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THESE
Présentée à
L’Université Abdelhamid Ibn Badis-Mostaganem
Spécialité : Nutrition et santé
Dédicaces
Mérièm
M.Mokhtar.(2015). Identification et propriétés biologiques des principes actifs du piment (Capsicum annuum L). Thèse de Doctorat en Sciences, Univ. Mostaganem
Avant-propos
Avant-propos
M.Mokhtar.(2015). Identification et propriétés biologiques des principes actifs du piment (Capsicum annuum L). Thèse de Doctorat en Sciences, Univ. Mostaganem
Mokhtar Mérièm
Avant-propos
M.Mokhtar.(2015). Identification et propriétés biologiques des principes actifs du piment (Capsicum annuum L). Thèse de Doctorat en Sciences, Univ. Mostaganem
ºC : Degré Celsius
AA : Acide acétique
ACN : Acetonitrile
AT3: Acyltransférase 3
C : Coumarine
Cap: Capsaïcine
Car : Caroténoïdes
Chl : Chlorophylle
DHC: Dihydrocapsaïcine
DMSO: Diméthylsulfoxyde
DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
EP : Extrait phénolique
EtOH: Ethanol
g: Gramme
h : Heure.
hn : énergie lumineuse
IR : Infrarouge
K : Kaempférol
kg : kilogramme
L : Litre
MH : Mueller Hinton
MeOH : Méthanol
mg : Milligramme
min : Minute
ml : Millilitre
mm : Millimètre
mM : Millimole
MP : Macular Pigment
N : Narangine
NK : Natural Killer
nm: Nanomètre
NO : Monoxyde d’azote
OH : Ion hydroxyde.
Pun1 : Pungency1
Q : Quercétine
R : Rutine
Rt : Temps de Rétention
Te : Trolox equivalent
TG : Triglycérides
TPTZ : 2,4,6-Tripyridyl-s-Triazine
µL: Microlitre
µm: Micromètre
UV : Ultraviolet
V/V: Volume/Volume
Tableau 11 : Diamètres des zones d’inhibition (mm) obtenus avec les différentes souches….. 87
Tableau 14: Etude de la synergie entre l’acide caféique et le Kaempférol contre S. aureus.. 100
Tableau 15 : Etude de la synergie entre l’acide caféique et la quercétine contre S. aureus… 101
Tableau 17 : Etude de la synergie entre l’acide caféique et le kaempférol contre P.aeruginosa 105
Tableau 18 : Etude de la synergie entre l’acide caféique et la quercétine contre P. aeruginosa 106
Figure 7: Quelques stilbènes retrouvés dans les tissus des arbres (Stevanovic et Perrin, 2009) 13
Figure 10: Structure des flavonoïdes (aglycones) et position des principaux substituants
(Stoclet et Chini-Kerth, 2011).… ............................................................................ 16
Figure 20: Chromatogrammes de capsaicinoïdes obtenus avec (A) : Méthanol, (B) : Éthanol,
(C) : Acétone, (D) : Isopropanol, (E): Acétate d’éthyle, (F) : Acétonitrile.…..... 49
Figure 21: Influence d’addition de différentes concentrations d’eau dans le solvant sur
l’extraction des capsaicinoïdes .………………………........................................... 50
Figure 25: Séparation des standards de polyphénols avec (A) : phase mobile A : H2O, phase
mobile B : MeOH ; (B) : phase mobile A : H2O, phase mobile B : ACN.……....... 61
Figure 26: Séparation des standards de polyphénols avec (A) : phase mobile A : H2O, phase
mobile B : ACN ; (B) : phase mobile A : H2O + AF, phase mobile B : ACN+ AF ;
(C) : phase mobile A : H2O + AA, phase mobile B : ACN+ AA……………….. 62
Figure 27: Séparation des standards de polyphénols avec (A) : C18 15x2.1; 2.7 um ; (B) : C18
15x4.6; 2.7 um ; (C) : RP-Amide C18 15x2.1, 2.7 um.…............................................ 65
Figure 28: Ordre d’élution (A) : C18,15x4.6; 2.7 um, (B) : RP-Amide C18,15x2.1, 2.7 um........... 66
Figure 29: Séparation des standards phénoliques avec colonne RP-Amide C18 15x2.1, 2.7 um
et méthanol comme modificateur organique.…........................................................ 67
Figure 30: Le profil phénolique du piment (Capsicum annuum L.) par HPLC-DAD-ESI-MS…… 69
Figure 34: Séparation des caroténoïdes de piment par (A) : C18 ; (B) : C30.…............................ 78
Figure 46: Cytotoxicité des polyphénols (A), capsaicinoïdes (B) et caroténoïdes (C) du piment…. 108
Résumé
Résumé
M.Mokhtar.(2015). Identification et propriétés biologiques des principes actifs du piment (Capsicum annuum L). Thèse de Doctorat en Sciences, Univ. Mostaganem
Abstract
The aim of this study was to determine the chemical composition of pepper and
evaluate its biological properties. The profile of polyphenols was determined with a
developed LC-MS method, the derivatives of quercetin, kaempferol and rutin ( 113.46, 30.86
and 18.30 µg/g respectively) were the major compounds. For the study of capsaicinoïds, an
extraction method was optimized. After identification, it appeared that capsaïcin and
dihydrocapsaïcin represent 59.83% and 33.12% of the total capsaicinoïds. The placenta was
the major site of capsaicinoïds followed by seeds then the pericarp. After identification of
carotenoids of peppers, lutein was found to represent 54.40% of total carotenoids (13.42
µg/g), Zeaxanthin (17.53%; 4.32 µg/g) and b-carotene (17.03%; 4.20 µg/g). The antioxidant
activity of the three extracts (polyphenols, capsaicinoïds and carotenoids) was evaluated with
DPPH, ABTS and FRAP tests. According to the results, carotenoids are the most powerful
antioxidants compared to polyphenols and capsaicinoïds (2.78, 0.052 and 0.050 mM Te/g),
(3.379, 0.069 and 0.065 mM Te/g) and (5.885, 0.109 and 0.094 mmol Fe2+ e/g) respectively.
The antimicrobial activity of the polyphenols, capsaicinoïds and the main identified
compounds was investigated. Caffeic acid, quercetin and kaempferol were the most actives
with MICS values range of (0.25-2 mg/ml), (0.00195-0.5 mg/ml) and (0.0078- 0.25 mg/ml)
respectively. In order to see if a possible synergy exists between these phenolic compounds,
the FIC index was calculated with a gram positive strain Staphylococcus aureus ATCC
6538P and another gram negative Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. The best
combination for S. aureus was caffeic acid and quercetin (FIC=0.37), quercetin and
kaempferol for P. aeruginosa (FIC=0.31). The cytotoxicity of the polyhenols, capsaicinoïds
and carotenoids of pepper was evaluated against PBMCs and U937 cell lines. The carotenoids
had the highest antitumoral effect with a decrease of 41.74% of U937 at only a concentration
of 25 μg/mL, but the phenolic extract had the most selective effect.
Abstract
M.Mokhtar.(2015). Identification et propriétés biologiques des principes actifs du piment (Capsicum annuum L). Thèse de Doctorat en Sciences, Univ. Mostaganem
Dédicace
Avant propos
Résumé
ABSTRACT
Introduction…………………………………………………………………………… 1
- Traitement de la douleur………………………………………………………. 9
- Capsaicinoïdes et cancer……………………………………………………… 9
- Les tanins……………………………………………………………………... 14
- Les flavonoïdes……………………………………………………………… 15
- Propriétés antioxydantes…………………………………………………….. 17
- Propriétés antimicrobiennes…………………………………………………. 18
- Polyphénols et cancer……………………………………………………….. 20
- Caroténoïdes et vision……………………………………………………….. 24
- Caroténoïdes et cancer……………………………………………………….. 26
II.1. 6. Rendement……………………………………………………………………….. 29
II.3.6. Rendement………………………………………………………………………… 38
II.5.2.4. Etude de la synergie d’action des substances actives contenues dans les
extraits de piment………………………………………………………………………….. 41
III.2.4. Rendement………………………………………………………………………. 75
Conclusion………………………………………………………………………………….. 113
Publication
Introduction
Au cours des dernières années, beaucoup de recherches ont été menées sur les
substances naturelles en vue d’exploiter leurs propriétés biologiques dans des domaines divers
tels que l’industrie pharmaceutique, agro-alimentaire ou encore cosmétique. Ces efforts de
recherche ont été déployés pour répondre à la méfiance, de plus en plus grandissante, des
consommateurs vis-à-vis des molécules de synthèse chimique utilisées à l’échelle industrielle
par les acteurs de ces filières.
Les plantes constituent une source très riche en molécules bioactives dont l'usage
traditionnel et médical est connu depuis bien longtemps. Parmi ces substances naturelles, les
métabolites secondaires comme les composés phénoliques, les alcaloïdes et les caroténoïdes
sont connus pour leurs bienfaits sur la santé.
Parmi ces plantes il y a le piment qui appartient au genre Capsicum et à la famille des
Solanacées. Ce genre comporte plus de 200 variétés regroupées en plus de 30 espèces, dont
cinq sont domestiqués: C. pubescens, C. baccatum, C. annuum, C. chinense et C. frutescens
(Lopez-Hernandez et al., 1996; González-Zamora et al., 2015).
Introduction
M.Mokhtar.(2015). Identification et propriétés biologiques des principes actifs du piment (Capsicum annuum L.). Thèse de Doctorat en Sciences, Univ. Mostaganem 2
des composés d’intérêt ; toutes guidées par des analyses phytochimiques et des tests
biologiques. Chacune de ces étapes rencontre des défis techniques, liés d’une part à la faible
concentration des molécules recherchées, et d’autre part à la complexité du mélange.
L’objectif de cette thèse est d’identifier les substances actives du piment (Capsicum
annuum L.) appartenant à la famille des polyphénols, caroténoïdes et des capsaicinoïdes et
l’évaluation de leurs potentielles propriétés biologiques.
Dans un premier temps, une méthode d’extraction des capsaicinoïdes a été optimisée,
avant qu’ils soient identifiés et quantifiés dans chaque tissu du piment par des méthodes
chromatographiques. Dans un deuxième temps, une méthode a été développée pour la
séparation et l’identification des composés phénoliques avec LC-MS. Cette méthode nous a
permis l’identification et la quantification des acides phénoliques et des flavonoïdes du
piment. Une autre famille importante de métabolites secondaires est représentée par les
caroténoïdes qui sont dotés d’une grande activité antioxydante. Les caroténoïdes du piment
ont été, également identifiés et quantifiés. Dans un troisième temps, les propriétés biologiques
de ces trois familles ont été étudiées.
La première partie de cette thèse présente une revue de la littérature sur la structure,
les propriétés chimiques et biologiques des capsaicinoïdes, polyphénols et des caroténoïdes.
La seconde partie décrit les techniques expérimentales utilisées au cours de ce travail. Enfin,
les résultats obtenus au cours de cette thèse sont présentés et discutés dans la troisième partie.
Introduction
Chapitre I : Le piment :
Composition et intérêts santé
M.Mokhtar.(2015). Identification et propriétés biologiques des principes actifs du piment (Capsicum annuum L). Thèse de Doctorat en Sciences, Univ. Mostaganem 3
Il comporte plus de 200 variétés regroupées en plus de 30 espèces, dont cinq sont
domestiqués: C. pubescens, C. baccatum, C. annuum, C. chinense et C. frutescens (Lopez-
Hernandez et al., 1996; González-Zamora et al., 2015). Capsicum annuum est l'espèce la
plus cultivée dans le monde, elle comporte beaucoup de variétés allant des plus douces aux
plus fortes (Kumar et al., 2009).
Cette espèce est cultivée principalement dans les états du sud des États-Unis
(notamment la Californie), le sud de l'Europe (plus particulièrement la Hongrie, l'Espagne,
l'Italie, l'ex-Yougoslavie, la Bulgarie et la Roumanie), ainsi que le Nord d’Afrique,
l'Amérique centrale et le Brésil (Lefebvre et al., 2002; Teuscher et al., 2005).
Règne: Plantae
Division: Magnoliophyta
Classe: Magnoliopsida
Ordre: Solanales
Bosland et Votava (2000) rapportent que le niveau d’âcreté des piments dépend de
la génétique de la plante et des facteurs environnementaux. La concentration de capsaïcine
change selon la variété de piment, l’origine géographique et les conditions climatiques
sous lesquelles les piments sont cultivés. La capsaïcine est aussi disponible sous forme
synthétique (Jolicoeur, 2001; Garcs-Claver et al., 2007).
La capsaïcine est le principe actif principal présent dans le fruit de plusieurs variétés
de Capsicum : poivron, paprika, chili, piment fort, etc.… (Bosland et Votava, 2000). C’est
une amide de formule : 8-méthyle N-vanillyle 6-nonénamide qui appartient à la famille des
capsaicinoïdes, des alcaloïdes responsables de la saveur piquante des piments forts (fig. 2)
(De, 2003; Ornelas-Paza et al., 2010 ; Ricard et al., 2013). Toute variation dans la structure
chimique des capsaicinoïdes, y compris la structure du fragment acyle, affecte le degré et
le niveau de l'âcreté (Wang, 2011 ; Wahyuni et al., 2013).
