AUTO-IMMUNE ?
détection de mutations ponctuelles (SNP : single nucleotide
polymorphism). Pour les autoanticorps, les quatre fabricants Si l’utilisation de cette technologie multiplex pour la recherche
implantés sur le marché français ont développé des trousses de des autoanticorps est séduisante a priori, elle se heurte à un
réactifs pour la détection de différents panels d’autoanticorps : certain nombre de difficultés.
anticorps antinucléaires, anticorps antithyroïdiens, facteurs rhu- Elles sont d’abord d’ordre économique. En effet, le coût de l’appa-
matoïdes, anticorps associés à l’intolérance au gluten, anticorps reillage et des réactifs n’est pas négligeable. Les quantités d’anti-
anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles. De nombreuses gènes utilisées dans ces tests sont pourtant nettement inférieures
évaluations de ces réactifs ont déjà été publiées [1, 3, 4, 9, 15-17]. à celles que nécessitent les techniques classiques comme l’ELISA,
Certains de ces réactifs sont déjà disponibles en France, d’autres mais l’utilisateur doit évidemment payer l’investissement en
devraient bénéficier bientôt du marquage CE. D’autres paramètres recherche et développement effectué par les sociétés concernées.
ont été développés par des firmes étrangères mais ne sont pas Par ailleurs, la réalisation systématique de panels d’analyses peut
disponibles en France : c’est le cas pour les anticorps anti- également être une source de difficultés en termes de rembourse-
Saccharomyces cerevisiae et les anticorps anti-bêta-2-gpI (Rules ment. Si l’on prend l’exemple des anticorps antinucléaires, la
Based Medicine). Nomenclature des Actes de Biologie Médicale autorise le biologiste
Dans ce domaine de l’auto-immunité, l’intérêt de ces analyses à effectuer de sa propre initiative la recherche d’anticorps anti-
multiparamétriques est évident. En effet, dans de nombreuses ADN natif lorsque l’immunofluorescence a mis en évidence un
pathologies auto-immunes, il est nécessaire ou souhaitable de titre élevé d’anticorps antinucléaires. Mais elle ne lui donne pas
rechercher plusieurs autoanticorps différents. C’est le cas de la explicitement le droit de rechercher de la même façon des anti-
polyarthrite rhumatoïde où l’on a coutume de rechercher en ENA, des anti-histones, des anti-ribosomes, des anti-CENP-B, …
parallèle des facteurs rhumatoïdes de spécificité humaine et ani- Bien que cette démarche puisse se justifier sur le plan médical, la
male qui ont des performances cliniques (sensibilité, spécificité) facturation de tels examens non prescrits peut être condamnée
un peu différentes. La recherche d’autres anticorps plus spéci- par les caisses d’assurance-maladie. Plusieurs démarches peuvent
fiques, comme les anticorps anti-peptides cycliques citrullinés être envisagées pour pallier cette difficulté. Une première solution
(anti-CCP), leur est de plus en plus souvent associée. Il en est de est de diversifier les panels d’anticorps afin de faire correspondre
même pour les anticorps anti-ENA : après une éventuelle premiè- le mieux possible les examens réalisés avec la prescription. De fait,
re étape de dépistage global, on recherche volontiers en parallèle l’un des fabricants présents sur le marché français (INOVA)
les quatre, cinq ou six spécificités les plus fréquentes. Pour le syn- propose quatre panels différents pour la recherche des anticorps
drome des anti-phospholipides, il peut être utile d’associer à la antinucléaires. Il est clair néanmoins que la multiplication des
recherche des classiques anti-cardiolipides celle des anti-ß2-gly- panels complique la gestion des analyses et des réactifs. Une autre
coprotéine I, voire d’anticorps dirigés contre d’autres phospholi- solution serait d’utiliser toujours un même panel regroupant de
pides ou d’autres cofacteurs protéiques. Le diagnostic et le suivi nombreux anticorps et de ne facturer que ceux qui ont été prescrits.
de la maladie cœliaque font généralement appel à plusieurs anti- Ceci suppose que le coût de ces réactifs soit suffisamment bas.
Devant cette possibilité de rechercher simultanément plusieurs tion des autoanticorps. Ainsi, dans l’un des panels actuellement
anticorps différents dans un même sérum, le biologiste pourrait proposés pour aider au diagnostic des connectivites, certaines
être tenté de les multiplier. La question de la définition des profils billes sont revêtues d’un extrait antigénique « total » de cellules
d’anticorps les plus pertinents se pose donc. À titre d’exemple, est- HEp-2. Certains pourraient être tentés d’utiliser exclusivement ce
il justifié de rechercher simultanément des anticorps anti-ADN panel en abandonnant la recherche des anticorps antinucléaires
natif, anti-chromatine (anti-nucléosomes) et anti-histones ? Est- par immunofluorescence. Il faut réaffirmer que l’immunofluores-
il justifié de rechercher des anticorps dirigés contre tous les cence peut fournir de très nombreux renseignements et doit
peptides des antigènes Sm et RNP ? garder sa place en première intention, la détection d’un panel
D’autre part, si la recherche d’un panel d’autoanticorps peut être d’anticorps antinucléaires venant en complément. La question se
utile dans le bilan initial d’une maladie auto-immune systémique, pose également pour les ANCA. La forte sensibilité du système
il n’en est pas de même, par exemple, pour le suivi d’un lupus, où BioPlex™ 2200 pour la détection des anti-MPO et anti-PR3 a fait
le seul taux des anticorps anti-ADN natif (ou des anti-nucléosomes) suggérer qu’elle pourrait être réalisée de cette façon, en première
pourrait suffire. intention, l’immunofluorescence n’étant utilisée que pour
contrôler les résultats positifs [3].
On peut également s’interroger sur la place que pourraient
prendre certains de ces tests multiplex dans la stratégie de détec-
CONCLUSION
Les technologies multiplex qui apparaissent sont séduisantes. Qu’elles utilisent des microbilles ou des puces à protéines, elles
offrent la possibilité de détecter simultanément un grand nombre d’analytes. Elles peuvent être appliquées à une multitude de
systèmes récepteur/ligands et sont donc amenées à se développer de façon importante en biologie, en particulier en biologie médi-
cale. La place que prendront ces technologies dans le domaine de la sérologie auto-immune au cours des prochaines années dépend
en particulier de leur coût, de la nature et de la qualité des antigènes utilisés, et des profils d’autoanticorps qui seront proposés.
Enfin, il appartiendra bien sûr aux biologistes d’évaluer la fiabilité et les performances des réactifs qui leur seront proposés.
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Apport de l’analyse sérologique du protéome
dans l’identification des autoantigènes
Éric BALLOT, Catherine JOHANET, Laboratoire d’Immunologie et d’Hématologie Biologiques, hôpital Saint-Antoine, Paris
Plus de 200 autoanticorps (Ac) sont actuellement décrits. Le développement récent des puces à protéines et
des techniques fluorométriques en flux utilisant des antigènes (Ag) couplés à des microbilles implique la
connaissance approfondie des autoAg pouvant entrer dans les panels de détection, panels susceptibles
chacun de compter plusieurs dizaines à plusieurs centaines d’Ag. C’est dans ce cadre que peut prendre place
la puissance de l’analyse protéomique appliquée à la détection des autoAg.
I/ PRINCIPES GÉNÉRAUX DE L’ANALYSE SÉROLOGIQUE DU PROTÉOME

