Colimetrie

COLIMÉTRIE
La colimétrie correspond aux méthodes de dénombrement des coliformes. Les techniques de

colimétrie ont pour objectif le dénombrement et, éventuellement, l’identification des coliformes
totaux, des coliformes thermotolérants (ou coliformes fécaux) ou d’Escherichia coli en particulier.
L’intérêt de ces manipulations est de déterminer pour le produit testé une contamination fécale et
d’en apprécier l’ampleur, car les coliformes sont des bactéries vivant principalement dans les
intestins.
De plus, les coliformes thermotolérants et Escherichia coli survivant difficilement hors de
l’intestin traduiront donc une contamination fécale récente.
• Témoins de contamination fécale
- Coliformes totaux
Un coliforme est une entérobactérie fermentant le lactose à 30 ou 37 °C avec production
de gaz.
-Coliformes thermotolérants
Un coliforme thermotolérant est une entérobactérie fermentant le lactose à 44 °C avec
production de gaz.
-Escherichia coli
Escherichia coli est une entérobactérie fermentant le lactose à 44 °C avec production de
gaz et produisant de l’indole à 44 °C.
• Principe de base des techniques de dénombrement
Tous les milieux utilisés contiennent du lactose. Les milieux liquides possèdent une cloche afin
de mettre en évidence la production de gaz. Un certain nombre de milieux utilisent des agents
sélectifs, inhibiteurs des bactéries Gram + : vert brillant, cristal violet, désoxycholate,… Des milieux
récents chromogènes permettent le dénombrement direct d’Escherichia coli par mise en évidence de
l’activité ß-glucuronidase.
• Dénombrement des coliformes
Le dénombrement des coliformes peut se faire, selon les produits, par des techniques en milieux
liquides ou solides. La démonstration de la nature « coliforme » n’est jamais parfaite mais le principal
est de suivre les normes permettant la standardisation des méthodes.
• En milieu liquide
-Milieu utilisé : BLBVB + cloche (Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant)
Ce milieu contient deux agents sélectifs : la bile (ou désoxycholate) et le vert brillant. Il
contient des peptones et du lactose (caractère biochimique). Il n’y a pas d’indicateur de pH. La
production de gaz se fait à partir de l’utilisation du lactose.
- Ensemencement
1 ml de chaque dilution est introduit dans un tube de BLBVB + cloche.
Homogénéiser l’inoculum afin qu’il se répartisse dans tout le tube, cloche comprise.
-Incubation 24 heures à 30°C.
-Lecture
Si un tube par dilution
La présence d’un trouble (culture) et la production de gaz dans la cloche (au moins 1/10 du
volume de la cloche) permet de conclure à la présence d’au moins un coliforme dans le ml d’inoculum
de la dilution testée. Si 2 ou 3 tubes par dilution on utilise la table de Mac Grady afin de déterminer
statistiquement la quantité de coliformes présents dans un mL
1
-En milieu solide
- Milieux utilisés : gélose au désoxycholate ou gélose VRBL
Ces deux milieux contiennent du désoxycholate qui inhibe les bactéries Gram +, du lactose
utilisé comme source de carbone et d’énergie et du rouge neutre (indicateur de pH permettant la
lecture du caractère « lactose » : colonies rouges lactose +).
Le milieu VRBL est plus sélectif du fait de la présence de cristal violet en plus du
désoxycholate.
-Ensemencement-incubation
Le dénombrement est réalisé dans la masse des milieux pré cités en double couche. Incubation
24 heures à 30/44°C.
-Lecture
Toutes les colonies rouges (lactose +) d’un diamètre minimum de 0,5 mm en 24 heures sont
considérés comme étant des coliformes.
• Escherichia coli : test de Mackensie

Le test de Mackensie permet un dénombrement d’Escherichia coli après avoir dénombré les
coliformes totaux en milieu liquide (BLBVB à 30 ou 37°C). Il utilise la propriété d’Escherichia coli
de produire de l’indole à 44°C et de fermenter le lactose à 44°C.
- Milieux utilisés
• Un tube de BLBVB
• Un tube d’eau peptonée
-Ensemencement
Pour chaque tube positif où l’on soupçonne la présence de coliformes en BLVB, on prélève
une anse de culture que l’on reporte dans un BLBVB et dans une eau peptonée.
-Incubation
24 à 48 h à 44°C
- Lecture
Le résultat se rapportera au tube initial. Le tube BLBVB est positif s’il présente un trouble et
que la cloche présente du gaz (au moins un 1/10 du volume de la cloche).
La lecture du caractère « indole » s’effectue après ajout du réactif de Kovacs : la présence
d’un anneau rouge permet de conclure à « indole + ».
• Isolement et identification des coliformes

- Isolement des coliformes
-Milieu utilisé : EMB (éosine – bleu de méthylène)
Ce milieu ne contient pas d’agents sélectifs très puissants (éosine et bleu de méthylène ne font
qu’inhiber partiellement la culture des Gram +) ni d’indicateur de pH.
-Ensemencement
Isoler classiquement à partir d’un tube de BLBVB positif ou à partir d’un bouillon contenant
des coliformes présumés.
- Incubation
24 à 48 h à 37°C.
2
-Lecture
Genres bactériens Aspect obtenu

probables
Colonies de 2 à 3 mm de
diamètre, plates, violet très
E. coli
foncé, avec très souvent un
reflet métallique
Colonies grosses de 4 à 6
mm de diamètre,
Klebsiella convexes, roses avec un
centre violet, muqueuses
Citrobacter Colonies violet pâle avec un
centre et un reflet métallique
peu marqué
Autres bacilles Gram – Petites colonies grises…….
• Identification
Les principaux genres appartenant aux coliformes sont :
• Escherichia
• Citrobacter
• Klebsiella
• Enterobacter
Test IMViC (Indole – rouge de Méthyle – Voges Proskauer – Citrate)

Ce test classique de microbiologie alimentaire ne permet pas une identification très précise
mais il est relativement peu coûteux (ensemencement d’une eau peptonée, d’un Clark et Lubs et d’un
Citrate de Simmons).
Le tableau suivant permet de donner une conclusion approximative :
Indole RM VP Citrate Genre ou

espèce
+ + – – Escherichia
(parfois – pour E. coli coli
atypique)
– + – + Citrobacter
(parfois + pour
Citrobacter atypique)
– – + + Enterobacter
(parfois + pour ou
Enterobacter Klebsiella
atypique)

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La colimétrie correspond aux méthodes de dénombrement des coliformes. Les techniques de

• Escherichia coli : test de Mackensie

• Isolement et identification des coliformes

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Test IMViC (Indole – rouge de Méthyle – Voges Proskauer – Citrate)

Indole RM VP Citrate Genre ou

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