La plupart des capsaicinoïdes sont piquants, mais il existe aussi des substances non
piquantes comme l’ω-hydroxycapsaïcine (Ochi et al., 2003; Wahyuni et al., 2013). En
outre, un autre groupe de capsaicinoïdes, non piquants, nommés capsinoïdes, a été retrouvé
dans le piment doux C. annuum CH-19 (Kobata et al., 1998).
Les capsinoïdes ont la même structure que les capsaicinoïdes, sauf qu’ils ont un
ester à la place de la fonction amide (fig.3). Selon la structure de leur fragment d'acide
gras, ces analogues ont été classés en capsiate, dihydrocapsiate et nordihydrocapsiate
(Eich, 2008).
Les capsaicinoïdes sont solubles dans les solvants organiques polaires comme le
chloroforme, l’acétone, l’acétate d'éthyle, le chlorure de méthylène, le méthanol, l’éthanol,
l’acétonitrile et autres (fig.4) (Duarte et al., 2004; Santamaria et al., 2000 ; Juangsamoot et
al., 2012).
La capsaïcine est une substance cristalline, non volatile, incolore et inodore d’une
masse moléculaire de 305,46 g/mol et une température de fusion de 62 à 65 ºC (Reyes-
Escogido et al., 2011). En raison de la présence de la chaîne latérale hydrophobe, la
capsaïcine est lipophile, et par conséquent, très soluble dans la graisse, l'huile et l'alcool
(Reyes-Escogido et al., 2011 ; Amruthraj et al., 2015). Cette molécule a un spectre
d’absorption maximale à 230 et 280 nm (Chen et al., 2013).
Les capsaicinoïdes sont des alcaloïdes possédants des activités biologiques très
intéressantes.
- Traitement de la douleur
- Capsaicinoïdes et cancer
Plusieurs études ont montré que la capsaïcine retarde la prise de poids corporel chez
le rat par l'augmentation de la thermogenèse dans le tissu adipeux blanc grâce à
l'amélioration de la sécrétion de catécholamines, la stimulation de la lipomobilisation,
l'abaissement de la triglycéridémie, et la réduction de la consommation d'énergie en
augmentant l'activité du système nerveux sympathique, plutôt que l'aversion gustative (Joo
et al., 2010; Mun et al., 2014).
Dans une autre étude, la capsaïcine administrée en capsules à des sujets présentant
une surcharge pondérale modérée a aidé à augmenter leur satiété ainsi qu’à diminuer leurs
apports caloriques et de matière grasse (Westerterp-Plantenga. et al., 2005 ; Borys et al.,
2012). Selon Date et al. (2002), l’administration de la capsaïcine favoriserait la perte de
poids en réduisant la sécrétion d’une hormone orexigène, la ghréline.
l'activité des facteurs de coagulation VIII et IX (Adams et al., 2009), une propriété qui peut
contribuer à la prévention de l'apparition et / ou la réduction de l'incidence des maladies
cardio-vasculaires ( Luo et al., 2011) .
Les plantes sont connues pour produire un grand nombre de composés à faible
poids moléculaire dont la structure ne fut que récemment déterminée ; et ceci malgré leur
Jusqu'à présent, la plupart des études réalisées sur le piment ont été consacrées à
l'analyse des capsaicinoïdes, qui sont responsables de l’âcreté de ce fruit, mais peu de
recherches ont été menées sur le profil phénolique.
Plusieurs auteurs ont rapporté que le piment est une source très riche en
polyphénols (Marin et al., 2004 ; Materska et Perucka, 2005 ; Wahyuni et al., 2011 ;
Materska, 2014). Parmi ces composées, les acides hydroxycinnamiques (acide trans-
ferulique et trans-sinapique) et les flavonoïdes (quercétine, lutéoline et apigénine sous leurs
formes glycosides) sont les plus représentés (Marin et al., 2004 ; Materska et Perucka,
2005). Le contenu en polyphénols varie selon la variété et la maturité du piment. Le taux
des flavonoïdes varie de 1 à 852 mg/kg dans les différents types de piment en fonction des
facteurs génétiques de la plante et des conditions environnementales (Lee et al., 1995).
Il existe plus de 8000 composés phénoliques classés en plusieurs classes dont les
plus représentatives sont celles des acides phénoliques et des flavonoïdes (fig.6) (Robards
et al., 1999).
Les acides phénoliques les plus courants ne sont pas présents dans les plantes à
l’état libre, mais plutôt sous forme d’esters de glucose, d’acide tartrique ou d’acide
quinique (Herrmann, 1989 ; Vauzour, 2014). L’acide caféique est l’acide phénolique le
plus abondant et existe principalement sous forme d’ester quinique (e.g. acide
chlorogénique) que l’on retrouve principalement dans les myrtilles, les kiwis, les prunes,
les pommes et le café (Macheix et Fleuriet, 1998; Manach et al., 2004; Grigoras, 2012;
Vauzour, 2014).
- Les stilbènes
un squelette C6-C2-C6, forme la famille des stilbénoïdes (fig.7) (Shibutani et al., 2004;
Stevanovic et Perrin, 2009; Vauzour, 2014).
Figure 7 : Quelques stilbènes retrouvés dans les tissus des arbres (Stevanovic et Perrin, 2009).
- Les lignanes
- Les coumarines
Les coumarines sont des hétérocycles oxygénés ayant comme structure de base le
benzo-2-pyrone (fig.9). Ils ont été isolés pour la première fois par Vogel en 1820 dans le
Coumarouna odorata. Aujourd’hui, prés de 1000 composés coumariniques sont isolés dans
plus de 800 espèces de plantes et dans les microorganismes.
Dans les plantes, on les rencontre chez les Apiacées, les Astéracées, les Fabacées,
les Rosacées, les Rubiacées, les Rutacées et les Solanacées. Du point de vue structural, ils
sont classés en coumarines simples avec des substituants sur le cycle du benzène,
furanocoumarines, pyranocoumarines, et en coumarines substitués en position 3 et/ou 4. Le
dernier groupe serait celui des dimères (Sakagami et al., 2005 ; Muanda, 2010).
- Les tanins
- Tanins hydrolysables : ils sont constitués par une molécule de sucre (le glucose le plus
souvent) estérifiée par l’acide gallique ou l’un de ses dérivés (acide ellagique, chébulique
ou valonique). Ils sont facilement hydrolysables par voie chimique ou enzymatique.
- Les flavonoïdes
Les flavonoïdes sont les composés polyphénoliques les plus abondants contenus
dans les végétaux. Leur structure comprend un squelette composé de deux cycles
aromatiques (A et B) porteurs de plusieurs fonctions phénol et réunis par une chaîne de
trois atomes de carbone ; ces derniers étant le plus souvent engagés dans un hétérocycle
avec un atome d’oxygène (Stoclet et Schini-Kerth, 2011).
Il existe dans les aliments plusieurs centaines de polyphénols (plus de 500 y ont été
caractérisés aujourd’hui), principalement des flavonoïdes (Scalbert et Williamson, 2000 ;
Manach et al., 2004 ; Stoclet et Schini-Kerth, 2011). Ce sont des pigments quasiment
universels des végétaux qui sont en partie responsables de la coloration des fleurs, des
fruits et parfois des feuilles. On les trouve dissous dans la vacuole des cellules à l'état
d'hétérosides ou comme constituants de plastes particuliers, les chromoplastes. Dans les
aliments, ils sont souvent présents sous forme d’hétérosides (Guignard, 1996).
•Les flavonols (par ex. kaempférol, quercétine), qui sont abondants dans les oignons, les
poireaux et le brocoli.
•Les flavones (par ex. apigénine, lutéoline), qui sont retrouvés dans le persil et le céleri
•Les isoflavones (par ex. daidzéine, génistéine), majoritaires dans les produits issus du soja
•Les flavanones (par ex. hespérétine, naringénine), qui sont particulièrement abondants
dans les agrumes et les tomates
•Les anthocyanes (par ex. pélargonidine, cyanidine, malvidine), dont les sources incluent le
vin rouge et les baies.
Figure 10 : Structure des flavonoïdes (aglycones) et position des principaux substituants (Stoclet
et Schini-Kerth, 2011).
Comme l'ensemble des dérivés hydroxylés, les phénols sont des molécules
associées par des liaisons hydrogène, donc peu volatiles (Simirgiotis et Schmeda-
Hirschmann, 2010 ; Petigny et al., 2014) . Les groupements OH en position para et ortho
des noyaux phénoliques de polyphénols présentent un caractère acide renforcé, ce qui
permet une dissociation au moins partielle à pH neutre. Les propriétés chimiques des
polyphénols sont essentiellement liées à celles des noyaux phénoliques, particulièrement
des substituants à effet mésomère attracteur d’électrons (- M) et substituants à effet
mésomère donneur (+M) (Dangles, 1999).
La solubilité des flavonoïdes dans l’eau et dans des solvants très apolaires est faible
et dépendante du pH. En effet, à un pH 1.5, la solubilité dans l’eau de l’hesperitine et de la
naringénine est respectivement de 6 et de 25 mg/L, alors qu’à un pH 8 la solubilité est
quatre fois plus élevée. D’autre part, la solubilité de la rutine, de la naringine et de la
quercétine dans l’eau à 20°C est respectivement de l’ordre de 125 mg/L, 0,5 g/L et < 10
mg/L (13, 14). Benavente-Garcia et al. (2001) ont évalué la solubilité de la néohespéridine
dihydrochalcone dans différents mélanges eau/éthanol. La solubilité de ce composé à 20°C
dans l’eau, l’éthanol et le mélange eau/éthanol (1/1) est respectivement de 0,4 g/L, 12 g/L
et 123 g/L (Anthoni, 2007).
Les composés phénoliques sont dotés d’un grand nombre de propriétés biologiques qui
sont exploitées dans de nombreux domaines thérapeutiques et pharmaceutiques (fig.11).
- Propriétés antioxydantes
Historiquement, les actions biologiques des polyphénols ont été attribuées à leurs
propriétés antioxydantes, que ce soit par leur capacité réductrice intrinsèque ou par leur
influence sur le statut redox intracellulaire (Visioli et al., 1998 ; Halliwell , 2006). Les
polyphénols, et, en particulier, les flavonoïdes sont d’excellents piégeurs d’espèces
réactives directement issues de l’oxygène (O2•, HO•, NO•, H2O2, HOCl, RO• et ROO•)
provenant de biomolécules telles que les lipoprotéines, les protéines et les acides
oligonucléiques (ADN, ARN). Cette faculté, tant étudiée et si reconnue, est fréquemment
citée comme étant une clé pour la prévention et/ou la réduction du stress oxydatif en lien
- Propriétés antimicrobiennes
L’effet bénéfique des polyphénols sur la santé cardiovasculaire a été attribué en partie
à leur effet direct sur les vaisseaux sanguins et plus particulièrement sur l’endothélium. En
effet, des études expérimentales et cliniques ont révélé que les polyphénols sont capables
d’augmenter la formation endothéliale de facteurs vasoprotecteurs comme le monoxyde
d’azote (NO), un puissant vasodilatateur et un inhibiteur de réponses pro-inflammatoires et
- Polyphénols et cancer
Plusieurs études menées in vitro sur des lignées de cellules cancéreuses (Yang et
al., 2010 ; Tabaczar et al., 2014 ; Pan et al., 2015 ; Pavan et al., 2015) ou in vivo à l'aide de
modèles animaux (Lee et al., 2006 ; Alonso-Castro et al., 2013 ; Thangavel et Vaiyapuri
2013) ont rapporté que les composés phénoliques possèdent une activité anti-carcinogène.
Les flavonoïdes ont montré des effets protecteurs contre les cancers de la prostate, du
côlon et du poumon (Duthie, 2000 ; Nkhili, 2009).
Le terme caroténoïde dérive de "Daucus Carota" qui est le nom latin de la carotte,
de laquelle le β-carotène fut extrait et isolé, pour la première fois, en 1831 par
Wackenroder. Plus de 700 membres de cette famille sont aujourd’hui connus et la
structure chimique de 500 d'entre eux est pleinement élucidée (Britton, 2004 ; Reynaud,
2009) (tableau 2).
Ils sont synthétisés et localisés dans les chromoplastes (organites dérivés des
chloroplastes lors du murissement des fruits), au niveau de diverses structures : des
gouttelettes lipidiques sphériques, les plastoglobules (où, à de fortes concentrations, les
caroténoïdes cristallisent) et des chromoplastes tubulaires (dans lesquels se trouvent des
superstructures de caroténoïdes, dont des esters de xanthophylles).
Les caroténoïdes sont insolubles dans l’eau et solubles dans les solvants apolaires et
également dans les graisses alimentaires. Toutefois, lorsque ces caroténoïdes sont associés
à des chloroplastes, leur solubilité dans l'eau est plus élevée, en raison de leur association
avec des lipoprotéines (Van Boekel et al., 2010). De par leur caractère fortement
hydrophobe, les caroténoïdes ont tendance a s’agréger et à cristalliser, en particulier dans
des milieux aqueux (Kohn et al., 2008).
- Caroténoïdes et vision
Les caroténoïdes, grâce à leurs longue chaîne polyinsaturée, sont de bons piégeurs
de radicaux libres ; leur pouvoir réducteur (antioxydant) est, par contre, beaucoup moins
évident puisqu'ils ne portent pas de groupement réducteur et ne sont pas des donneurs
d'électrons. À propos des caroténoïdes, le terme d'antioxydant ne paraît donc pas approprié,
on devrait plutôt parler de pouvoir anti-radicalaire, ou mieux encore, de pouvoir anti-
espèces activées (Faure et al., 1999 ; Cutting, 2008 ; Mata-Gómez et al., 2014) .