DANS L’IDENTIFICATION DES AUTOANTIGÈNES (Figure 1)
Figure 1/ Identification d’autoAg par analyse sérologique du protéome. Principe général.
La première étape est la séparation par électrophorèse bidimen- La deuxième étape consiste à repérer sur le gel de polyacrylamide,
sionnelle de protéines de fractions cellulaires. À partir du gel est coloré au bleu de Coomassie par exemple, les spots d’intérêt de
réalisé un immunoblot bidimensionnel [6]. La comparaison des l’immunoblot.
immunoblots obtenus à partir de sérums de contrôle et à partir de Ces spots sont excisés du gel, et après plusieurs étapes, les pro-
sérums de malades ayant une pathologie auto-immune permet de téines qu’ils contiennent sont protéolysées par une solution de
repérer les spots spécifiques des sérums de malades. Ce repérage trypsine. Les fragments trypsiques résultants sont alors extraits
peut éventuellement faire appel à des logiciels d’analyse d’image du morceau de gel, concentrés et dessalés avant d’être amenés en
et à des logiciels de traitement statistique. La reproductibilité de phase gazeuse pour l’analyse proprement dite par spectrométrie
l’électrophorèse bidimensionnelle a considérablement progressé de masse [18]. L’identification peut faire appel soit à une
ces dernières années, en particulier grâce à l’apport des immobi- recherche par homologie de masse, soit à une recherche par
lines®, couplage covalent entre l’acrylamide du gel et les ampho- homologie de séquence.
lytes assurant le gradient de pH dans les isoélectrofocalisations.
II/ IDENTIFICATION PAR HOMOLOGIE DE MASSE (Figure 2)
Figure 2/ Spectrométrie de type MALDI-TOF et identification par homologie de séquence.
A P P O R T D E L’ A N A LY S E S É R O L O G I Q U E D U P R O T É O M E
D A N S L’ I D E N T I F I C AT I O N D E S A U T O A N T I G È N E S
Les fragments de digestion trypsique sont cristallisés dans une est proportionnel à l’énergie cinétique acquise dans la première
matrice organique sur une plaque métallique. Ils sont désorbés de partie de l’analyseur ou règne un champ électrique, et donc au
cette matrice grâce à l’énergie d’un faisceau laser qui permet de rapport de la masse sur la charge du fragment trypsique. On obtient
les sublimer et de les ioniser (ionisation de type MALDI, matrix ainsi une liste des masses des produits de digestion trypsique de la
assisted laser desorption/ionisation). L’analyseur de masse associé protéine présente dans le spot d’intérêt. Cette liste de masses est
avec une source MALDI est le plus souvent un appareil de type comparée informatiquement à des listes de masses théoriques éta-
temps de vol (TOF, time of flight) qui apprécie le temps mis par les blies par simulation d’une digestion protéolytique de toutes les
fragments protéolytiques pour arriver à un détecteur. Ce temps protéines contenues dans les banques de données [7, 14].
III/ IDENTIFICATION PAR HOMOLOGIE DE SÉQUENCE (Figure 3)