Les caroténoïdes sont particulièrement efficaces contre 1O2. Di Mascio et al. (1992)
ont calculé des constantes de réaction entre les caroténoïdes biologiques et 1O2. Le
lycopène est le plus actif suivi par la canthaxanthine et le β-carotène. L'activité anti-
1
O2 dépend du nombre de doubles liaisons, de l'extrémité cyclique ou non et des
substituants sur les cycles (Stahl et Sies, 1996 ; Gerster, 1997). Ce processus physique
laisse intactes les molécules de caroténoïdes qui peuvent donc intervenir dans plusieurs
cycles successifs de captation de 1O2.
Les caroténoïdes n'agissent non seulement sur 1O2 ; mais aussi sur les
radicaux *NO2, thiyl et sulfonyl (Everett al., 1996 ; Mortensen et al., 1997). Woodall et
al. (1997) notent que les caroténoïdes sont diversement sensibles aux radicaux libres
(formés par une réaction de Fenton modifiée ou aux radicaux peroxyles). En fonction des
conditions expérimentales, les auteurs classent la réactivité des caroténoïdes dans l'ordre
décroissant suivant : lycopène > β-carotène > zéaxanthine > échinénone, isozéaxanthine >
astaxanthine, canthaxanthine.
- Caroténoïdes et cancer
Selon la littérature, deux solvants peuvent être utilisés comme phase mobile pour
l’analyse chromatographique des capsaicinoïdes, le méthanol et l’acétonitrile. Des essais
chromatographiques ont été effectués au préalable pour dégager le meilleur solvant mobile
dans les conditions présentées dans le tableau 3.
L'extraction est influencée par plusieurs facteurs tels que la méthode d’extraction, le
solvant, le pH, la température, le rapport poids de matière / volume du solvant et les
intervalles de temps.
Débit 1 mL/min
Gradient 60% B
Volume injecté 2 µL
Différents temps (20, 40 et 60 min) et températures (50, 75, 100 et 120 ºC)
d’extraction ont été testés en présence du solvant et du pourcentage d’eau sélectionnés.
II.1. 6. Rendement
Les solvants utilisés dans cette étude (méthanol, acétonitrile et l’acétate d’éthyle)
proviennent de Sigma-Aldrich (Germany) ; alors que l’eau, l’acide acétique et l’acide
formique ont été fournis par Riedel De Haën (Seelze, Germany). Les formules chimiques
des standards utilisés sont représentées dans la figure 18.
Dans le but d’optimiser la méthode HPLC, des solutions mères d’une concentration
égale à 1000 ppm de chacun des standards (cités précédemment) ont été utilisées pour
préparer une solution à une concentration finale de 78 ppm de chaque standard.
Le piment utilisé dans cette étude a été acheté du marché de Mostaganem (Algérie).
L’extraction des polyphénols a été effectuée à l’obscurité selon la méthode d’Arnnok et al.
(2012) avec quelques modifications. 2g de piment broyé a été mis en contact avec 50 mL
d’un mélange d’HCl 0.05% (V/V) et de solvant (3 types de solvants ont été testés :
méthanol, acétate d’éthyle et le mélange des deux) (10V/90V) dans un sonicateur pendant
30 min. Après quoi, l’extrait a été filtré sur papier Whatman (No. Z146374-100EA).
L’extraction a été répétée deux fois, et les deux extraits ont été réunis pour éliminer les
solvants par évaporation à 40°C au rotavapor. Après évaporation, les polyphénols ont été
solubilisés dans 2 ml de méthanol et filtrés avec un microfiltre de 0.45 µm pour éliminer
toute impureté.
Rutine Daphnétine
Le taux des flavonoïdes totaux a été estimé selon la méthode de Dowd adaptée par
Arvouet-Grand et al., (1994). Elle se base sur les propriétés chélatrices de l’ion aluminium.
500 µL de chaque extrait ont été mélangés avec le même volume du chlorure d’aluminium
à 2% (P/V). Après 10 min de réaction, l’absorbance a été mesurée à 415 nm contre un
blanc qui contient l’échantillon sans le chlorure d’aluminium. Le taux des flavonoïdes,
exprimé par mg d’équivalent de quercétine / g d’extrait, a été obtenu par extrapolation des
mesures sur une droite étalon de différentes concentrations de quercétine.
colonne, les divers composés de l’échantillon sont séparés l’un de l’autre en raison de leurs
diverses affinités à l’égard des deux phases – stationnaire et mobile. A la sortie de la
colonne les composés sont détectés à l’aide d’un détecteur (pouvant être UV, IR)
(Penchev, 2010).
Les analyses ont été réalisés à l’aide d’une HPLC-DAD-ESI-MS (Kyoto, Japan)
composé de deux pompes LC-20ADxr, un auto-échantillonneur SIL-20ACxr, un four
CTO-20AC, un détecteur SPD-M20A PDA et un système contrôleur CBM-20A, couplé à
un spectromètre de masse avec une source ESI (electrospray ionization) MS-2020
(Shimadzu, Kyoto, Japon). Les polyphénols ont été identifiés selon le temps de rétention,
le système de détection PDA, la spectrométrie de masse et la littérature. La quantification
de chaque composé a été déterminée en utilisant les courbes d’étalonnages des standards.
Volume injecté 5 uL
- Ascentis Express C18 15x2.1, 2.7 µm (USWM002260) (Supelco, Bellefonte, PA, USA);
débit = 0.5 mL/min
- Ascentis Express C18 15x4.6, 2.7 µm (USHW005381) (Supelco, Bellefonte, PA, USA);
débit = 1.0 mL/min
Après l’optimisation des conditions d’analyse HPLC pour assurer une meilleure
séparation des polyphénols, l’extrait qui a présenté le meilleur taux de polyphénols et de
flavonoïdes totaux a été choisi pour l’identification de ses divers constituants.
Les polyphénols identifiés ont été quantifiés grâce aux courbes d’étalonnages des
standards suivants en utilisant les conditions optimisées : acide gallique, acide
chlorogénique, acide cinnamique, acide caféique, daphnétine, apigénine, lutéoline,
quercétine, kaempférol, Naringine, rutine, coumarine, vanilline et catéchine. Des
concentrations de l’ordre de 5, 10, 50 et 100 ppm ont été préparées et injectées afin d’être
analysées dans les mêmes conditions d’HPLC optimisés.
II.2.5. Rendement
Tous les solvants utilisés dans cette étude ainsi que le Butylated hydroxytoluene
(BHT) ont été obtenus de chez Sigma–Aldrich (Milan, Italy). Le β-carotène a été obtenu
auprès de la firme « Extrasynthèse » (Genay, France).
Deux colonnes ont été testées pour l’obtention d’une bonne résolution :
- La colonne Ascentis Express C18: 25x4.6mm, 5 µm; (Supelco, Bellefonte, PA, USA);
débit = 0.8 mL/min
- La colonne YMC C30: 25 x 4.6 mm, 5 µm; (YMC Europe GmbH, Dinslaken, Germany) ;
débit = 0.8 mL/min
Les phases mobiles utilisées selon Giuffrida et al. (2013) sont: Phase mobile (A):
Méthanol/ MTBE /eau (83:15:2, v/v/v) ; Phase mobile (B) : Méthanol/ MTBE /water
(8:90:2, v/v/v). Le gradient de solvant appliqué aux différents intervalles est : 0 -20 min:
0% B; 20-160 min: 0-100% B. Le volume d’injection était de 20 µl.
Après la sélection de la colonne, les caroténoïdes du piment ont été identifiés par
HPLC-DAD-APCI-MS. Le spectre UV–Vis était compris dans un intervalle de 250-700
nm et les chromatogrammes ont été obtenus à 450 nm. Pour la spectrométrie de masse
(MS), l’APCI (atmospheric pressure chemical ionization) a été utilisée en mode positif et
négatif, le débit du gaz à 2.5 L/min, le voltage 0.8 kV; gamme de masse allant de 200 à
1200 m/z; Interface Voltage: 4.5 kV; température: 350 ºC. La quantification a été réalisée
grâce à la droite étalon de β-carotène (0.05, 0.1, 1, 10, 25, 50 et 100 ppm).
II.3.6. Rendement
Une solution mère d’ABTS à 1.7 mM/L est préparée 12 à 14 h à l’avance pour
être, ensuite, mélangée à une solution de persulfate de potassium à 4.3 mM/L dans un
rapport 5/1 (V/V) et laissée à l’obscurité. La solution mère d’ABTS est diluée avec le
méthanol jusqu’à une absorbance de 0.70 ± 0.02 à 734 nm. Une solution mère de trolox à
250 mM/L a été utilisée pour la préparation de solutions filles de concentrations comprises
entre 0 et 250 mM/L. Un volume équivalent à 0.1 mL de polyphénols, caroténoïdes,
capsaicinoïdes ou bien de trolox a été ajouté à 2 mL d’ABTS et l’absorbance a été mesurée
après 6 min à 734 nm (Buenguer et al., 2006).
Une série de solutions a été préparée: Le tampon acétate est préparé par le mélange
de 25 mL du tampon d’acétate à 300 mM, de 2.5 mL TPTZ (2,4,6-Tripyridyl-s-Triazine)
(10 mM ) et 2.5 mL FeCl3 -6H2O (40 mM ). 50 µL de chaque échantillon ont été mélangés
avec 1.5 mL de la solution de FRAP et la lecture a été effectuée après 4 min à 593 nm.
Différentes concentrations de Fe (II) ont été choisies pour tracer les courbes d’étalonnage
(100-1000 μM L-1).
pneumoniae, Staphylococcus aureus (8, 14, 26, 32, 550, 319) ainsi que la souche
commensale Escherichia coli (ATCC 25922), proviennent de la collection du laboratoire
de microbiologie du département des sciences pharmaceutiques et produits de santé
(Université de Messine, Italie).
milieu gélose
Pour réaliser cette expérience, la préculture des souches à tester a été préparée 16 h
au préalable et les différents extraits de piment (polyphénols et capsaicinoïdes) ont été
dissous dans du DMSO (dimethyl sulfoxide) à raison de 100 mg/ mL ; alors que les
standards l’ont été à raison de 10 mg/mL. Avant l’expérimentation, Les bactéries ont été
ajustées à une concentration de 108 UFC/mL et ensemencées dans 20 mL du milieu de
culture. Après 15 min de repos, 10 µL de l’échantillon à tester ont été déposés sur les
disques filtres stériles (6 mm). Un autre disque contenant du diméthylsuloxide a été utilisé
comme témoin négatif. Les boites sont incubées après 30 min à 37°C pendant 24h et les
diamètres des zones d’inhibition ont été mesurés (Clinical and Laboratory Standards
Institute, 2008).
La Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) est considérée comme étant la plus faible
concentration d’antimicrobien capable d’inhiber toute croissance visible après un temps
d’incubation de 18 à 24 h (Teresa Fera et al., 1998). La détermination de la CMI a été
réalisée par la technique de micro-dilution en milieu liquide tel que cela est stipulé par le
CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008).
Dans cette technique, 100 µL de chaque suspension bactérienne ont été ajoutés
aux puits d’une microplaque de 96 contenants dejà 100 µL de l’échantillon dilué d’une
façon géométrique de raison de 2. La concentration finale de l’inoculum est 5 × 105
CFU/mL et la concentration maximale des échantillons testés est de 1 mg/mL pour les
standards et 20 mg/mL pour les extraits.
Des puits contenants du milieu de culture seul ou bien ensemencé avec la souche
testée mais sans l’échantillon ont été utilisés comme témoin. Les microplaques ont été
incubées à 37°C. Après 24h d’incubation, la plus faible concentration qui a totalement
inhibée le germe étudié est considérée comme la CMI.
II.5.2.4. Etude de la synergie d’action des substances actives contenues dans les
extraits de piment
Dans le but de chercher une éventuelle synergie, des combinaisons entre les agents
antimicrobiens testés et exerçant le plus grand effet inhibiteur a été étudié vis-à-vis deux
souches bactériennes une à gram négatif, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, et une
autre à gram positif, Staphylococcus aureus ATCC 6538P.
La suspension bactérienne était de l’ordre de 5 × 105 CFU/mL et les boites ont été
incubées pendant 24h à 37° C. Les résultats sont exprimés par le FIC index (fractional
inhibitory concentration ou bien fraction de concentration inhibitrice). L’index de FIC est
déterminé comme suit :
Si le FIC index est inférieur à 0,75, l’association est synergique, elle est additive
s’il est équivalent à 1, indifférente s’il est compris entre 1 et 2 et antagoniste s’il est
supérieur à 2 (Denes et Hidri, 2009).
La lecture a été effectuée 24h après en utilisant le bleu de trypan qui donne une
couleur bleue aux cellules mortes (Dinicola et al., 2012). Le pourcentage de cellules
viables est estimé selon la formule :
Dans les analyses des capsaicinoïdes, deux solvants sont habituellement utilisés : le
méthanol et l’acétonitrile. Pour voir quel était le meilleur solvant, deux analyses ont été
effectuées avec soit le méthanol ou bien l’acétonitrile comme phase mobile (B). Les
chromatogrammes obtenus sont présentés ci-dessous (fig. 17).
Il y’a une relation inverse entre la polarité et la force d’élution, lorsque la polarité
du solvant est relativement faible, il en résulte une forte force d’élution. Bien qu'une
grande variété de solvants organiques puisse être utilisée en chromatographie en phase
inverse, mais seuls quelques-uns sont utilisés couramment.
mAU(x10)
Extract-280nm,4nm (1.00)
(A)
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0 1
2
2.0
1.0
0.0
0 10 20 30 min
1
mAU(x10)
Extract-280nm4nm (1.00)
8.0
(B)
1
7.0
6.0 2
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
0 10 20 30 min
Pour quantifier les capsaicinoïdes tout au long du travail, les courbes d’étalonnage
de la capsaïcine et la dihydrocapsaïcine ont été effectuées (fig. 18). L’équation de la courbe
d’étalonnage de la capsaïcine est y= 4527x+3297 et le coefficient de corrélation est de
l’ordre de R2 = 0.998. Pour la dihydrocapsaïcine, y= 3605x+2295 et R2 = 0.999.
250000 (A)
y = 4527x + 3297
R² = 0,998
200000
150000
100000
50000
0
0 10 20 30 40 50 60
200000 (B)
y = 3605x + 2295
R² = 0,999
150000
100000
50000
0
0 10 20 30 40 50 60
Dans le but de voir l’effet du solvant sur l’extraction des capsaicinoïdes, six
solvants ont été étudiés (méthanol, éthanol, acétate d’éthyle, acétone, isopropanol et
acétonitrile). Selon la figure 19, l’effet du solvant était plus important dans l’extraction de
la capsaïcine que la dihydrocapsaïcine.
En ce qui concerne la capsaïcine, les meilleurs résultats ont été obtenus avec le
méthanol en enregistrant 123.47 µg/g de matière sèche du piment, suivi de l’éthanol
(110.84 µg/g) et l’isopropanol (99.10 µg/g). Le pouvoir d’extraction de la capsaïcine était
moins prononcé avec l’acétonitrile (81.22 µg/g) et l’acétate d’éthyle (77.59 µg/g).
L’acétone est le solvant qui a donné la valeur la plus faible de la capsaïcine (71.62 µg/g).
Barbero et al. (2008) ont étudié l’effet du méthanol, l’éthanol, l’acétonitrile et l’eau
sur l’extraction des capsaicinoïdes. Leurs résultats confirment que le méthanol est le
meilleur solvant pour l’extraction des capsaicinoïdes suivi de l’éthanol et de l’acétonitrile.
L’eau arrive en dernière position, il ne semble être un bon solvant pour l’extraction des
capsaicinoïdes. Selon Peusch et al (1997), la polarité des solvants a un effet significatif sur
l’extraction des capsaicinoïdes.
Chinn et al. (2011) ont utilisé trois solvants dans leur étude (l’éthanol, l’acétonitrile
et l’acétone). Le taux des capsaicinoïdes était plus important dans les extraits d’éthanol et
d’acétonitrile. Mais lorsque le piment est sec, l’acétone s’avère le meilleur solvant.
300 Capsaicine
Dihydrocapsaicine
Concentration (µg/g)
250
200
150
100
50
0
Méthanol Acétonitrile Acétate d'éthyle Acétone Isopropanol Ethanol
mAU(x10) mAU(x10)
2.00 Extract-280nm,4nm (1.00) 2.00 Extract-280nm,4nm (1.00)
(A) (B)
1.75 1.75
1.50 1.50
1.25 1.25
1.00 1.00
0.75 0.75
0.50 0.50
0.25 0.25
0.00 0.00
0.0 2.5 5.0 7.5 min 0.0 2.5 5.0 7.5 min
mAU(x10) mAU(x10)
2.00 Extract-280nm,4nm (1.00) 2.00 Extract-280nm,4nm (1.00) (D)
(C)
1.75 1.75
1.50
1.50
1.25
1.25
1.00
1.00
0.75
0.75
0.50
0.50
0.25
0.00 0.25
-0.25 0.00
0.0 2.5 5.0 7.5 min 0.0 2.5 5.0 7.5 min
mAU(x10) mAU(x10)
Extract-280nm,4nm (1.00) 2.00 Extract-280nm,4nm (1.00)
2.00
(E) (F)
1.75
1.75
1.50
1.50
1.25
1.25
1.00
1.00
0.75
0.75
0.50
0.50
0.25
0.25
0.00
0.00
0.0 2.5 5.0 7.5 min 0.0 2.5 5.0 7.5 min
Dans la littérature, il ya une contradiction dans les résultats obtenus par différents
auteurs. D’après Barbero et al. (2008), l’addition de différents pourcentages d’eau dans le
méthanol a diminué le taux d’extraction des capsaicinoïdes, alors que Boonkird et al.
(2008) ont remarqué une amélioration d’extraction des capsaicinoïdes en utilisant 75%
d’éthanol à 60 ºC.
Capsaicine
300
Dihydrocapsaicine
Concentration (µg/g)
250
200
150
100
50
0
100% MeOH 95% MeOH 90% MeOH 75% MeOH 50% MeOH
Figure 21: Influence d’addition de différentes concentrations d’eau dans le solvant sur
l’extraction des capsaicinoïdes.
300 Capsaicine
Concentration (µg/g)
Dihydrocapsaicine
250
200
150
100
50
0
50ºC 75ºC 100ºC 125ºC
Barbero et al. (2006) ont étudié la stabilité des capsaicinoïdes dans des
températures allant de 50 à 200°C. Les extractions ont été effectuées suivant la méthode
PLE (extraction liquide sous pression). Ils ont trouvé que le maximum de capsaicinoïdes a
été obtenu à 200°C.
Dans le travail de Juangsamoot et al. (2012), les capsaicinoïdes ont été extraits par
la méthode de macération en utilisant trois solvants (méthanol, 80% v/v éthanol et
acétonitrile) à quatre différentes températures (60, 70, 80 et 90°C) pendant (1, 2 et 3 h). Ils
ont trouvé que la meilleure méthode d’extraction des capsaicinoïdes serait soit d’utiliser
MeOH/60oC/2h, 80% EtOH/90oC/1h ou ACN/80oC/1h.
Certains auteurs comme Barbero et al. (2008), Chuichulcherm et al. (2013) ont
confirmé que le temps adéquat pour l’extraction des capsaicinoïdes serait entre 10 et 20
min lorsque le méthanol est utilisé comme solvant.
mAU(x10)
Extract-280nm,4nm (1.00)
1.75
2
1.50
1.25
1.00
0.75
3
0.50
0.25 1 5
4
0.00
-0.25
0.0 2.5 5.0 min
Tableau 5: Contenu en capsaicinoïdes dans le péricarpe, le placenta et les graines du Capsicum annuum (µg/g MS).
Plusieurs études ont été menées sur l’accumulation des capsaicinoïdes en relation
avec la taille, l’âge et le stade du développement du fruit du piment (Estrada et al., 2000;
Mueller-Seitz et al., 2008 ; Barbero et al., 2014). Tous les résultats ont confirmé que les
capsaicinoïdes commencent à s’accumuler durant les premiers stades de développement
jusqu’à atteindre un maximum pendant la maturation. A ce moment, plus de 60% de
capsaicinoïdes sont dégradés après leur oxydation par la peroxydase (Bernal et al., 1993).
Il a été aussi démontré que les fruits du piment qui ont une déficience d’eau produisent
plus de capsaicinoïdes (Sung et al., 2005 ; Ruiz-Lau et al., 2011 ; Barbero al., 2014).
Les quantités des capsaicinoïdes présentes dans le placenta est 7 fois supérieure à
celles des graines et 36 fois au péricarpe (tableau 6) qui correspond à 1099.82, 39847.40 et
5392.76 unités Scoville respectivement. Ces résultats confirment que les capsaicinoïdes
sont synthétisés dans le placenta et que leur présence dans les graines et le péricarpe n’est
qu’une conséquence de leur diffusion.
Les quantités en capsaicinoïdes des tissus secs étaient plus importantes par rapport
au frais. Le piment frais a une couche de cire qui peut empêcher la diffusion du solvant et
l’extraction de ces composés. Cette couche a été dégradée lors du séchage ce qui a
amélioré la capacité d’extraction des capsaicinoïdes (Chinn et al., 2011).
Le contenu des polyphénols et flavonoïdes totaux des trois extraits a été déterminé
par des méthodes colorimétriques. Les résultats sont reportés dans le tableau 7. En ce qui
concerne les polyphénols totaux, La courbe est établie en utilisant l’acide gallique comme
référence et les résultats sont exprimés en mg équivalent d’acide gallique par gramme de
piment frais (mg EGa/ g).
(A)
3
0
0 100 200 300 400 500 600
Concentration (ppm)
3
(B)
Absorbance
y = 0,019x + 0,029
R² = 0,999
2
0
0 25 50 75 100 125 150
Concentration (ppm)
Parmi ces trois solvants, le méthanol et l’acétonitrile ont été étudiés dans notre
travail en raison de leur grande utilisation dans les analyses des composés phénoliques. Les
chromatogrammes obtenus avec les deux solvants sont présentés dans la figure 25.
L’utilisation d’acétonitrile comme phase mobile a permis de réduire le temps d’analyse.
La polarité du méthanol est plus importante par rapport à l’acétonitrile qui rend le
temps d’analyse plus important en mode inverse, ainsi la force d’élution de l’acétonitrile
est plus puissante que celle du méthanol.
coefficients est grande, plus la rétention sera importante ou l'élution rapide (Montpas,
1999).
L’effet des deux acides (acide acétique et acide formique) sur la performance
séparative de la phase mobile a été étudié. L’ajustement du pH des solvants organiques
peut se faire de la même façon que celui de l’eau selon l’Institut National des Standards et
de la Technologie (INST) (Bauke et al., 1993 ; Barbosa et al., 1998). La modification de
la phase mobile en utilisant un agent organique serait un outil très efficace pour manipuler
la sélectivité de la séparation (Snyder, 1974 ; Neue et al., 2006 ; Amundsen et al ., 2013).
Par contre, une phase mobile contenant un acide organique très volatil, comme
l'acide formique ou acétique, demeure une solution idéale pour fournir une source de
+
proton et ainsi ioniser des composés en mode positif sous la forme [M+H] . Toutefois, bien
que cet acide soit parfait en spectrométrie de masse, la phase mobile doit être compatible
avec la colonne utilisée et les molécules à séparer (Maheux, 2012).
Selon les résultats (fig. 26), l’addition des deux acides au solvant acétonitrile a
nettement amélioré la forme des pics ainsi la séparation. La séparation et l’ionisation sont
souvent améliorées par l’ajout d’un modificateur comme l’acide acétique, l’acide
formique, l’acétate d’ammonium ou bien formate d’ammonium (El Mrabet, 2008).
(A)
75mAU
280nm,4nm (1,00)
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 min
(B)
mAU
50 280nm,4nm (1,00)
45
40
35
30
25
20
15
10
Figure 25: Séparation des standards de polyphénols avec la colonne C18, 15x 2.1, 2.7 µm et les phases
mobiles (A) : phase mobile A : H2O, phase mobile B : MeOH ; (B) : phase mobile A : H2O, phase
mobile B : ACN.
(A) 50mAU
280nm,4nm (1,00)
45
40
35
30
25
20
15
10
mAU
50 280nm,4nm (1,00)
(B)
45
40
35
30
25
20
15
10
mAU
50 280nm,4nm (1,00)
(C) 45
40
35
30
25
20
15
10
Figure 26 : Séparation des standards de polyphénols avec (A) : phase mobile A : H2O, phase mobile B :
ACN ; (B) : phase mobile A : H2O + AF, phase mobile B : ACN+ AF ; (C) : phase mobile A : H2O + AA,
phase mobile B : ACN+ AA.
Le nombre de pics obtenus avec l’acide acétique était supérieur à celui de l’acide
formique. L’acide acétique a permis une meilleure séparation des polyphénols, la raison
pour laquelle qu’il a été retenu pour le reste de l’expérimentation.
Hua et Jenke (2012) ont essayé d’optimiser la phase mobile pour augmenter la
sensibilité et la détection en LC-MS. Ils ont utilisé le méthanol comme phase mobile avec
différent combinaisons d’acides et de sels. Ils ont rapporté que l’ionisation est beaucoup
plus favorisée avec l’acide acétique que l’acide formique, ce qui améliore la séparation et
la détection.
Cette partie non-polaire devient L'élément adsorbant pour les composés peu
polaires et Le coefficient de partage la favorise au profit de la phase mobile qui doit être un
éluant polaire (acétonitrile, méthanol, H20). C'est ce type de composé qui sortira de la
colonne en dernier. Les plus polaires, par ailleurs, sont peu retenus.
Afin d’améliorer encore la séparation des composés phénoliques, trois colonnes ont
été étudiées en utilisant l’eau et l’acétonitrile comme phases mobiles : C18, 15x 2.1, 2.7
µm, C18, 15x 4.6, 2.7 µm et RP-Amide C18, 15x 2.1, 2.7 µm. Les résultats obtenues sont
présentés dans la figure 27. Selon les résultats, l’utilisation des deux colonnes (C18,
15x4.6, 2.7 µm et RP-Amide C18, 15x2.1, 2.7 µm) a permis de donner une bonne
séparation des standards phénoliques, mais la meilleure séparation a été obtenue avec la
RP-Amide.
En comparant les deux colonnes RP-Amide et la C18, nous avons remarqué que
l’ordre d’élution des standards n’était pas le même (fig.28). Avec la C18, l’ordre d’élution
était : Acide gallique, acide chlorogénique, catéchine, acide caféique, vanilline, rutine,
coumarine, naringine, acide cinnamique, quercétine + lutéoline, apigénine et kaempférol.