Dans cette technique, les fragments de la digestion protéolytique des différents fragments sont analysées par un analyseur de type
sont ionisés par électronébulisation le plus souvent (technique TOF. La différence de masse entre deux fragments sera alors d’un
ESI, electrospray ionisation). Les ions moléculaires ainsi générés acide aminé, donnant accès au nom de cet acide aminé. On peut
entrent dans un premier analyseur où ils sont sélectionnés selon ainsi obtenir une courte séquence. Si cette séquence recouvre
leurs trajectoire, fonction du rapport masse sur charge. Ces ions plus de 5 à 6 acides aminés, elle permet l’identification de la
sélectionnés entrent ensuite dans une chambre de collision où ils protéine sélectionnée par recherche par homologie de séquence
sont fragmentés au niveau des liaisons peptidiques. Les masses protéique dans les banques de données [7, 14].
Figure 3/ Spectrométrie
tandem de type
ESI-Q-TOF et
identification par
homologie de masse.
IV/ AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DE L’ANALYSE SÉROLOGIQUE

DU PROTÉOME DANS L’IDENTIFICATION DES AUTOANTIGÈNES
L’identification des cibles antigéniques des autoAc a considérable- Cette approche technologique a cependant des limites. L’élec-
ment progressé ces quinze dernières années grâce en partie au trophorèse bidimensionnelle, préalable actuellement quasi incon-
développement de la technologie de l’ADN recombinant. Mais les tournable, ne permet souvent pas, dans des conditions techniques
ADNc utilisés dans les immunocriblages ne recouvrent pas forcé- standards, une migration satisfaisante des protéines de membranes
ment l’ADN in vivo, quant à la régulation ou au niveau d’expres- et des protéines très basiques. Alors qu’il existe dans le génome
sion des gènes. Il est maintenant établi qu’une séquence isolée environ 100 000 gènes et qu’une lignée cellulaire donnée en
d’ADNc ne préjuge pas du niveau d’expression de la protéine in exprime environ 10 000, une électrophorèse bidimensionnelle
vivo [9]. De plus, il existe de nombreuses modifications post- de bonne qualité ne sera à même de séparer que 1 500 protéines
traductionnelles pouvant être à l’origine d’isoformes et rentrant [8, 16]. Pour cibler les protéines d’intérêt, il est donc nécessaire
dans la composition de la structure épitopique. Ces modifications de réaliser une prépurification préalable, par exemple par un frac-
peuvent dépendre du vecteur d’expression. C’est du fait de ces res- tionnement cellulaire de bonne qualité. Il n’en reste pas moins
trictions que l’identification des autoAg par analyse protéomique vrai que seules les protéines de 10 à 300 kilodaltons seront
trouve toute son utilité, puisqu’elle permet d’identifier des pro- séparées sur gels de polyacrylamide. Par ailleurs, l’identification
téines telles qu’elles se présentent dans la cellule, à leur niveau par interrogation de banques de données ne peut être réalisée et
d’expression et avec leurs modifications post-traductionnelles. Il valide que si les protéines sont déjà connues et entrées dans les
pourrait ainsi être intéressant de valider les cibles de certains banques avec des séquences exactes, ce qui n’est pas toujours le
autoAc, comme les anticorps appelés anti-SS-A/Ro52 qui en fait cas. Les fractions cellulaires à la base de la préparation antigénique
ne réagissent pas avec la protéine native SS-A/Ro mais avec la doivent être répétées et les profils de migration reproductibles.
protéine TRIM21. Enfin, un regard critique doit être apporté sur les identifications
Cette technologie est encore peu usitée en auto-immunité mais a obtenues. L’analyse protéomique fournit des pistes de travail, mais
déjà permis d’identifier les cibles de différents autoAc, en particu- une validation des résultats, par utilisation d’Ag purifié par
lier dans l’hépatite auto-immune [2, 10], l’ostéoarthrite [22], la exemple, semble nécessaire.
polyarthrite rhumatoïde [17], la maladie cœliaque [20], des Cette technique ne peut que concourir à une connaissance précise
uvéites [19], l’encéphalopathie d’Hashimoto [15], le lupus [21], des cibles antigéniques dans le but d’améliorer le diagnostic
des stérilités auto-immunes [3, 4], la maladie de Behçet [11, 13], biologique à travers la création de nouveaux tests et de mieux
les cardiomyopathies avec Ac anti-M7 [5], la slérose en plaque [1], connaître la physiopathologie des maladies auto-immunes,
ainsi que dans des tumeurs où apparaissent des autoAc [12]. encore largement inconnue.
A P P O R T D E L’ A N A LY S E S É R O L O G I Q U E D U P R O T É O M E
D A N S L’ I D E N T I F I C AT I O N D E S A U T O A N T I G È N E S
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16 membres du GEAI
Association GEAI
CHU Hôpital Larrey
Laboratoire d’Immunologie et d’Immunopathologie
49033 ANGERS Cedex 01
Chantal ANDRÉ Bruno LARIDA
Vice-Présidente du GEAI Secrétaire du GEAI
CHU Henri Mondor BIO-RAD Laboratories
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Laboratoire d’Immunologie et d’Immunopathologie E.mail : moniersurf@aol.com
49033 ANGERS Cedex 01
Tél. : 02 41 35 47 89 ou 02 41 35 35 77 Françoise OKSMAN
Fax : 02 41 35 47 83 Hôpital Rangueil
E.mail : alchevailler@chu-angers.fr Laboratoire d’Immunologie
Avenue Jean-Poulhes - 31403 TOULOUSE Cedex 4
Pascale CHRÉTIEN Tél. : 05 61 32 34 25 (direct) ou 05 61 32 34 31 (sec)
CHI Fax : 05 61 32 34 30
Service Hématologie et Immunologie E.mail : oksman.f@chu-toulouse.fr
49, avenue de Verdun - 94000 CRÉTEIL Cedex
Tél. : 01 45 17 53 88 ou 01 45 17 53 33 (sec) Nils Olivier OLSSON
Fax : 01 45 17 53 49 CHU, Hôpital du Bocage
E.mail : pascale.chretien@chicreteil.fr Laboratoire d’Immunologie
2, bd du M.-de-Lattre-de-Tassigny - BP 77908 - 21079 DIJON Cedex
Andrée ESCANDE Tél. : 03 80 29 33 72 ou 03 80 29 32 26 (labo)
CHU Saint Éloi ou 03 80 29 30 31 (standard)
Laboratoire d’Immunologie Fax : 03 80 29 37 87
Avenue Bertin-Sens - 34295 MONTPELLIER Cedex
E.mail : nils.olsson@chu-dijon.fr
Tél. : 04 67 33 71 35 - Fax : 04 67 33 71 29
E.mail : a-escande@chu-montpellier.fr
Marielle SAN MARCO
Nicole FABIEN Hôpital de la Conception - Pavillon Cornil
Docteur Laboratoire d’Immunologie
CHU Lyon Sud 147, boulevard Baille - 13385 MARSEILLE Cedex 05
Laboratoire d’Auto-Immunité Tél. : 04 91 38 39 70 ou 04 91 38 39 08 ou 39 07 (sec)
Bât. 2A - Niveau 2 - 69495 PIERRE-BÉNITE Cedex Fax : 04 91 38 36 33
Tél. : 04 78 86 66 83 - Fax : 04 78 56 90 60 E.mail : msanmarco@mail.ap-hm.fr
E.mail : nicole.fabien@chu-lyon.fr
Jean SIBILIA
Joëlle GOETZ CHU Hautepierre
CHU Hautepierre Service Rhumatologie
Laboratoire d’Immunologie 67098 STRASBOURG
Avenue Molière - 67098 STRASBOURG Cedex Tél. : 03 88 12 79 53 ou 03 88 12 79 55
Tél. : 03 88 12 75 26 - Fax : 03 88 12 81 34 Fax : 03 88 12 81 50
E.mail : joelle.goetz@chru-strasbourg.fr E.mail : jean.sibilia@wanadoo.fr
René-Louis HUMBEL Marie-France TAILLEFER