Lorsque la même analyse a été effectuée avec la RP-Amide, l’ordre d’élution était
comme suite: Acide gallique, vanilline, catéchine, acide chlorogénique, acide caféique,
coumarine, narangine, rutine, acide cinnamique, quercétine + lutéoline, apigénine et
kaempférol. Une co-élution entre la quercétine et la lutéoline a été remarquée avec les deux
colonnes.
(A)
50mAU
280nm,4nm (1,00)
45
40
35
30
25
20
15
10
(B)
mAU
80 280nm,4nm (1,00)
70
60
50
40
30
20
10
(C)
150 mA
U 280nm,4nm
140 (1,00)
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 min
Figure 27 : Séparation des standards de polyphénols avec les colonnes (A) : C18,
15x2.1, 2.7 µm ; (B) : C18, 15x4.6, 2.7 µm ; (C) : RP-Amide C18, 15x2.1, 2.7 µm.
mAU
(A)
280nm,4nm 9
7 (1,00)
0
6
7
0
5
0 5
4
1 4
0
3
0
2 10 11
2
0 3 6 12
8
1
0
(B)
150 mAU
280nm,4nm (1,00)
140
130 9
120
6
110
100
90
80
70 2
60
50
5
1 10
40
30 7 11
20
4 12
8
10
3
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 min 60
Figure 28: Ordre d’élution avec les deux colonnes (A) : C18, 15x4.6, 2.7 µm et (B) : RP-Amide C18,
15x2.1, 2.7 µm.
Les séparations par HPLC peuvent être effectuées en mode isocratique, lorsque la
composition en solvants de la phase mobile demeure constante, ou en mode gradient, c'est-
à-dire que la composition de la phase mobile varie durant l'analyse. Lors de l'utilisation
d'un gradient, on débute toujours par une composition de phase mobile de polarité opposée
à celle de la phase stationnaire, pour évoluer vers une polarité qui tend vers celle de la
phase stationnaire. Ainsi, en RP-HPLC, on commence la séparation avec un mélange de
solvants polaire, donc à plus grande teneur en phase aqueuse, ce qui permet aux analytes
de demeurer retenus sur la colonne chromatographique. On augmente ensuite
graduellement la proportion de la phase organique (Maheux, 2012).
Différent gradients ont été utilisés pour séparer ces deux standards phénoliques,
mais la co-élution était inévitable. Un autre essai a été réalisé avec la colonne RP-Amide
mais cette fois ci avec le méthanol comme phase mobile, ce qui a permis de résoudre le
problème et de séparer la quercétine et la lutéoline (fig.29). Le gradient final optimisé est:
0 min- 5 min: 2% B; 5- 60 min : 50% B; 60-70 min: 50% B ; 71 min, 2% B.
mAU
150 280nm,4nm (1,00)
9
140
130
120
6
110
100
90
80
70 2
60
50 5
10
40 1
30 7 11
20
8 12 13
4
10 3
0
0 10 20 30 40 50 60 min
Figure 29: Séparation des standards phénoliques avec colonne RP-Amide C18 15x2.1, 2.7 µm et
méthanol comme modificateur organique. 1 – Acide gallique, 2 – Vanilline, 3- Catéchine, 4 –
Acide chlorogénique, 5 – Acide caféique, 6 – Coumarine, 7 – Narangine, 8 – Rutine, 9 – Acide
cinnamique, 10 –Lutéoline, 11 – Quercétine,12- Apigénine, 13 – kaempférol.
Le profil phénolique de l’extrait de piment obtenu par les deux solvants méthanol et
acétate d’éthyle a été identifié par HPLC-DAD-ESI-MS (fig.30). La quantification a été
faite grâce aux courbes d’étalonnage obtenues avec les treize standards (fig.31). Le
tableau 8 montre les différents polyphénols identifiés et leur quantité dans le piment frais.
Le piment vert était plus riche de ces deux flavonoïdes que le piment rouge. La
quercétine rhamnoside et lutéoline glucoside diminuaient avec la maturation (42.2 µg/g et
41.4 µg/g dans le piment vert immature, 5.7 µg/g et 7.3 µg/g dans le piment vert mature,
3.2 µg/g et 4.4 µg/g dans le piment rouge immature et enfin 3.1 µg/g et 3.9 µg/g dans le
piment rouge mature) (Marin et al., 2004). Le piment utilisé dans notre étude est plus riche
en lutéoline glucoside (8.09 µg/g).
Parmi les flavonoïdes, Les dérivés de la quercétine sont les plus dominants avec un
taux de 113.46 µg/g, suivis des dérivés du kaempférol (30.86 µg/g) et la rutine (18.30
µg/g). Les composés suivant : hydroxybenzoyl hexose, acide vanillique glucoside,
hydroxycoumarine, lutéoline et quercétine ont été reportés pour la première fois.
Materska et al. ( 2005) ont identifié les polyphénols dans quatre variétés de piment
dans des stades verts et rouges. Huit polyphénols ont été identifiés dont deux dérivés de
quercétine rhamnoside et trois de lutéoline glucoside et aussi un dérivé d’apigénine
glucoside. Les quantités de ces flavonoïdes varient selon la variété et le stade de
maturation, mais la lutéoline glucoside était le flavonoïde le plus abondant suivie de la
quercétine rhamnoside. Le piment vert reste toujours plus riche en composés phénoliques
que le piment rouge.
mAU
32,5 280nm,4nm (1,00)
15
30,0
27,5
25,0
22,5
20,0
17,5
15,0
12,5
20
10,0
7,5
2 12
5,0 3 5 7 13 14 17
1
4 11 16
2,5 6 8 9 10 18 19
0,0
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 min
300000 400000
150000 200000
0 0
0 50 100 0 50 100
y = 5552,x + 4136,
Aire du pic (mAU)
600000
y = 9315.5x + 11729
Aire du pic (mAU)
400000
600000
200000 300000
0 0
0 50 100 0 50 100
210000
y = 4155.1x + 8162.1 y = 1970,x + 3731,
300000 140000
150000 70000
0
0
0 50 100
0 20 40 60 80 100
Concentration (ppm)
Concentration (ppm)
Vanilline Naringine
600000
100000
300000 50000
0 0
0 20 40 60 80 100 0 50 100
Coumarine Rutine
450000
Aire du pic (mAU)
y = 3481x + 5372,
R² = 0,997
300000
150000
0
0 20 40 60 80 100
Concentration (ppm)
Kaempférol
600000
Aire du pic (mAU)
450000
200000 150000
0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100
Concentration (ppm) Concentration (ppm)
Quercétine Lutéoline
600000 90000
Aire du pic (mAU)
y = 807,1x + 1461,
Aire du pic (mAU)
30000
200000
0
0 0 50 100
0 20 40 60 80 100
Apigénine Catéchine
Figure 31: Courbes d’étalonnage des standards étudiés : Acide gallique, acide chlorogénique,
Formule
Pic tR [min] [M-H]- UV/Vis max [nm] Composé Quantification (µg/g)
moléculaire
Le profil phénolique de trois variétés de piment a été étudié par Jeong et al. (2011).
Après l’identification par HPLC-MS/MS, plusieurs composés ont été identifiés. La
composition était différente d’une variété à une autre. La lutéoline glucoside est le
principal flavonoïde dans deux variétés d’environ 80.6 et 81.9 µg/g, et 206.6 µg/g dans la
troisième variété. Alors que la quercétine rhamnoside ne se trouvait que dans la troisième
variété avec un taux de 1501.8 µg/g. d’autres travaux ont aussi confirmé ces résultats
(Wahyuni et al., 2011 ; Materska, 2014).
III.2.4. Rendement
Le rendement a été calculé par l’ajout d’un standard (daphnétine) 24h avant
l’extraction. Après l’analyse de l’extrait par HPLC-DAD-ESI-MS, la daphnétine a été
quantifiée grâce a la courbe d’étalonnage (fig.32) et le rendement de l’extraction a été
calculé. Le rendement était de l’ordre de 82.90%.
y = 2891x - 1231,
300000
R² = 1
Aire du pic (mAU)
200000
100000
0
0 20 40 60 80 100
Concentration (ppm)
0.6
y = 0.111x - 0.0097
Absorbance
R² = 0.9988
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6
Concentration (ppm)
González de Mejıá et al. (1998) ont trouvé des valeurs comprises entre 1598 et
6428 μg/100 g de caroténoïdes dans le piment vert. Deli et al. (2001) ont étudié la
composition en caroténoïdes du piment durant les différents stades de maturations, ils ont
trouvé que la teneur en caroténoïdes du piment vert est 19,6 mg/100g de matière sèche.
Selon la littérature, le taux des caroténoïdes est plus élevé dans le piment rouge que
le piment vert ou même jaune (Matsufuji et al., 2007; Chuah et al., 2008). Durant la
maturation, la couleur verte du piment due à la présence des chlorophylles et quelques
caroténoïdes comme la lutéine disparaissent avec la synthèse des pigments chromoplastes
(Hornero-Mendez et al., 2000).
Selon la littérature, deux colonnes sont utilisées lors de l’analyse des caroténoïdes :
C18 (Zanfini et al., 2010 ; Loranty et al., 2010 ; Plaza et al., 2011 ; Mech-Nowak et al.,
2012 ; Condurso et al., 2012; Meulebroek et al., 2012; Xiao et al., 2012; Li et al.,
2013; Vinas et al., 2013) et C30 (Melendez-Martinez et al., 2010 ; Mertz et al., 2010 ;
Djuikwo et al., 2011 ; Kao et al., 2012; Garzon et al., 2012; Vallverdu-Queralt et al.,
2013 ; Amoussa-Hounkpatin et al., 2013 ; Lachman et al., 2013 ; Courraud et al., 2013 ;
Giuffrida et al., 2013).
Pour cela, ces deux colonnes ont été utilisées dans notre travail pour voir celle qui
assure une bonne séparation des caroténoïdes de piment (Ascentis Express C18, 25 x 4.6
mm, 5 µm et YMC C30, 25 x 4.6 mm, 5 µm). Les chromatogrammes obtenus sont
présentés dans la figure 34.
(A)
mAU
450nm,4nm (1,00)
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 min
(B)
mAU
11 450nm,4nm (1,00)
10
-1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 min
Figure 34: Séparation des caroténoïdes de piment par les colonnes (A) : Ascentis
Express C18, 25 x 4.6 mm, 5 µm YMC; (B) : C30, 25 x 4.6 mm, 5 µm.
La phase stationnaire C18 et récemment C30 sont des colonnes typiques pour les
chromatographies en phase inverse. Elles permet d’avoir une bonne et rapide séparation
d’une gamme vaste d’analytes, surtout ceux qui possèdent des chaines courtes et un faible
poids moléculaire. Mais la colonne C18 possède une faible résolution pour les isomères
cis-trans (Simonovska et al., 2013).
Les colonnes C30 sont un excellent choix pour la séparation de ces isomères (ex :
lutéine et zéaxanthine) et donnent une meilleure forme de pic ainsi possèdent une meilleure
sélectivité pour les analytes de longues chaines (Melendez-Martinez et al., 2007 ;
Simonovska et al., 2013).
La phase stationnaire C18 est la plus utilisée parmi les chromatographies en phase
inverse pour la séparation des molécules bioactives (Chauveau-Duriot et al., 2010; Abidi,
1999 ; Saha et al., 2013). Mais cette phase stationnaire est incapable de séparer les
isomères comme β and γ-tocopherol. Ce problème a été résolu avec l’utilisation du C30
comme phase stationnaire (Britz et al., 2007).
Depuis leurs introduction dans les années 1990 (Sander et al., 1994), les colonnes
C30 ont connu un grand succès concernant la séparation des caroténoides (Melendez-
Martinez et al., 2007; Sander et al., 2000; Oliver et Palou, 2000) par rapport au C18. Selon
Saha et al. (2013), la phase stationnaire C30 se comporte différemment des autres colonnes
en ce qui concerne le temps de rétention.
La phase stationnaire C30 permet une bonne séparation et résolution des isomères
de caroténoïdes moins polaires comme lycopène et β-carotène. Le problème qui se pose
une fois appliquée à l’analyse générale des caroténoïdes comme les xanthophylles, C30
donne un profile similaire à celui du C18 mais dans un temps d’analyse plus long (Kashik
et al., 2009 ; Daood et al., 2013 ; Amorim-Carrilho et al., 2014).
40
35
3
0
2
5
20
4 8
15 6 10
10
3 9
1
2
5 7
0
-5
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15, 17, 20,0 22,5 25,0 27,5 min
0 5
12000000
8000000
4000000
0
0 20 40 60 80 100 120
concentration (ppm)
Parmi les caroténoïdes identifiés, la lutéine est le plus abondante avec une valeur de
13.42 µg/g soit 54.40%, suivie de la zéaxanthine (4.32 µg/g ; 17.53%) et le β-carotène
(4.20 µg/g ; 17.03%) (tableau 9). Ces taux sont plus élevés que ceux rapportés par Deli et
al. (2001) qui ont trouvé que la lutéine et le β-carotène représentent 31.6% et 13.7% des
caroténoïdes du piment.
Violaxanthine 1.50
Lutéoxanthine 1.22
Lutéine 13.42
Zéaxanthine 4.32
β-carotène 4.20
Total 24.67
caroténoïdes) du piment
Ces dernières années, l’intérêt porté aux antioxydants naturels, en relation avec
leurs propriétés thérapeutiques, a augmenté considérablement. Des recherches scientifiques
dans diverses spécialités ont été développées pour l’extraction, l’identification et la
1
y = -0,571x + 0,887
Absorbance 0.8 R² = 0,998
0.6
0.4
0.2
0
0 0.4 0.8 1.2 1.6
Concentration (mM)
0.8
Absorbance
y = -1.6395x + 0.6952
R² = 0.9957
0.6
0.4
0.2
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Concentraction (mM)
1.5
y = 1.2076x + 0.0082
R² = 0.9995
Absorbance
1
0.5
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Concentration (mM)
Les caroténoïdes sont des pigments responsables des couleurs rouges, orangées,
jaunes et vertes des fruits, des légumes, des fleurs et des algues. Cette vaste famille de
substances liposolubles possède des propriétés antioxydantes. Les caroténoïdes majeurs
identifiés dans le piment sont la lutéine, la zéaxanthine et le β-carotène connus pour leur
grand pouvoir antioxydant.
Les polyphénols ayant des stœchiométries élevées ont une capacité importante à
piéger les radicaux libres par transferts multiples d’atomes H ou d'électrons du phénol de
départ et de certains de ses produits d'oxydation, comme dans le cas de la quercétine
(Goupy et al., 2009; Achat, 2013). Les produits d'oxydation de la quercétine, notamment
le dérivé benzofuranone et l'acide protocatéchique, possèdent un pouvoir antioxydant
propre. Ils contribuent au pouvoir antioxydant global de ce flavonol, ce qui explique
pourquoi la quercétine est un très bon antioxydant en général, dont l'effet protecteur peut
persister même après sa consommation totale (Achat, 2013).
Plusieurs études ont montré que les capsaicinoïdes possèdent un grand pouvoir
antioxydant et peuvent empêcher l’oxydation des lipoprotéines humaines (Ahuja et al.,
2006 ;Yang, et al., 2010). Ces recherches ont indiqué aussi que la capsaïcine inhibe
potentiellement différents peroxydations lipidiques, piège directement les différents
radicaux toxiques, et empêche l'accumulation des espèces actives de l'oxygène (Kogure et
al., 2002).
Les plantes synthétisent plus de 100 000 petites molécules (MM < 500 Da) dotées
pour la plupart d’une activité antibiotique. En général, cette activité est inférieure à celle
exercée par les antibiotiques d’origine microbienne (Tegos et al., 2002 ; Lewis et Ausubel,
2006). Les concentrations requises pour exercer une activité antimicrobienne sont donc
plus élevées pour les molécules isolées de plantes que pour celles issues de bactéries et de
champignons (Guinoiseau, 2011). L’utilisation des plantes à des fins thérapeutiques est une
pratique traditionnelle et universelle qui remonte à plusieurs siècles. Les plantes
représentent une source très riche de molécules bioactives pouvant avoir un effet
antimicrobien sur les bactéries résistantes.
Les souches étudiées sont : Staphylococcus aureus (ATCC 6538P, 8, 14, 26, 32,
550, 319), Listeria monocytogenes (ATCC 7644 et ATCC 1392), Escherichia coli (ATCC
25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella typhimurium (ATCC
13311), Proteus mirabilis (ATCC 13315), Enterococcus hirae (ATCC 10541), Bacillus
subtilis (ATCC 6633), Klebsiella pneumoniae, Bifidobacterium animalis sbsp lactis Bb12
et Lactobacillus rhamnosus LbRE-LSAS.
D’après les résultats illustrés dans le tableau 11, l’effet antibactérien varie d’une
souche à une autre et dépend aussi de l’échantillon testé. Les souches probiotiques Bb12 et
LbRE-LSAS semblent être résistantes vis-à-vis tous les échantillons testés vu qu’aucune
zone d’inhibition n’a été obtenue.
Tableau 11 : Diamètres des zones d’inhibition (mm) obtenus avec les différentes souches.
S. aureus 6538P 6±0 4.5±0.17 9.5±0.35 11.5±0.5 16.5±0.43 9±0.35 9.5±0.17 8.5±0.43 - -
S. aureus 319 6±0.32 8±0.25 5±0.17 8±0.19 20.5±0.47 9±0 12±0.37 11±0.62 - -
S. aureus 550 8±0.32 5±0.17 3.5±0.19 4±0.22 9.5±0.42 8.5±0.34 12±0.36 12±0.41 - -
E. coli ATCC 25922 6.25±0.35 4.75±0.25 5±0.22 5±0.25 4.5±0.18 - 12±0.63 10.75±0.25 - -
P. aerugenosa 6±0.23 4±0.18 - 3±0 5±0.24 5±0.30 13±0.36 11.75±0.56 5±0.32 4.5±0.42
ATCC 27853
B. subtilis ATCC 10±0 4.5±0.12 3±0 7±0.15 12.13±0.12 - 12±0 12±0 - 3.21±0.20
6633
P. mirabilis ATCC 4±0.25 3.5±0.17 3.5±0.17 3.25±0.14 3.5±0.17 3±0.07 4.75±0.27 7±0.32 - 7±0.65
13315
Lb. rhamnosus - - - - - - - - - -
Bb12 - - - - - - - - - -
EP : Extrait phénolique ; EC: Extrait capsaicinoïdes ; Cap: Capsaïcine; DHC: Dihydrocapsaïcine ; AC caf : Acide caféique ; C: Coumarine ;
Q : Quercétine ; K: Kaempférol ; N : Narangine ; R : Rutine.
Plusieurs études menées chez des sujets humains ou bien animaux (rats, cochons et
poulets) ont révélé une augmentation de la croissance des bactéries bénéfiques comme
Lactobacillus et une diminution dans les Entorabacteriaceae, Clostridium et Bacteroides
après une administration de sources naturelles riches en polyphénols (Hara, 1997 ; Dolara
et al., 2005 ; Molan et al., 2010 ; Viveros et al., 2011).
Il ya un nombre limité d'études sur la capacité des probiotiques tels que les
bactéries lactiques et bifidobactéries à métaboliser des composés polyphénoliques.
Lactobacillus plantarum a été décrite d’avoir plusieurs activités enzymatiques tels que la
tannase, l'acide phénol décarboxylase (PAD) et la benzyl alcool déshydrogénase qui sont
capables de dégrader quelques composés phénoliques (Rodríguez et al., 2009).
La seule souche qui était sensible à la rutine est P. aeruginosa avec une zone
d’inhibition de l’ordre de 5 mm. Ceci est déjà confirmé par les résultats obtenus par Sami
et Shakoori (2007) qui ont trouvé que la croissance de Pseudomonas est retardée en
présence de la rutine.
Dans une autre recherche menée par Céliz et al. (2011), l’activité antimicrobienne
de la naringine et ses dérivés a été étudiée contre quelques bactéries pathogènes (L.
monocytogenes, E. coli O157: H7 et S. aureus). Leurs résultats confirment que la naringine
n’a aucune activité antimicrobienne.
Un grand nombre des effets délétères des flavonoïdes sur les bactéries pathogènes
peuvent se produire en particulier en présence d'aglycones, qui sont facilement transportés
à travers les membranes cellulaires par diffusion (Mandalari et al., 2007). Ce qui peut
expliquer la raison pour laquelle la rutine et la naringine n’avaient pas un grand effet
inhibiteur sur la croissance bactérienne par rapport aux autres flavonoïdes aglycones.
Les meilleurs résultats ont été obtenus avec l’acide caféique, la quercétine et le
kaempférol qui ont pu inhiber toutes les souches pathogènes. Les zones d’inhibition
obtenues avec les souches pathogènes en présence d’acide caféïque varient de 3.5 à 20.5
mm. La souche la plus sensible est S. aureus 319 suivie de S. aureus ATCC 6538P, et la
plus résistante est P. mirabilis.
staphylocoques sont toujours les plus sensibles, une zone de l’ordre de 14 mm a été
obtenue avec la souche S. aureus 26.
D’une façon générale et selon les résultats, les bactéries à Gram positif sont
beaucoup plus sensibles par rapport aux bactéries à Gram négatif. La structure de la paroi
cellulaire est à l’origine de la résistance des bactéries à Gram négatif vu qu’elles possèdent
une membrane externe en plus du peptidoglycane. L’interaction des polyphénols avec les
membranes, parois cellulaires et / ou les protéines extracellulaires semble être la base de
leur effet inhibiteur sur les bactéries, donc les variations dans les activités antimicrobiennes
de ces composés peut être expliquée par les différences dans la structure de surface
cellulaire entre les espèces à Gram négatif et à Gram-positifs ( Smith et al., 2005 ; Cueva
et al., 2010).
Rodriguez Vaquero et Manca de Nadra (2008) ont montré que parmi les non-
flavonoïdes, les dérivés d'acide hydroxycinnamique, comme l'acide caféique, sont des
antibactériens plus efficaces contre L. monocytogenes et E. coli que les dérivés de l'acide
hydroxybenzoïque.
L'activité antimicrobienne des acides phénoliques est déterminée par leur structure
chimique, en particulier le nombre et la position de substitution sur le noyau benzène, et la
Plusieurs auteurs ont rapporté que l'absence du groupe hydroxyle dans les
flavonoïdes diminue leurs capacités antioxydante et antimicrobienne (Sichel et al., 1991 ;
Tripoli et al., 2007 ; Haneen et al., 1997 ; Wu et al.,2013).
Les trois standards (acide caféique, quercétine et kaempférol) ainsi les deux extraits
de polyphénols et capsaicinoïdes ont été maintenus pour le test de la concentration minimal
d’inhibition (tableau 12). On remarque que les trois standards phénoliques exercent un
grand pouvoir inhibiteur sur les souches testées. Cet effet était plus important en milieu
liquide par rapport au milieu de culture solide pour les deux flavonoïdes quercétine et
kaempférol, cela peut être expliqué par des problèmes de solubilités de ces deux composés
dans l’agar, ce qui a diminué leur effet dans le test en milieu solide.
K. pneumoniae 10 10 2 1 1
Les souches cliniques S. aureus (319, 14, 8, 32 et 550) étaient plus sensibles à
l’action de la quercétine par rapport au kaempférol et l’acide caféïque avec des CMIs qui
varient de 0.00195- 0.0078 mg. En ce qui concerne les souches L. monocytogenes ATCC
7644, K. pneumoniae, E.coli, B. subtilis ; les CMIs obtenus avec ces deux flavonoïdes
étaient identiques. Le reste des souches (S. aureus 6538, S. aureus 26, E. hirae, L.
monocytogenes ATCC 1392, S. typhimurium et P. aeruginosa ) étaient plus sensibles vis-
à-vis du kaempférol avec des CMIs entre 0.0156 et 0.125 mg.
Les composés phénoliques de faible taille, tels que les acides phénoliques, seraient
facilement capable de traverser la membrane et exercer leur activité antimicrobienne
(Ikigai et al., 1993). Un mécanisme possible pour expliquer l'action antimicrobienne des
acides phénoliques est l’hyperacidification (Vattem et al., 2005) en raison de la
dissociation des acides phénoliques (Choi and Gu, 2001). Cette hyperacidification
modifierait la membrane cellulaire et la rend plus perméable, ainsi affecte la pompe
sodium-potassium impliquée dans la synthèse d'ATP (Vattem et al., 2005).
L’effet de l’acide caféique était moins important que celui de la quercétine ou bien
le kaempférol, cela peut être attribué au fait que le pH du milieu de culture MHB (6.5) est
élevé au pKa du groupe carboxyle des acides phénoliques (environ 4.5). A ce pH du
milieu, les acides sont généralement dissociés, alors que la forme non dissociée a le
pouvoir antimicrobien le plus élevé car ils sont plus solubles dans la membrane (Davidson
et Taylor, 2007).
La concentration des acides phénoliques non dissociés qui sont plus lipophiles
augmente avec la diminution du pH. L'activité des acides phénoliques non dissociés est
plus élevée par rapport aux acides phénoliques dissociés, car ils sont plus solubles dans la
membrane cytoplasmique (Ramos-Nino et al., 1996).
Le kaempférol et la quercétine qui possèdent les plus grande charges positives sur
C3 exercent la plus forte activité antibactérienne. Bien que l'addition de groupes hydroxyle
affaiblit le caractère hydrophobe de ces flavonoïdes, elle augmente la charge d'atomes.
Cela pourrait expliquer pourquoi d'autres études ont également constaté le fait que
l’activité antibactérienne augmente lorsque le nombre des groupes hydroxyles est plus
élevé (Alcaraz et al., 2000 ; Sato et al., 1996 ; Wu et al., 2013).
L’effet inhibiteur d’un extrait ou bien des composés purs dépend des conditions
expérimentales telles que la concentration de l’inoculum, les quantités des nutriments, le
solvant utilisé et la concentration finale de l’agent antimicrobien. La concentration
minimale inhibitrice (CMI) est considérée comme une bonne méthode d’évaluation de
l’activité antimicrobienne des composés qui ont une faible solubilité dans l’eau car leur
précipitation peut diminuer leur effet (Pistelli et Giorgi, 2012).
Le test de diffusion sur disques est une méthode qui dépend de la solubilité et la
diffusion de l’agent testé sur un milieu solide. Le kaempférol a une faible solubilité ce qui
provoque une perte d'inhibition dans la méthode de disques par rapport à son effet à une
dilution appropriée dans le bouillon (Santas et al., 2010).