Professeur Laboratoire BIOCENTRE
Laboratoire Luxembourgeois d’Immunopathologie
9, rue d’Hespel
L-4149 ESCH-SUR-ALZETTE
59910 BONDUES
Luxembourg
Tél. : 00 352 488 288 380 - Fax : 00 352 488 288 385 Tél. : 03 20 23 23 52 - Fax : 03 20 23 23 52
E.mail : rlhumbel@llip.lu E.mail : mftaillefer@nordnet.fr
Catherine JOHANET Laurent TESTE

CHU Saint-Antoine Secrétaire adjoint du GEAI
Laboratoire Central d’Immunologie BIO-RAD
184, faubourg St-Antoine - 75571 PARIS Cedex 12 3, bd R.-Poincaré - 92430 MARNES LA COQUETTE
Tél. : 01 49 28 20 11 - Fax : 01 49 28 22 92 Tél. : 01 47 95 62 56 - Fax : 01 47 95 62 20
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RÉDACTEUR EN CHEF : Jean-Claude MONIER - ÉQUIPE DE RÉDACTION : Chantal ANDRÉ, Alain CHEVAILLER, Pascale CHRÉTIEN, Andrée ESCANDE, Joëlle GOETZ, René-Louis HUMBEL,
Catherine JOHANET, Françoise OKSMAN, Nils Olivier OLSSON, Marielle SAN MARCO, Jean SIBILIA, Marie-France TAILLEFER
BIO-RAD, 3 bd R. Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette
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‘