Face à des infections dont l'éradication est réputée difficile ou devant des germes
avec des profils de résistance inhabituels, le clinicien peut avoir recours à une association
d'antibiotiques dans le but d'accroître la bactéricidie. Il est nécessaire dans ces situations de
s'assurer que les antibiotiques utilisés répondent au concept de synergie, c'est-à-dire que
l'association de deux antibiotiques exerce une activité antibactérienne supérieure à celle de
l'effet additionné de chacun d'entre eux (Montravers et Dupont, 1996).
- indifférence : l’activité de l’un des antibiotiques n’est pas affectée par la présence de
l’autre ;
- addition : l’effet de l’association est égal à la somme des effets de chaque antibiotique
étudié séparément à la même concentration que dans l’association ;
Afin de chercher une éventuelle synergie entre les trois standards retenus (acide
caféique, kaempférol et quercétine), la méthode d’échiquier a été utilisée. Deus souches
appartenant au gram positif et négatif ont été sélectionnées (Staphylococcus aureus ATCC
6538P et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853).
- Quercétine et Kaempférol
Q K
∑ FIC Interprétation
Concentration Fic Q Concentration Fic K
0,03125 1 0 0 1 CMI Q
0 0 0,01562 1 1 CMI K
Arima et al. (2002) ont étudié effet de quelques associations (la quercétine et la
quercitrine, la quercétine et la morine, la quercétine et la rutine) sur la croissance de
quelques souches pathogènes. Ils ont remarqué que ces associations sont beaucoup plus
actives contre ces souches que les flavonoïdes seuls.
1
FIC Quercétine
0.75
0.5
0.25
0
0 0.25 0.5 0.75 1
FIC Kaempférol
Cet indice diminue jusqu’à 0.4996, qui est le meilleur indice avec cette association,
lorsque les concentrations de l’acide caféique et le kaempférol sont équivalents à 0.0625 et
0.0039 respectivement ; l’effet est synergique. Un autre effet synergique mais légèrement
inférieur (FIC= 0.53 ; fig.41) est obtenu avec la moitié du CMI du kaempférol et ¼ de
l’acide caféique.
Tableau 14: Etude de la synergie entre l’acide caféique et le Kaempférol contre S. aureus.
Ac caf K
∑ FIC Interprétation
Concentration Fic Ac caf Concentration Fic K
0 0 0,01562 0 1 CMI K
1
FIC Acide caféïque
0.75
0.5
0.25
0
0 0.25 0.5 0.75 1
FIC Kaempférol
La souche Staphylococcus aureus est très sensible à l’action de l’acide caféique avec
une CMI de 0.25 mg/mL, l’addition de 0.00195 mg/mL de quercétine n’a pas amélioré son
effet inhibiteur vue que l’effet est indifférent avec un indice de FIC de 1.06 (tableau 15).
Cet effet devient additif lorsque 0,125 mg/mL d’acide caféique sont mélangé avec 0,0039
de quercétine, mais une synergie (fig.42) est remarquée lors de l’utilisation de (0,00195 -
0,03125 mg/mL) d’acide caféique et (0,0156- 0,0078 mg/mL) de quercétine.
Toutes les combinaisons qui ont été testées semblent améliorer l’action de chacune
des molécules mais l’association entre l’acide caféique et la quercétine a donné le meilleur
indice de FIC (0.37661) avec seulement 1/8 et 1/4 de leur CMIs respectivement.
Prasad et al. (2014) ont étudié l’effet des combinaisons entre la quercétine et trois
acides phénoliques (acide gallique, acide cinnamique et acide p-anisique) contre trois
bactéries à gram négatif pathogènes pour les poissons (Aeromonas hydrophila, Aeromonas
salmonicida et Edwardsiella tarda). Toutes les molécules testées ont pu inhiber ces
bactéries avec des CMIs qui varient entre 0.83 et 2.5 mg/mL.
Tableau 15: Etude de la synergie entre l’acide caféique et la quercétine contre S. aureus.
Ac caf Q
∑ FIC Interprétation
Concentration Fic Ac caf Concentration Fic Q
0 0 0,03125 1 1 CMI Q
0.75
FIC Acide caféïque
0.5
0.25
0
0 0.25 0.5 0.75 1
FIC Quercétine
Les acides phénoliques ont un effet antibactérien faible lorsqu’ils sont administrés
seuls avec des CMIs qui peuvent atteindre 2.5 mg/mL, mais leur combinaisons avec
d’autres molécules permettent la réduction du CMIs jusqu’à 8 fois (Prasad et al., 2014).
- Quercétine et Kaempférol
de quercétine, l’effet de ces deux composés s’additionne et donne un indice de FIC de 0.56
(tableau 16).
Ces deux flavonoïdes semblent avoir une synergie très positive claire dés les
concentrations (0.0039- 0.0625 mg/mL) de quercétine et (0.1248- 0.5 mg/mL) de
kaempférol. Mais le meilleur indice de FIC (0.31) est obtenu avec 0.0156 mg/ml de
quercétine et 0.03125 mg/mL de kaempférol (fig.43).
Akroum et al. (2009) ont étudié l’effet de quelques flavonoïdes isolés (lutéoline-7-O-
glucoside, lutéoline-7,3’-O-diglucoside, apigénine, quercétine3-O-glycoside, kaempférol-
3-O-glucoside) sur E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, B. cereus et B. subtilis. Tous les
flavonoïdes testés ont inhibé toute les souches, sauf le lutéoline-7-O-glucoside et le
lutéoline-7,3’-O-diglucoside qui ont donné un résultat négatif avec E. coli et P.
aeruginosa. La quercétine 3-O-glycoside a inhibé toutes les souches testées avec de très
faibles CMIs, mais la combinaison entre la quercétine3-O-glycoside, kaempférol-3-O-
glucoside et l’apigénine a donné les meilleurs résultats. Un CMI de l’ordre de 0.40 mg/mL
a été obtenu en présence de cette combinaison avec P. aeruginosa.
Q K
∑ FIC Interprétation
Concentration Fic Q Concentration Fic K
0,25 1 0 0 1 CMI Q
0 0 0,125 1 1 CMI K
FIC Quercétine
0.75
0.5
0.25
0
0 0.25 0.5 0.75 1
FIC Kaempférol
Tableau 17: Etude de la synergie entre l’acide caféique et le kaempférol contre P. aeruginosa.
Ac caf K
∑ FIC Interprétation
Concentration Fic Ac caf Concentration Fic K
2 1 0 0 1 CMI Ac caf
0 0 0,125 1 1 CMI K
1
FIC Acide caféïque
0.75
0.5
0.25
0
0 0.25 0.5 0.75 1
FIC Kaempférol
En dernier lieu, la combinaison entre l’acide caféique et la quercétine n’a pas d’effet
synergique sur P. aeruginosa (tableau 18). L’effet modéré de l’acide caféique ne subit pas
une grande amélioration lorsqu’il est associé avec la quercétine. Le meilleur indice de FIC
calculé est 0.75, il reflète un effet additif (fig.45).
Tableau 18: Etude de la synergie entre l’acide caféique et la quercétine contre P. aeruginosa.
2 1 0 0 1 CMI Ac caf
0 0 0,25 1 1 CMI Q
1
FIC Acide caféïque
0.75
0.5
0.25
0
0 0.25 0.5 0.75 1
FIC Quercétine
Ces dernières années, plusieurs recherches ont été menées sur l’activité anti-
tumorale des plantes afin d’identifier de nouvelles molécules actives avec de nouveaux
mécanismes d’action (Jayaprakasha et al., 2007).
Dans une étude cas-témoin incluant plus de 250 personnes, Greenwald et al. (2001)
ont montré que la consommation de fruits, légumes et graines diminuait le risque de
développer un certain nombre de cancers tels que les cancers de la bouche, de l’oesophage,
du pharynx, des poumons, de l’estomac, du colon et du rectum.
Viabilité (%)
75
50
25
0
0 50 100 150 200
Concentration (µg/ml)
100
U937
(B)
PBMCs
Viabilité (%)
75
50
25
0
0 50 100 150 200
Concentration (µg/ml)
U937
100
PBMCs
Viabilité (%)
(C)
75
50
25
0
0 50 100 150 200
Concentration (µg/ml)
Figure 46 : Cytotoxicité des polyphénols (A), capsaicinoïdes (B) et caroténoïdes (C) du piment.
Parmi les trois extraits, les caroténoïdes ont exercé le pouvoir anti-tumorale le plus
important. L’addition de seulement 25 μg/mL a permis une diminution de 41.74% des
cellules cancéreuses U937. Lorsque cette concentration augmente à 50 μg/mL, 50.64%
d’U937 sont inhibées.
Smith-Warner et al. (1999) ont signalé dans leur étude que la réduction du risque de
développer un cancer de sein était souvent associée à la consommation de carottes et de
légumes verts riches en caroténoïdes. La réduction du risque de cancer de prostate était
associée à la prise régulière de légumes de couleur jaune très riches en caroténoïdes et de
tomates qui sont riches en caroténoïdes lycopène (Souleymane, 2011).
Lin et al. (2013) ont étudié l’effet de la capsaïcine sur une lignée cellulaire
cancéreuse humaine. Ils on observé quelques effets tels que la réduction de la viabilité et
prolifération, ainsi l’arrêt du cycle cellulaire dans la phase G2/M et la perte de la
membrane de la mitochondrie conduisant à une activation de la caspase 9, qui à son tour
est responsable de l'apoptose cellulaire.
Ces dernières années, plusieurs études menées in vitro sur des lignées de cellules
cancéreuses ou in vivo à l'aide de modèles animaux ont montré le rôle protecteur des
polyphénols contre différents types de cancers (Yang et al., 2010).
Plusieurs études ont été menées sur l’effet de la quercétine sur des cellules
cancéreuses (Wattel et al., 2004; Gulati et al., 2006; Thaler et al., 2009; Gibelliniet al.,
2010 ; Yamaguchi and Weitzmann, 2011; Yao et al., 2012 ; Pratheeshkumar et al., 2012 ;
Tabaczar et al., 2014 ; Pan et al., 2015 ; Pavan et al., 2015).
Selon des recherches réalisées sur des modèles murins par Lee et al. (2006), la
quercétine semble posséder un effet anticancer en empêchant la prolifération, et par arrêt
de la phase G2/M dans les cellules U937. Ramos et al. (2008) ont montré que la quercétine
et l’acide ursolique peuvent prévenir les dommages d’ADN et la prolifération des cellules
HepG2, alors que la rutine n’avait pas d’effet.
le kaempférol apparaît à préserver la viabilité des cellules saines, dans certains cas, en
exerçant un effet protecteur (Chen et Chen, 2013).
Une autre étude menée par Ramesh et Alshatwi (2013) a montré que la naringine
est capable d’inhiber la prolifération des cellules cancéreuses du col d’utérus SiHa
engendrant l’arrêt du cycle cellulaire dans la phase G2/M. Ce flavonoïde a permis aussi la
réduction de la prolifération des cellules cancéreuses de foie et induit l’apoptose selon les
recherches in vivo de Thangavel et Vaiyapuri (2013).
Conclusion
Conclusion
M.Mokhtar.(2015). Identification et propriétés biologiques des principes actifs du piment (Capsicum annuum). Thèse de Doctorat en Sciences, Univ. Mostaganem 114
Dans le test de cytotoxicité de ces trois extraits sur les deux lignés cellulaires
PBMCs et U937, les caroténoïdes avaient le plus grand pourcentage de réduction des
cellules cancéreuses mais les polyphénols possédaient la meilleures sélectivité.
Les résultats des propriétés biologiques des principes actifs de piment suggèrent
leurs utilisations dans le domaine agroalimentaire pour protéger les aliments contre
l’oxydation et les altérations microbiennes ou dans le domaine pharmaceutiques pour luter
contre le stress oxydatif et les maladies qui peuvent en résulter ainsi contre les bactéries
pathogènes.
Sur le plan des perspectives, nous considérons que les observations faites in vitro
ne constituent qu’une première étape de recherche pour l’évaluation des propriétés
biologiques des substances bioactives du piment. Ces effets doivent être explorés in vivo.
Conclusion
Références bibliographiques
M.Mokhtar.(2015). Identification et propriétés biologiques des principes actifs du piment (Capsicum annuum L). Thèse de Doctorat en Sciences, Univ. Mostaganem 115
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vitamins [7]. Capsicum annuum is the most widespread 2.3 Phytochemical investigations
and widely cultivated species in subtropical and temperate
countries [8]. 2.3.1 Determination of total phenols (TP) and total
So far, several studies carried out on Capsicum have fo- flavonoids
cused on the analysis of capsaicinoids, which are responsible
of the pungency of pepper, but some studies investigating The amount of TPs was determined by the Folin–Ciocalteau
the polyphenolic profile of peppers have been reported as reagent based on the method of Gutfinger [18]. The content
well [9–16]. was expressed as milligram of gallic acid equivalents (GAE)/g
This research was conducted in two steps: (i) to achieve of extract.
a thorough characterization of flavonoids and other phenolic The total flavonoid content was determined using the
components extracted from C. annuum by LC in combina- Dowd method, as adapted by Arvouet-Grand et al. [19]. The
tion with photodiode array (PDA) and ESI-MS detection; (ii) content was expressed as milligram of quercetin equiva-
correlate the polyphenolic content with important biological lents/g of extract.
properties, namely antioxidant, antimicrobial, and cytotoxic
activities.