Immunofluorescence indirecte. Joëlle GOETZ, Alain CHEVAILLER 1

Les méthodes de double immunodiffusion en milieu gélifié. Pascale CHRÉTIEN 5

Les radio-immunodosages ont-ils encore une place

Techniques ELISA en auto-immunité. Catherine JOHANET, Éric BALLOT 10

L’immunodot. René-Louis HUMBEL 12

Principe, avantages et inconvénients de la technique d’immunotransfert dans le cadre

Biopuces à autoantigènes pour la caractérisation des autoanticorps

La technologie Luminex® : application à la recherche des autoanticorps.

Apport de l’analyse sérologique du protéome dans l’identification

Liste des membres 32

L’immunofluorescence indirecte (IFI) représente la technique maîtresse de dépistage des autoanticorps

HISTORIQUE FACTEURS INFLUENÇANT L’IFI

Tableau 1 : Principaux autoanticorps ayant un intérêt clinique et détectés par IFI

EXAMEN COMPLÉMENTAIRE : MALADIES

[5] GOETZ J. [13] RENIER G, McILROY A, TANGUY-SCHMIDT A, NEDELLEC R,

Figure 1 / Schéma des réactions d’identité totale (1),

II/ L’ÉLECTROSYNÉRÈSE elle présente plus de difficultés techniques dans sa réalisation. En

Les radio-immunodosages ont-ils encore

Figure 1 / Immunodosage par compétition.

Figure 2 / Dosage « sandwich ».

Tableau 1 / Avantages et inconvénients liés à l’utilisation de traceurs isotopiques

Techniques ELISA en auto-immunité

Figure 1 / Détection d’Ac par ELISA indirect.

La plupart des AAc peuvent être caractérisés par cette technique

Figure 3 / ELISA indirect avec capture de l’Ag sous forme

III/ PROBLÈMES LIÉS À L’ELISA

III.2. IMMOBILISATION DES AG support. Certains constituants, agrégats d’IgG, Ig monoclonales,

[3] HUMBEL RL. [7] VAN WEEMAN BK, SCHUURS AH.

Tableau 2 / Fabricants et distributeurs de dots en France et en Belgique.

Principe, avantages et inconvénients

mide dehydrogenase (sous-unité E3). La PDH-E2 comprend 2 auto-

Figure 2 / Autoanticorps anti-mitochondries.

téines, alors que 50 % des sérums positifs ne réagissent pas avec

Figure 6 / Autoanticorps anti-filagrine.

L’antigène reconnu a un PM de 70 kDa. Ces autoanticorps sont

5. DÉTECTION DES AUTOANTICORPS ANTI-FILAGRINE

III.2. PUCES À ANTIGÈNES

[6] HAAB BB, DUNHAM MJ, BROWN PO.

PRINCIPE DE LA TECHNOLOGIE Pour permettre la détection simultanée de plusieurs analytes, il

[13] MOALIC V, MERCIER B, FEREC C. [17] TOZZOLI R, KODERMAZ G, TONUTTI E, BIZZARO N,

I/ PRINCIPES GÉNÉRAUX DE L’ANALYSE SÉROLOGIQUE DU PROTÉOME

Figure 1/ Identification d’autoAg par analyse sérologique du protéome. Principe général.

II/ IDENTIFICATION PAR HOMOLOGIE DE MASSE (Figure 2)

Figure 2/ Spectrométrie de type MALDI-TOF et identification par homologie de séquence.

III/ IDENTIFICATION PAR HOMOLOGIE DE SÉQUENCE (Figure 3)

IV/ AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DE L’ANALYSE SÉROLOGIQUE

René-Louis HUMBEL Marie-France TAILLEFER

Catherine JOHANET Laurent TESTE

GEAI ’info Parution bisannuelle

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