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equipment. Afterwards, the optimization study was focused From a chromatographic point of view, out of the two
on finding an appropriate methanol/water gradient and a suit- columns tested the RP-amide, probably due to the polar em-
able pH value, to achieve optimal separation of the polyphe- bedded RP phase, provided the highest selectivity separation
nolic standard mixture in a reasonable analysis time. The use for the target extract components in the shortest analysis time
of formic and acetic acids was tested to suppress ionization of (roughly 56 min) at a mobile phase flow rate of 1.0 mL/min.
the polyphenolic acids, thus improving the chromatographic On-line coupling to PDA (extracted at a 280 nm wavelength)
performance (e.g., peak tailing) and finding proper analyt- and MS detection provided complementary information for
ical conditions for MS ionization. In particular, the use of reliable identification of all the separated compounds (Fig. 1).
0.075% acetic acid (at pH 3.6) with the LC–MS method as the A list of the identified flavonoids is reported in Table 1. MS
aqueous portion of the mobile phase provided favorable sen- identification was achieved by inspection of both m/z values
sitivities for most of the polyphenolic compounds in negative of the [M–H]− ions and secondary fragment ions resulting
ionization mode [34]. from further fragmentation (loss of the sugar moieties).
Table 1. HPLC–PDA and ESI-MS (negative and positive ionization mode) polyphenolic fingerprint of Capsicum annuum L.
Peak Molecular formula tR (min) [M–H]− observed UV/Vismax (nm) Compound Quantificationa)
1 C15 H18 O8 7.3 325 264, 300 p-Coumaric acid derivative 6.97
2 C18 H17 NO5 10.2 326 264, 300 p-Coumaryl tyrosine 6.81
3 C11 H10 O5 12.3 221 264, 305 p-Coumaroyl glycolic acid 6.47
4 C13 H16 O8 12.9 299 270 Hydroxybenzoylhexose 3.29
5 C14 H18 O9 22.3 329 254, 280 Vanillic acid glucoside 4.02
6 C15 H18 O9 22.6 341 286, 338 Caffeoyl glucoside 2.59
7 C9 H6 O4 25.0 177 315 Daphnetine 16.29
8 C9 H6 O3 37.4 161 277, 315 Hydroxycoumarin 2.42
9 C9 H10 O4 38.1 181 285, 325 Hydrocaffeic acid 3.03
10 C33 H40 O20 39.9 741, 285 365 Kaempferol diglucoside 17.17
11 C21 H20 O12 41.0 463, 301 262, 355 Quercetin glucoside 19.86
12 C26 H28 O15 42.9 579, 285 255, 350 Luteolin glucoside 12.73
13 C27 H32 O14 44.4 579, 285 255, 350 Luteolin glucoside 16.49
14 C27 H30 O16 47.3 447, 301 262, 355 Quercetin rhamnoside 82.60
15 C21 H18 O12 49.5 461, 285 260, 350 Luteolin glucoside 5.09
16 C29 H30 O18 50.8 665, 285 260, 350 Luteolin diglucoside 5.66
17 C15 H10 O6 53.3 285 260, 350 Luteolin 0.88
18 C21 H20 O11 53.8 447, 285 260, 350 Luteolin glucoside 1.15
19 C15 H10 O7 55.9 301 260, 370 Quercetin 10.81
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18 compounds were identified and out of them hydroxy- expression [39]. Arora et al. [40] found that flavonoids display
benzoylhexose, vanillic acid glucoside, hydroxycoumarin, higher antioxidant capacity against metal ion induced perox-
luteolin, and quercetin were reported for the first time in the idation than peroxyl radical induced peroxidation. The num-
sample tested. Daphnetine, a polyphenolic compound not ber of hydroxyl groups and their position on the molecule ring
usually present in C. annuum L. fruits, was employed as inter- largely affect the antioxidant capacity of individual flavonols.
nal standard. Considering its very similar chemical structure, Among this class of compounds, in agreement with previous
it was assumed that similar recoveries could be attained for all findings by Majo et al. [41], the activity was enhanced with the
polyphenolic compounds contained in the sample and a value increasing number of hydroxyl substitution at the flavonoid
as high as 82% demonstrated the exhaustiveness of the extrac- nucleus, while it was reduced by substitution with a methoxyl
tion method. Quantitative determination of the polyphenolic group.
content in the pepper extract analyzed was performed by
interpolation of the coumarin ( = 305 nm), gallic acid ( =
270 nm), vanillin ( = 280 nm), caffeic acid ( = 325 nm),
daphnetine ( = 315 nm), kaempferol ( = 365 nm), rutin ( 3.4 Antimicrobial activity
= 355 nm), luteolin ( = 350 nm), and quercetin ( = 370 nm)
calibration curves and the results (ppm ± SD) are reported The antimicrobial properties of certain classes of polyphe-
in Table 1. nols have been assessed for several reasons. The development
As reported in the literature, quercetin rhamnoside of novel food preservatives, due to the increasing consumer
turned out to be the most abundant compound (82.6 g/g pressure on the food industry aims to avoid the use of syn-
of fresh pepper) [9, 10, 12–16], accounting for 36% of the thetic preservatives. Further, in the pharmaceutical industry,
total polyphenolic content. Among flavonoids, the quercetin there is an interest in natural bioactive compounds able to
derivatives had the highest concentration (65%) in accordance solve the problems of antibiotic resistant bacteria, thus con-
with literature data [9,10,12,13,16], followed by luteolin (24%) tinuous effort is poured into the search of natural compounds
and kaempferol derivatives (9%). with antimicrobial activity against these resistant strains [42].
Last, it is important to emphasize that the study of the inter-
actions between pepper polyphenols and gut microbiota with
3.3 Antioxidant activity the reference to human health can exert a negative impact on
intestinal bacteria and more precisely beneficial microorgan-
Since different antioxidant compounds may act in vivo isms.
through different mechanisms of action, no single method The results obtained from the filter disc for the antimicro-
is able to fully evaluate the antioxidant capacity of a food bial properties assay are shown in Table 2. The polyphenolic
sample [35]. On the basis of such observation, these assays, extract from C. annuum L. was active against Gram-positive
namely DPPH, ABTS and FRAP, based on distinct mecha- bacteria, except the two beneficial bacteria L. rhamnosus and
nisms, were selected to take into account the wide variety and B. longum, and inactive against the Gram-negative bacteria
range of actions of the antioxidant compounds in the food K. pneumoniae. Staphylococcus aureus was the most sensitive
sample. strain, followed by L. monocytogenes and E. hirae, with inhibi-
Evaluation of the antioxidant activity using the ABTS+ tion zones of 12, 8, and 4.5 mm.
radical cation and free radical DPPH is based upon the ability These results confirm those obtained by Nazzaro et al.
of an antioxidant to donate protons in a physiological or in who investigated the antimicrobial activity of pepper polyphe-
an alcoholic medium [36]. The ABTS+ test gave higher value nols against Bacillus cereus, Escherichia coli, Lactobacillus
than that obtained with the DPPH test (0.069 mM TE/g ± casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus,
0.007 and 0.052 TE/g ± 0.008, respectively), in agreement Lactobacillus bulgaricus, and L. rhamnosus [28]. The two
with what observed in other works [37]. ABTS is soluble in pathogenic strains were sensitive to the pepper polyphenols,
both aqueous and organic solvents, and it reacts relatively whereas the lactic acid bacteria were resistant.
rapidly compared to DPPH, which normally takes several The different behavior of polyphenols toward Gram-
hours for the reaction to be completed. In the DPPH assay, positive and Gram-negative bacteria might be attributed to
color interference may arise from anthocyanins contained in the difference in their membrane structure and the associ-
a sample, thus leading to underestimation of the antioxidant ated cell wall differences. For a polyphenolic compound to
activity. In contrast, this problem does not occur with the function effectively as an antimicrobial agent, it should be
ABTS assay, especially when the absorbance is measured at able to function at the lipid–water interface and therefore
734 nm wavelength [38]. should be partially hydrophobic [43].
The reducing power assay, which measures the ability Duda-Chodak studied the antimicrobial activity of some
of the extract components to donate electrons to Fe (III), polyphenols (naringenin, naringin, hesperetin, hesperidin,
gave as a result 0.109 mM Fe2+ E/g (± 0.002). Antioxidant quercetin, rutin, and (+)-catechin) and also noticed that both
properties of polyphenolic compounds are mainly ascribed to rutin and naringin were inactive [44]. On the other hand,
their free radical scavenging and metal chelating activities, as naringenin and quercetin slowed the growth of all analyzed
well as their effects on cell signaling pathways and on gene intestinal bacteria or even completely inhibited it.
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Table 2. Inhibition zone diameter (mm) of the Capsicum annuum L. polyphenolic extract and some selected polyphenolic standards
Table 3. MIC (mg/mL) of the Capsicum annuum L. polyphenolic whereas flavan-3-ols and isoflavones inhibit nucleic acid syn-
extract, quercetin, kaempferol, and caffeic acid against thesis through topoisomerase and/or dihydrofolate reductase
Listeria monocytogenes ATCC 1392, Enterococcus hi-
rae ATCC 10541, Klebsiella pneumonia (wild type), and
inhibition [48].
Staphylococcus aureus ATCC 49444
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in HepG2 cells, suggesting an anticarcinogenic potential Matusheski, N., Klein, B. P., J. Food Comp. Anal. 2003,
for these compounds, whereas rutin had no effect. Xu 16, 323–330.
et al. reported that kaempferol-7-O--D-glucoside displayed [6] Menichini, F., Tundis, R., Bonesi, M., Loizzo, M. R., Con-
marked anticancer activity on a panel of established cancer forti, F., Statti, G., Cindio, B. D., Houghton, P. J., Menichini,
cells, of which, HeLa human cervix carcinoma cells were F., Food Chem. 2009, 114, 553–560.
the most sensitive [54]. Meanwhile, the cytotoxic effects [7] Rosa, A., Deiana, M., Casu, V., Paccagnini, S., Appendino,
of kaempferol-7-O--D-glucoside on normal human cells G., Ballero, M., Dessi, M. A., J. Agric. Food Chem. 2002,
50, 7396–7401.
(HEK293 embryonic kidney cells and L-02 embryonic liver
cells) were much smaller than on cancer cells. [8] Belletti, P., Marzachi, C., Lanteri, S., Plant Syst. Evol. 1998,
209, 85–91.
[9] Marin, A., Ferreres, F., Tomas-Barberan, F. A., Gil, M. I., J.
Agric. Food Chem. 2004, 52, 3861–3869
4 Concluding remarks
[10] Materska, M., Perucka, I., J. Agric. Food Chem. 2005, 53,
1750–1756.
In the current work, a comparative study of the polypheno-
lic composition and some biological properties of a pepper [11] Kappel, V. D., Costa, G. M., Scola, G., Silva, F. A., Landell,
M. F., Valente, P., Souza, D. G., Vanz, D. C., Reginatto, F.
(C. annuum L.) was carried out. The HPLC–PDA–ESI-MS H., Moreira, J.C.F., J. Med. Food 2008, 11, 267–274.
analysis achieved on an RP-Amide column highlighted the
[12] Jeong, W. Y., Jin, J. S., Cho, Y. A., Lee, J. H., Park, S.,
presence of 18 compounds, of which quercetin rhamnoside Jeong, S. W., Kim, Y. H., Lim, C. S., Abd El-Aty, A. M.,
was the most abundant, accounting for roughly 36% of the Kim, G. S., Lee, S. J., Shim, J. H., Shin, S. C., J. Sep. Sci.
whole fresh pepper. Total polyphenols and flavonoids were 2011, 34, 2967–2974.
extracted using two solvents (methanol and ethyl acetate), re- [13] Wahyuni, Y., Ballester, A.-R., Sudarmonowati, E., Bino,
vealing how a proper solvent combination could represent a R. J., Bovy A. G. Phytochem. 2011, 72, 1358–1370.
promising extraction tool for recovery of both phenolic acids [14] Park, S., Jeong, W. Y., Lee, J. H., Kim, Y-H., Jeong, S. W.,
and flavonoids. For the antimicrobial activity, the best results Kim, G.S., Bae, D. W., Lim, C.S., Jin, J.S., Lee, S. J., Shin,
were obtained with kaempferol, quercetin, and caffeic acid, S. C., Food Chem. 2012, 130, 981–985.
and S. aureus turned out to be the most sensitive strain. The [15] Morales-Soto, A., Gomez-Caravaca, A. M., Garcia-Salas,
extract exhibited strong antioxidant properties, as capable of P., Segura-Carretero, A., Fernandez-Gutierrez, A., Food
reducing the viability of the studied cancer cells. The results Res. Int. 2013, 51, 977–984.
of this study indicate that the fruits of C. annuum L. may be [16] Materska, M., J. Funct. Foods 2014, 7, 269–277.
considered a source of natural compounds with antioxidant [17] Arnnok, P., Ruangviriyachai, C., Mahachai, R., Techa-
and antimicrobial activity, explaining in part the therapeutic wongstien, S., Chanthai, S., Int. Food Res. J. 2012, 19,
and preventive usefulness. 235–243.
[18] Gutfinger, T., J. Am. Chem. Soc. 1981, 58, 966–998.
M. M. thanks the Erasmus Mundus programme of the Eu- [19] Arvouet-Grand, A., Vennat, B., Pourrat, A., Legret, P., J.
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